JPS63500353A - ヒトｔリンパ球指向性ウイルス３からのｓｏｒ遺伝子生産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒ）Ｔす／パ球指向性ウィルス履からのＳＯＲ遺伝子生産物 と）　Ｔ　！ｊ　：ｙハＲＷｉｔ向性り（ｋＸ　Ｉ　（ＨＴＬＶ−１１１／ＬＡ Ｙ　）は、ヒトにおける後天性免疫不全症候群〔エイズ（ＡＩＤＳ）Ｊの病原体 とされているレトロウィルスで６ル、ＨＴＬＶ−履および関連ウィルスの３ｓの 分離体の公表さｎたヌクよび３′匣を予言する。これらの２つの小さな転写解読 枠は％２種類の他のヒトレトロウィルスＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−１を含む その他の外因性レトロウィルスのゲノム内における大きさおよび位置において類 似性を有しないという点において、これら２つの小さな転写ＮＲ枠は、ルトン（ Ｋｄ　）の分子量を有する１９３個のアミノ酸からなるタンパク質をエンコード できる。そのイニシェータータンパク質をエンコードする可能性のある他の転写 解読枠を含む、μ堡遺伝子の下流には、３′末端反復配列であることがわかって いる０本発明は、こｎもまた生体内で免疫原でろる２　３Ｋｄのタンパク質に相 当するＨＴＬＶ対する抗体および診断試験キットも開示している。

ＨＴＬＶ−ＩＩは、主にＯＫＴ　４＋ヒ）Ｔ細胞に感染する外因性レトロウィル スである。はとんどの他の欠陥のないレトロウィルスと異な５．　ＨＴＬＶ−１ ［の感染は、一般に試験管内での細胞死を導き、そしてエイズの患者においてＯ ＫＴ４表＃Ｌ型を有するＴ、ｌｆｌ胞の減少を導（、ＨＴＬＶ−璽グツムに特有 である小さい転写Ｓ読枠は、直接または間接のどちらかで細胞の代謝を変えるフ ィルス性タンパク質をエンコードすることにより、上記の細胞変性効果に寄与す る。ｓｏｒ領域から誘導されたＤＮＡグローブは、ＨＴＬＶ−１感染細胞中のＲ ＮＡ　種にハイブリッド形成することが最近わかっている。

発明の詳細な説明 は、ヒトＴリンパ球指向性ウィルスタイプ■のクローンのＡＡｕ　Ｉ　−ＡＡｕ 　Ｉ　７ラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ　）内に見い出される。　ＨＴＬＶ−１ クローン例えばＢ）ｌ−１０からのヌクレオチドセグメン）　（ｓｅｇｍｅｎｔ ）　４７２４−５２０１　ｔ−分離し、そして適当な発現ベクター内に組込む、 　５　ＡｔｕＩ部位は、イニシエーターメチオニンからアミノ酸３５個下ｆＩｔ 、ｇ８に位置し・一方３’　Ａｊｕ　Ｉ部位はｓｏｒ転写解読粋の終止コドンま しくはｐＪＬ　６に、図面に示される非反復（ｕｎｉｑｕｅ）Ｈｉｎｄｌ［部位 で結合される。プラスミドＰＪＬ６は、ラムダ７アージｃＨ遺伝子のイニシエー ターメチオニンを供そのアミノ末端にｃｌ遺伝子から誘導される１５個のア大腸 菌内に挿入し得る。このタンパク質は、ｆｉｉ＆！Ｌ、そしてＨＴＬＶ−１診断 試験に使用し得、またはｓｏｒタンパク質のアミノ酸配列に特異的に結合するモ ノクローナル抗体を主意するために使用し得る。

寄託の声明 グラスミド９８０Ｒ２を、マリ−ランド、ロックグイルにあるアメリカン　エイ ズ　カルチャー　コレクシジン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ 　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）にＡＴＣＣ第５３４５７号の下に１９８６年１月３ １日寄託し、そしてそれは３０年の間、ｔたは該寄託に対する最後の請求後５年 の間、またはこの特許の有効期間のいずれかの最も長い期間保管さｎるであろう 、寄託の期間内に培養物が突然変異するか、または生存できなくなった場合には 、再寄託さ扛るで６ろう。

