CN105648037A - 一种重组慢病毒在hiv表型耐药检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，该重组慢病毒是包装质粒、包膜质粒和转移质粒共转染293FT细胞或293T细胞后得到的包装体；其中，所述包装质粒为psPAX2m-pol质粒；所述转移质粒为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen质粒。该重组慢病毒安全高效毒副作用小成本低，将其应用于HIV表型耐药检测中，能为临床上合理有效地选用抗HIV药物提供重要参考依据。该转移质粒报告基因Luciferase与ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV启动子控制报告基因Luciferase与ZsGreen的表达，使得HIV-1抑制剂的抗病毒效果能够简易地通过在倒置荧光显微镜下观察到或通过测定荧光素酶活性而获得，将pol区导入后，多种细胞用具有此转移质粒的重组慢病毒均可进行耐药性检测，通用性强。

Description

一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用
技术领域
本发明涉及及医学分子生物学领域，具体涉及了一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用。
背景技术
过去的数十年中，多种HIV-1抑制药物已批准入市，用于HIV感染病人的治疗。基于HIV-1逆转录酶和(或)蛋白酶的两种或多种抑制剂联合应用的高效抗逆转录病毒疗法(HAART)，被公认为是治疗HIV感染病人最有效方法之一。它不仅能够提高HIV感染病人的生活质量也能降低HIV的感染风险。尽管HAART能够抑制病毒的复制和降低HIV感染的风险，但不能清除HIV-1感染者体内的病毒。因此，抗逆转录病毒疗法会因药物选择性压力下新现的耐药毒株而大打折扣。因此，很有必要监测耐药毒株并对临床精准抗病毒治疗提供指导。
目前，对于HIV药物耐药性检测主要有基因型和表型耐药两种检测类型。基因型耐药检测是通过序列分析，能检出HIV-1靶基因中特定耐药相关的基因突变，因其操作简便，成本低廉，及在线的评估系统的应用，较表型耐药检测常用。但是，基因型检测不能用于解释不常见的突变或几种突变型的混合突变。表型耐药检测，能够在体外测定HIV-1抑制剂作用下的病毒产量或酶活性，能够直接测定每种抑制剂的耐药水平，而无需知晓HIV-1毒株的基因突变。因此，表型耐药检测对于HIV-1感染的病人，特别是为已经多次治疗的病人提供精准的药物指导是很有意义的。通常情况下，表型耐药检测是分离和培养临床毒株。但是，这些检测需要采集献血者新鲜的外周血单个核细胞，这将耗时耗力。最近，有一些检测基于重组病毒的单环感染，或用感染性粒子进行多轮感染。尽管这些检测用于表型耐药分析有巨大的应用前景，但是，由于采用高通量定量萤火虫萤光素酶表达系统，成本还是很高昂，再就是可能存在着生物安全问题。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足，本发明提供了一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，该重组慢病毒安全高效毒副作用小成本低，将其应用于HIV表型耐药检测中，能为临床上合理有效地选用抗HIV药物提供重要参考依据。该重组慢病毒带有的转移质粒，其报告基因Luciferase与ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV启动子控制报告基因Luciferase与ZsGreen的表达，使得HIV-1抑制剂的抗病毒效果能够简易地通过在倒置荧光显微镜下观察到或通过测定荧光素酶活性而获得，将pol区导入后，多种细胞用具有此转移质粒的重组慢病毒均可进行耐药性检测，通用性强。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
本发明的发明思路基于以下考虑。第一，在艾滋病人临床治疗工作中，表型耐药检测能为患者个体化治疗提供参考。但是表型耐药检测是分离和培养临床毒株。但是，以往的检测方法存在耗时耗力或是成本高昂，及生物安全性的问题。基于此，发明人开发了一种具有新的转移质粒的重组慢病毒，它具有简易操作性、较好的生物安全性及通用性。
一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，该重组慢病毒是包装质粒、包膜质粒和转移质粒共转染293FT细胞或293T细胞后得到的包装体；其中，所述包装质粒为psPAX2m-pol质粒；所述转移质粒为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen质粒。
进一步地，所述转移质粒结构如图1所示。
