CN112638412A - 产生病毒的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于产生用作疫苗的重组腺病毒的方法，该重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列，该方法包括以下步骤：通过将末端蛋白复合腺病毒基因组DNA(TPC‑Ad gDNA)与多核苷酸重组，将异源目的基因插入腺病毒基因组，该多核苷酸包含编码目的基因的核苷酸序列，并所述核苷酸序列的5’末端和3’末端与在体外重组反应中腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源；用来自(i)的体外重组反应混合物的稀释液转染在单个容器中生长的细胞，使得许多这样的单个容器包含被重组腺病毒感染的单个细胞，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列；鉴定其中单个细胞已被重组腺病毒感染的那些个容器，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列。适当地，所述TPC‑Ad gDNA包含血清型匹配的末端蛋白和腺病毒基因组，所述目的基因编码单个表位、表位串、抗原区段或完整抗原蛋白。本发明还涉及使用这些方法制备的重组腺病毒和组合物。

Description

产生病毒的方法和组合物
技术领域
本发明涉及重组腺病毒的快速产生，用于诱导针对异源抗原的免疫应答，适当地为保护性免疫应答，所述异源抗原包括感染性病原体抗原和与癌症有关的肿瘤抗原。
背景技术
源自血清5型人腺病毒(HAdV-C5)或其他人类腺病毒或猿猴腺病毒的复制能力不强的腺病毒载体已被用作疫苗载体，以在多个临床试验中传递感染性病原体抗原和癌症抗原(Ewer et al.(2017)Hum Vaccin Immunother.13(12):3020-3032和Cappuccini et al.(2016)Cancer Immunol Immunother.65(6):701-13.)。这些载体为疫苗开发提供了许多优势。它们在人中不具有复制能力，因此比复制载体更安全；它们感染复制和非复制细胞；它们具有广泛的组织嗜性，可引起高免疫反应，包括特别有效的细胞免疫；而且它们很容易纯化至高滴度(Morris et al.(2016)Future Virology 11(9),649-659)。结合λ噬菌体Red重组(重组工程)的细菌人工染色体(BAC)技术的出现促进了腺病毒基因组的克隆和操作(Ruzsics Z.,Lemnitzer F.,Thirion C.(2014)Engineering Adenovirus Genome byBacterial Artificial Chromosome(BAC)Technology.In:Chillón M.,Bosch A.(eds)Adenovirus.Methods in Molecular Biology(Methods and Protocols),vol1089.Humana Press,Totowa,NJ)。该技术与重组技术相结合，用于快速插入表达盒，目前用于产生腺病毒载体。但是，使用这种方法和传统的制造过程，从抗原鉴定到临床级腺病毒载体的平均时间为33-44周(图1)。制备用作疫苗的重组病毒涉及在GMP之前(药品生产质量管理规范之前)产生的起始物料，所述起始物料需要在最初感染受纳细胞后将其拯救(rescue)后才能克隆该重组病毒。这是一个耗时的过程，由于可能需要将氯霉素基因(用于标准腺病毒基因组操作过程中用于细菌人工染色体(BAC)选择)插入到腺病毒基因组中，以及从BAC衍生的腺病毒基因组产生的病毒载体是异质性的，因此最多需要进行3轮克隆，每轮克隆需要5周。使用BAC时，在细菌操作过程中可能在腺基因组中引入的任何突变都将被带入腺病毒。在本发明的方法中解决了该问题，其中在开始产生重组腺病毒之前已经克隆并表征了腺病毒基因组DNA，因而已知是正确的。因此，没有必要对腺病毒基因组DNA进行测序，就像之前已经描述过的那样。
Hillgenberg及其合作者(Journal of Virology 80(11)(2006)5435-5450)和另外的Choi及其合作者(Journal of Biotechnology 162(2012)246-252)已描述了使用重组手段用于生成大量重组腺病毒的快速方法，不再需要穿梭载体构建、细菌转化和选择，并减少了噬斑分离所需的精力。然而，这些作者试图产生表达大量不同异源基因的重组腺病毒种群，并且在其用作疫苗的方法中未能提供对单个重组病毒的快速且简单的克隆。根据与此类疫苗的GMP生产和临床使用相关的法规，腺病毒疫苗的临床使用需要单个克隆。
最近，Miciak及其合作者(PLoS ONE 13(6)(2018)e0199563)描述了一种体外腺病毒基因组从多个片段的组装方法，然后将其转染到细胞中。这些人还没有获得产生克隆的单一重组病毒的方法，其中在分离出重组病毒之后不必进行克隆选择方法。
因此，现有技术中没有适合于快速产生用作疫苗的重组腺病毒的方法。本发明试图通过提供一种新的方法来解决和克服这一挑战，并克服与现有技术中的方法有关的一个或多个问题，该新方法用于在4周内产生临床小批量的复制不完全的腺病毒载体(图2)。
发明内容
腺病毒是非包膜病毒，具有长度在26-46kb之间的线性双链DNA(dsDNA)基因组。腺病毒基因组DNA以裸露的DNA形式转染到受纳细胞中时具有传染性。然而，据报道，当与来自相同腺病毒的55kDa末端蛋白(TP)复合的人Ad-5(HAdV-C5)基因组DNA(gDNA)被转染到受纳细胞中时，产生的病毒噬斑比裸露的DNA高100-1000倍。TP保护病毒gDNA免受细胞核酸外切酶的消化，充当引发DNA复制的引物，并与DNA聚合酶形成异二聚体。DNA聚合酶将第一个dCTP与HAdV-C5 TP的Ser-580共价偶联。与不含蛋白质的模板相比，人腺病毒TP通过将模板活性提高20倍来增强人腺病毒复制。这是通过复制起点的细微变化实现的，从而可以结合其他复制因子。TP还通过介导HAdV-C5基因组DNA-宿主核基质缔合来促进转录。
