CN108220337A - 一种dna病毒重组体的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种DNA病毒重组体的构建方式，属于生物技术领域。本发明所述的DNA病毒重组体的构建方式，具体包括如下步骤：1）PCR分别扩增置换位点基因两侧翼1000‑2000bp的同源片段；2）以含GFP基因的质粒为模版扩增GFP荧光蛋白全基因序列；3）置换同源质粒的构建；4）GFP荧光病毒的构建；5）病毒重组体的构建。本发明通过In‑fusion技术大大简化了构建重组病毒的步骤，使得本发明的构建方法实现DNA重组病毒的快速构建，同时不引入其他的外源核酸片段。该方法适用于抗肿瘤基因病毒治疗，病毒学研究，病毒载体开发，以及疫苗研究等需要构建DNA病毒重组体的各种情况。

Description

一种DNA病毒重组体的构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种DNA病毒重组体的构建方式。

背景技术

双链DNA病毒包括腺病毒，痘病毒，疱疹病毒等，这些病毒在生物工程领域被广泛地应用。不管是抗肿瘤基因病毒治疗，病毒学研究，病毒载体开发，还是疫苗研究都经常需要构建病毒重组体。

目前DNA重组病毒的构建方法主要有两种。

一种是应用细菌人工染色体Bacterial Artificial Chromosome（BAC）系统，BAC是指一种以F质粒（F-plasmid）为基础建构而成的细菌克隆载体，常用来克隆150kb左右的DNA片段。典型的BAC载体有一个复制起点，BAC复制所必需的基因(如repE)，及控制复制速度的基因(如parB)。抗生素耐药性标记(如氯霉素)或其他可用于病毒BAC阳性菌落筛选的也必须包含在BAC载体中。用于病毒重组的BAC系统，还需要携带有att等重组相关序列，这样就可以在生成重组病毒时删除大部分的BAC载体序列。要构建BAC病毒，还需在BAC载体序列上插入2000bp与目的病毒同源的碱基对片段。为了分离BAC病毒，BAC载体也应该携带一个可选择的标记物(如GFP)。此外，为了在细菌体内实现同源交换，进行病毒重组体的构建，通常还需要导入可以表达DNA重组酶的辅助质粒。

病毒BAC构建的具体做法是在感染病毒的细胞内导入含有病毒核酸同源序列，att等重组相关核酸序列，及用于筛选的荧光蛋白序列的线性化BAC载体，通过同源交换获得含有BAC核酸序列的荧光病毒。在病毒核酸复制成环时，提取核酸，导入DH10β细菌中。在构建病毒重组体时，是先在细菌内完成病毒核酸的重组，再提取重组BAC病毒核酸，体外去除BAC序列后转染细胞获得重组病毒。而构建的病毒将依然携带有部分外源序列如基因重组过程中发挥重要作用的att序列。这些二百多bp的序列可能对邻近的病毒基因的转录表达造成影响，从而使病毒的毒力及致病性发生变化。商品化的腺病毒载体，杆状病毒载体多通过此类方法构建。像CMV疱疹病毒，痘病毒这样拥有更大基因组的病毒，往往需要删除一些非必须核酸序列来提高病毒BAC的成功率。

另一种重组病毒的构建方法主要是基于在感染细胞内病毒核酸的同源置换。外来核酸的插入有可能影响其他基因的转录，使用该方法可以达到不带入额外基因的情况下，对病毒基因组进行改造。疱疹病毒的同源重组是比较容易发生的，病毒基因ICP8，UL21参与了病毒的重组，这为通过同源构建重组病毒奠定了基础。本发明就是基于病毒的同源交换来构建重组病毒。该方法的另一个优点是不受重组位点的限制。荧光蛋白基因可以插在基因内，对于要置换的基因为必需基因的情况，可以将荧光蛋白基因插在置换基因的上游侧翼或下游侧翼，避开对基因转录的影响。

综上，可知现有技术的缺点：操作比较繁琐；应用BAC系统，牵涉到病毒BAC的构建，其方法繁琐且成功率低。重组病毒的获得，还需要再进行新的构建，筛选，转化。此外，不管是Gateway重组系统，还是Cre／loxP重组系统，其最终获得的病毒重组体都带有外源核酸序列。现有的通过同源交换构建重组病毒的方法，步骤也较为繁琐，多是应用内切酶等方法进行核酸的连接来构建用于基因重组的质粒，限制了核酸片段的自由组合。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的缺点与不足，提供一种DNA病毒重组体的构建方式。本发明的构建方法是实现DNA重组病毒的快速构建，同时不引入其他的外源核酸片段。该方法适用于抗肿瘤基因病毒治疗，病毒学研究，病毒载体开发，以及疫苗研究等需要构建DNA病毒重组体的各种情况。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种DNA病毒重组体的构建方式，具体包括如下步骤：

