ES2320053T3 - Construcciones de antigenos utiles en la deteccion y diferenciacion de anticuerpos contra vih. - Google Patents

Abstract

Una construcción de antígeno que comprende una fusión de al menos un polipéptido env de VIH-1 Grupo O con al menos un polipéptido env de VIH-1 Grupo M, en el que cada polipéptido derivado de la proteína env del Grupo O o M contiene al menos 5 aminoácidos.

Description

Construcciones de antígenos útiles en la detección y diferenciación de anticuerpos contra VIH.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere generalmente a inmunoensayos para la detección y diferenciación de anticuerpos contra el virus de la inmunodeficiencia humana de Tipo 1 (VIH-1) Grupo M, VIH-1 Grupo O y el virus de inmunodeficiencia humana de Tipo 2 (VIH-2). Más particularmente, la invención se refiere a nuevas construcciones de antígenos útiles como reactivos en dichos ensayos, así como a polinucleótidos, clones de ADN, vectores de expresión, células hospedadoras transformadas y similares que son útiles en la preparación de dichos antígenos.

La detección de la infección por VIH en un paciente y la caracterización del tipo viral se llevan a cabo típicamente usando inmunoensayos que dependen de una interacción altamente específica entre antígenos usados como reactivos en el ensayo y anticuerpos circulantes en el suero del paciente. La inmunorreactividad de anticuerpos del paciente con algunos antígenos y en un menor grado, o nada en absoluto, con otros permite la identificación del tipo y subtipo del VIH que está presente.

Actualmente, existen dos grupos filogenéticos principales del VIH-1 denominados grupos "M" y "O". G. Meyers et al. Human Retroviruses and AIDS 1995, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM (1995). Los aislados del VIH Grupo M se han dividido adicionalmente en subgrupos (A a J) que son filogenéticamente aproximadamente equidistantes entre sí. Los aislados del Grupo M son los predominantes en todo el mundo. Los primeros informes acerca de la secuencia del VIH Grupo O indicaban que estos virus estaban tan estrechamente relacionados con un virus de chimpancé como otros subgrupos del VIH-1. Véase, por ejemplo, L. G. Gürtler et al. J. Virology 68: 1581-1585 (1994); M. Vanden Haesevelde et al. J. Virology 68: 1586-1596 (1994); De Leys et al., J. Virology 64: 1207-1216 (1990); DeLeys et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.304.466; L. G. Gürtler et al. Publicación de Patente Europea Nº 591.914 A2. Las secuencias del Grupo O son las más divergentes de las secuencias del VIH descritas hasta la fecha. Aunque las cepas del VIH Grupo O son endémicas en África Occidental y Central (Camerún, Guinea Ecuatorial, Nigeria y Gabón), se han identificado ahora pacientes infectados con aislados del Grupo O en Bélgica, Francia, Alemania, España y los Estados Unidos. Véase, por ejemplo, R. DeLeys et al., anteriormente; P. Charneau et al. Virology 205: 247-253 (1994); I. Loussert-Ajaka et al. J. Virology 69: 5640-5649 (1995); H. Hampl et al. Infection 23: 369-370 (1995); A. Mas et al. AIDS Res. Hum. Retroviruses 12: 1647-1649 (1996), M. Peters, et al., AIDS, 11: 493-498 (1997), y M. A. Rayfield et al., Emerging Infectious Diseases 2: 209-212 (1996).

La serología del VIH Grupo M se caracteriza en gran parte por las secuencias de aminoácidos de las proteínas virales expresadas (antígenos), particularmente las que comprenden las regiones del núcleo y la envoltura (env). Como entre diversas cepas de este virus que muta rápidamente, estos antígenos son estructuralmente y funcionalmente similares pero tienen secuencias de aminoácidos divergentes que provocan anticuerpos que son similares pero no idénticos en su especificidad por un antígeno particular.

Una de las dianas serológicas clave para la detección de una infección por VIH es la proteína transmembrana (TMP) de 41.000 PM, la glicoproteína 41 (gp41). gp41 es una proteína altamente inmunogénica que provoca una respuesta de anticuerpos fuerte y sostenida en individuos considerados seropositivos para el VIH. Los anticuerpos contra esta proteína están entre los primeros que aparecen en la seroconversión. La respuesta inmune contra gp41 aparentemente permanece relativamente fuerte durante todo el curso de la enfermedad, como demuestra la presencia casi universal de anticuerpos anti-gp41 en pacientes asintomáticos así como los que presentan fases clínicas del SIDA. Una proporción significativa de la respuesta de anticuerpos contra gp41 se dirige hacia una región inmunodominante bien caracterizada (IDR) dentro de la gp41.

Actualmente se han identificado infecciones con el VIH de Tipo 2 (VIH-2), un virus que se encontraba inicialmente en individuos de África, en seres humanos fuera del área endémica inicial del África Occidental y se han descrito en europeos que han vivido en el África Occidental o los que han tenido relaciones sexuales con individuos de esta región. Véase, por ejemplo, A. G. Saimot et al. Lancet i: 688 (1987); M. A. Rey et al. Lancet i: 388-389 (1987); A. Werner et al. Lancet i: 868-869 (1987 ); G. Brucker et al. Lancet i: 223 (1987); K. Marquart et al., AIDS 2: 141 (1988), CDC, MMWR 37: 33-35 (1987), Anónimo, Nature 332: 295 (1988). Los casos de SIDA debidos a VIH-2 se han documentado por todo el mundo. Los estudios serológicos indican que mientras que el VIH-1 y el VIH-2 comparten múltiples epítopos comunes en sus antígenos del núcleo, las glicoproteínas de la envoltura de estos dos virus presentan mucha menos reactividad cruzada. F. Clavel, AIDS 1: 135-140 (1987). Se piensa que esta reactividad cruzada limitada de los antígenos de la envoltura explica por qué los ensayos serológicos actualmente disponibles para el VIH-1 no reaccionan con ciertos sueros de individuos con anticuerpos contra el VIH-2. F. Denis et al., J. Clin. Micro. 26: 1000-1004 (1988). La Patente de Estados Unidos recientemente expedida Nº 5.055.391 mapea el genoma del VIH-2 y proporciona ensayos para detectar el virus.

Estas cepas virales son, en su mayoría, fáciles de identificar y caracterizar usando ensayos de diagnóstico disponibles en el mercado. Sin embargo, han surgido problemas con respecto a la capacidad de los inmunoensayos actualmente disponibles diseñados para la detección de anticuerpos contra VIH-1 (Grupo M) y/o VIH-2, para detectar la presencia de anticuerpos contra VIH-1 Grupo O. I. Loussert-Ajaka et al. Lancet 343: 1393-1394 (1994), C. A. Schable et al. Lancet 344: 1333 - 1334 (1994); L. Gürtler et al., J. Virol. Methods 51: 177-184 (1995). Aunque hasta la fecha se ha descubierto que pocos pacientes fuera del África Central Occidental están infectados con aislados de VIH-1 Grupo O, los funcionarios de la salud temen la emergencia de este subtipo en otras áreas geográficas también.

Por consiguiente, existe una necesidad continuada de nuevos antígenos adecuados para el uso en inmunoensayos que, en solitario o junto con otros antígenos, permitan el reconocimiento de todos los aislados y/o infecciones de VIH-1 (Grupo M y Grupo O) y VIH-2.

Sumario de la invención

Actualmente se ha descubierto que ciertos polipéptidos o combinaciones son particularmente útiles en la detección de infecciones por VIH-1 Grupo O y otros VIH.

En un primer aspecto de la presente invención, se describe una construcción de antígenos que comprende una fusión de al menos un polipéptido env de VIH-1 Grupo O con al menos un polipéptido env de VIH-1 Grupo M en el que cada polipéptido procedente de la proteína env del Grupo O o M contiene al menos 5 aminoácidos y, más preferiblemente, una construcción de antígeno que comprende una fusión de:

(a) un primer polipéptido env de VIH-1 Grupo O;

(b) un segundo polipéptido env de VIH-1 Grupo O;

(c) un primer polipéptido env de VIH-1 Grupo M; y

(d) un segundo polipéptido env de VIH-1 Grupo M

Los polipéptidos de VIH-1 Grupo M en las construcciones anteriores pueden proceder de un aislado del VIH de subtipo B y, preferiblemente, al menos uno proceden del aislado de VIH-1 Grupo M HXB2R. En cualquiera de estas construcciones de env de Grupo O/Grupo M, al menos una de las secuencias del VIH-1 Grupo O puede proceder del aislado del VIH-1 Grupo O HAM112.

Más particularmente, el primer polipéptido env del Grupo O y el primer polipéptido env del Grupo M pueden ser ambos polipéptidos gp120, mientras que el segundo polipéptido env del Grupo O y el segundo polipéptido env del Grupo M pueden ser ambos polipéptidos gp41. Para mejorar la expresión, puede delecionarse una porción de la región hidrófoba de al menos uno de los polipéptidos gp41. Las construcciones de antígenos incluidas entre las anteriores son aquellas en las que:

(a)

el primer polipéptido env del VIH-1 Grupo O comprende una porción inmunorreactiva de la proteína gp120 del aislado del VIH-1 Grupo O HAM112;

(b)

el segundo polipéptido env del VIH-1 Grupo O comprende una porción inmunorreactiva de la proteína gp41 del aislado de VIH-1 Grupo O HAM112;

(c)

el primer polipéptido env del VIH-1 Grupo M comprende una porción inmunorreactiva de la proteína gp120 de un primer aislado de VIH-1 Grupo M del subtipo B; y

(d)

el segundo polipéptido env del VIH-1 Grupo M comprende una porción inmunorreactiva de la proteína gp41 de un segundo aislado de VIH-1 Grupo M de subtipo B. Entre estas construcciones se prefieren en las que el primer y segundo aislado de VIH-1 Grupo M de subtipo B son iguales y son el aislado del VIH-1 Grupo M HXB2R, así como aquellas en los que está ausente una porción de la región hidrófoba de la proteína gp41 del aislado del VIH-1 Grupo M HXB2R del segundo polipéptido env del VIH-1 Grupo M.

Las construcciones de env Grupo O/Grupo M preferidas incluyen aquellas en las que (a) el primer polipéptido env de VIH-1 Grupo M tiene una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en los restos 251 a 292 de la secuencia de la Figura 12 (SEC ID Nº: 108) y (b) el segundo polipéptido env del VIH-1 Grupo M tiene una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en los restos 293 a 599 de la secuencia de la Figura 12 (SEC ID Nº: 108) o una porción de la misma. Se prefieren especialmente aquellas en los que el segundo polipéptido env del VIH-1 Grupo M tiene una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en los restos 293 a 492 de la secuencia de la Figura 12 (SEC ID Nº: 108).

También se prefieren las construcciones env de Grupo O/Grupo M anteriores en las que el primer polipéptido env del VIH-1 Grupo O tiene una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en los restos 1 a 520 de la secuencia de la Figura 1 (SEC ID Nº: 61) o una porción de la misma y, especialmente los que comprenden un primer polipéptido env del VIH-1 Grupo O que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en los restos 476 a 520 de la secuencia de la Figura 1 (SEC ID Nº: 61). El segundo polipéptido env del VIH-1 Grupo O puede ser uno que tenga una secuencia de aminoácidos que consista esencialmente en los restos 521 a 873 de la secuencia de la Figura 1 (SEC ID Nº: 61) o una porción de la misma, de la que opcionalmente puede estar ausente una porción de la región hidrófoba de la proteína gp41 del aislado del VIH-1 Grupo O HAM112. Son construcciones preferidas aquellas en las que dichos segundos polipéptidos env del VIH-1 Grupo O tienen una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en los restos 47 a 373 de la Figura 9 (SEC ID Nº: 52); son más preferidos aquellos en los que el segundo polipéptido env del VIH-1 Grupo O tiene una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en los restos 47 a 245 de la Figura 7 (SEC ID Nº: 48); y son incluso más preferidos aquellos en los que el segundo polipéptido env del VIH-1 Grupo O tiene una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en los restos 47 a 215 de la Figura 5 (SEC ID Nº: 58). Son representativas de las construcciones de env Grupo O/Grupo M de la invención las construcciones pGO-12CKS, pGO-13CKS y pGO-14PL, y derivados, variantes y análogos de las mismas.

Un aspecto adicional de la presente invención, se describe un método para detectar anticuerpos contra VIH-1 en una muestra de ensayo que comprende las etapas de:

(a)

combinar al menos una construcción de antígeno de acuerdo con la invención con la muestra de ensayo para formar un mezcla;

(b)

incubar la mezcla en condiciones adecuadas para la formación de complejos entre el antígeno y los anticuerpos, si existen, que estén presentes en la muestra y sean inmunológicamente reactivos con el antígeno; y

(c)

detectar la presencia de cualquier complejo formado. En una realización del método, la detección de la presencia de complejos en la etapa (c) se lleva a cabo usando una construcción de antígeno adicional de la invención a la que se ha unido un compuesto generador de señal. En otra realización, la detección se lleva a cabo usando una construcción de antígeno adicional de la invención a la que se une un primer miembro de una pareja de unión específica y usando adicionalmente un reactivo indicador que comprende un segundo miembro de la pareja de unión específica al que se une un compuesto generador de señal. Una realización adicional proporciona que la detección de la presencia de complejos en la etapa (c) se lleve a cabo usando un anticuerpo dirigido contra los complejos formados en la etapa (b), estando unido a dicho anticuerpo un compuesto generador de señal. Otra realización más proporciona que la detección de la presencia de complejos en la etapa (c) se lleve a cabo usando un anticuerpo dirigido contra los complejos formados en la etapa (b) y unidos en la misma a un primer miembro de una pareja de unión específica; requiriendo dicha detección adicionalmente el uso de un reactivo indicador que comprende un segundo miembro de la pareja de unión específica al que se une un compuesto generador de señal.

En un aspecto final de la presente invención se describen kits de inmunoensayo para la detección de anticuerpos contra el VIH-1, comprendiendo dichos kits una construcción de antígeno de la invención. Dicha construcción puede usarse como un reactivo de captura o un reactivo indicador. Como alternativa, la construcción de antígeno puede unirse a un primer miembro de una pareja de unión específica, comprendiendo el kit adicionalmente un reactivo indicador que comprende un segundo miembro de la pareja de unión específica unido a un compuesto generador de señal.

Breve descripción de los dibujos

En la descripción detallada de la presente invención que sigue, se hace referencia a los dibujos adjuntos en los que:

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína env del aislado del VIH-1 Grupo O HAM112 (SEC ID Nº: 61).

La Figura 2 representa la estrategia usada para generar construcciones génicas de env gp120/gp41 del VIH-1 Grupo O sintéticas, en las que el inserto pGO-8 = Osyn-5' a Osyn-P3'; inserto pGO-9 = Osyn-5' a Osyn-03'; inserto pGO-11 = Osyn-5' a Osyn-M; y en el que H = la región hidrófoba del VIH-1 Grupo O delecionada como se muestra.

Las Figuras 3A a 3D muestran una representación esquemática de las etapas implicadas en la construcción de pGO-9PL/DH5\alpha y pGO-9CKS/XL1.

Las Figuras 4A a 4G muestran una representación esquemática de las etapas implicadas en la construcción de pGO-11PL/DH5\alpha y pGO-11CKS/XL1.

La Figura 5 ilustra la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGO-8PL (SEC ID Nº: 58).

La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGO-8CKS (SEC ID Nº: 60).

La Figura 7 ilustra la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGO-9PL (SEC ID Nº: 48).

La Figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGO-9CKS (SEC ID Nº: 50).

La Figura 9 ilustra la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGO-11PL (SEC ID Nº: 52).

La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGO-11CKS (SEC ID Nº: 54).

La Figura 11 ilustra la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pHIV-210 (SEC ID Nº: 55).

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La Figura 12 ilustra la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGM-1CKS (SEC ID Nº: 108).

La Figura 13 ilustra la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGO-12CKS (SEC ID Nº: 91), incluyendo una indicación de los restos correspondientes al CKS/polienlazador, env gp120/gp41 del aislado del VIH-1 Grupo M HXB2R y env gp120/gp41 del aislado del VIH-1 Grupo O HAM112.

La Figura 14 ilustra la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGO-13CKS (SEC ID Nº: 93), incluyendo una indicación de los restos correspondientes al CKS/polienlazador, env gp120/gp41 del aislado del VIH-1 Grupo M HXB2R y env gp120/gp41 del aislado del VIH-1 Grupo O HAM112.

La Figura 15 ilustra la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGO-14PL (SEC ID Nº: 95), incluyendo una indicación de los restos correspondientes a env gp120/gp41 del aislado del VIH-1 grupo M HXB2R y env gp120/gp41 del aislado del VIH-1 Grupo O HAM112.

La Figura 16 ilustra la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGO-15CKS (SEC ID Nº: 97), incluyendo una indicación de los restos correspondientes al CKS/polienlazador, env gp120/gp41 del aislado del VIH-1 Grupo O HAM112, un enlazador de cuatro aminoácidos y la segunda copia de la IDR de gp41 del aislado HAM112.

La Figura 17 ilustra la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGO-15PL (SEC ID Nº: 120), incluyendo una indicación de los restos correspondientes a env gp120/gp41 del aislado del VIH-1 Grupo O HAM112, un enlazador de cuatro aminoácidos y la segunda copia de la IDR de gp41 del aislado HAM112.

Las Figuras 18-23 muestran los resultados obtenidos en inmunoensayos de perlas recubiertas (descritos en el Ejemplo 14 a continuación) que ensayan la reactividad del antígeno del Grupo M pTB319 y de los antígenos recombinantes del Grupo O pGO-9CKS, pGO-11PL, pGO-12CKS, pGO-14PL y pGO-15CKS, respectivamente, con un panel de sueros que comprenden HIVPL-31 (Grupo M-positivo) y los números de suero 14283, 189404, 193Ha, 14791, 267Ha y ESP-1 (todos Grupo O-positivo).

Descripción detallada de la invención

En una realización de la presente invención, la secuencia de aminoácidos de la proteína env del aislado del VIH-1 Grupo O HAM112 a la que se hace referencia en la presente invención se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº: 61). En el presente contexto, "aislado" pretende significar que dichos polipéptidos están relativamente purificados con respecto a otros componentes virales o celulares que normalmente estarían presentes in situ hasta e incluyendo una preparación sustancialmente pura de la proteína. Dichos polipéptidos pueden utilizarse como reactivos de ensayo para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales en la fabricación de vacunas o de otro modo.

Las porciones inmunorreactivas o fragmentos de los polipéptidos anteriores también se espera que sean útiles. Por "inmunorreactivo" se entienden porciones de una longitud tal que son capaces de provocar una respuesta inmune en un hospedador y/o de reaccionar con anticuerpos dirigidos específicamente contra las mismas; preferiblemente, dichos polipéptidos parciales tendrán cinco o más aminoácidos de longitud. También debe señalarse que el término "porción", como se usa en este documento, se dirige tanto a secuencias truncadas terminalmente como a las que se acortan por eliminación de una secuencia intermedia.

Los polipéptidos y porciones anteriores se producirán mejor por expresión de polinucleótidos que los codifiquen. Esto además permite un grado de variabilidad en su secuencia, como por ejemplo debido a la degeneración del código genético, predisposición de codones en favor de la célula hospedadora que expresa el polipéptido y sustituciones de aminoácidos conservativas en la proteína resultante. Además, se prevé que aparecerá cierta variación de secuencias entre -y posiblemente incluso dentro de- un aislado dado del VIH-1 u otra unidad filogenética. Por consiguiente, los polipéptidos y construcciones de la invención incluyen no solamente los que son idénticos en secuencia a las secuencias anteriores sino también los que tienen una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en esa secuencia de referencia, donde la expresión "que consiste esencialmente" se entiende que incluye polipéptidos variantes cuyas características estructurales y funcionales permanecen sustancialmente iguales. Preferiblemente, dichos variantes (o "análogos") tendrá una homología de secuencia ("identidad") del 80% o más con respecto a la secuencia de la Figura 1. En este sentido, se conocen bien en la técnica procedimientos para determinar la "similitud" de secuencias de aminoácidos. En general, "similitud" significa la comparación exacta aminoácido a aminoácido de dos o más polipéptidos en el lugar apropiado, donde los aminoácidos son idénticos o poseen unas propiedades químicas y/o físicas similares tales como carga o hidrofobicidad. Después, puede determinarse un denominado "porcentaje de similitud" entre las secuencias polipeptídicas comparadas. También se conocen bien en la técnica procedimientos para determinar la identidad de secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos e incluyen determinar la secuencia de nucleótidos del ARNm para ese gen (habitualmente a través de un intermedio de ADNc) y determinar la secuencia de aminoácidos codificada por la misma y comparar ésta con una segunda secuencia de aminoácidos. En general, la "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido con nucleótido o aminoácido con aminoácido de dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas, respectivamente. Pueden compararse dos o más secuencias polinucleotídicas por determinación de su "porcentaje de identidad" al igual que pueden compararse dos o más secuencias de aminoácidos. Los programas disponibles en el Paquete de Análisis de Secuencia Wisconsin, Versión 8 (disponible en Genetics Computer Group, Madison, WI), por ejemplo, el programa GAP, son capaces de calcular tanto la identidad entre dos polinucleótidos como la identidad y similitud entre dos secuencias polipeptídicas, respectivamente. Se conocen en la técnica otros programas para calcular la identidad o similitud entre secuencias.

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De acuerdo con una realización de la invención, se proporcionan construcciones de antígenos que son adecuadas para el uso en la detección de anticuerpos anti-VIH-1. Como se describe en más detalle a continuación, dichas construcciones pueden prepararse por medios recombinantes, como péptidos sintéticos o de otro modo; además, pueden glicosilarse o no glicosilarse dependiendo de la forma y/o de la célula hospedadora por la que se generen. Por consiguiente, aunque se hace referencia a ellos como si comprendieran glicoproteínas (por ejemplo, "un polipéptido gp 120"), las construcciones de antígenos de la invención pretenden incluir las que se expresan en hospedadores bacterianos tales como E. coli y, por lo tanto, no están glicosiladas.

Debe señalarse que las construcciones anteriores son fusiones de diversas secuencias, es decir, las construcciones se forman por unión de diversas secuencias que contienen epítopos, como por ejemplo por co-expresión, ligación o síntesis secuencial. También unidas a las mismas y, opcionalmente incluidas en las construcciones de la invención, están otras secuencias polipeptídicas tales como polienlazadores de expresión (CKS) y otras secuencias enlazadoras. El orden de las diversas secuencias polipeptídicas no es crítico; por consiguiente, los polipéptidos y sus epítopos pueden reorganizarse como una cuestión práctica. También son posibles modificaciones adicionales como por ejemplo por mutación aleatoria o mutagénesis dirigida o incluso la deleción (eliminación u omisión) de ciertas regiones tales como la región hidrófoba de gp41, cuya ausencia se ha descubierto que aumenta la expresión del polipéptido restante. En cualquier caso, ya sean casi iguales o sustancialmente modificados, los polipéptidos que experimentan estas modificaciones puede decirse que están "derivados" de sus fuentes respectivas y los polipéptidos resultantes pueden denominarse "derivados".

En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos de ensayo que utilizan las construcciones de la invención en la detección de anticuerpos anti-VIH-1 en muestras de ensayo. Dichos métodos permiten el ensayo directo de muestras biológicas; sin embargo, los métodos de ensayo también pueden modificarse para permitir el ensayo de muestras previamente procesadas tales como sueros, células lisadas y extractos o preparaciones hechas a partir de las mismas (como por concentración, dilución, separación, fijación y/o inmovilización). Dependiendo del formato de ensayo deseado, las construcciones de antígenos también pueden modificarse para el uso en dichos ensayos, como por ejemplo por marcaje, inmovilización en una fase sólida o de otro modo, o conjugación con otros reactivos de
ensayo.

Ciertos términos usados en este documento pretenden tener significados especializados. A menos que se indique otra cosa, los términos a continuación tendrán los siguientes significados:

El término "cebador" denota una secuencia oligonucleotídica específica complementaria a una secuencia de nucleótidos diana y usada para hibridar con la secuencia de nucleótidos diana. Sirve como punto de inicio para la polimerización de nucleótidos catalizada por una ADN polimerasa, ARN polimerasa o transcriptasa inversa.

El término "polinucleótido", como se usa e este documento significa una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término se refiere solamente a la estructura primaria de la molécula. Por lo tanto, el término incluye ADN bicatenario y monocatenario, así como ARN bicatenario y monocatenario. También incluye modificaciones, tales como metilación o terminación y formas no modificadas del polinucleótido.

"Codificado por" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia polipeptídica. También se incluyen secuencias polipeptídicas que sean inmunológicamente identificables con un polipéptido codificado por la secuencia. Por lo tanto, una secuencia "polipeptídica", "proteica" o "de aminoácidos", como se reivindica en este documento, tendrá al menos una similitud del 60%, más preferiblemente una similitud de al menos aproximadamente el 70% y, más preferiblemente, una similitud de aproximadamente el 80% con una secuencia polipeptídica o de aminoácidos particular especificada a continuación.

Las expresiones "polipéptido recombinante" o "proteína recombinante", usadas de forma intercambiable en este documento, describen un polipéptido que en virtud de su origen o manipulación no está asociado con todo o una porción del polipéptido con el que se asocia en la naturaleza y/o está unido a un polipéptido distinto de aquel con el que está unido en la naturaleza. Un polipéptido o proteína recombinante o codificado no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. También puede generarse de cualquier forma, incluyendo síntesis química o expresión de un sistema de expresión recombinante.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan de forma intercambiable en este documento e indican una cadena molecular de aminoácidos unidos a través de enlaces covalentes y/o no covalentes. Los términos no se refieren a una longitud del producto específica. Por lo tanto, se incluyen péptidos, oligopéptidos y proteínas dentro de la definición de polipéptido. Los términos incluyen modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Además, se incluyen fragmentos proteicos, análogos, proteínas mutadas o variantes, proteínas de fusión y similares dentro del significado de polipéptido.

Un "fragmento" de un polipéptido especificado se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende al menos aproximadamente 3-5 aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 8-10 aminoácidos y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 15-20 aminoácidos, derivados del polipéptido especificado.

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La expresión "péptido sintético", como se usa en este documento significa una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede sintetizarse químicamente por métodos bien conocidos para los especialistas en la técnica. Estos péptidos sintéticos son útiles en diversas aplicaciones.

La expresión "polipéptido purificado" se refiere a un polipéptido de interés o fragmento del mismo que esencialmente está libre, es decir, contiene menos de aproximadamente el 50%, preferiblemente menos de aproximadamente el 70% y, más preferiblemente, menos de aproximadamente el 90% de componentes celulares con los que el polipéptido de interés se asocia de forma natural. Se conocen en la técnica métodos para purificar.

El término "aislado" se refiere a que el material se retira de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o ADN o polipéptido que está separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dicho polinucleótido podría ser parte de un vector y/o dicho polinucleótido o polipéptido podría ser parte de una composición y aun así estar aislado por el hecho de que el vector o composición no son parte de su entorno natural.

Las expresiones "células hospedadoras recombinantes", "células hospedadoras", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares" y otras expresiones similares que denotan microorganismos o líneas celulares eucariotas superiores cultivadas como entidades unicelulares se refieren a células que pueden ser o que han sido usadas como destinatarias para un vector recombinante u otro ADN transferido, e incluyen la progenie original de la célula original que se ha transfectado.

Como se usa en este documento el término "replicón" se refiere a cualquier elemento genético, tal como un plásmido, un cromosoma o un virus que se comporta como una unidad autónoma de replicación polinucleotídica dentro de una célula.

Un "vector" es un replicón al que se une otro segmento polinucleotídico, tal como para provocar la replicación y/o expresión del segmento unido.

La expresión "secuencia de control" se refiere a las secuencias polinucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión de secuencias codificantes con las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador. En procariotas, dichas secuencias de control incluyen generalmente un promotor, sitio de unión al ribosoma y terminadores; en eucariotas, dichas secuencias de control incluyen generalmente promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores. La expresión "secuencia de control" pretende incluir por lo tanto como mínimo todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, secuencias líder.

La expresión "unido operativamente" se refiere a una situación en la que los componentes descritos están en una relación que los permite funcionar de la forma deseada. Por lo tanto, por ejemplo, una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante está ligada de tal forma que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.

Una "secuencia codificante" es una secuencia polinucleotídica que se transcribe en ARNm y se traduce en un polipéptido cuando se coloca bajo el control de secuencia reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por e incluyen un codón de inicio de la traducción en el extremo terminal 5' y uno o más codones de terminación de la traducción en el extremo terminal 3'. Una secuencia codificante puede incluir, pero sin limitación, ARNm, ADNc y secuencias polinucleotídicas recombinantes.

La expresión "identificable inmunológicamente con/como" se refiere a la presencia de un epítopo o epítopos y polipéptido o polipéptidos que también estén presentes en y sean únicos para el polipéptido o polipéptidos designados. La entidad inmunológica puede determinarse por unión a anticuerpo y/o competición en la unión. Estas técnicas se conocen por los especialistas y también se describen en este documento. La exclusividad de un epítopo también puede determinarse por búsquedas informáticas de bancos de datos conocidos, tales como GenBank, para las secuencias polinucleotídicas que codifican el epítopo y por comparaciones de secuencia de aminoácidos con otras proteínas conocidas.

Como se usa en este documento, "epítopo" se refiere a un determinante antigénico de un polipéptido. Es posible imaginar que un epítopo puede comprender tres aminoácidos en una conformación espacial que sea única para el epítopo. En general, un epítopo consiste en al menos cinco de dichos aminoácidos y, más habitualmente, consiste en al menos ocho a diez aminoácidos. Se conocen en la técnica métodos de examen de la conformación espacial e incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional.

Un "epítopo conformacional" es un epítopo que está compuesto por una yuxtaposición específica de aminoácidos en una estructura inmunológicamente reconocible, estando dichos aminoácidos presentes en el mismo polipéptido en un orden contiguo o no contiguo o presentes en diferentes polipéptidos.

Un polipéptido es "inmunológicamente reactivo" con un anticuerpo cuando se une a un anticuerpo debido al reconocimiento de anticuerpo de un epítopo específico contenido dentro del polipéptido. La reactividad inmunológica puede determinarse por unión a anticuerpo, más particularmente, por la cinética de unión a anticuerpo y/o por la competición en la unión usando como competidor o competidores un polipéptido o polipéptidos conocidos que contengan un epítopo contra el que se dirige el anticuerpo. Los métodos para determinar si un polipéptido es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo se conocen en la técnica.

El término "transformación" se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula hospedadora independientemente del método usado para la inserción. Por ejemplo, se incluyen la captación directa, transducción o apareamiento f. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido o, como alternativa, puede integrarse en el genoma hospedador.

La expresión "muestra ensayo" se refiere a un componente de un cuerpo individual que es la fuente del analito (tal como anticuerpos de interés o antígenos de interés). Estos componentes son bien conocidos en la técnica. Estas muestras de ensayo incluyen muestras biológicas que se han ensayado por los métodos de la presente invención que se describen en este documento e incluyen fluidos corporales humanos y animales tales como sangre completa, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, orina, líquidos linfáticos y diversas secreciones externas de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, leucocitos, mielomas y similares; fluidos biológicos tales como sobrenadantes de cultivo celular; muestras de tejidos fijados; y muestras de células fijadas.

La expresión "producto purificado" se refiere a una preparación del producto que se ha aislado a partir de los constituyentes celulares con los que se asocia normalmente el producto y de otros tipos de células que puedan estar presentes en la muestra de interés.

La presente invención proporciona ensayos que utilizan miembros de unión específicos. Un "miembro de unión específico", como se usa en este documento, es un miembro de una pareja de unión específica. Es decir, dos moléculas diferentes dónde una de las moléculas se une específicamente a la segunda molécula por medios químicos o físicos. Por lo tanto, además de las parejas de unión específicas de antígeno y anticuerpo de inmunoensayos comunes, otras parejas de unión específicas pueden incluir biotina y avidina, carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleótidos complementarias, moléculas efectoras y receptoras, cofactores y enzimas, inhibidores enzimáticos y enzimas y similares. Además, las parejas de unión específicas pueden incluir miembros que sean análogos de los miembros de unión específicos originales, por ejemplo, un analito-análogo. Los miembros de unión específica inmunorreactivos incluyen antígenos, fragmentos de antígenos, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, tanto monoclonales como policlonales y complejos de los mismos, incluyendo los formados por moléculas de ADN recombinantes.

Un "reactivo de captura", como se usa en este documento, se refiere a un miembro de unión específica sin marcar que es específico para el analito como en un ensayo de tipo sándwich, para el reactivo indicador o analito como en un ensayo competitivo o para un miembro de unión específica auxiliar que por sí mismo es específico para el analito, como en un ensayo indirecto. El reactivo de captura puede unirse directa o indirectamente a un material en fase sólida antes de la realización del ensayo durante la realización del ensayo, permitiendo de este modo la separación de complejos inmovilizados de la muestra de ensayo.

El "reactivo indicador" comprende un "compuesto generador de señal" ("marcador") que es capaz de generar y genera una señal medible detectable por medios externos, conjugado ("unido") a un miembro de unión específico. La expresión "miembro de unión específico" como se usa en este documento significa un miembro de una pareja de unión específica. Es decir, dos moléculas diferentes en las que una de las moléculas se une específicamente a la segunda molécula por medios químicos o físicos. Además de ser un miembro de anticuerpo de una pareja de unión específica, el reactivo indicador también puede ser un miembro de cualquier pareja de unión específica, incluyendo sistemas hapteno-antihapteno tales como biotina o anti-biotina, avidina o biotina, un carbohidrato o una lectina, una secuencia de nucleótidos complementaria, un efector o una molécula receptora, un cofactor enzimático y una enzima, un inhibidor enzimático o una enzima y similares. Un miembro de unión específica inmunorreactivo puede ser un anticuerpo, un antígeno, o un complejo de anticuerpo/antígeno que sea capaz de unirse al polipéptido de interés como en un ensayo de tipo sándwich, al reactivo de captura como en un ensayo competitivo o al miembro de unión específica auxiliar como en un ensayo indirecto.

Los diversos "compuestos generadores de señal" (marcadores) contemplados incluyen cromógenos, catalizadores tales como enzimas, compuestos luminiscentes tales como fluoresceína y rodamina, compuestos quimioluminiscentes como dioxetanos, acridinios, fenantridinios y luminol, elementos radiactivos y marcadores visuales directos. Los ejemplos de enzimas incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano rusticano, beta-galactosidasa y similares. La selección de un marcador particular no es crítica pero será capaz de producir una señal por sí mismo o junto con una o más sustancias adicionales.

Las "fases sólidas" ("soportes sólidos") son conocidos para los especialistas en la técnica e incluyen las paredes de pocillos de una bandeja de reacción, tubos de ensayo, perlas de poliestireno, perlas magnéticas, tiras de nitrocelulosa, membranas, micropartículas tales como partículas de látex, eritrocitos de oveja (u otro animal) y Duracytes® (eritrocitos "fijados" por aldehído pirúvico y formaldehído disponibles en Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) y otros. La "fase sólida" no es crítica y puede seleccionarse por un especialista en la técnica. Por lo tanto, las partículas de látex, micropartículas, perlas magnéticas o no magnéticas, membranas, tubos de plástico, paredes de pocillos de microtitulación, microplacas de vidrio o silicio, eritrocitos de oveja (u otro animal adecuado) y Duracytes® son todos ejemplos adecuados. Los métodos adecuados para inmovilizar péptidos sobre fases sólidas incluyen interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes y similares. Una "fase sólida" como se usa en este documento se refiere a cualquier material que sea insoluble o pueda hacerse insoluble mediante una reacción posterior. La fase sólida puede seleccionarse por su capacidad intrínseca para atraer e inmovilizar el reactivo de captura. Como alternativa, la fase sólida puede retener un receptor adicional que tenga la capacidad de atraer e inmovilizar el reactivo de captura. El receptor adicional puede incluir una sustancia cargada que esté cargada de forma opuesta con respecto al propio reactivo de captura o a una sustancia cargada conjugada con el reactivo de captura. Como otra alternativa más, la molécula receptora puede ser cualquier miembro de unión específico que se inmovilice sobre (se una a) la fase sólida y que tenga la capacidad de inmovilizar el reactivo de captura mediante una reacción de unión específica. La molécula receptora permite la unión indirecta del reactivo de captura a un material en fase sólida antes de la realización del ensayo o durante la realización del ensayo. Por lo tanto, la fase sólida puede ser un plástico, plástico derivatizado, metal magnético o no magnético, superficie de vidrio o silicio de un tubo de ensayo, placa de microtitulación, lámina, perla, micropartícula, microplaca, eritrocitos de oveja (u otro animal adecuado), Duracytes® y otras configuraciones conocidas por los especialistas en la técnica.

Se contempla y se incluye en el alcance de la presente invención que la fase sólida también puede comprender cualquier material poroso adecuado con una porosidad suficiente para permitir el acceso por anticuerpos de detección y una afinidad superficial adecuada para unirse a antígenos. Generalmente se prefiere una estructura microporosa pero también pueden usarse materiales con una estructura de gel en el estado hidratado. Dichos soportes sólidos útiles incluyen, pero sin limitación, nitrocelulosa y nylon. Se contempla que dichos soportes sólidos porosos descritos en este documento estén preferiblemente en forma de láminas de un grosor de aproximadamente 0,01 a 0,5 mm, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mm. El tamaño de poro puede variar dentro de amplios límites y, preferiblemente es de aproximadamente 0,025 a 15 micrómetros, especialmente de aproximadamente 0,15 a 15 micrómetros. La superficie de dichos soportes puede activarse por procesos químicos que causan el enlace covalente del antígeno o anticuerpo al soporte. La unión irreversible del antígeno o anticuerpo se obtiene, sin embargo, en general, por adsorción sobre el material poroso mediante fuerzas hidrófobas que apenas se comprenden. Se conocen en la técnica otros soportes sólidos adecuados.

La presente invención proporciona secuencias polinucleotídicas derivadas de virus de la inmunodeficiencia humana de interés y polipéptidos codificados por las mismas. El polinucleótido o polinucleótidos pueden estar en forma de ARNm o ADN. Los polinucleótidos en forma de ADN, ADNc, ADN genómico y ADN sintético están dentro del alcance de la presente invención. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario y si es monocatenario puede ser la cadena codificante (con sentido) o la cadena no codificante (antisentido). La secuencia codificante que codifica el polipéptido puede ser idéntica a la secuencia codificante que se proporciona en este documento o puede ser una secuencia codificante diferente que la secuencia codificante, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, que codifica el mismo polipéptido que el ADN suministrado en este documento.

Este polinucleótido puede incluir solamente la secuencia codificante para el polipéptido o la secuencia codificante para el polipéptido y una secuencia codificante adicional tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia de proproteína, o la secuencia codificante para el polipéptido (y opcionalmente secuencia codificante adicional) y una secuencia no codificante, tal como una secuencia no codificante 5' y/o 3' de la secuencia codificante para el polipéptido.

Además, la invención incluye polinucleótidos variantes que contienen modificaciones tales como deleciones, sustituciones o adiciones de polinucleótidos; y cualquier modificación polipeptídica que sea el resultado de la secuencia polinucleotídica variante. Un polinucleótido de la presente invención también puede tener una secuencia codificante que sea una variante de origen natural de la secuencia codificante que se proporciona en este documento.

Además, la secuencia codificante para el polipéptido puede fusionarse en la misma fase de lectura que una secuencia polinucleotídica que ayude en la expresión y secreción de un polipéptido a partir de una célula hospedadora, por ejemplo, una secuencia líder que funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y la secuencia líder puede escindirse por la célula hospedadora para formar la forma del polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar una proproteína que es la proteína más restos aminoacídicos 5' adicionales. Una proteína que tiene una prosecuencia es una proproteína y en algunos casos puede ser una forma inactiva de la proteína. Una vez que se escinde la prosecuencia queda una proteína activa. Por lo tanto, el polinucleótido de la presente invención puede codificar una proteína o una proteína que tenga una prosecuencia o una proteína que tenga tanto una presecuencia (secuencia líder) como una prosecuencia.

Los polinucleótidos de la presente invención también pueden tener la secuencia codificante fusionada en la fase de lectura con una secuencia marcadora que permita la purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser un marcador de hexa-histidina suministrado por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido fusionado con el marcador en el caso de un hospedador bacteriano o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser un marcador de hemaglutinina (HA) cuando se usa un hospedador de mamífero, por ejemplo, células COS-7. El marcador HA se corresponde con un epítopo derivado de la proteína de la hemaglutinina de influenza. Véase, por ejemplo, I. Wilson, et al., Cell 37: 767 (1984).

La presente invención se refiere además a polipéptidos del VIH-1 que tienen la secuencia de aminoácidos deducida que se proporciona en este documento, así como a fragmentos, análogos y derivados de dichos polipéptidos. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos purificados naturales o polipéptidos sintéticos. El fragmento, derivado o análogo de dicho polipéptido puede ser uno en el que uno o más de los restos aminoacídicos se sustituyen con un resto aminoacídico conservado o no conservado (preferiblemente, un resto aminoacídico conservado) y dicho resto aminoacídico sustituido puede ser o no uno codificado por el código genético; o puede ser uno en el que uno o más de los restos aminoacídicos incluyen un grupo sustituyente; o puede ser uno en el que el polipéptido se fusione con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol); o puede ser uno en el que los aminoácidos adicionales se fusionan con el polipéptido, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido o una secuencia de proproteína. Dichos fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de la presente invención. Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en forma aislada y, preferiblemente purificada.

Por lo tanto, un polipéptido de la presente invención puede tener una secuencia de aminoácidos que sea idéntica a la del polipéptido de origen natural o que sea diferente por variaciones minoritarias debidas a una o más sustituciones aminoacídicas. La variación puede ser un "cambio conservativo" típicamente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos, donde el aminoácido sustituido tienen unas propiedades estructurales o químicas similares, por ejemplo, reemplazo de leucina con isoleucina o treonina con serina. Por el contrario, las variaciones pueden incluir cambios no conservativos, por ejemplo, reemplazo de una glicina con un triptófano. Las variaciones minoritarias similares también pueden incluir deleciones o inserciones de aminoácidos o ambos. Pueden encontrarse orientaciones en la determinación de qué y cuántos restos aminoacídicos pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin cambiar la actividad biológica o inmunológica usando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, programa informático DNASTAR (DNASTAR Inc., Madison WI).

Los polipéptidos recombinantes de la presente invención pueden producirse no solamente como se demuestra a continuación, sino también de acuerdo con varios métodos alternativos y usando una diversidad de células hospedadoras y vectores de expresión. Las células hospedadoras se modifican por ingeniería genética (se transducen o transforman o transfectan) con los vectores de esta invención que pueden ser un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células hospedadoras modificadas por ingeniería genética pueden cultivarse en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para promotores activadores, selección de transformantes o amplificación de genes derivados del VIH. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares son los usados anteriormente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión y serán evidentes para el especialista.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden emplearse para producir un polipéptido por técnicas recombinantes. Por lo tanto, la secuencia polinucleotídica puede incluirse en uno cualquiera de una diversidad de vehículos de expresión, en particular vectores o plásmidos para expresar un polipéptido. Dichos vectores incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivados del SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fagos; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN viral tal como de vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar y pseudorrabia. Sin embargo, puede usarse cualquier otro plásmido o vector siempre que sea replicable y viable en el hospedador.

La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el vector mediante una diversidad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en sitios de endonucleasa de restricción apropiados por procedimientos conocidos en la técnica. Dichos procedimientos y otros se consideran dentro del alcance de los especialistas en la técnica. La secuencia de ADN en el vector de expresión está unida operativamente a una secuencia o secuencias de control de la expresión apropiadas (promotor) para dirigir la síntesis de ARNm. Los ejemplos representativos de dichos promotores incluyen, pero sin limitación, promotor LTR o SV40, el lac o trp de E. coli, promotor P sub L de fago lambda y otros promotores conocidos para controlar la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Además, los vectores de expresión contienen preferiblemente un gen para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedadoras transformadas tal como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para un cultivo celular eucariota, o tal como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como se ha descrito anteriormente en este documento, así como una secuencia promotora o de control, puede emplearse para transformar un hospedador apropiado para permitir que el hospedador exprese la proteína. Como ejemplos representativos de hospedadores apropiados, pueden mencionarse: células bacterianas tales como E. coli, Salmonella typhimurium; Streptomyces sp; células fúngicas tales como levaduras; células de insecto tales como Drosophila y Sf9; células animales tales como de ovario de hámster chino (CHO), COS o melanoma de Bowes; células vegetales, etc. La selección de un hospedador apropiado se considera dentro del alcance de los especialistas en la técnica a partir de los contenidos que se proporcionan en este documento.

Más particularmente, la presente invención también incluye construcciones recombinantes que comprenden una o más de las secuencias como se han descrito ampliamente anteriormente. Las construcciones comprenden un vector, tal como un vector plasmídico o viral, en el que se ha insertado una secuencia de la invención en una orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la construcción comprende además secuencias reguladoras incluyendo, por ejemplo, un promotor unido operativamente a la secuencia. Se conocen por los especialistas en la técnica grandes cantidades de vectores y promotores adecuados y están disponibles en el mercado. Se proporcionan los siguientes vectores a modo de ejemplo. Bacterianos: pINCY (Incyte Pharmaceuticals Inc., Palo Alto, CA), pSPORT1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD), pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) pBs, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNHl6a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eucariotas: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Sin embargo, puede usarse cualquier otro plásmido o vector siempre que sea replicable y viable en el hospedador.

Pueden seleccionarse regiones promotoras a partir de cualquier gen deseado usando vectores de CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores de selección. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Los promotores bacterianos particularmente fijados incluyen lacI, lacZ, T3, SP6, T7, gpt, lambda P sub R, P sub L y trp. Los promotores eucariotas incluyen el temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), timidinaquinasa de virus herpes simple (HSV), temprano y tardío de SV40, LTR de retrovirus y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y promotor apropiado está bien dentro del nivel de especialidad en la técnica.

La célula hospedadora usada en este documento puede ser una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero o una célula eucariota inferior tal como una célula de levadura o la célula hospedadora puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula hospedadora puede efectuarse por transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano o electroporación (L. Davis et al., "Basic Methods in Molecular Biology", 2ª edición, Appleton y Lang, Paramount Publishing, East Norwalk, CT [1994]).

Las construcciones en células hospedadoras pueden usarse de una forma convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Como alternativa, los polipéptidos de la invención pueden producirse sintéticamente mediante sintetizadores de péptidos convencionales.

Las proteínas pueden expresarse en células de mamíferos, levaduras, bacterias u otras células bajo el control de promotores apropiados. También pueden emplearse sistemas de traducción sin células para producir dichas proteínas usando ARN derivados de las construcciones de ADN de la presente invención. Se describen vectores de clonación y expresión apropiados para el uso con hospedadores procariotas y eucariotas por Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición, (Cold Spring Harbor, NY, 1989) que se incorpora en este documento como referencia.

La transcripción de un ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención mediante eucariotas superiores se aumenta por inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (de 100 a 270 pb), un potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, un potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus.

Generalmente, los vectores de expresión recombinante incluirán orígenes de replicación y marcadores de selección que permitan la transformación de la célula hospedadora, por ejemplo, el gen de la resistencia ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural cadena abajo. Dichos promotores pueden proceder de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), factor alfa, fosfatasa ácida o proteínas de choque térmico entre otras. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en su fase apropiada con las secuencias de inicio y terminación de la traducción y, preferiblemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida hacia el espacio periplásmico o al medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluya un péptido de identificación N-terminal que confiera características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado.

Los vectores de expresión útiles para el uso en bacterias se construyen por inserción de una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína deseada junto con señales de inicio y terminación de la traducción adecuadas en una fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores de selección fenotípica y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y para, si es deseable, proporcionar la amplificación dentro del hospedador. Los hospedadores procariotas adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otros como una cuestión de selección rutinaria.

Los vectores de expresión útiles para el uso bacteriano comprenden un marcador de selección y un origen bacteriano de replicación derivado de plásmidos que comprende elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Otros vectores incluyen, pero sin limitación PKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI). Estas secciones de "estructura" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural que se va a expresar.

Después de la transformación de una cepa hospedadora adecuada y del cultivo de la cepa hospedadora a una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se desreprime por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional. Típicamente, las células se recogen por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y el extracto bruto resultante se conserva para una purificación adicional. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden romperse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, rotura mecánica o uso de agentes lisantes de células; dichos métodos son bien conocidos por el especialista.

También pueden emplearse diversos sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono descritas por Gluzman, Cell 23: 175 (1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, tales como las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuados y también cualquier sitio de unión al ribosoma necesario, sitio de poliadenilación, sitios donadores y aceptores de corte y empalme, secuencias de terminación de la transcripción, secuencias no transcritas flanqueantes 5' y marcadores de selección tales como las secuencias de ADN del gen de la neomicina fosfotransferasa derivada del genoma viral de SV40, por ejemplo, puede usarse un origen de SV40, promotor temprano, potenciador, sitios de corte y empalme y poliadenilación para proporcionar los elementos genéticos no transcritos necesarios. Los vectores útiles representativos incluyen pRc/CMV y pcDNA3 (disponibles en Invitrogen, San Diego, CA).

Los polipéptidos derivados del VIH se recuperan y purifican a partir de cultivos de células recombinantes por métodos conocidos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía hidroxiapatita o cromatografía de lectina. Se prefiere tener bajas concentraciones (aproximadamente 0,1-5 mM) de ión calcio presentes durante la purificación (Price et al., J. Biol. Chem. 244: 917 [1969]). Pueden usarse etapas de replegamiento de proteínas según sean necesarias al completarse la configuración de la proteína. Por último, puede emplearse una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para las etapas de purificación finales.

Los polipéptidos de la presente invención puede ser productos purificados de forma natural expresados a partir de una línea celular de alta expresión o un producto de procedimientos sintéticos químicos, o producirse por técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariota o eucariota (por ejemplo, mediante células bacterianas, de levaduras, plantas superiores, insectos y mamíferos en cultivo). Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención también pueden glicosilarse con carbohidratos de mamíferos u otros eucariotas o pueden no-glicosilarse. Los polipéptidos de la invención también pueden incluir un resto aminoacídico de metionina inicial.

La presente invención incluye además versiones modificadas del polipéptido recombinante para impedir la glicosilación al tiempo que se permita la expresión de una forma de carbohidrato reducido de la proteína en sistemas de expresión de levaduras, insectos o mamíferos. Los métodos conocidos para inactivar sitios de glicosilación incluyen, pero sin limitación, los que se presentan en la Patente de Estados Unidos 5.071.972 y documento EP 276.846, que se incorporan en este documento como referencia.

Otras variantes incluidas en la presente invención incluyen las obtenidas por eliminación de secuencias que codifican restos de cisteína, evitando de este modo la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos con disminución de la actividad biológica del producto proteico. Las construcciones de la presente invención también pueden prepararse por eliminación del sitio de procesamiento proteolítico, permitiendo la expresión en sistemas que contienen una proteasa problemática, por ejemplo, la proteasa KEX2 en levaduras. Los métodos conocidos para eliminar dichos sitios de proteasa incluyen, pero sin limitación, un método para eliminar sitios de KEX2 que se presenta en el documento EP212. 914.

La presente invención incluye los péptidos anteriores en forma de oligómeros, dímeros, trímeros y oligómeros de orden superior. Pueden formarse oligómeros por varios medios incluyendo, pero sin limitación, enlaces disulfuro entre péptidos, interacciones no covalentes entre péptidos y enlaces polietilenglicol entre péptidos.

La fusión de los péptidos anteriores con enlazadores peptídicos o péptidos que sean capaces de promover oligómeros también se incluye en esta invención. Dichos péptidos incluyen, pero sin limitación cremalleras de leucina y péptidos derivados de anticuerpos tales como se describen en Landschulz et al., Science 240: 1759 (1988); Hollenbaugh y Aruffo, "Construction of Immunoglobin Fusion Proteins", en Current Protocols in Immunology, Suplemento 4, págs 10.19.1-10.19.11 (1992) John Wiley and sons, Nueva York, NY.

Los plásmidos de partida pueden construirse a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados y conocidos. Además, se conocen en la técnica plásmidos equivalentes a los descritos y serán evidentes para el especialista.

Una vez que se obtienen cultivos homogéneos de células recombinantes, pueden recuperarse grandes cantidades de proteína producida de forma recombinante a partir de los medios acondicionados y analizarse usando métodos cromatográficos bien conocidos en la técnica. Un método alternativo para la producción de grandes cantidades de proteína secretada implica la transformación de embriones de mamífero y la recuperación de la proteína recombinante a partir de la leche producida por vacas, cabras, ovejas, transgénicas, etc. Pueden expresarse de forma recombinante polipéptidos y moléculas estrechamente relacionadas de forma que se facilite la purificación de proteínas. Una estrategia implica la expresión de una proteína quimérica que incluye uno o más dominios polipeptídicos adicionales no presentes de forma natural sobre los polipéptidos humanos. Dichos dominios facilitadores de la purificación incluyen, pero sin limitación, péptidos quelantes de metales tales como dominios de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado en el sistema de extensión de FLAGS/purificación por afinidad (Immunex Corp, Seattle, WA). La inclusión de una secuencia enlazadora escindible tal como Factor XA o enteroquinasa de Invitrogen (San Diego, CA) entre la secuencia polipeptídica y el dominio de purificación puede ser útil para recuperar el polipéptido.

También se contempla y se incluye en el alcance de la presente invención que los antígenos recombinantes anteriores se usarán en una diversidad de formatos de inmunoensayo, incluyendo, pero sin limitación ensayos directos e indirectos. Los medios para adaptar los antígenos a dichos diversos formatos -como por conjugación con marcadores o macromoléculas o inmovilización sobre superficies de soportes adecuados- se comprenden bien y deberían ser familiares para los especialistas en la técnica.

Por ejemplo, los polipéptidos incluyendo sus fragmentos o derivados o análogos de los mismos de la presente invención, o células que los expresan, pueden usarse para la detección de anticuerpos contra el VIH (así como un inmunógeno para producir anticuerpos). Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales, quiméricos, de cadena sencilla y anticuerpos humanizados, así como fragmentos Fab o el producto de una biblioteca de expresión de Fab. Pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de dichos anticuerpos y fragmentos.

Además, pueden obtenerse anticuerpos generados contra un polipéptido que se corresponde con una secuencia de la presente invención por inyección directa del polipéptido en un animal o por administración del polipéptido a un animal tal como un ratón, conejo, cabra o ser humano. Se prefiere un ratón, conejo o cabra. El anticuerpo obtenido de este modo se unirá después al propio polipéptido. De esta forma, incluso una secuencia que codifica solamente un fragmento del polipéptido puede usarse para generar anticuerpos que se unan al polipéptido nativo. Después, dichos anticuerpos pueden usarse para aislar el polipéptido de muestras de ensayo tales como tejidos sospechosos de contener ese polipéptido. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos continuos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen la técnica del hibridoma como se describe por Köhler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas como se describe por Kozbor et al, Immun. Today 4: 72 (1983), y la técnica del EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos como se describe por Cole et al., en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Nueva York, NY, págs. 77-96 (1985). Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla contra productos polipeptídicos inmunogénicos de esta invención. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778, que se incorpora en este documento como referencia.

Diversos formatos de ensayo pueden utilizar dichos anticuerpos, incluyendo, inmunoensayos de tipo "sándwich" y ensayos de sondas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales o fragmentos que se han descrito anteriormente pueden emplearse en diversos sistemas de ensayo para determinar la presencia, si existe, de polipéptido derivado del VIH en una muestra de ensayo. Por ejemplo, en un primer formato de ensayo, un anticuerpo policlonal o monoclonal o un fragmento del mismo, o una combinación de estos anticuerpos, que se ha recubierto sobre una fase sólida se pone en contacto con una muestra de ensayo para formar una primera mezcla. Esta primera mezcla se incuba durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar complejos de antígeno/anticuerpo. Después, un reactivo indicador que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento del mismo o una combinación de estos anticuerpos, al que se ha unido un compuesto generador de señal, se pone en contacto con los complejos de antígeno/anticuerpo para formar una segunda mezcla. Esta segunda mezcla se incuba después, durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar complejos de anticuerpo/antígeno/anticuerpo. La presencia de un antígeno polipeptídico derivado del VIH presente en la muestra de ensayo y capturado sobre la fase sólida, si existe, se determina por detección de la señal medible generada por el compuesto generador de señal. La cantidad de antígeno polipeptídico derivado del VIH presente en la muestra de ensayo es proporcional a la señal generada.

O un anticuerpo policlonal o monoclonal de polipéptido derivado del VIH o fragmento del mismo o una combinación de estos anticuerpos que esté unida a un soporte sólido, la muestra de ensayo y un reactivo indicador que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal o fragmento del mismo, que se une específicamente al antígeno polipeptídico derivado del VIH o una combinación de estos anticuerpos a los que se une un compuesto generador de señal, se ponen en contacto para formar una mezcla. Esta mezcla se incuba durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar complejos de anticuerpo/antígeno/anticuerpo. La presencia, si existe, de polipéptidos derivados del VIH presentes en la muestra de ensayo y capturados sobre la fase sólida se determina por detección de la señal medible generada por el compuesto generador de señal. La cantidad de proteínas polipeptídicas derivadas del VIH presentes en la muestra de ensayo es proporcional a la señal generada.

En otro formato de ensayo, uno o una combinación de al menos dos anticuerpos monoclonales pueden emplearse como una sonda competitiva para la detección de anticuerpos contra proteína polipeptídica derivada del VIH. Por ejemplo, proteínas polipeptídicas derivadas del VIH tales como los antígenos recombinantes descritos en este documento, en solitario o en combinación, se recubren sobre una fase sólida. Una muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpo contra antígeno polipeptídico derivado del VIH se incuba después con un reactivo indicador que comprende un compuesto generador de señal y al menos un anticuerpo monoclonal durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar complejos de antígeno/anticuerpo de la muestra de ensayo y el reactivo indicador unido a la fase sólida o del reactivo indicador unido a la fase sólida. La reducción en la unión del anticuerpo monoclonal a la fase sólida puede medirse de forma cuantitativa.

En otro método de detección más, puede emplearse cada uno de los anticuerpos monoclonales o policlonales en la detección de antígenos polipeptídicos derivados del VIH en secciones tisulares fijadas, así como en células fijadas mediante análisis inmunohistoquímico. Puede usarse un análisis citoquímico en el que estos anticuerpos se marcan directamente (con por ejemplo, fluoresceína, oro coloidal, peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, etc) o se marcan mediante el uso de anticuerpos secundarios anti-especie marcados (con diversos marcadores como se ejemplifica en este documento) para realizar el seguimiento de la histopatología de la enfermedad. Además, estos anticuerpos monoclonales pueden unirse a matrices similares a Sepharose activada con CNBr y usarse para la purificación por afinidad de proteínas polipeptídicas derivadas del VIH específicas a partir de cultivos celulares o tejidos biológicos para purificar antígenos polipeptídicos y proteínas derivadas del VIH recombinantes y nativas.

También pueden usarse anticuerpos monoclonales para la generación de anticuerpos quiméricos para uso terapéutico u otras aplicaciones similares.

Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos pueden proporcionarse individualmente para detectar antígenos polipeptídicos derivados del VIH. También pueden usarse combinaciones de los anticuerpos monoclonales (y fragmentos de los mismos) juntos como componentes en una mezcla o "combinación" de al menos un anticuerpo de polipéptido derivado del VIH con anticuerpos u otras regiones polipeptídicas derivadas del VIH, teniendo cada una diferentes especificidades de unión. Por lo tanto, esta combinación puede incluir anticuerpos monoclonales que se dirigen contra proteínas polipeptídicas derivadas del VIH y otros anticuerpos monoclonales contra otros determinantes antigénicos del genoma de polipéptidos derivados del VIH.

El anticuerpo policlonal o fragmento del mismo que puede usarse en los formatos de ensayo deben unirse específicamente a una región polipeptídica derivada del VIH u otras proteínas polipeptídicas derivadas del VIH usadas en el ensayo. El anticuerpo policlonal usado preferiblemente es de origen de mamífero; pueden usarse anticuerpos policlonales anti-polipéptido derivado del VIH de seres humanos, cabras, conejos u ovejas. Mas preferiblemente, el anticuerpo policlonal es un anticuerpo policlonal de conejo anti-polipéptido derivado del VIH. Los anticuerpos policlonales usados en los ensayos pueden usarse en solitario o como una combinación de anticuerpos policlonales. Puesto que las combinaciones usadas en los formatos de ensayo están compuestas por anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales que tienen diferente especificidad de polipéptido derivado del VIH, serán útiles para el diagnóstico, evaluación y pronóstico de una afección por polipéptidos derivados del VIH, así como para el estudio de la diferenciación y especificidad de proteínas polipeptídicas derivadas del VIH.

Se contempla e incluye en el alcance de la presente invención que los polipéptidos derivados del VIH pueden ser detectables en ensayos mediante el uso de antígenos recombinantes así como mediante el uso de péptidos sintéticos o péptidos purificados que contienen secuencias de aminoácidos de polipéptidos derivados del VIH. También se incluye en el alcance de la presente invención que diferentes péptidos sintéticos, recombinantes o purificados que identifican diferentes epítopos de cada uno de dichos polipéptidos derivados del VIH pueden usarse en combinación en un ensayo para diagnosticar, evaluar o pronosticar la afección patológica del VIH. En este caso, estos péptidos pueden recubrirse sobre una fase sólida o cada péptido separado puede recubrirse sobre fases sólidas separadas, tales como micropartículas, y después combinarse para formar una mezcla de péptidos que pueden usarse más tarde en ensayos. Además, se contempla que múltiples péptidos que definen epítopos de diferentes polipéptidos pueden usarse en combinación para hacer un diagnóstico, evaluación o pronóstico de la enfermedad por VIH. Después, se deja que los péptidos recubiertos sobre fases sólidas o marcados con marcadores detectables compitan con péptidos de una muestra de paciente por una cantidad limitada de anticuerpo. Una reducción en la unión de los péptidos sintéticos, recombinantes o purificados al anticuerpo (o anticuerpos) es un indicio de la presencia de polipéptidos secretados por el VIH en la muestra de paciente que a su vez indica la presencia de gen del VIH en el paciente. Dichas variaciones de formatos de ensayo son conocidas para los especialistas en la técnica y se analizan en este documento a
continuación.

En otro formato de ensayo, puede detectarse la presencia de antígenos y/o anticuerpos contra polipéptidos derivados del VIH en un ensayo simultáneo, de la forma siguiente. Una muestra de ensayo se pone en contacto simultáneamente con un reactivo de captura de un primer analito, en el que dicho reactivo de captura comprende un primer miembro de unión específico para un primer analito unido a una fase sólida y un reactivo de captura para un segundo analito, en el que dicho reactivo de captura comprende un primer miembro de unión para un segundo analito unido a una segunda fase sólida, para formar de este modo una mezcla. Esta mezcla se incuba durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar complejos de reactivo de captura/primer analito y reactivo de captura/segundo analito. Estos complejos formados de este modo se ponen en contacto después con un reactivo indicador que comprende un miembro de una pareja de unión específico para el primer analito marcado con un compuesto generador de señal y un reactivo indicador que comprende un miembro de una pareja de unión específico para el segundo analito marcado con un compuesto generador de señal para formar una segunda mezcla. Esta segunda mezcla se incuba durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar complejos de reactivo de captura/primer analito/reactivo indicador y complejos de reactivo de captura/segundo analito/reactivo indicador. La presencia de uno o más analitos se determina por detección de una señal generada en relación con los complejos formados en cualquiera o ambas fases sólidas como un indicio de la presencia de uno o más analitos en la muestra de ensayo. En este formato de ensayo, pueden utilizarse antígenos recombinantes así como anticuerpos monoclonales producidos a partir de los mismos. Dichos sistemas de ensayo se describen con más detalle en la publicación EP Nº: 0473065.

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En otros formatos de ensayo más, los polipéptidos descritos en este documento pueden utilizarse para detectar la presencia de anticuerpos específicos para polipéptidos derivados del VIH en muestras de ensayo. Por ejemplo, una muestra de ensayo se incuba con una fase sólida a la que se ha unido al menos una proteína recombinante. Esto se deja reaccionar durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar complejos de antígeno/anticuerpo. Después de la incubación, se detecta el complejo de antígeno/anticuerpo. Pueden usarse reactivos indicadores para facilitar la detección dependiendo del sistema de ensayo seleccionado. En otro formato de ensayo, se pone en contacto una muestra de ensayo con una fase sólida a la que se une una proteína recombinante producida como se describe en este documento y también se pone en contacto con un anticuerpo monoclonal o policlonal específico para la proteína, que preferiblemente se ha marcado con un reactivo indicador. Después de la incubación durante un tiempo y en condiciones suficientes para que se formen complejos de anticuerpo/antígeno, la fase sólida se separa de la fase libre y el marcador se detecta en la fase sólida o libre como un indicio de la presencia del anticuerpo de polipéptido derivado del VIH. Se contemplan otros formatos de ensayo que utilizan los antígenos recombinantes descritos en este documento. Estos incluyen poner en contacto una muestra de ensayo con una fase sólida a la que se ha unido al menos un antígeno de una primera fuente, incubar la fase sólida y la muestra de ensayo durante un tiempo y en condiciones suficientes para formar complejos de antígeno/anticuerpo y después poner en contacto la fase sólida con un antígeno marcado, procediendo dicho antígeno de la misma fuente o, como alternativa, de una segunda fuente diferente de la primera fuente. Por ejemplo, una proteína recombinante derivada de una primera fuente tal como E. coli se usa como antígeno de captura sobre una fase sólida, se añade una muestra de ensayo a la fase sólida preparada de este modo y se utiliza una proteína recombinante derivada de una fuente diferente ( es decir, no de E. coli) como parte de un reactivo indicador. Asimismo, también son posibles combinaciones de un antígeno recombinante sobre una fase sólida y péptido sintético en la fase de indicador. Se contempla cualquier formato de ensayo que utilice un antígeno específico para polipéptido derivado del VIH de una primera fuente como el antígeno de captura y un antígeno específico para polipéptido derivado del VIH de una segunda fuente. Por lo tanto, se incluyen en el alcance de esta invención diversas combinaciones de antígenos recombinantes, así como el uso de péptidos sintéticos, proteínas purificadas y similares. Se describen ensayos como éstos y otros en la Patente de Estados Unidos Nº 5.254.458, que goza de propiedad común y se incorpora en este documento como referencia.

Otras realizaciones que utilizan diversas otras fases sólidas también se contemplan y se incluyen en el alcance de esta invención. Por ejemplo, pueden emplearse procedimientos de captura de iones para inmovilizar un complejo de reacción immobilizable con un polímero cargado negativamente (descrito en la publicación EP 0326100 y la publicación EP Nº 0406473), de acuerdo con la presente invención para efectuar una reacción inmunoquímica rápida en fase de solución. Un complejo inmune immobilizable se separa del resto de la mezcla de reacción por interacciones iónicas entre el polianión cargado negativamente/inmunocomplejo y la matriz porosa cargada positivamente previamente tratada y se detecta mediante el uso de diversos sistemas generadores de señal descritos anteriormente, incluyendo los descritos en mediciones de señal quimioluminiscente, como se describe en la publicación EPO Nº 0 273.115.

Además, los métodos de la presente invención pueden adaptarse para el uso en sistemas que utilizan tecnología de micropartículas incluyendo en sistemas automáticos y semiautomáticos en los que la fase sólida comprende una micropartícula (magnética o no magnética). Dichos sistemas incluyen los descritos en las solicitudes EPO publicadas Nº 0 425 633 y EP Nº 0 424 634, respectivamente.

El uso de microscopía de sondas de barrido (SPM) para inmunoensayos también es una tecnología a la que los anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden adaptar fácilmente. En la microscopía de sondas de barrido, en particular, en microscopía de fuerza atómica, la fase de captura, por ejemplo, al menos uno de los anticuerpos monoclonales de la invención, se adhiere a una fase sólida y se utiliza un microscopio de sondas de barrido para detectar complejos de antígeno/anticuerpo que pueden estar presentes en la superficie de la fase sólida. El uso de microscopía de túneles de barrido elimina la necesidad de marcadores que normalmente deben utilizarse en muchos sistemas de inmunoensayo para detectar complejos de antígeno/anticuerpo. El uso de SPM para controlar reacciones de unión específicas puede producirse de muchas formas. En una realización, un miembro de una pareja de unión específica (sustancia específica de analito que es el anticuerpo monoclonal de la invención) se une a una superficie adecuada para el barrido. La unión de las sustancia específica de analito puede ser por adsorción a un artículo de ensayo que comprende una fase sólida de una superficie plástica o metálica, siguiendo métodos conocidos por los especialistas en la técnica. O puede utilizarse la unión covalente de un compañero de unión específico (sustancia específica de analito) a un artículo de ensayo, comprendiendo el artículo de ensayo una fase sólida de plástico, metal, silicio o vidrio. Se conocen métodos de unión covalentes por los especialistas en la técnica e incluyen una diversidad de medios para unir de forma irreversible compañeros de unión específicos al artículo de ensayo. Si el artículo de ensayo es silicio o vidrio, la superficie debe activarse antes de unirse al compañero de unión específico. Además, pueden usarse interacciones polielectrolíticas para inmovilizar un compañero de unión específico sobre una superficie de un artículo de ensayo mediante el uso de técnicas y químicas. El método preferido de unión es por medios covalentes. Después de la unión de un miembro de unión específico, la superficie puede tratarse adicionalmente con materiales tales como suero, proteínas u otros agentes bloqueantes para minimizar la unión inespecífica. La superficie también puede explorarse en el sitio de fabricación o punto de uso para verificar su idoneidad para fines de ensayo. El proceso de exploración no se prevé que altere las propiedades de unión específica del artículo de ensayo.

Aunque la presente invención describe la preferencia por el uso de fases sólidas, se contempla que los reactivos tales como anticuerpos, proteínas y péptidos de la presente invención pueden utilizarse en sistemas de ensayo en fase no sólida. Estos sistemas de ensayo son conocidos por los especialistas en la técnica y se considera que se incluyen en el alcance de la presente invención.

La presente invención se entenderá mejor en relación con los siguientes ejemplos, que pretenden ilustrar pero no limitar el espíritu y alcance de la invención.

Ejemplo 1 Procedimientos de clonación

Se sintetizaron oligonucleótidos para construcción y secuenciación de genes en Abbott Laboratories, Synthetic Genetics (San Diego, CA) u Oligo Etc. (Wilsonville, CA). Todos los reactivos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) incluyendo la ADN polimerasa AmpliTaq y la ADN polimerasa UITma se adquirieron en Perkin-Elmer Corporation (Foster City, CA) y se usaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante a menos que se indique otra cosa. Las amplificaciones por PCR se realizaron en un termociclador GeneAmp 9600 (Perkin-Elmer). A menos que se indique otra cosa, las enzimas de restricción se adquirieron en New England BioLabs (Beverly, MA) y las digestiones se realizaron según recomienda el fabricante. Los fragmentos de ADN usados para la clonación se aislaron en geles de agarosa (Life Technologies, Gaithersburg, MD) a menos que se indique otra cosa.

Los fragmentos deseados se escindieron y el ADN se extrajo con un kit de extracción de gel QIAEX II o el kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) según recomienda el fabricante. El ADN se resuspendió en H_{2}O o TE [ácido etilendiaminotetraacético 1 mM (EDTA; pH 8,0; BRL Life Technologies), clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano 10 mM y (Tris-HCl; pH 8,0; BRL Life Technologies)]. Las ligaciones se realizaron usando un kit de ligación de ADN de Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) según recomienda el fabricante. Las ligaciones se incubaron a 16ºC durante una noche.

Las transformaciones bacterianas se realizaron usando células competentes DH5\alpha MAX EFFICIENCY (BRL Life Technologies) o células supercompetentes Epicurian Coli XL1-Blue (Stratagene Cloning Systems) siguiendo los protocolos del fabricante. A menos que se indique otra cosa, las transformaciones y resiembras en estrías se sembraron en placas de agar LB (Lennox) con ampicilina 150 \mug/ml (M1090; MicroDiagnostics, Lombard, IL) o en placas de agar LB + ampicilina suplementadas con glucosa hasta una concentración final de 20 mM, según se indica. Todas las incubaciones bacterianas (placas y cultivo de una noche) se realizaron durante una noche (\sim16 horas) a 37ºC.

La exploración de transformantes para identificar los clones deseados se realizó por secuenciación de ADN de minipreparaciones y/o por PCR de colonias. Se preparó ADN de minipreparaciones con un Qiagen Tip 20 Plasmid Prep Kit o un Qiagen QIAwell 8 Plasmid Prep Kit siguiendo las especificaciones del fabricante a menos que se indique otra cosa. Para la exploración por PCR de colonias, se escogieron colonias individuales a partir de placas de transformación y se transfirieron a un pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano estéril (Costar, Cambridge, MA) que contenía 100 \mul de H_{2}O estéril. Un tercio del volumen se transfirió a una segunda placa y se almacenó a 4ºC. La placa de 96 pocillos original se calentó en microondas durante 5 minutos para romper las células. Después se transfirió 1 \mul de volumen a un tubo de PCR como molde. Se añadieron 9 \mul de una mezcla maestra de PCR que contenía 1 \mul de tampón de PCR 10X, 1 \mul de dNTP 2 mM, 1 \mul (10 pmol) de cebador directo, 1 \mul (10 pmol) de cebador inverso, 0,08 \mul de ADN polimerasa AmpliTaq (0,4 unidades) y 4,2 \mul de H_{2}O al tubo de PCR. En general, las reacciones se amplificaron durante 20-25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 50-60ºC (dependiendo de las temperaturas de hibridación de cebadores) durante 30 segundos y 72ºC durante 60 segundos. Los cebadores dependían del inserto y las condiciones de ciclado se modificaron en base a las temperaturas de hibridación de cebadores y la longitud del producto esperado. Después del ciclado, aproximadamente 1/3 del volumen de reacción se cargó en un gel de agarosa para análisis. Las colonias que contenían clones deseados se propagaron a partir de la placa de
transferencia.

A menos que se indique otra cosa, se realizó secuenciación de ADN en un secuenciador automático ABI Model 373A Stretch Sequencer (Perkin Elmer). Las reacciones de secuenciación se prepararon con reactivos de un FS TACS Dye Term Ready Reaction Kit (Perkin Elmer) y 250-500 ng de ADN plasmídico de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Las reacciones se procesaron en columnas Centri-Sep (Princeton Separations, Adelphia, N. J.) antes de cargarlas en el secuenciador. Los datos de secuencia se analizaron usando Sequencher 3.0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) y GeneWorks 2.45 (Oxford Molecular Group, Inc., Campbell, CA).

Ejemplo 2 Determinación de la secuencia de env del aislado del VIH-1 grupo O HAM112

Se extrajo ARN viral de sobrenadantes de cultivo de células mononucleares de sangre periférica humanas infectadas con el aislado del VIH-1 grupo O denominado HAM112 (H. Hampl et al., Infection 23: 369-372 [1995]) usando un QIAamp Blood Kit (Qiagen) y el procedimiento recomendado por el fabricante. El ARN se eluyó en un volumen de 50 \mul de agua sin nucleasas (5Prima-3Prima, Inc., Boulder, CO) y se almacenó a -70ºC. La estrategia para obtener la secuencia de la región env implicaba síntesis de ADNc y amplificación por PCR (anidada) de cuatro fragmentos génicos de env solapantes. Los productos amplificados se secuenciaron directamente en un secuenciador automático ABI Model 373A Stretch Sequencer. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo con kits de PCR de ARN GeneAmp y de PCR GeneAmp (Perkin Elmer) como se describe por el fabricante. Las posiciones del cebador oligonucleotídico se corresponden con la secuencia de env del VIH-1 ANT70 (G. Myers et al., eds., anteriormente). Los cebadores env10R [nucleótidos (nt) 791-772; SEC ID Nº: 62], env15R (nt 1592-1574; SEC ID Nº: 63), env22R (nt 2321-2302; SEC ID Nº: 64), env26R (nt 250-232 3' de env; SEC ID Nº: 65) se usaron para síntesis de ADNc de los fragmentos 1-4, respectivamente. Se incubaron reacciones de transcripción inversa a 42ºC durante 30 minutos, después a 99ºC durante 5 minutos. Las amplificaciones de PCR de primera vuelta consistían en 30 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 52ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minutos usando las combinaciones de cebadores: env1F (nt 184-166 5' de env; SEC ID Nº: 66) y env10R (SEC ID Nº: 62), env7F (nt 564-586; SEC ID Nº: 67) y env15R (SEC ID Nº: 63), env12F (nt 1289-1308; SEC ID Nº: 68) y env22R (SEC ID Nº: 64), env19F (nt 2020-2040; SEC ID Nº: 69) y env26R (SEC ID Nº: 65) para los fragmentos 1 a 4, respectivamente. Para la segunda vuelta de amplificación (PCR anidada), se usaron 5 \mul de las reacciones de PCR de primera vuelta respectivas como molde junto con las combinaciones de cebadores env2F (nt 37-15 5' de env; SEC ID Nº: 70) y env9R (nt 740-721; SEC ID Nº: 71), env8F (nt 631-650; SEC ID Nº: 72) y env14R (nt 1437-1416; SEC ID Nº: 73), env13F (nt 1333-1354; SEC ID Nº: 74) y env21R (nt 2282-2265; SEC ID Nº: 75), env20F (nt 2122-2141; SEC ID Nº: 76) y env25R (nt 111-94 3' de env; SEC ID Nº: 77) para los fragmentos 1 a 4, respectivamente. Las condiciones de amplificación de segunda vuelta eran idénticas a las usadas para la primera vuelta. Los fragmentos se purificaron en gel de agarosa y se extrajeron con un kit de extracción de gel Qiagen QIAEX II. Los fragmentos se secuenciaron directamente con los cebadores usados para PCR anidada junto con los cebadores env4F (SEC ID Nº: 78) y env5R (SEC ID Nº: 79) para el fragmento 1; cebadores env10F (SEC ID Nº: 80), env 11F (SEC ID Nº: 81), env11R (SEC ID Nº: 82), env12F (SEC ID Nº: 68), y AG1 (SEC ID Nº: 87) para el fragmento 2; cebadores env15F (SEC ID Nº: 83) y env19R (SEC ID Nº: 84) para el fragmento 3; cebadores env22F (SEC ID Nº: 85) y env24R (SEC ID Nº: 86) para el fragmento 4. La secuencia de aminoácidos deducida de env del aislado del VIH-1 Grupo O HAM112 (SEC ID Nº: 61) se presentan en la Figura 1.

Ejemplo 3 Construcción de genes sintéticos env gp 120/gp41 del VIH-1 Grupo O

La Figura 2 representa la estrategia usada para generar construcciones génicas sintéticas de env gp 120/gp41 del VIH-1 Grupo O. Las secuencias de env gp 120/gp41 se basaron en el aislado del VIH-1 Grupo O HAM112 (SEC ID Nº: 61). La determinación de la secuencia de env de HAM112 se describe en el Ejemplo 2 anteriormente en este documento. Se diseñaron oligonucleótidos que codifican los 45 aminoácidos C-terminales del env gp 120 y los 327 aminoácidos del env gp41 (el nucleótido nº 1 es la primera base del primer codón de gp 120 en el gen sintético). El gen sintético tiene una deleción de 26 aminoácidos (nucleótidos 643 a 720) con respecto al gp41 de HAM112 nativo, que incluye una región altamente hidrófoba (H) (región transmembrana) de gp41. Por lo tanto, el gen de gp41 sintético de longitud completa construido tiene 327 aminoácidos.

En los oligonucleótidos sintéticos, los codones del VIH-1 nativos se modificaron para conformar la tendencia de codones de E. coli en un esfuerzo por aumentar los niveles de expresión de la proteína recombinante en E. coli. Véase, por ejemplo, M. Gouy y C. Gautier, Nucleic Acids Research 10: 7055 (1982); H. Grosjean y W. Fiers, Gene 18: 199 (1982); J. Watson et al. (eds.), Molecular Biology of the Gene, 4ª Ed., Benjamin Kumming Publishing Co., págs.440 (1987). La estrategia de construcción de genes implicaba la síntesis de una serie de oligonucleótidos solapantes con extremos complementarios (Osyn-A a Osyn-L, representado como A a L). Cuando hibridaban, los extremos servían como cebadores para la extensión de la cadena complementaria.

Después, los fragmentos se amplificaron por PCR. Este proceso ("ligación por PCR" de oligonucleótidos) se repitió para alargar progresivamente el fragmento génico. Se diseñó el oligonucleótido Osyn-5' para clonación en el vector de PL pKRR826. El vector de expresión pKRR826, es una forma modificada del vector de promotor PL lambda pSDKR816, descrito en la patente de Estados Unidos de nº de serie 08/314.570, incorporado en este documento como referencia. El pKRR826 es un derivado de alto número de copias de pBR322 que contiene el gen represor cl sensible a temperatura (Benard et al., Gene 5: 59 [1979]). Sin embargo, pKRR826 carece del terminador de la transcripción rmBt1 y tiene los promotores pL lambda y pR lambda en orientación inversa, con respecto a pSDKR816. La región polienlazadora de pKRR826 contiene sitios de enzimas de restricción Eco RI y Bam HI pero carecen de un codón de inicio ATG. La expresión óptima se obtiene cuando el extremo 5' del inserto génico (incluyendo una metionina N-terminal) se clona en el sitio EcoRI. Osyn-5' se diseñó para contener un sitio de restricción de Eco RI para clonación y un codón ATG (metionina) para proporcionar un inicio de la traducción apropiado de las proteínas recombinantes. Los oligonucleótidos antisentido Osyn-O3' (SEC ID Nº: 15), Osyn-P3' (SEC ID Nº: 16) y Osyn-M (M) (SEC ID Nº: 14) contienen cada uno dos codones de terminación de la traducción secuenciales (TAA, TAG) y un sitio de restricción Bam HI. Cuando se usaron los cebadores exteriores Osyn-5' (SEC ID Nº: 11) y Osyn-M (M) (SEC ID Nº: 14), se sintetizó un gen de gp41 de longitud completa (327 aminoácidos) (pGO11PL; SEC ID Nº: 52). Los oligonucleótidos exteriores Osyn-5' (SEC ID Nº: 11) y Osyn-03' (SEC ID Nº: 15) dieron como resultado un producto de gp41 truncado de 199 aminoácidos (pGO-9PL; SEC ID Nº: 48). Como alternativa, los oligonucleótidos exteriores Osyn-5' (SEC ID Nº: 11) y Osyn-P3' (SEC ID Nº: 16) dieron como resultado un producto de gp41 truncado de 169 aminoácidos de longitud (pGO-8PLM; SEC ID Nº: 58).

Los genes sintéticos también se expresaron como proteínas de fusión de CMP-KDO sintetasa (CKS). La transferencia mediada por PCR de los genes sintéticos de pKRR826 a pJ0200 (descrita en la patente de Estados Unidos de nº de serie 572.822 e incorporada en este documento como referencia) se consiguió con un cebador de PCR oligonucleotídico con sentido exterior alternativo (extremo 5'), Osyn-5'CKS (SEC ID Nº: 25). Osyn-5'CKS contenía un sitio de restricción Eco RI y daba como resultado la fusión en la fase de lectura del inserto génico sintético para CKS en el vector de expresión pJO200. Los cebadores exteriores 3' (antisentido) Osyn-M (SEC ID Nº: 14), Osyn-O3' (SEC ID Nº: 15) y Osyn-P3' (SEC ID Nº: 16) se usaron en combinación con Osyn-5'CKS (SEC ID Nº: 25) para generar pGO-11CKS (SEC ID Nº: 54), pGO-9CKS (SEC ID Nº: 50) y pGO-8 CKS (SEC ID Nº: 60), respectivamente. Estas etapas se detallan en este documento a continuación.

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A. Ligación por PCR de oligonucleótidos sintéticos

Se prepararon tres reacciones de PCR (volumen de 100 \mul) de la forma siguiente:

(1) Reacción 1B: ADN polimerasa AmpliTaq (2,5 U) y tampón IX junto con 40 \muM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 25 pmol de cada uno de los oligonucleótidos Osyn-A (SEC ID Nº: 3) y Osyn-D (SEC ID Nº: 5) y 0,25 pmol de cada uno de los oligonucleótidos Osyn-B (SEC ID Nº: 17) y Osyn-c (SEC ID Nº: 4);

(2) Reacción 2A: ADN polimerasa UITma (3 U) y tampón 1X junto con MgCl_{2} 1,5 mM, 40 \muM de cada dNTP, 25 pmol de cada uno de los oligonucleótidos Osyn-E (SEC ID Nº: 6) y Osyn-H (SEC ID Nº: 9) y 0,25 pmol de cada uno de los oligonucleótidos Osyn-F (SEC ID Nº: 7) y Osyn-G (SEC ID Nº: 8); y

(3) Reacción 3A: ADN polimerasa UITma (3 U) y tampón 1X junto con MgCl_{2} 1,5 mM, 40 \muM de cada dNTP, 25 pmol de cada uno de los oligonucleótidos Osyn-I (SEC ID Nº: 10) y Osyn-L (SEC ID Nº: 13) y 0,25 pmol de cada uno de los oligonucleótidos Osyn-J (SEC ID Nº: 18) y Osyn-K (SEC ID Nº: 12).

Las amplificaciones consistían en 20 ciclos de 97ºC durante 30 segundos, 52ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 60 segundos. Después, las reacciones se incubaron a 72ºC durante 7 minutos y se mantuvieron a 4ºC. Los productos derivados de PCR 1B, 2A y 3B se aislaron en gel en un gel de agarosa al 1%.

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B. Ligación por PCR de productos de PCR de la reacción 1B y la reacción 2A

Se preparó una reacción de PCR con ADN polimerasa UITma (3 U) y tampón 1X junto con MgCl_{2} 1,5 mM, 40 \muM de cada dNTP, 24,4 pmol de oligonucleótidos Osyn-5' (SEC ID Nº: 11), 25 pmol de oligonucleótido Osyn-P3' (SEC ID Nº: 16) y \sim10 ng de cada uno de los productos 1B y 2A aislados de gel del Ejemplo 3, Sección 1A, anteriormente en este documento. Las condiciones de ciclado eran las mismas que en el Ejemplo 3, Sección 1A. Se usó una segunda vuelta de amplificación para generar más cantidad del producto deseado. Esto se realizó preparando una mezcla de UITma como se ha descrito anteriormente en este documento (100 \mul de volumen de reacción) con Osyn-5' (SEC ID Nº: 11) 49 pmol, Osyn-P3' (SEC ID Nº: 16) 50 pmol y 5 \mul del producto de PCR de la primera vuelta como molde. Estas reacciones se incubaron a 94ºC durante 90 segundos y después se ciclaron como anteriormente (Sección 3A). El producto de PCR Osyn-5'/Osyn-P3' se aisló en gel como se ha descrito anteriormente en este documento.

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C. Clonación del producto de PCR Osyn-5'-Osyn-P3'

El producto de PCR Osyn-5'-Osyn-P3' se digirió con las endonucleasas de restricción Eco RI + Bam HI y se ligó en el vector pKRR826 (descrito anteriormente en este documento) que se había digerido con Eco RI + Bam HI y aislado en gel. El producto de ligación se usó para transformar células competentes DH5\alpha. El clon deseado se identificó mediante PCR de colonias usando los oligonucleótidos pKRREcoRI directo (SEC ID Nº: 38) y pKRRBamHI inverso (SEC ID Nº: 39). Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de un cultivo de una noche de clon candidato de pGO-8 A2 y se secuenció el inserto plasmídico Osyn-5'-Osyn-P3' con los cebadores oligonucleotídicos pKRREcoRI directo (SEC ID Nº: 38), pKRRBamHI inverso (SEC ID Nº: 39), 41sy-1 (SEC ID Nº: 44) y 41sy-2 (SEC ID Nº: 41).

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D. Modificación del clon candidato de pGO-8 A2

Se preparó un volumen de 100 \mul de reacción de PCR con ADN polimerasa UITma (3 U) y tampón 1X junto con MgCl_{2} 1,5 mM, 40 \muM de cada dNTP, 50 pmol de oligonucleótidos Osyn-5'-reparación (SEC ID Nº: 24), 50 pmol de Osyn-P3' (SEC ID Nº: 16) y \sim1 ng de ADN de minipreparación de clon candidato de pGO-8 A2 como molde (obtenido a partir de las reacciones expuestas anteriormente en este documento). La reacción se incubó a 94ºC durante 90 segundos y después se amplificó con 20 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 60 segundos. El producto de PCR de Osyn-5'-reparación/Osyn-P3' se aisló en gel después y se digirió con Eco RI + Bam HI. El producto digerido se ligó en vector pKRR826 digerido con Eco RI + Bam HI. El producto de ligación se usó para transformar células competentes DH5\alpha. El clon deseado se identificó mediante PCR de colonias usando los oligonucleótidos pKRREcoRI directo (SEC ID Nº: 38) y pKRRBamHI inverso (SEC ID Nº: 39). Se preparó un cultivo de una noche de clon candidato de pGO-8 6 y se preparó el ADN de minipreparación. El inserto plasmídico Osyn-5' reparación/Osyn-P3' se secuenció con los cebadores pKRREcoRI directo (SEC ID Nº: 38), pKRRBamHI inverso (SEC ID Nº: 39), 41sy-1 (SEC ID Nº: 44) y 41sy-2 (SEC ID Nº: 41). En base a los resultados de secuenciación, el clon candidato de pGO-8 nº 6 se denominó pGO-8PL/DHS\alpha. La SEC ID Nº: 57 presenta la secuencia de nucleótidos de la región codificante. La Figura 5 presenta la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGO-8PL (SEC ID Nº: 58). La proteína recombinante pGO-8PL consiste en una metionina N-terminal, 45 aminoácidos de env gp 120 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112) y 169 aminoácidos de env gp41 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112).

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E. Construcción de pGO-8CKS/XL1

El pGO-8CKS/XL1 (la SEC ID Nº: 59 presenta la secuencia de nucleótidos de la región codificante) codifica la proteína recombinante pGO-8CKS. La Figura 6 presenta la secuencia de aminoácidos de pGO-8CKS (SEC ID Nº: 60). Esta proteína consiste en 246 aminoácidos de CKS/polienlazador, 45 aminoácidos de env gp 120 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112) y 169 aminoácidos de env gp41 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112). La construcción de pGO-8CKS/XL1 se consiguió de la forma siguiente.

Se preparó una reacción de PCR (100 \mul de volumen) con una ADN polimerasa UITma (3 U) y tampón 1X junto con MgCl_{2} 1,5 mM, 40 \muM de cada dNTP, 50 pmol de Osyn-5'CKS (SEC ID Nº: 25), 50 pmol de Osyn-P3' (SEC ID Nº: 16) y 1 ng de ADN de minipreparación de clon de pGO-8PL nº 6. La reacción se incubó a 94ºC durante 90 segundos, después se amplificó con 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos; 55ºC durante 30 segundos; 72ºC durante 90 segundos. Después, el producto de PCR Osyn-5'CKS/Osyn-P3' se aisló en gel. Eco RI + Bam HI digirieron el producto de PCR Osyn-5'CKS/Osyn-P3' y el vector pJO200. El vector pJO200 se aisló en gel y se ligó con el producto de PCR Osyn-5'CKS/Osyn-P3' digerido. Se transformaron células supercompetentes XL1-Blue con la ligación y se sembraron en placas de LB + ampicilina suplementadas con glucosa 20 mM. Las colonias se volvieron a sembrar en estrías para el aislamiento sobre el mismo tipo de placas. Un cultivo de una noche de clon pGO-8CKS/XL1 se cultivó en caldo LB + carbenicilina 100 \mug/ml (Sigma Chemical Co.) + glucosa 20 mM (Sigma Chemical Co.). Se prepararon reservas congeladas (0,5 ml de cultivo de una noche + 0,5 ml de glicerol) para análisis de secuencia. Se usaron los siguientes oligonucleótidos como cebadores de secuenciación: CKS-1 (SEC ID Nº: 30), CKS-2 (SEC ID Nº: 31), CKS-3 (SEC ID Nº: 32), CKS-4 (SEC ID Nº: 33), 43461 (SEC ID Nº: 2), 41sy-1B (SEC ID Nº: 29), 41sy-2B (SEC ID Nº: 34), CKS176.1 (SEC ID Nº: 19) y CKS3583 (SEC ID Nº: 20).

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F. Construcción de pGO-9PL/DH5\alpha

Las Figuras 3A a 3D muestran una representación esquemática de las etapas implicadas en la construcción de pGO-9PL/DH5\alpha. pGO-9PL/DH5\alpha codifica la proteína recombinante pGO-9PL. La SEC ID Nº: 47 presenta la secuencia de nucleótidos de la región codificante de pGO-9PL/DH5\alpha. La Figura 7 ilustra la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGO-9PL (SEC ID Nº: 48). Esta proteína consiste en una metionina N-terminal, 45 aminoácidos de env gp120 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112) y 199 aminoácidos de env gp41 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112). La construcción de pGO-9PL/DH5\alpha se consiguió de la forma siguiente.

Etapa 1: se preparó una reacción de PCR de 100 \mul con ADN polimerasa UITma (3 U) y tampón 1X junto con MgCl_{2} 1,5 mM, 40 \muM de cada dNTP, 50 pmol de Osyn-5' (SEC ID Nº: 11), 50 pmol de Osyn-H (SEC ID Nº: 9) y \sim2 ng de ADN de minipreparación de clon candidato de pGO-8 6 (obtenido del Ejemplo 3, Sección D anteriormente en este documento) como molde. La reacción se incubó a 94ºC durante 120 segundos y después se amplificó con 8 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 60 segundos.

Etapa 2: Se preparó una reacción de PCR de 100 \mul con ADN polimerasa UITma (3 U) y tampón 1X junto con MgCl_{2} 1,5 mM, 40 \muM de cada dNTP, 50 pmol de Osyn-5' (SEC ID Nº: 11), 50 pmol de Osyn-O3' (SEC ID Nº: 15) y 10 \mul de la reacción de PCR de la etapa 1 como molde. La reacción se incubó a 94ºC durante 120 segundos, después se amplificó con 18 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 60 segundos, seguido de incubación a 72ºC durante 5 minutos.

Después, el producto de PCR Osyn-5'/Osyn-03' (2A/2B) se aisló en gel y se digirió con Eco RI + Bam HI. El producto digerido se ligó en un vector pKRR826 digerido con Eco RI + Bam HI. El producto de ligación se usó a continuación para transformar células competentes DH5\alpha. Se preparó un cultivo de una noche de clon candidato de pGO-9PL 3 y se preparó un ADN de minipreparación. El inserto plasmídico Osyn-5'/Osyn-03' se secuenció con los siguientes oligonucleótidos como cebadores: pKRREcoRI directo (SEC ID Nº: 38), pKRRBamHI inverso (SEC ID Nº: 39), 41sy-1C (SEC ID Nº: 40) y 41sy-2 (SEC ID Nº: 41), 41sy-3 (SEC ID Nº: 42) y 41sly-4 (SEC ID Nº: 23). Después, el clon de pGO-9PL nº 3 se volvió a sembrar en estrías para el aislamiento. Se escogió una colonia aislada, se cultivó un cultivo de una noche de la misma y se preparó una reserva congelada (0,5 ml de glicerol + 0,5 ml de cultivo de una noche). La reserva se almacenó a -80ºC. La secuencia se confirmó usando los cebadores indicados anteriormente en este documento y este clon se denominó pGO-9PL/DH5\alpha (la SEC ID Nº: 47 presenta la secuencia de nucleótidos de la región codificante y la SEC ID Nº: 48 presenta la secuencia de aminoácidos de la región codificante). El pGO-9PL/DH5\alpha se volvió a sembrar en estrías, se cultivó un cultivo de una noche y se preparó el ADN de minipreparación (esta preparación se denominó H5).

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G. Construcción de pGO-9CKS/XL1

Las Figuras 3A a 3D muestran una representación esquemática de las etapas implicadas en la construcción de pGO-9CKS/XL1. El pGO-9CKS/XL1 codifica la proteína recombinante pGO-9CKS. La Figura 8 presenta la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGO-9CKS (SEC ID Nº: 50). Esta proteína consiste en 246 aminoácidos de CKS y polienlazador seguidos de 45 aminoácidos de env gp120 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112) y 199 aminoácidos de env gp41 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112). La construcción de pGO-9CKS/XL1 se consiguió de la forma siguiente.

Se prepararon dos reacciones de PCR (volumen de 100 \mul) con ADN polimerasa UITma (3 U) y tampón 1X junto con MgCl_{2} 1,5 mM, 40 \muM de cada dNTP, 50 pmol de Osyn-5'CKS (SEC ID Nº: 25), 50 pmol de Osyn-O3' (SEC ID Nº: 15) y 1 ng de ADN de minipreparación de clon candidato de pGO-9PL 3 (obtenido del Ejemplo 3, Sección F, anteriormente en este documento). Cada reacción se incubó a 94ºC durante 120 segundos, después se amplificó con 24 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 120 segundos, seguido de incubación a 72ºC durante 5 minutos. Después, el producto de PCR Osyn-5'CKS/Osyn-03' se aisló en gel. El producto de PCR Osyn-5'CKS/Osyn-03' y el vector pJO200 se digirieron con Eco RI + Bam HI. El vector pJO200 digerido se aisló en gel y se ligó con el producto de PCR Osyn-5'CKS/Osyn-O3' digerido. Se transformaron células supercompetentes XL1-Blue con la ligación y se sembraron en placas de LB + ampicilina suplementadas con glucosa 20 mM. Las colonias se volvieron a sembrar en estrías para el aislamiento sobre el mismo tipo de placas. Un cultivo de una noche de clon candidato de pGO-9CKS 4 se cultivó en caldo LB + carbenicilina 100 mg/ml (Sigma Chemical Co.) + glucosa 20 mM (Sigma Chemical Co.). Se prepararon reservas congeladas (0,5 ml de cultivo de una noche + 0,5 ml de glicerol) y se preparó ADN para análisis de secuencia. Se usaron los siguientes oligonucleótidos como cebadores de secuenciación: CKS-1 (SEC ID Nº: 30), CKS-2 (SEC ID Nº: 31), CKS-3 (SEC ID Nº: 32), CKS-4 (SEC ID Nº: 33), 43461 (SEC ID Nº: 2), 43285 (SEC ID Nº: 1), 41sy-1B (SEC ID Nº: 29), 41sy-2B (SEC ID Nº: 34), 41sy-3B (SEC ID Nº: 35), CKS176.1 (SEC ID Nº: 19), CKS3583 (SEC ID Nº: 20) y pTB-S8 (SEC ID Nº: 28). El clon candidato de pGO-9CKS 4 se denominó pGO-9CKS/XL1 (la SEC ID Nº: 49 presenta la secuencia de nucleótidos de la región codificante y la SEC ID Nº: 50 presenta la secuencia de aminoácidos de la región codificante).

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H. Construcción de fragmento Osyn I-M

El fragmento Osyn-O-M se construyó de la forma siguiente. Se preparó una reacción de PCR de 100 \mul usando ADN polimerasa AmpliTaq (2,5 U), tampón 1X, 50 \muM de cada dNTP, 50 pmol de I-PCR (SEC ID Nº: 26), 50 pmol de Osyn-M (SEC ID Nº: 14) y 10 ng de fragmento de PCR aislado en gel 3A (Ejemplo 3, Sección A, anteriormente en este documento). La reacción se incubó a 95ºC durante 105 segundos y después se amplificó con 15 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 60 segundos y después se mantuvo a 72ºC durante 7 minutos. El producto, denominado Osyn I-M se aisló en gel y se clonó en el vector PCR II (TA Cloning Kit; Invitrogen, San Diego, CA) siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante. El producto de ligación resultante se usó para transformar células competentes DH5\alpha. Se generó ADN de minipreparación plasmídica a partir de un cultivo de una noche del clon IM-6 y el insertó génico se secuenció con los oligonucleótidos 56759 (SECUENCIA ID Nº: 45) y 55848 (SEC ID Nº: 46).

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I. Síntesis y ligación de fragmentos de PCR I/6R e IM-6F

Estos procedimientos se realizaron de la forma siguiente.

Etapa 1: se prepararon las siguientes reacciones de PCR (volumen de 100 \mul): (a) I/6R con ADN polimerasa AmpliTaq (2,5 U), tampón 1X, 50 \muM de cada dNTP, 50 pmol de I-PCR (SEC ID Nº: 26), 50 pmol de IM-6R (SEC ID Nº: 22) y 281 ng de clon IM-6 (obtenido del Ejemplo 3, Sección H) como molde; (b) 6F/M con ADN polimerasa AmpliTaq (2,5 U), tampón 1X, 50 \muM de cada dNTP, 50 pmol de IM-6F (SEC ID Nº: 21), 50 pmol de M-PCR (SEC ID Nº: 27) y 281 ng de clon IM-6 (obtenido del Ejemplo 3, Sección H) como molde.

Las reacciones se incubaron a 95ºC durante 105 segundos y después se amplificaron con 20 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 60 segundos, después se incubaron a 72ºC durante 7 minutos. Los productos de PCR I/6R y 6F/M a continuación se aislaron en gel siguiendo los procedimientos que se han descrito anteriormente en este documento.

Etapa 2: Se preparó una reacción de PCR (volumen de 100 \mul) con ADN polimerasa UITma (3 U) y tampón 1X junto con MgCl_{2} 1,5 mM, 40 \muM de cada dNTP, 50 pmol de I-PCR (SEC ID Nº: 26), 50 pmol de M-PCR (SEC ID Nº: 27), -50 ng de I/6R y \sim20 ng de 6F/M. La reacción se incubó a 95ºC durante 105 segundos y después se amplificó con 20 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 60 segundos, seguido de incubación a 72ºC durante 7 minutos. El producto de PCR se procesó en una columna Centri-sep (Princeton Separations) siguiendo las instrucciones del fabricante.

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J. Construcción de pGO-11PL/DH5\alpha

Las Figuras 4A a 4F muestran una representación esquemática de las etapas implicadas en la construcción de pGO-11PL/DH5\alpha. pGO-11PL/DH5\alpha codifica la proteína recombinante pGO-11PL. La Figura 9 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGO-11PL (SEC ID Nº: 52). Esta proteína consiste en una metionina N-terminal, 45 aminoácidos de env gp120 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112) y 327 aminoácidos de env gp41 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112). El pGO-9PL/DH5\alpha se construyó de la forma siguiente.

El producto de PCR final del Ejemplo 3, Sección I y el vector pGO-9PL (minipreparación H5 del Ejemplo 3, Sección F) se digirieron secuencialmente con Age I y Bam HI. El pGO-9PL digerido se trató después con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (fosfatasa CIA) (BRL Life Technologies) durante 15 minutos a 37ºC, se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con NaOAc y EtOH. El vector (pGO-9PL) se aisló en gel posteriormente. El pGO-9PL digerido y el producto de PCR digerido se ligaron y el producto de ligación se usó para transformar células competentes de DH5\alpha. Las colonias se volvieron a sembrar en estrías para el aislamiento. Después se identificó el clon pGO11-4 y se volvió a sembrar en estrías para el aislamiento. Se preparó un cultivo de una noche de pGO11-4 para generar reservas congeladas y obtener ADN de minipreparaciones para secuenciación. Se secuenció el clon de pGO11-4 con los siguientes cebadores oligonucleotídicos: pKRREcoRI directo (SEC ID Nº: 38), pKRRBamHI inverso (SEC ID Nº: 39), 41sy-1C (SEC ID Nº: 40) y 41sy-2 (SEC ID Nº: 41), 41sy-3 (SEC ID Nº: 42) y 41sy-4 (SEC ID Nº: 23), 41sy-5B (SEC ID Nº: 43), 41sy-5C (SEC ID Nº: 36) y 41sy-6B (SEC ID Nº: 37). En base a los resultados de secuenciación, este clon se denominó pGO-11PL/DH5\alpha (la SEC ID Nº: 51 presenta la secuencia de nucleótidos de la región codificante y la SEC ID Nº: 52 presenta la secuencia de aminoácidos de la región codificante).

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K. Construcción de pGO-11CKS/XL1

Las Figuras 4A a 3G muestran una representación esquemática de las etapas implicadas en la construcción de pGO-11CKS/XL1. El pGO-11CKS/XL1 codifica la proteína recombinante pGO-11CKS. La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGO-11CKS (SEC ID Nº: 54). Esta proteína consiste en 246 aminoácidos de CKS y polienlazador seguido de 45 aminoácidos de env gp120 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112) y 327 aminoácidos de env gp41 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112). El pGO-11CKS/XL1 se construyó de la forma siguiente.

Se preparó una reacción de PCR (volumen de 100 \mul) con ADN polimerasa UITma (3 U) y tampón 1X junto con MgCl_{2} 1,5 mM, 40 \muM de cada dNTP, 50 pmol de Osyn-5'CKS (SEC ID Nº: 25), 50 pmol Osyn-M (SEC ID Nº: 14) y 1 ng de pG011-4 (obtenido del Ejemplo 3, Sección J) como molde. La reacción se incubó a 94ºC durante 105 segundos y después se amplificó con 20 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 120 segundos, seguido de incubación a 72ºC durante 7 minutos. El producto de PCR Osyn-5'CKS/Osyn-M se aisló en gel. A continuación, el producto de PCR Osyn-5'CKS/Osyn-M y el vector pJO200 se digirieron con Eco RI + Bam HI. El vector pJO200 digerido se aisló en gel. Se prepararon ligaciones de una noche (16ºC) con el producto de PCR digerido. Se transformaron células supercompetentes XL1-Blue con la ligación y se sembraron en placas de LB + ampicilina suplementadas con glucosa 20 mM. Las colonias se volvieron a sembrar en estrías para el aislamiento sobre las mismas placas. Se preparó un cultivo de una noche (medio LB + carbenicilina 100 \mug/ml + glucosa 20 mM) de clon candidato de clon pGO-11CKS 2. Se prepararon reservas congeladas (0,5 ml de glicerol al 80% + 0,5 ml de cultivo de una noche) así como ADN de minipreparación para la secuenciación. Se usaron los siguientes oligonucleótidos como cebadores para el análisis de secuencia: CKS-1 (SEC ID Nº: 30), CKS-2 (SEC ID Nº: 31), CKS-3 (SEC ID Nº: 32), CKS-4 (SEC ID Nº: 33), 43461 (SEC ID Nº: 2), 43285 (SEC ID Nº: 1), 41sy-1B (SEC ID Nº: 29), 41sy-2B (SEC ID Nº: 34), 41sy-3B (SEC ID Nº: 35), 41ys-4 (SEC ID Nº: 23), 41sy-5C (SEC ID Nº: 36), 41sy-6B (SEC ID Nº: 37), CKS176.1 (SEC ID Nº: 19), CKS3583 (SEC ID Nº: 20) y pTB-S8 (SEC ID Nº: 28). El clon de pGO-11CKS nº 2 se denominó pGO-11CKS/XL1. La SEC ID Nº: 53 presenta la secuencia de nucleótidos de la región codificante de pGO-11CKS/XL1 y la SEC ID Nº: 54 presenta la secuencia de aminoácidos de la región codificante de pGO-11CKS/XL1.

Ejemplo 4 Construcción de pHIV210/XL1-Blue

La Figura 11 presenta la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pHIV-210 (SEC ID Nº: 55). Esta proteína consiste en 247 aminoácidos de secuencias CKS/enlazadoras, 60 aminoácidos de env gp120 (nº 432-491; aislado del VIH-2 D194.10) y 159 aminoácidos de env gp36 (nº 492-650; aislado del VIH-2 D194.10). La construcción de pHIV210/XL1-Blue se consiguió de la forma siguiente.

El ADN genómico del aislado del VIH-2 D194.10 [H. Kuhnel et al., Nucleic Acids Research 18: 6142 (1990)] se clonó en el vector de clonación lambda EMBL3. Véase H. Kuhnel et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86: 2383-2387 (1989), y H. Kuhnel et al., Nucleic Acids Research 18: 6142 (1990), incorporados en este documento como referencia. El clon lambda que contiene D194.10 (lambda A10) se obtuvo en Diagen Corporation (Düsseldorf, Alemania). Se preparó una reacción de PCR (volumen de 100 \mul) usando ADN polimerasa AmpliTaq (3,75 unidades), 200 \muM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 0,5 \mug de cebador 3634 (SEC ID Nº: 88; hibridación en posiciones 7437-7455 sobre el aislado del VIH-2 D194.10 (nº de acceso del EMBL X55553), 0,5 \mug de cebador 3636 (SEC ID Nº: 89, hibridación en posiciones 8095-8077), tampón de PCR 1X y 5 \mul del ADN de A10 lambda diluido 1:50. La reacción se incubó 5 minutos a 94ºC, después se amplificó con 35 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 45ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 2 minutos; seguido de una incubación a 72ºC durante 5 minutos. La reacción de PCR se extrajo con fenol/cloroformo (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN) y el ADN se precipitó con etanol (AAPER Alcohol & Chemical Company, Shelbville, KY). El ADN se digirió con Eco RI + Bam HI y se purificó en gel sobre un gel de agarosa al 1,5% (SeaJem GTG agarose, FMC Corporation, Rockland, Maine). El producto purificado se ligó en vector pJO200 digerido con Eco RI + Bam HI usando 800 unidades de ADN ligasa T4 (New England BioLabs). Las células supercompetentes XL1-Blue (Stratagene) se transformaron con 2 \mul de la ligación como se describe por el fabricante y se sembraron en placas de LB suplementadas con ampicilina (Sigma Chemical Company). Se establecieron cultivos de una noche por inoculación de colonias individuales en medio Superbroth II (GIBCO BRL, Grand Island, NY) suplementado con ampicilina 50 \mug/ml (Sigma) y glucosa 20 mM (Sigma). Se establecieron reservas congeladas por adición de 0,3 ml de glicerol al 80% hasta 0,7 ml de cultivo de una noche. Después de mezclar las reservas se congelaron a -70ºC. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los cultivos de una noche usando el método de lisis alcalina seguido de precipitación con PEG. Se realizaron reacciones de secuencia con un kit reactivo 7-deaza-dGTP con Sequenase Version 2.0 (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH) como se describe por el fabricante. Las reacciones se procesaron en geles de acrilamida al 6% (GIBCO BRL Gel-Mix 6) usando el aparato de gel IBI según recomienda el fabricante. En base a los resultados de secuenciación, el clon de pHIV-210 nº 7 se denominó pHIV-210. La secuencia de aminoácidos de la región codificante del pHIV-210 se presenta como SEC ID Nº: 55.

Ejemplo 5 Cultivo e inducción de cepas de E. coli con construcción de antígeno gp41 recombinante del VIH-1 Grupo O

Se prepararon cultivos sembrados durante una noche de pGO-9CKS/XL1 y pGO-11CKS/XL1 en 500 ml de caldo Excell Terrific estéril (disponible en Sigma Chemical Corp., St. Louis Mo.) suplementado con ampicilina sódica 100 \mug/ml y se colocaron en un incubador con agitación orbital a 32ºC ó 37ºC. Se transfirieron inóculos de cien mililitros (100 \mul) de los cultivos sembrados a matraces que contenían 1 litro de caldo Excell Terrific estéril suplementado con ampicilina sódica 100 \mug/ml. Los cultivos se incubaron a 37ºC hasta que el cultivo o cultivos alcanzaron un crecimiento semilogarítmico y después se indujeron con ITPG 1 mM (isopropiltiogalactósido) durante 3 horas a 37ºC. (En el caso de construcciones de vector PL, los cultivos se incubaron a 32ºC hasta que el cultivo o cultivos alcanzaron un crecimiento semilogarítmico y después se indujeron durante 3 horas por cambio de la temperatura del cultivo o cultivos a 42ºC). Después del periodo de inducción, las células se sedimentaron por centrifugación y se recogieron siguiendo procedimientos convencionales. Las células sedimentadas se almacenaron a -70ºC hasta que se procesaron adicionalmente.

Ejemplo 6 Aislamiento y solubilización de antígeno gp41 recombinante del VIH-1 Grupo O producido como cuerpos de inclusión insolubles en E. coli

Células congeladas obtenidas del Ejemplo 5 se resuspendieron por homogeneización en tampón de lisis frío que comprendía Tris 50 mM pH 8, Na EDTA 10 mM, NaCl 150 mM, sacarosa al 8% (p/v), Triton X-100® al 5% (v/v), PMSF 1 mM y pepstatina A 1 \muM. Se añadió lisozima a los homogeneizados a una concentración de 1,3 mg por gramo de células procesadas y la mezcla resultante se incubó durante 30 minutos en hielo para lisar las células. Se separaron los cuerpos de inclusión de las proteínas solubles por centrifugación. Estos cuerpos de inclusión sedimentados se lavaron y se sedimentaron secuencialmente en (1) tampón de lisis; (2) Na EDTA 10 mM pH 8, sacarosa al 30% (p/v); y (3) agua. Los cuerpos de inclusión lavados se resuspendieron en Tris 50 mM pH 8, Na EDTA 10 mM, NaCl 150 mM y urea 3 M y se incubaron en hielo durante 1 hora. Los cuerpos de inclusión se separaron después de las proteínas solubilizadas por centrifugación. Los cuerpos de inclusión sedimentados se solubilizaron completamente en guanidina-HCl 7 M, Tris 50 mM pH 8, beta-mercaptoetanol (BME) al 0,1% (v/v) durante una noche a 4ºC. Los antígenos recombinantes solubilizados se aclararon por centrifugación, se pasaron a través de un filtro de 0,2 \mum y se almacenaron a -20ºC hasta purificarse por cromatografía.

Ejemplo 7 Purificación de antígeno gp41 recombinante del VIH-1 Grupo O por cromatografía

Se purificaron antígenos gp41 recombinantes del VIH-1 Grupo O solubilizados obtenidos del Ejemplo 6 mediante un método de dos etapas de la forma siguiente. Los extractos de guanidina-HCl de antígenos insolubles se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaños en una columna Sephacryl S-300 equilibrada con Tris 50 mM, pH 8, urea 8 M y BME al 0,1% (v/v). Se usó electroforesis en SDS-poliacrilamida para analizar las fracciones. Las fracciones que contenían el antígeno gp41 recombinante se combinaron y después se concentraron por ultrafiltración. El concentrado de antígeno recombinante se trató con SDS al 4% (p/v) y BME al 5% (p/v) a temperatura ambiente durante 3 horas. El antígeno tratado con SDS se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaños en una columna Sephacryl S-300 equilibrada con Tris 25 mM pH8, NaCl 0,15 M, BME al 0,1% (v/v), SDS al 0,1% (p/v). Se usó electroforesis en SDS-poliacrilamida para analizar las fracciones. Las fracciones que contenían antígeno recombinante purificado se combinaron, se pasaron a través de un filtro de 0,2 \mum y se almacenaron a -70ºC.

Ejemplo 8 Preparación de antígeno de VIH-1 Grupo M

Se cultivaron células que contenían el plásmido pTB319 y se indujeron como se ha descrito en el Ejemplo 5. Las células se lisaron y se procesaron los cuerpos de inclusión esencialmente como se describe en el Ejemplo 5 de la patente de Estados Unidos nº 5.124.255, incorporada en este documento como referencia. El material sedimentado se solubilizó posteriormente en SDS, fosfato, pH 6,8 y después se sometió a cromatografía en una columna S-300.

Ejemplo 9 Preparación de antígeno de VIH-2

Se cultivaron células pHIV-210/XL1-Blue (Ejemplo 4, anteriormente en este documento) y se indujeron como se describe en el Ejemplo 5. Las células se lisaron con un tampón que contenía fosfato, MgCl_{2}, Na EDTA, Triton X-100® a pH 7,4 suplementado con benzonasa, lisozima y PMSF. Se separaron los cuerpos de inclusión de las proteínas solubles por centrifugación. El sedimento se lavó secuencialmente con: H_{2}O destilada; Triton X-100®, desoxicolato, NaCl, fosfato a pH 7,0; fosfato 50 mM, pH 7,0; urea, SDS en fosfato, pH 7,0 + BME. Las proteínas se solubilizaron en SDS, fosfato, pH 7,0 y BME y después se sometieron a cromatografía en una columna S300.

Ejemplo 10 Ensayo inmunocromatográfico de una etapa para la detección y diferenciación simultánea de VIH-1 Grupo M, VIH-1 Grupo O y VIH-2 A. Preparación de reactivo

1. Se preparó una suspensión coloidal de selenio (Se) sustancialmente la forma siguiente: se disolvió SeO_{2} en agua a una concentración de 0,0625 g/ml. Después se disolvió ascorbato en agua hasta una concentración de 0,32 g/ml y se calentó en un baño de agua a 70ºC durante 24 horas. La solución de ascorbato se diluyó después a 0,0065 g/ml en agua. La solución de SeO_{2} se añadió rápidamente a la solución de ascorbato diluido y se incubó a 42ºC. La incubación se terminó después de un mínimo de 42 horas cuando la absorbancia máxima superaba 30 a una longitud de onda entre 542 nm y 588 nm. La suspensión coloidal se enfrió a 2-8ºC, después se almacenó. Está disponible una suspensión coloidal de selenio en Abbot Laboratories, Abbot Park, Illinois (Código 25001).

2. Se prepararon conjugados de coloide de selenio/anticuerpo de la forma siguiente. La suspensión coloidal de selenio se concentró a una absorbancia de 25 (DO 500-570) en agua destilada. Después, se añadió MOPS 1 M hasta una concentración final de 10 mM pH 7,2. Se diluyeron anticuerpos de cabra específicos para la región Fc de IgG humana (u otras especies de anticuerpo específicas para la región Fc de IgG humana) a una concentración de 0,75 mg/ml con tampón fosfato 50 mM y la preparación de anticuerpo resultante se añadió después con mezcla a la suspensión coloidal de selenio preparada como se ha descrito anteriormente en este documento a una concentración de anticuerpo final de 75 \mug/ml. Se continuó agitando durante 40 minutos. Después, se añadió albúmina de suero bovino (BSA) al 1% (en peso) a la solución y la solución de conjugado de coloide de selenio/anticuerpo se agitó durante 15 minutos adicionales y se centrifugó a 5000 x g durante 90 minutos. Después de esto, se eliminó el 90% del sobrenadante y el sedimento se resuspendió con el sobrenadante restante. Inmediatamente antes de recubrir este conjugado de selenio-IgG en una almohadilla de fibra de vidrio, se diluyó 1:10 con diluyente conjugado (Caseína al 1% [en peso], Triton X-405® al 0,1% [en peso] y Tris 50 mM, pH 8,2).

3. Se preparó reactivo de control del procedimiento como una mezcla de sueros positivos a VIH-1 (grupo M), VIH-1 (grupo O) y VIH-2 y se utilizó en un dispositivo de tiras separadas como un control positivo del ensayo.

4. El reactivo de control negativo usado era humano normal utilizado en un dispositivo de ensayo separado como control negativo del ensayo.

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B. Preparación de almohadilla de aplicación

El material de almohadilla de aplicación comprende papel de fibra de vidrio unido a resina (Lydall). Se aplicaron aproximadamente 0,1 ml del conjugado preparado (descrito en el párrafo 2anterior) en la almohadilla de aplicación.

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C. Preparación de material cromatográfico

Todos los reactivos se aplican a una membrana de nitrocelulosa por carga y desviación de chorro de reactivo. La nitrocelulosa está soportada por una membrana MYLAR® que se recubre con un adhesivo sensible a presión.

Los reactivos de captura de muestra de ensayo se prepararon mediante (a) dilución del antígeno especifico preparado como se ha descrito anteriormente en este documento a una concentración de 0,5 mg/ml en diluyente de chorro (Tris 100 mM, pH 7,6 con sacarosa al 1% (en peso), NaCl al 0,9% y fluoresceína 5 \mug/ml) para el reactivo de captura del VIH-1 grupo O (pGO-9/CKS, SEC ID Nº: 50), (b) para reactivo de captura del VIH-1 grupo M subgrupo B (pTB319, SEC ID Nº: 56) y (c) para reactivo de captura del VIH-2 (pHIV-210, SEC ID Nº: 55). Se aplicaron 0,098 \mul de un primer reactivo de captura (reactivo del VIH-1 grupo M subgrupo B; SEC ID Nº: 56) a la tira en la localización de captura designada y se constituyó un sitio de captura de un paciente. Así mismo, se aplicaron 0,098 \mul de un segundo reactivo de captura (reactivo del VIH-1 grupo O; SEC ID Nº: 50) a la tira en la localización de captura designada y se constituyó un sitio de captura de paciente y se aplicaron 0,098 \mul de un tercer reactivo de captura (reactivo del VIH-2; SEC ID Nº:
55) en la tira a la localización en la localización de captura designada y constituyeron un sitio de captura de paciente.

D. Ensayo rápido para la presencia de anticuerpos contra VIH

Se realizó un ensayo rápido para determinar la presencia de anticuerpos contra VIH en suero de muestras de ensayo, sangre completa, saliva y muestras de orina de la forma siguiente. En un tubo Eppendorf de 1,5 ml, se mezclaron 5 \mul de suero y 600 \mul de tampón de elución de muestra (SEB) (que contenía Tris 50 mM, BSA al 1% (p/v), Triton X-405® al 0,4% (v/v), Caseína al 1,5% (p/v), IgG bovina al 3% (p/v), lisado de E. coli al 4% (v/v), [pH 8,2]). Se aplicaron cuatro gotas de esta mezcla al pocillo de muestra del alojamiento STAR. A continuación, se añadieron 1 \mul de suero o sangre completa a 100 \mul de SEB en un pocillo de una placa de microtitulación y la tira de nitrocelulosa se añadió en el pocillo. Después de esto, se aplicaron puntualmente 1 \mul de suero o sangre completa en el dispositivo de ensayo del pocillo de muestra de la invención directamente y se añadieron 4 gotas de SEB. Cuando se ensayaba saliva, se añadieron 50 ó 75 \mul de saliva a 50 \mul ó 25 \mul de SEB, respectivamente, en un pocillo de una placa de microtitulación y después la tira de ensayo de nitrocelulosa se añadió al pocillo. Cuando se ensayaba orina, se añadieron 50 \mul de orina a 50 \mul de SEB en un pocillo de una placa de microtitulación y se añadió la tira de ensayo de nitrocelulosa al pocillo. Como alternativa, se usaron 100 \mul de orina en el pocillo de una placa de microtitulación y la tira de ensayo de nitrocelulosa se añadió sin usar SEB.

La IgG en la muestra se unió por el coloide de selenio-cabra anti-IgG humana en la almohadilla de conjugado y los complejos se sometieron a cromatografía a lo largo de la longitud de las tiras de ensayo de membrana de nitrocelulosa sobre las que se habían aplicado previamente los tres antígenos recombinantes pGO-9CKS (SEC ID Nº: 50), pTB319 (VIH-1 grupo M (subgrupo B), SEC ID Nº: 56) y pHIV210 (VIH-2, SEC ID Nº: 55) a una concentración de 1 mg/ml usando una máquina biodot, que proporcionaba un dispensación por desplazamiento positivo usando tamaños de gota precisos. El dispositivo de ensayo se incubó después a temperatura ambiente durante dos minutos y los resultados se leyeron visualmente.

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E. Ensayo con adición de sangre completa

En un tubo Eppendorf de 1,5 ml, se añadió el equivalente de 1 \mul de sangre de muestras de ensayo de sangre completa de VIH-1 grupo O o VIH-1 grupo M o VIH-2 positivas confirmadas o de VIH-1 grupo O o VIH-1 grupo M o VIH-2 negativas confirmadas a 5 \mul de un suero de VIH-1 grupo O o VIH-1 grupo M o VIH-2 negativo confirmado junto con 100 \mul de SEB y se mezclaron. La mezcla se aplicó al pocillo de muestra del dispositivo de ensayo de la invención.

La IgG en la muestra se unió por el coloide de selenio-cabra anti-IgG humana en la almohadilla de conjugado y los complejos se sometieron a cromatografía a lo largo de la longitud de las tiras de ensayo de membrana de nitrocelulosa sobre las que se habían aplicado previamente los tres antígenos recombinantes pGO-9CKS (SEC ID Nº: 50), pTB319 (VIH-1 grupo M (subgrupo B), SEC ID Nº: 56) y pHIV210 (VIH-2, SEC ID Nº: 55) a una concentración de 1 mg/ml usando una máquina biodot, que proporcionaba un dispensación por desplazamiento positivo usando tamaños de gota precisos. El dispositivo de ensayo se incubó después a temperatura ambiente durante dos minutos y los resultados se leyeron visualmente.

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F. Resultados

Si estaba presente anticuerpo contra antígeno 1 en la muestra de ensayo, una reacción visible se indicaba en el área de la zona de captura del antígeno 1 y en la zona de terminación del ensayo y no en las zonas del antígeno 2 o del antígeno 3. Si estaba presente anticuerpo contra antígeno 2 en la muestra de ensayo, se indicaba una reacción visible en el área de la zona de captura del antígeno 2 y en la zona de terminación del ensayo y no en las zonas del antígeno 1 o del antígeno 3. Si estaba presente anticuerpo contra antígeno 3 en la muestra de ensayo, se indicaba una reacción visible en el área de la zona de captura del antígeno 3 y en la zona de terminación del ensayo y no en las zonas del antígeno 1 o antígeno 2. Además, un control negativo debía no ser reactivo (no mostrar reacción visible) en las zonas del antígeno 1, antígeno 2 y antígeno 3 pero debía ser reactivo en la zona de terminación del ensayo. Un control positivo (anticuerpo reactivo conocido contra antígeno 1, 2 y/o 3) debía ser reactivo en la zona del antígeno apropiado al que se une específicamente en una reacción de antígeno/anticuerpo. Un resultado se consideraba inválido cuando se producía una reacción positiva en una de las zonas de captura de antígeno pero no en la zona de terminación del ensayo y se repetía el ensayo.

(i) Ensayo para anticuerpos en sangre, orina y saliva. Se ensayó la sangre, orina y saliva de tres pacientes (identificados mediante los números de paciente 0109, 4068 y 4475) sobre dispositivos en fase sólida de nitrocelulosa de la invención como se describen en este documento y siguiendo el protocolo de ensayo que se ha expuesto anteriormente en este documento. Cada muestra de ensayo de sangre y orina de cada paciente 0109, 4068 y 4475 era reactiva con el antígeno 1 (pTB1319; SEC ID Nº: 56). La muestra de ensayo de saliva de los pacientes 4068 y 4475 también era reactiva con el antígeno 1 mientras que la muestra de ensayo de saliva del paciente 0109 no era reactiva en el dispositivo de ensayo de la invención. La muestra de ensayo de saliva del paciente 0109 se volvió a ensayar más tarde mediante un EIA convencional y se confirmó que no era reactiva para los anticuerpos contra gp41 del VIH-1 indicando que los resultados obtenidos para la muestra de ensayo de saliva del paciente 0109 eran válidos.

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(ii) Ensayo de muestras negativas para anticuerpos de VIH. Se ensayaron dos sueros negativos y dos muestras de ensayo de sangre completa negativas, cada una con adiciones de los mismos dos sueros negativos. Las muestras no contenían anticuerpos específicos para los antígenos pertinentes y las muestras de ensayo eran negativas después del ensayo sobre la prueba (es decir, sin reactividad, como indicaba la ausencia de barras visibles que signifiquen una reacción en cualquier posición O, M ó 2). Estaba presente muestra de ensayo en cada dispositivo de ensayo, como indicaba una barra de reacción positiva en la zona de reactividad de muestra de ensayo.

(iii) Ensayo para anticuerpo del VIH-1 Grupo M. Se ensayaron cinco sueros de VIH-1 Grupo M y cinco muestras de sangre completa con adiciones de los sueros positivos a VIH-1 Grupo M usando diez dispositivos. Se observó que las muestras de VIH-1 Grupo M contenían anticuerpos específicos para el antígeno del VIH-1 Grupo M (pTB319) como se mostraba por el desarrollo de una línea de reacción en la zona de antígeno del VIH-1 Grupo M y líneas de reacción visibles podían observarse en la zona de terminación del ensayo de nueve de los 10 dispositivos de ensayo. Aunque está presente una banda en un dispositivo de ensayo particular en la zona de captura para el anticuerpo de VIH-1 Grupo M, la muestra de ensayo no alcanzó la zona de terminación del ensayo y, por lo tanto, el ensayo tuvo que repetirse para esta muestra particular. No se observó reactividad cruzada con los reactivos de captura para VIH Grupo O y VIH-2.

(iv) Ensayo para anticuerpos de VIH-1 Grupo O. Se ensayaron dos sueros positivos confirmados de VIH-1 Grupo O y dos muestras de ensayo de sangre completa con adiciones de sueros de VIH-1 Grupo O usando cuatro dispositivos adicionales. Se descubrió que las muestras de VIH-1 Grupo O contenían anticuerpos específicos para antígeno de VIH-1 Grupo O como indicaba un resultado de barra positiva en el área de la zona de captura de antígeno VIH-1 Grupo O con líneas de reacción visibles en la zona de terminación del ensayo de cada dispositivo. No se observó reacción cruzada con antígenos de captura de VIH-1 Grupo M o VIH-2 (no barras visibles).

(v) Ensayo para anticuerpos de VIH-2. Se usaron diez dispositivos de ensayo adicionales para ensayar cinco sueros positivos confirmados de VIH-2 y sangre completa con adición de cinco sueros de VIH-2. Las muestras de VIH-2 se descubrió que contenía anticuerpos específicos para antígeno de VIH-2 (pHIV210) como se muestra por barras de reacción en la zona de antígeno de VIH-2. No se observó reacción entre estas muestras de ensayo y los antígenos del VIH-1 Grupo O o VIH-M; se observaron líneas de reacción visibles en la zona de terminación del ensayo de cada dispositivo.

(vi) Ensayo de muestras de VIH-1 Grupo M, VIH-1 Grupo O, VIH-2 y negativas. Se usaron cuatro dispositivos finales para ensayar una muestra de ensayo positiva a VIH-1 Grupo M, una muestra de ensayo positiva a VIH-1 Grupo O y una muestra de ensayo positiva a VIH-2 y una muestra de control negativa. El suero de ensayo negativo no reaccionó con ningún antígeno en la zona de captura de antígeno; la muestra de ensayo positiva a VIH-1 Grupo M era reactiva solamente con antígeno de VIH-1 Grupo M; la muestra de ensayo positiva VIH-1 Grupo O era reactiva solamente con el antígeno del VIH-1 Grupo O; y la muestra de ensayo positiva VIH-2 era reactiva solamente con el antígeno de VIH-2. Se observaron líneas de reacción visibles en la zona de terminación del ensayo de cada dispositivo.

Las cinco muestras de ensayo de VIH-1 grupo M y las dos de VIH-1 Grupo O se confirmaron como muestras seropositivas que se habían ensayado previamente usando un inmunoensayo enzimático disponible en el mercado (Abbot Nº 3A77) y se habían amplificado por PCR, secuenciado y determinado su subtipo en base al análisis filogenético. Las cinco muestras de VIH-2 usadas eran seropositivas usando el mismo EIA y se confirmaron como muestras positivas a VIH-2 usando un ensayo de transferencia de Western de VIH-2 (Sanofi).

Ejemplo 11 Construcción de genes híbridos sintéticos de VIH-1 Grupo M y VIH-1 Grupo O A. Modificación de pTB318

El plásmido pTB319 (patente de Estados Unidos nº 5.124.255 incorporada en este documento como referencia) codifica una proteína recombinante gp41 truncada debido a una deleción de una base en el interior del gen sintético de gp41 de VIH-1 Grupo M que da como resultado un desplazamiento de la fase de lectura. Para facilitar la generación de construcciones de genes híbridos de VIH-1 Grupo M y Grupo O, se usó mutagénesis específica de sitio para eliminar el desplazamiento de la fase de lectura en el interior de la región codificante de gp41 en pTB319. Esto se consiguió digiriendo secuencialmente el plásmido pTB319 con las endonucleasas de restricción Rsr II y Bst XI. Los oligonucleótidos sintéticos pTB319+A (SEC ID Nº: 98) y pTB319+T (SEC ID Nº: 99) se hibridaron y ligaron en el pTB319 digerido con Rsr II y Bst XI. El producto de ligación se usó para transformar células XL1-Blue supercompetentes y las células se sembraron en placas de agar LB suplementado con ampicilina 150 \mug/ml. Se usó PCR de colonias para identificar correctamente los clones modificados usando las combinaciones de cebadores pTB-S4 (SEC ID Nº: 100)/pTB-S7 (SEC ID Nº: 101) y pTB-S4 (SECUENCIA ID Nº: 100)/63168 (SEC ID Nº: 121). Se establecieron cultivos de una noche para clones candidato en caldo LB suplementado con glucosa 3 mM y ampicilina 200 \mug/ml para la preparación de ADN de minipreparaciones. La región codificante completa se secuenció usando los cebadores oligonucleotídicos 43461 (SEC ID Nº: 2), 43285 (SEC ID Nº: 1), CKS-1 (SEC ID Nº: 30), CKS-3 (SEC ID Nº: 32), pTB-S1 (SEC ID Nº: 102), pTB-S2 (SEC ID Nº: 103), pTB-S3 (SEC ID Nº: 104), pTB-S4 (SEC ID Nº: 100), pTB-S5 (SEC ID Nº: 105), pTB-S6 (SEC ID Nº: 106), pTB-S7 (SEC ID Nº: 101), y pTB-S8 (SEC ID Nº: 28). En base a los resultados de secuenciación, el clon pTB319+A-Nº31 (pGMcks-1) tenía la secuencia de región codificante deseada. Este clon se designó posteriormente pGM-1CKS/XL1. (La SEC ID Nº: 107 presenta la secuencia de nucleótidos de la región codificante).
La Figura 12 presenta la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante pGM-1CKS (SEC ID Nº: 108).

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B. Construcción de pGO-12CKS/XL1

El pGO-12CKS/XL1 codifica la proteína recombinante pGO-12CKS cuya secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 91) se muestra en la Figura 13. Esta proteína consiste en 250 aminoácidos de CKS/polienlazador fusionado con 42 aminoácidos de env gp120 (VIH-1 Grupo M, aislado HXB2R), 200 aminoácidos de env gp41 (VIH-1 Grupo M, aislado HXB2R), 45 aminoácidos de env gp120 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112) y 199 aminoácidos de env gp41 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112). Se construyó pGO-12CKS/XL1 de la forma siguiente:

Se preparó una reacción de PCR (volumen de 100 \mul) con ADN polimerasa UITma (3 U) y tampón 1X junto con MgCl_{2} 1,5 mM, 40 \muM de cada dNTP, 50 pmol de pTB/O-5' (SEC ID Nº: 109), 50 pmol de pGO-9/Kpn (SEC ID Nº: 110) y 1 ng de ADN de pGO-9PL (minipreparación H5; obtenida del Ejemplo 3, Sección F anteriormente) como molde. La reacción se incubó a 94ºC durante 105 segundos, después se amplificó con 22 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 75 segundos, seguidos de incubación a 72ºC durante 5 minutos. El producto de PCR pTB/O-5'/pGO-9/Kpn se aisló en gel. El producto de PCR pTB/O-5'/pGO-9/Kpn y el plásmido pGM-1CKS (descrito en la Sección A anteriormente en este documento) se digirieron secuencialmente con Asp 718 (Boehringer Mannheim Biochemicals) y Bst XI. El vector digerido se trató después con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (Boehringer Mannheim Biochemicals), se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. El producto de PCR digerido se purificó en una columna Centri-Sep (Princeton Separations). El producto de PCR digerido se ligó en el vector pGM-1 CKS digerido y tratado con fosfatasa durante una noche a 16ºC. Se transformaron células supercompetentes XL1-Blue con el producto de ligación y se sembraron en placas de LB + ampicilina suplementadas con glucosa 20 mM. Las colonias se volvieron a sembrar en estrías para aislamiento en el mismo tipo de placas. Se preparó un cultivo de una noche (medio LB + carbenicilina 100 \mug/ml + glucosa 20 mM) del clon de pGO-12CKS clon nº 1. Se prepararon reservas congeladas (0,5 ml de glicerol al 80% + 0,5 ml de cultivo de una noche) y se preparó ADN de minipreparaciones para secuenciación. Se usaron los siguientes oligonucleótidos como cebadores para el análisis de secuencia: CKS-1 (SEC ID Nº: 30), CKS-2 (SEC ID Nº: 31), CKS-3 (SEC ID Nº: 32), CKS-4 (SEC ID Nº: 33), CKS176.1 (SEC ID Nº: 19), 3962 (SEC ID Nº: 111), 3965 (SEC ID Nº: 113), pTB-S2 (SEC ID Nº: 103), pTB-S3 (SEC ID Nº: 104), pTB-S4 (SEC ID Nº: 100), pTB-S5 (SEC ID Nº: 105), sy120-S1 (SEC ID Nº: 112), 41sy-1B (SEC ID Nº: 29), 41sy-2B (SEC ID Nº: 34), 41ys-4 (SEC ID Nº: 23), pTB-S8 (SEC ID Nº: 28). En base a los resultados del análisis de secuencia, el clon candidato de pGO-12CKS nº 1 se designó pGO-12CKS/XL1. (La SEC ID Nº: 90 presenta la secuencia de nucleótidos de la región codificante y la SEC ID Nº: 91 presenta la secuencia de aminoácidos codificada).

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C. Construcción de pGO-13CKS/XL1

El pGO-13CKS/XL1 codifica la proteína recombinante pGO-13CKS, cuya secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 93) se muestra en la Figura 14. Esta proteína consiste en 250 aminoácidos de CKS/polienlazador fusionado con 42 aminoácidos de env gp120 (VIH-1 Grupo M, aislado HXB2R), 200 aminoácidos de env gp41 (VIH-1 Grupo M, aislado HXB2R), 45 aminoácidos de env gp120 (aislado de VIH-1 Grupo O, HAM112) y 169 aminoácidos de env gp41 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112). El pGO-13CKS/XL1 se construyó de la forma siguiente:

Se preparó una reacción de PCR (volumen de 100 \mul) con ADN polimerasa UITma (3 U) y tampón 1X junto con MgCl_{2} 1,5 M, 40 \muM de cada dNTP, 50 pmol de pTB/O-5' (SEC ID Nº: 109), 50 pmol de pGO-8/Kpn (SEC ID Nº: 114) y 1 ng de ADN de pGO-9PL (minipreparación H5; obtenida del Ejemplo 3, Sección F, anteriormente en este documento) como molde. La reacción se incubó a 94ºC durante 105 segundos, después se amplificó con 22 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 75 segundos, seguido de incubación a 72ºC durante 5 minutos. El producto de PCR pTB/O-5'/pGO-8/Kpn se aisló en gel. El producto de PCR pTB/O-5'/pGO-8/Kpn y el plásmido pGM-1CKS (descrito en la Sección A anterior) se digirieron secuencialmente con Asp 718 (Boehringer Mannheim Biochemicals) y Bst XI. El vector digerido se trató después con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (Boehringer Mannheim Biochemicals), se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. El producto de PCR digerido se purificó en una columna Centri-Sep (Princeton Separations). El producto de PCR digerido se ligó en el vector pGM-1CKS digerido y tratado con fosfatasa durante una noche a 16ºC. Se transformaron células supercompetentes XL1-Blue con el producto de ligación y se sembraron en placas de LB + ampicilina suplementadas con glucosa 20 mM. Las colonias se volvieron a sembrar en estrías para el aislamiento en el mismo tipo de placas. Se preparó un cultivo de una noche (medio LB + carbenicilina 100 \mug/ml + glucosa 20 mM) de clon de pGO-13CKS clon nº 1. Se prepararon reservas congeladas (0,5 ml de glicerol al 80% + 0,5 ml de cultivo de una noche) y se preparó ADN de minipreparaciones para secuenciación. Se usaron los siguientes oligonucleótidos como cebadores para el análisis de secuencia: CKS-1 (SEC ID Nº: 30), CKS-2 (SEC ID Nº: 31), CKS-3 (SEC ID Nº: 32), CKS-4 (SEC ID Nº: 33), 43461 (SEC ID Nº: 2), 43285 (SEC ID Nº: 1), pTB-S1 (SEC ID Nº: 102), pTB-S2 (SEC ID Nº: 103), pTB-S3 (SEC ID Nº: 104), pTB-S4 (SEC ID Nº: 100), pTB-S5 (SEC ID Nº: 105), sy120-S1 (SEC ID Nº: 112), 41sy-1B (SEC ID Nº: 29), 41sy-2B (SEC ID Nº: 34), 41ys-4 (SEC ID Nº: 23), pTB-S8 (SEC ID Nº: 28). En base a los resultados del análisis de secuencia, el clon candidato de pGO-13CKS nº 1 se designó pGO-13CKS/XL1. (La SEC ID Nº: 92 presenta la secuencia de nucleótidos de la región codificante y la SEC ID Nº: 93 presenta la secuencia de aminoácidos codificada).

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D. Construcción de pGO-14PL/DH5\alpha

El pGO-14OL/DH5\alpha codifica la proteína recombinante pGO-14PL, cuya secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 95) se muestra en la Figura 15. Esta proteína consiste en una metionina N-terminal seguida de 45 aminoácidos de env gp120 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112), 200 aminoácidos de env gp41 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112), fusionados a 42 aminoácidos de env gp120 (VIH-1 Grupo M aislado HXB2R) y 200 aminoácidos de env gp41 (VIH-1 Grupo M, aislado HXB2R). El pGO-14OL/DH5\alpha se construyó de la forma siguiente:

Se preparó una reacción de PCR (volumen de 100 \mul) con ADN polimerasa UITma (3 U) y tampón 1X junto con MgCl_{2} 1,5 M, 40 \muM de cada dNTP, 50 pmol de pTB/Age5' (SEC ID Nº: 115), 50 pmol de pGOB-3' (SEC ID Nº: 116) y 1 ng de ADN de pGM-1CKS (minipreparación de pTB319+A-Nº31; obtenido de la Sección A anterior) como molde. La reacción se incubó a 95ºC durante 30 segundos, después se amplificó con 22 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 60 segundos, seguido de incubación a 72ºC durante 5 minutos. El producto de PCR pTB/Age5'/pGOB-3' se aisló en gel. El producto de PCR pTB/Age5'/pGOB-3' y el plásmido pGO-9PL (obtenido del Ejemplo 3, Sección F anteriormente en este documento) se digirieron secuencialmente con Age I y Bam HI. Después, el vector digerido se trató con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (Boehringer Mannheim Biochemicals), se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. El producto de PCR digerido se purificó en una columna Centri-Sep (Princeton Separations). El producto de PCR digerido se ligó en el vector pGM-1 CKS digerido y tratado con fosfatasa durante una noche a 16ºC. Se transformaron células competentes DH5\alpha con el producto de ligación y se sembraron en placas de LB + ampicilina (150 \mug/ml). Las colonias se analizaron para determinar la presencia del inserto apropiado mediante PCR de colonias usando los cebadores del vector pKRR EcoR1 directo (SEC ID Nº: 38) y pKRR BAMHI inverso (SEC ID Nº: 39). Las colonias que contenían los clones candidatos se volvieron a sembrar en estrías para aislamiento sobre el mismo tipo de placas. Se prepararon cultivos de una noche (medio LB +
carbenicilina 100 \mug/ml) para generar reservas congeladas y ADN de minipreparaciones. Se prepararon reservas congeladas (0,5 ml de glicerol al 80% + 0,5 ml de cultivo de una noche) y se preparó ADN de minipreparaciones para secuenciación. Se usaron los siguientes oligonucleótidos como cebadores para el análisis de secuencia: pTB-S1 (SEC ID Nº: 102), pTB-S2 (SEC ID Nº: 103), pTB-S3 (SEC ID Nº: 104), pTB-S4 (SEC ID Nº: 100), pTB-S5 (SEC ID Nº: 105), 41sy-1C (SEC ID Nº: 40), 41sy-2 (SEC ID Nº: 41), 41sy-3 (SEC ID Nº: 23), pkRREcoR1 directo (SEC ID Nº: 38), pKRRBamH1 inverso (SEC ID Nº: 39). En base a los resultados del análisis de secuencia, el clon candidato de pGO-14PL nº 11 se designó pGO-14OL/DH5\alpha. (La SEC ID Nº: 94 presenta la secuencia de nucleótidos de la región codificante y la SEC ID Nº: 95 presenta la secuencia de aminoácidos codificada).

Ejemplo 12 Construcción de un gen sintético de env gp120/gp41 de VIH-1 Grupo O con una segunda copia de la región inmunodominante (IDR) de gp41 fusionada al extremo C-terminal A. Construcción de pGO-15CKS/XL1

El pGO-15CKS/XL1 codifica la proteína recombinante pGO-15CKS cuya secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 97) se muestra en la Figura 16. Esta proteína consiste en 246 aminoácidos de CKS/polienlazador fusionado con 45 aminoácidos de env gp120 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112), 199 aminoácidos de env gp41 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112), seguido de un enlazador de 4 aminoácidos (Gly, Gly, Gly, Ser) y 32 aminoácidos que incluyen la región IDR de env gp41 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112). El pGO-15CKS/XL1 se construyó de la forma siguiente:

El plásmido pGO-11CKS propagado en células XL1-Blue (obtenido del Ejemplo 3, sección K) se digirió secuencialmente con Age I y Bam HI, se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. Los oligonucleótidos sintéticos synIDRNº2-A (SEC ID Nº: 117) y synIDRNº2-B (SEC ID Nº: 118) se trataron con quinasa de polinucleótidos (Boehringer Mannheim Biochemicals) siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante. Los oligonucleótidos tratados con quinasa se hibridaron y el dúplex se ligó en el vector pGO-11CKS digerido (Age I + Bam HI). Se transformaron células supercompententes XL1-Blue con el producto de ligación y las células se sembraron en placas de LB suplementadas con ampicilina 150 \mug/ml y se incubaron durante una noche. Se usó PCR de colonias (cebadores 41sy-1B SEC ID Nº: 29 y pTB-S8 SEC ID Nº: 28) para identificar los clones candidato. Las colonias se volvieron a sembrar en estrías para el aislamiento en placas de LB suplementadas con ampicilina 150 \mug/ml. Se establecieron cultivos de una noche de los clones candidatos en caldo LB 2X (Life Technologies, Inc.) suplementado con carbenicilina 100 mg/ml y glucosa 20 mM (Sigma Chemical Co.). Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los cultivos de una noche usando un kit de aislamiento de ADN Promega 373 (Promega Corporation, Madison, WI) siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante. También se usaron los cultivos de una noche para establecer reservas congeladas. Se sedimentaron células y se resuspendieron en caldo LB 2X con glicerol al 20% (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) y se congelaron a -70ºC. Se usaron los siguientes cebadores oligonucleotídicos para el análisis de secuencia: CKS-1 (SEC ID Nº: 30), CKS-3 (SEC ID Nº: 32), 43285 (SEC ID Nº: 1), 43461 (SEC ID Nº: 2), 41sy-1B (SEC ID Nº: 29), 41sy-2B (SEC ID Nº: 34), 41-sy-3B (SEC ID Nº: 35), 41ys-4 (SEC ID Nº: 23), y CKS3583 (SEC ID Nº: 20). En base a los resultados de la secuenciación, el clon candidato de pGO-15CKS-48 se designó pGO-15CKS/XL1. (La SEC ID Nº: 96 presenta la secuencia de nucleótidos de la región codificante y la SEC ID Nº: 97 presenta la secuencia de aminoácidos codificada).

B. Construcción de pGO-15PL/DH5\alpha

El pGO-15OL/DH5\alpha codifica la proteína recombinante pGO-15PL, cuya secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 120) se muestra en la Figura 17. Esta proteína consiste en una metionina N-terminal seguida de 45 aminoácidos de env gp120 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112), 199 aminoácidos de env gp41 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112), un enlazador de 4 aminoácidos (Gly, Gly, Gly, Ser) y 32 aminoácidos que incluyen la región IDR de env gp120 (VIH-1 Grupo O, aislado HAM112). El pGO-15OL/DH5 se construyó de la forma siguiente:

Se preparó una reacción de PCR (volumen de 100 \mul) con ADN polimerasa AmpliTaq (2,5 U) y tampón 1X junto con 40 \muM de cada dNTP, 50 pmol de 41sy-3B (SEC ID Nº: 355), 50 pmol de pTB-S8 (SEC ID Nº: 28) y 1 ng de ADN de pGO-15CKS (minipreparación de clon candidato de pGO-15CKS-48; obtenido de la Sección A anterior) como molde. La reacción se incubó a 95ºC durante 30 segundos, después se amplificó con 35 ciclos de 94ºC durante 20 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 60 segundos, seguido de incubación a 72ºC durante 7 minutos. El producto amplificado se purificó usando un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen). El producto de amplificación 41sy-3B/pTB-S8 purificado se digirió secuencialmente con Age I y Bam HI, después se ligó en pGO-9PL (preparación de vector digerido con Age I + Bam HI/tratado con fosfatasa del Ejemplo 3, Sección J anterior). Se transformaron células DH5\alpha competentes usando el producto de ligación y se sembraron en placas de LB suplementadas con ampicilina 150 \mug/ml. Se identificaron los clones candidato mediante PCR de colonias con los cebadores 41sy-3 (SEC ID Nº: 42) y pKRR BamHI inverso (SEC ID Nº: 39), seguido de digestión del producto de PCR con Age I. El clon candidato nº 4 se volvió a sembrar en estrías para aislamiento. Se estableció un cultivo de clon nº 4 en caldo LB 2X (Life Technologies) suplementado con carbenicilina 100 \mug/ml (Sigma Chemical Co.) y se incubó a 34ºC durante una noche. Se preparó ADN de minipreparación a partir de parte del cultivo de una noche usando un kit de aislamiento de ADN Promega 373 (Promega Corp.) como se describe por el fabricante. Se establecieron reservas congeladas por sedimentación del cultivo de una noche restante y resuspensión de las células en caldo Terrific con glicerol al 20% (J. T. Baker Co) y congelación a -70ºC. Se usaron los siguientes cebadores oligonucleotídicos para análisis de secuencia: pKRR EcoR1 directo (SEC ID Nº: 38), pKRR BamHI inverso (SEC ID Nº: 39), 41sy-1C (SEC ID Nº: 40), 41sy-2 (SEC ID Nº: 41), 41-sy-3 (SEC ID Nº: 42), 41sy-3B (SEC ID Nº: 35), 41ys-4 (SEC ID Nº: 23). En base a los resultados de secuenciación, el clon candidato de pGO-15PL nº 4 se designó pGO-15CKS/XL1. (La SEC ID Nº: 119 presenta la secuencia de nucleótidos de la región codificante y la SEC ID Nº: 120 presenta la secuencia de aminoácidos codificada).

Ejemplo 13 Preparación y purificación de antígenos de gp41 recombinantes del VIH-1 Grupo O pGO-8PL pGO-9PL, pGO-12CKS, pGO-14PL y pGO-15CKS

Los antígenos anteriores se prepararon por cultivo e inducción de cepas de E. coli que contienen las construcciones de antígeno gp41 recombinante de VIH-1 Grupo O respectivas como se han descrito en el Ejemplo 5. Las células congeladas resultantes se resuspendieron por homogeneización en tampón de lisis frío que comprendía Tris 50 mM a pH 8, Na EDTA 10 mM, NaCl 150 mM, sacarosa al 8% (p/v), Triton X-100® al 5% (v/v), PMSF 1 mM y pepstatina A 1 \muM. Se añadió lisozima a los homogeneizados a una concentración de 1,3 mg por gramo de células procesadas y se incubaron durante 30 minutos en hielo para lisar las células. Se separaron los cuerpos de inclusión de las proteínas solubles por centrifugación. Estos cuerpos de inclusión sedimentados se lavaron y se sedimentaron secuencialmente en (1) tampón de lisis; (2) Na EDTA 10 mM a pH 8, sacarosa al 30% (p/v); y (3) agua. Los cuerpos de inclusión lavados se resuspendieron en Tris 50 mM a pH 8, Na EDTA 10 mM, NaCl 150 mM y urea 3 M y se incubaron en hielo durante 1 hora. Después, los cuerpos de inclusión se separaron de las proteínas solubilizadas por centrifugación. Los cuerpos de inclusión sedimentados se solubilizaron completamente en guanidina-HCl 7 M, Tris 50 mM pH 8, beta-mercaptoetanol (BME) al 0,1% (v/v) durante una noche a 4ºC. El antígeno o antígenos recombinantes solubilizados se aclararon por centrifugación, se pasaron a través de un filtro de 0,2 \mum. El antígeno o antígenos de gp41 solubilizados se precipitaron a partir de la solución de guanidina-HCl 7 M por dilución (1:7) con agua hasta una concentración final de guanidina-HCl 1 M. Después de la incubación a 4ºC durante 30 minutos, las proteínas precipitadas se centrifugaron y se volvieron a solubilizar en Tris 50 mM pH 7, urea 9 M, BME al 0,1% (v/v) durante una noche a 4ºC.

Los antígenos de gp41 recombinante de VIH-1 Grupo O solubilizados se purificaron a continuación de la forma siguiente: los antígenos recombinantes se purificaron primero por cromatografía de intercambio de aniones y/o cationes usando columnas de Q-Sepharose (Pharmacia) o S-Sepharose (Pharmacia). Las soluciones de antígeno gp41 solubilizado se cargaron en una columna de Q-Sepharose o S-Sepharose que se había equilibrado previamente con Tris 50 mM pH 8, urea 8 M, BME al 0,1% (v/v). Los antígenos de gp41 (1) se pasaron a través de la columna directamente y se recogieron en el volumen evacuado o (2) se unieron a la matriz de la columna. Si se adsorbían, los antígenos gp41 se eluyeron de las columnas mediante un gradiente de NaCl 0-1 M. Se usó electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida para analizar las fracciones de las columnas Q-Sepharose o S-Sepharose. Las fracciones que contenían los antígenos de gp41 recombinantes se combinaron y después se concentraron por ultrafiltración. Los concentrados de antígeno recombinante se trataron con SDS al 4% (p/v) y BME al 5% (p/v) a temperatura ambiente durante 3 horas. Los antígenos tratados con SDS se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaños en una columna de Sephacryl S-300 (Pharmacia) equilibrada con Tris 25 mM pH 8, NaCl 0,15 M, BME al 0,1% (v/v), SDS al 0,1% (p/v). Se usó electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida para analizar las fracciones de la columna S-300. Las fracciones que contenían antígenos recombinantes purificados se combinaron, se pasaron a través de un filtro de 0,2 mM y se almacenaron a -70ºC.

Ejemplo 14 Ensayo de reactividad de antígeno recombinante con muestras de VIH-1 Grupo M y Grupo O A. Recubrimiento de perlas

Para examinar la reactividad de antígenos de VIH-1 recombinantes, se recubrieron recombinantes purificados sobre perlas de poliestireno de 0,64 cm (un cuarto de pulgada). Estas perlas recubiertas con antígeno se usaron en una serie de ensayos de captura para acceder a reactividad tanto de muestras de VIH-1 Grupo M como Grupo O.

Los antígenos recombinantes se recubrieron sobre perlas de 0,64 cm (un cuarto de pulgada) a 0,5 \mug/ml en PBS. Se recubrieron los siguientes antígenos recombinantes: pTB319 (Grupo M), pGO-9/CKS, pGO-11/PL, pGO-12/CKS, pGO-14/PL y pGO-15/CKS (todos Grupo O).

El procedimiento para recubrimiento de los antígenos recombinantes sobre las perlas es el siguiente: para cada antígeno se lavaron 35,5 g (\sim250) de perlas (Abbot Laboratories código 93-2556, lote 6840M100) en N-propanol al 15% en agua durante 30 minutos a 40ºC. Todas las incubaciones y lavados se realizaron en pequeños tarros de vidrio marrón en una plataforma de agitación. La solución de N-propanol se retiró por aspiración, se añadieron 58,25 ml de solución de antígeno y las perlas se incubaron durante 2 horas a 40ºC. La solución de antígeno se retiró por aspiración y se añadieron 60 ml de una solución de Triton X-100 al 0,1% en PBS durante 30 minutos a 40ºC. Después, las perlas se lavaron con 60 ml de PBS dos veces y se incubaron con 60 ml de BSA al 2% en PBS durante 30 minutos a 40ºC. El BSA se aspiró y las perlas se lavaron de nuevo en PBS. Después, las perlas se incubaron con 60 ml de sacarosa al 0,5% en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, la sacarosa se aspiró y las perlas se dejaron secar al aire. Las perlas recubiertas se almacenaron en frascos de polipropileno con un desecante a
4ºC.

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B. Ensayos

Se ensayaron perlas recubiertas con antígeno recombinante para determinar la reactividad frente a una diversidad de muestras usando el kit de Abbott Laboratories 3A11 (primera generación, formato de ensayo indirecto). Las muestras se diluyeron y se añadieron a pocillos en bandejas de poliestireno. Las perlas se añadieron y las bandejas se incubaron a 40ºC durante 1 hora. Las bandejas se lavaron con agua en un dispositivo Abbott Laboratories QUICKWASH. Después, el conjugado del kit, un anti-IgG humana-peroxidasa de rábano rusticano se añadió y las bandejas se incubaron de nuevo a 40ºC durante 1 hora. Las bandejas se lavaron de nuevo y se añadieron 300 \mul de solución de sustrato (1,28 mg/ml o-fenilendiamina \cdot HCl en tampón citrato-fosfato que contenía peróxido de hidrógeno al 0,02%) a cada pocillo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadió 1 ml de ácido sulfúrico 1 N para detener la reacción y las bandejas se leyeron en un espectrofotómetro Abbott QUANTUM.

Las muestras usadas para este estudio eran de plasma humano normal (Abbott Laboratories código 99800, lote 17535M400), usado como control negativo; HIVPL-31 (suero positivo del Grupo M) y los siguientes sueros positivos del Grupo O: 14283, 189404. 193Ha, 14791, 267Ha y ESP-1. Todas las muestras excepto el plasma humano normal control se procesaron a tres diluciones; 1:1.000, 1:10.000 y 1:100.000 en el diluyente de muestras del kit. Cada dilución de cada muestra se procesó por duplicado frente a cada una de las seis perlas y los resultados de cada dilución se calculó el promedio y se representó para cada perla.

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C. Resultados

Los resultados de los ensayos anteriores que se muestran en las Figuras 18-23 demuestran las mejoras en la sensibilidad y la selectividad disponible mediante el uso de los antígenos recombinantes de la presente invención. La perla recubierta con el antígeno recombinante del VIH-1 Grupo M (pTB319) detectaba la muestra de suero del Grupo M pero no detectaba ninguna excepto una de las muestras del Grupo O. Las perlas recubiertas con solamente antígenos recombinantes de VIH-1 Grupo O (pGO-9/CKS, pGO-11/PL, y pGO-15/CKS) detectaban las muestras de suero del Grupo O pero mostraban una sensibilidad inferior en la detección de la muestra de VIH de Grupo M. Las perlas que se recubrieron con antígenos recombinantes de Grupo M y Grupo O híbridos (pGO-12/CKS, y pGO-14/PL) eran capaces de detectar muestras positivas tanto VIH-1 Grupo M como Grupo O. Por último, el pGO-15/CKS, que tiene una secuencia adicional que representa la región inmunodominante del Grupo O de gp41 unido por medios recombinantes al extremo carboxi en la proteína mostraba una mayor reactividad para muestras de Grupo O de bajo
título.

Ejemplo 15 Examen de sensibilidad de ensayo para muestras infectadas con VIH-1 Grupo O usando antígenos recombinantes de Grupo O pGO-9CKS y pGO-11CKS A. Ensayos

Para evaluar el rendimiento en inmunoensayos de construcciones de antígenos de la presente invención, se incorporaron antígenos recombinantes pGO-9CKS y pGO-11CKS en cuatro inmunoensayos de VIH-1/VIH-2 que contenían reactivos de VIH-1 Grupo M (subtipo B). Las construcciones se ensayaron usando un ensayo de perlas (Ensayo 1) y tres ensayos basados en micropartículas automáticos (Ensayos 2-4). En todos los casos, se evaluó la reactividad de muestras infectadas con VIH-1 Grupo O con (formato 2) y sin (formato 1) incorporación de los recombinantes del VIH-1 Grupo O. Las perlas/micropartículas recubiertas se hicieron reaccionar con múltiples diluciones de los siguientes sueros humanos positivos a VIH-1 Grupo O: ESP1, 189404, 193Ha, 341Ha, 2156 y ABB 9/96.

Para el Ensayo 1, se incorporó pGO-11CKS purificado en un ensayo basado en perlas disponibles en el mercado por recubrimiento de la construcción de antígeno sobre perlas de poliestireno de 0,64 cm (un cuarto de pulgada). Las perlas recubiertas se hicieron reaccionar con una variedad de diluciones de sueros humanos positivos a VIH-1 Grupo O, se lavaron y después se hicieron reaccionar con pGO-9CKS purificado conjugado con peroxidasa de rábano rusticano. Después del lavado/separación de conjugado de pGO-9CKS unido de no unido, se añadió sustrato y en ensayo se terminó como se indica en el Ejemplo 14.

Para el Ensayo 2, se incorporó pGO-11CKS purificado en un segundo ensayo disponible en el mercado por recubrimiento de la construcción de antígeno sobre micropartículas. Las micropartículas recubiertas se hicieron reaccionar con el mismo intervalo de diluciones de sueros humanos positivos a VIH-1 Grupo O utilizados en el Ensayo 1. Después, las micropartículas se lavaron y posteriormente se hicieron reaccionar con pGO-9CKS biotinilado. Después de un lavado adicional, las partículas se hicieron reaccionar con un anticuerpo anti-biotina policlonal conjugado con fosfatasa alcalina. La señal de ensayo se reveló por adición del sustrato fosfato de metilumbeliferilo.

Para el Ensayo 3, se incorporó pGO-11CKS purificado en un tercer ensayo disponible en el mercado por recubrimiento de la construcción de antígeno sobre micropartículas. Las micropartículas recubiertas se hicieron reaccionar de nuevo con el mismo intervalo de diluciones de sueros humanos positivos a VIH-1 Grupo O utilizados en el Ensayo 1. A continuación, las micropartículas se lavaron y después se hicieron reaccionar con pGO-9CKS biotinilado. Después del lavado, las micropartículas se hicieron reaccionar con un anticuerpo anti-biotina conjugado con acridinio como el compuesto generador de señal.

Para el Ensayo 4, se incorporó pGO-11CKS purificado en un ensayo de desarrollo por recubrimiento de la construcción de antígeno sobre micropartículas magnéticas. Como en el Ensayo 1, las micropartículas recubiertas se hicieron reaccionar con un intervalo de diluciones de sueros humanos positivos a VIH-1 Grupo O, se lavaron y posteriormente se hicieron reaccionar con pGO-9CKS conjugado con acridinio.

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B. Resultados

Los resultados de los ensayos anteriores se presenta en las Tablas 1 y 2 a continuación, en las que los datos se presentan como proporciones de señal/límite (S/CO). El formato 1 se refiere al ensayo convencional sin las construcciones de antígeno de la presente invención mientras que el formato 2 se refiere al ensayo complementado con las construcciones de VIH-1 Grupo O.

A partir de estos datos, puede observarse que la adición de los recombinantes de VIH-1 Grupo O daba como resultado un aumento significativo de la sensibilidad del ensayo para los sueros infectados con VIH-1 Grupo O a todas las diluciones ensayadas. Por ejemplo, en el caso del ensayo 1 y de la muestra 193Ha se obtuvo una proporción de S/CO de 7,14 a una dilución de 1:10 usando el formato 1 mientras que se obtuvo una proporción S/CO similar (7,22) a una dilución 160 veces mayor (1:1600) usando el formato 2. Esta tendencia se mantuvo a lo largo de todas las plataformas de ensayo ensayadas. La utilidad de los recombinantes del Grupo O era particularmente evidente para la muestra 2156 que dio resultado negativo de ensayo (S/CO < 1) en los 4 ensayos antes de la adición de los recombinantes del Grupo O. Con la adición de las construcciones de VIH-1 Grupo O, sin embargo, esta muestra 2156 dio resultado positivo de ensayo en los 4 ensayos a una dilución 1:400. En el Ensayo 1, la 2156 todavía era positiva una dilución de 1:5000. La adición de los reactivos recombinantes pGO-9CKS y pGO-11CKS se observó por lo tanto que proporcionaba una sensibilidad sustancialmente mejor para sueros infectados con VIH-1 Grupo O cuando se usaban los inmunoensayos de formato directo anteriores.

TABLA 1

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1

TABLA 2

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4

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1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Hackett, John R. Jr.

\hskip3,9cm Yamaguchi, Julie

\hskip3,9cm Golden, Alan M.

\hskip3,9cm Brennan, Catherine A.

\hskip3,9cm Hickman, Robert K.

\hskip3,9cm Devare, Sushil G.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Antígenos recombinantes útiles en la detección y diferenciación de anticuerpos contra VIH

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 121

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: Abbott Laboratories

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 100 Abbott Park Road

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Abbott Park

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: IL

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 60064-3500

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete de 3,5 pulgadas, 1.4 MB, formateado en DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Power Macintosh 7100/66

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: MacOS 7.1.2 (emulación de DOS)

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: WordPerfect 3.1 (guardado como exportación de texto en formato ASCII)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Danckers, Andreas M.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 32.652

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 6165.US.01

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 847-937-9803

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 847-938-2623

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 114 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 111 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 110 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 111 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 117 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 101 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 114 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 109 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 114 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 60 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 106 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 108 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 64 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 741 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 245 aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1476 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 490 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 50:

54

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1125 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 373 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 52:

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1860 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 53:

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 618 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

58

59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 466 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 55:

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 491 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 56:

61

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 651 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 57:

\vskip1.000000\baselineskip

63

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 215 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 58:

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1386 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 59:

65

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 460 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

66

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 873 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 61:

68

69

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 62:

\vskip1.000000\baselineskip

71

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 63:

\vskip1.000000\baselineskip

72

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 64:

\vskip1.000000\baselineskip

73

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 65:

\vskip1.000000\baselineskip

74

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 66:

\vskip1.000000\baselineskip

75

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 67:

\vskip1.000000\baselineskip

76

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 68:

\vskip1.000000\baselineskip

77

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 69:

\vskip1.000000\baselineskip

78

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 70:

79

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 71:

\vskip1.000000\baselineskip

80

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 72:

\vskip1.000000\baselineskip

81

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 73:

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 74:

\vskip1.000000\baselineskip

83

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 75:

\vskip1.000000\baselineskip

84

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 76:

\vskip1.000000\baselineskip

85

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 77:

\vskip1.000000\baselineskip

86

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 78:

\vskip1.000000\baselineskip

87

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 79:

\vskip1.000000\baselineskip

88

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 80:

\vskip1.000000\baselineskip

89

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 81:

\vskip1.000000\baselineskip

90

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 82:

\vskip1.000000\baselineskip

91

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 83:

\vskip1.000000\baselineskip

92

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 84:

\vskip1.000000\baselineskip

93

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 85:

\vskip1.000000\baselineskip

94

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 86:

\vskip1.000000\baselineskip

95

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 87:

\vskip1.000000\baselineskip

96

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 88:

\vskip1.000000\baselineskip

97

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 89:

\vskip1.000000\baselineskip

98

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2214 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 90:

99

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 736 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 91:

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2124 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 92:

101

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 706 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 93:

102

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1470 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 94:

103

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 95:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 488 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 95:

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 96:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1584 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 96:

\vskip1.000000\baselineskip

105

106

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 97:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 526 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 97:

107

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 98:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 60 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 98:

\vskip1.000000\baselineskip

108

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 99:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 99:

\vskip1.000000\baselineskip

109

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 100:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 100:

\vskip1.000000\baselineskip

110

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 101:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 101:

\vskip1.000000\baselineskip

111

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 102:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 102:

\vskip1.000000\baselineskip

112

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 103:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 103:

\vskip1.000000\baselineskip

113

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 104:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: XXX pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 104:

\vskip1.000000\baselineskip

114

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 105:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 105:

\vskip1.000000\baselineskip

115

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 106:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 106:

\vskip1.000000\baselineskip

116

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 107:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1800 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 107:

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 108:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 599 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 108:

\vskip1.000000\baselineskip

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 109:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 109:

\vskip1.000000\baselineskip

119

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 110:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 110:

\vskip1.000000\baselineskip

120

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 111:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 111:

\vskip1.000000\baselineskip

121

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 112:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 112:

\vskip1.000000\baselineskip

122

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 113:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 113:

123

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 114:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 114:

\vskip1.000000\baselineskip

124

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 115:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 115:

\vskip1.000000\baselineskip

125

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 116:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 116:

126

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 117:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 122 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 117:

127

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 118:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 122 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 118:

128

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 119:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 849 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 119:

129

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 120:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 281 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 120:

130

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 121:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 121:

\vskip1.000000\baselineskip

131

Claims (12)

1. Una construcción de antígeno que comprende una fusión de al menos un polipéptido env de VIH-1 Grupo O con al menos un polipéptido env de VIH-1 Grupo M, en el que cada polipéptido derivado de la proteína env del Grupo O o M contiene al menos 5 aminoácidos.

2. Una construcción de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende una fusión de:

(a) un primer polipéptido env de VIH-1 Grupo O;

(b) un segundo polipéptido env de VIH-1 Grupo O;

(c) un primer polipéptido env de VIH-1 Grupo M; y

(d) un segundo polipéptido env de VIH-1 Grupo M.

3. Una construcción de antígeno de acuerdo con la reivindicación 2 en la que al menos una de la secuencias del VIH-1 Grupo O procede del aislado de VIH-1 Grupo O HAM112.

4. Una construcción de antígeno de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el primer polipéptido env de Grupo O y el primer polipéptido env de Grupo M son ambos polipéptidos gp120 y el segundo polipéptido env de Grupo O y el segundo polipéptido env de Grupo M son ambos polipéptidos gp41.

5. Una construcción de antígeno de acuerdo con la reivindicación 2 en la que:

(a) el primer polipéptido env de VIH-1 Grupo O comprende una porción inmunorreactiva de la proteína gp120 del aislado de VIH-1 Grupo O HAM112;

(b) el segundo polipéptido env de VIH-1 Grupo O comprende una porción inmunorreactiva de la proteína gp41 del aislado de VIH-1 Grupo O HAM112;

(c) el primer polipéptido env de VIH-1 Grupo M comprende una porción inmunorreactiva de la proteína gp120 de un primer aislado de VIH-1 Grupo M del subtipo B; y

(d) el segundo polipéptido env de VIH-1 Grupo M comprende una porción inmunorreactiva de la proteína gp41 de un segundo aislado de VIH-1 Grupo M de subtipo B.

6. Una construcción de antígeno de acuerdo con la reivindicación 5 en la que:

(a) el primer polipéptido env del VIH-1 Grupo M tiene una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en los restos 251 a 292 de la secuencia de la Figura 12 (SEC ID Nº: 108); y

(b) el segundo polipéptido env del VIH-1 Grupo M tiene una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en los restos 293 a 599 de la secuencia de la Figura 12 (SEC ID Nº: 108) o una porción de la misma.

7. Una construcción de antígeno de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el segundo polipéptido env de VIH-1 Grupo M tiene una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en los restos 293 a 492 de la secuencia de la Figura 12 (SEC ID Nº: 108).

8. Una construcción de antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2, 4, 5, 6 y 7, en la que el primer polipéptido env de VIH-1 Grupo O tiene una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en los restos 1 a 520 de la secuencia de la Figura 1 (SEC ID Nº: 61) o una porción de la misma.

9. Una construcción de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 91, SEC ID Nº: 93 y SEC ID Nº: 95.

10. Un polinucleótido que codifica una construcción de antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 9.

11. Un método para detectar anticuerpos contra VIH-1 en una muestra de ensayo que comprende las etapas de:

(a) combinar al menos una construcción de antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 9 con la muestra de ensayo para formar una mezcla;

(b) incubar la mezcla en condiciones adecuadas para la formación de complejos entre el antígeno y los anticuerpos, si existen, que estén presentes en la muestra y sean inmunológicamente reactivos con el antígeno; y

(c) detectar la presencia de cualquier complejo formado.

12. Un kit de inmunoensayo para la detección de anticuerpos contra VIH-1, que comprende una construcción de antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 9.