JP5785607B2 - サルアデノウイルス血清型１９から単離されたヘキソン、その超可変領域、およびそれらを用いるキメラアデノウイルス - Google Patents

Description

本発明は、サルアデノウイルス血清型１９（「ＳＡｄ１９」）から単離された新規ヘキソン、その超可変領域（「ＨＶＲ」）、それらを用いるキメラアデノウイルス、およびそれらの治療的使用に関する。

アデノウイルスは、１９５３年に最初に単離されたアデノウイルス科に属する。ヒトアデノウイルスは、ゲノム類似性、発癌性、血液凝固特性に基づき、６群の亜属（ＡからＦ）に分類される。アデノウイルスはほとんど、筋肉、肺、脳および心臓細胞などの非分裂細胞（ｎｏｎ−ｄｉｖｉｄｅｄ ｃｅｌｌ）に感染し、その分子生物学的特徴は当分野においてよく知られている。そのゲノムは、３５ｋｂの直鎖二本鎖ＤＮＡから構成され、宿主細胞におけるその複製は、ウイルスタンパク質、Ｅ１Ａにかかっている。

アデノウイルスの上記特徴は、Ｅ１Ａ欠失を有する非複製ベクターを用いることにより利用できる。アデノウイルスのＥ１遺伝子が挿入されたＨＥＫ２９３細胞株の開発以降、アデノウイルスベクター系は多数の研究で用いられ、宿主細胞の細胞毒性を利用するビロセラピューティクス（ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の開発を導いた。２００５年に中国で商品化された腫瘍溶解性のビロセラピューティクスであるオンコリン（Ｏｎｃｏｒｉｎｅ）^登録商標は、ｐ５３欠損腫瘍におけるアポトーシス細胞死を選択的に誘導するための、Ｅ１Ｂ５５欠損アデノウイルスである。

選択的複製アデノウイルス治療薬の開発では、Ｅ１Ａタンパク質の選択的発現が最も重要であり、腫瘍選択的発現プロモーターを用いる、腫瘍選択的アデノウイルス遺伝子治療薬の可能性に関する多くの事例が示唆されている。腫瘍選択的アデノウイルスのほとんどは、よく見られるヒトアデノウイルス血清型５（「ＨＡｄ５」）を用いて調製される。ＨＡｄ５は８０％の有病率を占めるため、ヒトは高濃度のアデノウイルス中和抗体を有すると報告されている（Ａｐｐａｉａｈｇａｒｉ， Ｍ． Ｂ．，ら （２００７） Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４， １０５３−１０５５）。これらのアデノウイルスカプシドタンパク質に対する中和抗体は、全身的に投与されたアデノウイルスの有効性および毒性に影響を与える（Ｃｈｅｎ， Ｙ．，ら （２０００） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １１， １５５３−１５６７）。

ウイルスのカプシドは、３種のタンパク質、すなわち、ヘキソン、ファイバーおよびペントンからなり、かつ、２４０個のヘキソンおよび１２個のペントンからなる対称性正２０面体構造を有するカプソメア（ｃａｐｓｏｍｅｒｅ）を含む。各ペントンは、７０〜１００ｎｍの突き出た三量体ファイバーに結合する。アデノウイルスに感染した場合、該三量体ファイバーが、アデノウイルス感染過程において、宿主細胞の表面膜上のコクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）に付着する。ペントンのＲＧＤ領域が、ウイルスの吸着（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）および宿主細胞内への侵入（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）をもたらすインテグリンに結合する。

ヘキソンタンパク質のループ１（Ｌ１）およびループ２（Ｌ２）がウイルスのカプソメア構造の外側に露出されると報告されている。Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、６つの超可変領域（ＨＶＲ）、すなわち、ヘキソンタンパク質の１３２番目から３２０番目のアミノ酸内のＨＶＲ−１からＨＶＲ−６、および４０８番目から４５９番目のアミノ酸内の七番目のＨＶＲ（ＨＶＲ−７）を含有する。

アデノウイルスは、細胞内へ治療遺伝子を導入する、的確かつ効率的な手段を提供する。しかしながら、インビボでの遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用が遭遇する一つの課題は、アデノウイルスカプシドタンパク質上の抗原エピトープへの抗体の生成である。

アデノウイルスがヒト体内に投与される場合、ヘキソンタンパク質に対する中和抗体が形成され、かつそのような抗体はほとんど、主要な（ｄｏｍｉｎａｎｔ）ＨＶＲ領域を標的とする。また、抗体は、宿主細胞の感染を抑制するためにウイルスの複製効率を減少させることも知られている（Ｗｏｈｌｆａｒｔ， Ｃ． （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２， ２３２１−２３２８， Ｔｏｏｇｏｏｄ， Ｃ．Ｉ．Ａ．，ら （１９９２） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７３， １４２９−１４３５． Ｓｕｍｉｄａ， Ｓ． Ｍ．，ら （２００５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７４， ７１７９−７１８５）。

ヒトでＨＡｄ５に対する圧倒的多数のヒト中和抗体により引き起こされる課題は、ウイルス遺伝子送達ベクターおよびウイルス性治療薬を用いてアデノウイルスを投与する際に克服されなければならない。上述の中和抗体に関連する課題に加えて、全身的にさらす際、アデノウイルスが肝臓に感染することも報告されている。これに関連して、アデノウイルスは肝臓指向性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｓｍ）を有すること、および、アデノウイルスが静脈経路で投与された場合、その９０％が２４時間以内に肝臓へ導入されることが報告されている（Ｗｏｒｇａｌｌ， Ｓ．，ら （１９９７） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ８， ３７−４４）。アデノウイルスのそのような肝臓選択性に起因して、１９９９年、遺伝子治療アデノウイルス薬を用いる臨床試験中であった、若年患者のＪｅｓｓｉｅ Ｇｅｌｓｉｎｇｅｒは、急性肝毒性により死亡した。そのためそれ以降、アデノウイルスの用量は１×１０^１３ｖｐを超えない量に制限されている。そのため肝毒性は、アデノウイルスを用いる多数の遺伝子治療薬に関する非臨床／臨床試験において、用量規制因子（ｄｏｓｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）として一般に考えられている（Ａｌｅｍａｎｙ， Ｒ．ら （２００１） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ８（１７）， １３４７−１３５３； Ｃｈｒｉｓｔ， Ｍ．，ら （２０００） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １１（３）， ４１５−４２７； Ｌｉｅｂｅｒ， Ａ．，ら （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７（１１）， ８７９８−８８０７）。このような肝臓選択性が、アデノウイルス性治療薬の全身投与による効率的な治療の達成における主要な課題である（Ｗｏｒｇａｌｌ， Ｓ．，ら （１９９７） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ８， ３７−４４）。

この点に関して、Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎらが最近、Ｇｌａドメイン、血液凝固因子、が血液中でアデノウイルスのヘキソンタンパク質と結合し、肝臓へのアデノウイルスの導入を促進することを報告した（Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎ， Ｓ． Ｎ．，ら （２００８） Ｃｅｌｌ， １３２， ３９７−４０９）。ヘキソンのＨＶＲ−３、ＨＶＲ−５またはＨＶＲ−７が血液凝固因子、Ｇｌａドメイン、に結合できることが推測されている。ＨＶＲはアデノウイルスの血清型に依存して変化し、血液凝固因子への結合アフィニティーのために何が極めて重大な因子なのかはまだ明らかにされていない。アデノウイルスの最大耐容量は、血液凝固因子への結合アフィニティーを著しく弱め、肝臓指向性を減少させるために、ＲＧＤ、ＲＦＰおよびＢＡＰ（ビオチンアクセプターペプチド）などの特定のタンパク質を挿入することにより、１００倍上昇させることができると報告されている（Ｓｈａｓｈｋｏｖａ， Ｅ．Ｖ．，ら （２００９） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． １７， ２１２１−２１３０）。

ヘキソンタンパク質の多数の機能が現在知られており、また肝毒性および抗アデノウイルス免疫の課題を克服するためにヘキソンタンパク質を改変するための、多くの研究が現在行われている。ヘキソンタンパク質を改変するための４つの戦略がある：１）ヘキソン遺伝子を他のアデノウイルス血清型の対応するヘキソン遺伝子と交換する、２）ＨＶＲ内にペプチドを挿入する、３）ヘキソンタンパク質のＨＶＲをコードする遺伝子を他のアデノウイルス血清型のＨＶＲをコードする対応する遺伝子と交換する、および、４）血液凝固因子および中和抗体に結合する領域をＨＶＲから取り除く。最新では、ＨＶＲ内にペプチドを挿入する方法、およびＨＶＲをコードする遺伝子を、他のアデノウイルス血清型のＨＶＲをコードする対応する遺伝子と交換する方法が、ヘキソン改変のために行われている。上述の４つの戦略のうち、完全なヘキソン置換が、ウイルスの免疫原性を変化させる最も明らかな方法である。しかしながら、ヘキソンタンパク質の改変のための完全なヘキソン交換を達成するための方法は、ヘキソンをペントンおよびファイバーに結合させる際の微妙な構造差がアデノウイルスカプシド構造の不安定性を誘導する、という事実に起因する、生産性の劣化の課題を有する（Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｄ．Ｍ．，ら （２００６） Ｎａｔｕｒｅ， ４４１， ｐ２３９−２４３； Ｙｏｕｉｌ， Ｒ．，ら （２００２） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ． Ｔｈｅｒ． １３， ｐ３１１−３２０； Ｓｈａｓｈｋｏｖａ， Ｅ．，ら （２００９） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． １７， ２１２１−２１３０）。