进一步地，所述转移质粒的构建方法，包括以下步骤：使用BamHI和KpnI双酶切pMD2.G质粒，回收酶切产物，收取119bpCMV片段；将pHAGE-EF1α-IRES-ZsGreen质粒用BamHI和KpnI进行双酶切，回收4736bppHAGE-IRES-ZsGreen片段；将回收的CMV片段和pHAGE-IRES-ZsGreen用T4DNA连接酶进行连接，连接成功后，提取的质粒命名为pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒；使用NcoI和XbaI双酶切PGL3-PromoterVector，回收1906bpLuciferase片段，pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒用NcoI和XbaI双酶切，回收4855bp的片段，将该片段和Luciferase片段用T4DNA连接酶进行连接；连接成功后，提取的质粒即为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen。
进一步地，所述psPAX2m-pol质粒结构如图3所示。
进一步地，所述psPAX2m-pol质粒序列如SEQIDNo.6所示。
进一步地，所述psPAX2m-pol质粒的构建方法，包括以下步骤：
psPAX2载体重建：利用长引物法突变psPAX2载体的酶切位点AgeI，获得psPAX2-1载体；利用定点突变试剂盒突变psPAX2-1载体的酶切位点ApaI，获得psPAX2-2载体；DpnI酶切psPAX2-2载体，酶切产物转化XL10-GOLD感受态细胞，质粒提取，ApaI酶切该质粒，挑取酶切产物鉴定测序，获得psPAX2m载体，其序列如SEQIDNo.4所示；
psPAX2m-pol质粒构建：利用PCR扩增pol片段，其序列如SEQIDNo.5所示；用ApaI和AgeI酶切扩增后的pol片段回收并插入psPAX2m载体，得到psPAX2m-pol质粒，其序列如SEQIDNo.6所示。
进一步地，所述psPAX2-1载体的序列如SEQIDNo.2所示。
进一步地，所述psPAX2-2载体的序列如SEQIDNo.3所示。
进一步地，所述psPAX2m载体的序列如SEQIDNo.4所示。
进一步地，所述长引物法突变psPAX2载体所用的引物为AgeI-F和AgeI-R，其中，
AgeI-F：CGAAGAGCTCATCAGAACAGTCAGACTCATCAAGCTTCTCTATC；
AgeI-R：CTGCTAGCTATAGTTCTAGAGGTATCGGTTGTTTCGAGCTTATAG；
模板为psPAX2，PCR条件：94℃预变性4min，94℃变性20s、55℃退火20s、72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸5min；
所述利用定点突变试剂盒突变psPAX2-1载体所用的引物为M-ApaI-F和M-ApaI-R；其中，
M-ApaI-F：GCCTTGAGGGGCCTCCGGGGACGGCCCTTTGTGCGGGG
M-ApaI-R：CCCCGCACAAAGGGGCCGTCCCGGAGCCCCCTCAAGGC；
模板为psPAX2-1，PCR条件：95℃预变性2min，95℃变性30sec，55℃退火1min，68℃延伸10min，循环18次。
本发明具有如下有益效果：一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，该重组慢病毒安全高效毒副作用小成本低，将其应用于HIV表型耐药检测中，能为临床上合理有效地选用抗HIV药物提供重要参考依据。该重组慢病毒带有的转移质粒，其报告基因Luciferase与ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV启动子控制报告基因Luciferase与ZsGreen的表达，使得HIV-1抑制剂的抗病毒效果能够简易地通过在倒置荧光显微镜下观察到或通过测定荧光素酶活性而获得，将pol区导入后，多种细胞用具有此转移质粒的重组慢病毒均可进行耐药性检测，通用性强。
附图说明
图1为本发明中转移质粒的结构图；
图2为本发明中转移质粒的构建方法示意图；
图3为本发明中包装质粒的结构图；
图4为本发明中荧光显微镜下质粒共转染情况；其中：左边一列为载体突变前，病毒感染293A细胞荧光百分比；右边一列为载体突变后，病毒感染293A细胞荧光百分比，其中，
A与D表示原始病毒液感染293A细胞荧光百分比；
B与E表示原始病毒液稀释10倍后感染293A细胞荧光百分比；
C与F表示原始病毒液稀释100倍后感染293A细胞荧光百分比
结果：从各个梯度百分比可以看出，载体改造后，对病毒的浓度和感染性无影响；
图5中A～C分别为使用本发明重组慢病毒共转染293A细胞，抗HIV药物司他夫定敏感性与细胞数目、病毒MOI及病毒感染时间相关实验结果；
图6为本发明中重组慢病毒活性滴度情况；