本发明人试图利用转染的TPC-腺病毒gDNA(TPC-Ad gDNA)与现有的重组技术相结合来增加噬斑产生的特性，以产生临床批的腺病毒疫苗载体，尤其是现在优选的猿猴腺病毒载体。
可以分离和纯化TPC-Ad gDNA，测试其同质性，并在腺病毒生产和制造之前进行贮存。这种方法消除了在细菌中传播腺病毒gDNA的需要，因此避免了将氯霉素基因(用于BAC选择)插入腺病毒基因组的可能性以及避免病毒基因组在细菌宿主中多轮扩增后发生异质性的可能性。当仅产生少量重组腺病毒基因组时，用TPC-Ad gDNA转染细胞后产生的噬斑数量增加，可以成功拯救重组病毒，此外可以在制造过程中在非常早期阶段就快速且容易地克隆得到的重组腺病毒。本发明人简化了病毒的生产和制造工艺，很明显的结果使得有可能在短短28天之内产生和制造用作疫苗的重组腺病毒。疫苗生产时间的缩短将带来许多优势，其中包括：i)允许快速产生个性化的癌症疫苗，以便通过治疗性免疫更迅速地治疗恶性肿瘤；ii)面对新的流行病，速度更快地生产针对新的暴发病原体疫苗，从而可以更快地制造和生产更多数量的疫苗；iii)通过显著减少设备制造时间来降低昂贵的GMP(生产质量管理规范)制造设备的制造成本。
在第一方面，本发明提供了一种用于产生用作疫苗的重组腺病毒的方法，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列，该方法包括以下步骤：(i)通过将末端蛋白复合腺病毒基因组DNA(TPC-Ad gDNA)与合成DNA重组，将异源目的基因插入腺病毒基因组，该合成DNA包含编码目的基因的核苷酸序列，并在其5’末端具有至少15bp的碱基且在其3’末端具有至少15bp的碱基，其与在体外重组反应中腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源；(ii)用来自(i)的体外重组反应混合物的稀释液转染在单个容器中生长的细胞，使得许多这样的单个容器包含被重组腺病毒感染的单个细胞，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列；(iii)鉴定其中单个细胞已被重组腺病毒感染的那些个容器，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列。
第一方面的方法可有利地用于产生重组腺病毒，用作疫苗的生产时间从约33-44周减少至低至28天。
使用当前的方法，通过扩增大量转染来生产病毒原液，其中可能包含许多极低水平的难以检测的小种。因此，需要3轮克隆以确保使用这种方法产生克隆原种。本发明的方法从特征化的病毒基因组开始，因此在重组和转染后仅重组抗原序列可能是错误的。进行转染以使得仅一个重组病毒基因组转染每个容器，因此不会有包括许多小种的混合物。在极少数情况下，两个病毒基因组可以转染同一细胞，但是如果它们在重组抗原编码序列中不相同，则可以通过对编码DNA序列进行测序来轻易区分它们，因为每种病毒将占混合物的50％左右，因此我们不再寻找小种。任何看起来包含正确和错误序列的混合物的病毒样本将被丢弃，只有那些正确的病毒样本才被选作疫苗。
编码目标异源基因的合成DNA可能包含不完全正确的小种。本发明的方法通过在转染后立即产生病毒克隆并因此测序每个克隆中的基因编码序列并仅选择正确的克隆来解决该问题。这优于扩增可能代表重组病毒混合物的大量病毒原液，然后在以后克隆。
除了提供重组腺病毒的即时克隆和快速扩增以外，本发明的方法在任何特异性重组腺病毒的生产开始之前，在重新定位大量质量控制(QC)检验方面提供了重要的改进，该测试对于使用重组病毒作为疫苗是必要的。这样的QC检验可以在大量的起始原料上进行，并且当该方法用于产生用作疫苗的重组腺病毒时，可以节省大量时间。
新方法的另一个优点是可以有效地用于生成本文所示的猿猴腺病毒载体。以前关于快速产生腺病毒载体的大多数工作仅使用了一种或几种血清型人腺病毒，尤其是血清5型人腺病毒(Ad-5)。现在，猿猴腺病毒比人腺病毒更优选作为免疫载体，因为：i)受自然暴露于人腺病毒引起的预先存在的抗载体免疫的负面影响要小得多；ii)与常见的人腺病毒载体(Ad-5)相比，在数千个受试者中发现它们是安全的和具有免疫原性的(Ewer atal.supra)，Ad-5与主要的安全信号相关，并与在默克公司HIV疫苗的主要“STEP”试验中增强HIV感染有关(Cohen(2007)Science 318：28-29)。
在第二方面，本发明提供了包含腺病毒基因组的组合物，其中E1基因被表达盒代替，所述表达盒包含编码荧光标记蛋白的DNA序列，所述DNA序列旁侧带有第一对独特的限制性位点，所述限制性位点在用于第一方面的方法的腺病毒基因组中的其他任何地方均不存在。
第二方面的组合物可以有利地用于第一方面的方法中，以允许清晰地鉴定包含编码目的异源基因的核苷酸序列的重组腺病毒。使用第一方面的方法的所有明显优点也可以在第二方面的组合物中找到。
附图说明
现在将参考附图以示例的方式描述本发明，其中：
图1显示了使用现有方法快速生产用作疫苗的重组腺病毒的时序示意图。QC-质量控制；Amp-放大；GMP-生产质量管理规范；MVSS-主病毒种子原液。
图2显示了用于本发明方法生产用作疫苗的重组腺病毒构建的时序示意图。
图3显示了用于本发明方法的亲本病毒组合物的示意图。在这种情况下，亲本病毒是ChAdOx1-Bi-GMP基因组，其中包含3个独特的限制性位点(PsiI、AsiSI和RsrII)，用于插入抗原或表达盒。LPTOS-长四环素调节的CMV启动子。
图4显示了被3M盐酸胍破坏的TPC-Ad gDNA的分析。在冰上用3M盐酸胍破坏200μl腺病毒颗粒(1.4e12VP/ml)45min。将10μl样品在65℃下与(+)或不与(-)2μg蛋白酶K一起温育40分钟，然后通过0.7％琼脂糖进行分离。M＝1kbp Generuler ladder(Thermofisher)。
图5显示了在3M盐酸胍破坏后，在2.8M CsCl梯度中以68000rpm离心18小时后的TPC-Ad gDNA分离、纯化、脱盐和过滤。将分离的DNA脱盐至10mM Tris pH7.8中，并通过0.2μM注射过滤器过滤。通过0.7％的琼脂糖分离DNA的等分试样。M＝1kbp Generuler(thermofisher).
