CN109722465A - 一种hiv耐药检测载体和构建方法 - Google Patents
一种hiv耐药检测载体和构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109722465A CN109722465A CN201910012341.3A CN201910012341A CN109722465A CN 109722465 A CN109722465 A CN 109722465A CN 201910012341 A CN201910012341 A CN 201910012341A CN 109722465 A CN109722465 A CN 109722465A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- carrier
- drug resistance
- resistance detection
- gene
- hiv
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明HIV耐药检测载体，属于基因工程技术领域，构建方法包括：将载体pLWJ‑SV40‑Luc+与LacZ基因进行第一In‑fusion连接，得到载体pLWJ‑SV40‑Luc‑LacZ；将载体pLWJ‑SV40‑Luc‑LacZ与耐药检测基因进行第二In‑fusion连接，得到HIV耐药检测载体；所述耐药检测基因为受检样本中HIV病毒Gag‑Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因。采用本发明提供的HIV耐药检测载体可同时检测HIV‑1逆转录酶、蛋白酶和整合酶抑制剂在内的Gag‑Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因，能涵盖目前绝大多数艾滋病抗病毒治疗药物的主要作用靶点，实现高通量检测。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种HIV耐药检测载体和构建方法。
背景技术
随着艾滋病抗病毒治疗的广泛开展，HIV耐药的出现和重要性已成为日益关注的热点，亟须加以预防和控制。福建省于2005年启动免费抗病毒治疗工作，至2017年底全省已累计为10299个病人提供免费抗病毒治疗，耐药监测结果显示：福建省抗病毒治疗失败患者对NRTI、NNRTI和PI的耐药率分别是54.5％(72/132)、67.4％(89/132)、5.3％(7/132)。HIV耐药性已逐渐成为威胁抗病毒治疗可持续性发展的主要因素。国际AIDS协会已推荐将病毒耐药性检测纳入AIDS的临床管理中，并建议对新发感染者、抗病毒治疗失败的病人及孕妇感染者进行病毒耐药性检测。HIV耐药性检测是指导抗HIV临床管理和抗病毒治疗失败后重新制定治疗方案的主要技术手段；在临床治疗方面，耐药性检测结果能很好地指导用药，有效降低初始治疗失败的风险；制定良好规范，指导程序服药，是目前减少耐药产生的最有效方法。另外，耐药性检测对于控制HIV-1耐药株的流行传播，了解某一流行区域HIV-1的耐药性，具有重大的社会意义。
目前国际上发展较为成熟并且应用于临床的有基因型和表型耐药检测。基因型检测具有多种优点，如简便、快速、费用低，在HIV-1耐药性检测使用频率方面高于表型耐药性检测，但是基因型检测也存在一定局限性，如应用PCR方法只能扩增出患者体内的优势株，耐药突变位点之间的联合耐药效应与单独耐药突变位点的耐药效应具有较大差异等，因此基因型检测在判定和解释耐药结果方面具有一定局限。相对于基因型耐药检测，表型耐药检测可以更为准确直观地反映病毒对药物的敏感性，并能揭示事先存在或交叉的耐药情况,对于基因突变类型比较复杂、基因型结果解释不明了、多种治疗方案失败导致的多位点耐药性突变，新的可疑耐药突变位点的鉴定以及包括细胞在内新药的敏感性检测，这些表型检测的作用是基因检测所不可替代的。当然相对而言，表型检测也存在着繁琐、慢和高费用等缺点。
目前建立的HIV-1表型耐药检测方法主要有基于真病毒的表型耐药检测(包括传统病毒培养法和改良细胞法)和基于假病毒的表型耐药检测。前者必须在生物安全Ⅲ级实验室进行，这不利于大规模开展基础和应用研究。后者主要基于将反转录－PCR扩增的患者HIV-1蛋白酶(PR)和反转录酶(RT)区基因插入载体中，同时利用其他病毒的包膜糖蛋白而产生重组假病毒进行表型耐药检测。该方法只有单轮感染能力，不具有复制能力，方法的安全性较高，可以在生物安全II级实验室进行。随着HIV病毒亚型的增多以及新抗病毒药物的增加,特别是新耐药位点和多位点联合耐药病毒株的出现，对现有表型耐药性检测技术的应用提出了很大的挑战。表现在如下三个方面。
1.目前表型耐药检测范围主要是针对逆转录酶和蛋白酶主要酶活性区域。然而随着整合酶抑制剂、融合抑制剂等新药不断推广应用，针对新药的HIV耐药相关突变位点的出现将不可避免。此外，目前除了药物主要作用靶点检测到耐药突变外，还在HIV-1连接区、Gag区蛋白酶剪切位点处(p7/p1/p6)检测到耐药相关突变位点的存在。因此，有必要扩大耐药检测范围，尽可能涵盖对病毒所有酶区、所有药物靶点及其相互作用检测的要求。
2.先前建立的表型耐药检测方法主要采用酶切连接克隆，连接效率低，耗时较长，需要特定限制性酶切位点，应用上有所受限。因此，有必要探索利用新的高通量克隆技术应用于表型耐药检测，真正实现快速、高通量、无缝连接。
3.目前商品化试剂盒主要有3种:AntivirogramTM(Tibotec-Virco)、PhenoSenseTM(MonogramBiosciences)和Phenoscript(Viralliance)。与传统表型耐药检测相比，商品化试剂盒在很大程度上简化了检测步骤，提高了检测的可重复性，但并未明显地降低检测周期，检测成本也比较高。随着耐药检测的普及，有必要研制一种操作简便，高效稳定、具有自主知识产权的HIV-1表型耐药检测系统，为国产商品化的HIV-1表型检测试剂盒的研发提供技术支持。
高通量HIV-1表型耐药检测方法的建立至少应包括两个方面，一方面是基因克隆的高通量，另一方面是药物检测的高通量。近年来发展起来的高效克隆技术，由于它不依赖于酶切连接，克服了常规酶切连接法效率低下、载体自连程度高等因素的限制，尤其适用于较大基因片段的高效克隆。例如Gateway技术(Invitrogen)、In-fusion技术(Clontech)等。国内部分学者已建立了基于上述两种方法的表型耐药检测系统，如陈德喜等建立基于Gateway重组技术的包含LTR-Gag-Pol基因的HIV-1表型耐药检测方法，该方法可检测HIV-1逆转录酶、蛋白酶和整合酶抑制剂(Gag-Pol基因)。但由于其基于Gateway重组技术，中间需要特殊的入门载体，载体构建过程比较繁琐，而且在表达载体启动子和目的基因间需插入一段特定的噬菌体重组酶识别序列，对表达的影响不好估计。王佑春等建立基于In-fusion定向克隆技术的高通量HIV表型耐药检测方法。虽然与Gateway技术相比，In-fusion技术连接时只需要一步，在定向进化突变库构建应用中降低了多步骤连接带来的库容量与丰度的损失，而且不需对载体进行改造，适用于任何载体。但是该方法仅针对部分蛋白酶和逆转录酶基因(1479bp)，无法实现药物检测的高通量。因此，现有表型耐药性检测试剂盒存在耐药检测范围有限、检测效率低下等缺陷，为了解决这个问题，亟待研制一种操作简便、高效稳定、且尽可能涵盖HIV病毒所有酶区、所有药物靶点及其相互作用的高通量HIV-1表型检测试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种HIV耐药检测载体，采用本发明提供的载体可同时检测HIV-1逆转录酶和蛋白酶抑制剂在内的Gag-Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因，能涵盖目前绝大多数艾滋病抗病毒治疗药物的主要作用靶点，实现高通量检测。
本发明提供了一种HIV耐药检测载体，所述HIV耐药检测载体的构建方法，包括以下步骤：
1)将载体pLWJ-SV40-Luc+与LacZ基因进行第一In-fusion连接，得到载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ；