図面の説明 図面は、ヒトＴリンパ球指向性ウィルスタイプ■からのＡｔｕ　Ｉ　−Ａｔｕ　 Ｉフラグメントおよびラムダｃｌ遺伝子のイニシェークーメチオニンを含むプラ スミドの構造を示す。

発明の詳細な説明 ヒト１９７７球指向性ウィルスエイズｌ１ｌ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ　）のＡｔｕＩ 　−ＡｔｕＩ　７ラグメントは位置４７２４−５２０１に相当するＢＨ−１０ク ローンから誘導される。ＢＨ−１０は、バーン第１６６頁（１９８４年）に記載 されているよく知られたＨＴ　ＬＶ　−ＩＩＩクローンである。クローンＢ）ｉ −ｉ　ｏの使用は、好ましいものでちるが、本発明はこれに限定されない。

ＡｔｕＩ−ＡｔｕＩフラグメントを含むその他のＨＴＬＶ−ｌ［クローン、例え ばＨＸＢ−２、ＨＸＢ−５ｔたはＢＨ−ｓ　／　Ｂ）ｌ−８は。

本発明の範囲内に含まれる。さらに上記のアミノ酸配列は、ＢＨ−１ｏクローン に相当し、その他のクローンからのＡｔｕＩ　−Ａｊｕ　Ｉ７ラグメントは、わ ずかに異なるアミノ酸配列番号により区別できる〔本発明において使用される番 号付けの方法の記載は、ラットナー（Ｒａｔｎｅｒ）等、ネ写解読枠により決定 される最大１９３個のうち、１６０個のアミノ酸をエンコードし、このようにＨ ＴＬＶ−１ｓｏｒ遺伝子の少なくと一８５チに及ぶ、ラムダｃｌ遺伝子のイ二シ エーターメチオニンから下流にアミノ酸１５個のところに位置する非反復Ｈｉｎ ｄＢ１部位を含む１発現ベクターｐＪＬ６に１人ｔｕＩフラグメントを結合させ る。ベクターｐＪＬ４ａ１本発明の好ましいベクターであるが、その他のベクタ ーもそれらがｃｌｌ遺伝子イワシエータ−メチオニン含むならば、使用しても艮 い。

ＡｔｕＩフラグメントを発現ベクターＰＪＬ６に挿入する方法は、十分公知の手 順を含む０図面に示すように。

ｐＪＬ６ＤＮＡをＨｉ　ｎ　ｄ　ｌ［で切断し、そして付着端を大腸菌ポリメラ ーゼによシブラント末端に変える。　ＨＴＬＶ−Ｉ！クローンからのＡｔｕＩ７ ラグメントー　推定されるイニシェークーメチオニンから下流にアミノ酸３３個 のところ解読粋の終止コドンに一致する−を、ｍに直線化ｐＪＬ６　ＤＮＡへＴ ＪＤＮ人リガーゼによシブラント末端連結する。

ＰＪＬ６　Ｋ含まれるラムダ７アージｃＨ遺伝子は、ｓｏｒ含有タンパク質のた めのイニシェークーメチオニンを含むＮ末端に１５個のアミノ酸を供給する。ｐ ＳＯＲｌと命名されたグラスミドは、　ＡＬｕＩ　７ラグメントの中央近傍の非 反復５ｔｕＩ部位を観察することによル、正しい方向にクローン化されるＨＴＬ Ｖ−１［ｓｏｒ配列を含むことが解った。

挿入さ扛る配列の翻訳の枠を調整するために、ｐｓＯＲＩＤＮＡ　ｔ−Ｃｔａ　 Ｉで切断し、大腸菌ポリメラーゼで処理して付Ｎ端を補光、そしてＴ４リガーゼ によシ再連結する。

この緒釆生成したプラスミド６ｐＳＯＲ２と命名し、これはＣＬａ　Ｉ部位を置 換している新しいＮｒｕＩ部位を観察することにより、およびベクター−挿入ジ ャンクションの直接配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により期待される解読枠 を有することが解っている。

正しい配列がｐｓＯＲ２内に存在することを確認するために、二重鎖ｐｓＯＲ２ ＤＮＡを変性させ、ｃｉ遺伝子の末端から誘導さｎる合成オリゴヌクレオチドの 存在下で再生させ、そして配列分析の公知の方法に従って配列決定する。約１０ ０ヌクレオチドのＤＮＡ配列は、９８０Ｒ２が枠内でｓｏｒ転写解読枠に延びる ベクター内のｃｌ遺伝子で始まる転写解読枠を含むことを示す、ｆａ菌にニジ合 成されるｓｏｒタンパク質は、およそ１８Ｋｄの分子量を有し、そしてそのアミ ノ末端にｃｌ遺伝子から誘導さ扛た１５個のアミノ酸およびＨＴＬＶ−１［ｓｏ ｒ領域から誘導さｎた残）の１６０個の７ミノｔＲを含む。