图6显示了在2.8M CsCl梯度中离心后分离的TPC-Ad gDNA的蛋白质分析。含有50ng TPC-Ad gDNA的样品通过SDS还原4-12％Bis-Tris NuPAGE midigel中进行分离，并用银染剂染色。
图7A和图7B显示了qPCR引物和探针在ChAdOx1、ChAdOx2和ChAd63腺病毒基因组中的结合位置。
图8显示了所要求保护的方法的体外重组反应方案，以使用ChAdOx1-Bi-GFP作为亲本腺病毒基因组DNA来生产重组ChAdOx1。
图9显示了转染30小时后表达mCherry和GFP的细胞的百分数，所述转染是用含有各种量的TPC-Ad gDNA和mCherry ORF PCR产物的重组反应转染的。使用NEBuilder将60、40和20ng PsiI消化的TPC-Ad gDNA与40、20和10ng mCherry ORF PCR产物重组。将重组反应在转染前在50℃温育40分钟，然后在20℃温育2分钟。使用lipofectamine 2000以1：5的比例用重组反应转染接种到96wp中的T-Rex-293细胞。转染后5小时加入含有四环素的培养基。感染后30小时通过FACS分析确定表达GFP和mCherry的细胞数。
图10显示了快速产生用作疫苗的重组腺病毒的方法的概况。
具体实施方式
在第一方面，本发明提供了一种用于产生用作疫苗的重组腺病毒的方法，该重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列，该方法包括以下步骤：(i)通过将末端蛋白复合腺病毒基因组DNA(TPC-Ad gDNA)与合成DNA重组，将异源目的基因插入腺病毒基因组，该合成DNA包含编码目的基因的核苷酸序列，并在其5’末端具有至少15bp的碱基且在其3’末端具有至少15bp的碱基，其与在体外重组反应中腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源；(ii)用来自(i)的体外重组反应混合物的稀释液转染在单个容器中生长的细胞，使得许多这样的单个容器包含被重组腺病毒感染的单个细胞，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列；(iii)鉴定其中单个细胞已被重组腺病毒感染的那些个容器，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列。
现有技术提供了许多产生重组腺病毒的方法，例如Hillgenberg et al.(2006)、Choi et al.(2012)和Miciak et al.(2018)都提供了简洁的方法。然而，所提供的方法均未解决对长时间的克隆过程以分离用作疫苗的重组克隆腺病毒的需要。本发明的方法有利地提供了一种在产生重组腺病毒时消除长时间的克隆过程的方法。这继而消除了重组腺病毒载体的产生中的巨大延迟，这使得此类载体更易于适于用作疫苗，特别是用作针对癌症的治疗或暴发病原体的快速反应疫苗的个性化疫苗。
在本发明的优选实施例中，TPC-Ad gDNA包含血清型匹配的末端蛋白和腺病毒基因组。血清型匹配的腺病毒基因组和末端蛋白的使用可在重组和转染细胞后高效拯救病毒。
在本发明的具体实施例中，目的基因编码单个表位、表位串、抗原区段或完整抗原蛋白。提供各种目的基因允许开发改进的疫苗，以保护或治疗处于发展或患有包括癌症或暴发性疾病在内的多种疾病风险的患者。
在替代实施例中，多核苷酸是合成DNA分子，纯化的DNA限制片段或聚合酶链反应(PCR)产物。该方法允许灵活地选择用于产生重组腺病毒的DNA的来源，这将导致该方法更快速地完成，这对于生产用作预防或治疗许多疾病的疫苗的重组腺病毒至关重要，所述疾病包括癌症或爆发性疾病。
在进一步的替代实施例中，多核苷酸在其5’末端具有5至50bp之间的碱基，在其3’末端具有5至50bp之间的碱基，其与腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源，或者该多核苷酸在其5’末端具有10至20bp之间的碱基，在其3’端之间具有10和20bp之间的碱基，其与腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源，或者该多核苷酸的5’端具有15bp的碱基，在3’端具有15bp的碱基，其与腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源。提供具有合适的同源末端的多核苷酸允许与腺病毒基因组DNA有效重组，从而允许在使用该方法的体外重组反应中可靠地产生重组腺病毒。
在优选的实施例中，腺病毒基因组DNA的插入位点序列位于E1基因座内。E1基因的缺失允许插入异源表达盒，并在重组病毒感染的细胞中可靠且高水平表达目标抗原。这为用作疫苗的重组腺病毒提供了有利的特性。
在某些实施例中，TPC-Ad gDNA在腺病毒基因组DNA的E1基因座内的独特的限制性位点处被消化，所述限制性位点在其5’端侧接长四环素调节的CMV启动子，所述长四环素调节的CMV启动子驱动目的基因的表达，并所述限制性位点在其3’端侧接牛生长激素聚腺苷酸化序列。在E1基因座中的独特的限制性位点处消化腺病毒基因组DNA，为与编码目的抗原的DNA序列重组提供了合适的末端序列，同时还从任何重组反应中去除了完整的亲本腺病毒DNA。有利地，这允许与编码目的抗原的DNA序列更有效地重组，并且还减少了使用该方法再生的亲本腺病毒的数量。
