CN105648037B - 一种重组慢病毒在hiv表型耐药检测中的应用 - Google Patents
一种重组慢病毒在hiv表型耐药检测中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105648037B CN105648037B CN201511033231.3A CN201511033231A CN105648037B CN 105648037 B CN105648037 B CN 105648037B CN 201511033231 A CN201511033231 A CN 201511033231A CN 105648037 B CN105648037 B CN 105648037B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plasmid
- vector
- hiv
- cells
- pspax2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 title claims abstract description 47
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 title abstract description 36
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 title abstract description 31
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 104
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 37
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 9
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 8
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 claims description 8
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 5
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 101150075675 tatC gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 2
- 101000856513 Homo sapiens Inactive N-acetyllactosaminide alpha-1,3-galactosyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 102100025509 Inactive N-acetyllactosaminide alpha-1,3-galactosyltransferase Human genes 0.000 claims 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 abstract description 42
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 abstract description 41
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 abstract description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 27
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 10
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 abstract description 9
- 239000002259 anti human immunodeficiency virus agent Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 abstract description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 116
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 87
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 85
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 51
- XNKLLVCARDGLGL-JGVFFNPUSA-N Stavudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1C=C[C@@H](CO)O1 XNKLLVCARDGLGL-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 25
- 229960001203 stavudine Drugs 0.000 description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- ILAYIAGXTHKHNT-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(2,4,6-trimethyl-phenylamino)-pyrimidin-2-ylamino]-benzonitrile Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1NC1=CC=NC(NC=2C=CC(=CC=2)C#N)=N1 ILAYIAGXTHKHNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 11
- WREGKURFCTUGRC-POYBYMJQSA-N Zalcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)CC1 WREGKURFCTUGRC-POYBYMJQSA-N 0.000 description 11
- 229950006497 dapivirine Drugs 0.000 description 11
- 229960002555 zidovudine Drugs 0.000 description 11
- HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N zidovudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 11
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 10
- NQDJXKOVJZTUJA-UHFFFAOYSA-N nevirapine Chemical compound C12=NC=CC=C2C(=O)NC=2C(C)=CC=NC=2N1C1CC1 NQDJXKOVJZTUJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- BXZVVICBKDXVGW-NKWVEPMBSA-N Didanosine Chemical compound O1[C@H](CO)CC[C@@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 BXZVVICBKDXVGW-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- PYGWGZALEOIKDF-UHFFFAOYSA-N etravirine Chemical compound CC1=CC(C#N)=CC(C)=C1OC1=NC(NC=2C=CC(=CC=2)C#N)=NC(N)=C1Br PYGWGZALEOIKDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960002049 etravirine Drugs 0.000 description 8
