CN109321583B

CN109321583B - 一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法

Info

Publication number: CN109321583B
Application number: CN201811152680.3A
Authority: CN
Inventors: 林锋强; 陈少莺; 王劭
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-09-29
Filing date: 2018-09-29
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2038-09-29
Also published as: CN109321583A

Abstract

本发明公开了一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法，通过从含有番鸭呼肠孤病毒细胞培养毒提取病毒基因组RNA，通过设计的特定引物，以病毒基因组RNA为模板RT‑PCR扩增MDRV全序列的基因分段，将目的基因分段进行酶切连接成MDRV10个基因片段，并与载体连接，挑取阳性菌落进行测序验证。将MDRV 10个片段的阳性质粒按比例混合共转染单层293T细胞。在细胞上传代到第15代后，细胞病变开始稳定，获得MDRV重组病毒。

Description

一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法

技术领域

本发明涉及一种构建番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）反向遗传系统的方法。

背景技术

番鸭呼肠孤病毒病是由番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)引起的，病鸭以软脚，肝和脾表面有大量灰白色坏死点，肾脏肿大、出血为主要特征的传染病，而且免疫器官严重受损呈现免疫抑制，并在水禽流感传播与流行过程中可能扮演带毒与储毒宿主的角色。因此，该病已成为目前严重威胁水禽养殖业的主要疫病之一。

根据第七次国际病毒分类委员会报告（2000年，Van Regenmortal等），番鸭呼肠孤病毒为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属II亚群禽正呼肠孤病毒的成员。电镜下病毒粒子呈球形或近球形，直径60nm～80nm，正二十面体，立体对称、无囊膜，有可见的双层衣壳结构。

MDRV基因组为dsRNA，全长约为22,969 bp。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明共有10个片段, 按其电泳率大小可分为三类：大片段（L1-L3）、中片段（M1-M3）和小片段（S1-S4），分别编码12个蛋白，即10个结构蛋白和2个非结构蛋白。S1基因全长1324bp,编码主要核心蛋白σA；S2基因全长1201bp,编码小非结构蛋白σNS；S3基因全长1191bp,编码主要外壳蛋白σB；S4基因全长1124bp, S4基因是个双顺反子，含有两个重叠的开放式阅读框（ORF），其中ORF1编码10.8kD的多肽P10，该多肽未发现任何潜在的跨膜区；而ORF2编码29.4kD的σC蛋白，编码的σC蛋白为小外壳蛋白，具有细胞粘附活性，可诱导型特异性中和抗体产生，在抵抗强毒攻击中起主要作用。M3基因全长1995bp，编码大非结构蛋白μNS；M2基因全长2155bp，编码主要外壳蛋白μB；M1基因全长2283bp，编码小核心蛋白μA。L1基因全长3959bp，L1基因编码λA蛋白;L2基因长3830bp，L2基因编码λB蛋白;L3基因长3907bp，编码λC蛋白。MDRV国内外分离株S基因同源性高，与传统的禽呼肠孤病毒(ARV)差异大，特别是σC 蛋白基因。MDRVMW9710株与ARV的σA 、σB、σNS 和σC 蛋白基因核苷酸同源性分别为76.0%～77.1%、60.3%～64.4%、78.4%～79.6%和2.7%～9.9%；而与法国MDRV89026 株σA、σB、σNS 和σC 基因的核苷酸同源性分别为90.0%、93.6%、87.9%～88.0%和93.1%。对MDRV M基因测序表明M1、M2、M3基因分别编码uA、uB、uNS蛋白，与ARV 同源性分别为 72.9%-73.9%、 67.15-69.6%和69.4%-70.8%。MDRV的非结构基因（NS）与法国89026株NS基因核苷酸同源性为87.8%，与ARV S1133的NS基因同源性为79%；进化树分析表明，MDRV与ARV形成不同的分支。

由于缺乏技术手段，无法开展MDRV基因组功能研究，导致相关研究停滞不前。而反向遗传系统是解决这一难题的有效手段。反向遗传学是指直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象。通过这种系统可以研究人为修饰的目的基因对生物体的性状和表型的影响，从而进一步研究病毒基因结构、功能、病毒与宿主之间的相互作用。反向遗传技术推动了病毒基因组的人工操作和病毒基因功能的研究。因此，建立病毒反向遗传系统的研究具有十分重大的科学意义。因此构建MDRV反向遗传系统，分析相关基因在致病功能的作用，有助于阐明番鸭呼肠孤病毒关键基因或蛋白的功能，丰富呼肠孤病毒属病毒学的研究内涵，为番鸭呼肠孤病毒基因及表达蛋白的功能研究提供技术平台，为我国番鸭呼肠孤病毒病以及水禽其他病毒性传染病的防控奠定理论基础。