在具体实施例中，体外重组反应包含40ng消化的TPC-Ad gDNA和44fmol编码目的基因的合成DNA的3’和5’末端。提供这样数量的反应物允许优化的重组和重组腺病毒的产生，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列。有利地，这允许使用一定量的重组腺病毒基因组DNA转染合适的细胞，所述重组腺病毒基因组DNA使用本发明的方法增加单个克隆的产生。
在进一步的具体实施例中，在转染前一天将要转染的细胞以3.75×105细胞/ml的密度接种在单个容器中。以这种密度接种细胞可提高细胞中重组腺病毒拯救的效率。
在进一步的具体实施例中，在单个容器中以约80％汇合生长的同时转染细胞。这增加了腺病毒早期基因的表达并提高了细胞中重组腺病毒拯救的效率。
在进一步的具体实施例中，细胞稳定表达四环素阻遏物。使用此类细胞，例如T-Rex-293细胞，可以在转染后的病毒拯救期间抑制目的基因的表达。转染后细胞易碎，异源基因表达的抑制可最大程度地减少细胞死亡，并在该方法的此步骤中有效拯救病毒。
在特定的实施例中，被转染的细胞稳定表达四环素阻遏物。四环素阻遏物在用于拯救重组病毒的细胞中的表达阻止了可能对细胞有毒的目的基因的表达，因此增加了病毒的拯救。
在另外的特定实施例中，将体外重组反应混合物在转染培养基中稀释并等分，以便转染在60个单独容器中生长的细胞。有利的是，将每个重组反应分为60个等份并将其转染，这将单个重组腺病毒递送到一部分而不是全部60个单独的容器中。这允许用户鉴定许多含有单个重组腺病毒的孔，同时包括不含重组腺病毒的阴性对照孔。
在优选的实施例中，将转染的细胞冷冻并解冻以释放细胞相关病毒，并且使用来自转染细胞的每个孔的细胞裂解液、一组引物和探针通过定量PCR(qPCR)来鉴定重组腺病毒的存在，所述探针设计成与腺病毒反向末端重复序列(ITR)下游基因组和非编码区中目标基因插入位点的上游基因组的左端结合。这种简化和加速的样品提取和筛选过程可轻易、快速地鉴定目标重组腺病毒，并排除样品中存在的亲代腺病毒。
在另外的优选实施例中，腺病毒基因组源自人腺病毒或猿猴腺病毒，优选地，人腺病毒不是血清5型人腺病毒。在最优选的实施例中，猿猴腺病毒是黑猩猩腺病毒，例如ChAdOx1(Antrobus et al.(2014)Mol Ther.22(3):668-674),ChAdOx2(Morris et al.(2016)Future Virol.11(9):649-659)、ChAd3或Chad63。通过使用人或猿猴腺病毒，允许使用通过该方法产生的重组腺病毒用作人受试者的疫苗。猿猴腺病毒的使用，尤其是ChAdOx1或ChAdOx2的使用，提供了改进的疫苗，对人类受试者给药时，所述疫苗的既有抗腺病毒免疫力的发生概率较低。
在具体实施例中，各个容器是多孔板中的单独的孔。这种小体积容器的使用允许细胞的快速、经济和有效的转染并筛选所得的重组腺病毒。多壁式的板的使用还允许该方法和所有相关过程的自动化。
在优选的实施例中，TPC-Ad gDNA由TPC-Ad gDNA的原料库提供，所述TPC-Ad gDNA原料已经过并通过了必要的质量控制(QC)测定，从而允许用于生产质量管理规范(GMP)生物制造。来自质量控制(QC)的原料库的TPC-Ad gDNA的使用可提高生产用作疫苗的重组腺病毒的方法的快速性。在开始此方法之前进行QC检验，可以预先检验病毒成分，并另外减少腺病毒生产和制造过程中的检验和测定负担。
在某些实施例中，本发明的第一方面的方法产生的重组腺病毒可以用作预防和/或治疗人或动物疾病的疫苗。特别地，该方法产生的重组腺病毒在产生用于治疗癌症的个性化疫苗中非常有用。本发明克服了使用病毒载体提供这种治疗的主要阻碍：即产生和开发病毒载体疫苗的过程很慢。通过本文公开的新即时方法快速生成重组腺病毒，可以为患者进行临床评估，鉴定患者自身的癌症特异性抗原以及生成合适的重组腺病毒疫苗以治疗该个体患者提供足够的时间。在开发本发明的第一方面的要求保护的方法之前，这是不可能的。
在第二方面，本发明提供了包含腺病毒基因组的组合物，其中E1基因被表达盒代替，所述表达盒包含编码荧光标记蛋白的DNA序列，所述DNA序列旁侧带有第一对独特的限制性位点，所述限制性位点在用于第一方面的方法的腺病毒基因组中的其他任何地方均不存在。
如上所述，现有技术提供了许多生产重组腺病毒的方法。然而，这些方法中的每一种都是通过使用未修饰的腺病毒基因组作为起始物料而开始的，因此，每种方法都必须执行复杂的步骤以产生适合用于体外重组反应的消化的腺病毒基因组DNA。本发明该方面提供的组合物克服了这一障碍，并允许单个步骤的限制性消化反应来制备腺病毒DNA与合适的异源核酸分子重组。除了简化腺病毒基因组DNA的制备过程外，这种组合物的使用还可以大规模制备从腺病毒原液中产生的消化后的基因组DNA，已经过测试以确认其无菌性、支原体缺乏、同一性和遗传稳定性，该病毒可以预先贮存，以简化生成完全符合GMP要求的重组腺病毒的生产过程，并根据需要随时用于临床。
在具体实施例中，腺病毒基因组源自人腺病毒或猿猴腺病毒，优选地，人腺病毒不是血清5型人腺病毒。在更优选的实施例中，腺病毒基因组源自猿猴腺病毒，最优选地，猿猴腺病毒是黑猩猩腺病毒，例如ChAdOx1(Antrobus et al.supra),ChAdOx2(Morris etal.supra),ChAd3或Chad63。人或猿猴腺病毒的使用，允许通过该方法产生的重组腺病毒用作人受试者的疫苗。猿猴腺病毒的使用，尤其是ChAdOx1或ChAdOx2的使用，提供了改进的疫苗，当对人类受试者给药时，所述疫苗的既有抗腺病毒免疫力的发生概率较低。
