JP4843613B2 - 改良されたアデノウイルスベクターおよびその使用方法 - Google Patents

Description

本発明は医学分野に関するものであり、特に、ワクチンの成分中に治療的な核酸を含む組換えキメラアデノウイルスベクターを用いた予防及び治療の分野に関するものである。

発明の背景

組み換えアデノウイルスベクターは遺伝子治療の用途およびワクチンとして広く利用されている。これまでに、５１種類のアデノウイルスのセロタイプが同定された。遺伝子治療などの応用のために最も詳細に研究されているのはサブグループＣのアデノウイルスであり、特にセロタイプ２および５（Ａｄ２およびＡｄ５）が従来技術において広く利用されている。Ａｄ５の組み換え型はワクチン投与を含む様々な用途に使用されている。重要なことには、Ａｄ５ベクターを基にしたワクチンは、様々な動物モデルにおいて強力な防御免疫反応を誘発することが示されてきた。更に、Ａｄ５を基にした組み換えベクターが使用されたＨＩＶワクチンの投与の大規模な臨床試験が行われている（WO 01/02607、WO 02/22080、"Shiver et al. 2002"、"Letvin et al. 2002"、"Shiver and Emini. 2004"）。しかし、ヒト集団におけるＡｄ５特異的中和抗体（ＮＡｂｓ）の血清陽性率が高いため、組み換えＡｄ５ベクターを基にしたワクチンのＨＩＶおよび他の病原菌に対する利用はかなり限定される。抗Ａｄ５免疫の存在によってＡｄ５を基にしたワクチンの免疫原性が大幅に抑制されることが、マウスおよびアカゲザルを用いた研究から示されている。臨床試験のフェーズ１の初期データは、この問題がヒトにおいても起こる可能性があることを示す（"Shiver 2004"）。

（Ａｄ５などの）最も一般的なヒトアデノウイルスに過去に感染した個人が保有する既存免疫の存在を回避する有望な戦略の１つは、このような既存の免疫と遭遇しないアデノウイルスのセロタイプから組み換えベクターを作製することである。特に有用であると特定されたヒトアデノウイルスベクターはセロタイプ１１、２６、３４、３５、４８、４９、および５０をベースとしたものであり、これはWO 00/70071、WO 02/40665およびWO 2004/037294に示される（"Vogels et al. 2003"も参照）。稀なセロタイプであることが示されたことからアデノウイルス２４（Ａｄ２４）にも関心が持たれている（WO 2004/083418）。

サルアデノウイルスは通常ヒトに感染しないため、このサルアデノウイルスを用いても同様の戦略がとられる。ヒトの血清中でのサルアデノウイルスの血清陽性率は低い。しかしサルアデノウイルスがヒト細胞に感染できることが試験管内で示されたため（WO 03/000283、WO 2004/037189）、サルアデノウイルスをヒトに適用することは可能である。

アデノウイルスのセロタイプ３５（Ａｄ３５）のベクターをベースとしたワクチンが、抗Ａｄ５免疫によって有意には抑制されない強力な細胞免疫反応を誘発できることが示された。同様に、チンパンジーのアデノウイルスを用いると、抗Ａｄ５免疫から受ける影響が最小限である免疫応答が誘発されることが示された（"Farina et al. 2001"、"Pinto et al. 2003"）。中和抗体（ＮＡｂｓ）およびＣＤ^８＋Ｔリンパ球応答が共に抗Ａｄ５免疫に貢献することが最近示され、ここにおいてはＡｄ５特異的ＮＡｂｓが中心的な役割を果たすようである（"Sumida et al. 2004"）。この開発はとても有用なアプローチであるように思えるが、既存のＡｄ５免疫が存在しない条件では、Ａｄ３５ベクターをベースとしたワクチンはＡｄ５をベースとしたワクチンと比較して免疫原性が低くなることもまた、マウスを用いた実験から示された（"Barouch et al. 2004"）。

明らかに、この技術分野において、ホストに既存の免疫とは反応せず、その一方で免疫原性を保有し、ベクターの有する核酸内に挿入された異種核酸によってコードされるタンパク質に対して強い免疫応答を誘発する代替的なアデノウイルスベクターが必要とされている。

発明の概要

改良された遺伝子送達、ワクチン投与、および遺伝子治療のために新規に開発した組み換えアデノウイルスベクターが、本願明細書中で開示される。ある好適な実施例において、ベクターはアデノウイルスセロタイプ３５（Ａｄ３５）に基づいた組み換えアデノウイルスであり、ここでは、少なくともＡ３５のファイバーノブがＣＡＲ（Coxsackievirus and Adenovirus Receptor、コクスサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体）に結合するセロタイプのファイバーノブに置換されている。より好適には、このセロタイプのファイバーノブとはＡｄ５のファイバーノブである（その結果、ノブのみが置換されたＡｄ３５ｋ５と定義されるベクター、もしくは、ノブ、シャフト、およびテールの一部が置換されたＡｄ３５ｆ５と定義されるベクターとなる）。ファイバーのシャフトおよびテールはバックボーンのセロタイプ、すなわちＡｄ３５のものであって良い一方、本発明はまた、シャフト部位のセロタイプがファイバーノブのセロタイプと同一であるベクターにも関する。Ａｄ３５ｆ５においては、テールのうちの、バックボーンのセロタイプのまま残された領域によってカプシッドの他の部分との正常な相互作用が確保され、安定なベクターの作製が可能となる。本発明のベクターは、望みの治療的な核酸、好適にはワクチン投与の目的で使用可能である核酸を含む。

本発明は、ヒト集団のうちの大多数において存在する既存免疫の量が少なく、その一方でベクターに含まれる核酸のコードする抗原に対する強い免疫反応を誘発することのできる組み換えアデノウイルスベクターに関する。これは、Ａｄ１１、Ａｄ２４、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ４９、Ａｄ５０、などのアデノウイルスのセロタイプ、またはキメラカプシッドをもつサルアデノウイルスをベースにした組み換えベクターを作製することにより達成される。キメラカプシッドは、バックボーンのベクターとは異なるヒトアデノウイルスセロタイプのファーバータンパク質から部分的に成るファイバータンパク質を備え、最も好適な実施例においては、このファイバータンパク質が（ノブ領域を介して）ＣＡＲ受容体に結合する。ファイバーノブにはＣＡＲと優先的に結合するたくさんの種類のアデノウイルスを使用することが可能で、例えばサブグループＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦのヒトアデノウイルス、およびＣＡＲと結合するヒツジアデノウイルスなどがその例である。ファイバーノブ領域に用いるのに好適なアデノウイルスセロタイプはサブグループＣのヒトアデノウイルス、より好適にはＡｄ２およびＡｄ５である。

別の実施例においては、本発明によって作製したウイルスはサブグループＣのアデノウイルス、好適にはＡｄ５をベースとした組み換えアデノウイルスであり、この組み換えアデノウイルスは、Ｅ１領域の機能の削除によって複製欠損とされており、このウイルスのカプシッドのヘキソンタンパク質は、１つまたは複数の超可変領域（ＨＶＲ）を稀なアデノウイルスセロタイプのＨＶＲで置換したキメラタンパク質である。このような稀なアデノウイルスセロタイプは、ヒト集団中に含まれるほとんどの個体内において、ＮＡｂと遭遇することがない。ＨＶＲの提供のために使用するのに好適なセロタイプはＡｄ３５およびＡｄ４８である。好適には組み換えウイルスは、予防や治療の目的で宿主に運搬されるべく、望みの異種核酸を備える。

発明の詳細な説明

前述の通り、Ａｄ５を基にした組み換えベクターの利用は、過去に野生型のウイルスに感染したことによってほとんどのヒト個体に存在する中和抗体（ＮＡｂ）の存在によって妨げられる。ウイルスの表面に存在する様々なカプシッドタンパク質が宿主における抗体の産生を誘発するが、Ａｄ５特異的ＮＡｂの第一のターゲットはＡｄ５ヘキソンタンパク質であることが示された（Sumida et al. 2005）。このことから、ヘキソンタンパク質を既存のＮＡｂによって認識されなくなるように改変することによって、Ａｄ５に対するＮＡｂを既に保有する人、またはＡｄ５から過去に作られたワクチンを過去に接種された人、またはプライムブーストワクチン投与療法によってＡｄ５から作られたベクターを投与された人に有益となる改良アデノウイルスベクターを作製できる、という考えが生まれた。しかし、ヘキソンタンパク質を改変するのは容易ではなかった。ヘキソンタンパク質の完全な交換は一般に同一のＡｄサブグループに属すアデノウイルス間でのみ可能であり、その結果生存力の低いウイルスしか作製できなかった（"Youil et al. 2002"; "Gall et al. 1998"; "Roy et al. 1998"）。もしこれが制約となるならば、Ａｄ５をベースとしたベクターはサブグループＣに属する別のアデノウイルスのヘキソンタンパク質を含まなければならばならない。しかし、これらのうち全てと言わずともほとんどは、稀なセロタイプだとは言えないという点で無益である。ヒト集団中のほとんどの個体は、一度はサブグループＣのセロタイプに遭遇したことがある。既に存在するＮＡｂに出くわさないであろうセロタイプのヘキソンを使用するのが好適である。それらの稀なセロタイプの大部分はサブグループＢ（Ａｄ１１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ５０）およびＤ（Ａｄ２４、Ａｄ２６、Ａｄ４８、およびＡｄ４９）に存在する。

本発明の発明者らは、今回初めて、保存的なアプローチと既存の構造情報および配列情報を利用してヘキソン中の特定の部位を（再）同定することによって、ある特定部位を同定・交換すると、生存可能で十分に大きなタイターを持ち得る組み換えウイルスを作製することが可能であることを示した。ヘキソンタンパク質およびそれに関連した部位を提供するため使用するのに好適であるセロタイプはＡｄ１１、Ａｄ２４、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ４９、およびＡｄ５０であり、これらのセロタイプは遭遇する既存免疫が少ないことが知られている（WO 00/70071を参照）。より好適なのはＡｄ１１、Ａｄ２６、Ａｄ３５、およびＡｄ４８であり、Ａｄ４８が最も好適なセロタイプである。また、この観点では非ヒトアデノウイルスも興味深い。１つの好適な例はチンパンジーアデノウイルスＰａｎ９である。

同定された領域はヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）としても知られる７つの表面ループである。アデノウイルスのセロタイプ間でのヘキソンの可変性はこれらの７つのループ部に集中している（Crawford-Miksza and Schnurr. 1996）。当然のことながら、本発明は、実施例で概説しているＡｄ４８のＨＶＲの使用に限られるものではない。このことは、いくぶん広い定義での（表IIを参照）、およびいくぶんより限定された、より絞られた定義での（表IV参照）Ａｄ５、Ａｄ１１、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ４９、およびＡｄ５０におけるＨＶＲの同定によって更に実証される。Ａｄ４８は、遭遇する既存免疫が少なく、Ａｄ５によって例証されるサブグループＣアデノウイルスの公知の利点（強力な免疫原性、容易に生産できること、その他）に加えて稀なセロタイプの利点（既存免疫が少ない）の恩恵を受けるキメラアデノウイルスを作製するのに便利である他の全てのセロタイプの代表として用いた。Ａｄ３５などの他のセロタイプのバックボーンを使用することが好適とされているプライムブーストワクチン投与療法について考えると、明らかに、プライミングベクターに対抗して生成したＮＡｂと遭遇することのないベクターをブーストに用いるのが有益である。したがって、Ａｄ１１、Ａｄ２４、Ａｄ２６、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ４９、Ａｄ５０などと、他の稀なセロタイプ（上記の稀なセロタイプのいずれか、など）のＨＶＲの組み合わせもまた、本発明に含まれる。そのようなベクターの限定されない例は、Ａｄ５ＨＶＲ４８、Ａｄ５ＨＶＲ３５、Ａｄ３５ＨＶＲ１１、Ａｄ３５ＨＶＲ４８、Ａｄ１１ＨＶＲ３５、およびＡｄ１１ＨＶＲ４８で、少なくとも１つ、より好適には６つ、そして最も好適には７つのＨＶＲがセロタイプ間で交換されたものである。したがって、最低でも１つのＨＶＲを稀なセロタイプから取り出し、バックボーンセロタイプのヘキソンに導入する。ＡＤ５由来の７つ全てのＨＶＲをＡＤ４８の対応するＨＶＲで置換すると、生存可能で生産可能なベクターが生成し、このベクターは空のＡｄ５ウイルスによって免疫化したマウスにおいて、既存免疫の接触をほとんどおこさなかった。しかし、（ウイルスゲノムの左のＩＴＲから右のＩＴＲの向きで見て）１つ目のＨＶＲのみが置換された場合には効果がみられなかった。これは１つのＨＶＲの置換では十分でないということではない。１つの領域の免疫原性が他の領域の免疫原性よりも高いと考えられており、同定された７つの領域のうちどれが最も寄与するか、そして特定の環境においてや特定の用途のためにはどのＨＶＲを置換しなくてもかなわないかはまだ解明されていない。ある個人が、別の個人と比較して異なったＨＶＲに対して異なった免疫応答を示すということがある可能性もある。更に、キメラのヘキソンを備えたベクターが宿主におけるＮＡｂの活動があまり多くない環境においてうまく機能する可能性もある。提供する実施例における既存免疫は、空のＡｄ５ベクターの１０^１０ｖｐの２連続投与により、非常に高くしてある。いずれにせよ、宿主に既存のＮＡｂによって検出されないベクターを得る最高の機会を与えるため、ヘキソンタンパク質中の全てのＨＶＲを置換するのが最も好適である。

改良アデノウイルスベクターの開発のために、まずＡｄ５特異的中和抗体（ＮＡｂ）のエピトープをマッピングした。ヒト集団におけるＡｄ５の血清陽性率およびタイターが非常に高い（米国では約５０％、発展途上国の一部では約９０％）ことが明らかになった。更に、本明細書で明らかにしているように、機能的に有意であるＡｄ５特異的ＮＡｂは、ほとんどヘキソンタンパク質にのみを標的とすることがわかった（"Sumida et al. 2005"を参照）。対照的に、ファイバータンパク質に対するＡｄ５特異的抗体は天然に存在するであろう適切な環境下、すなわちヒトにおいて見出される抗Ａｄ５ＮＡｂタイターと同じ環境では有意にＡｄ５ワクチンの免疫原性を抑制することができない。Ａｄ５とは対照に、ヒト集団中のＡｄ３５およびＡｄ１１の血清陽性率およびタイターは世界の多くの地域でとても低いことがわかった。

本発明はＡｄ１１、Ａｄ２４、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ４９、およびＡｄ５０などの稀な（もしくは少なくとも中和されることが稀な）Ａｄセロタイプのヘキソンを有し、そして好適には、サブグループＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦに属すほとんどのヒトアデノウイルスのセロタイプおよびサルアデノウイルスのようにＣＡＲ受容体と相互作用するセロタイプの、少なくともファイバーノブ領域を有する新規のアデノウイルスベクターに関する。ヒト集団中ではほとんどみられないＮＡｂに対するヘキソンタンパク質を有し、バックボーンベクターとして用いるのに好適なものはＡｄ１１とＡｄ３５である。バックボーンベクターとして使用するのに、およびファイバーを利用するのに好適なセロタイプはＡｄ５である。免疫反応において重要な役割を果たす細胞が樹状細胞であることは本技術分野においてよく理解されているが、樹状細胞は免疫原性のあるペプチドをそれらの細胞表面上に発現し、それによってこのペプチドに対する強力な免疫反応を誘発することができるためである。樹状細胞を非常に効率的に感染させることができるため本技術分野において好適とされてきたベクターはアデノウイルスサブグループＢに属するもの、もしくは、例としてWO 02/24730およびWO 00/70071参照の、効率的な様式で樹状細胞を認識し感染させるアデノウイルスのファイバータンパク質を有するベクターである。これらのベクターはおそらくＣＤ４６をレセプターとして用いる。驚くべきことに、本明細書で示す通り、ＣＡＲを通じて相互作用することが知られているアデノウイルスベクター、すなわちＡｄ５の少なくともファイバーノブを有するベクターを、既存免疫に遭遇することの少ないベクター上にクローンすると、免疫反応の向上がみられることを本発明の発明者らが見出した。このことは、樹状細胞を経由した望ましい免疫反応を考慮するとかなり予想外である。

