CN104513830A - 一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体及其应用，所述载体是：1)将质粒pBBR1MCS-5中的rep基因启动子-35区“TTGACT”序列定点突变为“TTGACA”得到的质粒，或将所述质粒的rep基因启动子-10区“CATAAT”序列定点突变为“TATAAT”得到的质粒，或以上两处均定点突变得到的质粒；或2)以pBBR1MCS质粒为基础的、且具有相同的rep基因作为复制起始区的质粒发生与1)相同的定点突变所得到的质粒。该基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中具有更高的拷贝数，可用于在氧化葡萄糖酸杆菌中进行基因表达和未知功能基因的探索研究，尤其可用于高产基因工程菌的构建。

Description

一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体及其应用。

背景技术

质粒作为应用最广泛的基因表达载体，可帮助外源基因转入受体细胞，并为其提供在受体细胞中的复制或整合能力及扩增与表达能力。质粒是细菌中一种独立于染色体之外的可自主复制的双链环状DNA分子，它含有独特的复制起始位点(ori)，有的还含有特定的复制子结构(replicon)，质粒的拷贝数与它的复制结构息息相关。

氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)含有多种膜结合脱氢酶，可不完全氧化醇、醛等化合物生成相应的醛、酮和酸，其独特的不完全氧化特性使得它具有广泛的工业应用价值。利用基因重组技术在氧化葡萄糖酸杆菌中过表达脱氢酶基因，可在很大程度上增加单位质量菌体的酶活，提高相关产物的合成效率。目前，广泛用于G.oxydans基因表达的质粒主要是广宿主质粒pBBR1MCS系列，但是该质粒拷贝数较低。近来，少数研究者报导了基于广宿主质粒pBBR1MCS或G.oxydans内源性质粒而改造的质粒。例如，Verena等人将编码G.oxydans核糖体蛋白L35和L13的基因的启动子区域整合到广宿主质粒pBBR1MCS-2中，构建了强启动子载体pBBR1p264和中等强度启动子载体pBBR1p452，有利于满足不同程度蛋白表达水平的要求(参见VerenaKallnik,Maria Meyer,UweDeppenmeier,Paul Schweiger.Construction ofexpression vectors for proteinproduction in Gluconobacteroxydans.Journal ofBiotechnology,2010,150:460-465.)。本发明人曾以G.oxydans内源性质粒pGOX3为基础，构建了基因表达质粒pZL1。该质粒包含了pGOX3中与质粒分配有关的par基因和与复制有关的rep基因，以及质粒PUC19的氨苄抗性基因和复制起始区origin，因而该质粒在大肠杆菌及氧化葡萄糖酸杆菌中均可自主复制(参见Lin Zhang,Jinping Lin,Yushu Ma,Dongzhi Wei,Ming Sun.Construction of a Novel Shuttle Vector for Use in Gluconobacteroxydans.MolBiotechnol,2010,46:227-233.)。然而，这些质粒在G.oxydans中的拷贝数普遍较低，这大大限制了G.oxydans的工业应用潜能及科学研究进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体及其应用，从而解决现有技术中的质粒在氧化葡萄糖酸杆菌中的拷贝数普遍较低，导致氧化葡萄糖酸杆菌的工业应用受到限制的缺陷。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体，所述基因表达载体是：1)将质粒pBBR1MCS-5中的rep基因启动子-35区“TTGACT”序列定点突变为“TTGACA”序列得到的质粒(即将序列1689bp处的碱基T替换为碱基A得到的质粒)，或将质粒pBBR1MCS-5中的rep基因启动子-10区“CATAAT”序列定点突变为“TATAAT”序列得到的质粒(即将序列1707bp处碱基C替换为碱基T得到的质粒)，或以上两处均定点突变得到的质粒，其中，所述质粒pBBR1MCS-5序列如SEQ ID NO：1所示；或2)其他以pBBR1MCS质粒为基础的、且与pBBR1MCS质粒具有相同的rep基因作为复制起始区的质粒发生与1)相同的碱基替换所得到的质粒。

