DE68929467T3 - HIV-2 Varianten - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft HIV D205, eine HIV-2-Virusvariante, die vom entsprechenden Virusisolat HIV D205 (ECACC V 87122304) kloniert werden kann.
• ”Molecular cloning of two West African human immunodeficiency virus type 2 isolates which replicate well on macrophages: a Gambian isolate from a case of neurologic aquired immunodeficiency syndrome, and a highly divergent Ghanesian isolate” (H. Kühnel, H. v. Briesen, U. Dietrich, M. Adamski, D. Mix, L. Biesert, R. Kreutz, A. Immelmann, K. Henco, Ch. Meichsner, R. Andreesen, H. Gelderblom, und H. Rübsamen-Waigmann, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 4, 2383–2387.
• In der Diagnostik müssen zwei Kriterien erfüllt werden, nämlich die Spezifität und die Empfindlichkeit für das nachzuweisende Antigen. Bei der AIDS-Diagnose kann der Bedarf an einer Spezifität sicherlich der Verwendung der Isolate HTLV-III_B und LAV-2 (M. Guyader et al., ”Nature” 326, 1987, 662–669) entsprechen, um HIV-Infektionen von andere Infektionen abzugrenzen und somit eine grobe Zuordnung zu den Klassen der ”HIV-2-verwandten Infektionen” oder der ”HIV-1-verwandten Infektionen” vorzunehmen. Ein Problem besteht jedoch in der Empfindlichkeit der Diagnose. Im Bereich der sogenannten Serokonversion, d. h. dem anfänglichen Auftreten des Antikörpers in der infizierten Person, impliziert eine Verminderung der Empfindlichkeit eine Erhöhung der Zahl ”falsch negativer” Testergebnisse. Folglich besteht ein Hauptziel in einer möglichst großen Verkürzung des Zeitraums zwischen einer Infektion und der Nachweisbarkeit dieser Infektion durch eine Verbesserung der Testempfindlichkeit.
• Eine verminderte Überkreuz-Reaktivität manifestiert sich in der Praxis der häufig eingesetzten ELISA-Diagnostik zum Beispiel durch eine verminderte Empfindlichkeit. Somit bedeutet die Verwendung des beschriebenen HIV-1-Isolat etwa eine mittlere Verminderung der Testempfindlichkeit gegenüber HIV-2-Seren um den Faktor von 100 bis 1000, während das Isolat HTLV-III_B dazu führt, dass fast kein Nachweis mehr bewerkstelligt werden kann.
• Ein verhängnisvolles Prinzip der durch HIV verursachten Krankheiten besteht in der Tatsache, dass es nicht nur einen Typ an Phänotypen und Genotypen jeweils des HIV-1- und des HIV-2-Virus gibt. Statt dessen ist eine große Gruppe verwandter Viren, möglicherweise sogar Populationen, zu postulieren, die keinesfalls strikt voneinander getrennt sind, sondern kontinuierlich ineinander eindringen und eine evolutionäre Entwicklung zu einer immer mehr ansteigenden Divergenz erfahren, während sie gleichzeitig durch Rekombinationsereignisse damit beginnen, Teile des Genoms untereinander auszutauschen. Somit bilden die existierenden HIV-Spezies ein breites, kontinuierliches Populationsniveau, in dem es keine eng abgegrenzten Unterpopulationen einer Virusvariante gibt. Statt dessen ist anzunehmen, dass ein Kontinuum existiert, das im Laufe der Zeit permanenten Schwankungen unterliegt.
• Die klassifizierten Virusvarianten HIV-1 und HIV-2 sind Repräsentanten der diffus voneinander abgegrenzten Unterpopulationen mit einem relativ niedrigen Grad an Beziehungen, was sich durch eine nur teilweise Überkreuzreaktivität zeigt. Andererseits gibt es Varianten der HIV-1-Gruppe (H. Rübsamen-Waigmann et al., ”AIDS-Forschung” 10, 1987, 572–575; H. Rübsamen-Waigmann et al., J. Med. Virol. 19, 1986, 335–344; H. v. Briesen et al., J. Med Virol. 23, 1987, 51–66), die mit HIV-2 signifikant stärkere Überkreuzreaktionen eingehen als das zuerst charakterisierte HIV-1-Isolat selbst (B. Hahn et al., ”Nature” 312, 1984, 166–169). Ein aus einem solchen Isolat bestehendes kommerzielles Produkt ermöglicht die Diagnose von deutlich mehr Seren als HIV-2-positiv als das beschriebene Standardisolat HTLV-III_B.
