CN102199616B - Hiv-1表型耐药检测载体及其构建方法 - Google Patents

Hiv-1表型耐药检测载体及其构建方法 Download PDF

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Abstract

一种HIV-1表型耐药检测载体，其特征在于，所述载体结构如图6所示。本发明是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，这项强大的体外技术利用位点特异重组不再需要使用限制性内切酶和连接酶，省时省力，保证目的基因正确的方向和阅读框。本发明克隆得到的入门载体可以多次使用，转移目的基因到Gateway改造过的各种表达载体。因此本项新型表型耐药检测载体一方面将大大缩短表型耐药检测时间，提高检测效率，另一方面可以为进一步HIV-1表型耐药的研究打下基础。

Description

HIV-1表型耐药检测载体及其构建方法
技术领域
本发明充分利用分子克隆技术和位点重组原理，构建一个入门克隆和目的表达克隆。构成新型表型耐药检测系统。
背景技术
艾滋病抗病毒治疗的广泛应用显著延长了患者寿命，提高了患者的生活质量，大大降低了HIV/AIDS相关发病率和死亡率。但是HIV耐药性的出现却极大地限制了抗病毒治疗的效果。
HIV耐药不仅使患者抗病毒治疗的效果下降，甚至完全失败。HIV耐药株的出现和流行将带来严重的公共卫生问题：1)耐药导致的治疗失败使艾滋病死亡病例增加；2)更换“二线药物”导致治疗费用增加；3)HIV耐药株的传播。
HIV-1耐药检测不仅可以帮助公共卫生研究人员了解耐药毒株传播现状和趋势，以制定相应的公共卫生防治策略，还可以帮助临床医生选择有效地药物尤其是在对一线或二线药物治疗出现病毒学失败的病例，因此耐药检测无论是对耐药流行株的检测还是对艾滋病患者的关怀都是一种非常重要和有价值的方法。表型耐药检测能够直接定量评估HIV耐药情况，而且对于非B亚型和任何新的抗病毒药耐药均可评估。然而假病毒骨架载体分子很大，传统的表型耐药检测系统很难及时有效的将RT区耐药片段置换进去，致使检测时间长，不利于临床合理治疗方案的及时制定。基于此，我们必须依托我们实验室现有条件，发明出一种全新、高效和快速的HIV-1表型耐药检测系统。
发明内容
本发明目的在于构建利用位点重组HIV-1表型耐药检测载体，提高表型耐药检测效率。
本发明的另一目的在于提供上述载体构建方法。
本发明的发明思路基于下述两方面的考虑。第一，在艾滋病临床治疗工作中，表型耐药检测能够为艾滋病患者的治疗方案的制定提供重要依据。然而假病毒骨架载体分子很大传统的表型耐药检测系统很难及时有效的将RT区耐药片段置换进去，致使检测时间长，严重影响了耐药检测原有的效果；第二，GatewayTM技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95％或更高。它主要是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统(attB x attP→attL xattR)。BP和LR两个反应就构成了GatewayTM技术。BP反应利用一个attB DNA片段和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。基于上述原理，我们开发了一项新型表型耐药检测系统，它将大大缩短表型耐药检测时间，提高检测效率。
为了达成本发明上述目的，本发明采用如下具体技术方案：
HIV-1表型耐药检测载体，所述载体结构如图6所示。
所述载体的碱基序列如SEQ ID No.3所示。
一种上述的HIV-1表型耐药检测载体的构建方法，具体步骤如下：
(1)pcDNA6.2gw_miR载体(invitrogen公司，结构如图1所示)重建，利用限制性内切酶BamH1和BaglII切割pcDNA6.2gw_miR载体并重组加入gag-pol片段得到pcDNA6.2-gag-pol载体，所述pcDNA6-gag-pol结构如图2所示；
(2)pNL4-3载体(结构如图4所示)重建，利用Mscil限制性内切酶切割p NL4-3载体，删除原有pol区，自连形成缺失pol区的载体pNL4-3-1载体，利用限制性内切酶spe1和apa1切割plenti6 v5/dest(invitrogen结构如图3所示)得到ATTR片段，利用限制性内切酶spe1和apa1切割pNL4-3-1载体回收载体，将载体和ATTR片段定向连接，得到pNL4-3-ATTR载体，结构如图5所示；
(3)将pcDNA6.2-gag-pol质粒和pNL4-3-ATTR质粒经BP、LR反应后最终得到质粒pNL4-3-gag-pol，结构如图6所示；
(4)将上述pNL4-3-gag-pol与pcDNA3.1-ENV质粒共转染293细胞得到假病毒，假病毒感染Ghost细胞检测荧光素酶基因表达情况。
上述载体在制备HIV-1表型耐药检测试剂盒中的用途。
本发明的有益效果：
本发明是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，这项强大的体外技术利用位点特异重组不再需要使用限制性内切酶和连接酶，省时省力，保证目的基因正确的方向和阅读框。本发明克隆得到的入门载体可以多次使用，转移目的基因到Gateway改造过的各种表达载体。因此本项新型表型耐药检测载体一方面将大大缩短表型耐药检测时间，提高检测效率，另一方面可以为进一步HIV-1表型耐药的研究打下基础。