当然のことながらアデノウイルスベクターが結合する特定の細胞レセプターの認識に主としてかかわっている部位がノブ領域であり、ノブ領域は当業者によって（配列の比較およびレセプター間相互作用についての一般的な知識によって）ファイバータンパク質の他の部分と容易に区別される。Ａ５ファイバーノブが細胞表面でＣＡＲと相互作用して、ウイルスの進入に先立って効率的にウイルスを結合させるのを仲介し、その後のウイルス進入をペントンベースおよび細胞内インテグリンが更に促進する（"Bergelson et al. 1997"; "Bewley et al. 1999"; "Roelvink et al. 1998 and 1999"; "Wickham et al. 1993"）のに対し、Ａｄ１１およびＡｄ３５などのＢグループのウイルスはＣＤ４６を介して相互作用する。本発明は、少なくとも（ノブ領域によって決定される）レセプター結合領域が交換されたアデノウイルスベクターに関する。したがって後者のベクターは、バックボーンベクター由来のシャフトおよび／またはテールの一部、などといったファイバー領域を備える可能性がある。実際、他のカプシッドタンパク質との正常で安定な相互作用を確保し、安定な組み換えベクターを得るために、バックボーンベクターのテール領域の少なくとも一部を使用することが好ましい。

本発明によるキメラアデノウイルスベクターは、単独のＡｄ５またはＡｄ３５をベースとし、キメラのファイバータンパク質を持たないベクターよりも、ワクチンや遺伝子治療のために、より効果的である。Ａｄ５とＡｄ３５とのキメラファイバーを有するキメラアデノウイルスは当技術分野で周知である。少なくともノブ領域がＡｄ３５に由来するキメラファイバーを有するＡｄ５ベクターが示された（WO 00/31285, WO 00/52186; WO 02/24730; "Shayakhmetov et al. 2003"; "Rea et al. 2001"）。Smith氏ら(2003)は、テールおよびシャフトがＡｄ３５のもので、ノブ領域がＡｄ５のものであるキメラファイバーを示した。 これらの引例によるベクターは全てＡｄ５をベースとしており、ウイルスベクターのカプシッドにＡｄ５ヘキソンが存在するため、これらのベクターは依然既存免疫に遭遇する。Ophorst氏ら(2004)の提供したデータによりこの現象が確認できた。複製欠損組み換えＡｄ３５ベクターおよびその作製方法もまた公知技術であり（WO 00/70071; WO 02/40665）、Ganesh氏ら (2003)はＡｄ３５を基にしたベクターで、Ａｄ３５のファイバーノブをＡｄ５のファイバーノブで置き換えたファイバーを備えたものの使用を公表した。しかし、ベクターはマーカー遺伝子（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ）を含み、トランスダクション効率が低かった。結果として、Ganesh氏らは、Ａｄ３５のノブをＡｄ５のノブで置き換えたベクターをベースとしたワクチンの開示または示唆は行わず、言うまでもなくこのワクチンの使用による利益についても述べなかった。Ganesh氏らは、Ａｄ３５をベースとしたベクターで、完全なＡｄ５ファイバーを有するものについても発表した。このベクターはキメラファイバーではなく、完全なＡｄ５ファイバーを備える点で本明細書におけるベクターを異なることを留意しなくてはならない。Ganesh氏らは、部分的にファイバーを置き換えるとトランスダクション効率の低下が起こったと警告する。本発明によるベクターは高いトランスダクション効率を示し、一方キメラファイバーは残っているカプシッドにおける安定な結びつきを保証する。当業者で、ワクチンの用途のために、樹状細胞を効率的に感染させることが知られているセロタイプ（例えばＡｄ１１、Ａｄ３４、およびＡｄ３５といった、サブグループＢに属するものなど）のファイバーノブを、基本的にＣＡＲを通して細胞を感染させるセロタイプのファイバーノブで置き換えようと考えるものはいないだろう。

宿主によるアデノウイルスベクターに対する中和活性は主にヘキソンタンパク質に対するＮＡｂｓに対するものであるため、アデノウイルスベクターは、Ａｄ５で例示される高度に中和されたセロタイプに基づいてもよく、そこでヘキソンは、Ａｄ１１、Ａｄ２４、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ４９、およびＡｄ５０などの稀にしか中和されないセロタイプのヘキソンと交換されている。そのようなベクターはＡｄ５ｈ３５（Ａｄ５をベースとしたベクターで、Ａｄ５のヘキソンタンパク質の代わりに、Ａｄ３５のヘキソンタンパク質を備えたもの）などと称される。当業者は、本明細書に示される情報および当技術分野で周知の情報に基づいてあらゆる異なった組み合わせを構想し、作り出すことができる。ヘキソンを完全に交換するのは難しいということが明らかになった（"Gall et al. 1998"; "Youil et al. 2002"）。キメラのヘキソンタンパク質を構築する新しく、有用な方法の１つを実施例に示す。異なったセロタイプのヘクソンタンパク質を用いてキメラのカプシッドを備えたベクターを作製する別の方法はWO 00/03029の実施例８に示される。

本発明による組み換えアデノウイルスベクター、すなわち、ヒト集団中で遭遇する既存免疫の活性が一般的に低いセロタイプ（Ａｄ１１、Ａｄ２４、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ４９、およびＡｄ５０に加えて、ある特定のサルアデノウイルス）をベースとしたもので一般的に高い免疫応答を誘発するアデノウイルスのノブ領域を有するものは、一般的に高い免疫応答を誘発するアデノウイルス、および世界人口のうちの高い割合が持つ既存免疫によって検出されないヘキソンタンパク質を有することから既存の中和活性を逃れるアデノウイルス、のどちらよりも優れる。言い換えると、またここに示されるように、Ａｄ３５ｆｉｂ５およびＡｄ３５ｋ５は共に、Ａｄ５およびＡｄ３５の双方よりも優れている。

ヒト集団中に抗Ａｄ５免疫が高いレベルで存在するため、少なくともマウスおよびサルを使って行った実験に基づくと、Ａｄ５ベクターは抗ベクター抗体によって実質的に抑制される。ヒト集団中に存在する抗Ａｄ３５免疫のレベルは低いため、この点においては、Ａｄ３５およびＡｄ３５に関連するベクターはＡｄ５よりも実質的に有利である。言い換えると、Ａｄ３５、Ａｄ３５ｆｉｂ５、およびＡｄ３５ｋ５ベクターは抗ベクター免疫によって実質的に抑制されはしない。しかし、抗原性の導入に対する抗体という観点からは、Ａｄ３５ベクターをベースにしたワクチンの免疫原性はＡｄベクターをベースにしたワクチンの免疫原性と比べて低い。

重要なことに、中和されにくいベクターであって、高い免疫原性を有している異なったベクターの（異種の）ノブ領域を少なくとも備えたものが、その固有のファイバーを備えるバックボーンベクターよりも、実質的により強力な免疫応答を誘発することが、本発明の発明者らによって初めて示された。したがって、そのようなベクターは、現在使用されているアデノウイルスベクターよりも技術面および実用面で優れている。当業者はここに提供する知識を用い、同じ原理に基づいて、他のアデノウイルスベクターをクローニングすることが可能であろう。例えば本発明は、免疫原生のヒトアデノウイルスのファイバーのノブ領域を備えた組み換えサルアデノウイルスにも関する。組み換えサルアデノウイルスとは別に、組み換えウシおよびイヌアデノウイルスなどの、その他の非ヒトアデノウイルスを本発明は包含する。本発明はまた、他の免疫原生のアデノウイルスの少なくともノブ領域を有し、バックボーンベクターとして使用できるその他の中和されにくいヒトアデノウイルスにも関連する。異なった組み合わせ方は無数にあるが、アデノウイルスの少なくともヘキソンタンパク質が高レベルの既存免疫と遭遇してはならない一方で、少なくともノブ領域がＣＡＲレセプターの認識を行い、ベクターが投与される宿主内での高い免疫応答をもたらすことを請け負うという点は限定される。当業者は、当技術分野の一般的な知識を用いてこれらの特徴を見分け、既存免疫を判断し、誘発される免疫応答のレベル、本発明において概説する組み換え（キメラ）ベクターを得るための方法を判断することができるだろう。

Ａｄ３５ｋ５ワクチンベクターの強力な免疫原性によって、Ａｄ５ファイバータンパク質が機能的に重要な役割を果たしていることが示唆される。Ａｄ５ファイバーノブは、高親和性レセプターＣＡＲへの結合を左右し、また、ウイルス粒子の核への効率的な細胞間輸送において重要な役割を果たす。Ａｄ３５ｋ５ベクターの高められた免疫原性は、既知であるＡｄ５ファイバーノブの生物学的機能をおそらく反映するが、詳細なメカニズムはまだ解明されていない。組み換えＡｄ３５ｋ５ベクターは中和において主に組み換えＡｄ３５ベクターの性質を示し、ここに示すように、低い／中程度のレベルの抗Ａｄ５免疫から効果的に逃れた。これらの観測は、Ａｄ５特異的ＮＡｂｓは主としてＡｄ５ヘキソンタンパク質を標的にしていることを示す過去の研究結果と一貫している。Ａｄ３５ファイバータンパク質を含んでいるＡｄ５ベクターが抗Ａｄ５免疫を回避することができなかったという観測もまた、このモデルを裏付ける（Ophorst et al. 2004）。しかし、ここに示すように、高レベルの抗Ａｄ５免疫はＡｄ３５ｋ５ベクターの免疫原生を減少させることが実のところ可能であり、これはおそらくタイターは低いが明確に検出可能であるＡｄ５ファイバータンパク質を標的としたＮＡｂｓの存在が反映されたものである。抗Ａｄ５免疫によるＡｄ３５ｋ５の免疫原生の低下は部分的でしか無く、極端に高いＡｄ５特異的ＮＡｂタイターにおいてのみ認められたという点には注意すべきである。

Ａｄ３５ｋ５ベクターの別の制限は、Ａｄ３５ベクターにおいて典型的に観測される値の約１０倍の、比較的高いｖｐ／ｐｆｕ値にある可能性がある。この観測結果は、キメラのファイバータンパク質の導入によってウイルスの保全および安定性が損なわれている可能性があることを示唆するが、このことは更に調査し確認する必要がある。

ここで概説するように、アカゲザルを用いたＡｄ５、Ａｄ３５ｋ５、およびＡｄ３５ベクターの免疫原性の比較の研究は、マウスから得られた結果を裏付けるものとなった。マウスはＡｄ３５の最適なレセプターであるＣＤ４６を持たず、それ故Ａｄ３５ベクターの免疫原性が過小評価される可能性があるため、これは適切である。アカゲザルにおいては、Ａｄ５ベクターは高タイターのベクター特異的ＮＡｂｓを迅速に誘発し、推測どおり、ブーストによる同種免疫を効果的に妨げた。対照的に、Ａｄ３５およびＡｄ３５ｋ５ベクターの双方は、Ａｄ５ベクターと比較してより低いタイターのベクター特異的ＮＡｂを誘発し、同種のベクターの再投与に従ってこれらの免疫応答のブーストを促進した。Ａｄ３５ｋ５ベクターを投与されたサルにおいて観測された強力な免疫応答は、このベクターが強力な免疫応答をプライムすると共に、効果的にブーストされることが可能であるという事実をおそらく反映していると推測される。

本発明は、異なったＡｄセロタイプの有益な免疫学的および血清学的特性を融合するために、キメラのカプシッドを有する組み換えＡｄベクターを構築することが可能であることを示す。キメラＡｄベクターの作製は、ワクチン投与および遺伝子治療双方のための第２世代の改良Ａｄベクターへとつながる新規の戦略である。

好適な実施形態によると、本発明は、ＣＡＲに結合するアデノウイルスのセロタイプの少なくともノブ領域を備えたキメラのファイバータンパク質を備えた複製欠損の組み換えアデノウイルスセロタイプ３５（Ａｄ３５）ベクターに関し、ここにおいて、この組み換えベクターは更に、興味の対象である治療的な核酸を備える。治療的な核酸とは、哺乳類、好ましくはヒトの治療的および／または予防的処置に役立つタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドなどの治療的なタンパク性の物質をコードする核酸、と定義される。治療的なタンパク質の例として、腫瘍ワクチンにおいて免疫応答を誘発するタンパク質が挙げられる。他の例は、遺伝子治療に使用されるものなど、遺伝的疾患の治療に有用なタンパク質である。好適な治療的なタンパク質とは、バクテリア、寄生虫、またはウイルスなどの感染力をもつものに由来した、またはこれらをベースとした、またはこれらから（直接）クローンニングされたタンパク質である。アデノウイルスベクターはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＳＩＶ、エボラウイルス、狂犬病ウイルス、単純疱疹ウイルス （ＨＳＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、などのウイルスに対するワクチン摂取に非常に適切である。アデノウイルスの核酸にコードすることのできるＨＩＶ由来の抗原の例はnef、gag、pol、およびenvである。ＨＳＶの抗原の例は抗原９Ｄである。マラリアを起こす寄生虫などの寄生虫に由来する治療的なタンパク質もまた、本発明のベクターに導入することができる。これらのベクターに組み込むのに特に好適なタンパク質は、スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質およびＬＳＡ−１などのマラリア原虫由来のものである。他の好適なタンパク質はマイコバクテリウム株のタンパク質、特にヒト結核菌などの、結核を起こすものである。このバクテリア由来の好適な抗原は１０．４、８５Ａ、８５Ｂ、および８５Ｃ抗原であり、これらもまた本発明によるベクターに導入することが可能である。in vitroの研究においてマーカーとして使用されるタンパク質は概して治療的なタンパク質とはみなされないため、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、またはＣＡＴは治療的とみなされない。

抗原を発現するために使用することが可能である適切なプロモーターおよびポリ（Ａ）配列は周知の技術であり、ＣＭＶ、Ａｄ２、ＭＬＰ、ＳＶ４０を含むがこれらに限定されない。適切な転写終止配列は例としてＳＶ４０またはＢＧＨから得ることができる。抗原のコード配列は哺乳類、好適にはヒトにおける最適な発現のためにコドン最適化することが可能である。コドン最適化の方法は周知の技術である。

