DE69232975T2 - Protein p100von menschlichem Herpesvirus Typ 6, die korrespondierenden DNS Squenzen, ihre Herstellung und Verwendung - Google Patents

Protein p100von menschlichem Herpesvirus Typ 6, die korrespondierenden DNS Squenzen, ihre Herstellung und Verwendung Download PDF

Info

Publication number
DE69232975T2
DE69232975T2 DE69232975T DE69232975T DE69232975T2 DE 69232975 T2 DE69232975 T2 DE 69232975T2 DE 69232975 T DE69232975 T DE 69232975T DE 69232975 T DE69232975 T DE 69232975T DE 69232975 T2 DE69232975 T2 DE 69232975T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
protein
hhv
dna
sequence
dna sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69232975T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69232975D1 (de
Inventor
Frank Neipel
Bernhard Fleckenstein
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Original Assignee
Dade Behring Marburg GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dade Behring Marburg GmbH filed Critical Dade Behring Marburg GmbH
Publication of DE69232975D1 publication Critical patent/DE69232975D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69232975T2 publication Critical patent/DE69232975T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16511—Roseolovirus, e.g. human herpesvirus 6, 7
    • C12N2710/16522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/94—Saccharomyces
    • Y10S435/942—Saccharomyces cerevisiae

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Human-Herpesvirus Typ 6-Protein p100 und auf Teile hievon, welche dessen spezifischen immunologischen Eigenschaften, wie sie hierin nachstehend angeführt sind, besitzen.
  • Sie bezieht sich ferner auf DNA-Sequenzen, welche für das genannte Protein oder für Teile hievon codieren, auf diese DNA-Sequenzen enthaltende rekombinante Vektoren und auf die mit diesen Vektoren transformierten Wirtsorganismen. Darüber hinaus bezieht sie sich auf die Herstellung der Proteine und der DNA-Sequenzen und auf deren Verwendung in pharmazeutischen oder diagnostischen Zusammensetzungen.
  • Vom Human-Herpesvirus Typ 6 (HHV-6) wurde vor kurzem gezeigt, daß er mit dem Human-Cytomegalovirus (HCMV) eng verwandt ist auf Basis der Aminosäuresequenzhomologie (Littler et al., 1990; Lawrence et al., 1990; Chang und Balachandran, 1991; Neipel et al., 1991), der genomischen Stellung und Orientierung der konservierten Herpesvirus-Gene (Neipel et al., 1991); und der Antigeneigenschaften (Larcher et al., 1988; Yamamoto et al., 1990; Littler et al., 1990). Bislang sind nur zwei Proteine von HHV-6 und deren Gene detaillierter beschrieben worden: das Hauptcapsidprotein (MCP) (Littler et al., 1990) mit einem Molekulargewicht von 135 kda und ein Phosphoprotein von 41 kda, welches als HHV-6 p41 bezeichnet wurde (Chang and Balachandran, 1991). Das letztgenannte ist zu UL44 von HCMV homolog.
  • Um Infektionen unterscheiden zu können, welche durch HHV6 und HCMV hervorgerufen werden, ist es wünschenswert, ein Reagenz zu besitzen, welches für den Human-Herpesvirus Typ 6 spezifisch ist.
  • Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht daher im wesentlichen darin, ein Protein mit immunogenen Eigenschaften und der Fähigkeit bereitzustellen, die Ausbildung von Antikörpern zu induzieren, welchem eine Kreuzreaktivität mit HCMV und anderen Human-Herpesviren fehlt. Darüber hinaus ist es ein technisches Problem, die entsprechenden DNA-Sequenzen bereitzustellen.
  • Die Lösung für dieses technische Problem wird durch Bereitstellen der in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf eine isolierte DNA-Sequenz, welche für das HHV-6 (Humanherpesvirus Typ 6)-Protein p100 mit der in der Tabelle 3 angegebenen Aminosäuresequenz kodiert, ausgehend von der Position, welche dem Nucleotid 639 entspricht, bis zur Position, welche dem Nucleotid 3248 entspricht.