发明内容

针对现有技术的空白，本发明公开了一种构建MDRV反向遗传系统的方法，能够有效获得重组病毒，本发明公开的方法具有重组病毒毒价高、纯度高的特点。

本发明采用以下技术方案：

一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）提取MDRV 基因组RNA；

（2）以步骤（1）的RNA作为模板，用引物进行PCR扩增，得到相应的基因片段或分段的基因；

（3）回收和纯化上述PCR产物，将相应分段基因进行酶切连接后，共获得10个基因片段；

（4）将上述PCR获得的10个片段与pBD-initial载体酶切连接加入到JM109感受态细胞中进行转化培养，培养24h提取菌落质粒为模板进行酶切和序列测定鉴定。

（5）将MDRV 10个片段的阳性质粒按比例混合共转染单层293T细胞。37℃,5%CO2条件下，每天观察细胞病变情况。

（6）在293T细胞上传代到第15代后，细胞病变开始稳定，在接毒后第4天出现细胞圆缩现象；6天出现细胞拉网，脱落现象；第7天时可以收毒。重组病毒毒价为10^-5TCID₅₀/0.1mL。

在本发明中，为了保持基因组RNA的完整性和纯度，步骤（1）可采用TRIzol试剂提取RNA。市场上已有多种此类试剂盒在销售，具体的操作方法按照其说明书即可。为了保持质粒DNA的完整性和纯度，步骤（5）提取的质粒可采用质粒提取试剂盒进行提取。市场上已有多种此类试剂盒在销售，具体的操作方法按照其说明书即可。

在本发明中，PCR引物需满足如下要求：

1）S1-S4片段各设计一对简并引物，上游引物在起始核苷酸的下游区域设计，下游引物在末端核苷酸的上游区域设计，设计的引物能够对MDRV S基因片段全序列进行阳性扩增；

2）M1、M2、M3基因各分成2段进行扩增，分别设计两对引物。第一对上游引物在起始核苷酸的下游区域设计；第一对下游引物和第二对上游引物根据基因片段的一个酶切位点（M1为1542-1547 EcoRI、M2为921-926 EcoRV、M3为1067-1072 Bsp1407I）附近区域进行设计；第二对下游引物在末端核苷酸的上游区域设计。通过PCR扩增后将片段进行特异性酶切连接即可得到MDRV M基因片段全序列。

3）L1、L2、L3基因各分成3段进行扩增，分别设计三对引物。MDRV L1基因(3959bp)利用1424位NruI位点和 2795位AclI 位点将L1基因分成三段进行扩增，L2基因(3830bp)利用1441位SacI位点和 2719位HpaI 位点将L2基因分成三段进行扩增。L3基因(3907bp)利用1497位EcoRI位点和 2799位NaeI 位点将L3基因分成三段进行扩增。

4）设计PCR引物时按pBD-initial载体的要求，在上游引物5’端加上GCGCTAT七个碱基。

在本发明中，按pBD-initial载体的要求，步骤（2）采用具有3’→5’核酸外切酶活性的高保真酶做为针对MDRV全基因的DNA扩增酶。市场上已有多种此类3’→5’核酸外切酶活性的高保真PCR酶在销售，具体的操作方法按照其说明书即可。

在本发明中，为了提高回收和纯化速度，步骤（3）采用纯化回收试剂盒回收PCR产物。市场上已有多种此类试剂盒在销售，具体的操作方法按照其说明书即可。

在本发明中，为了提高长片段外源基因的连接效率，步骤（4）采用的pBD-initial载体可接纳长片段的DNA，在该载体上插入长片段的外源DNA时，不会破坏载体的自我复制性质。