2)将所述步骤1)得到的载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ与耐药检测基因进行第二In-fusion连接，得到HIV耐药检测载体；
所述耐药检测基因为HIV病毒Gag-Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因。
优选的，所述步骤1)第一In-fusion连接使用的体系每10μL包括：5×In-fusion 2μL，浓度为30ng/μL的载体pLWJ-SV40-Luc+2.5μL，浓度为10ng/μL的LacZ基因1.5μL，ddH2O4μL。
优选的，所述步骤1)第一In-fusion连接的条件包括：所述连接的温度为45～55℃，所述连接的时间为10～20min。
优选的，所述步骤1)载体pLWJ-SV40-Luc+经过AgeI和AarI双酶切后再进行连接。
优选的，所述步骤1)LacZ基因扩增使用的体系每50μL包括：5×primer STAR GXLBuffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，GXL DNA Polymerase 1μL，浓度为20μM的5InLacZ引物1μL，浓度为20μM的3InLacZ引物1μL，浓度为0.1ng/μL的载体pUC195μL，ddH2O 28μL；
所述5InLacZ引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
所述3InLacZ引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
优选的，所述步骤1)LacZ基因扩增的程序包括：98℃2min；98℃10s，55℃15s，68℃30s，30个循环；68℃10min。
优选的，所述步骤2)第二In-fusion连接使用的体系每10μL包括：5×In-fusion 2μL，浓度为30ng/μL载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ 2.5μL，浓度为10ng/μL耐药检测基因1.5μL，ddH2O 4μL。
优选的，所述步骤2)第二In-fusion连接的条件包括：所述连接的温度为45～55℃，所述连接的时间为10～20min。
优选的，所述步骤2)载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ经过AgeI和AarI双酶切后再进行连接。
本发明还提供了上述技术方案所述的HIV耐药检测载体的构建方法，包括以下步骤：
1)将载体pLWJ-SV40-Luc+与LacZ基因进行第一In-fusion连接，得到载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ；
2)将所述步骤1)得到的载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ与耐药检测基因进行第二In-fusion连接，得到HIV耐药检测载体；
所述耐药检测基因为HIV病毒Gag-Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因。
本发明提供了一种HIV耐药检测载体，基于将反转录-PCR扩增的待检样本HIV-1Gag-Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因插入到HIV骨架质粒载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ中构建HIV耐药检测载体，与膜蛋白表达质粒VSV-G，共转染293T细胞，产生HIV重组假病毒，通过检测不同药物浓度作用下感染细胞中Luc荧光素表达水平来反映药物对病毒的抑制程度。所述载体可同时检测HIV-1逆转录酶和蛋白酶抑制剂在内的Gag-Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因，能涵盖目前绝大多数艾滋病抗病毒治疗药物的主要作用靶点，实现高通量检测。
附图说明
图1为Takara公司In-fusion技术操作示意图；
图2为质粒pLWJ-SV40-Luc-LacZ改造流程图；
图3为耐药检测扩增片段示意图；
图4为耐药检测载体(RTV)的构建图；
图5为表型耐药检测示意图；
图6为pUC-19质粒中扩增LacZ基因的结果；
图7为原骨架质粒pLWJ经Age I/AarI双酶切结果；
图8为通过蓝白斑筛选出正确插入LacZ基因的菌落；
图9为挑取蓝白斑后经双酶切鉴定结果，其中a为经双酶切的蓝斑质粒，b为未经双酶切的蓝斑质粒；构建的新骨架质粒，因载体和LacZ片段的分子量比为约10000:500，即1μg的质粒，双酶切后，仅47ng LacZ，所以凝胶电泳图较淡；
图10为DNA比对结果，其中第一行为质粒测序结果，第二行为pUC-19质粒中扩增的LacZ基因序列；
图11为表型耐药检测片段扩增，其中，1：15000marker 2：YYL 3：HXM 4：DLJ 5：XYQ6：CLM 7：ZZ 8：HJY 9：HYZ10：HJW 11：LQQ 12：ZKZ13：阴性对照；
图12为耐药检测载体的蓝白斑筛选鉴定；
图13为菌落PCR鉴定，其中，1：15000marker 2：YYL-1 3：YYL-2 4：YYL-3 5：YYL-46：YYL-5 7：YYL-6 8：YYL-7 9：YYL-8 10：YYL-9 11：YYL-10 12：YYL-1113：YYL-12 14：YYL-13 15：YYL-14 16：YYL-15 17：YYL-16 18：YYL-17 19：YYL-18 20：YYL-19 21：YYL-20 22：HXM-1 23：HXM-224：HXM-3 25：HXM-4；
图14为细胞接种浓度与Luc值之间关系。
具体实施方式
本发明提供了一种HIV耐药检测载体，所述HIV耐药检测载体的构建方法，包括以下步骤：
1)将载体pLWJ-SV40-Luc+与LacZ基因进行第一In-fusion连接，得到载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ；
2)将所述步骤1)得到的载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ与耐药检测基因进行第二In-fusion连接，得到HIV耐药检测载体；
所述耐药检测基因为HIV病毒Gag-Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因。
本发明还提供了上述技术方案所述的HIV耐药检测载体的构建方法，包括以下步骤：
1)将载体pLWJ-SV40-Luc+与LacZ基因进行第一In-fusion连接，得到载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ；
2)将所述步骤1)得到的载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ与耐药检测基因进行第二In-fusion连接，得到HIV耐药检测载体；
所述耐药检测基因为HIV病毒Gag-Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因。
本发明将载体pLWJ-SV40-Luc+与LacZ基因进行第一In-fusion连接，得到载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ。
本发明对所述载体pLWJ-SV40-Luc+的来源没有特殊限定，在本发明实施例中，所述载体pLWJ-SV40-Luc+优选以pLWJ-10+6-SV40-Luc为基础载体参照文献(Shou-li Wu,Yan-sheng Yan,Ping-ping Yan,Hai-long Huang,Hui-rong Wang.Construction andcharacterization of a full-length infectious clone from a fast replicating,X4-tropic HIV-1subtype Thai-B isolate.Archives ofvirology,2010 Dec,155(12):1923-1931.和Shouli Wu，Pingping Yan，Yansheng Yan，Lijun Qiu，Meirong Xie.Asingle-loop recombinant pseudotyped-virus-based assay to detect HIV-1phenotypic resistance.Archives ofvirology,2015Jun；160(6):1385-95.)公开的构建方法构建得到。