  • Das Protein p100 ist ein Strukturprotein vom Human-Herpesvirus Typ 6 mit einem Molekulargewicht von etwa 100 kda, welches teilweise zu pp150 von HCMV homolog ist. Es kann durch Expression des Gens erhalten werden, welches in der Region der EcoRI-Fragmente 6/7 vom HHV-6-Stamm U1102 befindlich ist (Distanz zum linken Ende des HHV-6-Genoms 21-25 kb). Das Protein p100 besitzt immunogene Eigenschaften und es fehlt ihm die Kreuzreaktivität mit Human-Cytomegalovirus und anderen Human-Herpesviren (Yamamoto et al., 1990). Es kann daher als Reagenz zur Detektion von HHV-6-Antikörpern und für die differenzierende Diagnose von HHV-6-Infektionen gegenüber CMV-Infektionen verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf die entsprechende DNA-Sequenz, welche in Tabelle 3 angeführt ist, von Position 639 bis zur Position 3248.
  • Die für p100 kodierende DNA-Sequenz kann aus einem HHV-6-Genom wie es hierin beschrieben ist, isoliert werden. Wenn sich die erhaltene DNA-Sequenz von der in Tabelle 3 angeführten DNA-Sequenz unterscheidet, kann die vorstehende DNA daraus durch herkömmliche in vitro Mutagenesetechniken erhalten werden. Darüber hinaus wird der Fachmann, ausgerüstet mit der hierin beschriebenen technischen Lehre fähig sein, die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung durch herkömmliche DNA-Synthesetechniken zu erhalten.
  • In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine DNA-Sequenz, welche mit der vorstehenden DNA-Sequenz hybridisiert und für ein Protein mit den spezifi- schen immunologischen Eigenschaften des HHV-6-Proteins p100 kodiert. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck "Hybridisierung" auf herkömmliche Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridisierungsbedingungen unter welchen der Tm-Wert zwischen Tm = –20 und Tm = –27°C liegt. Am stärksten bevorzugt bezieht sich der Ausdruck "Hybridisierung" auf stringente Hybridisierungsbedingungen. Der Ausdruck "mit den spezifischen immunologischen Eigenschaften" charakterisiert das gesamte durch die Aminosäuresequenz in Tabelle 3 definierte Protein ebenso wie Teile dieses Proteins, welche mit für das Protein spezifischen Antikörpern reagieren und im wesentlichen keine Kreuzreaktivität auf Komponenten von Human-Cytomegalovirus und andere Herpesviren zeigen. Beispiele derartiger immunogener Teile oder Epitope des Proteins sind die Aminosäuresequenzen, welche von der in Tabelle 3 von Position 2960 bis zur Position 3141 angegebenen Nucleotidsequenz codiert werden oder von der in Tabelle 3 von Position 2408 bis zur Position 2959 angegebenen Nucleotidsequenz codiert werden. Diese Epitope können auch in der nachstehend beschriebenen diagnostischen Zusammensetzung verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf rekombinante Vektoren, welche die vorstehenden DNA-Sequenzen enthalten, wobei die DNA-Sequenzen unter der Kontrolle eines homologen oder eines heterologen Promotors stehen können, der deren Expression in einer gewünschten Wirtszelle erlaubt.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird von einem Wirtsorganismus gebildet, welcher mit einem der rekombinanten Vektoren der vorliegenden Erfindung transformiert wurde, wobei der Wirtsorganismus ein Bakterium, vorzugsweise der Gattung Escherichia, eine Hefe, vorzugsweise der Gattung Saccharomyces, eine Pflanzenzelle oder eine Tierzelle, vorzugsweise eine Säugetierzelle ist.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Herstellung des HHV-6-Proteins p100, welche die Schritte des Kultivierens eines transformierten Wirtsorganismus und das Gewinnen des genannten Proteins aus der Kultur umfaßt.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, welche das HHV-6-Protein p100 oder Teile hievon mit dessen spezifischen immunologischen Eigenschaften, wie sie vorstehend beschrieben sind, enthalten, wobei die pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Prophylaxe oder Behandlung von HHV-6-Infektionen nützlich sind.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, eine das HHV-6-Protein p100 oder Teile hievon mit dessen spezifischen immunologischen Eigenschaften, wie sie vorstehend beschrieben sind, oder die entsprechenden DNA-Sequenzen der Erfindung enthaltende Zusammensetzung bereitzustellen.