本发明所提供的基因表达载体以广泛用于氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌构建的质粒pBBR1MCS-5或以pBBR1MCS质粒为基础的衍生质粒为骨架，将其与复制有关的rep基因启动子的-35区和-10区分别突变为保守序列“TTGACA”和“TATAAT”，从而增强该启动子的强度，以增加rep基因的表达量，进而提高质粒的拷贝数。

所述衍生质粒包括所有以pBBR1MCS质粒为基础的、且与pBBR1MCS质粒具有相同的rep基因作为复制起始区的质粒。

这些衍生质粒可以是：pBBR1MCS-1、pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-3、pBBR1MCS-4、pEXGOX、pBBR1-p264、pBBR1-p452等等。由于这些衍生质粒均具有与pBBR1MCS质粒相同的rep基因，即与pBBR1MCS-5相同的rep基因作为复制起始区，因此在经过相同的定点突变后这些衍生质粒能实现与质粒pBBR1MCS-5经过相同的定点突变后的相同的技术效果。

本发明还提供一种如上所述的适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体的应用，所述基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中能够有效表达同源基因或异源基因，尤其能够更有效地表达同源基因。

所述同源基因可以是氧化葡萄糖酸杆菌膜结合葡萄糖酸-2-脱氢酶(ga2dh)基因，所述异源基因可以是绿色荧光蛋白(GFP)基因。

本发明还提供了所述基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中表达氧化葡萄糖酸杆菌膜结合葡萄糖酸-2-脱氢酶基因的应用，以及绿色荧光蛋白基因的应用。

所述基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中对膜结合葡萄糖酸-2-脱氢酶基因的有效表达还可用于2-酮基-D-葡萄糖酸高产基因工程菌的构建。

还提供一种重组载体，所述重组载体通过如上所述的基因表达载体构建。

还提供一种重组菌，所述重组菌含有如上所述的基因表达载体。

本发明提供的基因表达载体通过在常用载体的基础上进行特定位点的突变，使其在氧化葡萄糖酸杆菌中的拷贝数得到明显提高。并且经证明该载体具有在氧化葡萄糖酸杆菌中能有效表达同源基因或异源基因的功能，与广泛应用于氧化葡萄糖酸杆菌中基因表达的载体pBBR1MCS-5质粒相比，本发明提供的基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中具有更高的拷贝数，可用于在氧化葡萄糖酸杆菌中进行基因表达和未知功能基因的探索研究，尤其可用于2-酮基-D-葡萄糖酸高产基因工程菌的构建。

附图说明

图1为实时定量PCR法测定质粒相对拷贝数的结果；

图2为PCR扩增得到的启动子tufB的电泳图谱；其中，左边泳道为DNAMarker，分子标准从小到大依次为100bp，300bp，800bp，1500bp，2000bp，3000bp；右边泳道为tufB基因片段；

图3为PCR扩增得到的ga2dh基因的电泳图谱；其中，左边泳道为DNAMarker，分子标准从小到大依次为300bp，500bp，800bp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp；右边泳道为ga2dh基因片段；

图4为各个重组菌与野生菌中ga2dh转录水平的比较；

图5为各个ga2dh过表达菌催化葡萄糖酸钠(GA)的反应初速度的比较，即比较相同条件下反应2h后生成产物2KGA的浓度；

图6为各菌在7L发酵罐中以GA为底物生产2KGA的过程比较；

图7为PCR扩增得到的GFP基因的电泳图谱；其中，左边泳道为DNAMarker，分子标准大小从小到大依次为300bp，500bp，800bp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp；右边泳道为GFP基因片段；

图8为各表达GFP的重组菌在荧光共聚焦显微镜下的荧光照片；其中，(A)为G.oxydans/pBBR1MCS-GFP的照片，(B)为G.oxydans/pBBR10-GFP的照片，(C)为G.oxydans/pBBR35-GFP的照片，(D)为G.oxydans/pBBR3510-GFP的照片，(E)为对照菌G.oxydans/pBBR1MCS的照片；

