CN111100845A - 一种重组麻疹病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组麻疹病毒及其制备方法和应用，属于反向遗传学应用领域。所述重组麻疹病毒，以麻疹病毒为载体，在N基因5’端前的非编码区或P基因与M基因之间的非编码区或H基因与L基因之间的非编码区插入有目的基因，所述目的基因为绿色荧光蛋白基因。将目的基因的开放阅读框插入S191麻疹病毒全长转录载体三个不同的位置，获得三个表达目的蛋白的重组质粒，转染细胞，拯救获得重组麻疹病毒株。该病毒株可高效表达外源基因，且拯救效率高，稳定性好，可用于改善麻疹疫苗的制备以及为携带其他病毒抗原蛋白基因的重组麻疹病毒疫苗提供插入位点的参考，如荧光蛋白的表达有利于观察病毒疫苗株的感染进程，在溶瘤治疗方面具有广泛应用价值。

Description

一种重组麻疹病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及反向遗传学应用领域，具体涉及一种重组麻疹病毒及其制备方法和应用。
背景技术
麻疹病毒(Measles Virus，MV)是单股负链RNA病毒，分类上属于副粘液病毒科麻疹病毒属，麻疹病毒为球形或丝形，直径约120nm-250nm，核心为单负链RNA，不分节段，基因组全长约16kb，基因组有N、P、M、F、H、L 6个基因，分别编码6个结构和功能蛋白：核蛋白(nucleoprotein，NP)、磷酸化蛋白(phosphoprotein，P)、M蛋白(membrane protein，M)、融合蛋白(fusion protein，F)、血凝素蛋白(hemagglutinin，H)和依赖RNA的RNA聚合酶(large polymerase，L)。其引起的疾病麻疹(Measles)是一种严重威胁公众健康的急性传染病，其传染性极强，但尚无特异性治疗药物，预防性接种疫苗是控制该病的关键。
WHO使用麻疹减毒活疫苗来消除麻疹，因为麻疹减毒活疫苗不仅能够有效复制，而且具有安全性和长效保护性，而且疫苗的制备工艺也已成熟建立。另外，运用反向遗传学构建的重组麻疹病毒可以表达不同的的抗原。体内实验研究表明表达外源基因的重组麻疹病毒疫苗引起的免疫反应可以对抗载体和插入的外源性抗原，并且之前注射过麻疹疫苗的动物在注射重组麻疹病毒疫苗之后仍然可以产生对抗外源性抗原的免疫反应。因此选择麻疹减毒活疫苗作为载体疫苗具有强大的优势。
目前麻疹病毒载体疫苗不仅用于预防病毒的感染，还用于癌症的治疗。癌症是发达国家和欠发达国家人口死亡的主要原因，是世界各国经济社会发展的巨大负担。根据WHO报道，2012年世界范围内有1400万癌症新发病例和820万癌症死亡病例。在未来20年中每年癌症新发病例将会升至1300万例。因此，研究出有效治疗肿瘤的方法显得刻不容缓。溶瘤的病毒治疗药物已经成为癌症治疗的重要方法之一。溶瘤病毒是一种倾向于感染并消灭癌症细胞的病毒。当感染麻疹病毒的癌症细胞由于溶瘤的作用死亡后，会释放出新的具有感染性的病毒分子从帮助消灭剩余的癌症细胞。溶瘤病毒不仅可以直接消灭肿瘤细胞，还可以刺激宿主体内抗肿瘤免疫反应。目前很多病毒包括腺病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、单纯性疱疹病毒、新城疫病毒以及牛痘病毒作为溶瘤药物已进入临床试验阶段。麻疹病毒是目前研究最热门的溶瘤病毒之一。
除了具有上述溶瘤病毒的特点之外，麻疹病毒还具有基因组稳定、安全有效等理想的溶瘤病毒所应具备的特点。随着反向遗传学技术的发展，科学家现在可以将外源性基因或治疗基因导入病毒基因组等技术从而使其易于检测并增强其抗肿瘤效应。使用携带荧光蛋白基因序列的麻疹病毒可以无创性地监测病毒在体内的复制和活性。在临床中表达荧光蛋白的麻疹病毒可以为合适的给药剂量和重复治疗周期的时间间隔提供信息。
目前，我们国内使用的主要是“沪191”(S191)麻疹病毒疫苗株，自使用以来，儿童麻疹的发病率显著下降，且实验表明“沪191”株能在鸡胚成纤维细胞中稳定连续传代35代，感染宿主细胞后仅在胞质中完成复制，这恰恰说明了该疫苗株具有良好的免疫原性、遗传稳定性和安全性。但在国内以“沪191”麻疹病毒疫苗株为载体的溶瘤麻疹疫苗仍旧滞后，因此是否能够构建出有效表达外源基因的新型“沪191”重组麻疹病毒仍是我们目前需要解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组麻疹病毒，为外源基因提供可插入位点，同时保证麻疹病毒的活性和免疫原性等特性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种重组麻疹病毒，以麻疹病毒为载体，在所述麻疹病毒的N基因5’端前的非编码区或P基因与M基因之间的非编码区或H基因与L基因之间的非编码区插入有目的基因。
