JPH04502773A - 1種より多い抗体について試験するための診断用蛋白質 - Google Patents
1種より多い抗体について試験するための診断用蛋白質Info
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- JPH04502773A JPH04502773A JP91502660A JP50266091A JPH04502773A JP H04502773 A JPH04502773 A JP H04502773A JP 91502660 A JP91502660 A JP 91502660A JP 50266091 A JP50266091 A JP 50266091A JP H04502773 A JPH04502773 A JP H04502773A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
1種より多い抗体について試験するための診断用蛋白質発明の分野
この発明は、ヒト免疫不全ウィルス2(HIV−2)のある種のエンベロープ・
ペプチド・フラグメントがHIV−2抗体に対して特に免疫反応性を示すという
発見に関するものである。従って、これらの7ラグメントは、HIV−2に対す
る抗体の検出を目的とする免疫診断的試験に適用され得る。この発明はまた、H
IV−2、HIV−1,HTLV−18よびHTLV−11に対する抗体に関す
る試験に使用され得るHIV−2、HIV−1またはHTLV−1のユンベロー
ブ遺伝子の免疫原部分から製造されるある種のキメラ・ペプチド・フラグメント
に関するものである。
発明の背景
ヒト免疫不全ウィルス(HI V)は、RNAに遺伝子コードを有するレトロウ
ィルスである。ヒトの場合、後天性免疫不全症候群(AIDS、エイズ)は、2
つのタイプのHIV、すなわちHI V−1またはHIV−2のいずれかにより
誘発され得る。
HIV−1(元来HTLV−Il+)は、ガロおよびモンタギア等、U3452
0113により分離および同定された。ラトナー等、「ネイチャーJ3’13:
277−284(1985)、ミュージング等、「ネイチャーJ313:450
−458(1985)、サンチェスーペスカドール等、「サイエンスJ227:
484−492(1985)およびワイン〜ポプリン等、「セルJ40:9−1
7(1985)は、HTLV−II+ウィルスの完全なりNA配列を開示してい
る。
HIV−2(元来LAV−2)は、最初面アフリカのエイズ様疾患患者から分離
された(クラベル、Fl等、「サイエンスJ233:343−346(1986
)、クラベル、F2等、「ネイチャーJ324 :69 ]−695(1986
))。
HIV−17;よびHIV−2は、T4トロピック・レトロウィルスというウィ
ルスの種類に属するヒトT細胞白血病−リンパ腫ウィルス(HTLV)に関連し
ている。HTLV−1は、T細胞白血病およびリンパ腫の病因である。元来毛様
細胞性白血病患者から分離され!:HTLV−11は、成熟Tリン3球の悪性白
血病の発現に関与している。HTLIIのプロウィルス・ゲノムの完全なヌクレ
オチド配列は、セイキ等、「プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンシーズ(USA)J80:3618−3622(198
3)で与えられている。
レトロウィルスが宿主細胞に感染すると、そのゲノムのDNAコピーはその宿主
の染色体へ組み込まれる。レトロウィルスによっては、DNAがプロウィルスと
して知られている配列形態で宿主細胞の染色体へ組み込まれる場合もある。レト
ロウィルスの遺伝子コードのDNAコピーは、RNA依存DNAポリメラーゼと
呼ばれるウィルス酵素まt;は逆転写酵素により合成される。宿主細胞は、ウィ
ルス遺伝子のDNAを転写し、ウィルスによりコードされる蛋白質を合成し、次
いでこれらは新しいウィルスに組み立てられる。
HIVウィルスおよびHTLVウィルスは、少なくとも(i)内部構造にューロ
カプシドまt;はコア)蛋白質をコードするgag遺伝子、(ii)逆転写酵素
をコードするpol遺伝子および(iii)ウィルスのエンベロープ糖蛋白質を
コードするenv遺伝子を含む。
HIV−1を用いた初期の研究において、ガロ(ガロ、R,C,等、「サイエン
スJ224:500:503(1984)、サルナガドハーレン、M、G、等、
「サイエンスJ224:506:508(1985))およびモンタニア(バレ
ージノウッシ、F9等、「サイエンスJ220:868−.871(1983)
)は、ウェスタン・プロットを用いて、大部分のエイズ患者がHI V−1抗原
に対する抗体ををすることを立証した。この研究結果から、またプロットがp1
7、p24および他のHIV−1抗原での非特異的反応を有し得ることが広範に
は認められなかったため、gag抗原がHIV−1抗体に関するスクリーニング
での使用に適しI;抗原であると一般に信じられた。しかしながら、必ずしも全
部のエイズ血清が、ウェスタン・プロットにおいてgag抗y7ttこ対して反
応性を示すとは限らない。感染の第1の最も信頼できるマーカーは、エンベロー
プ蛋白質に対する抗体の存在である。
HI V−1のウィルス性すゼイトは、現在ヒト血清におけるHlV−1抗体の
検出に汎用されている。ウィルス性すゼイトは、組織培養で生育され、抗原供給
源として部分的に精製されたHIV−1に由来する。この試験は確かに高感度で
はあるが、偽陽性の率が比較的高いという欠点をもつ。多くの科学者らは、これ
らの偽陽性がウィルス製品を汚染している細胞蛋白質(ホンター、J、B、等、
「ランセット」l+1222−1223(1985)、セイヤーズ、M、H,、
「トランスフュージョンJ26:I l 3−115(1986))および交差
反応性抗体の存在(シリ−1L3等、「サイエンスJ227:1484(198
5)、ポルスキー、D、J 、、「ニューイングランド・ジャーナル・オプ・メ
ディシンJ315:457−458(1986))によるものと考えた。
HTLV−18よびHTLV−11ウイルスは、抗体陽性者の末梢血白血球から
抗体陰性者の白血球へと(これらを−緒に培養した場合)容易に移され得る。ポ
ポビック等、「サイエンスJ219:856−859(1983)。従って、輸
血された血液が感染細胞を含む場合、全血輸血に伴う感染の危険が存在する。
さらに、lレトロウィルスに感染した個体には第2のレトロウィルス感染も潜ん
でいることがあり得る。まt;、HIV−1感染者から得l;生物試料は、HT
LV−1またはHTLV−I+に対する抗体についての陽性試験結果を与えるこ
とが多い。患者血清におけるHTLV−1およびHIV−1抗体に関する次の研
究で検定が行なわれI;:ロッジ等、「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・キャ
ンサー・(?)C1in、0nco1.J22:411 418(1986)、
青木等、「ランセット」、1984年IO月20日、936−937頁、テツダ
ー等、「ランセット」、1984年7月21日、125−128頁およびロバ−
ドーグロア等、「ランセットJ、1984年7月21日、128−130頁。こ
れらの研究において、HTLV−1は、ウィルス性すゼイト(ロッジ等および青
木等)およびコア抗原(テ・ンダー等およびロバ−ドーグロア等)により検出さ
れた。
パフ、”)−ルELAVIAl1合検定は、HIV−1抗体よりもHIv−2抗
体を優先的に検出することが報告されている。(レリー、前出)。しかしながら
、この検定はHIV−2ウイルス性リゼイトの使用に基づくため、全ウィルスの
使用を必要とする。
アメリカ合衆国では、ヒト血液を、HIV−18よびHTLV−■に対する抗体
および肝炎についてスクリーニングしなければならない。ヒト血清はまた、まも
なくHTV−2に対する抗体に関してスクリーニングされることも必要になると
予想される。すなわち、ヒト生物試料l;おいてHIV−2に対する抗体の存在
について試験するための信頼できるスクリーニング検定が要望されている。また
、ヒト生物試料から複数の種類の抗体を検出し得る単一試験も要望されている。
発明の要旨
本発明は、HIV−2抗体の検出に使用され得る免疫反応性envHIV−2ペ
プチドのアミノ酸配列を含む。本発明はまた、複数の種類の抗体を検出し得る免
疫診断用キメラenvペプチドのアミノ酸配列を含む。具体的に述べると、これ
らのキメラenvペプチドは、HIV−2、HIV−1およびHTLV−Iおよ
びHT L V−11i:ltする抗体を検出することができる。すなわち、こ
の発明は、HIV−2−HIV−1、HIV−2−HIV−1−HTLV−1,
HIV−2−HTLV−ISよびHIV−1−HTLV−1の免疫診断用env
ペプチド・7ラグメントを含むキメラenvペプチドを含む。
図面の簡単な記載
図1は、HIV−1クローンに3Dを含むプラスミドに3DおよびpcBclか
らのプラスミドpKlの構築を示す。
図2は、K1と呼ばれる誘導34kd蛋白質を示す電気泳動ゲルである。
図3は、誘導蛋白質Klと、HIV−2感染個体から得られたヒト血清との反応
