JPS61501431A - Ｈｔｌｖ−３のゲノムの分子クロ−ン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＴＬＶ−Ｉｆｆのゲノムの分子クローン関連する発明においてＨＴＬＹ−１１ ｔを検出０分離し、ＨＴ細胞株で不死化した。ＨＴＬＶ−瓜が後天性免疫不全症 候群（人ＩＤ８．エイズ）に関係して、いることが強く証拠づけられたので、こ のウィルスの産生を強め得ることおよびこのウィルスのＤＮＡ配列を決め得るこ とがエイズの治療法、あるいはエイズに対する薬剤を開発する上で決定的に重要 である。本発明は、ＨＴＩ、Ｖ−１ウイルスの完全なゲノムを分子クロー二／グ する方法を示すことにより、意味ある一歩となるものである。要約すれば、Ｈ９ ／ＨＴＬＶ−厘と名付けられたひとつの株によシ産生されるＨＴＬＶ−ｍウィル スの完全なゲノムの分子クローニングを開示している。非常に関連を持つがいく つかの制限酵素切断部位を異にするこのウィルスの二つのｍを同定してｈる。両 変株は１感染細胞株に組込まれた形および組込まれない形で存在する。二つの型 のＨＴＬＶ−逼の完全なゲノムを分子クローニングし、多クローン的に組込まれ たプロウィルスおよび組込まれなりウィルスＤＮＡとして長期間感染細胞株に存 在することを示している。これらのクローンを、種々のエイズ患者から採りたＨ ９／ＨＴＬＹ−１以外の細胞株における、およびエイズ患者の新鮮なリンパ様組 織におけるウィルス配列を検出するプローブとして使用し、更にこのクローン化 ゲノムがほとんどエイズの病原゛体の）ＩＴＬＶ−ｌから成っている証拠を与え ている。

有用性の記述 ＨＴＬＶ＃のウィルスについての従来の研究成果により三種の変株が認められた 。これらの内、ＨＴＬＶ−＃がエイズの病原体と信じられた。本発明によってつ くられたクロー　ｙ　ｆ　使イ、）（ＴＬＶ−ＩＩＩ　カＨＴＬＶ　−１オ上Ｕ 　ＨＴＬＶ−ｎと明らかに異ることが示され、この際、ＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ −亘は高す同一性を持っていて、このために血清中のエイズウィルスの同定が良 好にできた。

図面の説明 第１図はＨＴＬＶ−利の組込まれないＤＮＡのプザーンプロット（５ｏｕｔｈｅ ｒｎ　ｂｌｏｔ　）分析を表わす。４時間後に未消化ＤＮＡにはウィルスの配列 は検出できなかった。しかし、１０．１５．２４および４８時間で採取したもの Ｋは約１０　Ｋｂの長さのウィルスの主要な分子種が存在し、ウィルスの直線状 の組込まれない形を示している。いくつかの制限酵素で消化した１５時間後の試 料の代表的なナザーン　プロット（８ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　）を本図に示 す。方法：８Ｘ１０”個の新鮮で未感染Ｈ９細胞Ｋ　４　Ｘ　１０”粒子Ｏ）ｉ ＴＬｙ−ｍ　ｋ含ｔｒＭ！ｄ胞株Ｈｑ／ＨＴＬＶ−ＩＩＩ　ｏｌｌｋｍ上泄ｆｔ Ｘを感染させた。感染させた細胞を５個のローラーびんに分注し、４．１０．１ ５．２４および４８時間後に採取した。

低分子ｊｔＤＮＡをバー）（Ｈｉｒｔ）分画法を使って調製した。

未消化および消化ＤＮＡ３０μ２を１８チアガロース　グルテ分履、ニトロセル ロース紙に移し、１ｘＳ８Ｃ，４０−ホルムアミドおよび１０％硫酸デキストラ ン中、３７℃で２４時間、　ＨＴＬＶ−■ｃＤＮλｃＤＮＡとハイプリダイゼイ シ璽ンを行った。ｃＤＮＡはオリゴ（ｄＴ）グ２イマーの存在下に二にバンド化 処理した）ｉＴＬＹ−厘ウィルスから調製したポリ（人）選択ＲＮ人から合成し た。フィルターは１ｘＳＳＣＫよシロ５℃で洗浄した。