1）PCR分别扩增置换位点基因两侧翼1000-2000bp的同源片段；

提取DNA病毒核酸。设计引物对A和引物对B的两对引物分别扩增置换位点左侧翼a和右侧翼b同源片段；引物的设计为左侧翼a的上游引物含有质粒末端的15bp序列，右侧翼b的下游引物含有质粒另一个末端的15bp序列（图1）；

2）以含GFP基因的质粒pEGFP为模版扩增GFP荧光蛋白全基因序列，其中上下游引物分别含有左右侧翼末端的15bp（图1）；

3）置换同源质粒的构建

按In-fusion试剂说明书的要求将病毒基因同源的左侧翼a和右侧翼b的2个PCR扩增片段，GFP荧光蛋白全基因序列，线性化质粒pUC19（In－fusion试剂盒提供），及In-fusion试剂混合配制10微升反应体系，50℃孵育15min；所有需要连接的DNA片段在In-fusion试剂处理前，做DNA片段的纯化；经转化筛选获得包含同源片段及GFP片段的目的质粒pUC19－GFP－ab（图1左）；

4）GFP荧光病毒的构建

目的质粒pUC19-GFP-ab在转染细胞前需要用内切酶酶切进行线性化；用病毒多重感染度MOI 0.1感染细胞，孵育1小时后用Opti－MEM medium清洗细胞；加入线性化DNA和lipofetamine 2000的混合物（400 µl／6孔板），孵育2小时后，去除DNA混合物，加入含5%FBS的细胞培养基；病变细胞达到90%时，回收病毒上清液，将回收的病毒上清做适当稀释，感染平板内培养好的细胞，使直径9cm平板内病毒的个数为200-300个；病毒吸附1小时后除去病毒液，加入含有5%FBS，及1.5%甲基纤维素的细胞培养基；2-3天后，在荧光显微镜下，寻找发绿色荧光的病毒，用200微升枪头将发光病毒空斑及周围的细胞吸走，放入已准备好的1ml培养基中，－80℃保存；保存的含有荧光病毒的培养基经3次冻融之后，重新感染细胞，进行第2次的空斑纯化；经3次的空斑纯化可获得纯的GFP荧光病毒；

5）缺陷病毒重组体的构建

设计引物扩增病毒缺陷基因左侧翼a，上游引物含有质粒末端的15bp，下游引物含有右侧翼b的末端15bp序列；右侧翼b扩增所使用引物同步骤1）；将1000-2000bp长度的a和b片段通过in-fusion试剂连接并插入线性化载体pUC19中，构建pUC19－ab（图1右）；后续的操作同上；如果要在病毒基因组中插入外源序列，则同步骤1）和2）分别设计引物扩增外源片段，及左右侧翼同源片段a和b；同样通过in-fusion试剂将同源左侧翼a，外源基因，右侧翼b连接并插入载体pUC19中，转染感受态细菌；将获得的质粒同样线性化后，转染感染上述步骤4）获得的荧光GFP病毒的细胞中，转染步骤同步骤4）相同；90%细胞出现病变之后回收病毒上清液；同步骤4）中荧光病毒空斑纯化方法一样，此次依然在荧光显微镜底下进行非荧光空斑的纯化；在绿色荧光显微镜下，可见不发光的空斑，即为目的重组病毒。

步骤1）中所述的扩增置换位点上下游的左侧翼a和右侧翼b同源片段，具体包括以下步骤：

设计引物对A和引物对B的两对引物分别扩增置换位点左侧翼a和右侧翼b同源片段；左侧翼片段a的上游引物有15bp同待连接质粒相同的片段，右侧翼b片段的下游引物有15bp同待连接质粒相同的片段；两对引物的上下游引物的长度存在较大差异，引物Tm值也差异较大；在PCR扩增时可先以低于较低Tm值2-3℃先进行5个循环的扩增，之后再以较低Tm值进行30循环的扩增，获得同源序列。