腸菌ＭＺ１（温度感受性ラムダリグレッサーを含Ｍ）内にｐｓＯＲＺを組込む、 全ての大腸菌のタンパク質を、（５５Ｓ　）メチオニンまたはＣ５５Ｓ　）シス ティンて代謝的に標識すると、２０Ｋｄの新規タンパク質がｐＳＯ几２を含む温 度誘発へ１ｊ７１１細胞内に坐座される。このタンパク質は誘誘発ｍ胞内にも観 察されない。クーマシーブルー染色は。

により記載されたように塩および界面活性剤で連続抽出によシ精製する。

手順によル逆相ＨＰＬＣを使用して、細菌によシ合成されたｓｏｒタンパク質を ｎｙｉする。２つの主要なタンパク質バンドをＣｔｓカラムから一緒に溶出させ る。これらの２つのバンドは存在するタンパク質の９５−以上を構成する。この 逆相ＨＰＬＣｆｉ製５Ｏｒｌ　７パク質の１ｏｏｕｇ接種３回によシウサギを免 疫感作する。ウェスタンプロットアッセイは、ウサギ抗血清が陽イオン又換ＨＰ ＬＣカラムによシ精製した２種のｓａｔタンパク質と強く反応することを示す。

次に、ＨＴＬＶ−ＩＮ感染Ｈ９細胞内の本来ｃｖｓｏｒタンパク質を固定するた めに、このウサギ抗血清を使用する。？ａ胞を代謝的に標識し、そして細胞抽出 物をウサギ抗血清で免疫沈降させる。グレー免疫血清ではなく、免疫血清のみが 、　ＨＴＬＶ−Ｉｌｌ感染細胞内の２５Ｋｄ　タンパク質を認識する。エイズの 徴候はないが、しかしＨＴＬＶ−１１１エンベロープ抗原に対して血清陽性で６ る血友病者の血清は、２５Ｋｄタンパク質と一緒に移動する同じ細胞の抽出物か らのタンパク質とも反応する。　ＨＴＬＶ−１ｇ染ｊｆＢ胞内の同じ大きさのタ ンパク質はまた。　ＨＴＬＶ−１１１血清陽性の人々からの血清に検出され、そ して部分的なアミノ酸認されている。

実施例 スタンプロットアッセイに使用し、ヒト血清に対するその免疫反応性を試験する 。７９棟の血清が、その他のＨＴ　ＬＶ　−Ｉｉ１抗ＪｌｉＸ（Ｐ２４オ！ヒ／ ｌたはｇｐ４１（２）いず牡か）に血清陽性である患者から得られ、そして１６ 種の血清が、　ＨＴＬＶ−１１１ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質に対する抗体を 検°出できない正常人から得らｔた。７９人の血清陽性患者の群は＝１危険にさ らされている”人２９人１例えば同性愛者、■薬剤使用者およびエイズ患者のＲ 類；エイズ関連症候群（λ１ｌｌＬＣ）の患者２２人：そしてエイズ患者２８人 を含む０分析された全群の幾人かにｓｏｒタンパク質と反応する抗体が検出され た。エイズおよび健康な“危険にさらされている″患者からの血清の約半数が、 細菌により合成されたｓｏｒタンパク質と反応し、−万Ｍば患者からの血清の八 だけが陽性だった。結果を表１にまとめて示す。

表　１ 対するヒト生抗体の頻度 臨床状態　試験数　陽性数　陽性− 健康供血者　１６　４　２５ 危険にさらさｎている健常者　２９”　１２　４１Ａ　ＲＣ２２＠　７　５２ エ　イ　ズ　２８”　１５　５５ −　全てのこれらの血清は、その他のウィルスの抗原（ｐ２４および／またはｇ ｐ４１のいずれか）に対しても陽性だった。

われわれの結果は、ｓｏｒタンパク質は生体内で免疫原性でおること、および正 常人においてよ夕も感染した患者においてＨＴＬＶ−１［ｓｏｒタンパク質に対 する抗体の十分によシ高い有症率がおることを示す。