第２図は組込まれていないウィルスＤＮＡからクローン化した関連性の高い二つ のＨＴＬＹ−１変株の制限エンドヌクレアーゼ地図を表わす。三種０組換えクロ ーン（λＢＨ１０，λＢＨ５およびλＢＨ８）を分析し、その挿入（それぞれ９ Ｋｂ、　５．５ＫｂおよびＡ５Ｋｂ）ｔ−示した酵素によって地図をつくった。

これには太字とアステリスクで描かれた５個所の酵素部位で異っているＨＴＬＶ 　−１１［の二種の変株型が示されている。Ｓｓｔ　ｌはＨＴＬｖ−ｍのＬＴＲ を切断するので、三種のクローンはひとつのＬＴＲを持つ二つの全長のゲノムを 表わしている。ＬＴＲの全長は大体であるが、このウィルスゲノムの図式的地図 を図の下部に示す。方法＝１５および２４時間採取物から集めた低分子ＪｉＤＮ Ａ６１ｏ　−４０％　１ｉｅＷｉｔ　ａ度勾配テ分画した。画分の一部をα５チ アガロース　ゲルで電気泳動し、ニトロセルロース紙に移し、第１図に記載した 条件下にＨＴＬＶ　ｃＤＮＡとハイブリダイゼイシ璽ンを行った。ハイプリダイ ゼイショ／によシ示された組込まれない直線のＨＴＬＶ−ｆｌゲノムを含む一分 を集め、七のＤＮＡを次いでＳｓｔ　ｌ　′″ＣＣ消化λｆｔＷｅｓλＢのホス ファターゼ処理５ｓｔｌ枝部Ｋｇ合した。　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでパッケージング した後、組換え７アー　シｆ　ＨＴＬＶ−ＩＩｌｃＤＮＡ　Ｋよｐウィルス配列 をスクリーニングした。

第Ｓ　図ＦｉＮ＆染１ａ胞株Ｈ９／ＨＴＬＶ−１ｉｔＫおけるＨＴＬＶ−瓜つイ ルス配列ｔ−我わす、ＨＴＬＶ−厘の両変株型は感染細胞株の内でプロウィルス および組込まれないウィルスＤＮＡとして検出された。しかし、非感染Ｈ９ｉ胞 、非感染）ＩＴ細胞にも、正常ヒト胸腺（ＮＴ）にもウィルス配列は見い出せな かった。方法：高分子量ＤＮＡ１０μｔを示されたようＫ　ＩＩ限酵素で消化し 、第１図において記載したものと同じ条件下でＢＨｌｏのニック翻訳７アージ挿 入部とハイプリダイゼイン１ノを行った。

第４図はＨＴＬＶ詳の他の本ＯとＨＴＬＶ−１の配列の同一性ｔＮｂｆ、Ｈ’ｒ ＬＹ−ｊ、ＨＴＬＹ−１ｂおよび）ｉＴＬＶ−４の図式化した制限地図を描き、 相当するゲノム部分に関して生じ九７ラグメントの長さと位置を下に示す。ＬＴ Ｒ。

