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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe synthetischer virusähnlicher
Partikel (VLP), welche sich zur Charakterisierung einer Human-Papillomavirus-Infektion
eignen, und Assays, welche die synthetischen virusähnlichen
Partikel einsetzen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Papillomavirus-Infektionen
treten bei einer Vielzahl von Lebewesen, einschließlich von
Menschen, Schafen, Hunden, Katzen, Kaninchen, Affen, Schlangen und
Rindern, auf. Papillomaviren infizieren Epithelzellen, wobei sie
im allgemeinen gutartige epitheliale oder fibroepitheliale Tumore
an der Infektionsstelle induzieren. Papillomaviren sind speziesspezifische
infektiöse
Agenzien; ein Human-Papillomavirus kann kein nicht-menschliches
Lebewesen infizieren.
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Papillomaviren
können
auf Grundlage des Wirts, den sie infizieren, in verschiedene Gruppen
eingeteilt werden. Human-Papillomaviren (HPV) werden weiterhin auf
der Grundlage von DNA-Sequenzhomologie in mehr als 60 Typen eingeteilt
(hinsichtlich eines Überblicks
siehe Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (Hrsg.), CRC
Press, Inc., 1990). Papillomavirus-Typen scheinen insofern typspezifische
Immunogene darzustellen, als eine neutralisierende Immunität gegen
Infektion durch einen Typ von Papillomavirus keine Immunität gegen
einen anderen Typ von Papillomavirus verleiht.
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Beim
Menschen verursachen verschiedene HPV-Typen unterschiedliche Erkrankungen.
Die HPV-Typen 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 26–29 verursachen gutartige Warzen
bei sowohl normalen als auch immungeschwächten Individuen. Die HPV-Typen
5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19–25,
36 und 46–50
verursachen flache Läsionen
bei immungeschwächten
Individuen. Die HPV-Typen 6, 11, 34, 39, 41–44 und 51–55 verursachen nicht-maligne Condylome
der Schleimhäute
der Genitalien oder Atemwege. Die HPV-Typen 16 und 18 verursachen
eine Epithel-Dysplasie der Genitalschleimhaut und sind mit der Mehrheit
von in situ- und invasiven Karzinomen des Gebärmutterhalses, der Vagina,
Vulva und des Analkanals assoziiert. HPV6 und HPV11 sind die Ursachen
für mehr
als 90% aller Condylome (Genitalwarzen) und laryngealer Papillome.
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Immunologische
Studien bei Tieren haben gezeigt, daß die Produktion neutralisierender
Antikörper gegen
Papillomavirus-Antigene eine Infektion mit dem homologen Virus verhindert.
Die Entwicklung wirksamer Papillomavirus-Vakzine wurde durch Schwierigkeiten,
die mit der Kultivierung von Papillomaviren in vitro verbunden sind,
verlangsamt. Die Entwicklung eines effektiven HPV-Vakzins wurde
insbesondere durch das Fehlen eines geeigneten Tiermodells verlangsamt.
Die Neutralisation von Papillomavirus durch Antikörper scheint typspezifisch
zu sein und abhängig
von Konformationsepitopen auf der Oberfläche des Virus.
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Papillomaviren
sind kleine (50–60
nm), nicht von einer Hülle
umgebene, ikosaedrische DNA-Viren, welche
für bis
zu acht frühe
und zwei späte
Gene kodieren. Die offenen Leserahmen (ORF) der Virusgenome werden
als E1 bis E7 und L1 und L2 bezeichnet, wobei "E" früh bedeutet
und "L" spät bedeutet.
L1 und L2 kodieren für
Virus-Kapsidproteine. Die frühen
(E) Gene sind mit Funktionen wie viraler Replikation und zellulärer Transformation
assoziiert.
