JP2012105649A - Hivに対する抗体の検出および識別に有用な抗原構築物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】HIV-1分離株HAM112から得た単離されたHIV-1 O群envポリペプチド、ならびに(a)HIV-1 O群envポリペプチドおよびHIV-1 M群envポリペプチドのそれぞれの1以上の融合体を含む抗原構築物、および(b)追加的なO群配列を含有する他の抗原構築物。
【選択図】なし
Description
(a)第1 HIV-1 O群envポリペプチド、
(b)第2 HIV-1 O群envポリペプチド、
(c)第1 HIV-1 M群envポリペプチド、および
(d)第2 HIV-1 M群envポリペプチド
の融合体を含む抗原構築物を開示する。前記構築物中のHIV-1 M群ポリペプチドはB亜型のHIV-1分離株に由来するものであってもよく、好ましくは、少なくとも1つはHIV-1 M群分離株HXB2Rに由来する。これらのO群/M群env構築物のいずれかにおいては、HIV-1 O群配列の少なくとも1つはHIV-1 O群分離株HAM112に由来するものであってもよい。
(a)該第1 HIV-1 O群envポリペプチドが、HIV-1 O群分離株HAM112のgp120タンパク質の免疫反応性部分を含み、
(b)該第2 HIV-1 O群envポリペプチドが、HIV-1 O群分離株HAM112のgp41タンパク質の免疫反応性部分を含み、
(c)該第1 HIV-1 M群envポリペプチドが、B亜型の第1 HIV-1 M群分離株のgp120タンパク質の免疫反応性部分を含み、
(d)該第2 HIV-1 M群envポリペプチドが、B亜型の第2 HIV-1 M群分離株のgp41タンパク質の免疫反応性部分を含むものである。これらのうちで好ましいのは、B亜型の第1および第2 HIV-1 M群分離株構築物が同じでありHIV-1 M群分離株HXB2Rである構築物、およびHIV-1 M群分離株HXB2Rのgp41タンパク質の疎水性領域の部分が該第2 HIV-1 M群envポリペプチドに存在しない構築物である。
(a)該第1 HIV-2 envポリペプチドが、図11の配列(配列番号55)の残基248〜307またはその一部より実質的になるアミノ酸配列を有し、
(b)該第2 HIV-2 envポリペプチドが、図11の配列(配列番号55)の残基308〜466またはその一部より実質的になるアミノ酸配列を有するものである。本発明のHIV-2構築物の代表例としては、pHIV-210(配列番号55)ならびにその任意の誘導体、変異体および類似体が挙げられる。
(a)本発明の少なくとも1つの抗原構築物と該試験サンプルとを一緒にして混合物を得、
(b)該抗原に対して免疫学的に反応性であり該サンプル中に存在しうる抗体と該抗原との複合体の形成に適した条件下、該混合物をインキュベートし、
(c)形成したいずれかの複合体の存在を検出する工程を含んでなる方法を開示する。該方法の1つの実施形態においては、工程(c)における複合体の存在の検出を、シグナル生成化合物が結合している本発明の追加的抗原構築物を使用して行なう。もう1つの実施形態においては、特異的結合ペアの第1メンバーが結合している本発明の追加的抗原構築物を使用して、さらに、シグナル生成化合物が結合している特異的結合ペアの第2メンバーを含む指示試薬を使用して、検出を行なう。もう1つの実施形態においては、工程(c)における複合体の存在の検出を、工程(b)において形成した複合体に対する抗体(該抗体にはシグナル生成化合物が結合している)を使用して行なう。さらにもう1つの実施形態においては、工程(c)における複合体の存在の検出を、特異的結合ペアの第1メンバーが結合している工程(b)において形成した複合体に対する抗体を使用して行なう(そのような検出は、さらに、シグナル生成化合物が結合している特異的結合ペアの第2メンバーを含む指示試薬の使用を必要とする)。
本発明の単離されたポリペプチドの1つの実施形態においては、HIV-1 O群分離株HAM112のenvタンパク質のアミノ酸配列を図1(配列番号61)に示す。この場合の「単離(された)」は、そのようなポリペプチドが、該タンパク質の実質的に純粋な調製物にまで、通常はin situで存在する他のウイルスまたは細胞成分に対して比較的に精製されていることを意味すると意図される。そのようなポリペプチドは、アッセイ試薬として、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造のために、ワクチンの製造などにおいて使用することができる。
遺伝子の構築および配列決定のためのオリゴヌクレオチドは、Abbott Laboratories, Synthetic Genetics(San Diego, CA)またはOligo Etc.(Wilsonville, CA)で合成した。AmpliTaq DNAポリメラーゼおよびUlTma DNAポリメラーゼを含むすべてのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)試薬は、特に示さない限り、Perkin-Elmer Corporation(Foster City, CA)から購入し、製造業者の仕様書に従い使用した。PCR増幅はGeneAmp 9600サーマルサイクラー(Perkin-Elmer)上で行なった。特に示さない限り、制限酵素はNew England BioLabs(Bevery, MA)から購入し、消化は製造業者の推奨どおりに行なった。クローニングに使用したDNA断片は、特に示さない限り、アガロース(Life Technologies, Gaithersburg, MD)ゲル上で単離した。