图7中A～C分别为使用本发明重组慢病毒共转染TZM-B细胞，抗HIV药物齐多夫定(D4T)敏感性与细胞数目、病毒MOI及病毒感染时间相关实验结果；
图8中A～C分别为使用本发明重组慢病毒共转染huh7.5细胞，抗HIV药物齐多夫定(D4T)敏感性与细胞数目、病毒MOI及病毒感染时间相关实验结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明。
本发明一种重组慢病毒系统是利用下述方法构建的，步骤为：
(1)转移质粒的构建
本发明的转移质粒具有双报告基因荧光素酶Luciferase与ZsGreen，其具体结构如图1所示。Luciferase与ZsGreen为各自独立表达的蛋白，而非融合蛋白。
如图2所示，该转移质粒的构建方法如下：
(1.1)使用BamHI和KpnI双酶切pMD2.G质粒，回收酶切产物，收取119bpCMV片段；
(1.2)将pHAGE-EF1α-IRES-ZsGreen质粒用BamHI和KpnI进行双酶切，回收4736bppHAGE-IRES-ZsGreen片段；
(1.3)将回收的CMV片段和pHAGE-IRES-ZsGreen用T4DNA连接酶进行连接，连接成功后，提取的质粒命名为pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒；
(1.4)使用NcoI和XbaI双酶切PGL3-PromoterVector，回收1906bpLuciferase片段，pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒用NcoI和XbaI双酶切，回收4855bp的片段，将该片段和Luciferase片段用T4DNA连接酶进行连接；连接成功后，提取的质粒即为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen。
(2)包装质粒的构建
所述包装质粒为psPAX2m-pol质粒，其序列如序列如SEQIDNo.6所示，结构如图3所示。
所述包装质粒的构建方法如下：
(2.1)基于psPAX2的载体重建
定点突变改造载体psPAX2，以定向封闭多余的酶切位点AgeI与ApaI。
为使人源HIV-1耐药基因片段(Pol-HIV(partial)片段，简写为pol)克隆到包装质粒psPAX2限制性酶切位点AgeI和ApaI之间，需要通过PCR和基因定点突变修饰质粒另外两位点的AgeI(7697位)和ApaI(863位)。
在本发明中，该HIV-1耐药基因片段的提取方式如下：
PCR扩增获得pol片段，其序列如SEQIDNo.5所示。
引物：OUT-F：GCAAGAGTTTTGGCTGAAGCAATGAG
OUT-R：CCTTGCCCCTGCTTCTGTATTTCTGC
IN-F：TGCAGGGCCCCTAGGAAAAAGGGCTG(ApaI)
IN-R：CACTCCATGTACCGGTTCTTTTAGAATCTC(AgeI)
模板为人体样本提取的RNA，第一轮反应条件：45℃逆转录30min，PCR94℃预变性2min，98℃变性10s，51℃退火15s，68℃延伸2min，循环30次；第二轮反应条件：98℃变性10s，51℃退火15s，68℃延伸2min，循环30次。
(2.1.1)利用长引物法PCR突变包装质粒psPAX2酶切位点AgeI
(2.1.1.1)PCR扩增突变包装质粒psPAX2酶切位点AgeI获得AgeI-1片段，其序列如SEQIDNo.1所示。
引物：AgeI-F:CGAAGAGCTCATCAGAACAGTCAGACTCATCAAGCTTCTCTATC(SacI)
AgeI-R:CTGCTAGCTATAGTTCTAGAGGTACGGTTGTTTCGAGCTTATAG(NheI)
加粗斜体T代表突变后的碱基，其原始碱基为C。模板为psPAX2(psPAX2为HIV-1野生株假病毒骨架质粒，GenBank编号：D86068.1)PCR条件：94℃预变性4min，94℃变性20s、55℃退火20s、72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸5min。
(2.1.1.2)回收突变后AgeI-1片段，插入PZeroBack/BluntVector(北京天根公司)，形成T-AgeI′质粒；将T-AgeI′质粒进行鉴定测序，正确即点突变成功；用SacI与NheI双酶切T-AgeI′质粒，即酶切突变成功的片段；将该酶切突变成功的片段连接至表达载体psPAX2，连接成功后，提取的质粒命名为psPAX2-1，其序列如SEQIDNo.2所示。
(2.1.2)利用定点突变试剂盒突变载体psPAX2-1酶切位点ApaI
(2.1.2.1)使用Agilent公司定点突变试剂盒对载体psPAX2-1进行定点突变，命名为psPAX2-2，其序列如SEQIDNo.3所示。
