DE19627031C2 - Nachweisverfahren für spezifische, gegen frühe HPV-Proteine gerichtete Antikörper - Google Patents
Nachweisverfahren für spezifische, gegen frühe HPV-Proteine gerichtete AntikörperInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Spezifischen, gegen frühe HPV-
Proteine gerichteten Antikörpern in Körperflüssigkeiten. Ferner betrifft die Erfin
dung einen hierfür verwendbaren Kit. Desweiteren betrifft die Erfindung native
HPV-Proteine, die sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
eignen.
US-A-4 748 109 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von gegen HPV-Proteine
gerichteten Antikörpern in Körperflüssigkeiten, bei dem ein aus zerstörten HPV-
Virionen erhaltenes Protein an einen Träger gebunden wird. In diesem Patent ist
allerdings nicht beschrieben, daß das Protein in nativer Form vorliegt. Vielmehr wird
darauf hingewiesen, daß das Protein durch Behandlung der HPV-Virionen mit 1%
SDS und 2% Mercaptoethanol erhalten wird. Gemäß Beispiel 3 werden die HPV-
Virionen ferner 1 Minute gekocht. Das erhaltene Protein kann daher unmöglich in
nativer Form vorliegen und als solches nicht in einem immunologischen Nachweis
verfahren eingesetzt werden.
Kemeny, D. M, ELISA,. . .: Gustav Fischer Verlag, 1994, S. 50 und 51 ist ein
allgemeiner Stand der Technik bezüglich ELISAs, der nichts weiter als das Prinzip
dieser Technik ohne Hinweis auf spezielle Antigene oder Antikörper erläutert.
Datenbank: Medline auf STN. Derwent, AN 94322001 beschreibt einen ELISA mit
rekombinant hergestellten HPV 11 virus-like particles zum Nachweis von HPV-
Antikörpern.
Carter et al., in: Virology, 1991, Bd. 192, S. 513-521 beschreiben die Isolierung
des HPV-16 E7-Proteins aus Hefe. Hierzu wird gewonnenes Zellysat auf eine DEAE-
Sephadex-Säule gegeben und das HPV-16 E7-Protein durch Zugabe von 700 mM
NaCl eluiert. Das HPV-16 E7 Protein wird ferner einer 0,1% SDS-Lösung ausge
setzt und 5 Minuten gekocht, bevor es an einen Träger gebunden wird. Somit
beschreiben Carter et al. kein HPV-Protein, das in nativer Form vorliegt.
Es ist bekannt, daß viele Menschen an persistierenden Infektionen durch humane
Papillomviren (nachstehend mit HPVs bezeichnet) leiden. Ferner ist bekannt, daß
mehr als 95% aller Anogenitalkarzinome, insbesondere des Gebärmutterhalskrebs,
und ein beachtlicher Prozentsatz der Karzinome im Murid/Rachenraum mit persi
stierenden Infektionen durch HPVs assoziiert sind.
Desweiteren gibt es Hinweise, daß zur Entstehung von Karzinomen bei Zellen, die
eine persistierende Infektion durch HPVs aufweisen, eine unkontrollierte Expression
von HPV-Genen, insbesondere der Gene E6 und/oder E7, notwendig ist.
Der Nachweis einer solchen Expression könnte daher eine Möglichkeit sein, HPV-
assoziierte Karzinome frühzeitig zu erkennen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
bereitzustellen, mit dem die unkontrollierte Expression von HPV-Genen, insbeson
dere der Gene E6 und/oder E7, nachgewiesen werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen
erreicht.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Nachweis von spezifischen,
gegen frühe HPV-Proteine gerichteten Antikörpern, das folgende Verfahrensschritte
umfaßt
- (I) Inkubation eines nativen, Trägermaterial-gebundenen frühen HPV-Proteins mit Körperflüssigkeiten, und
- (II) Umsetzung von spezifischen, an das HPV-Protein gebundenen Anti körpern (a)
- - mit markierten, gegen die Antikörper (a) gerichteten Antikörpern (b), oder
- - mit unmarkierten Antikörpern (b) und letztere mit markierten, gegen die Antikörper (b) gerichteten Antikörpern (c).
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß
oftmals in Menschen, in denen eine unkontrollierte Expression von HPV Genen,
insbesondere der Gene E6 und/oder E7, vorliegt, Antikörper existieren, die gegen
die Expressionsprodukte dieser Gene gerichtet sind.
Der vorstehende Ausdruck "frühes HPV-Protein" umfaßt jegliches Protein eines jeglichen
HPV-Typs. Insbesondere betrifft der Ausdruck ein HPV-E6 und HPV-E7 Protein,
ganz besonders von HPV 16 und HPV 18. Das HPV-Protein kann eine Wildtyp-
Sequenz aufweisen. Auch kann es eine davon abweichende Sequenz haben, wobei
sich die Abweichungen in Form von Additionen, Deletionen und/oder Substitutio
nen von ein oder mehreren Aminosäuren darstellen können. Ferner kann das HPV-
Protein Teil eines Fusionsproteins sein.