ｆａｔ、　ｐｏｐ、　ｅｎｖおよびｐＸ　ｉ分はＨＴＬＶ−１の公表されたヌク レオチド配列にしたがったスケールで描いた。厳密さの増加として最も高度に保 存されるバンドは）ｉＴＬＶ−ｉ（１，ｌ３ＫｂのＰｓｔｌ、ｙラグメント）お よび）ＩＴＬＶ−ｊＩｂ（！１ＫｂＰｓｔ１７ラグメント）の？ａｆ／ｐｏｊ９ 続部分（相当し、また重）合わない）ｉＴＬＹ　−１（２，ＩＫｂ　５ｒｎａＩ ／Ｂゴ■フラグメント）のｐｏｊ部分の３′部分に相当し、ＥｉＴＬＹ−１［に おけるものと同じゲノム組立てを推定させる。ＨＴＬＶ−１（２，ＩＫｂ　５ｓ ｔＩＰｓｔ　７　ラｆ）７　）　）　オＬ（ｉＨＴＬＶ−１ｂ（ｌ４Ｋｂ　Ｐｓ ｔ　７ラグメント）のｐＸＫ相当するフラグメントは保存されることが少いが、 元のオート２ジオグラム１（’Ｉ’ｍ−２８℃でまだ見ることができる。ＧａＬ Ｖ　ｆ消化すると６個の７ツグメントを生ずるが、そのいずれも中装置または高 度の厳密さでハイブリダイゼイン１ンを示さナイ。方法：プロトタイプＯＨＴＩ 、Ｙ−１，ＨＴＬ’Ｖ−１ｂ、　ＨＴＬＶ−１およびＧａＬＶ　（５ｅａｔｏ株 ）の全長を持つゲノムのサブクローンを下記の酵素で消化した。Ｐｓｔ　ｌとＳ 　ｓ　ｔ　ｌ　（ＨＴＬｖ−エおよびＨＴＬＶ　−１ｂ　）　、　ＢａｍＨＩ　 、！−５ｒｎａ　Ｉ　（ＨＴＬｖ−！Ｉ　）およびＨｉ　ｎｄ　ｌＩｌとＳｍａ ｉとＸｈｏ　ｌ　（ＧａＬＶ）　。４枚の複製フィルターを用意し、λＢＨ１０ のニック翻訳挿入と低紙密度で（８ｘ　Ｓａｃ、　２０　％ホルムアきド、１０ チ硫酸デキストラン、３７℃）５６時間ハイブリダイゼイシ璽ンを行った。次い でフィルターを異った温度、フィルター１ハ２２℃（Ｔｍ−７０℃）　、７　イ ”ター２は３７℃（Ｔｍ−５６℃）、フィルター３は５０℃（Ｔｍ−４２℃）お よび６ｓｃ（Ｔｍ−２８℃）で１ｘＳＳＣＫよシ洗浄した。

発　明 本発明は急性的に感染し九細胞において組込まれなＡプロウイルスの濃厩を高め た両分からＨＴＬＹ−厘の分子クローンを製造する方法に関する。ＨＴＩｖ−瓜 ゲツムのための三種のクローンを、組込まれないウィルスＤＮＡを分離し、同定 し、適当な制限＃素を使りてこのＤＮＡ　ｔ−切断し、ウィルスｃＤＮＡＫより てスクリーニングされ得る７アージライブラリーを構築することＫよる組換えＤ Ｎ人技術ｔ−便って製造した。この方法によシ三種のクローンが製造できた：完 全なＨＴＬＶ−Ｉｉ１ゲノムに相当する９゜ＯＫｂのウィルス挿入を含むＢＨ１ ０；　Ｌ５Ｋｂの挿入を含むクローンＢＨ８；および１５Ｋｂのウィルス挿入を 含むクローンＢ）１５゜これら三種のクローン間の差を図示した第３図を参照。

一般に、ＨＴＬＶ−１１のクローニングには、濃縮したＨＴＬＶ−ｍウィルスｔ −Ｈ９細胞に感染後、組込まれないウィルスＤＮＡを分離すること、および２ム ダ７アージ　ライブラリーでこのＤＮＡをクローニングしてウィルスｃＤＮＡで スクリーニングすることが含まれる。細胞株Ｈ９／）ｉＴＬＹ　−ｍ　ｎ、多ｉ のＨＴＬＶ−Ｉ［１ウイ＃スを産生ｔ、、エイズ血清中のウィルス特異抗原およ び抗体を検出するために使用する免疫的分析用の主要な産生細胞株として働く。

Ｈ９／ＨＴＬＹ−１１細胞（感染細胞）を培養し、細胞を集・め、次いで新たに 感染したｉＥＪ胞から低分子量ＤＮＡを抽出する。これによシ組込まれないウィ ルスＤＮＡが得られる。ｃＤＮＡライブラリーをＨＴＬＶ−１［ｃＤＮＡ　ｔ− 使ってつくる。次いで、このｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを組込まれていないウィルスＤＮＡ 分析のためのグローブとして使用する。次に組込まれていない直１ｉｊＡＤＮ人 （プロウィルスＤＮＡ）ｉｉるが、これは全ＨＴＬＶ−厖ゲツムを含み、すなわ ち組換え能を持つ。次いでこのＤＮＡを消化し、プ之スミドラムダ１１Ｗａｓ　 −−ｙムダＢＫ入れラムダＢＨＩＯクローンを形成させる。他のクローンはＨＴ Ｌｖ−１ｌｌゲノム全体は含んでいないグロウイルスＤＮＡ′ｔ−消化すること によりてつくる。