四　グラスミドｐｓｏｎ　２をＤＣ６４６細胞内で増やし。

温度感受性リグレッサー（ｃＩ　８５７　）を含むＭＺｌを形質転換するために 後で使用する。ベクターｐＪＬ６、またはグラスミドｐｓＯＲ２、またはプラス ミドｐｓＯＲ１を含む威１細胞を、Ｍ５６補足培地中、３２℃で、５９０での党 学密庭約ｃＬ４’ｊで増殖させる０分取した５　０　ｕｔを代謝的に（３５８） メチオニンで４２℃５０秒間標識し、そして全人ｍ菌タンパク質を１Ｏ−８ＤＢ −ポリアクリルアミドゲル上でオートラジオグラフィーによル視党化した。新規 なタンパク質の大きさは、　ＨＴＬＶ−Ｉ　ＡｔｕＩフラグメント（１６０個の アミノ酸）とｃＩ遺伝子のＮ末端（１５ａのアミノ酸）との予想さｎた分子量と 一致する。（Ｓ）システィンで得られた結果も上記のものと同じだった。

（ハ）ベクターｐ　Ｊ　Ｌ　６またはグラスミドＩ）ＳＯＲ２のいずれかを含む 大腸菌Ｍｚ１細胞を４２℃で１時間誘発し、そして全大腸菌タンパク質をクーマ シーブルーで染色した１　０　％　５Ｄ８−ポリアクリルアミドゲルで分析した 。

（ｑ　ｃ　ｌ−ｓ　ｏ　ｒハイブリッドタンパク質をｐｓＯＲ２を含む鷹１の培 養液２ｔから％物足の開示に記載されているように抽出した。チオシアン酸カリ ウムペレット画分（１−）中のタンパク’Ｘ　ｔ　５０　ｍＭ　）すＸ　、　Ｐ Ｈ７，５、２ｍ１ＪＤＴＴ、７Ｍ尿素内に浴解し、そしてその一部をクーマシー ブルーで染色された１２５チ８ＤＳ−ボリアクリルア４　ＤＯｕｇを、２０ｍＭ 燐酸ナトリウＡ　、　ｐｎ　７．０　および７Ｍ尿素で平衡化した陽イオン５！ 換ウオーターズ　プロティン−バック（Ｗａｔｅｒｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　−Ｐａ ｋ）　ＳＰ　−５ＰＷＨＰＬＣカラムに供給した。２棟類の上ヅメンバク質は、 平衡緩衝液中０−８０　’ｆｉ　ＯｃＬ７５ＭＮａｃｔＯ稼状２５分濃度勾配で 異なる画分に溶出した。ピーク画分の一部を、クーマシープルーで染色された１ ２．５％　５Ｄ８−ポリアクリルアミドゲルで分析した。

ロ　セクション（ｑで示しためる程度精製したｓｏｒタンパク質両分を、１５チ ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロースフィルターに 移し、そしてウェスタンプロットアッセイによりヒト血清（１：１００希釈）と 反応させた。抗原−抗体複合物をＣＩ）プロティン人を使用して検出した。

ウェスタンイムノプロット試験（５）および免役沈降試験（ロ）に使用した。ク リッペル等により記載さｔたように塩と界面活性剤で抽出され、そしてサムエル 等によル記載されたようにＣカラムを使用する逆相）ＬＰＬＣによりｎ製された 細菌によシ合成されたｓｏｒタンパク質を抗体誘引に使用した。最初の免疫感作 ｔ％上記タンパク質１１００ｕで行ない１次いで１０日後および２０日後の２度 １１００ｕの追加免疫を行なった。１０％５Ｄ８−ポリアクリルアミドゲルで電 気泳動し、セしてクエスタ／プロットアッセ（ニよｐエトｐセルロースフィルタ ー上に固定した精製ｓｏｒタンパク質との反応のために、上記抗血清を用いた。

免役複合体をＣＩ、ｌプロティンＡｔ−使用して検出した。

ＨＴＬＶ−１ｆ感染Ｈ９細胞を等しい活性値の（ｆ９）メチオニンおよび（８） システィンで標識し、そして溶菌させた。細胞抽出物を、ウサギプレ免疫血清； （Ａｌに記載したようなウサギ抗血清；血友病患者からの血清；および別の血友 病思考からの血清と免疫沈降させ、次いで１０％５Ｄ８−ポリアクリルアミドゲ ル上で電気泳動を行なった。

オートラジオグラムに関するＨＴＬＶ−１［エンベロープｐｓｓとｐ２４は、患 者がウィルスに暴露されたことを示す。

試験キット グラスミドｐｓＯＲ２を不死化細胞系例えばＨ９Ｖｃ）ランスフエリションさせ ても良く、そして該細胞、抗原または該細胞から生産されるタンパク質を試験キ ット内の抗原として混合しても良い、このようなキットは、固体支持体に結合し た１種もしくはそｎ以上のプラスミドまたは本発明のプラスミドでトランスフェ クションさせた細胞を含むが、これに限足さ牡るものではない、一般に本発明は 、ヒトの試料中のｓｏｒ遺伝子の検出に使用するために適当な抗体試薬キットを 含む、さらに、本発明はウェスタンプロットキット、イムノプロットキットまた はＡＢＣ／エイズ患者からの血清を含むヒト血清中のｓｏｒに対する抗体量を測 定するためのエリザ（ＥＬＩＳＡ）グレートに有用である。

本発明（２）−ｇｔまたは七ｎ以上のプラスミドを含む不死化細胞系、またはそ れらのセグメントを、酵素結合イムノソルベントアッセイ（エリザ）に使用して も良い、エイズ−特異性抗体の検出のための診断試験キットは、使用前、プラス ミドまたはプラスミドから得らｎｆｃＤＮＡ配列でトランスフェクションさヒた 細胞から誘導さｎた抗Ｗ、またはタンパク質で被覆した、複数のウェル（ｗｅｌ ｌ）またはグレート（ンルベン）　（５ｏｒｂｅｎｔ　）または多孔性の表面を 使用する）を含む区画された囲いからなる。

そして、多孔性表面に結合したプラスミドまたはＤＮＡ配列はヒトの血液の試販 材料と共に培養される。試料を除去し友後、エリザアッセイを行なう公知方法を 行なう：即ち、正常のヤギ血清およびペルオキシダーゼで標識したヤギー抗ヒト 免疫グロブリンおよび変色指示薬（例えば燐酸塩クエン酸塩緩衝液中のオルトフ ェニレンジアミンおよび過酸化水素）でウェルを被覆する。

他の盤の試験キットも考えられる０例えば、競合的ラジオイムノアッセイまたは ドツトプロット（Ｄｏｔ　Ｂｌｏｔ　）アッセイハ、カバー、ソルベントもしく はニトロセルロースシートのような多孔性表面、界面活性剤、ｐ）１調節剤（ｍ ｏｄｉｆ　ｉｅｒ　）、ウシ血清アルブミン、ヒトＦａｂ、希釈した正常のヤギ 血清、および　Ｉで標識した動物の抗ヒト免疫グロブリンを伴なった区画さｎた 容器を含む。

国際調査報告

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＴＬＶ−ＩＩＩクローンから得られるＡｌｕＩフラグメントを適当なブラ スミドベクターに挿入し、そして該ベクターを適当な細菌細胞に形質転換するこ とを特徴とするヒトＴリンパ球指向性クイルスタイブＩＩＩｓｏｒタンパク質の 製造方法。
2. ２．該ＡｌｕＩフラグメントが、実質的にヌクレオチド配列４７２４−５２０１ に相当するＨＴＬＶ−ＩＩＩクローンＢＨ−１０セグメントであることを特徴と する請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．アメリカンタイプカルチヤーコレクシヨンに承認番号５３４５７のもとに寄 託され、ヒトＴリンパ球指向性ウイルスからのＡｌｕＩ−ＡｌｕＩフラグメント を含むブラスミドｐＳＯＲ２。
4. ４．哺乳類の宿主を、精製したｓｏｒタンパク質で免疫感作し、そして該ｓｏｒ タンパク質に特異的に結合する抗体を分離および精製することを特徴とするヒト Ｔリンパ球指向性ウイルスタイブＩＩＩのｓｏｒ遺伝子に特異的に結合する抗体 の製造方法。
5. ５．固体支持体に結合した、ブラスミドまたはブラスミドｐＳＯＲ２でトランス フェクションされた細胞を含むことを特徴とする区画された囲いからなる試験キ ット。