在优选的实施例中，荧光标记蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。荧光标记蛋白的存在允许快速检测未经过重组的原封不动的腺病毒感染的细胞，这些重组腺病毒未经重组即可表达此方面的目标基因，GFP是一种特别方便的标记蛋白，可以通过荧光显微镜直接检测，或间接地例如使用抗GFP抗体而容易地检测。
在优选的实施例中，第一对独特的限制性位点选自PsiI、AsiSi或RsrII位点。
在某些实施例中，表达盒还包含长四环素调节的CMV启动子和牛生长激素聚腺苷酸化序列，所述长四环素调节的CMV启动子位于编码荧光标记蛋白的DNA序列的5’端，所述牛生长激素聚腺苷酸化序列位于编码荧光标记蛋白的DNA序列的3’端，其中第一对限制性位点位于长四环素调节的CMV启动子与编码荧光标记蛋白的DNA序列之间，以及编码荧光标记蛋白的DNA序列与牛生长激素聚腺苷酸化序列之间。有利地，在本发明的第一方面的方法中，亲本腺病毒基因组DNA中GFP编码序列的包含可以用作有效的阴性对照，以鉴定其中再生亲本腺病毒的任何细胞。当寻找用作疫苗的包含编码目的异源基因的核苷酸序列的重组腺病毒时，简单的筛选步骤可以消除那些表达GFP的病毒。另外，当产生用于第一方面的方法的亲本腺病毒基因组DNA库时，GFP的存在可以用作有用的标记。
在优选的实施例中，表达盒还包含与第一对独特的限制位点不同的第二对独特的限制位点，所述独特限制位点位于长四环素调节的CMV启动子的5’端和牛生长激素聚腺苷酸化序列的3’端。有利地，添加第二对独特的限制性位点允许去除整个GFP表达盒，并且这允许产生包含编码目的异源基因的核苷酸序列的重组腺病毒，所述异源基因是使用不同启动子系统表达的。在这种情况下，可以将所需的启动子和聚腺苷酸化序列设计到合成的DNA中，所述合成的DNA包含编码目的基因的核苷酸序列。
在进一步优选的实施例中，第二对独特的限制性位点选自PsiI、AsiSi或RsrII位点。
在另外的实施例中，进一步改造腺病毒基因组以在S15/E4基因座处包含另外的独特的限制位点。这允许将包含编码目的基因的核苷酸序列的第二合成DNA重组到腺病毒基因组DNA中。
在进一步另外的实施例中，另外的独特的限制性位点选自PsiI、AsiSi或RsrII位点。
在具体实施例中，腺病毒基因组与异源或非血清型匹配的末端蛋白复合，但是在优选的实施例中，腺病毒基因组与自体或血清型匹配的末端蛋白复合。
在进一步的具体实施例中，腺病毒基因组缺少Gateway重组序列。
在优选的实施例中，上述组合物已经过并通过了必要的质量控制(QC)测定，从而允许用于生产质量管理规范(GMP)生物制造。来自质量控制(QC)测定的原料库的原料的使用可提高生产用作疫苗的重组腺病毒的方法的快速性。在开始此方法之前进行QC检验，可以预先检验病毒成分，并另外减少腺病毒生产和制造过程中的检验和测定负担。
在最后方面，本发明提供了重组腺病毒载体免疫原，其包含本发明第二方面的任何组合物，并表达针对在哺乳动物中产生的免疫应答的病原体或肿瘤表位或抗原。
在整个说明书和所附的权利要求书中，词语“包括(comprise和include)”以及诸如“包括(comprises、comprising、includes和including)”的变体将被包括在内。也就是说，在上下文允许的情况下，这些词意在传达可能包含的其他未明确叙述的元素或整数。
实施例
实施例1-通过氯化铯密度梯度超速离心纯化腺病毒末端蛋白复合物病毒gDNA(TBC-gDNA)。
55kDa末端蛋白(TP)与腺病毒基因组DNA每条链的5’端共价连接，以产生末端蛋白复合物病毒gDNA(TPC-Ad gDNA)。血清型匹配的(“自体”)和错配的(“异源”)TP均可用于本发明。TP保护病毒gDNA免受细胞核酸外切酶的消化，充当引发DNA复制的引物，并与DNA聚合酶形成异二聚体。与无蛋白质模板相比，通过复制起点的细微变化，TP通过将模板活性增加20倍以上来增强复制，从而实现了其他复制因子的结合。使用盐酸胍从破坏的纯化病毒颗粒中分离TPC-Ad gDNA，并通过氯化铯密度梯度超速离心进行纯化。
将含有1×1011和1×1012病毒颗粒(500μl-1ml)的纯化病毒溶液等分到1.5ml或2ml试管中，并加入等体积的用无核酸酶水配制的过滤后的无菌6M盐酸胍(GndHCl)，最终的GndHCl浓度为3M。温和混合后，将稀释的病毒溶液在冰上温育45-60分钟。
通过将9.4281g CsCl加入到20ml过滤灭菌的3M盐酸胍(GndHCl)中，制得2.8M氯化铯(CsCl)溶液，该溶液用无核酸酶水配制。将2ml 2.8M CsCl溶液添加到MSCII罩中适当大小的超速离心管中，然后将病毒/GndHCl溶液轻轻铺在2.8M CsCl的顶部。然后使用台式Optima TLX超速离心机在Beckman TLA100.3转子中于20℃在68,000rpm下通过CsCl溶液将病毒样品制备物离心18小时。
离心完成后，将TPC-Ad gDNA分装成100μl等份试样，然后转移到微量离心管中。当起始物料中存在的病毒物料数量增加时，在CsCl离心步骤结束时会看到沉淀，然后将其重新悬浮于在无核酸酶水中制备的pH7.8的100μl 10mM Tris HCl中。从CsCl离心管中取出的等分试样中的纯化的DNA的存在是通过以下操作由肉眼确认的：将1μl各等分试样放在封口膜上，加入1μl的工作储备液(1：10,000)SYBR safe，并在蓝光下用橙色滤光片肉眼观察。
然后使用在不含核酸酶的水中制备的Zeba柱(用10mM pH7.8的Tris HCl平衡)将从CsCl离心步骤纯化得到的TPC-Ad gDNA脱盐。通过分光光度法确定DNA浓度，并通过凝胶电泳评估DNA纯度(图4和图5)。通过降低4-12％梯度凝胶的SDS-PAGE定性测定TPD-gDNA制备物中的蛋白水平(图6)。然后将TPC-Ad gDNA贮存在-80℃直至需要。