上記の方法の内のふたつの要素が組換えＤＮＡ法で、すなわちＤＮＡライブラリ ーとｃＤＮＤＮＡ−ブである。ライブ）！ｊ−ａ、ｈ９／ＨＴＬＹ−Ｉ［Ｊｔｆ ｌｊｌｌ−ラ全ＤＮｈｔ−取り、適当な制限酵素を使ってそのＤＮＡを７２グメ ン）Ｋ切断し、放射標識したｃＤＮＤＮＡ−ブとその７，９グメントとをノ・イ ブリダイゼイシ璽ンを行い、７ツグメントをプラスミドベクターに接続し、次い でこの組換えＤＮＡを適当な宿主に導入するととＫよりてつくられる。

ｃＤＮＤＮＡ−ブは二度ノ（ンド化処理したＨ’ｌ’ＬＶ−１ｍＲＮ人からツく ったＨＴＬＶ−ＤＩｃＤＮ人グローラグローブ短いオリゴｄＴ鎖をｍ几Ｎ人鎖０ ポリ人尾部とＩ・イブリダイゼイ７璽／ｌ−行う、オリゴＴセグメ／トが逆転写 ５＃素作用のプライマーとして働く。この酵素は相補ＤＮＡ鎖合成のための鋳型 としてｍＲＮ人を使用する。得られＩｃＤＮＡは末端がヘアピンルーズ状である ０ｍ几ＮＡ鎖をＮａＯＨ処理によシーに分解すると、ヘアピンループはＤＮＡボ リメ之−ゼＩのプライマーとなプ、対になったＤＮＡ鎖を完結させる。次いでル ープをＳＩヌクレアーゼで切断して二重ｇｃＤＮ人分子全分子。次にＤＮＡリガ ーゼを使用することによシ、この二重ｉｌｌ　ＣＤＮＡ　Ｋリンカ−を加える。

リンカ−を制限＃素により切シ開いた後に、ｐＢＲ３２２のような、同じ酵素で 切断した適当なプラスミドにこのｃＤＮＡを挿入する。得られたものがｃＤＮ人 含有組換えグラスミドである。

答託の陳述 本発明の細胞株とクローンは、特許の有効期間中一般への制限なしＫＷ託が永続 されていることに関してパテント　アンド　トレードマーり　オフィス（Ｐａｔ ｅｎｔ　ａｎｄＴｒ鳳ｄｅｍａｒｋ　０ｆｆｉｃｅ　）によシ決められたように アメリカンタイプ　カルチャー　コレクシ璽ン（ＡｍｅｒｉｃＪ＋ｎ　Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔムｏｎ））（寄託されている。

詳細な説明 Ｈ９／ＨＴＬＹ−１からの濃縮ウィルスを使い、新鮮な非感染Ｈ９＃ｌ胞に５Ｇ ウィルス粒子／細胞の割合で感染させる；培養物から４．１０．１５．２４およ び４８時間後に細胞を集める。染色体外ＤＮＡ　ｔ−バー）（Ｈｉｒｔ）の方法 によって抽出し、ＨＴＬＶ　−１［ｃＤＮＡ　ｔ−グは−ブとして使って組込ま れていないウィルスＤＮＡの量を分析する。このｃＤＮＡはオリゴ（ｄＴ）Ｋよ りてプライマーをっけ、庶塘密度勾配で温度バンド形成させたウィルス粒子から のポリ（人）含有几ＮＡから転写した。組込まれない直線ウィルスＤＮＡは１０ 時間後に初めて検出され、以降の時点でも存在する。１５時間で採取したものの サザーン　プロブ）　（５ｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ　）を第１図に示す。未消化 ＤＮＡ　Ｋおける約１０　Ｋｂのバンドは組込まれていない組換ｉ、能のあるＨ ＴＬｖ−１ｉ１ｆ）　直Ｍｍ’ｆｃ示ｆ。１０．１５オ！ヒ２４時ｒｓＱ採取物 には閉じた、または切れ目を持つ環状ＤＮＡは検出できなかったが、４８時間採 取物には両型が少量認められた（データは示していなｌＡ）。ウィルスゲノムｔ −Ｘｂａｌで切っていないが、８ｓｔ　ｌでは９Ｋｂ、　ａ５Ｋｂ　＞よび五５ Ｋｂの主要な５個のバンドが生じた（第１図）。これらのバンドは二つの型のＨ ＴＬＶ−瓜の完全なゲノムを表わし、両方共にＳｓｔ　ｌによ？）ＬＴＲで切断 され、一方はそのゲノムの中火に更ＫＳｓｔ１部位を持つ。りｃｙ　−：／　Ｂ Ｈｌｏ　Ｆｉｑ、。