在本发明中，所述LacZ基因扩增使用的体系每50μL优选包括：5×primer STARGXL Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，GXL DNA Polymerase 1μL，浓度为20μM的5InLacZ引物1μL，浓度为20μM的3InLacZ引物1μL，浓度为0.1ng/μL的载体pUC195μL，ddH2O 28μL；所述5InLacZ引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述3InLacZ引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述5InLacZ引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：
GACTATGTAGACCGGTTTTACACTTTATGCTTCCGGCT，划线部分为与载体pUC-19两端15bp同源序列。
在本发明中，所述3InLacZ引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：
CACCTGCCATCTGTTCTATGCGGCATCAGAGCAG，划线部分为与载体pUC-19两端15bp同源序列。
在本发明中，所述5InLacZ引物和3InLacZ引物设计的思路优选为：所述引物是根据In-fusion无缝连接所需条件，即引物5’端与载体片段具有15-25bp同源序列，和pUC-19质粒包含LacZ启动子在内的基因片段序列设计而成。在本发明中，所述引物由上海铂尚生物技术有限公司合成。
在本发明中，所述LacZ基因扩增的程序优选包括：98℃2min；98℃10s，55℃15s，68℃30s，30个循环；68℃10min。
在本发明中，所述第一In-fusion连接使用的体系每10μL优选包括：5×In-fusion2μL，浓度为30ng/μL的载体pLWJ-SV40-Luc+2.5μL，浓度为10ng/μL的LacZ基因1.5μL，ddH2O4μL。
在本发明中，所述第一In-fusion连接的条件优选包括：所述连接的温度优选为45～55℃，更优选为50℃；所述连接的时间优选为10～20min，更优选为15min。
在本发明中，所述pLWJ-SV40-Luc+优选经过AgeI和AarI双酶切后再进行连接。
在本发明中，所述pLWJ-SV40-Luc+经AgeI和AarI双酶切使用的体系优选每50μL包括：10×Tango Buffer 5μL，10×Oligonucletide 0.5μL，AgeI 2μL，AarI 2μL，载体pLWJ-SV40-Luc+≤2.0μg，余量为ddH2O。
在本发明中，所述pLWJ-SV40-Luc+经AgeI和AarI双酶切的条件优选包括：37℃酶切8h，65℃下灭活20min。
本发明将所述载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ与耐药检测基因进行第二In-fusion连接，得到HIV耐药检测载体；所述耐药检测基因为HIV病毒Gag-Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因。
在本发明中，所述第二In-fusion连接使用的体系每10μL优选包括：5×In-fusion2μL，浓度为30ng/μL载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ 2.5μL，浓度为10ng/μL耐药检测基因1.5μL，ddH2O 4μL。
在本发明中，所述第二In-fusion连接的条件优选包括：所述连接的温度优选为45～55℃，更优选为50℃；所述连接的时间优选为10～20min，更优选为15min。
在本发明中，所述载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ优选经过AgeI和AarI双酶切后再进行连接。在本发明中，所述载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ经过AgeI和AarI双酶切的体系优选每50μL包括：10×Tango Buffer 5μL，10×Oligonucletide 0.5μL，AgeI 2μL，AarI 2μL，载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ≤2.0μg，余量为ddH2O。
在本发明中，所述载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ经过AgeI和AarI双酶切的条件优选包括：37℃下酶切8h，65℃下灭活20min。
在本发明中，所述耐药检测基因的获取方法优选包括：
提取HIV病毒RNA，将所述RNA反转录为cDNA；
以所述cDNA为模版，用Age I引物、A-run-1引物、A-run-2引物、ED8MR2引物、Vif-HB引物和Aar I引物进行巢式PCR扩增，得到耐药检测基因。
在本发明中，所述Age I引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，具体如下所示：
ACCCTTTAGAGACTATGTAGACCGGTTCTWTAAAACTYTMAGAG，下划线部分为与载体两端的20bp同源序列，斜体部分为Age I酶切位点；
所述A-run-1引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸系列，具体序列如下所示：
TCYTCTGGGGVTTGTTCCAT；
所述A-run-2引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：
TATGYTGRCACCCAATTCTGAAATG；
所述ED8MR2引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：
CACTTCTCCAATTGTCCCTCATATCTCC；
所述Vif-HB引物具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：
CCTTTTCTCCTGTCTGCAGACCCCAATATG；
所述Aar I引物具有SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：
GTCTACTTGCCACACAATCAKCACCTGCCATCTGTTTTC，下划线部分为为与载体两端的21bp同源序列，斜体部分为Aar I酶切位点。
在本发明中，所述的反转录(RT)使用的体系每20μL优选包括：5×AMV buffer4μL，dNTP(10mmol/L)2μL，Random primer(100nmol/L)0.5μL，RNA酶抑制剂0.5μL，AMV反转录酶1μL，RNA模板1μg,余量为无RNase水。反应条件：室温10min，42℃反转录1h，96℃5min，4℃保温。
在本发明中，所述巢式PCR扩增使用的体系每50μL优选包括：10×Buffer5μL，浓度为25mM的MgCl2溶液3μL，浓度为10mM的dNTP Mixture 1μL，浓度为20μM的upstream primer1μL，浓度为20μM的Downstream primer1μL，酶活浓度为5u/μl的Taq DNA聚合酶0.5μL，模板<500ng，去离子水补足50μL。
在本发明中，所述巢式PCR扩增的程序优选包括第一轮扩增和第二轮扩增：
所述第一轮扩增时以cDNA为模板，模板量约<500ng，扩增条件分别为：
(1)AgeI/Vif-HB：94℃3min；94℃30sec，57℃45sec，72℃4min，扩增30个循环；72℃7min；4℃保温；