在本发明中，JM109感受态细胞既可以从试剂公司购买，也可以采用本领域常见方法，例如氯化钙法制备。

在本发明中，为了保持质粒DNA的完整性和纯度，步骤（5）提取的质粒可采用质粒提取试剂盒进行提取。

在本发明中，还包括步骤（4）所得MDRV基因全序列进行同源性比对的步骤，用来验证所得序列的准确性。

在本发明中，为了提高质粒转染293T细胞，步骤（5）采用Lipofectamine2000脂质体作为转染试剂。

附图说明

图1：MDRV反向遗传系统技术路线

以提取MDRV 基因组RNA作为模板，用引物进行PCR扩增，得到相应的基因片段或分段的基因；回收和纯化上述PCR产物，将相应分段基因进行酶切连接后，共获得10个基因片段。获得的10个片段与pBD-initial载体酶切连接加入到感受态细胞。将MDRV 10个片段的阳性质粒按比例混合共转染单层293T细胞，获得重组病毒。

图2：MDRV重组毒致细胞病变图

重组病毒在293T细胞上传代15代后，细胞病变开始稳定，在接毒后第4天出现细胞圆缩现象，第6天出现细胞拉网，第7天出现脱落现象。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

步骤1、病毒分离株：

MDRV 福建代表株MW9710由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定和保存。

步骤2、病毒RNA提取：

MDRV基因组RNA由TRIzol试剂，具体操作步骤为：

a. 收集250 μL MDRV病毒培养液，转入1.5 mL 离心管中。

b. 加750 μL TRIzol，漩涡振荡混合均匀，静置5 min。

c. 加150 μL CHCl3，漩涡振荡混合均匀，静置5 min

d.12,000×g 离心10 min。将上清转移到新的2 mL 离心管中，加500 μL 异丙醇，上下倒置6-8 次，混合均匀。

e.12,000×g 离心10 min。弃上清，加1mL 无水乙醇，漩涡振荡混合均匀。

f.12,000×g 离心10 min。弃上清，加1mL 75%乙醇，漩涡振荡混合均匀。

g.12,000×g 离心10 min。弃上清，风干5min，去除多余乙醇。

h.加入无核酶水50μL溶解后，得到RNA。

步骤3、引物设计及PCR反应：

根据已发表的MDRV基因序列设计引物，具体扩增引物的序列如下表：

表1：MDRV S基因含sapI酶切位点引物设计

表2：MDRV M基因含sapI酶切位点引物设计

表3：MDRV L基因含sapI酶切位点引物设计

用MDRV基因组RNA为模板进行高保真PCR操作扩增,方法如下：

RT反应：体系为10μL。5×反转录反应缓冲液2μL；dNTPs(2.5mmol/L) 1μL；Random9mers(50pmol/μL) 0.5μL；RNA酶抑制剂(40U/μL) 0.5μL；AMV反转录酶(40U/μL) 0.5μL；RNA 1μL；用DEPC处理水调至总体积10μL。反应条件为：25℃ 10min，42℃ 60min，70℃5min，4℃结束反应。

PCR反应体系为50 μL体系（10 μL 5×PrimeSTAR GXL Buffer，上下游引物各1 μL，10μL的病毒RT反应液，4 μL的dNTP Mixture，2 μL PrimeSTAR GXL DNA Polymerase，22μL的ddH2O），反应条件为95℃预变性5min；35个循环（94℃，60s；54℃，60s；72℃，2min），最后72℃ 20min。

反应结束后将约有1300-1500 bp 的PCR 产物收集到一个EP 管中并切胶回收，将回收的基因片段克隆到质粒载体中，然后挑取阳性菌进行PCR 反应，产物送测序公司测序。

步骤4、PCR 产物的回收和纯化：

PCR 产物用OMEGA胶回收试剂盒纯化回收，具体操作步骤为：

a. 电泳足够时间后，在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来，并尽量去除多余的凝胶；

b. 称取空离心管的重量，切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量，求出凝胶块的重量，近似地确定其体积。加入等倍凝胶体积的Binding Buffer，把混合物置于55℃~65℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化，其间每隔2-3分钟混匀一次；

c. 转移700 μL的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBind DNA柱子，并把柱子装在一个干净的2mL收集管内，室温下10,000×g离心1min，弃去液体；

d. 将柱子重新套回收集管中，加300 μL Binding Buffer至HiBind DNA 柱子中，室温下10,000×g离心 1min，去弃滤出液；

e. 将柱子重新套回收集管中，加入700 μL SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下10,000×g离心1min，去弃滤出液；

f. 将柱子重新套回收集管中，重复加入700 μL SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下10,000×g离心1min，弃去滤出液，将空柱子重新套回收集管中，10,000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体；

g. 把柱子装在一个干净的1.5 mL离心管上,加入30~50 μL洗脱液或灭菌水上柱子膜上，10,000×g离心1min，离心管中的溶液就是纯化的DNA产物，保存于-20℃。