- YIBOMRUWOWDFLG-ONEGZZNKSA-N rilpivirine Chemical compound CC1=CC(\C=C\C#N)=CC(C)=C1NC1=CC=NC(NC=2C=CC(=CC=2)C#N)=N1 YIBOMRUWOWDFLG-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 8
- 229960002814 rilpivirine Drugs 0.000 description 8
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 229960000523 zalcitabine Drugs 0.000 description 7
- KJHKTHWMRKYKJE-SUGCFTRWSA-N Kaletra Chemical compound N1([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)COC=2C(=CC=CC=2C)C)CC=2C=CC=CC=2)CCCNC1=O KJHKTHWMRKYKJE-SUGCFTRWSA-N 0.000 description 6
- QAGYKUNXZHXKMR-HKWSIXNMSA-N nelfinavir Chemical compound CC1=C(O)C=CC=C1C(=O)N[C@H]([C@H](O)CN1[C@@H](C[C@@H]2CCCC[C@@H]2C1)C(=O)NC(C)(C)C)CSC1=CC=CC=C1 QAGYKUNXZHXKMR-HKWSIXNMSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- QAGYKUNXZHXKMR-UHFFFAOYSA-N CPD000469186 Natural products CC1=C(O)C=CC=C1C(=O)NC(C(O)CN1C(CC2CCCCC2C1)C(=O)NC(C)(C)C)CSC1=CC=CC=C1 QAGYKUNXZHXKMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XQSPYNMVSIKCOC-NTSWFWBYSA-N Emtricitabine Chemical compound C1=C(F)C(N)=NC(=O)N1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 XQSPYNMVSIKCOC-NTSWFWBYSA-N 0.000 description 5
- 229960000531 abacavir sulfate Drugs 0.000 description 5
- WMHSRBZIJNQHKT-FFKFEZPRSA-N abacavir sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.C=12N=CN([C@H]3C=C[C@@H](CO)C3)C2=NC(N)=NC=1NC1CC1.C=12N=CN([C@H]3C=C[C@@H](CO)C3)C2=NC(N)=NC=1NC1CC1 WMHSRBZIJNQHKT-FFKFEZPRSA-N 0.000 description 5
- 229960002656 didanosine Drugs 0.000 description 5
- 229960000366 emtricitabine Drugs 0.000 description 5
- 229960004525 lopinavir Drugs 0.000 description 5
- 229960000884 nelfinavir Drugs 0.000 description 5
- 229960000689 nevirapine Drugs 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 2
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 2
- 238000011225 antiretroviral therapy Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 206010052804 Drug tolerance Diseases 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010016183 Human immunodeficiency virus 1 p16 protease Proteins 0.000 description 1
- 101900297506 Human immunodeficiency virus type 1 group M subtype B Reverse transcriptase/ribonuclease H Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 229940125676 combination antiviral drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- LLYJISDUHFXOHK-GOCONZMPSA-N ferroptocide Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]23C[C@@H](C(=O)[C@]2([C@@]1([C@@H](C[C@H]([C@@H]3C)C4=CCN5C(=O)N(C(=O)N5C4)C6=CC=CC=C6)OC(=O)CCl)C)O)O LLYJISDUHFXOHK-GOCONZMPSA-N 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011337 individualized treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013326 plasmid cotransfection Methods 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000135 prohibitive effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用,该重组慢病毒是包装质粒、包膜质粒和转移质粒共转染293FT细胞或293T细胞后得到的包装体;其中,所述包装质粒为psPAX2m‑pol质粒;所述转移质粒为pHAGE‑CMV‑Luc‑IRES‑ZsGreen质粒。该重组慢病毒安全高效毒副作用小成本低,将其应用于HIV表型耐药检测中,能为临床上合理有效地选用抗HIV药物提供重要参考依据。该转移质粒报告基因Luciferase与ZsGreen位于pHAGE‑CMV‑Luc‑IRES‑ZsGreen上,且由CMV启动子控制报告基因Luciferase与ZsGreen的表达,使得HIV‑1抑制剂的抗病毒效果能够简易地通过在倒置荧光显微镜下观察到或通过测定荧光素酶活性而获得,将pol区导入后,多种细胞用具有此转移质粒的重组慢病毒均可进行耐药性检测,通用性强。
Description
技术领域
本发明涉及及医学分子生物学领域,具体涉及了一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用。
背景技术
过去的数十年中,多种HIV-1抑制药物已批准入市,用于HIV感染病人的治疗。基于HIV-1逆转录酶和(或)蛋白酶的两种或多种抑制剂联合应用的高效抗逆转录病毒疗法(HAART),被公认为是治疗HIV感染病人最有效方法之一。它不仅能够提高HIV感染病人的生活质量也能降低HIV的感染风险。尽管HAART能够抑制病毒的复制和降低HIV感染的风险,但不能清除HIV-1感染者体内的病毒。因此,抗逆转录病毒疗法会因药物选择性压力下新现的耐药毒株而大打折扣。因此,很有必要监测耐药毒株并对临床精准抗病毒治疗提供指导。