步骤2）中以含GFP基因的质粒pEGFP为模版扩增GFP荧光蛋白全基因序列，具体包括以下步骤：

以pEGFP质粒为模版，PCR扩增的片段包括了启动子及开放阅读框（ORF）；扩增产物可用Dpn1 内切酶处理，除去模版质粒pEGFP；扩增的GFP基因将插入到置换基因左右双侧翼片段的中间；根据In-fusion试剂对引物的要求，扩增GFP基因引物的上下游都需要含有与置换基因左侧翼a同源片段3末端及右侧翼b同源片段5末端相同的15bp序列片段；扩增的引物包括置换用的相同序列的15bp，以及GFP扩增用的20bp；进行PCR扩增，可先低温45-50℃进行5次扩增，之后将退火温度调到低于引物Tm值2-4度进行30循环的扩增，获得GFP荧光蛋白全基因序列。

步骤3）中所述的转化筛选的具体步骤如下：将孵育产物经冰上冷却后加入感受态细菌DH5α，冰上孵育30分钟后，通过42℃热刺激转染到感受态细菌；再经过培养，筛选，测序获得包含同源片段及GFP片段的目的质粒pUC19－GFP－ab。

步骤3）中所述的DNA片段的纯化采用DNA片段纯化试剂进行纯化。

步骤4）中所述线性化，采用内切酶线性化，所采用的内切酶不能酶切插入的核酸序列。

步骤4）中所述转染细胞优选为二倍体细胞；因为比起传代细胞系，二倍体细胞更适用于构建重组病毒。

步骤4）中所述的病毒包括腺病毒，痘病毒，疱疹病毒等。

在做目的基因敲除时，步骤5）所述的外源基因可不添加。

在获得重组病毒之后，需要对目的重组病毒进行验证，二代测序的发展使对重组病毒的验证变得简单。以下介绍基于Spatz和Volkening(2009)的全基因提取发展而来的疱疹病毒以及其他DNA病毒的高效全病毒基因组提取方法。疱疹病毒以MOI 0.1接种细胞；当90%的细胞显示细胞病变效应(CPE)时，收集上清液，4000rpm离心30分钟沉淀细胞及大的细胞器；离心后的上清超速离心25000rpm，1h沉淀病毒颗粒；将病毒重悬于100 µl 的 nucleibuffer (10mM Tris-HCl/pH7.5, 2mM MgCl2 and 10% sucrose)，再加入等体积的2xnuclease buffer (40 mM PIPES, PH7.0, 7% sucrose, 20 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 10mM 2-mercaptoethanol and 200mM PMSF)，及各1 µl的micrococcal nuclease solution(300 units／1 µl) 和RNaseA (100mg/ml)，目的是降解游离的核酸。37℃孵育30分钟后，加入2.4 µl 0.5 M EDTA终止反应；然后加入400 µl的消化缓冲液（100 mM NaCl, 10 mMTris–HCl (pH 8.0), 25 mM EDTA (pH 8.0), 0.5% SDS）及2.5 µl蛋白酶K（20mg/ml），50℃孵育18小时。再用苯酚／氯仿萃取DNA，经乙醇沉淀后，DNA溶于适量的TE缓冲液；DNA溶液中加入MgCl₂（终浓度10mM）及聚乙二醇-8000（终浓度6.5%）进行病毒基因组DNA沉淀，去除小分子量的DNA碎片。最终将DNA溶于TE缓冲液并送去做全基因组二代测序。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明的构建方法能够快速地构建DNA病毒重组体，同时不在病毒基因组中插入额外的序列。病毒BAC系统的构建费时费力，在构建重组体时又需要多个步骤的基因操作。感染细胞内病毒核酸的同源交换，仅需要构建荧光病毒中间体，再通过第二次的同源交换即可获得目的重组病毒。同时，该方法还不受重组位点的限制，可灵活性地选择插入位点，最终重组的病毒不带入其他额外的核酸序列。荧光蛋白基因可以插在基因内，对于要置换的基因为必需基因的情况，可以将荧光蛋白基因插在置换基因的上游侧翼或下游侧翼，避开对基因转录的影响。虽然利用病毒同源交换获得重组病毒的技术早已存在，但是本发明应用in-fusion技术大大简化了构建重组病毒的步骤。本发明从准备用于构建重组病毒的质粒开始，到病毒的空斑纯化，以及最后的重组病毒核酸测序都做了详细介绍。本发明的主要有益效果概括在以下两个方面：

1. 使用BAC构建重组病毒，操作复杂，成功率低。同源交换可以更简单地构建重组病毒，同时还不带入非必要的外源核酸片段，避免了由非必要外源核酸序列引起的相邻基因转录和表达异常。