步骤5、克隆：

5.1 M基因和L基因的片段的连接：将M基因和L基因含有酶切位点的片段与相应的内切酶进行酶切，以上操作在冰上进行，稍离心混匀，37℃反应4h。反应结束后进行胶回收。回收后的片段按照基因排列顺序进行连接。具体操作体系为：

纯化回收后的PCR片段	30 μL
		T4 Ligation Solution	5 μL
T4 DNA Ligase	3 μL
		Sterile Water	12 μL
Total	50 μL

以上操作在冰上进行，稍离心混匀，16℃反应过夜。反应结束后进行胶回收。

5.2 酶切反应：含Sap位点的MDRV 10个片段用Sap内切酶进行酶切，操作体系为

以上操作在冰上进行，稍离心混匀，37℃反应4h。反应结束后进行胶回收。

5.3 目的片段与载体连接：将回收、检测后的10个目的片段与pBD-initial载体连接，操作连接体系为：

纯化回收后的PCR片段	30 μL
		Reaction buffer	5μL
Sap I	0.5 μL
		Sterile Water	14.5 μL
Total	50 μL

以上操作在冰上进行，稍离心混匀，16℃在PCR仪中连接过夜，-20℃保存备用。

5.4 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl2法）：

a. 将保存好的JM109 菌种划线接种于LB/Amp+琼脂平板上，37℃过夜培养16h-18h；

b. 从37°C过夜培养平皿内挑取一个直径约为2到3 mm的JM109单菌落。把这样的单菌落接种于一只装有5 mL LB肉汤的30 mL灭菌试管中，于37°C 200rpm振荡培养过夜；

c. 转移0.2 mL过夜培养物于一只装有15或20 mL LB的50 mL灭菌三角瓶中，于37°C 200rpm振荡摇菌培养至OD600=0.6；

d. 室温下，4000×g离心5 min收集对数期细胞。弃培养基，保留细胞沉淀；

e. 加入10 mL冰冷的CaCl2 溶液，并轻微打匀；

f.4°C下，4000×g离心10分钟min收集细胞；

g. 弃CaCl2 溶液，保留细胞沉淀；

h. 加入0.8 mL （每25 mL初始培养物加入1 mL）冰冷的0.1M的CaCl2 溶液，并轻微打匀，4℃在冰箱中放置过夜；

i. 按200 μL /份加入15％冰预冷甘油，混匀分装，-80℃冻存备用。

5.5 连接产物的转化：

a. 将10μL的连接产物加入到200 μL制备好的感受态细胞JM109中，混匀并冰浴30min；

b. 把转化管转移至放于42℃循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90s（此时不能摇动转化管）；

c. 把试管迅速转移至冰浴2到3 min；

d. 向每只试管中加入加入800 μL无抗生素的LB 液体培养基，37℃，200 r/min培养45 min；

e. 转移适量体积（如果使用90 mm平板，一半涂布量不应超过100 μL）的经转化处理的感受态细胞，涂布于已提前涂布了IPTG和X-gal并含有相应抗生素的LB/Amp+琼脂平板上，于37°C倒置平板培养过夜。

5.6 阳性菌落的筛选：

随机挑选菌落接种于LB/Amp+培养液中，培养至中等浓度后以菌液为模板，以目的基因PCR 扩增时的相同引物和反应条件进行菌液PCR扩增。扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增产物与目的片段大小一致的菌液0.5mL 装入1.5ml EP 离心管中，交送大连宝生物工程有限公司完成测序。

5.7 检验试验的正确性：

将测序结果在NCBI 上运用Blast 在线比对软件以验证序列的正确性和该方法的可靠性。结果表明该方法获得的MDRV MW9710株基因组序列的核苷酸序列与其他已在GenBank中登录的MDRV分离株全长序列的同源性为85％～99％。表明该方法能达到获得MDRV基因组的目的。

步骤6：重组病毒拯救

6.1 MDRV 10个转染质粒制备和浓度测定选取10个片段阳性菌落分别加入10mLLB-amp培养液中，200r/min，37℃过夜培养。利用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒DNA，溶解在200μL 蒸馏水。以蒸馏水作为空白，在260nm、280nm处调零紫外分光光度计。将提取的质粒DNA进行5倍稀释后测定OD260nm、OD280nm值，计算浓度。

