HU230488B1 - Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására - Google Patents

Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására Download PDF

Info

Publication number
HU230488B1
HU230488B1 HU1400619A HUP1400619A HU230488B1 HU 230488 B1 HU230488 B1 HU 230488B1 HU 1400619 A HU1400619 A HU 1400619A HU P1400619 A HUP1400619 A HU P1400619A HU 230488 B1 HU230488 B1 HU 230488B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
sequences
cells
sequence
adenovirus
virus
Prior art date
Application number
HU1400619A
Other languages
English (en)
Inventor
James M. Wilson
Guangping Gao
Soumitra Roy
Original Assignee
The Trustees Of The University Of Pennsylvania
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2002/003364 external-priority patent/WO2002063806A2/en
Application filed by The Trustees Of The University Of Pennsylvania filed Critical The Trustees Of The University Of Pennsylvania
Publication of HUP1400619A2 publication Critical patent/HUP1400619A2/hu
Publication of HU230488B1 publication Critical patent/HU230488B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/235—Adenoviridae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/17011—Spumavirus, e.g. chimpanzee foamy virus
    • C12N2740/17022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

snu áN AOFNOVÍKl S M RLE INSAV ES AM1ML5 W-SZFKVJ-Να V VI I ARI'ALM V,0 VEKTOROK, ÉS ELJÁRÁSOK ANNAK. ALKALMAZÁSÁRA
A találmány tárgyát képezik rekoosbináas sirnian adenovirus-szekvenciák és feeterológ gének szabályozó 5 szekvenciák kontrollja alatt. A. találmány tárgyát képezik továbbá shnlatt aáemWmgéníefeeX expresszáló sejtvonalak és eljárások a séjtvomifek és a vektorok alkalmazására,. továbbá a fentieket tartalmazó .keszítaiények és alkalmazásaik.
Az aáenovfeasok ketiősszálú, körüMSl 36'tóobásás (kb) körülbelül geaomoi. tartalmazó DNS-véresők, amelyeket széles körben használnak gémmnszfsrre tr vírus azon képességeit kihasználva, hogy nagy hatékonyul Sággal juttat géneket különböző eelszírtciekbe, és tmszgénb%fega4ó kapacitása nagy. Általában úgy járnak el, hogy az adenovírusok Ei-génjét eitaxotaják, és a választott promótert, a kérdéses génnek megfelelő eBNS·szekvenciái és poiiadouilezési helyet magában foglaló trasdzgén kazettával helyettesítik, repíikáeiö-defeiöns rekombináns vírust hozva létre.
Az adenovtrusok jellemző morfblógiájánk, bárom jelentősebb proteint, bevont (11), pentonbáztst (111) és 15 gőmhdoméshen végződd ilfeerprotaitpét („knobbed fíbed), valamim több kisebb jefethőségü: proteint:- VI, Vili, IX, I lla es 1 \ a2 - tartalmazó ikozaéderes kapsziddal [W.C. Rnssek X Gén. Virol. 81,2573 (2ÖŐ0, rmventber)], A $. u-ua-enom lineáris, kedösszáiü DNS, amelynek ó’-végéliez kovalens: módon protein kapcsolódik, és amely ltom Vét terrmnális ismétiétiö egységeket átverted tatzsmof zepeöí,?, i'LR) tartalmaz. A virus-DNS szorosan kap, -«Módik az igen bázifcus Vll-proteinnei és egy kisebb, stn elnevezésit proteinnel. Egy további protein, az V,
2(1 a fenti DNS-proteln komplexbe van csomagéba, és: a VI. proteinen kérésztől strukturális kapcsolatot létesít a kajsziddal. A vírus a vírus által kódolt pjoteazt is tartalmaz, amely a több síraktitráks protein átalakításához, ezáltal érett, fertőző vírusok keletkezéséhez zuk Jeges,
Reköiöbimins adeiíovsrtisok alkalmazását már leírták molekulák bejuttatására gazdasejtekbe. Lásd a ö.083 716 szánni amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást, amelyben két csimpánz adenovirus vektor leírását találjuk.
A technika állása szerint hatékonyabb vektorokra van szükség, amelyek ellen a populációban eredetileg !W mutatható ki immunválasz különböző adenovirus-szerotipusokkal történő korábbi találkozás áltat indukált immunválasz következtéixat. és/vagy klvám esetben alkalmasak ismételt beadásra és második vakéínázássat titaremelkedesf célzó megerősítő oltásra.
dő Az alábbiakban összefoglaljak a találmány szerutti megoldás lényegét.
A találmány tárgyat hat sintian adenovirnsból származó izolált mikleotta-szekvsnciák és amihosaw szekvenciák, a szekvenciáját tartalmazó vektorok. és síntian adenovírasgéneket expmsszálo sejtvonalak képezik.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezik eljárások a. találmány szerinti vétenék és sejtek alkalmazására.
A találmány szerinti eljárásbán egy vagy több heterológ gém juttatónk emlős betegbe a találmány szetittti vektor beadásával. Mivel a különböző vsktorkonstetkeiók humán adenovirusok. helyen mákon isimianí adouovimsokbői származnak, a nem majom humán vagy állati gazdaszervezet korábbi: találkozás hiányában nem reagál azonnali immunválasszal az idegen antigénként prozentálódő vektorra., A találmány szerinti készítmények alkalmazása tehát nem majotn beingnék beadva a kiválasztott tianszgés sokkal stabilabb expresszióját
4Ő teszi lehetővé. A találmány szerinti készítmények alkalmazása vakcinákéin lehetővé teszi a kiválasztott antigén
115688-6132 SG prezentálását, ezáltal protektiv immunválasz kiváltását. Anélkül, hogy igényünket bármilyen elméletre korlátozuásk, a találmány szerinti aáenovirasck húsún dendritikus sejteket. feanszdukáló képessége: felelős legalább részben azért, hogy a találmány szentül rekoofomáss konstrukciók ismmmválaszt váltanak ki. A találmány szériád .rekomfeíséna sírnám adenevírusok heterológ génieunékek la vto elöáliöásáía is alkalmazba-ók, Ilyen géutermékek maguk is alkalmazhatók különböző célokra az alább fejserieíettek szerint
A találmány fenti és egyéb előnyös megvalósítási módjait az alábbiakban részletesebben is isjaertepttk.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csasolt ábrákat.
íb'u t é 1 <.mnp<jv xzfeo íU'íís t/or>>s Vson n s^-scne J v68 .¾ mpanz sdeuovirus(Fanéj [14. azonosítószámú szekvencia], és a találmány szenntt éj Pan5 [1 5. azonosítószámú szekvenciái, kané [ló.
iÖ azonosítószámú szekvencia], és Pat:7 [1?. azonostíóvámú szekvenciái csimpánz adenovímsok hcxon» kapszidpTOteísjeí 1,1 hurokrégiójának, aminosav-szckscjxnu,.! és az 1,2-hurok egy részének: aminosav-szekve»ciáiáí rendeztük páronként! szekvencia-összerendezéssel egymás mellé, A közbeiktatott konzervált régió a különböző- atlenovirus '’erctmasok esetében konzervált alapdoxaén egy része,
A 2. ábrán a k<'$ csimpánz adenoviras {Pan-9l [18, azonosítószámú szekvenciái, Pan-6 [19. azönos&ó15 számú szekvencia], a Pan-7 [20, azonosítószámú szekvencia}, a Pan-5 [2:1. asonositöszátRÚ szekvencia]: és a humán adenou’ux vwtipt& [22 azvnosímvámu wksvncta} és 5 szerodpus (23. azonosítószámú szekvencia} fihvtj'óntbdoniéujgí arninosav-szekvenciájáaak szekvencia-összerendezését mutatjuk be.
Az alábbiakban részletesen Ismertetjük a találmány szetim! megoldás lényegét,
A találtnáay tárgyát az AdPaa5 [1-4., 15 és 21. azonosiiószámú szekvenciák}:, Aá Pan-ö [5-8., 16, és 19,
2G azonosítószámú szekvenciák] és Ad Parö’ [4--12., 17, és 21). azonosítószámú szekvenciák] szerötiposekbél származó: új nukieirmv- és axniaosav-szekvenciák képezik, amelyek eredetileg csimpánz nyirokcsomóból istiek izolálva. A leírás további részében ezeket az adeuovirusokat esotcakéíü C5, C6 és C7 adeso-viiusoteak aew?.zük, Szintért a találmány tárgyát képezik az eredetileg eynpmolgus majom vesesejfekbői izolált. SV1adesmvírnsböl származó szekvenciák [24-28. azonosítószámú szekvenciák]. Ugyancsak a találmány tárgyút képezik az eredetileg rhesusmajo-n véséseitekből izolál· SV -25-adcnovírtisböl származó szekvenciák (24-33, azonosítószámú szekvenciák] és SV-SP-gílenovíftísból származó szekvenciák (34-37. azonosítószámú szekvenciák].,
A találmány tárgyát képezik áj ades&vwsvckiorpk, vaiamiíd beesomagölú sejtvonalak a vektorok elóállíiására, amelyek alkalmasuk jekombuuns proteinek vagy feagmeníomok vagy más reagensek ín vkro lenaeié38 sere. Bzen felül, a mlahnany tűre;·. ü kepezfe bővítmények heterológ molekulák hejobaiására, terapsas vagy vakeoúzasi cclrastal A? dvea tempsas Ogy \'akcmakészhméó.yek inszertáit iieíerelóg molekulát tártál nwv adcmníni'oektoít tartalmaznak. Λ uhimany szermsi áj szekvenciák a rekombmáns adenövirus-a.ss,wiak mrastektmok tAAVl termdó-.fese szempontúból kulcsfontosságú helper (segítő) iúnkciókat is ellátják, A találíSián.y tárgyát képezik a fenti szekvenciák alkalmazásán alapuló helper komstrukeiök. eljárások ás sejívonalak.
.Akkor mondjuk. hogy aukiemsav-szekvencíák vagy azok feagmentumai 'lényegébets homológok'' vagy ‘'lényegében hasonlók, ha optimális páronként! szekvencrafosszeresdezés «setén - megfelelő sukieinsavinszercíók és - deléciók közbeiktatásával - legalább körülbelül 95-99% azonosság mutatható ki az: összerendezett nukleinsav-szekvenmák (vagy komplememer szálaik) közt.
Akkor mondjuk, hogy sml-msav-szekvenciák vagy azok iragíuemnmaí “lényegében homológok” vagy lényegében hasonlók”, ha optimális páronként! szeks-eneín-összcrendczés esetén - megfolelö aminösav115688-6132. Sö lőszereink és -deiéeiők közbeiktatásával - legalább körülbelül -95-99¾ azonosság mutatható ki az összereadezeít .smmosav-sxefcveacták ken.
Előnyösen, a hömológia a teljes szekvencia vagy általa kódolt protein mentén ktmtüáíhaíő:, vagy annak fegaUbb $ an'«nöuivl>ö{ álló fragmentuma menten, előnyösebben 15 aminosavbói álló ífago-senruma mentén kimutatható ilyen fragmentu-nnka; ísmenerünk az alábbiakban.,
XuUIeinxiv -szekvenciák vonatkozásában “százalékban kifejezetett szekveoxia-azonosságon vagy azonosságon' a szekvenciák optimális páronkénti összerendezése mellett a két szekvenciában megegyező mi kleoudokat éftSnk, A szekvenesarazonosságot vizsgálhatjuk a genom tejes hossza mentén (például körülbelül 36 kbp mentén), egy gém protein, alegység vagy enzim teljes nyitóit olvasási kerete mentén (lásd például az adénovírus kódoló régiókat ismertető táblázatokatj, vagy kívánt esetben, annak legalább 500-5000 mikleotíd hosszúságú fragmentuma mentén.
Az azonosságot megállapíthattuk azonban kisebb ihagöxeötiawk, például legalább 9 uttkfeotíd. tipikusan legalább 20-24 nnldeodd, legalább körülbelül 28-32 nmkfeotsd, és legalább körülbelül 3ő vagy több uukieotid nénién. A hasonlóságot, százalékban megadott azonosságot’' aminosav-szekvcne iákra Is egyszerűen, megadta hatjuk a teljes protein hossza vagy annak fragmentuma «testén. A fragmentum legalább 8 ttminosav hosszúságé, de lehel akár körülbelül ”úö ammosav hosszúságú -s, Ilyen fragmentumokat az alábbiakban ismertetünk.
Az azonosság fokát algoritmusok es számítógépes programok alkalmazásával határozhatjuk meg egyszerűen, alapértelmezett paraméterein mellett BiÖnyősen, az azonosság a protein, enzim, alegység vagy legalább: 8 amínosav hosszúságú fragmentum .teljes hosszára vonatkozik. Az azonosságot- azonban az azonosságot mutató gétüermék felhasználásának megfelelően rővidebb régiókra is megadhatjuk.
Kívánt esetben, az összerendezést végezhetjük térítés ne .kai vagy kereskedelemben hozzáférhető Multlpfe Sequence Aligment Program, például a Clustai W alkalmazásával, amely hozzáférhető a Web szervereken keresztül a? interneten. A&ahnazhatíuk a “vector NTF' slkabaazásokítt is. .A teofenika állása szerint számos algoritmus» ismert, amely alkatai a imklecitifezekvencia-szottosság meghatározására, például a fedi programok által tartalmazott algoritmusok. Ifeiimtkleoítd-szekveoelák Önszehasoniihaíck még a fasta, a „öí.lö Version ő.i fezét képező ptogram alkalmazásával. A fasta- az összehasonlítandó és adatbázisban szereplő .szekvenciák legoptunáúsabb összerendezése mentén végzi el az átfedő régiókban a páronkénti összerendezést, és határozza meg a százalékos szekvencia-azonossagot. Például,, xtukhíitssav-szekyenosík százalékban megadott szekvencia-azonosságát meghatározhatjuk a Fasta segítségévek a „GCö Version 6.1” alapértelmezett paraméte30 rei mellett: (szóhosszúság-tó; a pontozásos mátrixra N'0'P.AM-fakíor}, amely teljes terjedelmében a kü&ttüás -részét képezi. Hasonló pfogratttok.állnak rendelkezésre ammosav-szekvenciák összereitdezéséte. Áfíatáuosságban, o/ekeí a programokat: alapértelmezett- paraméterek mellett alkalmazzuk, bár a beáliításofetí szakember igény szennt megváltoztathatja. Szakember alkalmazhat inás algoritmusokat vagy számítógépes programokat is. amefrek ts referencia algoritmussal vagy programmal megállapított axottossúgi szinttel legalább megegyező ihkü azonosságot képesek megkeresni,
A leírásban és a csatolt igénypontokban ..tartalmaz” kifejezés és annak változ<ttai („cömpris&s'', „eomprising’'! más komponensek, elestek, integerek, lépések és hasonlók jelenlétére is: vonatkozik, A „valamiből ált * „valamiből felépül” kifejezés kizárja egyéb komponensek, eleinek, integerek, lépések és hasonlók jelenlétét.
115688-6132/SG .,
Λ találmány tárgyát a természetben előforduló környezetükből,.-azokkalasszociált más vitásoktól izolált Pan5, Paaő. Pan7, SVL SV25 és SV39 nukteittsav-szekvsiteiák és - amiaíssav-szeto'eactek képezik,.
Aüyktónsayögetengiák
A találmány szerkái Pa»5 nuklémsav-szckveaeia az' 1. azonosítószámú szekvencia /36 462. nukleofrdjaií tartalmazza. A íalálteáay szerinti Fanő atíclemsav-sxefevesefo az 5, azonosítószámú szekvencia I36 6ö4 ímklectídjalt tartelinazza. A. íniábnsny szerint: Pás? nakleinsítv-szekveneia a 9, asotrositőszámú szekvsneia /36.535 nnkle-otidiait tartalmazza. A találmány szennti SV1 unkfotasav-^ekveac-tá-a 24. szonpsitószámó szekvencia 1-34 264 wkieotidjait foglalja magában, A találmány sassdali SV25 nukleinsav-sze:kvxncía a 29, asonosttőszámö szekvencia /31 044 nukleetidjaií .foglalja magában. A találmány szénán SV39 nukleinsav19 szekvencia a 34, azssnositószánm: szekvencia /34 1 IS antóeóítdjatí foglalja magában. Lásd a sznkvenciaHstát, amely teljes ieqeáehnében a kihmhás részét képezi, \lalalmam. vírat.iittÁM 'zck,t.trn k; «. , u sora \o/:k a, s 24 2' es '4 azvncM.es/mtu szekvenciákkal komplementer szálakra, a szekvenciáknak megfelelő R'NS- és cDNS-szekvencxákta, e·» azokkal komplementer szálakra. Színién a találmány tárgyát képezik a szekvenclallstában szereplő szekvetut. Lkai 9515 9556-801 nagyobb mértékbeö, előttyösen körülbelül 99-99,9%-ban homológ vagy azonos nnkleinsavszekveneiák; Ugyancsak á találmány tárgyát képezik az 5„ 9„ 24.. 29. és 34. azonosítószámú szekvenciák természetes variánsai, és komplementer szálai. Ilyen mődosutások. lehetnek például a technika állása szériát ismert jelölések, wttlálás, és sgy vagy több természetben; élőfötxluló aukleotiá szubsztitúciója degenerált nukleoiiádal,
A találmány tárgyát képezik továbbá a PaaS, Fanó, Fan?, SV1, SV25 és SV39 szekvenciák frágxnenta20 mát, azok komplementer szálai, és azoknak megfelelő cDNS és RNS-szekveuciák, A fragmentomok előnyösen legalább 15 nnkleetid hosszúságúak, és azok lehelnek funkcionális fragmentumok, azaz biológiai szempontból érdekes fragmentinnok, Ilyen fenkeionáhs fragmentum expresszálhat például kívánt aőenovims-íermékei, vagy alkabnazbídő leltet rekombináns vsrosvektorok előállítására. Ilyen fragmentumok például az alábbi táblázatokban felsorolt génszekvencták és fragmentumok.
AZ; alábbi láblázatokban a. találmány szerinti smdan adenovtrus szekvenciák átirt .régiói: és nyitott olvasási kereteit adjuk meg. Egyes gének esetében a hranszkriptumok és nyitott olvasási kertnek (ORFj az 5,, 9., 24., 29. és 34. azonosítószámú szekvenciákkal komplementer szálon ;aiálhaíók. Lásd például, E2b, 134 és E2a. A kódolt proteinek számított molekalalő:negét is megadtuk. Felhívjuk a 6 gyeimet arra, hogy a Panő Bit: nyitott olvasási kerete [az 1. azonosítószámú szekvencia 576-14316. aukleotidjalj, a Panó El a oyitoti olvasási kerete (az
5, ttzonosiíószánrú szekvencia 576-1437. nukleotidjai}, és a Fan? Ela nyitott olvasási kerete [a 9, azonositőszámb szekvencia 576-1437. nukleoiidjaij belső hasítási helyeket tartalmaznak. Ezeket a hasítás: helyeket a táblázatokban jelöltök:.
11:5668-6132:50
Ad Pan~5 [1. a.sz.sz,] 1
Réí’iók fedet Vég ~ (Kööeotid)
fTt 1 120 Λ·
Ela ! ΛIV\<U'i ’ff 478 »
ns 576-654,1233- 1435 36750
ns 576-1046, 12331456 54»^ /
95 1436 m:
........ .....''·····— ....... Trsnszfcfiwtto | i l5l § U............... __________........ ... * ;
feli $ : ‘5 rsfiszki·· vuiYs }>52
KÍCSí I 1579 2171 35.3/7
Naav ’· niM 5412 555F5
IX 5472 5950 | '
5759 ' -Sf :
.................¾ írafiszKrsrutKH i j
RTF 10347 §451 22236
FöhífKfSZ 8448 5083 /52257
1V;C 5770 50766
rsmszfcwSííja 3760
Ö 5155 5977 5674/
Agnoprotem noo > oa 55755
| ti FíaBsaicrvattítn 10847 -
52Z$5b 17351 12025
Kla i noo 13819 1 65662
5'Γ,3Β’·Λ.π»ίι(ίη nm ~
$ Transzé nnam k.................................. '8F4
o Fcnton 13898 1 15490
vu n^4 sMr$ ?/475
V nn;' ml 57506
Ma rtn. n-tn^ nJT
ÍíW4Mií:« ; ϊϊΐη^-Λ.Λϊίϋίϊϊ 1748S Ϊ 17442 ί -
b j § VI 17471 18222 5(W ’
Hexán nn' oun /77674]
bnfjooiVK.-i?. 00789 2Π83 36564
1 Γ!ί»1\ί!>!>{ΐί<::Β onu
.. 6
; Ad Pan-S (folytatás) [ 1. a.sz.sz. j ) ~ ......~,,,.,,s, .v.v.......... ................................. .......
! Régiók Kezdet Vég ! mik lentid) Aöt«kutaKiBeg Í03ÍWSI)
E2a trí«!$:ito»;usR 26782 | •A
D.BP 23386 21845 57556
'í-taw&t íöííírí 2178S -
1,4' Í!3nSSto5»ítí··! 22406
* 4 5 • 10<D 23412 35805 \ -x Xt s
V X >5 -V 25525 26356 ?Ú3$ ’
: ~ · r ,y« ; r 3í»zkfiaítif« . BÚ8 27H1 3B21 ?4 75
ΓεΤ1 irssszsriffl.ara ·{ 26788
Ort'^i 27112 27432 3022
forhV. '27786 2S012 35040
OrÚÚ 2 B94 28527 /0525 1
Orf #4 23S57 291 2ö 22567 1
Orí45 33169 29783 5229?
Orí#b 29798 30673 5/959
0rB7 39681 i 30956 3047?
ohps ; .bb: 31396 b53J
Úrf 49 5 3 U8P 31796 /5236 í
Trsxaszknptam ..........'....C... ...............r.. £ ?lSú -73
1,5 rssssszfeoptyns 37032
Fw 32035 33372 γ Ú B
?ηκϊ«Λπρ&ΒΒ 33443
BÍ N ΙΑπνΙηρ'.ίίίϊί 36)35 • 5 ·*
úsC 7'B 33462 9/9/
Ofíó 'Bú 33710 55905
Ú4'4 34836 34521 /557/1
Odú 33249 34806 { /3641
Őrt 2 55635 352461 /4584
1 Otf 1 16956 35679 /5772
Asssy. w-ssss... .. ,. I w$k<Xknpvwn ; 33437
j ÍTR 36343 | 30462
Λά Paad? [5, aasz.sz.1
Régiók Kezdet Vég ' Mototeíjsw (nyJsieoM) (OaítOfi) |
Í1R. X 7 t «j 153 |
eu ii'.JÍiiíinpilÍSU 4?8 ΐ
13S -OdD. 123^ } 1457 5620/
ns 578-1050. Ϊ22Β 1457 24453
9S 576-6¾ 12.291 537 ÍÖ/Ő2
s , ’ Vtí'XÍ'. 1«í. JJ . A . aiúuaa. .....4·.. . . „„AUA^AW.- - -Ί 151 íj •v.
Elb 1 í Jeaiij.'k-íptön i P553 5 db
km me 275/5 |
f am''r i 1^05 34 Ü 555041
Πχ ’ im P>76 B47
TraftsArípíiSi» • 3005 v. ;
: EB TmsKtóBss» 13341 ‘
FIT .0530 5451 72570 1
íPotteeiáx 3443 5050 /2Ó0P7
!Va2 5610 3956 59457
......... Vt»WM>ewm í .1063 -
[ :u Ímft-ítepsum 13535 *· V
\ib<5 b-m 12012 44205
i i Illa ' 12036 $-------------------------------------- 13790 45460
'smfcíKnpnari. k 13512 * i
; :sa u 5 R$1 5085 .™~,,.......„,„,. w
* Ápjkd'hRm 7470 5580 25M7
- í: ϊ -.ίίϊ'ί χ-ρί'ΐίϊ! 1 5574 ............í
B375 ) )3467 503/4
í VU ; D4Ti ΒΟ35 2 /503
ΗλΫ, 115 25.255
i 1 Mu ; 17160 17393 4505
iTwr&eknpium ? -----Jo................^' ...... 17415 »
1.3 Tmnsítepsum : ) 7460
Vi 17469 18U8 25569
i Hexon 14534 21112 / 06/ 32
1 EsxtopnMease 71134 217541 Zp4j
rmn&í'knptuiyi í ... A...... 21003
1 Ka ‘, l'ftaöszfcopfe«R 26780 SS
. DBF 5'Bf: 3134? 5 l'/dP
Trdi's.íki rtunt >-<4 Í>A>^^^aaa^.......:..2
<s* χ2 Sv
: Ad Pan-ö (folytatás) [5. a.sz.szj
Régiók )..............<....................................................... . Kezdet Vég: Möfe&am&nag ÍPü- {mácleoiid) í(í!5·
U TíTíaakripíism 23393 :::
IfSŐ 23404 25306
33 W hömolög .....25523 26337 20000
vin 26426 27100 247/9
TíKíst-zkr-íitera 27419 V
i IS Tníiszkripnim . . : :: 2ö?S6
í ÖríOf 27Π0 27430 /2005
f 1 :< CM07 273^4 23007 22540
őriül 2?W 23519 /0460
I Orf ^4 24553 2'€5n 22402
OrfüS 29240 1 29340 22520
OrW 29375 30741 5/025
Öné?............... W49 51024 /0400
Orfüa 31030 31444 /6240
} ÖdW 3Í437 31344 /2207
ΐ tninszKnptu.!:! ) 3(90?
) 1.5 : Tr&ixixkivc&sm 32150 1
i Rher ? ? 165 33493 47564 í
£ratt$zfrnptítfft í rpansztasíííijft 1 23574 -
Orf 7 ( 5)44) ? 33593 W// i
: OH 6 54744 33541 52604
0rf4 !. 34652 /5057 |
OH 5 i 55330 5 35027 0502”'
1 OH 2 1 55764 i 35377 : /472?1
Orf 1 ; $'0Ϊ<Μ • C <> J· '* $ Λ>,Λ> «X >
Trans/fcnptuí'·. Γ 53555
rni Π§ΙΪ : 36604 i ~ 1
ÚSW-éöb'SG . 9 .
Ad Fan-7 (9. a,sz,sz.]
Kezdet Vég (suRkmid)
Réuiók
Mf>Sökiií;ití>!«eg: töiííís;í!)
US $76-1143,1209-1937 560/6 1
ns $76-1050229- 143? 2404/
9S 1229-1437 20(02
Tfafíszkfiriííjríí i 1316
Bb B2b 'f'.'.‘:fiSí.k!'!f5faí'.> i ] ÍV} - :
í iöVO 2178 22250
NagyT „ 1905 3419 55696
A V <&&· \\XX\\\XXXXXX\\\\\X\W.X»Vi,V.\V.\V»'\'X Ttaa$2te»tKa Írji'.s/kriíííwn PTp Pöiiüjej'áí w; [ 56¼ .......... 1 ty?i “Ί034ΓΓ~^ 103401 845? ~~----------------------- 345I 1 4095 592.09 χχχχχχχχχχ\χχ\χ\χ\\\\χχχχχχχ\χχχ<\χχ<<<<<<<χχχχχ«χ·> 726PW
IX 3504 1 3932 /444/
Traaszknptts?» 1970 X- 1
OlkD 5167 I $99 H 0567?
Agnvprötesn 3761 S566 j 2542?
U FrassszkiKteJS i 9539 ί 1
5/15? kO 10036 i 12ÖI1 1 77592
HU 12035 i B7951 oE/F
TraaszkrííKSJ)» i 15300 i
L2 Ifjü.'.ztópmra ' 53 93 .............................i.....................
! Pániba 13874 ISW) 5MM
VB : 15473 16057 1 2H59
V 5 I61B2 :7B9
Ma ; 1716? 17400 5506
TfairnkfiptuHi 17020 ...............................................3...
o P46?
Ví 17470 i im$ 06/05
Hexán ÍS2S8? 21080 /ÍUO
E;KÍOf;?e<«iz 2II06 1 21732 5501
1 FnassztepSufn í 201 :
i 82a Tmnszfcrtpfs»» „Ό$4 i 1
DBF 23333 L, í-'20$ i O'O
I isas&tef* $ «
:!Ö-
Ad Fan.-'? (folytatás) [<λ. a.sx.sz. j
Kií'Kifti
Régiók (nukkíotkl) iOüwn)
M rrdstóxkoptwjfi 33370 Λ
lÖOkD 23370 3ő?Í) 32029
33 kö 25489 263 3S 2W5
Immolög .....|
VÍÖ 26410 27093 37242
^'msxkt^wt 274(14 ^SW^\\SVA\SS\\\\\\\'AWAVAWAW.V.'.'.'.S\'.VAV«\4 - !
5 ϊ -ü<*? FnKszx'npfcirB .......... : 26770 : * *
Prí#l | ΐ .'·*·*$ ·< 3 « Z /2056 .
0rO2 27364 2794Í 32ü0 |
003 207O 2Ö0 /9062
(MM 2SS30 ‘ 29150 22907
(Mid 29163 29777 ..............
ÖríOO 29792 30679 522531
0rf#7 30éP 30962 /052/]
3096S 31399 M//0 j
: Orf 39 31302 31799 /5205''
’isuBvkrip'.íím 7 :: ,,.J, 31642
ö : TraSSSÍ'kíipííífE! 2209 í
F te 32094 33425 77J77
'Mw&rspm» 33517 ................................... ’
1<4 7 fa»-«krifRíHFí 36208
cm? 337S4 33336 9/9/
Örf s ÜüO 33784 55062
Orí4 34960 27595 /5279
On3 3S323 .0970 /567/
CM 2 36709 55320 1 /7094
(Mi 36123 8<\9 /5776
Ϊ «ífSjíkrsS’KH 283501 > <*
Γ ’rSC” 2 jS<4A-*' 50535
Π S6&8-6 B2/SG
Jl..........·Ί Λ 1 AdSV-t [24 s.sz.sz.j Ad SV-25 [29 3ΛΖ.5Ζ .j Ad S\ - 16 ; {34.az5z.szd 1
Résié Seí-deí Vés Kezeset Vés Vesikt Vés
: 1Τ». ............................1 1 HM 1 133 1 í 50 _____
EU 352 1O •v 4Ö4 W)
VOI 2591 339 ................. . ,.. 2273 1514 3877
üb 2552 905? 27.54 - 10143 .3868
82© 24415 39251 24034 20ÖS6 25381 21224
EZ s 24974 27806 24791 25792 25790 20330
B9 33498 '4881 50696 25103 33096 51157
1TR 34 H5 ................................. 54264 ............................ 30912 3104-4 33966 34115
.................................... Ad SVA [Wsz.szj ................................. } Ad SVAM [29 a.szxzj Ad SVA9 [34 ;l..«z,szj
Rósííí? ................................... Kezáet Vés KsZtkí Vés Kexks Vés
JTR A 166 1 133 _ l ISO
1,1 9313 12376 9343 12296 $ W16 13383
LE 12453 15838 1.2253 15696 L..... .... .......... 13ÍÍ4 .10077
1.3 1091 § 59274 15744 20066 17783 ?U92 L.S.......-1
-U 21715 25663 21520 1 20426 22659 2642?
IS 25959 30899 25529 25172 29513 31 ho
int 34145 3A7R 39912 31044 5AW 34110
11568.8-6132/SCi
Ad 8 V- 1, 24. a.sz.sz.
Kezdői W Midefc.KÍs- : iÓÍSSg
mt Ü ' ' 106
128 457 953 83829
12$
m KEI
Nagyi' GM 2413 02295
rx 23M 288 S )<W
(Va2 •GM 2928 58997
£poKj»eráz e-7M 40.82
Fi? 8 25 7 n? i 724/5
Aymeiehéqe 6839 7453 29960
U 5Í/SSW 9>:$ 19942 02675
HM FXXG G322 858568
íd P«siior> HÓM 17063 56725
νη BHiS GS31 29597
V S FSH 59570
88; ISM5 G33? ______ 7M9 .........................
ü VI. .............................. ÍS9H fc. M738 580 /9
UGM 15636 /68020
Endopxo’eáK: t9M3 2öMi : 75 M'
2s DSP .Ίλν 293 Π 52/97
U rxw 2G21 2-W 35593*
: Vili ps>}j 25292 :.......... 255.99
M56X8-6732/SG fehérje Ad SV-3 C&iysaíás)
24. S.SZ.SZ.
A'*Tí J*KCtCv./>.<.» s χ , v , s.
Kezdet 3*u.^cwixao twfíí-g }
ja OH'B 25292 25539 37.959
Orf« 25565 .2608! 3$B9
3 <W3 2BS4 26S23 W
Örf T?4 0/33 27/9 7Ö272
OH'45 27Π7 3 7512 726·/
Ódád 275ÖS 27873 330
I ? OBr 42 28952 23/9 <3372
dbod! 25/2 39867 57722
0/7 0325 39892 7327 ;
Ϊ.Η6 .............................................. a 3/2 5/22 52223
0/4 33277 33935 M35-?
3 OH'3 i i.............................................. • 5'> 32279 35.W
»42 33ÖB 32626 59752
öffl 3B23 37373 7 <393
1TR 34} 45 ...... 54244 ·.........—
1I5688-61323SG
fefeége --- -—- -------------- Ad SVUS, 29, a,s«.sz. Ad SV-39.34. a.sz.sz, „ Ívfeiíítehi- Matek- i&éxM Vég Uswg .Ksssfet Vág iiwg ;
ΓΓΚ 1 133 1 ISO 1
Eb US ) 492 US5 18582 )
US 492 IMS 25063
£ií> KOT •m Í030 16274 Í5Ü 20?2 2/622
\:UV 629 2244 527/6 ifö 3349 22239 )
IX 2306 27? 6 /2259 3434 3U4 /5672
£21> ÍVŰ MOS :?v .«o 59U 5:41 ................. 46/64
Poíifscrór .................. 6S6Í tus 1029/9 7723 3653 /62982
FTP ’MA? 7297 \V 55,43 $M' A) ' Ό
A«skx 164SÍ prdtw ( 7539 ' '535
ti 52 55 6.0 «b .........................i.................... UO ί X7O5 ( 104555 13666 44252
üb ? 50493 2202 63294 Ml 274 13364 66676
Ü Pssitosi : U'264 ?3S01 25tA 53440 149354 26263
VII 1« :4369 25566 UO 155)7 26574
V i 4M6 :SO 590 Í526? Ϊ6626 52676
1S4S3 UW 599 16630 165571 7467
ü Ví 15749 1659? 563·/? 16323 l'?693 22645
Hexöí* . iöSSi :9446 /67622 i?'§5 20538 /9?2é
aeo-protefe. 0855 20622 25256 205? ?> 71 ?§ϊ 227/6 i
: 28 i U8P 212Π 70123 22/66 7.2635 2125Ϊ 5//66
U WW 2ÍS32 .5S> ÍS926 226S9 i 25253 1 /602
: Vili 7.4400 2S1Ö9 7254? 25450 ? 26ÍÖS : 22726 ------j J .
i i3688~6132/SÖ
r-ehépe 1 SY-25 folytatás c <í Ad SV-29 (folytatást, 1. 3-s, a.sz.sz.
?o 4 ' S/ Möfc&eU- J tömeg
Kezdet Vég Ks.tee. Motekula-
i Vég «W
B3 25109“™* 25-06 .//845 2§3?5 .....................: 22434 42257
22530 23352 29745
Orfs.3 2S370 . 23045 103/2
OrfM 28362 29333 /5B5
On kS
Örfáis j '··'....................·
1-5 bibét 42 2538O 3002 > 5 7>2:2 í ___________________4
Fsbet á 1 vív 20120 40202 29515 3)U0 53252
E4 Őri’? 314-1Ϊ 31113 //824
Orfó 29235 25592 55295 32592 3H3S 5543?
Őri'4 29550 29143 /4399 3253? 22223 /5997
Ori'3 2VB-2 29552 ;5284 32054 /raB” /552?
Őri'2 20291 29350 /BÍ3 3354S 32959 /48?/
on'i 203 ló 30ö9ó /430/ 33204 33324 /4235
IÍR .............,............. 20912 2)044 32900 34115
V Pun' 0 rte, far' S\ 1, *A'25 es Ά cesro'.trus nukle iw\ s/ek'.e \ tk mkalma. h< íek .emmas ágensekként és különböző vektorremlszerok es gazdasejtek előállítására. A leírás szeműi érié lem ben, vektoros:
ériünk bármely ilyen tankcíö betöltésére képes nukkunsav-molekukli., ezen belül csupasz DNS-t, ptazmídot, vírust, kozmidot vagy eplszrmsát. Ezek a szekvenciák és termékek aikalmszbalék egyinagukban; vagy tnás aden-ovírus vagy nem aáenovírns szekvenciákkal vagy fragmentumokkal kombinálva; vagy más adé«ovín?s vagy nem atleoovjrus szekvenciák elemeivel kombinálva. A. találmány szerinti adéaovrms-szekvenciák aniíszensz vzáiHtóvektorofcként. gémeráptás vekiorokként vagy vakcina vektoricként is alkalmazhatók. Szintét! a
Ki tik mw arp t k.peuk tehat a tol *, 'v -, , m k, ns. r,n<! d c 'irt n w rak -. m< \ ixkvdav génszállitö vektorok, és gazdasej tek.
A találmány tárgyát képezik például a találmány szerinti simian Ad ITR-szekvenciákaí: tartalmazó nuklemsav-molekulák. Ezen felük a -találmány tárgyát képezik kívánt Ad-gémermeket kereső majom Adszekvenciákat tartalmazó rmklektsav-ttxOekníálc A találmány szerinti szekvenciák alkalmuzavávsl előállítható i 5 egyéb unkleinsav-molekülák a leírás alapján szakember számára nyilvánvalóak.
A találmány sgy további előnyös meg valósítási módja szerint az általunk azonosított majom Adgessrégíök alkalmazhatók különböző vektorokban. heterológ molekulák eljuttatására a sejtekhez,. Vektorokat eibaibihamstk poklául aclenovkus kapszkiprotein (vagy annak fragmentuma) expresszsitatására. becsomagoló guzíkíséiiekboé, alkalmazható vlrtiSvektorok létrehozására. ilyen vektorokat megtervezhetüifteügy. hogy azok a kívánt terméket irausz mödoo ekpíésszáijáfc. Ilyen vektorokat megtervezhetünk úgy is, hogy kivárd, adeno-v&us
115480-6132/90
Uőtenketökní - példáid az. Ela. bdb, a terminális ismétlődő szekvenciákat az.E2a, E2b, E4 ás/vagy E40RE8 régiókat - expresszáiő szekvenciákat stabil ttte&mtartnlmazö sejtvoaatot kapjunk.
Az· attettovírus géttszekveuéták. és azok fragmentumai alkalmazhatók továbbá &elperfrmkctó4ljggő varasok. (példám esszenciális funkciókat ellátó régiókban deisták adettovírus-vektorok vagy adeno-asszoctált víru5 sok; AAV) elbáShtásához szükséges.helper- (segító) funkciók ellátására, ilyen vítüsok előállítására, a találmány szerinti simian. adenovircs-szekvenesákat humán Ad-szekvencíákhoz hasonló módon alkalmazhatjuk. A majom és humán Aá-szekvenciák és a ialáitaápy szerinti majom adenoviius-szekvenciák eltéréseinek következtében azonban a találmány szerinti szekvenciák alkalmazása lényegében kiküszöböli a homológ rekombináció tehetőségét: humán Ad El-fimkelőt hordozó gazdasejíete például 293-sejtek helperfankctóivak ami esetleg fertőző adenovirus-komamináasok keletkezéséhez vezetne rAAV vírusok előállításit sorát·.
Ilyen rAAV-v kosok. adcnovirtis heiperlunkciök segítségével történő előállítására alkalmazható eljárások
- humán adenovíxus-szerotípusok alkalmazásával - leírása a szak irodalomban bőségesen hozzáférhetők. Lásd például a 6 258 595 .számú amerikai egyesüli államokbeli szabadalmi leírást és abban, idézett hivatkozásokat. Lásd még az 5 871 982 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi .leírásk es a Wö 99/14354,