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Das
L1-Protein ist das Haupt-Kapsidprotein und besitzt ein Molekulargewicht
von 55–60
kD. Das L2-Protein ist ein weniger häufiges Kapsidprotein, welches
ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 55–60 kD und ein scheinbares
Molekulargewicht von 75–100
kD, wie mittels Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt, aufweist.
Immunologische Daten legen nahe, daß sich der größte Teil
des L2-Proteins innerhalb des L1-Proteins befindet. Die L2-Proteine
sind bei verschiedenen Papillomaviren hoch konserviert, insbesondere die
10 basischen Aminosäuren
am C-Terminus. Der L1-ORF ist bei verschiedenen Papillomaviren hoch
konserviert.
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Die
L1- und L2-Gene wurden zur Herstellung von Vakzinen für die Prophylaxe
und Behandlung von Papillomavirus-Infektionen bei Lebewesen eingesetzt.
Zhou et al. (1991; 1992) klonierten HPV-Typ 16-L1- und -L2-Gene
in einen Vacciniavirus-Vektor und infizierten CV-1-Säugerzellen mit dem rekombinanten
Vektor, um virusähnliche
Partikel (VLP) zu produzieren.
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Rekombinante
Baculoviren, die HPV6-L1-, HPV11-L1-, HPV16-L1-, HPV18-L1-, HPV31-L1-oder HPV16-L2-ORFs
exprimieren, wurden zur Infektion von Sf9-Insektenzellen und zur
Produktion von L1- und L2-Proteinen eingesetzt. Westernblot-Analysen
zeigten, daß die
von Baculovirus erhaltenen L1- und L2-Proteine mit Antikörper gegen
HPV16 reagierten. Das von Baculovirus erhaltene L1 bildet VLPs.
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Carter
et al. (1991) demonstrierten die Produktion von HPV16-L1- und HPV16-L2-Proteinen
durch rekombinante Stämme
von Saccharomyces cerevisiae. Carter et al. demonstrierten auch
die Produktion von HPV6b-L1- und -L2-Proteinen. Das HPV6b-L1-Protein
war kein Vollängen-L1-Protein.
Die rekombinanten Proteine wurden als intrazelluläre und als
sekretierte Produkte produziert. Die rekombinanten L1- und L2-Proteine hatten ähnliche
Molekulargewichte wie die nativen Proteine. Wurden die Proteine
intrazellulär
exprimiert, wurde die Hauptmenge des Proteins als unlöslich befunden,
wenn die Zellen in Abwesenheit denaturierender Reagenzien lysiert
wurden. Obwohl diese Unlöslichkeit
die Reinigung des Proteins erleichtern kann, kann sie eine Analyse
der nativen Epitope des Proteins behindern.
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Von
rekombinanten Proteinen, die von Hefe sekretiert wurden, wurde gezeigt,
daß sie
von Hefe stammende Kohlenhydrate enthalten. Die Anwesenheit dieser
N-verknüpften
Oligosaccharide kann native Epitope maskieren. Darüber hinaus
können
die sekretierten rekombinanten Proteine andere Modifizierungen enthalten,
wie z. B. die Retention der sekretorischen Leadersequenz.
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WO-A-9420137
(University of Rochester) offenbart ein Verfahren zur Herstellung
von HPV6-L1- und HPV11-L1-VLPs
und die so hergestellten VLPs. Das Verfahren wird als allgemein
anwendbar angegeben.
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HPV16-L1-VLPs
werden in DE-A-4435907 (Lutz Gissmann, Jian Zhou, Martin Müller, MediGene
Gesellschaft für
Molekularbiologische Diagnostik, Therapie und Technologie mbH) offenbart.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung rekombinanter Papillomavirus-Proteine
mit den immunitätsverleihenden
Eigenschaften der nativen Papillomavirus-Proteine sowie Verfahren
zu deren Herstellung und Verwendung. Die vorliegende Erfindung betrifft
eine Reihe synthetischer virusähnlicher
Partikel, die für
die Charakterisierung einer Human-Papillomavirus-Infektion geeignet sind,
und Assays, welche die synthetischen virusähnlichen Partikel einsetzen.