を示すウェスタン・プロットである。
図4は、K1暗号化領域の完全なりNA配列および誘導されたアミノ酸配列を示
す。
図5は、プラスミドpK3および7101位から8139位までの1038塩基
対フラグメントの構築および発現ベクターpCBC2へのに3Dのライゲーショ
ンを示す。
図6は、K3と呼ばれる誘導40M蛋白質を示す電気泳動ゲルである。
図7は、誘導蛋白質に3と、HIV−2感染個体から得られたヒト血清との反応
を示すウェスタン・プロットである。
図8は、K3の暗号化領域の完全なりNA配列および誘導されたアミノ酸配列を
示す。
図9は、プラスミドpLcBcODG71AおよびpKlがらのプラスミドpK
IDG71の構築を示す。
図1Oは、KIDG71と呼ばれる誘導55kd蛋白質を示す電気泳動ゲルであ
る。
図11Aは、誘導蛋白質KIDG71と、HIV−1感染個体から得られたヒト
血清との反応を示すウェスタン・プロットである。
図11Bは、誘導蛋白質KIDG71と、HIV−2感染個体から得られたヒト
血清との反応を示すウェスタン・プロットである。
図12は、pKIDG71の暗号化領域の完全なりNA配列および誘導されたア
ミノ酸配列を示す。
図13は、プラスミドpDG71353の構築を示す。
図14は、プラスミドpKIDG71353の構築を示す。
図15は、pKIDG71353の暗号化領域の完全なり N A−配列および
誘導されたアミノ酸配列を示す。
図16は、誘導68kdキメラ蛋白質KIDG71353を示す電気泳動ゲルで
ある。
図17は、誘導蛋白質KIDG71353と、HIV−1陽性個体から得られた
ヒト血清との反応を示すウェスタン・プロットである。
図18は、誘導蛋白質KIDG71353と、HIV−2陽性個体から得られた
ヒト血清との反応を示すウェスタン・プロットである。
図19は、誘導蛋白質K]DG71353と、HTLV−Iffl性個体から得
られたヒト血清との反応を示すウェスタン・プロットである。
図20は、誘導蛋白質KIDG71353のウェスタン・プロットにおいて陰性
血清との非特異的反応性は全く見られなかったことを示す。
図21は、KIDG71353蛋白質の暗号化領域の完全なりNA配列および誘
導されたアミノ酸配列を示す。
定義
以下の記載では、組換えDNA技術および免疫学で使用されている若干の用語が
広範に使用されている。それらの用語に与えられる範囲を含め、明細書および請
求の範囲のさらに明確で矛盾の無い理解を達成するために、次の通り定義を行う
。
プロモーター。転写された配列の5′末端にある開始コドンの近位に位置するD
NA配列。プロモーター領域では、近接の機能し得るように結合した遺伝子(複
数も可)の転写が開始される。
遺伝子。ポリペプチドまたは蛋白質をコードするmRNAの転写に関する情報を
含むDNA配列。典型的には、最初の転写コドンのヌクレオチドは+1と番号付
けされ、ヌクレオチドは、遺伝子の転写領域を通して正の整数により連続的lこ
番号付けされる。また、ヌクレオチド+1は、最初の翻訳されたアミノ酸をコー
ドする場合もしない場合もあり得る。遺伝子は、5′末端および3′末端に転写
はされるが翻訳はされない領域を有し得る。同様に、遺伝子は、mRNAの翻訳
前に切り継ぎ(スプライシング)されなければならないイントロン情報を含む場
合も含まない場合もあり得る。tmRNAは、5′末端および/または3′末端
に翻訳されない領域を有し得る。
プロモーターおよび転写調節領域5′〜転写領域におけるヌクレオチドの番号付
けは、負の整数により連続的に進められ、第1転写コドンの隣の5″ヌクレオチ
ドは−1と番号付けされる。
「相補的DNAJまたはrcD N A J遺伝子は、mRNAの逆転写により
合成された組換え遺伝子を含み、そこから介在配列(イントロン)が除去される
。
機能し得るように結合。この明細書で使用されている、「機能し得るように結合
された」という語は、一方の要素に影響する因子が他方の要素にも影響する形で
2要素が物理的に配置されていることを意味する。例えば、特異的プロモーター
の機能を誘発する因子はまた、そのプロモーターに機能し得るように結合した遺
伝子の転写を誘発する。
発現。発現は、遺伝子内でコードされた情報が現れるプロセスである。遺伝子が
蛋白質をコードする場合、発現は、mRNAへのDNAの転写およびmRNAの
蛋白質への翻訳の両方を含む。
クローニング・ビヒクル。プラスミドもしくはファージDNAまたは宿主細胞に
おいて自己複製し得る他のDNA配列であり、ビヒクルの本質的な生物機能を失
わずに決定可能な様式で前記DNA配列が切断され得る1mまたは少数のエンド
ヌクレアーゼ認識部位を特徴とし、そこへDNAがスプライシングされることに
より、その複製およびクローニングが誘発され得るDNA配列。クローニング・
ビヒクルは、さらにクローニング・ビヒクルにより形質転換された細胞の同定で
の使用I:適したマーカーを含み得る。例えば、マーカーは、テトラサイタリン
耐性まt;はアンピシリン耐性である。「ベクター」という語は、「クローニン
グ・ビヒクル」I:対して使用されることもある。
発現ビヒクル。クローニング・ビヒクルに類似しているが、宿主への形質転換f
&を二、そこへクローン化された遺伝子を発現し得るビヒクルまたはベクター。
クローン化遺伝子は、通常ある種の制御配列、例えばプロモーター配列の制御下
に(すなわち、機能し得るように結合された状態に)置かれる。発現制御配列は
、ベクターが、原核生物または真核生物のいずれの宿主l:おいて機能し得るよ
うに結合した遺伝子を発現するように設計されているかにより変化し、さらに、
転写要素、例えばエンハンサ−要素、終結配列、組織特異性要素および/または
翻訳開始および終結部位を含み得る。
宿主。複製可能な発現ビヒクルの受容体である生物。
ペプチド・フラグメント。「ペプチド・フラグメント」という語は、HrV−2
、HIV−18よび/lf:はHTLV−1f)セf) ントを表すアミノ酸配
列であって、各抗体と免疫反応し得る配列を含むものとし、天然ペプチド配列、
合成的、化学合成的ペプチド配列および発現された遺伝子工学によるペプチド配
列を含む。
好ましい態様の記載
本発明は、HIV−2抗体の検出に使用され得る免疫反応性envHIV−2ペ
プチドのアミノ酸配列を含む。本発明はまた、免疫反応性envペプチドをコー
ドする遺伝子配列、前記遺伝子配列を含む発現ビヒクルおよびそれにより形質転
換されt;宿主を含む。
また、本発明は、複数の種類の抗体を検出し得る免疫反応性キメラenvヘプチ
ドのアミノ酸配列を含む。具体的には、これらのキメラenVペプチドは、HI
V−2、HIV−1およびHTLV−IおよびHTLV−I+に対する抗体を検
出することができる。すなわち、コノ発明は、HIV−2−HIV−1%HIV
−2−HIV−1−HTLV−I、HIV−2−)(TLV−IおよびHI V
−1−H7LV−Iの免疫診断用envペプチド・フラグメントを含むキメラe
nvペプチドを含む。キメラenvペプチドとは、ペプチドが相異なるウィルス
・ペプチドのドメインをコードするアミノ酸配列を含む場合のペプチドを意味す
る。2つのペプチドが天然ウィルスにおいて成熟形態で共有結合により連結され
ていない場合、それらは相異なるペプチドであると言われる。発明者らは、相異
なるレトロウィルスからのペプチドのドメインを組み合わせることにより、キメ
ラ・ぺプチドの特定の構築に従い、HIV−2、HI V−1およびHTLV−
IおよびHTLV−I+に対する抗体を検出し得るキメラ・ペプチドが作製され
ることを発見しt;。
HIV−2、HI V−1およびHTLV−1envペプチドからのドメインが
それらの各抗体に対して免疫反応性であり得るか、または抗体認識性を維持、促
進まt;は誘導する形で別のドメインと組み合わせられ得るものであれば、キメ
ラenvペプチドはそれらのドメインを含み得る。
HIV−2SL/IsYからの完全な旧V−2ヌクレオチド配列は、7ランチー
二等、「プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニー」86:2433−2437C198
9)に記載されている。好ましいペプチド・フラグメントは、後記実施例1に記
載され、Klペプチド・7ラグメントの暗号化領域の完全なりNA配列および誘
導されたアミノ酸配列を与える図4で示されているもの、および後記実施例2に
記載され、K3ペプチド・フラグメントの暗号化領域の完全なりNA配列および
誘導されたアミノ酸配列を与える図8で示されているものである。
HI V−1の好ましいenvペプチドは、ベルン等、US4753873に記
載されているもの、特にクローンGペプチド・フラグメントおよびそこから誘導
されたペプチド・フラグメントである。最も好ましいenvペプチド・フラグメ
ントは、HIV−1env遺伝子のgp120およびgp41領域から誘導され
たCBre3である。またデルタG71Aとしても同定されたCBre3は、ソ
ーン等、「ヒト免疫不全ウィルスを検出するための新規組換えポリペプチドを用
いた酵素免疫検定法」、「ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジ
ーJ25:1207−1212(1987)およびベルツ等、US475387
3に記載されている。組換え抗原を発現するセルラインはまた、受入れ番号53
455としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ3ン(ATCC)に寄
託されている。抗原がHIV−1抗体に対して免疫反応性を示すものであれば、
他の組換えHIV−1抗厚もこの発明で使用され得る。前記組換えHI V−1
抗厚の例は、チャック等、「バイオ/テクノロジーJ、3:905−909(1
985)、カブラディーラ等、「バイオ/テクノロジー」、4:128−133
(1985)およびUS4629783に記載されており、これら全てを引用し
て説明の一部とする。
エセックス等、PCT/US 8410 O561,公開番号WOa41043
27は、HTLV−1のenv糖蛋白質にツイテ記載している。HTLV−1の
env遺伝子によりコードされる免疫反応性ペプチド・フラグメントは全てこの
発明で使用され得る。好ましいペプチド・7ラグメントは、セイキ等(「プロシ
ーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オ
ブ・ザ・ニー・ニス・ニーJ80:3618(1983))の公表された配列に
基づく塩基対6101−6118および6170−6499のHTLV−1エン
ベロープ遺伝子であり、これを引用して説明の一部とする。他の好ましいペプチ
ド・フラグメントは、サミュエル等、「サイエンスJ126:1094−109
7(1984)に記載されたものであり(これを引用して説明の一部とする)、
HTLV−1のenv遺伝子の制限地図が与えられている。HTLV−11抗体
もまた、HTLV−1抗原の使用により検出され得る。
当業界の熟練者にとっては当然のことであるが、発現ビヒクルにおいてクローン
化されたヌクレオチド配列は正しい位置関係を占めているため、ペプチド・フラ
グメントの最初の1個または2個のアミノ酸については変形が存在し得る。
同じく当業界の熟練者にとっては当然のことであるが、ペプチド・フラグメント
についてもある程度の変形が存在し得る。ただし、この場合、これらのペプチド
は各々HIV−2、HIV−1またはHTLV−Iに対する抗体に対して免疫反
応性を保持しているものとする。すなわち、ペプチド・7ラグメントの長さの範
囲は正確に固定される必要は無い。ペプチド・フラグメントのアミノ酸は免疫反
応性を失わずに欠失または付加され得る。さらに、アミノ酸は交換され得、例え
ば中性アミノ酸、例えばバリンは別の中性アミノ酸、例えばロイシンと交換され
得る。アミノ酸の変化は、保存性または非保存性であり得る。また、ウィルス分
離株間のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列においてもゲノム変形が存在する
(例えば、ウォングースタール、F8等、「サイエンスJ229ニア59−76
2(1985)参照)。ペプチド・7ラグメントが適当な抗体を検出し得る場合
、前記変形はこの発明のペプチド・7ラグメントに含まれるものと理解される。
保存性置換は、意図されt;組み合わせ、例えばglY。
ala; valx 1leb leu; asp、 glu; asnllg
ln; 5erq thr; lyslarg;およびphe、 tyrである
。
後記方法の記載においては、HIV−2envペプチド・7ラグメントが説明用
に使用されている。キメラenv診断用ペプチドで使用されるHIV−1および
HTLV−1envペプチドもまた、これらの後記方法で使用され得る。
HIV−2ウイルスの天然ペプチド・フラグメントは、ペプチド・ドメイン供給
源として使用され得、感染した宿主細胞から直接入手され得る。次いで、ペプチ
ド・7ラグメントは、適当な酵素または化学的方法を用いて天然ウィルスを断片
化することにより得られる。
また、化学合成法、例えばよく知られた固相ペプチド合成方法によりペプチド・
フラグメントを得ることが可能である(メリフィールド、[ジャーナル・オブ・
アメリカン・ケミカル・ソサエティー」85:2149(1962)、ポダンツ
キー、Ml、[ペプタイド・ケミストリーニア・プラクティカル・テキストブッ
クJ、1988、スブリンガー−7ェルラーク、ニューヨーク)。
ペプチド・フラグメントの好ましい入手方法は、遺伝子工学技術を用いて、所望
のペプチドをコードするポリヌクレオチド・フラグメントをクローニングする方
法である。遺伝子工学および組換えクローン体を使用する利点は2つの面を有す
る。第1の利点は、ウィルスからの直接分離または化学合成により大量のウィル
ス・ペプチドを得ることは困難で時間がかかることである。第2の利点は、組換
えペプチドが、診断試験の信頼性を減じ得るヒト抗原を欠くことである。
遺伝子構築物およびそれらの使用方法を利用することにより、原核生物および真
核生物宿主を含む宿主においてペプチド・7ラグメントを発現させることができ
る。
好ましい態様では、導入された配列は、原核生物宿主において自己複製し得るプ
ラスミドまたはウィルス性ベクターへ組み込まれる。
下記で概説されている通り、広範な種類のベクターのいずれかがこの目的用に使
用され得る。
特定のプラスミドまt;はウィルス性ベクターを選択する場合に重要な因子とし
ては、ベクターを含む受容細胞がベクターを含まない受容細胞から認識および選
抜され得る場合の容易さ、特定の宿主で望まれるベクターのコピー数、および相
異なる種類の宿主細胞間でベクターを「シャトル」し得ることが望ましいか否か
という点が挙げられる。原核生物宿主には、細菌、例えばエシェリヒア・コIJ
ニス・チフィムリウム、セラチア・マルセセンス、またはバチラス・サチラス
が含まれ得る。好ましくは、本発明のペプチドは、原核生物および特にエシェリ
ヒア・コリで発現される。
発現に好ましい細菌宿主は、ラウテンバーガー等、Gene Anal。
Tech、、l:63−66(1984)に記載された、温度感受性バタテリオ
ファージ・ラムダCl857遺伝子を含むエシェリヒア・コリ株、例えばMZI
である。エシェリヒア・コリにおける発現に適当なベクター系は、ベルン、US
4753873に記載されたpCBCLおよびラウテンバーガー等、Gene
Anal、 Tech、 l : 63−66(1984)に記載されたpJL
6であり、この場合、バクテリオファージ・ラムダpLプロモーター、合成リポ
ソーム結合部位およびバクテリオファージ・ラムダC11遺伝子がらの最初の1
3アミノ酸が、クローニングを目的としたBa+nH1部位および3つの全解読
枠における翻訳終結コドンを含む合成的に誘導されたDNAと一緒にベクターに
組み込まれている。
真核生物宿主もまた使用され、酵母、線状真菌、昆虫細胞およびは乳類細胞(ス
ミス等、Mo1. Ce1l Biol、、3:2156−2165(1983
))および特に不死化された、細胞培養中で維持され得るは乳類細胞が含まれ得
る。
好ましい真核生物プラスミドには、牛パピローマ・ウィルス、ワクシニアウィル
ス、SV40に由来するものがあり、酵母では2−ミクロン環を含むプラスミド
まI;はそれらの誘導体がある。それらのプラスミドは当業界では周知であり(
ホトスタイン、Do等、Miami Wntr、 Symp、l 9:265−
274(1982)、ブローチ、J。
R1、「ザ・モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・イースト・サツカロマイ
セス:ライフ・サイクル・アンド・インへりタンス」中、コールド・スプリング
・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク、
445−470頁(1981)、ブローチ、J、R,、「セルJ28:203−
204(1982)、ボロン、D、P、等、rジャーナル・オプ・クリニカル・
ヘマトロジー・アンド・オンコロジー(?)Jlo:39−48(1980)、
マニアチス、T、、rセル・バイオロジーニア・コンプリヘンシブ・トリータイ
ズ、ボリューム3、ジーン・エクスプレッシ履ン」中、アカデミツク・プレス、
ニューヨーク、563−608頁(1980))、市販されている。例えば、M
SV−LTRプロモーターを用いてクローン化遺伝子の発現を誘導するもので、
ヘルパー・ウィルスと同時トランス7工クシ厘ンすることによりプラスミドのコ
ピー数が増幅され、宿主細胞の染色体へプラスミドが組み込まれ得るは乳類発現
ベクター系が記載されている(パーキンス、A、S、等、Mo1. Ce1lB
iol、、3.1123(1983)、クロンチック、バO−フル)、カリフ
ォルニア)。
また、ペプチド・フラグメントのDNA配列は、細胞の感染に使用されるウィル
スのゲノムへ挿入され得る。例えば、ワクシニアウィルスおよびバソクロウイル
スが使用され得る。(マケッ)、M、等、「プロシーデインダス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オプ・ザ・ニー・ニス・ニーJ