MO 99.5\W su, ut nort’A kort k>> ze.eteti mnx© 1/ek z/t nem-hum,n \ \\ szerotigiísok, például nem-humán föemlős AAV-szerotiposok előállítására is .alkalmazhatok. A szükséges feelperfefrkciök ellátására képes találmány szerinti simian adenovirus géuszekvenetak (például. Eta. Elb. E2a és/vagy £4 ORFó) alkalmazása különösen előnyös lehet a szükséges adenovírus-funkciök kotnptementelására a tipikusan humán eredetű rAAV becsomagoló sejtekben jelenlévő egyéb adenovlrusokkal történő rekontblnáeiö lehetőségének minimalizálása vagy kiküszöbölése miatt. A találmány szerinti tidenovtrus-szckveneták kiválasztott génjei vagy nyitott olvasási keretei alkalmazhatók az ilyen rAAV -termelő eljárásokban.
További: lehetőség szerint, a találmány szerinti rekombtnáns simian adenovíms-vektorok alknlrnazitmék az ilyen eljárásokban. Ilyen rekombintsns simian adenovirus-vektorok lehetnek például, hibrid csimpánz AíI/AAV-vektorote amelyekben a ősánpáhá Ad-ázékvenciák fogják közre például az AAV3’ és/vagy .5’ TTR25 régiókat és annak exprsssrióját szabályozó szekvenciák ellenőrzése alatt álló transzgent magukba foglaló rAAV exorv-^jos karodat bzAemoet szertári n-ro.00,81 m<t-takt nmnt -zcnn.s - műm adexn ! o sexetek és/vagy géntermékek is alkalmazhatok rAAV vagy egyéb, adenovlrus helperfünfeciótól: függő vírusok előállítására,
A találmány egy további előny ős megvalósítási módja szerint, nukleinsas molekulákat kívánt adsoovfras gétstertnékek gazdasejrekbe történő szállítására, ás azok expresszál-atására tervezünk, hogy ezáltal kávám élettani hatást ériünkéi. Például, a találmány szerinti, adeuovirus kIá-proteint kódoló szekvenciákat tartahmizó rmkleíttsav-motekulákat egyénekbe juttathatunk íumorterápiás célból. Adott esetben, ilyen molekulákat hpidházisü hordozóanyagban foumláztmte és azokat célzottan tumorsejtekhez juttatjuk, el. Ilyen készítményeket más ntmörterápiás szeretekéi (például essptetismah taxollal vagy hasonlókkal) kcsntbinálltatmtk. A íaláhnáoy szerinti aóenovfros-szsks-enciák további alkalmazási lehetőséget szakember számára világosak,
Ezea telük szakember számára az Is nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti Ad-szekveneiák könnyen adaptálhatók különböző virálts és nem-uralis vektorrendsz.erekhez terápiás és isounogöa molekttlák is vtím, ct r/vo vagy i« vri-o szállítására. A találmány szennti Pau5« Panó, Pari?, SV'L SV25 és/vagy SV39 simian Adget-msök alkalmazhatók például különböző rAd- és nem-rAd-veteorrettdszetékben. Ilyen vektortecöszerőfc
115688-6132/SG lehetnek többek között piazmidak, 'tetivirus, retrovlrus, poxvirusok, vaceimavúus és aáeno-asszociáh. virusroudszerek. A taiálmáay szerhni megoldás spsi korlátozódik valamely- meghatározott vektomsateerre.
ügyaucsak a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti irtatom ás snafontsredeín proteinek előállítására aSkaimas- molekulák. Ilyen molekulák, amelyek a. sanian Ad D\S-szekvenetákat tartalmazó pcdírtukleolidökítt hordoznak, lehe tnek csupasz !>NS, pl&zmíd, vírus vagy bármely más .genetikai elem ίοποόίόό&η.
Szintén a. taláhnány tárgyát képezik a fend adenovirusok géstéthrékoi, például & találmány szerintu ödesovíms-uiAlefossvste által kódolt proteinek, enzimek és azok. fragtnesimnai, A találmány íárgyát képezik továbbá a találmány szeriub: nukloiesav-szsítevénoíálc állal ködolt amfoosav-szekveneiájfo de más oh arassa! előállított BanS, Paső, Pan7, SV1, :SV25 és/vagy SV39 proteinek, enzimek és azok fragmentumai. Ilyen protelöfik például az 1, és 2. ábrán feemulaíoíí nyitott olvasást keretek által kódolt proteinek és azok fragmentumai.
A találmány egy szempontja szerint, a találmány tárgyát képezik izolál? sirsían adenovimsproteinek, amelyek lényegében tiszták, azaz más vírus és protein szerű komponensektől mentesek. Előnyőse·?, ezek a proteinek legalább 10%-ban homogének, előnyösebben· 60%-ban komp;gének, es legelőnyösebben 95%~bao homogének,
A találmány egy előnyös.megvalósításimódja szerint, a találmány tárgyát képezik izolált majorneredem adeuovíms-kapszídprofolnek. A leírás szerinti értelemben,. musometedetü adenevísm-kapszidproteine» a PanS, Fanó, Pari?. SVl. SY25 és/vagy SV39 kapszidprotemek bármelyikét vagy asvnak fragmentumát tartafrnazó ndenov uus-kupj-zidprotenu értünk, például, ue anélkül, hogy igényünket .1 felscrelukra korláté mánk, koncra kapszidprotemeket, íuzlós proteineket, mesterséges utón előállítón kapszsdproteineket, szintetikus kapszidprotemeket és rekotublnátts kzpszidpswmeker, tekintet nélkül a proteinek előállításának módjára.
Ennek megfelelően, ezek a majomeredetö kapszidprotemek égy vagy több PanS. Parté, Patt?. SV;. SV25 és/vagy SV39 régiöt vagy fragmentumot (például itesont, pentost, fibert vagy azok fragmentumát) tartalmasnak egyéb adanovtms-szerodpusokbél származó kapszidrégiókka! vagy fragmentusnokkul. vagy módosított simiatr adertovirus eredetű kapszidproteinekteel vagy fragmentumokkal kombinálva. A leírás szerint; érleiemben „a kapsztdprolsíxt megváltozott trogizmassal asszociált módosításán módosítót} kapszidprotem (például pentou-, hexon- vagy fi'bsrprotuio-régie vagy ilyen t'ragroonmn?, például HÍxtnógió-gömbdomén, vagy a fétsorohakat kódold pstlinukleodd) létrehozását értjük, amelynek specifttása a módosítás következtében megváltozott A majosíteredetukapszidoi előállíthatjuk egy vagy több találmány szerinti simian-Ad vagy tuás,hurná?? vágynom humán eredetit Ad-szerotipusbk alkalmazásával, ilyen Ad különböző forrásokból szerezhető be, például az ATCC gyűjteményéből, kereskedelmi forrásból vagy kutatási intézményekből: vagy az Ad-szekveneia hozzáférhető a GexiBank adatbázisából vagy más forrásból,
A találmány szerinti simtar? adeaovirus penroxtptotomek aminosav-szekvencmit csatoltuk. Az AdP;m5pensonproícin szekverteiáját a 2. azonosítószámú szekvencia tartalmazza. Az AdPanz-penton szekvenciáját a 6. azonosítószámú szekvencián adtak meg. Az AdPanó-penton a 10. azotrositószattní szekvencsájú. Az SVlpeutou szekvenciája a 25, azortősilószíunü szekvencia. Az SV25-peatonpto»esn szekvenciáját a 30, azonosítószámú szekvencia mutatja. Az SV39-pet;tost a.35. azonosítószámú szekvenciájó. A fend pertíonproinek bármelyike vagy azok fragmentuma különböző célokra alkalmazható. Alkalmazhatjuk például a fentiekben és a 2., 6>,
25,, 3ö, és 25. szonöritoszáínú szekvortciákon ídkaltgazott aminosav&zámozás szerint a peatoa M-tersúnális és/vagy C-termmáfrs végéről körülbelül 50, IÖQ, 15d vagy 200 amióosav detóciót tartalmazó· csoskltotí frsgLI568S-6132/SÖ „18.
mentnmekat. Alkalmazfeatask továbbá rövsdebb belső, C-terminális vagy N-terminális '^agmentumokat. Ezen féltik a pentonptótemt szatenber számára isirterf módon különböző célból módosíthatjuk.
Ugyancsak a taíáteásy tárgyát képezi a FaoS hexonproíem [3.. azonosítószámú- szekvencia]. Fanó hexonprötsirt (?,. ázonesbőszáinu szekvencia], Fan? hexoaproteí.«' pl. azonosítószámú szekvencia], SVf5 besonprotorn (26. azonosítószámú szekvencia]. SV25-hexonprotein [31. azonosítószámú szekvencia ] es/vagy SV^ó-hexonprotein [36. azonoshészánui szekiencia] aininosav-szekvencíáia. A fenn hexonptoíetnek bármely ike vagy azok izolált feag-aeaónna különböző célokra alkalmazható. Alkalmazhatjuk például a fentiekben és a 3„ 7.» 1 U,: 26., 31, és 36. azonosítószámú szekvenciákon alkalmazott antitiosavszámozás szerint a: hexon N~ terminális és/vagy C-termínálls végéről körülbelül 56, löö, 150, 206, 300-, 466 vagy 5ÖŐ ajtóaosav deledet tsrialmazó -osonkUött fragmentumokat. Alkálmazhaiuök továbbá reviüebb belső. C-termhtális vagy N-termtnáhs loigmentutisokat. -VLiima/l. ittuk pekiául a lk-%WK>iein hurekreemtanak töomvmanak) Dl ϊ e» 1 tM ölne,e.-esfí fragmentumát, wgy satuik hrpervanahilis régióját, ilyen régiók például a majomeredetü bexonprotei» - a 3-.,
1126,, 30, és 36, azonosítószámú szekvenciákban alkalmazóit számozás szerint - körülbelül 125-443,, kőrlübelűl 138-441, aminosavait átfedő fragmentumok, vagy kisebb fragmentumok, például a Ι3&Ί63, amiae15 savakat, körülbelül a 170- I 76. aminosavakat; körülbelül a 195-2115. arnitiosavakat; körülbelül a 233-264, aminosavakai; körülbelül 251-264. aminosavakau körülbelül a 287-29?. aminosavakat, és körülbelül 464-430 aminosavsk&t átfedő fragmentumok. Más alkalmas fragmentumok azonosítása szakember számára ismert. A hexonwteip szakentbsr számára ismén különböző alkalmazási céloknak megfelelően módosítható. Mivel a, bexonproteip határozza meg az adeaovírss- szeroítpusát. ilyen mesterséges hexortproteírtek beépítése természet20 ben elő nem forduló mesterséges szerotípusö adertov irmokat eredményezne. Más mesterséges kapsziöproieineket A előállíthatunk a csimpánz Adpentouszekvenciák és/vagy a találmány szerinti vagy azok. iragnteiitomaiiiaksikahínizá-iiii-a!,
A találmány egy előnyös megvalöülíási -módja szerint, módösteö hexonproteist tartalmazó adenovtet: áihtndk elő a találmány szerinti hexonproíeiíi-szekveneiák alkalmazásával. Hexonprotéinek módosítására al25 kahóazhátö eljárás ismertetései találjuk például az 5 922 315 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi. Ebben az eljárásban az adertovínts heson legalább egy hnrokrégióját másik adetm rus-szerotipus legalább egy hnrokrcgiójával helyettesítjük. Az ilyen módosított' adenovírus hexonprote» «. tA legalább egy huwkrégioja tehát a találmány szerinti, majomeredétü Adhexon-hotokrégió (példáid Fan7k A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a Fau?-bexonprotein
30' hurokrégióját helyettesitjük más adenovírus-szerotípus megfelelő hurokrégiójávai. A találmány egy további; előnyös megyalósfráíú módja szeri·?!, más adenovírus-szerotípus megfelelő burokzégiöját helyettesítjük a Pasa?-kexnrt hurokrégiójávai. Megfelelő adenovt'rus-szeronpusok választhatók humán vagy sem humán szerotípasok közül, például az ismertettek közül. A Fsn?-hesont csak a szemléltetés kedvéért választottuk; a találmány szerint I egyéb simian ,Ad-he,soöp«nemek hasonló módon, módosíthatók, vagy alkalmazhatók más /kd-hexoa módo35 sírására. A találmány szerinti megoldásnál a megfelelő szeret ipos kiválasztása nem korlátozó tényező. A htlálsaány szerinti hexonpxotein-szekvenciúk további alkalmazási lehetőségei szakember számára nyilvánvalóak.
v stíe' i ibídtn tt th ínve ru mit a1 ide im s is x bl\ rrtot'tpM V U.Pm'' frherprotemje a 4. azonosítószámú .ammosavvszekyeneiájú. Az AdFauó fifeerprotemjének aminössvs:zek vette iáját a -8. azonosítószámú szekvencián mutnijnk be. Az AdPán? fiteprotom aanrrosav-szekveaciáia a
12. azonosítószámú szekvencián látható. Az SV-1 két. tiberpreteist tartalmaz; a isber-2 mmosawszekveneiáját
Π 5683-6152.365 a 27, azojBosítósamó. szekvencia, a fiber-1 atnbjosav-szekvenciájét a 28. azonoshőszámú szekv^íícia mmatja. Az SV-25 szintén két fibotprofeísnel mtdefcik; a tiber-2 a 32. azonosítószámú atsraosav-szekveociájá, a bher-l s .3.3. azoaneítószánjá awinosav-szekvencíájú. Az SV-39 Sbe^roteinjének amiöosav-szekveneiálát n 37. azotiostiószártm szekvencia mutatja.
A- fiberprotem vsgy annak izolált fraraensana különböző célokra aikataszható. Alkalmazhatják példád a fibergömbdoraést, amely a 4., 8., 12., 28., 32., 33, és 37, azotaísítószánrá szekvenciák körülbelül 247*425, aminosavaif födi át Lásd 2, ábra, Alkalmazhattok példád a fentiekben és a 4., 8., 12,, 28., 32., 33. és 37. azonosítószámú szekvenciákon alkalmazott ambosawzámozás szerint a Ibetpswia Nhermírtálís ésrvagy Cterrainális végéről körülbelül 50, 100, 15Ö vagy 200 aminosav deiéeiót tartalmazó csonkítod fragmenümiokat,
Aíkahnazhatiink továbbá belső ftagtseattmohat Essen felöl, a fiberprofemt .szakember számára ismert módon módosíthatjuk. ‘
Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti proteinek legalább 8 ammosav bosszúsága izolált fragmentumai, Kívánt esetben alkalmazhatunk azonban más hosszúságú fragmentumokat is. Az erditetteken leiül, a taláhnány tárgyát képezik a PaaS, bánó, Fan?, SVL SV25 és/vagy SV39 géntesmékek előállításának hatásfokát nevelő és/vasy expresszióját fokozd módosítások, pékiául fúziós molekulák eldállhássí, {«melyekben a Pan5, Panó, Fan?, 5V1, SV25 éslvagy SV39 géniermek egésze vagy fragmentuma (közvetlenül vagy lsükére» keresztül) a hatásfokot vagy expressziét fokozó fúziós partnerrel feziouálf. További előnyös módosítások példánk de anélkül:, hogy igényünket a iclsosolsakra korlátoznánk, a kódold régid (például protein vagy enzim) csonkítása, hogy a pre- vagy pw-proteiu baxitásáuak szükségességét kiküszöböljük, és érett protein vagy enzim keletkezését biztosítsuk; vagy a kódold régió mutációja, hogy szekretálddé génförtnéket kapjunk, további módoshásók szakember számára ismertek, a találmány táj-gyár képezik továbbá a Paa5> Fanő, Pa»7, SV), SV25 vagy SV39 proteinekkel legalább körülbelül 95-79%-bao azonos proteinek.
A már ismertetették szerint, a laláímáay szerinti adenovirus-kápssídproíekieket tartalmazd vektorok alkalmazása különösen előnyös olyan esetekben, amikor oeutraiizáló ellenanyagok más Ad-szeron'pusok vagy más virnsvekíerok alkalmazásún alapuló vek.orok hutását semlegesítenék. A ísiálmány szerinti rAd-vcktorok különösen előnyösen alkalmazhatok ismételt beadásra génterápiás alkalmazásra, vagy Immunválasz megerősítésére (vakcinather emelésérek bizonyos köHifenésyek mellett, előnyős lehet a FanS, Fanő, Fnn7, SV1, SV25 és/vágy SV39 géntottnék (például kupszióprofem vagy orrnak fragmentuma) alkalmazása elienanyagök termelődésének kiváltására. A leírás szerinti értelemben „ellenanyagon valamely episóphoz specifikus módón kötődni képes immunglobulin molekulát értünk, A találmány szérián ellenanyagok tehát Purs5, Fané, Fan?, SV1, SV2S e^\ag> sV?u epítőpofcitoz körödnek, előnyösen specifikus módon és kereszíreaktlvitás nétel. A találmány s/enno ellenanyagok knlöisbözö formában létezhetnek, például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, nagy aföhutásá póliklofolis ellenaaysgokkésü monoktonáhs ellemtoyagokksut, szintetikus sblenonyagoukutt, iáméra ellenanyagokként, mkömbifonts ellenanyagokként vagy hunauuzálí éiienanysgokkénf. Az ellenanyagok származhatnak IgG. IgM. IgA, igD vagylgfi immöoglohuíia*o.sztáíyokbóL
Ilyen ellenanyagokat a technika állása szerint ismert módon állíthatunk elő. ellenanyagokat elÖállühahmk jól ismert hagyományos technológiákkal, például Kókler és Milsteit? áhal lerrtak szerint, és az: álíalnk ismertetett eljárás számos módosított változatának bármelyikével.
115088-6132/80
Hasonlóképp, magas titerő ellenanyag állítható elő az·' arítigéoekkel szemben kapott rrsouekltmális vagy polildooális ellenanyagok alapján isme/ rekombínáíts technológiák .alkalmazásával [lásd például a ECT/GB857OÖ392 számú FCT'közzétételi. iratöt; a GB216 863 8 A szánta Angol szabadalmi .bejelentést; Amit és mtsai.: .Scienee 2.33, 747 (1986); Quemt és mtsai,: Proc. Nett Aoad. Sci, (USA) 66, 10 029 <1989); a
FCT7WÖ9ÖÖ7861 «Μ PCI közzétételi iratot; fUéchtnann és mtsai.: Natúré 332, 323 (1986); Hasé és mtsaí.: Science .246, 1275 (lOSSs)), További lehetőség szerint, az ellenanyagokat előállíthatjuk a találmány szerinti antigén elleni állati vagy immát! ellenanyagok komplementeritást meghatározó régióinak módosításával. Lásd Mark és Padiltt: „Humarsfestiots of Mtmoelotíal Antibodies”, 4, fejezet -The Haudbook of Experimental .Pfesmaeölogy” 113, Tire PtemámOegy of Monocional Antibodies. Springer-Verlag í 1994); Harlow és xsúai.;
„Lferng Antibodies; .A tsboratőfy ManuaF*, Cotd Spring H&rbor Laböfatory Press, NY (1999); Harlow és nusaiz ..Antibodies: A Laboratoty MsnuaV) fold Spring Hatbor 1 .mmatoty Press, New York. (1989); Houston, m síi P.<c \ml Vad fes ι',Άιν V 4« owj samumBr, ο ποι A ume 2-*2. *2' < ’fes) \ taíalnwiv targv.ú kg·?// sose ha no \tu9tpa» elLr..t:r,úgok Vb2' e^ azt! antí-!ú\>upus el.en<nt\.tgek ( \bfe Lásd például Wetsendonf M. és misei. Akdulaüon of anti-tumor π-nmunüy by arúi-idíotypie smibodies', „Idfetypíc Nétwork and DiseasesL szerk.: Ceray 3, és Hiernaux J., 3, Arc. Soc. Microbíol.. Washington ÖC 203 (1990), Ezeket az anri-idict;pu$ ellenanyagokat és anti-anú- idiotfpus ellenanyagokat szakember számára ismert eljárásokkal állíthattuk elő. Az ellenanyagok különböző célra alkalmazhatóak, például diagnosztikus és klinikai eljárásokban és készletekben;,
Bizonyos körülmények «tellett előnyös-lehet, ha kimutatható jelölést vagy címkét adunk a Pan5, Fartő,
Pan7, SV1, SV2S és/yagy SV39 géntermékhez, ellenanyaghoz vagy más találmány szerinti kaswakcióhoz. A leírás szerinti értelemben kimutatható jelölésen olyan molekulát értünk, amely egymagában vagy másik molekulával k.ölcsiiíthatásha lépve képes kimutatható szignált generálni. Legelőnyösebben, a jelölés vizuálisan -detektálható, például lluoreszceneia alapján, például tmmuíúüszRíkémjai analízisekben vagy immuniluoreszeens mikroszkópizálással. Jelölésként alkaimaz’nató például ihíoreszeein-izotioctanát (FsTC) phyeoeriirin (PE) aliöphyeocianin (AEG), eorlphosphin-Ö íC.PO) vagy tandem festékek, PE-Ciania-5 íPCőt vagy Texas-Reá (ECD), Az említeti: fluoreszcens festékek a kereskedelemben hozzáférhetőek, és alkalmazásuk a technika álláss szerint ismert. További jelölések például kolloidéit? arany Jelölésként alkal u tzha unk még radioaktív vegyülőtokot vagy ohmeket. JCuhNként alkditr.azh.annk kibönKvo eoztntÍo'nds/etoko't amelyek kolerttnemas utón detektálható szignál keletkezéséihez vezetnek a uzsgnkubsn; ,i glükóz oxsöáz például «amely glukózként szuhsztráiot használ) termékként peroxidot szabadit fel, amely peroxidáz és hldrogéndutx ? p. Idául tetraassulbenzldln (TMB) jeleóíétében kék színű oxidált t'MB keletkezéséhez vezet, kikd '•otzbato továbbá törmaperoxidaz. (HRB) vagy a&uükus tbszdhtáz (AP), és hexokínáz glukóz-ó-feszült dehidrogenázzal együtt, .antely ATF-vel, glükózzal és NAD-Mal tép reakcióba, teás termékek mellett 34Ö tuti hullámhosszon méri ahszöth&ticia-emelkedés alapján kimutatható NADH keletkezéséhez vezetve;
A találmány szerisii eljárások bán alkalmazható további ielöiőrendszerek más módon detektálhatok, alkalmazhatunk például színes iaíex. mikrorészecskéket (őangs Laboratories, indiamtj, amelyben euztmek helyett beépített festéket alkalmazoHk, hogy a célszekvenciálck&l koujugámmot képezve, megfelelő fesztrunöszerekhen •a komplex jelenlétére utaló, v-zu&lis úton detektálható szignált kapjunk.
A jelölőattyag kívánt molekulához történő kapcsolásán vagy azzal történő asszocíálására alkalmazható eljárások szakember szántára ismének. Jelölőanyugot .bözzákape:solh;m.mk az alább ismertetett eljárásokkal:
115688-6132/60 .Jfesdbook oí Elnonsscení probes aad Research Chemicíds”, 6. kiadás, szcrfc: Hanuglaad R2GM,, Molevolar Probes, be,, .foggae, ÖR (1994); Perce Gaialog and Háaábook, Life Science and Asalyíioai Research Products, Pierce Chemical Córtípany, Rochford. 1L (1994/1995). A jeiölőanyag kiválasztása és az összekapesoló eljárás a találmány szerinti megoldás szempontjából nem korlátozó tényező.
Übln h>w,í ΛινΛΛα&'Α v Oi ak}/e\ bagnoltunk hartne \ Jkalmoe í nass, eot íhu tök, példára rekombmáns eclmológiákkal, kémiát »zinté:zist<xhnológíákk;d, vagy más szintetikus eljárással. Megfelelő eljárások szakember számára jól ismertek. Lásd például Sambrook ésmfsat.; „Mőléóulár Gloning; A Labertnory ManuslG. Coki Spriog .Hurbor Press (Goid boring Bárkor, NY). Peptidekéí szintetizálhatunk szilárd fázisú szimezssíeclmológiákkai [lásd példáéi Merrifield: í. Am. Cbem. Soc. 85. 2.149 f 1962); Stew3it és Young.
lő Solid Phase Pepiidé Sythesis (Freeman, San Francisco) 27-62, oldal, {1969)]. Ezek* és egyéb hasonló eljárások szakember számára ismertek, és a találmány szerinti megoldás szempontjából nem korlátozónk.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti Ad-szekvenciák könnyen adaptálhatók különböző virális és nem-virális vekterrertdszerskhez terápiás és ?mm-rnogén molekulák ój vino, er Nro vagy in rívó szállítására.: Például, a találmány egy előnyős megvalósítási utódja. szerint, a simian Ad-kapszidproteineket és a le'risban NmcrteMt ezyéb s-mhut adenovlrus proteineket nem-viráiis protein alapú saáiiítórendszerekben alkalmaz. r.k yenek, pjotcrx). c- m.x diagnosztikus, terápiás és knntunogén molekulák szállítására. A találmány egy eíöuvs 'negvnktotás', nodia szerint, a találmány szerinti proteint, közvetlenül vagy közvetett módon, a vírust aoer.or trus ,\epR r- ím-ön/o sejtekhez irányító molekulákhoz kapcsoljuk.
Előnyösen, ,s célNmutato molekulaként sejrteb/ms receptor vaniam hgandmnot tartattna/o
2ö kapszidproseins. például késést, pestont. tlbert vagy azok fragmentumát választunk. Azokat előnyösen a lenti ismene-ett terápiás molekulák és azok géntermékeinek szállítására alkalmazzuk. Kapcsoló régióként (linkerkéníí lipidekot. polyLys-likőr- és hasonlókat alkalnsaznatunk. Ilyen célra alkalmazhatjuk például a simian pentonproteint oly módon, hogy a majomeredetú pentonszekvencia alkalmazásával. Medina-Kauwe I...K. és munkatársai állni ismertetettek szerint fúziós proteint állítunk elő [Medina Kauue LK. és rsísai.: Gene Ther.
SÍK)), 795 <200i); Medina Kauw EK.. és tntSa;.: Geue Ther. 8(lö.t, 1753 (2öől)j. Vektorokat célzottan sejtfelszíni receptorokhoz irányíthatunk a sunian Aö IX-protein arninossv-szekveociájártak alkalmazásával is, a 2,0 1 lő + ÁAl szarta mxí.k.! egyesült , Hu t ovbeh abadaun xmsban sHkEtetettek seu'nt \ suandun szerepét betöltheti CD4Ö-antigén. egy RGD- vagy polilizm-tartaímú szekvencia, és hasonlók. ilyen es h.cmnío célokra alkalmazhatunk egyéb simian Ad-protelneket js, például hexonprofeint és/vsgy Ixberproíeini.
3Θ A találmány szerimi egyéb adenovirus-proteinck is alkalmazhatók egymagúkhu® Vagy más adetrovirnsproteinekkel kombinálva szakember szántára ismert különböző célokra. A találmány szerinti adenevírsisproteípek további alkalmazási lehetőségei szakember számára nyilvánvalóak.
n,..Eeko!nbmáns;idenyp/irus
A találmány szerinti készítmények lehetnek például vektorok, amelyek képesek hetetekig molekulák cl35 ;uUttasata ictuknc.· íesnous \ng\ \,n>„ntázuf ükol A Emu·, »zertnti n‘etemben vektoron genetikát <hmct erünk, például, de .tnelkul. hogy igenünket u 'bisorokakra kvtlato?n.mk. csupán NNS-E tagot, ttunsztxwn’,. kezmidot. epsszomát, pl&zstidoí vagy vírust. Ilyen vektorok Fatt5, Panó, P;tn7, SV1, SV25 és.Ángy SV39 simian adenovlnts DNS-t és minigént tartalmaznak, A leírás szerint! értelemben „minigénet?” a választott beterológ gén és a génterotek gazdasejtekben történő transzlációjának, transzkripciójának és/vagy expressziéi árak irányításé40 hoz szükséges más szabályozó elemek kombinációját étijük.
115688-6132/80 l pAn^an, a ηΡ.πϊ,ΠΛ venni; adenos sn.<o ektnrt u:; x-í sózzuk -ucc, !\>c\ í nntngen a vala-ctott adetsovirnsgep vonatkozásában natív régióban egyéb aáem)V!Ess-,«Kekv«öct^feat U tartalmazó nukleiassvmolekulában tegyen jelen. Kívánt esetben, a minlgéttt Inszertálhajük egy már létező gé:nrégiól>a ügy. hogy az adott régió működését megszakbjnk. Más eljárás szeriét, a mmígmt részlegesen vagy teljesen deleiálf sdeho5 vírusgén helyére mszeriábuk. A m-aigéu többek között jelen lehet fankeionállsan deleíáii El vagy funkcionálisan deletek 1-5 helyén. A leírás szerinti értelemben Jhnkcionahsím deleiéit” kifejezésen azt értjük, hogy a gét! tégtö elegendő mennyiségét íávehföüuk el vagy károsítottak más módén -- például mutációval vagy módosítással - ahhoz, hogy az többé ne legyen képes a génezpresszió funkcionális termékeit előállítani. Kívánt esetben. a teljes génrégíöt eliávelitbatink, öenmegszakhásra vagy deletálásea alkalmas helyeket a leírás már részeiben tárgyatok.
Rekptnbiná.os vírusok előállításúra alkalmas vektort léteefeoateittdi; példáid égy, hegy a abiogént az adenevirüS: genom. Ó’-végere, 3'~végre, vagy annak mind az 3'-, minő 3’-végére inszertáljuk. Az adenovirns gettóm 5’-vége a beesomagolodástJoz és replikáciohoz szükséges 5’-essz elemeket tartalmaz; azaz az 5' invertált Ismétlődő egység (FfR) szekvenciákat (amelyek teplikáctős origóként ttískcionálonk), a natív S’ becsomagoló dönteni, (amely a lineáris Ad-genom kapsztdba történő esomagolódásához nélkülözhetetlen szekvenciákat: és az El-promófer enhaaszer elemeit tartalmazza), Az aőcnovdi-s genom 3' -vége a becsossagolodáshoz és kapszlddal történd kombinálódáshoz szükséges l’-císz elemeket tartalmaz (ezen belül az ITR-eket). Előnyösen, a rektnobbiáas adeaovíms 5’- és 3’ aáeoovfeos cisz-elemefcöt. és az 5’- és 3' adenovírus-szekveoeiák közt mnügéoí tartalmaz. A találmány szerinti adenövirns vektor további sdenovinas-szekseneiáka- is tartalmazhat,
Előnyősén, a találmány szerinti aőesovimsvekíor egy \ agy teöb, a találmány ^zerinü adenovirus gettómból származó adenosdrus elemet tartalmaz. A találmány egy vlőnvM tmgsAkWas-t módja szermt. a vektorok PaaS, Fané, Ps»7, SV1, KV25 vagy SV3§ aífettovsrnsokból származó ÍTR-szekvenelákai és ugyanazon adeoovíms-szsrtrtlpasfeól származó egyéb admovfetts-szekvesciáka; tartalmaznak. A találmány egy további előnyős megvalósítási ísódja szérink a vektorok az n’R-szekvtmciUsat szolgáltató adermvírus-szerodp»siél eltérő adenovírus-szeroriposból származó adenevsrus-szekvenciákat tartalmaznak. Aiícnovirns-pszsudo-spassak olyan aáenovirusí nevezünk, amely más adenovtrus-széíoiipusböl származó kapszidproieint tartalmaz, mint amilyen szerötípnsből az ITR-szekvenesák származnak. Az ΠΚ-ΐ szolgáltató szerotmus kiválasztása és a vektorban található egyéb aítenovhus-sziskvctjciák szerottpusa a ublmaay s/erum megoldás -szempontjából nem korlátozó. Az. ATCC {..America» Ivpe Cuiture Collectlon'’, \ agmsai nyugt-meny eben számos adenovlrustörzs hozzáférhető, vagy ilyenek beszerezhetők kereskedelemből vauv tudományos kutatat végző intézetekből. Ezen felül, számos ilyen törzs szekvenciája bozzáferbető különböző adatbázisokból, például a Puh&ted és öeníiank adatbázisából. Más: majom vagy búmén adenövitusökből előahdoti homológ .ideivnirus-vektorok leírása megialálható a szakirodaiomfem [lásd például az 5 24Ö 846 számő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi teÍrást], Számos adenevfenstípos: .ÖblS-szekvenclája. hozzáférhető s OenSank adatbázisából, ilyenek például az
AdS- (GettBaok nyilvántartási szám: No. M?3'26ö|. Az aóet-ovirnsoMszttkveneiák származhatnak bármely ístnert .szeroripssböl, példáid a 2., 3,, 4., 7,, 12. és 40. szerolipusokhől, vagy bármely úiahban azonosított humán szerotipashők A találmány szerinti vekiorkooswkcíökban alkalmazhatunk nem humán altatókat {például majmokat) fertőző adenevírnsokat is. Lásd például a ÓÖŐ3 7 lő száron áruértem egyesnh államokbeli szabadalmi leírást.
lHők8-Ö132/SG
A találmány szeri»» vektorok előállításéra ttílhttsznáií vírUsszekvenciákal:, kelper vfeusök&t - atne-utyibea. azokra szükség vau -, rekombináns- vlrttsrészecskékei, és a koösttake lókban alkalmazotí egyéb vetakompcmeoseket és szekvenciákat a leírásba» istírerietjuk, és azokat a lentiekben leírtak szeri»?: kaphattak meg. A találmány szerinti RttuS, Éaaő, Fan?, SVk SV25 és/vagy SV39 simttet adenevims-szekvesclák DNS5 szekvenciáját alkalmazhatjuk ilyen veksexretidszerekbes? aikalmazbatö vektorök és sejtvonalak előállítására,
A találmány szerinti vektorokban aUmazott mdsietnsav-szekvenciákbau módosításokat, például szék* vexteia-áeltkiökst, -íaszerelókat és más- amtáctókat ismert. txtolekuiáris biolugxaí technológiákkal hozhatunk létre, és azok szinté» a tttlábnány tárgykörébe tartoznak.
AümnriógMC lö A ímszgéft kiválasztására, a ,jE»l»?g&i” klónozására és elóállitásara, valamim anruak a vtesvekterfeu történő ínszertálásdra alkalmazod eljárások a kltanitás alapjáé szakember szamara ismertek.
LA.transzg.é.0
A transzgén az. azt határoló vekterszekveaeklkhoz képest Eclerológ. a kívánt poiipeptidet. proteint, vagy más terméket kódoló auklsíasav-szekveneta. A nukleiímv kódoló szekvenciát funkcionális tnódoa szabályozó elemekkel- kapcsolj»k össze ágy, hogy szók lehetővé tegyék a transzgén átíródasat. ttu-jszláiödása· és/vagy exptesszálódását a gszdásejteskfeea..
A trauszgén-szekveaeia összetétele attól függ, hogy a kapott'vektort radvvn célra kívánjuk felhasználni. Iranszgén-szekvenela leket például .rtporimzckveneia, amelynek exptev., w <. veteKtaJum) vugn,. ko.ctkczcsebez vezet, ilyen -riporterazekveacíák például, de .apáikul, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoztunk.. a kő\ el 2Ö kezok: β-laktaöíáz, β-galsktözibáz, (l.acZ), albtlifcus fosxlá-áz, titnidm kinéz, zöld fluoreszcens protein (GER), kioramíenikoi acetilttanszisráz <CAT), lueiféráz, xne-rioránhoz kötött proteinek, például CD2, CD4, CDk, -az irtfluerua kaetsaggiutmis protein; és a technika állása szerint ismert egyéb górtok, amelyekkel szentben nagy aí'tímtású ríliettsnyagok állnak rendelkezésünkre vagy állíthatók elő- szokásos eljárásokkal; valambt tnembráahoz kötött proteinokéi antigéncánke doménhoz, például haeínagglntlnlnböl vagy Myc-fcŐl származó ilyen doménhoz fűzűmé kan tartalmazó fúziós proteinek, Ezek a kódoló szekvenc iák, expresszíójukat irányító- szabályozó élénaekkc! kapcsoltat·, szokásos utódon, példán! -euzümtíkas, radoíográisás, kolorbnclríás, lluoreszeens vagy más spektográ.bás eljárással; Haoreszcens aktivált sejtoszíáiynzöval, ínmranofógm eljárásolásuk például enzimes inmnmoszorbens vizsgálattal (EI.iSAg rádióimmá» vizsgálattal (IGA) vagy immusiasztótónjat eljárásokkal detektálható szignálok keletkezéséhez vezetnek. Amennyiben például markerszekvenciakéní IncZ-gésü alkalmazunk, a szignált generáló vektor jelenlétét a béta-galaktosadáz aktivitás alapján mulathattuk ki Amenynylbes a franszgén GFP vagy laciléráz, a szignál keletkezéséhez vezető szekvenciát bordoző vektort vizuális úton, szátsreakeio. vagy fényjelenség alapján, latafaentóterrei mutathatjuk ki.