(2)AgeI/A-run-1：94℃3min；94℃30sec，55℃45sec，72℃4min，扩增30个循环；72℃7min；4℃保温；
(3)AgeI/A-run-2：94℃3min；94℃30sec，52℃45sec，72℃5min，扩增30个循环；72℃7min；4℃保温；
(4)AgeI/DR8MR2：94℃3min；94℃30sec，52℃45sec，72℃6min，扩增30个循环；72℃7min；4℃保温，得到第一轮扩增产物。
第二轮扩增时以所述第一轮扩增产物为模板，模板量<500ng，引物为Age I/AarI，反应条件优选为94℃3min；94℃30sec，59℃45sec，72℃4min扩增35个循环；72℃7min；4℃保温，得到耐药检测基因。
在本发明中，所述耐药检测基因包括：Gag区p7-p1-p6protease cleavage sites，全长PR、RT、RNase及Integrase的1-280aa。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种HIV耐药检测载体和构建方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1材料与方法
1.1质粒和细胞
1.1.1 HIV骨架质粒pLWJ-SV40-Luc+的构建方法参照Shouli Wu，Pingping Yan，Yansheng Yan，Lijun Qiu，Meirong Xie.A single-loop recombinant pseudotyped-virus-based assay to detect HIV-1 phenotypic resistance.Archives of virology,2015Jun；160(6):1385-95.文献构建得到；膜蛋白表达质粒VSV-G，可表达水泡性口膜炎病毒G糖蛋白。
1.1.2 293T细胞，由转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制，可用含10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基进行培养。
1.1.3 pUC-19质粒，购自于TaKaRa公司。
1.2主要试剂见表1。
表1试剂种类
1.3 In-fusion无缝连接
In-fusion无缝连接技术，能够将单个或多个DNA片段快速定向克隆到任意载体中，其酶通过识别DNA片段和线性化载体末端15～25bp同源序列将DNA片段和线性化载体高效精确地融合在一起，能够克隆任意片段到任意载体中的任意位置，最终的重组载体不附加任何冗余或不需要的碱基序列(图1)。
1.4骨架质粒的改造
本研究选择改造的原骨架质粒pLWJ-10+6-SV40-Luc包含有HIV-1全基因组，其env基因区域插入了luciferases基因，不表达envelope蛋白。于细胞实验中将该质粒与VSV-G质粒共转染293T细胞，产生具有单轮感染性的HIV假病毒并用其感染新鲜293T细胞，通过检测感染后细胞的luciferases的表达值来判断其感染活性及活性大小。该HIV-1质粒载体蛋白酶及逆转录酶基因经斯坦福耐药数据库分析为B亚型，且不存在任何耐药性基因突变，对已知的各种类型抗病毒治疗药物均显示敏感。对HIV骨架载体序列进行全面分析,显示在Gag-Pol区约1678bp和5042bp处分别有AgeI和AarI单一酶切位点，经分析其能涵盖目前绝大多数艾滋病抗病毒治疗药物的主要作用靶点(RT、PR及integrase)及可能的酶活性相关区域如Gag以及Gag-Pol剪切位点。故将Gag-Pol区1678bp-5042bp之间的3364bp大小片段作为耐药检测区域。因AgeI和AarI在双酶切体系中效率分别为20％～50％和50％～100％，难以避免来自于本底pLWJ质粒的影响，故本研究拟从pUC-19质粒上PCR扩增出LacZ基因片段，替换目标检测区域，构建新的骨架质粒pLWJ-SV40-Luc-LacZ，利用蓝白斑筛选以排除在构建临床表型耐药检测质粒时来自本底的影响。
将HIV-1骨架载体pLWJ-SV40-Luc+经AgeI/AarI双酶切，通过In-fusion定向克隆连接将LacZ基因替换HIV骨架载体上相应酶切片段，构建耐药检测骨架载体(图2)。
1.4.1扩增LacZ基因的引物
所用引物是根据In-fusion无缝连接所需条件，即引物5’端与载体片段具有15～25bp同源序列，和pUC-19质粒包含LacZ启动子在内的基因片段序列设计而成(表2)，引物由上海铂尚生物技术有限公司合成。
表2基于In-fusion定向克隆技术设计扩增LacZ引物
注：下划线部分为与载体两端的15bp同源序列
1.4.2 PCR扩增LacZ基因
PCR反应体系(表3)如下，其中PCR所用酶为TaKaRa公司的primer STAR GXL DNAPolymerase，模板pUC-19质粒浓度为0.1ng/μl，模板量取5μl，反应条件为98℃，2min；98℃，10s，55℃，15s，68℃，30s，扩增30个循环；68℃，10min；4℃，保温。
表3 PCR扩增LacZ基因反应体系
1.4.3 PCR产物的纯化
将目的条带清晰且非特异性条带少的PCR产物，用QIAquick Gel Extraction Kit进行纯化，具体操作按试剂说明书进行。将回收产物鉴定浓度>50ng/ml和纯度OD260/OD280＝1.6-2.0，以达到测序要求。
1.4.4双酶切原骨架质粒pLWJ-SV40-Luc+
原骨架质粒上有AgeI和AarI单一酶切位点，应用双酶切将骨架切割(表4)。
表4原骨架质粒AgeI/AarI双酶切反应体系
1.4.5基于In-fusion无缝连接构建新骨架质粒
将双酶切后的骨架质粒与PCR扩增的LacZ基因片段进行In-fusion无缝连接(表5)。
表5构建新骨架质粒的反应体系
1.4.6新骨架质粒pLWJ-SV40-Luc-LacZ的鉴定
通过以下三种方法鉴定：
AgeI/AarI双酶切：是否切下428bp大小的LacZ片段；
测序：检测基因序列；
转化感受态细胞，置于含IPTG及X-gal的LB平板：蓝白斑筛选。
1.5病毒RNA的提取
采用QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒提取HIV病毒RNA。
1.6反转录cDNA的合成
以提取的病毒RNA为模板，进行反转录获得cDNA。
反转录(RT)为20μL反应体系包括：5×AMV buffer 4μL，dNTP(10mmol/L)2μL，Random primer(100nmol/L)0.5μL，RNA酶抑制剂0.5μL，AMV反转录酶1μL，RNA模板1μg,余量为无RNase水。反应条件：室温10min，42℃反转录1h，96℃5min，4℃保温。
1.7耐药检测片段的扩增
1.7.1耐药检测片段扩增所用引物
所用引物是根据HIV-1毒株不同亚型序列及In-fusion无缝连接所需15-25bp同源序列设计而成(表6)。其中，在5’端引物中引入Age I酶切位点，在3’端引物中引入Aar I酶切位点。引物由上海铂尚生物技术有限公司合成。
表6耐药检测片段扩增所用引物
注：下划线部分为与载体两端的15～25bp同源序列，斜体加粗部分为酶切位点
1.7.2耐药检测片段扩增示意图
Age I/Aar I引物扩增片段(共3364bp)包括：Gag区p7-p1-p6 protease cleavagesites，全长PR、RT、RNase及Integrase的1-280aa，扩增片段示意如下(图3)。
1.7.3巢式PCR扩增
PCR反应体系(表7)如下，其中第一轮扩增时以cDNA为模板，模板量约5μl，引物为AgeI/Vif-HB、A-run-1、A-run-2、DR8MR2，反应条件分别为：
AgeI/Vif-HB：94℃，3min；94℃，30sec，57℃，45sec，72℃，4min，扩增30个循环；72℃，7min；4℃保温。
AgeI/A-run-1：94℃，3min；94℃，30sec，55℃，45sec，72℃，4min，扩增30个循环；72℃，7min；4℃保温。
AgeI/A-run-2：94℃，3min；94℃，30sec，52℃，45sec，72℃，5min，扩增30个循环；72℃，7min；4℃保温。