• Ein ideales Diagnostikum oder Therapeutikum sollte wenigstens einen Repräsentanten aus den Populationen als biologisch signifikant voneinander unterschieden enthalten.
• HIV-1-Viren in einer Mehrzahl hoch polymorpher genetischer Mutanten können verschiedene Krankheiten wie ARC, LAS, AIDS und Enzephalopathien (ARC: AIDS-bezogene Krankheitszustände, LAS: Lymphadenopathie-Syndrom, AIDS: erworbenes Immunschwäche-Syndrom) verursachen. Klonierte Virusvarianten unterscheiden sich durch die Sequenz und das Restriktionsmuster sogar dann, wenn sie gleichzeitig, am selben Ort und sogar vom selben Patienten isoliert wurden (H. Rübsamen et all, 1986). Es konnte gezeigt werden, dass Virusvarianten vom HIV-1-Typ sich in einigen Virusantigenen um bis zu etwa 15% unterscheiden. Bei HIV-2 sind sogar mehr als 40% der Aminosäuren mancher Antigene verschieden, wobei Substitutionen, Insertionen und Deletionen in Betracht gezogen worden sind (M. Guyader et al., 1987, A. B. Rabson und M. A. Martin, ”Cell” 40, 1985, 477–480).
• Die vorliegende Erfindung macht eine Variante des HIV-2-Virus verfügbar. Die Variante HIV-2 D205 wurde aus einem klinisch asymptomatischen Patienten isoliert. Das Virusisolat erwies sich als Diagnostikum in Bezug auf DNA/RNA sowie in Bezug auf die Virus-Antigene zur serologischen und direkten Identifizierung von Infektionen durch den Typ HIV-2 in der Pre-AIDS- und der AIDS-Stufe.
• Das erfindungsgemäße Virusisolat umfasst Viren und Proviren, deren Merkmale mit denjenigen der offenbarten Restriktionskarte und der Sequenz der klonierten Teilbereiche identisch sind (1–4). Darüber hinaus umfasst das Virusisolat Varianten, die sich von den oben beschriebenen Viren und Proviren dahingehend unterscheiden, dass ihre Nucleotidsequenzen sich von den oben beschriebenen Viren nur um bis zu 5% und vorzugsweise 2%, besonders bevorzugt um 1% unterscheiden.
• Die erfindungsgemäße Virusvariante kann Lymphadenopathien (weiterhin als LAS/AIDS bezeichnet) verursachen.
• Eine weitere bevorzugte Ausführungsform besteht aus klonierten DNA-Sequenzen, die dazu fähig sind, mit genomischer RNA und DNA der Virusvariante zu hybridisieren. Erfindungsgemäß beansprucht sind stabile Gensonden, die DNA-Sequenzen enthalten, die zum Nachweis der Hybridisierung dieser und anderer HIV-Varianten oder verwandter Viren oder DNA-Proviren in zu untersuchenden Proben, insbesondere biologischen oder halbsynthetischen Proben, fähig sind.
• Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht aus einer Virusvariante der RNA/DNA, die oder deren jeweilige Fragmente, insbesondere c-DNA, genomische DNA, rekombinante DNA, synthetische DNA oder Fragmente davon unter stringenten Bedingungen an erfindungsgemäßen Virusvarianten hybridisieren. Es gilt als vereinbart, dass diese Varianten oder Fragmente einschließen, die im Vergleich zur erfindungsgemäßen Virusvariante Deletionen und Insertionen aufweisen.
• Als stringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind diejenigen Bedingungen zu verstehen, aus denen experimentell oder durch Berechnungen abgeleitet werden kann, dass der Schmelzpunkt der zu 100% homologen Nucleinsäurekomplexe unter den Hybridisierungs- und Waschbedingungen unter den eingesetzten Pufferbedingungen um nicht mehr als 5°C abnimmt.
• Die beschriebenen klonierten DNA-Fragmente sind zur Hybridisierung mit komplementären Nucleinsäuren (DNA/RNA) zum Zweck des diagnostischen Nachweises der Virusvarianten geeignet. Die erfindungsgemäßen Diagnosetests werden mittels DNA- oder RNA-Sonden durchgeführt. Die Sonden sind radioaktiv oder sind mit fluoreszenten bio- oder chemilumineszenten Gruppen oder Enzymen markiert oder sind mit Enzymen über gekoppelte Reaktionssysteme spezifisch nachweisbar. Die Hybridisierungen können in einer homogenen Phase einer Lösung oder in einer heterogenen Phase mit an Feststoff immobilisierten Nucleinsäuren erfolgen, während es sich beim Feststoff um eine Membran, ein Teilchen, eine Zelle oder ein Gewebe handeln kann, so dass die Hybridisierung auch in situ erfolgen kann.
• Die entsprechenden DNA-Sequenzen (1) aus den erfindungsgemäß beanspruchten Virusisolaten können in E. coli-Bakterien kloniert werden, indem eine genomische Lambda-Genbank eingerichtet wird, wobei von der DNA der mit dem Virusisolat infizierten Lymphozyten ausgegangen wird. Die gewünschten Klone werden erhalten, indem ein Plaque-Screening mit STLV-III-Sequenzen des Gag-Pol-Bereichs durchgeführt wird. Noch spezifischer kann eine DNA, die von der veröffentlichten Sequenz HIV-2 ROD (M. Guyader et al., ”Nature” 326, 1987, 6623–669) stammt, oder eine DNA-Sonde, die von den Teilsequenzen des erfindungsgemäßen Isolats HIV-2 D205 stammt, als Sonde verwendet werden.
• Das Diagnoseverfahren, das auf der Verwendung der erfindungsgemäß beanspruchten Viren basiert, umfasst die folgenden Schritte: Extraktion der RNA oder DNA aus biologischen Proben, gegebenenfalls die enzymatische Verarbeitung durch Restriktionsenzyme, die Trennung durch Gelelektrophorese und/oder Direkt-Blotting-Verfahren für Nucleinsäure bindende Träger, und die anschließende Hybridisierung mit Teilen der klonierten Fragmente der beanspruchten Viren. Hybridisierungen können auch direkt in chemisch behandelten Zellen oder Geweben erfolgen. Dabei ist der Ursprung der Gewebe oder Flüssigkeiten unerheblich.
• Insbesondere ist ein Verfahren zum in-vitro-Nachweis von Antikörpern gegen Expressionsprodukte der Viren der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionsprodukte der Viren oder Teile davon durch immunologische Methoden nachgewiesen werden. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Expressionsprodukten um Proteine, Peptide oder Teile davon handelt, die innerhalb der Bedeutung eines offenen Leserasters auf der DNA der proviralen Teilsequenzen nach Anspruch 1 kodiert worden sind und durch synthetische oder biosynthetische Verfahren hergestellt werden.
• Das Verfahren ist weiter dadurch gekennzeichnet, dass zuvor eine definierte Menge oder eine Kombination von Expressionsprodukten oder Teilen davon auf Mikrotiterplatten fixiert wird, wonach anschließend biologische Proben, verdünnt oder unverdünnt, mit den beschichteten Mikrotiterplatten in Kontakt gebracht werden und nach einer Inkubation und anschließenden Waschschritten mittels eines Nachweisreagenzes oder markierten Anti-HIV-Antikörpern identifiziert werden können.
• Alternativ werden Filterstreifen und Kunststoffstreifen oder -stäbe statt Mikrotiterplatten verwendet, wobei die Expressionsprodukte der Viren durch die isolierte Auftragung der verschiedenen Antigene an jeweils spezifischen Positionen fixiert worden sind.
• Für diagnostische und therapeutische Aufgaben können die beschriebenen DNA-Segmente auch zur Exprimierung kodierter Antigene verwendet werden. Dabei werden die DNA-Segment unter der gezielten Steuerung von Regulationssequenzen in pro- oder eukaryontische Zielzellen, -gewebe oder aus mehreren Zellen bestehende Zielorganismen eingeführt, um diese zur Produktion der entsprechend kodierten Antigene, Teilen davon oder Kombinationen davon mit fremden Antigenen zu stimulieren. Antigene können über die Reaktion mit Anti-HIV-2-Antikörpern, insbesondere aus den Seren der betreffenden Patienten, nachgewiesen werden. Antigene mit längeren offenen Leserastern (> 50 Aminosäuren) eignen sich dafür genauso wie diejenigen, die auf RNA-Ebene Spleißvorgängen unterworfen sind und somit so zusammengesetzt sind, dass sie die längeren offenen Leseraster bilden.
• Polypeptide, die von der erfindungsgemäßen klonierten Virusvariante stammen, können verwendet werden, um solche Antigene in einem zu untersuchenden Material nachzuweisen, das ähnliche Antigen-Determinanten enthält und deswegen eine immunologische Überkreuzreaktion eingeht. Dies ist zur Diagnose von AIDS und Pre-AIDS von Virenträgern oder asymptomatischen Virenträgern bzw. von Blut stammenden Virusprodukten besonders geeignet. Auch der serologische Nachweis der Antikörper, die gegen diese antigenen Polypeptide als Expressionsprodukte des erfindungsgemäß beanspruchten Virus gerichtet sind, werden durch die Verwendung herkömmlicher Systeme wie ELISA möglich. Die immunogenen Polypeptide können als schützende Polypeptide als Vakzine verwendet werden, um einen Schutz gegen AIDS-Infektionen zu bewirken.
• Die erfindungsgemäßen Virusisolate und die davon stammenden Produkte können mit anderen Isolaten der Teilpopulation HIV-2 in Testsystemen kombiniert werden, d. h. mit denjenigen, die sich so weit wie möglich im beschriebenen Populationsniveau entfernt befinden, wie zum Beispiel das Isolat HIV-2 ROD (M. Guyader et al., 1987). Dadurch wird es möglich, auch Populationen entfernter Verwandtschaft in einem Test empfindlich nachzuweisen.
• Die erfindungsgemäße Virusvariante ist vom Spektrum der HIV-1-Varianten hochgradig verschieden und weist eine engere molekulare Verwandtschaft zu dem von Guyader beschriebenen HIV-2-Virus auf, obwohl sie sich davon beträchtlich unterscheidet (1). Auch die biologischen Eigenschaften unterscheiden sich deutlich vom beschriebenen HIV-2-Isolat. Somit bevorzugt die erfindungsgemäße Variante für eine wirksame in-vitro-Replikation Zellen, die von myeloischen Linien stammen. Im Gegensatz dazu reproduziert das Virus sich in lymphozyten Linien schlecht.
• Eine Probe des erfindungsgemäß beanspruchten Virus ist in Form seines Isolats am European Collection of Animal Cell Cultures unter der Bezeichnung HIV D205 (V 87122304) gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt worden.
• 1 zeigt die Restriktionskarten des erfindungsgemäßen Virusisolats im Vergleich zu bekannten HIV-Sequenzen.
• 2 zeigt die partiellen Nucleotidsequenzen von HIV-D205 (entsprechend dem Klon HIV-2 A7.1 von 2).
• 3 zeigt die Sequenzhomologie von HIV-2 D205, 7 im Vergleich zur HIV/SIV-Gruppe (Genniveau; nt/aa).
• 4 zeigt einen Vergleich der Nucleotidsequenz zwischen HIV-2 D205 und HIV- und SIV-Stämmen (in % der Homologie).
• Experimentelle Ergebnisse und Merkmale von HIV-D205 sind in H. Kühnel et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 4, 2383–2387, beschrieben.
• Die Sequenz von HIV-D205 zeigt viele sogenannte ”offene Leseraster”. Die meisten dieser Leseraster können durch einen Vergleich von Homologien mit zuvor beschriebenen HIV-Viren mittels eines Vergleichs von Western-Blots, die mit HIV-D2-5-Antigenen durchgeführt wurden, die von infizierten HUT78- oder U937-Zellen stammen, und durch Untersuchungen mit Seren von den entsprechenden Patienten und Bezugsseren mit in vivo exprimierten Proteinen/Antigenen in Beziehung gesetzt werden.
• Andere offene Leseraster werden nicht auf dem Niveau ihrer exprimierten Antigene, die durch die Funktion oder die auf Western-Blots erfolgenden Färbung von Antikörpern definiert sind, identifiziert. Sie können unter bestimmten Umständen jedoch in vivo exprimiert werden. Andere Leseraster, sogar kurze, können gut auf eine Weise exprimiert werden, die auf Grund von Spleißvorgängen allein auf der Grundlage der Nucleinsäure-Sequenzdaten schwierig vorhersagbar ist.
• Antigen-Determinanten auf exprimierten Proteinen, die für die biologische Funktion, für Zielantigene in der Diagnostik oder für die Immunisierung wichtig sind, sind über die gesamte exprimierte lineare Proteinstruktur verteilt. Teile dieser Sequenzen können allgemeinere antigene Eigenschaften als andere haben, wie durch ein Peptid-Screening/eine Peptid-Kartierung für antigene Stellen gezeigt werden kann. Diese Stellen können als einzelne Epitope oder kontinuierliches Polypeptid oder in einer Version von in vitro oder synthetisch gespleißten Antigenen exprimiert werden. Die Antigenität der exprimierten Produkte kann durch eine Fixierung und ein Blotting des Antigens im Western-Blot-Assay gezeigt werden. Konstruktionen zur Antigen-Expression in E. coli können erfolgen, indem herkömmliche Techniken unter Verwendung von synthetischen Genen, Restriktionsfragmenten von klonierten viralen Genomsegmenten, unter Verwendung von mit Exonuclease oder DNase I getrimmten Produkte davon oder unter Verwendung von sequenzspezifischen synthetischen Primern, die das gewünschte 5'- und 3'-Ende des zu exprimierenden Fragments zusammen mit geeigneten Restriktionsorten definieren, verwendet werden. Diese Restriktionsorte können leicht zur Ligation in ein Feld von mehrfach klonierende Orte (pEX) aufweisenden Expressionsvektoren verschiedener Organismen wie denjenigen, die von PLc24 (Remault et al., 1981 Gene 15, 81–83) stammen, verwendet werden.
• Es wurde gezeigt, dass die exprimierten Antigene mit Seren von Patienten spezifisch reagieren. Das p27(24) des gag von HIV-D205 reagiert sehr empfindlich mit sowohl typischen HIV-1-Seren als auch mit typischen HIV-2-Seren (siehe Kühnel et al.).

Claims (6)

1. Virusisolat HIV-2 D205 (ECACC V 87122304), das zur in-vitro-Replikation von Knochenmarkzellen stammende Zellen bevorzugt.
2. Virus-RNA, die sich um bis zu 5% von der Nucleotidsequenz der Virusisolate gemäß Anspruch 1 unterscheidet.
3. RNA nach Anspruch 2, wobei die RNA als Hybrid mit komplementär markierten RNA-Strängen vorliegt.
4. Verfahren zum Nachweis von HIV-verwandten Nucleinsäuren (DNA und RNA) in biologischen Proben, Zellen und in isolierter Form durch Verwendung der Nucleinsäuren nach den Ansprüchen 2 oder 3.
5. Isolierte Zellen, die mit Nucleinsäuren nach einem der Ansprüche 2 oder 3 transformiert worden sind.
6. Isolierte Zellen, die mit dem Virusisolat nach Anspruch 1 infiziert worden sind.

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