图9为重组菌G.oxydans/pBBR35-GFP与原始质粒GFP表达菌G.oxydans/pBBR1MCS-GFP中GFP转录水平的对比。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，参照《分子克隆指南》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述条件。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

虽然以pBBR1MCS质粒为基础的、且与pBBR1MCS质粒具有相同的rep基因作为复制起始区的所有衍生质粒，例如pBBR1MCS-1、pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-3、pBBR1MCS-4、pEXGOX、pBBR1-p264、pBBR1-p452等等在实施本发明的碱基替换之后均能实现本发明的技术效果，但是由于篇幅限制，本说明书仅以质粒pBBR1MCS-5作为示例示出而非限制，应当理解，以pBBR1MCS质粒为基础的衍生质粒均能实现本发明的技术效果。

质粒pBBR1MCS-5：参考Kovach,M.E.,Elzer,P.H.,Steven Hill,D.,Robertson,G.T.,Farris,M.A.,Roop II,R.M.,Peterson,K.M.,(1995)Four newderivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying differentantibiotic-resistance cassettes.Gene166,175-176。

培养基：

LB培养基：10g/l NaCl，10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉。

山梨醇培养基：80g/l酵母粉，80g/l山梨醇，1g/l磷酸二氢钾，0.3g/l硫酸镁，0.1g/l谷氨酰胺。

固体培养基：液体培养基中加入1.5％的琼脂。

实施例1：质粒基因的定点突变

质粒DNA的定点突变选用TOYOBO公司的KOD-Plus-Mutagenesis Kit按照说明书进行操作。首先，按照说明书的要求设计并合成引物(引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成)，其序列如下：

M35-F：CAGCCACTTTTACGCAACGCATAATT；

M35-R：TCAATTACAGATTTTCTTTAACCTACGCAATG；

M10-F：GTATAATTGTTGTCGCGCTGCCGAAAAG；

M10-R：GTTGCGTAAAAGTGGCAGTCAATTACAG；

其中，质粒pBBR10由-10区的点突变产生，pBBR35由-35区的点突变产生，pBBR3510则由-10区和-35区2轮点突变后产生。

冰上配置反应液进行反向PCR，具体条件如下：

反应体系：10×Buffer for iPCR 2.5μl，质粒pBBR1MCS-5(50μl)，引物各0.75μl，2mMdNTPs 2.5μl，KOD-Plus-0.5μl，ddH₂O 10μl；

反应过程：94℃ 2min，98℃ 10s，68℃ 5min，6个循环，4℃保存。

PCR反应结束后，向PCR反应液中加入1μl DpnI，混匀，37℃保温2h，以去除其中的模板质粒，提高突变子得率。

DpnI酶处理后，向体系中加入连接酶，使产物自身环化，具体条件如下：

连接体系：DpnI酶切后的产物2μl，ddH₂O 7μl，Ligation high 5μl，T4Polynucleotide Kinase 1μl；

反应条件：16℃保温2h。

将上述连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过基因测序筛选阳性克隆。

实施例2：质粒相对拷贝数的检测

质粒的相对拷贝数通过实时定量PCR法进行检测，以G.oxydans低拷贝内源性质粒pGOX3作为参照，提取重组菌的总质粒作为模板，SYBR荧光染料购自北京康为世纪有限公司。首先，设计和合成引物如下(引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成)：

qpBBR-F：CGGATTCACCGTTTTTATCAGGCTC；

qpBBR-R：AGTGTGACCGTGTGCTTCTCAAATG；

qpGOX3-F：GTATTGGGCTGCGTTCGT；

qpGOX3-R：AATGGGTTTCATGGTGGC；

反应体系(20μl)：2×FastSYBR Green Master Mix 10μl，引物各0.5μl，ddH₂O 8μl，模板1μl。每个样品重复3次；

反应条件：94℃ 5min，94℃ 30s，57℃ 30s，40个循环。

结果如图1所示，改造后的新质粒在G.oxydans中的拷贝数均比原始质粒pBBR1MCS-5的拷贝数高。

实施例3：三种质粒的应用

3.1、表达ga2dh基因的重组质粒的构建

选择G.oxydans中的强启动子tufB作为表达目的基因ga2dh的启动子，设计并合成引物如下(引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成)：