AgeI/DR8MR2：94℃，3min；94℃，30sec，52℃，45sec，72℃，6min，扩增30个循环；72℃，7min；4℃保温。
第二轮扩增时以第一轮扩增产物为模板进行，模板量为5μl，引物为Age I/Aar I，反应条件为94℃，3min；94℃，30sec，59℃，45sec，72℃，4min扩增35个循环；72℃，7min；4℃保温。
表7 50μL PCR反应体系
1.7.4 PCR产物的纯化
将目的条带清晰且非特异性条带少的PCR产物，用QIAquick Gel ExtractionKit进行纯化，具体操作按试剂说明书进行。将回收产物鉴定浓度和纯度，以决定是否达到测序要求。
1.8耐药检测载体(RTV)的构建
将报告基因病毒载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ经相应的限制性内切酶(Age I/AarI)进行双酶切，酶切产物经纯化回收后，将载体与纯化后的耐药检测片段按一定比例用In-fusion无缝连接酶进行定向连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂板于已加入X-gal和IPTG的kan+抗性LB平板，次日挑取白色菌落进行菌落PCR。正确插入耐药检测片段的PCR结果应为包含3378bp检测区域大小的条带，将阳性克隆进行测序证实。主要构建流程(图4)如下。
1.8.1双酶切
骨架载体质粒用相应的AgeI/AarI进行双酶切，其反应体系(表8)如下，反应条件为：37℃酶切8h，65℃20min灭活酶。
表8 50μL双酶切反应体系
1.8.2回收、连接
将报告基因病毒骨架质粒载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ酶切产物用QIAEX II GelExtraction Kit进行胶回收纯化，具体操作按说明书进行。纯化后，将骨架质粒载体酶切产物与纯化后的耐药检测PCR片段进行In-fusion无缝连接，50℃15min，所加入的耐药检测片段与骨架质粒摩尔比在10～3:1之间，反应体系(表9)如下。
表9耐药检测载体构建体系
1.8.3转化
(1)取2-5μl连接产物加入50～100μl的DH5α感受态细胞中，混匀，冰浴30min；
(2)42℃热休克90sec，迅速置冰上1～2min；
(3)加800μl 37℃预温好的SOC培养基，置37℃，200rpm振荡培养1h；
(4)取200μl涂布LB平板(含Kan+50μg/ml，X-gal，IPTG)，37℃过夜培养，次日通过蓝白斑筛选挑取白斑作菌落PCR。
1.8.4质粒的提取
(1)挑取白色单克隆菌落于5ml LB kan+抗性培养基上，于37℃，200rpm培养12～16h。
(2)将菌液分三次置于1.5ml离心管中，12000g×1min，弃上清，收集菌体。
(3)加入250μlSolution Ⅰ/RNaseA，旋涡重悬。
(4)加入250μl Solution Ⅱ，轻轻上下颠倒数次，放置2min，至得到澄清裂解液，裂解时间不超过5min。
(5)加入350μlBuffer3轻轻上下颠倒直至出现白色絮状沉淀，13000g×10min，分离沉淀。
(6)将DNAMini Column放入2ml收集管中，取上清置于离心柱中。13000g×1min，弃废液。
(7)加入500μl HBC Buffer，13000g×1min，弃废液。
(8)加入700μl DNA Wash Buffer，13000g×1min，弃废液，重复一次。
(9)空管离心，13000g×1min，干燥离心柱。
(10)将离心柱置于1.5ml离心管中，且加入30-50μl Elution Buffer或ddH2O至离心柱正中膜上，室温静置1-3min，13000g×1min，-20℃保存。
1.8.5菌落PCR鉴定
(1)用10μl无菌枪头挑取单个菌落到0.2ml PCR管中，加入10μl无菌水，标记，盖紧。
(2)100℃煮沸5min，4℃冷却5min，反复一次，于PCR仪中操作。
(3)混匀后取5μl作为PCR扩增的DNA模板。
表10菌落PCR引物
表11菌落PCR体系
反应条件为94℃，3min；94℃，30s，52℃，45s，72℃，2min，扩增30个循环；72℃，10min；4℃，保温。
白色菌落经摇菌培养，提取质粒后，结果显示主要为三种质粒：正确插入耐药检测片段的RTV、未显蓝色的本底骨架和载体丢失部分片段后发生的载体自连。载体分析显示AgeI和AarI单一酶切位点在Gag-Pol区约1678bp和5042bp位置，于1678bp前端和5042bp后端设计特异性引物，若为成功插入耐药检测片段质粒，则为5000bp左右条带；若为未正常显蓝色的本底骨架，含LacZ，菌落PCR结果为2000bp左右条带；若为载体丢失部分片段后发生的载体自连，将扩增不出片段。PCR引物(表10)，体系(表11)。将菌落PCR阳性的菌落进行摇菌，次日提取质粒。
1.9耐药检测载体感染活性的鉴定
1.9.1质粒的定量
使用Series 500核酸蛋白分析仪(Beckman公司)进行质粒核酸浓度测定，具体操作按仪器说明书进行。
1.9.2假病毒的制备
采用脂质体转染法，按LipofectamineTM2000(invitrogen)转染试剂盒说明书进行体外转染293T细胞。挑取上述构建的耐药检测载体RTV(含有待检标本的耐药检测片段)不同克隆株分别和膜蛋白表达质粒VSV-G，按质量比2:1的比例共转染293T细胞，同时设HIV骨架质粒载体作为对照。转染质粒量依据转染细胞量而定。下面的转染过程在六孔板中进行的，所涉及的量是指六孔板中每一个孔所需要的量，若采用其他培养板则可根据比例做适当调整。
(1)转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。转染时，细胞要达到90～95％的融合；
(2)溶液A：240μl无血清培养基+10μl lipofectamine 2000per well(总体积250μl)，温育5min；
(3)溶液B：Xμl无血清培养基+4μg质粒perwell(总体积250μl)；
(4)将溶液A与溶液B混合，室温下置20min；
(5)与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入1.5ml无血清培养基；
(6)将步骤(4)中混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。于37℃，5％CO2中保温；
(7)5～6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％CO2中培养48～72h。假病毒分泌至上清中。用移液器尽量多地吸出细胞培养瓶或细胞培养板中的上清，经0.45μm滤器过滤或1000g离心10min取上清，向其中加入FBS使其终浓度为20％，转移入聚丙烯管中于-80℃保存备用或直接进行感染实验。
1.9.3假病毒感染活性的鉴定
将上述过滤的转染上清感染293T宿主细胞，于细胞培养箱中继续孵育48～72h后，收集感染细胞，利用Bright-Glo Luciferase Assay(Promega)试剂测定每孔感染细胞的萤光素酶(Luc+)的相对荧光单位。
萤光素酶检测试剂的配制：将萤光素酶检测缓冲液加入装有冻干萤光素酶检测底物的瓶中。冷冻前将其分装以避免萤光素酶检测试剂的的反复冻融；
细胞培养箱中取出96孔板，从上样孔中吸弃部分上清，留有100μl上清，将细胞从培养板上刮下；
用移液器从每孔中吸出100μl细胞液，加于对应96孔白板中，加入100μlBright-GLo荧光素酶检测试剂，反应2min，于化学发光仪读取萤光素酶的相对荧光单位(RLU)。
1.10表型耐药性检测
1.10.1转染和感染实验中细胞接种量的条件优化
细胞接种量对假病毒化学发光值Luc有一定的影响，最佳的细胞接种量应根据每个实验室的具体情况而定。将感染实验中加入的假病毒量定为未稀释的100μl每孔，通过改变转染及感染实验中加入的细胞量观察对Luc值的影响。用DMEM培养基分别将293T细胞浓度调至1×106/ml、5×105/ml、2.5×105/ml、1×105/ml，加入24孔板中，隔天进行转染实验，37℃，5％CO2培养48h，观察细胞状态，取100μl假病毒上清加入含100μl以下浓度1×106/ml、5×105/ml、2.5×105/ml、1×105/ml细胞量的96孔板中，37℃，5％CO2培养48h后，检测感染后细胞化学发光值，每个梯度包含3个复孔。