  • Diese Zusammensetzungen können zusätzlich Teile des Hauptcapsidproteingens von HHV-6, insbesondere die DNA-Sequenzen, welche in Tabelle 1 angegeben sind, und/oder das durch diese DNA-Sequenzen codierte Polypeptid oder Teile des Gens, welche für das phosphorylierte HHV-6-Protein von 41 kda codieren, insbesondere die in Tabelle 2 angegebene DNA-Sequenz und/oder die durch diese DNA-Sequenzen codierten Polypeptide enthalten. Da das HHV-6-Protein p100 die Fähigkeit besitzt, die Bildung von Antikörpern zu induzieren, welchen eine Kreuzreaktivität mit Human-Cytomegalovirus oder Human-Herpesviren fehlt, kann es in der differenzierenden Diagnose zur Unterscheidung angewandt werden, ob eine Infektion durch HHV-6 oder Human-Cytomegalovirus oder andere Herpesviren hervorgerufen wird.
  • Die vorliegende Erfindung wird detaillierter in der folgenden Beschreibung und in den Figuren erläutert:
  • 1 zeigt die DNA-Sequenzen der viralen Inserts der Klone pMF94 und pMF295. Beide Sequenzen sind Teile des Hauptcapsidproteingens von HHV-6, wie es in Littler et al., 1990, veröffentlicht ist.
  • 2 zeigt die DNA-Sequenz des viralen Inserts des Klons pMF90. Die Sequenz ist mit den Nucleotiden 117–194 der Sequenz identisch, welche in Chang and Balachandran, 1991, veröffentlicht ist.
  • 3 zeigt die vollständige DNA-Sequenz der HHV-6 EcoRI-Fragmente mit den Nummern 6 und 7 (beginnend vom linken Ende). Diese Fragmente enthalten das gesamte p100-Gen von HHV-6. Darüber hinaus ist die Aminosäuresequenz von p100 gezeigt.
  • 1 zeigt eine Western-Blot-Analyse, worin Antiserum von Hasen, immunisiert mit HHV-6 infizierten HSB-2-Zellen, und Antikörper gegen das HHV-6-Protein p100, gereinigt aus diesem Antiserum, mit viralen Proteinen umgesetzt werden.
  • 2 zeigt die Restriktionskarte des HHV-6-Genoms.
  • 3 zeigt die Ergebnisse der Expression von HHV-6-Proteinen im Expressionsvektor pROS in einem Westernblot mit Hasenserum und einer PAGE-Coomassie-Färbung.
  • 4 zeigt die Reaktivität des Serums von vier Patienten mit HHV-6-Epitopen.
  • Die für die immunogenen Proteine und Teile hievon codierenden DNA-Sequenzen wurden in einer genomischen HHV-6-Genbank mit mono- und polyspezifischen Hasen-Antiseren gegen HHV-6-Proteine identifiziert.
  • Die Hasen wurden mit ganzen HHV-6 infizierten HSB-2-Zellen immunisiert. Das erhaltene Antiserum reagierte mit mindestens 7 viralen Proteinen (4.). Die Antikörper gegen ein 100 kda Protein von HHV-6 wurden aus diesem Serum gereinigt. Für diesen Zweck wurde das gesamte virale Protein einer präparativen SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese unterzogen. Das virale Protein mit einem Molekulargewicht von 100 kda wurde auf Nitrozellulosemembranen übergeführt und mit dem verdünnten Hasenserum inkubiert. Antikörper, welche spezifisch an die Nitrozelluloseblätter gebunden wurden, wurden mit 100 mM Glycin bei pH 2,7 eluiert. Die erhaltenen Antikörper reagierten spezifisch mit einem HHV-6-Virionprotein von etwa 100 kda (4). Beide Serumpräparationen wurden verwendet, um die Genombank zu screenen.