2． 目前不同DNA片段的链接还主要是通过内切酶的酶切及连接酶来实现的，操作较为复杂，In-fusion试剂可以快速简单地将几个DNA片段相连到质粒。

附图说明

图1是通过In-fusion分别连接a-b片段，及a-GFP-b片段；并将俩者分别与线性化质粒pUC19相连。

图2是本发明的同源交换构建重组病毒的原理图。

图3是本发明的同源交换构建疱疹重组病毒的培养实物图。

图4是本发明的实施方案技术路线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种DNA病毒重组体的构建方式，具体包括如下步骤：

1）PCR分别扩增置换位点基因左右侧约1000-2000bp的同源片段

病毒核酸的提取可以使用市贩的试剂从病毒上清液中提取DNA，设计两对引物分别扩增置换位点上下游约1000-2000bp长的同源片段；因为要使用In-fusion试剂将各个片段进行连接；故左侧翼a片段的上游引物有15bp同质粒相同的片段，右侧翼b片段的下游引物有15bp同质粒相同的片段；上下游引物的长度存在较大差异，引物Tm值也差异较大；在PCR时可先以低于较低Tm值的2-3℃先进行5个循环的扩增，之后再以接近较低Tm值进行30循环的扩增。

2）以质粒为模版扩增GFP荧光蛋白全基因序列

中间置换GFP绿色荧光基因的扩增可以以pEGFP质粒为模版，PCR扩增的片段包括了启动子及开放阅读框（ORF）；扩增产物可用Dpn1 内切酶处理，除去模版质粒pEGFP；扩增的GFP基因将插入到置换基因左右双侧翼片段的中间；根据In-fusion试剂对引物的要求，扩增GFP基因引物分别含有与左侧翼a片段3末端及右侧翼b片段5末端相同的15bp序列片段；扩增的引物包括置换用的相同序列的15bp，以及GFP扩增用的20bp；进行PCR扩增，可先低温45-50℃进行5次扩增，之后将退火温度调到低于引物Tm值2-3度进行30循环的扩增；

3）置换同源质粒的构建

按In-fusion试剂说明书的要求将病毒基因同源的左侧翼a和右侧翼b的2个PCR扩增片段，GFP扩增片段，以及In-fusion试剂盒提供的线性化质粒pUC19，及In-fusion试剂混合配制10微升反应体系，50℃孵育15min；所有需要连接的DNA片段在In-fusion试剂处理前，可用DNA片段纯化试剂（TaKaRa）做DNA片段的纯化；经冰上冷却后加入感受态细菌DH5α，冰上孵育30分钟后，通过42℃热刺激转染到感受态细菌；再经过培养，筛选，测序获得包含同源片段及GFP片段的目的质粒pUC19－GFP-ab（图1所示）。

4）GFP荧光病毒的构建

目的质粒pUC19－GFP-ab转染细胞前需要进行线性化；可用内切酶，但要用的内切酶不能酶切插入的核酸序列；比起传代细胞系，二倍体细胞更适用于构建重组病毒；以疱疹病毒为例，用疱疹病毒多重感染度MOI 0.1感染细胞，孵育1小时后用Opti－MEM medium清洗细胞；加入DNA和lipofetamine 2000的混合物（400微升／6孔板），孵育2小时后，去除DNA混合物，加入含5%FBS的细胞培养基；病变细胞达到90%时，回收病毒上清液，-80℃保存。将回收的病毒上清做适当稀释，感染平板内的细胞，使直径9cm平板内病毒的个数为200-300个；病毒吸附1小时后除去病毒液，加入含有5%FBS，及1.5%甲基纤维素的培养基；2-3天后，在荧光显微镜下，寻找发绿色荧光的病毒，用200微升枪头将发光病毒空斑及周围的细胞吸走，放入已准备好的不含FBS液体细胞培养基中，－80℃保存；保存的含有荧光病毒的培养基经3次冻融之后，重新感染细胞，进行第2次的空斑纯化；经3次的空斑纯化可获得纯的荧光病毒（图3所示）。