实施例2-通过独特的限制酶消化来制备用于重组的TPC-Ad gDNA
亲本腺病毒基因组，例如ChAdOx1-Bi-GFP，如图3所示，在E1处包含GFP编码序列，两侧是长四环素调节的CMV启动子(LPTOS)和牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号(poly A)。GFP ORF两侧有一对PsiI限制性内切核酸酶识别的独特的限制性位点，可以使用PsiI切除，从而生成3个片段：腺病毒基因组的左臂，GFP ORF和腺病毒的右臂基因组。也可以用AsiSI消化该亲本病毒，以切除包括LPTOS和poly A的完整GFP表达盒。也可以通过RsrII消化这种亲本病毒，以制备用于在S14(E4)基因座插入表达盒的gDNA。
将120ng TPC-Ad gDNA在37℃的培养箱中与10U PsiI在推荐的反应缓冲液中温育过夜，所述反应缓冲液用无核酸酶的水稀释至30μl的最终反应体积。通过在65℃温育20分钟使限制性酶失活，一旦通过凝胶电泳或转染到细胞中确认没有产生病毒从而确认消化，然后将消化的TPC-Ad gDNA直接用于重组反应。
实施例3-腺病毒的快速产生：重组和转染
通过体外重组将感兴趣的抗原序列或目的表达盒引入TPC-Ad gDNA，然后将重组反应产物直接转染到互补的HEK293细胞中进行病毒拯救。进行转染，从而获得单个病毒克隆。
NEBuilder(NEB)和In-fusion(Takara)是可商购的系统，无论片段长度或末端相容性如何，均可无缝组装多个DNA片段。这些产物可用于将抗原/表达盒插入由实施例2适当制备的TPC-Ad gDNA中。重组反应混合物包括核酸外切酶和聚合酶，在NEBuilder的情况下，DNA连接酶共同作用以产生双链DNA分子。核酸外切酶产生单链3’突出端，其促进末端共享互补性的片段(重叠区域)的退火，聚合酶填充每个退火片段的间隙。在NEBuilder反应中，DNA连接酶将组装的DNA中的缺口密封，从而形成完全密封的DNA分子，而不是像输注反应(Infusion reaction)那样依靠宿主细胞DNA修复机制来填充有缺口的DNA。
将40ng PsiI消化的TPC-Ad gDNA(10μl的来自实施例2的限制性反应)在薄壁PCR管中与44fmol的所需抗原序列的5’/3’末端混合，该序列是用最小15bp的与TPC-Ad gDNA插入位点的5’和3’端互补的序列合成的。通过在微量离心机中短暂旋转将管中的内容物收集在管的底部。然后，通过添加推荐体积的NEBuilder反应混合物或In-fusion反应混合物和无核酸酶的水，使重组反应的最终体积达到30μl。将反应混合物在50℃下温育40分钟，然后在20℃下温育2分钟。重组反应可立即转染到互补细胞中，并拯救重组腺病毒。
为了拯救腺病毒，需要分裂细胞以表达E1蛋白并支持病毒复制，因此目标是达到转染当天融合度大约80％的水平。因此，在转染前24小时，将稳定表达四环素阻遏物的T-Rex-293细胞以3.75×104个细胞/孔的密度接种到96孔板的DMEM中，所述DMEM含有10％胎牛血清(FCS)和杀稻瘟菌素(5μg/ml)。
将预热的Optimem加入重组反应中，使反应管中的最终体积达到100μl。在重组反应中，每100ng DNA将0.5μl Lipofectamine 2000加到另一管中的100ml Optimem中。将两个管在室温下温育5分钟。然后将稀释的重组反应添加到稀释的Lipofectamine 2000中。将试管轻轻混合，然后在室温下再温育20分钟，然后将混合物用Optimem稀释至最终体积3ml。
将培养基与在96孔板中生长的T-Rex-293细胞分离，并将50μl稀释的脂质转染反应直接加入到60孔中的每一个孔中。然后将细胞在37℃和8％CO2下温育4至6小时。然后将每个孔中的转染培养基替换为100ml含10％胎牛血清(FCS)和杀稻瘟菌素(5μg/ml)的DMEM，并将细胞在37℃与8％CO2下温育。
5天后，将板进行3次冷冻/解冻循环以破坏细胞并释放相关病毒。从每个单独的孔中取出10ml细胞裂解液，并通过定量聚合酶链反应(QPCR)使用可商购的DNAreleasy试剂分析从其中分离DNA。将来自每个孔的剩余细胞裂解液添加到24小时前接种的96孔板的相应孔中，该孔以2.1×104细胞/孔的浓度在含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM中接种T-Rex-293细胞。当在孔中完全细胞病变效应明显时(感染后4至6天之间)，从各个孔中收获重组腺病毒。
实施例4–通过QPCR从细胞裂解液或纯化的病毒中定量腺病毒基因组拷贝数
通过QPCR测量HEK293或T-Rex-293细胞裂解液中ChAdOx1、ChAdOx2或ChAd63病毒基因组的量。通过定量PCR(qPCR)从用DNAReleasy处理的细胞裂解液确定病毒基因组的数量(可能与1：1的病毒颗粒有关)。已经设计了一组引物和探针，它们与反向末端重复序列(ITR)下游和非编码区中抗原插入区上游的基因组左端结合(参见图7A和图7B)。这些引物和探针序列是：
引物
ChAd fwd 5’GTGGGAAAAGTGACGTCAAACGAG3’(SEQ ID NO:1)
ChAd rev 5’TGCATCCGCCTAGAAACACCTCA3’(SEQ ID NO:2)
探针
ChAd通用探针5’GAGAGCGCGGGAAAATTGAGTATT3’(SEQ ID NO:3)
ChAdOx2的反向引物中只有一个错配；AdCh63中相关区域的序列与ChAdOx2中的序列相同，因此该方法对AdCh63也可能是成功的。相关序列在AdHu5载体中不存在。