PtufB-F：ACTGAGCTCCGATGGTAAGAAATCCACTGC；

PtufB-R：ATATCTAGACCAAAACCCCGCTCCACC；

ga2dh-F：CTATCTAGAGGAGAAACCTGTGCCCCCCATG；

ga2dh-R：GAGGGATCCTTCAGTTCAGTGAGACCGCATCATC；

以G.oxydans基因组为模板，分别PCR扩增tufB启动子片段和ga2dh基因片段；其中，tufB启动子两端含SacI和XbaI酶切位点，ga2dh两端含XbaI和BamHI酶切位点。反应条件如下：

反应体系：2×PCR mix 25μl，引物各1.5μl，模板1μl，ddH₂O 21μl；

反应条件：(tufB)95℃ 5min，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，25个循环，72℃ 10min，4°保存；(ga2dh)95℃ 5min，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 4min，25个循环，72℃ 10min，4°保存。

将PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，如图2、图3所示，tufB片段长约500bp，ga2dh片段长约3800bp。用胶回收试剂盒将目的片段回收，tufB片段用SacI和XbaI内切酶37℃处理2小时，纯化后与同样酶切处理的质粒连接，转化大肠杆菌，转化子经PCR验证后送测序，序列正确的保种并提质粒用于下一步构建。

ga2dh片段用XbaI和BamHI内切酶37℃处理2小时，纯化后分别与同样酶切处理的已连有tufB启动子的质粒连接，转化大肠杆菌，转化子经PCR验证后送测序，序列正确的保种。由此产生pBBR1MCS-ga2dh、pBBR10-ga2dh、pBBR35-ga2dh、pBBR3510-ga2dh四种过表达ga2dh基因的重组质粒。

3.2、表达ga2dh的G.oxydans基因工程菌的获得

将上述重组质粒转化E.coli后，用三亲本接合法将重组质粒导入G.oxydans。具体为：供体菌E.coliDH5α及含质粒pK2013的辅助菌E.coliHB101在LB培养基中培养10h左右，受体菌G.oxydansDSM2003在山梨醇培养基中培养14h左右。分别取3种菌的菌液1ml，6,000rpm离心1min，弃上清。用无菌山梨醇培养基分别洗涤3种菌体2次，6,000rpm离心1min，弃上清。用1ml山梨醇培养基将三种菌体合并到一个EP管，6,000rpm离心1min，弃掉850μl上清，剩余物用移液器混匀，涂布于无抗性的山梨醇固体平板上，于30℃倒置培养过夜。再将无抗板上的菌膜用3ml无菌山梨醇培养基洗下，取200μl菌液涂布到含有头孢西丁钠和硫酸庆大霉素的双抗山梨醇固体平板上，于30℃倒置培养2～4天。挑取双抗板上的单菌落于山梨醇液体培养基中培养20～24h，提取质粒进行PCR验证。获得的阳性克隆用甘油保种备用。由此得到重组菌G.oxydans/pBBR1MCS-ga2dh、G.oxydans/pBBR10-ga2dh、G.oxydans/pBBR35-ga2dh、G.oxydans/pBBR3510-ga2dh。同时将空质粒pBBR1MCS-5转入G.oxydans作为空白对照。