本発明はアデノウイルスセロタイプ１１、２４、２６、３４、３５、４８、４９、および５０からなる群から選択された複製欠損の組み換えアデノウイルスに関し、このアデノウイルスはＣＡＲに結合するアデノウイルスのセロタイプの少なくともノブ領域を含むキメラのファイバータンパク質を含み、更にこの組み換えベクターは興味の対象である治療的タンパク質または抗原タンパク質をコードする異種核酸を含む。好適なセロタイプはサブグループＢのセロタイプ、より好適にはセロタイプ１１、３４、および３５であり、最も好適なのはセロタイプ３５（Ａｄ３５）である。これらのセロタイプは、世界中の健康な個人から摂取されたヒト血清サンプルにおいて既存の中和免疫に遭遇する確率が非常に低いため、本発明はこれらのセロタイプに関する。本発明において使用するキメラのファイバータンパク質は、少なくとも異なった２つのアデノウイルスセロタイプからなる部分から構成され、ここにおいて、ノブ領域は、ＣＡＲに結合するアデノウイルスのものである。ベクターのカプシッドとの正常な相互作用を通してベクターの安定性を増すために、ファイバータンパク質のテール領域はバックボーンベクターのものであることが好適である。好適な実施形態において、ＣＡＲに結合するノブ領域はサブグループＣに属するアデノウイルスのセロタイプ、より好適にはセロタイプＡｄ５のファイバーのものである。

本発明で使用する興味の対象である治療的タンパク質とは、遺伝子治療など、哺乳類の治療に役立つタンパク質に関する。本発明で使用する興味の対象である抗原タンパク質は、宿主、または宿主細胞において発現するとこれに対する免疫応答が生じるタンパク質に関する。この免疫応答は様々な場合のワクチン投与において必要である：１つの例は、興味の対象である抗原タンパク質に対する免疫応答がそのタンパク質を発現する腫瘍細胞の除去に加担する腫瘍ワクチンであり、別の好適な応用は、ウイルス、バクテリア、酵母、または寄生虫などの病原体による宿主の感染を予防、または有意に阻害するためのワクチン投与などの予防治療である。従って、上記の望みの抗原タンパク質はウイルス、バクテリア、寄生虫、または酵母のタンパク質を含む。本発明による組み換えアデノウイルスはまた、既に起こった感染の治療として興味の対象である抗原タンパク質に対する免疫反応を発生させ、複製、パッケージング、その他を防ぐために使用することも可能である。言い換えると、既に感染した宿主から次の宿主へとウイルスが広がるのを阻止するためにこのベクターを使用することも可能である。

ある実施形態では、本発明による組み換えアデノウイルスは、異種プロモーターの支配下にある異種核酸を含む。

本発明の好適な態様においては、上記の抗原タンパク質はウイルスのタンパク質を含み、ここにおいて上記ウイルスはレトロウイルス、ＨＳＶまたはエボラウイルスであり、もしも抗原タンパク質がレトロウイルスの場合はウイルスがサルまたはヒトの免疫不全レトロウイルスであるのが好適であり、ここにおいて上記の異種核酸はｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｎｅｆからなる免疫不全ウイルスタンパク質の群をコードする遺伝子の中から選んだ１つまたは複数の遺伝子を含むことが望ましい。

本発明の別の態様において、上記の興味の対象である抗原タンパク質はマラリアを引き起こす寄生虫のものであり、ここにおいて、上記タンパク質はマラリア原虫、より好適には熱帯性マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質、または肝臓特異抗原（ＬＳＡ−１、ＬＳＡ−３）、またはその免疫原性のある部分であることが好適である。

本発明は異種核酸およびキメラファイバーを備えた新規の複製欠損の組み換えアデノウイルスであり、ここにおいて上記アデノウイルスは、薬剤としての使用のためにアデノウイルスセロタイプ１１、２４、２６、３４、３５、４８、４９、および５０からなる群から選択される。

本発明は更に、マラリア感染、エボラ感染、ＨＳＶ感染、ＨＣＶ感染、またはＨＩＶ感染の予防的または治療的な処置のための薬剤の製造に、本発明による組み換えアデノウイルスベクターを用いることに関する。

特に好適なある実施形態において、本発明は、図２Ｂの下線部のアミノ酸配列をもつＡｄ５ファイバーのノブ領域と、Ａｄ５とは異なったセロタイプのヘキソンタンパク質、より好適には中和されにくいアデノウイルスのセロタイプのヘキソンタンパク質、を備えたキメラの複製欠損の組み換えアデノウイルスに関する。中和されにくいセロタイプとは、健康な個人からのサンプルのうち少数でのみ、ＮＡｂｓの形での既存の中和活性に遭遇するセロタイプである。ある特定の実施形態において、本発明はＡｄ３５のヘキソン、および、配列番号２のアミノ酸配列を有すキメラのファイバータンパク質を含む、キメラの複製欠損の組み換えＡｄ３５ベクターに関する。
ヘキソンのＨＶＲの交換

優勢なＡｄ５特異的ＮＡｂｓは主としてＡｄ５ヘキソンタンパク質を標的としているため、標的突然変異によってヘキソンを交換した新規の組み換えＡｄ５ベクターが優勢なＡｄ５ヘキソン特異的ＮＡｂｓを逃れることができるかもしれないと推論した。これは新しい発想ではなく、このような‘ステレス’アデノウイルスベクターを生産しようという試みは当技術分野において何度かなされた。しかし、以下で概説するように、成功したものは無かった。

異なったセロタイプ由来のヘキソンタンパク質間でのアミノ酸の多様性の９９％以上が７つの比較的短い超過変領域（ＨＶＲ）に集中しているようであり、ＨＶＲはヘキソンの露出した部位に位置することがCrawford-MikszaおよびSchnurr (1996)によって同定された。これらの作者らは１５の異なったアデノウイルス（Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６、Ａｄ８、Ａｄ９、Ａｄ１２、Ａｄ１５、Ａｄ１６、Ａｄ３１、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、ＢＡＶ３およびＭＡＶ１）のヘキソンタンパク質を比較した。７つのＨＶＲはループ１およびループ２（ｌ１およびｌ２とも呼ばれる）にある２５０の可変残基中に同定され、ここにおいて、ＨＶＲ１〜ＨＶＲ６はループ１に位置し、ＨＶＲ２はループ２に位置する。Crystalおよびその同僚は、Crawford-Miksza氏ら(1996)の発見に基づき、バックボーンベクター（Ａｄ５）のループ１およびループ２の全体をＡｄ２のループ１およびループ２で置き換えた（WO 98/40509; US 6,127,525; US 6,153,435参照）。また、ループ２のみを置き換えたベクターも作製した。生存可能なウイルスが生成した。Ａｄ２およびＡｄ５は共にサブグループＣに属すアデノウイルスで、２つのループとも置き換えても依然交差中和がみられ、少なくとも同じサブグループのもの同士で交換を行わない場合には、このような交換によっては、野生型アデノウイルスのヘキソンタンパク質を標的とした中和抗体の認識を減少させたり、認識できなくなるようなベクターをもたらさないことが示された。それにもかかわらず、目的のベクターを得るため、彼らはＡｄ５のループをＡｄ７のループで置き換えることも試みた。これらの試みは失敗し、生存可能なウイルスは生成せず、少なくともCrawford-Mikszaの行ったＨＶＲの同定に基づいては、１つのサブグループから他のサブグループへの交換は行うことができないことが示された。当然、ウイルスのゲノム構造の知識が手元にあるため、遺伝子組み換えは一般的な分子生物学の技術によって実行することが可能で、組み換え（キメラ）ウイルス全体をコードするプラスミド／コスミドが作製できる。しかし、原因は不明だがおそらくヘキソンの複雑な構造およびカプシッド形成においてそれが果たす役割というかなり重大な側面から、ヘキソンをコードする領域が組みかえられた場合、生存可能なウイルスは得られなかった（Rux et al. 2003）。Gall氏ら(1998)は、ヘキソン全体を置き換えるのではなく、外部のループのみを置き換えることを提案した。また、ペントンなどの他のカプシッドタンパク質が有意な中和エピトープを有する可能性があり、これによってＡｄ５とＡｄ２の交換の失敗が説明できる可能性があることも述べられた。

本発明の発明者らは、Crawford-MikszaおよびSchnurr (1996)に従って、またRuxおよびBurnett (2000)によって更に概説される通り、Ａｄ５のＨＶＲの代わりにＡｄ３５またはＡｄ４８のＨＶＲを備えたキメラのヘキソンタンパク質を持つ、Ａｄ５をベースとしたキメラアデノウイルスを作製しようと試みた。この試みは失敗した。この結果は、異なったサブグループ由来のヘキソンの一部を交換すると組み換えウイルスが生成しなかったというCrystal氏らの発見（上記参照）と一致した。

この事態に対応するために、Rux氏ら(2003)は、Ａｄ２およびＡｄ５のヘキソンの構造に新規の高解像度の結晶学的な改良を施し、それまでに発見されていたＡｄ２およびＡｄ５ヘキソンの構造の違いを解析した。これによりヘキソンタンパク質内の領域があたらしく定義され、ＨＶＲが７つから９つとなった。Rux氏ら(2003)はまた、アデノウイルスをベースとした新規のベクターを設計する際、ヘキソンタンパク質内で、操作してはならない部分を同定した。

本発明の発明者らはまた、Rux氏ら(2003)によって提供された定義に基づいて、置換されたＨＶＲを有するキメラのヘキソンタンパク質を備えたキメラアデノウイルスの作製を試みた。しかし、再び、生存可能なウイルスは生成しなかった。明らかに、従来技術によって提供されるヘキソンのＨＶＲの定義に基づくと、バックボーンベクターと他のセロタイプの間で、少なくとも異なったサブグループのアデノウイルスセロタイプ間で、１つまたは複数のＨＶＲを交換した組み換えアデノウイルスが生成することは不可能である。

本発明の発明者らは、Crawford-MikszaおよびSchnurr (1996) の同定した７つのＨＶＲとも、Rux氏ら(2003)の同定した９つのＨＶＲとも異なった、７つのＨＶＲをヒトアデノウイルス内に同定した。本発明による幅広い定義を表IIに示し、表IVにより絞られた定義を提供する。これらのＨＶＲのみを置き換えると、生存可能なウイルスが生成した。発明者らの知る限りでは、ループ全体を置き換えるのではなく、それぞれのＨＶＲを置き換えることによってキメラのヘキソンタンパク質を含むキメラアデノウイルスを作製するのに成功したのはこれまでで初めてである。キメラのヘキソンタンパク質を備えた組み換えアデノウイルスで、ヘキソンが２つの異なったサブグループのアデノウイルスセロタイプからなるものを得ることに成功したのも初めてである。ＨＶＲの再定義の概念的基礎は、保存されるアミノ酸を接合部として用いることである。それにもかかわらず、アミノ酸を１つ、２つ、あるいは３つ、Ｎ末端および／またはＣ末端側にずらしても、生存可能なベクターを得られる可能性があるという点は無視してはならない。しかし、当技術分野で過去に提供された定義はキメラのヘキソンを有する生存可能なベクターを提供するのに十分で無かった。わずかにシフトさせたものもまたよい結果を提供することがあることから（表IIを表IVと比較して参照）、本発明で提供する定義は厳密にとらえすぎるべきではない。好適には、同定したＨＶＲ配列（配列番号１７〜７９および８８〜１５０に代表される）をセロタイプ間で交換するのが望ましい。

実施例にあるように、１つまたは複数のＨＶＲをＡｄ３５（サブグループＢ）またはＡｄ４８（サブグループＤ）のものと交換したものを含むＡｄ５をベースにしたベクターを構築した。明らかに、１つまたは複数のＨＶＲを交換することは可能である。ＮＡｂｓは複数のＨＶＲのうちどれを標的にすることも可能であるため、バックボーンベクターの野生型のＨＶＲの全てとはいかなくともほとんどを、稀なセロタイプのＨＶＲで交換することが望ましい。一方で、そのような大規模な交換によって、生存可能なベクターを生産するのが容易でなくなる可能性がある。バックボーンベクター（例としてＡｄ５）に含まれると同定された全７つのＨＶＲを稀なセロタイプ（例としてＡｄ４８）の対応する７つのＨＶＲで置き換えることが可能だということがここにおいて示される。これはまた、表IVの定義によるＨＶＲ^＊の交換によって生存可能なウイルスが得られることも示唆する。

ＨＶＲとＨＶＲの間のスペーサー領域はバックボーンセロタイプのものであり続け、タンパク質の正常なフォールディングを請け負うことが望ましい。好適なバックボーンはＡｄ５であるが、Ａｄ２などの、他の、一般的に使われ、広く適用されている、サブグループＣに属するセロタイプをバックボーンとして使用することも可能である。ＨＶＲの交換の際、好適には少なくとも１つ、より好適には２つ、更により好適には３つ、更により好適には４つ、更により好適には５つ、更により好適には６つ、そして最も好適には７つのＨＶＲを交換する。

抗Ａｄ５免疫の存在下では、本明細書で示す通りに作製したＡｄ５ＨＶＲ３５ベクターおよびＡｄ５ＨＶＲ４８ベクターは、Ａｄ５に感染した個人のＡｄ５のヘキソンタンパク質を主として標的にするＮａｂｓが、Ａｄ３５およびＡｄ４８のヘキソンのＨＶＲを通じては中和を行うことができないため、組み換えＡｄ５ベクターよりもかなり免疫原性が高い。この特徴は、Ａｄ１１、Ａｄ２４、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ４９、およびＡｄ５０から選択可能な、全ての公知の稀なセロタイプから採取された全てのＨＶＲについて成り立つ。

下に示す通り、Ａｄ５の７つのＨＶＲの代わりにＡｄ４８の全７つのＨＶＲを含むＡｄ５ＨＶＲ４８（１〜７）ウイルスは、Ａｄ５ウイルスを予め注射することによって誘導される既存免疫によって妨害されないウイルスとなる。このことから、Ａｄ５をベースとしたベクターを数多くの場面、例えばプライムベクターとブーストベクターのレセプター認識が同一であることが要求されるプライム・ブースト療法において、使用することが可能となる。他の適用としては、処置に先立って野生型のＡｄ５に感染した経験のある個人へ、Ａｄ５ベクターをベースとしたワクチン接種や医療適用を行うことであろう。

本明細書に示したＨＶＲの同定法に基づくと、バックボーンベクターと他のアデノウイルスセロタイプの数多くの組み合わせが実行可能である。この知識は全ての公知のヒトおよび非ヒトアデノウイルスのヘキソンに適用できる。プライム・ブースト療法が必要な際（Ａｄ５をベースとしたベクターが必要な場合に限らない）、本明細書において提供する知識を応用して、ステレス能力、すなわち、過去に使用したウイルスのヘキソンＨＶＲに対する既存免疫を回避する能力、を有するベクターを構築することが可能である。当然のことながら、本明細書において示すキメラＨＶＲベクターは、当技術分野で公知な技術を用いて更に改良することが可能である。例えば、特定なターゲット能力を持つようファイバーを改変することが可能である（例として、サブグループＢに属すウイルスのファイバーノブをサブグループＣをベースとしたベクターに組み込むと、平滑筋細胞、初代線維芽細胞、樹状細胞、その他を標的にするようになる可能性がある）。そのようなベクターの例は、例えばＡｄ４８のＨＶＲ、および、例えばＡｄ３５の少なくともファイバーノブ（レセプターの認識の主とした決定因子）を備えたＡｄ５をベースとしたベクターである。このようなベクターは、ＨＶＲがキメラであるヘキソンを備えたアデノウイルスベクターに関する本発明の範囲内である。

当業者は、本明細書において提供する知識を用いて、１つまたは複数のＨＶＲを他のアデノウイルスのＨＶＲで置き換えた生存可能な組み換え複製欠損アデノウイルスを構築および生産することが可能であろう。更に、本明細書で提供されたＨＶＲの配列により、それらの配列を取り除いてヘキソン中のこの部位を用い、他の物質、例えばアデノウイルスを（in vivoおよびin vitroで）望みの細胞にターゲットするためのリガンド、in vivoでアデノウイルスを追跡するための放射性結合部位、およびＢ細胞の特定のエピトープなどを導入することが可能である（"Worgall et al. 2005"に記載されている）。