QIAamp Blood Kit(Qiagen)および該製造業者が推奨している方法を用いて、HAM112と称されるHIV-1 O群分離株(H. Hamplら, Infection 23:369-370 [1995])に感染したヒト末梢血単核細胞の培養上清からウイルスRNAを抽出した。RNAを、ヌクレアーゼを含有しない50μl容量の水(5Prime-3Prime, Inc., Boulder, CO)中で溶出し、-70℃で保存した。env領域の配列を得るための方法は、4つの重複env遺伝子断片のcDNA合成およびPCR(ネスティド)増幅を含むものであった。該増幅産物を自動ABI Model 373A Stretch Sequencer上で直接配列決定した。増幅反応は、GeneAmp RNA PCRおよびGeneAmp PCR Kits(Perkin Elmer)を製造業者の概略説明のとおりに使用して行なった。オリゴヌクレオチドプライマーの位置はHIV-1 ANT70 env配列(G. Myersら編, 前掲)に対応する。プライマーenv 10R [ヌクレオチド(nt)791-772; 配列番号62]、env15R(nt 1592-1574; 配列番号63)、env22R(nt 2321-2302; 配列番号64)、env26R(envの3’側nt 250-232; 配列番号65)を、それぞれ断片1〜4のcDNA合成に使用した。逆転写反応物を、42℃で30分間、ついで99℃で5分間インキュベートした。第1ラウンドのPCR増幅は、以下のプライマーの組合せを使用する95℃で30秒間、52℃で30秒間および72℃で1分間の30サイクルよりなるものであった:断片1〜4に関してそれぞれenv1F(envの5’側nt 184-166; 配列番号66)およびenv10R(配列番号62)、env7F(nt 564-586; 配列番号67)およびenv15R(配列番号63)、env12F(nt 1289-1308; 配列番号68)およびenv22R(配列番号64)、env19F(nt 2020-2040; 配列番号69)およびenv26R(配列番号65)。第2ラウンドの増幅(ネスティドPCR)では、以下のプライマーの組合せと共に5μlのそれぞれの第1ラウンドPCR反応物を鋳型として使用した:断片1〜4に関してそれぞれenv2F(envの5’側nt 37-15; 配列番号70)およびenv9R(nt 740-721; 配列番号71)、env8F(nt 631-650; 配列番号72)およびenv14R(nt 1437-1416; 配列番号73)、env13F(nt 1333-1354; 配列番号74)およびenv21R(nt 2282-2265; 配列番号75)、env20F(nt 2122-2141; 配列番号76)およびenv25R(envの3’側nt 111-94; 配列番号77)。第2ラウンドの増幅条件は、第1ラウンドで用いたものと同じであった。断片をアガロースゲル精製し、Quiagen QIAEX II Gel Extraction Kitで抽出した。ネスティドPCRに使用したプライマーと、断片1にはプライマーenv4F(配列番号78)およびenv5R(配列番号79)、断片2にはプライマーenv10F(配列番号80)、env11F(配列番号81)、env11R(配列番号82)、env12F(配列番号68)およびAG1(配列番号87)、断片3にはプライマーenv15F(配列番号83)およびenv19R(配列番号84)、断片4にはプライマーenv22F(配列番号85)およびenv24R(配列番号86)を使用して、断片を直接配列決定した。HIV-1 O群分離株HAM112からのenvの推定アミノ酸配列(配列番号61)を図1に示す。
図2は、合成HIV-1 O群env gp120/gp41遺伝子構築物を得るために用いる方法を示す。該env gp120/gp41配列は、HIV-1 O群分離株HAM112(配列番号61)に基づく。HAM112のenv配列の決定の概要は、前記実施例2に説明されている。env gp120のC末端の45アミノ酸およびenv gp41の327アミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドを設計した(ヌクレオチド#1は、該合成遺伝子中のgp120の第1コドンの1番目のものである)。gp41の高度に疎水性(H)の領域(膜貫通領域)を含む天然HAM112 gp41と比べて、該合成遺伝子は26アミノ酸(ヌクレオチド643〜720)の欠失を有する。したがって、構築される完全長合成gp41遺伝子は327アミノ酸である。
3つのPCR反応(100μl容量)を以下のとおりに調製した。
PCR反応を、UlTma DNAポリメラーゼ(3U)および1×バッファーならびに1.5mM MgCl2、40μMの各dNTP、24.4pmolのオリゴヌクレオチドOsyn-5′(配列番号11)、25pmolのオリゴヌクレオチドOsyn-P3′(配列番号16)および前記実施例3第1A節からのそれぞれ〜10ngのゲル単離1Bおよび1A産物で調製した。サイクリング条件は実施例3第1A節と同じであった。第2ラウンドの増幅を用いて、さらなる所望の産物を得た。これは、49pmolのOsyn-5′(配列番号11)、50pmolのOsyn-P3′(配列番号16)および鋳型としての第1ラウンドからのPCR産物5μlで前記UlTma混合物(100μlの反応容量)を調製することにより行なった。これらの反応物を94℃で90秒間インキュベートし、ついで前記(第3A節)のとおりにサイクルを行なった。Osyn-5′/Osyn-P3′PCR産物を、前記のとおりにゲル単離した。