3.3、各ga2dh重组菌中ga2dh基因转录水平的检测

ga2dh基因的转录水平用实时定量PCR的方法检测，以重组菌cDNA作为模板，16SrRNA为内参，以插入空白质粒的原始菌为对照，比较各重组菌中ga2dh转录水平相对于对照菌中的倍数。首先按实时定量PCR的要求设计并合成如下引物：

q16S-F：GCGGTTGTTACAGTCAGATG；

q16S-R：GCCTCAGCGTCAGTATCG；

qga2dh-F：CCAGAACCTGTCCCAGTCCAC；

qga2dh-R：CAGAAAGGCTGCGAGTTGAC；

模板的获得：G.oxydans培养至对数中后期，取15ml菌液离心后，用takara公司的RNAiso plus试剂按说明书的方法提取RNA。获得的RNA用核酸定量仪将浓度稀释至小于1μg/μl，再用taraka公司的PrimeScript^TM RT reagentKit with gDNAEraser试剂盒按说明书的方法进行反转录，获得的cDNA作为实时定量PCR的模板。

反应的体系与条件同实施例2中实时定量PCR的反应体系与条件。

结果如图4所示。重组菌G.oxydans/pBBR1MCS-ga2dh、G.oxydans/pBBR10-ga2dh、G.oxydans/pBBR35-ga2dh、G.oxydans/pBBR3510-ga2dh中ga2dh的转录水平分别是原始菌的3.6倍、9.1倍、4.4倍和21.4倍。可见改造后的三种质粒过表达ga2dh的能力均比原始质粒高。

3.4、三种ga2dh重组菌催化活性的检测

将三种重组菌及原始质粒过表达菌培养至对数中后期，8000rpm离心10min，用50mMpH5.8的PBS洗涤两次，作为催化反应的静息细胞。用100mMpH5.8的PBS配置10ml反应体系，其中细胞10g/l(湿重)，葡萄糖酸钠(GA)40g/l。反应2h后，取样HPLC检测产物2-酮基葡萄糖酸钠(2KGA)的生成量，以检测重组菌催化活性。

HPLC检测条件：色谱柱为ICSep COREGEL-87H3(Transgenomic,USA)，柱温为35℃，流动相为0.008N H₂SO₄，流速为0.35ml/min，检测波长为210nm。

结果如图5所示。三种改造质粒过表达ga2dh的菌株催化活性均比原始质粒过表达的要高。

综上所述，本发明的三种质粒是三种拷贝数比原始质粒高的质粒，且能更有效地在G.oxydans中表达基因。

3.5、重组菌G.oxydans/pBBR3510-ga2dh生产2KGA的应用

根据3.4的研究结果，重组菌G.oxydans/pBBR3510-ga2dh是ga2dh催化活性提高最多的菌株，因而将反应体系放大到1.5L以考察其催化GA生产2KGA能力的提高程度，并以转入空质粒的野生菌G.oxydans/pBBR和原始质粒过表达菌G.oxydans/pBBR1MCS-ga2dh作为对照。在7L发酵罐中培养G.oxydans至对数后期，8000rpm离心20min，称取菌体加入到发酵罐中，加入用蒸馏水溶解的葡萄糖酸钠(GA)溶液至总体积为1.5L，使得细胞浓度为30g/l(湿重)，葡萄糖酸钠浓度为300g/l，通入无菌空气，控制温度为30℃、pH5.5、转速600rpm开始反应，定时取样，样品离心取上清进行检测。

结果如图6所示。重组菌G.oxydans/pBBR3510-ga2dh仅用17h就可将底物葡萄糖酸钠完全消耗，产物2KGA的浓度达到320g/L，但是原始质粒过表达菌G.oxydans/pBBR1MCS-ga2dh和转入空质粒的野生菌G.oxydans/pBBR则分别需要27h和48h才能完全反应。可见改造后的质粒能在G.oxydans中更有效地表达基因ga2dh。