本発明は第１のサブグループに属するセロタイプをベースとした組み換え複製欠損アデノウイルスのバッチに関し、該アデノウイルスはキメラのヘキソンタンパク質を備え、ここにおいて該ヘキソンタンパク質は上記の第１のサブグループに属するセロタイプ由来の配列および、少なくとも１つの第２のサブグループに属するセロタイプ由来の超可変領域（ＨＶＲ）配列から成り、ここにおいて、上記の第１と第２のサブグループは互いに異なったものである。好適には上記の第１のサブグループはサブグループＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦである。また、本発明によるバッチで、第２のサブグループがサブグループＢまたはＤであるものが好適である。より好適なのは第１のサブグループがサブグループＣであり、該サブグループＣのセロタイプがＡｄ５であり、また、サブグループＢまたはＤ由来のセロタイプが、Ａｄ１１、Ａｄ２４、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ４９、およびＡｄ５０から成る群から選択されたものであるバッチである。

本発明の好適な実施形態において、上記のキメラヘキソンタンパク質は、最初の６つのＨＶＲ配列（ＨＶＲ１〜ＨＶＲ６）、または全７つのＨＶＲ配列（ＨＶＲ１〜ＨＶＲ７）において、上記の第２のサブグループに属するセロタイプ由来のものを備える。

別の好適な実施形態においては、上記のヘキソンタンパク質は、ＨＶＲ配列間においてバックボーンウイルスのアミノ酸配列を保持する。したがって、本明細書で定義する１つまたは複数のＨＶＲ配列を欠失させたり、変異させたり、リンカーで置き換えたり、別のセロタイプのＨＶＲ配列と置き換えたりすることが可能だが、ＨＶＲ間を結ぶ配列は改変せず保つのが非常に好適である。このことによって、非ＨＶＲ配列によって提供されるヘキソンのバックボーン配列によって安定なウイルスを生産することが可能となる。このように、ＨＶＲ配列間の配列は上記の第１のサブグループに属すセロタイプのものであるのが好適である。

非常に好適な実施形態において、本発明は本発明によるアデノウイルスのバッチを提供し、ここにおいて第１のサブグループはサブグループＣであり、ここにおいて、少なくとも１つの上記の第２のサブグループに属すセロタイプのＨＶＲ配列は、配列番号２４〜７９、および配列番号９５〜１５０から選択される。更に好適な実施形態においては、ＨＶＲ１の配列は配列番号１７、２４、３１、３８、４５、５２、５９、６６、および７３から選択され、ＨＶＲ２の配列は配列番号１８、２５、３２、３９、４６、５３、６０、６７、および７４から選択され、ＨＶＲ３の配列は配列番号１９、２６、３３、４０、４７、５４、６１、６８、および７５から選択され、ＨＶＲ４の配列は配列番号２０、２７、３４、４１、４８、６６、６２、６９、および７６から選択され、ＨＶＲ５の配列は配列番号２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、および７７から選択され、ＨＶＲ６の配列は配列番号２２、２９、３６、４３、５０、５７、６４、７１、および７８から選択され、そしてＨＶＲ７の配列は配列番号２３、３０、３７、４４、５１、５８、６５、７２、および７９から選択される。更に別の好適な実施形態においては、ＨＶＲ１の配列（ＨＶＲ１^＊）は配列番号８８、９５、１０２、１０９、１１６、１２３、１３０、１３７、および１４４から選択され、ＨＶＲ２の配列（ＨＶＲ２^＊）は配列番号８９、９６、１０３、１１０、１１７、１２４、１３１、１３８、および１４５から選択され、ＨＶＲ３の配列（ＨＶＲ３^＊）は配列番号９０、９７、１０４、１１１、１１８、１２５、１３２、１３９、および１４６から選択され、ＨＶＲ４の配列（ＨＶＲ４^＊）は配列番号９１、９８、１０５、１１２、１１９、１２６、１３３、１４０、および１４７から選択され、ＨＶＲ５の配列（ＨＶＲ５^＊）は配列番号９２、９９、１０６、１１３、１２０、１２７、１３４、１４１、および１４８から選択され、ＨＶＲ６の配列（ＨＶＲ６^＊）は配列番号９３、１００、１０７、１１４、１２１、１２８、１３５、１４２、および１４９から選択され、そしてＨＶＲ７の配列（ＨＶＲ７^＊）は配列番号９４、１０１、１０８、１１５、１２２、１２９、１３６、１４３、および１５０から選択される。より好適には、表IIまたは表IVのＨＶＲ１配列、いずれかで表されるＨＶＲ１配列をバックボーンベクターから欠失させる。ＨＶＲ１配列を欠失させる理由は、アデノウイルスヘキソンタンパク質の結晶構造に基づくと、ＨＶＲ１の隣接配列は非常に密集して位置し、これが、これらの隣接配列を欠失以外の構造変化無しで直接リンクすることが可能だということを示唆するためである。別の好適な実施形態において、表IIまたは表IVのＨＶＲ２配列、いずれかで表されるＨＶＲ２配列は短いリンカー、より好適には２つのアミノ酸から成るリンカー、最も好適にはＱＧリンカーで置き換えられる。結晶構造によると、ＨＶＲ２の隣接配列もまた、互いに密集している。しかし、ＨＶＲ１でみられるものより僅かに離れているため、小さな架橋リンカー、好適には１つ、２つ、３つ、または４つ、より好適には２つのアミノ酸からなるリンカーを導入するのが望ましい。ＨＶＲにより提示される免疫原性の決定部位に対するＮＡｂｓの攻撃を防止するにはヘキソンをＨＶＲから取り除くのが理想的な解決法はである可能性がある。しかし、結晶構造からみると、ヘキソンタンパク質の全体の構造、およびおそらくその機能およびカプシッド形成における役割を失うことなく、ＨＶＲ３〜７をヘキソンタンパク質から欠失させるのは可能でないように思える。

Ａｄ２４のヘキソンは好適なＨＶＲを有するのにかかわらず、この特に「稀な」セロタイプのヘキソンタンパク質の配列は出願の時点で発明者らに公知でなかった。しかし、本明細書の提供する教示によって、当業者は、好適なセロタイプＡｄ２４を含む任意のアデノウイルスヘキソンタンパク質におけるＨＶＲを決定することができるであろう。Ａｄ２４の任意の１つＨＶＲの使用もまた、本発明に含まれる。

本発明はまた、サブグループＢのセロタイプのヒトアデノウイルスのヘキソンの少なくとも１つのＨＶＲ配列をコードする核酸を単離したものをキメラヘキソンタンパク質の構成に使用することに関し、このヘキソンは更に、サブグループＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦに属するアデノウイルスからの配列を含む。更に、本発明は、サブグループＤのセロタイプのヒトアデノウイルスのヘキソンの少なくとも１つのＨＶＲ配列をコードする核酸を単離したものをキメラヘキソンタンパク質の構成に使用することに関し、このヘキソンは更に、サブグループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、またはＦに属するアデノウイルス由来の配列を含む。好適には、少なくとも１つのＨＶＲ配列は配列番号２４〜７９および９５〜１５０から選択される。

表３は本発明の様々な実施形態をまとめたものである。表によると、本発明は、セロタイプＸのペントンおよびヘキソンタンパク質を備えたバックボーンアデノウイルスをベースとしたキメラ複製欠損アデノウイルスに関し、ここにおいて、ヘキソンタンパク質中のｎ個のＨＶＲがセロタイプＹのもので、更に、セロタイプＦのテールおよびシャフト、およびセロタイプＫのノブを備え、ここにおいて：
‐Ｘはヒトアデノウイルス１〜５１、サルアデノウイルス、イヌアデノウイルス、ヒツジアデノウイルス、ブタアデノウイルス、およびウシアデノウイルスのセロタイプから成る群から選択されたアデノウイルスのセロタイプであり；
‐Ｙはヒトアデノウイルス１１、２４、２６、３４、３５、４８、４９、および５０から成る群から選択されたアデノウイルスのセロタイプで、ここにおいてＸとＹは同一でも異なっていても良く、ここにおいてｎは０から７の間の任意のＨＶＲの数を示し、但しＸ≠Ｙの場合はｎ＝１〜７であり；
‐Ｆはヒトアデノウイルス１〜５１、サルアデノウイルス、イヌアデノウイルス、ヒツジアデノウイルス、ブタアデノウイルス、およびウシアデノウイルスのセロタイプから成る群から選択されたアデノウイルスのセロタイプであり、ここでＦ、Ｘ、およびＹは同一でも異なっていても良く；そして
‐Ｋは細胞レセプターとして基本的にＣＡＲを使用するアデノウイルスセロタイプであり、ここでＫ、Ｆ、Ｘ、およびＹは同一であっても異なっていても良い。好適には、ＦがＸでない場合、少なくともファイバータンパク質のテールの、ペントンタンパク質と相互作用する部分はセロタイプＸのものである。

当然ながら、バックボーンアデノウイルスベクターはヒトでの使用に適した（パッケージング細胞ではない通常の細胞で複製しないように組み換えられた）ものならばどのようなアデノウイルスであっても良い。複製欠損で、ヒトの治療に適用できるものである限り、６つのサブグループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦに含まれる公知のヒトアデノウイルス（セロタイプ１−５１）のうち任意のもの、および公知のサルアデノウイルス、イヌアデノウイルス、ヒツジアデノウイルス、ブタアデノウイルス、およびウシアデノウイルスをバックボーンベクターとして使用することが可能である。バックボーンベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの機能的部位の欠損によって、好適にはＥ１領域の全ての機能的部位の欠損によって、複製欠損とされている。バックボーンベクターは他の上流（early）および下流（late）の全ての領域を備えるが、当業者は、当技術分野において、ある特定の必要なアデノウイルスタンパク質を他の手段、例えばヘルパーウイルスの使用や、パッケージ細胞を改変し必要な核酸をゲノムに安定に組み込むことによって得る方法があることを認識している。典型例として、本発明によるウイルスはＥ１欠損したアデノウイルス、および好適には望みの異種核酸をクローニングする場所を提供するためにＥ３も欠損したアデノウイルスゲノムを含み、望みの異種核酸はＥ１領域またはＥ３領域、あるいはその両方にクローニングされる。Ｅ２、Ｅ４、ＩＴＲおよび下流領域（late region）などの残りの領域は一般的に存在しているが、パッケージ細胞での生産の際に別に生産される可能性もある。WO 03/104467に示されるように、ベクターは、好適には、パッケージ細胞系に存在するＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質と適合する（おそらく他のセロタイプの）Ｅ４ｏｒｆ６領域を備える。これは、PER.C6（商標登録）細胞または293細胞などの公知のパッケージングシステムでの生産を可能にするために、それらの細胞中に存在するＡｄ５由来のＥ１Ｂ５５Ｋと適合しない独自のＥ４ｏｒｆ６領域を組み換えベクターが保有する場合に行った。

バックボーンのセロタイプは上記で‘Ｘ’とされている。更に、バックボーンウイルスは、ヒトＡｄ１１、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ４９、およびＡｄ５０から選択された１つまたは複数のアデノウイルスセロタイプ（セロタイプ‘Ｙ’とされる）のＨＶＲを含むよう操作することが可能である。明らかに、ＸがＹのセロタイプの１つであった場合、このようなセロタイプは‘稀である’とされ、ヒト集団中のほとんどの個体において遭遇する既存免疫が少ないため、ＨＶＲを操作する必要がない可能性がある。よって、ＸがＹのセロタイプの１つであった場合、交換されたＨＶＲの数（‘ｎ’で示される数）はゼロである可能性があるが１〜７であってもよく、ここで、ＸがＹのセロタイプの１つでない場合、少なくとも１つのＨＶＲがＹセロタイプのものであり、ここにおいてはより多くのＨＶＲがＹセロタイプのものであることがますます好適であり、ここにおいて、全７つのＨＶＲがＹセロタイプの対応する領域と交換されるのが最も好適である。

本発明によるバックボーンウイルスは、バックボーンウイルスと同じセロタイプのペントンタンパク質を備える。バックボーンウイルスは、ヘキソンがキメラである（１つまたは複数のＨＶＲが交換または置換されている）という意味で、および／または、ファイバータンパク質がキメラであるという意味で、および／またはファイバータンパク質がバックボーンウイルスとは異なったセロタイプのものであるという意味で「キメラ」である。Ａｄ４８はＣＡＲに結合するため、例えば組み換えＡｄ４８ベクターなど、Ｘ＝Ｙ＝Ｆ＝Ｋのものが存在する可能性はある。しかし、そのようなベクターはｎ＝０の時、上記の意味では「キメラ」であるとはいえない。キメラ組み換え体でないＡｄ１１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、およびＡｄ５０は、ファイバーノブはＣＡＲと優先的に結合するセロタイプ由来のものであるべきであるのに対して、これらのサブグループＢに属すウイルスはこれに当てはまらないため、上記の定義の範囲内には含まれない。

ファイバーは「Ｆ」で示すセロタイプに由来するものであり、セロタイプＦのテールを備え、セロタイプＦのシャフトを備え、そして、‘Ｋ’で示すセロタイプのノブを備える。明らかに、ＫがＦと同じセロタイプである場合、ファイバータンパク質はキメラでない。ＫはＣＡＲレセプターと優先的に相互作用するセロタイプであり、Ｘと同じセロタイプであっても異なったセロタイプであっても良い。明らかに、サブグループＢに属するセロタイプなどのある特定のヒトセロタイプはＣＡＲと優先的に相互作用しないが、好適にはＣＤ４６などの他の細胞レセプターと相互作用する。なので、ＫがＸと同じである場合、ＸはサブグループＢに属するアデノウイルスの一つではない。また、ＫがＦとは異なったセロタイプであるとき（それゆえファイバーがキメラであるとき）、テールのうち少なくともカプシッド中のペントンと相互作用する部分はセロタイプＸのものであり、それによって本来の安定したカプシッドのフォーメーションが保たれる。周知のアデノウイルスのカプシッドタンパク質をコードする遺伝子のほとんどが当技術分野において知られているため、周知の全てのアデノウイルスおよびこれから発見されるアデノウイルスのテール領域、シャフト領域、およびノブ領域の同定を当技術分野の技術者の技術によって行うことは可能である。