Zur Herstellung eines HPV-Proteins können übliche Verfahren verwendet werden.
Günstig ist es, eine für ein HPV-Protein kodierende Nukleinsäure, insbesondere eine
DNA, in einen Expressionsvektor zu inserieren und diesen zur Transfektion bzw.
Transformation von Wirtszellen zu verwenden.
Der Fachmann kennt eine für ein frühes HPV-Protein kodierende Nukleinsäure (vgl.
Schwarz, E., 443-466 in "Papilloma Viruses and Human Diseases", (1987),
Springer-Verlag). Auch sind ihm hinsichtlich eines HPV-E6 und HPV-E7 Proteins,
insbesondere von HPV 16 und HPV 18, folgendes bekannt: EMBL-Datenbank, AC
KO2718 für HPV 16; Swiss-Protein-Datenbank P03126 für HPV 16-E6; Swiss-
Protein-Datenbank P03129 und Dürst, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60,
(1983), 3812-3815 für HPV 16-E7; EMBL-Datenbank, AC M20325 für HPV 18;
Swiss-Protein-Datenbank, PO6463 für HPV 18-E6; Swiss-Protein-Datenbank,
P06788 für HPV 18-E7.
Ferner sind dem Fachmann Expressionsvektoren bekannt. Im Falle eines Expres
sionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b
und pQE-8, wobei letzterer bevorzugt ist. Für die Expression in Hefe sind dies z. B.
pY100, Ycpad1 und pREP-L20, wobei letzterer bevorzugt ist. Für die Expression
in tierischen Zellen sind z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4 anzugeben, wäh
rend sich für die Expression in Insektenzellen besonders der Baculovirus-Expres
sionsvektor pAcSGHisNT-A eignet.
Desweiteren kennt der Fachmann Wirtszellen. Beispiele solcher Wirtszellen um
fassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und
SG13009, wobei letzterer bevorzugt ist, die Hefe-Stämme Saccharomyces cerevi
siae und Saccharomyces Pombe, wobei letzterer Stamm bevorzugt ist, und die
tierischen Zellen L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insek
tenzellen sf9.
Darüberhinaus kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte
Wirtszellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, ein exprimiertes HPV-
Protein zu isolieren und zu reinigen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können ein oder mehrere frühe HPV-Proteine, ins
besondere ein HPV-E6 und/oder HPV-E7 Protein, ganz besonders von HPV 16 und
HPV 18, gleichzeitig oder nacheinander eingesetzt werden. Sie liegen in nativer
Form vor. Damit werden alle natürlichen, auf den HPV-Proteinen liegenden Epitope
spezifischer Antikörper bereitgestellt. Dies optimiert den Nachweis spezifischer
Antikörper gegenüber HPV-Proteinen in denaturierter Form.
Zum Erhalt eines HPV-Proteins in nativer Form kann ein solches, wenn es in
denaturierter Form vorliegt, durch übliche Verfahren rückgefaltet werden. Günstig
ist es, das denaturierte Protein in einem Harnstoffpuffer, z. B. 10 mM Na-Phosphat,
pH 7,4, 10% Glycerin, 2 mM DTT, 8M Harnstoff, zu lösen, auf eine übliche
Hydroxylapatit-Säule, z. B. HA Ultrogel, IBF Biotechnics, zu laden, mit einem
üblichen Eluierungspuffer vorstehender Harnstoff-Molarität, z. B. 150 mM NaPi, pH
7,8, 10% Glycerin, 2 mM DTT, 1 M NaCl, 8 M Harnstoff, zu eluieren, gegen
einen üblichen Dialysepuffer absteigender Harnstoff-Molarität, z. B. 50 mM Tris-
HCl, pH 7,5, 0,1 mM ZnAc, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 4 M Harnstoff, zu dialysie
ren, auf einen üblichen Anionenaustauscher, z. B. Q-Sepharose (Pharmacia) zu
laden, mit einem üblichen Eluierungspuffer gleicher Harnstoff-Molarität wie vor
stehender Dialyse-Harnstoffpuffer, z. B. 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM ZnAc,
1 mM DTT, 1 M NaCl, 4 M Harnstoff, zu eluieren, einem üblichen Sammlungs
schritt, z. B. einer Gelfiltration, zu unterziehen und gegen einen üblichen Dialysepuf
fer, z. B. 5 mM Hepes, 5% Glycerin, 1 mM DTT, 20 µM ZnAc, zu dialysieren.
Alternativ ist es günstig, das denaturierte Protein in einem Harnstoffpuffer, z. B.