目前,对于HIV药物耐药性检测主要有基因型和表型耐药两种检测类型。基因型耐药检测是通过序列分析,能检出HIV-1靶基因中特定耐药相关的基因突变,因其操作简便,成本低廉,及在线的评估系统的应用,较表型耐药检测常用。但是,基因型检测不能用于解释不常见的突变或几种突变型的混合突变。表型耐药检测,能够在体外测定HIV-1抑制剂作用下的病毒产量或酶活性,能够直接测定每种抑制剂的耐药水平,而无需知晓HIV-1毒株的基因突变。因此,表型耐药检测对于HIV-1感染的病人,特别是为已经多次治疗的病人提供精准的药物指导是很有意义的。通常情况下,表型耐药检测是分离和培养临床毒株。但是,这些检测需要采集献血者新鲜的外周血单个核细胞,这将耗时耗力。最近,有一些检测基于重组病毒的单环感染,或用感染性粒子进行多轮感染。尽管这些检测用于表型耐药分析有巨大的应用前景,但是,由于采用高通量定量萤火虫萤光素酶表达系统,成本还是很高昂,再就是可能存在着生物安全问题。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足,本发明提供了一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用,该重组慢病毒安全高效毒副作用小成本低,将其应用于HIV表型耐药检测中,能为临床上合理有效地选用抗HIV药物提供重要参考依据。该重组慢病毒带有的转移质粒,其报告基因Luciferase与ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上,且由CMV启动子控制报告基因Luciferase与ZsGreen的表达,使得HIV-1抑制剂的抗病毒效果能够简易地通过在倒置荧光显微镜下观察到或通过测定荧光素酶活性而获得,将pol区导入后,多种细胞用具有此转移质粒的重组慢病毒均可进行耐药性检测,通用性强。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现:
本发明的发明思路基于以下考虑。第一,在艾滋病人临床治疗工作中,表型耐药检测能为患者个体化治疗提供参考。但是表型耐药检测是分离和培养临床毒株。但是,以往的检测方法存在耗时耗力或是成本高昂,及生物安全性的问题。基于此,发明人开发了一种具有新的转移质粒的重组慢病毒,它具有简易操作性、较好的生物安全性及通用性。
一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用,该重组慢病毒是包装质粒、包膜质粒和转移质粒共转染293FT细胞或293T细胞后得到的包装体;其中,所述包装质粒为psPAX2m-pol质粒;所述转移质粒为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen质粒。
进一步地,所述转移质粒结构如图1所示。
进一步地,所述转移质粒的构建方法,包括以下步骤:使用BamH I和Kpn I双酶切pMD2.G质粒,回收酶切产物,收取119bp CMV片段;将pHAGE-EF1α-IRES-ZsGreen质粒用BamHI和Kpn I进行双酶切,回收4736bp pHAGE-IRES-ZsGreen片段;将回收的CMV片段和pHAGE-IRES-ZsGreen用T4DNA连接酶进行连接,连接成功后,提取的质粒命名为pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒;使用NcoI和XbaI双酶切PGL3-Promoter Vector,回收1906bp Luciferase片段,pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒用NcoI和XbaI双酶切,回收4855bp的片段,将该片段和Luciferase片段用T4DNA连接酶进行连接;连接成功后,提取的质粒即为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen。
进一步地,所述psPAX2m-pol质粒结构如图3所示。
进一步地,所述psPAX2m-pol质粒序列如SEQ ID No.6所示。
进一步地,所述psPAX2m-pol质粒的构建方法,包括以下步骤:
psPAX2载体重建:利用长引物法突变psPAX2载体的酶切位点AgeI,获得psPAX2-1载体;利用定点突变试剂盒突变psPAX2-1载体的酶切位点ApaI,获得psPAX2-2载体;DpnI酶切psPAX2-2载体,酶切产物转化XL 10-GOLD感受态细胞,质粒提取,ApaI酶切该质粒,挑取酶切产物鉴定测序,获得psPAX2m载体,其序列如SEQ ID No.4所示;
psPAX2m-pol质粒构建:利用PCR扩增pol片段,其序列如SEQ ID No.5所示;用ApaI和AgeI酶切扩增后的pol片段回收并插入psPAX2m载体,得到psPAX2m-pol质粒,其序列如SEQ ID No.6所示。
进一步地,所述psPAX2-1载体的序列如SEQ ID No.2所示。
进一步地,所述psPAX2-2载体的序列如SEQ ID No.3所示。
进一步地,所述psPAX2m载体的序列如SEQ ID No.4所示。
进一步地,所述长引物法突变psPAX2载体所用的引物为AgeI-F和AgeI-R,其中,
AgeI-F:CGAAGAGCTC ATCAGAACAG TCAGACTCAT CAAGCTTCTC TATC;
AgeI-R:CTGCTAGCTA TAGTTCTAGA GGTATCGGTT GTTTCGAGCT TATAG;
模板为psPAX2,PCR条件:94℃预变性4min,94℃变性20s、55℃退火20s、72℃延伸1min,循环35次,最后72℃延伸5min;
所述利用定点突变试剂盒突变psPAX2-1载体所用的引物为M-ApaI-F和M-ApaI-R;其中,
M-ApaI-F:GCC TTG AGG GGC CTC CGG GGA CGG CCC TTT GTG CGG GG
M-ApaI-R:CCC CGC ACA AAG GGG CCG TCC CGG AGC CCC CTC AAG GC;
模板为psPAX2-1,PCR条件:95℃预变性2min,95℃变性30sec,55℃退火1min,68℃延伸10min,循环18次。
本发明具有如下有益效果:一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用,该重组慢病毒安全高效毒副作用小成本低,将其应用于HIV表型耐药检测中,能为临床上合理有效地选用抗HIV药物提供重要参考依据。该重组慢病毒带有的转移质粒,其报告基因Luciferase与ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上,且由CMV启动子控制报告基因Luciferase与ZsGreen的表达,使得HIV-1抑制剂的抗病毒效果能够简易地通过在倒置荧光显微镜下观察到或通过测定荧光素酶活性而获得,将pol区导入后,多种细胞用具有此转移质粒的重组慢病毒均可进行耐药性检测,通用性强。
附图说明
图1为本发明中转移质粒的结构图;
图2为本发明中转移质粒的构建方法示意图;
图3为本发明中包装质粒的结构图;
图4为本发明中荧光显微镜下质粒共转染情况;其中:左边一列为载体突变前,病毒感染293A细胞荧光百分比;右边一列为载体突变后,病毒感染293A细胞荧光百分比,其中,
A与D表示原始病毒液感染293A细胞荧光百分比;
B与E表示原始病毒液稀释10倍后感染293A细胞荧光百分比;
C与F表示原始病毒液稀释100倍后感染293A细胞荧光百分比
结果:从各个梯度百分比可以看出,载体改造后,对病毒的浓度和感染性无影响;
图5中A~C分别为使用本发明重组慢病毒共转染293A细胞,抗HIV药物司他夫定敏感性与细胞数目、病毒MOI及病毒感染时间相关实验结果;
图6为本发明中重组慢病毒活性滴度情况;
图7中A~C分别为使用本发明重组慢病毒共转染TZM-B细胞,抗HIV药物齐多夫定(D4T)敏感性与细胞数目、病毒MOI及病毒感染时间相关实验结果;
图8中A~C分别为使用本发明重组慢病毒共转染huh7.5细胞,抗HIV药物齐多夫定(D4T)敏感性与细胞数目、病毒MOI及病毒感染时间相关实验结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明。
本发明一种重组慢病毒系统是利用下述方法构建的,步骤为:
(1)转移质粒的构建
本发明的转移质粒具有双报告基因荧光素酶Luciferase与ZsGreen,其具体结构如图1所示。Luciferase与ZsGreen为各自独立表达的蛋白,而非融合蛋白。
如图2所示,该转移质粒的构建方法如下:
(1.1)使用BamH I和Kpn I双酶切pMD2.G质粒,回收酶切产物,收取119bp CMV片段;
(1.2)将pHAGE-EF1α-IRES-ZsGreen质粒用BamH I和Kpn I进行双酶切,回收4736bp pHAGE-IRES-ZsGreen片段;
(1.3)将回收的CMV片段和pHAGE-IRES-ZsGreen用T4DNA连接酶进行连接,连接成功后,提取的质粒命名为pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒;
(1.4)使用NcoI和XbaI双酶切PGL3-Promoter Vector,回收1906bp Luciferase片段,pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒用NcoI和XbaI双酶切,回收4855bp的片段,将该片段和Luciferase片段用T4DNA连接酶进行连接;连接成功后,提取的质粒即为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen。
(2)包装质粒的构建
所述包装质粒为psPAX2m-pol质粒,其序列如序列如SEQ ID No.6所示,结构如图3所示。
所述包装质粒的构建方法如下:
(2.1)基于psPAX2的载体重建
定点突变改造载体psPAX2,以定向封闭多余的酶切位点AgeI与ApaI。
为使人源HIV-1耐药基因片段(Pol-HIV(partial)片段,简写为pol)克隆到包装质粒psPAX2限制性酶切位点Age I和Apa I之间,需要通过PCR和基因定点突变修饰质粒另外两位点的Age I(7697位)和Apa I(863位)。
在本发明中,该HIV-1耐药基因片段的提取方式如下:
PCR扩增获得pol片段,其序列如SEQ ID No.5所示。
引物:OUT-F:GCAAGAGTTT TGGCTGAAGC AATGAG
OUT-R:CCTTGCCCCT GCTTCTGTAT TTCTGC
IN-F:TGCAGG GCCCCTAGGA AAAAGGGCTG(ApaI)
IN-R:CACTCCATGT ACCGGTTCTT TTAGAATCTC(AgeI)
模板为人体样本提取的RNA,第一轮反应条件:45℃逆转录30min,PCR 94℃预变性2min,98℃变性10s,51℃退火15s,68℃延伸2min,循环30次;第二轮反应条件:98℃变性10s,51℃退火15s,68℃延伸2min,循环30次。
(2.1.1)利用长引物法PCR突变包装质粒psPAX2酶切位点AgeI
(2.1.1.1)PCR扩增突变包装质粒psPAX2酶切位点AgeI获得AgeI-1片段,其序列如SEQ ID No.1所示。
引物:AgeI-F:CGAAGAGCTC ATCAGAACAG TCAGACTCAT CAAGCTTCTC TATC(SacI)
加粗斜体T代表突变后的碱基,其原始碱基为C。模板为psPAX2(psPAX2为HIV-1野生株假病毒骨架质粒,GenBank编号:D86068.1)PCR条件:94℃预变性4min,94℃变性20s、55℃退火20s、72℃延伸1min,循环35次,最后72℃延伸5min。
(2.1.1.2)回收突变后AgeI-1片段,插入PZeroBack/Blunt Vector(北京天根公司),形成T-AgeI′质粒;将T-AgeI′质粒进行鉴定测序,正确即点突变成功;用SacI与NheI双酶切T-AgeI′质粒,即酶切突变成功的片段;将该酶切突变成功的片段连接至表达载体psPAX2,连接成功后,提取的质粒命名为psPAX2-1,其序列如SEQ ID No.2所示。
(2.1.2)利用定点突变试剂盒突变载体psPAX2-1酶切位点ApaI
(2.1.2.1)使用Agilent公司定点突变试剂盒对载体psPAX2-1进行定点突变,命名为psPAX2-2,其序列如SEQ ID No.3所示。
引物:M-ApaI-F GCC TTG AGG GGC CTC CGG GGA CGG CCC TTT GTG CGG GG
M-ApaI-R CCC CGC ACA AAG GGG CCG TCC CGG AGC CCC CTC AAG GC
模板为psPAX2-1,PCR条件:95℃预变性2min,95℃变性30sec,55℃退火1min,68℃延伸10min,循环18次。
(2.1.2.2)DpnI酶切扩增产物psPAX2-2;将酶切产物转化XL 10-GOLD感受态细胞,质粒提取,命名为psPAX2-2′;
ApaI酶切质粒psPAX2-2′,挑取酶切鉴定正确的质粒,送英骏公司测序,并将测序结果正确的质粒命名为psPAX2m,其序列如SEQ ID No.4所示。
(2.2)psPAX2m-pol质粒构建
用ApaI和AgeI酶切pol片段回收并插入psPAX2m载体(psPAX2m用ApaI和AgeI切割),构建为psPAX2m-pol质粒,用于重组慢病毒的生产。psPAX2m-pol质粒如图3所示,其序列如SEQ ID No.6所示。
(3)重组慢病毒的生产及其在不同细胞的应用
(3.1)将步骤(1)构建好的pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen转移质粒、步骤(2)构建好的psPAX2m-pol包装质粒与pMD2.G包膜质粒共转染293FT细胞或293T细胞后得到的包装体。本发明采用293FT细胞。转染前36h,铺细胞,75cm2细胞培养瓶,细胞总数为3×106个。当细胞汇合度达75%时,将总量为15μg的三质粒(2.8μg包膜质粒pMD2.G,5.2μg包装质粒psPAX2-Pol和7μg转移质粒pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen)和45μl X-tremeGENE HP DNA转染试剂(Roche,USA)一起置于1.5ml的Opti-MEM培养基中,室温静置15min,共转染293FT细胞。48h后倒置荧光显微镜下质粒共转染情况,结果如图4所示,证明重组慢病毒载体改造前后,转染特性未变。收集慢病毒上清,4℃ 3000rpm离心20min,用0.45μm滤器滤过,得到重组慢病毒。
(3.2)重组慢病毒活性与滴度测定
病毒滴度测定按照Ngai,S.C.等标准,得到的样本假病毒原液10倍稀释后,用50ul稀释后的病毒液感染十二孔板培养的293A细胞,60小时后,流式细胞仪检测每孔荧光百分比,计算慢病毒活性滴度。结果如图6所示,证明重组慢载体改造前后,病毒感染性未变。
(3.3)本发明的重组慢病毒在293A细胞中的应用
因psPAX2m中的pol基因来源于野生型的HIV-1,以psPAX2m,pMD2.G和pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen共转染293A细胞制备的重组慢病毒在表型耐药检测中作为野生型的HIV-1对照病毒。为了评价HIV-1抑制药物是否影响病毒感染和蛋白生产,齐多夫定(D4T)作为抗病毒药物代表,以优化检测条件。
(3.3.1)HIV药物司他夫定敏感性与细胞数目相关实验
铺板96孔板293A细胞,分5组,每组分别为10000、15000、20000、25000、与30000个/孔,当细胞汇合度达到80%时,按照每孔细胞数目计算MOI=10时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定,将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中,加入到96孔293A细胞中。感染60小时后,检测每孔细胞荧光素酶基因表达情况。结果显示,细胞数目为1.5×104细胞/孔时,药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图5中的A图所示。
(3.3.2)HIV药物司他夫定敏感性与病毒MOI相关实验
铺板96孔板293A细胞,每孔20000个细胞,共设置10个实验组,当细胞汇合度达到80%时,计数每个实验组孔中的细胞数目,按照每孔细胞数目计算当MOI分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定,并将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液,加入到96孔293A细胞中。感染60小时后,检测每孔细胞荧光素酶基因表达活性。结果显示,MOI为10时,药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图5中的B图所示。
(3.3.3)HIV药物司他夫定敏感性与病毒感染时间相关实验
铺板96孔板293A细胞,分4组,每组20000个/孔,当细胞汇合度达到80%时,按照每孔细胞数目计算MOI=10时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定,并将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液,加入到96孔293A细胞中。分别于病毒感染36、48、60、72小时后,检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示,感染时间为60小时时,药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图5中的C图所示。
(3.3.4)十二种抗病毒药物用于表型耐药检测的可重复性
通过测定12种抗病毒药物IC50的药物浓度来判断表型耐药检测的稳定性和可重复性。根据上述3个实验,确定了用于表型耐药检测时的细胞数目、MOI以及病毒感染时间。铺96孔板,当细胞汇合度达到80%时,按照每孔细胞数目计算MOI=10时所需要的病毒液体积。与此同时,用DMEM完全培养液配制不同药物浓度的HIV药物,将配置好的药物与病毒混合液,加入到96孔293A细胞中。感染60小时后,检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示,除了2种药物(利匹韦林和依曲韦林)大部分药物都显示较高的重复性。结果如表1所示,其中,IC50,能够使ZsGreen阳性细胞减少50%的药物浓度;SD,标准差;CV,变异系数。
表1十种药物用于表型耐药检测的可重复性
(3.3.4)病人HIV-1毒株耐药相关的突变基因分析
HIV-1感染病人的特征(表2),病人都是联合应用抗病毒药物,但所有的8名病人CD4细胞数低于400细胞/mm3,其中5人低于400细胞/mm3。HIV病毒载量在155~104000copies/ml之间。为了分析8名患者HIV-1毒株药物相关的突变,扩增了HIV-1的pol区基因,并进行了测序。基于此次研究涉及到的10种HIV抑制剂的基因型耐药数据,测到8名患者的HIV-1毒株突变(表3),这表明所有的HIV-1毒株都存在基因型耐药,但不能预测它们对抗病毒药物的耐受水平。
表2临床样本的特性
表3 8名患者体内HIV-1毒株药物耐受相关的突变分析
注:该项研究中涉及到的5种核苷酸类抑制剂地达诺新、司他夫定、齐多夫定、恩曲他滨、硫酸阿巴卡韦和三种非核苷酸类抑制剂奈韦拉平、依曲韦林和利匹韦林及2种蛋白酶抑制剂奈非那韦和洛匹那韦的基因型药物耐药性在数据库可以查到。
(3.3.6)病人体内HIV-1毒株的表型耐药分析
8名患者的HIV-1样本用本发明中带有双报告基因的重组慢病毒系统进行表型耐药分析。野生型的慢病毒作为对照。病毒抑制率(%)=(1-药物处理组的荧光素酶RLU/对照组的荧光素酶RLU)×100%。用非线性回归分析每个HIV-1毒株的IC50。HIV-1毒株对每种抑制剂的表型耐药程度用倍数变化(FC)来表示,即测试株的IC50/野生株的IC50。校正的用于表型耐药的分类标准:FC<3为敏感,FC=3-6为低度耐药,FC=6.01-10为中度耐药,FC>10为高度耐药[6,22,23]。表4呈现了6种6NRTIs(Didanosine,Stavudine,Zidovudine,Zalcitabine,Emtricitabine,Abacavir Sulfate),4NNRTIs(Nevirapine,Etravirine,Dapivirine,Rilpivirine)及2种PIs(Nelfinavir and Lopinavir)的表型耐药情况。Zalcitabine(DDC)和Dapivirine(DPV)两种药物在现有数据库中无基因型耐药情况分析。对10种药物的表型耐药与基因耐药结果进行分析,表明,大部分一致(表4)。例如,HIV-1毒株0022表型耐药分析对DDI和D4T两种药物敏感,但是基因型耐药分析显示为中度或高度耐药,毒株0312对ETR表型耐药分析为高度耐药,但基因型分析为低度耐药。
表4HIV-1毒株的基因型和表型耐药分析比较
注:DDI,地达诺新;D4T,司他夫定;AZT,齐多夫定;DDC,扎西他滨;FTC,恩曲他滨;ABC,硫酸阿巴卡韦;NVP,奈韦拉平;ETR,依曲韦林;DPV,达匹韦林;RPV,利匹韦林;NFV,奈非那韦;LPV,洛匹那韦。
(3.4)本发明重组慢病毒在TZM-B细胞中的应用
使用该重组慢病毒体系共转染TZM-B细胞,以评价HIV-1抑制药物是否影响病毒感染和蛋白生产,齐多夫定(D4T)作为抗病毒药物代表,以优化检测条件。
(3.4.1)HIV药物司他夫定敏感性与细胞数目相关实验
铺板96孔板TZM-B细胞,分5组,每组分别为10000、15000、20000、25000、与30000个/孔,当细胞汇合度达到80%时,按照每孔细胞数目计算MOI=10时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定,将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中,加入到96孔TZM-B细胞中。感染60小时后,检测每孔细胞荧光素酶基因表达情况。结果显示,细胞数目为1.5×104细胞/孔时,药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图7中的A图所示。
(3.4.2)HIV药物司他夫定敏感性与病毒MOI相关实验
铺板96孔板TZM-B细胞,每孔20000个细胞,共设置10个实验组,当细胞汇合度达到80%时,计数每个实验组孔中的细胞数目,按照每孔细胞数目计算当MOI分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定,并将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液,加入到96孔TZM-B细胞中。感染60小时后,检测每孔细胞荧光素酶基因表达活性。结果显示,MOI为10时,药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图7中的B图所示。
(3.4.3)HIV药物司他夫定敏感性与病毒感染时间相关实验
铺板96孔板TZM-B细胞,分4组,每组20000个/孔,当细胞汇合度达到80%时,按照每孔细胞数目计算MOI=10时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定,并将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液,加入到96孔TZM-B细胞中。分别于病毒感染36、48、60、72小时后,检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示,感染时间为60小时时,药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图7中的C图所示。
(3.4.4)十二种抗病毒药物用于表型耐药检测的可重复性
通过测定12种抗病毒药物IC50的药物浓度来判断表型耐药检测的稳定性和可重复性。根据上述3个实验,确定了用于表型耐药检测时的细胞数目、MOI以及病毒感染时间。铺96孔板,当细胞汇合度达到80%时,按照每孔细胞数目计算MOI=10时所需要的病毒液体积。与此同时,用DMEM完全培养液配制不同药物浓度的HIV药物,将配置好的药物与病毒混合液,加入到96孔TZM-B细胞中。感染60小时后,检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示,除了2种药物(利匹韦林和依曲韦林)大部分药物都显示较高的重复性。结果如表5所示,其中,IC50,能够使ZsGreen阳性细胞减少50%的药物浓度;SD,标准差;CV,变异系数。
表5十种药物用于表型耐药检测的可重复性
(3.4.5)病人体内HIV-1毒株的表型耐药分析
8名患者的HIV-1样本用本发明中带有双报告基因的重组慢病毒系统进行表型耐药分析。野生型的慢病毒作为对照。病毒抑制率(%)=(1-药物处理组的荧光素酶RLU/对照组的荧光素酶RLU)×100%。用非线性回归分析每个HIV-1毒株的IC50。HIV-1毒株对每种抑制剂的表型耐药程度用倍数变化(FC)来表示,即测试株的IC50/野生株的IC50。校正的用于表型耐药的分类标准:FC<3为敏感,FC=3-6为低度耐药,FC=6.01-10为中度耐药,FC>10为高度耐药[6,22,23]。表4呈现了6种6NRTIs(Didanosine,Stavudine,Zidovudine,Zalcitabine,Emtricitabine,Abacavir Sulfate),4NNRTIs(Nevirapine,Etravirine,Dapivirine,Rilpivirine)及2种PIs(Nelfinavir and Lopinavir)的表型耐药情况。Zalcitabine(DDC)和Dapivirine(DPV)两种药物在现有数据库中无基因型耐药情况分析。对10种药物的表型耐药与基因耐药结果进行分析,表明,大部分一致(表6)。例如,HIV-1毒株0022表型耐药分析对DDI和D4T两种药物敏感,但是基因型耐药分析显示为中度或高度耐药,毒株0312对ETR表型耐药分析为高度耐药,但基因型分析为低度耐药。
表6HIV-1毒株的基因型和表型耐药分析比较
(3.5)本发明重组慢病毒在huh7.5细胞中的应用
使用该重组慢病毒体系共转染huh7.5细胞,以评价HIV-1抑制药物是否影响病毒感染和蛋白生产,齐多夫定(D4T)作为抗病毒药物代表,以优化检测条件。
(3.5.1)HIV药物司他夫定敏感性与细胞数目相关实验
铺板96孔板huh7.5细胞,分5组,每组分别为10000、15000、20000、25000、与30000个/孔,当细胞汇合度达到80%时,按照每孔细胞数目计算MOI=10时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定,将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中,加入到96孔huh7.5细胞中。感染60小时后,检测每孔细胞荧光素酶基因表达情况。结果显示,细胞数目为1.5×104细胞/孔时,药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图8中的A图所示。
(3.5.2)HIV药物司他夫定敏感性与病毒MOI相关实验
铺板96孔板huh7.5细胞,每孔20000个细胞,共设置10个实验组,当细胞汇合度达到80%时,计数每个实验组孔中的细胞数目,按照每孔细胞数目计算当MOI分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定,并将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液,加入到96孔huh7.5细胞中。感染60小时后,检测每孔细胞荧光素酶基因表达活性。结果显示,MOI为10时,药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图8中的B图所示。
(3.5.3)HIV药物司他夫定敏感性与病毒感染时间相关实验
铺板96孔板huh7.5细胞,分4组,每组20000个/孔,当细胞汇合度达到80%时,按照每孔细胞数目计算MOI=10时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定,并将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液,加入到96孔huh7.5细胞中。分别于病毒感染36、48、60、72小时后,检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示,感染时间为60小时时,药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图8中的C图所示。
(3.5.4)十二种抗病毒药物用于表型耐药检测的可重复性
通过测定12种抗病毒药物IC50的药物浓度来判断表型耐药检测的稳定性和可重复性。根据上述3个实验,确定了用于表型耐药检测时的细胞数目、MOI以及病毒感染时间。铺96孔板,当细胞汇合度达到80%时,按照每孔细胞数目计算MOI=10时所需要的病毒液体积。与此同时,用DMEM完全培养液配制不同药物浓度的HIV药物,将配置好的药物与病毒混合液,加入到96孔huh7.5细胞中。感染60小时后,检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示,除了2种药物(利匹韦林和依曲韦林)大部分药物都显示较高的重复性。结果如表7所示,其中,IC50,能够使ZsGreen阳性细胞减少50%的药物浓度;SD,标准差;CV,变异系数。
表7十种药物用于表型耐药检测的可重复性
(3.5.5)病人体内HIV-1毒株的表型耐药分析
8名患者的HIV-1样本用本发明中带有双报告基因的重组慢病毒系统进行表型耐药分析。野生型的慢病毒作为对照。病毒抑制率(%)=(1-药物处理组的荧光素酶RLU/对照组的荧光素酶RLU)×100%。用非线性回归分析每个HIV-1毒株的IC50。HIV-1毒株对每种抑制剂的表型耐药程度用倍数变化(FC)来表示,即测试株的IC50/野生株的IC50。校正的用于表型耐药的分类标准:FC<3为敏感,FC=3-6为低度耐药,FC=6.01-10为中度耐药,FC>10为高度耐药[6,22,23]。表4呈现了6种6NRTIs(Didanosine,Stavudine,Zidovudine,Zalcitabine,Emtricitabine,Abacavir Sulfate),4NNRTIs(Nevirapine,Etravirine,Dapivirine,Rilpivirine)及2种PIs(Nelfinavir and Lopinavir)的表型耐药情况。Zalcitabine(DDC)和Dapivirine(DPV)两种药物在现有数据库中无基因型耐药情况分析。对10种药物的表型耐药与基因耐药结果进行分析,表明,大部分一致(表8)。例如,HIV-1毒株0022表型耐药分析对DDI和D4T两种药物敏感,但是基因型耐药分析显示为中度或高度耐药,毒株0312对ETR表型耐药分析为高度耐药,但基因型分析为低度耐药。
表8HIV-1毒株的基因型和表型耐药分析比较
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制,但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案,均应落在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种重组慢病毒的制备方法,该重组慢病毒是包装质粒、包膜质粒和转移质粒共转染293FT细胞或293T细胞后得到的包装体;其中,所述包装质粒为psPAX2m-pol质粒;所述转移质粒为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen质粒;所述转移质粒的构建方法,包括以下步骤:使用BamH I和Kpn I双酶切pMD2.G质粒,回收酶切产物,收取119bp CMV片段;将pHAGE-EF1α-IRES-ZsGreen质粒用BamH I和Kpn I进行双酶切,回收4736bp pHAGE-IRES-ZsGreen片段;将回收的CMV片段和pHAGE-IRES-ZsGreen用T4 DNA连接酶进行连接,连接成功后,提取的质粒命名为pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒;使用NcoI和XbaI双酶切PGL3-Promoter Vector,回收1906 bp Luciferase片段,pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒用NcoI和XbaI双酶切,回收4855bp的片段,将该片段和Luciferase片段用T4 DNA连接酶进行连接;连接成功后,提取的质粒即为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen;所述psPAX2m-pol质粒序列如SEQ ID No.6所示;所述psPAX2m-pol质粒的构建方法,包括以下步骤:
(1)psPAX2载体重建:利用长引物法突变psPAX2载体的酶切位点AgeI,获得psPAX2-1载体;利用定点突变试剂盒突变psPAX2-1载体的酶切位点ApaI,获得psPAX2-2载体;DpnI 酶切psPAX2-2载体,酶切产物转化XL 10-GOLD感受态细胞,质粒提取,ApaI酶切该质粒,挑取酶切产物鉴定测序,获得psPAX2m载体,其序列如SEQ ID No.4所示;
(2)psPAX2m-pol质粒构建:利用PCR扩增pol片段,其序列如SEQ ID No.5所示;用ApaI和AgeI酶切扩增后的pol片段回收并插入psPAX2m载体,得到psPAX2m-pol质粒,其序列如SEQ ID No.6所示。
2.根据权利要求1所述的重组慢病毒的制备方法,其特征在于,所述转移质粒结构如图1所示。
3.根据权利要求1所述的重组慢病毒的制备方法,其特征在于,所述psPAX2m-pol质粒结构如图3所示。
4.根据权利要求1所述的重组慢病毒的制备方法,其特征在于,所述psPAX2-1载体的序列如SEQ ID No.2所示。
5.根据权利要求1所述的重组慢病毒的制备方法,其特征在于,所述psPAX2-2载体的序列如SEQ ID No.3所示。
6.根据权利要求1所述的重组慢病毒的制备方法,其特征在于,所述psPAX2m载体的序列如SEQ ID No.4所示。
7.根据权利要求1所述的重组慢病毒的制备方法,其特征在于,所述长引物法突变psPAX2载体所用的引物为AgeI-F和AgeI-R,其中,
AgeI-F:CGAAGAGCTC ATCAGAACAG TCAGACTCAT CAAGCTTCTC TATC;
AgeI-R:CTGCTAGCTA TAGTTCTAGA GGTA T CGGTT GTTTCGAGCT TATAG;
模板为psPAX2,PCR条件:94℃预变性4min,94℃变性20s、55℃退火20s、72℃延伸1min,循环35次,最后72℃ 延伸5min;
所述利用定点突变试剂盒突变psPAX2-1载体所用的引物为M-ApaI-F和M-ApaI-R;其中,
M-ApaI-F:GCC TTG AGG GGC CTC CGG GGA CGG CCC TTT GTG CGG GG
M-ApaI-R:CCC CGC ACA AAG GGG CCG TCC CGG AGC CCC CTC AAG GC;
模板为psPAX2-1,PCR条件:95℃预变性2 min,95℃变性30 sec,55℃退火1min,68℃延伸10min,循环18次。
8.如权利要求1-7任一项所述制备方法制备得到的重组慢病毒在制备HIV表型耐药检测试剂中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201511033231.3A CN105648037B (zh) | 2015-12-30 | 2015-12-30 | 一种重组慢病毒在hiv表型耐药检测中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201511033231.3A CN105648037B (zh) | 2015-12-30 | 2015-12-30 | 一种重组慢病毒在hiv表型耐药检测中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105648037A CN105648037A (zh) | 2016-06-08 |
CN105648037B true CN105648037B (zh) | 2020-06-05 |
Family
ID=56491434
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201511033231.3A Active CN105648037B (zh) | 2015-12-30 | 2015-12-30 | 一种重组慢病毒在hiv表型耐药检测中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105648037B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109722465B (zh) * | 2019-01-07 | 2022-02-01 | 福建省疾病预防控制中心(福建省健康教育促进中心、福建省卫生检验检测中心) | 一种hiv耐药检测载体和构建方法 |
CN113736754A (zh) * | 2021-10-14 | 2021-12-03 | 湖南师范大学 | 一种带萤光素酶标签的抗mcmv药物的高效筛选方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1446265A (zh) * | 2000-06-12 | 2003-10-01 | 病毒科学公司 | 检测抗反转录病毒治疗的方式与方法和在hiv/aids治疗中的指导治疗方案 |
CN101353667A (zh) * | 2008-08-15 | 2009-01-28 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | Hiv毒株耐药表型分析细胞模型及其专用假型慢病毒 |
CN101353666A (zh) * | 2008-08-15 | 2009-01-28 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种hiv药物筛选细胞模型及其专用假型慢病毒 |
CN101418286A (zh) * | 2008-12-05 | 2009-04-29 | 上海之江生物科技有限公司 | 人免疫缺陷病毒ⅰ型的人工假病毒及其制备和应用 |
CN102199616A (zh) * | 2011-03-07 | 2011-09-28 | 首都医科大学附属北京佑安医院 | Hiv-1表型耐药检测载体及其构建方法 |
CN102876714A (zh) * | 2011-09-07 | 2013-01-16 | 深圳市易瑞生物技术有限公司 | 用慢病毒检测hiv耐药表型 |
-
2015
- 2015-12-30 CN CN201511033231.3A patent/CN105648037B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1446265A (zh) * | 2000-06-12 | 2003-10-01 | 病毒科学公司 | 检测抗反转录病毒治疗的方式与方法和在hiv/aids治疗中的指导治疗方案 |
CN101353667A (zh) * | 2008-08-15 | 2009-01-28 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | Hiv毒株耐药表型分析细胞模型及其专用假型慢病毒 |
CN101353666A (zh) * | 2008-08-15 | 2009-01-28 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种hiv药物筛选细胞模型及其专用假型慢病毒 |
CN101418286A (zh) * | 2008-12-05 | 2009-04-29 | 上海之江生物科技有限公司 | 人免疫缺陷病毒ⅰ型的人工假病毒及其制备和应用 |
CN102199616A (zh) * | 2011-03-07 | 2011-09-28 | 首都医科大学附属北京佑安医院 | Hiv-1表型耐药检测载体及其构建方法 |
CN102876714A (zh) * | 2011-09-07 | 2013-01-16 | 深圳市易瑞生物技术有限公司 | 用慢病毒检测hiv耐药表型 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Molecular chaperone TRAP1 regulates a metabolic switch between mitochondrial respiration and aerobic glycolysis;Soichiro Yoshida et al.;《PNAS》;20130423;补充材料第1页 * |
Novel Single-Cell-Level Phenotypic Assay for Residual Drug Susceptibility and Reduced Replication Capacity of Drug-Resistant Human Immunodeficiency Virus Type 1;Haili Zhang et al.;《Journal of Virology》;20040228;1719 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105648037A (zh) | 2016-06-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7189505B2 (en) | Methods of assessing HIV integrase inhibitor therapy | |
Hayman et al. | A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses | |
Dapp et al. | Interrelationship between HIV-1 fitness and mutation rate | |
Ssemwanga et al. | Multiple HIV-1 infections with evidence of recombination in heterosexual partnerships in a low risk Rural Clinical Cohort in Uganda | |
Pattery et al. | Development and performance of conventional HIV-1 phenotyping (Antivirogram®) and genotype-based calculated phenotyping assay (virco® TYPE HIV-1) on protease and reverse transcriptase genes to evaluate drug resistance | |
Liu et al. | The genetic diversity of HIV-1 quasispecies within primary infected individuals | |
CN105648037B (zh) | 一种重组慢病毒在hiv表型耐药检测中的应用 | |
EP1283272B1 (en) | Methods and means for assessing HIV envelope inhibitor therapy | |
Knoepfel et al. | In-depth analysis of G-to-A hypermutation rate in HIV-1 env DNA induced by endogenous APOBEC3 proteins using massively parallel sequencing | |
CN104846116B (zh) | 检测人类免疫缺陷病毒1型的pcr引物组、探针及其试剂盒和检测方法 | |
US10161931B2 (en) | Methods for determining susceptibility to coreceptor inhibitors | |
US20170159139A1 (en) | Compositions and methods for determining whether a subject would benefit from co-receptor inhibitor therapy | |
Heger et al. | Development of a phenotypic susceptibility assay for HIV-1 integrase inhibitors | |
CN105647947A (zh) | 一种转移质粒及其构建方法和重组慢病毒 | |
CN110079635A (zh) | 用于检测艾滋病治疗药物abc耐药突变位点的引物对和探针及其应用 | |
EP1285971B1 (en) | Methods for the phenotypic and genotypic assessment of the drug sensitivity of HIV integrase variants | |
Hendricks et al. | Discordance between hiv-1 population in plasma at rebound after structured treatment interruption and archived provirus population in peripheral blood mononuclear cells | |
Zhang et al. | Evolution of coreceptor utilization to escape CCR5 antagonist therapy | |
US11499200B2 (en) | Methods for determining resistance or susceptibility to HIV entry inhibitors | |
Brandful et al. | Genotypic diversity and mutation profile of HIV-1 strains in antiretroviral treatment (ART)–Naïve Ghanaian patients and implications for antiretroviral treatment (ART) | |
Rawson et al. | Retroviral vectors for analysis of viral mutagenesis and recombination | |
Marty et al. | Adapting the geno2pheno [coreceptor] tool to HIV-1 subtype CRF01_AE by phenotypic validation using clinical isolates from South-East Asia | |
AU2010247444A1 (en) | HIV-1-C resistance monitoring | |
Van Der Hoek et al. | Characterization of an HIV-1 group M variant that is distinct from the known subtypes | |
EP2823068A2 (en) | Methods and compositions for determining virus susceptibility to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210521 Address after: 510700 Room 403, building A5, No.3, scientific research road, Science City, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province Patentee after: GUANGZHOU BAIRUIKANG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: South Medical University, 1838 Guangzhou Avenue North, Guangzhou, Guangdong 510515 Patentee before: SOUTHERN MEDICAL University |