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Die
Erfindung beinhaltet die Ableitung von HPV11-L1-spezifischen Resten,
welche für
die Bindung neutralisierender Antikörper erforderlich sind, und
ein modifiziertes HPV16-L1-Gen mit HPV11-ähnlichen Substitutionen, so
daß VLPs,
die von dem modifizierten HPV16-L1-Gen hergestellt werden, auch HPV11-neutralisierende
monoklonale Antikörper
binden.
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Wir
zeigten bereits, daß die
HPV11-L1-Reste Gly131-Tyr132 für die HPV11-Spezifität der Bindung
verschiedener HPV11-neutralisierender monoklonaler Antikörper verantwortlich
waren. Nachdem die Bindung dieser Antikörper konformationsabhängig ist,
blieb die Frage offen, ob das Epitop zusammenhängend ist und aus Resten besteht,
die sich nebeneinander befinden, mit einer Konformation, welche
eine VLP-Assemblierung erfordert, oder nicht zusammenhängend und
Reste umfaßt,
die in der linearen L1-Sequenz wohlgetrennt sind, jedoch nach korrekter
Faltung und Assemblierung von Partikeln in enge Nachbarschaft kommen.
Wir untersuchten Reste über
eine Folge von 20 Resten mit dem Zentrum bei Gly131-Tyr132 und identifizierten fünf Reste, bei denen die Substitution
in einem signifikanten Verlust der Bindung neutralisierender monoklonaler
Antikörper
resultierte, ohne andere HPV11-spezifische VLP-abhängige Antikörper zu
beeinflussen. Dies demonstriert, daß das Epitop zusammenhängend ist.
Dies wurde bestätigt
durch die Demonstration, daß HPV11-Substitutionen an
diesen Positionen in die HPV16-L1-Sequenz die Grundlage der Übertragung
der Bindung dieser monoklonalen Antikörper auf modifizierte HPV16-VLPs
bilden.
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Die
Gruppe von neutralisierenden monoklonalen Antikörpern für HPV11 wurde von Neil Christensen (Pennsylvania
State University, Hershey, PA) erhalten. Die monoklonalen Antikörper in
der Gruppe sind HPV11-spezifisch und VLP-abhängig. Die Antikörper können voneinander
dadurch unterschieden werden, welche Aminosäurereste die Bindung der individuellen
Antikörper
beeinflussen, obwohl es überlappende
Positionen für
alle der monoklonalen Antikörper
gibt. Zusätzliche
Antikörper,
die in diesen Studien eingesetzt wurden, wurden ebenfalls von Dr.
Neil Christensen erhalten.
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Diese
Reste definieren zusammen das Epitop für Antikörper, von denen bekannt ist,
daß sie
HPV11 neutralisieren. Wir demonstrieren auch, daß die Substitution dieser Reste
in äquivalenten
Positionen der HPV16-L1-Sequenz die Grundlage für die Übertragung der Bindung dieser
Antikörper
auf modifizierte HPV16-VLPs bildet. Die modifizierten HPV16-VLPs
können
zur Entwicklung HPV11-spezifischer serologischer Assays eingesetzt
werden. Aufgrund der hohen Identität zwischen HPV6- und HPV11-L1-Sequenzen
können derzeitige
serologische Assays Reaktionen von diesen beiden Typen nicht sehr
gut unterscheiden. Modifizierte HPV16-VLPs mit einem einzigen HPV11-spezifischen
Epitop und keiner Kreuzreaktivität
mit HPV6-VLPs sollten in der Lage sein, HPV11-Immunreaktionen nach
Infektivität
oder Immunisierung zu identifizieren.
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Dieses
Problem wurde in der Vergangenheit nicht gelöst und unseres Wissens ist
dies die erste Demonstration, daß ein konformationsabhängiges Epitop
zusammenhängend
ist.