1.10.2核苷类和非核苷类反转录酶抑制剂的药物敏感性检测(图5)
(1)将鉴定有感染活性的耐药检测载体按上述方法进行转染试验，收集相应的假病毒；
(2)将药物按10×倍比稀释铺入96孔板中，终体积为50μl，其中用50μl DMEM培养基替代药物作为空白对照；
(3)每孔加入HIV-1假病毒100μl；
(4)用胰酶消化293T细胞，细胞计数，往上述96孔板中加入293T细胞50μl/孔，根据上述得到感染细胞浓度调整每孔细胞总量。将96孔板放入细胞培养箱中，37℃，5％CO2培养；
(5)感染48h后，每孔吸弃部分上清，剩余100μl上清将细胞从培养板上刮下；
(6)用移液器从每孔中吸出100μl细胞液，加于对应96孔白板中，加入100μlBright-GLoTM荧光素酶检测试剂，反应2min，于微孔板光度计读取萤光素酶的相对荧光单位(RLU)。
1.10.3蛋白酶抑制剂的药物敏感性检测(如图5)
(1)将各临床样本构建好的耐药检测载体按上述方法进行转染试验，转染6h后，弃上清，将药物按10×倍比稀释加入96孔板中，终体积为100μl，其中用100μl DMEM/F12培养基培养基替代药物作为空白对照；
(2)培养48～72h后取上清100μl感染新鲜的293T细胞，培养48～72h后，利用Bright-Glo Luciferase Assay试剂测定每孔细胞中相对荧光单位(RLU)。
1.11表型耐药检测的数据分析
表型耐药检测中得到是确切数据，为相对荧光单位(RLU)数值，可以定量分析药物半数抑制剂量(IC50)，所有药物浓度均转化为log10浓度值，每一浓度样品孔均计算平均RLU值，计算每一浓度样品萤光素酶抑制率，计算公式：
数据分析利用GraphPad Prism Software 5.01软件，采用非线性回归分析中剂量反应-抑制率来分析每个样本对每种药物的IC50值及药物抑制曲线。
2结果
2.1新骨架质粒的构建
本研究以质粒pLWJ-10+6-SV40-Luc为基础，拟引入LacZ基因。基于In-fusion无缝连接条件及pUC-19质粒的全序列设计扩增LacZ基因片段的引物5InLacZ、3InLacZ，该对引物扩增的片段大小约为460bp(图6)，其中包含了能够表达LacZ包括启动子在内的完整片段、两端具有能够与骨架酶切载体连接的15bp同源序列。对HIV骨架载体序列进行全面分析，显示在Gag-Pol区约1678bp和5042bp处分别有AgeI和AarI单一酶切位点，经序列分析显示其能涵盖目前绝大多数艾滋病抗病毒治疗药物的主要作用靶点，将质粒pLWJ10+6-SV40-Luc用AgeI和AarI进行双酶切(图7)。利用In-fusion无缝连接酶，将纯化后的LacZ扩增片段和pLWJ10+6-SV40-Luc骨架酶切载体连接起来，转化DH5α感受态细胞，利用蓝白斑筛选(图8)，挑取蓝色菌斑，需摇菌提质粒鉴定，通过双酶切显示能够切割下LacZ基因片段(图9)、经过测序(图10)确证LacZ基因已经正确于原骨架替换目标片段，新骨架质粒构建成功。
2.2 HIV-1耐药检测片段的扩增
本研究表型耐药片段扩增所用引物是根据不同的HIV-1亚型序列设计而成的，其中AgeI/AarI引物扩增片段总长度约为3364bp，用该表型耐药扩增引物共扩增了抗病毒治疗前后临床标本36份(治疗前6份和治疗后30份)，其临床治疗信息详见表(12)，最后得到的阳性扩增样本有30份，总扩增率为83％(30/36)，PCR扩增结果如图11。
表12临床样本扩增
2.3表型耐药检测载体的构建及其感染活性的鉴定
将获得的阳性耐药检测片段和经AgeI/AarI双酶切后的新HIV骨架质粒载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ进行凝胶电泳切胶纯化，后将产物通过In-fusion无缝连接将耐药检测片段替换骨架质粒载体上对应LacZ片段，构建相应的耐药检测载体RTV，分别以耐药检测样本的编号命名。通过蓝白斑筛选(图12)，各挑取10～20个白斑作菌落PCR鉴定(图13)，若PCR结果为5000bp大小的片段，则预示表型耐药检测载体构建成功，若PCR结果为2000bp大小的片段，则为显色不充分的本底骨架质粒，若PCR结果为阴性，则为载体发生自连。最后经测序证实有26例临床样本成功构建出表型耐药检测载体，成功构建率是86.7％(26/30)。将经过蓝白斑筛选及菌落PCR初筛预示构建成功的不同阳性克隆质粒与包膜质粒VSV-G通过脂质体转染进入293T细胞，产生假病毒感染新鲜293T细胞，确认各克隆的感染活性，结果显示有21例临床耐药样本表型耐药检测载体的感染活性实验结果为有感染活性。
2.4表型耐药检测载体的基因型耐药分析结果
具有感染活性的21例临床耐药检测样本的基因型耐药相关突变位点分析详见表13。本研究所关注的抗病毒治疗药物主要是目前福建省绝大部分病人服用的NRTIs(AZT、3TC、TDF)、NNRTIs(NVP、EFV)及PIs(LPV/r)6种药物，21份临床样本对这6种抗病毒治疗药物的基因型耐药解释结果详见表14。
表13 21份临床样本基因型耐药解释结果
2.5转染和感染实验的细胞接种量
细胞接种量对检测结果有一定的影响，细胞过密会改变细胞状态，降低假病毒的产生量及Luciferases基因的表达，在转染实验及感染实验的细胞浓度摸索结果，在转染实验中细胞浓度为5×105ml，感染实验中细胞浓度为2.5×105ml的条件下得到最佳实验条件，Luciferases表达值最高，如图14。
2.6基因型及表型耐药检测结果
将上述构建的具有感染活性的21例临床表型耐药检测载体进行药物敏感性实验，共计NRTIs(AZT、3TC、TDF)、NNRTIs(NVP、EFV)及PIs(LPV/r)6种药物，由于所构建的HIV骨架质粒pLWJ-SV40-Luc+对所有药物均敏感，故将其作为野生型参考株进行对照。最终表型耐药结果(表14)是将其IC50与野生株的进行比较，用IC50改变的倍增值(即FC值)来表示。
表14基因型与表型耐药结果
2.7 HIV-1表型耐药检测结果与基因型耐药解释结果的比较
本研究表型耐药结果判定原则为与野生株IC50相比，其FC值<4为敏感，>4倍为耐药。按照此判定原则，将表型耐药检测结果与基因型耐药解释结果进行比较(表15)，结果显示，在本次21例样本的表型耐药检测实验中6种药物检测结果与基因型耐药检测结果完全一致。
表15表型耐药检测结果与基因型分析结果的比较
注：第一行数据为基因型与表型结果都为耐药的数量；第二行数据为基因型与表型结果都为敏感的数量；第三行数据为基因型为耐药而表型结果为敏感的数量；第四行数据为基因型为敏感而表型结果为耐药的数量
由以上实施例可以得出，采用本发明提供的载体可同时检测HIV-1逆转录酶和蛋白酶抑制剂在内的Gag-Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因，能涵盖目前绝大多数艾滋病抗病毒治疗药物的主要作用靶点，实现高通量检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 福建省疾病预防控制中心（福建省健康教育促进中心、福建省卫生检验检测中心）
<120> 一种HIV耐药检测载体和构建方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gactatgtag accggtttta cactttatgc ttccggct 38
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacctgccat ctgttctatg cggcatcaga gcag 34
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accctttaga gactatgtag accggttctw taaaactytm agag 44
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcytctgggg vttgttccat 20