5）病毒重组体的构建

构建缺陷病毒，将要去除的基因的1000-2000bp 2个侧翼a和b片段通过In－fusion试剂连接（图1右）并插入载体pUC19中，构建pUC19－ab。引物的设计为左侧翼a的下游引物含有右侧翼b前端的15bp序列，或右侧翼b的上游引物含有左侧翼a后端的15bp序列。后续的操作同上。如果要在病毒基因组中插入外源序列，则扩增的外源片段上游引物含有与同源左侧翼a相同的15bp序列，下游引物含有与右侧翼b相同的15bp序列。同样通过in－fusion试剂将，同源左侧翼a，外源基因，右侧翼b连接并插入载体pUC19中，转染感受态细菌。将上述的质粒同样线性化后，转染感染上述荧光GFP病毒的细胞中，做法同上。90%细胞出现病变之后回收病毒上清液。同上述荧光病毒空斑纯化方法一样，这次依然在荧光显微镜底下进行非荧光空斑的纯化。在绿色荧光显微镜下，可见不发光的空斑，即为目的重组病毒。

获得重组病毒之后，需要对目的重组病毒进行验证，二代测序的发展使对重组病毒的验证变得简单。以下介绍基于Spatz和Volkening(2009)的全基因提取发展而来的疱疹病毒以及其他DNA病毒的高效全病毒基因组提取方法。病毒以MOI 0.1接种细胞；当90%的细胞显示细胞病变效应(CPE)时，收集上清液，4000rpm离心30分钟沉淀细胞及大的细胞器；离心后的上清超速离心25000rpm，1h沉淀病毒颗粒；将病毒重悬于100 µl 的 nuclei buffer(10mM Tris-HCl/pH7.5, 2mM MgCl2 and 10% sucrose)，再加入等体积的2x nucleasebuffer (40 mM PIPES, PH7.0, 7% sucrose, 20 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 10 mM 2-mercaptoethanol and 200mM PMSF)，及各1 µl的micrococcal nuclease solution(300units／1 µl) 和RNaseA (100mg/ml)，目的是降解游离的核酸。37℃孵育30分钟后，加入2.4µl 0.5 M EDTA终止反应；然后加入400 µl的消化缓冲液（100 mM NaCl, 10 mM Tris–HCl(pH 8.0), 25 mM EDTA (pH 8.0), 0.5% SDS）及2.5 µl蛋白酶K（20mg/ml），50℃孵育18小时。再用苯酚／氯仿萃取DNA，经乙醇沉淀后，DNA溶于适量的TE缓冲液；DNA溶液中加入MgCl₂（终浓度10mM）及聚乙二醇-8000（终浓度6.5%）进行DNA沉淀，最终将DNA溶于TE缓冲液并送去做全基因组二代测序。

本发明的同源交换构建重组病毒的原理图如图2所示。

上述实施方案技术路线图如图4所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种DNA病毒重组体的构建方式，其特征在于，具体包括如下步骤：

1）PCR分别扩增置换位点基因两侧翼1000-2000bp的同源片段；

提取DNA病毒核酸，设计引物对A和引物对B的两对引物分别扩增置换位点上下游的左侧翼a和右侧翼b同源片段；引物的设计为左侧翼a的上游引物含有质粒末端的15bp序列，右侧翼b的下游引物含有质粒另一个末端的15bp序列；

2）以含GFP基因的质粒pEGFP为模版扩增GFP荧光蛋白全基因序列；其中上下游引物分别含有左右侧翼末端的15bp；

3）置换同源质粒的构建

按In-fusion试剂说明书的要求将病毒基因同源的左侧翼a和右侧翼b的2个PCR扩增片段，GFP荧光蛋白全基因序列，线性化质粒pUC19，及In-fusion试剂混合配制10微升反应体系，50℃孵育15min；所有需要连接的DNA片段在In-fusion试剂处理前，需要做DNA片段的纯化；经转化筛选获得包含同源片段及GFP片段的目的质粒pUC19-GFP-ab；

4）GFP荧光病毒的构建

目的质粒pUC19-GFP-ab在转染细胞前需要用内切酶酶切进行线性化；用病毒多重感染度MOI 0.1感染细胞，孵育1小时后用Opti-MEM medium清洗细胞；加入线性化pUC19-GFP-abDNA和lipofetamine 2000的混合物，孵育2小时后，去除DNA混合物，加入含5%FBS的细胞培养基；病变细胞达到90%时，回收病毒上清液，将回收的病毒上清做适当稀释，感染平板内培养好的细胞，使直径9cm平板内病毒的个数为200-300个；病毒吸附1小时后除去病毒液，加入含有5%FBS，及1.5%甲基纤维素的细胞培养基；2-3天后，在荧光显微镜下，寻找发绿色荧光的病毒，用200微升枪头将发光病毒空斑及周围的细胞吸走，放入已准备好的1ml培养基中，-80℃保存；保存的含有荧光病毒的培养基经3次冻融之后，重新感染细胞，进行第2次的空斑纯化；经3次的空斑纯化可获得纯的GFP荧光病毒；