本発明によるキメラの複製欠陥アデノウイルスの好適な例は、これに限定されるものではいが、：Ａｄ５ＨＶＲ１１（１−７）、Ａｄ５ＨＶＲ２４（１−７）、Ａｄ５ＨＶＲ２６（１−７）、Ａｄ５ＨＶＲ３４（１−７）、Ａｄ５ＨＶＲ３５（１−７）、Ａｄ５ＨＶＲ４８（１−７）、Ａｄ５ＨＶＲ４９（１−７）、Ａｄ５ＨＶＲ５０（１−７）、Ａｄ５ＨＶＲＰａｎ９（１−７）、Ａｄ５ＨＶＲ１１（１−６）、Ａｄ５ＨＶＲ２４（１−６）、Ａｄ５ＨＶＲ２６（１−６）、Ａｄ５ＨＶＲ３４（１−６）、Ａｄ５ＨＶＲ３５（１−６）、Ａｄ５ＨＶＲ４８（１−６）、Ａｄ５ＨＶＲ４９（１−６）、Ａｄ５ＨＶＲ５０（１−６）、Ａｄ５ＨＶＲＰａｎ９（１−６）、Ａｄ５ＨＶＲ１１（１）、Ａｄ５ＨＶＲ２４（１）、Ａｄ５ＨＶＲ２６（１）、Ａｄ５ＨＶＲ３４（１）、Ａｄ５ＨＶＲ３５（１）、Ａｄ５ＨＶＲ４８（１）、Ａｄ５ＨＶＲ４９（１）、Ａｄ５ＨＶＲ５０（１）、Ａｄ５ＨＶＲＰａｎ９（１）、Ａｄ１１ｋ５、Ａｄ２４ｋ５、Ａｄ２６ｋ５、Ａｄ３４ｋ５、Ａｄ３５ｋ５、Ａｄ４８ｋ５、Ａｄ４９ｋ５、Ａｄ５０ｋ５、Ｐａｎ９ｋ５、Ａｄ１１ｆ５、Ａｄ２４ｆ５、Ａｄ２６ｆ５、Ａｄ３４ｆ５、Ａｄ３５ｆ５、Ａｄ４８ｆ５、Ａｄ４９ｆ５、Ａｄ５０ｆ５、Ｐａｎ９ｆ５、Ａｄ１１ｋ２６、Ａｄ３４ｋ２６、Ａｄ３５ｋ２６、Ａｄ５０ｋ２６、Ｐａｎ９ｋ２６、Ａｄ１１ｆ２６、Ａｄ３４ｆ２６、Ａｄ３５ｆ２６、Ａｄ５０ｆ２６、Ｐａｎ９ｆ２６、Ａｄ１１ｋ４９、Ａｄ３４ｋ４９、Ａｄ３５ｋ４９、Ａｄ５０ｋ４９、Ｐａｎ９ｋ４９、Ａｄ１１ｆ４９、Ａｄ３４ｆ４９、Ａｄ３５ｆ４９、Ａｄ５０ｆ４９、Ｐａｎ９ｆ４９、Ａｄ２ＨＶＲ１１（１−７）、Ａｄ２ＨＶＲ２４（１−７）、Ａｄ２ＨＶＲ２６（１−７）、Ａｄ２ＨＶＲ３４（１−７）、Ａｄ２ＨＶＲ３５（１−７）、Ａｄ２ＨＶＲ４８（１−７）、Ａｄ２ＨＶＲ４９（１−７）、Ａｄ２ＨＶＲ５０（１−７）、Ａｄ２ＨＶＲＰａｎ９（１−７）、Ａｄ２ＨＶＲ１１（１−６）、Ａｄ２ＨＶＲ２４（１−６）、Ａｄ２ＨＶＲ２６（１−６）、Ａｄ２ＨＶＲ３４（１−６）、Ａｄ２ＨＶＲ３５（１−６）、Ａｄ２ＨＶＲ４８（１−６）、Ａｄ２ＨＶＲ４９（１−６）、Ａｄ２ＨＶＲ５０（１−６）、Ａｄ２ＨＶＲＰａｎ９（１−６）、Ａｄ２ＨＶＲ１１（１）、Ａｄ２ＨＶＲ２４（１）、Ａｄ２ＨＶＲ２６（１）、Ａｄ２ＨＶＲ３４（１）、Ａｄ２ＨＶＲ３５（１）、Ａｄ２ＨＶＲ４８（１）、Ａｄ２ＨＶＲ４９（１）、Ａｄ２ＨＶＲ５０（１）、Ａｄ２ＨＶＲＰａｎ９（１）、Ａｄ１１ｋ２、Ａｄ２４ｋ２、Ａｄ２６ｋ２、Ａｄ３４ｋ２、Ａｄ３５ｋ２、Ａｄ４８ｋ２、Ａｄ４９ｋ２、Ａｄ５０ｋ２、Ｐａｎ９ｋ２、Ａｄ１１ｆ２、Ａｄ２４ｆ２、Ａｄ２６ｆ２、Ａｄ３４ｆ２、Ａｄ３５ｆ２、Ａｄ４８ｆ２、Ａｄ４９ｆ２、Ａｄ５０ｆ２、およびＰａｎ９ｆ２である。

Ａｄ５、Ａｄ３５、およびＡｄ１１の国際的な血清陽性率およびＮＡｂタイター
Ａｄ特異的中和抗体（ＮＡｂ）の応答を、一般的にSprangersら(2003)によって示された通りに、ルシフェラーゼを用いたウイルス中和アッセイによって評価した。簡単に説明すると、Ａ５４９ヒト肺癌細胞を各ウェルにつき１×１０^４細胞の密度で９６ウェルプレートに蒔き、これにＥ１欠損を有し複製することのできないＡｄ‐ルシフェラーゼレポーターコンストラクトにより、感染の多重度（moi）５００で、血清で２倍の希釈系列として、２００μｌの反応容積中で感染させた。２４時間のインキュベーションの後、細胞内のルシフェラーゼ活性をSteady-Glo Luciferase Reagent System（プロメガ社）を用いて測定した。９０％中和タイターは、ルシフェラーゼ活性の９０％を中和する血清の最大濃度として規定された。

WO 00/70071に含まれる内容に加えて、発展途上国のＡｄ５および他のＡｄセロタイプの血清陽性率およびＮＡｂタイターを評価するための実験を行った。アメリカ合衆国（Ｎ＝１９）、ハイチ（Ｎ＝６７）、ボツワナ（Ｎ＝５７）、ザンビア（Ｎ＝２９）、および南アフリカ（Ｎ＝５９）の健康な大人から採取した血清サンプルを用いて、Sprangersら(2003)による、ルシフェラーゼを用いたウイルス中和アッセイを行った。 図１Ａに示すとおり、アメリカ合衆国では、Ａｄ５の血清陽性率は５０％で、タイターの平均値は比較的低い。一方、Ａｄ５の血清陽性率はハイチでは８２％、ボツワナでは９３％、ザンビアでは９３％、南アフリカでは８８％であった。更に、これらのサンプル中でのＡｄ５特異的ＮＡｂのタイターは、アメリカ合衆国のサンプル中でのタイター平均値の１０倍以上の値を示す（図１Ｂ）。これらのデータは過去の研究結果（"Kostense et al. 2004"; "Vogels et al. 2003"）を拡張し、Ａｄ５特異的ＮＡｂｓはほぼ全世界的に存在し、発展途上国においては高いタイターを有すことを示す。一方で、これらの集団中においてＡｄ１１およびＡｄ３５の血清陽性率およびタイターはかなり低かった。

Ａｄ５特異的中和抗体の免疫優勢ターゲット
先の実施例において概説したサンプルを更に用い、アメリカ合衆国およびサハラ以南のアフリカ、それぞれにおいての Ａｄ５特異的ＮＡｂの優勢な抗原性標的を決定した。Ａｄ５およびＡｄ３５のＮＡｂの間に交差反応が確認されないため、カプシッドがキメラであるＡｄ５／Ａｄ３５ウイルスで、ルシフェラーゼを発現するものをウイルス中和アッセイに使用した。これらのベクターは、野生型の成長機構を有すインタクトなウイルス粒子を基として、そのヘキソン、ペントンおよびファイバータンパク質を、Ａｄ５およびＡｄ３５の様々な組み合わせによって構成したものである（"Havenga et al. 2002"; "Rea et al. 2001"）。本研究で用いたキメラベクターはＡｄ５ｆ３５（Ａｄ３５のファイバーノブおよびファイバーシャフト、そしてＡｄ３５−Ａｄ５のキメラなテールおよびペントンを有すＡｄ５）、およびＡｄ３５ｆ５（Ａｄ５のファイバーノブおよびファイバーシャフト、そしてＡｄ５−Ａｄ３５のキメラなテールを有すＡｄ３５）を含む。

図１Ｃに示す通り、Ａｄ５をベースとしたＡｄ５、Ａｄ５ｆ３５、そしてＡｄ５ｆ３５ｐ３５においては、同等のＮＡｂタイターが観測された。Ａｄ５ｆ３５ｐ３５ベクターのカプシッドはＡｄ５のヘキソンを含むがＡｄ３５由来のファイバーおよびＡｄ３５由来のペントンを含むことからこのデータは、Ａｄ５特異的ＮＡｂ活性の大多数がＡｄ５ヘキソンをターゲットとしていることを示唆する。組み換え体Ａｄ３５ｆ５（本明細書においてＡｄ３５ｆｉｂ５とも称される）に対するタイターも、より小さい値だがはっきりと検出され、Ａｄ５ファイバーに特異的なＮＡｂも、Ａｄ５ヘキソンに特異的なＮＡｂｓと比較して５倍から１０倍低いタイターでこれらのサンプル中に存在するということが示された。これらのウイルスを用いてＡｄ５のペントンに特異的なＮＡｂは測定されなかったが、Ａｄ５ｆ３５およびＡｄ５ｆ３５ｐ３５に対するＮＡｂタイターが同程度であったため、ペントン特異的ＮＡｂは中和においてせいぜい小さい役割しか果たしていないことが示唆される。

Ａｄ３５ｆ５およびＡｄ３５ｋ５の作製
組み換えＡｄ３５をベースとしたワクチンは抗Ａｄ５免疫の存在下においても免疫原性を保つ。しかし、組み換えＡｄ３５ワクチンは抗Ａｄ５免疫の存在しない状況においては、本質的には組み換えＡｄ５ワクチンと比較して、免疫原性が低い（Barouch et al. 2004）。この問題は、カプシッドがキメラな組み換えＡｄ３５ベクターを構築することによって克服され、そのベクター中では、少なくともＡｄ３５のファイバーノブがＡｄ５のファーバーノブで置き換えられている（ノブの交換を行ったものはＡｄ３５ｋ５、ファイバーのほとんどを交換したものはＡｄ３５ｆ５と呼ぶ）。

組み換えＡｄ３５ｋ５ベクターは、Ａｄ３５のファイバータンパク質をコードする遺伝子を、Ａｄ３５のファイバーテールおよびシャフト（アミノ酸１〜１３２）をＡｄ５ファイバーノブ（アミノ酸１３３〜３１４）に連結したキメラのファイバータンパク質をコードする遺伝子で置き換えることによって作製した。Ａｄ５ファイバーに特異的な抗体は、組み換えＡｄ５ワクチンの免疫原性を低下させない。Ａｄ３５はサブグループＢに属すアデノウイルスであるため、Ａｄ３５ファイバーノブはＣＡＲと相互作用せず（Roelvink et al. 1998）、代わりにＣＤ４６をレセプターとして使用する（Gagger et al. 2003）。異なったファイバータンパク質を有するウイルスは、異なった細胞内移動経路をとる。過去の研究により、Ａｄ５ファイバーノブは、初期エンドソームから細胞質ゾルへの迅速なウイルスの移動を促進し、ウイルスゲノムの核への効率的なトランスロケーションを導くが、一方で、Ａｄ１１およびＡｄ３５を含むサブファミリーＢに属すアデノウイルスのファイバーノブは、ウイルス粒子が後期エンドソームに保持されることを促し、ウイルス粒子の大部分は細胞表面に戻されることが示されている（Shayakhmetov et al. 2003）。

Ａｄ３５ｋ５ベクターをコードする組み換え核酸のクローニングは以下の通りに行った。Ａｄ５ファイバーノブをコードする領域をＰＣＲによって合成し、BsiWI-NheI断片としてpBR.Ad35.PacI-rITR.dE3プラスミド（＝WO 2004/001032におけるpBr.Ad35.PRn△E3）にクローニングし、Ａｄ３５ファイバーノブをコードする対応する領域を置き換えた。その後、変異pBR.Ad35k5.PacI-rITR.dE3プラスミドをpWE.Ad35.pIX-EcoRV（WO 2004/001032）コスミドおよびSIVmac239 Gag遺伝子を含むアダプタープラスミドpAdApt35-SIV Gagと共にPER.C6/55K細胞にトランスフェクションし（WO 00/70071およびWO 02/40665参照）、そして、二重相同組み換えによりＡｄ３５ｋ５−ＳＩＶＧａｇベクターを得た。このベクターをプラーク精製し、配列を決定し、伸長し、当業者に公知な一般的な精製方法に従いＣｓＣｌ密度勾配遠心法により精製した。このキメラファイバーのヌクレオチド配列を図２Ａ（配列番号１）に示し、アミノ酸配列を図２Ｂ（配列番号２）に示す。

Ａｄ３５ｆ５ベクターは、典型的にはWO 00/70071においてＡｄ３５ｆｉｂ１６について概説されている通り、およびWO 00/03029においてＡｄ５ｆｉｂＸＸキメラについて概説されている通りに作製し、ここでは、Ａｄ５ファイバーのテールの一部をＡｄ５ファイバーシャフトおよびＡｄ５ファイバーノブと連結したものをコードするＰＣＲ産物をＡｄ３５ファイバーテールの残りの部分と合わせている。クローニングにはまた、Ｅ３欠損のバックボーンベクターを用い、BsiWIおよびNheIを制限酵素認識部位／クローニング部位として用いて行った。ベクターについての詳細はWO 03/104467およびWO 2004/001032を参照。

詳しくは、pBr/Ad35.pacI-rITRfib5の作製は以下の手順で行った：プラスミドpBr/Ad35.PacI-rITRNotI（＝pBr/Ad35.PRn WO 2004/001032参照）において、プライマーDF35-1：5'- CAC TCA CCA CCT CCA ATT CC-3'（配列番号６）更に、BamHIサイトおよびBsiWIサイトを含むプライマーDF35-2：5'- CGG GAT CCC GTA CGG GTA GAC AGG GTT GAA GG-3'（配列番号７）を用いてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応の結果、ファイバー３５のテール領域から開始し、BamHIサイトおよびBsiWIサイトの両方が導入された、約６５０ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。次に、プラスミドpBr/Ad35.PRnにおいて、BamHIサイトおよびNheIサイトを含む プライマーDF35-3：5'- CGG GAT CCG CTA GCT GAA ATA AAG TTT AAG TGT TTT TAT TTA AAA TCA C-3'（配列番号８）およびプライマーDF35-4：5'- CCA GTT GCA TTG CTT GGT TGG- 3'（配列番号９）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応の結果、ファイバー３５のストップコドンの直後から開始し、Ｅ４領域まで続く約１４００ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。pBr/Ad35.PRnをMluIおよびNdeIで処理し、Ａｄ３５バックボーンから、２８５０ｂｐのＤＮＡ断片を取り除いた（これによりファイバー３５領域のほぼ全領域が取り除かれる）。DF35-1 + DF35-2によるＰＣＲ断片をMluIおよびBamHIで処理し、DF35-3 + DF35-4によるＰＣＲ断片をBamHIおよびNdeIで処理した。これらのＰＣＲ断片を切断したpBr/Ad35PRnプラスミドにライゲーションし、pBr/Ad35PRndFIBコンストラクトを得た。その後、Ａｄ５のＤＮＡをテンプレートとして、プライマー35F5-5-F：5'-CGG GAA CGT ACG ACA CGG AAA CCG GTC CTC C-3'（配列番号１０）およびプライマー35F5-R：5'-CGG CTA GCT AGC TTA TTC TTG GGC AAT GTA TGA AA-3'（配列番号１１）を用いてＰＣＲ産物を生成し、新規に導入したBsiWIサイトおよびNdeIサイトを利用して、Ａｄ３５バックボーン中にＡｄ５ファイバー配列を導入した。この後、pBr/Ad35PRNdE3コンストラクトにおいて行ったのと同様にＥ３領域を欠失させた。