100 mM Phosphatpuffer, pH 8,0, 8M Harnstoff, zu lösen und einer schrittweisen
Dialyse gegen übliche Dialysepuffer, z. B. 50 mM Mops/NaOH, pH 7,8, 500 mM
NaCl, 20% Glycerin, 5 mM DTT, 100 µM ZnCl2, zu unterziehen. Die Dialysepuffer
weisen absteigende Harnstoff-Molaritäten, z. B. 8M, 3M, 1M bzw. OM auf. Die
Dialysen erfolgen in üblicher Weise, z. B. jeweils innerhalb von 24 Stunden. Nach
der letzten Dialyse wird ein rückgefaltetes HPV-Protein erhalten, das in üblicher
Weise, z. B. durch Gelfiltration, insbesondere an Superdex 200 (Pharmacia),
gesammelt wird. Ein HPV-Protein, das in vorstehender Weise rückgefaltet worden
ist, ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Erfindungsgemäß wird ein frühes HPV-Protein an ein Trägermaterial gebunden. Als
solches kann jegliches zur Bindung von Proteinen geeignete Material, insbesondere
Mikrotiterplatten, Röhrchen, Mikrokugeln und Objektträger, verwendet werden. Die
Bindung zwischen dem HPV-Protein und dem Trägermaterial kann nach üblichen
Verfahren erfolgen. Günstig ist es, wenn das HPV-Protein zusammen mit einem
den C-Terminus, z. B. 11 Aminosäuren, von SV40t-Antigen bildenden tag Polypep
tid als Fusionsprotein vorliegt, wodurch dieses über einen allgemein erhältlichen
gegen das tag Polypeptid gerichteten Antikörper an das Trägermaterial gebunden
werden kann.
Erfindungsgemäß wird ein an ein Trägermaterial gebundenes HPV-Protein mit
Körperflüssigkeiten inkubiert. Als solche sind sämtliche Flüssigkeiten gemeint, die
aus einem tierischen Körper, insbesondere einem Säugetier und ganz besonders
einem Menschen erhalten werden können. Die Flüssigkeiten umfassen vorzugs
weise Serum, Lymphe, Speichel, Sputum, Urin, Stuhl, Liquor, Galle und gastrointe
stinale Sekrete. Ferner gehören zu ihnen auch Flüssigkeiten, die aus festen Gewe
ben, wie Lunge, Gehirn und Knochenmark, Abstrichen und Biopsien sowie Tumo
ren, z. B. Anogenitalkarzinome, isoliert werden können. Die Inkubation des HPV-
Proteins mit den Körperflüssigkeiten kann nach üblichen Verfahren erfolgen.
Durch vorstehende Inkubation werden Antikörper, die spezifisch für ein frühes HPV-
Protein sind, an dieses gebunden. Solche Antikörper (nachstehend mit (a) bezeich
net) werden dann
- - mit markierten, gegen die Antikörper (a) gerichteten Antikörpern (b), oder
- - mit unmarkierten Antikörpern (b) und letztere mit markierten, gegen die Antikörper (b) gerichteten Antikörpern (c) umgesetzt.
Die Markierung kann radioaktiv oder nicht-radioaktiv sein. Im letzteren Fall werden
andere übliche Marker verwendet. Geeignet sind insbesondere Fluoreszenzfarb
stoffe, wie z. B. Fluoresceinisothiocyanat, und Enzyme, wie alkalische Phosphatase
oder Peroxidase. Als Verstärkersystem kann ein Biotin/Streptavidinkomlex einge
setzt werden. Die Marker sind allgemein erhältlich. Die Konjugierung mit den
Antikörpern (b) oder (c) erfolgt nach den Vorschriften des Herstellers. Auch sind
bereits markierte Antikörper (b) und (c) allgemein erhältlich.
Die Wahl der geeigneten Antikörper (b), ob markiert oder unmarkiert, hängt davon
ab, von welchem Tier bzw. welcher Tierart die verwendete Körperflüssigkeit
stammt. Handelt es sich beispielsweise um eine Flüssigkeit aus einem Menschen,
so werden als Antikörper (b) solche verwendet, die gegen humanes Immunglobulin
gerichtet sind. In entsprechender Weise werden, sofern zusätzlich noch Antikörper
(c) eingesetzt werden, diese bezüglich des Tieres oder der Tierart ausgewählt, aus
der die Antikörper (b) stammen. Die Wahl geeigneter Antikörper ist dem Fachmann
bekannt und kann ohne weiteres durchgeführt werden.
Die Umsetzung von gebundenen Antikörpern (a) mit markierten Antikörpern (b)
bzw. mit unmarkierten Antikörpern (b) und dann mit markierten Antikörpern (c)
kann in üblicher Weise erfolgen. Günstig ist es, die Umsetzung mit den Antikörpern
(b) in beiden Alternativen innerhalb von 1 h bei 37°C erfolgen zu lassen. Nach
mehreren Waschvorgängen wird dann in der ersten Alternative eine dem Marker
entsprechende Substratlösung zur Entwicklung der Nachweisreaktion zugegeben.