、79ニア4J5(1982)、パニカリ、Do等、「ブロシーデインダス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニ
ス・ニー」、80:5364(1983)、およびスミス、G、L、等、「ネイ
チャーJ302:490(1983))。組換えワクシニアウィルスはあらゆる
は乳類細胞において複製し、興味の対象であるフラグメントはエンベロープまI
;は内部ウィルス蛋白質に現れる。
遺伝情報供給源としてのHIV−2ゲノムの利用が望ましくない場合、DNA配
列は化学的に構築され得る。DNAの化学的合成方法は当業界ではよく知られて
いる(「オリゴヌクレオチド・シンセシス、チ・プラクティカル・アプローチ」
、M、J、ガイド編、IRSプレス、ワシントン、D、C,,1984、rシン
セシス・アンド・アプリケーションズ・オブ・DNA・アンド・RNAJ、S、
A、ナラング編、アカデミツク・プレス、サンディエゴ、カリフォルニア、19
87)。遺伝コードは同義性であるt;め、複数のコドンを用いて、特定アミノ
酸をコードするDNA配列が構築され得る(ワトソン、J、D、、rモレキュラ
ー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン」中、第34 W、A、ベンジャミン、イ
ンコーホレイテッド、メン口・パーク、カリフォルニア(1977)、356−
357頁)。
本発明の組換えHIV−2ペプチドを発現させるためには、適当な宿主により認
識される転写および翻訳シグナルが必要である。上記方法により得られた、好ま
しくは2本鎖形態のクローン化HIV−2ペプチド暗号化配列は、発現ベクター
において転写発現を制御する配列に機能し得るように結合され、原核生物または
真核生物の宿主細胞へ導入されることにより、本発明の組換えHIV−2ペプチ
ドまたはその機能的誘導体を生成し得る。
相異なる宿主におけるHIV−2ペプチドの発現の結果、ペプチドの特性を改変
し得る様々な翻訳後修飾が行なわれ得る。HIV−2抗体により免疫学的に認識
されるペプチドの能力を妨げない宿主でペプチドを発現させることが必要である
。
一般に、挿入された遺伝子フラグメントの有効な転写を容易にし、宿主細胞と適
合し得る種類から誘導された、転写調節配列、例えばプロモーター配列を含む発
現ベクターが、これらの宿主と共に使用される。発現ベクターは、典型的には別
個の要素、例えばa)ベクターまたは宿主染色体へのベクターの挿入を促進する
要素を自律複製させ得る複製開始点、b)興味の対象である配列が機能し得るよ
うに結合され得る適当な転写プロモーター、C)転写終結配列(必要な場合)お
よびd)形質転換された細胞において表現型による選択を可能にする特異的遺伝
子を含む。遺伝子発現に必要とされる調節領域の正確な性質は種類または細胞タ
イプ間で異なり、市販されている(例えば、ファーマシア、ベーリンガー・マン
ハイムまたはクロンチックによる)多くの適当な発現ベクター系が存在する。
核酸分子、例えばDNAは、それが転写調節情報を含む発現制御配列を含む場合
、ポリペプチドをr発現し得る」と言われ、前記配列は、ポリペプチドをフード
するヌクレオチド配列へ「機能し得るように結合」されている。
機能し得る結合は、配列の発現がlll11m配列の影響ま!;は制御下Iこ置
かれる形で配列がtlIi節配列(複数もあり得る)に連結されている結合であ
る。2つのDNA配列(例えば、HIV−2ペプチド暗号化配列および暗号化配
列の5″末端に結合したプロモーター領域配列)は、プロモーター機能が誘導さ
れた結果、ペプチド暗号化+nRNAの転写が行なわれる場合、および2つのD
NA配列間の結合の性質が、(1)結果的に7レームーシフト突然変異を導入せ
ず、(2)HIV−2ペプチドの発現を指令する発現調節配列の能力を妨害せず
、または(3)RNAポリメラーゼにより転写されるHIV−2ペプチド鋳型の
能力を妨害しない場合、機能し得るように結合されていると言われる。すなわち
、プロモーターがDNA配列の転写を行い得る場合、前記プロモーター領域は前
記DNA配列へ機能し得るように結合されている。
真核生物宿主におけるHIV−2ペプチドの発現は、前記宿主において機能的な
調節領域および好ましくは真核生物調節システムの使用を要求する。真核生物宿
主の性質に従い、広範な種類の転写および翻訳調節配列が使用され得る。また、
転写および翻訳調節シグナルは、真核生物細胞に感染するウィルス、例えばHI
V、5IV1アデノウイルス、牛パピローマ・ウィルス、さるウィルス、ヘルペ
ス・ウィルスなどのゲノム配列から誘導され得る。好ましくは、これらの調節シ
グナルは、宿主細胞において高レベルの発現を行い得る特定遺伝子と組み合わさ
れる。所望ならば、HIV−2ペプチドの融合生成物が構築され得る。例えば、
HIV−2ペプチドをコードする配列は、特定宿主からの蛋白質の分泌または特
定宿主における蛋白質の画分化を可能にするシグナル配列に結合され得る。特異
的プロテアーゼ部位随伴または非随伴の前記シグナル配列は、シグナル・ペプチ
ド配列が後続の除去に従いやすいように設計され得る。
抑制または活性化を可能にする転写開始調節シグナルが選択され得、その結果、
機能し得るように結合した遺伝子の発現が変調され得る。興味深いのは、温度感
受性であるため温度を変えることにより発現が抑制まt:は開始され得るか、ま
たは化学的調節、例えば代謝が行なわれやすい調節シグナルである。
天然発現制御配列シグナルが宿主細胞において満足に機能しない場合、宿主細胞
において機能的な配列と置き換えられ得る。
本発明のベクターは、さらに他の機能し得るように結合した調節要素、例えばエ
ンハンサ−配列、または機能し得るように結合した遺伝子に種、組織または細胞
型特異的発現性を与えるDNA要素を含み得る。
一旦構築物(複数もあり得る)を含むベクターまたはDNA配列が発現用に製造
されると、DNA構築物(複数もあり得る)は、様々な適当な手段のいずれか、
例えば細菌細胞の形質転換により適当な宿主細胞へ導入される。ベクターの導入
後、ベクター含有細胞の生長について選抜する選択培地で前記受容細胞を生長さ
せる。クローン化遺伝子配列(複数も可能)が発現された結果、HIV−2ペプ
チドの製造またはこのペプチドの7ラグメントの製造が行なわれる。この発現は
、形質転換細胞において連続的方式で、まI;は制御された方式で行なわれ得る
。
HIV−2ペプチドDNA暗号化配列および機能し得るように結合しt;プロモ
ーターが、線状分子まt;はさらに好ましくは自律複製できない閉鎖共有結合環
状分子であり得る非複製性DNA(またはRNA)分子として宿主細胞へ導入さ
れた場合、HIV−2ペプチドの発現は導入された配列の一時的発現を通して行
なわれ得る。
遺伝的に安定した形質転換体は、ベクター系または形質転換系により構築され得
、この際HIV−2ペプチドDNAは宿主染色体へ組み込まれる。前記組み込み
は、細胞内で新たに行なわれるか、または宿主染色体へ自身を機能的に挿入する
ベクター、例えばレトロウィルス性ベクター、トランスポゾンまたは染色体にお
けるDNA配列の組み込みを促進する他のDNA要素による形質転換により補助
され得る。は乳類宿主細胞染色体へ所望の遺伝子配列を組み込み得るベクターが
使用される。
本発明のHIV−2ペプチド含有DNAベクターにより形質転換されI;細胞は
、ベクターを含む宿主細胞の選別を可能にする1種またはそれ以上のマーカーを
導入することによっても選別され、例えば前記マーカーは、抗生物剤耐性、例え
ば抗生物質または重金属、例えば銅などに対する耐性を与え得る。
形質転換された宿主細胞を当業界で公知の手段により発酵(原核生物の場合)ま
たは培養(真核生物の場合)することにより、最適な細胞生長が達成され、また
同じくクローン化HIVペプチド配列フラグメントの最適な発現も達成され得る
。後述されている通り、ペプチド・7ラグメントをコードするクローン化配列に
関する高レベルのHIV−2ペプチド発現は、この発明の好ましい方法に従い達
成され得る。
クローン化HIV−2ペプチド・7ラグメントの発現後、フラグメントは、典型
的には当業界で公知の手段に従い採取および精製される。細菌を宿主として使用
する場合、クローン体が高レベルで発現される結果、通常は不溶性細胞封入体ま
たは集合体が形成される。
発現された蛋白質を精製するために、不溶性細胞封入体を可溶性にしなければな
らない。この発明の好ましい態様では、発現されたペプチド・フラグメントは、
アミノ基のN−アシル化を用いた方法、例えばシトラコニル化により精製される
(マルチアーニ、D、J、等、「プロティン・ピューリフイケーション:マイク
ロ・トウ・マクロ」、アラン、R,リス、インコーホレイテッド、1987.4
43−4458頁)。
ペプチド・7ラグメント抗原を製造するための組換え遺伝子工学技術に代わる方
法には、酵素ポリメラーゼ指令インビトロ転写および翻訳システムがある。ペプ
チド・フラグメントを製造するt;めの増幅システムは、例えばUS46832
02に記載されている。
この発明に従い精製された免疫原性および診断用ペプチド・7ラグメントは、H