引物：M-ApaI-FGCCTTGAGGGGCCTCCGGGGACGGCCCTTTGTGCGGGG
M-ApaI-RCCCCGCACAAAGGGGCCGTCCCGGAGCCCCCTCAAGGC
模板为psPAX2-1，PCR条件：95℃预变性2min，95℃变性30sec，55℃退火1min，68℃延伸10min，循环18次。
(2.1.2.2)DpnI酶切扩增产物psPAX2-2；将酶切产物转化XL10-GOLD感受态细胞，质粒提取，命名为psPAX2-2′；
ApaI酶切质粒psPAX2-2′，挑取酶切鉴定正确的质粒，送英骏公司测序，并将测序结果正确的质粒命名为psPAX2m，其序列如SEQIDNo.4所示。
(2.2)psPAX2m-pol质粒构建
用ApaI和AgeI酶切pol片段回收并插入psPAX2m载体(psPAX2m用ApaI和AgeI切割)，构建为psPAX2m-pol质粒，用于重组慢病毒的生产。psPAX2m-pol质粒如图3所示，其序列如SEQIDNo.6所示。
(3)重组慢病毒的生产及其在不同细胞的应用
(3.1)将步骤(1)构建好的pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen转移质粒、步骤(2)构建好的psPAX2m-pol包装质粒与pMD2.G包膜质粒共转染293FT细胞或293T细胞后得到的包装体。本发明采用293FT细胞。转染前36h，铺细胞，75cm2细胞培养瓶，细胞总数为3×106个。当细胞汇合度达75％时，将总量为15μg的三质粒(2.8μg包膜质粒pMD2.G，5.2μg包装质粒psPAX2-Pol和7μg转移质粒pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen)和45μlX-tremeGENEHPDNA转染试剂(Roche，USA)一起置于1.5ml的Opti-MEM培养基中，室温静置15min，共转染293FT细胞。48h后倒置荧光显微镜下质粒共转染情况，结果如图4所示，证明重组慢病毒载体改造前后，转染特性未变。收集慢病毒上清，4℃3000rpm离心20min，用0.45μm滤器滤过，得到重组慢病毒。
(3.2)重组慢病毒活性与滴度测定
病毒滴度测定按照Ngai，S.C.等标准，得到的样本假病毒原液10倍稀释后，用50ul稀释后的病毒液感染十二孔板培养的293A细胞，60小时后，流式细胞仪检测每孔荧光百分比，计算慢病毒活性滴度。结果如图6所示，证明重组慢载体改造前后，病毒感染性未变。
(3.3)本发明的重组慢病毒在293A细胞中的应用
因psPAX2m中的pol基因来源于野生型的HIV-1，以psPAX2m，pMD2.G和pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen共转染293A细胞制备的重组慢病毒在表型耐药检测中作为野生型的HIV-1对照病毒。为了评价HIV-1抑制药物是否影响病毒感染和蛋白生产，齐多夫定(D4T)作为抗病毒药物代表，以优化检测条件。
(3.3.1)HIV药物司他夫定敏感性与细胞数目相关实验
铺板96孔板293A细胞，分5组，每组分别为10000、15000、20000、25000、与30000个/孔，当细胞汇合度达到80％时，按照每孔细胞数目计算MOI＝10时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定，将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中，加入到96孔293A细胞中。感染60小时后，检测每孔细胞荧光素酶基因表达情况。结果显示，细胞数目为1.5×104细胞/孔时，药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图5中的A图所示。
(3.3.2)HIV药物司他夫定敏感性与病毒MOI相关实验
铺板96孔板293A细胞，每孔20000个细胞，共设置10个实验组，当细胞汇合度达到80％时，计数每个实验组孔中的细胞数目，按照每孔细胞数目计算当MOI分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定，并将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液，加入到96孔293A细胞中。感染60小时后，检测每孔细胞荧光素酶基因表达活性。结果显示，MOI为10时，药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图5中的B图所示。
(3.3.3)HIV药物司他夫定敏感性与病毒感染时间相关实验