5）缺陷病毒重组体的构建

设计引物扩增病毒缺陷基因左侧翼a，上游引物含有质粒末端的15bp，下游引物含有右侧翼b的末端15bp序列；右侧翼b扩增所使用引物同步骤1）；将1000-2000bp长度的a和b片段通过in-fusion试剂连接并插入线性化载体pUC19中，构建pUC19-ab；后续的操作同上；如果要在病毒基因组中插入外源序列，则同步骤1）和2）分别设计引物扩增外源片段，及左右侧翼同源片段a和b；同样通过in-fusion试剂将同源左侧翼a，外源基因，右侧翼b连接并插入载体pUC19中，转染感受态细菌；将获得的质粒同样线性化后，转染感染上述步骤4）获得的荧光GFP病毒的细胞中，转染步骤同步骤4）相同；90%细胞出现病变之后回收病毒上清液；同步骤4）中荧光病毒空斑纯化方法一样，此次依然在荧光显微镜底下进行非荧光空斑的纯化；在绿色荧光显微镜下，可见不发光的空斑，即为目的重组病毒。

2.根据权利要求1所述的DNA病毒重组体的构建方式，其特征在于：步骤1）中所述的扩增置换位点上下游的左侧翼a和右侧翼b同源片段，具体包括以下步骤：

设计引物对A和引物对B的两对引物分别扩增置换位点的左侧翼a和右侧翼b同源片段；左侧翼片段a的上游引物有15bp同待连接质粒相同的片段，右侧翼b片段的下游引物有15bp同待连接质粒相同的片段；两对引物的上下游引物的长度存在较大差异，引物Tm值也差异较大；在PCR扩增时可先以低于较低Tm值2-3℃先进行5个循环的扩增，之后再以较低Tm值进行30循环的扩增，获得同源序列。

3.根据权利要求1所述的DNA病毒重组体的构建方式，其特征在于：步骤2）中以含GFP基因的质粒pEGFP为模版扩增GFP荧光蛋白全基因序列，具体包括以下步骤：

以pEGFP质粒为模版，PCR扩增的片段包括了启动子及开放阅读框；扩增产物可用Dpn1内切酶处理，除去模版环状质粒pEGFP；扩增的GFP基因将插入到置换基因左右双侧翼片段的中间；根据In-fusion试剂对引物的要求，扩增GFP基因引物的上下游都需要含有与置换基因左侧翼a同源片段3末端及右侧翼b同源片段5末端相同的15bp序列片段；扩增的引物包括置换用的相同序列的15bp，以及GFP扩增用的20bp；进行PCR扩增，可先低温45-50℃进行5次扩增，之后将退火温度调到低于引物Tm值2-3度进行30循环的扩增，获得GFP荧光蛋白全基因序列。

4.根据权利要求1所述的DNA病毒重组体的构建方式，其特征在于：步骤3）中所述的转化筛选的具体步骤如下：用In-fusion试剂将置换基因同源的左侧翼a和右侧翼b扩增片段，GFP全基因片段，以及线性化的质粒pUC19，50℃孵育15min进行连接；将孵育产物经冰上冷却后加入感受态细菌DH5α，冰上孵育30分钟后，通过42℃热刺激转染到感受态细菌；再经过培养，筛选，测序获得包含同源片段及GFP片段的目的质粒pUC19-GFP-ab。

5.根据权利要求1所述的DNA病毒重组体的构建方式，其特征在于：步骤3）中所述的DNA片段的纯化采用DNA片段纯化试剂进行纯化。

6.根据权利要求1所述的DNA病毒重组体的构建方式，其特征在于：步骤4）中所述线性化，采用内切酶线性化，所采用的内切酶不能酶切插入的核酸序列。

7.根据权利要求1所述的DNA病毒重组体的构建方式，其特征在于：步骤4）中所述转染细胞为二倍体细胞。

8.根据权利要求1所述的DNA病毒重组体的构建方式，其特征在于：步骤4）中所述的病毒包括腺病毒，痘病毒或疱疹病毒中的一种。

9.根据权利要求1所述的DNA病毒重组体的构建方式，其特征在于：在做目的基因敲除时，步骤5）所述的外源基因可不添加。