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Es
gab zwei Probleme zu bewältigen.
Erstens ist das Epitop ein Konformationsepitop und herkömmliche
Mittel der Epitopkartierung, die Bindung an Peptidfragmente, konnten
nicht verwendet werden. Es war nötig,
irgendein Test-L1-Protein in einer Weise zu exprimieren, welche
die Bildung virusähnlicher
Partikel, welche die Virusstruktur nachahmen, erleichterte. Zweitens
machte die große
Anzahl von L1-Klonen, welche für
die Kartierung erforderlich war, die Schaffung eines leichten Mittels
zur Expression der viralen Test-Hüllproteine erforderlich.
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Ohne
Isolierung eines typspezifischen Epitops wäre es schwierig, HPV6- und
HPV11-Immunreaktionen
zu unterscheiden.
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Eine
Verwendung des derivatisierten HPV16-VLP ist diejenige als Reagens
in einem serologischen Assay. Nachdem die meisten Epitope HPV6-
und HPV11-VLPs gemeinsam sind, konkurrieren polyklonale Seren gegen
eines mit der Bindung eines typspezifischen monoklonalen Antikörpers an
das andere aufgrund einer sterischen Hinderung durch die Bindung
von Antikörpern
an benachbarte Stellen. Es gibt sehr wenige kreuzreaktive Epitope
zwischen HPV16 und entweder HPV11 oder HPV6. Deshalb sollte die
Präsentation
eines HPV11-spezifischen Epitops auf einem HPV16-VLP das Problem
der sterischen Konkurrenz benachbarter Epitope eliminieren. Nur
die Anwesenheit eines Antikörpers
in einer polyklonalen Reaktion auf das spezifisch übertragene
Epitop sollte mit der monoklonalen Antikörperbindung konkurrieren.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Diese
Erfindung umfaßt
synthetische HPV16L1-Virus-ähnliche
Partikel (VLP) mit den folgenden Substitutionen L126Y, S133G, A134G,
A136G, A137G, A139P, V141Q und E145V, die zur Charakterisierung
einer Infektion der Human-Papillomavirus-Typen 11 und 16 geeignet
sind, und Assays, welche die synthetischen Partikel einsetzen.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt die Aminosäuresequenzen
des HPV11- und HPV16-L1-Proteins in der mutagenisierten Region (Reste
121 bis 147) und zeigt auch die spezifischen Substitutionen, die
bei dieser Studie vorgenommen wurden. Diese Sequenzen sind in der
EMBL GeneBank verfügbar.
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2 zeigt die Aminosäuresequenzen
für das
L1-Protein von HPV16 und mehreren substituierten Klonen (HPV16:5,
HPV16:8 und HPV16:10).
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3 zeigt, daß Aminosäuresubstitutionen
an kritischen Positionen nicht ausreichen, um die HPV11-Bindung
monoklonaler Antikörper
(MAb) auf HPV16-VLPs zu übertragen.
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4 zeigt, daß 8 Aminosäuresubstitutionen
in der HPV16-L1-Sequenz die HPV11-Bindung monoklonaler Antikörper verleihen
und demonstrieren ein zusammenhängendes
Konformationsepitop.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe synthetischer virusähnlicher
Partikel (VLP), welche sich zur Charakterisierung einer Human-Papillomavirus
11-Infektion eignen, und Assays, welche die synthetischen virusähnlichen
Partikel einsetzen, die zur Überwachung
serologischer Reaktionen auf eine HPV11-Infektion und -Immunisierung
eingesetzt werden können.
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Papillomavirus-Infektionen
treten bei einer Vielzahl von Lebewesen, einschließlich von
Menschen, Schafen, Hunden, Katzen, Kaninchen, Affen, Schlangen und
Rindern, auf. Papillomaviren infizieren Epithelzellen, wobei sie
im allgemeinen gutartige epitheliale oder fibroepitheliale Tumore
an der Infektionsstelle induzieren.
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Papillomaviren
können
auf Grundlage des Wirts, den sie infizieren, in verschiedene Gruppen
eingeteilt werden. Human-Papillomaviren (HPV) werden weiterhin auf
der Grundlage von DNA-Sequenzhomologie in mehr als 60 Typen eingeteilt
(hinsichtlich eines Überblicks
siehe Papillomaviruses and Human Cancer, N. Pfister (Hrsg.), CRC
Press, Inc., 1990). Papillomavirus-Typen scheinen insofern typspezifische
Immunogene darzustellen, als eine neutralisierende Immunität gegen
Infektion durch einen Typ von Papillomavirus keine Immunität gegen
einen anderen Typ von Papillomavirus verleiht.
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Beim
Menschen verursachen verschiedene HPV-Typen unterschiedliche Erkrankungen.
Die HPV-Typen 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 26–29 verursachen gutartige Warzen
bei sowohl normalen als auch immungeschwächten Individuen. Die HPV-Typen
5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19–25,
36 und 46–50
verursachen flache Läsionen
bei immungeschwächten
Individuen. Die HPV-Typen 6, 11, 34, 39, 41–44 und 51–55 verursachen nicht-maligne Condylome
der Schleimhäute
der Genitalien oder Atemwege. Die HPV-Typen 16 und 18 verursachen
eine Epithel-Dysplasie der Genitalschleimhaut und sind mit der Mehrheit
von in situ- und invasiven Karzinomen des Gebärmutterhalses, der Vagina,
Vulva und des Analkanals assoziiert. HPV6 und HPV11 verursachen
die Mehrheit von Genitalwarzen und laryngealen Papillomen.
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Immunologische
Studien bei Tieren haben gezeigt, daß die Produktion neutralisierender
Antikörper gegen
Papillomavirus-Kapsidproteine eine Infektion mit dem homologen Virus
verhindert. Die Entwicklung wirksamer Papillomavirus-Vakzine wurde
durch Schwierigkeiten, die mit der Kultivierung von Papillomaviren
in vitro verbunden sind, verlangsamt. Die Entwicklung eines effektiven
HPV-Vakzins wurde insbesondere durch das Fehlen eines geeigneten
Tiermodells verlangsamt. Die Neutralisation von Papillomavirus durch
Antikörper scheint
typspezifisch zu sein und abhängig
von Konformationsepitopen auf der Oberfläche des Virus.
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Papillomaviren
sind kleine (50–60
nm), nicht von einer Hülle
umgebene, ikosaedrische DNA-Viren, welche
für bis
zu acht frühe
und zwei späte
Gene kodieren. Die offenen Leserahmen (ORF) der Virusgenome werden
als E1 bis E7 und L1 und L2 bezeichnet, wobei "E" früh bedeutet
und "L" spät bedeutet.
L1 und L2 kodieren für
Virus-Kapsidproteine. Die frühen
(E) Gene sind mit Funktionen wie viraler Replikation und zellulärer Transformation
assoziiert.
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Das
L1-Protein ist das Haupt-Kapsidprotein und besitzt ein Molekulargewicht
von 55–60
kD. Das L2-Protein ist ein weniger häufiges Kapsidprotein, welches
ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 55–60 kD und ein scheinbares
Molekulargewicht von 75–100
kD, wie mittels Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt, aufweist.