IV−2ウイルスに応じて産生された抗体により特異的に認識される。血液また
は組織試料中のHIV−2抗体は、ペプチドが液相中または固相担体に結合した
状態で使用され得る免疫検定法でペプチド・フラグメントを用いて検出され得る
。さらに、ペプチド・フラグメントは、ウィルスに関する免疫検定法で使用され
る様々な方法により検出可能な形で標識され得る。この発明のペプチド・7ラグ
メントを用いたHIV−2抗体を検出するための好ましい免疫検定法には、放射
線免疫検定法、固相酵素免疫検定法(ELISA)または当業界で知られている
他の検定法、例えば免疫蛍光検定法、化学発光検定法または生物発光検定法があ
る。
検定で特に有用な放射性同位元素は、”H% ”’I、131■、map。
”S、”CS”Cr、”C1,”Co、”Co、l1pe、715eおよびIS
”Euである。
放射性標識は一ス体例を代表するものであり、別法として、ペプチド配列または
それに対する抗体は、当業界で公知の技術を用いた、蛍光性標識、酵素標識、遊
離基標識、アビジン−ビオチン標識またはバクテリオファージ標識を用いても標
識され得る(チャード、「ラボラトリ−・テクニクス・イン・バイオロジー」、
「アン・イントロダクション・トウ・ラジオイムノアッセイ・アンド・リレイテ
ツド・テクニクス」、ノース・ホーランド・パブリッシング・カンパニー(19
78))。
代表的な蛍光性標識には、フルオレセイン、イソチオシアナート、ローダミン、
フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、0−7タルデヒドお
よびフルオレスカミンがある。
代表的な化学発光性化合物には、ルミノール、イソルミノーノ呟芳香族アクリジ
ニウムエステル類、イミダゾール類、アクリジニウム塩類およびしゅう酸エステ
ル類がある。代表的な生物発光性化合物には、ルシフェリン、ルシフェラーゼお
よびエクオリンがある。
代表的酵素には、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコー
ス−6−燐酸デヒドロゲナーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース・オ
キシダーゼおよびペルオキシダーゼがある。
酵素検定法の2つの主たるタイプは、固相酵素免疫検定法(ELISA)および
、エンザイム・マルチイブライド・イムノアッセイ(enzy+ae−mult
iplied immunoassaySE M r T)(シバやコーポレー
ション)としても知られているホモジニアス酵素免疫検定法である。EMITシ
ステムは、トレーサー−抗体複合体における酵素の不活化に依存する。すなわち
、活性は、分離段階を必要とせずに測定され得る。
本発明の範囲に含まれる免疫検定法には、ラテックス凝集検定法、イムノメトリ
ックアッセイおよびきっ抗検定法がある。
ラテックス凝集検定法は、ベルン、G、A、等、「モレキュラー・ブロープス:
テクニクス・アンド・メディカル・アプリケーションスJ、A、アルベルチー二
等編、ラーベン・プレス、ニューヨーク(1989)に記載されており、これを
引用して説明の一部とする。ラテックス凝集検定法では、抗原被覆ラテックス粒
子および試験される血清を混合し、次いで結果を読み取る。HIV−2抗体を欠
く試料を用いると、ラテックス粒子は懸濁した状態のままであり、滑らかな乳状
の様相を保持している。しかしながら、組換え抗原と反応する抗体が存在する場
合、ラテックス粒子は視覚的に検出可能な集合体に凝集する。スライド(例えば
、リギン等、EPO公開済み特許出願第289339号参照。これを引用して説
明の一部とする)、および視覚的または分光光度計、例えばUS4596695
および4775525(これらを引用して説明の一部とする)に記載された装置
により読み取られる特製スライドを用いた視覚的方法を含め、ラテックス凝集検
定法の結果を読み取る幾つかの方法が存在する。
ラテックス凝集検定法は、小量のユーザー、緊急状況およびイムノメトリックア
ッセイに必要とされる高性能の研究設備および供給体制を欠く地域に特に適して
いる。
また、凝集検定法を用いてもHIV−2抗体を検出することができる。この方法
では、所望のペプチド・7ラグメントを、ラテックス・ビーズ以外の適当な粒子
、例えばゼラチン、赤血球、ナイロン、リポソーム、金粒子等に固定する。これ
らにおける抗体の存在は、沈澱反応と同様に凝集を誘発し、次いで、比濁分析法
、混濁度、赤外線分光測定法、視覚診査、比色定量法などといった技術により検
出され得る。
イムノメトリックアッセイには、7オワード・サンドイッチ、逆サントイ7チ免
疫検定法および同時検定法がある。これらの6語は当業界の熟練者には充分理解
されているものである。イムノメトリックアッセイは、HIV−2に対する抗体
の検出に関して記載されている。これらの検定法では、ペプチド・フラグメント
は固相担体に結合し、抗IgG抗体は検出可能な形で標識されている。
フォワード・サンドイッチ免疫検定法では、最初に、HIV−2に対する抗体を
含む疑いのある試料を、ペプチド・7ラグメント含有固相免疫吸収剤(i+nm
unoabsorbent)とインキュベージコンする。
試料中の抗体が固定されたペプチド・フラグメントに結合するのに充分な時間イ
ンキュベーションを続行する。最初のインキュベーション後、同相免疫吸収剤を
インキュベージコン混合物から分離し、同じく試料中に存在し得る干渉性物質を
洗浄除去する。続いて、固定されたペプチド・フラグメントに結合した抗体を含
む固相免疫吸収剤を、検出すべき抗体の異なるドメインと交差反応する可溶性標
識抗体と再びインキュベーションする。第2のインキュベーション後、さらに洗
浄することにより、非結合標識抗体を固相免疫吸収剤から除去し、非特異的結合
標識抗体を除去する。次いで、固相免疫吸収剤に結合した標識抗体が検出され、
検出された標識抗体の量は、もとの試料中に存在する抗体の量の直接的尺度とし
て用いられる。別法として、免疫吸着複合体に伴わない標識抗体も検出され得、
この場合、測定値は試料中に存在する抗原の量に逆比例する。フォワード・サン
ドイッチ検定法は、例えばアメリカ合衆国特許第3867517号、同第401
2294号および同第4376110号に記載されている。
逆サンドインチ検定法では、HIV−2に対する試験抗体を含む疑いのある試料
を、まず標識抗抗体とインキュベーションした後、試験抗体の異なるドメインと
交差反応する固定ペプチド・フラグメントを含む固相免疫吸収剤をそこに加え、
第2のインキュベーションを行う。フォワード・サンドイッチ検定法により要求
される最初の洗浄段階は必要とされないが、第2インキユベーシヨン後に洗浄が
行なわれる。逆サンドイッチ検定法は、例えばアメリカ合衆国特許第40988
76号および同第4376110号に記載されている。
同時サンドインチ検定法では、試料、ペプチド・フラグメントが固定されI;免
疫吸収剤および試験抗体の異なるドメインに特異的な標識可溶性抗体を一インキ
ュベーション段階で同時にインキュベーションする。同時検定法は、単一インキ
ュベーションのみを必要とし、洗浄段階は必要としない。同時検定法の使用は、
操作が容易で、均質で、再現性があり、検定法が一次性であり、非常に精密であ
るため、非常に有用な技術である。同時サンドイッチ検定法は、例えばアメリカ
合衆国特許第4376110号に記載されている。
また、いわゆる遅延型イムノメトリックアッセイも使用され得、例えばチューの
アメリカ合衆国特許第4289747号およびウォルターズのアメリカ合衆国特
許第4343896号に記載されている。
別のイムノメトリックアッセイは、Fc捕獲技術を伴う。Fc捕獲免疫検定法で
は、総血清抗体が、典型的には固体支持体に結合した抗ヒトFc抗体により捕獲
される。すなわち、結合した、検出すべき抗体のFc領域は、他の蛋白質−蛋白
質相互作用に関与しない。
次いで、検出すべき抗体は、この発明のHIV−2ペプチド・フラグメント(複
数もあり得る)または適当なキメラ・ペプチド・フラグメント(複数もあり得る
)によりスクリーニングされ得る。好ましいFc捕獲免疫検定法は、1988年
6月8日付けのアメリカ合衆国シリアルナンバー07/203730に記載され
ており、これを引用して説明の一部とする。
上記検定法の各々では、抗体含有試料、ペプチド・フラグメントを固定した固相
免疫吸収剤および標識可溶性抗体を、試験抗体を固定されたペプチド・7ラグメ
ントおよび可溶性抗体に結合させるのに充分な条件下および充分な時間インキュ
ベージジンする。一般に、固相への標識抗体の結合を最大化することによりシグ
ナルも増加するため、可能な限り多くの抗体と結合させるのに充分なインキュベ
ーション条件の提供が望ましい。勿論、標識抗体およびフラグメントの具体的濃
度、インキュベージ9ンの温度および時間並びに他の上記検定条件は、試料中の
抗体濃度、試料の性質などを含む様々な因子により変化し得る。当業界の熟練者
であれば、常用の実験法を用いることにより、各測定に好影響を及ぼす最適な検
定条件を決定することができる。