  • Das Konstrukt einer Genombank-DNA von Cosmiden, welche das gesamte HHV-6-Genom in überlappenden Fragmenten enthielten, wurde durch Beschallung geschert. Nach der Zugabe von EcoRI-Linkern, nach EcoRI-Verdauungen und einer Größenfraktionierung wurde es in den kommerziell verfügbaren Vektor lambda zapII (Stratagene Inc., La Jolla, USA) ligiert. Nach einem in vitro-Packaging wurde eine Genbank von 3 × 105 unabhängigen Rekombinanten erhalten. Positive Klone wurden durch immunologisches Screenen unter Verwendung der erwähnten Seren und eines kommerziell verfügbaren Detektionssystems ("Pico blue", Stratagene Inc., La Jolla, USA) identifiziert. Die identifizierten lambda-Klone wurden anschließend in den Bluescript SK-Vektor durch "in vivo-Excision", unter Befolgung der Instruktionen des Lieferanten (Stratagene Inc.) subkloniert. Vier Klone, welche in Western-Blots besonders reaktiv waren (pMF101, pMF90, pMF94, pMF295) wurden für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Die Inserts dieser Klone wurden durch die Sanger-Kettenabbruchmethode sequenziert. Die Daten wurden mittels Genetics Computer Group (GCG, Madison, Wisconsin, USA) Sequenzanalysepackage analysiert. Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen wurden für Homologieuntersuchungen mit dem Computerprogramm FASTA (Pearson & Lipman, 1988) in einer Bankherangezogen, welche alle publizierten Herpesvirussequenzen enthält. Von den Klonen pMF94 und pMF295 wurde festgestellt, daß sie Teile des veröffentlichten Hauptcapsidproteingens von HHV-6 (1) (Littler et al., 1990) enthalten, wogegen pMF90 Teile eines offenen Leserahmens enthält, welcher zu UL44 von HCMV (2) homolog ist. Das entsprechende HHV-6-Gen wurde vor kurzem identifiziert unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen ein phosphoryliertes HHV-6-Protein von 41 kda (Chang and Balachandran, 1991). Jedoch ist das von Chang et al. identifizierte Epitop nach der Aminosäure 227 von deren Sequenz angeordnet, wogegen pMF90 nur die Aminosäuren 119–187 abdeckt. Es konnte kein homologes Gen für die vorhergesagte Aminosäuresequenz des Klons pMF101 gefunden werden. Das Insert von pMF101 wurde verwendet, um das Gen im Virusgenom zu lokalisieren. Durch Hybridisierung mit 7 Cosmidklonen, welche das gesamte HHV-6-Genom (Neipel et al., 1991) umfassen, konnte es innerhalb eines 1,4 kb EcoRI-Fragmentes nahe dem linken terminalen Repeat (2) lokalisiert werden. Ein weiteres Sequen zieren in diesem Gebiet erbrachte einen offenen Leserahmen, welcher für ein Protein von 870, Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 97 kda codiert (welches hierin nachstehend als p100 bezeichnet wird).
  • Fünf Fragmente von p100, umfassend nahezu das vollständige Protein (pDF446-4, pDF446-3, pD2Hae, pD2Hind, pMF101R) wurden. prokaryontisch als β-Galactosidase-Fusionsprotein im Vektor pROS (Ellinger et al.) exprimiert. In Western-Blot-Assays, reagierten nur die Carboxy-terminalen Klone sowohl mit Hasen- als auch mit Human-HI3V-6-positiven Seren (3, 4). Das von pMF101R exprimierte Fusionsprotein wurde verwendet, um Antikörper aus Hasenserum, wie vorstehend beschrieben, zu reinigen. Die Antikörper wurden verwendet, um Western-Blot-Analysen mit HHV-6-infizierten und nicht-infizierten HSB-2-Zellen durchzuführen. Ein Protein von 100 kda wurde nur in infizierten Zellen festgestellt. Von allen bislang untersuchten Expressionsklonen wurden die Carboxy-terminalen Teile von p100 am verläßlichsten von Human-HHV-6-positiven Seren in Western-Blot-Analysen erkannt. Da es nur mit großem technischem Aufwand möglich wäre, Virionproteine in den für diagnostische Hilfsmittel erforderlichen Mengen zu isolieren, ist die Art der Herstellung durch Gentechnologie gemäß der Erfindung besonders vorteilhaft. In Western-Blot-Analysen, worin HHV-6-infizierte Zellen verwendet werden, wird ein Protein von 100 kda durch Human-Seren am verläßlichsten erkannt. Es konnte nicht erwartet werden, daß prokaryontisch exprimiertes p100 oder Teile hievon zwangsläufig von Human-Seren erkannt werden, da das homologe Gen HCMV für ein viel größeres Protein codiert und die immunogenen Teile des HHV-6-Gens keine Homologie zu HCMV pp150 zeigten. Es ist auch überraschend, daß der prokaryontisch exprimierte Teil eines phosphorylierten HHV-6-Proteins, welches homolog zu HCMV UL44 (pMF90) ist, durch die meisten HHV-6-positiven Human-Seren erkannt wird.
  • Es ist auf Grund der Erfindung möglich, p100 und/oder das Fragment des UL44-Homologen von HHV-6 (pMF90) und/oder das phosphorylierte HHV-6-Protein von 41 kD, oder immunogene Teile hievon, welche in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen, beispielsweise Hefezellen, Human- oder Tierzellen herge= stellt wurden, als Reagenz zur Feststellung von HHV-6-Antikörpern, beispielsweise in einem ELISA-Assay zu verwenden:
  • BEISPIEL
  • Ein Fragment von 182 bp aus dem Carboxy-terminalen Teil von HHV-6 p100 (Nucleotide 2960–3141 in 3) wurde in den Expressionsvektor pROS (Ellinger, S. et al., 1989) ligiert. Der Klon wird als pMF101R bezeichnet. Die BamHI-HindIII-Fragmente vom Plasmid pMF90, pMF94 und pMF295 wurden ebenfalls in pROS ligiert. Sie werden als pD2MF90, pD2MF94 bzw, pD2MF295 bezeichnet. Der Transformation des entstehenden Hybridplasmids in E. coli JK50 folgte die Isolierung von Klonen, deren Plasmid-DNA das erwartete Restriktionsmuster aufwies. Nach Induktion des lac-Promotors mit Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) exprimierten die Klone große Mengen eines Fusionsproteins mit einem viralen Anteil. Die Fusionsproteine wurden aus den Bakterienzellen isoliert und in Western-Blot-Experimenten eingesetzt. Alle Human-Seren, welche in einem Standard Immunofluoreszenz-Assay unter Verwendung von HHV-6-infizierten HSB-2-Zellen HHV-6-positiv waren, erkannten mindestens eines der Fusionsproteine (3). Human-Seren, von denen unter Verwendung der Immunofluoreszenz festgestellt wurde, daß sie HHV-6-negativ waren, reagierten schwach öder überhaupt nicht.
  • Die prokaryontisch exprimierten Teile von p100 oder das UL44-Homologe von HHV-6 können in einem diagnostischen Assay verwendet werden, welches empfindlicher und spezifischer als die bislang verwendete Immunofluoreszenz ist.
  • Referenzliteratur:
  • Chang, C. K. und Balachandran, N. (1991) Identification, Characterization, and Sequence Analysis of a cDNA Encoding a phosphoprotein of Human Herpesvirus 6. J. Virol., 65: 2884–2894
    Larcher, C., Huemer, H. P., Margreiter, R., und Dierich, M. P. (1988) Serological crossreaction of human herpesvirus-6 with cytomegalovirus (letter). Lancet, 2: 963–964
    Lawrence, G. L., Chee, M., Craxton, M. A., Compels, U. A., Honess, R. W., und Barrell, B. G. (1990) Human herpesvirus 6 is closely related to human cytomegalovirus. J. Virol., 64: 287-299
    Littler, E., Lawrence, G., Liu, M. Y., Barrell, B. G., und Arrand, J. R. (1990) Identification, cloning, and expression of the major capsid protein gene of human herpesvirus 6. J. Virol., 64: 714–722
    Neipel, F., Ellinger, K., und Fleckenstein, B. (1991) The unique region of the human herpesvirus type 6 genome is essentially colinear to the UL segment of human cytomegalovirus. J. Gen. Virol.
    Yamamoto, M., Black, J. B., Stewart, J. A., Lopez, C., und Pellen, P. E. (1990) Identification. of a nucleocapsid protein as a specific serological marker of human herpesvirus 6 infection. J. Clin. Microbiol., 28: 1957–1962
    Ellinger, S., Glockshuber, R., Jahn, G., und Plückthun, A. (1989) Cleavage of procaryotically expressed human immunodeficiency virus fusion proteins by factor Xa and application in western blot (immunoblot) assays; J. Cllin. Microbiol. 27 (5): 971–976
    Pearson, W. R., and Lipman, D. J. (1988) Improved tools for biological sequence comparison; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85 (8): 2444–2448.
  • Abb. 1
  • Sequenzen der viralen Inserts der Klone pMF94 und pMF295. Beide Sequenzen sind Teil des Hauptcapsidprotein-Gens von HHV-6 wie es in (Littler et al., 1990) veröffentlicht ist. Nucleotidsequenz von pmF94
    Figure 00110001
    Nucleotidsequenz von pMF295
    Figure 00110002
  • Abb. 2
  • Sequenz des viralen Inserts des Klons pMF90. Die Sequenz ist identisch mit den Nucleotiden 117–194 der Sequenz, welche in (Chang und Balachandran, 1991) veröffentlicht ist.
  • Figure 00120001
  • Abb. 3
  • Vollständige Sequenz der HHV-6 EcoRI-Fragmente mit den Nummern 6 und 7 (ausgehend vom linken Ende). Diese Fragmente enthalten das gesamte p100-Gen von HHV-6. Die Position von pR05-Expressionsklonen ist in der Sequenz angegeben.
  • Figure 00130001
  • Figure 00140001
  • Figure 00150001
  • Figure 00160001
  • Figure 00170001
  • Figure 00180001
  • Figure 00190001
  • Figure 00200001
  • Figure 00210001
  • Figure 00220001
  • Figure 00230001

Claims (18)

  1. Isolierte DNA-Sequenz, welche für das HHV-6(Human-Herpesvirus Typ 6)-Protein p100 mit der in Tabelle 3 angegebenen Aminosäuresequenz codiert, ausgehend von der Position, welche dem Nucleotid 639 entspricht, bis zur Position, welche dem Nucleotid 3248 entspricht.
  2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, mit der Nucleotidsequenz von der Position 639 bis zur Position, welche dem Nucleotid 3248 entspricht.
  3. DNA-Sequenz, welche an eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 hybridisiert und für das gesamte Protein codiert, das durch die Aminosäuresequenz in Tabelle 3 definiert ist, oder für Teile des genannten Proteins, welche mit Antikörpern reagieren, die für das genannte Protein spezifisch sind, und im wesentlichen ohne Kreuzreaktivität gegenüber Komponenten von Human-Cytomegalovirus und anderen Herpesviren.
  4. DNA-Sequenz nach Anspruch 3 mit der in Tabelle 3 angegebenen Nucleotidsequenz von der Position 2960 bis zur Position 3141.
  5. DNA-Sequenz nach Anspruch 3 mit der in Tabelle 3 angegebenen Nucleotidsequenz von der Position 2408 bis zur Position 2959.
  6. HHV-6-Protein p 100 oder ein Teil hievon, welcher mit Antikörpern reagiert, die für das Protein mit der in Tabelle 3 angegebenen Aminosäuresequenz spezifisch sind, und im wesentlichen ohne Kreuzreaktivität gegenüber Komponenten von Human-Cytomegalovirus und anderen Herpesviren, welches durch eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert wird.
  7. Rekombinanter Vektor, umfassend die DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
  8. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 7, worin die genannte DNA-Sequenz von einem homologen oder heterologen Promotor reguliert wird, welcher deren Expression in einer gewünschten Wirtszelle erlaubt.
  9. Transformierter Wirtsorganismus, erhältlich durch Transformation mit dem Vektor nach Anspruch 7 oder 8.
  10. Transformierter Wirtsorganismus nach Anspruch 9, welcher ein Bakterium, vorzugsweise vom Genus Escherichia, eine Hefe, vorzugsweise vom Genus Saccharomyces, eine Pflazenzelle oder eine Tierzelle, vorzugsweise eine Säugetierzelle ist.
  11. Verfahren zur Herstellung des HHV-6-Proteins p100 oder eines Teils hievon wie in Anspruch 6 beansprucht, umfassend die Schritte des Kultivierens des transformierten Wirtsorganismus wie in Anspruch 9 oder 10 beansprucht und das Gewinnen des genannten Proteins oder des genannten Teils hievon aus der Kultur.
  12. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Protein nach Anspruch 6, wahlweise in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder Verdünnungsmittel.
  13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12 zur Prophylaxe oder Behandlung von HHV-6-Infektionen.
  14. Zusammensetzung, umfassend einen Teil des HHV-6-Proteins p100 wie in Anspruch 6 beansprucht und/oder die für den genannten Teil codierende DNA, wie sie in einem der Ansprüche 2 bis 5 beansprucht wird.
  15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, welche zusätzlich Teile des Hauptcapsidproteingens von HHV-6, insbesondere die in Tabelle 1 angegebenen DNA-Sequenzen und/oder das durch diese DNA-Sequenzen codierte Polypeptid enthält.
  16. Zusammensetzung nach Anspruch 14, welche zusätzlich Teile der Gene, die für das phosphorylierte HHV-6-Protein von 41 kD codieren, insbesondere die DNA-Sequenzen, welche in Tabelle 2 angegeben sind, und/oder das Polypeptid enthält, für welches diese DNA-Sequenzen codieren.
  17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 16 zur Durchführung eines ELISA-Assays.
  18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 14 bis 17 für die unterscheidende Diagnose von HHV-6.
DE69232975T 1991-07-08 1992-06-15 Protein p100von menschlichem Herpesvirus Typ 6, die korrespondierenden DNS Squenzen, ihre Herstellung und Verwendung Expired - Lifetime DE69232975T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP91111338 1991-07-08
EP91111338 1991-07-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69232975D1 DE69232975D1 (de) 2003-04-30
DE69232975T2 true DE69232975T2 (de) 2004-03-04

Family

ID=8206915

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69232975T Expired - Lifetime DE69232975T2 (de) 1991-07-08 1992-06-15 Protein p100von menschlichem Herpesvirus Typ 6, die korrespondierenden DNS Squenzen, ihre Herstellung und Verwendung

Country Status (10)

Country Link
US (3) US5814475A (de)
EP (1) EP0524421B1 (de)
JP (1) JP3425164B2 (de)
AT (1) ATE235553T1 (de)
AU (1) AU666482B2 (de)
CA (1) CA2073282C (de)
DE (1) DE69232975T2 (de)
DK (1) DK0524421T3 (de)
ES (1) ES2194008T3 (de)
PT (1) PT524421E (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994003605A2 (en) * 1992-07-31 1994-02-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Compositions and methods for detecting human herpesvirus 6 strain z29
EP0893504B1 (de) 1997-07-11 2003-05-14 Fleckenstein, Bernard, Prof. Dr. Von Kaposi-sarkom assoziiertem Herpes-Virus (KSHV, HHV-8) kodiertes Polypeptid und dessen Verwendung in Diagnostik und Therapie
SE528319C2 (sv) * 2004-09-17 2006-10-17 Forskarpatent I Syd Ab Användning av humant herpesvirus 6 eller derivat av dessa för tillverkning av en farmaceutisk komposition för förebyggandet av atopi eller atopisk sjukdom, inklusive astma, hos barn
EP1994151A2 (de) * 2006-03-08 2008-11-26 University of Rochester Zusammensetzungen und verfahren zur erkennung und behandlung des humanen herpesvirus 6 (hhv-6)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4013536A1 (de) * 1989-05-04 1990-11-08 Univ Kansas Monoclonaler antikoerper fuer mit hhv-6 infizierte zellen und deren proteinmaterial sowie seine anwendungen
FR2651007B1 (fr) * 1989-08-18 1992-09-04 Pasteur Institut Fragments d'acides nucleiques et reactifs de diagnostic derives du genome de hhv6/sie et procede de diagnostic des infections a hhv6
DE4013526C2 (de) * 1990-04-27 1994-04-28 Rutenbeck Wilhelm Gmbh & Co Schaltungsanordnung zum Übertragen von Daten zwischen mehreren Geräten über eine Busleitung

Also Published As

Publication number Publication date
EP0524421B1 (de) 2003-03-26
DE69232975D1 (de) 2003-04-30
AU1945592A (en) 1993-01-14
PT524421E (pt) 2003-08-29
CA2073282C (en) 2005-12-06
US5827519A (en) 1998-10-27
EP0524421A1 (de) 1993-01-27
CA2073282A1 (en) 1993-01-09
ATE235553T1 (de) 2003-04-15
DK0524421T3 (da) 2003-07-21
US5814475A (en) 1998-09-29
US6174685B1 (en) 2001-01-16
JPH06113858A (ja) 1994-04-26
AU666482B2 (en) 1996-02-15
ES2194008T3 (es) 2003-11-16
JP3425164B2 (ja) 2003-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE68929467T3 (de) HIV-2 Varianten
DE3587394T3 (de) Rekombinante Virusproteine begleitet von lymphadenopathischem Syndrom und/oder "Acquired Immune Deficiency Syndrome" (AIDS).
DE69637264T2 (de) Virales Material und Multiple-Sklerose assoziierte Nukleotidfragmente mit diagnostischen, prophylaktischen und therapeutischen Verwendungen
DE3588251T2 (de) DNS-Fragmente des GAG-Gens von LAV
DE69214146T3 (de) Deletionsmutanten von bovinem herpuvirus-1, auf diese basierte impfstoffe,diagnosesätze für den nachweis von bovinem herpesvirus-1
DD283935A5 (de) Verfahren zur herstellung eines aids-virus-impfstoffes
EP0418827A1 (de) Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit
EP0591914A2 (de) Retrovirus aus der HIV-Gruppe und dessen Verwendung
EP0252531B1 (de) Strukturelles Phosphoprotein (pp 150) des menschlichen Cytomegalovirus, seine Herstellung und Verwendung
EP0268014A2 (de) Cytomegalovirus-DNA-Strukturen, Expressionsvektor dafür, CMV-Protein-Strukturen und deren Verwendung
DE69734387T2 (de) Ein kombiniertes antigen vom menschlichen cytomegalievirus und seine anwendung
DE69232975T2 (de) Protein p100von menschlichem Herpesvirus Typ 6, die korrespondierenden DNS Squenzen, ihre Herstellung und Verwendung
EP0252302A1 (de) Hauptglykoprotein des menschlichen Cytomegalovirus, seine Herstellung und Verwendung
DE19627031C2 (de) Nachweisverfahren für spezifische, gegen frühe HPV-Proteine gerichtete Antikörper
DE69333511T2 (de) Epstein-barr virus peptide, und antikörper gegen diese peptide
WO1992011370A2 (de) Von proteinen des hepatitis c-virus abgeleitete polypeptide und deren verwendung
EP0702083A2 (de) Polypeptide und Fusionsproteine bestehend aus dem UL 57 Leserahmen bzw. dem C-terminalen Bereich des Tegumentproteins pp150 aus HCMV, entsprechende Oligonucleotide und Nachweis reagentien
EP0926155B1 (de) Polypeptide mit Aminosäuresequenzen aus dem N-terminalen Bereich von gp116 von Cytomegalovirus und deren Verwendung bei der Diagnostik, Prophylaxe und Therapie
DE3942728C1 (en) New immunologically active proteins derived from Borelia burgdorferiensity polyethylene vessel and a high density polyethylene sealing cap - useful as vaccine and for quick accurate diagnosis of Borelia infections
EP0893504B1 (de) Von Kaposi-sarkom assoziiertem Herpes-Virus (KSHV, HHV-8) kodiertes Polypeptid und dessen Verwendung in Diagnostik und Therapie
EP0281803A1 (de) Immunogene Fusionsproteine, die Epstein-Barr-Virusproteine enthalten
DE19611234C1 (de) Tyrosin-Phosphatase-verwandtes Protein
EP0754755B1 (de) Rekombinante autologe Fusionsproteine des Epstein-Barr-Virus, diese enthaltende Testkits und Verfahren zum Nachweis von Epstein-Barr-Virus-spezifischen Antikörpern
EP0547446A2 (de) Impfstoffe auf Basis geänderter Boviner Herpesviren Typ 1
EP0322712B1 (de) Malaria-spezifische DNA-Sequenzen, ihre Expressionsprodukte und deren Verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: SIEMENS HEALTHCARE DIAGNOSTICS PRODUCTS GMBH, , DE