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Über die
Herstellung von HPV16-L1-, HPV16-L2- und HPV Typ 6-L1-Proteinen
durch rekombinante Stämme
von Saccharomyces cerevisiae wurde berichtet. Es wäre von Nutzen,
Verfahren zur Herstellung großer
Mengen von Papillomavirus-Proteinen beliebiger Spezies und beliebigen
Typs durch Kultivierung rekombinanter Hefen zu entwickeln. Es wäre auch
von Nutzen, große
Mengen von Papillomavirus-Proteinen mit den immunitätsverleihenden
Eigenschaften der nativen Proteine, wie z. B. der Konformation des
nativen Proteins, herzustellen. Zur Erreichung dieses letzteren
Ziels wäre
es erforderlich, die Wirkung zahlreicher Mutationen in dem L1-Gen
auf die Bindung von Antikörpern
bekannter Eigenschaften (VLPabhängig,
kreuzreaktiv, etc.) zu analysieren.
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Das
empirische Scanning natürlicher
oder konstruierter Peptidsequenzen hinsichtlich funktioneller Reste
ist inhärent
abhängig
von der Expression einer großen
Zahl von Sequenzvarianten, um deren relative funktionelle Wirksamkeit
zu untersuchen. Das Niveau der erhaltenen Proteinexpression kann
insbesondere im Falle von selbstassemblierenden viralen Strukturproteinen
kritisch sein, da die Effizienz der Selbstassemblierung häufig konzentrationsabhängig ist.
Das Baculovirus-Insektenexpressionsvektorsystem wurde in großem Umfang eingesetzt,
um virale Selbstassemblierung zu untersuchen, es erfordert jedoch
im allgemeinen eine vorherige Isolierung und Expansion einer plaquegereinigten
rekombinanten Virenstammkultur, um brauchbare Mengen selbstassemblierter
Partikel herzustellen. Bei der Prüfung einer Reihe von Möglichkeiten
zur Expression analytischer Niveaus des L1-Hüllproteins von Baumwollschwanzkaninchen-
und Human-Typ 11-Papillomaviren fanden wir, daß selbst eine kurze transiente
Cotransfektion von Insektenzellen mit Baculovirus-Transfervektoren
und viraler DNA assemblierte Partikel ergab, welche immunologisch
von Partikeln, die zuvor aus plaquegereinigten Stammkulturen erhalten
worden waren (Benincasa et al., 1996, Rapid, high-level transient expression
of papillomavirus-like paricles in insect cells, BioTechniques 20,
890–895),
nicht unterscheidbar waren. Binnen sechs Tagen von Plasmid-Virus-DNA-Cotransfektion
von Sf9-Zellen konnten mindestens 1–2 mg assemblierter L1-Partikel/100-mm-Platte
demonstriert werden. Dieses Expressionsniveau ist mehr als ausreichend,
um die Funktionalität
zu untersuchen, und bietet mehrere Vorteile gegenüber vergleichbaren
transienten Expressionssystemen in Säugerzellen.
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Zur
Bestimmung neutralisierender Epitope bei HPV-Infektionen mußten wir
die Aminosäurereste
identifizieren, welche Human-Papillomavirus-Subtypen eine antigene
Typspezifität
verleihen (Christensen, N. D., et al., 1990, Monoclonal antibody-mediated
neutralization of infectious human papillomavirus type 11). Viele der
typspezifischen Epitope sind konformationsabhängig und nur nach VLP-Assemblierung
nachweisbar. Das L1-Strukturhüllprotein
mehrerer Tier- und Human-Papillomaviren wurde befunden, bei Expression
in Insektenzellen mittels rekombinanter Baculovirus-Stämme effizient
selbst zu assemblieren (Christensen, N. D., et al., 1994, Assembled
baculovirus-expressed human papillomavirus type 11 L1 capsid protein
virus-like particles are recognized by neutralizing monoclonal antibodies
and induce high titres of neutralizing antibodies, J. Gen. Virol.
75, 2271–2276).