当業者は分子クローニングおよびアデノウイルス産生についての一般的な周知の知識を使用することにより、これらのクローンを作製し、断片を挿入し、ＰＣＲ産物を作製し、特定の断片を欠失させ、将来的にウイルスをパッケージング細胞系として生産することが可能であろう。更に、in vivoでもin vitroでも使用可能なアデノウイルスバッチを得るための生産方法および精製方法もまた、当技術分野において周知である。

ここで述べる全てのベクターは一般的なＣｓＣｌ精製を用いて得られ、PER.C6/55Kパッケージング細胞系において少なくとも５代継代にわたって安定であることが明らかとなった（データは示さない）。Ａｄ３５ｋ５ベクターの増殖速度および収率は親Ａｄ３５ベクターと同程度であった（データは示さない）。しかし、プラーク形成単位（ｐｆｕ）あたりのウイルス粒子（ｖｐ）の比率を比較すると、Ａｄ３５ｋ５ベクター（１００〜１０００）ではＡｄ３５ベクター（１０〜１００）の約１０倍の値であった。

天然のファイバーノブ、あるいは置き換えられたファイバーノブを有するベクターが、それぞれに対応するレセプターを依然として認識する（Ａｄ５ファイバーがＣＡＲに結合し、Ａｄ３５ファイバーがＣＤ４６に結合する）ことができるかどうかについてもまた、検討を行った。これらの特異的な相互作用はキメラのベクターにおいても、元のＡｄ５およびＡｄ３５をベースとしたベクターにおいても、依然として実現した。

同様の方法をとって、Ａｄ２６またはＡｄ４９のノブを有すキメラで複製不能な、Ａｄ３５をベースとしたウイルスを作製した。これらのウイルスはＡｄ３５ｋ２６およびＡｄ３５ｋ４９と名付けられ、これらは稀なセロタイプであるＡｄ３６およびＡｄ４９のＣＡＲへの結合能力を有し、またそれと同時に、バックボーンベクターのカプシッドに存在するヘキソンタンパク質もまた、ここではＡｄ３５で例証しているが、稀なセロタイプのものである。Ａｄ３５ｋ２６およびＡｄ３５ｋ４９それぞれのキメラファイバーのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は図２Ｅ〜２Ｈに示す。

in vitroで導入遺伝子を発現する能力の比較をＡｄ３５ｋ５ウイルス、Ａｄ３５ｋ２６ウイルスおよびＡｄ３５ｋ４９ウイルスを用いて行った。全てのベクターは導入遺伝子としてSIVGagを有す。７．５×１０^４のＡ５４９細胞をマスターウイルスのシードストックウイルス（濃度未知のウイルス）で２時間、２ｍｌの体積で感染させた。その後これらの細胞を洗浄し、４８時間培養した。２Ｆ１２抗ｐ２７モノクローナル抗体を用いた細胞内染色によってgag染色を評価し、フローサイトメトリーによって分析を行った。この実験における制限は、ある特定の数のウイルス粒子を使用したわけではないため、Ａｄ３５ｋ４９が他のウイルスに比べて高いタイターを有するのか、比活性度が高いのかを決定づけることができないという点である。どちらにせよ、このベクターは他のベクターに比べ、複製／増殖において、もしくは発現量において、確かな利点があるようである。図１６は、Ａｄ３５ｋ４９の３つの代表的なバッチが、Ａｄ３５ｋ５およびＡｄ３５ｋ２６の代表的なバッチと比較して有意に高い細胞内発現を示したことを示す。組み換えアデノウイルスベクターＡｄ３５ｋ４９は本発明における好適な実施形態である。

パッケージング細胞においてアデノウイルスベクターが効率よく産生されるためには、パッケージング細胞のゲノムに遺伝子が安定に組み込まれているために一般的に発現するＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質が、ウイルスベクターのＥ４領域によって生産されるＥ４ｏｒｆ６タンパク質と適合する必要がある。Ａｄ３５のＥ４ｏｒｆ６タンパク質は293細胞やPER.C6（商標登録）細胞などの周知のパッケージング細胞において一般的に発現するＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質と適合しないことが過去に発見された（WO 03/104467; WO 2004/001032; WO 2004/018627; WO 95/34671を参照）。Ａｄ３５由来のＥ１Ｂ−５５タンパク質がゲノムに組み込まれた新しい細胞系の使用を避け、PER.C6細胞によって提供される確立された産生プラットフォームの利用を可能とするために、WO 03/104467において詳しく説明される内容に従い、Ａｄ３５バックボーンのＥ４ｏｒｆ６領域をＡｄ５のＥ４ｏｒｆ６領域で置き換えたコンストラクトを作製した。Ａｄ３５をベースとした全てのベクターにおいてＥ４ｏｒｆ領域の置き換えを行ったが、このことはこれ以上、本明細書において示す免疫原性の研究およびターゲッティングの研究において使用されない。

組み換え体Ａｄ３５ｆ５およびＡｄ３５ｋ５の免疫原性の、Ａｄ５およびＡｄ３５との比較
ベクターの免疫原性の評価は、キメラのファイバーを有すベクターをＡｄ５−ＳＩＶＧａｇおよびＡｄ３５−ＳＩＶＧａｇと比較することによって行った。

実験未使用のマウス（各グループにつきＮ＝５）に１０^１０ｖｐのＡｄ５−ＳＩＶＧａｇ、Ａｄ３５−ＳＩＶＧａｇ、Ａｄ３５．ＢＳＵ．−ＳＩＶＧａｇ、Ａｄ３５．ｆｉｂ５．ＢＳＵ．−ＳＩＶＧａｇ、を筋肉注射した。ＢＳＵという用語は、Ａｄ３５をベースとした組み換えウイルスの生産の際、確実にｐＩＸ遺伝子の正常な発現を行うために、アデノウイルスゲノム核酸に存在するｐＩＸプロモーターを使用するということを意味する。ＢＳＵコンストラクトに関しての詳細についてはWO 2004/001032を参照。コントロールマウス（各グループにつきＮ＝３）にはＡｄ５およびＡｄ３５の空ベクターを注射した。２８日後、血液サンプルを採取し、以下に説明する通りにSIV gag ELIspotアッセイを行い、免疫応答を測定した。

この実験の結果が図３であり、空ベクターと比較して、全てのベクターが正常なＴ細胞応答を誘発しており、これらのベクターをマウスに注射すると挿入遺伝子によって抗原性タンパク質が提供されることがわかった。

別の実験未使用（naive）のマウス（各グループにつきＮ＝８）には、１０^９ｖｐまたは１０^８ｖｐのＡｄ５−Ｇａｇ、Ａｄ３５−Ｇａｇ、およびＡｄ３５ｋ５−Ｇａｇベクター（これらは全てSIV Gagタンパク質をコードする）を注射した。ワクチンによって誘発されるＣＤ８^＋Ｔリンパ球応答をＤ^ｂ／ＡＬ１１四量体結合アッセイにより以下の方法で評価した：優勢なSIVmac239 Gag AL11エピトープペプチド（AAVKNWMTQTL；配列番号３；Barouch et al. 2004）の周りに四量体のＨ−２Ｄ^ｄ複合体がフォールドしたものを調製し、当技術分野で周知な技術を用いてマウスのＰ１８特異的ＣＤ８^＋Ｔリンパ球を染色するのに用いた。マウスの血液は４０Ｕ／ｍｌのヘパリンを含むRPMI 1640培地に回収した。赤血球の細胞溶解に従って、０．１μｇのＰＥラベルしたＤ^ｄ／Ｐ１８四量体をＡＰＣラベルした抗CD8alpha mAb（Ly-2；Caltag, Burlingame, CA, USA）と共に用い、Ｐ１８特異的ＣＤ８^＋Ｔリンパ球を染色するのに用いた。細胞を２％ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄し、１．５％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ ０．５ｍｌ中で固定した。サンプルはFACSCaliburを用いた２カラーフローサイトメトリーによって分析した（Becton Dickinson）。ゲートされたＣＤ８^＋Ｔリンパ球について、Ｄ^ｄ／Ｐ１８四量体によって染色されているかを検査した。実験未使用のマウスのＣＤ８^＋Ｔリンパ球は０．１％未満の四量体染色を示し、これをネガティブコントロールとして用いた。

図４に示す通り、１０^９ｖｐの高用量においては、全３種類のワクチンの免疫原性は同程度であった（Ａ）。重要なことに、１０^８ｖｐのより低用量においては（Ｂ）、組み換え体Ａｄ３５ｋ５−Ｇａｇによって誘発された免疫応答は組み換え体Ａｄ３５−Ｇａｇによって誘発された免疫応答（ｐ＜０．０１ 多重比較であるためボンフェローニの補正を用いた分散分析を行って、マウスの各グループの四量体を用いた応答の平均値を比較した）よりもかなり強力であり、Ａｄ５−Ｇａｇによって誘発された免疫応答（ｐ＝ｎｓ）とほぼ同程度であった。これは過去の観測結果と一致する（"Barouch et al. 2004"; "Lemckert et al. 2005"）。これらのデータから、Ａｄ３５ベクターをサブグループＣに属すアデノウイルス（例として、Ａｄ５）のノブ領域を持つように操作することにより、ベクターに導入した抗原の免疫原性の有意な向上が得られることがわかった。

これらの実験は抗Ａｄ５免疫の非存在下で行っており、ここでは、Ａｄ５およびＡｄ３５ｋ５が同程度の免疫原性を示し、これらはＡｄ３５ベクターの免疫原性よりも有意に大きい。Ａｄ３５ｋ５ベクターはＡｄ３５ヘキソンを有し、これがＡｄ５のヘキソンタンパク質に対する中和活性を有する個体において免疫応答を起こす効能を高めるのに有効であることは特筆すべきである。ゆえに、Ａｄ３５ｋ５ベクターは、抗Ａｄ５抗体の存在下ではＡｄ５をベースとしたベクターおよびＡｄ３５をベースとしたベクターの双方よりも有効であり、その理由は、この条件下ではＡｄ５は天然のＡｄ５ヘキソンタンパク質を有するために免疫原性が低く、Ａｄ３５は天然のＡｄ３５ファイバーノブ領域を有するため一般に免疫原性が低いためである。

感染に伴ってファイバータンパク質に対する中和抗体が発生する可能性があるということも忘れてはならない。しかし、自然状態では、そのような中和活性はごくわずかであり、ホストによる免疫応答のほとんどはヘキソンタンパク質に対するものである。親ベクターによって予め免疫化を行った後に組み換えベクターの比較の実験を行う場合は、天然の（ヒトの）条件を真似た条件、すなわち、野生型のウイルスが天然のホストに一度か二度感染し、天然に発生する程度の量の中和抗体が誘発された条件で実験を行うことが重要である。実験室条件下では、多数回におよぶ投与や、高タイターのものの投与によりマウスの免疫応答を極端に高めることが可能である。天然の条件を真似た実験により、ファイバータンパク質を標的とした中和抗体が、投与されたアデノウイルスベクターを中和するのにおいて実際に重要であるかどうかが示される。この実験はまた、これもまた中和活性に用いる典型的な部分である、ファイバーのシャフト領域の存在の重要性を明らかにする。

ＣＡＲを介してホスト細胞を認識し感染させるアデノウイルス（例として、Ａｄ２、Ａｄ５、その他）の少なくともノブを含むベクターであって、更に、カプシッドのうち免疫原性を決定する主要な領域（すなわち、ヘキソンタンパク質）が、中和されることの最も少ないセロタイプ（例として、Ａｄ１１、Ａｄ２４、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、Ａｄ４９およびＡｄ５０）のものによって構成されるベクターは、ヒト集団中に存在する既存免疫が少ない、抗原の導入によって得られる免疫応答が高い、トランスダクション効率が高い、安定性が高い、というこれまで知られていなかった利点を組み合わせた、優秀なワクチンベクターである、と我々は主張する。

既存免疫の存在するマウスにおけるＡｄ５、Ａｄ３５ｋ５、およびＡｄ３５の免疫原性
次に、これらのベクターの免疫原性に抗Ａｄ５免疫が与える影響を評価した。ワクチン投与の４週間前に、全てのグループのC57/BL6マウス（各グループにつきＮ＝４）に１０^１０ｖｐのＡｄ５−Ｅｍｐｔｙを予め１回投与し、低い／適度な量の抗Ａｄ５免疫を生成させた。これらのマウス内のＡｄ５特異的中和抗体（ＮＡｂ）のタイターは６４〜１２８であった（"Barouch et al. 2004"; "Lemckert et al. 2005"; "Sprangers et al. 2003"）。図４Ｃに示すとおり、これらのマウスの体内で１０^８ｖｐのＡｄ５−Ｇａｇが誘発する四量体^＋ＣＤ８^＋Ｔリンパ球応答は実質的に抑えられた。一方で、１０^８ｖｐのＡｄ３５−ＧａｇおよびＡｄ３５ｋ５−Ｇａｇによる応答は、このレベルの抗Ａｄ５免疫によってはほとんど影響を受けなかった。重要なことに、免疫化の１４日後には、Ａｄ３５ｋ５−Ｇａｇの免疫原性がＡｄ５−Ｇａｇ（ｐ＜０．００１）およびＡｄ３５−Ｇａｇ（ｐ＜０．０５）のどちらの免疫原性よりも高いという結果になった。

Ａｄ３５ｋ５−Ｇａｇが低い／適度な量の抗Ａｄ５免疫を逃れることのできるということは、Ａｄ５特異的ＮＡｂは主としてＡｄ５ヘキソンタンパク質を標的としているという過去の発見と一致している（上記参照；Sumida et al. 2005）。しかし、この過去の研究において、Ａｄ５ファイバータンパク質を標的とする少量のＮＡｂｓもまた、検出された。従って、高いレベルの抗Ａｄ５抗体を有するマウスを用いて、本実験の再現を行った。ワクチン投与の８週間前および４週間前の２度にわたって、予めマウスに１０^１０ｖｐのＡｄ５−Ｅｍｐｔｙを投与し免疫化を行った。これらのマウス中のＡｄ５特異的ＮＡｂのタイターは８１９２〜１６３８４となり（"Barouch et al. 2004"; "Lemckert et al. 2005"; "Sprangers et al. 2003"）、これはサハラ以南のアフリカにおいて測定した、個人の持つタイターの最大値に匹敵する（"Kostense et al. 2004"; "Sumida et al. 2005"）。図４Ｄに示す通り、これらのマウスの体内でＡｄ３５ｋ５−Ｇａｇによって誘発された四量体^＋ＣＤ８^＋Ｔリンパ球応答は部分的に減少し、Ａｄ３５−Ｇａｇによって誘発された応答（ｐ＝ｎｓ）と同程度になった。このように、高レベルの抗Ａｄ５免疫はＡｄ３５ｋ５ベクターの免疫原性を部分的に抑制した。