铺板96孔板293A细胞，分4组，每组20000个/孔，当细胞汇合度达到80％时，按照每孔细胞数目计算MOI＝10时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定，并将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液，加入到96孔293A细胞中。分别于病毒感染36、48、60、72小时后，检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示，感染时间为60小时时，药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图5中的C图所示。
(3.3.4)十二种抗病毒药物用于表型耐药检测的可重复性
通过测定12种抗病毒药物IC50的药物浓度来判断表型耐药检测的稳定性和可重复性。根据上述3个实验，确定了用于表型耐药检测时的细胞数目、MOI以及病毒感染时间。铺96孔板，当细胞汇合度达到80％时，按照每孔细胞数目计算MOI＝10时所需要的病毒液体积。与此同时，用DMEM完全培养液配制不同药物浓度的HIV药物，将配置好的药物与病毒混合液，加入到96孔293A细胞中。感染60小时后，检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示，除了2种药物(利匹韦林和依曲韦林)大部分药物都显示较高的重复性。结果如表1所示，其中，IC50，能够使ZsGreen阳性细胞减少50％的药物浓度；SD，标准差；CV，变异系数。
表1十种药物用于表型耐药检测的可重复性
(3.3.4)病人HIV-1毒株耐药相关的突变基因分析
HIV-1感染病人的特征(表2)，病人都是联合应用抗病毒药物，但所有的8名病人CD4细胞数低于400细胞/mm3，其中5人低于400细胞/mm3。HIV病毒载量在155～104000copies/ml之间。为了分析8名患者HIV-1毒株药物相关的突变，扩增了HIV-1的pol区基因，并进行了测序。基于此次研究涉及到的10种HIV抑制剂的基因型耐药数据，测到8名患者的HIV-1毒株突变(表3)，这表明所有的HIV-1毒株都存在基因型耐药，但不能预测它们对抗病毒药物的耐受水平。
表2临床样本的特性
表38名患者体内HIV-1毒株药物耐受相关的突变分析
注:该项研究中涉及到的5种核苷酸类抑制剂地达诺新、司他夫定、齐多夫定、恩曲他滨、硫酸阿巴卡韦和三种非核苷酸类抑制剂奈韦拉平、依曲韦林和利匹韦林及2种蛋白酶抑制剂奈非那韦和洛匹那韦的基因型药物耐药性在数据库可以查到。
(3.3.6)病人体内HIV-1毒株的表型耐药分析
8名患者的HIV-1样本用本发明中带有双报告基因的重组慢病毒系统进行表型耐药分析。野生型的慢病毒作为对照。病毒抑制率(％)＝(1-药物处理组的荧光素酶RLU/对照组的荧光素酶RLU)×100％。用非线性回归分析每个HIV-1毒株的IC50。HIV-1毒株对每种抑制剂的表型耐药程度用倍数变化(FC)来表示，即测试株的IC50/野生株的IC50。校正的用于表型耐药的分类标准：FC<3为敏感，FC＝3-6为低度耐药，FC＝6.01-10为中度耐药，FC>10为高度耐药[6,22,23]。表4呈现了6种6NRTIs(Didanosine，Stavudine，Zidovudine，Zalcitabine，Emtricitabine，AbacavirSulfate)，4NNRTIs(Nevirapine，Etravirine，Dapivirine，Rilpivirine)及2种PIs(NelfinavirandLopinavir)的表型耐药情况。Zalcitabine(DDC)和Dapivirine(DPV)两种药物在现有数据库中无基因型耐药情况分析。对10种药物的表型耐药与基因耐药结果进行分析，表明，大部分一致(表4)。例如，HIV-1毒株0022表型耐药分析对DDI和D4T两种药物敏感，但是基因型耐药分析显示为中度或高度耐药，毒株0312对ETR表型耐药分析为高度耐药，但基因型分析为低度耐药。
表4HIV-1毒株的基因型和表型耐药分析比较
注:DDI，地达诺新；D4T，司他夫定；AZT，齐多夫定；DDC，扎西他滨；FTC，恩曲他滨；ABC，硫酸阿巴卡韦；NVP，奈韦拉平；ETR，依曲韦林；DPV，达匹韦林；RPV，利匹韦林；NFV，奈非那韦；LPV，洛匹那韦。
(3.4)本发明重组慢病毒在TZM-B细胞中的应用
使用该重组慢病毒体系共转染TZM-B细胞，以评价HIV-1抑制药物是否影响病毒感染和蛋白生产，齐多夫定(D4T)作为抗病毒药物代表，以优化检测条件。
(3.4.1)HIV药物司他夫定敏感性与细胞数目相关实验
铺板96孔板TZM-B细胞，分5组，每组分别为10000、15000、20000、25000、与30000个/孔，当细胞汇合度达到80％时，按照每孔细胞数目计算MOI＝10时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定，将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中，加入到96孔TZM-B细胞中。感染60小时后，检测每孔细胞荧光素酶基因表达情况。结果显示，细胞数目为1.5×104细胞/孔时，药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图7中的A图所示。
(3.4.2)HIV药物司他夫定敏感性与病毒MOI相关实验
铺板96孔板TZM-B细胞，每孔20000个细胞，共设置10个实验组，当细胞汇合度达到80％时，计数每个实验组孔中的细胞数目，按照每孔细胞数目计算当MOI分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定，并将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液，加入到96孔TZM-B细胞中。感染60小时后，检测每孔细胞荧光素酶基因表达活性。结果显示，MOI为10时，药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图7中的B图所示。
(3.4.3)HIV药物司他夫定敏感性与病毒感染时间相关实验
铺板96孔板TZM-B细胞，分4组，每组20000个/孔，当细胞汇合度达到80％时，按照每孔细胞数目计算MOI＝10时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定，并将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液，加入到96孔TZM-B细胞中。分别于病毒感染36、48、60、72小时后，检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示，感染时间为60小时时，药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图7中的C图所示。
(3.4.4)十二种抗病毒药物用于表型耐药检测的可重复性
通过测定12种抗病毒药物IC50的药物浓度来判断表型耐药检测的稳定性和可重复性。根据上述3个实验，确定了用于表型耐药检测时的细胞数目、MOI以及病毒感染时间。铺96孔板，当细胞汇合度达到80％时，按照每孔细胞数目计算MOI＝10时所需要的病毒液体积。与此同时，用DMEM完全培养液配制不同药物浓度的HIV药物，将配置好的药物与病毒混合液，加入到96孔TZM-B细胞中。感染60小时后，检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示，除了2种药物(利匹韦林和依曲韦林)大部分药物都显示较高的重复性。结果如表5所示，其中，IC50，能够使ZsGreen阳性细胞减少50％的药物浓度；SD，标准差；CV，变异系数。
表5十种药物用于表型耐药检测的可重复性
(3.4.5)病人体内HIV-1毒株的表型耐药分析
8名患者的HIV-1样本用本发明中带有双报告基因的重组慢病毒系统进行表型耐药分析。野生型的慢病毒作为对照。病毒抑制率(％)＝(1-药物处理组的荧光素酶RLU/对照组的荧光素酶RLU)×100％。用非线性回归分析每个HIV-1毒株的IC50。HIV-1毒株对每种抑制剂的表型耐药程度用倍数变化(FC)来表示，即测试株的IC50/野生株的IC50。校正的用于表型耐药的分类标准：FC<3为敏感，FC＝3-6为低度耐药，FC＝6.01-10为中度耐药，FC>10为高度耐药[6,22,23]。表4呈现了6种6NRTIs(Didanosine，Stavudine，Zidovudine，Zalcitabine，Emtricitabine，AbacavirSulfate)，4NNRTIs(Nevirapine，Etravirine，Dapivirine，Rilpivirine)及2种PIs(NelfinavirandLopinavir)的表型耐药情况。Zalcitabine(DDC)和Dapivirine(DPV)两种药物在现有数据库中无基因型耐药情况分析。对10种药物的表型耐药与基因耐药结果进行分析，表明，大部分一致(表6)。例如，HIV-1毒株0022表型耐药分析对DDI和D4T两种药物敏感，但是基因型耐药分析显示为中度或高度耐药，毒株0312对ETR表型耐药分析为高度耐药，但基因型分析为低度耐药。
表6HIV-1毒株的基因型和表型耐药分析比较
(3.5)本发明重组慢病毒在huh7.5细胞中的应用
使用该重组慢病毒体系共转染huh7.5细胞，以评价HIV-1抑制药物是否影响病毒感染和蛋白生产，齐多夫定(D4T)作为抗病毒药物代表，以优化检测条件。
(3.5.1)HIV药物司他夫定敏感性与细胞数目相关实验
铺板96孔板huh7.5细胞，分5组，每组分别为10000、15000、20000、25000、与30000个/孔，当细胞汇合度达到80％时，按照每孔细胞数目计算MOI＝10时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定，将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中，加入到96孔huh7.5细胞中。感染60小时后，检测每孔细胞荧光素酶基因表达情况。结果显示，细胞数目为1.5×104细胞/孔时，药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图8中的A图所示。
(3.5.2)HIV药物司他夫定敏感性与病毒MOI相关实验
铺板96孔板huh7.5细胞，每孔20000个细胞，共设置10个实验组，当细胞汇合度达到80％时，计数每个实验组孔中的细胞数目，按照每孔细胞数目计算当MOI分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定，并将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液，加入到96孔huh7.5细胞中。感染60小时后，检测每孔细胞荧光素酶基因表达活性。结果显示，MOI为10时，药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图8中的B图所示。
(3.5.3)HIV药物司他夫定敏感性与病毒感染时间相关实验
铺板96孔板huh7.5细胞，分4组，每组20000个/孔，当细胞汇合度达到80％时，按照每孔细胞数目计算MOI＝10时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定，并将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液，加入到96孔huh7.5细胞中。分别于病毒感染36、48、60、72小时后，检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示，感染时间为60小时时，药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图8中的C图所示。
(3.5.4)十二种抗病毒药物用于表型耐药检测的可重复性
通过测定12种抗病毒药物IC50的药物浓度来判断表型耐药检测的稳定性和可重复性。根据上述3个实验，确定了用于表型耐药检测时的细胞数目、MOI以及病毒感染时间。铺96孔板，当细胞汇合度达到80％时，按照每孔细胞数目计算MOI＝10时所需要的病毒液体积。与此同时，用DMEM完全培养液配制不同药物浓度的HIV药物，将配置好的药物与病毒混合液，加入到96孔huh7.5细胞中。感染60小时后，检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示，除了2种药物(利匹韦林和依曲韦林)大部分药物都显示较高的重复性。结果如表7所示，其中，IC50，能够使ZsGreen阳性细胞减少50％的药物浓度；SD，标准差；CV，变异系数。
表7十种药物用于表型耐药检测的可重复性
(3.5.5)病人体内HIV-1毒株的表型耐药分析
8名患者的HIV-1样本用本发明中带有双报告基因的重组慢病毒系统进行表型耐药分析。野生型的慢病毒作为对照。病毒抑制率(％)＝(1-药物处理组的荧光素酶RLU/对照组的荧光素酶RLU)×100％。用非线性回归分析每个HIV-1毒株的IC50。HIV-1毒株对每种抑制剂的表型耐药程度用倍数变化(FC)来表示，即测试株的IC50/野生株的IC50。校正的用于表型耐药的分类标准：FC<3为敏感，FC＝3-6为低度耐药，FC＝6.01-10为中度耐药，FC>10为高度耐药[6,22,23]。表4呈现了6种6NRTIs(Didanosine，Stavudine，Zidovudine，Zalcitabine，Emtricitabine，AbacavirSulfate)，4NNRTIs(Nevirapine，Etravirine，Dapivirine，Rilpivirine)及2种PIs(NelfinavirandLopinavir)的表型耐药情况。Zalcitabine(DDC)和Dapivirine(DPV)两种药物在现有数据库中无基因型耐药情况分析。对10种药物的表型耐药与基因耐药结果进行分析，表明，大部分一致(表8)。例如，HIV-1毒株0022表型耐药分析对DDI和D4T两种药物敏感，但是基因型耐药分析显示为中度或高度耐药，毒株0312对ETR表型耐药分析为高度耐药，但基因型分析为低度耐药。
表8HIV-1毒株的基因型和表型耐药分析比较
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，该重组慢病毒是包装质粒、包膜质粒和转移质粒共转染293FT细胞或293T细胞后得到的包装体；其中，所述包装质粒为psPAX2m-pol质粒；所述转移质粒为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen质粒。
2.根据权利要求1所述的重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，其特征在于，所述转移质粒结构如图1所示。
3.根据权利要求1所述的重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，其特征在于，所述转移质粒的构建方法，包括以下步骤：使用BamHI和KpnI双酶切pMD2.G质粒，回收酶切产物，收取119bpCMV片段；将pHAGE-EF1α-IRES-ZsGreen质粒用BamHI和KpnI进行双酶切，回收4736bppHAGE-IRES-ZsGreen片段；将回收的CMV片段和pHAGE-IRES-ZsGreen用T4DNA连接酶进行连接，连接成功后，提取的质粒命名为pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒；使用NcoI和XbaI双酶切PGL3-PromoterVector，回收1906bpLuciferase片段，pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒用NcoI和XbaI双酶切，回收4855bp的片段，将该片段和Luciferase片段用T4DNA连接酶进行连接；连接成功后，提取的质粒即为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen。
4.根据权利要求1所述的重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，其特征在于，所述psPAX2m-pol质粒结构如图3所示。
5.根据权利要求1所述的重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，其特征在于，所述psPAX2m-pol质粒序列如SEQIDNo.6所示。
6.根据权利要求1所述的重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，其特征在于，所述psPAX2m-pol质粒的构建方法，包括以下步骤：
psPAX2载体重建：利用长引物法突变psPAX2载体的酶切位点AgeI，获得psPAX2-1载体；利用定点突变试剂盒突变psPAX2-1载体的酶切位点ApaI，获得psPAX2-2载体；DpnI酶切psPAX2-2载体，酶切产物转化XL10-GOLD感受态细胞，质粒提取，ApaI酶切该质粒，挑取酶切产物鉴定测序，获得psPAX2m载体，其序列如SEQIDNo.4所示；
psPAX2m-pol质粒构建：利用PCR扩增pol片段，其序列如SEQIDNo.5所示；用ApaI和AgeI酶切扩增后的pol片段回收并插入psPAX2m载体，得到psPAX2m-pol质粒，其序列如SEQIDNo.6所示。
7.根据权利要求6所述的重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，其特征在于，所述psPAX2-1载体的序列如SEQIDNo.2所示。
8.根据权利要求6所述的重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，其特征在于，所述psPAX2-2载体的序列如SEQIDNo.3所示。
9.根据权利要求6所述的重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，其特征在于，所述psPAX2m载体的序列如SEQIDNo.4所示。
10.根据权利要求6所述的重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用，其特征在于，所述长引物法突变psPAX2载体所用的引物为AgeI-F和AgeI-R，其中，
AgeI-F：CGAAGAGCTCATCAGAACAGTCAGACTCATCAAGCTTCTCTATC；
AgeI-R：CTGCTAGCTATAGTTCTAGAGGTATCGGTTGTTTCGAGCTTATAG；
模板为psPAX2，PCR条件：94℃预变性4min，94℃变性20s、55℃退火20s、72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸5min；
所述利用定点突变试剂盒突变psPAX2-1载体所用的引物为M-ApaI-F和M-ApaI-R；其中，
M-ApaI-F：GCCTTGAGGGGCCTCCGGGGACGGCCCTTTGTGCGGGG
M-ApaI-R：CCCCGCACAAAGGGGCCGTCCCGGAGCCCCCTCAAGGC；
模板为psPAX2-1，PCR条件：95℃预变性2min，95℃变性30sec，55℃退火1min，68℃延伸10min，循环18次。
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