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tatgytgrca cccaattctg aaatg 25
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cacttctcca attgtccctc atatctcc 28
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccttttctcc tgtctgcaga ccccaatatg 30
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtctacttgc cacacaatca kcacctgcca tctgttttc 39
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agcgaaagtg agaccagagg 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttactaatgc tgctaatgcc aag 23
Claims (10)
1.一种HIV耐药检测载体，其特征在于，所述HIV耐药检测载体的构建方法，包括以下步骤：
1)将载体pLWJ-SV40-Luc+与LacZ基因进行第一In-fusion连接，得到载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ；
2)将所述步骤1)得到的载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ与耐药检测基因进行第二In-fusion连接，得到HIV耐药检测载体；
所述耐药检测基因为HIV病毒Gag-Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因。
2.根据权利要求1所述的HIV耐药检测载体，其特征在于，所述步骤1)第一In-fusion连接使用的体系每10μL包括：5×In-fusion2μL，浓度为30ng/μL的载体pLWJ-SV40-Luc+2.5μL，浓度为10ng/μL的LacZ基因1.5μL，ddH2O4μL。
3.根据权利要求2所述的HIV耐药检测载体，其特征在于，所述步骤1)第一In-fusion连接的条件包括：所述连接的温度为45～55℃，所述连接的时间为10～20min。
4.根据权利要求2所述的HIV耐药检测载体，其特征在于，所述步骤1)载体pLWJ-SV40-Luc+经过AgeI和AarI双酶切后再进行连接。
5.根据权利要求1所述的HIV耐药检测载体，其特征在于，所述步骤1)LacZ基因扩增使用的体系每50μL包括：5×primerSTARGXLBuffer10μL，dNTPMixture4μL，GXLDNAPolymerase1μL，浓度为20μM的5InLacZ引物1μL，浓度为20μM的3InLacZ引物1μL，浓度为0.1ng/μL的载体pUC195μL，ddH2O28μL；
所述5InLacZ引物具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；
所述3InLacZ引物具有SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1或5所述的HIV耐药检测载体，其特征在于，所述步骤1)LacZ基因扩增的程序包括：98℃2min；98℃10s，55℃15s，68℃30s，30个循环；68℃10min。
7.根据权利要求1所述的HIV耐药检测载体，其特征在于，所述步骤2)第二In-fusion连接使用的体系每10μL包括：5×In-fusion2μL，浓度为30ng/μL载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ2.5μL，浓度为10ng/μL耐药检测基因1.5μL，ddH2O4μL。
8.根据权利要求1或7所述的HIV耐药检测载体，其特征在于，所述步骤2)第二In-fusion连接的条件包括：所述连接的温度为45～55℃，所述连接的时间为10～20min。
9.根据权利要求7所述的HIV耐药检测载体，其特征在于，所述步骤2)载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ经过AgeI和AarI双酶切后再进行连接。
10.权利要求1～9任意一项所述的HIV耐药检测载体的构建方法，包括以下步骤：
1)将载体pLWJ-SV40-Luc+与LacZ基因进行第一In-fusion连接，得到载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ；
2)将所述步骤1)得到的载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ与耐药检测基因进行第二In-fusion连接，得到HIV耐药检测载体；
所述耐药检测基因为HIV病毒Gag-Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910012341.3A CN109722465B (zh) | 2019-01-07 | 2019-01-07 | 一种hiv耐药检测载体和构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910012341.3A CN109722465B (zh) | 2019-01-07 | 2019-01-07 | 一种hiv耐药检测载体和构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109722465A true CN109722465A (zh) | 2019-05-07 |
| CN109722465B CN109722465B (zh) | 2022-02-01 |
Family
ID=66298242
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910012341.3A Active CN109722465B (zh) | 2019-01-07 | 2019-01-07 | 一种hiv耐药检测载体和构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109722465B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110527745A (zh) * | 2019-07-17 | 2019-12-03 | 南京市第二医院 | 用于一次性hiv基因型耐药检测的简并引物组及其应用 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989009271A1 (en) * | 1988-03-21 | 1989-10-05 | Viagene, Inc. | Recombinant retroviruses |
| CN1038496A (zh) * | 1988-05-13 | 1990-01-03 | 西屋电气公司 | 透平轴的轴向负荷保护系统 |
| CN1263867C (zh) * | 1996-01-29 | 2006-07-12 | 病毒科学公司 | 用于确定抗病毒药物敏感性和抗性和筛选抗病毒药物的组合物和方法 |
| CN102199616A (zh) * | 2011-03-07 | 2011-09-28 | 首都医科大学附属北京佑安医院 | Hiv-1表型耐药检测载体及其构建方法 |
| CN102312004A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-01-11 | 张晓光 | 基因突变和hiv-1耐药突变位点检测方法及试剂盒 |
| CN102876714A (zh) * | 2011-09-07 | 2013-01-16 | 深圳市易瑞生物技术有限公司 | 用慢病毒检测hiv耐药表型 |
| US8932818B2 (en) * | 2008-08-13 | 2015-01-13 | Ptc Therapeutics, Inc. | Screening assays for compounds that modulate programmed ribosomal frameshifting |