この発明で使用され得、これまでにも使用されてきた多くの固相免疫吸収剤が存
在する。よく知られI;免疫吸収剤には、ガラス、ポリスチレン、紙、ポリプロ
ピレン、デキストラン、ナイロンおよび他の材料から形成されたビーズ、上記材
料から形成またはそれらによって被覆されたチューブなどがある。固定されたペ
プチド・フラグメントは、例えばアミドによる共有結合またはエステル結合また
は吸着などの技術により、固相免疫吸収剤へ共有結合または物理的に結合され得
る。当業界の熟練者であれば、ペプチド・フラグメントの結合に適した多くの他
の担体を知っているか、または常用の実験法を用いてそれらを確認することがで
きる。
微量の有機分子、例えばホルモン、蛋白質、抗体などの検出に有用な一般的きっ
抗的結合検定技術は当業界では濁知である。チャード(前出)参照。これらのき
っ抗的結合検定技術のいずれかが、HIV−2抗体検出用に使用され得る。きっ
抗的結合検定法、一般的に放射線免疫検定法(RIA)を行うためには、ペプチ
ド・フラグメントに応じて産生された標識抗体およびHIV−2試験杭体に対す
る親和力を有する結合性分子の提供が必要である。未知量のHIV−2抗体を含
む少量の液体まt;は組織試料を、産生された標識抗体および既知量の抗体特異
的ペプチド・7ラグメントの存在下でインキュページ齋ンする。
産生される抗体は、好ましくはこの発明の抗原性ペプチド・7ラグメントにより
生成される。一旦、試験試料と7ラグメントおよびトレーサー含有抗体とのイン
キュページ璽ンが完了すると、遊離および結合(免疫複合)形態間におけるトレ
ーサー含有分子の分布を測定することが必要である。常ではないが、通常、これ
は、結合7ラクシ2ンが遊離7ラクシ1ンと物理的に分離されていることを必要
とする。例えば、特異的ペプチド・フラグメントはプレートに結合され得る。様
々な他の技術もその目的に使用され得、各々トレーサー含有分子の遊離および結
合形態間の物理化学的差異を利用する。
一般に利用可能な方法は、ヤロウによる「7アーマコロジカル・レビュー」、2
8:161(1973)に記載されている。これらの技術には、吸着、沈澱、塩
析技術、有機溶媒、電気泳動的分離などがある。チャード(前出)、405−4
22頁参照。
上記イムノメトリックアッセイの場合と同様、可溶性抗体は、検出可能な標識、
例えば放射性標識、蛍光性標識、酵素標識、遊離基標識またはバクテリオファー
ジ標識により標識され得る。最も一般的には、1111識は放射性li[識また
は酵素標識である。
この発明によるHIV−2免疫原性ペプチド・フラグメントは、抗体産生の刺激
に使用され得る。抗体産生を刺激するため、ペプチド・7ラグメントは、当業界
でよく知られ、常用されている技術を用いて、担体蛋白質、例えば牛血清アルブ
ミンまたはキーホール・リンペット・ヘモシアニン(KLH)に結合され得る。
好ましくは、担体蛋白質は、システィン残基によりペプチド・7ラグメントに結
合させたKLHである。
サラに、HIV−2ペプチド・7ラグメントは、免疫学的lこ不活性または活性
担体と混合され得る。免疫応答を促進または誘導する担体、例えばフロイント完
全アジュバントが使用され得る。
動物Iこおける抗血清の製造はよく知られた技術である(例えば、チャード(前
出)、385−396頁、および[アンティボディーズ、ア・プラクティカル・
ハンドブックJ% Iおよび11巻、D5キャティー編、IRLプレス、ワシン
トン、D、C,(1988)参照)。動物の選択は、普通、利用可能な施設およ
びに生成される抗血清の容量に関して想定される必要条件間のバランスにより決
定される。大量の血清が容易に得られるため、大型種、例えばヤギ、ロバおよび
ウマが好まれ得る。しかしながら、高い力価の抗血清が得られることが多いさら
に小さい種類、例えばウサギまたはモルモットの使用も可能である。通常、抗原
性物質(ペプチド・フラグメント・ハプテン−担体蛋白質コンジュゲート)の皮
下注射は、抗体が産生される動物の免疫系へ導入される。適当な抗体の検出は、
抗血清を適当に標識したトレーサー含有分子で試験することにより行なわれ得る
。次いで、トレーサー含有分子に結合する7ラクシaンを分離し、必要ならばさ
らに精製する。
次いで、こうして得られた抗体を様々な免疫検定法で利用することにより、HI
V−2ウイルスまたはそのフラグメントの同定および定量が行なわれ得る。この
発明のペプチド・フラグメントに対して産生される、キャディー(前出)に記載
された公知技術により生成されl;、ポリクローナル抗体およびモノクローナル
抗体は両方とも免疫検定法で使用され得る。
イムノメトリックアッセイを用いてHIV−2ウイルスまたはその一部分を検出
する場合、2種の別個の相異なる抗体が必要とされる。これらの抗体の一つは固
相支持体に結合され、他方は検出可能な形で標識される。本質的に、2種の異な
る抗体は、HIV−2ウイルスに特異的であるが、ウィルス蛋白質の異なるドメ
インと交差反応する。−態様では、2種の相異なる抗体は、この発明による2種
の相異なるペプチド・フラグメントを用いて製造され得る。一方は担体l;結合
し、他方は検出可能な形で標識された、相異なるペプチド・フラグメントに対す
る抗体の使用は、様々なサンドイッチ検定法において有用である。
別法として、同じペプチド・フラグメントを用いて、2つの相異なる種類、例え
ばウサギおよびマウスにおいて抗血清を製造することにより、HIV−2ウイル
スに特異的ではあるが、相異なるドメインと交差反応する抗体の製造も可能であ
る。
さらに、この発明の検定法で使用される材料は、理想的にはキットの製造に遺し
t:ものである。前記キットは、1つまたはそれ以上の容器手段、例えばガラス
瓶、試験管などを閉鎖封入状態で受容すべく区画化されている担体手段を含み得
る。前記容器手段の各々は、この方法で使用される個別成分の一つを含む。
例えば、前記容器手段の一つは、免疫吸収剤結合ペプチド・7ラグメントを含み
得る。前記7ラグメントは、別々の固相免疫吸収剤または直接容器の内壁へ結合
され得る。第2容器は、検出可能な形で標識された抗抗体の凍結乾燥形態または
溶液を含み得る。
また、この担体は、さらに各々相異なる予め測定された既知量の抗体を含む複数
の容器を含み得る。次いで、これらの後記容器を用いることにより、標準曲線が
作成され得、そこから未知量の抗体を含む試料から得られる結果が補間され得る
。
この発明を実践する場合、HIV−2抗体またはウィルスそのものもしくはその
一部分の存在は、生物流体および組織で検出され得る。未知量のHIV−2抗体
またはHIV−2を含むあらゆる試料が使用され得る。通常、試料は、液体、例
えば尿、唾液、涙滴、脳を髄液、血液、血清など、まI;は固体もしくは半固体
、例えば組織、糞便などである。当業界で知られている通り、HIV−2ウイル
スおよびこのウィルスに対する抗体は、TJI胞疾患、後天性免疫不全症候群(
AIDS、エイズ)および前エイズ状態、例えばエイズ関連コンプレックス(A
RC)に関与する。さらに、当業界では、ヒトまたは動物がAIDSまたはAR
Cにり患していなくても、HIV−2に対する抗体が、上記ヒトまたは動物の生
物流体または組織に存在し得ることも知られている。
この発明によるペプチド・7ラグメントは、HIV−2ウイルスに対するワクチ
ンとしても使用され得る。このペプチド・フラグメントは、当業界において一般
的に知られている通り、製造され、動物に投与されることにより抗体の産生を刺
激し得る。好ましくは、ワクシニアウィルスは、HIV−2ワクチンの製造を目
的として既知手段に従い使用され得る。
以下、実施例において、この発明を寅施する場合に使用される原材料および方法
の記載を行う。これらの実施例は、いかなる意味にせよこの発明を限定するもの
ではない。
実施例
実施例I
HIV−2工ンベロープ発現性クローンMZ−1/pK1の構築。
K3Dクローンは、ブルースクリプト・ベクター(ストラタジーン、インコーホ
レイテッド)へ5295位〜9012位のHIV−2のKPNIフラグメントを
挿入することにより製造されSBL/l5Y
I;、完全なHIV−2クローンHIV−2C7ランチー二等、SL/ISY
「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナシ3ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ
ーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニーJ86:2433−2437(198’9)
)のサブゲノム・フラグメントである。HIV−2クローンに3Dは、ジェノベ
ツ7ア・7ランチー二により提供された。
エシェリヒア・コリにおけるHIV−2のenv領域のペプチド・7ラグメント
を発現させるプラスミドであるpKlの構築戦略は、図1で説明されている。
K3D DNAを、7297位で切断する制限酵素EcoRIにより消化した。
、EcoR1末端をフレノウ・ポリメラーゼによりプラント化し、8glllリ
ンカ−を加えた。次いで、DNAをBglrlおよび5au3AIにより消化し
た。7297位のEcoR1部位(Bglllへ変換)から8139位の5au
3AI部位へ伸びる約848塩基対の7ラグメントを精製し、BamHIで制限
した発現ベクターPCBC1へクローン化することにより、クローンpK1が生
成された。
プラスミドpc B C1は、バタテリオファージのラムダpLプロモーターを
利用するエシェリヒア・コリ発現ベクターでアル。pCBClはpJL6(ラウ
テンバーガー等、Gene Anal、 Teeh、l :53(1984))
に似ており、その構築は、ベルン等、アメリカ合衆国特許第4753873号に
完全に記載されている(これを引用して説明の一部とする)。
バクテリオファージ・ラムダC、、、、について溶製性の株である、エシェリヒ
ア・コリ株MZ−1をpKIの宿主株として用いて、32°C〜442℃の温度
シフトにより、組換え蛋白質合成を誘導した(ナイ等、「ネイチャーJ309:
810(1984))。図2で示されている通り、温度シフトの結果、34kd
蛋白質が合成された。分離された蛋白質のウェスタン・プロット移動後、Klと
呼ばれる誘導されI;蛋白質は、HIV〜2感染個体からのヒト血清と特異的に
反応した(図3)。Klの暗号化領域の完全なりNA配列および誘導されたアミ
ノ酸配列を図4に示す。
実施例2
HIV−2工ンベロープ発現性クローンMZ−1/pK3の構築に3D(実施例
1に記載)を5au3AIにより消化しt;。この切断により、7101位から
8139位までの1038塩基対フラグメントが生じた(図5)。フラグメント
を精製後、それを発現ベクターpCBC2”ライゲーションした。pCBC2は
、まさに5’−BamHTクローニング部位の単一塩基対がpcBclとは異な
っている。
この場合、適切な解読枠を配列させるのにpcBclではなくpCBC2が使用
された。pCBC2もまt;、ベルン等、アメリカ合衆国特許第4753873
号に記載されており、これを引用して説明の一部とする。生成されたプラスミド
pK3をエシェリヒア・コリ宿主MZ−1へ移した。32℃〜42℃へMZ −
1/pK 3培養物を温度シフトすると、40kdの組換え蛋白質の合成が誘導
された(図6)。ウェスタン・プロット分析は、K3と呼ばれるこの蛋白質がH
IV−2感染個体からの血清と特異的に反応することを示した(図7)。pK3
の暗号化領域の完全なりNA配列および誘導されたアミノ酸配列を図8に示す。
実施例3
HIV−2−HIV−1キメラ・エンベロープ発現性クローンMZ−1/pKI
DG71の構築。
プラスミドを構築してキメラ・エンベロープ・クローンを発現させるストラテジ
ーを図9に示す。プラスミド・クローンpL CB C○DG71Aは、ベルン
等、US4753873に記載されており、これを引用して説明の一部とする。
このプラスミドは、HIV−1エンベロープ・ポリペプチドの発現に使用される
。pLcBcODG71AをBglllおよびBamHIにより消化した。Bg
lllは407位で開裂し、BamHIは944位で開裂する。537BPフラ
グメントを分離した。
890位で開裂するBamHIにより、実施例1記載のpKlプラスミドDNA
を消化しf:、pLcBcODG71A(7)537BP Bglll−Bam
H17ラグメントを、BarnH1消化pKlにライゲーションした。生成した
プラスミドpKIDG71を、エシェリヒア・コリ宿主MZ−1に移した。MZ
−1/pK IDG71培養物を32℃から42℃に温度シフトすると、約55
kdの組換え蛋白質の合成力N11.’hf:、Cr1lJ l O)。HIV
−2感染個体、HI V−2感染個体および陰性対照から採取しl:血清により
ウェスタン・プロット分析を行った。ウェスタン・プロット(図11)は、キメ
ラHI V−2−HI V−1蛋白質KIDG71が、HI V−1感染個体カ
ラ得うした血清(図11A)およびHIV−2感染個体から得られた血清(図1
1B)と反応することを示した。陰性血清との反応性は全く観察されなかった(
図11C)。
pKIDG71の暗号化領域の完全なりNA配列および誘導されたアミノ酸配列
を図12に示す。
実施例4
HI V−2−HI V−1−HTLV−1−キ/ 5− エンベロープ発現性
クローンの構築。
HI V−2−HI V−1−HTLV−I −キ) ラ−エンベロープ発現性
クローンの構築ストラテジーを図13および図14で説明する。
pcBI353は、発現プラスミドpcBc1ヘクローン化されたセイキ等の発
表した配列(「プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニーJ80:361 B(1983
))に基づいた、塩基対6101−6118および6170−6499(7)H
TLV −1エフへo −7’遺伝子領域を含む発現プラスミドである。プラス
ミドpcBc1353をBamHIおよび5allで消化することにより、37
0塩基対フラグメントが生成された。BaraHIおよび5alIにより消化さ
れたプラスミドpcB2DG71へ、前記370BPフラグメントを挿入した。
pcBc2DG71は、HI V −l xンヘcy−プ蛋白質ノポリペプチド
をコードする発現プラスミドである。このプラスミドは、ベルン等、US475
3873に記載されており、これを引用して説明の一部とする。生成しt;プラ
スミドpDG71353は、HIV−1−HTLV−Iのキメラ・ポリペプチド
をコードする。pDG71353の暗号化領域の配列を図15に示す。
図14は、HIV−2−HIV−1−HTLV−、I構築に関スル残りの段階を
示す。pDG71353をHindll+および5ailにより消化した。HI
V−1−HTLV−Iポリペプチドをコードする配列を含む挿入部分を、H4
ndll+および5ailで消化されたベクターpK I DG 71ヘライゲ
ーシヨンした。pKIDG71は実施例3に記載されている。生成したプラスミ
ドはpKIDG71353と呼ばれる。pKIDG71353を細菌株MZ−1
へ導入させた。
MZ−1pKIDG71353を、32℃から42℃への温度シフトにより誘導
すると、68kdの蛋白質が製造されI;(図16)。分離された蛋白質のウェ
スタン・プロット移動後、誘導された蛋白質は、HI V−1陽性個体から得ら
れた血清(図17)、HIV−2陽性個体から得られた血清(図18)およびH
TLV−1陽性個体から得られた血清(rI!J19)と特異的に叉応した。陰
性血清との特異的反応性は見られなかった(図20)。pKIDG71353の
暗号化領域の完全な配列を図21に示す。
実施例5
HIV−2env(K−1)およびHrV−2−HIV−1キメラ抗原の精製。
次の精製方法を用いて、HIV−2env(Kl)およびHIV−2−HIV−
1キメラ抗原の両方を精製しt;。
ニシェリヒア・コリ細胞を、2ミリモルのPMSF、アプロチニン(細胞1グラ
ム当たりO、l mg)およびデオキシリボヌクレアーゼ!(細胞1グラム当た
りO、l mg)を含む5envモルのトリスHCI。
pH7,5(細胞1グラム当たり3 ml)中で10分間リソチーム(細胞1グ
ラム当たり1 mg)による酵素消化により溶解し!;。この溶液を1%トリト
ンX−100へ導入し、室温で30分分間上んした。不溶性物質を30分間12
000xgの遠心分離により集め、デオキシリボヌクレアーゼI(細胞1グラム
当たり0.05+ng)および265ミリモルのMgC1,が加えられる点以外
は上記と同様に再消化した。
消化後、沈澱物を上記と同じ遠心分離により集めた。
次いで、不溶性物質を、次の緩衝液(細胞0.2グラム/ml):1)lOミリ
モルEDTAおよび0.5%ツウイツタージエント3−14を含む5envモル
のトリスHCI、pH9,0,2)5envモルのトリスHCI、pH9,0/
1モルNaC1,3)5envモルのトリスHCI、pH7,5中6モル尿素、
4)1%β−メルカプトエタノール含有5envモルのトリストC1%pH9中
8モル尿素
により連続洗浄した。
各場合とも、組換え抗原が不溶性沈澱物中に残存していた。次いで、8モル尿素
洗浄による沈澱物を、7モルのグアニジン−HCl、pHl1.olo、5%β
−メルカプトエタノールにより可溶化した。
HIV−2env抗原およびHTV−2−HIV−1キメラ蛋白質は両方とも高
疎水性であり、グアニジン−HClの除去時に集合体を形成しやすい。この集合
体形成を阻止するt;め、可溶化抗原を、水性緩衝液における抗原の溶解度を高
めるべく設計された下記の化学的修飾に付しt;。
まず、6モルのグアニジン−HCl中可溶化された蛋白質を、pH8,5でのβ
−メルカプトエタノールに対して1.2倍過剰のヨード酢酸によりアルキル化し
た。未反応ヨード酢酸を全てβ−メルカプトエタノールによりクエンチングしt
;。アルキル化試料を、200倍の5envモルのボラ−t−1pH9−0に対
して3回透析した。透析すると、蛋白質は不溶性になった。不溶性物質を遠心分
離により集め、アシル化用に8モル尿素、50ミリモルのボラート、pH9゜0
に再溶解しt;。
アルキル化抗原をアシル化するため、抗原に存在するアミノ基に対して50倍過
剰のシトラコン酸無水物を加え、溶液のpHをNaOHにより8.5ないし9.