附图说明
图1为pcDNA6.2gw_miR载体；
图2为构建的pcDNA6.2-gag-pol载体；
图3为plenti6 v5/dest载体结构图；
图4为pNL4-3载体结构图；
图5为pNL4-3-ATTR载体结构图；
图6为重组pNL4-3-gag-pol载体结构图。
具体实施方式
本发明所述新型HIV-1表型耐药检测载体是利用下述方法构建的，步骤为：
(一)基于invitrogen公司gateway重组系统的pcDNA6.2gw_miR载体重建
1.pcDNA6.2-gag-1载体构建
1.1PCR扩增gag-1片段，序列如SEQ ID No.1所示。
引物：gag-S-BamH1：tgactagcggatcctagaaggaga
gag-ASE-NheI-BgII：GAGAGATCTGAGGGAAGCTAGCGGATACAG
模板为pNL4-3质粒(pNL4-3为HIV-1野生株假病毒骨架质粒，GenBank编号：M19921.2)PCR条件：94℃预变性2min，94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸1.5min循环30次，最后72℃延伸10min。
1.2gag-1片段用BamhI和BglII酶切回收gag-1片段，插入pcdna6.2gw_miR载体(invitrogen公司，结构如图1所示)(pcdna6.2gw_miR用BamHI和BgII切割回收载体)形成pcDNA6.2-gag-1载体序列如SEQ ID No.2所示。
2.pcDNA6.2-gag-2载体构建
2.1PCR扩增gag-2片段，序列如SEQ ID No.3所示。
引物：gag-S2-BamH1：ttttagggaggatccggccttcccacaag
gag-ASE-NheI-BgII：GAGAGATCTGAGGGAAGCTAGCGGATACAG
模板为pNL4-3质粒，PCR条件：94℃预变性2min，94℃变性30s、50℃退火30s、72℃延伸0.5min循环30次，最后72℃延伸10min。
2.2用BamhI和BgII酶切gag-2片段回收并插入pcDNA6.2-gag-1载体(pcdna6.2-gag-1用BglII切割)形成载体pcDNA6.2-gag载体，序列如SEQ IDNo.4所示。
3.pcDNA6.2-pol-S1载体构建
3.1PCR扩增pol-S1片段序列如SEQ ID No.5
引物：pol-S1-BamHI：TtccctcGGATCCctctttggcagc
pol-AS1-BglII：CTATTGGCTGCCAGATCTACATAGAAAGTT
模板为pNL4-3质粒，PCR条件：94℃预变性2min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1.5min，循环30次，最后72℃延伸10min。
3.2回收pol-S1片段PCR产物插入pMD18-T Simple载体(takara公司)序列如SEQID No.6所示。
3.3利用PCR扩增突变链，DpnI消化甲基化质粒即未突变的模板链的原理，合成两条反向互补的突变引物：
ECORI-mut-s：CCAAAGCACTAACAGAATTCGTACCACTAACAGAAG
ECORI-mut-as：CTTCTGTTAGTGGTACGAATTCTGTTAGTGCTTTGG
将pol-S1片段内逆转录酶区(RT区)C端形成ECORI突变位点。
PCR条件：94℃预变性2min，94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸4min，循环30次，最后72℃延伸10min。突变后形成pMD18-Simple-pol-S1载体，序列如SEQID No.7所示。
3.4用BamHI和BgII酶切pMD18-Simple-pol-S1载体pol-S1片段插入pcDNA6.2gw_miR载体(pcDNA6.2gw_miR用BamHI和BgII切割)，形成pcDNA6.2-pol-S1载体，序列如SEQ ID No.8。
4.pcDNA6.2-pol-S2载体构建
4.1PCR扩增pol-S2片段，序列如SEQ ID No.9所示。
引物：pol-S2-BamHI：aactttctatgtggatccggcagccaatag
pol-AS2-BglII：GGTGTTTTACAGATCTTTTCCATGTG
模板为pNL4-3质粒PCR条件：94℃预变性2min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1.5min，循环30次，最后72℃延伸10min。
4.2用BamHI和BgII酶切回收pol-S2片段插入pcDNA6.2gw_miR载体(pcDNA6.2gw_miR用BamHI和BgII切割)形成pcDNA6.2-pol-S2载体，序列如SEQ IDNo.10。
5.pcDNA6.2-pol载体构建
用XhoI和BgII切割pcDNA6.2-pol-S1，回收载体，用BamHI和XhoI切割pcDNA6.2-pol-S2后回收片段与线性pcDNA6.2-pol-S1相连构成pcDNA6.2-pol载体序列如SEQ ID No.11所示。