A franszgért azonban előnyösen nem markor szekvencia, amely biológiai vagy orvosi jelentőségű termékek például proteineket, peptidekeu RNS-t. eazímeket vagy katalrtíkos RNS-eket kódol. Előnyösen, az RNS35: saolekula tRNS. ásRNS, nboszomálls RNS, katalitikus RNS vagy sntiszensz RNS. A találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint, az RNS-szekvesels s kezelt állatban egy célzott nukieinsav·szekvencia cspressziójár kioltó szekvencia.
A trtms2gé«t alkalmazhattak terápiás célra, pékiául genetikai deüeiencták kezelésére, tunwrtetápiára vagy tumor elleni vaké úrázásra, immunválasz: kiváltására, érivagy proliktksíkus vnkclrsázásra. A kutas szerinti
40- értelemben immunválasz kiváltásán. a. Htoíekaia (például géníermék) azon tulajdonságát értjük, hogy képes az
I i5óSR4n2/$G ,24.
,xk’!t 'ooLkufov..' omw , seU' Inmor.ns írnwabvt kjsaltam ü-awi a gfalrcmv u g><4 képezi több tr&nszgőn alkalmazása, például több alegységből felépülő proteinnel kapcsolatos reaáellenesség helyreállkására vagy enyhitésere. Bizonyos körülmények mellett, különböző transzgénekeíBlWnwbatank a protein egyes alegységeinek vagy peptlájeinek kódolására. Ekkor előnyős, ha a protetnalegységei kódoló DNS
S mérete nagy, például immunglobulinok, vérlemezke eredetű növekedési; Mtor, vagy disztrőfla protein esetébe». Ahhoz, hogy a sejt termelje a -Óbb alegységből álló proteint, azt a különböző alegységeket kódoló rekömbiaáeas vnufesai fertőzzük. Más lehetőség szerint, a protein különböző alegységeit azonos transzgén kódolhatja. .Ebben az esetben, egyetlen transzgén hordozza az egyes alegységeket kódoló DNS~eket, és azok belső ríbozlsn felismerő helyek („yjfersa/ nyöozme enín·· sáte; 1RES) által vannak elválasztva. Ez a megoldás előnyős, ha az
IC . egyes alegységeket kódoló WS mérete kiesi, például az alegységet és ffi.ES-i kódoló DNS métete összeses kisebb mint 5 kilobázis. 1RES-szekvenciák.helyett, a DNS-eket 2 ?\-peptidet kódoló szekvenciákkal is elválaszthatjuk egymástól, amely a transzlációt követően önmagái hasítja. Lásd például Donneiiy M.l,. és rmsai.: J. Gén. Vtrol. 78(1), 13 (1997); Euníer S. és ratsai.: Gene Titer. 8(llk 8Ó4 <2001X Klump H. és mtsai.: Gene Iker.
8.(11}, 811 (2001;·. Ez a 2A-peptíd lényegesen kisebb, mint az 1RES, amely alkalmazását különösen előnyőssé
1.5 teszi akkor, ha a rendelkezésre: álló hely korlátozó tényező.
A választott ir-mszgén bármely biológiailag aktiv terméket vagy más imaéket is kódolhat, például olyan terméket, amelynek tulajdonságait tanulmányozol kívánjuk.
Megfelelő transzsének kiválasztása szzkeirtber számára,netajelent gondot, A transzgén kiválasztása a.takslmany szerinti megoldás szempontjából nem korlátozó faktor.
A minigén fent ismertetett lő komponensein leiül, a vektor a iranszgénnei funkcionálisan kapcsoltan szokásos szabályozó elemeket is tartalmaz, amelyek jelenléte lehetővé teszi a transzáén transzkripcióját, transzlációját é&'vagy expressz,lóját a találmány szerimi plazaó.dvektotrál transzfoktált vagy vírussal fertőzőit sejtekben, Akkor mondjuk, hogy szekvenciák „fcokcíonálismt kapcsoltak’'', ba az expressziét szabályozó szekvenciák az adott génnel folyamatosak, vagy hatásukat transz módon kifejtve, vagy bizonyos távolságból irányítják a kiránt gén expresszióját.
Expressziás szabályozó szekvenciák például megfelelő transzkripciós kozdöszekveneiák, termmációs he,\ek pm méterek, eshsnszer-szekvenciák; hatékony RNS-éresi szekvenciák, például ősszeáilitódási és po.s tde 'eződési (pulyA) szignálok; a citoplazma RNS-t stabilizáló szignálok; transzláció hatékonyságát nőve· jó szignálok (azaz Kozák konszenzus szekvenciák); a protein stabilitását fokozó szekvenciák; valamint · kívánt esetben -- a kódolt termék szekreíáíödását fokozó szignálok, Expressziét szabályozó szekvenciák a technika állása szerint nagy szántban ismertek, például nativ, köírstitativ, índokálba-ó és-vagy szövetspecdikns pro n>uem k, és azok bármelyikét alkalmazhatjuk.
ismert konstitutív protnőíerek például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, a retrovírus eredetű Rous-szarkoma viras (8SV) ETR-promőter (adott esetben RNS-enhan.szerrel együtíl, a citofnegsiovirps (CMVj promófor (adott eseten a CMV-enhanszerrel együtt) liásá például Boshart és másai.: Coll 41, 521 (1985)], az $\ R promóter, a dihjdrofolát reáuktáz promóter, a β-akíin promóter, u foszibglieero.1 kinéz (EGK) promóter, és az EElo-promőset ilavílrogenj.
indukálható protnöterek alkalmazása lehetővé teszi a géoe\pres»2W szabályozását exogén úton bozzá40 a’or kom Ό' meg oí. mdasat el b -n'e'cu lek uo\ p<, dam h< mersek U nodmut o,.v„. sm,v uc>' n ,to íl5óá8-öl32íSG zott fiziológiai állapotba». például akut fázis: a sejt adott differenciálódási fázisában; vagy csak repiikáiődó sejtekben, Indukálható promcK-fek es indukálható rendszerek a kereskedelem bér; különböző forrásokból hozzáférhetőek, példánk de spélkut, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, az Invltrogen, Cloatoeh, és Áriad cégektől. Számos egyéb rendszer isíned, és alkalmazható szake-nber számára ismert módos. indukálható ptomotetek pcklaul .- ctnk aha; mdjkah br&a rncíalieiríon'ne ttol ) prometcr es a dezatnethason (Dox) által mdukah ege’ ent.őtut'tor vírus fMMTV? prontóler. További mdukálbútó rendszerek a T7 pohnteráz promóK-r rendszer (hasd 98 ló 1)88 számú nemzetközi közzétételi irat], az ecdysose rovagjrosrtoter (No és snsth.: Proe. Natl. Acad, Sei. (USA) 93, 3 346 (1996): a tetraciklinnei represszálhatö rendszer (Gossert és tntsai.: Proc, Natl Acad, Sói. (USA) 84. 554? (1992): a íetracsklkmei indukálható rendszer (Gcssert; Science 268, 1761
Id (1995)^ valámíst Httrvey és tntsai,: Carr. öptn. Cbetn. Bioi. 2, 512 (1998)3. További ilye® rendszerek az RKSOö-dsner, VP16 vagy p65, ranaly eashsdiol, ül. diphenol-smrisleröse alkalmazásán alapúk az RU48Őindukáih&íó rendszer [Waog és mtsai.;: Nah Bioíech. (5, 239 (1997); valamint Wang és sasai.: Geae'Tber. 4, 432. (1997)), és a rapamycin-iadukálfetríó rendszer [Magarhés mtsaí,: J. Clírt. Invest 100. 2865 (1997)). Egyes indukálható piomötetek hatékonysága az Idő függvényében no. ilyen esetekben, a rendszer hatékonyságét fo15 kő?botiul ha több represszorí isssertálsak tandem elrendezésben, például TetR-szekveiíoíát ÍRES-ett keresztül 1 xR-ve.\ve«ciához kapcsolva. További lehetőség szerint, legalább 3 napot várónk a kívánt funkció tesztelését snege o Gén. A kívánt proféi» expresszlójál ismert eljárásokkal fokozhatjuk a rendszer hatékonyságának növelése \ < 1 -dd fol a Wooáchuck Hepatitis Vírus pösAtranszkripeiós szabályozó elem (WPRP) alkalmazásával,
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a transzáén natív promőterét alkahsazznk.
A natív prontőter alkalmazása előnyös, ha a. trsnszgén expresszíójának utánoznia keli a natív gén expressz lóját. Λ natív promótert alkalmazzuk, amennyiben atranszgén expressziőját időben korlátozottan, fejlődési szakasszal összefüggésben, szövetspcetílkus módon, vagy specifikus, transzkripciót indukáló stimukissai szabályozni kívánjuk. A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, ínás natív expresxziős szabályozó elemekei, például cnhauszsr elemeket, poiíadenHszödési szignálokat, vagy Kozák konszenzus szekvenciákat alkui25 utazhatunk a natív expresszit utánzására.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a trauszgéut funkeiöúáhsan szdvetspeeitlkus protnóierhez kapcsoljuk. Amennyiben például a -ranszgém vázizombaa kívánjuk expresszáííatm, izomban aktív promotert alkalmazunk. Ilyen pnunoter például 3 vazi/om b-akíin. mmzirs konnyúláne 2A, dsstrophyn, izom krearin kinéz gének promóterei, valamint a természetben előforduló promótcrcknél nagyold? aktivitású szirsteti30 kus izom promóterek (lásd Li é» mtsai.; Nat. Bioteeh, |7, 241 (1999)). Szövetspecifikus promotsrek ismertek például májban történő expresszáltatásra íalbutnin, Miyaiake és misai.: ,1, Virok 7.1., 5124 (1997); Hepatitis ö vírus „coré” protsöter, Sandig es mtsas.: Gene Tber., 3, 1(8)2 (I99ó); aifá tötoproíein (AFP), Axfeuthnot és torsai.; Hűm. Gerse I’feer, 7, 1503 11996); esőst oszteokalein, Síéin és msssi.; Moh Bioi, Rep. 24- 185 (199?); csont, szialokalci·?. Chen és mtsas.; 1. Bonc Mitter Rés. 1..R 654 (í 996)1; lánióesíákbar; történő expresszáltatásra (CD2, Kansal és tntsai.: J. Immunoi. 16.(. b)63 {1998); immunglobulin nchczlánc; ϊ-sejt recoptorlánc); osuronőkben történő expresszáltatásra, például neuroo-specifikus ettoláz (NSh) promóter lAudcrscsi és tntsai.: Coll \?oí Xeutobívl G, v;: (HA'5) , r.cutofkrner.íum kennvulatte ucn fPtccioh e- uKa. Rnx Vdl Vese bet (USA) 83, 5611 (199 i)); és a neuronspecífikus vgl-gén protrsötere (Btocioh és tntsai,: Neuron 15, 373 (1995)).
Adott esetben, terápiás célra alkalmazha-ó vagy namasogéa terméket kódoló transzgént hordozó vekto40 rok szelektálható nsarkereket vagy riportergeneket is sartaltnitzhatísak, amelyek genedein-, hygyouhciö- vagy
I15Ó83-0132/813 parírnyda-rezisztenesái kódoló szekvenciákat foglalhatnak magúkban, Ezek a szelektálhafo riporfergéoek vagy markergéttek (amelyek, előnyösen a vfrusrteecskébe csomagolandó vlrusgenomon kívül helyezkednek db például ampictilin-rezlsztcúeia alapján jelezhetik a plaztslá jelenlétéi a bakteriad sejtekben. A vektor egyéb kmuponenskémt replikáclós origót tartalmazhat. Ilyen és egyéb· preíuóferek és: vektorelemek kiválasztása szakember számára nem jeleni nehézségek és Öyen szekvenciák rendelkezésre állnak [lásd például Sambrook és nttsúi.:: és abban idézeti hivatkozások].
tizeket a vektorokat a találmány szerinti eljárások, és szekvenciák és szakember számára ismert eljárások kombinációjának alkalmazásával állniuk elő. Ilyen technológiák például a szokásos cDNS-klónozásieljárások, például Sambrook és mtsaí. kézikönyvében ismertetett eljárások. í,,Moleenhsr Clening, A Laboratory Majmai’', Coki Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY], az adenovíras genomók átfedő ohgonukleotld. szekvenciáinak alkalmazása, potimeráz-láncreakció., vagy bármely alkalmas eljárás, amely a kívánt aökleoíidszekvenciái eredményez.
A találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint, a simian adénovints szék vette iákat tartalmazó plaziuidoi (vagy más vektort) alkalmazunk tx-komhittáus adenovírss-rószeeskék előállítására. A íaiáfeátsy egy előnyős megvalósítást módja szerint, a rckoroúmans adem·', ss usokből az kla- vagy Elb-géneket rtmkciosállsna deletáljuk, adott esetben, azokban más tnutactokal. oéldaol homérséktet-szenzltiv mutációkat vagy deléclókat is létrehozunk, A találmány egy további előmos megs.hosc.as: módi»szerink SSEla ésivagy ElO-régiók megtartása előnyös tehet a rekombmans ademn n ásókban. Intakt Bl-régió jelen lehet annak eredeti helyéit az adenmiru. genomtem, vags azt athehezbetjük a natív adenot cus e.morn delem!! reptojaba tpeldaul annak 1 3régióiába),
Gének humán (vagy más emlős) sejtekhez történő eljuttatására alkalmas simian adenovtrus vektorok létrehozása. során adénovlms nukteíssav-szekvejicták szeles skálálat alkalmazhatjuk a vektorokban. Például, az E3 elnevezésű adettovirus késlelteteti korai gén egészét vagy része; deietalh-mak a rekomfemáns vírus részét képező sinthtn adenovlrus-szekvötclábói. A májomerederá E3-gén ti rekonibtnáns» vtrusrészecske: íhnkciőkepessége és termelődése szemponttéboí lényegtelen, A simám adenovirus vektorokat előállíthatunk .ágy is, hogy az E4-géa legalább OREó-tegtetet deletalyak, és előnyösebben, a fenti régió timkeiőjának redttodímcíája miatt, a teljes B4régsőt deleíáljnk. \ tahimany szerinti további vektor az Ete késlelteteti korai génben hordoz deléciót. Eteléé iákai a simian adenovtrus genom 11 -1..5 késői génjeinek bármelyikébe» is létrehozhatunk. Hasonlóképp, a. IX és IVííS intermedier géneket is deletálhmiuk hasonló cél bők További deiéeiókat hozhatunk létre egyéb strukturális vagy nem strukturális. adettovinisgártekhmt. ?\ fenti deiéeiókat aiknlmazhaljök k«10n-kulön,: ahol a találmány szerinti adenoviros-szek vencta csak egyetlen régtóhasi tartalmaz deléciót. További lehetőség szerint, teljes géneket dektálank. vagy azoknak a biológiai aktivitás megszüntetéséhez elegendő részeit defetábuk valamilyen kombinációban. A vektorban az adtmovirus-szekveneia deléciót hordozhat például az BI-génekben, és az E4géttbea; vagy az El-, B2a- és E3- génekben; vagy az El- és E3- génekben; vagy az El-, E2a- és E4- zenekben, az £3-gén deléciójával kombinálva vagy anélkül, stb. A fentiekben már emlitetiek szerint, ilyen delectok más mutációkkal, például bőmérseklet-szenzttiv mutációkkal kombinálva is alkalmazhatók a kívánt eredmény elérésére.
Az esszenciális adenevírus-szekve:K:iákbítn tpéklátsl Bla, Elb, B2a, E2b, B4 OW6 11 {.?, 1 ó, 1.4 e* L5) defektiv iidenövlrusvekterek a viras· infektivitásához és az adenovírus-részeeskék. szaporodásához szüksé115686-6132. SG ges hiányzó afasovínjs-gétósmók^: jeleniőtéöett tenyészthetők. Ezeket a segítő ibelper) funkciókat úgy szolgálísthatjük, hogy az - adeaewas-vektort egy vagy több belper konstrukmő (például plazssid vagy vírus) jelenlétéhen tenyésztjük, vagy azokat szolgáltathalja a beostmragolö ssjtvonai. Lásd példán! a WO 96.·'1:3 59? szántó nemzetközi közzététel}, iratban ismertetett, „minimális humán Ad-veklor előállítására alkalmazott eljárásokat (közzététel napja: 1996, május 9.; amely teljes terjedelmében a küanitás részét képezi).
A minigént hordozó vnusvektorok majom adenovírusgémtat-lalmától Edggően, helner sósnovh-asra vagy sem roptikálódő várusíra.gmentitmra lehet szükség ahhoz, hogy elegendő majom adenovirus génszekveness legyen jelen a minigént tartalmazó tnfekíiv rekombináns virusrészecskék termelődéséhez. A heipervfensok az /10 sdetipvirös-vektorkonstiuke lóból hiányzó és/vagy a vektorral Wíszfektáli becsomagoló sejtvonai által nem expresszit adoovirtis-gériszekveneiákat tartalmaznak. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerính a helpervirus replíkáció-defieiens, és a fenti szekvenciákon félül különböző sdenovtrusgéneket tartalmaz. Ilyen helperv'lmsokaí előnyösen EI -expressz» ló sej tvonalakkai koíubináclőbaa alkalmazóik.
Heipcrvirusok poli-kationos konjogátomokkém is eioáílitba-ók például Wa és nttsai. által ismertetettek szerint p. Bioi. Chem. 269. 16 985 (1989); Eisher KJ, és Wíbon 1M.: Sfecten X 299. 39 il994)] A helpervirus adóit esetben egy második riporter minigént is tartalmaz. A technika állása szerint számos ilyen riporíergén ismert. A -az adenovirusvektooon jelenlévő transzgénlöl éhérő riporteriért jelenléte a. heipervirusban lehetővé teszi, hogy az Ad-vektor és a helpervirus jelenlété· egymástól tagneüsnüi kövessük. .A második ripv-ríergént lehetővé teszi a rekombináns vírus és a helpervirus elkülönítésé? ^'.tsztitás· során.
X.Kptnplejt^ntajo seuy;gnatak
A fenti gének bármelyikében deistáit rekomblntans sírnia»rttéenovlrusokok. (Ad) elóálHtásáíü a Jeleiéit génrégló funkcióját ···· amennyiben az a vtias replikáesöjához vagy infektiviíásához: esszenciális — helpervirus vagy sejtvonal alkalmazásával, azaz kotnplementólással vagy becsomagoló sgjíwaai alkalmazásával a rekombmáus vírus számára pótolnunk kell. A2 esetek többségében, a h rm<m El -proteint expresszáló sejívonahü alkalmazhatunk csimpánz A«-\ektor trsnszkonjpletnentálasáta I z kniono,>en előnyős, mivel ~ figyelembe véve a találmány szerinti, csimpánz Ad-szekveuciák és jelenleg ret-delkn. ön»te álló becsomagoló sejivoöéiakban alkalmazott: humán Ad El-szekvenciák közti eltéréseket a gyakorlatban elterjedt barnán El-íartaimú sejtek alkalmazása megakadályozza repiikációkompetens adenovirusok keletkezesét a reptikádő és urostepuelödés során. Bizonyos esetekben azonban előnyös lehet az E1 -génterméket expresszáló sejtvonal aikalmaznso, például
Jti E 1 -deleink simám aJenovímsok előállítására. Ilyen sejtvötmldk leírását találjuk például a 6 683 215 számú amvahco eevemh aí’nmok'vh vtabuddim fen.htén
Kívánt: esetben, a találmány szermti szekvenciák alkalmazásával mízámálisau a Pan5, Patak kan'/, SV'Í, SV25 vagy SV39 adenovirns El-gánt adott szülői sejtvonalban timkciottális prosnöíer szabályozása alatt expresszáió becsomagoló sejteket vagy sejtvonaiakat állíthatunk elő. Étre a célra indnkáíható vagy konstitutív promőtareket alkalmazhatunk. 1 Íven promöterek részletes ismertetését találjuk, a leírás más részeiben. Szülői sejtvomdst választónk a kívánt AdParő. Patai,. Patt?. SVX SV25· vagy SV39 gént expresszáló új sej ivónál előállítására, Például, de anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, szülői sejtekként alkalmazhatunk Heta \lLe ποΜίυη,-ΜΛΜί \o k Cl 2' r vih^ nan im -,/.«» r U SJ lXK2k KB [e t I I~]
Deírosí. [péláátsl Detóoit 510, CCl. 72], és 1VI-38 (CCE 75] sejteket. Ezek a sejtvon&lak hozzáférhetők az ÁTCC
115688-6132/SG
28..
nyu-tememebol (\nmrean Ape Cuhre Cníiec.sen, 1080} 1 n\ci-.sts öoulevnd. Mana.>..is, Virginia 2011022tNí Ma- utas ,yk·.-rjheí ί»Λ <.g>ebό>nőnkbe!'.zoc/vctoxbe
Ilyen, Eí-expresszátö .sejtvonalak. alkalmazhatók rekoinbináns, Et-deleteiáh slmí&n adernsvirusvektorok előállítására. Szirtié® a találmány tárgyát képezi egy vagy több simlan adenovta géntérméket például Eta, Elb,
F.2a ós'sngy EáÖREö-géntenaekei expmsszátó seíNonat, amely lényegébe» <t mkomfemáns, sírnia» vímsvektor «setében ismertetetek szénát állítható elő. Ilyen aejtvonalak alkalmasak a fenti géntermékeket kódoló-esszenci-. sós génekben deletált a<leisovirusveÍ!ti>rok tnuiszkoinplementálásám, vagy helper-depenáens virulok (például adeso-asszociált. vírusok) becsomagolásához szükséges hetper ttmkdók szolgáltatásáta. A tuUdmany .szerinti gazdasejt előállítására például DNS-szekvenciás összeállítására alkalmas eljárásokat alkalmazunk. A szekven10 piák.összeállítását szokásos eljárásokkal végezhetjük. Ilyen eljárások például a cDNS és gencreí DNS klónozása, amely technológia jól ismert, és amelynek leírása megtalálható például Sambrook.és mtsai. kézikönyvében {lásd fentX az adesovírus· genom átfedő ollgonukleotld-szekvenciáínak alkalmazása polim«táz-láscreakeióval kombinálva; xzíntézisteeljíiolőgiáfe; és bármely más, a kívánt nnkleoitd- szék véne iát eredményező eljárás.
További lehetőség szerint, az esszenciális adenovirus-genterméket t'« óo«s szolgáltatjuk iadenovírnsvektor vagy helpervims által. Ebben az esetben, megfelelő gazdasejtet választhatunk bármely biológiát organizmusból. például ptokanota (pckkml bakiénál·.!!) sejteket, cukanuta sejteket, pelduul rovarsejtehet, élesztősejteket vagy emlős sejteket, <űzd,sejtekként különösen előnyösen emlős sejteket alkalmazunk, például, de anélkül, hogy igényűnket a felsoroltakra korlátoznánk, A549-, WEH1-, 3T3-, löTi HEK 283-sejíeket vagy PERCő-sej'töket (amely utóbbiak ítmkcionáhs adenovirus El-génterméket espresszálnak) ÍEailaux E..E és '20 isixak: Ham. Gene Tfeer. 0, 1909 {10980; Saos-. C2C12-. L-sejseket, HTIIOSO·, HstG2- és primer l'sferofelaszt sejteket, vagy emlősökből, példáéi emberből. majomból, egérből, patkány bök ny tóból vagy hörcsögből szánna·· zó hepaioclta vagy myöbkrst sejteket, A sejtek forrásául szolgáló emlős lak vagy emlőssejtek opusa— például ühroblaszí, hepatoeiía, tomorsejp stb, · a találmány szerints megoldás szempontjából nem korlátozó.
Általánosságban, a minigént tarlalinazó vektor transzfékeióval történő bejuhstásakor a vektort körülbelül ug - 100 ug DNS mennyiségben, előnyösen körülbelül 10-50 ug DNS mennyiségben, adjuk körülbelül 1x10* sejthez. körülbelül lxlO'J sejthez, és előnyösebben 10'' sejthez. A vektor-DNS és gazdasert aránya azonban változtatható a választod vektor, a iKikloiasav bejurtsíására alkalmazotteijtós és a gazda,sejt figyelembe vételével.
3(1 \ λ-v-fί χΙηι,κΛ f'M ,/ernt tsrae.t —cs - len ,ΛΙχ i ont t, tt b un eb, v.kt 'r 'ehet, ru ódul esn pasz DNS, pta/nnd, Dg, imszpozon, .kozmid, epíszoma, vírus, stb. A vektort a gazdasejtekbe juttathatjuk bárót \ a o-bukia íMvenri-tcr v.et u üukb, r .. mt.U < u, í.io-.v x őiul tíU'-zte-M. tv,5 \ n ' trto/e'· sel. Egy \ug\ több adenovirusgént stabil.módona gazdasejt genomjábaépíthetünk, stabil módon epsszomaként expresszaltumatunk, vagy tranziens módon expresszáltathatunk Valamennyi géntern-éket tranziens módon exptewzaitadutiuk cpiszomárol. vagy stabilan integrálhatjuk; vagy eljárhatunk úgy. hogy a géntermékek egy részéi stabtl módón exprcsszsltstjuk, «lg naás részéi tranziens módon expresszáltatjuk. Az egyes ad,w\ írusgvnek psömóterdként - egymástól íiiggeítenül - választhatunk konstitutív promótereket, indukálható promótereket,. vagy natív adésoviras prométeri. A promótetf szabályozhatja az organizmus vagy sejt meghatározott fiziológiás állapom (például differenciálódási fázis, vagy replikáciő. vagy 3 sejtek osztódásai, vagy
4ö exogéa. forrásból származó faktor.
115688-6 B2/SG ~29
A (molekulákat (például plazmidokaí vagy vírusokat) szakember számára ismeri módom a leírásba» ismertetettek szerint juttathatjuk gazdasejtekbe. A találmány egy előnyös mcgvalóstiásÍ módja szerint, szokásos transzlékciós eljárásokat, például CaPOrtranszfeketót vagy elektroporáeiót aíkalmaz»nk.
A választott adesovüns DNS-szekvertriák. vaknmní a transzgéu. és egyéb vekteeeíemekösszeállítását különböző köztes plaztnidokká, valamint a plazmidok és vektorok Összeépítését rekcniblnáns vírwészecské&ké szokásos eljárásokkal végezzük, Ilyen, eljárások például szokásosan alkalmazott eD^S-klőnozó- eljárások, például Sambrook kv?ikönv\#ea ismertetettek (lásd lent), az adeaovíras geaomok átfedő óllgottukleodászokyeneiáiitak alkalmazass, polimeráz-láacreakem, és bármely egyéb, a kívánt ittikleottd-szekvmreiát eredményező eljárás, ismert írtmszfekeiós és kotrattszfekeiós: eljárásokat alkalmazhatunk, például CaFÖ4-precípiíáeiós techttológiákst, További szokásosan alkalmazott eljárások például a virusgéoomok 'homológ íekombinációján, agarfemezre öntött hlgyagarban vírusplakkok képződésén, vagy szignálok keletkezésének mérésén, és hasonlókon. alapulnak.
Például, a kívánt mimgéntartataű vímsvektör összeállítását kővetően a vektorral 1« ri/ro becsomagoló sejtvouakd traasriektátek a belpervkus jelentőiében. A helper- és adenovlrus-szekvenciák közt homológ rekombináció megy végbe, ami lehetővé teszik, hogy a vektorba épített adenotstu» ír,m»zgén szekvenciák replt-suk ttpmak, és vmonkapszidokbü csomagolódjanak, rekombíoáns vlsusjcszouskek kdeik,eredményezve, Ilyen vunsrészecékék előállítására tenszfékción alapuló eljárási a lka bum· tünk Λ ublmarn szerinti megoldás: azonban nem korlátozódik ilyen eljárások alkalmazására,
A fenti módos kapott: rekombmáns, simlan adenovírusok alkalmasak a választott trimszgén választott sejtekbe történő bejuttatására. A -becsomagoló sejtekben szaporított rekombináns vírusok alkalmazásával végzett m ’iii,- kísérletekben. a találmány sz, nn?, 1 i · delet alt, rekvn-.bináa», ssmun adcnovirus'.ckt'xok alkahn ásnák Ssa· nyúltak transzgén nem-majom, előnyösen barnán: sejtekbe történő bejuttatására.
Á találmány szerinti rekombínáss. sínnan adenovírusvektorok alkalmasak m víp-o, ex vívó vagy in s-ivo géaímwterre humán .betegekbe vagy nem humán, beteg állatokba.. Az ismertetett rekotabinánss adeaovírusvektorok evpressziós vektorokkéitt is alkalmazhatóak a heteroíóg gén által kódolt termék ó? vát-cj előállítására. Például, az hl-delécló helyére htszeriáligéni tamteazó rekostbínáns adenovírusok a fentiekben letriak szerint El-expresssáló sejtvoaalba trsttszíektálfettók. Más eljárás szerint, replíkáeíókompetens adénoviresokat: altóümazhabmk egyéb sejtvunalakban. Ezután, a transzfektált sejteket szokásos módon tényésztjük, lehetővé téve, hogy a rekombínáns aóenovtrasok a premöterről: expresszálják a géutemréket, Ezt kővetően, a génterméket a tenyésztő tápközegből proleiírtzolálásra és tenyészetből történő, izolálásra alkalmas ismert eljárásokkal kinyerjük,
A találmány szerinti: Fan5, Fané, Fan?, SV1, SV2S és/vagy SV39 eredeté rekombináns, simíaa adenovirnsvekiorok hatékonyan alkalmazhatók gémrauszferre, azaz kívánt, traaszgént- hatékonyan képesok i« vöm vagy «x vivő a választott gazdasejiekhe juttatni még abban az esetben is. ha az organizmus ncuttalizáló xt5uíjsapot.„t t.<.! o nsu.'ez\ '<n sef> \\\ ''ctottpus díen ' talanam eionvos tregs r osí. -t -nodja szerint, az rAAV-feszecskófet és a sejteket ex rivo érmikemetíSk: a fertőzött sejteket szokásos műdön tenyésztjük; és a transzdukált sejteket visszattüundáljak a betegbe, Ilyen készítmények különösen alkalmasak terápiás célra és immunizálásra, például pnstetóív immunválasz kiváltására.
115őS8-ö 1 .)2-St..:
Tiptkusalfoso, a fentiekben már ismorteteítsk .«zerínt, a találmány szerinti Pas5, Pajró, Pari?, SVi, SV25 és/vagy SV39 tőkombmátis adntwíutsvekfemkat terápiás vagy immaogea mttlekulák bejuttatására alkalmazzak. Mindkét alkalmazás «setén nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti rekomoináns adenovirusvekforfe alkal· tnazása különösen előnyös: olyas beadási rendeknél, adni a refembittÁns adenovirusvektorok ismételt beadására van: szükség, Oym beadási rendeknél tipikusán agy járnak el, hagy sorozatban több, nmgválfoztafott viruskapszidoí larádntazó virasvektort adunk be. A víruskapszidos mifeegyik beadás alkalmával, vagy bizonyos szerodpusú kapszid meghatározón száife (például egy, két, három. négy vagy több alkslommal végzett) beadását kővetően megváltoztathatjuk. A beadási rend szerint eljárhatunk ügy, hogy egy ehö majonseredetü kapszldöt hordozó rAd-t adunk be, majd egy másod ik mttjomeredetü kapszldöt hordozó r.Ad-t adunk be, végül egy hartuaiö óik majomeredetü kapszldöt hordozd rAd-t adunk be. Más beadási rendek, amelyekben a találmány szerinti Adkapszidekat alkalmazzuk egymagákban, egymással k'tnbtnálva. vagy más szerotípusú kapszidokkal fembiaálva, szakember szántára nyilvánvalóak. Adott t . oe t a beadást rend szerint, ttuis nem humán főemlős ttdenovírusábol, humán adenovímsbói, vagy mesterséges Ad-szerottpusből származó knpszidot hordozó rAD-l. adunk be a már ismerte tettek szerint. A beadási rend minden, egyes szakaszában egyetlen Ad-szerotspus15 kapszldöt adunk be több injekcióval (vagy más beadást út alkalmazásával), majd további sorozatot adunk be egy másik Ad-szerotípas alkalmazásával. A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti rskíusbináns Ad-vektorokat más. nem adesovirus által közvetített szállítórendszerek, például más virnlis vekiorrendszerek. nem virálís szállítórendszerek, proteinek, peptidek vagy más biológistilsg aktív molekulák alkalmazáson alapuló beadási rendben stlkalnut/zok. A következő fejezetben a találmány szerinti adetun n u>. vektorok aíkJn: szaksai K juttat ható m-dzkuiak rs-rtenetesute összpontosítunk
A találmány egy előnyös rstegvalósllási utódja szerint, a találmány szerinti rekombirtána vektorokat: a szakirodalomból ismert génteráptás eljárásokkal adtuk be embernek. A tx&nszgént hordoz» majotu vírusvektoA betegnek adjuk be, előnyösen biológiailag kompatibilis oldalban vagy gyógyászatüag e> orudható hordozóén anyagban szusapendálva. Hordozóanyagként alkalmazhatunk például steril fiziológiás soouktnt Erre a célra alkalmazhatunk szakember szamára gyógyásszatilag elfogadható hordozóanyagokként jól ismert egyéb vizes és notn vizes izoté» is, steril mjokciós oldatokat; vagy' vizes és nem vizes, steril szuszpeszrókat.
A taíáhnanv s/ouno stmwtt adenovüusvehmrekat elesendő mennyiségben adjtsk be ahhoz, hogy a eél· zott sejteket tram-zdnkfea:., .?> a kívánt terápiás hatás eléréshez megfelelő szintű géstranszferi és gén-expressziét
3-t> idézzenek elő káros vagy gyógyászat ti &g el ibg&dhatatlan fiziológiás mellékhatások néíkük az ilyen dózisok szakember számára ismert módon meghatározhatók. Szokásos, gyogyásztUilag elfogadható beadási utak például, oecneku' bőm tgetyu két? uo „ kot koda o/u tnk a %ov e keu >k a s^.-Z!tmert\ \ozv<tknt' a s/jvananv bástyára történő juttatása és más intraokuláris beadási utak; a készítmény közvetlen bejuttatása a májba; inhalálás; írtírunazstiis, intravénás, ínteamuszknlans. intraducabx s-zubkutás, imradermáife reetáhs, orális és más parenteúhs beadási utak, A küiöttbözu beadási utak ksvanr esetben egymással kotrsbinálhatók vagy módosíthatók a tumszgétmék vagy a körülményeknek meetdeioen \ beadás útja elsődlegesen a. kezefetnió állapottól i«OA vifusvekfor beadandó mennyisége elsősorban a kezelendő állapottól, a beteg életkorától. leu.-,Bh .női és egészségi állapotától foga, és ennek megfefeiően betegenként eltérő lehet. Például, a virusvok-or iet.tpi.mtt
115ÖS8-ófo2/SG hatásos- uozjsvs humáaa wgy állatorvosi alkalmazásra tips&asw körülbelül IxlöMxlO’' vírasrészecske;. körülbelül lxlQj!-|xl:Öu vfrttsrészecske; vagy körülbelül lxíöMxlö:z virusrészecske. A dózis függ aa állabeíuber méretétől és a beadás áíjáföl. Például. intratmiszkuláris fitos? történő beadás esetés, humán vagy állatorvosi alkalmazásra (körülbelül 80 kg testtömeg# állaitmltlémbernek) előnyösen kötölbelül lxlO9-5xlÖi2 VírasrészoesS két adunk be egy suti ilüer térfogatban. egyetlen helyre. Adott esetben, a készítményt több különböző helyre adjuk be. A találmány egy további előnyős megvalósítási módja szerint, orális -fiion történő beadás esetén, kutsán vagy állatorvosi alkalmazásra körülbelül 1x10' Mxiö'5 vírusrészeeskét adunk be. Szakember a fenti dózisokat módosíttatja a beadás fisának, és a rekembínáns vektor terápiás vagy vakcmázásí célú aíkahsazásáffiak megfelelően. A dánszgén expressziója - vagy íramunogéoek esetében - a keringő ellenanyagok szintje követhe1.1) tő, és énnek alapján a beadások gyakorisága msgállaplthatő. A beadás Időzítésének és gyakoriságának meghatározna más módszerekkebszakember számára ismert.