さらに、異種アデノウイルスの血清型ならびにヒトアデノウイルスのものを用いる、カプシドタンパク質の改変に関する集中的な研究が進行中である。サルアデノウイルス血清型２２から２５にそれぞれ分類されている、チンパンジーアデノウイルスｐａｎ５、６、７および９に対する中和抗体の保有率は、それぞれ６％未満であり、それゆえ、チンパンジーアデノウイルスを含むサルアデノウイルスベクター系が、遺伝子治療ベクターとして有用である可能性がある（Ｒｏｙ， Ｓ．ら （２００４） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １５， ｐ５１９−５３０）。国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０４０３３０号および同第ＷＯ２００２／０８３９０２号は、ＣＡＲまたはヘキソンタンパク質に結合するアデノウイルスｋｎｏｂドメインが他の血清型のものと置換される、組換えキメラアデノウイルスにおいて中和抗体により引き起こされる免疫反応を抑制するための、ヒト血清型１１、２４、２６、３０、３４、３５、４８、４９および５０のファイバーあるいはヘキソンタンパク質の使用を教示する。サルアデノウイルス血清型に関して、国際公開第ＷＯ２００５／００１１０３号は、サルアデノウイルス血清型１８を用いるキメラアデノウイルスを開示する。

しかしながら、免疫原性がより低く、毒性がより低いアデノウイルスを開発する強い要望が存在する。それゆえ、本願発明者らは、ヒヒ排泄物から単離された新規ＳＡｄ１９ヘキソン遺伝子を同定し、ＨＡｄ５に対する中和抗体を回避する能力が高いこと、および低い毒性を示すことを発見した。

発明の概要
従って、本発明の目的は、キメラアデノウイルスの調製における使用のための、新規ヘキソンタンパク質およびそれをコードするＤＮＡを提供することである。

本発明の別の目的は、該新規ヘキソンタンパク質を含むキメラアデノウイルスを提供することである。

本発明のさらなる目的は、該キメラアデノウイルスを含む組成物を提供することである。

本発明のまたさらなる目的は、該キメラアデノウイルスを用いる遺伝子治療の方法を提供することである。

本発明の一態様に従って、ＳＡｄ１９から単離されたヘキソンおよび該ヘキソンをコードするＤＮＡが提供される。

本発明の別の態様に従って、ＳＡｄ１９から単離されたヘキソンのＨＶＲおよび該ＨＶＲをコードするＤＮＡが提供される。

本発明のさらなる態様に従って、ＳＡｄ１９から単離されたヘキソンタンパク質またはそれ由来の７以上の連続した残基の置換により、ヘキソンにおいて非天然アミノ酸配列を有するキメラアデノウイルスが提供される。

本発明のまたさらなる態様に従って、本発明のキメラアデノウイルスを含む組成物が提供される。

本発明のまたさらなる態様に従って、本発明のキメラアデノウイルスを細胞内に導入することを含む、ほ乳類細胞へ治療的導入遺伝子を送達するための方法が提供される。

本発明のまたさらなる態様に従って、本発明のキメラアデノウイルスを対象内に投与することを含む、癌を治療するための方法が提供される。

本発明のまたさらなる態様に従って、ヒトアデノウイルスのヘキソンにおける７以上のアミノ酸残基を、本発明のヘキソンタンパク質の７以上の残基で置換することを含む、遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターを調製するための方法が提供される。

本発明のまたさらなる態様に従って、本発明のキメラアデノウイルスを含む単離された宿主細胞が提供される。

本発明の上記および他の目的および特徴は、それぞれ次を示す添付の図面とあわせて、本発明の以下の記載から明らかとなるだろう：
ヒトアデノウイルス（ＨＡｄ）血清型５（Ａ）および４１（Ｂ）、ならびにＳＡｄ１９由来のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列； ｐＨｅｘ−ＳＡｄ１９ Ｈｅｘｏｎベクター（Ａ）、ｐＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳベクター（Ｂ）、ｐＡｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳベクター（Ｃ）およびｐＡｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳΔ１９ｋ（Ｄ）の切断地図； Ａｄ Ｈ５＿８ＤＳおよびＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳの感染単位（ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｕｎｉｔ）に比例する、腫瘍特異的Ｅ１Ａの発現量を示すウェスタンブロット解析の結果； ヒト血液凝固因子ＸとＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳの間の結合アフィニティーを測定するためのＳＰＲ結果（Ａ）、ならびにＡｄ Ｈ５＿８ＤＳ、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳ、Ａｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳまたはＡｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳΔ１９ｋのいずれかとの、ヒト血液凝固因子ＩＸまたはＸの共免疫沈降後のヒト血液凝固因子およびアデノウイルスファイバータンパク質に関するウェスタンブロットの結果（Ｂ−Ｄ）； Ａｄ Ｈ５＿８ＤＳおよびＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳの静脈注射後の、各臓器におけるアデノウイルスのファイバー遺伝子のＰＣＲ増幅ＤＮＡバンドを示す、アガロースゲル電気泳動の結果； ＨＡｄ５に対する中和抗体を用いることによる、サルアデノウイルス血清型１９、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳ（Ａ）、Ａｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳおよびＡｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳΔ１９ｋ（Ｂ）のヘキソンを有するキメラアデノウイルスの感染回避能力を実証する、ウェスタンブロット解析結果； ＨＡｄ５に対する中和抗体を用いることによる、ＳＡｄ１９、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳ（Ａ）、Ａｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳおよびＡｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳΔ１９ｋ（Ｂ）のヘキソンを有するキメラアデノウイルスの感染回避能力を示す、免疫染色写真および棒グラフ； ＨＡｄ５により免疫付与されたシリアンハムスターに投与されるＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳおよびＡｄ Ｈ５＿８ＤＳにより導入された、血液中のＬＫ８遺伝子の発現パターンを示すグラフ； Ａｄ Ｈ５＿８ＤＳおよびＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳが用量依存的に静脈内投与される、剖検マウスから摘出された各臓器の写真； Ａｄ Ｈ５＿８ＤＳが静脈内投与されるマウスの血液解析データ； Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳが静脈内投与されるマウスの血液解析データ； Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳの静脈注射後の、Ｈ４６０非小細胞肺癌に関する動物モデルにおける腫瘍増殖曲線； ＨＡｄ５に対する免疫付与に依存する、腫瘍特異的キメラアデノウイルス、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳの注射後に剖検されたＨ２１７２同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）肺癌に関する動物モデルの肺写真；および 図１３の肺の腫瘍の容積、重量、数および大きさの解析の結果。

発明の詳細な説明
別段の定めがない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明の属する分野における当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。さらに本明細書で述べられる全ての資料は、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる。

本明細書で用いられる用語「アデノウイルス」は、約３６ｋｂの略直鎖状のゲノムを有する、エンベロープを持たない正２０面体の二本鎖ＤＮＡウイルスをさす。

本明細書で用いられる用語「キメラアデノウイルス」は、その核酸配列が少なくとも２つのアデノウイルスの血清型の核酸配列から構成されるアデノウイルスをさす。

本明細書で用いられる場合、「置換」は、異なるポリヌクレオチドまたはアミノ酸により、それぞれ、一以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸の交換から生じる。

本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、その配列が超可変であり、構造的に制限されたループを形成している、可変ドメインを意味する。

本明細書で用いられる用語「非天然アミノ酸配列」は、アデノウイルスの既知の血清型の天然のヘキソンタンパク質では見られず、かつ遺伝子発現の段階でヘキソンタンパク質内に（すなわち、非天然アミノ酸配列をコードする核酸配列の生成により）導入される、任意のアミノ酸配列を意味する。

本明細書で用いられる用語「治療的導入遺伝子」は、細胞内に導入され、適した条件下で翻訳および／または発現されることができ、かつ、それが導入された細胞に所望の特性を付与し、またあるいは所望の治療結果を導くポリヌクレオチドをさす。

本明細書で用いられる用語「ベクター」は、当業者にその用語が理解されるような、遺伝子導入のための媒体であり、ウイルス、プラスミド等を含む。

本明細書で用いられる用語「中和抗体」は、アデノウイルスにより行われる、感染性（すなわち、細胞への侵入）または遺伝子発現を阻害することができる抗体を意味する。中和抗体は、血清から精製されるか、血清中に存在するかのいずれかの抗体であり得る。

本発明は以下に、詳細に記載される。

本発明において、ＳＡｄ１９から単離されたヘキソン、そのＨＶＲおよび該ヘキソンをコードするＤＮＡが提供される。

本発明によるＳＡｄ１９は、ヒヒ排泄物からの単離により提供され、サブグループＦに分類される。ＳＡｄ１９のヘキソンは、ヒトアデノウイルス血清型４１（「ＨＡｄ４１」）ヘキソンのものと８５％の相同性、およびＨＡｄ５ヘキソンのものと７６％の相同性を有する、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。さらに、ＳＡｄ１９のヘキソンをコードするヌクレオチド配列は、ＨＡｄ４１ヘキソンのものと７６％の相同性、およびＨＡｄ５ヘキソンのものと７０％の相同性を有する。好ましくは、本発明によるＳＡｄ１９のヘキソンは配列番号３のＤＮＡ配列を有する。

ＳＡｄ１９のヘキソンまたはそれ由来の７以上の残基は、キメラアデノウイルスを提供するために、置換により各種アデノウイルスに組み込まれ得る。従って、本発明のＳＡｄ１９のヘキソンタンパク質またはそれ由来の一以上の残基の置換により、ヘキソンにおいて非天然アミノ酸配列を有するキメラアデノウイルスが提供される。

好ましくは、該キメラアデノウイルスは、配列番号１６のアミノ酸配列を有するヘキソン由来の７以上の残基の置換により、ヘキソンにおいて非天然アミノ酸配列を有し得る。ＳＡｄ１９のヘキソン由来の該７以上の残基は、ＨＶＲであってもよい。該ＨＶＲは、配列番号２１のアミノ酸配列を有し、配列番号２０のヌクレオチド配列によりコードされ得る。より好ましくは、該キメラアデノウイルスは、配列番号２１の１１から４１、４６から５２、６９から７８、１０６から１１９、１２６から１３８、１６０から１７３、および２７５から３０３のアミノ酸残基にそれぞれ対応する、ＨＶＲ、すなわちＨＶＲ−１から−７、の断片の置換により、ヘキソンにおいて非天然アミノ酸配列を有し得る。