Ｋｂのウィルス挿入全台み、これは完全なＨＴＬＶ−逼グツムに一致する大きさ である。クローンＢＨＩ３およびＢＨ５Ｆｉそれぞれ５５Ｋｂとｘ５Ｋｂの挿入 を含み、ＢＨ５の二三の制限酵素部位多形性を除き、これらは共にＢＨｌｏと完 全く重ナル。シｆｃｙｂＫ−ｚテ、Ｂ）１１０とＢＨＩ３　オｊ　ヒＢＨ５ｄ　 ＨＴＬＶ−瓜の二つの変株を表わしている。

元の細胞株にこれら二種の変株が存在することを示すために、ニック翻訳したラ ムダＢｕｂｏの挿入をいくつかの制限＃素で消化したＨ９／）（ＴＬＶ−ＩＮゲ ノムｃＤＮ人のサザーン　プロット（５ｏｕｔｈｅｒａ　ｂｌｏｔ　）とハイプ リダイゼイシ璽ンを行った（第３図）。期待されたρＯＫｂ、五５Ｋｂおよび五 ５Ｋｂの３個のバンドを生成する酵素Ｓｓｔ　ｌを使って両型を検出することが できた。プロウィルスを切断しないＸｂａｌはプロウィルスの多クローン組込み を表わす高分子量ゲノム、および消化されていない最初の標品にも同一バンドが 存在することから組込まれていな−ウイルスＤＮＡを表わすものと解釈され得る 約１０　Ｋｂのバンドを生成する（第１図）。これは消化されていない細胞ＤＮ 人のサザーン　ブＣＸｙト（５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　）　ｚｓイプリダイ ゼイシ璽ンによって確認され次、シたがって、組込まｎていないライ・ルスＤＮ 人が存在するということから、最初および全＆ｆｉ胞ＤＮＡ標品の両方に見られ る４Ｋｂおよび４５Ｋｂ　Ｅｃｏ几夏フラグメントの存在を説明できる（第１図 および第３図ン。Ｂ２澹およびＨｉｎｄ瓜は両方ともＩ、ＴＲを切断し、期待さ れる内側のバンドが生じた。内側のバンドに加えて、Ｈｉｎｄ［消化物中おるい くつかの薄めバンドは、欠陥プロウィルスかまたは）ｉｆ　ａｄ　Ｉｌｌ制限パ ターンで差異を持つもうひとつの変株を表わす。非感染Ｈ？Ｍｉ胞株および非感 染の母株ＨＴ、更には正常ヒト胸腺にＨＴＬＶ−１ｉｔ配列が存在しないことは 、ＨＴＬＹ−［１は外来性のものであシ、またウィルスがいかなるヒト細胞配列 をも含んでいないことを示している。同じ結果がラムダＢＨ５およびラムダＢＨ １１からのニック翻訳挿入を使りて得られた。

実施例２ １　ａ−ｙ化ＨＴＬＹ−ＬＨ’ｌ／　ムＫ　ヨｐ　ＨＴＬＹ−ＩＩＩ、　ＨＴＬ Ｖ　−１および）ｉＴＬＶ−１間の配列の同一性を示し得るかどうカを杆（ｉｆ ｆｉＬり。ＨＴＬＹ−１，ＨＴＬＶ−１ｂ、　ＨＴＬＶ−１オＺ　ヒ対照として のＧＡＬ”／の完全なゲノムを表わす制＠′＃素消化クローンの複製サザーン　 プＯｙト（５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　）を全長のＨＴＬＹ−１１１グローブ と緩和条件下でハイプリダイゼイ７璽ンを行った。次に）（ＴＬＹ−１１とこれ らのウィルスとの同一性の程度を調べるために低、中および高度の敵密さの条件 下で洗浄した（λＢＨ１０ｉ）　（第４図）。