6.pcDNA6.2-gag-pol载体构建
用XhoI和BgII切割pcDNA6.2-gag，回收载体，用BamHI和XhoI切割pcDNA6.2-pol后回收小片段与线性pcDNA6-gag相连构成pcDNA6.2-gag-pol序列如SEQ IDNo.12所示，结构如图2所示。
(二)pNL4-3-ATTR载体重建
1.利用Mscil限制性内切酶切割pNL4-3载体(结构如图4所示)，删除原有pol区，自连形成缺失pol区的载体，即pNL4-3-1载体，序列如SEQ ID No.13。
2.利用限制性内切酶spe1和apa1切割plenti6v5/dest(invitrogen，结构如图3所示)和pNL4-3-1载体，回收ATTR片段(序列如SEQ ID No.14所示)和线性pNL4-3-1载体，定向连接，得到pNL4-3-ATTR载体序列如SEQ ID No.15所示，结构如图5所示。
(三)基于invitrogen公司gateway重组系统
1.将构建好的pcDNA6-gag-pol质粒和pNL4-3-ATTR质粒经BP LR反应后(具体步骤参照invitrogen公司BP LR试剂盒标准步骤)最终得到质粒pNL4-3-gag-pol序列如SEQ ID No.16，结构如图6所示。
2.并将其与pcDNA3.1-ENV质粒共转染293细胞得到假病毒(转染步骤参照engreen公司EntransterTM-H转染试剂说明书)，检测上清P24抗原，结果如表1所示，证实病毒表达。
表1重组载体转染293细胞测上清P24抗原结果
  样本   P24检测值
  阴性对照   0.0789
  阳性对照   0.986
  样本上清   2.467
用得到的样本假病毒和NL4-3假病毒(阳性对照)各约1X106个病毒感染六孔板培养的CD4和CCR5受体阳性的Ghost细胞，24小时后裂解细胞，检测荧光素酶基因表达情况。结果显示，两例重组标本的报告基因数值分别是阴性对照的9到15倍，差异显著，而和阳性对照相比没有显著差异(结果如表2)。该结果显示上述载体可以工作，本发明技术可以实施。
表2假病毒感染Ghost细胞后报告基因结果
  样本   荧光素酶报告基因结果
  水   235
  阴性对照   400
  阳性对照   4294
  样本1   3631
  样本2   5465
(四)耐药检测补充说明
1.因构建pcDNA6.2-gag-pol载体的蛋白酶-逆转录酶区(PR-RT区)大约有1.2kb片段其上下游包含Nhe1和ECOR1制性内切酶酶切位点，可以用一步法RT-PCR扩增HIV病人耐药区片段后经Nhe1和ECOR1酶切后置换野生型蛋白酶-逆转录酶区，按照(三)步骤进而表型耐药检测
2.同时为了配合此表型耐药载体检测系统的推广我们做了常见蛋白酶-逆转录酶区(PR-RT区)单位点耐药突变，将其插入pcDNA6.2-gag-pol载体，进行相应耐药检测后以求得到适合本系统的cut-off值。
Figure IDA0000052093790000011
Figure IDA0000052093790000021
Figure IDA0000052093790000031
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Figure IDA0000052093790000121
Figure IDA0000052093790000131
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Figure IDA0000052093790000181
Figure IDA0000052093790000191
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Figure IDA0000052093790000241
Figure IDA0000052093790000251
Figure IDA0000052093790000261
Figure IDA0000052093790000281
Figure IDA0000052093790000291
Figure IDA0000052093790000321
Figure IDA0000052093790000331
Figure IDA0000052093790000341
Figure IDA0000052093790000351
Figure IDA0000052093790000361
Figure IDA0000052093790000371
Figure IDA0000052093790000391
Figure IDA0000052093790000401
Figure IDA0000052093790000411
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Figure IDA0000052093790000441
Figure IDA0000052093790000451
Figure IDA0000052093790000461
Figure IDA0000052093790000471