3.6、用三种质粒表达外源基因GFP

表达GFP的重组质粒的构建方法同3.1，同样选用tufB启动子，GFP片段引物如下：

GFP-F：ACGTCTAGAAGAAAGACGATGGCTAGCA；

GFP-R：CGCGGATCCTTATTTGTACAGTTCATCCA；

以质粒PET28a-GFP(购自美国绿阳生物医药有限公司)为模板扩增GFP基因片段，PCR反应体系与条件同扩增tufB。片段电泳图如图7所示，GFP片段长约720bp。由此构建pBBR1MCS-GFP、pBBR10-GFP、pBBR35-GFP、pBBR3510-GFP四种表达GFP基因的重组质粒。

表达GFP的G.oxydans基因工程菌的构建方法同3.2，由此获得重组菌G.oxydans/pBBR1MCS-GFP、G.oxydans/pBBR10-GFP、G.oxydans/pBBR35-GFP、G.oxydans/pBBR3510-GFP。

3.7、各GFP重组菌中荧光蛋白表达的检测

各GFP重组菌先于试管中培养22h，再以1％的接种量转接到盛有50ml山梨醇培养基的摇瓶中培养22h，获得的菌液于4℃、8000rpm离心10min，用50mM pH6.0的PBS缓冲液洗涤2遍，重悬后滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片，用吹风机小心吹干，放到荧光共聚焦显微镜(Nikon，TE2000-U)下进行观察，并拍照记录。

检测结果如图8所示，四种载体表达GFP的重组菌均有荧光，而对照菌则无荧光，说明本发明的三种质粒均可使GFP基因在G.oxydans中成功表达，其中，G.oxydans/pBBR35-GFP检测到的荧光最强。

3.8、重组菌G.oxydans/pBBR35-GFP相对于原始质粒重组菌G.oxydans/pBBR1MCS-GFP中GFP基因转录水平的检测

GFP基因转录水平的检测方法同3.3中ga2dh转录水平的检测方法，其中，所用检测GFP片段的引物为：

qGFP-F：GTTCAATGCTTTTCCCGTTATCC；

qGFP-R：CGTCTTGTAGTTCCCGTCAT

结果如图9所示。G.oxydans/pBBR35-GFP中GFP的转录水平相当于原始质粒重组菌G.oxydans/pBBR1MCS-GFP中的1.7倍。可见质粒pBBR35在G.oxydans中能更有效地表达外源基因GFP。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (8)

1.一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体，其特征在于，所述基因表达载体是：

1)将质粒pBBR1MCS-5中的rep基因启动子-35区“TTGACT”序列定点突变为“TTGACA”序列得到的质粒，或将质粒pBBR1MCS-5中的rep基因启动子-10区“CATAAT”序列定点突变为“TATAAT”序列得到的质粒，或以上两处均定点突变得到的质粒，其中，所述质粒pBBR1MCS-5序列如SEQ ID NO：1所示；或

2)以pBBR1MCS质粒为基础的、且与pBBR1MCS质粒具有相同的rep基因作为复制起始区的质粒发生与1)相同的定点突变所得到的质粒。

2.根据权利要求1所述的基因表达载体，其特征在于，所述以pBBR1MCS质粒为基础的、且与pBBR1MCS质粒具有相同的rep基因作为复制起始区的质粒包括：pBBR1MCS-1、pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-3、pBBR1MCS-4、pEXGOX、pBBR1-p264、pBBR1-p452。

3.一种根据权利要求1所述的适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体的应用，其特征在于，所述基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中能够有效表达同源基因或异源基因。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述同源基因包括氧化葡萄糖酸杆菌膜结合葡萄糖酸-2-脱氢酶基因。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述异源基因包括绿色荧光蛋白基因。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中对所述氧化葡萄糖酸杆菌膜结合葡萄糖酸-2-脱氢酶基因的有效表达可用于2-酮基-D-葡萄糖酸高产基因工程菌的构建。

7.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体通过根据权利要求1所述的基因表达载体构建而成。

8.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌含有根据权利要求1所述的基因表达载体。