Előnyösen, & vírus vektorral együtt: vagy annak beadását megelőzően vagy azt kővetően rövid hatású imraunmodídátert is beadunk megfelelő mennyiségben. Imtuunmodulátorcm olyan szert értünk., amely képes a találmány szerinti rskosnbiítáns vektor elírni neuírakzálő ellenanyagok képződését gátolni, vagy a vektort sütő mutáló mtoKliktiS T-lhíjfoelíáli (GTE) Itatását gátofei. Az mmwmodulálöf megakadályozhatja a T-helper szttbpopulációk (Tbi vagy T,.s) és B-seitek közti kölcsönhatást, és ezáltal gátolhatja a rmutralizáló ellenanyagok képződését. Más lehetőség szerint, az únnmmnedul&tor gátolhatja a dfi-sejtek és CTl..-ek közti kölcsönhatást, és ezzel gátolhatja a vektor CTI, általi elíminádöját A találmány szerinti eüárásban alkalmazható különböző imptunmodulátofok és azok adagolásának leírása megtalálható például a kővetkező szakirodalmi helyeken:
2Ő Yaog é\ tH'xa! 1' Vpol 70(0). (:996j;.'WÖW.124Öó számú nemzetközi közzétételi irat (közzététel «apja: 1996, '«a' ? 1, K t A soo 33C'? számú PCT közzétételi irat; amelyek teljes terjedelmekben a khanhás részét képszik.
1... Terápiás transzgének
A transzgén által kódolt: terápiás termékek lehetnek például hormonok, növekedési és őlOérenclálódáss faktorok, például, de anélkül. hogv rgényünket a felsoroltakra korlátoznánk, inzulin, glukagon, növekedési laktor fGH). parathyroid hormon (FTH), növekedési hormon releasing faktor (GET), löiltkulas stimuláló hormon (FSH). luleirnzáió hormon humán chorlogonadotropin fhCG), v&szkuláris endothel növekedési faktor i VGF.H, sngiopoetinek, angtosztaiín, grannloclía kíslöstlaslmtolálö faktor (GCSf k eritropoetin (EPO), kötoszoveti növekedési faktor (CTGFs, bazikns fibrabiaszt növekedési faktor (bFGE), savas flbroblaszt növekedési
3ő láktor laFOF >. epídetmális növekedési faktor 1FGF), transzformáld növekedési faktor (TGF), vérlemezke eredetű növekedési faktor tFOGF), inzulin növekedési faktor 1 és IT (FGF-í és iGF-Ilj; a trauszfbrmáló növekedési faktor főcsalád bármely tagja, például TGF, aldlvinek. inhlfeinek; vagy ráesőm, motfogén protemek (8ME) bármelyike, például BMÉ-1-15; a növekedési faktorok feeroglmntoerfögiuin/ARJAfneu ddlérenciálédási faktor (NDF) családjának bármely tagja: idegnövekeáási faktor (NGF), az agyi eredetű neurotroph faktor (SONFl. a
NT-3 és NT-4/5 netttotrtphmek; a eilíáris neurotroph faktor (CNTF'k glissejtvonal eredetű neurotroph faktor (GDNi’k neurturtn, agrin: a ,semaplK!riní?k.coll3psmok családjának bármely ingta, netnn-í, netrin-2. hepatocita növekedési faktor (HGF). ephrlnek, uoggis, remié áedgeáog' fáz agy morfogenezisét szabályozó protein) és iirezta hidroxíláz).
A transzgén termékei lehetnek továbbá az immunrendszert szabályozó proteinek, például, de anélkül,
4ö hogy igényünket n felsoroltakra korlátoznánk, cltokiaek és btatokirsok, példáid trómbopoeda <TFÖ), llS6k8-öI32/SG •nsericukínck Hl k 11,-1-11,-25 cpr-ldaul 11 -?. II -A II ! ? sags IL-idk ntenvcna kcmoanuk'ans proteinek, leukémia iulübitór fektor, grannlocíta-toakrofeg stimuláló faktor, Fas-lsgandam, tumor aokrózís faktorok. interferonok, őssejt faktorok, 0k-2/flt3-!igan'á»Js. A találmány szerinti eljárásba» az «mtwrendszer által termelt géntermékeket is alkalotazhatunk. Ilyenek például, de anélkül. hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, a következők: IgG. IgM, IgA. igD es ígE, kunéra immtiaglobufmok, .humanizált- ellenanyagok, egyláneó ellenanyagok, r-sejt-roeepíorok, 1. és 11. osztályú MlKI-molekuIák, geaíechtralőglai úton módosítóit immunglobulinok és MHC-molekulák. Gyermekekként eaptewáhaötahmfc konrpfementszabáiyozó proteineket, példáid membrán kofaktor proteint (MFC), ./róem- faktort (a Cd-kouvertáz .alegységekre történő bontását gyorsító fekteti) (DAF), CRI, CF2 vagy CD59 faktort,
1(1 A öaaszgen által esprasszált gyermekek lehetnek továbbá g fenti hormonok, növekedési faktorok, citokmsk, limfekurek, szabályozó protemsk: és immunrendszert proteinek receptorai. A találmány egy előnyös megvalósítási. módja szerint, ilyen receptorok lehetnek például koleszterin. szabályozó proteinek receptorai, példán! alacsony derrzitású iipoproteia (1.ÖL) receptor, magas dcnznásd lipoproteia (ÖDLj receptor, nagyon alacsony deazttásá íipoprotein (V1..DL.) receptor, és a „scaveagcr” receptor. A traaSzgéa gentermékel lehetnek a szteroid-hörraon receptor foesaiád laujai, például gh-kokoriikoíd receptorok ás ösztrogés-receptorok, Övtíamla-rocepíorok és más sxtagrecepfórofc. Ezen felül, a géntermék lehetnek traas :k- ipóós faktorok, például hm./feí, m.<íx, maii, szórom rarrpooso faktor (ŐRS), AP-1, AP-2, r«yb, >MyoI> és tnyogenin. ETS-box-tartalmú pro-ebmk, '11133, E2E, ATI'l. ATF2, ATF3, ATF4, ZFS, N'FAT. CR13B. IÍNF-4, C EBP. SPl. CCAAT-ho\ kötőprófejnek. interferon szabályozó faktor (IRF-l), Wiiras tumor proféra, ETS-kötő-protein. STAT, GaX\
2ö box köföprotem, például GATA-3, és a szárnyas hslix: proteinek villás nyíl C/orferamf') családja.
A találmány egy előnyös raegvaléthtásr utódja szerint, a transzegés géntemfeke lehet k&rbamoíl s/mu-uz
I, orrúim umtr-zkafhamsláz, argluoszokcmát szinteiás, argínoszukemat ház, argináz, fmrtnril-aeciaeetát bidroíáz, terolaiamn htdroláz, aife-1 antitripszin, gfekőz-ó-feszfetáz, pöriobilittogén dezKmináz, Víít fektor, IX. faktor, cisztnrion béta-saáníetáz,· elágazó lárscú ketoasav dckarbroriláz, albumin, izovsrehl-Co.A debldtoganáz, p*opwn -( >k L'rtwu' raeíd n riom C,» \ mtv ckía '(ok dehfe'eenaz nzulm fen ,·?,> mór du piruvát karboxiláf, hepaíifess feszferiláx, .foszferiláz kináz, gliciu dekarboxiláz, H-prot&in, T-protcin, ciszfikns rihrózis iímvszmembráti szabályozó (CFTR) szekvencia, és disArofm-cfábjS-szekventha.
A már említetteken felül, a génferméfcefc lehetnek természetben elő nem forduló polipeptidek, például termeszeiben elő sem forduló nmiuosav-szekvenciájó, például inszerciókat, áeléciókat vagy aruinc-sav3(? szubsztitúciókat 'hordozó kíroéra vagy hibrid polipeptidek. Egyes itoraunkompromlPáh betegekben előnyös lehet ifeldául egy láncú, géntechnológiai úton raédosiföit immunglobulinok alkalmazása. Ujen. természetben elő nem forduló génszekveneiák példáéi valamely eélmolekula. túlzott mértékű expressztojának visszaszorítására nlkídínasbató auíiszeusz molekulák és katalitikus uuklfiiusavak. például ríboz-mok.
Valamely gén expressziőjának csökkentése és/vagy szabályozása különösen ctóns-x túlzott.mértékben puf'.feí dodo \e tok <. co I nlk u et. í spm proliét .ro j'Otos, pd.’un, pszoru/v, ke/e\-cre XrcirU, poiipepiklek kizárólag a hípetprolíferativ sejtekben termelődő, vagy az ilyen sejtekben a normális sejteknél nagyobb mennyiségben termelődő pobpeptidek lehetitek. A vefoott antigének lehetnek onkögének, például a .i«yh, ütve. jyj?, a ócíÁtöf iraoszlokácíós gén. mj, sre, P53, ·Ό'ί<, n* \apy EöFR által kiidolt polipepiide-k. Ctókogóifok által kódolt célzóit antigéneken félül, ürifotumcsr terápia vagy tomorproSektiv kezelési rend célzó» antigénjei lehetnek 8-sejtes íimfómák által termelt ellenanyagok variábilis régiói, 'f-sejtes lirafouuik T-spitII5688-64 323SG uveptom uak vanab-hs jegun, ,;nu'is<k ? ukthouns egyes donvos megvatosítaO írottját szedni auo-roroun betegségek célantigé»jdkéat is szerepelhetnek. A célzott polipeptidek egyéb tumorasVíVsJt polipepiídek is lehetnek, például tontorsejtekben nagyobb rtetmyiségben előforduló polipeptidek,. példáit! a 17-l.A jelzésű tnonokionális ellenanyag által felismert polipért!,1, és felá-kötö poiipepíidek,
Terápiás pobpeptldeklíént és proteinekvént atofeiazfeatunk autoimmun betegségekben szenvedő betegek es rendellenességek kezelésére alkalmazható polipeptiáeket, széleskörű protektiv imtnnns'ál.asitt indukálva az autötmmunitást előidéző célföolekttiákkal, pékiául sejtreeeptttrokkal és sajtó antigének ellen irányuló: ellenanyagokat termelő sejtekkel szemben., T-sejtek álad közvetítettautounnum betegségek példává rheumatoid atihőds (RA), setoi'özis multiplex (MS), Sjögren szindróma, sareotáosis, ínzulindepesdens diábetes u-ellöm- pPDM n lö autornuntm thynsíáítfe. reaktív arthritis, sponáyfeús ankylöpoedea, sejtedért»», polyroiosriis. dermaíomyositis, psomsis, vaseulíus, Wegener grartulomatösss, Crohn betegség és eoíitís öleeresa, A fenti- betegségek ső-iadégyikéí az auíommum betegséggel kapcsolatos gyulladásos láncreakció kiváltásáért felelős, endogén amigénekhez ' kuiotto Γ sejt-reeeptotok (TCR-eki jelenléte jellemzi.
A toiáttnány szerinti stnuaa ttdenov&nsvekiteök különösen alkalmasak olyan terápiás eljárásokban Jörté15 ttö íiikahtutzásra, ahol Wtmgéiteket: több alkalommal ktvátmak heittttahu adenovütisvekiorok álfák például ugyanazt .a ttattszgésf kívánjuk bejuttatni ismételten, vagy a trastszgéot más tosszgétsaM együtt kívánjak beadni kombinációban. Ilyen beadást rendekben bejuttathatunk Pan.5, Ranő, Patt?, SVi, SV25 vagy SV39 sitnian adenoviros vektort, majd ismételton, azonos szerotípnsü adenovirusvektori. Különösen előnyösen, a találmány szerinti Pan5„ Panö, Fan?, SV1, SV25 vagy SV3F siíniaa adeuovúüsvektert adunk be, álról áz első alkalommal beadott vírusvektor szemtiptisn eltér az egy vagy több további alkalonmuü beadott virusvektorétől. Előnyösen, a terápiás rend szerint beadhatunk például PanS, Panm Pa»?, SVI, SV25 vagy SV39 vektort, majd egy vagy több azonos vagy eltérő szerotlpusd adenovirusvektott. A találmány egy további előnyős megvalósítási módja szerint, adenovirnsvektort adunk be, majd az ismétek beadás .során a találmány szerinti, az első alkalommal beadott aáenovínisvekiorétői eltérő szerotlpusü Pan5, fenő, fen?, SV1, SV2S vagy SV3-9 vektort adunk be, és adott esetben, s<,abbt beadásokat veuzünk ,·./ elozekg alkalmazón adenoví-usvek-ortal megegyező, vaus e.nnyosen. attól eltérő szerotipusü adenovírusvektorral. A beadási, rend nem korlátozódik a találmány szerinti Fanő, Fanő, Fan, SV1, SV25 és/vagy SV39 simktn adenovirus szerotípusok alkalmazásával létrehozott adenovíntsvekferok bejuttatására. A beadási rendekben alkaitttazkttunR más adeneviras. szetottpusok alkalmazásával létrehozott vektorokat is, például, dé anélkül, hogy igényünket a felsoroltakra korlátoznánk, alfeatstazitatubk utas sumer .38 adenovírus szerotipusokat (például Pau9, vagy C68. Cl. stb.), más ttem-butnán főemlős adenova'tts szeroüpusokaí vagy humán adenovírus szeredpusrskm. a találmány szerinti FtmS, Pssö, Fan?, SV1, SV25 és/vagy SV39 vektorok egyikével vagy azok közöl többel kombinálva, ilyen, majom, más nem humán fenni ős vagy humán adenovírus szerofípusúkal a leírás más fejezeteibe-» ismeretünk. A fenti terápiás beadási rendekben, a találmány szerinti ParsŐ, Fartő, Fan?, SV1, SV25 és/vagy SV39 adenovfesvehtorok,!) beadhatjuk tte nem adénovíttisok vektorokkal nem viráiis vektorokkal és/vagy különböző terápiás szerekkel \an\ molekulákká! együtt; vagy azok beadáséi végezhetjük egymást kővetően (séekvenetálisan;. A találmány -,/erutt· nu^o.das nem korlátozódik a fenti terápiás beadási rendekre, hanem szakember számára más beadás»} tündék &· uxth.ntxalőak.
Ád.áiigl.kőzyet!fet.bejmtotása
115Ő88-Ő132/SG
34A rekombináns. sutban adenovírnsok tromunogén kész! treényekben is alkalmazhatók. A leírás szeriutl áttéteiben, tntmunogétt készítményen etnlősoeh. előnyösen főemlősnek a trans.zgéöBel bejuttatott terméket értünk, amely immoritiis {például ellenanyag) választ vagy eelluláris (például cltotoxíkus T-sspes) választ vált tó. A találmány tárgyát képezi rekomfentáns, -atman Ad, amely az ®tem£ru.s-S2efey«neb valatntóy részében létrehozott dotáció helyén 3 kíván- jmm.anoget« kódoló gént tartalmaz. A Amiatt adenoviros éló, tekomhméns \-rútakénaként. ccts a Utóiban iurteno aAalmvasra alku'musabb. tmm a humán esődet'.! adtomíroros. de a találmány szerinti megoldás nem korlátoodik azok más fajban történő alkalmazására. A rekonsbíttára adottovirusok alkalmazhatók proőiaktikus vagy terápiás vakcinaként bármely paíogósnel szemben, amelynek az. immunválasz kiváltása szempontjából Imlcsfeuíosságú antigénjét (aotigénjeit) azonosítottá^ at»ély{ek} ellen
ΙΟ irányuló immunválasz képes a patogén terjedésének:gátlására, -ás amelyneteMiyeknek megfelelő-cDNS rendelkezésre: ált - .
A vakcina (vagy bmrunogén)..készítményeket a fent ismerteted megfelelő hordozóanyagokban fóron··iázzák. Álialáuosságban, az immöaogén késziiruésy dózisa a föntiekben, a terápiás készítményekre megadott tartományban van,. A választott gén imrsusögenhása követhető az esetleges megerősítő oltások szükségességéIS »ék magiltópftáaóra. Mintán az-dlenanyaghteb a szénnsbsn megálfepköhnk, kívánt esetbe® megerősítő -itnnm* rozálást végezhetünk.
Adott, esetben, a találmány szerinti: vaké ínaké:sztónéayt más komponensekkel együtt is formulázbaijuk, például adjpvánsokkal, stafoíllzálószerekkeh pld-beállhó szerekkel, iaríósitószerekkel: vagy hasonlókkal. Ilyen kompoaenrok vsfo-inazásban jártas szakember számára jól ismertek. Adjuváosként '-alkalmazhatok például, de őreikül, hogv menyünket..» felsoroltakra korlátoznánk, liposzőmák, alom, söonofoszfortl4:g>id.«A- biológiailag aktív faktorok, például eiíokin, iaterfeukia, keruokts, hgaodmtxtk, és adott esetben, azok kombinációi. A férni, biológiailag skttv faktorok közűi egyesek cxprosszáltathatök fe v/vö, például plazmádtól vagy vírosvektorróí. Ihen aopstán» beadható például az dsö i-mnwxzálás alkalmával, az antigént kódoló DNS-vakeinával annak eMeke-'vn, houy erősebb uutígénspecsfikus immunválaszt váltsunk ki. mintha csak az antigént kódoló DNS23 < nkc mát ad> nk \ olna be egymagában.
A iekesnbtnáns adenovirosokat „tntstunogén mennyiségbe»” adjuk .be, azaz olyan mennyiségben, amely tz ,tlkaim.K»ott beadási ut melleit a kívánt sejtek hatékony huaszfekelőját, és a választott génnek az ímmunvákt?z kiáltásához megfelelő színtű expresstóőjMbiztosítja. Amennyiben pjotefctív immmválaszt kívánunk kiváltanp a rekombináns sdeuovítusokat a fertőzést és/vagy rekwrens betegséget megelőzői képes vukekta30 kompöitessekkéot alkabnazfeaiiuk.
Ezen felük vagy más megoldás sze-rtm, a találmáuy szerinti vektorok tartalunízhsifeak a választott innnortogésnel szemben mmmnválaszt kiváltó pepiidet, poSpeplídet. vagy proteint kódoló traaszgéné A találmány szerinti rekombmans asáenovírasok várhatóan nagyon hatékonyak az feszertáit, a vektor által expresszált heterológ antigén protein ellesi citolitikus T-sejték indukálásában és ellenanyag-termelődés kiváltásában.
Az ísnmunogén származhat például különböző víruscsalááokbol. Immunválaszt ktválthatunk például a picom&vüus családba tartozó vírusok ellen, például a közönséges ttátha körülbelül 50%-árt felelős rhittovirusek ellen: emeTOvirasok, például políovírusok, coxackie vírusok, echovirusok és humán enterovirusok ellet!, például a hepatitis A vírus ellen: aph-ov irusok ellen, amelyek roáj körömfájást okoznak elsősorban nem humán organizmusokban A pteornasmus crofödha tartozó uruscL i eí.smtgenje lehet, például a VP1, YP2, YPY VP4 és
VFG. További vírnscsslád a callcsvírasok család., amely magában foglalja a járványos gastrocnteritísck kiváltóit 563 8-6132/SG
33sában betöltőd szerepe miatt négy jelentőségű Horwalk vírusokat Barnás és nem humán organizznnsokhan iöriSBtivátesxt kiválté eélastigének ibnsbstd szolgálhat továbbá a teg&vfrns család, amelybe az alphavímsokat, ezen belül a Sindbís vírust, Köss Kiver vírust és venezuelai keleti és nyugati lőencephalítis vírust soroljak; .a rttbívírust ezen belül rufeeoia vírust. A. daviviridae családba tetőzik a dengue vírus, sárgaláz vírus, japán .5 eteephahiis vírus, St, Louís encephahtís és ktábaoseneepisalitis vírus. Célaniigém előállíthatunk továbbá Hepatitis C vírusból vagy a coronavirus családba, tartozó vírusokból, amely utóbbi számos nem humán vírust foglal magában, példán! a (baromfiak) ledöző íégcsőharut vírusát a sertések fertőző gásíróetderhis vírusát (amely malacokban okoz betegségei), a sertések, .íiernagglutítelö eoronavlrus okozta agy- és gerincvelő-gyulladását okozó vírust (amely malacokban okoz betegségei), a macskák fertőző perítomtisei okozó vírust (amely macskáid kát bet-' t uxg), a navskak be gs dkíl..-^ srovo vo onas>ne< s wuo ute.csősze tnn < >>ncn n u ·Ί,.<οaí oeteg t meg), a kutsak cvrotu'trus-t fomeó kutsak mcgboí.gydesef m.o/za}, es a humán o'ipiratonkus coronavirusokat (amelyek közönséges sárira!. és/vagy non- Λ π··»ο ·Β, non-C hepatitist okoznak). A eőronavírus családon belül, a célandgéa lehet az El (más néven M- vagy mátrixprotem), E2 (más néven. S vagy ,,Spíks” protein), £3 (más néven HE vagy nemagglorinin-elterese) ghkeprotein (amely nincs jelen minden •Cöroaavírusfeaa),. vagy X (ínskleokapszid). Az antigén származhat a rhalxfovirus családból. amely magában foglalja például a Vesieulovirusokat (például hólyagos száigynliariáx vírust 1 és a I.yssa vírusokat (ezen belül a vesneítségvirust). A rhabdovlrus család esetében, az antigén származhat például a C-proteinből vagy Nproteinből. Az antigén forrása lehet a fllovirídae család, amely tartalmazza a haetnoirhagiás láz vírusokat, ezen belül a Marbnrg és Ebola vírusokat A paratnyvovhus családba sorolják az l. típusú pamisfhnmza vírust, 3.
típusú parsinflussza vírust, aszazvásmarha paráútflúenza-3 vírust, a rtibulavírus· (mumpsz vírust), 2. típust! parainflnenza. vírust, 4. típusú parairsfíuönró vírust, Nevve-astie-betegség íbaromíípestis) vírust, a keleti marhavész („rmsicrpcst· urasát, a mmbd ló rumokat atuefs kanyaró ex kutyákat tnagbetegno szoporny -c..i must foglalja magában, valamint a poeumovirust, amely hez tartozik a respir&toríkus színe íehsmképző vírus. Az míínemzavírust az or&omyxövirtisok családjába soroljuk, és az is antigének forrása lehet (például a HA-proteío, az NI25 protein), A. brtsyavirus család foglalja magába a hmtyavfrua nemzetséget íkaitfornkd encephalúis, La öosse), pktebovfrus nemzetséget (RíA-volgyi láz), i-lanínviros nemzetséget (a puremaha egy hemahagís lázat okozó vírus), uairevírns nemzetséget fa juhok Nairobi betegségét okozó vírust), és különböző, külön elnevezés nélküli buoyaArusokat. Az arenavirus nemzetség esetében antigén forrása lehet az l CM és Lasxa-laz \trus A reofomsok családjába sorolják a reovírus, rotavírus nemzetségeket (amely utóbbiak gyermekek akut gssiro30 enteritisei okozzák), orbivimsokat, és euiilvírssokat [kolorádői kullanesláz, Lebembo (embereknél), ló eucephalosís, „kék nyelv” betegség).
A teúovirus családba sorolt vírusok az. öneovirinae alcsaíád tagjai, amelybe tmmas és állatorvosi jelentőségű betegségek kórokozóit Söroiják, például a macska leukémia vírust, HTLVI és HT1.VÍI vírust; a leaslvíras alcsaládot (amely tartalmazza a 'humán imstütideflciencia Árust (HÍV), majom irnmunőeSeiesKia v-fosst (S!V), macska ixnmmfoeíiAeneia vírust (FIV), a lovak fertőző kevősvóriiségét okozó vírust)·; és a spatnavlrinae aíeaaládot.
Számos előnyösen alkalmazható letitívírosanttgés ismert és választható. ilyen HÍV- és S.lV-aatígérsek ormául de t telke >>w ía”.‘ n«, ; te.xorol ox, i x<, sfoto »so-. < g <g r\/ A< m >'/A rvo n' \>z .· Aev-proteisek, valamint azok különböző úagssenünnaL Az Esv-proteín fragmentumaiként alkalmazhatjuk annak alegységei-, például a gpl2ö, gpióO, gp41-alegységeket. vagy azok kisebb fragmentumait például azok
H5688-Ó13ASG
-.36legalább körülbelül 8 aniiunsav hosszúságú tfragmextómaií. Hasonlóképp, választhatjuk a au-prolein fragtaeatömait [lásd például az 5 $91994 vagy 6 193 981 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat. Lásd még a HÍV- és SíV-proteiueket [Barosch D.H. és mtsaí,: 3, VwL 25(5). 2462 (2001 )}; Amara R,R. Smeoce 29.2, 69 (2001)j. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a HÍV és/vagy S1V Immunogéu pro5 temeket vagy pephdekst taás Immunogén: proteinekkel alkotott í'úzíős proteinekként alkalmazzuk. Lásd példáid a Wö 01-54719 számú (közzététel napja: 20001, augusztus 24 valamint a WO 99 16 884 számú (közzététel napja: 1999, április 8.) nemzetközi közzétételi iratokban, ismertetett HIV-1 2«r és/vagy Ah/'fúziós proteineket és imrmmizálásl rendeket. A találmány szerinti megoldás nem korlátozódik az itt leirt HÍV és/vagy §jy immtínögdn proteinek vagy pephdek alkalmazására. Szakember szántára a lenti proteinek szárnos lehetséges mssáo-síiása ismert elvégezhető. Lásd példáid az 5 972 596 számú amerikai egyesö-U államokbeli szabadalmi Vitásban ismertetett modostíUt ‘ -profe-nt. l.-.zen léiül. bármely koant HÍV es vagy SíV mununogex· beiktatható egymagában vagy kombin.a xoban. Ilyen kombináció expresszáltathaió- egyetlen vektorról vagy több vektorról. Adott esetben, a kombloárióbart egy vagy több exp?-esszákatoú inmumogént adnak be, áltól egy vagy több humunogént pástéin formájában adunk be. Ilyen kombinációkat az alábbiakban részletesen ismertetünk,
A papovavírus családba soroljuk a polvomavinu; aiesaládo! (BKV és ICL vírusokat! és a papdlomavirns síesaládot (amelynek tagjai ttanoros elváltozásokkal és papillonra malignus elfajulásával kapcsolatosak.). Az aáenovímsok családjába légúti betegségeket es vagy enteritist okozó vfrusokat sorolunk (EX, ÁD7, ARD, 0,8.), Λ parvovúus családba tartozó vírusok közül megemlítjük a macska parvoviru-st (macska en-eritist okozó: vírust), macska panléukopenla vírust, kutya parvovfrnsí és sertés patvovfíust. A betpesvírusok családjába tarío29 zik az alphaherposvirinae díesaláá - amelybe a herpes vírus (118VI, HSVI1) és varicelh vírus tpseadvtabics - .» cella /ostort ; trwts,mket v-mluk . hetol'erpesunnae a.csmaö - amelybe a cytomegalövlrus (HCMV, tmTOUiegaiovíxus) nemzetséget soroljuk és a gammaherpesvírinue alesalád amelybe a limphoejyptoyws és EBV ’imzetségeket (Burkiít Im^towj féttőxo rhínotracbettfe yírusk a Matekbetegség vírusát, és rhadinoviruat soroljuk, A poxvírusok családjába tartozik a cnotuopoxvimae alesalád, amely az oríhop<sxv|rus nemzetséget (vanola rteketehimlő) vaccinía (tehénbitniol). parapóxvírus, avlpoxvírus, capiipowír.‘s, '.cponpownns. n: pow rus χ· ivoíscrrk í íz er.fomopow trus JcsuL-dx t tngla ia muyubun \ hepadsavírtts család Tartalmazza a Hepatitis B vírust. Egy még osztályozaíian, anugésdőrráskéní alkalmazbúé vírus a hepatitis doha vírus. Az antigén származhat további vírusokból, például a madár fertőző burzabetegség vírusból és a sertések légzőszerv! és reproduktív szindróma vírusból. Az slphavírns családba soroljuk a 16 arteritís vírust és a kötönhdzó encepttalitis vírusokat.
szinten a talahnanv tsxeyaí kepe/tk .«««nn vags ωκ humán organizmusok humán cs nem hamut? gerinceseket megfertőző patogének, például baktériumok, gombák, parazita mikroorganizmusok vagy más' többsejtű paraziták elleni immunizálására alkalmazható, vagy rákos sejtekből vagy tömörségekből származó immurtögének, Ilyen bakteriális patogé?iek például patogéxt Gram-pozmv coccasok. például: pneumoeoecusok, siaphylococeusok és streprococcusok. Patogén örmn-ne.gativ eoeeusok például a nseabgococcasok és gonococcusok. Patogén Gram-negativ baeillusok például az eráerobacmri&ceae család tagjai, a.pseüdomoaasok, acisttetöhacter. eikeneila: a meíioidosis kórokozója (P. pseoaemríí/A), sabnosellák, slúgeliák, haemophilusok, moraxellák, /7. <7κοχν (a lágyfekély kórokozója), brucella, Frafícti&tía ra/omísA (a tularemia okozója), yersíma (pastuereHa), Sfrepíoóflt'íVhíS JK«%7?ys>mfs és spírifhuuok; Gram-pozítív badllusok például a kővetkezők:
Zivcriíí ?í?o.«o<.;í,-geney. £fr,wA.7ö/á«r rAoíopn7/««í?, CöfyscőatcteÍKt»· hipűfcriííe (diphietia), a kolera kör115688-6132/SG
->·*ί okozója a fi. amtinKés (as&ast, a donovaaosis (grattulonta jogúinak > kórokozója, és a bartottellosis kórokozója (Bartonelia sp.k Pálosért anaerob baktériumok által okozott betegségek például a kővetkezők: tetanusz., hetitliznins, egyéb olosíridiumok által okozott betegségek, tuberculozis, lepus, más myeobueieríum által okozott betegségek. Fatogért spsroeheták által okozott betegségek például a szifilisz, trepenematozisok, fmmhoesia·, pinta endémiás sziPó1' és iepiosptrozts. Magasabb rendű patogén baktériumok vagy patogén gombák okozta egyéb fertőzések pJdaa az aetisotpyeosis, nocardiosis, ctyptoooecosís, blaslotoyeosis, hisíopiasmosts: és coccidiomycosis, candtdust^ aspergülosís, ttiueormycoxis, sporöttiehosis, paracoeetdlornycosis, petrieüdtdosfe. torulopsis, mvcetoma, cltromotnycosís és dermatophytosis. Rickcttsla fertőzések például a tífusz, szíkfeshegységi foltos láz, O-láz, Rlckeítslshimia. 'Myeopiasma. és Chlsraydia fertőzések például a ?,ficoph;>m<í
I (> jwejmoB&e pneaxnoaia, a lytr^hograoukmía vextereom, pslttacosis, és. a permatáíis eklamytiia-fertőzések. Patogén eukariotáfe például psuogéo egysejtűek és férgek, és azok által okozott fertőzések például az amobtasis, malária, leishtnattiasts, trvmenosmomlasis, toxoplasmosts, Eóetímöcwfi corfefi, Triehans, Toxoplastna gondit, babesiosis, gjardiasís. tríeiunosis, fiiiariasis, sebisiesötniaisls, forúdfereg fertőzések, métely fertőzések, horogférgesség; és galandféreg (szalngfereg) okozta fertőzések,
A „Center fór Dísoase CóuirpF’ (GÓC: „Departmnent of Bealífe and- Humán Services”, USA) szerűit a fend orgardztmisok és/vagy általuk termelt toxiaok közül több potenciális biológiai fegyverként is számításba jön. Ilyeu hm ogtu égessek példáid a kővetkezők; «Ktámris (antrax), Cfo.őrfdíKm fioófiú?»#; és toxfoja (bemfizmus), FexsíHfo pestis (pestis), wtó mfor (fökeísbimői, fihzuefeetiö íítisrenső (íularemlaj és vírusos baemonbagíés lázak [dlo vírusok (például Efeola, Marborg), aréna vírusok (például Lám, Mochupo}], amelyek „A” veszélyességi köíegórrába sorolt organizmusok; Cktóefio fonmetti {Q-lázg Bruceila species (brucellosfej,
Stukhoíderia mailéi i takonykorj, 8üriiM-á.erit} psewfamaltá (mslioídosis), Fie/»w conroutítás- és toxinja (riein toxái), C'vóótihwt peri?««:>*.«,$ és toxmja (epszálon-toxrnj, Sinphyliseoccus sp. -és toxípjai (eníerotoxin B), Cámvmvóo psjftui { unecfertrsOiieíizak a > ízbiztonságot veszélyeztető ágensek (például lítirfo etíoó'?w, C;-ypíOxp<n pun urak utoszos láz iRickeíÍSííÍ pr(tivazekü2 viruseneephahfisek (alphavirusok, például venc25 zuetai loeuvephulbfe, kdeit toeoeephalítis, nyugati ióeneephaiitis), amelyek jelenleg „B” veszélyességi kategóriába sorolt ruiltroorgmnzntusok; továbbá a Nippas vírus és hanuvfotsök, amelyek jelén lég ,,C-’ veszélyességi kategóriába sorolt ágensek. A jövőben azonban további mikroorganizmusokat azonosíthatnak és. vagy sorolhatnak a lenti kategóriákba, vagy már osztályozott mrkroorganizmusokai. sorolhatnak más kategóriába. Nyilvánvaló, hogy & fém ismertetett, virnsvekíorokat és más konstrukciókat alkalmazhatjuk a festi miknocu^amzmusokbói.
vírusoktól ioxmjaíktól és egyéb melléktermékelkból származó antigének bejuttatására abból a célból, hogy a fent I biológiai ágensek okozta fertőzéseket vagy más káros reakciókat megelőzzük és/vagy kezeljük, i-sejtik \anubibs regtot elleni nmntmgének bejuttatása a találmány s/ermtt vektorok alkalmazásit',al CTL-sejtek közretnükődéaén alapuló immunválaszt vált kt, és sfoütiáíja a fenti T-sejteket. RA bán, a TCR-ok több specifikus, a betegség létrehozásában szerepet játszó variábilis régióját azonositottak. Ilyen TCR-régiők például a V-3, V-14, V-i? és Vp-17, A fonti polipsptidek legalább egyikét kódold nuklefosav-szekveacla bejuttatása tehát célzottat;, az RA kialakulásába» szerepet játszó T-seiíek ellen irányuló ímmmsálaszt vált let. MSben, szintért a TCR-ek több specifikus, a betegség létrstezásáfeaa szerepet játszó variábilis régióját sikerült azososfemi. Ezek a TCR-régiék a V7 és Vet-Ifi. A fenti pobpeptldek legalább egyikét kódoló nnklelnsayszekvettcla bejuttatása tehát célzottan, az M$ kialakulásában szerepet játszó T-sejtek ellen irányuló imtnurt a4© laszt vált ki. Seferodermában, a. TCR-ek főbb specifikus. a betegség létrehozásában szerepet játszó varubdis
115dh3-di32/SG
-38tótját azonosították Ezek a TCR-eka V-6, V-8, V*Í4 és Vet-16, Vo.-3C, Va~7, Vo~Í4, Vec-TS, Vtf-ifo Va28 és Vet-12, A fenti polipeptidek legalább egyikét kódoló rekonfomáss síttiian adeaovfeus bejuttatása ísbát célzottan, scleroderma kialakulásában szerepet játszó T-sejtek ellen irányuló ktnsnraválasxt vált ki.
CÁdJhtoközy^^
A választott gén terápiás s/héje, immnogenitásának szintje követhető annak megálk«>iíására, hogy szükség van-e megerősítő oltásra, A CDS-?· T-sejtes válasz, vagy adott esetben a szérum ellesanysgtitor meghatározásai követően, megerősítő immunizálásra lehet szükség. A találmány szermtl rekorabtnáns sí ottan aőenovjmsvsktort adott esetben beadhatjuk egyetlen adagolással, vagy különböző kombinációs beadási rendek szerint, példán! más aktív hatóanyagok beadását L magában foglaló beadási vagy kezelési rend szerint, vagy ίψ iKBi’t), thNt es ruge os in '{rmum Adásokat mzabrt !o-' ds ne időst tét rf s/et n Auxhi'ka tHasa szerint sZíhnos ilyért beadási rend ismert és alkalmazható.