ＳＡｄ１９のヘキソンまたはそれ由来の７以上の残基を有するキメラアデノウイルスは、中和抗体による免疫阻害および肝毒性をほとんど示さない。

各種アデノウイルス、好ましくはヒトアデノウイルス血清型、より好ましくはヒトアデノウイルス血清型５、１１、２４、２６、３０、３４、３５、４８、４９および５０が、本キメラアデノウイルスの調製に有用だろう。腫瘍特異的で複製可能なアデノウイルスまたは腫瘍特異的で複製を制限されたアデノウイルスが、アデノウイルス治療薬として有用だろう。本発明のキメラアデノウイルスは、免疫反応および肝毒性の課題を克服するように非天然アミノ酸配列を有する。

特に、本発明による非天然アミノ酸配列は、野生型アデノウイルスのヘキソン領域をＳＡｄ１９のもので置換することにより調製される。最適には、得られる非天然アミノ酸配列は、対応する野生型アデノウイルスヘキソンタンパク質に対する中和抗体に対して、７以上の存在するエピトープが非免疫原性の状態にされる。

本発明によると、該キメラアデノウイルスは７以上のアミノ酸のヘキソン改変を含み、そのようなヘキソン改変は７以上の領域で作製される。

最も好ましいキメラアデノウイルスは、ヒト肺腺癌上皮細胞株、Ａ５４９へのアデノウイルスベクターｐＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳの形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）により調製され、それによってヒトアデノウイルスのヘキソンがＳＡｄ１９のヘキソンで置換される、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳとすることができる。

本発明の好ましい実施形態では、本発明のキメラアデノウイルスはさらに治療的導入遺伝子を含有してもよい。そのような治療的導入遺伝子の非限定的な例として、腫瘍抑制遺伝子、抗原性遺伝子、細胞傷害性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、自殺遺伝子、抗血管新生遺伝子、および免疫調節遺伝子が挙げられる。

具体的には、「腫瘍抑制遺伝子」は、標的細胞における発現が、悪性表現型を抑制し、かつ／またはアポトーシスを誘導することができる、ヌクレオチド配列である。腫瘍抑制遺伝子の例として、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＤＰＣ−４／Ｓｍａｄ４遺伝子、ＢＲＣＡ−１遺伝子、ＢＲＣＡ−２遺伝子、ＷＴ−１遺伝子、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｌｅｅら， Ｎａｔｕｒｅ， １９８７， ３２９，６４２）、ＭＭＡＣ−１遺伝子、大腸腺腫様ポリポーシス遺伝子（米国特許第５，７８３，６６６号）、ＤＣＣ（大腸癌において欠失した）遺伝子、ＭＭＳＣ−２遺伝子、染色体３ｐ２１．３に位置する鼻咽腔癌抑制遺伝子（Ｃｈｅｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９８， ９５， ３０４２−３０４７）、ＭＴＳ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、ＮＦ−２遺伝子、ＶＨＬ遺伝子等が挙げられる。

「抗原性遺伝子」は、標的細胞における発現が、免疫系による認識能力がある細胞表面抗原タンパク質の生成をもたらす、ヌクレオチド配列である。この抗原性遺伝子の例には、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、およびｐ５３（国際公開第ＷＯ９４／０２１６７号）が挙げられる。免疫系の容易な認識のため、抗原性遺伝子はＭＨＣタイプＩ（ＭＨＣ ｔｙｐｅ Ｉ）抗原と結合されてもよい。

「細胞傷害性遺伝子」は、細胞において発現された場合、毒性効果を示すヌクレオチド配列である。細胞傷害性遺伝子の例として、緑膿菌外毒素、リシン毒素、ジフテリア毒素等をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。

「細胞増殖抑制遺伝子」は、細胞において発現された場合、細胞周期停止を誘導するヌクレオチド配列である。細胞増殖抑制遺伝子の例として、ｐ２１、網膜芽細胞腫遺伝子、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質遺伝子、サイクリン依存性キナーゼ抑制因子をコードする遺伝子（例えば、ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８およびｐ１９）、増殖抑制特異的ホメオボックスおよび（ＧＡＸ）遺伝子（国際公開第ＷＯ９７／１６４５９号および同第ＷＯ９６／３０３８５号）等が挙げられる。

「自殺遺伝子」は、細胞において発現された場合、アポトーシスを介して細胞死を誘導するヌクレオチド配列である。自殺遺伝子の非限定的な例として、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、水痘チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２、シトクロムＰ４５０−２Ｂ１、ニトロレダクターゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）等をコードする遺伝子が包含される。

「抗血管新生遺伝子」は、その発現が抗血管新生因子の細胞外分泌をもたらすヌクレオチド配列である。抗血管新生因子には、アンギオスタチン、可溶化ＶＥＧＦＲ１（ｓＦＬＴ−１）（ＰＮＡＳ （ＵＳＡ）， １９９８， ９５， ８７９５−８００）などの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）の抑制因子、エンドスタチン、およびアポリポタンパク質（ａ）クリングルドメイン（ＬＫ８）が包含される。好ましい抗血管新生遺伝子はＬＫ８をコードする遺伝子である。ＬＫ８は、アポトーシスを誘導し、上皮細胞の遊走を阻害するために、直接的に血管内皮細胞へ影響を与える。特に、アデノウイルスを介するＬＫ８の発現がマウスにおける肝細胞癌増殖を抑制する、と報告されている（Ｌｅｅ Ｋ．ら， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ （２００６） ４３：１０６３）。それゆえ、アデノウイルスの腫瘍溶解効果がＬＫ８の導入により改善されるだろうと期待されている。

「免疫調節遺伝子」は、細胞において発現された場合、体液性および細胞性免疫反応を調節するヌクレオチド配列である。免疫調節遺伝子の非限定的な例には、ＣＤ１６、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ２４、ＧＭ−ＣＳＦ等をコードする遺伝子が包含される。

治療的導入遺伝子は、当分野において知られた様々なＤＮＡ組換え技術により本発明のキメラアデノウイルス内に挿入され得る。

本発明はまた、腫瘍細胞増殖の阻害のため、ならびに腫瘍および他の疾患の治療において有用な治療的導入遺伝子を送達するためのアデノウイルスベクターの調製のための、本発明のキメラアデノウイルスの使用を提供する。具体的には、本発明のキメラアデノウイルスを細胞に導入することを含む、ほ乳類細胞へ治療的導入遺伝子送達するための方法；対象内に前記アデノウイルスを投与することを含む、癌を治療するための方法；ヒトアデノウイルスのヘキソンにおける７以上のアミノ酸残基を、ＳＡｄ１９ヘキソンタンパク質の７以上の残基で置換することを含む、遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターを調製するための方法が提供される。

本発明では、本発明のキメラアデノウイルスを含む組成物も提供される。本発明の組成物は、遺伝子治療またはウイルス性治療、好ましくは癌治療に有用である。

本発明の組成物は、医薬上許容される担体および／または賦形剤と共に様々な製剤を提供するように処方することができる。それゆえ該製剤は、油媒体あるいは水媒体での溶液、懸濁液あるいは乳液、抽出物、粉末、顆粒、錠剤またはカプセルの形状とすることができる。

経口製剤のため、アデノウイルス放出のために特異的に設計されたものを含む様々な調製方法を、例えばＥｕｄｒａｇｉｔまたはｔｉｍｅｃｌｏｃｋ放出システム（Ｌｕｂｅｃｋら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６（１７）， ６７６３−６７６７ （１９８９）； および Ｃｈｏｕｒａｓｉａ ａｎｄ Ｊａｉｎ， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， ６（１）， ３３−６６ （２００３））により用いることができる。

上述のように、キメラアデノウイルスは当分野で知られた任意の遺伝子導入系を介して導入され得る。［Ｒｏｌｌａｎｄ （１９９８） Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａｐ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １５： １４３−１９８］およびそこで引用されている参考文献で開示されているもののような、たくさんの遺伝子導入系が、当分野においてよく知られている。従って、本発明の組成物はこれらの遺伝子導入系に好ましく処方され得る。

本発明の組成物は、当分野で知られた任意の医薬上許容される担体を含んでもよい。適した担体の例は、水、塩水、アルコール、脂質、ろう、緩衝溶液、マンニトール、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、ブドウ糖、ショ糖、および炭酸マグネシウムなどの固形担体、または生分解性ミクロスフェア（例えばポリ乳酸ポリグリコール酸）である。

本発明の組成物は、密封されたアンプルまたはバイアルなどの単回投与または複数回投与容器の形状で提供されてもよい。好ましくは、そのような容器は、使用前に製剤処方の無菌状態を保つように密封することができる。一般に製剤は、懸濁液、流体、および油性または水性媒体での乳液として保存することができる。さらに製剤処方は凍結乾燥条件下でも保存することができる。

キメラアデノウイルスおよびそれを含む組成物は、部位特異的注射または静脈注射で投与されてもよい。部位特異的注射には、例えば、腹腔内注射、胸膜内注射、くも膜下注射、動脈注射、腫瘍内注射、または局所適用が挙げられる。そのような投与方法はまた、アデノウイルスベクターを利用する治療および他の標的疾患のための治療の組み合わせに、容易に適用することができる。好ましい方法は静脈注射である。

実際に投与される活性成分の適した量は、治療される予定の状態、個々の患者の年齢および体重、食事、投与時間、排せつ率、患者の症状の重篤度、および反応感受性（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を含む、様々な関連因子をふまえて決定されるであろう；かつ、それゆえ、上記の用量は決して発明の範囲を限定する目的とされるべきではない、ということが理解されるべきである。一般に、本発明の組成物は、１×１０^７から１×１０^１３ｐｆｕ／ｍｌの本キメラアデノウイルスを含有し、かつ、本キメラアデノウイルスは、３から５週間、１週間あたり１回、１×１０^１１ｐｆｕの量で注射することができる。

本発明の組成物は、単独治療（ｓｉｎｇｌｅ ｔｈｅｒａｐｙ）として用いてもよい。しかしそれは、癌を治療するための従来型の化学療法または放射線療法などの他の抗腫瘍プロトコルと組み合わせてもよい。本発明の組成物と共に用いることができる化学療法薬は、パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ブレオマイシンン、プリカマイシン、マイトマイシン、エトポシド、タモキシフェン、タキソール、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキサートを包含する。本発明の組成物と共に用いることができる放射線療法は、Ｘ線照射およびγ線照射等であり得る。