Osyn-5′-Osyn-P3′PCR産物を制限エンドヌクレアーゼEco RI+Bam HIで消化し、Eco RI+Bam HIで消化されゲル単離されているベクターpKRR826(前記のとおり)中に連結した。該連結産物を使用してDH5αコンピテント細胞を形質転換した。オリゴヌクレオチドpKRREcoRIフォワード(配列番号38)およびpKRRBamHIリバース(配列番号39)を使用するコロニーPCRにより、所望のクローンを同定した。ミニプレップDNAをpGO-8候補クローンA2の一晩培養から調製し、Osyn-5′-Osyn-P3′プラスミドインサートをオリゴヌクレオチドプライマーpKRREcoRIフォワード(配列番号38)、pKRRBamHIリバース(配列番号39)、41sy-1(配列番号44)および41sy-2(配列番号41)で配列決定した。
100μl容量のPCR反応を、UlTma DNAポリメラーゼ(3U)および1×バッファーならびに1.5mM MgCl2、40μMの各dNTP、50pmolのオリゴヌクレオチドOsyn-5′-修復(配列番号24)、50pmolのOsyn-P3′(配列番号16)および鋳型としての〜1ngのpGO-8候補クローンA2ミニプレップDNA(前記反応から得たもの)で調製した。該反応物を94℃で90秒間インキュベートし、ついで94℃で30秒間、50℃で30秒間および72℃で60秒間の20サイクルで増幅した。ついでOsyn-5’修復/Osyn-P3′ PCR産物をゲル単離し、Eco RI+Bam HIで消化した。該消化産物を、Eco RI+Bam HIで消化されたpKRR826ベクター中に連結した。該連結産物を使用してDH5αコンピテント細胞を形質転換した。オリゴヌクレオチドpKRREcoRIフォワード(配列番号38)およびpKRRBamHIリバース(配列番号39)を使用するコロニーPCRにより、所望のクローンを同定した。pGO-8候補クローン6の一晩培養を準備し、ミニプレップDNAを調製した。Osyn-5′修復/Osyn-P3′プラスミドインサートを、オリゴヌクレオチドプライマーpKRREcoRIフォワード(配列番号38)、pKRRBamHIリバース(配列番号39)、41sy-1(配列番号44)および41sy-2(配列番号41)で配列決定した。配列決定の結果に基づき、pGO-8候補クローン#6をpGO-8PL/DHSαと称することにした。配列番号57は、該コード領域のヌクレオチド配列を示す。図5は、pGO-8PL組換えタンパク質のアミノ酸配列(配列番号58)を示す。pGO-8PL組換えタンパク質は、N末端メチオニン、45アミノ酸のenv gp120(HIV-1 Group O, HAM112分離株)および169アミノ酸のenv gp41(HIV-1 O群HAM112分離株)よりなる。
pGO-8CKS/XL1(配列番号59は該コード領域のヌクレオチド配列を示す)は、組換えタンパク質pGO-8CKSをコードしている。図6は、pGO-8CKSのアミノ酸配列(配列番号60)を示す。このタンパク質は、246アミノ酸のCKS/ポリリンカー、45アミノ酸のenv gp120(HIV-1 O群, HAM112分離株)および169アミノ酸のenv gp41(HIV-1 O群, HAM112分離株)よりなる。pGO-8CKS/XL1の構築は以下のとおりに行なった。
図3A〜3Dは、pGO-9PL/DH5αの構築にかかわる工程の概要を図示する。pGO-9PL/DH5αは、組換えタンパク質pGO-9PLをコードしている。配列番号47は、pGO-9PL/DH5αのコード領域のヌクレオチド配列を示す。図7は、pGO-9PL組換えタンパク質のアミノ酸配列(配列番号48)を例示する。このタンパク質は、N末端メチオニン、45アミノ酸のenv gp120(HIV-1 O群, HAM112分離株)および199アミノ酸のenv gp40(HIV-1 O群, HAM112分離株)よりなる。pGO-9PL/DH5αの構築は以下のとおりに行なった。
図3A〜3Dは、pGO-9CKS/XL1の構築にかかわる工程の概要を図示する。pGO-9CKS/XL1は、組換えタンパク質pGO-9CKSをコードしている。図8は、pGO-9CKS組換えタンパク質のアミノ酸配列(配列番号50)を示す。このタンパク質は、246アミノ酸のCKSおよびポリリンカー、およびそれに続く45アミノ酸のenv gp120(HIV-1 O群, HAM112分離株)および199アミノ酸のenv gp41(HIV-1 O群, HAM112分離株)よりなる。pGO-9CKS/XL1の構築は以下のとおりに行なった。
Osyn-O-M断片を以下のとおりに構築した。100μlのPCR反応を、AmpliTaq DNAポリメラーゼ(2.5U)、1×バッファー、50μMの各dNTP、50pmolのI-PCR(配列番号26)、50pmolのOsyn-M(配列番号14)および10ngのゲル単離されたPCR断片3A(前記実施例3第A節)を使用して調製した。該反応物を95℃で105秒間インキュベートし、ついでそれを95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で60秒間の15サイクルで増幅し、ついでそれを72℃で7分間維持した。Osyn I-Mと称される該産物をゲル単離し、製造業者が推奨している方法に従いPCR IIベクター(TA Cloning Kit; Invitrogen, San Diego, CA)中にクローニングした。得られた連結産物を使用してDH5αコンピテント細胞を形質転換した。プラスミドミニプレップDNAをクローンIM-6の一晩培養から作製し、該遺伝子インサートを56759(配列番号45)および55848(配列番号46)で配列決定した。
これらの操作は以下のとおりに行なった。
図4A〜4Fは、pGO-11PL/DH5αの構築にかかわる工程の概要を図示する。pGO-11PL/DH5αは、組換えタンパク質pGO-11PLをコードしている。図9は、pGO-11PL組換えタンパク質のアミノ酸配列(配列番号52)を示す。このタンパク質は、N末端メチオニン、45アミノ酸のenv gp120(HIV-1 O群, HAM112分離株)および327アミノ酸のenv gp41(HIV-1 O群, HAM112分離株)よりなる。pGO-11PL/DH5αは以下のとおりに構築した。
図4A〜4Gは、pGO-11CKS/XL1の構築にかかわる工程の概要を図示する。pGO-11CKS/XL1は、組換えタンパク質pGO-11CKSをコードしている。図10は、pGO-11CKS組換えタンパク質のアミノ酸配列(配列番号54)を示す。このタンパク質は、246アミノ酸のCKSおよびポリリンカー、およびそれに続く45アミノ酸のenv gp120(HIV-1 O群HAM112分離株)および327アミノ酸のenv gp41(HIV-1 O群HAM112分離株)よりなる。pGO-11CKS/XL1は以下のとおりに構築した。
図11は、pHIV-210組換えタンパク質(配列番号55)のアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、247アミノ酸のCKS/リンカー配列、env gp120からの60アミノ酸(#432-491; HIV-2分離株D194.10)および159アミノ酸のenv gp36(#492-650; HIV-2 D194.10)よりなる。pHIV210/XL1-Blueの構築は以下のとおりに行なった。
pGO-9CKS/XL1およびpGO-11CKS/XL1の一晩種培養物を、100μg/mlアンピシリンナトリウムで補足された500mlの無菌Excell Terrific Broth(Sigma Chemical Corp., St. Louis Mo.から入手可能)中で調製し、振とうオービタル(orbital)インキュベーター中、32℃または37℃で配置した。種培養からの100μlの接種物を、100μg/mlアンピシリンナトリウムで補足された1リットルの無菌Excell Terrific Brothを含有するフラスコに移した。培養が中期対数増殖に達するまで該培養を37℃でインキュベートし、ついで1mM ITPG(イソプロピルチオガラクトシド)で37℃で3時間誘導した(PLベクター構築物の場合には、培養が中期対数増殖に達するまで該培養をインキュベートし、ついで培養温度を42℃に変化させることにより3時間誘導した)。誘導期の後、細胞を遠心分離によりペレット化し、標準的な技術に従い収穫した。ペレット化細胞を、さらなる加工処理まで-70℃で保存した。
実施例5から得た凍結細胞を、50mM Tris pH8、10mM Na EDTA、150mM NaCl、8% (w/v)ショ糖、5% Triton X-100(登録商標) (v/v)、1mM PMSFおよび1μMペプスタチンAを含む冷溶解バッファー中でホモジナイズすることにより再懸濁させた。リゾチームを、加工細胞1g当たり1.3mgの濃度で該ホモジネートに加え、得られた混合物を氷上で30分間インキュベートして該細胞を溶解した。封入体を遠心分離により可溶性タンパク質から分離した。これらのペレット化封入体を洗浄し、(1)溶解バッファー、(2)10mM Na EDTA pH8、30% (w/v)ショ糖、および(3)水中で順次ペレット化した。洗浄された封入体を50mM Tris pH8、10mM Na EDTA、150mM NaClおよび3M尿素に再懸濁し、氷上で1時間インキュベートした。ついで該封入体を遠心分離により可溶性タンパク質から分離した。該ペレット化封入体を、7Mグアニジン-HCl、50mM Tris pH8、0.1% (w/v)β-メルカプトエタノール(BME)中で4℃で一晩、完全に可溶化した。該可溶化組換え抗原を遠心分離により清澄化し、0.2μmのフィルターに通過させ、クロマトグラフィーによる精製まで-20℃で保存した。
実施例6から得た可溶化HIV-1 O群組換えgp41抗原を、以下のとおり、2工程の方法により精製した。不溶性抗原のグアニジン-HCl抽出物を、50mM Tris pH8、8M尿素および0.1% BME (v/v)で平衡化したSephacryl S-300カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。SDS-ポリアクリルアミド電気泳動を用いて画分を分析した。組換えgp41抗原を含有する画分をプールし、ついで限外濾過により濃縮した。該組換え抗原濃縮物を4% SDS (w/v)および5%BME (w/v)で室温にて3時間処理した。SDSで処理した抗原をさらに、25mM Tris pH8、0.15M NaCl、0.1% v/v BME、0.1% SDS (w/v)で平衡化したSephacryl S-300上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。SDS-ポリアクリルアミド電気泳動を用いて該画分を分析した。精製組換え抗原を含有する画分をプールし、0.2μmのフィルターに通過させ、-70℃で保存した。
実施例5に記載のとおりに、プラスミドpTB319を含有する細胞を増殖させ、誘導した。細胞を溶解し、封入体を加工した(参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,124,255号の実施例5に記載されているのと実質的に同じ方法で行なった)。ついで該ペレット物質をSDS、リン酸塩(pH6.8)中で可溶化し、ついでS-300カラム上でのクロマトグラフィーに付した。
実施例5に記載のとおりに、pHIV-210/XL1-Blue細胞(前記実施例4)を増殖させ、誘導した。ベンゾナーゼ、リゾチームおよびPMSFで補足されたリン酸塩、MgCl2、Na EDTA、Triton X-100(登録商標)(pH7.4)を含有するバッファーで細胞を溶解した。封入体を遠心分離により可溶性タンパク質から分離した。該ペレットを、蒸留H2O、Triton X-100(登録商標)、デオキシコラート、NaCl、リン酸塩(pH7.0);50mMリン酸塩(pH7.0);尿素、SDS(リン酸塩(pH7.0)中)+BMEで順次洗浄した。タンパク質をSDS、リン酸塩(pH7.0)およびBME中で可溶化し、ついでS300カラム上でのクロマトグラフィーに付した。
A.試薬の調製
1.セレン(Se)コロイド懸濁液を、実質的に以下のとおりに調製した。SeO2を水に0.0625gm/mlの濃度にまで溶解した。ついでアスコルバートを水に0.32gm/mlの濃度にまで溶解し、70℃の水浴中で24時間加熱した。ついで該アスコルバート溶液を水中で0.0065gm/mlにまで希釈した。該SeO2溶液を該希釈アスコルバート溶液に素早く加え、42℃でインキュベートした。吸光度の最大値が、542nm〜588nmの波長において30を超えた時点(最低で42時間後)で、インキュベーションを終了した。該コロイド懸濁液を-2〜8℃に冷却し、ついで保存した。セレンコロイド懸濁液は、Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois(Code 25001)から入手可能である。
適用パッド材は、樹脂結合ガラス繊維紙(Lydall)を含む。調製した共役体(前パラグラフ2に記載)の約0.1mlを適用パッドに加える。
すべての試薬を、充填およびデフレクト試薬の噴射(charge and deflect reagent jetting)により、ニトロセルロースメンブレンに適用する。該ニトロセルロースは、感圧接着剤でコーティングされたMYLAR(登録商標)メンブレンにより支持する。
試験サンプル血清、全血、唾液および尿サンプル中のHIVに対する抗体の存在に関する高速アッセイを、以下のとおりに行なった。1.5mlのエッペンドルフチューブ中に、5μlの血清および600μlのサンプル溶出バッファー(SEB)(50mM Tris、1%BSA (w/v)、0.4% Triton X-405(登録商標) (v/v)、1.5%カゼイン(w/v)、3%ウシIgG (w/v)、4%大腸菌(E. coli)ライセート(v/v)[pH8.2]を含有)を混合した。この混合物の4滴をSTARハウジングのサンプルウェルに適用した。つぎに1μlの血清または全血をマイクロタイタープレートのウェル中の100μlのSEBに加え、該ニトロセルロースストリップを該ウェル中に加えた。この後、1μlの血清または全血を本発明のサンプルウェルの試験装置中に直接スポットし、4滴のSEBを加えた。唾液を試験する場合には、50または75μlの唾液を、マイクロタイタープレートのウェル中のそれぞれ50μlまたは25μlのSEBに加え、ついで該ニトロセルロース試験ストリップを該ウェルに加えた。尿を試験する場合には、50μlの尿をマイクロタイタープレート中のウェル中の50μlのSEBに加え、該ニトロセルロース試験ストリップを該ウェル中に加えた。あるいは、100μlの尿をマイクロタイタープレートのウェル中で使用し、SEBを使用することなく該ニトロセルロース試験ストリップを加えた。
1.5mlのエッペンドルフチューブ中に、確認された陽性HIV-1 O群、HIV-1 M群もしくはHIV-2または確認された陰性HIV-1 O群、HIV-1 M群もしくはHIV-2全血試験サンプルからの1μlの血液の等価体を、5μlの確認された陰性HIV-1 O群、HIV-1 M群もしくはHIV-2血清および100μlのSEBに加え、混合した。この混合物を、本発明の試験装置のサンプルウェルに適用した。
抗原1に対する抗体が試験サンプル中に存在する場合には、可視反応が抗原1の捕捉帯域およびアッセイ完了帯域において示されたが、抗原2または抗原3の帯域においては示されなかった。抗原2に対する抗体が試験サンプル中に存在する場合には、可視反応が抗原2の捕捉帯域およびアッセイ完了帯域において示されたが、抗原1または抗原3の帯域においては示されなかった。抗原3に対する抗体が試験サンプル中に存在する場合には、可視反応が抗原3の捕捉帯域およびアッセイ完了帯域において示されたが、抗原1または抗原2の帯域においては示されなかった。また、陰性対照は、抗原1、抗原2および抗原3の帯域においては無反応性である(可視反応を示さない)はずであるが、アッセイ完了帯域においては反応性であるはずである。陽性対照(抗原1、2および/または3に対する既知反応性抗体)は、それが抗原/抗体反応において特異的に結合する適当な抗原の帯域において反応性であるはずである。陽性反応が抗原捕捉帯域の1つにおいては生じたが、アッセイ完了帯域においては生じなかった場合には、結果を無効とみなし、試験を繰返した。
3人の患者(患者番号0109、4068および4475で識別する)の血液、尿および唾液を、本明細書に記載の本発明のニトロセルロース固相装置上で、前記のアッセイプロトコールに従い試験した。患者0109、4068および4475のそれぞれの各血液および尿試験サンプルは、抗原1(pTB319; 配列番号56)に対して反応性であった。患者4068および4475の唾液試験サンプルも抗原1に対して反応性であったが、患者0109の唾液試験サンプルは本発明の試験装置において無反応性であった。患者0109の唾液試験サンプルを後で、標準的なEIAにより再試験したところ、それはHIV-1 gp4に対する抗体に対して無反応性であると確認された。このことは、患者0109の唾液試験サンプルについて得られた結果が有効であったことを示している。
2つの陰性血清および2つの陰性全血試験サンプル(それぞれは同じ2つの陰性血清でスパイクされたもの)を試験した。サンプルは関連抗原に特異的な抗体を含有しておらず、該試験サンプルは、該試験に関するアッセイ後に陰性であった(すなわち、O、Mまたは2のいずれの位置にも反応を示す可視的バーが存在しないことから示されるとおり、無反応性であった)。試験サンプル反応帯域中の陽性反応バーにより示されるとおり、試験サンプルは各試験装置中に存在した。
5つのHIV-1 M群血清および5つの全血サンプル(HIV-1 M群陽性血清でスパイクされたもの)を、10個の装置を使用して試験した。HIV-1 M群抗原帯域の反応線の現像から示されるとおり、HIV-1 M群サンプルは、HIV-1 M群抗原(pTB319)に特異的な抗体を含有することが認められ、試験装置10個中9個のアッセイ完了帯域中に可視反応線が認められた。1つの特定の試験装置においては、HIV-1 M群抗体に関する捕捉帯域中にバンドが存在したが、試験サンプルがアッセイ完了帯域まで到達せず、したがって、この特定のサンプルについては、該アッセイを繰返す必要があった。HIV O群およびHIV-2に関する捕捉試薬に対する交差反応性は認められなかった。
2つの確認された陽性HIV-1 O群血清および2つの全血試験サンプル(HIV-1 O群血清でスパイクされたもの)を、さらに4個の装置を使用して試験した。HIV-1 O群抗原捕捉帯域中に陽性バーの結果が認められ、各装置のアッセイ完了帯域中に反応線が認められたことから示されるとおり、HIV-1 O群サンプルは、HIV-1 O群抗原に特異的な抗体を含有することが判明した。HIV-1 M群またはHIV-2捕捉抗原に対する交差反応性は認められなかった(可視的なバーは存在しなかった)。
さらに10個の試験装置を使用して、確認された5つのHIV-2陽性血清および全血(5つのHIV-2血清でスパイクされたもの)を試験した。HIB-2抗原帯域の反応バーにより示されるとおり、該HIV-2サンプルは、HIV-2抗原(pHIV210)に特異的な抗体を含有することが判明した。これらの試験サンプルとHIV-1 O群またはHIV-1 M群抗原との間で反応は認められず、各装置のアッセイ完了帯域において可視的な反応線が認められた。
最後の4個の装置を使用して、HIV-1 M群陽性試験サンプル、HIV-1 O群陽性試験サンプル、HIV-2陽性試験サンプルおよび陰性対照サンプルを試験した。陰性試験血清は、抗原捕捉帯域中のいずれの抗原とも反応しなかった。HIV-1 M群陽性試験サンプルは、HIV-1 M群抗原のみに対して反応性であった。HIV-1 O群陽性試験サンプルは、HIV-1O群抗原のみに対して反応性であった。HIV-2陽性試験サンプルは、HIV-2抗原のみに対して反応性であった。各装置のアッセイ完了帯域中に、可視的な反応線が認められた。
A.pTB319の修飾
プラスミドpTB319(参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,124,255号)は、フレームシフトを引き起こす合成HIV-1 M群gp41遺伝子内の1つの塩基の欠失によるトランケート化gp41組換えタンパク質をコードする。HIV-1 M群およびO群ハイブリッド遺伝子構築物の産生を容易にするために、部位特異的突然変異誘発を用いて、TB319のgp41コード領域内のフレームシフトを排除した。これは、TB319を制限エンドヌクレアーゼRsr IIおよびBst XIで順次消化することにより達成された。合成オリゴヌクレオチドpTB319+A(配列番号98)およびpTB319+T(配列番号99)をアニールさせ、Rsr IIおよびBst XIで消化されたpTB319中に連結した。該連結産物を使用して、スーパーコンピテントXL1-Blue細胞を形質転換し、該細胞を、150μg/mlアンピシリンで補足されたLB寒天プレート上にプレーティングした。プライマーの組合せpTB-S4(配列番号100)/pTB-S7(配列番号101)およびpTB-S4(配列番号100)/63168(配列番号121)を使用するコロニーPCRを用いて、正しく修飾されたクローンを同定した。ミニプレップDNAの調製のために3mMグルコースおよび200μg/mlアンピシリンで補足されたLBブロス中の候補クローンに関して一晩培養を樹立した。オリゴヌクレオチドプライマー43461(配列番号2)、43285(配列番号1)、CKS-1(配列番号30)、CKS-3(配列番号32)、pTB-S1(配列番号102)、pTB-S2(配列番号103)、pTB-S3(配列番号104)、pTB-S4(配列番号100)、pTB-S5(配列番号105)、pTB-S6(配列番号106)、pTB-S7(配列番号101)およびpTB-S8(配列番号28)を使用して、全コード領域を配列決定した。配列決定の結果によれば、クローンpTB319+A-#31(pGMcks-1)は所望のコード領域の配列を有する。ついでこのクローンをpGM-1CKS/XL1(配列番号107は、該コード領域のヌクレオチド配列を示す)と称することにした。図12は、pGM-1CKS組換えタンパク質のアミノ酸配列(配列番号108)を示す。
pGO-12CKS/XL1は、組換えタンパク質pGO-12CKSをコードしており、そのアミノ酸配列(配列番号91)を図13に示す。このタンパク質は、42アミノ酸のenv gp120(HIV-1 M群HXB2R分離株)と融合した250アミノ酸のCKS/ポリリンカー、45アミノ酸のenv gp120(HIV-1 O群, HAM112分離株)および199アミノ酸のenv gp41(HIV-1 O群, HAM112分離株)よりなる。pGO-12CKS/XL1は以下のとおりに構築した。
pGO-13CKSは、組換えタンパク質pGO-13CKSをコードしており、そのアミノ酸配列(配列番号93)を図14に示す。このタンパク質は、42アミノ酸のenv gp120(HIV-1 M群HXB2R分離株)と融合した250アミノ酸のCKS/ポリリンカー、200アミノ酸のenv gp41(HIV-1 M群HXB2R分離株)、45アミノ酸のenv gp120(HIV-1 O群, HAM112分離株)および169アミノ酸のenv gp41(HIV-1 O群, HAM112分離株)よりなる。pGO-13CKS/XL1は以下のとおりに構築した。
pGO-14PL/DH5αは、組換えタンパク質pGO-14PLをコードしており、そのアミノ酸配列(配列番号95)を図15に示す。このタンパク質は、N末端メチオニンおよびそれに続く45アミノ酸のenv gp120(HIV-1 O群, HAM112分離株)、42アミノ酸のenv gp120(HIV-1 M群HXB2R分離株)と融合した200アミノ酸env gp41(HIV-1 O群, HAM112分離株)および200アミノ酸のenv gp41(HIV-1 M群HXB2R分離株)よりなる。pGO-14PL/DH5αは以下のとおりに構築した。
A.pGO-15CKS/XL1の構築
pGO-15CKS/XL1は、組換えタンパク質pGO-15CKSをコードしており、そのアミノ酸配列(配列番号97)を図16に示す。このタンパク質は、45アミノ酸のenv gp120(HIV-1 O群, HAM112分離株)と融合した246アミノ酸のCKS/ポリリンカー、199アミノ酸のenv gp41(HIV-1 O群, HAM112分離株)、およびそれに続く4アミノ酸のリンカー(Gly、Gly、Gly、Ser)およびenv gp41(HIV-1 O群, HAM112分離株)のIDR領域を含む32アミノ酸よりなる。pGO-15CKS/XL1は以下のとおりに構築した。
pGO-15PL/DH5αは、組換えタンパク質pGO-15PLをコードしており、そのアミノ酸配列(配列番号120)を図17に示す。このタンパク質は、N末端メチオニン、およびそれに続く45アミノ酸のenv gp120(HIV-1 O群, HAM112分離株)、199アミノ酸のenv gp41(HIV-1 O群, HAM112分離株)、4アミノ酸のリンカー(Gly、Gly、Gly、Ser)およびenv gp41(HIV-1 O群, HAM112分離株)のIDR領域を含む32アミノ酸よりなる。pGO-15PL/DH5は以下のとおりに構築した。
実施例5に記載のとおりに、それぞれのHIV-1 O群組換えgp41抗原構築物を含有する大腸菌(E. coli)株を増殖させ、誘導することにより、前記抗原を調製した。得られた凍結細胞を、50mM Tris pH8、10mM Na EDTA、150mM NaCl、8% (w/v)ショ糖、5% Triton X-100(登録商標) (v/v)、1mM PMSFおよび1μMペプスタチンAを含む冷溶解バッファー中でホモジナイズすることにより再懸濁させた。リゾチームを、加工細胞1g当たり1.3mgの濃度で該ホモジネートに加え、氷上で30分間のインキュベーションを行なって該細胞を溶解した。封入体を遠心分離により可溶性タンパク質から分離した。これらのペレット化封入体を洗浄し、1)溶解バッファー、2)10mM Na EDTA pH8、30% (w/v)ショ糖、および3)水中で順次ペレット化した。洗浄された封入体を50mM Tris pH8、10mM Na EDTA、150mM NaClおよび3M尿素に再懸濁し、氷上で1時間インキュベートした。ついで該封入体を遠心分離により可溶性タンパク質から分離した。該ペレット化封入体を、7Mグアニジン-HCl、50mM Tris pH8、0.1% (w/v)β-メルカプトエタノール(BME)中で4℃で一晩、完全に可溶化した。該可溶化組換え抗原を遠心分離により清澄化し、0.2μmのフィルターに通過させた。1Mグアニジン-HClの最終濃度まで水で希釈(1:7)することにより、該可溶化gp41抗原を7Mグアニジン-HCl溶液から沈殿させた。4℃で30分間のインキュベーションの後、沈殿したタンパク質を遠心分離し、50mM Tris pH8、9M尿素、0.1% BME(v/v)中、4℃で一晩、再び可溶化した。
A.ビーズのコーティング
組換えHIV-1抗原の反応性を調べるために、精製組換え体を1/4インチポリスチレンビーズ上にコーティングした。これらの抗原コート化ビーズを、HIV-1 M群およびO群サンプルに対する反応性を評価するための一連の捕捉アッセイで使用した。
組換え抗原でコーティングされたビーズを、Abbott Laboratories 3A11キット(第1世代の間接アッセイ様式)を使用して、種々のサンプルに対する反応性に関して試験した。サンプルを希釈し、ポリスチレントレー中のウェルに加えた。ビーズを加え、該トレーを40℃で1時間インキュベートした。該トレーを、Abbott Laboratories QUICKWASH装置中、水で洗浄した。つぎに該キット共役体(抗ヒトIgG-ホースラディッシュペルオキシダーゼ)を加え、該トレーを再び40℃で1時間インキュベートした。該トレーを再び洗浄し、300μlの基質溶液(0.02%過酸化水素を含有するクエン酸-リン酸バッファー中1.28mg/mlのo-フェニレンジアミン・HCl)を室温で30分間、各ウェルに加えた。1mlの1N硫酸を加えて反応を停止し、該トレーをAbbott QUANTUM分光光度計中で読取った。
図18〜23に示す前記試験の結果は、本発明の組換え抗原の使用により得られうる感度および選択性における改善を示している。HIV-1 M群組換え抗原(pTB319)でコーティングされたビーズは、M群血清サンプルを検出したが、1つを除くすべてのO群サンプルを検出しなかった。HIV-1 O群組換え抗原(pGO-9/CKS、pGO-11/PLおよびpGO-15/CKS)のみでコーティングされたビーズは、O群血清サンプルを検出したが、HIV-1 M群サンプルの検出においてはより低い感度を示した。ハイブリッドM群およびO群組換え抗原(pGO-12/CKSおよびpGO-14/PL)でコーティングされたビーズは、HIV-1 M群陽性サンプルおよびHIV-1 O群陽性サンプルの両方を検出する能力を有していた。最後に、pGO-15CKS(これは、該タンパク質のカルボキシ末端に組換え手段により結合したgp41のO群免疫優性領域に相当する追加的な配列を有する)は、低力価O群サンプルに対して、より大きな反応性を示した。
A.アッセイ
本発明の抗原構築物のイムノアッセイにおける性能を評価するために、組換え抗原pGO-9CKSおよびpGO-11CKSを、HIV-1 M群(B亜型)試薬を含有する4つのHIV-1/HIV-2イムノアッセイに組み入れた。1つのビーズアッセイ(アッセイ1)および微粒子に基づく3つの自動化アッセイ(アッセイ2〜4)を用いて、該構築物を試験した。すべての場合に、HIV-1 O群組換え体を組み入れて(フォーマット(Format)2)および組み入れないで(フォーマット1)、HIV-1 O群感染試料の反応性を評価した。該コート化ビーズ/微粒子を、HIV-1 O群陽性ヒト血清ESP1、189404、193Ha、341Ha、2156およびABB 9/96の複数の希釈物と反応させた。
前記試験の結果を以下の表1および2に示す。表中のデータは、シグナル/カットオフ(S/CO)比として示されている。フォーマット1は、本発明の抗原構築物の不存在下での通常のアッセイを意味し、フォーマット2は、該HIV-1 O群構築物で補足されたアッセイを意味する。
Claims (12)
- 少なくとも1つのHIV-1 O群envポリペプチドと少なくとも1つのHIV-1 M群envポリペプチドとの融合体を含んでなる抗原構築物であって、それぞれのポリペプチドが少なくとも5アミノ酸からなるO群又はM群envタンパク質に由来するポリペプチドである抗原構築物。
- (a)第1 HIV-1 O群envポリペプチド、
(b)第2 HIV-1 O群envポリペプチド、
(c)第1 HIV-1 M群envポリペプチド、および
(d)第2 HIV-1 M群envポリペプチド
の融合体を含む、請求項1に記載の抗原構築物。 - 該HIV-1 O群配列の少なくとも1つがHIV-1 O群分離株HAM112に由来する、請求項2に記載の抗原構築物。
- 該第1 O群envポリペプチドおよび該第1 M群envポリペプチドが共にgp120ポリペプチドであり、該第2 O群envポリペプチドおよび該第2 M群envポリペプチドが共にgp41ポリペプチドである、請求項2に記載の抗原構築物。
- (a)該第1 HIV-1 O群envポリペプチドが、HIV-1 O群分離株HAM112のgp120タンパク質の免疫反応性部分を含み、
(b)該第2 HIV-1 O群envポリペプチドが、HIV-1 O群分離株HAM112のgp41タンパク質の免疫反応性部分を含み、
(c)該第1 HIV-1 M群envポリペプチドが、B亜型の第1 HIV-1 M群分離株のgp120タンパク質の免疫反応性部分を含み、かつ
(d)該第2 HIV-1 M群envポリペプチドが、B亜型の第2 HIV-1 M群分離株のgp41タンパク質の免疫反応性部分を含む、請求項2に記載の抗原構築物。 - (a)該第1 HIV-1 M群envポリペプチドが、図12の配列(配列番号108)の残基251〜292より実質的になるアミノ酸配列からなり、かつ
(b)該第2 HIV-1 M群envポリペプチドが、図12の配列(配列番号108)の残基293〜599またはその一部より実質的になるアミノ酸配列からなる、請求項5に記載の抗原構築物。 - 該第2 HIV-1 M群envポリペプチドが、図12の配列(配列番号108)の残基293〜492より実質的になるアミノ酸配列からなる、請求項6に記載の抗原構築物。
- 該第1 HIV-1 O群envポリペプチドが、図1の配列(配列番号61)の残基1〜520またはその一部より実質的になるアミノ酸配列からなる、請求項2、4、5、6および7のいずれか1項に記載の抗原構築物。
- 配列番号91、配列番号93及び配列番号95よりなる群から選ばれるアミノ酸からなる請求項1に記載の抗原構築物。
- 請求項1又は9に記載の抗原構築物をコードするポリヌクレオチド。
- 試験サンプル中のHIV-1に対する抗体を検出する方法であって、以下の工程を含む方法、
a)請求項1又は9に記載の少なくとも一つの抗原構築物を試験サンプルと組み合わせ、混合物を形成する工程、
b)サンプル中に抗体が存在し、免疫学的に抗原と反応性であれば抗原と抗体が複合体を形成するのに適した条件下で、混合物をインキュベートする工程、及び
c)形成された複合体の存在を検出する工程。 - 請求項1又は9に記載の抗原構築物を含むHIV-1に対する抗体を検出するためのイムノアッセイキット。
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