Például, sgy első immunizálás· es megerősítő immunizálásokat magában foglaló beadást rend szerint, először DNS alapú vektort (például piazmldoft adunk be, hogy az immunrendszert indukáljuk, majd tnásodlfa megerősítő immunizálást végzünk szokásos antigénnel, például proteinnel vagy ilyen antigént kódoló szekvén15 mái hordozó rekombmshs virossáL Lásd például a WO 09/11140 .számú nemzetközi közzétételi iratot; közzététel napja: 2000, március 2.; amely sebes terjedelmében a ki-atmás részét képezi. Az immunizálást végezhetjük ágy is, hogy a találmány szerinti rekotnbináns, sirman adenovirusvektort adunk be, hogy az antigént hordozó vektorral (vte vagy DNS rdapú vektorral) szemben az mmmrirendsxer reakcióját megerősítsük, vagy proteinl adunk be, Eljárhatunk úgy is, hogy proteint adunk be, majd az antigént hordozó vektorral végzünk megerősítő
2ö itnmunizálást.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi elsó immunizálást és megerősítő tmmumAi.ast tnagaban toukslo beadást rerd k.vuiix/tort ammemtcl ->ze:nNm amelyben ant.gent hordozó plazmád. DNS-vektort adunk be, majd megerősítő immunizálást végzünk a találmány szerinti rekornbitíáíís, simiaa sdesovlrasvekíorrai, A találmány egy előnyős tuegvafósbási módja szerint, az. első és megerősítő immunizálást: magában foglaló beadási rend szerint multiprotemt expresszáltatunk az első és/vagy megerősítő immnntzálásra alkalmazott, vektorról [lásd például Amara R.R.; Science 292. 69 (2001, április}, amelyben multiproteín beadási rendet ismerteinek pretemalegy vicék expresszáhatására, ezáiütl íflV és SÍV elleni insrnunválusz kiváltására. Az: immunválasz imíukahbara eNoként alkalmazott DNS-sel bejuttathatunk például Gag, Fok Vili V?X,: Vpr, Pnv, Tat és/vagy Re, r>to!em>Aos egyetlen transzkriptumról. További lehető30 ség: szerint, a SÍV Gag, Föl- és íílV-Env-stcekvenomkaí juttattuk be a találmány szerinti rekotnbmáns adencndrös-kenstrakcióvak További ilyen beadási rendek: ismertetésé; találjuk pékláu! a WO 99/16884 és A (s t, sa iu >,/s vj. % jvj eíEoz ko ao'-tch irat x> n
Az első és megerősítő úntnunizáiást magában foglaló beadási rend alkalmazásé nem· korlátozódik HÍV eiíetti immunizálásra, vagy ilyen antigének bejuttatására. Az immunválaszt először indukálhatjuk például egy, a .35 találmáíty szerinti első cshnpárz vektorral, majd megerősítő immunizálást végezhetünk egy második csimpánz •vektorral, vagy az: antigént protein formájában tartalmazó készítménnyel. Az első és megerősítő immunizálást magában foglaló beadási rend alkalmazásával protektiv immunitást hozhatunk létre az antigén forrásául szolgáló vírusok, baktérinjsek vágy más otganizumsok ellen. A találmány egy további előnyös- megvalósítási módja szerint, az első és megérösifo -Immunizálási magában foglaló beadási rend alkalmazása a kezelendő állapot kj40 mutatására alkalmas szokásos eljárásokkal metbelő terápiás hatást hoz létre.
115688-6 B2/SG „39.
\z eko tntniuntzalasra alkalmazón készítményt különböző helyekre adhatjuk be dózisfüggő módon; az adott dózrs függ az antigéntől, amcüyel szemben immunválaszt kívánunk kiváltani·. A találmány szerinti megoldás sem korlátozódik meghatározott dózisok, 'injektálási helyek vagy gyógyaszaiilag elfogadható hordozóanyagjuk i alkalmazására Ax eljárás első és/vagy megerősítő- immunizálást foglal magában. amely lépesek állít hatnak egyetlen dózis beadásából, vagy több dózis óránként. naposként, hetenként, temeted vagy évenként történő beadásából. Az emlősnek beadhatunk például egy vagy több, 10-50 pg plazmidőt hordozóanyagban tartatosző dózist. Á DHS-készítmény előnyösen 1-íöOŐö gg DNS-vehum tartalmaz, A DNS dózisa 1 testtönxeg-fcg-ra számítva tipikusan 1 pg ás lóöö pg közti tartományba esik. A beadás helyűt az emlős faja és állapota szénát választjuk meg.
Az antigénnek emlősbe történő beadására alkalmazott vektor dózisát az alábbiakban ismertetjük. A vektort úgy alakítjuk beadást a alkalmas formává, hogy gyógyászatiig vagy fiziológiásán elfogadható hordozóanyagbím, például t/cfoutas, fiziológiás sóoldaibtm sznszpendáljuk vagy oldjuk; izotóttiás. sóöldatok vagy más formulák. szakember szamára ismertek. A választandó hordozóanyag szakember számára nyilvánvaló, és nagyid foszt a beadás áljától függ. A találmány szerinti kásritinényéket beadhatjuk a fent Ismerteteti beadás! utakon, a hatóanyag elnyújtott felszabadulását biztosltő készítményben, biológiailag lekötnie, biokempatibilis polimerben, vagy azokat a célzott hxöyre juttathatjuk míeellák, gélek vagy liposzomák alkalmazásával. Adott esetben, az első immunizálást úgy végezzük, hogy megfelelő mennyiségű atgövánst, például n leírásban említett •Ktjiiváns: N adunk a készítményhez.
Előnyösen, a megerősítő immunizálásra alkalmazott készítményt körülbelül 2-27 héttel az első itntnttnizu.ast kowtoen aduik ne az err ősnek \ megerősítő vcvstintny az <Jfo .mmun.zulusra Cska'tra/er PN\· vakcinával bejuttatott antigént tartalmazza vagy képes bejuttatni hatékony mennyiségben. A megerősítő készítmény tartalmazhat azonos vírusból szánna®} rékontbutáss'vírusvekfort (például a találmány szerinti aeenosim·» szekvenciákéi!, vagy más forrásból származó vímsvektort. További lehetőség szerint, a „megerősítő készít25 meny tártaim azhat a gazdaszervezetben immunválaszt Indukáló első itumanizálásra alkalmazott DNS-vakctoa áltál kódolt antigénnek megegyező antigént, de proleib vagy pepiid fortnájábatt. A- találmány egy további előnyös megvalósitás! módja szerint, & megerősítő készítmény antigént kódoló DNS-szekveociát tartatom ásnák espresszióját emlős sejtekben irányító szabályozó szekvenciák Irányítása alatt, például jói ismert bakteriális vagy vuusvekiorekat tartalmaz. A megerősítő- készítménnyel szemben az elsődleges elvárás az, hogy az első
-3G immunizálásra alkalmazott .készítmény által kódolt sntigéurtel megegyező, vagy azzal keresztreagáló antigént tartatotazzon,
A találmány egy további előnyős megváissitási módja szerint, a találmány szerinti shnian adenovirosvektorokat különböző itmmmizáiö és terápiás eljárásokban alkalmazzuk. A lenti eljárásokban, a találmány szerinti simian adenovíntsvektorokai eltérő szerotipusú kapszídoí hordozó Ad-vektorökkaí együtt, vagy azokhoz képest szekvenciálisán adjuk be; a találmány szerint!, adenovirasvektorokat neni-Ad-vektorokkal együtt, vagy azokhoz képest szekveneíáirsim adjuk be; a találmány szerinti adenovfotsvektorokat proteinekkel, peptidekkel és/vagy más biológiailag előnyős, terápiás vagy Immunogén. készüményekkei együtt, vagy azokhoz képest szekvenciálisa» adjuk be., ilyen beadási rendek szakember számára nytivásvalőak.
115688-6132/SC1 .40.
A csatolt példákban siaxiart adextovimsok klónozását és a találmány szerinti' rekombínáns adénovirosvekíorok sibáhftását szemléíteljük. A csatok példák csupán a találmány szerinti megoldás szemléltetését szolgálják, anélkül azonban, begy igéayüaket.aa ismertetettekre korlátoznánk.
s hMIáa
V h-ttsszáoort'tás
A P;tn5 [ATCC nyilvántartási szám: VR-S91], Panő [ATCC nyilván!anási νώτ YP·5Ή:, Pau7 [ATCC nyilvántartás; szám: VR-S931 vírusokat - amelyek eredetileg estsrtpánzok nytrokcsimtosbol lettek izolálva 293-sejtekbex· [ATí.'C nyilvántartási szám: CRL157TÍ szaporítottuk. Tipikusan, a sejteket 10% iötáits botjbssé10 rummal íFC'S; Sigreai és 1% pemcillatneVátteptomycínnel (Sigma) ktagés/'í.tt Dugsecco-féte xnésdosított Eagle-iápközegben szaporítottak (DM£M; Sigma. Sí. I.ouis, .MOj, A 293-sejtéi* t! '' FCS-sel kiegészített ÖMEMtapkőzegben fertőztük az első 24 órán át, majd f( S-t adtunk hozzájuk 10% végkottceniráciöig. A fertőzött: sejteket akkor gyűjtöttük össze, amikor a virus által indukált cüepátíás hatás („eyíopiííkíc etfeef'; CFE) a sejtek 100%-ában megfigyelhető volt; ekkor, az összegyűjtött sejteket cesttrifegálásssl koncentráltuk·,, Az ülepített
s.'tt<-ket IP mmo: I 1 re- pulíé-rben vpll fed snis/pendaltuk. os hárem fagyasztás oítasz! ts t ikh:ss,;l iizaitütttk. A vínsskészttméayt cézumt-klórid sürüséggrsdien'.e:; kot lépégben ulb-aeeíttrtíbgálttík, majd a vfoustajseutóbunot 10 mtnol/l Tris/100 ntmol/hlO tnmol/l N&íT5ö% uhceris összetételű puffertax !:--5xí0u részecske/ml dénzitástg, higitofttík, majd ---7Ö°C-oo tároltuk.
Egyéb nem-humán adesovfexs'szerotíptisok szaporodására vonatkozó ismereteit^. alapján, a 29320 sejtekben a x-árakozásí felülnxúló .adeuovírus-hözamot értünk el.
| Vírus |fezgmivímsfeszeeske.8xlí/.sejn
1 Pttn.5 I. Aferiif'
j Puttó .............................. f;6sj0>s
f Fan? SAxbF
3Ö
2, példa kib?úsgenm3;d)NSjeikpn:íésít
Az 1. példában ismertetettek szerint kapott tisztított virtiskésztfefenyfeőj: genosni ÖN S-t izoláltunk, és azt Hindii! vagy 'Bandii restrikciós enzimekkel emésztettük a gyártó utasításai szerint eljárva,. Eredményeire szerint (amelyeket itt nem tüntettük feí s a találmány srennti P;m5-, Fartő- és Pan.7-get5oni és a szskírodalonxből ismert Pan9-genem Kótri eávrő restrikciós hasítási mintázató· ad, tehát nem egyeznek meg egymással,
Meghatároztuk a Pan5~, Fanő- és Pan7-genom nukleotid-szekvenetáját. A FanS DNS felső szálának nufeieotid-szekveneiájái az. 1. azonosítószámú szekvencián adtuk ;neg. A Puttó DNS felső szálának nakleotidszekvenciáját az 5. azonos 11 ószámú szekvencián adtuk meg, A Fan? DNS felső szálának nukfeotiászeks eaciáját a 9, azonosítószámú szekvencián adtuk meg.
A víros-DNS-szekvenciák szabályozó és kódoló régióit, ismert adenmfe-us-szekvenciákkal mutatott koótolögíájuk alapján azöneaitottnk a fent .ismertetet!. „Cktsí&l W’ program alkalmazásával,. szokásos beállítások mellett. Az adenovmus-szekvencíákat lásd a fenti íábiázatokbazt. A nyitott olvasást kereteket transzláhuk, és a következtetett axomosav-szekvímeiákaS. korábban leirt adenovírus proíeffirszekvössciákkal - Add, Ad5, Ad7, Ad 12 ós.AddO - baseniiíotttik össze.
1IS6S8-ÖI32/SG
-41A szekvenciák analízisével a genom szerveződéséi humán adeoovlrusok szerveződéséhez hasonlónak találtuk, a legnagyobb foké Imsonlóságot az Aé4 esetében mutattuk ki. A csimpánz adesövirusok és más ismert: adenovímsok, ezen belül az Adlíu4 hexán binervtsriábilis régiói azonban. jelsníSs eltéréseket mutattak, Ezeket az eltéréseket tükrözik a megfigyelt szerológiaikereszareakciták is (lásd az alábbiakban).
Λ nexon-szekvenciák egy részének páronként összerendezését mutatja az 1, ábra. A Ixmmíaioti részlet bexon Mtolo megjelentett a vm,t»bol ptoteksuléde Oki- löl-hutoktéptof rbol s'rrnta.sk, amehek a legnagyobb (okú variabilitást mutatják a különböző szerodpusok közt. Megfigyelhető egy. a hesost bázisának (elépítéséhez hozzájáruló,, a különböző szorotipnsok közt nagy mértékben konzervált közbeiktatott rész is (az. ADC68 308-368. nukleottájamak megfelelő szekvencia:; lásd 6 083 716 számú amerikai egyesült államokbeli szshsdal10 mi leírási). Az alábbi táblázatban a hexonnroteistek aminos.o-szel>oencía'artak páíohkéati szekvenclaösszerendezésével kapott adatainkat foglaltuk,össze.
Összehasonlított: szekvenciák Hexonprotoinek atninosav-szekveneiájánnk. hasonlósága (%)
#1 42
AdC5 AdC 99.0
AdC5 ÁdC68 98,3
AdC 8 AdGö 88,0
AdCÖ AáC 1 84,9
AdCó AdC? 87,7
AdCó AáCö8 87,3
AdCb Add 84,9
AdC? AdC68 97,5
AáC7 óh 1 84,8
AdCóS kde 1 84.9
A csimpánz .ulenov erjsok íslxrgombdememanak f amely a reeeptothoz tőd, no kötődését tek-Kk.) struktúrája összességében hasonló (.'?.. ábra). A. noAdS és Có8 E l-proteinjének szekvencia -hasonlósága (lásd az alábbi
ÍS táhláz.atokhan) nagyjából megfelel a huAdb és kas5, Eanó, kan? szekvenciák közti hasonlóságnak.
115688-6S32/SG
Szekvencta-szonosság humán Ad5«$zekvenctával
Elb kis T-proteút Elb nagy T-protein
C68 47,5% 55,886
Es:í5 43,2% 54,5%
Partb 15,3% 54,575
Pan7 46,4% 518%
Az AdCS, AdCó és AdC? rephldáódefieierts változatait állítotok élő molekuláris klórozó eljárásokkal, az alábbi példákban ismertetettek szerint. ágy, hogy rnlsjgénkazetiákat ioszertólítmk az El a- és E.lb-gé»e'k.
kelvén' \ tekembmans vtnxsok Llonfiu r.olaltuk, e» Cm. 1 «.zeduneunvós elfutással 2dt-tci?ekbea szaporílob tűk nagy mennyiségben történő tisztításra [bischer K. és mtsab: k Virol. 76. 520 (I996)j. A vektor hozamot 50 lemez alapján határoztuk meg (ISÖrttm átmérőjű lemezek), amelyeken körülbelül 1x1(0 293-sejtet fertőztünk a megfelelő vírussal. A hozamot ügy határoztuk meg, hogy spektofotmnetnus úton ínértük a víruarészecskekoncealráctöb Miután El-deletak vektorokat boztank létre, tnegállamtottök,. hogy HEK 293-sejték (tanán adenovirus-5 El-gént éxpresszátó sejtek.! Jiansz-komplemenlásják az új vírusvekforok El-deléclóit, és azokban magas tttetú vtruskészitmériy állt-ható elő Néhány rekotnbinán» vírus eseteden kopott v trnshozamokat adtunk meg az alábbi táblázatban.
A vektorok transzgétdceat δ-gtdaktozsdáz (LuzZ), zöld Euereszeeus protein (GÉB), alfa-i-antitripszin (AlAT), edob gbkoproteiu (ebo), a trauszmembráa cítoplazrna dötöént nem tartalmazó szolübilis ebola ghkoprotetn variáns (sEdo) gént vagy az ebola glíkoproldn deiéciós mutteamah (EboA2, EboA? és EboÁ4) t, Aek- o g, kx.i t. vet 'aszúit.k í utót teg tiouru» {< \1\ ; premeter .ransít^a akit V E\i!kw un a/ufb n ..ND*' jelentése az, hogy az adott vizsgálatot még nem végeztük el.
11568%0132/SG .43.
A humán aáeuov&usvEl-géa Eí-delstált csimpánz: vírusokat femsz-kompletstesíáló képessége előnyös, mivel lehetővé teszi a találmány szerinti Ei-deistáit csimpánz adersovirusvektorok termelését, emellett, akarnád Au és a találmány szerbül csimpánz adesovírns-szekveociák közti eltérések miatt csökkenti vágy kiküszöböli s homológ rekombináció esélyei:.
A hexon hipervaríafeilía régiókban msgűgyelhetb eltérések mhtt azt vártuk, hogy a C5-, C6- és C7vírusok wrölógiailag eltérnek a humán adesovirusokíók ezen beiül az AdHu-4-vírusiól,
Vad-típusú vírusokkal mutatott elieaap.yug-kcícsztícíikó'viiás meghatározására vizsgáltuk az ellenanyagok reptoácsó-tompetens vírusok cüopáüás hatását (CPE) gátié képességét. Röviden, a vizsgálathoz 5xlO!J részecskéd»! koncentrációban tárolt adenovinss-készittnényeket (Adha.5, Pauő, Pánit, P&n? és AdCbá) lágitot·· intik. 1/606 aranyban,. Azért választottuk ezt a kötoentráesót, mert azt salatok, hogy centralizáció hiányában 48 óráit belül 106%-os enopádás hatást eredményez. Mielőtt a vírusokat s 29?-sejtekhez adtuk volna (4xlö* sett kuk, 96-lyakú lemezeken), azokhoz I :20 arányban hígított szérumot adtunk. Λ s -.'Sgabtbun a CPE kialakulását vagy annak hiányát értékeltük: teljes nemraHzáető esetén oltopátiás hatás som alakult ki. Irredntényeíoket az alábbi táblázatban összegeztük,. Az a megfigyelés, hogy a 36 humán szérumból 9 uoutralízuita az: AdhuS által indnkáit CTE-E öaSzhanzoa t \ í'u ki,,‘i(ibe es om.cov eldoídukn-cm k hx-u » ammutu < h'vrpopu Melóban. A számok a ueutralizációt matató egyének számát ieicm.íli (számlálói az összes szart egyén számával szemben (nevező). ND Jelentése: nem vizsgáltak.
Neatralizacio 1/20 aranyban hígított szérumokkal
Hűmen Λ fe) Rhesus IN===52> Csimpánz (19===20}
Adbuö 936 ND ND
Ad€68 1/36 ........................0/52 12/20
Eau5 0/36 0/52 16/20
Fané duó 0 52 9/26
Pun? 6/36 n 52 12/20
\ s/urt huntan v?es«mok közül 'ο bel 55 -x ru ocun ih/mtu ,tz Adó 03 hatuvit. es 3t>-bo' egy sem ncutralizálta :a Pan5, Panö és patté cítopátlás hatását. Az 52 vizsgált rfaesus szérumból egy sem neutraliz&ha a csímpánz atkmovbusoknu a rhesns majmot előszeretettel alkalmazzák pre-klinikai modellként HÍV-vakcinák tesztelésére. A 2Ö csimpánzból 9-12 széruma matatott jelentős mértékű centralizáló hatást egy vagy több csimpánz adeaovlrusssi szemben, sutnak megfelelően, hogy azok valóban endémiás csimpán2specifikus patogeoek t rdckes módon, séháoy csimpánz széruma csak a Pao5, Ptmő vagy AuCNt sírások ellen tartalmazod centralizáló ellenanyagokat. alátámasztva azt a feltevést, hogy ezek a csiötpáaz adenovirusveklstrok oem keresztnetítrallzálják egymást, és különböző szerotlpusokat képviselnek.
Ugyanezt a vizsgálatot végeztük cl 20 csunpáoz szétummhítával. A minták léié (5ö%~a) reagált szcrolőgiail&g, bár különböző mértékben a Pan5-vírusokkal, 40%-a a Panö, 55%-a a Part?, és 60%-a a Có8-virusokkal.
115668-6132'SG
A o.vttn s/c-umrenGk Kerül ezy tartalmazod erősen nentralizAio hasasa ellenanyagokat mind a «egy csimpánz Vírussal szemben.
A különböző szeroilpusok közti kereszt-neutralízácíó pontosabb meghatározására magas titerii pötikionális ellenanyag-készítményeket áihtothmk. elő a simám adenwírusek ellen. Azok -előállítására nyalakat immu;mzálfemk intramuszkulárísan, a C68 csimpánz adenovírösofcfcal végzett korábbi kísérletek alapján adjavánsként GFP-l hordozó r&kombináns vírusokkal. A szérumok seatralizáló aktivitását teszteltük a bárom, találmány szerinti csimpánz: adesovírussal - ÁőCS, AdGb -és AdC? - szemben. A nyulakat testtömeg’ kilogrammonként 5x1.0*' CőS'CMVGFP virosraszeeskével injektáltak lutramüszkulárisan, majd 5 hét máivá, azonos dózis alkalmazásával megerősítő Immunizálásban részesítettük. A kilenc héttel később levett vér vizsgálata azt matatta, az igen hatékony aeotralizálé aktivitású C68-, valamint Part-S- és Pan-7-vimsok élleó. de nem «eotralfzáió Pan-ó-virussal szentben (iáid az alábbi táblázatos.!, ami arra utas, hogy egy C6S (vagy l’an? vagy Fan-71 alapú vakcim hatékony immunizálást biztosíthat Pan-6 alapú vektort alkalmazva megerősítő unmera/asásra, Megfigyeltük azonban, hogy a masuk közti fenti mértékű hasonlóság nem szükségszerűen akadályozza az ismételt beadást olyas sKÍmáeiőkb&ú. amikor & v'ín'^Fenés Jfenanyagiiter nem olyan magas, srdat a fenti kísérletben a nyulakba® kiváltott elionanyagszmt. Az alebbj vb áraiban * jelentése 55% CPF, s-t- jelentése ő>6% CFE; és -í-s-í- jelentése löő% CP£.
I I56SF-ÓI32/SG
293 sejtek fertőzése vírussal.:
Fán? Psaő Fsss? FmBOS) €68 CFP Szérum- hígítás
- 4·'τ·$*· - ... 1/20
14-4- í/40
4-4-4- I/SŐ
V X. í-’lhO
J - 1/320
44*4*· · íM<l
4^..4,. Ί'Τΐ - !··' 1/1.280
•~ 1/2,00
>.<ss^s7%.r - ... mi no
4‘ «.· X. 1/10,240
4. Ή* 100,480
+'4 ,;..i.i. 44-4- 4. -.. 1 Ü x\ .
V4 4-H- -f -r 1/31.920
444- 44 4.4 1063040
4ír· 4-4-4- -^4-4- 1027,0
♦ .: ... 0665060
t: f -!-! -i - 5- 444 >** 1-0010,720
. .^>xv-xv 54-4 X·. <.;. 5 2,t?2h-40 |
-46Az eredményeket ueutralszálő ellenttnyagok kimutatására szolgáló kvantitatív vizsgálattal erősítettük meg, amely GEF-vektor transzdukriáján alapult. Röviden, f ΚΒΙ ó egereket immunizáltunk imramuszkulártsas vagy intravénásán 5,0x10:,? részecskédül PsuS, Pítué, kas? vagy Cóh készitmésnyek Bmösayolc (28) nappal később levett szénásokat keresztneutraíízáló aktivitásra teszteMüuk CökCMVEGFP-vírussai szemben 1/20 és 1/80 hígításban, összefoglalva, antíkor gyógyászati célra előélbtotí barnás ímtsunslobulin készítményt teszteltünk PanS, Psnő, Pau7: vagy C6S vírussal szemben mutatott .szexológiai reakciókra, alacsony színűi neajralizálő aktivitás? tapttszí Aunk a Paa7 és Cőb vírusok esetébem Ugyanebbert a vizsgálatban M liutuán szérumot Is teszteltünk. A szerummintákat 1/20 hígításban vizsgáltok. EreórítenyeitA szériák vsak egy egyén széruma tartahnazott nyilvánvalóan neutralízáló aktivitású ellenanyagokat Cbá-vlrussaí szemben. Nem mutattunk ki nearrahzáió aktivitást a PanS··, Fané- vagy PanMvírwAkal szemben.
Vizsgáltuk a Ptusá, Etmú, Pun? és CöS sinusa adertovírusőkkal szemben előállított, magas merő pohkionáfis ellenanyagok sírnia» aáenovírusokar kerc-szmemrahzálő halasát.
Nyulskat muannizálttmlc löí3 csimpánz adenovírusrészeeske tnUamuszkniáris beadásával, és megefosrtö itmmmízáiásí végeztünk 40 nappal később, azonos dózis alkalmazásával. ínkompieti Freoad-adjavánssal. A szérnmökat neutralizáló ellenanyagok jelenlétére analizáltok oly módon, hogy azokból felező sorozathigitós; készítettünk, és « megfelelő, GPP-t expresszslő csimpánz adesovbusvektob 10* gettóm kópiában tartalmazó szaszpetszióval fertőzőit 293-sejtekea GEP-expmsszsőt szupmssaáió hatásra teszteltük, A GEF-expressziót 5Ö%~ btm gátló hatású szérrmthígítást tekmteüúk az adóit vírust neutralizsló ellenuayagtiternek.
Eredményeinket az; alábbi táblázatban adtuk meg. Adataink jő egyezést mutatnak a be\o« umtnosavszekvenciák szekvenma-snafeíse alapján várt eredsnényekkel, mely szerint az Ad Pan-6 a saeroiogtaibg várhatóan leginkább eltérő a tőből csimpánz tidenovírgstől.
3-sej tok fertőzése 1 if géhöbskópiávál
benuó írotts Aá Fho-A Aő hm-ő: Ad hiú-f Adca
ruhbít iftutm-hzed uőfe Ati feéit-5 ΠΠϋ <1/20 1A560 I/2S60
Λ4 PtóMt Netitrahzáoiő nélkül ./<<<<) <1/20 <1/20
ÁdlW? 1/256(1 1»
Ad CbK Neutraiízáciő nélkül <i,:o <1 20
Annak sunghöíározósám, hogy s sírásán atienovímsokkal kerssztreagálő ellenanvagvk ptet uhmctája vár’uusm uluesvm e a barnán oopulactebao. ez b\ I W 'l5 es Ά ?s adertev ,rusek,r ana nezse tes.'-e.íuk
1ISO-Ú132/SG
47hogy keteskedeleínbeá hozzáiérhetö kevert humán inrmtmglöbniiunal (lg) ínköfeá.lva képesek-e a tteutraiizáló hatásnak ellettáíko. Ugyanezt a vizsgalatot elvégeztük az Adba5 vírussal és a Parid, .Paaó és Pm7, valamint C$8 csimpánz adsttowusökknl, Egy további kmfcftea, a. €5. C6, C? és CÖ8 csimpánz adenovlrusokkal immunizált egerek szérumát teszteltük az SV-15, SV-23, SA-17 ás Babooa majom mtenowusokai keresztneatraHzáló ké5 pességre. Egyik esetben sem tapasztaltunk kemsztneutmlizáeiót,
4» példa
Módosított pX-plazmidot állítottunk eio ügy, hogy a pX (Clontech) bfo-génrégiójábaü beiyspectftkus rnuugeuezissel megszüntettük az F«pi-hciyeí ráz így kapott módosított plazmád. pX\ 3009 bp cirkuláris ptazmld, amely fi replíkáeiós origót tori és ampieilim-reziszteneiagent tartalmaz (AmpR-cds),
A. A Pan5 adeíKtvirmsplaznud előállítása
A pX’-plazmrdban poklaikért hoztunk létre a FanS DNS-íragmermmi szekvenciális klónozására. A polilinkeriel a már meglévő ρΧ’-puklinkért belyettesitettük a piamid Máz/- ás EeoAAenzimekkeí történő emésztését követően. A PahS [tompa vég - Fse/1 fragöxé&taáí a pohkitker Síue/- és (AvAhetyes közé itsszertákuk. Ez a fragmentum az adenovírnsgenom 5'-ségét taríahnazta tsz 1. azonosítószámú szekvencia szermti 1-3606, házaspárokat). A Pan5 6«η6/-/Αρ/-fragmentumát (az 1. azomrsitószámú szekvencia szerinti 455·· >Ά -e\it) t p> n ítk (c lót ü< m eev sosk /( < vs íe.sok , tti 1 itt \t s cst-mu t ar il 1d’ <
tesít&nók, hogy az adeouvirasgenotn El -régióját ekmmáijuk. A PanS (ScW - tompa végű] fragmentumát (az i, azottoskószőmú szekvencia szerinti 28 658-36 462. bázispárokat) a pulii isiket EeoRZ-to^F-helyei közé ínszertáltuk (hegy az aöenovirusgeuom 3'-vée.ét a konstrukcióhoz adjukr, az /Ae.'-.V//«/-íragm«starnot (az 1. azonositészámu szekvencia szenmi ^t>6o-i5 P5 bá/ísparokui) a pobhokerhe ms/eradtok, es az *.//w/-A«.o6/feígmenmmot (az l. azonosítószámú szekreacia szerinti 15 135-38 658. bázispárokat; szintén a polilinkerbe iaszeríáituk. Adott esetben, kívánt ttanszgétit ísszertálunk az újonnan létrehozott pX’FssSAEl -vektor AGmA és 6/-5ee/-iiely8Íre.
ikAJATomri^
A kiindulást pX-piazmidot a pAdX-adenoviíus-piaztnidból (Ciontecb) állítottuk elő a fent ismertetetlek szeriut. Ezután, a pX' /hí?!< /A7i.u/-régíoját deletáltuk, és a tompa végűvé alakított Pan$-poliIbikért a./Ap/-hslyre inszeriáltuk, így kaptuk a pX'PtNX-ptamduí (2994 bp). A P;tu5 5'~vég-/Ge/-régiéjáí (az 1. azonosítószámú szekvencia szerint? i-3607, házaspárokat) a pX'I.NK 5b>«/-/ösc/-helyeire mszertáltuk, így kaptuk a pXTnn5-5’36 píazrmdoi (6591 bp), A pX'?an5-5’ SoaRi-Xi/;?./-régióíái kivágtuk, és a pRCS-piazmidtril PCR-ampliőkák CkíriSbe-fcazettával helyettesítettük, a fenti taddon kaptok a p.X'PanS- S’áE 1 -plazznidof (4374 bp), Rövidem az Z-Chti/ és W-Sce/ ritka, hasítási helyeket tartalmazó szekvenciát FCR-technológiával ampiirikálnik a pRSC>1 um xb >’ t '11' hol \ V P«'{< L '-semdtie \deí-celv 'xwaidisuí eted nesoe E a FCR íetmsk'r- *
A pX'?arí5-5’őE l-piííznrtdbaji (4374 bp) a PaaS-DNS-t úgy hosszabbítottuk meg, hogy ahhoz a Paa5 / M'(-,tú'«/-reg'.o:a; tűz I. a.'ooesuos.'omú veWtKU szerinti 3667-15 135. bázispárokat) adtuk, hogy megkaptak a pX'P:m5-*'Mh! pl.vtutcot (P ;Yb?í P.m5-s/ek\uEíi femmtasaeo í/ÚC ? ^ge: tar 1 uom-oto számú szekvenoia szerinti 15 135-36 462. házispátokai) a vektor pobtioker MM-££»/?k-My«s közé i:3\zcrtaltus. így kaptuk a pX'lhmŐAE 1 pia/ímdot. amely az ki-régióban ödeirdE teljes hosszúságú Pan5szekvenciss tartalmaz,
115688-6132/SG .48,
CJ.kkö.fb^
A pX’PsjsSAEl-plaasniöhól rekombfete adenovimsokat úgy állftöKtntk elő, hogy a plazmidot 81poiipeptideí expresszáhá heíperrel együtt ks^ttaasztetoálmk, vagy El-expresszáló becsomagoló- sejfvomdba, póídaal 293-sejtekhe, vagy a leírásban isruejtetsbek szerint elöáihioit sejtvonalba triuíszíekíáltuk. Az Et expresszipja a becsomagoló íejtsosalban- lehetővé teszt a PsioóAEl repliáciőját és víriookapszidba csomagolódását. A találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint, a pX’EanSAEl’transzfektáít -csomagoló sejteket a leni -ismertetett, transzként hordozó aáeaovdrasvektotrat transzfekíáljnk. A feelpervíms és ptazroid közt homológ rekombináció jön létre, ami lehetővé teszi, hogy a vektorban található sderiovir-us-transzgér· szekvencia repiikálódion, virionkapszídha.csomag-olódjoa, és ily módon retombinass adenovímok jöjjenek létre.
A transz&kdót követően iágyagart rétegezőink agarleta&tm, 2 hétig állni hagyjuk, vlntsplakkokaí gyűjtőnk, a vírusokat íslszaporiijök, és a iranszgé»- expressziójára szűrjük. Ezután, a plakkbsztltást íöhbször ísmcn-Sok c-. \nv-te í'.í.s Kítktí v-vjw’i Vet t svííCkC oss,eo>t tpk 'hu^x < h\imo kivim, 's a kívánt traaszgéat tartalmazó rekomtánám, csimpánz adenovirmu CsCl-gradlensben végzett sóriiseggradiensalriaeentófugálással tisztítjuk, vagy szakember számára ismert más tnódoo nsztíijuk,
5, példa
Eekö?nb?.öáns_Ebds)etáh„gam;;yektpr.dpánáása
A F.aub-virusí prenáz és proteináz-K-kezeléssei, majd fenolextrakcíővíd protemmentestíettük. A virus20 DblS-hes szintetikus 12 bp AmeAlinkerefcet tígáhxmk Serkosr és Sharp által leírlak szerint (Nocleic Acids Ikesearch Π, 6003 (i083)j, Ezután, a vírus-DNS-t Xbal-enznnmel emsszteitük, hogy abból S'-iragmemumot izoláljunk (6043 bp), Az Adó-Xba! SMragmenmmot pX-plazmidba ligáitok .a ő>a«Wbö/ helyek közé, így kaptuk a pX-AdPaníkÖ-ló.5-piaxnadot, A /ÓBto-linkerelíkel ellátott vírus-DNS-t PeoZ-enzíromel emészietnth. nvc> abból a 6475 fcp l’-iensánális fritgmestumol izoláljuk, és a pX-ONX Pael-Sroal-helyeire klónozzuk; a fenu raő25: dón kaptok a pX-AdPáaő-82-löö-phzudíteí.
;Ν0ΑΕ.(;Α:<3ΟλΑ32Αλ0Ολ;ζ.5.0χΙ<:ο6ο!
Az El-régió deleiálás&ra ím,.uJ,2-9) e. pX-AdP:an.6-S2-10ö--pkízaHd 2&ilFi-.X&a/-fragRW«íunut a m,u,91 ,?-(rngrnet!tumot átfedő, és AW-doameRtó kezeit FER-iritgusenlummal belyéttestícuak; sg\ kaptuk a pX--Ad-kanó m.u.ő-i,9-ió.5-piazmsdot.
Először, a pX-Ad-Fssö m.u.0-1,9-16.5 S’-klöat hosszabbítottuk meg úgy, hogy a Fano-gcaom 2. A2W(ragmenntmát (4358 bp, 16,5-28) a pX-Ab-Eanö m.o.0-1,9-16.5 XöoOelyére iuszertáituk. Eri a konsirnkcióí pX-Ad-Faoó am,0-t,9-2S-plásajidaak Köveztük.
Másodszor, a lE-klőní is meghosszsbbítotluk oly módon, hogy-a Fanó-gestoiu iu.o.41-82-szekvenciáját átfedő 15 026 bp M^t/ZFöö'-ibagmerhumoí a pXAdPanó-82-1-00 MuErktcd-helyére inszeriéltuk.
Ezután, a Sió? bp //mdiE/Ezt>2/7Z Pasó-iíngmeaiumot izoláltuk a pX-Ad-Fapó nm.0-1,^-28pkízaddbói, és & pXAdEaníMl-iÖO-plazxtndba isszertáltak a EöWE? és tompa végűvé alakított ,E\-b-helyek közé. Ezt, az 5’- és 3'-szekvenciákat egyaránt tartalmazó fúziós klóm pXAdí*aaó-G-l.9-19.5,64- iOó-kkmnak
40: nevezlek.
A Patté ló .335 bp líindni-íragmcntastiát írn-ts. 19.5-o-G pXAdlktn6-(M .9-19.5,64-10(1 Hindii l-helyere imzertákuk, így kaptuk 3 pXAtlP;Kf6-Ö-l,9- OO-plaznndot.
rekombináns íranszfewtartsok zöid/íéhér megjelenés alapján történő szeiektálásám
A GEP-géht Zör-próoxiter irányítása alatt expresszáíó, ritka,, tntroafcóáoíő restrikciós enzim hasítást helyekkel ?Pl-$ceí és l-Ceu 1 - határolt minigéttkazettái izoláltunk a pSimPle-pkG.FP-plazundfeól: (mszert: ttéíkéli} 5<tp/· és />ro,67-emésztéssel:, maid. a ragadós végek feltöltésével. A .•pSkutífe-pfcGFP-plaznsd (inszert nélküli) 4126bp hosszúságé, és GoJAGOri repbkációs origói; kanamycin-rezisztenciagént, p/ae, .LacZ-prataőtóf10 GFPmut3-1 cds szekvenciát t Cktnteeh), valamim GFPmttG-leds (Clontéeh) szekvenciát tartahnaz. Ext. a kazettát ák/Z-eozimmel emészte-t. ·όί«ρύ végűvé nktkitoít pXAdRanó-O-l.fr-iOÖ-plaznhdba szubkiŐHOZiuk, Ezt. 3 végső konstrukciót pX-Pand-pkGlTmu ó-l .9-1 tJO-plazmulaak reveztük, és az alkalmas a kívánt, géneket hordozó rvkontótnans, El-delvíad í’wfc moichuku is klor-A cteumtasarz oí\ módón, mg> abba a gént kózvartcnul bgaijuk, majd a kapott klánokat az eredeti pShutíle-pkGPP-vsktorolast hordozó klóitoktól zokl/fehér megjelené15 síik alapján szelektáljuk.
B, Alternatív eljárás Pstn-6-píaztnid előállítására
A Parté- vírust pronáa és proteináz-K-kozeléssel, majd rfenolextrakcíőval a fent leírtak szerint ''toAinnterávsiíetmk. majd a vintsd»\b-he/ v.ntcrtkus t?óp Fmí'Abiikvtvkvt hgabunk Az Aoó\ral5’20 fragmentumot izoláltuk, és pX-plazmidba itgáltnk, Így kaptuk az A-pontbaa ismertetett pX-AdFaaö-O-lő.Spíazmidot (9922 bp).
Az E1 -gén {m.u. 1.2-9) deletálásához 3.pX-AdEanó-ö- í GS-píazmidoi éGőBA és AGeAertzitsekk.ei emésztettük. v/títal az b la és P1 b-proteineké* kódoló régiókat (3442-63 lö.bp) ehávrslhofruk.. Ezután, a kapott vek25 tért BstWÍ-cnztntnu'l emésztettük, hogy a srekxtn maikért hordozó trúnigén kazettával kompaíibsEs tompa vegeket kamunk
2\..Szefekuy.niar>rerbgikmtó.sa
A GPP-géttí Gc-protnóíer irányítása alatt ezpmsszáíó, ritka, infröítkódelö restrikciós enzim hasítási beIvekkel - Ρϊ-Xcel és ECeu í - határolt íuintgett kazettát izoláltunk a pSbatífe-pkGFF-plaznhdbói a leni leírtak szerittr. Ezután, a öoGáó&sté-fragmeníumet az emésztett pX-AáPutJÓ-O-lóJ-plaztníddal ligáitok:, hogy megkapjuk a pXrÁdPa'nöMGŐ-I6.5AE1 (7749bp)píazmidot.
4,.
A pX-AdPunóM.Gö-ió.őóEt-piazondo! A2m/-enzimmei emésztették, hogy abba egy zPáv</-.feí('-lsttkert hgáíjunk. Az AdPímó-genombói XbaERsrl:í-&agme:ntmnot izoláltunk (mn2>8-i0ő, 26240 bp), és azt az .áAö//ks?7/-einésztett pX-AdPaoóMGÖ-16.SA£l-piazrn.idbu lígáhok; a fend módon kaptuk a pX-ÁdPun6MGÖ),9-i6.5,28-iÖO-piazfr3tdót, A Partó-genowfeöl izolált második Xbai-fr-agmentumot (mn 16.5-28;: 435Öbp) ágáltunk st leüti plastaátttfea, hogy megkapjuk apX-AdPan6MGÖ-E9~i06-ph3zmidot (3:8551 bp),
Ahhoz, hogy az A és B pontokban leírtak szerint előállított FI-deistáit Panó-plazmitíböl: rekomhhtáus adenevirusokokat állítsunk elő, a plazmitíoi EJ -poiipeptidet expresszáíő hetperrel együtt ko-transztek-áltuk.
1:15688-6132/80
5Θvagy E 1 -expresszáíó becsomagoló sejtvonalba, például 293-sejtekbe. vagy a leírásba» ismertetettek szériái előállított sejtvonalba transzfektoitnk, Az E í expresszlója a becsomagoló sejtvonaib&n lehetővé teszi a FanépkGrFmu.0-1,9-100 repliác tóját és viriortkapsztdba csomagoíódását. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a pX-Panő-pkGFPma,ö-1,9-1 Oö-transzfekták csomagoló sejteket a fent ismertetett, tnásik.transzgént hordozó adenovbusvektortsl transztektáljuk.
A,..F;jlC:kÜzmidok.el<\ib;U^
A Pací-Stnal-Fsel-Mlui-Bco;RV-.FacI restiikoiős helyeket tartalmazó szintetikus linkért klőnoztonk
EeoRI- és Ndel- enzimekkel hasított gBR322-plazmidba. Az: AdPan? bal véget (1-3618. bázispárokat} a hakerbe klouoztuk a és EW-bdyok közé. Ezután, az itáesovims El-régióját a klónozott végből 5h«ő/- és AhW-enzimekkel kivágtok, majd helyére a pSfesttie (Oanteeh)· vektorból sztornó I-CeuI-öFP-PI-Seel-hazettáí ínszertáltonk, A kapoti plazmádét Esel- és Mbd-mrimekkeí hashottek, és erre a helyre, a bal vég taeghosszabbilására az AdPau?-yirusből származó PkeZ(3618, bp) - tálal(15114, bpj fi-agmentonito inssertáhunk, A konst15 rskeíó (pPan7pGEB} végső kialakítására a fenti piaznbd Aíhb- és őkaRÍMtolyei kézé az AdPan?-genom 21 421 bp jobb oldali Iragmetonttoh: inszeitáltok a Mlul-hellyel 05 114. bp) kezdődően; a lenti: módon Eldeleta.t I\to7~adsro vírus: komplett tnolekuláris klóniát kaptok, amely alkalmas rekombináss adenovtook előállítására. Adott esetben, a® ójotman létrehozott. pFanT-vektorpiammdba, az l-Ceal és PÍ-SeeEhelyekre kívánt tmaszgént Inszertálhatunk.
ö,.Eixík^ákPíín7rytrysyekíorokelóálbtósa ?! pPan/AEl-plazmádból rekombináns adénovtrasokaí ügy áílítmttmk elő, hogy a plazmádét ESpokpepödei: expresszáíó telpet reí együtt ko-transzíefoáltuk, vagy El-expresszáíó becsomagoló vejtvonalba. például 293-sejtekbe, vagy a: leírásba» ismertetettek szerint előállított sejtvonalba transzfektáltok. Az El expressz ion a heespwgöló sejivósálban lehetővé teszi a.Pan?AEl relációját és vúrionkapszidte csomágoló25 dását \ toluhnány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a pX’PanTÁEl-lraitsztekiálí: csomagoló sejteket s fent ismertetett, ttuuszgent hordozó adenovírtmektorral tianszfektáljuk A belpervtrus és plazmtd közt homológ reko ,b< U'k.o jón létre, ami lehetővé teszt, hogy a vektorban íalálhsttó adenovfru-s-transzgén szekvencia rephvA'd <O viriottkapszidba esomagolódjoa, és Ily módost rekömbmásss adenovfeusofc jöjjenek létre, A to o tisztítás menetét a fentiekben ismertettük.
7. példa
Λ P&O.5E1 -régiónak megfelelő gént expresszáíó plaztnidvelóorokaf állítottunk elő, és azok alkalmazásával a vírus E 1-proíeinoket stabil módot? expresszáíó sejtvonalakat hoztunk lene,
A. Pat?5 El-régióját pX'-plazmádba klónoztok, lényegében a 4. példába» ismertetettek szerint, mielőtt a fenti régió; a pShudíe (Clontecb) vektor fragmentumával hoiyehesiíehbk. Az expresszlés plszmld a PauSgenotn legalább 1-3959. ttukleotídjaít átfedő Panó-udenovirosgenoto-szekvenclst tattahuaz. Az expressziós pkiznud tehát az Ad Pan5 csimpánz adeaovíxus Ekt- és Elb-protoinjeit kódoló szekvenciákat tartalmaz' teterológ promóter irányítása alatt. Hasonló expressziós plazmidokat előállíthatunk a fenti táblázatokban szereplő AdPanb és AdPan? E1-régiók alkalmazásával.
115688-0(32/80 * \t pMuncUí QprcsvJo Mtwtu ,<a riouli ’d»a
Vírus: El-prptefeefeet expresszálo sejivouakikal hoztunk létre úgy, hogy feíetu- (ATCÜ nyilvántartási szám: CGL2) sejteket trtnrszformálttttfe a 6 példában ismertetettek szerint előállított piacúiddal. Az igy kapott sejtvoeal&k alkalmasak fel-ddeíált rékoxobtnáns cstmpánz· adeuovirusok termelésére olymódon, isogy azokat genoxai vúus-DNS-sei és a fent leírtak, szerint ektoibtott exprcssziós plazmídokkai ko-trauszfektáljuk, .A sejtvonalak transzfektátósát és a fekwnbtnáns csimpánz adsoovirusok tisztítását a sejtekből más adenovbusók, például barnán-adoaovírusok -esetében szokásosan alkalmazott eljárásokkal végezzük f lásd például Konvitz: lásd fent és egyéb szakirodalmi bivaíkozásokfetm),
Ti - O'U'J'kpi ki'se^ oukTy^hv vto.tott IV ttajszk >ttÍurk <' yAPaiMl!
DNS-síd a Cdiphcet™ reagetukészlet alkalmazásával (Pharmacia, Dppsala, Svédország), a gyárié utasításai szerint eljárva. \ tran-zfekciót követően 22 érával a sejteket három percig glicerinsokknak tettük ki (15% glicerin 1 k'pes~pufti,bon. pH \5i íó% iosahs. '.v;juszerummai <> 1% Pvi-forvp anuhsoi:k>uno».kaJ ku'íis/vett
ÖMFM (Kel .0 \agv 1Ί2Κ- (?\549; Lite Science Technologies, Inc., Grartd Islaná, NY) tágközeggdl egyszer Htósíuk, majd hat órán át, 37°C-oa a fenti tápfeozegben inkubák-ik. fe/ntán, a transzfekíált sejteket duplikstunaokban 15- cm átmérőjű íeuyésztöedényekbe öltöttük 1 :.2ő. 1.:.40,. 1:8Ö, 1:16Ö és 1:32ö arányban hígítva. Mintás azokat egy éjszakán át, ST^G-oa inkubáifek, s tápközeget GAlfe-antibíotikuarmal egészitettük ki (Life: 'Fechaolagies, Inc,)· l ug/rn! koncentrációban. A tápfeszeget 5' naposként felcseréltük. és a temszfokelót kővető 20. na20 pon klóitokat izoláltunk.
Béta Ei~klőuokat izoláltunk, és azokat adeno-asszoclált vírus (AAV) fertőzést támogató képességre és rekösshiaáss LacZ-pcöteis-expresszsőra teszteltük az alább ismertetettek szerint.
B,.AAVAgrtózést Gősegttd üfegdorgafeydz^
Az AAY adenovirax által kódol: proteinek jelenlété: igényli teljes éietcxkltuának bva'lp>?'e>».'he/ Az
AAV-fertőzés elősegítéséhez az adettovlrtss El-protcin és az E4-régió által kódolt ORT6-proteta je-cnlete vgyaxáttt szükséges, Az el-expresszié kinsiútására AAV-feriözés elősegítésén alapuló eljárást atkalmazlonk Röviden, adesovixus El-protelnt expresszálő -sejteket ügy izolálniuk. hogy feltételezetten adenovirus E1 -expresszié sejteket és adenovírus-szcfevencíákat nem tartalmazó sejteket tartalmazó sejttenyészeleket fertőztünk megfelelő ideig snarkergéttt expresszálö edeno-asszocíál: vírwsal (AAV.i és humán adenovirus E4-gén által kódolt OR.Í'ó30 pro-eint expresszáló AAV-sal. Mérjük a markergén-aktivítást a keletkező sejtekben, és a kontroli sejtekhez képest jelentősen megnövekedőn markeraknvításü sejteket szelektálunk fe 1 -expresszáló sej-ekkénl. A kőt etfeezó kísérletben,, markergéítkéui s LacZ-gént alkalmaztuk, és a juarkerafebvltást kék szín -megjelenés© jelezte·;
Peluau'. a lenn scjnonai.tk.tt es >ωη toms/kétalt kömre'·: Jfelj» sejtrouaktka? terte/titok . egeckent löt) genom sueunyíséghen nwkergéu: botdozó AAV-vektor getsommal, például AV(fe.aeZ-geríijítutxul (Fishsr X, és ttttssi,: J. Vírol. 7Ő, 520 í 1996)1, ős humán adesovínts-5 ORFÓ-régíóját- expresszáló AAV-vektorral ( kk eriM Λ pfe/nud D\k szekvenciája u·, a Lac/'-transzgent es az Ad b.4 ORÍV-r, gint - ,.:ncfe ns top o.\a-así korét expressziős terméke az rAAV-ge:tönma.k megfelelő egxszálú (ss) DNS kettősszálú (ds) DNS-sé történő áialakttíását segíti elő - hordozó rekorobináns adeno-asszoejült vírusok (t/kAV) keletkezését eredményezi. fezeket a vektorokat 2% FCS-tés 1% Pen-Slrep elegye? tartalmazó tápközegbext ínkaháljuk 37oC-on. 4 órán át, amikor is azonos mennyiségű, 1055 FCS-t -tartalmazó tápkőxegei adunk hozzájuk. Szakember számára nyilván115688-Ó132/SG való, hogy az első AAV- vektorban bármely rtsarkergén (vagy nportergén) alkalmazható a vizsgálatban, például edkalikus lőszfatás, luei leráz, >tb. Amennyiben a .markor valarmlyen antigést expresszál, ellenanyagok slkalmzásáu alapuló enzimes vizsgálati eljárást alkalmazhatunk az antigén kvantitatív megfealározására. Az eljárás nem korlátozódik a markergéo azonosítására. A tertőzést követően büsz-huszounégy órával a sejteket Las-Z5 aktivitásra festjük ismert módon. Négy (4) óra múlva a sejteket mikroszkóp alatt vizsgáljuk, és a kontroll A459vagy flel.u-sejtekttél szignifikáns mértekben több kék sejtet tartalmazó sojtvonalalíat pozitívnak tekimjük.
Ifassőgén befettanba.gasdasejtekba
A 4., 5, vagy 6. példában Ismertetettek szerint előállított reketubínáns csimpánz adenev (tusokkal transz10 gént juttatunk emlős, előnyösen hmnán sejtekbe. Eljárhatunk például ágy, hogy a rekombináns vírust tisztítják, ’íi.iid azokkal 2v?> jeí/csü humán embronahs. sescsvií.Axí tersozimk Só \RH részéveké >eU koneentrae'óban. Λ GFP-expresszióí a fertőzést követően 24 órával jegyeztük fél.
A rekombináns csimpánz atlenovírusok géntranszlert előidéző hatékonyságát és tovikolé ρρ f lját egérmájfoa irányítóit gémmoszfer, egértüdőbe irányított géntranszfer és egérízötnba.b&öyítőti gt ή t s < et u dékonyságámik vizsgálatával hasonlítottuk: össze,
A LacZ-geat CMV-promóter irányítása alatt tartalmazó E1-deleíáh. adenövirtisvekterokai uiutottunk elő a fent Ismertetett eljárással humán Adő, csimpánz Patió, csimpánz Patt? és csimpánz Pan9 (Có8) vuusokböl. A vektorokat iommodefioieus NCR ustfe-egerekbe juttattuk (SÖ egér.· kísérletj a következőkben leírtak szerint. A májtrsnszfckciős kísérlethez 100 pl sznszpesiziót (lxiöu részecskét) injektáltunk a fárokvénáha. A füdötmnszfekclóhoz 58 pi szuszpertziót (5χ1Οιβ részecskét): adtunk be üttratracheálísas. Az izomtranszfekeiőboz 25 μ! szúszpefiziót {5xWiö részecskéi) injektáltok a AóínZát unterior izomba. Az egereket a vektor injektálását kővető 3., ?., 14. és 28. napon öltük le (időpontonként 5-5 egeret), A boncolásnál máj-, tüdő- vagy izomszövetet távolítottunk el fagyasztásra és paraffinfest ágyazásra. A fagyasztott: blokkokból metszeteket készíttettünk X-gai festésre, és a paraffinba ágy sütött szövetből készüli metszeteket hentatoxilin-eozm-festettük kórszövettani analízisre. Mindent ik időpontban vért vettünk. A szérurntnimákból máifunkcíös teszteket végeztünk.
A férni kísérletben megfigyeltük, hogy a Pan-6 Fan-? és Fatt-9 csimpánz adenovírusofc kevésbé hatékonyan idéztek elő géntraszfert a májban es tüdőben, nftetí a htiAdS-vínts. Ez azonban előnyős is lehet bizonyos vöt élmények tiellott mvei „\okkco tel hu Vb etott-ben vegtmdt i apovetas Az izomba történő géú38 transzfer kisebb eltéréseket mutatott az egyes szeret ipusok közt.
IkAdenoyirusyekmrpkJstmé^
B«tíyvgkl<:A>k.kŐztL
Egereknek (C57/8lő; 4/csoport) AdEnS, Pan-ó, Fan-? és Páu-9 alapú EacZ-vektort (B5.840€MVI,ac2, Panó.öOOCMVkaeZ, Esn?.őOöCMV.l..acZ, Fantí.ÖODCMVLacZ; IO!í részecske/ínjektálás) adtunk be a farokvénán keresztül. blartnlnc nappal később <-/ egereknek ismét, α 1 -antitripszmt expresszáló adettevírosvektort Adtunk be 015 ó40CMVhAlAI. Paaő.OOlX MVhAlAL IW.OöOCMYhA 1 AT. Paa9,0ÖÖCMVhAiAT; lÖí! tfe/eexke upektaLs) \z isméteken beadott vektor trauszdttkciójának sikerességét a szérum. et-aatítripszinkoncentracto meghámozz alapján állapítottak meg s vektor ismételi beadását követé 3, és ?, papon.
115688-6132. SG
Λζ AdHa5, Paa-6. Éan-7 és Paa-9-vira$okon alapuló adettoviryavekterds egénnájaí transzdukáló képességét a többi szerotipa^l szemben termelődön neutralizátó ellenanyagok jeleneiében is vizsgátok. Eredményeteket a? alább- ubü/adw összegeztük.
115088-6132/SG
Vektorok egértnútat transzunkéin képessége más szerotípasokkal szemben termelődött smtttrálizáíó ellenanyagok jelenlétébe».
A hoAd5-v.irussai végzett immu-rizáció m akadályozta a. Pan-ő, Fas-7 vagy Pan-9 fCÓ8) csimpánz adeuvv trusok ismételt beadását. A fend kísérlet alapján az: is megálfeíítfetó, hogy a P.aa-7 & .'Pan-ő és: Pan-9 közt helyezkedik el untíget-rekooság tekintetében, és- mindkettővel keresztreagái: s Pan-6 és .Psco-9 sznifem nem iieipraiizaha egymást bz meglepő a két vírus közti IroomiógíaGzsgátedok alapján, melyek szerint a Paö-6 Igen ;dentóstn éttér a Pan-7- es Fas-9-vírusoktól, A Psa-9 ellen termelt ansíszerntn nem kereszötetiíraihálta a Patt-őv uwokatt de bizonyos ntériéklg: seutraiizálta a Pan-T-vlrusokat» ami arra utal, hogy a Pan-ő eltér a másik két lő Vírusról.
10, péiíbs Rgkpmbm^
A -eijes SV--25-genoinei - kivéve a géntechnológiai eljárásokkal létrehozott El-deléeíót - iartaknazó plazmláot állítottunk elő. Az bl-delóGö helyére beiktatott I-Ceul és Pl-Scel restrikciós enzim iéiistnerő helyek lehetővé teszik transzgén inszeriálását ingázó piaztnidőkből úgy, hogy oda a fenti restrikciós· leitsmerő helyek által határok transzgén expressziös kazettás ínszertáioiík.
A Snal-SnaBI-Spei-Anii-PeoRV-S'.val restrikciós helyeket tariaknanó szintetikus linkért klérsozítínk EeoRl-· és Nitel- enzimekkel hasított pöR322-pl&zassdba, Ext két .szíateőfcus olígotnari - SV25-T (5’-AAT TTA AAT ACG TAG CGC ACT AGT CGC GC’T AAG CGC GGA TAT GAT TTA. AA-3'; 3S. azonosítószámú szekvencia! és az SV25B (5 '-TÁT TTA AAT GAT ATC CGC GCT TAA GCG CG A CTA GTÖ CGC TAG GTA TTT A-3C 39. azonosítószámú szekvenciái ·· inbrldlzáhattnnk, és inszertáltnak az EeoS.1- és Kdei- enzinrekkol hasított pBR322-plaaantdba. Az AdSV25 bal végét (1-1057, bp; 29, szonosííészfetú szekveticíál a festi knkerke klónoztuk a So&BÍ és Spel-helycs közé. Az AŐSV25 jobb végét (23 059-31 042. bp; 29. azonosítószámú szekvenciát a Ihikerbe klónoztuk az Αί;Π- és bcoEY-heiyek közé. Az adettovsrns Él-gént a klónozott kai íragmenttmtból. az beoRi-belyiői t547. kp) az Xhoi-heiylg (2031. bpt a kővetkezőkben ismertetettek szerint ksvágtak. Λ pSknttle-vektorróí A ionteeb) PCR-eljárással előállított l-Ceu-Pl-Scel-kaze-tái mvzemilíunk az beoRl- és Spel-beiyek közé. Ezután, az AdSV?.$ itl 154 bp Xhoí-Í'-agmentuniáí «2051-12 185. bp. 29. azonosítószámú szekvencia) ttiszeriáfek az Spel-belyre, A kapott ^lazmidot Hindii 1-enzimmei emésztettük, és a végső konstrukciót (pSV25) a 18 344 bp AdSY-25 fíindíií-fraginenimn t11 984-30 328 bp, 29, azonosítószámú szek30 vencitt) (uszeriáktsávál hoztuk létre: a féntí módon Eh-iteleSáií :SA’25-adeaovirus kompiéit molekuláris klónjái
II5648-41327SG kap’uk, «mdv mkdums fekombn&'s .uk-tun ttosokok eloalbí-tstna \doti esetben, az {honnan íettehozott pSVSó-velssorplazaudba, az Evéül esPI-Scel-hetyekre kívánt transzként iaszertálbatttsk.
Markergém hordozó AdSV25-vekü>rt egy ál Utódunk elő, hogy előzőleg a pShttttle-plazntidks (Ckmtecfe) klórsozott zöld fíuoreszeetss proteint (GFP) exniesszáló kazettát l-Ceul és Pí-Sceí restrikciós éttermekkel kívúg5 tűk, és ugyanezekkel -az «szintekkel emésztett pSV25-plaz3ítidfea (vagy -a leírásban ismertetett más csitupátte Ad-piazmidba) ligáitok, A kapott pa/sudot (pkV25GFPl aí-esrimmel emésztettük, hogy a kazettáia bakteriális pkumidváztől szétválasszuk, es HFk 2°' joMíM F l kompUítnesíáló -.seftvonafea traaszfektálíaL Kőrtllhelül 1Θ nappal később, a replikákon surook idenietem utaló dtöpáíras hatást megfigyeltük, A GEPtexpmsszáíó AdSV25 atópú adcrovfotsvektor előállításául sikerességét ügy igazobuk, hogy a transzfektált tenyészet felölik úszóját ftbs Litton ozetre vittük át. A stásotüagosau íértözótt sejtek jelenlétet, a sejtpopulációban megfigyelhető zöld fitajreszceneta«tápján muíaütsk ki.
l. példa
Ordslstáh .Pan-5-,. P » ji^jrioAA,és iAíüyekti>rpk.döálijtúsa
Az adeuovúusvektou'k ki-mozó kapacitásának növelésére az E3-régiő delet&lhaté, mivel ez a régió a ΜΙ 5 ars .tenyészetben történő sz^orf-íása- szempeabából nem esszenciális géneket tartalmaz, Ebhez, a Pan -5-, Patt -őFííu-?- és Cób-saíktorok E3-d:eleíált változatait hoztuk létre (az £31 A'-szekvanciáí: tartalmazó: 3·,5 kb Nnx* \vrilfragmentumot deletáknk).
V.E3“óels|áh.Pan5 .alapú, vektor
Az El-deleíált pPasó-pkGFP-plazsndot Ávrlhendmmkleázzai kezeltük, hogy az: E3-régW utstaluí.i/ö
5,8 kb íragtnentemot izoláljunk, és az: Avríl-deléciót tartalmazó pPanS-pköFF-psszutídoí újból dskuíári-M>a alakítottuk; így kaptuk a pPaíiö-pkGFF-Ea-Avrö-ptazítüdot, Ezután, az 5,8 kb Avril-fiagmetomot pM -PatsE3-Avrn~pláKrtbdl?a szuhklöuoztuk, hogy az £3-régióhan Nmí-emésztessel további delédói hozzunk Jetre \ lead módon kaptak a pSt-PanS-O delédós konstrukciói, A végső pFati5-Ei3-pkGFP-kottstrtíkeíöt úgy kaptuk, hogy a pSL-PanS-ES deléciős koustmkeiőből eltávolítóitok: egy 4,3 kb Avril/Gpd-frítgmeníuíttisí és szí a pl\ai ρΜσϊΡ 1 1 V E-rtazn dkt mzertumk az Arii !r \ < k »a\»tt ι,οη-'rrux óban 3,1 kb dclecOt Ír tünk létre az E3~régióbau.
B^-ágjégíOgre^ áz Eí -ödetáit píbtnő-pkGFP tsolekulárts klóm Síül- és Noíl-eözíttrekkel emósztettök, hogy abból egy
19,3 .kb fragmentumot izoíáíjuttk, és azt újból az Sbö-helyre Egáljuk. Á kapott konstrukciót - pPanö-Sbíl-E? ~
Úti Eóo4?Hi- és Swaí-eruúmekkel emésztettük, így kaptak a pPar}6-£3-kföm. Végül, a SbŐ-eim.észtett pPaoópköFP-plazutíéból egy 21 kb Shfí-Sagmenttsmot a pEán6-ö~píazaúó.btt szubkíóuozruak, hogy megkapjuk a pPatt6-E3-pkGEF-klórtt, amely 4 kb delécíól hordozott az E3-régiőbssi
CxbVdrieteltj^M^ésVafepktetok
Ugyanezt a stratégiát, követtük stindkét vektor esetében az Eü-ósledó létrehozására. Először, egy, az E335 emui ,'!ok> S kb V-ribl uzk m nvt - u bklonox u us. Avlimdbs u-d ,' H~ cetet \m’~ emésztenél ddeíál'.uk Λ kapott, píaznúdokat Speí- és Avrli-eazimekkel emésztettük, hogy egy 4.4 kb fxagroen* műtőt kantunk, arovKct ?í\'.o pkGÍF·· és pPan’EpkGFF-píaztnsdok Avríl-hdvére klónoztunk az eredeti F.3régiót 'tartalmazó Avril-fiagmetttuntok helyére. A pPan?-E3-pkGFP- és pPunó-f l -p.kGFF-konsírnkctók 3.5 kb deléetót hordoztak az £3-régióbam
4(1
113Ő88-6132/SG
- ?0~
1Ö
12, példa
EL ,L
Bár-az sdenovtrusok £1 -régiójában. létrehozóit deléeló (első generációs adenovhusvektotok) a vírusokat repltkádőra képletemé teszt, az teenovirasvektor gének expressziója nem szűnik .meg teljesen. Az Ed-régió cteéehpa ezt a maradvány génexpmssziót jelentőse® gyengíti, és előnyösen, a vektorok alkalmazását bisionságombba teheti. Ezért. 2.5 kb deledét hordozó E4-deletáh Pan-7-vekíort hoztunk léire (amelyből sz E4ORFIORF7.s?ekveftciáknak megfelelő Pvnn-Agci-hagnmntmttoí deleíállnk), Magas íiteru vírustenyészetei áiltettünk do HEH 293 alapú sejtvonalban, amely El-proteinen felül egy esszenciális E4-géat (oríó) is expresszit i,.E4-d?l£cjóJét^^
Egy 19 kb Xfed-imgmemarnot defetúfítrok a ppÍm7-pkG££-phízmidből, hogy megkapjuk a pPart7-Xaihnnstrukmot, .rmeb-boí \gcl- és- Psun-en-umekket vegzx.it rexzleges emevnessel egy 2.5 kb E-teiagmentiunm íteetáhank,. így kaptuk a pPan7-Xhal-E4-k»nsíná«ciót A pRajfe-'Eá-pkGFP-plaznddöt a pEan7--Xbaí-E4plazmádból állítottuk elő két szekvenciális klónozás! lépéssel, a pPand-pkOEP-konslrsteiéhöl származó 19 kh Xhsl- és 15 kh Ceut^Mlul-ftagmentumok hozzáadásával,
IdLcLJLddé^
Az E4-régiót tartalmazó 1 i. kb pbznnáoí - pPas9-B«.oRí — kozmák létre oly módon, hogy a pPan9pkGFP-plazmt-dot EeoRf-enzimmel emséztettűk, abból egy 11 kh EcöRMrogmdstomot visszanyertünk, és önmagával 'dgáhnnk. A fenti koasinteióbél az £4-rógiöt Agel-etnészfesset (majd- a ragadós vég feltőltésévei) és PviiTÍ részleges emésztéssel deletáhok, és a. fragmentumot önmagával ligálíuk; így kaptuk a pPan.9EcoRl-Eá-kh'-ni \. pP;m9~pkGEP-p!aztnidbó? 23 kh EceRÍ-ffagmetttamdf izoláltunk, és azt pPan9-EcoRÍ-E4plazmid EcoR--helyére inszertáhuk. Ezután, .& komtrukeróhoz a pPan9-pköFP-pl&zmidbóí származó 5,8 kb A\TÜ-fragmentUíWt adtunk, hogy a. pPtm9.-E3-E4-p.kGFP elnevezésű végső konströkciót megkapjuk. Figyelembe véve a vad-típusú Ean9 genom rnémlét, az EI-E3-E4-beíeíslt vektor 8 kh fmnszgéoí képes befegadni.
LKML gént, poklául riporter ter^Ótóinfetefeízettu.bfeptfe^a Agilífcyektorok. !^lekulárfetófefefe
Nagy hatékonyságó direkt klónozó eljárást és sóld/felte fenotipus alapján történd szelekciót alkahnaztu«\ Jekonf'-íraío v .tusok n/utet,-, klótp'iuk e'oalbí.uora Rovtocn a so-art oenes-v pvmrtk-pted Pvéklorba klónoztuk úgy, hogy fehér rekombfeánsekat szelektáltunk. Ezután, a tnbúgén kazettát különböző déléé lókat hordozó pP.mX pG 11P csimpánz sdeuovirus plaznndvázha feszertátek úgy, hogy azt a pkGFPkazetta által elfoglalt l--€enl- és Rl-SceFhelyre klónoztuk, és a helyesen inszertálódott föagíuentmnekaí tartalmazó néhány rekombiránsnstfc -megfelelő fehér kolóniákat szelektáltunk.
ÍSAG..éSü.yÁmrok.?k?appritása
E1~E3-deletek csimpánz sáenovirusvekíorok molekuláris klórjait ágy kaptuk, hogy a klénotet megfelelő restrikciós enzimekkel finearizálíuk, ős szokásosan alkalmazott 293-sejtekhe transzföktáltuk. Mintán a transzfektált sejtekben a c-topátrás hatás teljesen kialakult, nyers Jlzátumot gytljíötthnk. és 293-sejtekben ipari léptékű fertőzéshez felszaporitotronk, A vírusokat CsGl szedimentáclős eljárással tisztítottak.
E1-F.4 és E1-F3-E4-deletek. Pan-vektorokat lO-S-sejtek - 293 alapú E1-Ed-kontpiementló sepvooal - aikfeamzásával kaptunk, és a- vektorokat abban szaporítottuk. E4 ÖRFó-génexpressztót a lÖ-3-sejtakben úgy indukáltunk, hogy a tenyésztő tápközeghez 1 Sö umold ZaS'Ch -~t adtunk.
nSó88-öl32/SG
Ébola burok toérákat expressz;® Adh»5- vagy AdC^-vektorokat állítottunk elő C5~BL/S~egerekbeu végzett /« v;v<> ínunumzácios kWrkiekhe? Különböző vlrnsvázas tartalmazó rekomhlnáns vírusokat hoztunk létre molekuláris klónozó eljárásokkal ügy, hogy tninigén kazettákat tnszertáltunk az Eí-deléeió helyére. Valamennyi rekombináns vírusklont kinyertük, és nagy mennyiséghez·, CsC’i-szsdlmeníáeiős eljárással történő tisztításra 293-sejtekbeg szaporítottuk. Öt; az AdfíöS· vagy AdPaaa? tC7t által kódolt EhoZ-varánst szelektál10 tünk, és azokat relatív tmmuaoges.itásuk möanmszkxdári» Ad-lttjekíáhtsal történő összehasonlítására szaporítottuk, A kezdeti vakcínázási kísérletekben a következő variánsokat hasonlítottuk össze; vad-típusú Ebo, szolubÜis EIjo-variáns, EhoAl, EboA2. EboAÍ, EboA4, EboASS, EboAőS, EboATSl és Ebo.A8S. Az alábbi táblázatban a fertőzött 293-sejtekben termelődött vírusrészecske-szárnot adtuk meg (egy msihliíerre vagy az összes meaayiségre vonatköztafvss) soektrotbtometriás úton történő meghatározás alapján.
EhöZukaséssakatkí^
BttÁdS AdC?
Géa Éh© wt Títéf tVFx 10ΑρΠ Teljes hozam íVPx Tster (VFx ίΛηΙ) ! Gjes h zom t'VP 1OS>
24 12 4,3 43
Ebö-B 4,9 49 4,5 SS
Btó2 11 9 5,3 93
EbdíA3 1,7 a 5,3 95
BbM4 .A π 4,1 33
A. vektort tnírantíjszknlárísan adtuk he (18f 1 genom! köpia/sep) C5?B1.76-egere®ek, es meghatároztuk a vfetsneatraltzálö ellenanyagfhert („V\A-titer> fVNAö: 28· nappá! később megbatározott neotraiizáfő eltenanyagiher, az Bbola hurok «hkoprotcimei szentben indukálódott imtuuúváiasz első indikátoraként). A leírás szerinti értelemben VMA. kth-je/ewn HsLa-sejíek vad-típusú Ebola burok-ghkeptotelríokeí hordozó HÍV alapú vektor {„pszeododpus'·’) áltah transzdökeieját gátló szérum ellenanyagokat értünk.
Ás kfeoZ-pszeudoíiptissal szemben kimutsthatö VNA Adkan? (C7> vektor esetében magasabb bterüaek bizonyult, nőm az ,AdÖ»S esetében. A célzott transzgén vonatkozásában az bhoZAa váltotta kí a legmagasabb tííeru VRA-t. Az alább! íab'a/eibtm a HÍV-EhoZ-GFP--pszetídot!pusokkal szemben kimutatható ítenírabzálö ellenanyagtitereket adtuk tueg ta hígítás reciprokával) (N« 5 állat/esoport),
VNA-therek
EiXjZ vad-itpUSÚ íihoXs hboXAÓ
AdBu5 1.2 ló
AdC7 44 12 ;4ö .........................................
115488-6132/SG .58
Egédtisérle-ekct kezdtünk az Ebota-lmrokproíeineket és az Ebob nukleáris antigént expresszáló Paa-7vektorok jctiemzésére. Vizsgáltuk négy (4) különböző Ebofee env-köostrukcsóí: expresszáló AdfeaS- vagy Pas-7-vekterokkal mtrarauszteláris&íi (I.M.) injektált C57Bi/ő-egerekben kíaltfalt aeutrallzáló eiknanyagiiteraket.
A. CTL'Váfesz snegbgí;lr»?.ása EboU Etm-konstrukciókat expresszáló ÁdíaiS- vagy Paa-7-vefctoKíkkaí.
toütoKUSZkulárísnsr ipiekíalt C57Bl/6-egetckben .L.&rtözéssjjj^
V í bvia-burekKal x/citbcn ksaükak neutrabzJo J ionon vags.d.u>/t („ev. s,o'.vm-vg í/r.vboJ'.’, NABt vizsgáltuk az Ebráa-btwk-glíkoprotemeket hordozó fenti-vírus (HÍV) vektor pszetídotiptisokkal (élbe N’ilkk NíEö, NTD4) intoíunixált.egerek szérumainak alkalmazásával. C57BL/Ö- vagy BALB/c-egereket mjcktaíusnk egyetlen at-vdiom nn mtr.ont.szkulin»sn. outtv-nkent 5xlC* Ebtoa-huroksanánst kvdoto (ΛόΓάηΆ \xruv részecskédet \ ne Un ' unó clfenanyagtitert a vakcinázást követően 30 nappal később határoztuk üreg Rőt td<-n. 3-va*akt»>/uJ i i mvívKí 'bdc-Zaue ps,,-eudoío«:s 111 V-\ okiért (1 beZ-KlYJ ac/i mkubaUunk 2 órán ot. 3\ on 'tw?i rs.kn.to'euera/tr. t't A k tfeibo^o t <'t'.^,ts i\ se , n et' vn á'-/eruntnei ét <nv i )kna ot k.nctőm, az EboZ’HÍ^ I .n ’ vírussal HeLs-sejíeket fertőztünk: 37°G:-on, Jő őrá# át-A fertőzőképességet transzénkáJt IfeLa-sejfek. X-gal festésével igazoltuk, ahol azok β -gaktktezidáz pozitív féstődést matatnak. A neaíraltzáló íiter-azon -szénitnhigitás reeiproks, amely a β-gaiaktozidáx pozitív, kők festődésö sejtek számát Söbá-kal csökkenti· Sxératn mintákat az immunizác tőt követően 3Önappal -gyűjtöttünk, az immunizálást 5x1 Ö!ö' részocskerá-H-af isírtotorszkuláris (I.M.) beadásával végeztük, Vslaníeisnyá csoportban kimutattunk Ebísla-borokprotoineke; hordozó HÍV (pszeodotipus) elleni neuteíizáiő eifenasysgokat, az ellenaayagtíter Ad-EboZ (EboZ-cxpresszáló ÁdfeuS), Ad~NTD3 (szcíófeilis NTD3-expresszáló Aábnő) és C? sJ'bo ti boZ-expresszáJó AdPan-7) esetében 20, a C7--NTD3 íszolúbihs NTDl-expresszálö AdPait-7! esetében 130 sóit A fentivel azonos timntmízáciős stratégia BALÖ'c-egerekhen alacsonyabb neuíralizáló elleaaayagítfetvket eredményezett az Ad- és C7-NTÖ2 és NTD4 esetében.
Az Ebola-barok ellent celttoáris uwnválaszt C57BL-'6-egerckben vizsgáltuk. 8 nappal állatonként 5x10*'’ C7-t;tcZ vagy C7-Ebo1s búitok$.n<ms vfeusrészeeske intramuszkalárís beadását követően, Egereket I.M. vakcirtáztunk Sxlös'' C7-tacZ vagy t 7 Ebota burokvariáns! kódoló vírusrészeeskével. Nyolc (Sj nappal az immunizálás után, az ümmmízált egerekből lép litníócitSkat izoláltunk, és azokat ó? vúro tápláló sejtekkel (vadtípusú Ebola burokpnotónt kódoló, sugárkezelt barnás adenovírus-S szerotipuasal fertőződ, kezeletlen egerekből származó lép lünfocitákkal) stimuláltak. A CTL-vizsgálatot szokásos módon, 5 órán át végeztük. EfeoZexpresszáió vektorral transz fektéit, 5íCr-jelöh sziugén C57-sej-ek. alkalmazásával.
Pozitív MBC-koríátozott citofesikus ϊ-lintibeíta (CTI.) választ tapasztaltnak- valammayi Ebolaburosvanánst kódoló AdPas-?-ktö« esetében, erősebb válasz volt megfigyelhető az NTJ32-, NTD3- és NTXM~ ixtmtumzált egerekixta. Az Ebola-batokproteiai kódoló C7-víntssaJ immunizált egerekből származó eflektorsejtek felismerték a® EboZ-transzfekták célsejteket, és CTIz-válasszal reagáltak akár 3Ö% specifikus lízíst eredményezve. Naív vagy I.acZ-Ifrananixálí kotorod egerekből -származó effekíorsejtek alkalmazásakor 5%-aál alacsonyabb arányé ífeis: volt tncgfigyelisető, atní azt igazolja, -hogy a {fess specifikus volt az Ebela buxokanügénre.
’ 1 $688-6132/SG
-59.Az'EboZrvaríáswkat kódoló C? (AdPsn-7) sikeres vakeisaként történő aikaimtMtatéságánsk értékelésére, az: mmrurúzálássai létrehozott védettséget vizsgáltuk egerekben, egetekhez adaptált Bhola-Zsire vírussal történő ietális fertőzés által .előidézett testsúiyveszteséggel és pusztulással szemben. BALS/e-egereket ismmui5 záimnk a kombbiakban ismertetettek szerint, egyetlen alkalommal, állatonként 5x:l.ő,u részecske beadásával, és 21 nappal, később a vskeináznri állatokat 2@ŐXD$) egérhez adaptált hbob-Zaire vírussal fertőztük. Valamennyikontroll egér (hordozóanyag és €7-lscZ) elpusztult a fertőzést kővető 5-9, nap között. Ezzel szemben, egy kivételével (a CP-sBbo-osopertból) valamennyi vakcinázott egér életben rnatadt az Ebola-Zaire vírussal történt: fertőzést követően.
Mértük a C7-sFbo-vakoiuázöti égerek testsélyveszteségét a 4-7, nap közötti időszakban, A betegség tik netei, például .borzolt szőrzet, enyhe fokától sülyes fokúig terjedő levertség megfigyelhető volt a C7-slbo-, NTD2-. és bffD3~vakeinázoit csoportban a 4-7. «·pok körött, A C7-EboZ- és C?-NTD4-ínmwm}záh egetekben betegségre utaló tünetek nem jelentkeztek, Összességében, -egyetlen dózis C7-EboZ vagy C7-NTD4 teljes védettséget nyújtott az, immunizált egereknél a beíey-e. >d és a fertőzés okozta pusztulással szemben, feltehetően jelentős mértékű T-sóites immunitáson kérésziül.
A leírásban idézett valamennyi szakirodákra luvatkozás teljes tetjedebnében a kitsrniás részét képezi. A találmány szerinti megoldásnak számos nfedosftása és variációja lehetséges, amelyek szakember szamára nyilvánvídőak, és ezek színién a találmány tárgyát képezik, a találmány szerinti készítmépyek és eljárások ilyen módosításai és variációi, például a különböző mmlgének vagy voktordózisok vagy immomootinláto? dózisok
2G megválasztása ugyancsak & találmány támyköfehe tartozik.
SBBKVBNCíABlSTA
A szekvenciaustában szereplő kötetlen szövegrészek (223-as kód) fordítása;
<2IŐ> 1 <223> 12Fenton <223> 13 Hexon <223> LSFiber <219> 5 <223> L2 Ponton <223> 13 Hexoo <223> IriPíber <210> 9
-225' L 2 P er tton <223> 13 fiföxon <223> 15 Fsber <21Ő> 24 <223> 12 Ponton <223> 13 Hexon <223> LS Fiber #2
115688-6132/SÖ
J '13462-6132
..60..
<23> ' ' 1 j'-.n ; <2;0> 29 <23> Hentes <22.3> Bevon <2<
<23> Fíber4i <lö> 34 <223> 1,2. Prate <23-> 1,3 Hexon ' ?2S'> 1,5 Filmr e 1 <iö> 38
- 223s·' ellgonser SV25T <2 lö> 39 <23 v- oligemer 8 ¥2513

Claims (2)

  1. SZABADALMI íöÉNb’PONTOri
    1, Refennfeináns adenösírns, amelynek a következőket tartalmazó kapszrdja van: AdPanS-hexonproteln, amelynek· anrinosav-íszekveniriájs a SFQ ID NO, 3 szerinti szekvencia, fiberprotem és .peHtoaj^ötón, továbbá amely adenovírua tartalmaz olyan adenovims-szekversesáka!:. amelyekből az £la- és/vagy Elb-genek iankrionáltsan deietálva vannak, 5’ -és 3’ sáenevkas cisx-eíemeket, amelyek reptikáeídkez és kapsxidba esestagoloőásbez szükségesek, amely eisz-elemek adenovíass 5’ Invertált terminális ismétlő egységet és adsnoviras 3' invertált terminális ismétlő egységet tartalmaznak. valamint az adeanvlros szempontjából keterefog transzgént a gén gazdasejtben történd expresazióját irányító sxeRvestolakhoz kapcsoltan.
    35 2. Az 1. igénypont szerimi reknmbináns adenovims, amelyben a Eberprotciu a SEQ »D NO. 21 szerinti A^auS'-fiteprut'ein-fragrueubm,
    3, Az 1. igénypont szerinti rekémblnáns adenöririis, ahol a ribctprotetn. a SEQ ID NO, 4 szerimi ÁdPaaS-ílfeerprmcis,
    4., Az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti rekorsbiata udea&ritiras·, almi a pemonprslertr AdPsnő40 peníonproíeln.
    I i 3462-61.3 2
    -6i~
    5. Az 1-4. igénypontok hártsslyíks szerbit rekombináns arismovirss, amely psssudotípneé adenovirus, és tartalmas replikáéihoz és; kajszidba csomagul ódára hoz szükséges 5' és 3' adcnovíxus cisz elemekei, amely císz-eletnek adesövirashói szérssazó adeawinn 5' invertált tetmmális ismétlő egységet és adenovirus < ti π ilt n-h'—svőu r. ít arntk onieh tdvkx m o ’ il >. itt izük to i®\ s ix oi 5 6. Rín,».nho,®x Alenotims amchrmi a kove’xe/oket taitáhouo \x<w'tdM \,to kdlfetri-hex onproteiti ítagmeatáraáí tartalmaz® koson, fiberproteia és pecíonprotesn, továbbá «mely adenoviros tartalmaz oíyartadeeovirtB-szekvenelákat amelyekből az E)a- és/vagy Elb-gének űtakeionábsan áeletálva vannak, 5' x ükruMO®· vtx/, <o <tei <ns.Pxl .x, hxus dt® mi-. v„x uds 10 xakxcgxx.k nn® cisz-elemek ítdenovirus 5’ inveríált terminális istnétiö egységet és adefiovirus 3' invertált terminális ismétlő
    10 egységet tartalmaznék, és az AdkariS-tel heteroíög nukleinsav-szekveaetát, ahol az AdPanS-bexonprotetn &agmense a SEQ1D NO. 3 szerinti A.dParí5-he.\onpr®tein-$zekvenoia mintegy 50 aaunesav fymzaságö Nisrtmnáks vagy C-termmdl'ís deléciöí tartalmazó,. csonkolt változata.
    7, Az 1-4. vagy g„ igénypontok bármelyike szerinti, rcfcombináns atfenevlres, ahokae: aáenovírns esszéiéinél tartalmaznak 5’ invertált terminált ritnéílndő (OK) szekvenciákat, és a SEQ ÍD MA 1 szeriről Patd
    1:5 3/f fb:-jét, vagy olyan szekvenciát, amely esek bármelyiket®! koinnfenisnter.
    8,. A 6. .igénypont: szerinti aáeoovinis, amely legalább egy, a kővetkezők közül választott simsart kspszldproisúrt .tartalmaz: n Pan5 SEQ XD NO. 2 szertári pentosprotein; és n Paa5 SEQXDNQ. 4 szerinti Mbstprotetn.
  2. 2ö $. Izolált gazdasejt, amely 1-8. igénypontok bármelyike szérián rekombináns.adenovtrurt tartalmaz.
    10. Készítmény, amely 1 -8. igénypontok bántmlyske szerinti reköínbbráos aelenovírnst és gyögyász&nsag elfogadhat® hordozót tartalmaz,
    Ή, Az 1-8, igénypontok bársitclyíke szerinti rekomfemáps sdenovirns alkalmazása entlösgazdaszervezslben fertőz® ágens ellent töttptinválasz kiváltására szolgáló gyógyszer eíóábiíssára, ahol a
    25 transzáén vagy hetes-pírig géri a lenéző ágens antigénjét hódolja.
HU1400619A 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására HU230488B1 (hu)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33195101P 2001-11-21 2001-11-21
US60/331,951 2001-11-21
PCT/US2002/003364 WO2002063806A2 (en) 2001-02-07 2002-02-07 System, method, and computer program product for sharing bandwidth in a wireless personal area network or a wireless local area network
US36679802P 2002-03-22 2002-03-22
US60/366,798 2002-03-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP1400619A2 HUP1400619A2 (en) 2006-01-30
HU230488B1 true HU230488B1 (hu) 2016-08-29

Family

ID=26987985

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0500987A HU230364B1 (hu) 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
HU1300578A HU230365B1 (hu) 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleisav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
HU1400619A HU230488B1 (hu) 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0500987A HU230364B1 (hu) 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
HU1300578A HU230365B1 (hu) 2001-11-21 2002-11-20 Simian adenovírus nukleisav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására

Country Status (19)

Country Link
US (5) US7247472B2 (hu)
EP (4) EP2286841A1 (hu)
JP (9) JP2005511035A (hu)
KR (1) KR100987360B1 (hu)
CN (1) CN1578678B (hu)
AU (1) AU2002365366B2 (hu)
BR (1) BR0214350A (hu)
CA (3) CA2466431C (hu)
CO (1) CO5590973A2 (hu)
HU (3) HU230364B1 (hu)
IL (5) IL161584A0 (hu)
MX (2) MXPA04004876A (hu)
NO (3) NO332692B1 (hu)
NZ (3) NZ550416A (hu)
PH (1) PH12016500338A1 (hu)
PL (1) PL209133B1 (hu)
SG (2) SG165153A1 (hu)
WO (1) WO2003046124A2 (hu)
ZA (1) ZA200403117B (hu)

Families Citing this family (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002322285A1 (en) 2001-06-22 2003-01-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for rapid screening of bacterial transformants and novel simian adenovirus proteins
US20040136963A1 (en) * 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
MXPA04004876A (es) 2001-11-21 2004-07-30 Univ Pennsylvania Secuencias de acido nucleico y de aminoacido de adenovirus de simio, vectores que contienen los mismos y metodos de uso.
NZ539509A (en) 2002-10-23 2008-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Priming vaccine comprising a polynucleotide encoding at least one first malarial antigen and a boosting vaccine comprising at least one polypeptide comprising at least one second malarial antigen having at least one epitope in common with the first malarial antigen of the priming vaccine
ES2478625T3 (es) 2003-06-20 2014-07-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Método de generación de adenovirus quiméricos y usos de tales adenovirus quiméricos
US7291498B2 (en) 2003-06-20 2007-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
ATE449105T1 (de) 2004-01-23 2009-12-15 Angeletti P Ist Richerche Bio Impfstoffträger für schimpansen-adenovirus
WO2006033672A2 (en) * 2004-04-28 2006-03-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immunization regimen with e4-deleted adenovirus prime and e1-deleted adenovirus boost
US8394386B2 (en) * 2004-04-28 2013-03-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Sequential delivery of immunogenic molecules via adenovirus and adeno-associated virus-mediated administrations
CA2567741A1 (en) * 2004-05-25 2006-03-30 Chimeracore, Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
GB0417494D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
SG159554A1 (en) 2004-11-16 2010-03-30 Crucell Holland Bv Multivalent vaccines comprising recombinant viral vectors
ES2533970T3 (es) * 2005-03-08 2015-04-16 Aptose Biosciences Inc. Uso de interleucina 17E para el tratamiento de cáncer
GB0513421D0 (en) 2005-06-30 2005-08-03 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccines
JP2009533350A (ja) * 2006-04-07 2009-09-17 キメロス， インコーポレイテッド Ｂ細胞悪性疾患を処置するための組成物および方法
PT2012822E (pt) * 2006-04-28 2010-04-27 Univ Pennsylvania Proteínas hexon de adenovirus modificadas e suas utilizações
US20090246220A1 (en) 2006-08-28 2009-10-01 Ertl Hildegund C J Constructs for enhancing immune responses
AU2008223951B2 (en) 2007-03-02 2014-03-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel method and compositions
WO2008124165A2 (en) * 2007-04-09 2008-10-16 Chimeros, Inc. Self-assembling nanoparticle drug delivery system
CN101883858B (zh) * 2007-11-28 2015-07-22 宾夕法尼亚大学托管会 猿猴亚家族E腺病毒SAdV-39、-25.2、-26、-30、-37和-38及其应用
DK2220242T3 (en) * 2007-11-28 2017-03-27 Univ Pennsylvania ABE-ADENOVIRA OF GROUP B, SADV-28,27, -29, -32, -33 AND -35 AND APPLICATIONS THEREOF
EP2220217A2 (en) * 2007-11-28 2010-08-25 The Trustees of the University of Pennsylvania Simian subfamily c adenoviruses sadv-40, -31, and-34 and uses thereof
AU2014203073B2 (en) * 2007-11-28 2016-07-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian E adenovirus SAdV-30
JP5661476B2 (ja) * 2008-03-04 2015-01-28 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア サルアデノウイルスＳＡｄＶ−３６、−４２．１、−４２．２および−４４ならびにそれらの用途
US9217155B2 (en) 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
WO2010051367A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenoviruses sadv-43, -45,-48,-49, and -50 and uses thereof
WO2010085984A1 (en) * 2009-02-02 2010-08-05 Okairos Ag Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
AU2010209938A1 (en) 2009-02-02 2011-08-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
SG10201900819SA (en) * 2009-02-02 2019-03-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid- sequences, vectors containing same, and uses thereof
EA021100B1 (ru) 2009-03-17 2015-04-30 МДхХЭЛС СА Усовершенствованное определение экспрессии генов
WO2010120874A2 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Chimeros, Inc. Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
CA2762203A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Soumitra Roy Simian adenovirus 41 and uses thereof
WO2011057254A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
EA201270607A1 (ru) 2009-11-09 2012-09-28 Генвек, Инк. Аденовирус обезьян и способы его использования
JP5785607B2 (ja) * 2010-04-14 2015-09-30 モガム バイオテクノロジー リサーチ インスティチュート サルアデノウイルス血清型１９から単離されたヘキソン、その超可変領域、およびそれらを用いるキメラアデノウイルス
DK2561073T3 (en) 2010-04-23 2016-12-12 Univ Massachusetts Aav vectors targeted to central nervous system and methods of use thereof
WO2011133874A1 (en) 2010-04-23 2011-10-27 University Of Massachusetts Multicistronic expression constructs
EP3444346B1 (en) 2010-04-23 2022-07-27 University of Massachusetts Aav-based treatment of cholesterol-related disorders
ES2788198T3 (es) * 2010-05-14 2020-10-20 Univ Oregon Health & Science Vectores de CMVH y CMVRh recombinantes que codifican un antígeno heterólogo aislado del virus de la hepatitis B y usos de los mismos
WO2012021730A2 (en) 2010-08-11 2012-02-16 Genvec, Inc. Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
CN103118702A (zh) 2010-09-20 2013-05-22 克鲁塞尔荷兰公司 活动性结核病的治疗性接种
EP2643465B1 (en) 2010-11-23 2016-05-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Subfamily e simian adenovirus a1321 and uses thereof
CA2823066A1 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Alexion Pharma International Sarl Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
WO2012089231A1 (en) * 2010-12-30 2012-07-05 Okairòs Ag Paramyxovirus vaccines
US9267112B2 (en) 2011-05-10 2016-02-23 The Regents Of The University Of California Adenovirus isolated from Titi Monkeys
US10221218B2 (en) 2011-05-10 2019-03-05 The Regents Of The University Of California Adenovirus isolated from titi monkeys
GB201108879D0 (en) * 2011-05-25 2011-07-06 Isis Innovation Vector
TWI623618B (zh) 2011-07-12 2018-05-11 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
US20140348791A1 (en) * 2011-09-09 2014-11-27 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Modified adenoviral vectors and methods of treatment using same
EP2747774A4 (en) 2011-09-09 2015-02-11 Biomed Realty L P METHOD AND COMPOSITIONS FOR CONTROLLING VIRUS PROTECTION
TW201321016A (zh) 2011-09-29 2013-06-01 Transgene Sa 免疫療法組成物及用於治療ｃ型肝炎病毒感染之療程（二）
WO2013045658A1 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
CN107937440A (zh) * 2011-10-05 2018-04-20 金维克有限公司 猴腺病毒(大猩猩)或腺病毒载体及其使用方法
KR20140084201A (ko) 2011-10-19 2014-07-04 알렉시온 파마 홀딩 알칼리성 포스파타제 및/또는 나트륨이뇨 펩티드를 포함하는 조성물 및 그의 사용 방법
WO2013063019A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for enhancing the therapeutic effect of anti-tumor t cells
US10238755B2 (en) 2011-11-30 2019-03-26 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for regulation of cell aging, carcinogenesis and reprogramming
SG10201609511XA (en) 2012-05-18 2016-12-29 Univ Pennsylvania Subfamily e simian adenoviruses a1302, a1320, a1331 and a1337 and uses thereof
EP2892554B1 (en) 2012-09-07 2020-08-26 Emory University Hiv immune stimulating compositions comprising recombinantly expressed pili on bacteria and methods related thereto
WO2014047261A1 (en) * 2012-09-19 2014-03-27 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Viruses associated with immunodeficiency and enteropathy and methods using same
CN105051198A (zh) * 2012-11-16 2015-11-11 貝丝以色列女执事医疗中心 重组腺病毒及其用途
US9222142B2 (en) * 2013-01-15 2015-12-29 The Regents Of The University Of California Adenoviruses and their use
US9624510B2 (en) 2013-03-01 2017-04-18 The Wistar Institute Adenoviral vectors comprising partial deletions of E3
EP2971008B1 (en) 2013-03-14 2018-07-25 Salk Institute for Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
US9402888B2 (en) 2013-03-14 2016-08-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating cancer
BR112016008806A2 (pt) * 2013-11-01 2017-10-03 Pfizer Vetores para expressão de antígenos associados à próstata
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
PT3200815T (pt) 2014-10-02 2021-05-07 Wistar Inst Métodos e composições para o tratamento de cancro
MX2017004507A (es) 2014-10-06 2017-06-28 Univ Pennsylvania Composiciones y metodos para el aislamiento de celulas tumorales circulantes (ctc).
CA2964272A1 (en) 2014-10-21 2016-04-28 Guangping Gao Recombinant aav variants and uses thereof
BR112017009497A2 (pt) 2014-11-05 2018-02-06 Voyager Therapeutics, Inc. polinucleotídeos de aadc para o tratamento da doença de parkinson
BR112017010087A2 (pt) 2014-11-14 2018-06-05 Voyager Therapeutics, Inc. composições e métodos para tratar esclerose lateral amiotrófica (ela)
KR20230145206A (ko) 2014-11-14 2023-10-17 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
EP3230441A4 (en) 2014-12-12 2018-10-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
WO2016131945A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Transgene Sa Combination product with autophagy modulator
EA038402B9 (ru) * 2015-06-12 2021-09-22 Глаксосмитклайн Байолоджикалс Са Аденовирусные полинуклеотиды и полипептиды
AU2016362477A1 (en) 2015-12-02 2018-06-14 Voyager Therapeutics, Inc. Assays for the detection of AAV neutralizing antibodies
US11208468B2 (en) 2016-02-18 2021-12-28 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating melanoma
JP7015551B2 (ja) 2016-02-23 2022-02-15 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ ウイルス動態への影響を最小限にするための治療用アデノウイルスにおける外因性遺伝子発現
JP7054527B2 (ja) 2016-02-23 2022-04-14 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ アデノウイルスの複製動態を測定するための高スループットアッセイ
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
EP3448987A4 (en) 2016-04-29 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
CA3023022A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Transgene Sa Combination therapy with cpg tlr9 ligand
RU2764587C2 (ru) 2016-05-18 2022-01-18 Вояджер Терапьютикс, Инк. Способы и композиции для лечения хореи гентингтона
MX2018014154A (es) 2016-05-18 2019-05-06 Voyager Therapeutics Inc Polinucleotidos moduladores.
AU2017305176B2 (en) * 2016-08-01 2021-05-27 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Compositions and methods of replication deficient adenoviral vectors for vaccine applications
EP3831281A1 (en) 2016-08-30 2021-06-09 The Regents of The University of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
US20190328869A1 (en) 2016-10-10 2019-10-31 Transgene Sa Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
EP3526333A4 (en) 2016-10-13 2020-07-29 University of Massachusetts AAV CAPSIDE DESIGNS
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
AU2018261790A1 (en) 2017-05-05 2019-11-28 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
EP3619308A4 (en) 2017-05-05 2021-01-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT FOR HUNTINGTON'S MORBUS
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
WO2019018342A1 (en) 2017-07-17 2019-01-24 Voyager Therapeutics, Inc. NETWORK EQUIPMENT TRACK GUIDE SYSTEM
WO2019028306A2 (en) 2017-08-03 2019-02-07 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR ADMINISTRATION OF ADENO-ASSOCIATED VIRUSES
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
EP4124658A3 (en) 2017-10-16 2023-04-19 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
US11773142B2 (en) 2017-12-11 2023-10-03 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Recombinant adenoviruses and uses thereof
EP3807404A1 (en) 2018-06-13 2021-04-21 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered 5' untranslated regions (5' utr) for aav production
JP2021530548A (ja) 2018-07-24 2021-11-11 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics, Inc. 遺伝子治療製剤を生産するための系および方法
TW202035689A (zh) 2018-10-04 2020-10-01 美商航海家醫療公司 測量病毒載體粒子的效價及強度之方法
US20210348194A1 (en) 2018-10-05 2021-11-11 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acid constructs encoding aav production proteins
US20210395777A1 (en) 2018-10-15 2021-12-23 Voyager Therapeutics, Inc. EXPRESSION VECTORS FOR LARGE-SCALE PRODUCTION OF rAAV IN THE BACULOVIRUS/Sf9 SYSTEM
US20230193315A1 (en) 2019-01-31 2023-06-22 Oregon Health & Science University Methods for using transcription-dependent directed evolution of aav capsids
WO2020214203A1 (en) * 2019-04-17 2020-10-22 The Wistar Institute Replication deficient adenoviral vectors for hiv vaccine applications
EP4178605A1 (en) 2020-07-13 2023-05-17 Transgene Treatment of immune depression
CA3209779A1 (en) 2021-02-01 2022-08-04 Regenxbio Inc. Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
CN112831524B (zh) * 2021-02-20 2023-06-13 苏州相奕生物技术有限公司 人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用
EP4317446A1 (en) 2021-03-29 2024-02-07 Genematrix Inc. Recombinant chimeric adenoviral vector substituted by knob gene of chimpanzee adenovirus serotype 6, and application thereof
WO2022218997A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Novel universal vaccine presenting system
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5240846A (en) 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
US6174666B1 (en) 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
JPH10507758A (ja) 1994-10-19 1998-07-28 ジェネティック セラピー，インコーポレイテッド アデノウイルスおよび免疫抑制剤同時反復投与を伴う遺伝子治療
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
EP0787200B1 (en) 1994-10-28 2005-04-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Improved adenovirus and methods of use thereof
US6127525A (en) * 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
US5770442A (en) * 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
AU6261696A (en) 1995-06-05 1996-12-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The A replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier
US5698202A (en) 1995-06-05 1997-12-16 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier
WO1998010087A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
WO1998010088A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase
US5922315A (en) 1997-01-24 1999-07-13 Genetic Therapy, Inc. Adenoviruses having altered hexon proteins
US5891994A (en) 1997-07-11 1999-04-06 Thymon L.L.C. Methods and compositions for impairing multiplication of HIV-1
WO1999014354A1 (en) 1997-09-19 1999-03-25 The Trustees Of The University Of The Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
CA2304168A1 (en) 1997-09-19 1999-04-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
GB9720585D0 (en) 1997-09-26 1997-11-26 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
PT1064393E (pt) 1998-03-20 2005-04-29 Univ Pennsylvania Composicoes e metodos para a producao de virus adeno-associados recombinantes sem auxiliar
US20030017138A1 (en) * 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
WO2000011140A1 (en) 1998-08-20 2000-03-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
EP1200622A4 (en) 1999-07-06 2004-12-22 Merck & Co Inc HIV VACCINE COMPRISING A GAG GENE VEHICLE ADENOVIRUS
JP2003529559A (ja) 2000-01-31 2003-10-07 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 新規用途
US6740525B2 (en) 2000-02-09 2004-05-25 Genvec, Inc. Adenoviral capsid containing chimeric protein IX
EP1409012B1 (en) * 2001-06-22 2009-02-11 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
US20040136963A1 (en) 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
AU2002322285A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for rapid screening of bacterial transformants and novel simian adenovirus proteins
MXPA04004876A (es) 2001-11-21 2004-07-30 Univ Pennsylvania Secuencias de acido nucleico y de aminoacido de adenovirus de simio, vectores que contienen los mismos y metodos de uso.
NZ539509A (en) 2002-10-23 2008-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Priming vaccine comprising a polynucleotide encoding at least one first malarial antigen and a boosting vaccine comprising at least one polypeptide comprising at least one second malarial antigen having at least one epitope in common with the first malarial antigen of the priming vaccine
ES2478625T3 (es) 2003-06-20 2014-07-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Método de generación de adenovirus quiméricos y usos de tales adenovirus quiméricos
US7291498B2 (en) 2003-06-20 2007-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
WO2006033672A2 (en) * 2004-04-28 2006-03-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immunization regimen with e4-deleted adenovirus prime and e1-deleted adenovirus boost
US8394386B2 (en) * 2004-04-28 2013-03-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Sequential delivery of immunogenic molecules via adenovirus and adeno-associated virus-mediated administrations
EP1743028A2 (en) * 2004-04-28 2007-01-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Polyvalent viral vectors and a system for production thereof
CN103088060A (zh) 2005-05-12 2013-05-08 葛兰素集团有限公司 疫苗组合物
PT2012822E (pt) * 2006-04-28 2010-04-27 Univ Pennsylvania Proteínas hexon de adenovirus modificadas e suas utilizações
AU2007276217B2 (en) 2006-07-18 2013-08-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccines for malaria
AU2008223951B2 (en) 2007-03-02 2014-03-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel method and compositions
WO2013055268A1 (en) 2011-10-13 2013-04-18 Telefonaktiebolaget L M Ericsson (Publ) Method and node related to channel estimation

Also Published As

Publication number Publication date
IL231502A0 (en) 2014-04-30
PH12016500338A1 (en) 2018-03-26
US20050069866A1 (en) 2005-03-31
KR100987360B1 (ko) 2010-10-12
IL223344A (en) 2015-04-30
JP2011055835A (ja) 2011-03-24
US7247472B2 (en) 2007-07-24
JP2015057051A (ja) 2015-03-26
US8603459B2 (en) 2013-12-10
MX351516B (es) 2017-10-17
HU230364B1 (hu) 2016-03-29
CA2466431C (en) 2014-08-05
IL223344A0 (en) 2013-02-03
IL231502A (en) 2017-04-30
IL230292A (en) 2016-08-31
CN1578678B (zh) 2010-05-26
JP2009136296A (ja) 2009-06-25
CA2990322A1 (en) 2003-06-05
HUP0500987A2 (en) 2006-01-30
NO332692B1 (no) 2012-12-10
NO20120337L (no) 2004-05-26
CA2852277C (en) 2018-02-20
JP2017035111A (ja) 2017-02-16
SG165153A1 (en) 2010-10-28
US20080090281A1 (en) 2008-04-17
NZ564586A (en) 2009-09-25
NO20130590L (no) 2004-05-26
WO2003046124A3 (en) 2003-11-20
US20140065105A1 (en) 2014-03-06
CO5590973A2 (es) 2005-12-30
AU2002365366B2 (en) 2007-05-10
SG2013034475A (en) 2016-10-28
KR20040054796A (ko) 2004-06-25
BR0214350A (pt) 2005-05-10
NO335438B1 (no) 2014-12-15
CA2466431A1 (en) 2003-06-05
EP1453543A4 (en) 2006-12-06
EP1453543A2 (en) 2004-09-08
MXPA04004876A (es) 2004-07-30
NZ550416A (en) 2008-06-30
EP2286841A1 (en) 2011-02-23
US8105574B2 (en) 2012-01-31
HUP0500987A3 (en) 2008-05-28
PL373602A1 (en) 2005-09-05
US20150352203A1 (en) 2015-12-10
EP3108899A1 (en) 2016-12-28
CA2852277A1 (en) 2003-06-05
EP2301582A1 (en) 2011-03-30
JP2015057052A (ja) 2015-03-26
ZA200403117B (en) 2005-03-30
EP1453543B1 (en) 2017-08-30
AU2002365366A1 (en) 2003-06-10
JP5715749B2 (ja) 2015-05-13
US20120093778A1 (en) 2012-04-19
JP2017070292A (ja) 2017-04-13
PL209133B1 (pl) 2011-07-29
IL161584A (en) 2015-05-31
JP2013252144A (ja) 2013-12-19
NO334512B1 (no) 2014-03-24
WO2003046124A2 (en) 2003-06-05
US20170119873A9 (en) 2017-05-04
JP2017035110A (ja) 2017-02-16
JP2005511035A (ja) 2005-04-28
HUP1400619A2 (en) 2006-01-30
EP2301582B1 (en) 2017-07-12
HU230365B1 (hu) 2016-03-29
NO20042191L (no) 2004-05-26
CN1578678A (zh) 2005-02-09
NZ532383A (en) 2007-03-30
US9133483B2 (en) 2015-09-15
IL161584A0 (en) 2004-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU230488B1 (hu) Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
CN111088283B (zh) mVSV病毒载体及其病毒载体疫苗、一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗
WO2021254327A1 (zh) 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法
CN103930551B (zh) 猴腺病毒和杂合腺病毒载体
EP0098299B1 (en) Viruses with recombinant surface proteins
CN112618707B (zh) 一种SARS-CoV-2冠状病毒疫苗及其制备方法
JPH05505306A (ja) 組換えアデノウイルス
BG98718A (bg) Състав за въвеждане на комплекси на нуклеинови киселини в по-висши еукариотни клетки
HU228121B1 (en) Corona-virus-like particles comprising functionally deleted genomes
CN109803677A (zh) 用于α病毒疫苗接种的组合物和方法
EA007811B1 (ru) Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva)
HU230406B1 (hu) Eljárás adeno-asszociált vírus(AAV)szekvenciák detektálására és/vagy azonosítására és az azzal azonosított új szekvenciák izolálására
HU228327B1 (en) Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
US20050002953A1 (en) SARS-coronavirus virus-like particles and methods of use
CN101384722A (zh) 疫苗组合物
HU228205B1 (en) Infectious clones
EA015013B1 (ru) Рекомбинантный вирус сендай с ослабленной способностью к репликации, предназначенный для использования в качестве вакцин
CN110951699B (zh) 表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用
JPS6349077A (ja) ベクターウイルスおよびベクターウイルスを含む薬用組成物
CN107530383A (zh) 用于埃博拉病毒疫苗接种的方法和组合物
CN113666990A (zh) 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用
Bergman et al. Treatment of implanted mammary tumors with recombinant vesicular stomatitis virus targeted to Her2/neu
Phillpotts et al. Intranasal immunisation with defective adenovirus serotype 5 expressing the Venezuelan equine encephalitis virus E2 glycoprotein protects against airborne challenge with virulent virus
WO2006002594A1 (fr) Adenovirus canin de type 2 recombinant, procede d&#39;elaboration et utilisation
CN112641937B (zh) 一种重组腺病毒在制备预防病毒的药物中的用途

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees