CN1446265A - 检测抗反转录病毒治疗的方式与方法和在hiv/aids治疗中的指导治疗方案 - Google Patents

检测抗反转录病毒治疗的方式与方法和在hiv/aids治疗中的指导治疗方案 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于鉴别治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染和获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的有效药物治疗方案的抗病毒药物敏感性和抗性试验，还涉及监测HIV感染的临床进展以及HIV感染对抗反转录病毒治疗、特别是使用表型敏感性分析和基因型分析的核苷逆转录酶抑制剂治疗的响应的方式和方法。

Description

检测抗反转录病毒治疗的方式与方法和 在HIV/AIDS治疗中的指导治疗方案
在本申请中，作者参考了各种出版物并且在文中注明了日期。这些出版物的全部引文按字母顺序列在说明书的末尾、紧接着权利要求之前。所有在此引用的专利、专利申请和出版物，无论是上文的或者下文的，全部结合于此作为参考。将这些出版物的公开文本全部结合于此作为参考的目的是为了在此更加全面地描述技术人员所熟知的、到在此描述并根据权利要求的本发明的日期为止的、该领域的状态。
技术领域
本发明涉及用于鉴别治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染和获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的有效药物治疗方案的抗反转录病毒药物敏感性和抗性试验。本发明还涉及监测HIV感染的临床进展和其对使用表型或基因型敏感性分析的抗反转录病毒治疗的反应的方式和方法。本发明还涉及用于实施表型敏感性试验的新载体、宿主细胞和组合物。本发明还涉及使用各种基因型方法学来鉴别这样的患者，它们的感染已对特定抗反转录病毒药物治疗方案变得较不敏感(耐受的)。本发明还涉及筛选能抑制病毒、选择的病毒序列和/或病毒蛋白的候选抗反转录病毒药物。更具体而言，本发明涉及使用表型敏感性试验和/或基因型试验来鉴别这样的患者，这些患者体内的病毒在抗反转录病毒制剂存在时，显示出复制的药物依赖性刺激。
发明背景
HIV感染被表征为在疾病过程中病毒高速周转，最后导致CD4减少和疾病进展(Wei X，Ghosh SK，Taylor ME，等.(1995)Nature 343，117-122)(Ho DD，Naumann AU，Perelson AS，等.(1995)Nature 373，123-126)。抗反转录病毒治疗的目的是能够实现真正和持久的病毒复制抑制。实现持续的病毒控制可能要涉及应用序贯治疗，通常每种治疗包含三种或更多抗反转录病毒药物的组合。因此，最初和随后治疗的选择应该在合理的基础上进行，抗性和交叉抗性模式的知识对于指导这些决定是必需的。联合治疗的主要的基本原理涉及结合或附加的活性以实现对病毒复制的更大的抑制。但是，由于治疗需要进行许多年，因此药物治疗方案的容许能力将保持临界状态。
在未被治疗的患者中，每天会产生1010个新病毒颗粒。再加上HIV逆转录酶(RT)未能通过核酸外切校正来纠正转录错误，这些高水平的病毒周转导致每天在HIV基因组的每个位置有104到105个突变。结果快速建立了广泛的基因型变异。而一些模板位置可能更倾向于出错，(Mansky LM，Temin HM(1995)J Virol 69，5087-5094)(Schinazi RF，LloydRM，Ramanathan CS，等.(1994)Antimicrob Agents Chemother 38，268-274)，数学模型提示：在被感染个体的每一个核苷酸位置，每天可以发生104次突变。
为了使抗反转录病毒药物抗性出现，靶酶必须被修饰而保留其在抑制剂存在时的功能。导致氨基酸取代的点突变可以引起该酶的活性位点、底物结合位点或者周围区域在形状，大小或电荷上的改变。在治疗初始前已检测到低水平的对抗反转录病毒制剂的突变体抗性(Mohri H，SinghMK，Ching WTW，等.(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90，25-29)(Nájera I，Richman DD，Olivares I，等.(1994)AIDS Res Hum Retroviruses 10，1479-1488)(Nájera I，Holguin A，
Figure A0181405600171
-Mateu E，等.(1995)J Virol 69，23-31)。但是，这些突变株所代表的只是总病毒负荷的一小部分，而且与野生型病毒相比可能具有复制或竞争的劣势(Coffin JM(1995)Science267，483-489)。抗反转录病毒治疗的选择性压力给这些药物抗性突变体提供了竞争优势并且从而使它们成为代表占优势地位的、最终在患者体内导致药物抗性和病毒衰竭的准种类(Frost SDW，McLean AR(1994)AIDS8，323-332)(Kellam P，Boucher CAB，Tijnagal JMGH(1994)J Gen Virol75，34l-351)。
导致病毒不仅能在存在药物时(即抗性病毒)复制而且在药物存在时比没有药物时(即病毒的药物依赖刺激)复制更有效的一个或者多个突变，将呈现出一个特别重要的表型来识别。在这种情况下，药物能够实际上加速了对免疫系统的破坏速率和疾病的进展。非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)
非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)是一个化学性质上各异的化合物组，其在体外是HIV-1逆转录酶(RT)的有效抑制剂。这些化合物包括吡啶酮衍生物，二(杂芳基)哌嗪(BHAPs)例如地拉夫定和阿的维定，二吡啶并二氮杂酮(奈韦拉平)，胸腺嘧啶衍生物组(TSAO和HEPT)，a-苯胺基苯乙酰胺(a-APA)化合物(loviride)，喹喔啉类抑制剂(HBY-097)，苯并二氮杂酮和苯并二氮杂硫酮(TIBO)化合物，和吡啶酮衍生物(L-697，661)。概述参见(DeClercq E.(1996)Rev Med Virol 6，97-117)(Emini EA(1996)Antiviral Drug Resistance，DD Richman编辑，John Wiley & Sons，Ltd)。三种NNRTIs：奈韦拉平(NVP，Viramune，Boehringer Ingelheim，Ingelheim amRhein，德国)，地拉夫定(DLV，Rescriptor，Pharmacia & Upjohn，Kalamazoo，MI，美国)，和efavirenz(EFV，Sustiva，Dupont，威尔明顿，DE，美国)在美国已获准使用。
对单个化合物的高水平抗性似乎形成得很迅速，经常出现在初始单一治疗的几星期内，常常只涉及单一的点突变，而且在许多情况下还引起对其它NNRTIs相当大的交叉抗性。大多数被报道的突变发生在密码子组100-108和181-190，这些密码子组编码临近RT酶的催化位点的两个b-片层(Kohlstaedt LA，Wang J，Friedman JM，等.(1992)Science256，1783-90)。如已经被描述那样，NNRTI结合袋，是RT的疏水性非底物结合区，在此区域这些制剂直接与RT相互作用。它们通过干扰“拇指”亚结构域的流动性或者通过破坏保守的、对于催化活性而言必需的天冬氨酸侧链的定向来抑制活性(D′Aquilla RT.(1994)Clin Lab Med14，393-423)(Arnold E.，Ding J.，Hughes SH，等.(1995)Curr Opin StructBiol 5，27-38)。
使得对奈韦拉平的敏感性降低的突变在HIV RT密码子98，100，103，106，108，181，188和190处已经被描述(Richman DD，Havlir D，CorbeilJ.(1994)J Virol 68，1660-1666)。奈韦拉平单药治疗期间被最高频率选择的变异是Tyr181àCys(Y181C)突变，它导致对该制剂的敏感性降低了100倍，也降低了对吡啶酮衍生物的敏感性(L-696，229和L-697，661)(Arnold，Ibid)。在存在Y181C突变时，TSAO同样具有有限的活性，但是在HIV RT的密码100和103突变存在时保持活性，而且它在体外在与RT相互作用最密切的区域选择独特的突变，GLU138àLys(E138K)(Richman，DD，Ibid)(Richman DD，Shih C-K，Lowy I，等.(1991)Proc Natl Acad Sci美国88，11241-11245)。
当loviride被用作单一治疗时，多数患者在24周形成对loviride的抗性。这已经被绘制在HIV RT的密码子100-110；181-190)范围中，最常见的是密码103(Staszewski S，Miller V，Kober A，等.(1996)Antiviral Ther1，42-50)。在使用loviride和叠氮胸苷或叠氮胸苷加拉米夫定的联合治疗中，密码子98和103的变异是在24周时所检测到的最频繁的突变(Staszewski S，Miller V，Rehmet S，等.(1996)AIDS 10，F1-7)。
尽管K101E，K103N，和Y181C突变也会赋予对BHAPs的交叉抗性，(Balzarini J，Karlsson A，Pérez-Pérez M-J，等.(1992)Virology 192，246-253)但在体外由这些制剂选择的特征P236L替代，似乎使RT对一些其它NNRTIs敏感，例如使奈韦拉平的IC50减少了7-10倍，而没有影响对核苷类似物的敏感性(Staszewski S.，Ibid)。尽管已经报道了在单一治疗期间赋予抗性的密码子103和181的突变以及同叠氮胸苷联合治疗期间密码子101，188，233和238的突变，但是在阿的维定治疗期间，已在临床分离物中观察到了密码子236的突变。
在体外，虽然HBY-097可能最初选择在HIV RT密码子190的突变，另外的途径一直选择在HIV RT密码子74和75的突变，伴随有这样一些突变病毒，这些病毒显示出对地丹诺辛和斯塔夫定而不是对叠氮胸苷的敏感性降低(Kleim J-P，Rsner M，Winkler I，等.(1995)J Acquir ImmuneDefic Syndr 10 Suppl 3，2)。
由于典型的41和215密码子突变，已经报道在密码子181的突变拮抗叠氮胸苷抗性，(Zhang D，Caliendo AM，Eron JJ，等.(1994)AntimicrobAgents Chemother 38，282-287)这提示了一些NNRTIs和叠氮胸苷的联合治疗可能是可行的。尽管已经描述了一种在体外对叠氮胸苷，地丹诺辛和奈韦拉平有三倍抗性的HIV突变体，(Larder BA，Kellam P，Kemp SD(1993)Nature 365，451-453)但是在CD4细胞计数＜350/mm3的患者中，使用这三种药物的联合治疗的确在治疗48星期后，提供了比叠氮胸苷只加地丹诺辛的治疗更好的免疫和病毒反应。
使用叠氮胸苷和吡啶酮衍生物L-697，661的联合治疗，防止了在使用这种NNRTI进行的单一治疗过程中被典型选择的密码子181突变的出现，延迟了对这种化合物的高水平抗性的出现。在此研究中没有检查到对叠氮胸苷敏感性的改变(Staszewski S，Massari FE，Kober A，等.(1995)Jinfect Dis 171，1159-1165)。在奈韦拉平治疗期间，伴随使用或者交替使用叠氮胸苷治疗并没有延迟抗性的出现(Richman DD，Ibid)(Nunberg JH，Schleif WA，Boots EJ，等.(1990)J Virol 65，4887-4892)(DeJong MD，Loewenthl M，Boucher CAB，等.(1994)J Infect Dis 169，1346-1350)(Cheeseman SH，Havlir D，McLaughlin MM，等.(1995)J Acquir ImmuneDefic Syndr 8，141-151。然而，在这种联合治疗期间并没有观察到181突变，最常见的突变发生在190密码子(Richman DD，Ibid)。这提示了：在体外拮抗叠氮胸苷抗性的密码子181突变，在体内与倾向其它突变的选择是不相容的，或者是不优选的，所述的其它突变允许伴随叠氮胸苷抗性的、对奈韦拉平降低的敏感性。
对NNRTIs敏感性降低的快速形成提示了这些制剂的效用、特别是用作单一治疗的效用是有限的，因此导致对这些分子进行修饰以延迟耐药病毒的出现。‘第二代’NNRTI，吡啶酮衍生物L-702，019，证实：在野生型和密码子181突变体HIV-1之间，IC50只有3倍改变，并需要多个突变来产生高水平的抗性(Goldman ME，O′Brien JA，Ruffing TL，等.(1993)Antimicrob Agents Chemother 37，947-949)。
类似地，最近Efavirenz(EFZ)被作为第二代NNRTI提出。Efavirenz有独特的分布(profile)，其在于它能保留抗含有常见的RT突变Y181C的病毒的活性。在体外，efavirenz选择在密码子100，101，103，108，179，181，和188的突变。这与体内的抗性分布相似，其包括密码子100，103，108，190和225的突变，(并且可能是101，179，181和188)。(Winslow DL，Garber S，Reid C，等.Fourth International Antiviral Therapy 1977；1(Suppl.1)：6.Conference on HIV Drug Resistance Sardinia，意大利，(1995)(Winslow DL，Garber S，Reid C，等.Antiviral Therapy 1997；1(suppl.1)：6)(Young SD，Britcher SF，Tran LO，等.Antimicrobial Agents & Chemotherapy 1995；39.2602-2609.)(Bacheler LT，Anton E，Jeffrey S，等.Antiviral Therapy 1998；3(Suppl.1)：15-16)(Bacheler LT，Weislow 0，Snyder S & Hanna G.12thWorld AIDS Conference，1998，日内瓦城，瑞士，摘要41213.)
本发明的一个目的是提供一种能够显示患者体内的病毒群是否抗特定的处方药的药物敏感性和抗性试验。本发明的另一个目的是提供一种试验，该试验可以使医生能够对那些经过一段治疗时间后，对特定的一种或多种药物产生抗性的患者，在治疗方案中替换一种或者多种药物。本发明的另一个目的是提供了一种试验，该试验能够选择一种用于HIV感染和/或AIDS治疗的有效药物治疗方案。本发明的另一个目的是提供鉴定一些患者已对其产生抗性的药物的方法，特别是鉴定对非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)抗性的方法。本发明的另一个目的是提供试验和方法，它们被用于评价作用于特定病毒、病毒基因和/或病毒蛋白的候选药物化合物的生物有效性，特别是关于与非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)相关的病毒药物抗性。本发明的另一个目的是提供用来评价HIV抗反转录病毒药物抗性和敏感性的方法和组合物。本发明的另一个目的是提供一种方法，该方法用来确定候选的抗反转录病毒药物是否会引起病毒复制的增加或刺激病毒复制。从整个说明书中，本发明的这些目的和其它目的将会显而易见。
发明概述
本发明涉及方法，使用表型和基因型方法来监测人免疫缺陷病毒感染的临床进展和其对抗病毒治疗的反应。本发明还部分地基于这样一个发现：赋予对抗反转录病毒治疗抗性的HIV逆转录酶(RT)中的遗传改变，可以通过使用表型或基因型方法直接从患者血浆的HIV RNA快速确定。这些方法使用基于聚合酶链反应(PCR)的分析。或者，在缺少扩增步骤时评估病毒核酸或病毒蛋白的方法，可以利用本发明的教导来监测和/或修改抗反转录病毒治疗。本发明部分地基于这样一个发现：在NNRTI抑制剂治疗的患者中，发现在HIV RT的密码子230的单独突变或结合有HIV RT密码子103或181的突变，其中存在的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低相关，而且与在地拉夫定，奈韦拉平或efavirenz存在时病毒复制的药物依赖性刺激相关。初始治疗一段时间后，可以在血浆HIV RNA中发现这些突变。除了HIV RT密码子103或181的突变，密码子230的突变形成被发现是抗性形成和最终免疫功能下降的一个指示剂。使用定点诱变，构建抗性测试载体，这些抗性测试载体在逆转录酶中含有密码子230的单一位点突变(M230L)、和M230L结合有103(K103N)或181(Y181C)的突变(Sarkar G，Sommer SS.(1990).Biotechniques 8：404-407)。经过观察发现这些突变与对NNRTI降低的敏感性相关，而且以一些组合形式，与病毒复制的药物依赖性刺激相关。
本发明部分地基于这样一个发现：在NNRTI治疗的患者中，在HIV RT的密码子230的突变结合有密码子101，103，190，221和238突变，这些突变的存在与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低相关，而且与在地拉夫定，奈韦拉平或efavirenz存在时与病毒复制的药物依赖性刺激相关。
本发明部分地基于这样一个发现：在NNRTI治疗的患者中，发现在RT的密码子241出现突变。除了其它的NNRTI抗性突变(这些突变可以包括前述的NNRTI-抗性突变例如：K101E，K103N，V106M，I135T，E138A和G190A)，在241位的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz降低的敏感性相关。包含带有这些突变的患者序列的抗性测试载体表现出对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的降低的敏感性，以及在所有这三种药物存在时表现出复制的药物依赖性刺激。
本发明部分地基于这样一个发现：在NNRTI治疗的患者中，发现在RT的密码子245出现突变。除了其它的NNRTI抗性突变(这些突变可以包括前述的NNRTI-抗性突变例如：A98G，K101E，K103N，I135T，E138A，Y181C，G190A和P225H)，在245位存在的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz降低的敏感性相关。包含带有这些突变的患者序列的抗性测试载体表现出对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的降低的敏感性，以及在所有这三种药物存在时表现出复制的药物依赖性刺激。使用定点诱变，构建抗性测试载体，一些抗性测试载体在密码子245位出现单一位点突变(V245E或者T)，以及一些抗性测试载体在RT中含有结合有103(K103N)和135(I135T)突变的V245E或T。虽然V245E单独突变对NNRTI的敏感性没有影响，经观察发现三者联合突变(K103N，I135T和245E或T)与对NNRTI的降低的敏感性和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
本发明部分地基于这样一个发现：在NNRTI治疗的患者中，发现在RT的密码子270出现突变。除了其它的NNRTI抗性突变(这些突变可以包括前述的NNRTI-抗性突变例如：K103N，I135T和P225H)，在270位存在的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz降低的敏感性相关，也与病毒复制的药物依赖性刺激相关。本发明部分地基于这样一个发现：在NNRTI治疗的患者中发现源自患者的片段，其包含在RT的HIV RT密码子35，67，69，70，106，189，200，202，208，211，215，218，219，221，227，228，283，284，286，293和297的复合突变。包含带有这些突变的患者序列的抗性测试载体表现出对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的降低的敏感性，以及在所有这三种药物存在时表现出复制的药物依赖性刺激。特定突变的定点回复，证实了许多突变在病毒复制的药物依赖性刺激中起作用，但是没有一个突变能够独自引起这种效应。具体地，发现在106，189，227，283，284和286的突变调节抗性和由此所看到的病毒复制的刺激作用。
附图简述
图1.抗性测试载体。HIV-1基因组(上图)和抗性测试载体(下图)的示意图，其包含一个源自患者的片段和一个指示基因病毒载体。
图2.两细胞测定。测定的示意图。通过将源自患者的片段(PDS)克隆到指示基因病毒载体中来产生抗性测试载体。使用缺陷的PR和RT序列，研究结果显示萤光素酶的活性依赖于功能性的PR和RT。将抗性测试载体与一个表达载体共同转染，该表达载体能够产生能够使感染发生的兼嗜性鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白或者其它病毒或细胞蛋白。假型病毒颗粒被产生，其含有由源自患者的片段(PDS)编码的蛋白酶(PR)和逆转录酶(RT)的基因产物。然后收集这些颗粒并且用来感染新鲜的细胞。在没有药物时和在很广范围的药物浓度存在时进行测定。在转染以后，蛋白酶PR抑制剂被加入到细胞内，并因此在颗粒成熟过程中出现。相反，RT抑制剂在病毒颗粒感染时或感染之前被加入细胞中。在测试的不同浓度药物下确定萤光素酶的量和抑制百分比(％)。
图3.表型药物敏感性分布的实例。通过绘制萤光素酶活性的抑制百分比对log10药物浓度曲线来对数据进行分析。该曲线被用于计算约50％(IC50)和约95％(IC95)抑制病毒复制所需的药物浓度。在抑制曲线中向着更高药物浓度的位移被解释为药物敏感性降低(＂耐药性＂)的证据。图示了NNRTI的地拉夫定(DLV)，奈韦拉平(NVP)和efavirenz(EFV)的三种典型曲线。药物敏感性的降低(或耐药性增加)表示为：与基线样品(治疗前)或者与药物敏感性病毒对照例如PNL4-3、HXB-2相比，在药物敏感性曲线中向着更高药物浓度方向(向右)移动。
图4.显示病毒复制的药物依赖性刺激的表型药物敏感性分布的实例。通过绘制萤光素酶活性的抑制百分比对log10药物浓度曲线来对数据进行分析。该曲线被用于计算能够约50％(IC50)和约95％(IC95)抑制病毒复制所需的药物浓度。在这些图表中，病毒复制的刺激表现为抑制百分比小于零(即阴性抑制)。图示了三种典型的曲线，其显示了存在NNRTI的地拉夫定(DLV)，奈韦拉平(NVP)和efavirenz(EFV)时病毒复制的药物依赖性刺激。将从源自患者的或者定向位点突变型抗性测试载体得到的结果，与从药物敏感性病毒对照如PNL4-3或HXB-2所获得的结果相比较。
图5.如实施例3，4和5中所描述，在HIV RT密码子位点230含有突变的患者病毒的表格。
图6.如实施例4中所描述，三种定向位点突变型K103N，M230L，和结合有K230L的K103N的降低的敏感性和病毒复制的药物依赖性刺激。将来自每个定向位点突变型的结果相互之间相比较，并且也与从药物敏感性病毒对照例如PNL4-3，或HXB-2中获得的那些结果相比较。在这些图表中，病毒复制的刺激示为抑制百分比小于零(即阴性抑制)。
图7.如实施例3中所描述，三种定向位点突变型Y181C，M230L，结合有K230L的Y181C的降低的敏感性和病毒复制的药物依赖性刺激。对于每种NNRTI(地拉夫定，efavirenz，和奈韦拉平)，将来自每个定向位点突变型的结果相互之间相比较，并且也与从药物敏感性病毒对照例如PNL4-3，或HXB-2中获得的那些结果相比较。在这些图表中，病毒复制的刺激表示为抑制百分比小于零(即阴性抑制)。
图8.如实施例6中所描述，在患者11073中的HIV RT密码子位点241和277的回复突变。上面的一组图显示了来自含有V241S突变的患者样品的图表。在这些图表中，对于所有的三种NNRTIs(地拉夫定，efavirenz，和奈韦拉平)，病毒复制的刺激表现为抑制百分比小于零(即阴性抑制)。下面的一组图显示了定向位点的突变回复为241V的结果。在此图中，在三种NNRTIs的任一种(地拉夫定，efavirenz，或奈韦拉平)中不再存在阴性抑制(病毒复制的刺激)。
图9.如实施例7中所描述，在患者014451的治疗过程中，间隔32周的两个时间点的敏感性曲线。上面的一组图显示了来自患者样品014459的敏感性曲线(0周)。下面的一组图显示了患者样品014451的敏感性曲线，(32周)，两者都显示了在存在所有三种NNRTIs时降低的敏感性和病毒复制的药物依赖性刺激，其与在密码子101，106，和190处出现HIV RT突变相一致。
图10.如实施例8，9，10和11中所描述，在HIV RT密码子位点245含有突变的患者病毒的表格。
图11.如实施例11中所描述，在患者010829中，HIV RT密码子位点245，270，277，292，293，和297的回复突变。将来自每个突变型的结果与从药物敏感性病毒对照例如PNL4-3，或HXB-2中获得的那些结果相比较。上面的一组图显示了来自患者样品的图表，其包含有在密码子位点245，270，277，292，293和297的突变。在这些图表中，对于所有三种NNRTIs(地拉夫定，efavirenz，和奈韦拉平)，病毒复制的刺激表现为抑制百分比小于零(即阴性抑制)。第二组图显示了在密码子245的定向位点回复突变，其后为在密码子270的回复突变。在NNRTIs的任何一种(地拉夫定，efavirenz或奈韦拉平)存在的情况下，两个单一回复突变型保持了与病毒复制的药物依赖性刺激相一致的分布(阴性抑制)。下面的一组图显示了在HIV-RT密码子245，270，277，292，293和297的回复突变。在这个最后的一组图中，尽管此定向位点突变型保持了降低的药物敏感性(药物抗性)，但是在三种NNRTIs的任何一种(地拉夫定，efavirenz，或奈韦拉平)中不再存在阴性抑制(病毒复制的刺激)。
图12.如实施例13中所描述，具有HIV RT突变K103N，135T，V245T的定向位点突变型中，降低的敏感性和病毒复制的药物依赖性刺激。将来自每个突变型的结果与从药物敏感性病毒对照例如PNL4-3，或HXB-2中获得的结果相比较。尽管每个HIV RT密码子位点的突变单独不能导致药物依赖性刺激，但是对于所有三种NNRTIs(地拉夫定，efavirenz或奈韦拉平)，三重突变型显示出药物依赖性刺激。在这些图表中，病毒复制的刺激表现为抑制百分比小于零(即阴性抑制)。
图13.如实施例12中所描述，患者13522的HIV RT密码子位点270的回复突变。将来自每个突变型的结果与从药物敏感性病毒对照例如PNL4-3，或HXB-2中获得的结果相比较。上面的一组图显示了含有I270S突变的患者样品的图表。在这些图表中，对于所有三种NNRTIs(地拉夫定，efavirenz，和奈韦拉平)，病毒复制的刺激表现为抑制百分比小于零(即阴性抑制)。第二组图显示在密码子270的定向位点的回复突变。尽管对三种NNRTIs的任何一种(地拉夫定，efavirenz，或奈韦拉平)不再表现阴性抑制(病毒复制的刺激)，但是对所有三种NNRTIs，定向位点突变型保持降低的药物敏感性(耐药性)。
图14.如实施例14中所描述，来自患者1033的12个病毒样品的临床史表。数据包括：药物治疗方案、服药治疗持续时间、病毒负荷、相对于药物敏感的病毒对照例如PNL4-3或HXB-2，敏感性数值中的表型倍数变化、和对那些显示出病毒生产的药物依赖性刺激的样品的阴性抑制百分比。
图15.如实施例14中所描述，来自患者1033的12个病毒样品的HIV-RT氨基酸突变表。
图16.由定点诱变确定的、如实施例14中讨论的、具体突变对1033-3病毒的作用。将来自每个突变型的结果与从药物敏感性病毒对照例如PNL4-3，或HXB-2中获得的结果相比较。在这些图表中，病毒复制的刺激表现为抑制百分比小于零(即阴性抑制)。
图17.由定点诱变确定的、如实施例14中描述的、M184V突变对刺激表型的作用。在HIV-RT密码子184的回复突变导致病毒复制的药物依赖性刺激水平增加，表现为抑制百分比小于零(即阴性抑制)。
图18.患者014451，与在密码子101，密码子106和密码子190的突变相关的，对NNRTI降低的敏感性和病毒复制的药物依赖性刺激(实施例7)。
图19.M184V突变对病毒复制的药物依赖性刺激的作用：RTV-309
发明详述
本发明涉及在接受抗反转录病毒治疗，特别是接受非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)抗反转录病毒治疗的患者中，监测HIV感染临床进展的方法，还涉及在存在一种或者多种NNRTI的时候，显示复制的药物依赖性刺激的HIV变种的检测。
在一个实施方案中，本发明提供了评价患者接受抗反转录病毒治疗的有效性的一种方法，该方法包含(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT的核酸，所述的HIV RT在RT中的一个或多个位点密码子处具有突变。该突变与表型敏感性/抗性中的变化正相关。
在一个具体实施方案中，本发明提供了评价患者接受NNRTI抗反转录病毒治疗的有效性的一种方法，该方法包含(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT的核酸，所述的HIV RT在密码子230和103或181处具有突变。通过使用表型敏感性分析，本发明确认：在密码子230的突变，其单独或结合有HIV RT密码子103或181的突变，与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低相关。源自患者的、包含M230L突变的抗性测试载体，其单独或结合有其它NNRTI-抗性突变，显示了：对于地拉夫定，敏感性下降10倍至＞450倍；对于efavirenz，下降5倍至＞250倍，对于奈韦拉平，下降10倍至＞600倍。对于所有三种NNRTI，在包含有HIV RT密码子230突变的、源自患者的抗性测试载体中病毒复制的刺激百分比范围为0％-100％。构建了定向位点的抗性测试载体，其单独包含有230位突变或结合有103或181位突变。单独的230位突变引起对地拉夫定(58倍)，奈韦拉平(40倍)和efavirenz(23倍)的敏感性降低，并且在奈韦拉平(约50％)和地拉夫定(约50％)存在时，引起复制的药物依赖性刺激。在230位和103位的结合突变引起对地拉夫定(＞250倍)，奈韦拉平(＞600倍)和efavirenz(＞470倍)的敏感性降低，并且在地拉夫定(约100％)，奈韦拉平(约70％)，和efaviraenz(约40％)存在时，引起复制的药物依赖性刺激。在230位与181位结合突变引起对地拉夫定(＞250倍)，奈韦拉平(＞800倍)和efavirenz(25倍)的敏感性降低，但是在地拉夫定，奈韦拉平，或efaviraenz存在时，复制的药物依赖性刺激没有降低。
在另一个具体实施方案中，本发明提供了评价患者接受NNRTI抗反转录病毒治疗的有效性的一种方法，该方法包含(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT的核酸，所述的HIV RT在密码子241，103和135位有突变，或者在密码子241结合有在101，106，135，138和190的突变。通过使用表型敏感性分析，本发明确认：在HIV RT的密码子241的突变结合有在密码子103的突变或者结合有在HIV RT的密码子101，106和190的突变，其与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低(抗性增加)相关。源自患者的、除了其它NNRTI抗性突变(例如101，103，106，135，138和190)外在241密码子含有突变的抗性测试载体显示：对于地拉夫定，敏感性下降范围为41倍至＞250倍；对于奈韦拉平(＞600倍)和efavirenz(＞470倍)，显示出高水平的敏感性降低。源自患者的、含有结合以其它NNRTI抗性突变(例如101，103，106，135，138和190)的241密码子突变的抗性测试载体，对所有三种NNRTI显示出的病毒复制药物依赖性刺激，其范围为70％-100％。
在另一个具体实施方案中，本发明提供了评价患者接受NNRTI抗反转录病毒治疗的有效性的一种方法，该方法包含(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT的核酸，所述的HIV RT在密码子245，103和135具有突变，或者在密码子245结合有可以包括98，101，103，135，138，181，190和/或225的额外的突变。通过使用表型敏感性分析，本发明确认：在HIV RT中，结合有在密码子103和135突变的密码子245突变，或者结合有可以包括98，101，103，135，138，181，190和225的额外突变的密码子245突变，与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低相关。源自患者的、含有245密码子突变和上述额外的NNRTI抗性突变的抗性测试载体显示：对于地拉夫定，敏感性下降范围为20倍至＞250倍；对于奈韦拉平，下降8倍至＞600倍，对于efavirenz，下降5倍至＞470倍。对于所有三种NNRTI，包含有245位突变和上述额外的NNRTI抗性突变的、源自患者的抗性测试载体显示病毒复制中的药物依赖性刺激，其范围为20％-100％。构建定向位点抗性测试载体，该载体在245，103和135位和在如上述各种组合中包含突变。在HIV RT密码子245的单独突变(V245E或V245T)不能导致对地拉夫定，奈韦拉平或efavirenz敏感性的明显降低。245(V245E)与103(K103N)和135(I135T)的结合突变引起对地拉夫定(169倍)，奈韦拉平(244倍)和efavirenz(93倍)的敏感性降低，和在地拉夫定(约20％)和奈韦拉平(约15％)而非efavirenz存在时引起复制的药物依赖性刺激。在245(V245T)与103(K103N)和135(I135T)的结合突变，引起对地拉夫定(＞250倍)，奈韦拉平(544倍)和efavirenz(174倍)的敏感性降低，和在地拉夫定(约50％)，奈韦拉平(约40％)，和efavirenz(约25％)存在时引起复制的药物依赖性刺激。
在另一个具体实施方案中，本发明提供了评价患者接受NNRTI抗反转录病毒治疗的有效性的一种方法，该方法包含(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT的核酸，所述的HIV RT在密码子270具有突变并且在密码子103和135具有带有或者不带有密码子225突变的额外突变。通过使用表型敏感性分析，本发明确认：在HIV RT中，在密码子270的突变结合以在密码子103和135的突变带有或者不带有密码子225的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低相关，和在地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz存在时与复制的药物依赖性刺激相关。源自患者的、除了其它NNRTI抗性突变(例如103，135，伴有或不伴有225)外还含有270突变的抗性测试载体显示：对于所有三种NNRTI高水平的敏感性降低，而且对于所有三种NNRTI，病毒复制中的药物依赖性刺激，其范围为80-110％。
在前面所述的情况下，感染患者的HIV病毒的表型敏感性/抗性分布和基因型分布已经被改变，这反映了响应于抗反转录病毒制剂的一些变化。在NNRTI抗反转录病毒治疗中，感染患者的HIV病毒可能对在此描述的三种NNRTI的任何组合产生抗性。此外，可能会发现：当存在一种或者多种药物的时候，复制要比没有这些药物的时候更有效。因此，在检测到突变以后，或者增加抗反转录病毒制剂的剂量，改成另一种抗反转录病毒制剂，或者在患者的治疗方案中添加一种或几种额外的抗反转录病毒制剂可能是理想的。例如，当在使用efavirenz(DMP-266)治疗的患者中出现230和103突变的时候，患者的治疗方案中最好作以改变，将NNRTI抗反转录病毒制剂如地拉夫定，efavirenz或奈韦拉平去除；和/或者(ii)在患者的治疗方案中添加使用另一种抗反转录病毒制剂。治疗改变的有效性可以通过监测病毒负荷如HIV RNA拷贝数来评价。HIVRNA拷贝数的下降与治疗药物的有效性呈正相关。
此处用到的短语“正相关”指特定的结果导致一个比其它结论更合适的特定的结论。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行NNRTI治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；(ii)将生物样品中的编码HIV的RNA转录成cDNA；(iii)使用这样的HIV PCR引物来扩增源自患者的片段(PDS)，该引物产生含有RT基因的产物；(iv)使用这样的引物来进行序列反应，该引物产生的序列包含野生型或者在密码子230，103和181的突变氨基酸；和(v)从序列中确定是否存在或者缺少在密码子230，103和181的突变。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行NNRTI治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；(ii)将生物样品中的编码HIV的RNA转录成cDNA；(iii)使用这样的HIV PCR引物来扩增源自患者片段(PDS)，该引物产生含有RT基因的产物；(iv)使用这样的引物来进行序列反应，该引物产生的序列包含野生型或者在密码子230，101，103，190，221，和238的突变氨基酸；和(v)从序列中确定是否存在或者缺少在密码子230，101，103，190，221，和238的突变。
本发明还提供了一种评价HIV感染患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和(b)评价是否该生物样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该逆转录酶在密码子230具有单独的突变或者其结合有密码子103或密码子181突变，其中这种突变的存在与非核苷逆转录酶抑制剂敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
本发明还提供了一种评价候选HIV抗反转录病毒药物化合物的生物有效性的方法，其包含：(a)将抗性测试载体引入宿主细胞，该载体包含来源于患者的片段，该片段还包含在密码子230的单独突变或者其结合有在密码子103的突变或在密码子181的突变，和一个指示基因；(b)培养步骤(a)中的宿主细胞；(c)在目的宿主细胞中测量指示基因的表达；和(d)将来自步骤(c)中指示基因的表达的测量结果与在不存在候选抗反转录病毒药物化合物时执行(a)-(c)步骤所测量的指示基因的表达的测量结果相比较；其中在步骤(a)-(c)；步骤(b)-(c)；或者步骤(c)中存在候选抗反转录病毒药物化合物的测试浓度，其中在候选抗反转录病毒药物化合物存在时测量到的指示基因表达的降低表现出该化合物的生物有效性。
本发明提供了一种抗性测试载体，其包含：来源于HIV患者的片段，其含有逆转录酶，该逆转录酶在密码子230，103或者181中的至少一个具有突变，和(ii)和一个指示基因，其中指示基因的表达依赖于来源于患者的片段。
本发明还提供了一种评价HIV感染患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：
(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和
(b)评价是否该生物样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该逆转录酶在密码子230具有单独的突变或者其至少结合有选自下列密码子的突变：密码子101，密码子103，密码子190，密码子221，和密码子238，其中这些突变的存在，与非核苷逆转录酶抑制剂敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行NNRTI治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；(ii)将该生物样品中的编码HIV的RNA转录成cDNA；(iii)使用这样的HIV PCR引物来扩增源自患者的片段(PDS)，该引物产生含有RT基因的产物；(iv)使用这样的引物来进行序列反应，该引物产生的序列包含野生型或者在密码子241，103和135的突变氨基酸；和(v)从序列中确定是否存在或者缺少在密码子241，103和135的突变。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行NNRTI治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；(ii)将该生物样品中的编码HIV的RNA转录成cDNA；(iii)使用这样的HIV PCR引物来扩增源自患者的片段(PDS)，该引物产生含有RT基因的产物；(iv)使用这样的引物来进行序列反应，该引物产生的序列包含野生型或者在密码子241，101，106，135，138和190的突变氨基酸；和(v)从序列中确定是否存在或者缺少在密码子241，101，106，135，138和190的突变。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行NNRTI治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；(ii)将该生物样品中的编码HIV的RNA转录成cDNA；(iii)使用这样的HIV PCR引物来扩增源自患者的片段(PDS)，该引物产生含有RT基因的产物；(iv)使用这样的引物来进行序列反应，该引物产生的序列包含野生型或者在密码子245，98，135和181的突变氨基酸；和(v)从序列中确定是否存在或者缺少在密码子245，98，135和181的突变。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行NNRTI治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；(ii)将该生物样品中的编码HIV的RNA转录成cDNA；(iii)使用这样的HIV PCR引物来扩增源自患者的片段(PDS)，该引物产生含有RT基因的产物；(iv)使用这样的引物来进行序列反应，该引物产生的序列包含野生型或者在密码子245，101，103，135和190的突变氨基酸；和(v)从序列中确定是否存在或者缺少在密码子245，101，103，135和190的突变。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行NNRTI治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；(ii)将该生物样品中的编码HIV的RNA转录成cDNA；(iii)使用这样的HIV PCR引物来扩增源自患者的片段(PDS)，该引物产生含有RT基因的产物；(iv)使用这样的引物来进行序列反应，该引物产生的序列包含野生型或者在密码子245，103，225和270的突变氨基酸；和(v)从序列中确定是否存在或者缺少在密码子245，103，225和270的突变。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行NNRTI治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；(ii)将该生物样品中的编码HIV的RNA转录成cDNA；(iii)使用这样的HIV PCR引物来扩增源自患者的片段(PDS)，该引物产生含有RT基因的产物；(iv)使用这样的引物来进行序列反应，该引物产生的序列包含野生型或者在密码子245，135和138的突变氨基酸；和(v)从序列中确定是否存在或者缺少在密码子245，135和138的突变。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行NNRTI治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；(ii)将该生物样品中的编码HIV的RNA转录成cDNA；(iii)使用这样的HIV PCR引物来扩增源自患者的片段(PDS)，该引物产生含有RT基因的产物；(iv)使用这样的引物来进行序列反应，该引物产生的序列包含野生型或者在密码子245，98，103，135，181和190的突变氨基酸；和(v)从序列中确定是否存在或者缺少在密码子245，98，103，135，181和190的突变。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行NNRTI治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；(ii)将该生物样品中的编码HIV的RNA转录成cDNA；(iii)使用这样的HIV PCR引物来扩增源自患者的片段(PDS)，该引物产生含有RT基因的产物；(iv)使用这样的引物来进行序列反应，该引物产生的序列包含野生型或者在密码子245和103的突变氨基酸；和(v)从序列中确定是否存在或者缺少在密码子245和103的突变。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行NNRTI治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；(ii)将该生物样品中的编码HIV的RNA转录成cDNA；(iii)使用这样的HIV PCR引物来扩增源自患者的片段(PDS)，该引物产生含有RT基因的产物；(iv)使用这样的引物来进行序列反应，该引物产生的序列包含野生型或者在密码子245，103，135和225的突变氨基酸；和(v)从序列中确定是否存在或者缺少在密码子245，103，135和225的突变。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行NNRTI治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染的患者中收集生物样品；(ii)将该生物样品中的编码HIV的RNA转录成cDNA；(iii)使用这样的HIV PCR引物来扩增源自患者的片段(PDS)，该引物产生含有RT基因的产物；(iv)使用这样的引物来进行序列反应，该引物产生的序列包含野生型或者在密码子270，103和135的突变氨基酸；和(v)从序列中确定是否存在或者缺少在密码子270，103和135的突变。
在HIV RT的密码子230和或者103或者181呈现的突变表明：当前或预期的NNRTI治疗有效性已经被减小了。如本发明所示：在密码子230的突变，结合以密码子103或181的突变，降低了药物敏感性，并且引起了病毒复制的药物依赖性刺激。使用本发明的方法能够显示在NNRTI治疗上的变化。
类似地，使用本发明的方式和方法，在HIV RT基因的密码子230，101，103，190，221和238呈现的突变表明：当前或预期的NNRTI治疗有效性已经被减小了。如本发明所示：密码子230，101，103，190，221和238的突变，降低了药物敏感性，并且引起了病毒复制的药物依赖性刺激。使用本发明的方法能够显示在NNRTI治疗上的变化。
类似地，使用本发明的方式和方法，在HIV RT基因的密码子241，103和135呈现的突变表明：当前或预期的NNRTI治疗有效性已经被减小了。如本发明所示：密码子241，103和135的突变，降低了药物敏感性，并且引起了病毒复制的药物依赖性刺激。使用本发明的方法能够显示在NNRTI治疗上的变化。
类似地，使用本发明的方式和方法，在HIV RT的密码子241，101，106，135，138和190呈现的突变表明：当前或预期的NNRTI治疗有效性已经被减小了。如本发明所示：密码子241，101，106，135，138和190的突变，降低了药物敏感性，并且引起了病毒复制的药物依赖性刺激。使用本发明的方法能够显示在NNRTI治疗上的变化。
类似地，使用本发明的方式和方法，在HIV RT的密码子245，98，135和181呈现的突变表明：当前或预期的NNRTI治疗有效性已经被减小了。如本发明所示：密码子245，98，135和181的突变，降低了药物敏感性，并且引起了病毒复制的药物依赖性刺激。使用本发明的方法能够显示在NNRTI治疗上的变化。
类似地，使用本发明的方式和方法，在HIV RT的密码子245，101，103，135和190呈现的突变表明：当前或预期的NNRTI治疗有效性已经被减小了。如本发明所示：密码子245，101，103，135和190的突变，降低了药物敏感性，并且引起了病毒复制的药物依赖性刺激。使用本发明的方法能够显示在NNRTI治疗上的变化。
类似地，使用本发明的方式和方法，在HIV RT的密码子245，103，225和270呈现的突变表明：当前或预期的NNRTI治疗有效性已经被减小了。如本发明所示：密码子245，103，225和270的突变，降低了药物敏感性，并且引起了病毒复制的药物依赖性刺激。使用本发明的方法能够显示在NNRTI治疗上的变化。
类似地，使用本发明的方式和方法，在HIV RT的密码子245，135和138呈现的突变表明：当前或预期的NNRTI治疗有效性已经被减小了。如本发明所示：密码子245，135和138的突变，降低了药物敏感性，并且引起了病毒复制的药物依赖性刺激。使用本发明的方法能够显示在NNRTI治疗上的变化。
类似地，使用本发明的方式和方法，在HIV RT的密码子245，98，103，135，181和190呈现的突变表明：当前或预期的NNRTI治疗有效性已经被减小了。如本发明所示：密码子245，98，103，135，181和190的突变，降低了药物敏感性，并且引起了病毒复制的药物依赖性刺激。使用本发明的方法能够显示在NNRTI治疗上的变化。
类似地，使用本发明的方式和方法，在HIV RT的密码子245和103呈现的突变表明：当前或预期的NNRTI治疗有效性已经被减小了。如本发明所示：密码子245和103的突变，降低了药物敏感性，并且引起了病毒复制的药物依赖性刺激。使用本发明的方法能够显示在NNRTI治疗上的变化。
类似地，使用本发明的方式和方法，在HIV RT的密码子245，103，135和225呈现的突变表明：当前或预期的NNRTI治疗有效性已经被减小了。如本发明所示：密码子245，103，135和225的突变，降低了药物敏感性，并且引起了病毒复制的药物依赖性刺激。使用本发明的方法能够显示在NNRTI治疗上的变化。
类似地，使用本发明的方式和方法，在HIV RT的密码子270，103，和135呈现的突变表明：当前或预期的NNRTI治疗有效性已经被减小了。如本发明所示：密码子270，103，和135的突变，降低了药物敏感性，并且引起了病毒复制的药物依赖性刺激。使用本发明的方法能够显示在NNRTI治疗上的变化。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行抗反转录病毒治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT基因的核酸，而且其含有在密码子230和或者密码子103或者密码子181的突变。通过使用表型敏感性分析，本发明观察到：在密码子230和或者103和181存在的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低正相关并且引起病毒复制的药物依赖性刺激。在另一个具体实施方案中，HIV RT的突变的密码子230编码亮氨酸(L)，而突变的密码子103编码天冬酰胺(N)。在另一个具体实施方案中，HIVRT的突变的密码子230(the mutated codon 230 or HIV RT)编码亮氨酸和在181突变的密码子编码半胱氨酸(C)。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行抗反转录病毒治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT基因的核酸，而且其含有在密码子230，101，103，190，221，和238的突变。通过使用表型敏感性分析，本发明观察到：在密码子230，101，103，190，221，和238存在的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低正相关并且引起病毒复制的药物依赖性刺激。在另一个具体实施方案中，HIV RT的突变的密码子230编码亮氨酸(L)，突变的密码子101编码谷氨酸(E)，突变的密码子103编码天冬酰胺(N)，突变的密码子190编码丝氨酸(S)，突变的密码子221编码酪氨酸(Y)，和突变的密码子238编码苏氨酸(T)。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行抗反转录病毒治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT基因的核酸，而且其含有在密码子241，103和135的突变。通过使用表型敏感性分析，本发明观察到：在密码子241，103和135存在的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低正相关并且引起病毒复制的药物依赖性刺激。在另一个具体实施方案中，HIV RT突变的密码子241编码丝氨酸(S)，突变的密码子103编码天冬酰胺(N)，和突变的密码子135编码苏氨酸(T)。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行抗反转录病毒治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT基因的核酸，而且其含有在密码子241，101，106，135，138和190的突变。通过使用表型敏感性分析，本发明观察到：在密码子241，101，106，135，138和190存在的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低正相关并且引起病毒复制的药物依赖性刺激。在另一个具体实施方案中，HIV RT突变的密码子241编码异亮氨酸(I)，突变的密码子101编码谷氨酸(E)，突变的密码子106编码蛋氨酸(M)，突变的密码子135编码苏氨酸(T)，突变的密码子138编码丙氨酸(A)，和突变的密码子190编码丙氨酸(A)。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行抗反转录病毒治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT基因的核酸，而且其含有在密码子245，98，135和181的突变。通过使用表型敏感性分析，本发明观察到：在密码子245，98，135和181存在的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低正相关并且引起病毒复制的药物依赖性刺激。在另一个具体实施方案中，HIV RT突变的密码子245编码谷氨酸(E)，突变的密码子98编码甘氨酸(G)，突变的密码子135编码苏氨酸(T)，和突变的密码子181编码半胱氨酸(C)。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行抗反转录病毒治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT基因的核酸，而且其含有在密码子245，101，103，135和190的突变。通过使用表型敏感性分析，本发明观察到：在密码子245，101，103，135和190存在的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低正相关并且引起病毒复制的药物依赖性刺激。在另一个具体实施方案中，HIV RT突变的密码子245编码谷氨酸(E)，突变的密码子101编码谷氨酸(E)，突变的密码子103编码天冬酰胺(N)，突变的密码子135编码苏氨酸(T)，和突变的密码子190编码丙氨酸(A)。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行抗反转录病毒治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT基因的核酸，而且其含有在密码子245，103，225和270的突变。通过使用表型敏感性分析，本发明观察到：在密码子245，103，225和270存在的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低正相关并且引起病毒复制的药物依赖性刺激。在另一个具体实施方案中，HIV RT突变的密码子245编码谷氨酸(E)，突变的密码子103天冬酰胺(N)，突变的密码子225编码组氨酸(H)，和突变的密码子270编码蛋氨酸(M)。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行抗反转录病毒治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT基因的核酸，而且其含有在密码子245，135和138的突变。通过使用表型敏感性分析，本发明观察到：在密码子245，135和138存在的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低正相关并且引起病毒复制的药物依赖性刺激。在另一个具体实施方案中，HIV RT突变的密码子245编码苏氨酸(T)，突变的密码子135编码苏氨酸(T)，和突变的密码子138编码甘氨酸(G)。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行抗反转录病毒治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT基因的核酸，而且其含有在密码子245，98，103，135，181和190的突变。通过使用表型敏感性分析，本发明观察到：在密码子245，98，103，135，181和190存在的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低正相关并且引起病毒复制的药物依赖性刺激。在另一个具体实施方案中，HIV RT突变的密码子245编码苏氨酸(T)，突变的密码子98编码谷氨酸(G)，突变的密码子103编码天冬酰胺(N)，突变的密码子135编码苏氨酸(T)，突变的密码子181编码半胱氨酸(C)，和突变的密码子190编码丙氨酸(A)。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行抗反转录病毒治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT基因的核酸，而且其含有在密码子245和103的突变。通过使用表型敏感性分析，本发明观察到：在密码子245和103存在的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低正相关并且引起病毒复制的药物依赖性刺激。在另一个具体实施方案中，HIV RT突变的密码子245编码苏氨酸(T)，和突变的密码子103编码天冬酰胺(N)。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行抗反转录病毒治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT基因的核酸，而且其含有在密码子245，103，135，和225的突变。通过使用表型敏感性分析，本发明观察到：在密码子245，103，135，和225存在的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低正相关并且引起病毒复制的药物依赖性刺激。在另一个具体实施方案中，HIV RT突变的密码子245编码蛋氨酸(M)，突变的密码子103编码天冬酰胺(N)，突变的密码子135编码苏氨酸(T)，和突变的密码子225编码组氨酸(H)。
本发明的另一个优选的、非限制性的具体实施方案如下：一种评价方法，该方法评价对患者进行抗反转录病毒治疗的有效性，其包括：(i)从HIV感染患者中收集生物样品；和(ii)确定是否该生物样品含有编码HIV RT基因的核酸，而且其含有在密码子270，103，和135的突变。通过使用表型敏感性分析，本发明观察到：在密码子270，103，和135存在的突变与对地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的敏感性降低正相关并且引起病毒复制的药物依赖性刺激。在另一个具体实施方案中，HIV RT突变的密码子270编码丝氨酸(S)，突变的密码子103编码天冬酰胺(N)，和突变的密码子135编码苏氨酸(T)。
本发明还提供了将抗性测试载体用于药物筛查的方式和方法，该抗性测试载体包含一个含有NNRTI突变的HIV基因。更具体地说，本发明描述了用于药物筛查的含有HIV逆转录酶的抗性测试载体，该HIV逆转录酶在密码子230和或者103或者181具有突变。本发明还描述了包含有HIV逆转录酶的抗性测试载体，该HIV逆转录酶在密码子230和101，103，190，221，和238具有突变。本发明还描述了包含有HIV逆转录酶的抗性测试载体，该HIV逆转录酶在密码子241，103，和135具有突变。本发明还描述了包含有HIV逆转录酶的抗性测试载体，该HIV逆转录酶在密码子241，101，106，190，135，和138具有突变。本发明还描述了包含有HIV逆转录酶的抗性测试载体，该HIV逆转录酶在密码子245，98，135，和181具有突变。本发明还描述了包含有HIV逆转录酶的抗性测试载体，该HIV逆转录酶在密码子245，101，103，135，和190具有突变。本发明还描述了包含有HIV逆转录酶的抗性测试载体，该HIV逆转录酶在密码子245，103，225，和270具有突变。本发明还描述了包含有HIV逆转录酶的抗性测试载体，该HIV逆转录酶在密码子245，135和138具有突变。本发明还描述了包含有HIV逆转录酶的抗性测试载体，该HIV逆转录酶在密码子245，98，103，135，181，和190具有突变。本发明还描述了包含有HIV逆转录酶的抗性测试载体，该HIV逆转录酶在密码子245和103具有突变。本发明还描述了包含有HIV逆转录酶的抗性测试载体，该HIV逆转录酶在密码子245，103，135，和225具有突变。本发明还描述了包含有HIV逆转录酶的抗性测试载体，该HIV逆转录酶在密码子270，103和135具有突变。
本领域的普通技术人员熟悉病毒的结构，生命周期和遗传因子，这些可以在本发明的药物敏感性和抗性试验中被测试。例如，了解反转录病毒的生活周期以及反转录病毒拯救与感染性所需的病毒基因，对本发明的实践是有用的。被反转录病毒感染的细胞排出一种包含二倍体RNA基因组的膜病毒。嵌合有包膜糖蛋白(其用于确定感染的宿主范围)的该病毒，粘附到将要被感染的细胞的细胞膜的受体上。与受体结合后，病毒在通过宿主细胞质时被内化并脱壳。在进入细胞核的过程中或在细胞核中，病毒核心中的逆转录酶分子促进双链DNA前病毒的合成，该合成作用是通过tRNA分子与基因组病毒RNA的结合引发的。双链的DNA前病毒随后被整合到宿主细胞基因组中，在那里它可以作为编码病毒蛋白的mRNAs和病毒体基因组RNA的转录模板，这些mRNAs和RNA将被包裹到病毒核心颗粒中。在它们从被感染细胞中出来的过程中，核心颗粒穿过细胞质，粘附在新感染细胞的质膜内，并且出芽，此出芽过程携带着包含有病毒编码的包膜糖蛋白基因产物的膜壳体(tract)。这个感染循环：反转录，转录，翻译，病毒组装，和出芽，在感染传播过程中不断地重复。
病毒RNA和作为其结果的前病毒DNA，编码几种顺式作用元件，这些顺式作用元件对于成功的完成病毒生活周期是至关重要的。病毒体RNA在其3′末端携带病毒启动子。当基因组被反转录时，复制特技(acrobatics)把病毒启动子安置在前病毒基因组5′末端。恰恰3′到5′反转录病毒LTR位于病毒包装位点。反转录病毒生活周期需要病毒编码的反式作用因子的存在。病毒-RNA-依赖性的DNA聚合酶(pol)-逆转录酶也被包含在病毒核心内，它对于病毒生活周期是至关重要的，因为其负责将基因组RNA转换成整合的中间体前病毒DNA。病毒粘附到未感染的细胞和病毒扩散需要病毒包膜糖蛋白-env。还存在一些被称为反式激活蛋白的转录反式激活因子，其可以被用于调节整合的亲代前病毒的转录水平。典型地，有能力复制(无缺陷)病毒是自给的病毒，因为它们编码所有的这些反式作用因子。它们缺陷的对应物不是自给的病毒。
至于DNA病毒，例如嗜肝DNA病毒，了解其生活周期和用于感染的病毒基因对于本发明的实践很有用。HBV进入的过程尚未被很好的定义。HBV的复制使用RNA中间体模板。在被感染的细胞中，复制的第一步是将不对称的松环DNA(rc-DNA)转化为共价闭环DNA(cccDNA)。这个过程发生在被感染的肝细胞的核中，其包括完成DNA正链合成和完成DNA末端的连接。在第二步中，cccDNA被宿主的RNA聚合酶转录产生3.5kB的RNA模板(前基因组)。该前基因组在病毒核心中与蛋白复合。第三步包括：通过使用病毒编码的P蛋白逆转录酶拷贝前基因组RNA，合成第一负义DNA链。P蛋白也作为负链DNA引物。最后，使用P蛋白DNA聚合酶活性并且将病毒RNA寡聚体作为引物，通过拷贝第一DNA链合成第二正义DNA链。前基因组还为主要的结构核心蛋白转录mRNA。
下面的流程图显示了一些本发明可能会用到的各种载体和宿主细胞。并没有打算全部包括在内。流程图：载体指示基因盒                     +           病毒载体(功能的/无功能的指示基因             (基因组或者亚基因组))
                            ↓
                     指示基因病毒载体
                (功能的/无功能的指示基因)
                                +患者序列受体位点
                               +源自患者的片段
                            ↓
                      抗性测试载体
               (源自患者的片段+指示基因)宿主细胞包装的宿主细胞—用包装表达载体转染抗性测试载体宿主细胞—用抗性测试载体转染的包装的宿主细胞靶宿主细胞—将要被由抗性测试载体宿主细胞生产的抗性测试载体病毒颗粒感染的宿主细胞。抗性测试载体
“抗性测试载体”指的是一种或者多种这样的载体，它们总的来说包含含有源自患者的片段和指示基因的DNA或者RNA。当抗性测试载体含有超过一种载体的时候，源自患者的片段可以被包含在一种载体内并且指示基因被包含在不同的载体内。为了清楚起见，免得被认为是一种抗性测试载体，这种含有超过一种载体的抗性测试载体在此被称为抗性测试载体系统。抗性测试载体的DNA或者RNA因此可以被包含在一个或者多个DNA或者RNA分子中。在一个实施方案中，通过将源自患者的片段插入到指示基因病毒载体中，构建抗性测试载体。在另一个实施方案中，通过将源自患者的片段插入到包装载体中而指示基因被包含在第二载体如指示基因病毒载体中来构建抗性测试载体。此处用到的“源自患者的片段”指的是一个或者多个这样的病毒片段，这些片段是通过使用各种方法直接从患者中获得的，例如使用从病毒RNA制备得到的DNA或者互补DNA(cDNA)，对源自患者的片段群进行分子克隆或者聚合酶链式反应(PCR)扩增，所述的病毒RNA存在于被感染患者的细胞(例如：外周血单核细胞，PBMC)，血清或者其它体液。当病毒片段被从患者体内“直接获得”的时候，它的获得不经过培养病毒的路径，或者如果病毒被培养，那么经过最小数量的路径来基本上消除培养中的突变选择。术语“病毒片段”指的是：编码一种基因产物(如一种蛋白)的任何一种功能性病毒序列或病毒基因，所述基因产物为抗病毒药物的靶子。此处使用的术语“功能性病毒序列”指的是任何携带功能活性的核酸序列(DNA或者RNA)例如增强子、启动子、聚腺苷酸化位点，反式作用因子作用位点，例如tar和RRE，包装序列，整合序列，或者剪接序列。如果药物被靶向超过一种功能性病毒序列或者病毒基因产物，那么相应于每个所述病毒基因的源自患者的片段将被插入到抗性测试载体中。在联合治疗的情况下，相应于每个功能性病毒序列或者病毒基因产物的源自患者的片段将被插入到抗性测试载体中，在所述的联合治疗中，两个或者多个靶向两个不同功能性病毒序列或者病毒基因产物的抗病毒被评价。依赖于此处描述的所使用的特定的结构，在指示基因病毒载体或者例如包装载体中，这些源自患者的片段被插入到被称作患者序列受体位点的、独特的限制酶切位点或者特定的位置中。
此处用到的“源自患者的片段”包括来自人和各种动物种类的片段。这些种类包括，但不限于黑猩猩、马、牛、猫和狗。
源自患者的片段也可以通过使用任何几种候选的克隆技术被整合到抗性测试载体中。例如，通过将II类限制酶切位点同时引入质粒骨架和源自患者的片段中的克隆，或者通过尿嘧啶DNA糖基化酶引物克隆(参考文献)。
可以通过任何分子克隆或者基因扩增方法，或者其修饰方法，通过在将被引入到抗性测试载体中的源自患者的片段的末端引入患者序列受体位点，如下所述，获得源自患者的片段。例如，在基因扩增方法如PCR中，相应于患者序列受体位点的限制酶切位点可以被整合到在PCR反应中使用的引物的末端。类似地，在分子克隆方法例如cDNA克隆中，所述的限制酶切位点可以被整合到引物的末端，该引物被用于第一或者第二链cDNA的合成，或者，在例如DNA(无论克隆的或未克隆的DNA)引物修复方法中，所述的限制酶切位点可以被整合到用于修复反应的引物当中。对患者序列受体位点和引物进行设计，以提高源自患者的片段的表达。具有被设计的患者序列受体位点的抗性测试载体组，提供了源自患者的片段的表达，而在单独一种抗性测试载体中这些片段不会被充分表达。
通过对指示基因病毒载体(在下面描述)进行修饰来制备抗性测试载体：引入患者序列受体位点，扩增或者克隆源自患者的片段，并且在患者序列受体位点，精确地将被扩增的或者被克隆的序列插入到指示基因病毒载体中。抗性测试载体是从指示基因病毒载体构建的，指示基因病毒载体是依次衍生于基因组病毒载体或者亚基因组病毒载体和指示基因盒，每一个在下面将逐一描述。随后抗性测试载体被引入宿主细胞。或者，通过将患者序列受体位点引入到一个包装载体，扩增或者克隆源自患者的片段，并且在患者序列受体位点，精确地将被扩增的或者被克隆的序列插入到包装载体中，并且共转染该包装载体和指示基因病毒载体，来制备抗性测试载体(也被称作抗性测试载体系统)。
在一个优选实施方案中，可以将抗性测试载体与包装表达载体一起引入到包装宿主细胞中，如下面所定义，以产生抗性测试载体病毒颗粒，这些颗粒用于药物抗性和敏感性试验，在此将这些试验称为“基于颗粒的测试”。在一个备选的优选实施方案中，抗性测试载体可以在没有包装表达载体的情况下被引入到宿主细胞中，以实施药物抗性和敏感性试验，在此将该试验称为“不基于颗粒的测试”。此处用到的“包装表达载体”提供了一些因子，例如：包装蛋白(例如结构蛋白如核心和包膜多肽)，反式作用因子，或者复制缺陷的反转录病毒或嗜肝DNA病毒需要的基因。在这种情况下，有复制能力的病毒基因组在某种意义上被消弱，以至于它不能靠自己来复制。这意味着：尽管包装表达载体能够产生需要用来挽救缺陷病毒基因组的反式作用或者缺失基因，但是被消弱的基因组不能自我挽救，所述的缺陷病毒基因组存在于包含被削弱的基因组的细胞中。指示剂或者指示基因
“指示剂或者指示基因”指的是编码这样的蛋白，DNA或者RNA结构的核酸，它们或者直接地或者通过一种反应来引起一种可以测量的或者可以觉察的外观例如可测波长的颜色或者光，或者在DNA或RNA被用作指示剂的情况下，特殊DNA或者RNA的结构的变化或者产生。指示剂基因优选的实例是E.coli lacZ基因—其编码β-半乳糖苷酶，luc基因—其编码或者来自例如Photonis pyralis(萤火虫)或者来自Renillareniformis(海肾)的萤光素酶，E.coli phoA基因—其编码碱性磷酸酶，绿色荧光蛋白和细菌CAT基因—其编码氯霉素乙酰转移酶。指示基因的另外的优选实例是分泌蛋白或者细胞表面蛋白，它们可以通过下列测定法被很容易地测定，测定法例如放射性免疫测定(RIA)，或者荧光激活细胞分类术(FACS)，所述的蛋白包括，例如生长因子，细胞因子，和细胞表面抗原(例如分别为生长激素，IL-2或者CD4)。应该理解“指示基因”还包括选择基因，也被称作选择性标记。对于哺乳动物细胞的合适的选择性标记的实例是二氢叶酸还原酶(DHFR)，胸苷激酶，潮霉素，新霉素，双源(zeocin)或者E.coli gpt。在前述指示基因的实例的情况下，指示基因和源自患者的片段是分离的，即：离生的和分离的基因。在一些情况下，源自患者的片段也可以被用作指示基因。在一个这样的实施方案中，其中的源自患者的片段相应于超过一个的、为抗病毒的靶子的病毒基因，所述病毒基因的一种也可以作为指示基因。例如，因为其分解显色底物的能力或者其活化不活泼酶原(该酶原顺次分解显色底物)的能力，使得在每种情况下引起颜色反应，所以病毒蛋白酶基因可以作为指示基因。在所有上述指示基因的实例中，指示基因既可以是“功能性的”也可以是“非功能性的”，但是在每种情况下，靶细胞中指示基因的表达最终要依赖于源自患者的片段的作用。功能性指示基因
对于“功能性指示基因”，指示基因可能能够在如下定义的、独立于源自患者的片段，在“包装宿主细胞/抗性测试载体宿主细胞”中表达，但是功能性指示基因不能在如下定义的靶宿主细胞中表达，在靶宿主细胞中，没有功能性抗性测试载体颗粒的产生和它们对靶宿主细胞的有效感染。在功能性指示基因的一个实施方案中，含有控制元件和编码指示蛋白的基因的指示基因盒，被以与病毒载体的天然或者外源的增强子/启动子相同或者相反的转录方向插入到指示基因病毒载体中。在HIV或者HBV的情况下，功能性指示基因的一个实例将指示基因及其启动子(CMVIE增强子/启动子)分别以与HIV-LTR或者HBV增强子—启动子，或者与病毒载体相关的CMV IE增强子/启动子相同或者相反的转录方向放置。非功能性指示基因
或者，指示基因可以是“非功能性的”，因为指示基因在转染了抗性测试载体的包装宿主细胞内没有被有效地表达，直到其通过一种或者多种源自患者的片段产物的作用转换为功能性指示基因，所述包装宿主细胞随后被称为抗性测试载体宿主细胞。依照本发明，指示基因通过遗传操作成为非功能性的。1、改序的启动子
在一个实施方案中，由于启动子的位置，指示基因被变成非功能性的，因为，尽管启动子与指示基因的转录方向相同，它却是在指示基因编码序列之后而不是之前。这个错放的启动子被称为“改序的启动子”。除了改序的启动子，非功能性指示基因的方向与病毒载体的天然或者外源启动子/增强子的方向相反。因此，非功能性指示基因的编码序列既不能被改序的启动子转录，也不能被病毒启动子转录。通过一个或者多个病毒蛋白的作用，非功能性指示基因及其改序的启动子被变成功能性的。在HIV的情况下，带有改序的启动子的非功能性指示基因的一个实例，将T7噬菌体RNA聚合酶启动子(在这里称为T7启动子)以与指示基因相同的转录方向放置到5’LTR。因为指示基因盒被放置在T7启动子的上游，所以该指示基因不能被该T7启动子转录。通过从5’LTR到3’LTR进行拷贝，由于T7启动子相对于指示基因编码区的复位，因此在靶细胞感染的时候，逆转录酶将抗性测试载体中的非功能性指示基因转换为功能性指示基因。在由HIV整合酶将被修复的指示基因整合到靶细胞染色体以后，靶细胞表达的核T7 RNA聚合酶转录指示基因。在HBV的情况下，带有改序的启动子的非功能性指示基因的一个实例，将增强子—启动子区域放置到指示基因的下游或者3’，两者全都具有相同的转录方向。指示基因不能被增强子—启动子转录，因为指示基因盒被放置在上游。通过将相对于指示基因编码区域的增强子—启动子上游复位，抗性测试载体中的非功能性指示基因通过HBV指示基因病毒载体的反转录和环化被转变成功能性指示基因。
改序的启动子可以是任何真核的或者原核的启动子，它们可以在靶宿主细胞中被转录。优选地，启动子将是小体积的启动子，这样可以使其插入病毒基因组而不干扰病毒复制。更优选地，使用这样的启动子，该启动子体积小，而且能够被引入到靶宿主细胞中的单个亚基的RNA聚合酶所转录，例如细菌噬菌体启动子。这些细菌噬菌体启动子及其同源的RNA聚合酶的实例包括那些噬菌体T7，T3，和Sp6。核定位序列(NLS)可以被粘附到RNA聚合酶上以使RNA聚合酶定位到核来表达，在核中可能需要它们来转录被修复的指示基因。这种NLS可以从任何核转录的蛋白例如SV40 T抗原中获得。如果使用噬菌体RNA聚合酶，内部核糖体进入位点(IRES)例如EMC病毒5’未翻译区(UTR)可以被加入到指示基因的前面，用于翻译通常未被加帽的转录物。在HIV的情况下，只要LTR功能不被干扰，改序的启动子本身可以被引入到5’LTR中的任何位置，优选被引入到LTR的U5和R部分中，最优选被引入到U5和R的功能上重要的区域和高度保守的区域以外，所述的5’LTR在反转录的过程中被拷贝成3’LTR。在HBV的情况下，只要改序的启动子不干扰对于HBV DNA复制必需的顺式作用元件，改序的启动子可以被放置到任何位置。如果存在由转染的假象(DNA连锁)引起的非功能性指示基因的不适当表达，封闭序列可以被加到抗性测试载体的末端。在上面给出的改序的T7启动子的HIV实例中，这种封闭序列可以由T7转录终止子组成，其被安置在适当的位置来阻断来自DNA连锁的通读转录，而不会阻断由改序的T7启动子的复位(在反转录过程中从5’LTR到3’LTR)引起的转录。2、改序的编码区
在第二个实施方案中，由于指示基因5’和3’编码区的相对位置，指示基因被变成非功能性的，因为，3’编码区在5’编码区之前而不是之后。这个错放的编码区被称为“改序的编码区”。由于编码功能性指示基因的mRNA如果将会在每个方向被产生，因此非功能性指示基因的方向可与病毒载体的天然或者外源启动子/增强子的方向相同或者相反。通过一个或者多个源自患者的片段产物的作用，非功能性指示基因及其改序的编码区被变成功能性的。在HIV的情况下，带有改序的编码区的非功能性指示基因的第二个实例，将带有相关启动子的5’指示基因编码区放置在3’LTR U3区域，和将3’指示基因编码区域放置在HIV基因组上游位置，每个编码区域具有与病毒LTRs相同的转录方向。在两个实例中，5’和3’编码区还可以分别具有相关的剪接供体和受体序列，它们可以是异源的或者是人工的剪接信号。指示基因既不能被相关的启动子也不能被病毒启动子功能性地转录，因为改序的编码区防止了功能性剪接的转录物的形成。通过将3’LTR拷贝成5’LTR，由于相对于彼此的5’和3’指示基因编码区的复位，因此在靶细胞感染的时候，逆转录酶将抗性测试载体中的非功能性指示基因转换为功能性指示基因。在被与5’编码区域相关的启动子转录以后，RNA剪接可以连接5’和3’编码区以产生一个功能性指示基因产物。在HBV的情况下，带有改序的编码区的非功能性指示基因的一个实例，放置了一个3’指示基因编码区域在上游或者放置了增强子—启动子的5’和指示基因的5’编码区。指示基因5’和3’编码区的转录方向相互之间是相同的，而且与指示基因病毒载体的转录方向相同。但是，由于指示基因的5’和3’编码区在抗性测试载体中被改序(即：5’编码区在3’编码区的下游)，没有能被剪接以产生功能性指示基因编码区的mRNA被转录。在指示基因病毒载体反转录和环化以后，指示基因3’编码区被放置到增强子—启动子和5’编码区的下游或者3’，从而允许这种mRNA转录，此mRNA可以被剪接以产生功能性指示基因编码区。3、反向内含子
在第三个实施方案中，通过使用“反向内含子”使指示基因成为非功能性的，“反向内含子”即一种被插入到指示基因编码序列中的内含子，其转录方向与指示基因的转录方向相反。包含其本身，被连接的启动子的指示基因盒，其总的转录方向与病毒控制元件的方向相反，而人工内含子的方向与病毒控制元件的方向相同。通过其本身连接的启动子进行的指示基因的转录，不会导致功能性转录物的产生，因为反向内含子不会在这个方向上被剪接。尽管由于所得到的转录物具有反义方向，指示基因仍然不会被功能性地表达，但是由病毒控制元件进行的指示基因的转录，确实通过RNA剪接引起该反向内含子的去除。在这个转录产物的反转录和所得到的反转录病毒DNA的整合，或者嗜肝DNA病毒DNA的环化以后，由于先前已经去除了反向内含子，使用其本身连接的启动子，指示基因可以被功能性地转录。在这种情况下，指示基因本身可以含有它自己的功能性启动子，整个转录单元的定向与病毒控制元件相反。因此，非功能性指示基因处于被病毒控制元件转录的错误方向，而且它不能被其本身的启动子功能性地转录，这是因为反向内含子不能通过剪接被正确地切除。但是，在反转录病毒，而且具体为HIV的情况下，和嗜肝DNA病毒而且具体为HBV的情况下，病毒启动子(HIV LTR或者HBV增强子—启动子)的转录导致通过剪接而去除反向内含子。作为所得到的剪接转录产物的反转录和将所得到的前病毒整合到宿主细胞染色体中，或者HBV载体的环化的结果，指示基因此刻可以被其本身的启动子功能性地转录。由剪接供体和受体位点组成以去除内含子的反向内含子，优选位于指示基因的编码区以干扰指示基因的翻译。剪接供体和受体可以是任何剪接供体和受体。优选的剪接供体受体是CMV IE剪接供体和人α珠蛋白基因第二外显子的剪接受体(“内含子A”)。指示基因病毒载体—构建体
这里用到的“指示基因病毒载体”指的是含有指示基因及其控制元件和一种或者多种病毒基因的载体。指示基因病毒载体由一个指示基因盒和一个下面定义的“病毒载体”组装。指示基因病毒载体还额外地包含增强子，剪接信号，聚腺苷酸化序列，转录终止子，或者其它调控序列。另外，指示基因病毒载体可以是功能性的或者非功能性的。如果作为抗病毒药物靶子的病毒片段，没有被包含在指示基因病毒载体中，它们将在第二载体中被提供。“指示基因盒”包含指示基因和控制元件。“病毒载体”指的是含有部分或者全部下述物质的载体：编码基因产物的病毒基因，控制序列，病毒包装序列，和在反转录病毒的情况下的整合序列。该病毒载体可另外包含一个或者多个病毒片段，这些片段中的一个或者多个可能是抗病毒药物的靶子。含有病毒基因的病毒载体的两个实例在此指的是“基因组病毒载体”和“亚基因组病毒载体”。“基因组病毒载体”是这样的载体，其可能含有一个或者多个病毒基因缺失而使得病毒无能力复制，但是其却另外保留了完整病毒的mRNA的表达和加工特性。在HIV药物敏感性和抗性试验的一个实施方案中，基因组病毒载体包含HIV gag-pol，vif，vpr，tat，rev，vpu，和nef基因(一些、大多数或者所有的env可以被去除)。“亚基因组病毒载体”指的是含有一种或者多种病毒基因的编码区的载体，这些基因可以编码作为抗病毒药物的靶子的蛋白。在HIV的情况下，优选的实施方案是包含的HIV gag-pol基因的亚基因组病毒载体。在HBV的情况下，优选的实施方案是含有HBV P基因的亚基因组病毒载体。在HIV的情况下，用于病毒载体构建体的前病毒克隆的两个实例是：HXB2(Fisher等.，(1986)Nature，320，367-371)和NL4-3，(Adachi等.，(1986)J.Virol.，59，284-291)。在HBV的情况下，大量的全长基因组序列已经被表征而且可以用于HBV病毒载体的构建：GenBank序列号.M54923，M38636，J02203和X59795。病毒编码基因可以处于天然增强子/启动子或者外源病毒的或细胞的增强子/启动子的控制之下。对于HIV药物敏感性和抗性测试的一个优选实施方案，是将基因组或者亚基因组病毒编码区域置于HIV-LTR U3区域的天然增强子/启动子或者CMV早早期(IE)增强子/启动子的控制之下。HBV药物敏感性和抗性测试的一个优选实施方案，是将基因组或者亚基因组病毒编码区域置于CMV即早(IE)增强子/启动子的控制之下。在这种指示基因病毒载体的情况下，该载体含有作为靶子的一种或者多种病毒基因或者作为抗病毒药物的靶子的编码蛋白，那么所述的载体含有患者序列受体位点。源自患者的片段被插入到指示基因病毒载体的患者序列受体位点中，此载体随后被称为上述的抗性测试载体。
“患者序列受体位点”是载体中用于源自患者的片段插入的位点，这些位点可以是：1)由定向诱变引入到载体的独特的限制酶切位点；2)在载体中天然存在的独特的限制酶切位点；或者3)选择的位点，可以使用备选的克隆方法(例如UDG克隆)将源自患者的片段插入到这些位点中。在一个实施方案中，患者序列受体位点被引入到指示基因病毒载体中。患者序列受体位点优选位于病毒蛋白编码区中或者在病毒蛋白编码区附近，该病毒蛋白是抗病毒药物作用的靶子。优选对用于引入患者序列受体位点的病毒序列进行选择，以使得在该位置发现的氨基酸编码序列中没有变化或者发生保守的变化。优选地，患者序列受体位点位于病毒基因组的相对保守的区域以便利源自患者的片段的引入。或者，患者序列受体位点位于功能上重要的基因或者调控序列之间。患者序列受体位点可以位于病毒基因组区域中或者其附近，这些区域相对地保守以允许通过引物的引发，所述的引物用于将相应的限制酶切位点引入到源自患者的片段。为了进一步提高源自患者的片段的表达，这些引物可以被设计为简并库(degenerate pools)来接纳病毒序列的异质性，或者可以结合具有复合碱基配对能力的残基例如脱氧次黄苷(I)。具有患者序列受体位点的抗性测试载体组可以被一起用于药物抗性和敏感性测试以提供源自患者的片段的表达，并且将因此在任一个独自的抗性测试载体中不能被充分表达，所述的患者序列受体位点定义相同或者重叠的限制酶切位点间隔，所述的源自患者的片段含有与特定患者序列受体位点相同的内部限制酶切位点。宿主细胞
抗性测试载体被引入宿主细胞。合适的宿主细胞是哺乳动物细胞。优选的宿主细胞衍生于人类组织和细胞，它们是病毒感染的主要的靶子。在HIV的情况下，这些包括人类细胞例如人T细胞，单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞，朗格汉斯细胞，造血干细胞或者前体细胞，和其它细胞。在HBV的情况下，合适的宿主细胞包括肝细胞瘤细胞系(HepG2，Huh7)，初级人类肝细胞，可以被假型HBV感染的哺乳动物细胞，和其它细胞。人源宿主细胞将会确保：抗病毒药物会有效地进入细胞并且被细胞酶机制转换成为抗病毒抑制剂的代谢相关类型。宿主细胞在此被称为“包装宿主细胞”，“抗性测试载体宿主细胞”或者“靶宿主细胞”。“包装宿主细胞”指的是这样的宿主细胞，它们提供此处用到的、复制缺陷病毒载体如抗性测试载体所需要的反式作用因子和病毒包装蛋白，以产生抗性测试载体病毒颗粒。可以通过包含在抗性测试载体本身、包装表达载体、或者两者内的病毒基因的表达，来提供包装蛋白。包装宿主细胞是这样的宿主细胞，该细胞被一种或者多种包装表达载体转染，并且当被抗性测试载体转染的时候，那么其在此被称为“抗性测试载体宿主细胞”而且有时被称为包装宿主细胞/抗性测试载体宿主细胞。对于HIV，优选用作包装宿主细胞的宿主细胞包括293人胚肾细胞(293，Graham，F.L等.，J.Gen Virol.36：59，1977)，BOSC23(Pear等.，Proc.Natl.Acad.Sci.90，8392，1993)，tsa54和tsa201细胞系(Heinzel等.，J.Virol.62，3738，1988)，对于HBV HepG2(Galle和Theilmann，L.Arzheim.-ForschyDrug Res.(1990)40，1380-1382).(Huh，Ueda，K等.Virology*1989)169，213-216)。“靶宿主细胞”指的是被抗性测试载体病毒颗粒感染的细胞，这些颗粒由在其中发生了指示基因的表达或者抑制的抗性测试载体宿主细胞产生。被用作靶宿主细胞的优选宿主细胞包括人T细胞白血病细胞系包括Jurkat(ATCC TIB-152)，H9(ATCC HTB-176)，CEM(ATCC CCL-119)，HUT78(ATCC T1B-161)，及其衍生物。
本发明在随后的实验细节部分被描述。阐述这些部分的目的是为了帮助理解本发明，而不是意图和不能理解为以任何方式限制了如在其后的权利要求所陈述的本发明。实验详述
                     实施例1
     使用抗性测试载体的表型药物敏感性和抗性测试
使用描述在于1997年1月29日提交的、PCT国际申请号PCT/US97/01609的方式和方法来执行表型药物敏感性和抗性测试，此申请在此加入作为参考。
在这些实验中，相应于HIV蛋白酶(PR)和逆转录酶编码区域的源自患者的片段(PDS)，或者是使用从存在于HIV感染个体血清中的病毒颗粒分离出的病毒RNA通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增的源自患者的片段，或者是由抗性测试载体DNA亲本克隆的定向诱变产生的野生型HIV-1的突变型。使用标准的程序来进行病毒RNA的分离(例如RNAgents总RNA分离系统，普洛麦格，Madison WI或者RNAzol，Tel-Test，Friendswood，TX)。RT-PCR方法被分为两步。反转录病毒逆转录酶[例如Moloney MuLV逆转录酶(罗氏分子系统，有限公司(Roche Molecular Systems，Inc.，)Branchburg，新泽西)，或者禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶，(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)]被用来将病毒RNA转录成cDNA。而后进行的cDNA扩增使用耐热DNA聚合酶[例如Taq(罗氏分子系统，有限公司.，Branchburg，NJ)，Tth(罗氏分子系统，有限公司.，Branchburg，新泽西)，PrimeZyme(分离自Thermus brockianus，Biometra，Gottingen，德国)]或者如为执行“长PCR”所描述的耐热聚合酶的组合(Bames，W.M.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci，美国91，2216-2220)[例如.扩展高保真PCR系统(Taq+Pwo)，(Boehringer Mannheim.Indianapolis，印度)或者GeneAmp XL PCR试剂盒(Tth+Vent)，(罗氏分子系统，有限公司.，Branchburg，新泽西)]。
引物，ApaI引物(PDSApa)和AgeI引物(PDSAge)，被用来扩增包含“测试”源自患者的片段的序列，导致ApaI和AgeI识别位点被引入PCR产物的5′和3′末端，其分别被描述在于1997年1月29日提交的PCT国际申请号PCT/US97/01609中。
结合“测试”源自患者的片段的抗性测试载体的构建描述在于1997年1月29日提交的PCT国际申请号PCT/US97/01609中，使用1.5kB的扩增DNA产物，其由使用病毒RNA作为模板、寡核苷酸PDSApa(1)和PDSAge(2)作为引物的RT-PCR，而后用ApaI和AgeI)或者同切点酶PINAI.)进行消化来制备。为了保证相应于所得到的抗性测试载体的质粒DNA含有出现在特定患者血清内的HIV病毒准种类的代表性样品，许多(＞100)在特定抗性测试载体构建中获得的单独的E.coli转化突变型被库化并且用于质粒DNA的制备。
编码兼嗜性MuLV 4070A env基因产物的包装表达载体，能够在抗性测试宿主细胞中生产抗性测试载体病毒颗粒，该病毒颗粒可以有效地感染人类靶细胞。编码除env之外所有HIV基因的抗性测试载体被用于转染包装宿主细胞(一旦转染，宿主细胞被称为抗性测试载体宿主细胞)。编码兼嗜性MuLV 4070A env基因产物的包装表达载体与抗性测试载体一起使用，以能够在抗性测试载体宿主细胞中生产有感染性的假型抗性测试载体病毒颗粒。
使用包装宿主和靶宿主细胞来实施使用抗性测试载体的抗性测试，所述的细胞由人胚肾细胞系293(细胞培养机构(Cell Culture Facility)，UC旧金山，SF，CA)或者Jurkat白血病T细胞系(Arthur Weiss，UC旧金山，SF，CA)组成。
使用两种宿主细胞类型来实施使用抗性测试载体的抗性测试。抗性测试载体病毒颗粒由第一宿主细胞(抗性测试载体宿主细胞)生产，该细胞通过使用抗性测试载体和包装表达载体转染包装宿主细胞而产生。而后将抗性测试载体病毒颗粒用于感染第二宿主细胞(靶宿主细胞)，在第二宿主细胞中测量指示基因的表达。
构建含有功能性萤光素酶基因盒的抗性测试载体，并且用抗性测试载体DNA转染宿主细胞。该抗性测试载体含有源自患者的逆转录酶和蛋白酶序列，这些序列或者对抗反转录病毒制剂敏感性或者对其有抗性，这些制剂例如核苷逆转录酶抑制剂，(NRTIs)非核苷逆转录酶抑制剂(NRTIs)和蛋白酶抑制剂。通过将抗性测试载体DNA转染到宿主细胞中产生的抗性测试载体病毒颗粒在存在或者不存在PRIs的情况下被用于感染靶宿主细胞，这些靶宿主细胞或者在没有NRTIs或NNRTIs的情况下，或者在存在增加药物浓度的情况下生长。在存在各不相同的药物浓度情况下，将在被感染靶宿主细胞中产生的萤光素酶活性的量与在不存在药物的情况下，在被感染靶宿主细胞中产生的萤光素酶活性的量相比较。“抗药性”被测量为：将在不存在药物时检测到的抑制约50％萤光素酶活性(抑制浓度50％，IC50)所需的药物量。通过绘制药物抑制百分比：log10药物浓度曲线来确定IC50值。病毒复制的刺激作用被测量为：当感染发生时，与没有药物存在时相比较，在药物存在时检测到的萤光酶素活性的百分比增加。
将宿主细胞接种于10厘米直径的培养皿内，在接种抗性测试载体质粒DNA和包膜表达载体后，转染数天。使用磷酸钙沉淀程序来进行转染。在转染后1-24小时，用新鲜培养基替换含有DNA沉淀物的细胞培养基。在转染后1-4小时，收获含有抗性测试载体病毒颗粒的细胞培养基并且在将其用于感染靶宿主细胞或者储存于-80℃之前，使其通过0.45mm的滤器。在所收获的细胞培养基中，HIV衣壳蛋白(p24)水平用由生产商描述的EIA方法确定(SAIC；Frederick，MD)。在感染前，将靶细胞(293和293/T)接种在细胞培养基上。使用来自摹拟转染(无DNA)或者含有没有包膜表达质粒的抗性测试载体质粒DNA的转染的细胞培养基来进行对照感染。在感染1-3天或者更多天以后，移去培养基并且在每个孔中加入细胞裂解缓冲液(普洛麦格)。分析细胞裂解物的萤光素酶活性(图3)。使用下面的方程式来确定药物的抑制作用：％萤光素酶抑制＝1-(RLUluc[药物]-RLUluc)×100其中RLUluc[药物]是在存在药物的时候，感染细胞中萤光素酶活性的相对光单位，RLUluc是在不存在药物的时候，感染细胞中萤光素酶活性的相对光单位。通过绘制萤光素酶活性的抑制百分比：log10药物浓度曲线，从由数据生成的S形曲线中得到IC50值。在图3中显示了药物抑制曲线。萤光素酶刺激百分比是使用上面的公式计算的％抑制的负数。显示病毒复制的药物依赖性刺激的曲线显示在图4中。
                       实施例2
              相关表型敏感性和基因型分析患者HIV样品的表型敏感性分析
如实施例1所述构建抗性测试载体。在表型分析中测试抗性测试载体或者衍生于抗性测试载体库中的克隆，以准确地和定量地确定对一组抗反转录病毒药物的敏感性水平。这组抗反转录病毒药物可以含有被通称为核苷逆转录酶抑制剂(NRTIs)，非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)，和蛋白酶抑制剂(PRIs)的种类中的成员。该组药物可以扩展到可以利用的新药物或者新药物靶子。对每种测试药物的每个抗性测试载体库确定IC50。检查对所有测试药物的敏感性模式并且与已知的敏感性模式作比较。药物对病毒复制的影响(即萤光素酶活性)被进一步分析以找寻病毒复制的药物依赖性刺激的任何证据，其将会在药物敏感性图表中作为负百分比抑制出现。可以进一步检查患者样品以找寻与观察到的敏感性模式相关的基因型变化。患者HIV样品的基因型分析
用本领域普通技术人员已知的任何基因型方法，来分析抗性测试载体DNAs库或者克隆(见PCT国际申请号PCT/US97/01609，于1997年1月29日提交)。在本发明的一个实施方案中，使用病毒RNA纯化、RT/PCR和ABI链终止子自动测序来确定患者HIV样品序列。将被确定的序列与存在于数据库中的对照序列相比较，或者，如果可能的话，与来自治疗起始前患者的样品作比较。检查基因型的这样的序列，这些序列与对照或者预治疗的序列不同并且与观察到的表型相关。定向位点突变型的表型敏感性分析
通过在定义的野生型(药物敏感的)遗传背景上构建含有特定突变的抗性测试载体，对这样的基因型变化进行评价，这些基因型变化被发现与在药物敏感性的表型模式中的变化相关。突变可以被单独整合和/或与其它已知的药物抗性突变结合整合，这些已知的药物抗性突变被认为调节了HIV对某些药物或者药物种类的敏感性。突变可以通过任何广泛已知的定向诱变方法被引入到抗性测试载体中。在本发明的一个实施方案中，使用用于定向诱变的mega-引物PCR方法(Sarkar G，Sommer SS.(1990).生物技术(Biotechniques)8：404-407)。随后，使用上述的表型敏感性分析来测试含有特定突变或者突变群的抗性测试载体，将其敏感性分布与遗传上定义的野生型(药物敏感的)抗性测试载体的敏感性分布相比较，所述的野生型抗性测试载体缺少特定的突变。在对测试的抗反转录病毒药物的表型敏感性模式中观察到的变化，归因于引入到抗性测试载体中的特定突变。
                      实施例3
在HIV中，使用抗性测试载体和定向位点突变型来将基因型和相关表型与NNRTI药物敏感性和抗性，和复制的药物依赖性刺激联系在一
                  起：M230L+Y181C抗性测试载体的制备和患者ARG-014HIV样品的表型分析
如实施例1中所述的方法从病毒样品中构建抗性测试载体，所述病毒样品来自于个体患者，在超过16周的时间间隔分三个时间点取样。此患者曾经接受过两种NRTIs(双脱氧腺苷和拉米夫定(lamivudine))和一种PRI印第那韦(indinavir)的治疗。在获得第一个样品(指定为98-773)的时候，患者开始采用一种新的抗病毒治疗方案，包括：NRTI(阿巴卡韦(abacavir))，NNRTI(奈韦拉平)和两种PRI′s(那非那韦和沙奎那韦)(PRIs)。第二个样品(98-1046)在8周后获得，第三个样品(98-887)在16周后获得。病毒负荷测量显示：该患者经历了短暂的病毒负荷降低(在第4周)，随后在第8周和第16周回到基线病毒负荷(约60,000拷贝/m1)。病毒RNA分离和RT/PCR被用于产生源自患者的片段(PDSs)，这些片段含有编码所有PR和RT的氨基酸1-313的病毒序列。
PDS被插入到指示基因病毒载体中以产生被称为RTV-773，RTV-1046和RTV-887的抗性测试载体。随后在一个表型分析中测试这些RTVs以准确地和定量地确定对一组抗反转录病毒药物的敏感性水平。这组抗反转录病毒药物含有被通称为NRTIs(齐多夫定，拉米夫定，斯塔夫定，双脱氧腺苷，扎西他宾，和阿巴卡韦)，NNRTIs(地拉夫定，efavirenz和奈韦拉平)，和PRIs(安泼那韦，印第那韦，那非那韦，利托那韦，和沙奎那韦)的成员。对每种测试药物的每个抗性测试载体库确定IC50。检查对所有测试药物的敏感性模式并且与已知的敏感性模式作比较。观察患者样品RTV-1046和RTV-887对NNRTIs的敏感性模式，其中efavirenz敏感性有中度降低(5-倍)，奈韦拉平(＞600-倍)和地拉夫定(＞250-倍)敏感性有明显降低患者HIV样品基因型的确定
通过ABI链终止子自动测序分析RTV-773，RTV-1046和RTV-887DNA。将该核苷酸序列与野生型分化体B HIV-1(HIV序列数据库LosAlamos，NM)的共有序列进行比较。检查基因型以找寻与对照序列不同的序列。在RTV-773(基线样品)中，与对照序列相比较，在HIV RE密码子41，74，184，210，211，215，228，和296发现突变。突变M41L，L74I，M184V，L210W和T215Y与NRTI抗性相关。突变R211K和T296S是已知的、在HIV不同野生型(药物敏感的)变异体中发现的序列多态性。在RTV-1046和RTV-887中，两个额外的突变出现在181和230。以前已经显示：突变Y181C与对NNRTIs奈韦拉平和地拉夫定的抗性相关，但是与对efavirenz的抗性无关。通过使用定点诱变和体外表型敏感性测试来将观察到的基因型变化与表形变化联系在一起，我们检查了单独的突变M230L并且检查了结合有Y181C的M230L突变。在HIV中，定向诱变被用来确证在对抗反转录病毒药物的表型敏感性中特定突变的作用
通过使用用于定向诱变的mega-引物法(Sakar和Sommar，Ibid.)，M230L突变被引入到野生型(药物敏感的)抗性测试载体中。随后使用早先描述的表型分析，对所得到的含有M230L突变的抗性测试载体(M230L-RTV)进行测试，将结果与那些使用遗传上定义的即野生型的抗性测试载体所确定的结果在位点230作比较。我们确定了在M230L-RTV中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。在野生型背景(即只有M230L突变)中，与野生型对照RTV相比，M230L-RTV显示了对efavirenz(23倍)，奈韦拉平(39倍)和地拉夫定(58倍)的中度敏感性丧失。M230L-RTV显示了病毒复制的药物依赖性刺激：地拉夫定(约50％)和奈韦拉平(约50％)，而efavirenz则没有。构建含有M230L突变和Y181C突变(Y181C/M230L-RTV)的抗性测试载体，并且使用前述的表型分析进行测试，将结果与那些使用遗传上定义的即野生型的抗性测试载体所确定的结果在位点181和230作比较。我们确定了在Y181C/M230L-RTV中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，Y181C/M230L-RTV显示了对efavirenz(25倍)的中度敏感性降低，对奈韦拉平(＞600倍)和地拉夫定(＞250倍)的敏感性高水平降低。Y181C/M230L-RTV在任何NNRTIs存在的情况下均没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激。
                      实施例4
在HIV中，使用抗性测试载体和定向位点突变型来将基因型和相关表型与NNRTI药物敏感性和抗性和复制的药物依赖性刺激联系在一起：
                    M230L+K103N抗性测试载体的制备和患者CCTG-2165 HIV样品的表型分析
如实施例1中所述的方法从病毒样品中构建抗性测试载体，所述病毒样品来自于个体患者，在超过15周的时间间隔分二个时间点取样。此患者曾经接受过两种NRTIs(斯塔夫定，laminvudine和一种PRI那非那韦)的治疗。在获得第一个样品(指定为99-2-009089)的时候，患者开始采用一种新的抗病毒治疗方案，包括：两种NRI’s(齐多夫定，拉米夫定和一种NNRTI)。第二个样品(99-2-009839)在病毒负荷无法检测到的4周获得，后来，第三个样品(99-2-010835)在基线后15周获得。在第二(第4周)和第三(第15周)次就诊之间应注意到有一个短暂的治疗停止。病毒负荷测量显示：该患者经历了短暂的病毒负荷降低(在第4周)，随后在第15周回到基线病毒负荷(约2,000拷贝/ml)。病毒RNA分离和RT/PCR被用于产生源自患者的片段(PDSs)，这些片段含有编码来自基线和第15周样品的所有的PR和RT的氨基酸1-313的病毒序列。PDS被插入到指示基因病毒载体中以产生被称为RTV-009089和RTV-010835抗性测试载体。随后在一个表型分析中测试这些RTVs以准确地和定量地确定对一组抗反转录病毒药物的敏感性水平。这组抗反转录病毒药物含有被通称为NRTIs(齐多夫定，拉米夫定，斯塔夫定，双脱氧腺苷，扎西他宾，和阿巴卡韦)，NNRTIs(地拉夫定，efavirenz和奈韦拉平)，和PRIs(安泼那韦，印第那韦，那非那韦，利托那韦，和沙奎那韦)的成员。对每种测试药物的每个抗性测试载体库确定IC50。检查对所有测试药物的敏感性模式并且与已知的敏感性模式作比较。观察患者样品RTV-010835对NNRTIs的敏感性模式，其中对efavirenz(270倍)，奈韦拉平(＞600倍)和地拉夫定(＞250倍)的敏感性有明显降低。患者HIV样品基因型的确定
通过ABI链终止子自动测序分析RTV-009089和RTV-010835DNA。将该核苷酸序列与野生型分化体B HIV-1(HIV序列数据库LosAlamos，NM)的共有序列进行比较。检查基因型以找寻与对照序列不同的序列。在RTV-009089中，与对照序列相比较，在位点49，102，122，169，178，184，195，200，211，245，250，275，276，277，286，和294发现突变。在RTV-010835中，在密码子103和230出现额外的突变。以前已经显示：突变K103N与对于NNRTIs奈韦拉平、地拉夫定和efavirenz的抗性相关。通过使用定点诱变和体外表型敏感性测试来将观察到的基因型变化与表形变化联系在一起，我们检查了单独的突变M230L并且检查了结合有K103N的M230L突变。在HIV中，定向诱变被用来确证在对抗反转录病毒药物的表型敏感性中特定突变的作用
单独测试M230L突变，并且被描述于上面的实施例3中。构建含有M230L突变和K103N突变的抗性测试载体(K103N/M230L-RTV)，并且使用前述的表型分析进行测试，将结果与那些使用遗传上定义的即野生型的抗性测试载体所确定的结果在位点103和230作比较。我们确定了在K103N/M230L-RTV中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，K103N/M230L-RTV显示了对奈韦拉平(＞600倍)、efavirenz(＞470倍)和地拉夫定(＞250倍)的敏感性高水平的降低。K103N/M230L-RTV还显示了病毒复制的明显的药物依赖性刺激：奈韦拉平(约70％)，efavirenz(约40％)和地拉夫定(约100％)。构建含有M230L，K103N和M184V突变的抗性测试载体(K103N/M230L/M184V-RTV)的抗性测试载体，并且使用前述的表型分析进行测试，将结果与那些使用遗传上定义的即野生型的抗性测试载体所确定的结果在位点103，184和230作比较。在K103N，M230L骨架上增加M184V突变，导致病毒复制的药物依赖性刺激的逆转。
                      实施例5
在HIV中，使用抗性测试载体将基因型和相关表型与NNRTI药物敏感性和抗性和复制的药物依赖性刺激联系在一起：M230L+K101E+
                     K103N+G190S抗性测试载体的制备和患者CCTG-1025 HIV样品的表型分析
如实施例1中所述的方法从病毒样品中构建抗性测试载体，所述病毒样品来自于个体患者，在超过48周的时间间隔分二个时间点取样。此患者曾经接受过四种NRTIs(齐多夫定，斯塔夫定，双脱氧腺苷，拉米夫定)，和一种PRI那非那韦的治疗。在获得第一个样品(指定为AA2919)的时候，患者开始采用一种新的抗病毒治疗方案，包括：两种NRTIs(斯塔夫定和阿巴卡韦)和一种PRI(印第那韦)。该患者体内的病毒负荷降低到检测不到的程度并且在检测不到的水平保持另外48周。在9周后，将Efavirenz加入到治疗方案中。第二个样品(00-2-012090)在研究开始后48周，病毒负荷增加到455的时候获得。病毒RNA分离和RT/PCR被用于产生源自患者的片段(PDS)，这些片段含有编码来自所有三种样品的所有的PR和RT的氨基酸1-313的病毒序列。PDS被插入到指示基因病毒载体中以产生被称为RTV-2919和RTV-012090抗性测试载体。随后在一个表型分析中测试这些RTVs以准确地和定量地确定对一组抗反转录病毒药物的敏感性水平。这组抗反转录病毒药物含有被通称为NRTIs(齐多夫定，拉米夫定，斯塔夫定，双脱氧腺苷，扎西他宾，和阿巴卡韦)，NNRTIs(地拉夫定，efavirenz和奈韦拉平)，和PRIs(安泼那韦，印第那韦，那非那韦，利托那韦，和沙奎那韦)的成员。对每种测试药物的每个抗性测试载体库确定IC50。检查对所有测试药物的敏感性模式并且与已知的敏感性模式作比较。观察患者RTV-012090对NNRTIs的敏感性模式，其中观察到对efavirenz(＞450倍)，奈韦拉平(＞600倍)和地拉夫定(＞144倍)的敏感性有明显降低，和病毒复制的明显的药物依赖性刺激：奈韦拉平(约80％)，地拉夫定(约30％)和efavirenz(约40％)。患者HIV样品基因型的确定
通过ABI链终止子自动测序分析RTV-2919和RTV-012090 DNA。将该核苷酸序列与野生型分化体B HIV-1(HIV序列数据库Los Alamos，NM)的共有序列进行比较。检查基因型以找寻与对照序列不同的序列。在RTV-2919中，与对照序列相比较，在HIV RT密码子67，86，102，118，122，158，162，174，177，211，214，215，272，275，276，277，278，281，286和293发现突变。在RTV-012090中，在密码子101、103、190和230出现额外的突变。以前已经显示：突变K101E，K103N和G190S与对于NNRTIs奈韦拉平、地拉夫定和efavirenz的抗性相关。在这个患者样品中，突变K101E，K103N，G190S和M230L响应于所有三种NNRTIs，与病毒复制的明显的药物依赖性刺激相关。
                      实施例6
在HIV中，使用抗性测试载体将基因型和相关表型与NNRTI药物敏感性和抗性和复制的药物依赖性刺激联系在一起：V241S+K103N+
                       I135T抗性测试载体的制备和患者011073HIV样品的表型分析
如实施例1中所述的方法从病毒样品中构建抗性测试载体，所述病毒样品来自于患者011073。以前的和目前的治疗方案是未知的。病毒RNA分离和RT/PCR被用于产生源自患者的片段(PDS)，这些片段含有编码所有的PR和RT的氨基酸1-313的病毒序列。PDS被插入到指示基因病毒载体中以产生被称为RTV-011073的抗性测试载体。随后在一个表型分析中测试该RTV-011073以准确地和定量地确定对一组抗反转录病毒药物的敏感性水平。这组抗反转录病毒药物含有被通称为NRTIs(齐多夫定，拉米夫定，斯塔夫定，双脱氧腺苷，扎西他宾，和阿巴卡韦)，NNRTIs(地拉夫定，efavirenz和奈韦拉平)，和PRIs(安泼那韦，印第那韦，那非那韦，利托那韦，和沙奎那韦)的成员。对每种测试药物的每个抗性测试载体库确定IC50。检查对所有测试药物的敏感性模式并且与已知的敏感性模式作比较。观察患者RTV-012090对NNRTIs的敏感性模式，其中观察到对efavirenz(＞450倍)，奈韦拉平(＞600倍)和地拉夫定(＞250倍)的敏感性有明显降低，和病毒复制的明显的药物依赖性刺激：奈韦拉平(约70％)，地拉夫定(约90％)和efavirenz(约80％)。患者HIV样品基因型的确定
通过ABI链终止子自动测序分析RTV-011073 DNA。将该核苷酸序列与野生型分化体B HIV-1(HIV序列数据库Los Alamos，NM)的共有序列进行比较。检查基因型以找寻与对照序列不同的序列。在RTV-011073中，与对照序列相比较，在HIV RT密码子20，67，69，70，102，103，118，I135T，162，211，214，218，219，241和277发现突变。在HIV中，定向诱变被用来确证在对抗反转录病毒药物的表型敏感性中特定突变的作用
构建除了V241S和T277K之外，含有所有出现在RTV-011073中的突变的抗性测试载体，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用亲本RTV-011073所确定的结果作比较。我们确定了在回复载体(reverted vector)RTV-011073/241V/277T中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-011073/241V/277T显示了对奈韦拉平(126倍)、efavirenz(54倍)和地拉夫定(50倍)的敏感性的高水平降低。RTV-011073/241V/277T没有显示出对任何测试NNRTI的病毒复制的药物依赖性刺激。构建含有除了V241S之外，所有出现在RTV-011073中的突变的抗性测试载体，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用亲本RTV-011073所确定的结果作比较。我们确定了在回复载体RTV-011073/241V中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-011073/241V显示了对奈韦拉平(146倍)、efavirenz(54倍)和地拉夫定(59倍)的敏感性的高水平降低。在存在任何测试的NNRTI的情况下，RTV-011073/241V没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激。在这个患者样品中，在V241S的突变对与病毒复制的药物依赖性刺激的相关性是非常显著的。构建在V241S含有单一突变的抗性测试载体(RTV-V241S)，并且在使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用野生型对照RTV所确定的结果作比较。我们确定了在RTV-V241S中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-V241S显示了对奈韦拉平(9倍)、efavirenz(3倍)和地拉夫定(6倍)的敏感性少量的降低。RTV-V241S显示了病毒复制的药物依赖性刺激：奈韦拉平(约30％)，地拉夫定(约25％)，但在efavirenz存在的情况下，却未显示病毒复制的药物依赖性刺激。
                      实施例7
在HIV中，使用抗性测试载体将基因型和相关表型与NNRTI药物敏感性和抗性和复制的药物依赖性刺激联系在一起：V241S+K101E
             +V106M+I135T+E138A+G190A抗性测试载体的制备和患者014451 HIV样品的表型分析
如实施例1中所述的方法从病毒样品中构建抗性测试载体，所述病毒样品来自于个体患者，在两个间隔为32周的两个时间点对患者取样。以前的和目前的治疗方案是未知的。病毒RNA分离和RT/PCR被用于产生源自患者的片段(PDS)，这些片段含有编码所有3种样品的所有的PR和RT的氨基酸1-313的病毒序列。PDS被插入到指示基因病毒载体中以产生被称为RTV-014459和RTV-014451的抗性测试载体。随后在一个表型分析中测试该这些RTVs以准确地和定量地确定对一组抗反转录病毒药物的敏感性水平。这组抗反转录病毒药物含有被通称为NRTIs(齐多夫定，拉米夫定，斯塔夫定，脱氧腺苷，扎西他宾，和阿巴卡韦)，NNRTIs(地拉夫定，efavirenz和奈韦拉平)，和PRIs(安泼那韦，印第那韦，那非那韦，利托那韦，和沙奎那韦)的成员。对每种测试药物的每个抗性测试载体库确定IC50。检查对所有测试药物的敏感性模式并且与已知的敏感性模式作比较。观察患者RTV-014451对NNRTIs的敏感性模式，其中观察到对efavirenz(＞450倍)，奈韦拉平(＞600倍)和地拉夫定(41倍)的敏感性有明显降低，和病毒复制的明显的药物依赖性刺激：奈韦拉平(约100％)，地拉夫定(约90％)和efavirenz(约70％)。患者HIV样品基因型的确定
通过ABI链终止子自动测序分析RTV-014459和RTV-014459DNA。将该核苷酸序列与野生型分化体B HIV-1(HIV序列数据库LosAlamos，NM)的共有序列进行比较。检查基因型以找寻与对照序列不同的序列。在RTV-14459中，与对照NL4-3序列相比较，在HIV RT的35I，41，49，83，102，123，135，138，174，177，178，184，215，241，257，261，277，286，293和297发现突变。在RTV-014451中，在密码子101、106和190出现额外的突变。以前已经显示：突变K101E，V106M和G190A与对于NNRTIs奈韦拉平、地拉夫定和efavirenz的抗性相关，但是与病毒复制的刺激无关。在这个患者样品中，在该病毒中的特定遗传骨架上，响应于所有三种NNRTIs，突变K101E，V106M，和G190A出现与病毒复制的明显的药物依赖性刺激相关。上述实施例6中的结果提示：突变V241I可能有助于在此病毒中见到的病毒复制的刺激作用。
                      实施例8
在HIV中，使用抗性测试载体将基因型和相关表型与NNRTI药物敏感性和抗性和复制的药物依赖性刺激联系在一起：V245E结合有多个
                      其它突变抗性测试载体的制备和患者005738HIV样品的表型分析
如实施例1中所述的方法从病毒样品中构建抗性测试载体，所述病毒样品来自于患者005738。以前的和目前的治疗方案是未知的。病毒RNA分离和RT/PCR被用于产生源自患者的片段(PDS)，这些片段含有编码来自全部2种样品的所有的PR和RT的氨基酸1-313的病毒序列。PDS被插入到指示基因病毒载体中以产生被称为RTV-005738的抗性测试载体。随后在一个表型分析中测试该RTV-005738以准确地和定量地确定对一组抗反转录病毒药物的敏感性水平。这组抗反转录病毒药物含有被通称为NRTIs(齐多夫定，拉米夫定，斯塔夫定，脱氧腺苷，扎西他宾，和阿巴卡韦)，NNRTIs(地拉夫定，efavirenz和奈韦拉平)，和PRIs(安泼那韦，印第那韦，那非那韦，利托那韦，和沙奎那韦)的成员。对每种测试药物的每个抗性测试载体库确定IC50。检查对所有测试药物的敏感性模式并且与已知的敏感性模式作比较。观察患者样品RTV-005738对NNRTIs的敏感性模式，其中观察到对efavirenz(17倍)，奈韦拉平(＞600倍)和地拉夫定(63倍)的敏感性有中度降低，和病毒复制的明显的药物依赖性刺激：奈韦拉平(约20％)，地拉夫定(约40％)和efavirenz(约20％)。患者HIV样品基因型的确定
通过ABI链终止子自动测序分析RTV-005738 DNA。将该核苷酸序列与野生型分化体B HIV-1(HIV序列数据库Los Alamos，NM)的共有序列进行比较。检查基因型以找寻与对照序列不同的序列。在RTV-005738中，与对照序列相比较，在D67N，K70R，R83K，A98G，Q102K，K122P，I135T，I142V，C162S，K173Q，I178L，Y181C，G196E，I202V，T215F，D218E，K219Q，V245E，A272P，R277K，V293I和E297Q位点发现突变。抗性测试载体的制备和患者007130HIV样品的表型分析
如实施例1中所述的方法从病毒样品中构建抗性测试载体，所述病毒样品来自于患者007130。以前的和目前的治疗方案是未知的。病毒RNA分离和RT/PCR被用于产生源自患者的片段(PDS)，这些片段含有编码所有的PR和RT的氨基酸1-313的病毒序列。PDS被插入到指示基因病毒载体中以产生被称为RTV-007130的抗性测试载体。随后在一个表型分析中测试该RTV-007130以准确地和定量地确定对一组抗反转录病毒药物的敏感性水平。这组抗反转录病毒药物含有被通称为NRTIs(齐多夫定，拉米夫定，斯塔夫定，脱氧腺苷，扎西他宾，和阿巴卡韦)，NNRTIs(地拉夫定，efavirenz和奈韦拉平)，和PRIs(安泼那韦，印第那韦，那非那韦，利托那韦，和沙奎那韦)的成员。对每种测试药物的抗性测试载体库确定IC50。检查对所有测试药物的敏感性模式并且与已知的敏感性模式作比较。观察患者RTV-007130对NNRTIs的敏感性模式，其中观察到对efavirenz(＞450倍)，奈韦拉平(＞600倍)和地拉夫定(＞250倍)的敏感性有显著降低，和病毒复制的明显的药物依赖性刺激：奈韦拉平(约50％)，地拉夫定(约30％)和efavirenz(约40％)。患者HIV样品基因型的确定
通过ABI链终止子自动测序分析RTV-007130 DNA。将该核苷酸序列与野生型分化体B HIV-1(HIV序列数据库Los Alamos，NM)的共有序列进行比较。检查基因型以找寻与对照序列不同的序列。在RTV-007130中，与对照序列相比较，在密码子67，101，102，103，122，135，162，174，184，190，208，221，245，272，277，283，293发现突变。
                     实施例9
在HIV中，使用抗性测试载体将基因型和相关表型与NNRTI药物敏感性和抗性和复制的药物依赖性刺激联系在一起：V245T结合有多个
                     其它突变抗性测试载体的制备和患者006782HIV样品的表型分析
如实施例1中所述的方法从病毒样品中构建抗性测试载体，所述病毒样品来自于患者006782。以前的和目前的治疗方案是未知的。病毒RNA分离和RT/PCR被用于产生源自患者的片段(PDS)，这些片段含有编码所有的PR和RT的氨基酸1-313的病毒序列。PDS被插入到指示基因病毒载体中以产生被称为RTV-006782的抗性测试载体。随后在一个表型分析中测试该RTV-006782以准确地和定量地确定对一组抗反转录病毒药物的敏感性水平。这组抗反转录病毒药物含有被通称为NRTIs(齐多夫定，拉米夫定，斯塔夫定，脱氧腺苷，扎西他宾，和阿巴卡韦)，NNRTIs(地拉夫定，efavirenz和奈韦拉平)，和PRIs(安泼那韦，印第那韦，那非那韦，利托那韦，和沙奎那韦)的成员。对每种测试药物的抗性测试载体库确定IC50。检查对所有测试药物的敏感性模式并且与已知的敏感性模式作比较。观察患者RTV-007130对NNRTIs的敏感性模式，其中观察到对efavirenz(5倍)，奈韦拉平(8倍)和地拉夫定(18.5倍)的敏感性有少量降低，和病毒复制的明显的药物依赖性刺激：奈韦拉平(约60％)，地拉夫定(约70％)和efavirenz(约25％)。患者HIV样品基因型的确定
通过ABI链终止子自动测序分析RTV-006782 DNA。将该核苷酸序列与野生型分化体B HIV-1(HIV序列数据库Los Alamos，NM)的共有序列进行比较。检查基因型以找寻与对照序列不同的序列。在RTV-006782中，与对照序列相比较，在HIV RT密码子Q102K，D123E，I135T，E138A，C162S，G196E，I202V，V245T，R277K，T286A，V293I，P294T和E297K发现突变。抗性测试载体的制备和患者012123HIV样品的表型分析
如实施例1中所述的方法从病毒样品中构建抗性测试载体，所述病毒样品来自于患者012123。以前的和目前的治疗方案是未知的。病毒RNA分离和RT/PCR被用于产生源自患者的片段(PDS)，这些片段含有编码所有的PR和RT的氨基酸1-313的病毒序列。PDS被插入到指示基因病毒载体中以产生被称为RTV-012123的抗性测试载体。随后在一个表型分析中测试该RTV-012123以准确地和定量地确定对一组抗反转录病毒药物的敏感性水平。这组抗反转录病毒药物含有被通称为NRTIs(齐多夫定，拉米夫定，斯塔夫定，脱氧腺苷，扎西他宾，和阿巴卡韦)，NNRTIs(地拉夫定，efavirenz和奈韦拉平)，和PRIs(安泼那韦，印第那韦，那非那韦，利托那韦，和沙奎那韦)的成员。对每种测试药物的抗性测试载体库确定IC50。检查对所有测试药物的敏感性模式并且与已知的敏感性模式作比较。观察患者RTV-012123对NNRTIs的敏感性模式，其中观察到对efavirenz(＞450倍)，奈韦拉平(＞600倍)和地拉夫定(＞250倍)的敏感性有显著降低，和病毒复制的明显的药物依赖性刺激：奈韦拉平(约20％)，地拉夫定(约80％)和efavirenz(约70％)。患者HIV样品基因型的确定
通过ABI链终止子自动测序分析RTV-012123 DNA。将该核苷酸序列与野生型分化体B HIV-1(HIV序列数据库Los Alamos，NM)的共有序列进行比较。检查基因型以找寻与对照序列不同的序列。在RTV-012123中，与对照序列相比较，在HIV RT密码子20，39，41，44，60，67，98，102，103，118，122，135，142，162，173，181，190，196，202，210，215，221，245，272，277，293和297发现突变。抗性测试载体的制备和患者014397HIV样品的表型分析
如实施例1中所述的方法从病毒样品中构建抗性测试载体，所述病毒样品来自于患者014397。以前的和目前的治疗方案是未知的。病毒RNA分离和RT/PCR被用于产生源自患者的片段(PDS)，这些片段含有编码所有的PR和RT的氨基酸1-313的病毒序列。PDS被插入到指示基因病毒载体中以产生被称为RTV-014397的抗性测试载体。随后在一个表型分析中测试该RTV-014397以准确地和定量地确定对一组抗反转录病毒药物的敏感性水平。这组抗反转录病毒药物含有被通称为NRTIs(齐多夫定，拉米夫定，斯塔夫定，脱氧腺苷，扎西他宾，和阿巴卡韦)，NNRTIs(地拉夫定，efavirenz和奈韦拉平)，和PRIs(安泼那韦，印第那韦，那非那韦，利托那韦，和沙奎那韦)的成员。对每种测试药物的抗性测试载体库确定IC50。检查对所有测试药物的敏感性模式并且与已知的敏感性模式作比较。观察患者RTV-014397对NNRTIs的敏感性模式，其中观察到对efavirenz(＞450倍)，奈韦拉平(＞600倍)和地拉夫定(＞250倍)的敏感性有显著降低，和病毒复制的明显的药物依赖性刺激：奈韦拉平(约100％)，地拉夫定(约100％)和efavirenz(约70％)。患者HIV样品基因型的确定
通过ABI链终止子自动测序分析RTV-014397 DNA。将该核苷酸序列与野生型分化体B HIV-1(HIV序列数据库Los Alamos，NM)的共有序列进行比较。检查基因型以找寻与对照序列不同的序列。在RTV-014397中，与对照序列相比较，在HIV RT密码子31，102，103，123，162，166，177，211，215，228，245，272和277发现突变。
                      实施例10
在HIV中，使用抗性测试载体将基因型和相关表型与NNRTI药物敏感性和抗性和复制的药物依赖性刺激联系在一起：V245M结合有多个
                      其它突变抗性测试载体的制备和患者013415HIV样品的表型分析
如实施例1中所述的方法从病毒样品中构建抗性测试载体，所述病毒样品来自于患者013415。以前的和目前的治疗方案是未知的。病毒RNA分离和RT/PCR被用于产生源自患者的片段(PDS)，这些片段含有编码所有的PR和RT的氨基酸1-313的病毒序列。PDS被插入到指示基因病毒载体中以产生被称为RTV-013415的抗性测试载体。随后在一个表型分析中测试该RTV-013415以准确地和定量地确定对一组抗反转录病毒药物的敏感性水平。这组抗反转录病毒药物含有被通称为NRTIs(齐多夫定，拉米夫定，斯塔夫定，脱氧腺苷，扎西他宾，和阿巴卡韦)，NNRTIs(地拉夫定，efavirenz和奈韦拉平)，和PRIs(安泼那韦，印第那韦，那非那韦，利托那韦，和沙奎那韦)的成员。对每种测试药物的抗性测试载体库确定IC50。检查对所有测试药物的敏感性模式并且与已知的敏感性模式作比较。观察患者RTV-013415对NNRTIs的敏感性模式，其中观察到对efavirenz(＞450倍)，奈韦拉平(＞600倍)和地拉夫定(＞250倍)的敏感性有显著降低，和病毒复制的明显的药物依赖性刺激：奈韦拉平(约20％)，地拉夫定(约30％)和efavirenz(约20％)。患者HIV样品基因型的确定
通过ABI链终止子自动测序分析RTV-013415 DNA。将该核苷酸序列与野生型分化体B HIV-1(HIV序列数据库Los Alamos，NM)的共有序列进行比较。检查基因型以找寻与对照序列不同的序列。在RTV-013415中，与对照序列相比较，在HIV RT密码子35，102，103，122，123，135，162，177，200，207，211，225，245，264，277和290发现突变。
                      实施例11
在HIV中，使用抗性测试载体将基因型和相关表型与NNRTI药物敏感性和抗性和复制的药物依赖性刺激联系在一起：K103N+V245E
                      +I270M抗性测试载体的制备和患者10829HIV样品的表型分析
如实施例1中所述的方法从病毒样品中构建抗性测试载体，所述病毒样品来自于患者10829。以前的和目前的治疗方案是未知的。病毒RNA分离和RT/PCR被用于产生源自患者的片段(PDS)，这些片段含有编码所有的PR和RT的氨基酸1-313的病毒序列。PDS被插入到指示基因病毒载体中以产生被称为RTV-010829的抗性测试载体。随后在一个表型分析中测试该RTV-010829以准确地和定量地确定对一组抗反转录病毒药物的敏感性水平。这组抗反转录病毒药物含有被通称为NRTIs(齐多夫定，拉米夫定，斯塔夫定，脱氧腺苷，扎西他宾，和阿巴卡韦)，NNRTIs(地拉夫定，efavirenz和奈韦拉平)，和PRIs(安泼那韦，印第那韦，那非那韦，利托那韦，和沙奎那韦)的成员。对每种测试药物的抗性测试载体库确定IC50。检查对所有测试药物的敏感性模式并且与已知的敏感性模式作比较。观察患者RTV-011073对NNRTIs的敏感性模式，其中观察到对efavirenz(＞450倍)，奈韦拉平(＞600倍)和地拉夫定(＞250倍)的敏感性有显著降低，和病毒复制的明显的药物依赖性刺激：奈韦拉平(约100％)，地拉夫定(约100％)和efavirenz(约80％)。患者HIV样品基因型的确定
通过ABI链终止子自动测序分析RTV-010829 DNA。将该核苷酸序列与野生型分化体B HIV-1(HIV序列数据库Los Alamos，NM)的共有序列进行比较。检查基因型以找寻与对照序列不同的序列。在RTV-010829中，与对照序列相比较，在HIV RT密码子31，35，90，102，103，122，162，196，211，214，215，228，245，270，276，277，292，293和297发现突变。在HIV中，定向回复诱变被用来确证在对抗反转录病毒药物的表型敏感性中特定突变的作用
构建除了V245E突变之外，含有所有出现在RTV-010829中的突变的抗性测试载体(RTV-010829/245V)，并且使用前述的表型分析进行测试，将结果与那些使用亲本RTV-010829所确定的结果作比较。我们确定了在回复载体RTV-010829/245V中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-010829/245V显示了对奈韦拉平(505倍)、efavirenz(189倍)和地拉夫定(182倍)的敏感性高水平的降低。RTV-010829/245V显示出病毒复制的药物依赖性刺激：奈韦拉平(约80％)，efavirenz(约60％)和地拉夫定(约60％)。构建含有除了I270M突变之外，所有出现在RTV-010829中的突变的抗性测试载体(RTV-010829/270I)，并且使用前述的表型分析进行测试，将结果与那些使用亲本RTV-010829所确定的结果作比较。我们确定了在回复载体RTV-010829/270I中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-010829/270I显示了对奈韦拉平(341倍)、efavirenz(145倍)和地拉夫定(247倍)的敏感性高水平的降低。RTV-010829/245V显示出病毒复制的药物依赖性刺激：奈韦拉平(约30％)，efavirenz(约20％)和地拉夫定(约40％)。构建含有除了V245E，I270M，V276I，R277K，V292I，V293I和E297K突变之外，所有出现在RTV-010829中的突变的抗性测试载体(RTV-010829/245V-297E)，并且使用前述的表型分析进行测试，将结果与那些使用亲本RTV-010829所确定的结果作比较。我们确定了在回复载体RTV-010829/245V-297E中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-010829/245V-297E显示了对奈韦拉平(233倍)、efavirenz(76倍)和地拉夫定(198倍)的敏感性高水平的降低。在存在奈韦拉平，efavirenz和地拉夫定的情况下，RTV-010829/245V-297E没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激。在这个患者样品中，病毒复制的药物依赖性刺激是由突变V245E和I270M的存在所调节的。病毒复制的药物依赖性刺激可以通过V245E，I270M，V276I，R277K，V292I，V293I和E297K突变的回复被完全取消。
                      实施例12
在HIV中，使用抗性测试载体将基因型和相关表型与NNRTI药物敏感性和抗性和复制的药物依赖性刺激联系在一起：K103N+I135T+
                       I270S抗性测试载体的制备和患者013522HIV样品的表型分析
如实施例1中所述的方法从病毒样品中构建抗性测试载体，所述病毒样品来自于患者013522。以前的和目前的治疗方案是未知的。病毒RNA分离和RT/PCR被用于产生源自患者的片段(PDS)，这些片段含有编码来自所有三种样品的所有的PR和RT的氨基酸1-313的病毒序列。PDS被插入到指示基因病毒载体中以产生被称为RTV-013522的抗性测试载体。随后在一个表型分析中测试该RTV-013522以准确地和定量地确定对一组抗反转录病毒药物的敏感性水平。这组抗反转录病毒药物含有被通称为NRTIs(齐多夫定，拉米夫定，斯塔夫定，脱氧腺苷，扎西他宾，和阿巴卡韦)，NNRTIs(地拉夫定，efavirenz和奈韦拉平)，和PRIs(安泼那韦，印第那韦，那非那韦，利托那韦，和沙奎那韦)的成员。对每种测试药物的每个抗性测试载体库确定IC50。检查对所有测试药物的敏感性模式并且与已知的敏感性模式作比较。观察患者RTV-013522对NNRTIs的敏感性模式，其中观察到对efavirenz(＞450倍)，奈韦拉平(＞600倍)和地拉夫定(＞250倍)的敏感性有显著降低，和病毒复制的明显的药物依赖性刺激：奈韦拉平(约90％)，地拉夫定(约110％)和efavirenz(约100％)。患者HIV样品基因型的确定
通过ABI链终止子自动测序分析RTV-013522 DNA。将该核苷酸序列与野生型分化体B HIV-1(HIV序列数据库Los Alamos，NM)的共有序列进行比较。检查基因型以找寻与对照序列不同的序列。在RTV-013522中，与对照序列相比较，在HIV RT密码子35，60，68，102，103，135，162，K166R，184，196，204，211，248，250，270，286，293和297发现突变。在HIV中，定向回复诱变被用来确证在对抗反转录病毒药物的表型敏感性中特定突变的作用
构建除了I270S突变之外，含有所有出现在RTV-010829中的突变的抗性测试载体(RTV-013522/270I)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用亲本RTV-013522所确定的结果作比较。我们确定了在回复载体RTV-013522/270I中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-013522/270I显示了对奈韦拉平(14倍)、efavirenz(8倍)的敏感性中度降低和对地拉夫定(40倍)的敏感性显著降低。在存在任何测试的NNRTIs的情况下，RTV-013522/270I没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激。在这个患者样品中，在I270S的突变与病毒复制的药物依赖性刺激的相关性是非常显著的。构建在I270S含有单一突变的抗性测试载体(RTV-270S)，并且使用前述的表型分析进行测试，将结果与那些使用野生型对照RTV所确定的结果作比较。我们确定了在RTV-V241S中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-I270S显示了对奈韦拉平(15倍)、efavirenz(4倍)和地拉夫定(13倍)的敏感性的少量降低。RTV-I270S显示出病毒复制的药物依赖性刺激：奈韦拉平(约60％)，地拉夫定(约60％)和efavirenz(约40％)。
                      实施例13在HIV中，定向诱变被用来确证在对抗反转录病毒药物的表型敏感性中
                   特定突变的作用V245E
构建含有单一突变V245E的抗性测试载体(RTV-V245)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用遗传上定义的即野生型的抗性测试载体所确定的结果在位点245作比较。我们确定了在RTV-245E中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-245E对奈韦拉平、efavirenz或地拉夫定没有显示出敏感性降低。在存在奈韦拉平，efavirenz或地拉夫定的情况下，RTV-245E没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激。V245T
构建含有单一突变V245T的抗性测试载体(RTV-V245)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用遗传上定义的即野生型的抗性测试载体所确定的结果在位点245作比较。我们确定了在RTV-245E中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-245T对奈韦拉平、efavirenz或地拉夫定没有显示出敏感性降低。在存在奈韦拉平，efavirenz或地拉夫定的情况下，RTV-245T没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激。I135T
构建含有单一突变I135T的抗性测试载体(RTV-I135T)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用遗传上定义的即野生型的抗性测试载体所确定的结果在位点135作比较。我们确定了在RTV-I135T中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-I135T对奈韦拉平、efavirenz或地拉夫定没有显示出敏感性降低。在存在奈韦拉平，efavirenz或地拉夫定的情况下，RTV-I135T没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激。K103N
构建含有单一突变K103N的抗性测试载体(RTV-K103N)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用遗传上定义的即野生型的抗性测试载体所确定的结果在位点103作比较。我们确定了在RTV-K103N中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-K103N显示了对奈韦拉平(67倍)、efavirenz(29倍)和地拉夫定(87倍)的敏感性的降低。在存在奈韦拉平，efavirenz或地拉夫定的情况下，RTV-K103N没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激。K103N+I135T
构建含有两个突变K103N和I135T的抗性测试载体(RTV-K103N/I135T)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用遗传上定义的即野生型的抗性测试载体所确定的结果在位点103和135作比较。我们确定了在RTV-K103N/I135T中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-K103N/I135T显示了对奈韦拉平(171倍)、efavirenz(80倍)和地拉夫定(121倍)的敏感性的降低。在存在奈韦拉平，efavirenz或地拉夫定的情况下，RTV-K103N/I135T没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激。I135T+V245E
构建含有两个突变I135T和V245E的抗性测试载体(RTV-I135T/V245E)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用遗传上定义的即野生型的抗性测试载体所确定的结果在位点135和245作比较。我们确定了在RTV-I135T/V245E中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-I135T/V245E显示了对奈韦拉平(2.5倍)、efavirenz(2倍)和地拉夫定(2倍)的敏感性的较小的降低。在存在奈韦拉平，efavirenz或地拉夫定的情况下，RTV-K103N没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激。I135T+V245T
构建含有两个突变I135T和V245T的抗性测试载体(RTV-I135T/V245T)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用遗传上定义的即野生型的抗性测试载体所确定的结果在位点135和245作比较。我们确定了在RTV-I135T/V245T中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-I135T/V245T显示了对奈韦拉平(4倍)、efavirenz(2.4倍)和地拉夫定(2.5倍)的敏感性的较小的降低。在efavirenz存在的情况下，RTV-I135T/V245T没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激，而在奈韦拉平或地拉夫定存在的情况下，仅显示出病毒复制的较小的刺激作用：奈韦拉平(约10％)或地拉夫定(约10％)。K103N+I135T+V245E
构建含有三个突变K103N、I135T和V245E的抗性测试载体(RTV-K103N/I135T/V245E)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用遗传上定义的即野生型的抗性测试载体所确定的结果在位点103，135和245作比较。我们确定了在RTV-K103N中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-K103N/I135T/V245E显示了对奈韦拉平(244倍)、efavieenz(93倍)和地拉夫定(169倍)的敏感性的降低。在efavirenz存在的情况下，RTV-K103N/I135T/V245E没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激，但在奈韦拉平和地拉夫定存在的情况下，显示出中等水平的复制的病毒刺激作用：奈韦拉平(约15％)和地拉夫定(约20％)。K103N+I135T+V245T
构建含有三个突变K103N、I135T和V245T的抗性测试载体(RTV-K103N/I135T/V245T)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用遗传上定义的即野生型的抗性测试载体所确定的结果在位点103，135和245作比较。我们确定了在RTV-K103N中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-K103N/I135T/V245T显示了对奈韦拉平(594倍)、efavirenz(174倍)和地拉夫定(＞250倍)的敏感性的显著降低。RTV-K103N/I135T/V245T显示出的病毒复制的药物依赖性刺激：efavirenz(约25％)，奈韦拉平(约40％)和地拉夫定(约50％)。
                     实施例14
在HIV中，使用抗性测试载体将基因型和相关表型与NNRTI药物敏感性和抗性和复制的药物依赖性刺激联系在一起：多个突变可以既调
            节敏感性和又调节刺激作用分布抗性测试载体的制备和患者97-309HIV样品的表型分析
如实施例1中所述的方法从病毒样品中构建抗性测试载体，所述病毒样品来自于个体患者，在超过2年半的时间间隔分13个时间点取样。在获得第一个(97-309)和第二个(98-754)样品的时候，此患者已经先接受了大约2年的两种NRTIs(齐多夫定和拉米夫定)AZT，3TC(NRTIs)，和一种PRI(印第那韦)的治疗。在获得第三种样品(98-1032)的时候，该患者开始采用一种新的抗病毒治疗方案，包括：NRTI(斯塔夫定)，NNRTI(奈韦拉平)，和两种PRIs(那非那韦和沙奎那韦)(PRIs)。另外的样品在4，5和10周以后获得(分别为00-2-011658，00-2-011659和98-1033)。而后患者停止使用奈韦拉平，另外的样品在12，16，24和36周以后获得(分别为99-2-008973，98-757，99-2-8980和98-1080)。患者随后被重新转变为齐多夫定，拉米夫定和印第那韦治疗，另外的样品在5个月后(AAl264)和10个月后(99-2-006174)获得。在图14中显示了病毒负荷测量，患者治疗，和绘图日期。在启用d4T，奈韦拉平，那非那韦，和沙奎那韦以后，该患者经历了短暂的病毒负荷降低，随后回到基线病毒负荷(约1,200,000拷贝/ml)。从治疗方案中去除奈韦拉平会导致病毒负荷降低到小于300,000拷贝/ml(4倍的降低)。病毒RNA分离和RT/PCR被用于产生源自患者的片段，这些片段含有编码来自所有12种样品的所有PR和RT的氨基酸1-313的病毒序列。这些PDS被插入到指示基因病毒载体中以产生被称为RTV-309，RTV-754，RTV-1032，RTV-011658，RTV-011659，RTV-1033，RTV-008973，RTV-757，RTV-008980，RTV-1080，RTV-1264，和RTV-006174的抗性测试载体。随后在一个表型分析中测试这些RTVs以准确地和定量地确定对一组抗反转录病毒药物的敏感性水平。这组抗反转录病毒药物含有被通称为NRTIs(齐多夫定，拉米夫定，斯塔夫定，脱氧腺苷，扎西他宾，和阿巴卡韦)，NNRTIs(地拉夫定，efavirenz和奈韦拉平)，和PRIs(安泼那韦，印第那韦，那非那韦，利托那韦，和沙奎那韦)的成员。对每种测试药物的每个抗性测试载体库确定IC50。检查对所有测试药物的敏感性模式并且与已知的敏感性模式作比较。观察患者RTV-1033，RTV-008973，RTV-757，RTV-008980和RTV-1080对NNRTIs的敏感性模式，其中观察到对奈韦拉平(＞600倍)，地拉夫定(3-18倍)和efavirenz(16-300倍)的敏感性降低。此外RTV-1033，RTV-008973，RTV-757，RTV-008980和RTV-1080显示出响应于奈韦拉平(40-250％)，地拉夫定(20-180％)和efavirenz(30-170％)的病毒复制的药物依赖性刺激。图14a中显示了对每个RTV的在敏感性方面的实际倍数变化和病毒复制刺激作用的百分比。患者HIV样品基因型的确定
通过ABI链终止子自动测序分析RTV-309，RTV-754，RTV-1032，RTV-011658，RTV-011659，RTV-1033，KTV-008973，RTV-757，RTV-008980，RTV1080，RTV1264和RTV-006174 DNA。将该核苷酸序列与野生型分化体B HIV-1(HIV序列数据库Los Alamos，NM)的共有序列进行比较。检查基因型以找寻与对照序列不同的序列。在图14b列出的位点中观察到了突变。在HIV中，定向诱变被用来确证在对抗反转录病毒药物的表型敏感性中特定突变的作用
RTV-1033显示了来自该患者的所有测试样品的、最显著的病毒复制的药物依赖性刺激。单个克隆(RTV-1033-3)从源自患者的RTV库中获得，其具有RTV-1033库的突变和NNRTI敏感性的表型模式和病毒复制的药物依赖性刺激特性。RTV-1033-3具有下列出现在逆转录酶中的突变：V35I，D67N，T69D，K70R，V106A，D123G，V189L，T200A，I202T，H208Y，R211K，T215F，D218E，K219Q，H221Y，L228H，L283I，R284K，T286A，V293I和E297K。RTV-1033-3对地拉夫定(27倍)，efavirenz(＞450倍)和奈韦拉平(＞600倍)显示出敏感性的显著降低，和病毒复制的明显的药物依赖性刺激：地拉夫定(190％)，efavirenz(180％)和奈韦拉平(200％)。V106A
构建除了V106A之外，含有所有出现在RTV-1033-3中的突变的抗性测试载体(RTV-1033-3/106V)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用亲本RTV-1033-3所确定的结果作比较。我们确定了在回复载体RTV-1033-3/106V中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-1033-3/106V显示了对奈韦拉平(9倍)敏感性的中度降低，对efavirenz的敏感性没有减少和对地拉夫定(20倍)的敏感性显著增加(超敏感性)。在存在地拉夫定的情况下，RTV-1033-3/106V没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激，但是在存在efavirenz和奈韦拉平的情况下，显示出低水平的病毒复制的药物依赖性刺激：efavirenz(约20％)和奈韦拉平(约40％)。F227L
构建除了F227L之外，含有所有出现在RTV-1033-3中的突变的抗性测试载体(RTV-1033-3/227F)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用亲本RTV-1033-3所确定的结果作比较。我们确定了在回复载体RTV-1033-3/227F中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-1033-3/227F显示了对奈韦拉平(＞600倍)，efavirenz(18倍)和地拉夫定(72倍)敏感性的显著降低。RTV-1033-3/227F显示出病毒复制的药物依赖性刺激：地拉夫定(约100％)，efavirenz(约100％)和奈韦拉平(约120％)。V106A和F227L
构建除了V106A和F227L之外，含有所有出现在RTV-1033-3中的突变的抗性测试载体(RTV-1033-3/106V/227F)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用亲本RTV-1033-3所确定的结果作比较。我们确定了在回复载体RTV-1033-3/106V/227F中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-1033-3/106V/227F显示了对奈韦拉平(13倍)，efavirenz(6倍)和地拉夫定(6倍)敏感性的中度降低。RTV-1033-3/106V/227F显示出病毒复制的药物依赖性刺激：地拉夫定(约80％)，efavirenz(约80％)和奈韦拉平(约110％)。V106A，V189L和F227L
构建除了V106A，V189L和F227L之外，含有所有出现在RTV-1033-3中的突变的抗性测试载体(RTV-1033-3/106V/189V/227F)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用亲本RTV-1033-3所确定的结果作比较。我们确定了在回复载体RTV-1033-3/106V/189V/227F中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-1033-3/106V/189V/227F显示了对奈韦拉平(2.8倍)，efavirenz(2倍)和地拉夫定(2.7倍)敏感性的少量降低。RTV-1033-3/106V/189V/227F显示出病毒复制的药物依赖性刺激：地拉夫定(约35％)，efavirenz(约30％)和奈韦拉平(约40％)。V106A，F227L和T286A
构建除了V106A，F227L和T286A之外，含有所有出现在RTV-1033-3中的突变的抗性测试载体(RTV-1033-3/106V/227F/286T)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用亲本RTV-1033-3所确定的结果作比较。我们确定了在回复载体RTV-1033-3/106V/227F/286T中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-1033-3/106V/227F/286T显示了对奈韦拉平(6倍)，efavirenz(5倍)和地拉夫定(3倍)敏感性的中度降低。RTV-1033-3/106V/227F/286T显示出病毒复制的药物依赖性刺激：地拉夫定(约60％)，efavirenz(约50％)和奈韦拉平(约70％)。L283I，R284K和T286A
构建除了L283I，R284K和T286A之外，含有所有出现在RTV-1033-3中的突变的抗性测试载体(RTV-1033-3/283L/284R/286T)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用亲本RTV-1033-3所确定的结果作比较。我们确定了在回复载体RTV-1033-3/283L/284R/286T中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-1033-3/283L/284R/286T显示了对奈韦拉平(＞600倍)，efavirenz(85倍)和地拉夫定(7倍)敏感性的显著降低。RTV-1033-3/283L/284R/286T显示出病毒复制的药物依赖性刺激：地拉夫定(约40％)，efavirenz(约30％)和奈韦拉平(约80％)。L283I，R284K，T286A，V293I和E297K
构建除了L283I，R284K，T286A，V293I和E297K之外，含有所有出现在RTV-1033-3中的突变的抗性测试载体(RTV-1033-3/283L/284R/286T/293V/297E)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用亲本RTV-1033-3所确定的结果作比较。我们确定了在回复载体RTV-1033-3/283L/284R/286T/293V/297E中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-1033-3/283L/284R/286T/293V/297E显示了对奈韦拉平(114倍)，efavirenz(5倍)和地拉夫定(16倍)敏感性的显著降低。在奈韦拉平，efavirenz或地拉夫定存在的情况下，RTV-1033-3/283L/284R/286T/293V/297E没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激。Y181C
构建除了Y181C之外，还包含所有出现在RTV-1033-3中的突变的抗性测试载体(RTV-1033-3/181C)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用亲本RTV-1033-3所确定的结果作比较。我们确定了在突变载体RTV-1033-3/181C中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-1033-3/181C显示了对奈韦拉平(＞600倍)，efavirenz(＞450倍)和地拉夫定(＞250倍)敏感性的显著降低。在奈韦拉平存在的情况下，RTV-1033-3/181C没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激，但是在efavirenz和奈韦拉平存在的情况下，显示出病毒复制的药物依赖性刺激：efavirenz(约100％)和奈韦拉平(约100％)。M184V
构建除了M184V之外，还包含所有出现在RTV-1033-3中的突变的抗性测试载体(RTV-1033-3/184V)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用亲本RTV-1033-3所确定的结果作比较。我们确定了在突变载体RTV-1033-3/184V中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-1033-3/184V显示了对奈韦拉平(＞600倍)，efavirenz(28倍)敏感性的显著降低和对地拉夫定(5倍)敏感性的中度降低。RTV-1033-3/184V显示出病毒复制的药物依赖性刺激：地拉夫定(约100％)，efavirenz(约80％)和奈韦拉平(约100％)。克隆309-1
RTV-309来源于这样的病毒样品，此病毒样品来自接受任何NNRTI抑制剂之前的患者1033。RTV-309显示了对地拉夫定和efavirenz的野生型敏感性模式，和对奈韦拉平(3倍)的敏感性有少量的降低，并且在NNRTIs存在的情况下没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激。单个克隆(RTV-309-3)从源自患者的RTV库中获得，其具有RTV-1033库的突变和NNRTI敏感性的表型模式和病毒复制的药物依赖性刺激特性。RTV-309-3具有下列出现在逆转录酶中的突变：V35I，D67N，T69D，K70R，L109I，M184V，V189L，T200A，I202T，H208Y，R211K，T215F，D218E，K219Q，H221Y，L228H，L283I，R284K，T286A和E297K。RTV-309-3显示了对地拉夫定和efavirenz的野生型敏感性模式，和对奈韦拉平(3倍)的敏感性有少量的降低，和在NNRTIs存在的情况下没有显示出病毒复制的药物依赖性刺激。M184V
构建除了M184M之外，包含所有出现在RTV-309-3中的突变的抗性测试载体(RTV-309-3/184M)，并且使用前述的表型分析进行测试。将结果与那些使用亲本RTV-309-3所确定的结果作比较。我们确定了在回复载体RTV-309-3/184M中，对于NNRTIs，地拉夫定，奈韦拉平和efavirenz的表型敏感性的模式。与野生型对照RTV相比，RTV-309-3/184M显示了对地拉夫定(4倍)，efavirenz(5倍)和地拉夫定(9倍)敏感性的中度降低。RTV-309-3/184M显示出病毒复制的药物依赖性刺激：地拉夫定(约50％)，efavirenz(约60％)和奈韦拉平(约80％)。
本发明还涉及用于分离和鉴别非核苷HIV-1逆转录酶抑制剂抗性突变型的新的载体、宿主细胞和组合物，和使用这些载体、宿主细胞和组合物来执行抗病毒药物的筛选。本发明还涉及筛选能抑制/刺激所述突变型的候选药物。

Claims (87)

1、一种评价HIV感染的患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：
(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和
(b)评价是否该生物样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该酶在密码子230具有单独的突变或者其结合有密码子103或密码子181突变。
其中这种突变的存在，与非核苷逆转录酶抑制剂敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
2、权利要求1的方法，其中突变的密码子230编码亮氨酸(L)。
3、权利要求1的方法，其中突变的密码子103编码天冬酰胺(N)。
4、权利要求1的方法，其中HIV感染的患者用一种抗反转录病毒制剂来治疗。
5、一种评价候选的HIV抗反转录病毒药物化合物的生物有效性的方法，其包含：
(a)将一种抗性测试载体引入一种宿主细胞，该载体包含一个来源于患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子230的单独突变或者其结合有在密码子103的突变或在密码子181的突变；
(b)培养步骤(a)中的宿主细胞；
(c)在靶宿主细胞中测量该指示基因的表达；和
(d)将来自步骤(c)中指示基因的表达的测量结果与在不存在该候选抗反转录病毒药物化合物时执行(a)-(c)步骤所测量的指示基因的表达的测量结果相比较；
其中在步骤(a)-(c)；步骤(b)-(c)；或者步骤(c)中存在该候选抗反转录病毒药物化合物的测试浓度。
6、一种抗性测试载体，其包含：
(i)来源于HIV患者的片段，其含有逆转录酶，该逆转录酶在密码子230，103或者181中的至少一个密码子处具有突变，和
(ii)和一个指示基因，
其中该指示基因的表达依赖于来源于患者的片段。
7、一种评价HIV感染患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：
(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和
(b)评价是否该生物样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该酶在密码子230具有单独的突变或者其至少结合有选自下列密码子的一个突变：密码子101，密码子103，密码子190，密码子221，和密码子238，其中这些突变的存在与非核苷逆转录酶抑制剂敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
8、权利要求7的方法，其中突变的密码子230编码亮氨酸(L)。
9、权利要求7的方法，其中突变的密码子101编码谷氨酸(E)，突变的密码子103编码天冬酰胺(N)，突变的密码子190编码丝氨酸(S)，突变的密码子221编码酪氨酸(Y)，或者突变的密码子238编码苏氨酸(T)。
10、权利要求7的方法，其中HIV感染的患者用一种抗反转录病毒制剂来治疗。
11、一种评价候选HIV抗反转录病毒药物化合物的生物有效性的方法，其包含：
(a)将一种抗性测试载体引入一种宿主细胞，该载体包含一个来源于患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子230的单独突变或者其结合有在密码子103，密码子190，密码子221或者密码子238的突变；
(b)培养步骤(a)中的宿主细胞；
(c)在靶宿主细胞中测量该指示基因的表达；和
(d)将来自步骤(c)中指示基因的表达的测量结果与在不存在该候选抗反转录病毒药物化合物时执行(a)-(c)步骤所测量的指示基因的表达的测量结果相比较；
其中在步骤(a)-(c)；步骤(b)-(c)；或者步骤(c)中存在该候选抗反转录病毒药物化合物的测试浓度。
12、一种抗性测试载体，其含有一个来源于HIV患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子230，101，103，190，221和/或238具有突变的逆转录酶，其中该指示基因的表达依赖于来源于患者的片段。
13、一种评价HIV感染患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：
(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和
(b)评价是否该生物样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该酶在密码子241和103或者135具有突变，其中这些突变的存在与NNRTI敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
14、权利要求13的方法，其中突变的密码子241编码丝氨酸(S)。
15、权利要求13的方法，其中突变的密码子103编码天冬酰胺(N)和突变的密码子135编码苏氨酸(T)。
16、权利要求13的方法，其中HIV感染的患者用一种抗反转录病毒制剂治疗。
17、一种评价候选HIV抗反转录病毒药物化合物的生物有效性的方法，其包含：
(a)将一种抗性测试载体引入一种宿主细胞，该载体包含来源于患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子241和103或者135的突变；
(b)培养步骤(a)中的宿主细胞；
(c)在靶宿主细胞中测量该指示剂；和
(d)将来自步骤(c)中指示剂的测量结果与在不存在候选抗反转录病毒药物化合物时执行(a)-(c)步骤所测量的指示剂的测量结果相比较；
其中在步骤(a)-(c)；步骤(b)-(c)；或者步骤(c)中存在该候选抗反转录病毒药物化合物的测试浓度。
18、一种抗性测试载体，其含有来源于HIV患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子241，103和/或135具有突变的逆转录酶，其中该指示基因的表达依赖于来源于患者的片段。
19、一种评价HIV感染患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：
(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和
(b)评价是否该生物样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该酶在密码子241和101，106，135，138或者190具有突变，其中这些突变的存在与NNRTI敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
20、权利要求19的方法，其中突变的密码子241编码异亮氨酸(I)。
21、权利要求19的方法，其中突变的密码子101编码谷氨酸(E)，突变的密码子106编码蛋氨酸(M)，突变的密码子135编码苏氨酸(T)，突变的密码子138编码丙氨酸(A)和/或突变的密码子190编码丙氨酸(A)。
22、权利要求19的方法，其中HIV感染的患者用一种抗反转录病毒制剂来治疗。
23、一种评价候选HIV抗反转录病毒药物化合物的生物有效性的方法，其包含：
(a)将一种抗性测试载体引入一种宿主细胞，该载体包含来源于患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子241和101，106，135，138或者190的突变；
(b)培养步骤(a)中的宿主细胞；
(c)在靶宿主细胞中测量该指示剂；和
(d)将来自步骤(c)中指示剂的测量结果与在不存在候选抗反转录病毒药物化合物时执行(a)-(c)步骤所测量的指示剂的测量结果相比较；
其中在步骤(a)-(c)；步骤(b)-(c)；或者步骤(c)中存在该候选抗反转录病毒药物化合物的测试浓度。
24、一种抗性测试载体，其含有来源于HIV患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子241，101，106，135，138和/或190具有突变的逆转录酶，其中该指示基因的表达依赖于来源于患者的片段。
25、一种评价HIV感染患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：
(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和
(b)评价是否该生物样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该酶在密码子245和98，135和/或181具有突变，其中这些突变的存在，与NNRTI敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
26、权利要求25的方法，其中突变的密码子245编码谷氨酸(E)。
27、权利要求25的方法，其中突变的密码子98编码甘氨酸(G)，突变的密码子135编码苏氨酸(T)，和/或突变的密码子181编码半胱氨酸(C)。
28、权利要求25的方法，其中感染HIV的患者用一种抗反转录病毒制剂来治疗。
29、一种评价候选HIV抗反转录病毒药物化合物的生物有效性的方法，其包含：
(a)将一种抗性测试载体引入一种宿主细胞，该载体包含来源于患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子245和98，135，和/或181的突变；
(b)培养步骤(a)中的宿主细胞；
(c)在靶宿主细胞中测量该指示剂；和
(d)将来自步骤(c)中指示剂的测量结果与在不存在该候选抗反转录病毒药物化合物时执行(a)-(c)步骤所测量的指示剂的测量结果相比较，
其中在步骤(a)-(c)；步骤(b)-(c)；或者步骤(c)中存在该候选抗反转录病毒药物化合物的测试浓度。
30、一种抗性测试载体，其含有来源于HIV患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子245，98，135，和/或181的具有突变的逆转录酶，其中该指示基因的表达依赖于来源于患者的片段。
31、一种评价HIV感染患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：
(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和
(b)评价是否该生物样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该酶在密码子245和101，103，135和/或190具有突变，其中这些突变的存在与NNRTI敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
32、权利要求31的方法，其中突变的密码子245编码谷氨酸(E)。
33、权利要求31的方法，其中突变的密码子101编码谷氨酸(E)，突变的密码子103编码天冬酰胺(N)，突变的密码子135编码苏氨酸(T)，和/或突变的密码子190编码丙氨酸(A)。
34、权利要求31的方法，其中HIV感染的患者用一种抗反转录病毒制剂来治疗。
35、一种评价候选HIV抗反转录病毒药物化合物的生物有效性的方法，其包含：
(a)将一种抗性测试载体引入一种宿主细胞，该载体包含来源于患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子245和101，103，135，和/或190的突变；
(b)培养步骤(a)中的宿主细胞；
(c)在靶宿主细胞中测量该指示剂；和
(d)将来自步骤(c)中指示剂的测量结果与在不存在该候选抗反转录病毒药物化合物时执行(a)-(c)步骤所测量的指示剂的测量结果相比较，
其中在步骤(a)-(c)；步骤(b)-(c)；或者步骤(c)中存在该候选抗反转录病毒药物化合物的测试浓度。
36、一种抗性测试载体，其含有来源于HIV患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子245，101，103，135，和/或190具有突变的逆转录酶，其中该指示基因的表达依赖于来源于患者的片段。
37、一种评价HIV感染患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：
(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和
(b)评价是否该生物样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该酶在密码子245和103，225和/或270具有突变，其中这些突变的存在与NNRTI敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
38、权利要求37的方法，其中突变的密码子245编码谷氨酸(E)。
39、权利要求37的方法，其中突变的密码子103编码天冬酰胺(N)，突变的密码子225编码组氨酸(H)，和/或突变的密码子270编码蛋氨酸(M)。
40、权利要求37的方法，其中HIV感染的患者用一种抗反转录病毒制剂来治疗。
41、一种评价候选HIV抗反转录病毒药物化合物的生物有效性的方法，其包含：
(a)将一种抗性测试载体引入一种宿主细胞，该载体包含来源于患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子245和103，225，和/或270的突变；
(b)培养步骤(a)中的宿主细胞；
(c)在靶宿主细胞中测量该指示剂；和
(d)将来自步骤(c)中指示剂的测量结果与在不存在该候选抗反转录病毒药物化合物时执行(a)-(c)步骤所测量的指示剂的测量结果相比较；
其中在步骤(a)-(c)；步骤(b)-(c)；或者步骤(c)中存在该候选抗反转录病毒药物化合物的测试浓度。
42、一种抗性测试载体，其含有来源于HIV患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子245，103，225，和/或270具有突变的逆转录酶，其中该指示基因的表达依赖于来源于患者的片段。
43、一种评价HIV感染患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：
(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和
(b)评价是否该生物样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该酶在密码子245和135，和/或138具有突变，其中这些突变的存在与NNRTI敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
44、权利要求43的方法，其中突变的密码子245编码苏氨酸(T)。
45、权利要求43的方法，其中突变的密码子135编码苏氨酸(T)，和/或突变的密码子138编码甘氨酸(G)。
46、权利要求43的方法，其中HIV感染的患者用一种抗反转录病毒制剂来治疗。
47、一种评价候选HIV抗反转录病毒药物化合物的生物有效性的方法，其包含：
(a)将一种抗性测试载体引入一种宿主细胞，该载体包含来源于患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子245和135，和/或138的突变；
(b)培养步骤(a)中的宿主细胞；
(c)在靶宿主细胞中测量该指示剂；和
(d)将来自步骤(c)中指示剂的测量结果与在不存在该候选抗反转录病毒药物化合物时执行(a)-(c)步骤所测量的指示剂的测量结果相比较；
其中在步骤(a)-(c)；步骤(b)-(c)；或者步骤(c)中存在该候选抗反转录病毒药物化合物的测试浓度。
48、一种抗性测试载体，其含有来源于HIV患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子245，135，和/或138具有突变的逆转录酶，其中该指示基因的表达依赖于来源于患者的片段。
49、一种评价HIV感染患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：
(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和
(b)评价是否该生物学样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该酶在密码子245和98，103，135，181和/或190具有突变，其中这些突变的存在与NNRTI敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
50、权利要求49的方法，其中突变的密码子245编码苏氨酸(T)。
51、权利要求49的方法，其中突变的密码子98编码谷氨酸(G)，突变的密码子103编码天冬酰胺(N)，突变的密码子135编码苏氨酸(T)，突变的密码子181编码半胱氨酸(C)，和/或突变的密码子190编码丙氨酸(A)。
52、权利要求49的方法，其中HIV感染的患者用一种抗反转录病毒制剂来治疗。
53、一种评价候选HIV抗反转录病毒药物化合物的生物有效性的方法，其包含：
(a)将一种抗性测试载体引入一种宿主细胞，该载体包含来源于患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子245和98，103，135，181，和/或190的突变；
(b)培养步骤(a)中的宿主细胞；
(c)在靶宿主细胞中测量该指示剂；和
(d)将来自步骤(c)中指示剂的测量结果与在不存在该候选抗反转录病毒药物化合物时执行(a)-(c)步骤所测量的指示剂的测量结果相比较；
其中在步骤(a)-(c)；步骤(b)-(c)；或者步骤(c)中存在该候选抗反转录病毒药物化合物的测试浓度。
54、一种抗性测试载体，其含有来源于HIV患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子245，98，103，135，181和/或190具有突变的逆转录酶，其中该指示基因的表达依赖于来源于患者的片段。
55、一种评价HIV感染患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：
(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和
(b)评价是否该生物样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该酶在密码子245和103具有突变，其中这些突变的存在与NNRTI敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
56、权利要求55的方法，其中突变的密码子245编码苏氨酸(T)。
57、权利要求55的方法，其中突变的密码子103编码天冬酰胺(N)。
58、权利要求55的方法，其中HIV感染的患者用一种抗反转录病毒制剂来治疗。
59、一种评价候选HIV抗反转录病毒药物化合物的生物有效性的方法，其包含：
(a)将一种抗性测试载体引入一种宿主细胞，该载体包含来源于患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子245和103的突变；
(b)培养步骤(a)中的宿主细胞；
(c)在靶宿主细胞中测量指示剂；和
(d)将来自步骤(c)中指示剂的测量结果与在不存在该候选抗反转录病毒药物化合物时执行(a)-(c)步骤所测量的指示剂的测量结果相比较；
其中在步骤(a)-(c)；步骤(b)-(c)；或者步骤(c)中存在该候选抗反转录病毒药物化合物的测试浓度。
60、一种抗性测试载体，其含有来源于HIV患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子245和103具有突变的逆转录酶，其中该指示基因的表达依赖于来源于患者的片段。
61、一种评价HIV感染患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：
(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和
(b)评价是否该生物样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该酶在密码子245和103，135和/或225具有突变，其中这些突变的存在与NNRTI敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
62、权利要求61的方法，其中突变的密码子245编码蛋氨酸(M)。
63、权利要求61的方法，其中突变的密码子103编码天冬酰胺(N)，突变的密码子135编码苏氨酸(T)和/或突变的密码子225编码组氨酸(H)。
64、权利要求61的方法，其中HIV感染的患者用一种抗反转录病毒制剂来治疗。
65、一种评价候选HIV抗反转录病毒药物化合物的生物有效性的方法，其包含：
(a)将一种抗性测试载体引入一种宿主细胞，该载体包含来源于患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子245和103，135和/或225的突变；
(b)培养步骤(a)中的宿主细胞；
(c)在靶宿主细胞中测量指示剂；和
(d)将来自步骤(c)中指示剂的测量结果与在不存在该候选抗反转录病毒药物化合物时执行(a)-(c)步骤所测量的指示剂的测量结果相比较；
其中在步骤(a)-(c)；步骤(b)-(c)；或者步骤(c)中存在该候选抗反转录病毒药物化合物的测试浓度。
66、一种抗性测试载体，其含有来源于HIV患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子245，103，135，和/或225的具有突变的逆转录酶，其中该指示基因的表达依赖于来源于患者的片段。
67、一种评价HIV感染患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：
(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和
(b)评价是否该生物样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该酶在密码子270和103和/或135具有突变，其中这些突变的存在与NNRTI敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
68、权利要求67的方法，其中突变的密码子270编码丝氨酸(S)。
69、权利要求67的方法，其中突变的密码子103编码天冬酰胺(N)和/或突变的密码子135编码苏氨酸(T)。
70、权利要求67的方法，其中HIV感染的患者用一种抗反转录病毒制剂来治疗。
71、一种评价候选HIV抗反转录病毒药物化合物的生物有效性的方法，其包含：
(a)将一种抗性测试载体引入一种宿主细胞，该载体包含来源于患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子270和103和/或135的突变；
(b)培养步骤(a)中的宿主细胞；
(c)在靶宿主细胞中测量指示剂；和
(d)将来自步骤(c)中指示剂的测量结果与在不存在该候选抗反转录病毒药物化合物时执行(a)-(c)步骤所测量的指示剂的测量结果相比较；
其中在步骤(a)-(c)；步骤(b)-(c)；或者步骤(c)中存在该候选抗反转录病毒药物化合物的测试浓度。
72、一种抗性测试载体，其含有来源于HIV患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子270，103和/或135具有突变的逆转录酶，其中该指示基因的表达依赖于来源于患者的片段。
73、一种评价HIV感染患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：
(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和
(b)评价是否该生物样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该酶在密码子230具有突变，其中该突变的存在与NNRTI抑制剂敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
74、权利要求73的方法，其中突变的密码子230编码亮氨酸(L)。
75、权利要求73的方法，其中HIV感染的患者用一种抗反转录病毒制剂来治疗。
76、一种评价候选HIV抗反转录病毒药物化合物的生物有效性的方法，其包含：
(a)将一种抗性测试载体引入一种宿主细胞，该载体包含来源于患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子230的突变；
(b)培养步骤(a)中的宿主细胞；
(c)在靶宿主细胞中测量指示剂；和
(d)将来自步骤(c)中指示剂的测量结果与在不存在该候选抗反转录病毒药物化合物时执行(a)-(c)步骤所测量的指示剂的测量结果相比较；
其中在步骤(a)-(c)；步骤(b)-(c)；或者步骤(c)中存在该候选抗反转录病毒药物化合物的测试浓度。
77、一种抗性测试载体，其含有来源于HIV患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子230具有突变的逆转录酶，其中该指示基因的表达依赖于来源于患者的片段。
78、一种评价HIV感染患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：
(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和
(b)评价是否该生物样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该酶在密码子241具有突变，其中该突变的存在与NNRTI敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
79、权利要求78的方法，其中突变的密码子241编码丝氨酸(S)。
80、权利要求78的方法，其中HIV感染的患者用一种抗反转录病毒制剂来治疗。
81、一种评价候选HIV抗反转录病毒药物化合物的生物有效性的方法，其包含：
(a)将一种抗性测试载体引入一种宿主细胞，该载体包含来源于患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子241的突变；
(b)培养步骤(a)中的宿主细胞；
(c)在靶宿主细胞中测量指示剂；和
(d)将来自步骤(c)中指示剂的测量结果与在不存在该候选抗反转录病毒药物化合物时执行(a)-(c)步骤所测量的指示剂的测量结果相比较；
其中在步骤(a)-(c)；步骤(b)-(c)；或者步骤(c)中存在该候选抗反病毒转录药物化合物的测试浓度。
82、一种抗性测试载体，其含有来源于HIV患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子241具有突变的逆转录酶，其中该指示基因的表达依赖于来源于患者的片段。
83、一种评价HIV感染患者的非核苷逆转录酶抗反转录病毒治疗的有效性的方法，其包含：
(a)从HIV感染患者中收集生物样品；和
(b)评价是否该生物样品含有编码HIV逆转录酶的核酸，该酶在密码子270具有突变，其中该突变的存在与NNRTI敏感性的降低和病毒复制的药物依赖性刺激相关。
84、权利要求83的方法，其中突变的密码子270编码丝氨酸(S)。
85、根据权利要求83的方法，其中HIV感染的患者用一种抗反转录病毒制剂来治疗。
86、一种评价候选HIV抗反转录病毒药物化合物的生物有效性的方法，其包含：
(a)将一种抗性测试载体引入一种宿主细胞，该载体包含来源于患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子270的突变；
(b)培养步骤(a)中的宿主细胞；
(c)在靶宿主细胞中测量指示剂；和
(d)将来自步骤(c)中指示剂的测量结果与在不存在该候选抗反转录病毒药物化合物时执行(a)-(c)步骤所测量的指示剂的测量结果相比较；
其中在步骤(a)-(c)；步骤(b)-(c)；或者步骤(c)中存在该候选抗反转录病毒药物化合物的测试浓度。
87、一种抗性测试载体，其含有来源于HIV患者的片段和一个指示基因，该片段还包含在密码子270具有突变的逆转录酶，其中该指示基因的表达依赖于来源于患者的片段。
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