コＯ実ＭカラＨＴＬＹ−１！、　）ｉＴＬＹ−１，）ＩＴＬＹ−１ｂ　＞　！　 ヒ）ＩＴＬＶ−１の間には特異的な同一性がある２５ｊ％）ｉＴＩ、Ｖ−臘とＧ ＡＬＶＫついてはないことがわかった。ここに示されたように％）ＩＴＬＹ−厘 と他のＨＴＬＶ群のものとのハイプリダイゼイシ■ンＦｉ−４２℃および一２８ ℃の値で検出され、この条件下ではＧＡＬＹとのハイプリダイゼイシ冒ンは見ら れなかった（第４図、パネルＣおよびＤ）、註について、最大の同一性を示す制 限７２グメントは、ＨＴＬＹ　−１ＯＰ　ａｔ／’ｐＯＪ　部分、オヨＱ：　Ｈ ＴＬＶ　−ＨｔＤ　ｐｏＪ部分の見かけ上型なり合わない部分く相当している（ ゲノム配置がＨＴＬＶ−１のものに類似していると推定）。

更に解析することＫよｌ）、ｆａｆの５′側の半分、およびｆａｆとｐｏｊの間 のギャップがＨＴＬ”ｉ’ｉで最も同一性を持つことがわかった。ｉ後に、　Ｈ ＴＩ、Ｖ−１ｂ　（ＨＴＬＶ−１（０９株）において、元のオートラジオグラム 上で、ｐＸ部分（Ｌ４Ｋｂ　Ｐｓｔ７うｆ）７）　）　お！びＨＴＬＶ−１Ｏ相 ”ｋするＰＸ７ラグメント（２，Ｉ　Ｋｂ　Ｐｓｉ／Ｓｓｔ　）とのハイプリダ イゼイシ叢ンを認めることができた。

実施例３ 第２図はλＢＨ１０，λＢＨ５およびＡＢＨａと名付けられ、大きさが第１図に 示す三種のＳｓｔ　ｌフラグメントに相当する三種クローンの制限Ｓ図を表わす 。これら地図の比較から、λＢＨ５とＡＢＨａを加えたものが１個のＨＴＬＶ− １１ゲノムを購成し、λＢＨ１０がもうひとつｔ−揖成していることが示唆され る。二種のウィルスの型は内側のＳｓｔ１部位を含め２１の地図化された９２部 位の内の只３個が異るだけでちる。期待されたように、λＢ）１５および１ＢＨ ８のファージ挿入は、ナザーン　プロット（５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　）ハ イプリダイゼイ７冒ンおよび電子顕微鏡へテロデ為７・レックス分析で分析した 所、高紙密度条件下でλＢＨＩσとハイブリダイゼイシ璽ンを行うが、たがいＫ は行なはな一、クローン中のＬＴＲ配列の存在を示し、またその方向性を決める ために、ｃＤＮ人クローン（ＣＩ５）ｔプローグとして使用し、これはＵ３およ び几配列を含んでいた。このクローンはλＢＨ１０およびλＢ）４１３のａｓＫ ｂ　ＢＰｍ　７ラグメントと強くハイプリダイゼイシ璽ンを行い、この方向が３ ′でちゃ、また、λＢＨ５およびλＢＨＩのα７Ｋｂ　Ｓｓｔ　ｌ／Ｐｓｔ　ｌ 　７ラグ）１７トとわずかに′ハイプリダイゼイシ璽ンを行匹、この方向が５′ で６るｅとｔ示Ｌ、Ｓｓｔ　ＩｄＨＴＬｖ−ｍＯＬＴ几を几部分で切断すること を示した。

実施例４ 元の細胞株にＨＴＬＶ−１１１の二種の変株型が存在することを、λＢＨ１０の 放射標臓挿入といくつかの制限酵素によって消化したＨ９／ＨＴＬＹ−瓜ゲツム ＤＮ人のサザーンプロット（８ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　）とハイプリダイゼ イシ璽ンを行うことによって示した（第３図）。期待される？Ｋｂ。