0に維持した。反応完了後、シトラコニル化試料を4℃で50ミリモルのボラー
ト、pH9,0に対して透析した。透析後、シトラコニル化蛋白質は水性緩衝液
に溶け、標準クロマトグラフィー技術に敏感に反応しやすくなつI;。
次いで、修飾されI;蛋白質試料を、50ミリモルのボラート、pH9,0中で
平衡させf−D E A E −T S Kカラムに適用した。カラムを0.3
−1モルNaC1の一次勾配により展開し、組換え抗原を溶離させた。HI V
−2envSK −1、抗原またはHIV−2−HIV−1キメラ蛋白質KI
DG71を含む7ラクシヨンをプールしI;。
間接的免疫検定法(EIA)を用いて、精製されたKlおよびキメラKIDG7
1抗原の免疫反応性を試験した。K−2およびキメラ抗原に対して各々0.5μ
gおよび1.0μgの濃度で組換え抗原によりマイクロタイター・ウェルを被覆
した。洗浄し、ウェル上の非特異的結合部位をブロックした後、1:20に希釈
したヒト血清を加え、存在する抗体を37℃で1時間組換え抗原に結合させた。
ウェルを洗浄して非結合抗体を除去し、結合抗体の存在を西洋わさびペルオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗ヒト抗体およびTmB(3,3″、5.5’−テトラメチル/
ベンジジン)の基質により検出した。反応をH,SO6により終結させ、OD
a *。を測定した。様々な血清に関する各抗原により得られたシグナルの分布
を表1に示す。
FIG、 1
FIG、3
FIG、4
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弧葺電冨葺葺
I葺薦冨I葺
670 6B0 690 700 710 720真夏葺夏1N
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FIG、 6
FIG、 7
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FIG、 9
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FIG、 15 (cont、)
FIG、 16
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670 6B0 690 700 710 720丁GTGCGTTTAt、A
CMGTCTGCCACACT^CT[iTACCATGGGTAMT(IAc
ACCT丁AACACCTCys Ala Phe Arg Gln Vnl
Cys Has Thr Thr VQI Pro Trp VQI Asn
Asp@Thr Lpu Thr Pr。
7:10 740 750 760 770 780GAG TGG AACA
ACATG ACA TGG CM GAA TGG GM CACAAA A
TCC[iCTTCCTA GAf GCA A^T
Glu Trp Asn Asn )4pt Toy 丁rp Gin GLu
Trp Glu His Lys I lp #g Ph■@Leu GIL
I At+I Asn790 800 810 820 830 +1140A
TCAGT GAG AGT TTA GAA CAG GCA CAA AT
CCAG CM GM AAG ^^T ATG 74丁@GAG CTG C
M
lle Ser Glu Ser Leu Glu Gln AIQ Gln
lie Gin Gin Glu Lys Asn Met@Tyr Glu
Leu G1n
AAGCTAMTAGCTGGGATGTTTTTGGCMTTGGTTTGA
CT丁AACCTCCTGGATCTTCAGALys Lpu Asn Se
r Trp Asp Vat PheGly Asn Trp Phe Asp
Lt+u Thr Ser@Trp I le Phe Arg
9:0 920 930 940 950 96011夏電璽厘
夏葺葺lI蔓葺
FIG、 21 (cant、)
Gin Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu
Glu Leu Asp Lys Trp AIQ Arg@] IleGlu
Asp Leu
C6^ TCCC(ic TCCC[iCCG^ GCG GCT GGC(i
[iG ATT ACCGGCTCCATG TCCCTCmiCCTCA G
GA
Arg Ser Arg Ser Arg Arg AlCl AlCl Gl
y Gly 11e Thr Gly Ser Met S■秩@Lpu^In
Spr Gly
15+0 1520 1530 1540 1550 +560^A(i AG
CCTCCTA C4丁 GAG GTG GACAAA GAT ATT T
CCCAG TTA ACT CAA GC` ATA GTCAAA
Lys Ser Leu Leu Hls Glu V(11A5P Lys
Asp 1ieSer Gln Leu Thr Gin `IQ ]IEI
Va(Lys
1570 1580 1590 1600 16+0 1620^ACCACA
M MT CT^ CTCMA ATT GCG CAGTA丁 GCT GC
CC^G AACAGA CGA GGCCsT GAT
Asn H+s Lys Asn Leu Leu Lys lie^In G
ln Tyr^In Ala Gin Asn Arg A窒■@Gly Le
u^5p
CTCCTG TTCTGG にAG CM [iGA [iGA TTA T
(ic AM GCA TTA CM GAA CAG TfCCGT TTT
CCG
しeu Lpu Phe Trp [1+lu Gln Gly Gly Le
u Cys Lys ^In Leu 鼠n Glu Gl氏@Cys Arg
Phe Pr。
MT ATT ACCMT TCCGAT GTCCCA ATA CTA C
M CAA AGA CCCCCCCTT [1^G ^A噤@CGA GTC
Asn l le Thr Asn Ser H+5 VQI Pro Ile
LEILI Gin Glu Arg Pro Pro keu Glu A
sn Arg Vn1C丁GAC丁 [3GCTGG GGCCTT AACT
GG G^CCTT G(Ic CTCTCA CA[i TGG GCT C
G` TCCTAG
しEILI Thr Gly Trp Gly Leu Asn Trp ^s
p Leu Gly Leu Ser Gin Trp A撃bl Arg S
er −−−
FIG、 21 (cant、)
国際調査報告
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)HIV−2ウイルスのエンベロープ領域の約848塩基対のヌクレオチド によりコードされるペプチド・フラグメントであり、図4に示された7297位 〜8139位のHIV−2プロウイルス・ヌクレオチドによりコードされるペプ チド。フラグメント。 (2)HIV−2ウイルスのエンベロープ領域の約1038塩基対のヌクレオチ ドによりコードされるペプチド・フラグメントであり、図8に示された7101 位〜8139位のHIV−2プロウイルス・ヌクレオチドによりコードされるペ プチド・フラグメント。 (3)HIV−2ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチ・フラグメン トおよびHIV−1ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグ メントを含むキメラHIV−2−HIV−1ペプチド・フラグメント。 (4)請求項1記載のHIV−2ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプ チド・フラグメントおよびHIV−1ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用 ペプチド・フラグメントを含むキメラHIV−2−HIV−1ペプチド・フラグ メント。 (5)HIV−1ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグメ ントが、クローンGまたはそこから誘導されたペプチド・フラグメントから成る 群から選択される、請求項4記載のキメラHIV−2−HIV−1ペプチド・フ ラグメント。 (6)HIV−1ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグメ ントがCBre3である、請求項4記載のキメラHIV−2−HIV−1ペプチ ド・フラグメント。 (7)HIV−2ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグメ ント、HIV−1ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグメ ントおよびHTLV−1ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フ ラグメントを含むキメラHIV−2−HIV−1−HTLV−1ペプチド・フラ グメント。 (8)HIV−2ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグメ ントが、図4に示された7297位〜8139位のHIV−2プロウイルスヌク レオチドによりコードされるか、または図8に示された7101位〜8139位 のHIV−2プロウイルス・ヌクレオチドによりコードされる、請求項7記載の キメラHIV−2−HIV−1−HTLV−1ペプチド・フラグメント。 (9)HIV−1ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグメ ントが、図21に示されたKlDG71353のHIV−1暗号化配列を含む、 請求項7記載のキメラHIV−2−HIV−1−HTLV−1ペプチド・フラグ メント。 (10)HlV−2ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグ メントおよびHTLV−1ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・ フラグメントを含むキメラHIV−2−HTLV−1ペプチド・フラグメント。 (H)HIV−2ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグメ ントが、図4に示された7297位〜8139位のHIV一2プロウイルス・ヌ クレオチドによりコードされるか、または図8に示された7101位〜8139 位のHIV−2プロウイルス・ヌクレオチドによりコードされる、請求項10記 載のキメラHIV−2−HTLV−1ペプチド・フラグメント。 (12)HTLV−1ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラ グメントが、6101−6118および6170−6499位のHTLV−1プ ロウイルス・ヌクレオチドによりコードされる、請求項10記載のキメラHIV −2−HTLV−1ペプチド・フラグメント。 (13)HIV−1ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグ メントおよびHTLV−1ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・ フラグメントを含むキメラHIV−1−HTLV−1ペプチド・フラグメント。 (14)HIV−1ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグ メントが、クローンGまたはそこから誘導されたペプチド・フラグメントから成 る群から選択される、請求項13記載のキメラHIV−1−HTLV−1ペプチ ド・フラグメント。 (15)HlV−1ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグ メントがCBrc3である、請求項13記載のキメラHIV−1−HTLV−1 ペプチドフラグメント。 (16)HTLV−1ウイルスのエンペロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラ グメントが、6101−6118および6170−6499位のHTLV−1プ ロウイルス・ヌクレオチドによりコードされる、請求項13記載のキメラHIV −1−HTLV−1ペプチド・フラグメント。 (17)請求項1−16または22−24記載のペプチド・フラグメントのずれ かをコードするDNAを含む、宿主細胞形質転換用の組換えベクター。 (18)HIV−2抗体の検出方法であって、(a)HIV−2に対する抗体を 含む疑いのある試料を、請求項1−12または22−24のいずれか1項記載の ペプチド・フラグメントと接触させ、 (b)上記抗体の存在を検出する 段階を含む方法。 (19)HIV−1抗体の検出方法であって、(a)HIV−2に対する抗体を 含む疑いのある試料を、請求項3−9または22−24のいずれか1項記載のペ プチド・フラグメントと接触させ、 (b)上記抗体の存在を検出する 段階を含む方法。 (20)HTLV−1および/またはHTLV−11抗体の検出方法であって、 (a)HIV−2に対する抗体を含む疑いのある試料を、請求項7−16のいず れか1項記載のペプチド・フラグメントと接触させ、(b)上記抗体の存在を検 出する という段階を含む方法。 (21)試料からHIV−2、HIv−1またはHTLV−1およびHTLV− 11抗体またはそれらの抗体の組み合わせを検出するためのキットであって、1 個またはそれ以上の容器をその中に閉鎖封入状態で受容すべく区画化されている 担体を含み、さらに1.請求項1−16または22−24のいずれか1項記載の ペプチド・フグメントを含む第1容器手段、および2.HIV−2、HIV−1 またはHTLV−1およびHTLV−11抗体またはそれらの組み合わせの存在 を測定するための検出システム を含むキット。 (22)請求項2記載のHIV−2ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペ プチド・フラグメントおよびHIV−1ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断 用ペプチド・フラグメントを含むキメラHIV−2−HIV−1ペプチド・ラグ メント。 (23)HIV−1ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグ メントが、かクローンGまたはそこから誘導されるペプチド・フラグメントら成 る群から選択される、請求項22記載のキメラHIV−2−HIV−1ペプチド ・フラグメント。 (24)HIV−1ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグ メントがCBre3である、請求項22記載のキメラHIV−2−HIV−1ペ プチド・フラグメント。
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