本発明のキメラアデノウイルスは、血液凝固因子と相互作用しないので、ほとんど肝臓へ形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）をせず、また低い肝毒性を示す。従って、高用量の本キメラアデノウイルスが、その低リスクの免疫反応および肝毒性のおかげで、対象に投与することができ、かつ、それゆえ、本キメラアデノウイルスは、安全かつ効果的な遺伝子治療およびウイルス性治療に有用である。

以下の実施例は本発明を説明することを目的としており、その範囲を限定するものではない。

ＳＡｄ１９のヘキソン遺伝子の同定
ＰＣＲを用いてヘキソン遺伝子をＳＡｄ１９から増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクターへクローニングし、ＡＢＩ自動ＤＮＡシーケンサーで配列解析した。

＜１−１＞ヘキソン遺伝子の同定
ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＳＡｄ１９のゲノムが単離され、配列番号１および２のプライマーセットを用いるＰＣＲによるヘキソン遺伝子の増幅のための鋳型として用いられた。増幅されたヘキソン遺伝子は、Ｗｉｚａｒｄ^登録商標 ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＷＩ， ＵＳＡ）により精製され、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＷＩ， ＵＳＡ）内に挿入された。生じた組換えベクターはｐＧＥＭ−ＳＡｄ１９ Ｈｅｘｏｎベクターと命名された。該ベクターでの大腸菌細胞の形質転換後、ベクターＤＮＡが１０クローンの形質転換体から抽出され、ＡＢＩ自動ＤＮＡシーケンサーを用いることにより配列解析された。１０の塩基配列の内、他と最も高い配列相同性を有する一つが選択され、それによりＳＡｄ１９のヘキソン遺伝子のヌクレオチド配列を決定した（配列番号３）。

＜１−２＞ヒトアデノウイルス血清型の塩基およびアミノ酸配列との比較
ＳＡｄ１９のヘキソン遺伝子の塩基およびアミノ酸配列を、５１種のヒト血清型アデノウイルスのものと比較した。サブグループＦに属するＳＡｄ１９のヘキソンは、ＨＡｄ４１のものと最も類似し、それらの間でアミノ酸配列において８５％の相同性を有することがわかった。それは、ＨＡｄ５のヘキソンと７６％のアミノ酸相同性を示した。さらに、ＳＡｄ１９のヘキソンは、ＨＡｄ４１およびＨＡｄ５のものと、それぞれ、７６％および７０％のヌクレオチド配列相同性を共有することがわかった（図１）。

置換されたＳＡｄ１９のヘキソンを備えるキメラアデノウイルスの調製
ヘキソン遺伝子を交換するためのシャトルベクターが構築され、ｐＨｅｘベクターと命名された、これは相同組換えのためヘキソン遺伝子の左および右伸長領域を運んでいる。ＳＡｄ１９のヘキソン遺伝子が、ヘキソンの左および右伸長アームの間に位置する、ｐＨｅｘベクターの固有の制限酵素部位へクローニングされ、ｐＨｅｘ−ＳＡｄ１９ Ｈｅｘｏｎと命名された組換えベクターが提供された。ＳｐｈＩ−直線化ｐＨｅｘ−ＳＡｄ１９ Ｈｅｘｏｎが、ＢＪ５１８３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）におけるＡｓｉＳＩ−直線化ｐＡｄ Ｈ５＿８ＤＳとの相同組換えに供され、ｐＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳと命名されたＳＡｄ１９ Ｈｅｘｏｎ−運搬組換えベクターが提供された。ＰａｃＩで直線化した後、ｐＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳをＡ５４９細胞内へトランスフェクトし、つながれたＳＡｄ１９のヘキソンを備える新規キメラアデノウイルスを生成した（Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳ）。

＜２−１＞シャトルベクターの構築
相同組換えを介するヘキソン遺伝子の置換に適したシャトルベクターが構築された。その際、配列番号４および５のプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ＨＡｄ５のヘキソン遺伝子の５’末端の上流の約１ｋｂ長の領域が増幅された。このようにして得られたＰＣＲ生成物はＨｅｘｏｎ Ｌと命名され、次いで、ｐＣＲ２．１ Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）内に挿入された。ＤＮＡ配列解析で変異無しのクローンの選択が可能であり、ｐＣＲ２．１−Ｈｅｘｏｎ Ｌと命名された。独立して、配列番号６および７のプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ＨＡｄ５のヘキソン遺伝子の３’末端の下流の約１ｋｂ長の領域が増幅された。このようにして得られたＰＣＲ生成物はＨｅｘｏｎ Ｒと命名され、次いで、ｐＣＲ２．１ Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）内に挿入された。変異無しのクローンが、ＤＮＡ配列解析により解析された通り、ｐＣＲ２．１−Ｈｅｘｏｎ Ｒと命名された。

ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩの両方の使用によりｐＣＲ２．１−Ｈｅｘｏｎ Ｌから切除した後、Ｈｅｘｏｎ Ｌを、事前にＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩの両方で切断されたｐＥＮＴＲ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）内に挿入し、組換えベクターｐＥＮＴＲ２Ｂ−Ｈｅｘｏｎ Ｌを生じた。ｐＣＲ２．１−Ｈｅｘｏｎ ＲをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いて、クレノウ断片で処理し、平滑末端を作製した。ＥｃｏＲＩでの消化で、平滑末端化ｐＣＲ２．１−Ｈｅｘｏｎ ＲからＨｅｘｏｎ Ｒを切除した。このＨｅｘｏｎ Ｒを、ｐＥＮＴＲ２Ｂ−Ｈｅｘｏｎ Ｌベクターの平滑化ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ部位に挿入した。生じた組換えベクターはｐＨｅｘと命名された。鋳型として機能するｐＧＥＭ−ＳＡｄ１９ Ｈｅｘｏｎと、配列番号１および２のプライマーセットを用いて、ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）の存在下、ＰＣＲが行われた。ＳＡｄ１９のＭｆｅ１制限ヘキソン遺伝子が、ｐＨｅｘベクターのＥｃｏＲＩ部位へクローニングされた。ＤＮＡ配列解析により解析された通り、正しい位置においてＳＡｄ１９のヘキソンを有することがわかった、生じた組換えプラスミドが、ｐＨｅｘ−ＳＡｄ１９ Ｈｅｘｏｎと命名された（図２Ａ）。

＜２−２＞相同組換えを介するＳＡｄ１９のヘキソンでの置換
ＳＡｄ１９のヘキソンと再結合されたキメラアデノウイルスを調製するために、まず、ｐＥＮＴＲ２Ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ）をＥｃｏＲＩで処理し、そこからｃｃｄＢ領域を除去した。本発明者により以前構築されたｐＡＡＶ−ＣＭＶ＿ＬＫ８＿ＵＮベクター（国際公開第ＷＯ２００９／１０２０８５号参照）を、ＫｐｎＩ／ＢｇｌＩＩで処理し、ＣＭＶ＿ＬＫ８断片（後で平滑化される）を生じ、次いで、ＥｃｏＲＩ処理ｐＥＮＴＲ２ＢのＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ部位（後で平滑化される）に挿入し、組換えプラスミドｐＥＮＴＲ−ＣＭＶ＿ＬＫ８を生じた。

Ｅ１Ａ遺伝子の腫瘍特異的発現ユニットを運ぶプラスミドベクターを構築するために、ヒトゲノムＤＮＡから、ＤＮＭＴ−１（ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ）遺伝子の近位プロモーター（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）領域（ＤＳプロモーター）が増幅され、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）へクローニングされ、組換えプラスミドｐＣＲ−ＤＳを生じた。遺伝子増幅は、ＰＣＲ鋳型としてヒトゲノムＤＮＡ、ならびにＤＮＭＴ−１遺伝子の近位プロモーター領域の両端に結合する、配列番号８（５’−ＣＴＴ ＣＴＣ ＧＣＴ ＧＣＴ ＴＴＡ ＴＣＣ ＣＣＡ ＴＣ−３’）および配列番号９（５’−ＣＴＣ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＴＣ ＡＧＣ ＡＧＡ ＣＧＣ−３’）のプライマーセットを用いるＰＣＲにより、Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ， Ｊａｐａｎ）の存在下で実行された。９４℃で５分間の変性から開始し、ＰＣＲは、９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で１分間の伸長を３０サイクルで行われ、続いて７２℃でさらなる３分間の伸長が行われた。

ＳａｃＩおよびＸｈｏＩによりｐＣＲ−ＤＳから切除されたＤＮＡ断片を、ｐΔＥ１Ｓｐ１Ｂ−Ｅ２Ｆ−１ Ｒｂ７Δ１９ｋベクター（Ｋｉｍ，Ｊ．，ら（２００７）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １８，ｐ７７３−７８６；ｍＥ１Ａ，韓国特許第７４６１２２号；ΔＥ１Ｂ１９Ｋ，韓国特許第４３２９５３号）における変異Ｅ１Ａ遺伝子の前のＣｌａＩおよびＳａｌＩ部位に挿入し、組換えプラスミドｐＳＰ７２−ＤＳ＿ｍＥ１Ａ＿ΔＥ１Ｂ１９Ｋを構築した。ｐＳＰ７２−ＤＳ＿ｍＥ１Ａ＿ΔＥ１Ｂ１９ＫのＢａｍＨＩでの処理で生じる断片が、ｐＥＮＴＲ−ＣＭＶ＿ＬＫ８のＢｇｌＩＩ部位に挿入され、ｐＥＮＴＲ−ＣＭＶ＿ＬＫ８−ＤＳ＿ｍＥ１Ａ＿ΔＥ１Ｂ１９Ｋと命名されたシャトルベクターが提供された。

１００ｎｇのｐＡｄ−ＰＬ Ｄｅｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）および５００ｎｇのｐＥＮＴＲ−ＣＭＶ＿ＬＫ８−ＤＳ＿ｍＥ１Ａ＿ΔＥ１Ｂ１９Ｋの混合物へ１６μＬのクロナーゼＩ反応バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）が添加された。該反応混合物を２μＬのクロナーゼＩと室温で１時間、次いで、２μＬのプロテイナーゼＫ（２μｇ／μＬ）と３７℃で１０分間インキュベートした。生じた反応混合物の１０μＬを取り、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換させるために使用し、次いでアンピシリンプレートへ塗布した。制限酵素マッピングにおいて陽性のコロニーから抽出されたプラスミドＤＮＡが、対象とするアデノウイルスベクターとしてＤＮＡ配列解析により同定され、次いで、ｐＡｄ Ｈ５−８ＤＳと命名された。

ｐＡｄ Ｈ５−８ＤＳのヘキソン遺伝子をＳＡｄ１９ヘキソンで置換するために、まず、５００ｎｇのｐＨｅｘ−ＳＡｄ１９ Ｈｅｘｏｎおよび５０ｎｇのｐＡｄ Ｈ５＿８ＤＳを、それぞれＳｐｈＩおよびＡｓｉＳＩで直線化し、エレクトロポレーションによる大腸菌ＢＪ５１８３への形質転換の前に共に混合した。相同組換えを調べるように設計された、配列番号１０（５’−ＡＴＧ ＣＧＣ ＡＡＧ ＧＴＧ ＴＡＧ ＣＣＡ−３’）および配列番号１１（５’−ＡＧＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＧＴＧ−３’）のプライマーセットを用いるＰＣＲにより、相同組換えをスクリーニングした。９４℃で５分間の変性から開始し、ＰＣＲは、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で４０秒間のアニーリングおよび７２℃で１．５分間の伸長を３０サイクルで行われ、続いて７２℃でさらなる３分間の伸長が行われた。陽性にスクリーニングされたコロニーが、ＬＫ８およびＥ１Ａ遺伝子の両方を含む領域を増幅するように設計された、配列番号１２（５’−ＣＣＣ ＧＴＴ ＡＣＡ ＴＡＡ ＣＴＴ ＡＣＧ−３’）（ＣＭＶセンスプライマー）および配列番号１３（５’−ＴＴＡ ＴＧＧ ＣＣＴ ＧＧＧ ＧＣＧ ＴＴＴ ＡＣＡ Ｇ−３’）（Ｅ１Ａアンチセンスプライマー）のプライマーセットを用いるＰＣＲによる、第二のスクリーニングに供された。９４℃で５分間の変性から開始し、ＰＣＲは、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で４０秒間のアニーリングおよび７２℃で３０秒間の伸長を３０サイクルで行われ、続いて７２℃でさらなる５分間の伸長が行われた。２つのＰＣＲにより陽性にスクリーニングされたクローンからＤＮＡを単離し、大腸菌ＤＨ５αにおいて増幅させた。ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩおよびＰｓｈＡＩでの全ての切断パターンにおいて一致したクローンが確保され、ｐＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳと命名された（図２Ｂ）。ＤＮＡ配列解析で再度、ｐＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳがＳＡｄ１９のヘキソンを含有していることを同定した。

ＤＳプロモーターを含有するＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ消化によりｐＣＲ−ＤＳから切除し、ｐｈＲＬ−ｎｕｌｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＷＩ， ＵＳＡ）のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐｈＲＬ−ＤＳを生成した。ｐｈＲＬ−ＤＳのＳａｌＩおよびＰｓｔＩでの処理で生じる断片を、ｐＥ１．２（Ｏ．Ｄ．２６０ Ｉｎｃ． Ｂｏｉｓｅ， Ｉｄａｈｏ ＵＳ）シャトルベクターのＳａｌＩおよびＰｓｔＩ部位内に挿入し、ｐＥ１．２−ＤＳを生成した。ＡｌｗＮＩ消化によりｐＥ１．２−ＤＳから切除した１．７ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅエレクトロ−コンピテントセルを用いる酵素−ライゲーション法により、ｐＡｄ３２８（Ｏ．Ｄ．２６０ Ｉｎｃ． Ｂｏｉｓｅ， Ｉｄａｈｏ ＵＳ）のＳｆｉＩ部位にクローニングした。アンピシリンおよびカナマイシンを添加したＬＢプレート上で生育するコロニーから抽出されたプラスミドＤＮＡが、ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩおよびＰｓｈＡＩでの全ての切断パターンにおける一致により確保され、ｐＡｄ３２８−ＤＳアデノウイルスベクターと命名された（図２Ｃ）。アデノウイルスＥ１遺伝子をＨＡｄ５のゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＷＩ， ＵＳＡ）へクローニングし、組換えプラスミドｐＧＥＭＴ−Ａｄ Ｅ１を生じた。ｐＧＥＭＴ−Ａｄ Ｅ１をＢｓｓＨＩ消化の後ＥｃｏＮＩで非常に短く処理し、そこからＥ１Ｂ１９ｋ領域を除去した。Ｅ１Ｂ１９ｋ欠失ｐＧＥＭＴ−Ａｄ Ｅ１はｐＧＥＭＴ−Ａｄ Ｅ１Δ１９ｋと命名された。ｐＡｄ３２８−ＤＳのＥ１遺伝子をＥ１ＢΔ１９ｋ欠失Ｅ１遺伝子で置換するために、まず、１００ｎｇのｐＡｄ３２８−ＤＳおよび１μｇのＳｐｈＩ−直線化ｐＧＥＭＴ−Ａｄ Ｅ１Δ１９ｋを、エレクトロポレーションによる大腸菌ＢＪ５１８３への形質転換の前に共に混合した。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＶでの消化により相同組換えをスクリーニングした。全ての切断パターンにおいて一致したクローンを確保し、ｐＡｄ３２８−ＤＳΔ１９ｋと命名した。ｐＡｄ Ｈ５／Ｓ１９ ８ＤＳプラスミドを作製するために記載された上記手順に従って、ｐＡｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳおよびｐＡｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳΔ１９ｋが、ｐＨｅｘ−ＳＡｄ１９ ＨｅｘｏｎおよびｐＡｄ３２８＿ＤＳまたはｐＡｄ３２８−ＤＳΔ１９ｋの間での相同組換えにより生成された（図２Ｄ）。

＜２−３＞ＳＡｄ１９のヘキソンと再結合されたキメラアデノウイルスの調製
プラスミドｐＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳをＰａｃＩで直線化し、Ａ５４９細胞にトランフェクトした。トランスフェクション後１４日目に、細胞が細胞変性（ｃｙｔｏｐａｔｈｙ）を受けたことが観察され、培地と一緒に回収された。ウイルスを完全に分離するために、まず、細胞は３回凍結融解され、続いて遠心分離された。ウイルスを含有する上清が２ラウンドのプラーク精製に供され、純粋なウイルスを生じ、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳウイルスと命名された。Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳウイルスは、それらのゲノムＤＮＡの配列解析による解析の通り、ＳＡｄ１９のヘキソン遺伝子を有するキメラアデノウイルスとして同定された。Ａｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳおよびＡｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳΔ１９ｋウイルスは、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳの生成のための上述の手順のように調製された。

＜２−４＞ＳＡｄ１９のヘキソンを有するキメラアデノウイルスの生成および精製
Ａ５４９肺癌細胞を１５０ｍｍサイズの３０個の培養ディッシュにおいて８０％培養密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）で生育させ、次いで、２０のＭＯＩでＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳウイルスで感染させた。３７℃で２日間のインキュベーション後、細胞は１２，０００ｘｇで１０分間の遠心分離により回収され、次いで、１０ｍＬの溶解バッファー（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）に懸濁された。３ラウンドの凍結融解で細胞を溶解させ、続いて１２，０００ｘｇで１０分間の冷却遠心分離により、細胞残屑を除去した。不連続（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）ＣｓＣｌ勾配を調製するために、１．４の比重を有する８ｍＬのＣｓＣｌ溶液を超遠心分離管（Ｂｅｃｋｍａｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）内に置き、間の境界がはっきりと保たれるような方法で、１．２の比重を有する６ｍＬのＣｓＣｌ溶液で覆った。０．２２μｍフィルターを通して濾過されたウイルスサンプルを、境界を乱さないように、ＣｓＣｌ１．４／１．２勾配の上にロードし、チューブを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）で重量バランスをとった。該チューブをＳＷ２８ローターへアプライし、冷却条件下、２３，０００ｒｐｍで９０分間、超遠心分離して、ウイルスバンドを形成した。

このようにして分離されたウイルスを、連続（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）ＣｓＣｌ勾配超遠心分離工程を用いて再度精製した。このため、１．４の比重を有する８ｍＬのＣｓＣｌ溶液を超遠心分離管（Ｂｅｃｋｍａｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）に置き、間ではっきりとした境界が保たれるような方法で、１．２の比重を有する６ｍＬのＣｓＣｌ溶液で覆った。グラジエントステーション（Ｂｉｏｃｏｍｐ， Ｃａｎａｄａ）を用いて、管内に連続勾配を形成した。不連続ＣｓＣｌ勾配超遠心分離により獲得されたウイルスサンプルを、１倍量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）で希釈し、間の境界をぼやけさせないように、ＣｓＣｌ１．４／１．２勾配管内にロードした。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）で重量バランスをとった後、冷却条件下、２３，０００ｒｐｍで９０分間、超遠心分離して、ウイルスバンドを形成した。それを、ＰＢＳＧバッファー（１０％ グリセロール含有ＰＢＳ）で、バッファーを６時間毎に新鮮なものに交換しながら、３回透析した。

ＳＡｄ１９のヘキソンを有するキメラアデノウイルスのインビトロ研究
Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳウイルスが、肺癌細胞株Ａ５４９および正常細胞株ＭＲＣ５、両者は様々なＭＯＩで該ウイルスに感染させたものである、において、Ｅ１ＡおよびＬＫ８の発現量を比較することにより、肺癌に対する選択性に関してインビトロで測定された。加えて、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳウイルスは、肝臓への血液循環ウイルスを介在する凝固因子に対するアフィニティーに関して測定された。

＜３−１＞ＭＯＩ依存的Ｅ１Ａ発現
Ａ５４９肺癌細胞およびＭＲＣ５正常細胞、両者は６ウェルプレートにおいて約８０％培養密度で生育させたものである、を、１００、２５、１０および１のＭＯＩでＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳウイルスに感染させた。３７℃で２４時間のインキュベーションの後、該細胞は３，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収され、１ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８），２％ ＳＤＳ，１００ｍＭジチオスレイトール，０．１％ブロモフェノールブルー，１０％グリセロール）に懸濁され、水浴において１００℃で５分間加熱され、１０，０００ｒｐｍで２分間、遠心分離された。生じた上清を２０ｍＡで約２時間、４〜１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）上で電気泳動した。ゲル上で分離されたタンパク質バンドは、３００ｍＡの電界（ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ）を適用する、Ｔｒｉｓ−グリシンバッファー（３９ｍＭグリシン，４８ｍＭ Ｔｒｉｓ，０．０３７％ ＳＤＳ，２０％メタノール）における、トランスファーユニット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて、ＰＶＤＦ膜上に、約９０分間、転写された。膜はＴＢＳブロッキング溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＩＬ， ＵＳＡ）で、室温で１時間、ブロッキングされた。一次抗体として働くマウス抗−Ｅ１Ａモノクローナル抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）を、５％スキムミルク／１ｘＴＢＳＴバッファーで１：３，０００希釈し、室温で１時間、プローブさせ（ｐｒｏｂｅｄ）、１ｘＴＢＳＴバッファーで６回、各５分間洗浄した。二次抗体として働く抗−マウスＨＲＰ（ＫＰＬ， ＭＡ， ＵＳＡ）を、５％スキムミルク／１ｘＴＢＳＴバッファーで１：５，０００希釈し、３０分間プローブさせ、１ｘＴＢＳＴバッファーで６回、各５分間洗浄し、カラー現像試薬（ＥＣＬ， Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＫ）と反応させ、Ｅ１Ａタンパク質バンドを視覚化した。Ｅ１Ａの発現量は、Ａ５４９癌細胞においてＭＲＣ−５正常細胞におけるよりも１００倍高く、ＭＯＩ−依存的な方法で増加した（図３）。

＜３−２＞凝固因子Ｘに対するアフィニティー
Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳは、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）法を用いて、凝固因子Ｘに対するアフィニティーに関して測定された。精製された凝固因子Ｘ（ＨＣＸ−００５０， Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， ＶＴ， ＵＳＡ）をＣＳ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ， Ｓｗｅｄｅｎ）にアプライした。精製されたＡｄ Ｈ５＿８ＤＳおよびＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳウイルスのそれぞれを、５ｍＭ ＣａＣｌ_２を含有するＨＢＳＰバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０）にて、３．０×１０^１１ＶＰ／ｍＬ、１．５×１０^１１ＶＰ／ｍＬおよび０．７５×１０^１１ＶＰ／ｍＬの濃度で希釈した。ＨＢＳＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０）をチップからウイルスを離すための再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）バッファーとして用いた。ウイルス溶液が、３０μＬ／分の流速で凝固因子Ｘ−固定化ＣＭ５センサーチップを通り過ぎる間、ＲＵ値が記録された。３つの異なる濃度で、アデノウイルス血清型５ Ａｄ Ｈ５＿８ＤＳは各々、３００、１５０および７０ＲＵの固定化因子に対するＳＰＲシグナルを示した、一方で、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳ、ＳＡｄ１９のヘキソンを有するキメラアデノウイルス、は、３つの濃度全てでＳＰＲシグナルが５ＲＵ以内であることがわかったように、凝固因子Ｘに対するアフィニティーが非常に弱い、あるいはほとんどないことを示した（図４Ａ）。Ａｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳおよびＡｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳΔ１９ｋもまた、因子ＩＸの代わりに凝固因子Ｘタンパク質を用いて、下記＜３−３＞に記載されるように免疫沈降法により、凝固因子Ｘに対するアフィニティーに関して測定された（図４Ｄ）。

＜３−３＞凝固因子ＩＸに対するアフィニティー
Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳは、免疫沈降法を用いて、凝固因子ＩＸに対するアフィニティーに関して測定された。チューブ内の１ｍＬのＰＢＳに、１ｘ１０^１１ＶＰのＡｄ Ｈ５＿８ＤＳまたはＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳを、１０μｇの精製された凝固因子ＩＸ（ＨＣＩＸ−００４０， Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， ＶＴ， ＵＳＡ）、５μｇのヤギ抗−凝固因子ＩＸ抗体、および５０μＬのセファロース−プロテインＧ（５０％ スラリー）と共に添加し、続いてオービタルシェーカーにて４℃で２時間インキュベートした。５，０００ｒｐｍでの５分間の遠心分離の後、このようにして得られたセファロース−プロテインＧペレットをＰＢＳで３回洗浄し、１００μＬの１ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８），２％ＳＤＳ，１００ｍＭジチオスレイトール，０．１％ブロモフェノールブルー，１０％グリセロール）に懸濁し、５分間加熱した。該懸濁液を遠心分離し、生じた上清を２０ｍＡで約２時間、４〜１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。このようにして分離されたタンパク質は、３００ｍＡが適用される、Ｔｒｉｓ−グリシンバッファー（３９ｍＭグリシン，４８ｍＭ Ｔｒｉｓ，０．０３７％ ＳＤＳ，２０％メタノール）を含有するトランスファーユニット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）において、ＰＶＤＦ膜上に約９０分間、転写された。膜はＴＢＳブロッキング溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＩＬ， ＵＳＡ）で、室温で１時間、ブロッキングされた。一次抗体として働くマウス抗−ＨＡｄ５ファイバーモノクローナル抗体（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を、５％スキムミルク／１ｘＴＢＳＴバッファーで１：３，０００希釈し、室温で１時間、プローブさせ、１ｘＴＢＳＴバッファーで６回、各５分間洗浄した。二次抗体として働く抗−マウスＨＲＰ（ＫＰＬ， ＭＡ， ＵＳＡ）を、５％スキムミルク／１ｘＴＢＳＴバッファーで１：５，０００希釈し、３０分間プローブさせ、１ｘＴＢＳＴバッファーで６回、各５分間洗浄し、カラー現像試薬（ＥＣＬ， Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＫ）と反応させ、ファイバーバンドを視覚化した。ＰＶＤＦ膜上のブロットは、オービタルシェーカーでの振盪と共に、Ｒｅｓｔｏｒｅ^商標 ウェスタンブロットストリッピングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＩＬ， ＵＳＡ）において１時間浸され、１ｘＴＢＳＴバッファーで３回、各１０分間洗浄され、ＴＢＳブロッキング溶液で、室温で１時間、ブロッキングされた。一次抗体として用いられる、ヒツジ抗−凝固因子ＩＸ抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， Ｃａｎａｄａ）を、５％スキムミルク／１ｘＴＢＳＴバッファーで１：３，０００希釈し、室温で１時間、プローブさせ、１ｘＴＢＳＴバッファーで６回、各５分間洗浄した。二次抗体として働く抗−ヒツジＨＲＰ（ＫＰＬ， ＭＡ， ＵＳＡ）を、５％スキムミルク／１ｘＴＢＳＴバッファーで１：５，０００希釈し、３０分間プローブさせ、１ｘＴＢＳＴバッファーで６回、５分間洗浄し、カラー現像試薬（ＥＣＬ， Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＫ）と反応させ、凝固因子ＩＸバンドを視覚化した（図４Ｂ）。Ａｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳおよびＡｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳΔ１９ｋもまた、上述のような免疫沈降法を用いて、凝固因子ＩＸに対するアフィニティーに関して測定された（図４Ｃ）。

ＳＡｄ１９のヘキソンを有するキメラアデノウイルスのインビボ研究
＜４−１＞生体内分布
Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳが、Ｂａｌｂ／ｃ正常マウスおよびヌードマウス、両者ともに６週齢、に、３×１０^１０ＶＰの用量で静脈内注射された。注射後２日目に、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、脳、肝臓、肺、心臓、胸腺、脾臓、卵巣、子宮、および血液からＤＮＡが単離された。単離されたＤＮＡは、ＯＤ分光光度計を用いて定量的に解析され、ＰＣＲのための鋳型として２００ｎｇの量で使用された。アデノウイルスのＥ４領域が、配列番号１４（５’−ＡＣＴ ＣＧＡ ＧＣＡ ＣＧＴ ＴＧＴ ＧＣＡ ＴＴＧ ＴＣＡ−３’）および配列番号１５（５’−ＴＧＴ ＣＧＡ ＣＴＡ ＧＴＴ ＴＴＣ ＴＴＡ ＡＡＡ ＴＧＧ−３’）のプライマーセットを用いるＰＣＲにより増幅された。９４℃で５分間の変性から開始し、ＰＣＲは、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で４０秒間のアニーリングおよび７２℃で１分間の伸長を３０サイクルで行われ、続いて７２℃でさらなる３分間の伸長が行われた。ＰＣＲ生成物は、電界の存在下１％アガロース上で泳動され（ｒｕｎ）、臓器によるアデノウイルスの分布を解析した。注射された場合、ＨＡｄ５、すなわちＡｄ Ｈ５＿８ＤＳは肝臓および肺で最も高く観察され、心臓および脾臓で部分的に検出された。対照的に、ＳＡｄ１９のヘキソンを有するキメラアデノウイルス、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳウイルスは、心臓および脾臓で大部分が検出され、肝臓および肺で一部分だけが検出された（図５）。この分布パターンは、静脈内注射により肝臓内へ形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）され、大量の注射により肝毒性を誘導すると知られている、アデノウイルス血清型５の生体内分布とかなり異なっている。つまり、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳウイルスは、該ウイルスが凝固因子Ｘに対するアフィニティーをほとんど示さないという実施例＜３−２＞の観察から推論されるように、ごく少量肝臓に形質導入された。

ＨＡｄ５中和抗体の免疫認識を回避する、ＳＡｄ１９のヘキソンを有するキメラアデノウイルスの能力に関するインビトロ測定
＜５−１＞Ｅ１Ａ発現パターンによる、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳおよびＡｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳの形質導入への抗−ＨＡｄ５−陽性血漿の効果の試験
野生型ＨＡｄ５をマウスの後脚に１×１０^１１ＶＰの用量で筋肉内注射し、その後２週、免疫反応を引き上げる（ｂｏｏｓｔ）ために同量のウイルスを再び注射した。全てのウイルス注射マウスから採取された血液から血清を分離し、次いで抗−アデノウイルス抗体の濃度に関して測定した。その際、血清の１／２５、１／１００、１／１０００希釈液をアデノウイルスでコートされたＥＬＩＳＡプレートへ添加し、１時間インキュベートし、ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄し、続いてＨＲＰコンジュゲート化抗マウスＩｇＧ抗体の１／５，０００希釈液と共に１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で５回洗浄した後、ＴＭＢ基質との３０分間の反応および１Ｍ リン酸での終結により、カラーを現像した。該プレートは吸光度に関して測定された。抗−アデノウイルス抗体（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ， ＮＣ， ＵＳＡ）の１／１０００希釈液と反応することにより調製された、陽性コントロールのものと比較してそれらの吸光度が５０％以上であった場合、陽性の免疫反応を誘導するとみなされた。６ウェルプレートにおいて９０％培養密度で生育させたＡ５４９細胞は、陽性免疫反応であると決定されたマウス血漿と室温でインキュベートされる１時間前に、２５のＭＯＩでＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳまたはＡｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳに感染させられた。３７℃で２４時間のインキュベーションの後、該細胞は３，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収され、１ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）， ２％ ＳＤＳ， １００ｍＭ ジチオスレイトール， ０．１％ ブロモフェノールブルー， １０％ グリセロール）に懸濁され、水浴において１００℃で５分間加熱され、１０，０００ｒｐｍで２分間、遠心分離された。清澄化した上清を、電気泳動キット（Ｎｏｖｅｘ）を用いて、２０ｍＡの存在下、４〜１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）上で約２時間泳動した（ｒｕｎ）。分離されたタンパク質は、３００ｍＡの電界を適用する、Ｔｒｉｓ−グリシンバッファー（３９ｍＭ グリシン， ４８ｍＭ Ｔｒｉｓ， ０．０３７％ ＳＤＳ， ２０％ メタノール）を含有するトランスファーユニット（Ｎｏｖｅｘ）において、ＰＶＤＦ膜上に、９０分間、転写された。膜はＴＢＳブロッキング溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＩＬ， ＵＳＡ）で、室温で１時間、ブロッキングされた。膜を、５％ スキムミルク／１ｘＴＢＳＴバッファーでの、マウス抗−Ｅ１Ａモノクローナル抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）、一次抗体、の１：３，０００希釈液で、室温で１時間、インキュベートし、次いで、１ｘＴＢＳＴバッファーで６回、各５分間洗浄した。３０分間、５％ スキムミルク／１ｘＴＢＳＴバッファーでの、二次抗体としての抗−マウスＨＲＰ（ＫＰＬ， ＭＡ， ＵＳＡ）の１：５，０００希釈液でインキュベートし、続いて、１ｘＴＢＳＴバッファーで６回、各５分間洗浄した。カラー現像試薬（ＥＣＬ， Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＫ）でＥ１Ａタンパク質バンドを視覚化した。Ａｄ Ｈ５＿８ＤＳの形質導入は抗−ＨＡｄ５抗体−陽性血漿により阻害された一方、キメラアデノウイルスＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳ（図６Ａ）、Ａｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳおよびＡｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳΔ１９ｋ（図６Ｂ）の形質導入への影響は全くなかった。

＜５−２＞免疫染色による、Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳ形質導入への抗−ＨＡｄ５抗体−陽性血漿の影響の試験
陽性免疫反応であると決定されたマウス血漿と室温で１時間インキュベートさせた後に、９０％培養密度で培養したＡ５４９細胞を、２５のＭＯＩでＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳまたはＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳに感染させ、続いて３７℃で２日間インキュベートした。冷メタノールで細胞を固定し、プロテインフリーＴ２０（ＴＢＳ）ブロッキングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＩＬ， ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。該細胞はＰＢＳＴバッファーでのマウス抗−Ｅ１Ａモノクローナル抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）の希釈液（１／３，０００）で１時間インキュベートされ、ＰＢＳＴバッファーで６回、各５分間洗浄された。次いで、該細胞をＰＢＳＴバッファーでのＨＲＰコンジュゲート化抗マウス二次抗体の希釈液（１／５，０００）で１時間、再度インキュベートし、ＰＢＳＴバッファーで６回、各５分間洗浄し、ＤＡＢ溶液と反応させて色素を生成した。抗−ＨＡｄ５抗体−陽性血漿はＡｄ Ｈ５＿８ＤＳの形質導入を阻害するが、キメラアデノウイルスＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳ（図７Ａ）、Ａｄ３２８ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳおよびＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿ＤＳΔ１９ｋ（図７Ｂ）の形質導入には影響が全くなかったことがわかった。

＜５−３＞ＨＡｄ５中和抗体の免疫認識を回避する、ＳＡｄ１９のヘキソンを有するキメラアデノウイルスの能力へのインビボ試験
野生型ＨＡｄ５をハムスターの後脚に１×１０^１１ＶＰの用量で筋肉内注射し、その後２週目で、免疫反応を引き上げるために同量のウイルスを再び注射した。全てのウイルス注射ハムスターから採取された血液から血清を分離し、次いで抗−アデノウイルス抗体の濃度に関して測定した。その際、血清の１／２５、１／１００、１／１０００希釈液をアデノウイルスでコートされたＥＬＩＳＡプレートへ添加し、１時間インキュベート、ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄し、続いてＨＲＰコンジュゲート化抗ハムスターＩｇＧ抗体の１／５，０００希釈液と共に１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で５回洗浄した後、ＴＭＢ基質との３０分間の反応および１Ｍ リン酸での終結で、カラーを現像した。該プレートは吸光度に関して測定された。抗−アデノウイルス抗体の１／１０００希釈液と反応することにより調製された、陽性コントロールのものと比較してそれらの吸光度が５０％以上であった場合、陽性の免疫反応を誘導するとみなされた。ＨＡｄ５、すなわちＡｄ Ｈ５＿８ＤＳが１×１０^１１ＶＰの用量で静脈注射された免疫付与されたハムスターは、検出するには血中ＬＫ８濃度において低すぎることがわかった。対照的に、１×１０^１１ＶＰの用量でのＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳの静脈注射は、２００ｎｇ／ｍＬ以上の血中ＬＫ８濃度を確保（ｅｎｓｕｒｅ）し、発現量は２８日間、２００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度を維持し、ＳＡｄ１９のヘキソンを有するキメラアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５中和抗体により、それらの形質導入が阻害されることはないことを示した（図８）。

ＳＡｄ１９のヘキソンを有するキメラアデノウイルスの毒性
ＳＡｄ１９のヘキソンの毒性について研究した。この目的を達成するために、一日おきに計量された５匹のＢａｌｂ／ｃマウスの５群に、それぞれ、１ｘ１０^１１ＶＰ、５ｘ１０^１０ＶＰ、１ｘ１０^１０ＶＰ、５ｘ１０^９ＶＰおよび１ｘ１０^９ＶＰの用量でウイルスが静脈注射された。注射後３および６週で、血液および血清がマウスから採取され、白血球、赤血球、血小板およびヘモグロビン濃度、ヘマトクリット、ＭＣＶ（平均赤血球容積）、ＭＣＨ（平均赤血球ヘモグロビン量）、ＭＣＨＣ（平均赤血球ヘモグロビン濃度）および白血球分画（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ ｃｏｕｎｔ）に関して解析された。試験が、アルブミン、総タンパク質、肝機能検査に関するＳＧＰＴ（ＡＬＴ）、ＳＧＯＴ（ＡＳＴ）およびＡＬＰ、腎機能検査に関するクレアチニンおよびＢＵＮ、筋肉検査に関するクレアチニンキナーゼ、および代謝検査に関するコレステロールおよびグルコースの濃度で作製された。１×１０^１１ＶＰの用量でヒトアデノウイルス血清型５ウイルスＡｄ Ｈ５＿８ＤＳに感染させた群における５匹のマウスのうち、１匹は重度に病気のままであるが、４匹は５日目に死亡した。それらは剖検により、他の臓器においては異常な状態を有さないが、肝硬変を患っていることがわかった。他の群は全て、剖検による試験によると、正常であると観察された（図９）。

＜６−１＞血液検査
ＨＡｄ５、すなわちＡｄ Ｈ５＿８ＤＳが、１ｘ１０^１１ＶＰ、５ｘ１０^１０ＶＰ、１ｘ１０^１０ＶＰ、５ｘ１０^９ＶＰおよび１ｘ１０^９ＶＰの用量で静脈注射された。５日目、１ｘ１０^１１ＶＰのウイルスで注射されたマウスの全てが死亡した。一方で、他の群は異常な毒性の観察結果を示さなかった。試験群とＰＢＳを注射された陰性コントロールの間で、血液学的検査および血液生化学的検査において統計的学的差異はなかった（図１０）。異常な毒性の観察結果は、ＳＡｄ１９のヘキソンを有するキメラアデノウイルス、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳ、が１ｘ１０^１１ＶＰ、５ｘ１０^１０ＶＰ、１ｘ１０^１０ＶＰ、５ｘ１０^９ＶＰおよび１ｘ１０^９ＶＰの用量で注射された群のうちいずれにも見られなかった。また、試験群とＰＢＳ−注射された陰性コントロールの間で、血液学的検査および血液生化学的検査において統計的学的差異はなかった（図１１）。ＨＡｄ５の最大用量を注射された群において検出された肝毒性は、ＳＡｄ１９のヘキソンを有するキメラアデノウイルスを注射された対応する群においては観察されなかった。

＜６−２＞生検
脳、心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、子宮、卵巣を注射されたマウスから切除し、３．７％中性ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋し、薄切し、Ｈ＆Ｅで染色した。臓器の異常は、１ｘ１０^１１ＶＰのヒトアデノウイルス血清型を注射された群以外の試験群の全てにおいて見られなかった。肝臓生検結果は、１ｘ１０^１１ＶＰ注射群において重度の肝臓壊死を示し、死亡したマウスの急性肝不全を誘導したと考えられた。これがアデノウイルス性の肝毒性の一般的な観察結果であった。ＳＡｄ１９のヘキソンを有するキメラアデノウイルスに関しては、１ｘ１０^１１ＶＰの用量で注射された場合でさえ肝毒性ではなく、ＳＡｄ１９のヘキソンが、ＨＡｄ５が用いられた場合に引き起こされる肝毒性の課題への期待できる解決法になり得ることを示している。

実施例７：動物腫瘍モデルにおけるＳＡｄ１９のヘキソンを有するキメラアデノウイルスの抗腫瘍活性
＜７−１＞ヒト肺癌異種移植動物モデルへのキメラアデノウイルスの腫瘍選択的抗腫瘍活性
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株ＮＣＩ−Ｈ４６０を免疫不全Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの右側腹内に５ｘ１０^６細胞の用量で皮下注射し、５０〜１００ｍｍ^３の大きさの腫瘍を形成させた。該マウスを無作為にマウス５匹ずつの４群に分けた。コントロール群のマウスは、１ｘ１０^９ｐｆｕの用量でＬＫ８遺伝子を運ぶ複製欠損アデノウイルス、Ａｄ−ＬＫ８、またはＰＢＳのいずれかを、２日に一定間隔で３回、静脈注射した。４群の試験群に関しては、１ｘ１０^９ｐｆｕおよび２ｘ１０^８ｐｆｕの用量でＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳを、一定間隔で３回、静脈注射した。腫瘍は２日または３日ごとに大きさを測定し、腫瘍増殖曲線を描いた。ウイルスの最初の注射後２４日目、１ｘ１０^９ｐｆｕの用量でＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳを注射された群は、ＰＢＳ投与群より７４％高く、かつＡｄ−ＬＫ８投与群よりも６４％高い腫瘍増殖阻害率を示した。一方で、２ｘ１０^８ｐｆｕの用量でＡｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳを注射された群は、ＰＢＳ投与群より６１％高く、かつＡｄ−ＬＫ８投与群よりも４８％高い腫瘍増殖阻害率を示した。２−ｗａｙ ＲＭ ＡＮＯＶＡ検定から、注射後１７日目から、ＰＢＳ投与群と比較して、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳを注射された両群の統計学的有意性が明らかとなった（注射後１７日目、Ｐ＜０．０５；注射後２１日目および２４日目、Ｐ＜０．０１）（図１２）。

＜７−２＞ＨＡｄ５で免疫付与されたヒト肺癌同所性動物モデルへのキメラアデノウイルスの腫瘍選択的抗腫瘍活性
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスを、それらの後脚に２週間、一定間隔で、各ラウンドについて１ｘ１０^１０ＶＰの用量での２ラウンドの筋肉内注射により、ＨＡｄ５で免疫付与した。該マウスから採取した血液は、抗−ＨＡｄ５抗体を含有していることがわかった。ＮＳＣＬＣ細胞株ＮＣＩ−Ｈ２１７２を尾静脈内に１ｘ１０^６細胞の用量で接種した。ナイーブなマウスおよび免疫付与されたマウスは、１ｘ１０^９ｐｆｕの注射用量で、腫瘍接種後７、９および１１日目に、Ａｄ−ＬＫ８、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳまたはＡｄ Ｈ５＿８ＤＳのいずれかの三重静脈投与を受けた。６週目に、マウスから肺を切除した（図１３）。肺で生じた腫瘍を数え、大きさによって群に分け：ｘ≦０．５ｃｍ、０．５ｃｍ＜ｘ≦０．７ｃｍ、および０．７ｃｍ＜ｘ≦１ｃｍ、それぞれ、５、７および１０ポイントを与えた。肺で生じた腫瘍は、平均で、ＰＢＳ投与された陰性コントロール群で１８．６、およびＡｄ−ＬＫ８投与群で１１．２を数えることがわかった。Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳを投与された群に関しては、ＨＡｄ５で免疫付与された、もしくはされなかった場合、それぞれ、肺において、平均して、５．６および５．４の腫瘍を有することがわかった。一方で、Ａｄ Ｈ５＿８ＤＳを投与された群におけるマウスは、免疫付与された、もしくはナイーブなマウスの肺において、平均で、１０．８および６．２の腫瘍を有することがわかった。それゆえ、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳは、免疫付与に関係なく、ほぼ同じ力価（ｔｉｔｅｒ）を示したが、Ａｄ Ｈ５＿８ＤＳは抗−ＨＡｄ５抗体により著しい有効性の減少を示した。平均肺容量は、正常マウスで２７４ｍｍ^３、ＰＢＳ投与群で５７０ｍｍ^３、およびＡｄ−ＬＫ８投与群で４８０ｍｍ^３であると測定された。しかしながら、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳを注射されたマウス群は、免疫付与された、もしくは免疫付与されなかった場合、それぞれ、３７０ｍｍ^３の肺および３６０ｍｍ^３の肺を有することがわかった。両者の間で肺容量において著しい相違はなかった。Ａｄ Ｈ５＿８ＤＳを投与された群では、平均肺容量は、免疫付与された、もしくは免疫付与されなかった場合、それぞれ、４１０ｍｍ^３および３５０ｍｍ^３であった。肺の平均重量は、正常マウスで１７０ｍｇ、ＰＢＳ投与群で３７６ｍｇ、およびＡｄ−ＬＫ８投与群で２７８ｍｇであると測定された。Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳを注射された場合、免疫付与された、もしくは免疫付与されなかったマウス群の両方の平均肺重量は２１８ｍｇであると測定されたが、Ａｄ Ｈ５＿８ＤＳ投与群の平均肺重量は、免疫付与については２４０ｍｇ、非免疫付与については２３０ｍｇであった。腫瘍の大きさに従って獲得されたスコアを調べると、ＰＢＳ投与群で１０７．８、Ａｄ−ＬＫ８投与群で６０．８であると測定された。Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳを注射された場合、免疫付与された群および免疫付与されなかった群はそれぞれ、２８および２７ポイントを獲得した。一方で、Ａｄ Ｈ５＿８ＤＳが投与された場合は、免疫付与された群および免疫付与されなかった群はそれぞれ、５７．２および３２．６ポイントを獲得した。総合すると、これらのデータは、Ａｄ Ｈ５／Ｓ１９＿８ＤＳは、ＨＡｄ５での免疫付与に関係なく、静脈注射された場合でさえ、抗腫瘍活性を示すことができることを示している。

本発明は上記の具体的な実施形態に関して記載されているが、様々な改変および変更が、当業者により、添付の請求項によって定義される発明の範囲内に入る発明になされると認識されるべきである。

Claims (12)

1. 配列番号１６のアミノ酸配列からなるヘキソンタンパク質を有するキメラアデノウイルス。
2. サルアデノウイルス血清型１９とヒトアデノウイルスとのキメラアデノウイルスである、請求項１に記載のキメラアデノウイルス。
3. ヒトアデノウイルスが、ヒトアデノウイルス血清型２、３、５、１１、２４、２６、３０、３４、３５、３６、４１、４８、４９、および５０からなる群から選択される、請求項２に記載のキメラアデノウイルス。
4. キメラアデノウイルスがさらに治療的導入遺伝子を含む、請求項１に記載のキメラアデノウイルス。
5. 治療的導入遺伝子が、腫瘍抑制遺伝子、抗原性遺伝子、細胞傷害性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、自殺遺伝子、抗血管新生遺伝子、および免疫調節遺伝子からなる群から選択される、請求項４に記載のキメラアデノウイルス。
6. 腫瘍抑制遺伝子が、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＤＰＣ−４／Ｓｍａｄ−４遺伝子、ＢＲＣＡ−１遺伝子、ＢＲＣＡ−２遺伝子、ＷＴ−１遺伝子、網膜芽細胞腫遺伝子、ＭＭＡＣ−１遺伝子、大腸腺腫様ポリポーシス遺伝子、ＤＣＣ（大腸癌において欠失した）遺伝子、ＭＭＳＣ−２遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、ＮＦ−２遺伝子、ＭＴＳ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、およびＶＨＬ遺伝子からなる群から選択され；
   抗原性遺伝子が、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、またはｐ５３であり；
   細胞傷害性遺伝子が、緑膿菌外毒素をコードする遺伝子、リシン毒素をコードする遺伝子、およびジフテリア毒素をコードする遺伝子からなる群から選択され；
   細胞増殖抑制遺伝子が、ｐ２１、網膜芽細胞腫遺伝子、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質遺伝子、サイクリン依存性キナーゼ抑制因子をコードする遺伝子、および増殖抑制特異的ホメオボックス（ＧＡＸ）遺伝子からなる群から選択され；
   自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコードする遺伝子、水痘チミジンキナーゼをコードする遺伝子、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードする遺伝子、ベータ−ラクタマーゼをコードする遺伝子、カルボキシペプチダーゼＧ２をコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０−２Ｂ１をコードする遺伝子、ニトロレダクターゼをコードする遺伝子、ベータ−グルクロニダーゼをコードする遺伝子、およびＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）をコードする遺伝子からなる群から選択され；
   抗血管新生遺伝子が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の抑制因子をコードする遺伝子、可溶化ＶＥＧＦ受容体をコードする遺伝子、アンギオスタチンをコードする遺伝子、エンドスタチンをコードする遺伝子、およびアポリポタンパク質（ａ）クリングルドメイン（ＬＫ８）をコードする遺伝子からなる群から選択され；
   免疫調節遺伝子が、ＣＤ１６をコードする遺伝子、ＣＴＬＡ−４をコードする遺伝子、ＩＬ２４をコードする遺伝子、およびＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項５に記載のキメラアデノウイルス。
7. 請求項１に記載のキメラアデノウイルスを含む組成物。
8. 請求項４に記載のキメラアデノウイルスを含む、哺乳類細胞に治療的導入遺伝子を送達するための組成物。
9. 請求項４に記載のキメラアデノウイルスを含む、癌を治療するための医薬組成物。
10. 遺伝子治療のための請求項１に記載のキメラアデノウイルスの製造方法。
11. 請求項１に記載のキメラアデノウイルスを含む、単離された宿主細胞。
12. 単離された宿主細胞がヒト細胞である、請求項１１に記載の単離された宿主細胞。

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