本发明研究表明，在上述的三个位点中插入外源基因，不仅可以高效表达外源基因，而且不影响麻疹病毒本身具备的特性，重组麻疹病毒疫苗株拯救效率高且稳定。
作为优选，所述麻疹病毒来自于S191麻疹病毒疫苗株，其基因登录号为：FJ416067.1。
作为优选，所述目的基因插入的位点为第88位、或第3378位、或第10746位。
作为优选，所述目的基因的长度为700-800bp。
作为优选，所述目的基因为编码绿色荧光蛋白的EGFP基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
本发明成功构建了表达绿色荧光蛋白的重组麻疹病毒，EGFP基因分别位于沪191麻疹病毒疫苗株N基因前端的非编码区域、P基因与M基因之间的非编码区域、H基因与L基因之间的非编码区域。构建获得的三种重组麻疹病毒，能够很好地显示病毒感染细胞状况，无创性地监测病毒在体内的复制和活性，也可以为合适的给药剂量和重复治疗周期的时间间隔提供信息。
本发明的另一个目的是提供一种构建所述重组麻疹病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)设计引物，以含有目的基因A的质粒为模板，利用PCR扩增出含有目的基因A的DNA片段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，所述DNA片段Ⅰ中携带麻疹病毒N基因前端非编码区的部分碱基，所述DNA片段Ⅱ中携带麻疹病毒P基因与M基因之间非编码区的部分碱基，所述DNA片段Ⅲ中携带麻疹病毒H基因与L基因之间非编码区的部分碱基；
(2)以质粒pBlunt-MV-N、pBlunt-MV-P、pBlunt-MV-H为模板，利用PCR扩增获得线性化载体pBlunt-MV-N-1、pBlunt-MV-P-1、pBlunt-MV-H-1；
(3)将所述的DNA片段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别与线性化载体pBlunt-MV-N-1、pBlunt-MV-P-1、pBlunt-MV-H-1进行无缝克隆获得中间质粒pBlunt-MV-A-N、pBlunt-MV-P-A、pBlunt-MV-H-A；
(4)以所述中间质粒为模板，利用PCR技术扩增出DNA片段MV-A-N、MV-P-A、MV-H-A；
(5)设计引物，以质粒pBlunt-MV-N、pBlunt-MV-P、pBlunt-MV-M1、pBlunt-MV-M2、pBlunt-MV-F、pBlunt-MV-H、pBlunt-MV-L1、pBlunt-MV-L2为模板，利用PCR扩增出DNA片段MV-N、MV-P、MV-M1、MV-M2、MV-F、MV-H、MV-L1、MV-L2；
(6)将(4)中所述的DNA片段MV-A-N替代(5)中相应的DNA片段MV-N，并与(5)中其他的7个DNA片段利用多片段无缝克隆技术连入pYES-2载体中，构建得到含有重组麻疹病毒全长基因组的重组质粒，获得所述重组质粒命名为pYES-MV-A-N；同理，将MV-P-A替代MV-P，重组获得重组质粒pYES-MV-P-A，将MV-H-A替代MV-H，重组获得重组质粒pYES-MV-H-A；
(7)将所述重组质粒转染细胞，培养、收集培养基及细胞混合物，反复冻融，拯救获得重组麻疹病毒。
步骤(2)和步骤(5)中，质粒pBlunt-MV-N、pBlunt-MV-P、pBlunt-MV-M1、pBlunt-MV-M2、pBlunt-MV-F、pBlunt-MV-H、pBlunt-MV-L1、pBlunt-MV-L2为申请号为201711263696.7的专利文献公开。
其中N、P、H为麻疹病毒全长基因组中3个基因片段，pBlunt为pEASY-BluntCloning Kit试剂盒提供的线性载体；扩增获得的DNA片段中N、P、M1、M2、F、H、L1以及L2为麻疹病毒全长基因组中的8个基因片段。
作为优选，DNA片段Ⅰ的3’端含有GS和GE序列，所述DNA片段Ⅱ、Ⅲ的3’端含有GE和GS序列，GS和GE序列是荧光蛋白表达所必需的序列，且插入的位置不同，GE和GS的顺序会有所不同。
作为优选，步骤(4)中，利用辅助质粒与所述重组质粒共转染细胞。所述的辅助质粒为pT7CFE1-CMyc-MV-N、pT7CFE1-CMyc-MV-P、pT7CFE1-CMyc-MV-L，辅助质粒能够表达麻疹病毒N、P、L蛋白，是形成麻疹病毒感染性的基本单位--核糖核蛋白体(RNP)不可缺少的条件。