Dies erfolgt gemäß der Anleitung des Herstellers. In der zweiten Alternative
werden nach den Waschvorgängen die Antikörper (c) zugegeben. Deren Umset
zung und die Entwicklung der Nachweisreaktion erfolgen in entsprechender Weise.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist eine hohe Spezifität auf. Diese ist beson
ders hoch, wenn im Verfahrensschritt (I) ein HPV-tag-Fusionsprotein verwendet
wird. Ferner weist das erfindungsgemäße Verfahren eine hohe Sensitivität auf.
Diese ist besonders hoch, wenn im Verfahrensschritt (II) auch die Antikörper (c)
eingesetzt werden. Desweiteren ist es oftmals günstig, wenn im Verfahrensschritt
(I) zusätzlich ein oder mehrere denaturierte HPV-Proteine und/oder ein oder mehre
re Fragmente davon eingesetzt werden. Damit können spezifische Antikörper
nachgewiesen werden, die z. B. gegen Abbauprodukte eines HPV-Proteins gerichtet
sind. Die vorstehenden Ausführungen zum erfindungsgemäßen Verfahren, ins
besondere zur Bindung eines nativen HPV-Proteins an Trägermaterial und zur
Inkubation des Proteins mit Körperflüssigkeiten, gelten hier entsprechend.
Erfindungsgemäß wird auch ein Kit bereitgestellt, der zur Durchführung vorstehen
den Verfahrens geeignet ist. Dieser Kit enthält vorzugsweise
- - ein oder mehrere native, Trägermaterial-gebundene frühe HPV-Proteine, gegeben enfalls ein oder mehrere denaturierte, Trägermaterial-gebundene frühe HPV-Protei ne und/oder Fragmente davon, und markierte Antikörper (b) nach Anspruch 1 sowie übliche Waschpuffer und gegebenenfalls ein der Markierung ent sprechendes Substrat, oder
- - ein oder mehrere native, Trägermaterial-gebunden frühe HPV-Proteine, gegebe nenfalls ein oder mehrere denaturierte, Trägermaterial-gebundene frühe HPV- Proteine und/oder Fragmente davon und unmarkierte Antikörper (b) und markierte Antikörper (c) nach Anspruch 1 sowie übliche Wachpuffer und gegebenenfalls ein der Markierung entsprechendes Substrat.
Vorstehende Ausführungen zum erfindungsgemäßen Verfahren gelten hier ent
sprechend.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine unkontrollierte Expression von frühen
HPV-Genen, insbesondere der Gene E6 und/oder E7, nachzuweisen. Damit eignet
sich die Erfindung, HPV-assoziierte Karzinome frühzeitig zu erkennen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Es wurde von der Original-DNA von HPV 16 ausgegangen (vgl. Dürst M. et
al., vorstehend). Diese DNA wurde als Template für ein PCR-Verfahren
verwendet. Als Primer-Paar wurde verwendet: 5'-TTTGGATCCATGCATGG-
AGATACACCTACATTG-3' und 5'-TTTGTCGACTTATGGTTTCTGAGA-3'.
Der PCR-Ansatz und die Bedingungen waren standardmäßig.
Die amplifizierte DNA wurde mit BamHI und SalI gespalten und in den mit
BamHI und SalI geöffneten Hefe-Shuttle-Vektor pREP-L20 inseriert. Dieser
Vektor entspricht pREP3 (vgl. Maundrell, K., Gene 123 (1993), 127-130),
enthält aber die nachstehende "Multiple Cloning Site":
Es wurde das Expressionsplasmid pREP3-L20 HPV16-E7 erhalten. Dieses
wurde zur Transfektion von Schizosaccharomyces Pombe LEU 1 ,32 (vgl.
Bröker, M., Biotechniques, (1993), 119) verwendet. Die transfizierten
Hefezellen wurden in einem üblichen "Pombe min"-Medium in Anwesenheit
von Thiamin über Nacht kultiviert. Dadurch wurde der "no message thia
min"-Promotor des vorstehenden Expressionsplasmids unterdrückt. Nach
Wegwaschen des Thiamins und Kultivierung in Thiamin-freiem Medium
wurde der Promotor angeschaltet und das HPV 16-E7 Gen exprimiert. Das
HPV16-E7 Protein wurde nach mechanischem Aufbrechen der Hefezellen
isoliert.
Es wurde von der Original-DNA von HPV 16 ausgegangen (vgl. Dürst, M. et
al., vorstehend). Diese DNA wurde als Template für ein PCR-Verfahren
verwendet. Als Primer-Paar wurde verwendet: 5'-TTTTCTAGAA
GATCTATGCATGGAGATACACCT-3', und 5'-TTTGGATCCTGGTTTCT
GAGAACA-3. Der PCR-Ansatz und die Bedingungen waren standardmäßig.
Die amplifizierte DNA wurde mit BgIII and BamHI gespalten und in den mit
BgIII und BamHI geöffneten, für ein tag-Polypeptid kodierenden Bluescript-
Vektor pL441 inseriert. Das erhaltene DNA-Molekül wurde mit XbaI und SalI
gespalten und die HPV 16-E7 tag DNA isoliert. Diese DNA wurde in den mit
XbaI und SalI geöffneten Expressionvektor pREP-L20 (vgl. vorstehend)
inseriert. Es wurde das Expressionsplasmid pREP-L20 HPV 16-E7 tag erhal
ten. Dieses wurde zur Transfektion von Schizosaccharomyces Pombe Leu
1.32 (vgl. vorstehend) verwendet. Die Kultivierung der Hefezellen und die
Expression des HPV 16-E7 tag Gens sowie die Isolierung des HPV 16-E7
tag Fusionsproteins erfolgten wie in 1(a) beschrieben.
Das in Beispiel 1(a) erhaltene HPV 16-E7 Protein lag in unlöslicher, denatu
rierter Form vor. Es wurde in einem Puffer, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10%
Glycerin, 2 mM DTT, 6 M Guanidinhydrochlroid, 50 mM NaF, 0,1 mM Na-o-
Yanadat, gelöst. Zu seiner Rückfaltung wurde es in einem Harnstoffpuffer,
10 mM Na-Phosphat, pH 7,4, 10% Glycerin, 2 mM DTT, 8 M Harnstoff,
1 : 12 verdünnt und auf eine Hydroxylapatit-Säule (HA Ultrogel, IBF Bio
technics) geladen. Das HPV-Protein wurde mit einem Harnstoff-Eluierungs
puffer, 150 mM NaPi, pH 7,8,10% Glycerin, 2mM DTT, 8 M Harnstoff,
eluiert und gegen einen Harnstoff-Dialysepuffer, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5,
0,1 mM ZnAc, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 4 M Harnstoff, dialysiert. Das
Dialysat wurde auf einen Anionenaustauscher, Q-Sepharose (Pharmacia),
geladen und das HPV-Protein mit einem Harnstoff-Dialysepuffer, 50 mM
Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM ZnAc, 1 mM DTT, 1 M NaCl, 4 M Harnstoff,
eluiert. Das Eluat wurde einer üblichen Gelfiltration unterzogen und an
schließend gegen einen Dialysepuffer, 5 mM Hepes, 5% Glycerin, 1 mM
DTT, 20 µM ZnAc, dialysiert. Es wurde ein natives HPV 16-E7 Protein
erhalten.
Die Rückfaltung des in Beispiel 1(b) erhaltenen, denaturierten HPV 16-E7
tag Fusionsproteins erfolgte wie in Beispiel 2(a) beschrieben. Es wurde ein
natives HPV 16-E7 tag Fusionsprotein erhalten.
Zur Durchführung eines ELISA wurde die HPV 16-E7 Protein-Lösung von
Beispiel 2(a) in einem Carbonatpuffer, pH 9,6, verdünnt. Zur Beschichtung
einer 96-Loch-Platte wurden pro Loch 100 ng des HPV Proteins sowie
einmal Carbonatpuffer als Leerkontrolle zugegeben. Nach Inkubation über
Nacht bei 4°C schlossen sich 6 kurze Waschschritte mit PBS, 0,05%
Tween 20 an. Anschließend erfolgte die Blockierung freier Bindungsstellen
des polymeren Trägers durch einstündige Inkubation mit einem irrelevanten
Protein, z. B. Schweinehaut Gelatine, BSA oder Casein, wobei letzteres
bevorzugt ist, in PBS bei 37°C. Seren von Patientinnen mit Cervix-Carcinom
und von Kontrollpersonen jeweils aus Mexiko wurden in PBS (1 : 50 Ver
dünnung) 1 Stunde bei 37°C auf der Platte inkubiert. Nach erneutem Wa
schen mit PBS, 0,05% Tween 20 wurde ein allgemein erhältlicher Per
oxidase-gekoppelter Ziege Anti-Human Antikörper (Zymed Laboratories, CA,
USA; Verdünnung nach Angabe des Herstellers) zugegeben. Nach einstündi
ger Inkubation bei 37°C erfolgte ein erneutes Waschen und anschließend
die Peroxidase-Nachweisreaktion mit TMB-Entwicklungslösung (50 mM
Natriumacetat, 0,4 mM 3,3',5,5'-Tetramethyl-benzidin-dihydrochlorid, 4,4
mM H2O2) innerhalb 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Abstoppen
der Reaktion mit 1 M Schwefelsäure wurde die Farbintensität photometrisch
bei 450 nm bestimmt.
Es zeigte sich, daß durch ein HPV 16-E7 Protein HPV-spezifische Antikörper
in Seren von Cervix-Carcinom-Patientinnen nachgewiesen werden können.
Zur Durchführung eines ELISA mit dem HPV 16-E7 tag Protein von Beispiel
2(b) wurde eine 96-Loch-Platte mit 200 ng pro Loch des allgemein erhältli
chen, gegen das tag Polypeptid gerichteten monoklonalen Maus-Antikörpers
Mab tag (KT3) beschichtet. Hierzu wurde die Platte mit dem in vorstehen
dem Carbonatpuffer gelösten Antikörper über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach
sechs kurzen Waschschritten mit PBS, 0,05% Tween 20 wurde das in
vorstehendem Carbonatpuffer gelöste HPV 16-E7 tag Protein in einer Menge
von 100 ng pro Loch zugegeben. Die weiteren Verfahrensschritte erfolgten
wie in Beispiel 3(a) beschrieben.
Es zeigte sich, daß durch ein HPV 16-E7 tag Protein HPV-spezifische Anti
körper in Seren von Cervix-Carcinom-Patientinnen nachgewiesen werden
können.
Beide Nachweise in Beispiel 3(a) und (b) waren spezifischer als ein Ver
gleichs-ELISA, in dem ein HPV 16-E7-Fragment, d. h. kein natives Protein,
verwendet wurde. Die Spezifität des Nachweises von 3(b) war dabei noch
größer als jene des Nachweises von 3(a). In 3(a) wurden in 64 kontroll
werten 2 positive Beispiele erhalten, während in 3(b) all diese Kontrollwerte
negativ waren. Ferner konnten in 3(b) 28 von 73 Seren der Cervix-Carci
nom-Pafientinnen als HPV-spezifisch erkannt werden, während es in 3(a)
nur 20 waren.
Es wurde von dem Plasmid pGem-2/16 E6 ausgegangen, das eine für das
E6 Protein von HPV 16 kodierende DNA enthält (vgl. Werness, B.A. et al.,
Science, Band 248, (1990), 76-79). Diese DNA wurde als Template für ein
PCR-Verfahren verwendet. Als Primer-Paar wurde verwendet: 5'-
CAGGGATCCGATGACGATGACAAAATGTTTCAGGACCCACAGG-3' und
5'-GGGAAGCTTATTACAGCTGGGTTTCTCTAC-3'. Der PCR-Ansatz bzw.
die PCR-Bedingungen waren wie folgt:
Template DNA: | 1 µl = 1 ng |
Pfu-Polymerase 10x-Puffer: | 10 µl = 1 × |
DMSO: | 10 µl = 10% |
dNTP's: | 1 µl = je 200 µM |
Oligonukleotide, je 1,5 µl: | 3 µl = je 150 ng |
H2O-bidest: | ad 99 µl |
- - 92°C - 5 min
- - Zugabe von 1 µl Pfu-Polymerase (Stratagene) = 2,5 Einheiten
- - Zugabe von Paraffin
92°C | 1 min |
58°C | 1 min 1 Zyklus |
72°C | 10 min |
92°C | 1 min |
58°C | 1 min 39 Zyklen |
72°C | 2 min |
72°C | 10 min 1 Zyklus |
Die amplifizierte DNA wurde mit BamHI und HindIII gespalten und in den mit
BamHI und HindIII geöffneten Expressionsvektor pQE-8 (Diagen) inseriert.
Es wurde das Expressionsplasmid pQ/16/E6 erhalten. Dieses kodiert für ein
Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten und einer Enterokinase-Schnittstelle (N-
Terminuspartner) sowie dem E6 Protein von HPV 16 (C-Terminuspartner).
pQ/16/E6 wurde zur Transformation von E.coli SG 13009 (vgl. Gottesman,
S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273) verwendet. Die Bakterien
wurden in einem LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamy
cin kultiviert und 4 h mit 60 µ Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG)
induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wurde eine Lyse der
Bakterien erreicht, anschließend wurde mit dem Lysat eine Chromatographie
(Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben
des Herstellers (Diagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das
gebundene Fusionsprotein wurde in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach
seiner Neutralisierung wurde das Fusionsprotein einer 1 8% SDS-Polyacryla
mid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl.
Thomas, J.O. und Kornberg, R.D., J.Mol.Biol. 149 (1975), 709-733).
Es wurde ein reines HPV16-E6 Fusionsproten (MG ca. 18 kD) erhalten.
Dieses lag in denaturierter Form vor.
HPV 16-E7 und HPV 18-E6 (E7) Proteine wurden, wie in 4 (a) beschrieben,
hergestellt und gereinigt. Folgende Abweichungen wurden durchgeführt:
Zur Herstellung von HPV 16-E7 wurde von dem Plasmid pWV 2916 ausge
gangen, das eine für HPV 16 kodierende DNA enthält (vgl.Dürst, M. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 60, (1983), 3812-3815). Für das PCR-
Verfahren wurde als Primer-Paar verwendet: 5'-CAGGGATCCATGCATG
GAGATACACCTAC-3' und 5'-GGGAAGCTTATTATGGTTTCTGAGAACA
GATG-3'.
Nach Klonierung der amplifizierten DNA in pQE-8 (pQ/16/E7), wobei die
DNA keine Enterokinase-Schnittstelle aufwies, und Expression in SG 13009
sowie Reinigung wurde ein reines HPV 16-E7 Fusionsprotein (MG ca. 12
kD) erhalten. Dieses lag in denaturierter Form vor.
Zur Herstellung von HPV 18-E6 wurde von dem Plasmid pGem-1/18 E6
ausgegangen, das eine für das HPV 18-E6 Protein kodierende DNA enthält
(vgl. Werness, B.A. et al., vorstehend). Für das PCR-Verfahren wurde als
Primer-Paar verwendet: 5'-CAGAGATCTGATGACGATGACAA
AATGGCGCGCTTTGAGGATC-3', und 5'-GGGAAGCTTATTA
TACTTGTGTTTCTCTGCG-3'.
Nach Klonierung in pQE-8 (pQ/18/E6) und Expression in SG 13009 wurde
ein reines HPV 18-E6 Fusionsprotein (MG ca. 19 kD) erhalten. Dieses lag in
denaturierter Form vor.
Zur Herstellung von HPV 18-E7 wurde von dem Plasmid pGEM 3/91 ausge
gangen, das eine für HPV 18 kodierende DNA enthält (vgl. Roggenbuck, B.
et al., J. Virol., Band 65, (1991), 5068-5072). Für das PCR-Verfahren
wurde als Primer-Paar verwendet: 5'-CAGGGATCCATGCATGGACC
TAAGGCAAC-3' und 5'-GGGAAGCuATTACTGCTGGGATGCACACC-3'.
Nach Klonierung der amplifizierten DNA in pQE-8 (pQ/18/E7), wobei die
DNA keine Enterokinase-Schnittstelle aufwies, und Expression in SG 13009
wurde ein reines HPV 18-E7 Fusionsprotein (MG ca. 13 kD) erhalten. Dieses
lag in denaturierter Form vor.
Das in Beispiel 4(a) erhaltene HPV 16-E6-Protein wurde in einem Harnstoff-
Puffer (100 mM Phosphatpuffer, 8M Harnstoff, pH 8,0) gelöst und einer
schrittweisen Dialyse unterworfen. Die Dialysepuffer enthielten 50 mM
Mops/NaOH, pH 7,8, 500 mM NaCl, 20% Glycerin, 5 mM DTT, 100 µM
ZnCl2. Ferner wiesen sie 8 M, 3M, 1 M bzw. OM Harnstoff auf. Die einzelnen
Dialysen erfolgten jeweils innerhalb von 24 Stunden. Anschließend wurde
eine Gelfiltration an Superdex 200 (Pharmacia) durchgeführt.
Es wurde ein HPV 16-E6 Protein in nativer Form erhalten.
Die in Beispiel 4 (b) erhaltenen HPV 16-E7, HPV 18-E6 (E7) Proteine wur
den, wie in 5 (a) beschrieben, rückgefaltet. Es wurden entsprechende HPV-
Proteine in nativer Form erhalten.
Zur Durchführung eines ELISA wurden HPV 16-E6 und HPV 16-E7 Proteine aus
Beispiel 5 in Puffer (0,1 M NaH2PO4, pH 8,0) aufgenommen. Zur Beschichtung
einer 96-Loch-Platte wurden pro Loch je 100 µl mit 20 ng bzw. 8 ng der HPV
Proteine sowie einmal 1% BSA als Leerkontrolle einpipettiert. Nach Inkubation
über Nacht bei 4°C schlossen sich je 4 kurze Waschschritte mit PBS, 0,05%
Tween 20 im Abstand von 5 min an. Anschließend erfolgte die Blockierung freier
Bindungsstellen des polymeren Trägers durch über Nacht-Inkubation mit 1% BSA
in PBS, 0,05% Tween 20 bei 4°C. Ein zu testendes Serum einer Patientin mit
Gebärmutterhalskrebs wurde in 1 : 100 Verdünnung (PBS, 1% BSA, 0,05%
Tween 20) für 1 Stunde bei 37°C auf der Platte inkubiert ("Schachbrett-Titra
tion"). Nach 4 kurzen Waschschritten mit PBS, 0,05% Tween 20 im Abstand von
5 min wurde ein allgemein erhältlicher Peroxidase-gekoppelter Ziege Anti-Human
Antikörper (Verdünnung nach Angabe der Hersteller) zugegeben. Nach dreißigmi
nütiger Inkubation bei 37°C folgten wieder 4 Waschschritte, wie vorstehend, und
anschließend die Peroxidase-Nachweisreaktion mit TMB-Entwicklungslösung (50
mM Natriumacetat, 0,4 mM 3,3',5,5'-Tetramethyl-benzidin-dihydrochlorid- 4,4
mM H2O2) innerhalb 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Abstoppen der
Reaktion mit 2 M HCl wurde die Farbintensität photometrisch bei 450 nm be
stimmt. Absorptionswerte des mehr als doppelten der BSA-Kontrolle wurden als
positive Reaktion gewertet.
Es zeigte sich, daß HPV-E6 und HPV-E7 spezifische Antikörper im Serum einer
Patienten mit Gebärmutterhalskrebs nachgewiesen werden können.
Claims (16)
1. Verfahren zum Nachweis von spezifischen, gegen frühe HPV-Proteine gerichteten
Antikörpern in Körperflüssigkeiten, umfassend die folgenden Verfahrens
schritte:
- (I) Inkubation eines nativen, Trägermaterial-gebundenen frühen HPV-Proteins mit Körperflüssigkeiten, und
- (II) Umsetzung von spezifischen, an das frühe HPV-Protein gebundenen Anti
körpern (a)
- - mit markierten, gegen die Antikörper (a) gerichteten Antikörpern (b), oder
- - mit unmarkierten Antikörpern (b) und letztere mit markierten, gegen die Antikörper (b) gerichteten Antikörpern (c).
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrens
schritt (I) ein HPV-tag Fusionsprotein verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß im Ver
fahrensschritt (I) ferner ein oder mehrere denaturierte, Trägermaterial-gebun
dene HPV-Proteine und/oder Fragmente davon verwendet werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß
das frühe HPV-Protein ein HPV-E6 oder HPV-E7 Protein ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß
das frühe HPV-Protein von HPV 16 oder HPV 18 stammt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß im
Verfahrensschritt (I) mehrere native frühe HPV-Proteine verwendet werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß
das native HPV-Protein durch Rückfaltung eines entsprechenden denatu
rierten Proteins erhalten ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückfaltung
des denaturierten HPV-Proteins eine Lösung dieses Proteins in einem Harn
stoffpuffer und eine Dialyse des gelösten Proteins in üblichen, absteigende
Molaritäten von Harnstoff aufweisenden Puffern sowie eine Gelfiltration des
dialysierten Proteins umfaßt.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückfaltung
des denaturierten HPV-Proteins ein Lösen des Proteins in einem üblichen
Harnstoffpuffer, ein Aufbringen auf eine übliche Hydroxylapatit-Säule, ein
Eluieren mit einem üblichen Eluierungspuffer vorstehender Harnstoff-Molari
tät, ein Dialysieren gegen einen üblichen Dialysepuffer absteigender Harn
stoff-Molarität, ein Aufbringen auf einen üblichen Anionenaustauscher, ein
Eluieren mit einem üblichen Eluierungspuffer gleicher Harnstoff-Molarität wie
vorstehender Dialysepuffer, eine Durchführung einer Gelfiltration, und ein
Dialysieren gegen einen üblichen Dialysepuffer umfaßt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß
die Körperflüssigkeiten Serum, Lymphe, Speichel, Sputum, Urin, Stuhl,
Liquor, Galle, gastrointestinale Sekrete sowie aus festen Geweben und
Tumoren erhaltene Flüssigkeiten umfassen.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß
das Trägermaterial Mikrotiterplatten, Röhrchen, Mikrokugeln und Objekt
träger umfaßt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß
die Antikörper (b) in der ersten Alternative und die Antikörper (c) in der
zweiten Alternative mit einem Enzym markiert sind.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß
die Antikörper (b) in der ersten Alternative und die Antikörper (c) in der
zweiten Alternative mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß
die Antikörper (b) in der ersten Alternative und die Antikörper (c) in der
zweiten Alternative radioaktiv markiert sind.
15. Kit, enthaltend
- - ein oder mehrere native, Trägermaterial-gebundene frühe HPV-Proteine, gegebenenfalls ein oder mehrere denaturierte, Trägermaterial-gebun dene frühe HPV-Proteine und/oder Fragmente davon, und markierte Anti körper (b) nach Anspruch 1 sowie übliche Waschpuffer und gegebe nenfalls ein der Markierung entsprechendes Substrat, oder
- - ein oder mehrere native, Trägermaterial-gebundene HPV-Proteine, gegebenenfalls ein oder mehrere, denaturierte, Trägermaterial-gebun dene HPV-Proteine und/oder Fragmente davon, und unmarkierte Anti körper (b) und markierte Antikörper (c) nach Anspruch 1 sowie übli che Waschpuffer und gegebenenfalls ein der Markierung entsprechen des Substrat.
16. Native HPV-Proteine, erhalten durch das Verfahren nach einem der An
sprüche 7-9.
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