更に詳しくキメラＡｄ３５ｋ５−Ｇａｇベクターによって誘発されたベクター特異的免疫を評価するために、異種プライム・ブースト、およびウイルス中和アッセイを行った。実験未使用の全グループのC57/BL6マウス（各グループにつきＮ＝４）に、第０週で１０^９ｖｐのＡｄ３５ｋ５−Ｇａｇをプライムし、その後第４週で１０^９ｖｐのＡｄ５−ＧａｇまたはＡｄ３５−Ｇａｇをブーストした。図５Ａに示す通り、Ａｄ３５ｋ５−Ｇａｇによって誘発される四量体^＋ＣＤ８^＋Ｔリンパ球応答はＡｄ５−Ｇａｇによって効率的にブーストされたが、Ａｄ３５−Ｇａｇによってはブーストされなかった。これらのデータから、Ａｄ３５とＡｄ３５ｋ５は実質的に交差反応性のある抗ベクター免疫を誘発する一方で、Ａｄ５とＡｄ３５ｋ５は免疫学的に遠いということが示唆される。これらの観測結果と一致して、Ａｄ３５ｋ５−Ｇａｇで１度免疫化したマウスの生成したＡｄ３５特異的ＮＡｂｓはＡｄ３５−Ｇａｇで免疫化したマウスの生成したＡｄ３５特異的ＮＡｂｓと同程度であったが、生成したＡｄ５特異的ＮＡｂｓはかなり少なかった（図５Ｂ）。以上から、Ａｄ３５ｋ５ベクターは、Ａｄ５ベクターよりもＡｄ３５ベクターに近い血清学的な性質を表した。

これらの結果を一般化できるか検討するために、別の抗原（Ｅｎｖ：HIV-I 89.6P Env gpl20、クローニングの詳細については本明細書および"Vogels et al. 2003"を参照）を発現するＡｄ３５ｋ５ベクターを別の系統のマウスを用いて評価した。実験未使用の各グループのＢａｌｂ／ｃマウス（各グループにつきＮ＝４）に、１０^９ｖｐのＡｄ５−Ｅｎｖ、Ａｄ３５ｋ５−Ｅｎｖ、またはＡｄ３５−Ｅｎｖを１回筋肉注射した。IFN-yELISPOTアッセイ（図６Ａ）およびＥｎｖ特異的ELISA（図６Ｂ）による測定の結果、Ａｄ３５ｋ５−Ｅｎｖベクターの誘発した細胞および体液免疫応答は、Ａｄ５−ＥｎｖベクターおよびＡｄ３５−Ｅｎｖベクターの誘発した免疫応答の中間の値であった。

ELISAは以下の通りに行った。免疫化されたマウスの血清に含まれるHIV-I EnvまたはSIV Gagに特異的な抗体のタイターを記述通り、直接ELISAによって測定した（"Barouch et al. 2003"; "Sumida et al. 2005"）。組み換えHIV-I MN Env gpl20ポリペプチドまたは組み換えSIVmac239 Gag p27ポリペプチド（免疫診断学）の１μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液を各ウェルにつき１００μｌ用いて９６ウェルプレートを１晩コートし、２％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳを使用して２時間ブロックした。そこに連続希釈法によって血清を加え、１時間インキュベーションした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳを使用してプレートを３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識のアフィニティー精製したウサギ抗マウス二次抗体の１：２０００希釈物を１時間インキュベーションした。その後プレートを３回洗浄し、テトラメチルベンジジンを用いて検出し、１％ＨＣｌにより停止させ、Dynatech MR5000 ELISAプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで解析を行った。

アカゲザルにおけるＡｄ５、Ａｄ３５ｋ５およびＡｄ３５ベクターの免疫原性
マウスにおける免疫原性の研究結果の裏づけをするために、アカゲザルにこれらのベクターを投与した場合の免疫原性を評価するパイロット・スタディを行った。９頭のMamu-A*01-negativeのアカゲザル（各グループにつきＮ＝３）にSIV GagおよびHIV-I Envを発現するＡｄ５、Ａｄ３５またはＡｄ３５ｋ５ベクターを１０^１１ｖｐ筋肉注射した。アカゲザルは第０週にプライムし、第１２週にブーストによる同種免疫を行った。図７にこれらの動物中での抗原特異的免疫応答およびベクター特異的免疫応答を示す。Gag特異的細胞性免疫反応およびEnv特異的細胞性免疫反応はpooled peptide IFN-yELISPOTアッセイにより定量し、ベクター特異的ＮＡｂのタイターは免疫化後複数回にわたるルシフェラーゼを用いたウイルス中和アッセイによって決定した。中和アッセイは上記に記載したとおりに実行した。

予想通り、一次免疫を行うと、Ａｄ５ベクターは高い頻度でのELISPOT応答を誘発したが（第１２週での平均Gag+Env応答は538 SFC/10⁶ PBMC）、ブーストによる同種免疫を行ってもこれらの応答の大幅な増加はみられず（第１６週で、平均608 SFC/10⁶ PBMC；図７Ａ）、これはおそらくこれらの動物内でＡｄ５特異的ＮＡｂが高タイターで高速に生成することを反映している（図７Ｂ）。一方で、Ａｄ３５ベクターの誘発する抗原特異的ELISPOT応答は、最初の免疫化後にＡｄ５ベクターが誘発する抗原特異的ELISPOT応答の約半分であった（第１２週で、平均248 SFC/10⁶ PBMC）。興味深いことに、これらの応答はブーストによる同種免疫に従って、大幅に増加し（第１６週で、平均876 SFC/10⁶ PBMC；図７Ｃ）、この結果は、これらの動物に予め存在したベクター特異的ＮＡｂのタイターが低いことと一致している。これらのデータから、アカゲザルにおいては、Ａｄ３５ベクターはＡｄ５ベクターと比較して、より低い抗原特異的免疫応答を誘発すると共に、より低いベクター特異的免疫応答を誘発することが示唆される。

Ａｄ３５ｋ５ベクターの誘発する抗原特異的ELISPOT応答は、一次免疫に従ってＡｄ５ベクターが誘発する抗原特異的ELISPOT応答と同程度のものであった（第１２週で平均578 SFC/10⁶ PBMC；図７Ｅ）。重要なことに、これらの応答は、ブーストによる同種免疫に従って大幅に増大し（第１６週で平均1736 SFC/10⁶ PBMC）、これはおそらくこれらのサルに予め存在したベクター特異的ＮＡｂが比較的少ないことを反映している。実際、ブースト免疫に従い、Ａｄ３５ｋ５ベクターは、Ａｄ５ベクターおよびＡｄ３５ベクターのどちらよりも２、３倍高いGag特異的およびEnv特異的ELISPOT応答を示した。更に、ＣＤ８数およびＣＤ４数の減少したＰＢＭＣを用いて行ったELISPOTアッセイから、Ａｄ３５ｋ５ベクターは、免疫化後第１６週に、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔリンパ球応答の著しい減少を誘発することがわかった（図８Ａ、Ｂ、Ｃ；それぞれＡｄ５、Ａｄ３５、Ａｄ３５ｋ５）。

キメラのヘキソンタンパク質を含む組み換えＡｄ５ベクターの作製
Crawford-MikszaおよびSchnurr (1996)によるＡｄ２のＨＶＲ、RuxおよびBurnett (2000)によるＡｄ５のＨＶＲ、Ruxら(2003)によるＡｄ５のＨＶＲ、および、本発明によるＡｄ５のＨＶＲを表Ｉに示す。表IIは、本発明におけるＨＶＲの定義によるヒトアデノウイルスＡｄ５、Ａｄ１１、Ａｄ２６、Ａｄ３５およびＡｄ４８、さらにチンパンジーアデノウイルス６８（Ｐａｎ９）の７つのＨＶＲ配列を提供する。それぞれのヘキソン配列内における特定の部分もまた、示してある。

Ａｄ５をベースとしたベクターで、１つまたは複数のＨＶＲがＡｄ３５（サブグループＢ）またはＡｄ４８（サブグループＤ）のものと交換されたものを作製した。

本発明のより‘絞られた’実施形態においては、上記のアデノウイルスセロタイプのＨＶＲは、いくらか短くしたものが定義される。これらのＨＶＲは表IVで、ＨＶＲ（１−７）^＊のように、星印をつけて示す。組み換えベクターにおいて絞られた定義を用い、バックボーンからＨＶＲ１^＊を欠失させ、ＨＶＲ２^＊は２つのアミノ酸から成る短いスペーサー（ＱＧ）で置き換え、ＨＶＲ３^＊、ＨＶＲ４^＊、ＨＶＲ５^＊、ＨＶＲ６^＊およびＨＶＲ７^＊は他のセロタイプのそれぞれに対応する短い（^＊）部分で置き換える。最も重要なのは、ＨＶＲ７が再定義によってより短くなっていることである（表IIと表IVを比較せよ）。

望みの配列を含むヘキソン遺伝子の一部分をGeneArt社（ドイツ）の技術により合成し、Apal-Hpal断片として、完全なＡｄ５ヘキソンタンパク質を含むシャトルプラスミドにクローニングした。その後、より大きな範囲のAscl-Ascl断片をこのシャトルプラスミドから切り出し、これをＡｄ５コスミドpWE.Ad5.AflII-rITR.dE3（Ｅ３領域が欠失し、コスミドpWE.Ad5.AflII-rITRをベースとしたベクター、WO 02/40665を参照）中のAscl-Ascl断片と置き換えた。この変異コスミドを（サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のgagタンパク質をコードする）アダプタープラスミドpAdApt-Gagと共にPER.C6/55K細胞（PER.C6（商標登録）細胞のＡｄ３５の55K E1B遺伝子を含む、WO 02/40665参照）にトランスフェクションし、相同組み換えにより組み換えＡｄ５ＨＶＲ３５（１）−Ｇａｇウイルス、組み換えＡｄ５ＨＶＲ４８（１）−Ｇａｇウイルス、および組み換えＡｄ５ＨＶＲ４８（１‐７）−Ｇａｇウイルスを得たが、ここで‘１’はＨＶＲ１のみの置き換えを意味し、‘１−７’は７つのＨＶＲ全ての置き換えを意味する。これらのベクターは、当技術分野で一般に用いる手順を用いてプラーク精製し、配列を解読し、エクスパンドし、ＣｓＣｌ密度勾配遠心法により精製した。Ａｄ５ＨＶＲ４８（１‐７）−Ｇａｇのヘキソンの配列は図１１に示す。

上で述べた３つのウイルスとは別に、以下の組み換えベクターもまた作製した：Ａｄ５ＨＶＲ３５（１−６）、Ａｄ５ＨＶＲ３５（１−７）（図１２）、Ａｄ５ＨＶＲ１１（１−６）、Ａｄ５ＨＶＲ１１（１−７）（図１３）、Ａｄ５ＨＶＲ２６（１−６）、Ａｄ５ＨＶＲ２６（１−７）（図１４）、Ａｄ５ＨＶＲＰａｎ９（１−６）、Ａｄ５ＨＶＲＰａｎ９（１−７）（図１５）。‘１−６’は、親ベクターのＨＶＲ７を残し、ＨＶＲ１〜ＨＶＲ６の置き換えを行うことを意味する。当然ながら、（Ａｄ２およびＡｄ５などの）複数の親ベクターが使用可能で、複数の稀なセロタイプが周知であるため、本発明の教示を使用すると更に多くの組み合わせが作製可能である。‘ステレス’のようなベクターを産生するためにそのＨＶＲを使用することのできる他の稀なアデノウイルスセロタイプはＡｄ２４、Ａｄ３４、Ａｄ４９およびＡｄ５０である。

実験未使用マウスおよび抗Ａｄ５免疫を有するマウスにおけるＡｄ５、Ａｄ５ＨＶＲ４８（１）およびＡｄ５ＨＶＲ４８（１−７）の免疫原性
上記の通り、パッケージング細胞を用いて、生存可能な組み換えウイルスであるＡｄ５−Ｇａｇ、Ａｄ５ＨＶＲ４８（１）−ＧａｇおよびＡｄ５ＨＶＲ４８（１−７）−Ｇａｇを産生した。Ａｄ５ＨＶＲ４８（１）−Ｇａｇの収率は組み換えＡｄ５−Ｇａｇウイルスと同程度であったが、Ａｄ５ＨＶＲ４８（１−７）−Ｇａｇの成長率、収率およびｖｐ／ｐｆｕ比はＡｄ５−Ｇａｇウイルスの約半分であった。まず、A549細胞にそれぞれのベクターを１０^９ｖｐまたは１０^１０ｖｐ感染させ、Gag発現を確認した。HPLCのデータから、細胞内Gag発現量は十分で、Ａｄ５ＨＶＲ４８（１−７）−Ｇａｇによる発現量はＡｄ５−Ｇａｇによる発現量よりもいくらか少なかったが、３つのベクターそれぞれによる発現量は同程度であることが示された。これはいくらか遅い成長速度に関係するかもしれない。

ウイルスの免疫原性はまず、実験未使用のC57/BL6マウス（各グループにつき４匹のマウス）をそれぞれのベクター１０^９ｖｐ、１０^８ｖｐ、１０^７ｖｐで免疫化することによって検討した。ワクチンによって誘発されたＣＤ８^＋Ｔリンパ球応答は、上記した通りＤ^ｂ／ＡＬ１１四量体結合アッセイによって２週間にわたって評価した。結果を図９に示す。全３つのベクターは、成長率や導入遺伝子の発現量に小さな違いがあることにかかわらず、これらの実験未使用マウスにおいて明らかに同程度の免疫応答を示した。

続いて、Ａｄ５をベースとしたベクターに対する既存免疫を産生するために、望みのウイルスによる免疫化の８週間前および４週間前の２度にわたって、予めC57/BL6マウスに１０^１０ｖｐのＡｄ５−Ｅｍｐｔｙを投与し、免疫化を行った（Ａｄ５ Ｎａｂ タイター８、１９２−１６、３８４）。続いて（最初の免疫化を行った８週間後に）上記の通りマウスを１０^９ｖｐ、１０^８ｖｐおよび１０^７ｖｐの組み換えＡｄ５−Ｇａｇ、Ａｄ５ＨＶＲ４８（１）−ＧａｇおよびＡｄ５ＨＶＲ４８（１−７）−Ｇａｇによって免疫化した。再び、ワクチンによって誘発されたＣＤ８^＋Ｔリンパ球応答を、上記した通りＤ^ｂ／ＡＬ１１四量体結合アッセイにより２週間にわたって評価した。結果は図１０に示す。ELISPOTの結果はテトラマーアッセイの結果を反映し、同様の結果を提供した（データは示さない）。予想通り、Ａｄ５−Ｇａｇベクターはこれらの予め免疫化されたマウスの体内で既存抗体に遭遇し、その結果免疫応答はほとんど検出することができなかった。Ａｄ５ＨＶＲ４８（１）−Ｇａｇウイルスも、高レベルの抗Ａｄ５免疫を回避することはできず、このことから既存免疫はＨＶＲ１のみに関わるものではないことが示唆される。重要なことに、Ａｄ５ＨＶＲ４８（１−７）−Ｇａｇウイルスの免疫原性はＡｄ５によって誘発された既存免疫の影響をうけず、Ａｄ５の（本明細書において同定した）７つのヘキソンＨＶＲに変異を加え、これらを（Ａｄ４８に例証される）稀なセロタイプの対応するＨＶＲで置き換えることによって、野生型のタンパク質に対する既存抗体に妨害されることのないベクターが得られるということが示された。マウスを空のＡｄ５ベクターで２度に渡りプライムし、高レベルの既存免疫が存在する状況を真似て行った実験からも同様の結果が得られた（図２１）。この実験は各グループにつき４匹のC57/BL6マウスを用いて行った。各グループのマウスを１０^１０ｖｐのＡｄ５−ｅｍｐｔｙの２度の投与によって予め免疫化し、抗Ａｄ５抗体を誘発した。Ａｄ５−ｅｍｐｔｙによって予め免疫化したマウスのＮＡｂタイターは８１９２〜１６３８４となった。続いて第０日にマウスを１０^９ｖｐのＡｄ３５−Ｇａｇの筋肉注射でプライムし、その後第２８日に１０^９ｖｐＡｄ５−Ｇａｇ、１０^９ｖｐＡｄ３５−Ｇａｇまたは１０^９ｖｐＡｄ５ＨＶＲ４８（１−７）−Ｇａｇでブーストした。全ての投与は体積５０μｌで行った。ｘ軸の矢印は免疫化を意味する。第０日、第７日、第１４日、第２１日、第２８日、第３５日、第４２日、第４９日、第５６日、に血液サンプルを採取し、ワクチンによって誘発されたＣＤ８^＋Ｔリンパ球応答を定量するためＤ^ｂ／ＡＬ１１四量体染色アッセイを行った。第５６日にはIFN-gamma ELISPOTアッセイも行い、同様な結果が得られた（データは示さない）。Ａｄ５−Ｇａｇは、おそらく抗Ａｄ５免疫が既存であったため、ブーストすることができなかった。また、Ａｄ３５−Ｇａｇも、おそらくプライム免疫によって抗Ａｄ３５免疫が誘発されたため、ブーストすることができなかった。Ａｄ５ＨＶＲ４８（１−７）は免疫応答を効果的にブーストさせ、このベクターがある種の新規の‘セロタイプ’としての機能を果たすことが認められた。Ａｄ５ＨＶＲ４８（１−７）は、Ａｄ５を用いることができない場合、また（Ａｄ３５などの）異種ベクターをプライムベクターとして使用する場合に効果的なブースティングベクターとして機能する、と結論付けられる。本発表における先の研究とあわせて、我々は、Ａｄ５ＨＶＲ４８（１−７）で表されるベクターが、抗Ａｄ５免疫が既存であってＡｄ５を有効に用いることのできない環境において、効果的なプライミングベクター、かつ効果的なブースティングベクターとして機能する、と結論する。

これらの結果より、プライム‐ブーストを行う際に（主にファイバータンパク質およびペントンタンパク質による）レセプター認識を変化させることなく、Ａｄ５をベースとしたベクターを用いることが可能となった。

ヒトアデノウイルスＡｄ２（Crawford-MikszaおよびSchnurr（1996）による）、 Ａｄ５（Ruxおよび Burnett,（2000）、Ruxら（2003）による）、およびＡｄ５（本発明による）のヘキソンタンパク質内の超可変領域の定義。RuxおよびBurnett（2000）によるＡｄ５のＨＶＲの定義は、Ａｄ２配列おけるCrawford-MikszaによるＨＶＲの定義に正確に一致する。これらのＨＶＲの定義は、RuxおよびBurnett（2000）による定義で最初のメチオニン残基が欠如しているために、表の数値が全て1つ変わることに注意する（例えばHVR1でl37-181など）。

本発明によるキメラの複製欠損アデノウイルスベクター。該ベクターの様々な構成要素の同定を含む。

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図１（Ａ）は、米国、ハイチ島、ボツワナ、ザンビアおよび南アフリカからのサンプルのＡｄ５、Ａｄ１１およびＡｄ３５の血清陽性率のパーセンテージを示す。図１（Ｂ）は、アフリカおよび米国からのサンプルのＡｄ５、Ａｄ１１およびＡｄ３５に対する中和抗体のタイターを示す。図１（Ｃ）は、これらのサンプルのＡｄ５、Ａｄ５ｆ３５、Ａｄ５ｆ３５ｐ３５、Ａｄ３５ｆ５およびＡｄ３５に対する中和抗体価を示す。 図２（Ａ）は、Ａｄ３５ｋ５ファイバータンパク質をコードする核酸配列を示す（配列番号１；Ａｄ５ファイバーノブをコードする領域には下線を引いた）；図２（Ｂ）は、Ａｄ３５ｋ５ファイバータンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号２；Ａｄ５ファイバーノブを示す領域には下線を引いた）；図２（Ｃ）は、Ａｄ３５ｆ５ファイバータンパク質をコードする核酸配列を示す（配列番号４；Ａｄ３５ファイバーの残された部分をコードする領域には下線を引き、ＢｓｉＷＩクローニングサイトは小文字で示した）；図２（Ｄ）は、Ａｄ３５ｆ５ファイバータンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号５；Ａｄ３５ファイバーの残された部分を示す領域には下線を引いた）；図２（Ｅ）は、Ａｄ３５ｋ２６ファイバータンパク質をコードする核酸配列を示す（配列番号８０；Ａｄ２６ファイバーノブをコードする領域には下線を引いた）；図２（Ｆ）は、Ａｄ３５ｋ２６ファイバータンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号８１；Ａｄ２６ファイバーノブを示す領域には下線を引いた）；図２（Ｇ）は、Ａｄ３５ｋ４９ファイバータンパク質をコードする核酸配列を示す（配列番号８２；Ａｄ４９ファイバーノブをコードする領域には下線を引いた）；図２（Ｈ）は、Ａｄ３５ｋ４９ファイバータンパク質のアミノ酸配列を示す（配列番号８３；Ａｄ４９ファイバーノブを示す領域には下線を引いた）。 図３は、SIV Gagをコードする遺伝子を含むＡｄ５ベクター、Ａｄ３５ｆｉｂ５．ＢＳＵベクター、Ａｄ３５．ＢＳＵベクター、およびＡｄ３５ベクターを実験未使用のマウスに投入した際にSIV Gagに対して誘発されるＴ細胞応答を、空ベクター（Ａｄ５．ｅｍｐｔｙおよびＡｄ３５．ｅｍｐｔｙ）を投入したマウスにおけるＴ細胞応答と比較したものである。ｙ軸はＳＦＣ／１０^６脾細胞を表す。 図４は、実験未使用のマウスの体内でSIV Gagを発現するＡｄ５ベクター、Ａｄ３５ｋ５ベクター、およびＡｄ３５ベクターの免疫原性を示し、それぞれのベクターを１０^９ｖｐ投与した場合（Ａ）、１０^８ｖｐ投与した場合（Ｂ）、それぞれのベクターを１０^８ｖｐ投与するのに先立って１０^１０ｖｐのＡｄ５−ｅｍｐｔｙベクターをを１回（Ｃ）または２回（Ｄ）投与した場合を示す。全ての場合において、Gag特異的ＣＤ８^＋Ｔリンパ球応答は、投与後複数回にわたって行ったＤ^ｂ／ＡＬ１１四量体結合アッセイにより評価した。 図５は、マウスの体内においてＡｄ３５ｋ５ベクターによって誘発された抗ベクター免疫を示す。（Ａ）第０週に１０^９ｖｐのＡｄ３５ｋ５−Ｇａｇでプライムし、第４週に１０^９ｖｐのＡｄ５−ＧａｇまたはＡｄ３５−Ｇａｇでブーストした実験未使用のマウス。（Ｂ）１０^９ｖｐのＡｄ５−Ｇａｇ、Ａｄ３５ｋ５−Ｇａｇ、またはＡｄ３５−Ｇａｇを投入し、ルシフェラーゼによるウイルス中和アッセイで評価したマウスの血清サンプル。 図６は、マウスの体内でHIV-1 Envを発現するＡｄ５ベクター、Ａｄ３５ｋ５ベクター、およびＡｄ３５ベクターの免疫原性を示す。実験未使用のBalb/cマウスに１０^８ｖｐのＡｄ５−Ｅｎｖ、Ａｄ３５ｋ５−Ｅｎｖ、またはＡｄ３５−Ｅｎｖを投入した。（Ａ）プールドペプチド（pooled peptide）アッセイ、およびＭＩ１０エピトープペプチド特異的IFN-yELISPOTアッセイによって評価したEnv特異的細胞免疫応答。（Ｂ）ELISAによって評価したEnv特異的液性免疫応答 図７は、第０週に１０^１１ｖｐのＡｄ５−Ｇａｇ（Ａ，Ｂ）、Ａｄ３５−Ｇａｇ（Ｃ，Ｄ）、およびＡｄ３５ｋ５−Ｇａｇ（Ｅ，Ｆ）でプライムしたアカゲザルの体内のＡｄ５ベクター、Ａｄ３５ｋ５ベクター、およびＡｄ３５ベクターの免疫原性を示す。第１２週に、全てのサルにブーストによる同種免疫を行った。Env特異的免疫応答およびGag特異的免疫応答は、免疫後複数回にわたるプールドペプチド（pooled peptide）IFN-yELISPOTアッセイによって評価した（Ａ、Ｃ、Ｅ）。ベクター特異的ＮａｂのタイターはＡｄ５およびＡｄ３５のウイルス中和アッセイによって評価した（Ｂ、Ｄ、Ｆ）。 図８は、図７に示した研究で用いたサルにおけるＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔリンパ球応答を示す。免疫後の第１６週に、サルからＣＤ８数の減少したＰＢＭＣおよびＣＤ４数の減少したＰＢＭＣを採取してプールドペプチド（pooled peptide）IFN-y ELISPOTアッセイを行った。１０^１１ｖｐの（Ａ）Ａｄ５−Ｇａｇ、（Ｂ）Ａｄ３５−Ｇａｇ、および（Ｃ）Ａｄ３５ｋ５−Ｇａｇを第０週および第１２週にマウスに投与した。 図９は、Ａｄ５−Ｇａｇベクター、Ａｄ５ＨＶＲ４８（１）−Ｇａｇベクター、およびＡｄ５ＨＶＲ４８（１−７）ベクターを実験未使用のマウスに（Ａ）１０^９ｖｐ、（Ｂ）１０^８ｖｐ、（Ｃ）１０^７ｖｐ投与した場合のそれぞれの免疫原性を示す。Ｇａｇ特異的ＣＤ８^＋Ｔリンパ球応答は免疫後複数回にわたるＤ^ｂ／ＡＬ１１四量体結合アッセイにより評価した。 図１０は、実験未使用のマウスに、１０^１０ｖｐのＡｄ５−Ｅｍｐｔｙを８週間前と４週間前の２回にわたって事前投与した後、Ａｄ５−Ｇａｇベクター、Ａｄ５ＨＶＲ４８（１）−Ｇａｇベクター、およびＡｄ５ＨＶＲ４８（１−７）ベクターを（Ａ）１０^９ｖｐ、（Ｂ）１０^８ｖｐ、（Ｃ）１０^７ｖｐ投与した場合のそれぞれの免疫原性を示す。 図１１は、Ａｄ５をベースとし、７つのＨＶＲをＡｄ４８の対応する７つのＨＶＲ（下線が引いてある）で置き換えたヘキソンタンパク質（Ａｄ５ＨＶＲ４８（１−７））のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。 図１２は、Ａｄ５をベースとし、７つのＨＶＲをＡｄ３５の対応する７つのＨＶＲ（下線が引いてある）で置き換えたヘキソンタンパク質（Ａｄ５ＨＶＲ３５（１−７））のアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。 図１３は、Ａｄ５をベースとし、７つのＨＶＲをＡｄ１１の対応する７つのＨＶＲ（下線が引いてある）で置き換えたヘキソンタンパク質（Ａｄ５ＨＶＲ１１（１−７））のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。 図１４は、Ａｄ５をベースとし、７つのＨＶＲをＡｄ２６の対応する７つのＨＶＲ（下線が引いてある）で置き換えたヘキソンタンパク質（Ａｄ５ＨＶＲ２６（１−７））のアミノ酸配列（配列番号１５）を示す。 図１５は、Ａｄ５をベースとし、７つのＨＶＲをＰａｎ９アデノウイルスの対応する７つのＨＶＲ（下線が引いてある）で置き換えたヘキソンタンパク質（Ａｄ５ＨＶＲＰａｎ９（１−７））のアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。 図１６は、バックグランド条件下での（感染なし、グラフ１°＆２°Ａｂ）、およびＡｄ３５ｋ５による感染後の（２つのバッチ：＃４、＃５）、Ａｄ３５ｋ２６による感染後の（２つのバッチ：＃３が２つ、＃２８）、そしてＡｄ３５ｋ４９による感染後の（３つのバッチ：＃４、＃５、＃９）、細胞内のgag染色を示す。 図１７は、Ａｄ５ＨＶＲ４８（１−７）^＊（配列番号８４）のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列を示し、ここでは表４で定義されたＨＶＲ１配列が欠失しており、表４によるＨＶＲ２配列がＱＧリンカーで置き換えられ、また表４の定義によるＨＶＲ３〜ＨＶＲ５はＡｄ５のものがＡｄ４８のもので置き換えられている。 図１８は、Ａｄ５ＨＶＲ３５（１−７）^＊（配列番号８５）について図１７と同様で、ある。 図１９は、Ａｄ５ＨＶＲ２６（１−７）^＊（配列番号８６）について図１７と同様で、ある。 図２０は、Ａｄ５ＨＶＲ４９（１−７）^＊（配列番号８７）について図１７と同様で、ある。 図２１は、Ａｄ５−ｅｍｐｔｙの２回の事前投与の後、第０日にＡｄ３５−Ｇａｇによるプライムを行い、第２８日に示す通りの３種の異なったベクターによってブーストを行った後のマウスにおけるＣＤ８^＋Ｔリンパ球応答を示したグラフである。

Claims (8)

1. キメラヘキソンタンパク質を含む組み換えアデノウイルスにおいて、キメラヘキソンタンパク質の配列が配列番号１２からなる組み換えアデノウイルス。
2. アデノウイルスセロタイプ５（Ａｄ５）をベースとした複製欠損の組み換えアデノウイルスにおいて、
   キメラヘキソンタンパク質を備え、ここで前記キメラヘキソンタンパク質において、Ａｄ５のＨＶＲ１〜ＨＶＲ７の超可変領域の配列が、Ａｄ４８の超可変領域の配列と、
   Ａｄ５のＨＶＲ１配列（配列番号１７）が、配列番号２４からなる配列と置換されており、
   Ａｄ５のＨＶＲ２配列（配列番号１８）が、配列番号２５からなる配列と置換されており、
   Ａｄ５のＨＶＲ３配列（配列番号１９）が、配列番号２６からなる配列と置換されており、
   Ａｄ５のＨＶＲ４配列（配列番号２０）が、配列番号２７からなる配列と置換されており、
   Ａｄ５のＨＶＲ５配列（配列番号２１）が、配列番号２８からなる配列と置換されており、
   Ａｄ５のＨＶＲ６配列（配列番号２２）が、配列番号２９からなる配列と置換されており、
   Ａｄ５のＨＶＲ７配列（配列番号２３）が、配列番号３０からなる配列と置換されているように置換されており、
   ＨＶＲの配列の間の配列がＡｄ５に由来する複製欠損の組み換えアデノウイルス。
3. 前記複製欠損のアデノウイルスが所定の異種の核酸を含む請求項２記載の複製欠損の組み換えアデノウイルス。
4. 前記組み換えアデノウイルスが所定の異種の核酸を含む請求項１記載の組み換えアデノウイルス。
5. Ｅ１領域における欠損を有するアデノウイルスのゲノムを含む請求項１記載の組み換えアデノウイルス。
6. 前記アデノウイルスのゲノムがＥ３領域における欠損を更に有する請求項５記載の組み換えアデノウイルス。
7. 前記複製欠損のアデノウイルスが、Ｅ１領域における欠損を有するアデノウイルスのゲノムを含む請求項２記載の複製欠損の組み換えアデノウイルス。
8. 前記アデノウイルスのゲノムがＥ３領域における欠損を更に有する請求項７記載の複製欠損の組み換えアデノウイルス。

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