５、５　Ｋｂおよび１５Ｋｂの長さの３個のバンドを生ずる酵素Ｓｓｔ　ｌを使 ってこの型を検出した。これらはＨ９，メＨＴＬＶ−■ゲノムライブラリーから の側面を見せる細胞の配列といっしょにクローン化されたので、これら両型も組 込まれたプロウィルスとして存在する。丈に、グロウイルス全切断しないＸｂａ ｌは、プロウィルスの多クローン性組込みを表わす高分子量染色帯、および組込 まれていないウィルスＤＮＡを表わす約１０　Ｋｂのバンドを生成した。

組込まれて−ないウィルスＤＮＡが存在することＫよシ、バー１−（Ｈｉｒｔ） および全細胞ＤＮＡ標品中に４　Ｋｂおよび４．５Ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメ／ トが見られることも説明できる（　第１図オｘ　□：　第ｓ図）、Ｂｌｊｌｌお よび１（ｉｎｄ［は共にＬＴ几を切断して期待された内側のバンドを生ずる。

Ｈｉｎｄｌを使った時に内側のバンドに加えて存在するいくつかの弱いバンドは 欠陥プロウィルスまたは複製数の少いもうひとつの変株型を表わす。非感染Ｈ９ 細胞株および非感染母細胞株ＨＴ、更に正常ヒト胸腺のＤＮＡ　Ｋ　ＨＴＬＶ− ■配列が無いことはＨＴＬＹ−Ｉｌｌが外来性であることを強く示し、またウィ ルスがヒト細胞の配列を含んでいないことを示している。グローブ挿入としてλ ＢＨ５およびλＢＨａを使って同じ結果が得られた。

ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ Ｈ！ＩＨＴ１．、Ｖ、ｌ１１　８９　８’ｒ　Ｎ’ｒＦＩＧ、４ 国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．完全なＨＴＬＶ−ＩＩＩゲノムを含むことを特徴とする組換えクローンＢＨ １０。
2. ２．ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスからの５．５Ｋｂアイルス挿入を含むことを特徴 とする組換えクローンＢＨ８。
3. ３．ＨＴＬＶ−ＩＩＩからの３．５Ｋｂウイルス挿入を含むことを特徴とする組 換えクローンＢＨ５。
4. ４．ＨＴＬＶ−ＩＩＩ細胞からの組込まれていないウイルスＤＮＡを制限酵素を 使つて切断してプロウイルスを得て、放射標識ｃＤＮＡと上記プロウイルスとの ハイプリタイゼイションを行い、このウイルスを消化して適当なプラスミド中に 入れることから本質的に成るＨＴＬＶ−ＩＩＩの組換え分子クローンの製造法。
5. ５．Ｈ９／ＨＴＬＶ−ＩＩＩ細胞から全細胞ｍＲＮＡを分離すること； 上記ｍＲＮＡから二重鎖ｃＤＮＡをつくり、このｃＤＮＡをフアージラムダ中に 挿入して組換えＤＮＡ分子をつくること； 上記組換えＤＮＡ分子と放射標識プローブとハイブリダイゼイションを行うこと ； 上記分子からｃＤＮＡを放し、このｃＤＮＡを適当なプラスミド中に挿入するこ と；および 上記プラスミドをＨＴＬＶ−ＩＩＩＤＮＡ配列を表現可能な適当な宿主に移入す ること から本質的に成るＨＴＬＶ−ＩＩＩのｃＤＮＡ配列を分子クローニングおよび表 現する方法。
6. ６．プラスミドが■ＢＨ１０である請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．プラスミドが■ＢＨ８でわる請求の範囲第５項記載の方法。
8. ８．プラスミドが■ＢＨ５である請求の範囲第５項記載の方法。
9. ９．ｃＤＮＡ配列が９．０Ｋｂ配列に相当する請求の範囲第５項記載の方法。
10. １０．ｃＤＮＡ配列が５．５Ｋｂ配列に相当する請求の範囲第５項記載の方法。
11. １１．ｃＤＮＡ配列が３．５Ｋｂ配列に相当する請求の範囲第５項記載の方法。