| CN105648037A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-06-08 | 南方医科大学 | 一种重组慢病毒在hiv表型耐药检测中的应用 |
-
2019
- 2019-01-07 CN CN201910012341.3A patent/CN109722465B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989009271A1 (en) * | 1988-03-21 | 1989-10-05 | Viagene, Inc. | Recombinant retroviruses |
| CN1038496A (zh) * | 1988-05-13 | 1990-01-03 | 西屋电气公司 | 透平轴的轴向负荷保护系统 |
| CN1263867C (zh) * | 1996-01-29 | 2006-07-12 | 病毒科学公司 | 用于确定抗病毒药物敏感性和抗性和筛选抗病毒药物的组合物和方法 |
| US8932818B2 (en) * | 2008-08-13 | 2015-01-13 | Ptc Therapeutics, Inc. | Screening assays for compounds that modulate programmed ribosomal frameshifting |
| CN102199616A (zh) * | 2011-03-07 | 2011-09-28 | 首都医科大学附属北京佑安医院 | Hiv-1表型耐药检测载体及其构建方法 |
| CN102876714A (zh) * | 2011-09-07 | 2013-01-16 | 深圳市易瑞生物技术有限公司 | 用慢病毒检测hiv耐药表型 |
| CN102312004A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-01-11 | 张晓光 | 基因突变和hiv-1耐药突变位点检测方法及试剂盒 |
| CN105648037A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-06-08 | 南方医科大学 | 一种重组慢病毒在hiv表型耐药检测中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SHOULI WU等: "A single-loop recombinant pseudotyped-virus-based assay", 《ARCH VIROL》 * |
| 吴守丽等: "人类免疫缺陷病毒假病毒检测系统的构建", 《中国病毒病杂志》 * |
| 吴守丽等: "基于In-fusion技术的高通量HIV表型耐药检测系统的建立及应用研究", 《中国人兽共患病学报》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110527745A (zh) * | 2019-07-17 | 2019-12-03 | 南京市第二医院 | 用于一次性hiv基因型耐药检测的简并引物组及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109722465B (zh) | 2022-02-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111560354B (zh) | 重组新型冠状病毒及其制备方法和应用 | |
| Baranowski et al. | Cell recognition by foot-and-mouth disease virus that lacks the RGD integrin-binding motif: flexibility in aphthovirus receptor usage | |
| US6958211B2 (en) | Methods of assessing HIV integrase inhibitor therapy | |
| Meng et al. | SARS-CoV-2 Omicron spike mediated immune escape and tropism shift | |
| JPS61501431A (ja) | Ｈｔｌｖ−３のゲノムの分子クロ−ン | |
| WO2022160562A1 (zh) | 一种慢病毒滴度检测引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN108342362A (zh) | 一种用于扩增重组犬腺病毒cav2的稳定细胞系mdck及其构建方法 | |
| CN111910015A (zh) | 一种检测复制型慢病毒的探针、引物对、荧光定量pcr试剂盒及方法 | |
| CN108728492A (zh) | 一种基因突变和融合基因阳性参考品的制备方法 | |
| CN113186226B (zh) | Rna病毒核酸检测参照标准品及其用途 | |
| US7306901B2 (en) | Methods and means for assessing HIV envelope inhibitor therapy | |
| Heilmann et al. | SARS-CoV-2 3CLpro mutations confer resistance to Paxlovid (nirmatrelvir/ritonavir) in a VSV-based, non-gain-of-function system | |
| CN109722465A (zh) | 一种hiv耐药检测载体和构建方法 | |
| Safari et al. | Functional and structural segregation of overlapping helices in HIV-1 | |
| Esneau et al. | Rhinovirus structure, replication, and classification | |
| Xu et al. | Novel mutation of avian leukosis virus subgroup J from Tibetan chickens | |
| Qu et al. | Sequence analysis for the complete proviral genome of avian leukosis virus subgroup J associated with haemangiomas, leiomyosarcomas and myelomas in layer flocks | |
| Leath et al. | Developing novel lentiviral vectors into clinical products | |
| CN104846116B (zh) | 检测人类免疫缺陷病毒1型的pcr引物组、探针及其试剂盒和检测方法 | |
| CN104711240B (zh) | 禽呼肠孤病毒σA蛋白及其相关生物材料的应用 | |
| CN109971888A (zh) | 一种复制可控型流感病毒的检测方法 | |
| CN105483087B (zh) | 一种人支气管上皮细胞株hbe-tt | |
| CN104762274B (zh) | 禽呼肠孤病毒σNS蛋白及其相关生物材料的应用 | |
| Bernstein et al. | Presence and expression of Friend erythroleukemia virus-related sequences in normal and leukemic mouse tissues | |
| US10280405B2 (en) | Methods of propagating rhinovirus C in previously unsusceptible cell lines |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |