JPH04502773A - １種より多い抗体について試験するための診断用蛋白質 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 １種より多い抗体について試験するための診断用蛋白質発明の分野 この発明は、ヒト免疫不全ウィルス２（ＨＩＶ−２）のある種のエンベロープ・ ペプチド・フラグメントがＨＩＶ−２抗体に対して特に免疫反応性を示すという 発見に関するものである。従って、これらの７ラグメントは、ＨＩＶ−２に対す る抗体の検出を目的とする免疫診断的試験に適用され得る。この発明はまた、Ｈ ＩＶ−２、ＨＩＶ−１，ＨＴＬＶ−１８よびＨＴＬＶ−１１に対する抗体に関す る試験に使用され得るＨＩＶ−２、ＨＩＶ−１またはＨＴＬＶ−１のユンベロー ブ遺伝子の免疫原部分から製造されるある種のキメラ・ペプチド・フラグメント に関するものである。

発明の背景 ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）は、ＲＮＡに遺伝子コードを有するレトロウ ィルスである。ヒトの場合、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、エイズ）は、２ つのタイプのＨＩＶ、すなわちＨＩ　Ｖ−１またはＨＩＶ−２のいずれかにより 誘発され得る。

ＨＩＶ−１（元来ＨＴＬＶ−Ｉｌ＋）は、ガロおよびモンタギア等、Ｕ３４５２ ０１１３により分離および同定された。ラトナー等、「ネイチャーＪ３’１３： ２７７−２８４（１９８５）、ミュージング等、「ネイチャーＪ３１３：４５０ −４５８（１９８５）、サンチェスーペスカドール等、「サイエンスＪ２２７： ４８４−４９２（１９８５）およびワイン〜ポプリン等、「セルＪ４０：９−１ ７（１９８５）は、ＨＴＬＶ−ＩＩ＋ウィルスの完全なりＮＡ配列を開示してい る。

ＨＩＶ−２（元来ＬＡＶ−２）は、最初面アフリカのエイズ様疾患患者から分離 された（クラベル、Ｆｌ等、「サイエンスＪ２３３：３４３−３４６（１９８６ ）、クラベル、Ｆ２等、「ネイチャーＪ３２４　：６９　］−６９５（１９８６ ））。

ＨＩＶ−１７；よびＨＩＶ−２は、Ｔ４トロピック・レトロウィルスというウィ ルスの種類に属するヒトＴ細胞白血病−リンパ腫ウィルス（ＨＴＬＶ）に関連し ている。ＨＴＬＶ−１は、Ｔ細胞白血病およびリンパ腫の病因である。元来毛様 細胞性白血病患者から分離され！：ＨＴＬＶ−１１は、成熟Ｔリン３球の悪性白 血病の発現に関与している。ＨＴＬＩＩのプロウィルス・ゲノムの完全なヌクレ オチド配列は、セイキ等、「プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカ デミ−・オブ・サイエンシーズ（ＵＳＡ）Ｊ８０：３６１８−３６２２（１９８ ３）で与えられている。

レトロウィルスが宿主細胞に感染すると、そのゲノムのＤＮＡコピーはその宿主 の染色体へ組み込まれる。レトロウィルスによっては、ＤＮＡがプロウィルスと して知られている配列形態で宿主細胞の染色体へ組み込まれる場合もある。レト ロウィルスの遺伝子コードのＤＮＡコピーは、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと 呼ばれるウィルス酵素まｔ；は逆転写酵素により合成される。宿主細胞は、ウィ ルス遺伝子のＤＮＡを転写し、ウィルスによりコードされる蛋白質を合成し、次 いでこれらは新しいウィルスに組み立てられる。

ＨＩＶウィルスおよびＨＴＬＶウィルスは、少なくとも（ｉ）内部構造にューロ カプシドまｔ；はコア）蛋白質をコードするｇａｇ遺伝子、（ｉｉ）逆転写酵素 をコードするｐｏｌ遺伝子および（ｉｉｉ）ウィルスのエンベロープ糖蛋白質を コードするｅｎｖ遺伝子を含む。

ＨＩＶ−１を用いた初期の研究において、ガロ（ガロ、Ｒ，Ｃ，等、「サイエン スＪ２２４：５００：５０３（１９８４）、サルナガドハーレン、Ｍ、Ｇ、等、 「サイエンスＪ２２４：５０６：５０８（１９８５））およびモンタニア（バレ ージノウッシ、Ｆ９等、「サイエンスＪ２２０：８６８−．８７１（１９８３） ）は、ウェスタン・プロットを用いて、大部分のエイズ患者がＨＩ　Ｖ−１抗原 に対する抗体ををすることを立証した。この研究結果から、またプロットがｐ１ ７、ｐ２４および他のＨＩＶ−１抗原での非特異的反応を有し得ることが広範に は認められなかったため、ｇａｇ抗原がＨＩＶ−１抗体に関するスクリーニング での使用に適しＩ；抗原であると一般に信じられた。しかしながら、必ずしも全 部のエイズ血清が、ウェスタン・プロットにおいてｇａｇ抗ｙ７ｔｔこ対して反 応性を示すとは限らない。感染の第１の最も信頼できるマーカーは、エンベロー プ蛋白質に対する抗体の存在である。

ＨＩ　Ｖ−１のウィルス性すゼイトは、現在ヒト血清におけるＨｌＶ−１抗体の 検出に汎用されている。ウィルス性すゼイトは、組織培養で生育され、抗原供給 源として部分的に精製されたＨＩＶ−１に由来する。この試験は確かに高感度で はあるが、偽陽性の率が比較的高いという欠点をもつ。多くの科学者らは、これ らの偽陽性がウィルス製品を汚染している細胞蛋白質（ホンター、Ｊ、Ｂ、等、 「ランセット」ｌ＋１２２２−１２２３（１９８５）、セイヤーズ、Ｍ、Ｈ，、 「トランスフュージョンＪ２６：Ｉ　ｌ　３−１１５（１９８６））および交差 反応性抗体の存在（シリ−１Ｌ３等、「サイエンスＪ２２７：１４８４（１９８ ５）、ポルスキー、Ｄ、Ｊ　、、「ニューイングランド・ジャーナル・オプ・メ ディシンＪ３１５：４５７−４５８（１９８６））によるものと考えた。

ＨＴＬＶ−１８よびＨＴＬＶ−１１ウイルスは、抗体陽性者の末梢血白血球から 抗体陰性者の白血球へと（これらを−緒に培養した場合）容易に移され得る。ポ ポビック等、「サイエンスＪ２１９：８５６−８５９（１９８３）。従って、輸 血された血液が感染細胞を含む場合、全血輸血に伴う感染の危険が存在する。

さらに、ｌレトロウィルスに感染した個体には第２のレトロウィルス感染も潜ん でいることがあり得る。まｔ；、ＨＩＶ−１感染者から得ｌ；生物試料は、ＨＴ ＬＶ−１またはＨＴＬＶ−Ｉ＋に対する抗体についての陽性試験結果を与えるこ とが多い。患者血清におけるＨＴＬＶ−１およびＨＩＶ−１抗体に関する次の研 究で検定が行なわれＩ；：ロッジ等、「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・キャ ンサー・（？）Ｃ１ｉｎ、０ｎｃｏ１．Ｊ２２：４１１　４１８（１９８６）、 青木等、「ランセット」、１９８４年ＩＯ月２０日、９３６−９３７頁、テツダ ー等、「ランセット」、１９８４年７月２１日、１２５−１２８頁およびロバ− ドーグロア等、「ランセットＪ、１９８４年７月２１日、１２８−１３０頁。こ れらの研究において、ＨＴＬＶ−１は、ウィルス性すゼイト（ロッジ等および青 木等）およびコア抗原（テ・ンダー等およびロバ−ドーグロア等）により検出さ れた。

パフ、”）−ルＥＬＡＶＩＡｌ１合検定は、ＨＩＶ−１抗体よりもＨＩｖ−２抗 体を優先的に検出することが報告されている。（レリー、前出）。しかしながら 、この検定はＨＩＶ−２ウイルス性リゼイトの使用に基づくため、全ウィルスの 使用を必要とする。

アメリカ合衆国では、ヒト血液を、ＨＩＶ−１８よびＨＴＬＶ−■に対する抗体 および肝炎についてスクリーニングしなければならない。ヒト血清はまた、まも なくＨＴＶ−２に対する抗体に関してスクリーニングされることも必要になると 予想される。すなわち、ヒト生物試料ｌ；おいてＨＩＶ−２に対する抗体の存在 について試験するための信頼できるスクリーニング検定が要望されている。また 、ヒト生物試料から複数の種類の抗体を検出し得る単一試験も要望されている。

発明の要旨 本発明は、ＨＩＶ−２抗体の検出に使用され得る免疫反応性ｅｎｖＨＩＶ−２ペ プチドのアミノ酸配列を含む。本発明はまた、複数の種類の抗体を検出し得る免 疫診断用キメラｅｎｖペプチドのアミノ酸配列を含む。具体的に述べると、これ らのキメラｅｎｖペプチドは、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−１およびＨＴＬＶ−Ｉおよ びＨＴ　Ｌ　Ｖ−１１ｉ：ｌｔする抗体を検出することができる。すなわち、こ の発明は、ＨＩＶ−２−ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２−ＨＩＶ−１−ＨＴＬＶ−１， ＨＩＶ−２−ＨＴＬＶ−ＩＳよびＨＩＶ−１−ＨＴＬＶ−１の免疫診断用ｅｎｖ ペプチド・７ラグメントを含むキメラｅｎｖペプチドを含む。

図面の簡単な記載 図１は、ＨＩＶ−１クローンに３Ｄを含むプラスミドに３ＤおよびｐｃＢｃｌか らのプラスミドｐＫｌの構築を示す。

図２は、Ｋ１と呼ばれる誘導３４ｋｄ蛋白質を示す電気泳動ゲルである。

図３は、誘導蛋白質Ｋｌと、ＨＩＶ−２感染個体から得られたヒト血清との反応 を示すウェスタン・プロットである。

図４は、Ｋ１暗号化領域の完全なりＮＡ配列および誘導されたアミノ酸配列を示 す。

図５は、プラスミドｐＫ３および７１０１位から８１３９位までの１０３８塩基 対フラグメントの構築および発現ベクターｐＣＢＣ２へのに３Ｄのライゲーショ ンを示す。

図６は、Ｋ３と呼ばれる誘導４０Ｍ蛋白質を示す電気泳動ゲルである。

図７は、誘導蛋白質に３と、ＨＩＶ−２感染個体から得られたヒト血清との反応 を示すウェスタン・プロットである。

図８は、Ｋ３の暗号化領域の完全なりＮＡ配列および誘導されたアミノ酸配列を 示す。

図９は、プラスミドｐＬｃＢｃＯＤＧ７１ＡおよびｐＫｌがらのプラスミドｐＫ ＩＤＧ７１の構築を示す。

図１Ｏは、ＫＩＤＧ７１と呼ばれる誘導５５ｋｄ蛋白質を示す電気泳動ゲルであ る。

図１１Ａは、誘導蛋白質ＫＩＤＧ７１と、ＨＩＶ−１感染個体から得られたヒト 血清との反応を示すウェスタン・プロットである。

図１１Ｂは、誘導蛋白質ＫＩＤＧ７１と、ＨＩＶ−２感染個体から得られたヒト 血清との反応を示すウェスタン・プロットである。

図１２は、ｐＫＩＤＧ７１の暗号化領域の完全なりＮＡ配列および誘導されたア ミノ酸配列を示す。

図１３は、プラスミドｐＤＧ７１３５３の構築を示す。

図１４は、プラスミドｐＫＩＤＧ７１３５３の構築を示す。

図１５は、ｐＫＩＤＧ７１３５３の暗号化領域の完全なり　Ｎ　Ａ−配列および 誘導されたアミノ酸配列を示す。

図１６は、誘導６８ｋｄキメラ蛋白質ＫＩＤＧ７１３５３を示す電気泳動ゲルで ある。

図１７は、誘導蛋白質ＫＩＤＧ７１３５３と、ＨＩＶ−１陽性個体から得られた ヒト血清との反応を示すウェスタン・プロットである。

図１８は、誘導蛋白質ＫＩＤＧ７１３５３と、ＨＩＶ−２陽性個体から得られた ヒト血清との反応を示すウェスタン・プロットである。

図１９は、誘導蛋白質Ｋ］ＤＧ７１３５３と、ＨＴＬＶ−Ｉｆｆｌ性個体から得 られたヒト血清との反応を示すウェスタン・プロットである。

図２０は、誘導蛋白質ＫＩＤＧ７１３５３のウェスタン・プロットにおいて陰性 血清との非特異的反応性は全く見られなかったことを示す。

図２１は、ＫＩＤＧ７１３５３蛋白質の暗号化領域の完全なりＮＡ配列および誘 導されたアミノ酸配列を示す。

定義 以下の記載では、組換えＤＮＡ技術および免疫学で使用されている若干の用語が 広範に使用されている。それらの用語に与えられる範囲を含め、明細書および請 求の範囲のさらに明確で矛盾の無い理解を達成するために、次の通り定義を行う 。

プロモーター。転写された配列の５′末端にある開始コドンの近位に位置するＤ ＮＡ配列。プロモーター領域では、近接の機能し得るように結合した遺伝子（複 数も可）の転写が開始される。

遺伝子。ポリペプチドまたは蛋白質をコードするｍＲＮＡの転写に関する情報を 含むＤＮＡ配列。典型的には、最初の転写コドンのヌクレオチドは＋１と番号付 けされ、ヌクレオチドは、遺伝子の転写領域を通して正の整数により連続的ｌこ 番号付けされる。また、ヌクレオチド＋１は、最初の翻訳されたアミノ酸をコー ドする場合もしない場合もあり得る。遺伝子は、５′末端および３′末端に転写 はされるが翻訳はされない領域を有し得る。同様に、遺伝子は、ｍＲＮＡの翻訳 前に切り継ぎ（スプライシング）されなければならないイントロン情報を含む場 合も含まない場合もあり得る。ｔｍＲＮＡは、５′末端および／または３′末端 に翻訳されない領域を有し得る。

プロモーターおよび転写調節領域５′〜転写領域におけるヌクレオチドの番号付 けは、負の整数により連続的に進められ、第１転写コドンの隣の５″ヌクレオチ ドは−１と番号付けされる。

「相補的ＤＮＡＪまたはｒｃＤ　Ｎ　Ａ　Ｊ遺伝子は、ｍＲＮＡの逆転写により 合成された組換え遺伝子を含み、そこから介在配列（イントロン）が除去される 。

機能し得るように結合。この明細書で使用されている、「機能し得るように結合 された」という語は、一方の要素に影響する因子が他方の要素にも影響する形で ２要素が物理的に配置されていることを意味する。例えば、特異的プロモーター の機能を誘発する因子はまた、そのプロモーターに機能し得るように結合した遺 伝子の転写を誘発する。

発現。発現は、遺伝子内でコードされた情報が現れるプロセスである。遺伝子が 蛋白質をコードする場合、発現は、ｍＲＮＡへのＤＮＡの転写およびｍＲＮＡの 蛋白質への翻訳の両方を含む。

クローニング・ビヒクル。プラスミドもしくはファージＤＮＡまたは宿主細胞に おいて自己複製し得る他のＤＮＡ配列であり、ビヒクルの本質的な生物機能を失 わずに決定可能な様式で前記ＤＮＡ配列が切断され得る１ｍまたは少数のエンド ヌクレアーゼ認識部位を特徴とし、そこへＤＮＡがスプライシングされることに より、その複製およびクローニングが誘発され得るＤＮＡ配列。クローニング・ ビヒクルは、さらにクローニング・ビヒクルにより形質転換された細胞の同定で の使用Ｉ：適したマーカーを含み得る。例えば、マーカーは、テトラサイタリン 耐性まｔ；はアンピシリン耐性である。「ベクター」という語は、「クローニン グ・ビヒクル」Ｉ：対して使用されることもある。

発現ビヒクル。クローニング・ビヒクルに類似しているが、宿主への形質転換ｆ ＆を二、そこへクローン化された遺伝子を発現し得るビヒクルまたはベクター。

クローン化遺伝子は、通常ある種の制御配列、例えばプロモーター配列の制御下 に（すなわち、機能し得るように結合された状態に）置かれる。発現制御配列は 、ベクターが、原核生物または真核生物のいずれの宿主ｌ：おいて機能し得るよ うに結合した遺伝子を発現するように設計されているかにより変化し、さらに、 転写要素、例えばエンハンサ−要素、終結配列、組織特異性要素および／または 翻訳開始および終結部位を含み得る。

宿主。複製可能な発現ビヒクルの受容体である生物。

ペプチド・フラグメント。「ペプチド・フラグメント」という語は、ＨｒＶ−２ 、ＨＩＶ−１８よび／ｌｆ：はＨＴＬＶ−１ｆ）セｆ）　ントを表すアミノ酸配 列であって、各抗体と免疫反応し得る配列を含むものとし、天然ペプチド配列、 合成的、化学合成的ペプチド配列および発現された遺伝子工学によるペプチド配 列を含む。

好ましい態様の記載 本発明は、ＨＩＶ−２抗体の検出に使用され得る免疫反応性ｅｎｖＨＩＶ−２ペ プチドのアミノ酸配列を含む。本発明はまた、免疫反応性ｅｎｖペプチドをコー ドする遺伝子配列、前記遺伝子配列を含む発現ビヒクルおよびそれにより形質転 換されｔ；宿主を含む。

また、本発明は、複数の種類の抗体を検出し得る免疫反応性キメラｅｎｖヘプチ ドのアミノ酸配列を含む。具体的には、これらのキメラｅｎＶペプチドは、ＨＩ Ｖ−２、ＨＩＶ−１およびＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−Ｉ＋に対する抗体を検 出することができる。すなわち、コノ発明は、ＨＩＶ−２−ＨＩＶ−１％ＨＩＶ −２−ＨＩＶ−１−ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＩＶ−２−）（ＴＬＶ−ＩおよびＨＩ　Ｖ −１−Ｈ７ＬＶ−Ｉの免疫診断用ｅｎｖペプチド・フラグメントを含むキメラｅ ｎｖペプチドを含む。キメラｅｎｖペプチドとは、ペプチドが相異なるウィルス ・ペプチドのドメインをコードするアミノ酸配列を含む場合のペプチドを意味す る。２つのペプチドが天然ウィルスにおいて成熟形態で共有結合により連結され ていない場合、それらは相異なるペプチドであると言われる。発明者らは、相異 なるレトロウィルスからのペプチドのドメインを組み合わせることにより、キメ ラ・ぺプチドの特定の構築に従い、ＨＩＶ−２、ＨＩ　Ｖ−１およびＨＴＬＶ− ＩおよびＨＴＬＶ−Ｉ＋に対する抗体を検出し得るキメラ・ペプチドが作製され ることを発見しｔ；。

ＨＩＶ−２、ＨＩ　Ｖ−１およびＨＴＬＶ−１ｅｎｖペプチドからのドメインが それらの各抗体に対して免疫反応性であり得るか、または抗体認識性を維持、促 進まｔ；は誘導する形で別のドメインと組み合わせられ得るものであれば、キメ ラｅｎｖペプチドはそれらのドメインを含み得る。

ＨＩＶ−２ＳＬ／ＩｓＹからの完全な旧Ｖ−２ヌクレオチド配列は、７ランチー 二等、「プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ エンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニー」８６：２４３３−２４３７Ｃ１９８ ９）に記載されている。好ましいペプチド・フラグメントは、後記実施例１に記 載され、Ｋｌペプチド・７ラグメントの暗号化領域の完全なりＮＡ配列および誘 導されたアミノ酸配列を与える図４で示されているもの、および後記実施例２に 記載され、Ｋ３ペプチド・フラグメントの暗号化領域の完全なりＮＡ配列および 誘導されたアミノ酸配列を与える図８で示されているものである。

ＨＩ　Ｖ−１の好ましいｅｎｖペプチドは、ベルン等、ＵＳ４７５３８７３に記 載されているもの、特にクローンＧペプチド・フラグメントおよびそこから誘導 されたペプチド・フラグメントである。最も好ましいｅｎｖペプチド・フラグメ ントは、ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子のｇｐ１２０およびｇｐ４１領域から誘導され たＣＢｒｅ３である。またデルタＧ７１Ａとしても同定されたＣＢｒｅ３は、ソ ーン等、「ヒト免疫不全ウィルスを検出するための新規組換えポリペプチドを用 いた酵素免疫検定法」、「ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジ ーＪ２５：１２０７−１２１２（１９８７）およびベルツ等、ＵＳ４７５３８７ ３に記載されている。組換え抗原を発現するセルラインはまた、受入れ番号５３ ４５５としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ３ン（ＡＴＣＣ）に寄 託されている。抗原がＨＩＶ−１抗体に対して免疫反応性を示すものであれば、 他の組換えＨＩＶ−１抗厚もこの発明で使用され得る。前記組換えＨＩ　Ｖ−１ 抗厚の例は、チャック等、「バイオ／テクノロジーＪ、３：９０５−９０９（１ ９８５）、カブラディーラ等、「バイオ／テクノロジー」、４：１２８−１３３ （１９８５）およびＵＳ４６２９７８３に記載されており、これら全てを引用し て説明の一部とする。

エセックス等、ＰＣＴ／ＵＳ　８４１０　Ｏ５６１，公開番号ＷＯａ４１０４３ ２７は、ＨＴＬＶ−１のｅｎｖ糖蛋白質にツイテ記載している。ＨＴＬＶ−１の ｅｎｖ遺伝子によりコードされる免疫反応性ペプチド・フラグメントは全てこの 発明で使用され得る。好ましいペプチド・７ラグメントは、セイキ等（「プロシ ーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オ ブ・ザ・ニー・ニス・ニーＪ８０：３６１８（１９８３））の公表された配列に 基づく塩基対６１０１−６１１８および６１７０−６４９９のＨＴＬＶ−１エン ベロープ遺伝子であり、これを引用して説明の一部とする。他の好ましいペプチ ド・フラグメントは、サミュエル等、「サイエンスＪ１２６：１０９４−１０９ ７（１９８４）に記載されたものであり（これを引用して説明の一部とする）、 ＨＴＬＶ−１のｅｎｖ遺伝子の制限地図が与えられている。ＨＴＬＶ−１１抗体 もまた、ＨＴＬＶ−１抗原の使用により検出され得る。

当業界の熟練者にとっては当然のことであるが、発現ビヒクルにおいてクローン 化されたヌクレオチド配列は正しい位置関係を占めているため、ペプチド・フラ グメントの最初の１個または２個のアミノ酸については変形が存在し得る。

同じく当業界の熟練者にとっては当然のことであるが、ペプチド・フラグメント についてもある程度の変形が存在し得る。ただし、この場合、これらのペプチド は各々ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−１またはＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体に対して免疫反 応性を保持しているものとする。すなわち、ペプチド・７ラグメントの長さの範 囲は正確に固定される必要は無い。ペプチド・フラグメントのアミノ酸は免疫反 応性を失わずに欠失または付加され得る。さらに、アミノ酸は交換され得、例え ば中性アミノ酸、例えばバリンは別の中性アミノ酸、例えばロイシンと交換され 得る。アミノ酸の変化は、保存性または非保存性であり得る。また、ウィルス分 離株間のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列においてもゲノム変形が存在する （例えば、ウォングースタール、Ｆ８等、「サイエンスＪ２２９ニア５９−７６ ２（１９８５）参照）。ペプチド・７ラグメントが適当な抗体を検出し得る場合 、前記変形はこの発明のペプチド・７ラグメントに含まれるものと理解される。

保存性置換は、意図されｔ；組み合わせ、例えばｇｌＹ。

ａｌａ；　ｖａｌｘ　１ｌｅｂ　ｌｅｕ；　ａｓｐ、　ｇｌｕ；　ａｓｎｌｌｇ ｌｎ；　５ｅｒｑ　ｔｈｒ；　ｌｙｓｌａｒｇ；およびｐｈｅ、　ｔｙｒである 。

後記方法の記載においては、ＨＩＶ−２ｅｎｖペプチド・７ラグメントが説明用 に使用されている。キメラｅｎｖ診断用ペプチドで使用されるＨＩＶ−１および ＨＴＬＶ−１ｅｎｖペプチドもまた、これらの後記方法で使用され得る。

ＨＩＶ−２ウイルスの天然ペプチド・フラグメントは、ペプチド・ドメイン供給 源として使用され得、感染した宿主細胞から直接入手され得る。次いで、ペプチ ド・７ラグメントは、適当な酵素または化学的方法を用いて天然ウィルスを断片 化することにより得られる。

また、化学合成法、例えばよく知られた固相ペプチド合成方法によりペプチド・ フラグメントを得ることが可能である（メリフィールド、［ジャーナル・オブ・ アメリカン・ケミカル・ソサエティー」８５：２１４９（１９６２）、ポダンツ キー、Ｍｌ、［ペプタイド・ケミストリーニア・プラクティカル・テキストブッ クＪ、１９８８、スブリンガー−７ェルラーク、ニューヨーク）。

ペプチド・フラグメントの好ましい入手方法は、遺伝子工学技術を用いて、所望 のペプチドをコードするポリヌクレオチド・フラグメントをクローニングする方 法である。遺伝子工学および組換えクローン体を使用する利点は２つの面を有す る。第１の利点は、ウィルスからの直接分離または化学合成により大量のウィル ス・ペプチドを得ることは困難で時間がかかることである。第２の利点は、組換 えペプチドが、診断試験の信頼性を減じ得るヒト抗原を欠くことである。

遺伝子構築物およびそれらの使用方法を利用することにより、原核生物および真 核生物宿主を含む宿主においてペプチド・７ラグメントを発現させることができ る。

好ましい態様では、導入された配列は、原核生物宿主において自己複製し得るプ ラスミドまたはウィルス性ベクターへ組み込まれる。

下記で概説されている通り、広範な種類のベクターのいずれかがこの目的用に使 用され得る。

特定のプラスミドまｔ；はウィルス性ベクターを選択する場合に重要な因子とし ては、ベクターを含む受容細胞がベクターを含まない受容細胞から認識および選 抜され得る場合の容易さ、特定の宿主で望まれるベクターのコピー数、および相 異なる種類の宿主細胞間でベクターを「シャトル」し得ることが望ましいか否か という点が挙げられる。原核生物宿主には、細菌、例えばエシェリヒア・コＩＪ 　ニス・チフィムリウム、セラチア・マルセセンス、またはバチラス・サチラス が含まれ得る。好ましくは、本発明のペプチドは、原核生物および特にエシェリ ヒア・コリで発現される。

発現に好ましい細菌宿主は、ラウテンバーガー等、Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ。

Ｔｅｃｈ、、ｌ：６３−６６（１９８４）に記載された、温度感受性バタテリオ ファージ・ラムダＣｌ８５７遺伝子を含むエシェリヒア・コリ株、例えばＭＺＩ である。エシェリヒア・コリにおける発現に適当なベクター系は、ベルン、ＵＳ ４７５３８７３に記載されたｐＣＢＣＬおよびラウテンバーガー等、Ｇｅｎｅ　 Ａｎａｌ、　Ｔｅｃｈ、　ｌ　：　６３−６６（１９８４）に記載されたｐＪＬ ６であり、この場合、バクテリオファージ・ラムダｐＬプロモーター、合成リポ ソーム結合部位およびバクテリオファージ・ラムダＣ１１遺伝子がらの最初の１ ３アミノ酸が、クローニングを目的としたＢａ＋ｎＨ１部位および３つの全解読 枠における翻訳終結コドンを含む合成的に誘導されたＤＮＡと一緒にベクターに 組み込まれている。

真核生物宿主もまた使用され、酵母、線状真菌、昆虫細胞およびは乳類細胞（ス ミス等、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、３：２１５６−２１６５（１９８３ ））および特に不死化された、細胞培養中で維持され得るは乳類細胞が含まれ得 る。

好ましい真核生物プラスミドには、牛パピローマ・ウィルス、ワクシニアウィル ス、ＳＶ４０に由来するものがあり、酵母では２−ミクロン環を含むプラスミド まＩ；はそれらの誘導体がある。それらのプラスミドは当業界では周知であり（ ホトスタイン、Ｄｏ等、Ｍｉａｍｉ　Ｗｎｔｒ、　Ｓｙｍｐ、ｌ　９：２６５− ２７４（１９８２）、ブローチ、Ｊ。

Ｒ１、「ザ・モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・イースト・サツカロマイ セス：ライフ・サイクル・アンド・インへりタンス」中、コールド・スプリング ・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク、 ４４５−４７０頁（１９８１）、ブローチ、Ｊ、Ｒ，、「セルＪ２８：２０３− ２０４（１９８２）、ボロン、Ｄ、Ｐ、等、ｒジャーナル・オプ・クリニカル・ ヘマトロジー・アンド・オンコロジー（？）Ｊｌｏ：３９−４８（１９８０）、 マニアチス、Ｔ、、ｒセル・バイオロジーニア・コンプリヘンシブ・トリータイ ズ、ボリューム３、ジーン・エクスプレッシ履ン」中、アカデミツク・プレス、 ニューヨーク、５６３−６０８頁（１９８０））、市販されている。例えば、Ｍ ＳＶ−ＬＴＲプロモーターを用いてクローン化遺伝子の発現を誘導するもので、 ヘルパー・ウィルスと同時トランス７工クシ厘ンすることによりプラスミドのコ ピー数が増幅され、宿主細胞の染色体へプラスミドが組み込まれ得るは乳類発現 ベクター系が記載されている（パーキンス、Ａ、Ｓ、等、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌＢ 　ｉｏｌ、、３．１１２３（１９８３）、クロンチック、バＯ−フル）、カリフ ォルニア）。

また、ペプチド・フラグメントのＤＮＡ配列は、細胞の感染に使用されるウィル スのゲノムへ挿入され得る。例えば、ワクシニアウィルスおよびバソクロウイル スが使用され得る。（マケッ）、Ｍ、等、「プロシーデインダス・オブ・ザ・ナ ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オプ・ザ・ニー・ニス・ニーＪ 、７９ニア４Ｊ５（１９８２）、パニカリ、Ｄｏ等、「ブロシーデインダス・オ ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニ ス・ニー」、８０：５３６４（１９８３）、およびスミス、Ｇ、Ｌ、等、「ネイ チャーＪ３０２：４９０（１９８３））。組換えワクシニアウィルスはあらゆる は乳類細胞において複製し、興味の対象であるフラグメントはエンベロープまＩ ；は内部ウィルス蛋白質に現れる。

遺伝情報供給源としてのＨＩＶ−２ゲノムの利用が望ましくない場合、ＤＮＡ配 列は化学的に構築され得る。ＤＮＡの化学的合成方法は当業界ではよく知られて いる（「オリゴヌクレオチド・シンセシス、チ・プラクティカル・アプローチ」 、Ｍ、Ｊ、ガイド編、ＩＲＳプレス、ワシントン、Ｄ、Ｃ，，１９８４、ｒシン セシス・アンド・アプリケーションズ・オブ・ＤＮＡ・アンド・ＲＮＡＪ、Ｓ、 Ａ、ナラング編、アカデミツク・プレス、サンディエゴ、カリフォルニア、１９ ８７）。遺伝コードは同義性であるｔ；め、複数のコドンを用いて、特定アミノ 酸をコードするＤＮＡ配列が構築され得る（ワトソン、Ｊ、Ｄ、、ｒモレキュラ ー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン」中、第３４　Ｗ、Ａ、ベンジャミン、イ ンコーホレイテッド、メン口・パーク、カリフォルニア（１９７７）、３５６− ３５７頁）。

本発明の組換えＨＩＶ−２ペプチドを発現させるためには、適当な宿主により認 識される転写および翻訳シグナルが必要である。上記方法により得られた、好ま しくは２本鎖形態のクローン化ＨＩＶ−２ペプチド暗号化配列は、発現ベクター において転写発現を制御する配列に機能し得るように結合され、原核生物または 真核生物の宿主細胞へ導入されることにより、本発明の組換えＨＩＶ−２ペプチ ドまたはその機能的誘導体を生成し得る。

相異なる宿主におけるＨＩＶ−２ペプチドの発現の結果、ペプチドの特性を改変 し得る様々な翻訳後修飾が行なわれ得る。ＨＩＶ−２抗体により免疫学的に認識 されるペプチドの能力を妨げない宿主でペプチドを発現させることが必要である 。

一般に、挿入された遺伝子フラグメントの有効な転写を容易にし、宿主細胞と適 合し得る種類から誘導された、転写調節配列、例えばプロモーター配列を含む発 現ベクターが、これらの宿主と共に使用される。発現ベクターは、典型的には別 個の要素、例えばａ）ベクターまたは宿主染色体へのベクターの挿入を促進する 要素を自律複製させ得る複製開始点、ｂ）興味の対象である配列が機能し得るよ うに結合され得る適当な転写プロモーター、Ｃ）転写終結配列（必要な場合）お よびｄ）形質転換された細胞において表現型による選択を可能にする特異的遺伝 子を含む。遺伝子発現に必要とされる調節領域の正確な性質は種類または細胞タ イプ間で異なり、市販されている（例えば、ファーマシア、ベーリンガー・マン ハイムまたはクロンチックによる）多くの適当な発現ベクター系が存在する。

核酸分子、例えばＤＮＡは、それが転写調節情報を含む発現制御配列を含む場合 、ポリペプチドをｒ発現し得る」と言われ、前記配列は、ポリペプチドをフード するヌクレオチド配列へ「機能し得るように結合」されている。

機能し得る結合は、配列の発現がｌｌｌ１１ｍ配列の影響ま！；は制御下Ｉこ置 かれる形で配列がｔｌＩｉ節配列（複数もあり得る）に連結されている結合であ る。２つのＤＮＡ配列（例えば、ＨＩＶ−２ペプチド暗号化配列および暗号化配 列の５″末端に結合したプロモーター領域配列）は、プロモーター機能が誘導さ れた結果、ペプチド暗号化＋ｎＲＮＡの転写が行なわれる場合、および２つのＤ ＮＡ配列間の結合の性質が、（１）結果的に７レームーシフト突然変異を導入せ ず、（２）ＨＩＶ−２ペプチドの発現を指令する発現調節配列の能力を妨害せず 、または（３）ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるＨＩＶ−２ペプチド鋳型の 能力を妨害しない場合、機能し得るように結合されていると言われる。すなわち 、プロモーターがＤＮＡ配列の転写を行い得る場合、前記プロモーター領域は前 記ＤＮＡ配列へ機能し得るように結合されている。

真核生物宿主におけるＨＩＶ−２ペプチドの発現は、前記宿主において機能的な 調節領域および好ましくは真核生物調節システムの使用を要求する。真核生物宿 主の性質に従い、広範な種類の転写および翻訳調節配列が使用され得る。また、 転写および翻訳調節シグナルは、真核生物細胞に感染するウィルス、例えばＨＩ Ｖ、５ＩＶ１アデノウイルス、牛パピローマ・ウィルス、さるウィルス、ヘルペ ス・ウィルスなどのゲノム配列から誘導され得る。好ましくは、これらの調節シ グナルは、宿主細胞において高レベルの発現を行い得る特定遺伝子と組み合わさ れる。所望ならば、ＨＩＶ−２ペプチドの融合生成物が構築され得る。例えば、 ＨＩＶ−２ペプチドをコードする配列は、特定宿主からの蛋白質の分泌または特 定宿主における蛋白質の画分化を可能にするシグナル配列に結合され得る。特異 的プロテアーゼ部位随伴または非随伴の前記シグナル配列は、シグナル・ペプチ ド配列が後続の除去に従いやすいように設計され得る。

抑制または活性化を可能にする転写開始調節シグナルが選択され得、その結果、 機能し得るように結合した遺伝子の発現が変調され得る。興味深いのは、温度感 受性であるため温度を変えることにより発現が抑制まｔ：は開始され得るか、ま たは化学的調節、例えば代謝が行なわれやすい調節シグナルである。

天然発現制御配列シグナルが宿主細胞において満足に機能しない場合、宿主細胞 において機能的な配列と置き換えられ得る。

本発明のベクターは、さらに他の機能し得るように結合した調節要素、例えばエ ンハンサ−配列、または機能し得るように結合した遺伝子に種、組織または細胞 型特異的発現性を与えるＤＮＡ要素を含み得る。

一旦構築物（複数もあり得る）を含むベクターまたはＤＮＡ配列が発現用に製造 されると、ＤＮＡ構築物（複数もあり得る）は、様々な適当な手段のいずれか、 例えば細菌細胞の形質転換により適当な宿主細胞へ導入される。ベクターの導入 後、ベクター含有細胞の生長について選抜する選択培地で前記受容細胞を生長さ せる。クローン化遺伝子配列（複数も可能）が発現された結果、ＨＩＶ−２ペプ チドの製造またはこのペプチドの７ラグメントの製造が行なわれる。この発現は 、形質転換細胞において連続的方式で、まＩ；は制御された方式で行なわれ得る 。

ＨＩＶ−２ペプチドＤＮＡ暗号化配列および機能し得るように結合しｔ；プロモ ーターが、線状分子まｔ；はさらに好ましくは自律複製できない閉鎖共有結合環 状分子であり得る非複製性ＤＮＡ（またはＲＮＡ）分子として宿主細胞へ導入さ れた場合、ＨＩＶ−２ペプチドの発現は導入された配列の一時的発現を通して行 なわれ得る。

遺伝的に安定した形質転換体は、ベクター系または形質転換系により構築され得 、この際ＨＩＶ−２ペプチドＤＮＡは宿主染色体へ組み込まれる。前記組み込み は、細胞内で新たに行なわれるか、または宿主染色体へ自身を機能的に挿入する ベクター、例えばレトロウィルス性ベクター、トランスポゾンまたは染色体にお けるＤＮＡ配列の組み込みを促進する他のＤＮＡ要素による形質転換により補助 され得る。は乳類宿主細胞染色体へ所望の遺伝子配列を組み込み得るベクターが 使用される。

本発明のＨＩＶ−２ペプチド含有ＤＮＡベクターにより形質転換されＩ；細胞は 、ベクターを含む宿主細胞の選別を可能にする１種またはそれ以上のマーカーを 導入することによっても選別され、例えば前記マーカーは、抗生物剤耐性、例え ば抗生物質または重金属、例えば銅などに対する耐性を与え得る。

形質転換された宿主細胞を当業界で公知の手段により発酵（原核生物の場合）ま たは培養（真核生物の場合）することにより、最適な細胞生長が達成され、また 同じくクローン化ＨＩＶペプチド配列フラグメントの最適な発現も達成され得る 。後述されている通り、ペプチド・７ラグメントをコードするクローン化配列に 関する高レベルのＨＩＶ−２ペプチド発現は、この発明の好ましい方法に従い達 成され得る。

クローン化ＨＩＶ−２ペプチド・７ラグメントの発現後、フラグメントは、典型 的には当業界で公知の手段に従い採取および精製される。細菌を宿主として使用 する場合、クローン体が高レベルで発現される結果、通常は不溶性細胞封入体ま たは集合体が形成される。

発現された蛋白質を精製するために、不溶性細胞封入体を可溶性にしなければな らない。この発明の好ましい態様では、発現されたペプチド・フラグメントは、 アミノ基のＮ−アシル化を用いた方法、例えばシトラコニル化により精製される （マルチアーニ、Ｄ、Ｊ、等、「プロティン・ピューリフイケーション：マイク ロ・トウ・マクロ」、アラン、Ｒ，リス、インコーホレイテッド、１９８７．４ ４３−４４５８頁）。

ペプチド・７ラグメント抗原を製造するための組換え遺伝子工学技術に代わる方 法には、酵素ポリメラーゼ指令インビトロ転写および翻訳システムがある。ペプ チド・フラグメントを製造するｔ；めの増幅システムは、例えばＵＳ４６８３２ ０２に記載されている。

この発明に従い精製された免疫原性および診断用ペプチド・７ラグメントは、Ｈ ＩＶ−２ウイルスに応じて産生された抗体により特異的に認識される。血液また は組織試料中のＨＩＶ−２抗体は、ペプチドが液相中または固相担体に結合した 状態で使用され得る免疫検定法でペプチド・フラグメントを用いて検出され得る 。さらに、ペプチド・フラグメントは、ウィルスに関する免疫検定法で使用され る様々な方法により検出可能な形で標識され得る。この発明のペプチド・７ラグ メントを用いたＨＩＶ−２抗体を検出するための好ましい免疫検定法には、放射 線免疫検定法、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）または当業界で知られている 他の検定法、例えば免疫蛍光検定法、化学発光検定法または生物発光検定法があ る。

検定で特に有用な放射性同位元素は、”Ｈ％　”’Ｉ、１３１■、ｍａｐ。

”Ｓ、”ＣＳ”Ｃｒ、”Ｃ１，”Ｃｏ、”Ｃｏ、ｌ１ｐｅ、７１５ｅおよびＩＳ ”Ｅｕである。

放射性標識は一ス体例を代表するものであり、別法として、ペプチド配列または それに対する抗体は、当業界で公知の技術を用いた、蛍光性標識、酵素標識、遊 離基標識、アビジン−ビオチン標識またはバクテリオファージ標識を用いても標 識され得る（チャード、「ラボラトリ−・テクニクス・イン・バイオロジー」、 「アン・イントロダクション・トウ・ラジオイムノアッセイ・アンド・リレイテ ツド・テクニクス」、ノース・ホーランド・パブリッシング・カンパニー（１９ ７８））。

代表的な蛍光性標識には、フルオレセイン、イソチオシアナート、ローダミン、 フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、０−７タルデヒドお よびフルオレスカミンがある。

代表的な化学発光性化合物には、ルミノール、イソルミノーノ呟芳香族アクリジ ニウムエステル類、イミダゾール類、アクリジニウム塩類およびしゅう酸エステ ル類がある。代表的な生物発光性化合物には、ルシフェリン、ルシフェラーゼお よびエクオリンがある。

代表的酵素には、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコー ス−６−燐酸デヒドロゲナーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース・オ キシダーゼおよびペルオキシダーゼがある。

酵素検定法の２つの主たるタイプは、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）および 、エンザイム・マルチイブライド・イムノアッセイ（ｅｎｚｙ＋ａｅ−ｍｕｌｔ ｉｐｌｉｅｄ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙＳＥ　Ｍ　ｒ　Ｔ）（シバやコーポレー ション）としても知られているホモジニアス酵素免疫検定法である。ＥＭＩＴシ ステムは、トレーサー−抗体複合体における酵素の不活化に依存する。すなわち 、活性は、分離段階を必要とせずに測定され得る。

本発明の範囲に含まれる免疫検定法には、ラテックス凝集検定法、イムノメトリ ックアッセイおよびきっ抗検定法がある。

ラテックス凝集検定法は、ベルン、Ｇ、Ａ、等、「モレキュラー・ブロープス： テクニクス・アンド・メディカル・アプリケーションスＪ、Ａ、アルベルチー二 等編、ラーベン・プレス、ニューヨーク（１９８９）に記載されており、これを 引用して説明の一部とする。ラテックス凝集検定法では、抗原被覆ラテックス粒 子および試験される血清を混合し、次いで結果を読み取る。ＨＩＶ−２抗体を欠 く試料を用いると、ラテックス粒子は懸濁した状態のままであり、滑らかな乳状 の様相を保持している。しかしながら、組換え抗原と反応する抗体が存在する場 合、ラテックス粒子は視覚的に検出可能な集合体に凝集する。スライド（例えば 、リギン等、ＥＰＯ公開済み特許出願第２８９３３９号参照。これを引用して説 明の一部とする）、および視覚的または分光光度計、例えばＵＳ４５９６６９５ および４７７５５２５（これらを引用して説明の一部とする）に記載された装置 により読み取られる特製スライドを用いた視覚的方法を含め、ラテックス凝集検 定法の結果を読み取る幾つかの方法が存在する。

ラテックス凝集検定法は、小量のユーザー、緊急状況およびイムノメトリックア ッセイに必要とされる高性能の研究設備および供給体制を欠く地域に特に適して いる。

また、凝集検定法を用いてもＨＩＶ−２抗体を検出することができる。この方法 では、所望のペプチド・７ラグメントを、ラテックス・ビーズ以外の適当な粒子 、例えばゼラチン、赤血球、ナイロン、リポソーム、金粒子等に固定する。これ らにおける抗体の存在は、沈澱反応と同様に凝集を誘発し、次いで、比濁分析法 、混濁度、赤外線分光測定法、視覚診査、比色定量法などといった技術により検 出され得る。

イムノメトリックアッセイには、７オワード・サンドイッチ、逆サントイ７チ免 疫検定法および同時検定法がある。これらの６語は当業界の熟練者には充分理解 されているものである。イムノメトリックアッセイは、ＨＩＶ−２に対する抗体 の検出に関して記載されている。これらの検定法では、ペプチド・フラグメント は固相担体に結合し、抗ＩｇＧ抗体は検出可能な形で標識されている。

フォワード・サンドイッチ免疫検定法では、最初に、ＨＩＶ−２に対する抗体を 含む疑いのある試料を、ペプチド・７ラグメント含有固相免疫吸収剤（ｉ＋ｎｍ ｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ）とインキュベージコンする。

試料中の抗体が固定されたペプチド・フラグメントに結合するのに充分な時間イ ンキュベーションを続行する。最初のインキュベーション後、同相免疫吸収剤を インキュベージコン混合物から分離し、同じく試料中に存在し得る干渉性物質を 洗浄除去する。続いて、固定されたペプチド・フラグメントに結合した抗体を含 む固相免疫吸収剤を、検出すべき抗体の異なるドメインと交差反応する可溶性標 識抗体と再びインキュベーションする。第２のインキュベーション後、さらに洗 浄することにより、非結合標識抗体を固相免疫吸収剤から除去し、非特異的結合 標識抗体を除去する。次いで、固相免疫吸収剤に結合した標識抗体が検出され、 検出された標識抗体の量は、もとの試料中に存在する抗体の量の直接的尺度とし て用いられる。別法として、免疫吸着複合体に伴わない標識抗体も検出され得、 この場合、測定値は試料中に存在する抗原の量に逆比例する。フォワード・サン ドイッチ検定法は、例えばアメリカ合衆国特許第３８６７５１７号、同第４０１ ２２９４号および同第４３７６１１０号に記載されている。

逆サンドインチ検定法では、ＨＩＶ−２に対する試験抗体を含む疑いのある試料 を、まず標識抗抗体とインキュベーションした後、試験抗体の異なるドメインと 交差反応する固定ペプチド・フラグメントを含む固相免疫吸収剤をそこに加え、 第２のインキュベーションを行う。フォワード・サンドイッチ検定法により要求 される最初の洗浄段階は必要とされないが、第２インキユベーシヨン後に洗浄が 行なわれる。逆サンドイッチ検定法は、例えばアメリカ合衆国特許第４０９８８ ７６号および同第４３７６１１０号に記載されている。

同時サンドインチ検定法では、試料、ペプチド・フラグメントが固定されＩ；免 疫吸収剤および試験抗体の異なるドメインに特異的な標識可溶性抗体を一インキ ュベーション段階で同時にインキュベーションする。同時検定法は、単一インキ ュベーションのみを必要とし、洗浄段階は必要としない。同時検定法の使用は、 操作が容易で、均質で、再現性があり、検定法が一次性であり、非常に精密であ るため、非常に有用な技術である。同時サンドイッチ検定法は、例えばアメリカ 合衆国特許第４３７６１１０号に記載されている。

また、いわゆる遅延型イムノメトリックアッセイも使用され得、例えばチューの アメリカ合衆国特許第４２８９７４７号およびウォルターズのアメリカ合衆国特 許第４３４３８９６号に記載されている。

別のイムノメトリックアッセイは、Ｆｃ捕獲技術を伴う。Ｆｃ捕獲免疫検定法で は、総血清抗体が、典型的には固体支持体に結合した抗ヒトＦｃ抗体により捕獲 される。すなわち、結合した、検出すべき抗体のＦｃ領域は、他の蛋白質−蛋白 質相互作用に関与しない。

次いで、検出すべき抗体は、この発明のＨＩＶ−２ペプチド・フラグメント（複 数もあり得る）または適当なキメラ・ペプチド・フラグメント（複数もあり得る ）によりスクリーニングされ得る。好ましいＦｃ捕獲免疫検定法は、１９８８年 ６月８日付けのアメリカ合衆国シリアルナンバー０７／２０３７３０に記載され ており、これを引用して説明の一部とする。

上記検定法の各々では、抗体含有試料、ペプチド・フラグメントを固定した固相 免疫吸収剤および標識可溶性抗体を、試験抗体を固定されたペプチド・７ラグメ ントおよび可溶性抗体に結合させるのに充分な条件下および充分な時間インキュ ベージジンする。一般に、固相への標識抗体の結合を最大化することによりシグ ナルも増加するため、可能な限り多くの抗体と結合させるのに充分なインキュベ ーション条件の提供が望ましい。勿論、標識抗体およびフラグメントの具体的濃 度、インキュベージ９ンの温度および時間並びに他の上記検定条件は、試料中の 抗体濃度、試料の性質などを含む様々な因子により変化し得る。当業界の熟練者 であれば、常用の実験法を用いることにより、各測定に好影響を及ぼす最適な検 定条件を決定することができる。

この発明で使用され得、これまでにも使用されてきた多くの固相免疫吸収剤が存 在する。よく知られＩ；免疫吸収剤には、ガラス、ポリスチレン、紙、ポリプロ ピレン、デキストラン、ナイロンおよび他の材料から形成されたビーズ、上記材 料から形成またはそれらによって被覆されたチューブなどがある。固定されたペ プチド・フラグメントは、例えばアミドによる共有結合またはエステル結合また は吸着などの技術により、固相免疫吸収剤へ共有結合または物理的に結合され得 る。当業界の熟練者であれば、ペプチド・フラグメントの結合に適した多くの他 の担体を知っているか、または常用の実験法を用いてそれらを確認することがで きる。

微量の有機分子、例えばホルモン、蛋白質、抗体などの検出に有用な一般的きっ 抗的結合検定技術は当業界では濁知である。チャード（前出）参照。これらのき っ抗的結合検定技術のいずれかが、ＨＩＶ−２抗体検出用に使用され得る。きっ 抗的結合検定法、一般的に放射線免疫検定法（ＲＩＡ）を行うためには、ペプチ ド・フラグメントに応じて産生された標識抗体およびＨＩＶ−２試験杭体に対す る親和力を有する結合性分子の提供が必要である。未知量のＨＩＶ−２抗体を含 む少量の液体まｔ；は組織試料を、産生された標識抗体および既知量の抗体特異 的ペプチド・７ラグメントの存在下でインキュページ齋ンする。

産生される抗体は、好ましくはこの発明の抗原性ペプチド・７ラグメントにより 生成される。一旦、試験試料と７ラグメントおよびトレーサー含有抗体とのイン キュページ璽ンが完了すると、遊離および結合（免疫複合）形態間におけるトレ ーサー含有分子の分布を測定することが必要である。常ではないが、通常、これ は、結合７ラクシ２ンが遊離７ラクシ１ンと物理的に分離されていることを必要 とする。例えば、特異的ペプチド・フラグメントはプレートに結合され得る。様 々な他の技術もその目的に使用され得、各々トレーサー含有分子の遊離および結 合形態間の物理化学的差異を利用する。

一般に利用可能な方法は、ヤロウによる「７アーマコロジカル・レビュー」、２ ８：１６１（１９７３）に記載されている。これらの技術には、吸着、沈澱、塩 析技術、有機溶媒、電気泳動的分離などがある。チャード（前出）、４０５−４ ２２頁参照。

上記イムノメトリックアッセイの場合と同様、可溶性抗体は、検出可能な標識、 例えば放射性標識、蛍光性標識、酵素標識、遊離基標識またはバクテリオファー ジ標識により標識され得る。最も一般的には、１１１１識は放射性ｌｉ［識また は酵素標識である。

この発明によるＨＩＶ−２免疫原性ペプチド・フラグメントは、抗体産生の刺激 に使用され得る。抗体産生を刺激するため、ペプチド・７ラグメントは、当業界 でよく知られ、常用されている技術を用いて、担体蛋白質、例えば牛血清アルブ ミンまたはキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合され得る。

好ましくは、担体蛋白質は、システィン残基によりペプチド・７ラグメントに結 合させたＫＬＨである。

サラに、ＨＩＶ−２ペプチド・７ラグメントは、免疫学的ｌこ不活性または活性 担体と混合され得る。免疫応答を促進または誘導する担体、例えばフロイント完 全アジュバントが使用され得る。

動物Ｉこおける抗血清の製造はよく知られた技術である（例えば、チャード（前 出）、３８５−３９６頁、および［アンティボディーズ、ア・プラクティカル・ ハンドブックＪ％　Ｉおよび１１巻、Ｄ５キャティー編、ＩＲＬプレス、ワシン トン、Ｄ、Ｃ，（１９８８）参照）。動物の選択は、普通、利用可能な施設およ びに生成される抗血清の容量に関して想定される必要条件間のバランスにより決 定される。大量の血清が容易に得られるため、大型種、例えばヤギ、ロバおよび ウマが好まれ得る。しかしながら、高い力価の抗血清が得られることが多いさら に小さい種類、例えばウサギまたはモルモットの使用も可能である。通常、抗原 性物質（ペプチド・フラグメント・ハプテン−担体蛋白質コンジュゲート）の皮 下注射は、抗体が産生される動物の免疫系へ導入される。適当な抗体の検出は、 抗血清を適当に標識したトレーサー含有分子で試験することにより行なわれ得る 。次いで、トレーサー含有分子に結合する７ラクシａンを分離し、必要ならばさ らに精製する。

次いで、こうして得られた抗体を様々な免疫検定法で利用することにより、ＨＩ Ｖ−２ウイルスまたはそのフラグメントの同定および定量が行なわれ得る。この 発明のペプチド・フラグメントに対して産生される、キャディー（前出）に記載 された公知技術により生成されｌ；、ポリクローナル抗体およびモノクローナル 抗体は両方とも免疫検定法で使用され得る。

イムノメトリックアッセイを用いてＨＩＶ−２ウイルスまたはその一部分を検出 する場合、２種の別個の相異なる抗体が必要とされる。これらの抗体の一つは固 相支持体に結合され、他方は検出可能な形で標識される。本質的に、２種の異な る抗体は、ＨＩＶ−２ウイルスに特異的であるが、ウィルス蛋白質の異なるドメ インと交差反応する。−態様では、２種の相異なる抗体は、この発明による２種 の相異なるペプチド・フラグメントを用いて製造され得る。一方は担体ｌ；結合 し、他方は検出可能な形で標識された、相異なるペプチド・フラグメントに対す る抗体の使用は、様々なサンドイッチ検定法において有用である。

別法として、同じペプチド・フラグメントを用いて、２つの相異なる種類、例え ばウサギおよびマウスにおいて抗血清を製造することにより、ＨＩＶ−２ウイル スに特異的ではあるが、相異なるドメインと交差反応する抗体の製造も可能であ る。

さらに、この発明の検定法で使用される材料は、理想的にはキットの製造に遺し ｔ：ものである。前記キットは、１つまたはそれ以上の容器手段、例えばガラス 瓶、試験管などを閉鎖封入状態で受容すべく区画化されている担体手段を含み得 る。前記容器手段の各々は、この方法で使用される個別成分の一つを含む。

例えば、前記容器手段の一つは、免疫吸収剤結合ペプチド・７ラグメントを含み 得る。前記７ラグメントは、別々の固相免疫吸収剤または直接容器の内壁へ結合 され得る。第２容器は、検出可能な形で標識された抗抗体の凍結乾燥形態または 溶液を含み得る。

また、この担体は、さらに各々相異なる予め測定された既知量の抗体を含む複数 の容器を含み得る。次いで、これらの後記容器を用いることにより、標準曲線が 作成され得、そこから未知量の抗体を含む試料から得られる結果が補間され得る 。

この発明を実践する場合、ＨＩＶ−２抗体またはウィルスそのものもしくはその 一部分の存在は、生物流体および組織で検出され得る。未知量のＨＩＶ−２抗体 またはＨＩＶ−２を含むあらゆる試料が使用され得る。通常、試料は、液体、例 えば尿、唾液、涙滴、脳を髄液、血液、血清など、まＩ；は固体もしくは半固体 、例えば組織、糞便などである。当業界で知られている通り、ＨＩＶ−２ウイル スおよびこのウィルスに対する抗体は、ＴＪＩ胞疾患、後天性免疫不全症候群（ ＡＩＤＳ、エイズ）および前エイズ状態、例えばエイズ関連コンプレックス（Ａ ＲＣ）に関与する。さらに、当業界では、ヒトまたは動物がＡＩＤＳまたはＡＲ Ｃにり患していなくても、ＨＩＶ−２に対する抗体が、上記ヒトまたは動物の生 物流体または組織に存在し得ることも知られている。

この発明によるペプチド・７ラグメントは、ＨＩＶ−２ウイルスに対するワクチ ンとしても使用され得る。このペプチド・フラグメントは、当業界において一般 的に知られている通り、製造され、動物に投与されることにより抗体の産生を刺 激し得る。好ましくは、ワクシニアウィルスは、ＨＩＶ−２ワクチンの製造を目 的として既知手段に従い使用され得る。

以下、実施例において、この発明を寅施する場合に使用される原材料および方法 の記載を行う。これらの実施例は、いかなる意味にせよこの発明を限定するもの ではない。

実施例 実施例Ｉ ＨＩＶ−２工ンベロープ発現性クローンＭＺ−１／ｐＫ１の構築。

Ｋ３Ｄクローンは、ブルースクリプト・ベクター（ストラタジーン、インコーホ レイテッド）へ５２９５位〜９０１２位のＨＩＶ−２のＫＰＮＩフラグメントを 挿入することにより製造されＳＢＬ／ｌ５Ｙ Ｉ；、完全なＨＩＶ−２クローンＨＩＶ−２Ｃ７ランチー二等、ＳＬ／ＩＳＹ 「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナシ３ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ ーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニーＪ８６：２４３３−２４３７（１９８’９） ）のサブゲノム・フラグメントである。ＨＩＶ−２クローンに３Ｄは、ジェノベ ツ７ア・７ランチー二により提供された。

エシェリヒア・コリにおけるＨＩＶ−２のｅｎｖ領域のペプチド・７ラグメント を発現させるプラスミドであるｐＫｌの構築戦略は、図１で説明されている。

Ｋ３Ｄ　ＤＮＡを、７２９７位で切断する制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化した。

、ＥｃｏＲ１末端をフレノウ・ポリメラーゼによりプラント化し、８ｇｌｌｌリ ンカ−を加えた。次いで、ＤＮＡをＢｇｌｒｌおよび５ａｕ３ＡＩにより消化し た。７２９７位のＥｃｏＲ１部位（Ｂｇｌｌｌへ変換）から８１３９位の５ａｕ ３ＡＩ部位へ伸びる約８４８塩基対の７ラグメントを精製し、ＢａｍＨＩで制限 した発現ベクターＰＣＢＣ１へクローン化することにより、クローンｐＫ１が生 成された。

プラスミドｐｃ　Ｂ　Ｃ１は、バタテリオファージのラムダｐＬプロモーターを 利用するエシェリヒア・コリ発現ベクターでアル。ｐＣＢＣｌはｐＪＬ６（ラウ テンバーガー等、Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、　Ｔｅｅｈ、ｌ　：５３（１９８４）） に似ており、その構築は、ベルン等、アメリカ合衆国特許第４７５３８７３号に 完全に記載されている（これを引用して説明の一部とする）。

バクテリオファージ・ラムダＣ、、、、について溶製性の株である、エシェリヒ ア・コリ株ＭＺ−１をｐＫＩの宿主株として用いて、３２°Ｃ〜４４２℃の温度 シフトにより、組換え蛋白質合成を誘導した（ナイ等、「ネイチャーＪ３０９： ８１０（１９８４））。図２で示されている通り、温度シフトの結果、３４ｋｄ 蛋白質が合成された。分離された蛋白質のウェスタン・プロット移動後、Ｋｌと 呼ばれる誘導されＩ；蛋白質は、ＨＩＶ〜２感染個体からのヒト血清と特異的に 反応した（図３）。Ｋｌの暗号化領域の完全なりＮＡ配列および誘導されたアミ ノ酸配列を図４に示す。

実施例２ ＨＩＶ−２工ンベロープ発現性クローンＭＺ−１／ｐＫ３の構築に３Ｄ（実施例 １に記載）を５ａｕ３ＡＩにより消化しｔ；。この切断により、７１０１位から ８１３９位までの１０３８塩基対フラグメントが生じた（図５）。フラグメント を精製後、それを発現ベクターｐＣＢＣ２”ライゲーションした。ｐＣＢＣ２は 、まさに５’−ＢａｍＨＴクローニング部位の単一塩基対がｐｃＢｃｌとは異な っている。