6.2 病毒拯救将MDRV 10个片段质粒以1:1的比例混合共转染单层293T细胞。方法如下：混合质粒（10ug，每个转染质粒各1ug）和16uL Lipofectamine2000转染试剂分别溶于250uL OPTI-MEM I 无血清培养基中，室温静置5min后相互混合，室温放置20min。将6孔板中的细胞生长液吸弃，用不含血清和抗生素的D-Hanks缓冲液洗涤3次，然后在细胞孔中加入2mLOPTI-MEM I 无血清培养基。将质粒和Lipofectamine2000混合物均匀加入细胞孔中，于37℃,5%CO2培养箱中放置6h后换液。37℃,5%CO2培养箱中培养24h后加入含1ug/mLTPCK-胰酶的OPTI-MEM I 无血清培养基1mL。将36-48h后的转染上清经离心去除细胞碎片后接种于单层293T细胞。37℃,5%CO2条件下，每天观察细胞病变情况。

6.3 重组病毒细胞生长特性该重组病毒在293T细胞上传代5代后，均未出现细胞病变。当重组病毒传代6代后，在接毒后第6天出现细胞病变，表现为细胞圆缩，第7天出现细胞拉网，第8天出现脱落，现象收毒后继续传代。当重组病毒传代到第15代后，细胞病变开始稳定，在接毒后第4天出现细胞圆缩现象，第6天出现细胞拉网，脱落现象。第7天时可以收毒。通过对MDRV-rMS-A15(第15代传代毒)重组病毒TCID₅₀测定，其毒价为10^-5TCID₅₀/0.1mL。

本技术构建了MDRV反向遗传系统，为进一步研究水禽细小病毒基因组奠定了基础。

本发明设计的引物不会出现影响PCR 反应的发夹结构，引物二聚体，上下游引物交联。

Claims

1.一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法，其特征在于包括下述步骤：

（1）提取MDRV 基因组RNA；

（4）将步骤（3）获得的10个基因片段与pBD-initial载体酶切连接加入到JM109感受态细胞中进行转化培养，培养24h提取菌落质粒为模板进行酶切和序列测定鉴定；

（5）将MDRV 10个片段的阳性质粒按比例混合共转染单层293T细胞，37℃,5%CO₂条件下，每天观察细胞病变情况；

（6）在293T细胞上传代到第15代后，细胞病变开始稳定，在接毒后第4天出现细胞圆缩现象；6天出现细胞拉网，脱落现象；第7天时可以收毒；第15代传代毒MDRV-rMS-A15重组病毒毒价为10^-5TCID₅₀/0.1mL；

为了保持基因组RNA的完整性和纯度，步骤（1）可采用TRIzol试剂提取RNA；

步骤（4）提取的质粒可采用质粒提取试剂盒进行提取；

PCR引物需满足如下要求：

2）M1、M2、M3基因各分成2段进行扩增，分别设计两对引物；

第一对上游引物在起始核苷酸的下游区域设计；第一对下游引物和第二对上游引物根据基因片段的一个酶切位点附近区域进行设计：M1基因1542-1547位 EcoRI、M2基因921-926 位EcoRV、M3基因1067-1072位 Bsp1407I；第二对下游引物在末端核苷酸的上游区域设计；

通过PCR扩增后将片段进行特异性酶切连接即可得到MDRV M基因片段全序列；

3）L1、L2、L3基因各分成3段进行扩增，分别设计三对引物；

MDRV 3959bp 的L1基因利用1424位NruI酶切位点和 2795位AclI 位点将L1基因分成三段进行扩增；3830bp的L2基因利用1441位SacI酶切位点和 2719位HpaI 位点将L2基因分成三段进行扩增；

3907bp的L3基因利用1497位EcoRI酶切位点和 2799位NaeI 位点将L3基因分成三段进行扩增；

2.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，步骤（1）从含有MDRV细胞毒中提取病毒基因组RNA。

3. 根据权利要求2 所述的方法，其特征在于，采用TRIzol试剂提取病毒RNA。

4. 根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，步骤（2）采用高保真PCR。

5. 根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，步骤（3）采用纯化回收试剂盒回收PCR产物。

6. 根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，还包括将步骤（4）所得MDRV基因组全序列与其它MDRV分离株基因组全序列进行同源性比对验证的步骤。

7. 根据权利要求1 所述的方法，其特征在于步骤（4）采用的pBD-initial载体可接纳长片段的DNA，在该载体上插入长片段的外源DNA时，不会破坏载体的自我复制性质。