Claims (8)

1.HIV-1表型耐药检测载体，其特征在于，所述载体结构如图6所示。
2.根据权利要求1所述的HIV-1表型耐药检测载体，其特征在于，所述载体的碱基序列如SEQ ID No.16所示。
3.一种权利要求1所述的HIV-1表型耐药检测载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）pcDNA6.2-gag-pol载体构建：利用限制性内切酶BamH1和BaglII切割pcDNA6.2gw_miR载体并重组加入gag-pol片段得到pcDNA6.2-gag-pol载体；
（2）pNL4-3-ATTR载体重建：利用Msci1限制性内切酶切割pNL4-3载体，删除原有pol区，自连形成缺失pol区的载体pNL4-3-1载体，利用限制性内切酶spe1和apa1切割plenti6 v5/dest得到ATTR片段，利用限制性内切酶spe1和apa1切割pNL4-3-1载体回收载体，将载体和ATTR片段定向连接，得到pNL4-3-ATTR载体；
（3）将pcDNA6.2-gag-pol质粒和pNL4-3-ATTR质粒利用invitrogen公司的BP LR试剂盒，经BP、LR反应后最终得到质粒pNL4-3-gag-pol，序列如SEQ ID No.16所示，结构如图6所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述pcDNA6.2-gag-pol载体如序列表SEQ ID No.12所示。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述pNL4-3-ATTR载体如序列表如SEQ ID No.15所示。
6.权利要求1或2所述载体在制备HIV-1表型耐药检测试剂盒中的用途。
7.一种用于构建权利要求1所述HIV-1表型耐药检测载体的入门载体pcDNA6.2-gag-pol，其特征在于，所述入门载体pcDNA6.2-gag-pol的序列如序列表SEQID No.12所示。
8.一种用于构建权利要求1所述HIV-1表型耐药检测载体的目的载体pNL4-3-ATTR，其特征在于，所述目的载体pNL4-3-ATTR如序列表如SEQ ID No.15所示。
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