步骤(7)中，转染细胞采用工具细胞BHK-SR19-T7，将辅助质粒和重组质粒共转染到工具细胞中，培养，再将细胞与上清混合物加到Vero细胞中，传代，纯化拯救获得重组麻疹病毒疫苗株。
本发明的另一个目的是提供所述的重组麻疹病毒在制备麻疹病毒疫苗株、溶瘤药物中的应用。
本发明具备的有益效果：
本发明在麻疹病毒基因组N前段、P和M基因以及H和L之间的非编码区域插入外源基因，制得的重组麻疹病毒可高效表达外源基因，且拯救效率高，稳定性好，可用于改善麻疹疫苗的制备以及为携带其他病毒抗原蛋白基因的重组麻疹病毒疫苗提供插入位点的参考。如荧光蛋白的表达有利于观察病毒疫苗株的感染进程，在溶瘤治疗方面具有广泛应用价值。
附图说明
图1为实施例1中携带目的片段的中间质粒图谱。
图2-a、2-b、2-c分别为实施例1中重组麻疹病毒疫苗株pYES-MV-EGFP-N、pYES-MV-P-EGFP、pYES-MV-H-EGFP的全长质粒图谱。
图3-a、3-b、3-c分别为实施例1中为重组麻疹病毒疫苗株pYES-MV-EGFP-N、pYES-MV-P-EGFP、pYES-MV-H-EGFP的全长基因组质粒琼脂糖凝胶电泳验证结果图。
图4为实施例1中各个重组麻疹病毒疫苗株拯救过程示意图，以重组麻疹病毒疫苗株pYES-MV-EGFP-N为例。
图5为实施例1中用电子显微镜观察到的重组麻疹病毒疫苗株pYES-MV-EGFP-N、pYES-MV-P-EGFP、pYES-MV-H-EGFP的细胞病变图。
图6为实施例1中荧光显微镜观察到的重组麻疹病毒疫苗株pYES-MV-EGFP-N、pYES-MV-P-EGFP、pYES-MV-H-EGFP的荧光图。
图7为实施例3中重组麻疹病毒疫苗株pYES-MV-EGFP-N、pYES-MV-P-EGFP、pYES-MV-H-EGFP噬斑大小结果测定图。
图8为实施例中重组麻疹病毒疫苗株pYES-MV-EGFP-N、pYES-MV-P-EGFP、pYES-MV-H-EGFP荧光表达曲线结果图。
具体实施方式
以下将通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不对其内容进行限定。
1、材料
(1)质粒、细胞和病毒
构建全长cDNA克隆的所用pYES-2载体购于Invitrogen。
“沪191”麻疹病毒疫苗株由浙江省疾病预防控制中心提供，GenBank:FJ416067.1。麻疹病毒全基因组由N、P、M、F、H、L 6个基因组成，能表达核蛋白(N蛋白)、磷酸化蛋白(P蛋白)、基质蛋白(M蛋白)、融合蛋白(F蛋白)、血凝素蛋白(H蛋白)和依赖RNA的RNA聚合酶(L蛋白)；其中P基因还编码2个非结构蛋白C蛋白和V蛋白。
Vero细胞来源于美国ATCC，BHK-SR19-T7为本实验室保存，用含10％胎牛血清的DMEM培养液并置于37℃，5％CO2培养箱中培养，用0.25％胰酶溶液(含EDTA)消化后传代。
(2)主要试剂
RNA抽提试剂盒、质粒抽提试剂盒以及胶回收试剂盒皆购自Qiagen公司。
细胞裂解液(TRIzolTM Reagent)逆转录酶(
Figure BDA0001841528000000052
III)，胎牛血清、细胞培养基(DMEM)以及转染试剂(LipofectamineTM 2000Transfection Reagent)均来自ThermolFisher公司。
随机引物(Random Primer Mix)，PCR高保真酶(
Figure BDA0001841528000000053
High-Fidelity 2×MasterMix)、限制性内切酶购自New England Biolabs。
pEASY-Blunt Cloning Kit、pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly kit、大肠杆菌感受态(Trans10Chemically Competent Cell)、Trans2K Plus DNA Marker来源于全式金公司，
氨苄青霉素购自索来宝公司，实验用引物均由华大基因公司合成。
实施例1
1、获取含有目的基因的DNA片段
于上海华大基因组合成EGFP的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，设计引物，以含有目的基因的质粒为模板，利用Q5保真酶PCR扩增出含有目的基因的DNA片段Ⅰ-Ⅲ，其中DNA片段Ⅰ3’,5’端碱基序列与麻疹病毒插入位点第88位两边碱基序列有部分碱基序列重叠，其中DNA片段Ⅱ3’,5’端序列与与麻疹病毒插入位点第3378位两边碱基序列有部分碱基序列重叠，其中DNA片段3’,5’端碱基序列与与麻疹病毒插入位点第10746位两边碱基序列有部分碱基序列重叠。反应程序为：98℃预变性40s，98℃变性8s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃延伸2min。引物序列如表1所示。
表1
Figure BDA0001841528000000051
2、构建中间质粒pBlunt-MV-EGFP-N、pBlunt-MV-P-EGFP、pBlunt-MV-H-EGFP
(1)设计引物，以实验室原有的3个质粒pBlunt-MV-N、pBlunt-MV-P、pBlunt-MV-H为模板，利用PCR扩增出包含质粒所有序列的3个DNA片段pBlunt-MV-N-1、pBlunt-MV-P-1、pBlunt-MV-H-1，其中N、P、H为麻疹病毒全长基因组中3个基因片段，其中pBlunt为pEASY-Blunt Cloning Kit试剂盒提供的线性载体。反应程序为：98℃预变性40s，98℃变性8s，58℃退火30s，72℃延伸3min，35个循环后，72℃延伸2min。引物序列如表2所示。
表2
Figure BDA0001841528000000061
(2)将DNA片段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别与DNA片段pBlunt-MV-N-1、pBlunt-MV-P-1、pBlunt-MV-H-1利用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly kit试剂盒进行无缝克隆连接获得中间质粒pBlunt-MV-EGFP-N、pBlunt-MV-P-EGFP、pBlunt-MV-H-EGFP，经测序鉴定正确，构建示意图如图1所示。
3、构建携带EGFP基因的重组麻疹病毒疫苗株pYES-MV-EGFP-N、pYES-MV-P-EGFP、pYES-MV-H-EGFP的全长质粒
(1)设计引物，以实验室原有的8个质粒pBlunt-MV-N、pBlunt-MV-P、pBlunt-MV-M1、pBlunt-MV-M2、pBlunt-MV-F、pBlunt-MV-H、pBlunt-MV-L1、pBlunt-MV-L2为模板，利用Q5保真酶PCR扩增出DNA片段MV-N、MV-P、MV-M1、MV-M2、MV-F、MV-H、MV-L1、MV-L2，其中8个DNA片段中N、P、M1、M2、F、H、L1以及L2为麻疹病毒全长基因组中的8个基因片段。反应程序为：98℃预变性40s，98℃变性8s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸2min。引物序列如表3所示。
表3
Figure BDA0001841528000000062
Figure BDA0001841528000000071
(2)设计引物，以所述中间质粒为模板，利用PCR技术扩增出DNA片段MV-EGFP-N、MV-P-EGFP、MV-H-EGFP，引物序列如表4所示。
表4
Figure BDA0001841528000000072
(3)使用GeneArtTMSeamless Cloning and Assembly Kit试剂盒将DNA片段MV-EGFP-N、MV-P-EGFP、MV-H-EGFP分别替代相应的DNA片段MV-N、MV-P、MV-H，并与(1)中所述剩余的7个DNA片段利用多片段无缝克隆技术连入pYES-2载体中，构建得到含有重组麻疹病毒全长基因组的重组质粒，获得所述重组质粒分别命名为pYES-MV-EGFP-N、pYES-MV-P-EGFP、pYES-MV-H-EGFP，重组质粒示意图谱分别如2-a、2-b、2-c所示，重组质粒琼脂糖凝胶电泳图分别如3-a、3-b、3-c所示。
4、拯救步骤3中构建成功的表达EGFP的重组麻疹病毒疫苗株
利用实验室原有的拯救系统对构建成功的重组麻疹病毒疫苗株pYES-MV-EGFP-N、pYES-MV-P-EGFP、pYES-MV-H-EGFP进行拯救，如图4所示。拯救需要实验室原有的辅助质粒pT7CFE1-CMyc-MV-N、pT7CFE1-CMyc-MV-P、pT7CFE1-CMyc-MV-L。
(1)病毒拯救：当工具细胞BHK-SR19-T7的密度达到60％-75％时，分别取重组麻疹病毒质粒pYES-MV-EGFP-N、pYES-MV-P-EGFP、pYES-MV-H-EGFP 5ug，与其辅助质粒pT7CFE1-N 1.5ug、pT7CFE1-P 1.5ug和pT7CFE1-L 0.5ug共转染到BHK-SR19-T7细胞中，37℃培养3天后，用刮下细胞，将细胞与上清混合物加到提前备好的70％-80％的Vero细胞中，4小时后换液，每日观察细胞病变效应。
(2)检测：
1)细胞病变的观察：共培养24小时后Vero细胞开始出现细胞病变效应(CPE)，如图5所示，典型的合胞体样病变；
2)蛋白荧光的检测：利用荧光显微镜观察时，携带EGFP的重组麻疹病毒疫苗株还能在合胞体病变中观察到相应的绿色荧光，如图6所示
3)RT-PCR检测：病毒连续传10代，每隔两代收集一次病毒，并按照TRIzolTMReagent细胞裂解液说明书提RNA，测序检测荧光蛋白基因片段是否插入到正确位点以及碱基序列是否正确。
(3)拯救效率
将上述拯救方法三个麻疹病毒各10次，10组实验均可观察到细胞病变效应，其中重组麻疹病毒的10次实验均可观察到荧光，说明重组麻疹病毒疫苗株拯救效率高且稳定，详见下表5：
表5
实验 pT7-MV<sub>191</sub>-EGFP pT7-MV-N pT7-MV-P pT7-MV-L 结果
1 5μg 1.5μg 1.5μg 0.5μg 成功
2 5μg 1.5μg 1.5μg 0.5μg 成功
3 5μg 1.5μg 1.5μg 0.5μg 成功
4 5μg 1.5μg 1.5μg 0.5μg 成功
5 5μg 1.5μg 1.5μg 0.5μg 成功
6 5μg 1.5μg 1.5μg 0.5μg 成功
7 5μg 1.5μg 1.5μg 0.5μg 成功
8 5μg 1.5μg 1.5μg 0.5μg 成功
9 5μg 1.5μg 1.5μg 0.5μg 成功
10 5μg 1.5μg 1.5μg 0.5μg 成功
综上所述，本发明构建了携带EGFP的重组麻疹病毒疫苗株，并且拯救效率高，稳定性好，可用于改善麻疹疫苗的制备以及为携带其他病毒抗原蛋白基因的重组麻疹病毒疫苗提供插入位点的参考。
实施例2
制备、扩增、纯化、储存实施例1拯救出来的表达EGFP重组麻疹病毒疫苗株
观察到Vero细胞出现明显的麻疹导致的特异细胞病变，将细胞培养瓶置于-80℃超低温冰箱反复冻融3次，将冻融后的细胞培养瓶置于低温高速离心机3000g离心10-15分钟后，收集细胞裂解液的上清，取一部分继续感染长满培养瓶的Vero细胞继续传代，一部分上清冻存于负80度超低温冰箱储存备用。
实施例3
重组麻疹病毒疫苗株噬斑大小的测定
将重组麻疹病毒疫苗株与实验室原有亲本麻疹病毒减毒疫苗株pYES-MV-S191接种在6孔中的单层Vero细胞后，加入含有5％FBS，1％低熔点琼脂糖的MEM中，37℃培养6天后用5％(W/V)结晶紫染色。pYES-MV-EGFP-N、pYES-MV-P-EGFP疫苗株在琼脂上形成的噬斑明显的小于亲本麻疹病毒减毒疫苗株所形成的噬斑，pYES-MV-H-EGFP形成的噬斑与亲本麻疹病毒减毒疫苗株的噬斑大小相似，结果如图7所示。
实施例4
表达EGFP重组麻疹病毒疫苗株荧光表达曲线的绘制
以MOI＝0.1的表达EGFP的重组麻疹病毒疫苗株感染铺满6孔板的Vero细胞，用病毒噬斑实验来滴定病毒滴度，利用酶标仪检测不同时间点病毒的荧光表达量并绘制病毒荧光表达曲线。病毒荧光表达曲线结果如图8所示，亲本pYES-MV-S191未检测到荧光表达，疫苗株pYES-MV-EGFP-N检测到的荧光表达量最高，其次是疫苗株pYES-MV-P-EGFP，而疫苗株pYES-MV-H-EGFP检测到的荧光表达量最低。这与麻疹病毒基因组中不同位置的基因表达量不同有关，越靠近3’端基因表达量越高。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种重组麻疹病毒及其制备方法和应用
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720
tga 723
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctattatcag ggacaagaga tggtgagcaa gggcgaggag 40
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcggatatc cctaatcctg gtggacctgg ttcctaag 38
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catgccagtc gacccaacta gcctaccctc catcattgtt 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ataatggatt taggttgtat caggacttgt acagctcgtc 40
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acatcaggca tacccactag cctaccctcc atcattgt 38
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
attctgatgt ctatttcaca tcaggacttg tacagctcgt c 41
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caggattagg gatatccgag 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcttgtccc tgataatag 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tacaacctaa atccattat 19
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctagttgggt cgactggcat g 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgtgaaatag acatcagaat 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctagtgggta tgcctgatgt 20
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
accaaacaaa gttgggtaag gata 24
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggtaggcgga tgttgttctg 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cttctagact aggtgcga 18
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaacttggga ggcaatcact t 21
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccaactagta caacctaaat cca 23
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtggggagtt gagtgtcgtc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gggggcacca gtcttcacat 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtggggagtt gagtgtcgtc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cccgacgaca ctcaactccc 20
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cctaagtttt aattaactac cgata 25
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tccctctggc cgaacaat 18
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acgtttttct taattctgat gtctat 26
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acatcaggca tacccacta 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cccacatatg gcttcttag 19
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gacaaagagt catgttcagt g 21
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cagacaaagc tgggaatag 19
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
accaaacaaa gttgggtaag gata 24
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggtaggcgga tgttgttctg 20
<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttctagact aggtgcga 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaacttggga ggcaatcact t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tccctctggc cgaacaat 18
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acgtttttct taattctgat gtctat 26

Claims (8)

1.一种重组麻疹病毒，以麻疹病毒为载体，在所述麻疹病毒的N基因5’端前的非编码区或P基因与M基因之间的非编码区或H基因与L基因之间的非编码区插入有目的基因。
2.如权利要求1所述的重组麻疹病毒，其特征在于，所述麻疹病毒来自于S191麻疹病毒疫苗株。
3.如权利要求2所述的重组麻疹病毒，其特征在于，所述目的基因插入的位点为第88位、或第3378位、或第10746位。
4.如权利要求1-3任一项所述的重组麻疹病毒，其特征在于，所述目的基因的长度为700-800bp。
5.如权利要求4所述的重组麻疹病毒，其特征在于，所述目的基因为编码绿色荧光蛋白的EGFP基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.如权利要求1-5任一项所述的重组麻疹病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计引物，以含有目的基因A的质粒为模板，利用PCR扩增出含有目的基因A的DNA片段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，所述DNA片段Ⅰ中携带麻疹病毒N基因前端非编码区的部分碱基，所述DNA片段Ⅱ中携带麻疹病毒P基因与M基因之间非编码区的部分碱基，所述DNA片段Ⅲ中携带麻疹病毒H基因与L基因之间非编码区的部分碱基；
(2)以质粒pBlunt-MV-N、pBlunt-MV-P、pBlunt-MV-H为模板，利用PCR扩增获得线性化载体pBlunt-MV-N-1、pBlunt-MV-P-1、pBlunt-MV-H-1；
(3)将所述的DNA片段Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别与线性化载体pBlunt-MV-N-1、pBlunt-MV-P-1、pBlunt-MV-H-1进行无缝克隆获得中间质粒pBlunt-MV-A-N、pBlunt-MV-P-A、pBlunt-MV-H-A；
(4)以所述中间质粒为模板，利用PCR技术扩增出DNA片段MV-A-N、MV-P-A、MV-H-A；
(5)设计引物，以质粒pBlunt-MV-N、pBlunt-MV-P、pBlunt-MV-M1、pBlunt-MV-M2、pBlunt-MV-F、pBlunt-MV-H、pBlunt-MV-L1、pBlunt-MV-L2为模板，利用PCR扩增出DNA片段MV-N、MV-P、MV-M1、MV-M2、MV-F、MV-H、MV-L1、MV-L2；
(6)将(4)中所述的DNA片段MV-A-N替代(5)中相应的DNA片段MV-N，并与(5)中其他的7个DNA片段利用多片段无缝克隆技术连入pYES-2载体中，构建得到含有重组麻疹病毒全长基因组的重组质粒，获得所述重组质粒命名为pYES-MV-A-N；同理，将MV-P-A替代MV-P，重组获得重组质粒pYES-MV-P-A，将MV-H-A替代MV-H，重组获得重组质粒pYES-MV-H-A；
(7)将所述重组质粒转染细胞，培养、收集培养基及细胞混合物，反复冻融，拯救获得重组麻疹病毒。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述DNA片段Ⅰ的3’端含有GS和GE序列，所述DNA片段Ⅱ、Ⅲ的3’端含有GE和GS序列。
8.如权利要求1-5任一项所述的重组麻疹病毒在制备麻疹病毒疫苗株、溶瘤药物中的应用。
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