从显示出完全细胞病变效应(CPE)的烧瓶中收获细胞和培养基。对于小量的细胞和培养基，可以直接收获，但对于大量的细胞，可通过1500g离心5分钟来收集，并重悬于1/10培养基体积的腺病毒裂解缓冲液(50mMTris,2mM MgCl2,pH9.0)中。然后将要收获的细胞冷冻并融化三遍。将10μl裂解液添加到15μl DNAReleasy试剂中，并用以下循环在热循环仪中处理样品：65℃持续15分钟，96℃持续2分钟，65℃持续4分钟，96℃持续1分钟，65℃持续1分钟，96℃持续30秒，保持20℃。将样品稀释至总体积为1ml，每个QPCR反应使用5μl。
通过以下方式进行QPCR反应：在95℃进行初始热启动激活10分钟，然后在95℃变性15秒，进行45个循环，然后在60℃变性和退火1分钟。
使用pTOPO-ChAdOx1 LF1质粒建立标准曲线，该质粒长度为4,118个碱基对，并给出每ng DNA的确定的基因组拷贝数，如表1所示。
实施例5–表达mCherry的重组ChAdOx1的产生
mCherry基因用作插入ChAdOx1的模型抗原。使用包含与TPC-AdgDNA的PsiI插入位点具有15bp同源性的引物扩增mCherry基因。用PsiI消化TPC-gDNA，然后在重组之前将酶热灭活。使用NEBuilder和In-fusion测试了一系列TPC-gDNA和mcherry ORF浓度的重组效率。将反应物在50℃温育40分钟，然后在20℃温育2分钟，然后立即使用lipofectamine 2000以1：5的比例转染到接种于96孔板中的T-Rex-293细胞中。转染后30h，通过FACS测定GFP(来自未消化的TPC-Ad gDNA)和mCherry细胞(来自重组反应)的数量(图9)。
表1：腺病毒基因组拷贝数标准
DNA std的量 拷贝数
5ng 1×10<sup>9</sup>
0.5ng 1×10<sup>8</sup>
50pg 1×10<sup>7</sup>
5pg 1×10<sup>6</sup>
0.5pg 1×10<sup>5</sup>
0.05pg 1×10<sup>4</sup>

Claims (39)

1.一种用于产生用作疫苗的重组腺病毒的方法，该重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列，该方法包括以下步骤：
(i)通过将末端蛋白复合腺病毒基因组DNA(TPC-Ad gDNA)与多核苷酸重组，将异源目的基因插入腺病毒基因组，所述多核苷酸包含编码目的基因的核苷酸序列，并所述核苷酸序列的5’末端和3’末端与在体外重组反应中与腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源；
(ii)用来自(i)的体外重组反应混合物的稀释液转染在单个容器中生长的细胞，使得许多这样的单个容器包含被重组腺病毒感染的单个细胞，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列；
(iii)鉴定其中单个细胞已被重组腺病毒感染的那些个容器，所述重组腺病毒包含编码目的异源基因的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，TPC-Ad gDNA包含血清型匹配的末端蛋白和腺病毒基因组。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，目的基因编码单个表位、表位串、抗原区段或完整抗原蛋白。
4.根据上述权利要求中任意一项所述的方法，其中，多核苷酸是合成的DNA分子，纯化的DNA限制片段或聚合酶链反应(PCR)产物。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述多核苷酸在其5’末端具有5至50bp之间的碱基，在其3’末端具有5至50bp之间的碱基，其与腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述多核苷酸在其5’末端具有10至20bp之间的碱基，在其3’末端具有10至20bp之间的碱基，其与所述腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述多核苷酸在其5’末端具有15bp的碱基，在其3’末端具有15bp的碱基，其与所述腺病毒基因组DNA的插入位点序列同源。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，腺病毒基因组DNA的插入位点序列位于E1基因座内。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，TPC-Ad gDNA在腺病毒基因组DNA的插入位点序列内的独特的限制性位点处被消化，所述限制性位点在其5’端侧接长四环素调节的CMV启动子，所述启动子驱动目的基因的表达，并且所述限制性位点在其3’端侧接牛生长激素聚腺苷酸化序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，体外重组反应包含40ng消化的TPC-Ad gDNA和44fmol编码目的基因的合成DNA的3’和5’末端。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在转染前一天将要转染的细胞以3.75×105细胞/ml的密度接种在单个容器中。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在单个容器中以约80％汇合生长的同时转染细胞。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，被转染的细胞稳定表达四环素阻遏物。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，将体外重组反应混合物在转染培养基中稀释并等分，以便转染在60个单独容器中生长的细胞。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，将转染的细胞冷冻并解冻以释放细胞相关病毒，并且使用来自每个孔的转染细胞的细胞裂解液、一组引物和探针通过定量PCR(qPCR)来鉴定重组腺病毒的存在，所述探针设计成与腺病毒反向末端重复序列(ITR)下游基因组和非编码区中目标基因插入位点的上游基因组的左端结合。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述腺病毒基因组源自猿猴腺病毒。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述猿猴腺病毒是ChAdOx1或ChAdOx2或ChAd3或ChAd63。
18.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述腺病毒基因组源自人腺病毒。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述人腺病毒不是血清5型人腺病毒。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，单个容器是多孔板中的单独的孔。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，TPC-Ad gDNA由TPC-Ad gDNA原料库提供，该TPC-Ad gDNA原料已经过并通过了必要的质量控制(QC)测定，从而允许用于生产质量管理规范(GMP)生物制造。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法制得的重组腺病毒。
23.一种包含腺病毒基因组的组合物，其中E1基因被表达盒代替，所述表达盒包含编码荧光标记蛋白的DNA序列，所述DNA序列旁侧带有第一对独特的限制性位点，所述限制性位点在用于任一项前述权利要求的方法中的腺病毒基因组中的其他任何地方均不存在。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中，所述腺病毒基因组源自猿猴腺病毒。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中，所述猿猴腺病毒是ChAdOx1或ChAdOx2或ChAd3或ChAd63。
26.根据权利要求23所述的组合物，其中，所述腺病毒基因组源自人腺病毒。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中，所述人腺病毒不是血清5型人腺病毒。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的组合物，其中，所述荧光标记蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的组合物，其中，第一对独特的限制性位点选自PsiI、AsiSi或RsrII位点。
30.根据权利要求23至29中任一项所述的组合物，其中，表达盒还包含长四环素调节的CMV启动子和牛生长激素聚腺苷酸化序列，所述长四环素调节的CMV启动子位于编码荧光标记蛋白的DNA序列的5’端，所述牛生长激素聚腺苷酸化序列位于编码荧光标记蛋白的DNA序列的3’端，其中第一对独特的限制性位点位于长四环素调节的CMV启动子与编码荧光标记蛋白的DNA序列之间以及编码荧光标记蛋白的DNA序列与牛生长激素聚腺苷酸化序列之间。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中，表达盒还包含与第一对独特的限制位点不同的第二对独特的限制位点，所述第二对独特的限制位点位于长四环素调节的CMV启动子的5’端和牛生长激素聚腺苷酸化序列的3’端。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中，第二对独特的限制性位点选自PsiI、AsiSi或RsrII位点。
33.根据权利要求23至32中任一项所述的组合物，其中，进一步改造腺病毒基因组以在S15/E4基因座处包含另外的独特的限制位点。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中，另外的独特的限制性位点选自PsiI、AsiSi或RsrII位点。
35.根据权利要求23至34中任一项所述的组合物，其中，所述腺病毒基因组与自体末端蛋白复合。
36.根据权利要求23至34中任一项所述的组合物，其中，所述腺病毒基因组与异源末端蛋白复合。
37.根据权利要求23至36中任一项所述的组合物，其中，所述腺病毒载体缺少Gateway重组序列。
38.根据权利要求23至37中任一项所述的组合物，所述组合物已经过并通过了必要的质量控制测定，从而允许用于GMP生物制造。
39.一种重组腺病毒载体免疫原，其包含权利要求23至37所述的组合物中的任一种，表达针对在哺乳动物中产生的免疫应答的病原体或肿瘤表位或抗原。
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