この場合、適切な解読枠を配列させるのにｐｃＢｃｌではなくｐＣＢＣ２が使用 された。ｐＣＢＣ２もまｔ；、ベルン等、アメリカ合衆国特許第４７５３８７３ 号に記載されており、これを引用して説明の一部とする。生成されたプラスミド ｐＫ３をエシェリヒア・コリ宿主ＭＺ−１へ移した。３２℃〜４２℃へＭＺ　− １／ｐＫ　３培養物を温度シフトすると、４０ｋｄの組換え蛋白質の合成が誘導 された（図６）。ウェスタン・プロット分析は、Ｋ３と呼ばれるこの蛋白質がＨ ＩＶ−２感染個体からの血清と特異的に反応することを示した（図７）。ｐＫ３ の暗号化領域の完全なりＮＡ配列および誘導されたアミノ酸配列を図８に示す。

実施例３ ＨＩＶ−２−ＨＩＶ−１キメラ・エンベロープ発現性クローンＭＺ−１／ｐＫＩ ＤＧ７１の構築。

プラスミドを構築してキメラ・エンベロープ・クローンを発現させるストラテジ ーを図９に示す。プラスミド・クローンｐＬ　ＣＢ　Ｃ○ＤＧ７１Ａは、ベルン 等、ＵＳ４７５３８７３に記載されており、これを引用して説明の一部とする。

このプラスミドは、ＨＩＶ−１エンベロープ・ポリペプチドの発現に使用される 。ｐＬｃＢｃＯＤＧ７１ＡをＢｇｌｌｌおよびＢａｍＨＩにより消化した。Ｂｇ ｌｌｌは４０７位で開裂し、ＢａｍＨＩは９４４位で開裂する。５３７ＢＰフラ グメントを分離した。

８９０位で開裂するＢａｍＨＩにより、実施例１記載のｐＫｌプラスミドＤＮＡ を消化しｆ：、ｐＬｃＢｃＯＤＧ７１Ａ（７）５３７ＢＰ　Ｂｇｌｌｌ−Ｂａｍ Ｈ１７ラグメントを、ＢａｒｎＨ１消化ｐＫｌにライゲーションした。生成した プラスミドｐＫＩＤＧ７１を、エシェリヒア・コリ宿主ＭＺ−１に移した。ＭＺ −１／ｐＫ　ＩＤＧ７１培養物を３２℃から４２℃に温度シフトすると、約５５ ｋｄの組換え蛋白質の合成力Ｎ１１．’ｈｆ：、Ｃｒ１ｌＪ　ｌ　Ｏ）。ＨＩＶ −２感染個体、ＨＩ　Ｖ−２感染個体および陰性対照から採取しｌ：血清により ウェスタン・プロット分析を行った。ウェスタン・プロット（図１１）は、キメ ラＨＩ　Ｖ−２−ＨＩ　Ｖ−１蛋白質ＫＩＤＧ７１が、ＨＩ　Ｖ−１感染個体カ ラ得うした血清（図１１Ａ）およびＨＩＶ−２感染個体から得られた血清（図１ １Ｂ）と反応することを示した。陰性血清との反応性は全く観察されなかった（ 図１１Ｃ）。

ｐＫＩＤＧ７１の暗号化領域の完全なりＮＡ配列および誘導されたアミノ酸配列 を図１２に示す。

実施例４ ＨＩ　Ｖ−２−ＨＩ　Ｖ−１−ＨＴＬＶ−１−キ／　５−　エンベロープ発現性 クローンの構築。

ＨＩ　Ｖ−２−ＨＩ　Ｖ−１−ＨＴＬＶ−Ｉ　−キ）　ラ−エンベロープ発現性 クローンの構築ストラテジーを図１３および図１４で説明する。

ｐｃＢＩ３５３は、発現プラスミドｐｃＢｃ１ヘクローン化されたセイキ等の発 表した配列（「プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニーＪ８０：３６１　Ｂ（１９８３ ））に基づいた、塩基対６１０１−６１１８および６１７０−６４９９（７）Ｈ ＴＬＶ　−１エフへｏ　−７’遺伝子領域を含む発現プラスミドである。プラス ミドｐｃＢｃ１３５３をＢａｍＨＩおよび５ａｌｌで消化することにより、３７ ０塩基対フラグメントが生成された。ＢａｒａＨＩおよび５ａｌＩにより消化さ れたプラスミドｐｃＢ２ＤＧ７１へ、前記３７０ＢＰフラグメントを挿入した。

ｐｃＢｃ２ＤＧ７１は、ＨＩ　Ｖ　−ｌ　ｘンヘｃｙ−プ蛋白質ノポリペプチド をコードする発現プラスミドである。このプラスミドは、ベルン等、ＵＳ４７５ ３８７３に記載されており、これを引用して説明の一部とする。生成しｔ；プラ スミドｐＤＧ７１３５３は、ＨＩＶ−１−ＨＴＬＶ−Ｉのキメラ・ポリペプチド をコードする。ｐＤＧ７１３５３の暗号化領域の配列を図１５に示す。

図１４は、ＨＩＶ−２−ＨＩＶ−１−ＨＴＬＶ−、Ｉ構築に関スル残りの段階を 示す。ｐＤＧ７１３５３をＨｉｎｄｌｌ＋および５ａｉｌにより消化した。ＨＩ 　Ｖ−１−ＨＴＬＶ−Ｉポリペプチドをコードする配列を含む挿入部分を、Ｈ４ ｎｄｌｌ＋および５ａｉｌで消化されたベクターｐＫ　Ｉ　ＤＧ　７１ヘライゲ ーシヨンした。ｐＫＩＤＧ７１は実施例３に記載されている。生成したプラスミ ドはｐＫＩＤＧ７１３５３と呼ばれる。ｐＫＩＤＧ７１３５３を細菌株ＭＺ−１ へ導入させた。

ＭＺ−１ｐＫＩＤＧ７１３５３を、３２℃から４２℃への温度シフトにより誘導 すると、６８ｋｄの蛋白質が製造されＩ；（図１６）。分離された蛋白質のウェ スタン・プロット移動後、誘導された蛋白質は、ＨＩ　Ｖ−１陽性個体から得ら れた血清（図１７）、ＨＩＶ−２陽性個体から得られた血清（図１８）およびＨ ＴＬＶ−１陽性個体から得られた血清（ｒＩ！Ｊ１９）と特異的に叉応した。陰 性血清との特異的反応性は見られなかった（図２０）。ｐＫＩＤＧ７１３５３の 暗号化領域の完全な配列を図２１に示す。

実施例５ ＨＩＶ−２ｅｎｖ（Ｋ−１）およびＨｒＶ−２−ＨＩＶ−１キメラ抗原の精製。

次の精製方法を用いて、ＨＩＶ−２ｅｎｖ（Ｋｌ）およびＨＩＶ−２−ＨＩＶ− １キメラ抗原の両方を精製しｔ；。

ニシェリヒア・コリ細胞を、２ミリモルのＰＭＳＦ、アプロチニン（細胞１グラ ム当たりＯ、ｌ　ｍｇ）およびデオキシリボヌクレアーゼ！（細胞１グラム当た りＯ、ｌ　ｍｇ）を含む５ｅｎｖモルのトリスＨＣＩ。

ｐＨ７，５（細胞１グラム当たり３　ｍｌ）中で１０分間リソチーム（細胞１グ ラム当たり１　ｍｇ）による酵素消化により溶解し！；。この溶液を１％トリト ンＸ−１００へ導入し、室温で３０分分間上んした。不溶性物質を３０分間１２ ０００ｘｇの遠心分離により集め、デオキシリボヌクレアーゼＩ（細胞１グラム 当たり０．０５＋ｎｇ）および２６５ミリモルのＭｇＣ１，が加えられる点以外 は上記と同様に再消化した。

消化後、沈澱物を上記と同じ遠心分離により集めた。

次いで、不溶性物質を、次の緩衝液（細胞０．２グラム／ｍｌ）：１）ｌＯミリ モルＥＤＴＡおよび０．５％ツウイツタージエント３−１４を含む５ｅｎｖモル のトリスＨＣＩ、ｐＨ９，０，２）５ｅｎｖモルのトリスＨＣＩ、ｐＨ９，０／ １モルＮａＣ１，３）５ｅｎｖモルのトリスＨＣＩ、ｐＨ７，５中６モル尿素、 ４）１％β−メルカプトエタノール含有５ｅｎｖモルのトリストＣ１％ｐＨ９中 ８モル尿素 により連続洗浄した。

各場合とも、組換え抗原が不溶性沈澱物中に残存していた。次いで、８モル尿素 洗浄による沈澱物を、７モルのグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨｌ１．ｏｌｏ、５％β −メルカプトエタノールにより可溶化した。

ＨＩＶ−２ｅｎｖ抗原およびＨＴＶ−２−ＨＩＶ−１キメラ蛋白質は両方とも高 疎水性であり、グアニジン−ＨＣｌの除去時に集合体を形成しやすい。この集合 体形成を阻止するｔ；め、可溶化抗原を、水性緩衝液における抗原の溶解度を高 めるべく設計された下記の化学的修飾に付しｔ；。

まず、６モルのグアニジン−ＨＣｌ中可溶化された蛋白質を、ｐＨ８，５でのβ −メルカプトエタノールに対して１．２倍過剰のヨード酢酸によりアルキル化し た。未反応ヨード酢酸を全てβ−メルカプトエタノールによりクエンチングしｔ ；。アルキル化試料を、２００倍の５ｅｎｖモルのボラ−ｔ−１ｐＨ９−０に対 して３回透析した。透析すると、蛋白質は不溶性になった。不溶性物質を遠心分 離により集め、アシル化用に８モル尿素、５０ミリモルのボラート、ｐＨ９゜０ に再溶解しｔ；。

アルキル化抗原をアシル化するため、抗原に存在するアミノ基に対して５０倍過 剰のシトラコン酸無水物を加え、溶液のｐＨをＮａＯＨにより８．５ないし９． ０に維持した。反応完了後、シトラコニル化試料を４℃で５０ミリモルのボラー ト、ｐＨ９，０に対して透析した。透析後、シトラコニル化蛋白質は水性緩衝液 に溶け、標準クロマトグラフィー技術に敏感に反応しやすくなつＩ；。

次いで、修飾されＩ；蛋白質試料を、５０ミリモルのボラート、ｐＨ９，０中で 平衡させｆ−Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−Ｔ　Ｓ　Ｋカラムに適用した。カラムを０．３ −１モルＮａＣ１の一次勾配により展開し、組換え抗原を溶離させた。ＨＩ　Ｖ 　−２ｅｎｖＳＫ　−１、抗原またはＨＩＶ−２−ＨＩＶ−１キメラ蛋白質ＫＩ ＤＧ７１を含む７ラクシヨンをプールしＩ；。

間接的免疫検定法（ＥＩＡ）を用いて、精製されたＫｌおよびキメラＫＩＤＧ７ １抗原の免疫反応性を試験した。Ｋ−２およびキメラ抗原に対して各々０．５μ ｇおよび１．０μｇの濃度で組換え抗原によりマイクロタイター・ウェルを被覆 した。洗浄し、ウェル上の非特異的結合部位をブロックした後、１：２０に希釈 したヒト血清を加え、存在する抗体を３７℃で１時間組換え抗原に結合させた。

ウェルを洗浄して非結合抗体を除去し、結合抗体の存在を西洋わさびペルオキシ ダーゼ標識ヤギ抗ヒト抗体およびＴｍＢ（３，３″、５．５’−テトラメチル／ ベンジジン）の基質により検出した。反応をＨ，ＳＯ６により終結させ、ＯＤ　 ａ　＊。を測定した。様々な血清に関する各抗原により得られたシグナルの分布 を表１に示す。

ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ 厘葺Ｉ葺Ｉ葺 弧葺電冨葺葺 Ｉ葺薦冨Ｉ葺 ６７０　６Ｂ０　６９０　７００　７１０　７２０真夏葺夏１Ｎ ＧＴＡＧ Ｓａｕ３ＡＪ　ＥｃｏＲＩ　５ａｕ３ＡＩＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、　７ ＨＩＶＩ　ＨＩＶ２ Ｍｅｔ　Ｖ（１１Ａｒｇ　Ａｌｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　ｉ’ｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ ＾ＩＱ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　ｌｉｅ＾ｌｏ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　h［ｅ＾ｓｎ　Ｌｙ ｓ　Ｌｙｓ ７０　８０　９０　ｔｏｏ　１１０　１２０ＣＣＣＡＧＧ　ＣＭ　（ｉｃＡ　Ｔ ＧＧ　ＴＧＣＣＧＧ　ＴＴＣＡＡＡ　（＋（ＩＣＧへ〇Ｔ部＾ＧＧＧ品α工＾Ｔ ＧＣ酩６韻ＧＴ［ｌ＋　`ＡＡ Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌｃｉ　Ｍｅ煤@Ｇｌｎ　ＧＩＬ Ｉ　ＶＣＬＩ　ＬｙｓＣＡＡ　ＡＣＣＣ７丁　ＣＴＡ　ＡＡＡ　ＣＡＴ　ＣＣＣ ＡＧ［ｉ　ＴＡＴ　ＭＡ　ＧＧＡ　ＡＣＣＭＴ　［ｉＡＣＡＣＡ　＾＾ＴＡ＾Ａ ＾sＴ　＾＾ＣＴＴＴ Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖｃｌ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　 Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｔｙ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔ）ｒ　Ａｓｎ@Ｌｙｓ　１１ＥＩ 　Ａｓｎ　Ｐｈｅ ＡＣＡ　ＧＣＡ　ＣＣＡＧＡＡ　ＡＡＡ　ＧＡＣＴＣＡ　［１ｓＡＣＣＣＡ　Ｇ ＡＡ　ＧＴ＾α論ＴＡＴ＾ＴＧ　ＴＧＧ　ＡＣＴ　ＡＡＣＴfＣ心ＧＧ＾ Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｕ　Ｖａｔ＾Ｉａ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ＾唐氏@Ｃｙｓンｇ　 Ｇｌｙ ２５０　２６０　２７０　２Ｂ０　２９０　３００ＧＭ丁ＴＣＣＴＣ丁ＡＴＴＧ Ｃ＾＾ＣＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＴＣＣＴＴＡＡＴＴＧＧＧＴＡＧ＾＾ＭＣＭＧ＾ ＣＧＧＧＴＣＭＧｌｕ　Ｐｈｐ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｔ ｈｒ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　ＶＱＩ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ@Ｌ ｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇ１ｎ ＣＡＧ　ＣＡＴ　ＭＣＴＡＴ　ＧＴ［ｉ　ＣＣＧ　ＴＧＣＣＡＴ　ＡＴＡ　［Ｉ ＡＧ　ＣＡＡ　ＡＴＡ　ＡＴＴ　ＭＴ　ＡＣＣＴＧＧ　ＣＡs　ＭＧ　ＧＴＡ　 ＧＧＧ Ｇｉｎ　Ｈａｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　ＶＣＬＩ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｈａｓ　ｌｉｅ 　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　１１１１１１ｅ　Ａｓｎ　Ｔ）ｙ　Ｔｒ吹@Ｈａｓ　Ｌｙｓ 　Ｖａｌ　Ｇｌｙ ＾ＡＡ　ＭＴ　ＣＴＡ　丁＾Ｔ　ＴＴＧ　ＣＣＴ　ＣＣＴ　＾ＧＧ　ＧＡＡ　Ｇ ＧＡ　ＧＡＧ　ＴＴＧ　ＴＣＣ丁（Ｉｃ（ｌ＾Ａ　ＴＣＡ　`ＣＡ　ＧＴＧ　Ａ ＣＣ＾ＧＴ Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ＶＱ［Ｔｙｒ　Ｌ［ＩＬＩ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ 　Ｇｌｙ　ＧＬｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅ秩@Ｔｈｒ　Ｖｃｌ 　Ｔｈｒ　５ｅｒ ＦＩＧ、　８ 葺　葺　１　１　葺　夏 葺葺葺葺真！ （ｉＴＧ　ＧＣＡＣＡＴＡ　ＴＡＣＣＧＡ　ＴＴＧ　ＧＭ　ＴＴ［ｉ　ＣｉｉＣ ＡＴ　ＴＡＴＡＴＴＡ　ＧＴ＾６品ＧＴＡ醍ＡＣＣ＾＾ＴＴＶＱＩ　Ａｌｎ　Ｇ ｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔ ｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　ＶＱＩ　ＧＩＬh　ＶＱＩ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　ｌ１ｅ 璽Ｉ葺葺１１ ＧＧＣＴＴＣＧＣＣＣＣＴ　ＡＣＡ　ＧＣＡ　Ｇ＾＾ＭＡ　ＡＣＡＴＡＣＴＣＣ ＴＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＡ匹酩＾い■脚心ＧＧＴＧｌｙ　Ｐｈｅ＾Ｉａ　Ｐｒｏ　 Ｔｈｒ＾Ｉｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｈ撃刀@Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ １１葺璽葺皿 ６７０　６８０　６９０　７００　７１０　７２Ｇ葺葺１１葺ｌ ７３０　７４０　７５０　７６０　７７０　７８Ｇ璽蚕Ｉ葺葺に Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｌ（Ｌ　／ｌｒｇ　Ｖｏｌ　Ｔｈｒ　Ａｌ ｅ　Ｉ　（ｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ＾ｌｃｉ　`ｓｐ　Ｇｌｎ＾（ ａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ ８５Ｇ　８６０　８７０　８８０　８９０　９００Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇ ｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｌｃ　Ｐｈｅ　ｋｇ　Ｇｌｎ　ＶＱＩ　Ｃｙｓ　Ｈｌｓ　Ｔｈ ｒ　Ｔｈｒ　ＶＣＬＩ　Ｐｒｏ@Ｔｒｐ　ＶＱＩ　Ａｓｎ　Ａｓｐ ９１０　９２０　９３Ｇ　９４０　９５０　％０ＡＣＣＴＴＡ　ＡＣＡ　ＣＣＴ 　ＣＡＧ　ＴＧＧ　＾ＡＣＭＣＡＴＧ　ＡＣＡ　ＴＧＧ　ＣＭ　ＧＭ　ＴＧＧ　 ＧＭ　ＣＡＣ４Ｍ　ＡＴＣＣfＣＴＴＣ Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　 Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｈｌｓ@Ｌｙｓ　Ｉ　（ｅ 　Ａｒｇ　Ｐｈｅ ９７０　９８０　９９０　＋０００　＋０１０　１０２０ＣＴＡ　ＣＡＧ　ＧＣ Ａ　ＭＴ　ＡＴＣＡＧＴ　ＧＡＧ　ＡＧＴ　ＴＴＡ　ＧＡＡ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　 ＣＭ　ＡＴＣＣＡＧ　ＣＭ　（ＩＡ４@ＡＡＧ　＾＾■　＾ＴＧ Ｌｅｕ　Ｇｌｕ＾Ｉｎ　Ａｓｎ　ＩＩＥＩ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｌｔ＋ｕ 　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ａｔ＋Ｉ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｇ奄氏@Ｇｌｕ　Ｌｙ ｓ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ ＋０３０　１０４０　１０５０　１０６（１１０７０１０８０■＾ＴＧ＾Ｇ　Ｃ ＴＧ　ＣＡＡ　ＭＧ　ＣＴＡ　ＭＴ　ＡＧＣＴＧＧ　ＧＡＴ　（ｉＴＴ　ＴＴＴ 　Ｇ［ｉＣＡＡＴ　ＴＧＧ　ＴＴＴ　ＣＡbＴＴＡ　ＡＣＣＴＣＣ Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　 Ａｓｐ　Ｖ（１１Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ@Ａｓｐ　Ｌｔ＋ｕ 　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ ＴＧＧ　ＡＴＣＣＴＡ　［１ｌＧＴ　ＡＡＧ　ＴＡＧＴｒｐ　Ｔｌｅ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　−−−ＦＩＧ、　８　（ｃｏｎｔ、） プロモー９＝ ＦＩＧ、　９ ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＦＩＧ、　１２ しｙｓ　Ｌｐｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　ＡＳｐ　ＶＱＩ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　 Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ@Ｔｒｐ　Ｉ　ｌｅ 　Ｐｈｅ　＾ｒｇ。

東葺■葺ＭＩ ＡＡＡ　ＡＴＴ　ＧＡＡ　ＣＣＡ　ＴＴＡ　ＧＣｉＡ　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＣＣＣ ＡＣＣＭＧ　ｆｉｃＡ　ＭＧ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＧＴＧ　（撃s［Ｊ　ＣＡ［Ｊ 　ＭＪＡ　［１Ｍ Ｌｙｓ　ｒｌｅ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＶＱＬ　ＡＩＣＬ　Ｐｒｏ 　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ＾ｌ（Ｉ　ＬＹ５ンｇ　Ａｒｇ　ＶＱＩ　u（１１Ｇｉｎ　Ａ ｒｇ　Ｇｌｕ 葺　Ｗ　Ｉ　Ｉ　葺　夏 ＡＡＡ心匡Ａ　ＧＴＧ　ＧＧ＾ＡＴ＾Ｇ品Ｃ妬ＧＣＣＡ品Ｃ品ＴＴ＾ＴＴＧ　Ｔ ＣＴ印■＾ＴＡ　（ｉＴ（ｉ昆Ｇ　ＣＡＧ　Ｃ妬Ｌｙｓ　Ａｒｇ＾ＩｃＬ　Ｖａ ｌ　Ｇｌｙ　ＩＬｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｌｅ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅ ｕ　５ｅｒＧｌｙ　ｌｉｐ　uＱＩ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｇ１ｎ ＡＡＣＭＴＴＴ（ｉＣ丁ＧＡＧＧＧＣＴＡＴＴ１１！ＧＧＣＣＡＡＣＡ（ｉＣＡ ＴＣＴＧＴＴＧＣＭＣＴＣＡＣＡ（ＪＴＣＴＧＧＧＧＣＡｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｐｕ 　Ｌｅｕ　Ａｒｇ＾ｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｈｌｓ　 Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　sｏｙ　Ｖａｔ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ １１５０　１１６０　１１７０　１１８０　１１９Ｇ　＋２００１１ｅ　Ｌｙｓ 　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ｉ　Ｉｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ 　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ@Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ Ｃ丁Ｇ　ＧＧＧ　ＡＴＴ　ＴＧＧ　ＧＧＴ　ＴＧＣＴＣＴ　ＧＧ＾　＾Ｍ　ＣＴ ＣＡＴＴ　ＴＧＣＡＣＣＡＣＴ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＣＣＴ　sＧＧ　ＡＡＴ　Ｇ ＣＴ Ｌｐｕ　Ｇｌｙ　Ｉ　ｌｅ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ 　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｔ）Ｆ　ＴｌｌＴ−４１ｍ　Ｖi１１Ｐｒｏ　Ｔｒ ｐ　Ａｓｎ＾１ａ 葺葺璽ＩＩＩＩ ＡＧＴ　ＴＧ（ｉ　ＡＧＴ　ＭＴ＾＾Ａ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＣＡＧ　Ａ ＴＴ　ＴＧ［ｉ＾＾ＴＡＡＣ＾ＴＧ　ＡＣＣＴＧＧ　ＡＴ［堰@ＧＡＧ　ＴＧＧ 　ＧＡＣ Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ＾ｓｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｔ ｉｅ　Ｔｒｐ＾ｓｎ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｍ■煤@Ｇｌｕ　Ｔｒ ｐ　Ａｓｐ ｌ：］３Ｇ　１３４０　１３５０　１３６０　１３７０　１３８０４ＧＡ　ＧＭ 　Ａ丁ＴＭＣＡＡＴ　ＴＡＣＡＣＡ　ＡＧＣＴＴＡ　ＡＴＡ　ＣＡＣＴＣＣＴＴ Ａ　ＡＴＴ　ＧＭ　ＣＡＡ　ＴＣＧ　ＣＡＡ　lＣＣＡＧ Ａｒｇ　Ｇｌｕ　ｒｌｅ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　 Ｉｌｅ　Ｈｌｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ@Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　 Ａｓｎ　Ｇｌｎ ＋３９０　１４００　１４１０　１４２０　１４３０　１４４０ＣＡ＾ＧＡＡ　 ＭＧ　ＡＡＴ　Ｇ＾＾ＣＭＧ＾＾ＴＴ＾ＴＴＧ　ＧＡＡ　ＴＴＡ　ＧＡＴ＾Ｍ　 ＴＧＧ　ＧＣＡ　ＣＧＧ　ＡＴＣＣＴＡ　（P（ＩＴ脚 Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｐｕ　 Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ａｌ（Ｌ　Ａｒ■@Ｉｌｅ　Ｌｅｕ 　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ ＢａｍＨＩ　５ａＦ１ Ａ丁Ｇ　ＧＴＴ　ＣＧＴ　ＧＣＡ　ＡＡＣＡＡＡ　ＣＧＣＡＡＣ［ｉＡＧ　（ｉ ｃＴ　ＣＴＡ　ＣＧＡ　ＡＴＣＧＣＧ　ＣＧＧ　＾ＴＣＴＴbＡ［ＪＡ　ＣＣＴ 　Ｇ［ＪＡ Ｍｅｔ　ＶＱＩ　Ａｒｇ＾ＩＱ＾ｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　ＡＩ Ｑ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　ＡＩＱ　Ａｒｇ　ＩＩ（Ｉ　oｈｅ　Ａｒｇ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｙ ＧＧＡ　ＧＧＡ　［１ｔＡＴ　ＡＴＧ　ＡＧＧ　ＧＡＣＭＴ　ＴＧＧ　ＡＧＡ　 ＡＧＴ　［１ｌＡＡ　ＴＴＡ　ＴＡＴ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　Ａ`Ａ　ＧＴＡ　ＧＴ Ａ　ＡＡＡ　Ａｎ Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ａｓｐ＾ｓｎ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　５ ｅｒＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｖ≠煤@ｈｌ　Ｌｙｓ 　］　１ｐ ＧＭ　ＣＣＡ　ＴＴＡ　ＧＧＡ　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＣＣＣＡＣＣＭＧ　ＧＣＡ　 ＭＧ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＡＧＡ　m１１＾＾ＡＡＡ　 ＡＧ＾ Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＶＱＩ　Ａ１１ｌ　Ｐｒｏ　Ｔｌｙ　Ｌｙｓ 　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ＶＣｌｌ　ＶＱＩ　Ｇ奄氏@Ａｒｇ　Ｇｌ ｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ ＧＣＡ　ＧＴＧ　ＧＧＡ　ＡＴＡ　ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＧＣＣＡＧＡ　ＣＡＡ　Ｔ ＴＡ　ＴＴ（ｉ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＡＴＡ　ＧＴＧ　ＣＡ［堰@ＣＡＧ　ＣＡＧ 　ＭＣＭ丁 ＡＩＱ　ＶＱＩ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ＾ｌ（Ｉ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　 Ｌｐｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＩＩＥＩ　ＶＣｌｌ　Ｇ撃氏@Ｇｉｎ　Ｇｉ ｎ＾５ｎ＾５ｎ ＴＴＧ　ＣＴＧ　ＡＧＧ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＧＡＧ　［ｉＧＣＣＡＡ　ＣＡＧ　 Ｃ＾Ｔ　ＣＴＧ　ＴＴＧ　ＣＡＡ　ＣＴＣＡＣＡ　ＧＴＣＴfＧ　ＧＧＣ＾ＴＣ ＡＡＧ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌ＋１　ｌｉｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ 　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｔ）ｙ　Ｖ（P１ｔｒｐ　Ｇｌｙ 　ＩＩＥＩ　Ｌｙｓ ＣＡＧ　ＣＴＣＣＡＧ　ＧＣＡ　ＡＧＡ　ＡＴＣＣＴＧ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡ Ａ　ＡＧＡ　ＴＡＣＣＴ八へ［ｌＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＣＡf　ＣＴＣＣＴＧ　 ＧＧＧ Ｇｌｎ　Ｌｐｕ　Ｇｌｎ＾ｌａ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　Ｌｅｕ＾ＩＱ　Ｖａｔ　Ｇｌ ｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｇ奄氏@Ｌｅｕ　Ｌｅ ｕ　Ｇｌｙ ＾ＴＴ　ＴＧＧ　ＧＧＴ　ＴＧＣＴＣＴ　ＧＧＡ　ＡＡＡ　ＣＴＣＡＴＴ　ＴＧ ＣＡＣＣＡＣＴ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＣＣＴ　ＴＧＧ　ＭＴ　fＣＴ　ＡＧＴ　Ｔ θ ｒｌｔ＋　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　５ｅｒＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｔ＋ｕ　］　ｌ （Ｉ　Ｃｙｓ　Ｔ）ｙ　Ｔｈｒ　ＡＩＱ　Ｖｃｌ　Ｐｒｏ　sｒｐ　Ａｓｎ　Ａ ｌａ　Ｓｅｒ　丁ｒｐＡＧＴ　ＭＴ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　ＣＴＣｉ　Ｇ＾＾ＣＡＧ 　ＡＴＴ　ＴＧＧ　ＡＡＴ　ＭＣＡＴＧ＾ＣＣＴＧＧ＾ＴＧ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　 Ｇ`ＣＡｔ請崗 Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　１１ｅ　Ｔｒｐ＾ ｓｎ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　sｒｐ　Ａｓｐ　Ａ ｒｇ　Ｇｌｕ ＦＩＧ、１５ ＦＩＧ、　１５　（ｃｏｎｔ、） ＦＩＧ、　１６ ＦＩＧ、　１７ ｏｏ　ｏｏｏｏｏｏｏｏｏｏｏｏｏ。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ＨＩＶ−２ウイルスのエンベロープ領域の約８４８塩基対のヌクレオチド によりコードされるペプチド・フラグメントであり、図４に示された７２９７位 〜８１３９位のＨＩＶ−２プロウイルス・ヌクレオチドによりコードされるペプ チド。フラグメント。 （２）ＨＩＶ−２ウイルスのエンベロープ領域の約１０３８塩基対のヌクレオチ ドによりコードされるペプチド・フラグメントであり、図８に示された７１０１ 位〜８１３９位のＨＩＶ−２プロウイルス・ヌクレオチドによりコードされるペ プチド・フラグメント。 （３）ＨＩＶ−２ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチ・フラグメン トおよびＨＩＶ−１ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグ メントを含むキメラＨＩＶ−２−ＨＩＶ−１ペプチド・フラグメント。 （４）請求項１記載のＨＩＶ−２ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプ チド・フラグメントおよびＨＩＶ−１ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用 ペプチド・フラグメントを含むキメラＨＩＶ−２−ＨＩＶ−１ペプチド・フラグ メント。 （５）ＨＩＶ−１ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグメ ントが、クローンＧまたはそこから誘導されたペプチド・フラグメントから成る 群から選択される、請求項４記載のキメラＨＩＶ−２−ＨＩＶ−１ペプチド・フ ラグメント。 （６）ＨＩＶ−１ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグメ ントがＣＢｒｅ３である、請求項４記載のキメラＨＩＶ−２−ＨＩＶ−１ペプチ ド・フラグメント。 （７）ＨＩＶ−２ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグメ ント、ＨＩＶ−１ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグメ ントおよびＨＴＬＶ−１ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フ ラグメントを含むキメラＨＩＶ−２−ＨＩＶ−１−ＨＴＬＶ−１ペプチド・フラ グメント。 （８）ＨＩＶ−２ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグメ ントが、図４に示された７２９７位〜８１３９位のＨＩＶ−２プロウイルスヌク レオチドによりコードされるか、または図８に示された７１０１位〜８１３９位 のＨＩＶ−２プロウイルス・ヌクレオチドによりコードされる、請求項７記載の キメラＨＩＶ−２−ＨＩＶ−１−ＨＴＬＶ−１ペプチド・フラグメント。 （９）ＨＩＶ−１ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグメ ントが、図２１に示されたＫｌＤＧ７１３５３のＨＩＶ−１暗号化配列を含む、 請求項７記載のキメラＨＩＶ−２−ＨＩＶ−１−ＨＴＬＶ−１ペプチド・フラグ メント。 （１０）ＨｌＶ−２ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグ メントおよびＨＴＬＶ−１ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・ フラグメントを含むキメラＨＩＶ−２−ＨＴＬＶ−１ペプチド・フラグメント。 （Ｈ）ＨＩＶ−２ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグメ ントが、図４に示された７２９７位〜８１３９位のＨＩＶ一２プロウイルス・ヌ クレオチドによりコードされるか、または図８に示された７１０１位〜８１３９ 位のＨＩＶ−２プロウイルス・ヌクレオチドによりコードされる、請求項１０記 載のキメラＨＩＶ−２−ＨＴＬＶ−１ペプチド・フラグメント。 （１２）ＨＴＬＶ−１ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラ グメントが、６１０１−６１１８および６１７０−６４９９位のＨＴＬＶ−１プ ロウイルス・ヌクレオチドによりコードされる、請求項１０記載のキメラＨＩＶ −２−ＨＴＬＶ−１ペプチド・フラグメント。 （１３）ＨＩＶ−１ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグ メントおよびＨＴＬＶ−１ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・ フラグメントを含むキメラＨＩＶ−１−ＨＴＬＶ−１ペプチド・フラグメント。 （１４）ＨＩＶ−１ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグ メントが、クローンＧまたはそこから誘導されたペプチド・フラグメントから成 る群から選択される、請求項１３記載のキメラＨＩＶ−１−ＨＴＬＶ−１ペプチ ド・フラグメント。 （１５）ＨｌＶ−１ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグ メントがＣＢｒｃ３である、請求項１３記載のキメラＨＩＶ−１−ＨＴＬＶ−１ ペプチドフラグメント。 （１６）ＨＴＬＶ−１ウイルスのエンペロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラ グメントが、６１０１−６１１８および６１７０−６４９９位のＨＴＬＶ−１プ ロウイルス・ヌクレオチドによりコードされる、請求項１３記載のキメラＨＩＶ −１−ＨＴＬＶ−１ペプチド・フラグメント。 （１７）請求項１−１６または２２−２４記載のペプチド・フラグメントのずれ かをコードするＤＮＡを含む、宿主細胞形質転換用の組換えベクター。 （１８）ＨＩＶ−２抗体の検出方法であって、（ａ）ＨＩＶ−２に対する抗体を 含む疑いのある試料を、請求項１−１２または２２−２４のいずれか１項記載の ペプチド・フラグメントと接触させ、 （ｂ）上記抗体の存在を検出する 段階を含む方法。 （１９）ＨＩＶ−１抗体の検出方法であって、（ａ）ＨＩＶ−２に対する抗体を 含む疑いのある試料を、請求項３−９または２２−２４のいずれか１項記載のペ プチド・フラグメントと接触させ、 （ｂ）上記抗体の存在を検出する 段階を含む方法。 （２０）ＨＴＬＶ−１および／またはＨＴＬＶ−１１抗体の検出方法であって、 （ａ）ＨＩＶ−２に対する抗体を含む疑いのある試料を、請求項７−１６のいず れか１項記載のペプチド・フラグメントと接触させ、（ｂ）上記抗体の存在を検 出する という段階を含む方法。 （２１）試料からＨＩＶ−２、ＨＩｖ−１またはＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ− １１抗体またはそれらの抗体の組み合わせを検出するためのキットであって、１ 個またはそれ以上の容器をその中に閉鎖封入状態で受容すべく区画化されている 担体を含み、さらに１．請求項１−１６または２２−２４のいずれか１項記載の ペプチド・フグメントを含む第１容器手段、および２．ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−１ またはＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１抗体またはそれらの組み合わせの存在 を測定するための検出システム を含むキット。 （２２）請求項２記載のＨＩＶ−２ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペ プチド・フラグメントおよびＨＩＶ−１ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断 用ペプチド・フラグメントを含むキメラＨＩＶ−２−ＨＩＶ−１ペプチド・ラグ メント。 （２３）ＨＩＶ−１ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグ メントが、かクローンＧまたはそこから誘導されるペプチド・フラグメントら成 る群から選択される、請求項２２記載のキメラＨＩＶ−２−ＨＩＶ−１ペプチド ・フラグメント。 （２４）ＨＩＶ−１ウイルスのエンベロープ領域の免疫診断用ペプチド・フラグ メントがＣＢｒｅ３である、請求項２２記載のキメラＨＩＶ−２−ＨＩＶ−１ペ プチド・フラグメント。