Die Zeit und Mühe,
die mit der Herstellung rekombinanter Phagen verbunden ist, schließt die Anwendung
dieses Verfahrens zum Screenen einer großen Anzahl von VLP-Varianten,
welche mittels stellengerichteter Mutagenese hergestellt wurden,
aus. Jedoch beobachteten wir früher,
daß ein
rekombinantes Protein bei Expression in dem Baculovirus-System als
sekretiertes Produkt in Mengen von mg/ml innerhalb von 5–7 Tagen
der ursprünglichen
Transfektion von Insektenzellen mit Plasmid- und Virus-DNAs nachweisbar
ist. Auf Grundlage dieser Beobachtung überprüften wir, ob sich ausreichende
Mengen an Papillomavirus-L1-Protein anhäufen würden, um eine Selbstassemblierung
in VLPs nach transienten Expression zu erlauben, insbesondere wenn
ein effizienteres Baculovirus-Transfektionssystem wie das BaculogoldTM -System (Pharmingen, San Diego, CA) eingesetzt
würde.
Unter Anwendung eines schnellen sechstägigen transienten Transfektionsprotokolls
wurde das L1-Hüllprotein
zahlreicher Papillomaviren, korrekt zu VLPs assembliert, gebildet.
Extrakte, die aus transient transfizierten Zellen mit CRPV- oder
HPV11-L1-Genkonstrukten präpariert worden
waren, enthielten immunogenes Material, das von typspezifischen
und VLP-abhängigen
monoklonalen Antikörpern,
gebildet gegen entweder CRPV- oder HPV11-VLPs, erkannt wurde. Das
transient exprimierte Material war nicht kreuzreaktiv mit anderen
typspezifischen Antikörpern
und die Erkennung war für
eine alkalische Denaturierung sensitiv, was ferner die Präzision der
VLP-Bildung demonstrierte.
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Wir
identifizierten bereits früher
die HPV11-L1-Reste Gly131-Tyr132 als
verantwortlich für
die typspezifische Bindung mehrerer HPV11-neutralisierender monoklonaler
Antikörper
(Ludmerer et al., 1996, Two amino acid residues confer type specificity
to a neutralizing, conformationally dependent epitope on human papillomavirus
Type 11, J. Virol. 70, 4791–4794).
Zur Kartierung des HPV11-neutralisierenden Epitops mutierten wir HPV11
individuell über
eine Folge von 20 Resten mit dem Zentrum bei Gly131-Tyr132 an den Resten, an denen die Sequenz von
der HPV16-Sequenz abweicht. Die Positionen wurden mutiert, um der
HPV16-Sequenz zu entsprechen. Unter Einsatz des oben beschriebenen
transienten Sf9-Expressionssystems
wurden diese Mutanten-HPV11-L1-Gene exprimiert und hinsichtlich
Bindung von HPV11-spezifischen monoklonalen Antikörpern analysiert.
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Die
vorliegenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung näher zu erläutern, ohne
die Erfindung jedoch auf die speziellen Details dieser Beispiele
zu beschränken.
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BEISPIEL 1
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Erzeugung von Test-Expressionskonstrukten
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Das
HPV11-L1-Strukturgen wurde aus klinischen Isolaten unter Anwendung
von PCR mit Primern, die anhand der veröffentlichten L1-Sequenz konstruiert
worden waren, kloniert. Das L1-Gen wurde anschließend sowohl
in BlueScript (Pharmacia) für
die Mutagenese als auch in pVL1393 (Stratagene) für die Expression
in Sf9-Zellen subkloniert.
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Mutationen
wurden in das L1-Gen unter Einsatz des Amersham-Sculptor-in vitro-Mutagenesekits
eingeführt.
Das Auftreten der gewünschten
Mutation wurde durch Sequenzierung bestätigt und das mutierte Gen in
pVL1393 für
die Expression in Sf9-Zellen subkloniert.
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Das
HPV16-L1-Strukturgen wurde sowohl in BlueScript (Pharmacia) für die Mutagenese
als auch in pVL1393 (Stratagene) für die Expression in Sf9-Zellen
subkloniert. Mutationen wur den unter Einsatz des Amersham-Sculptor-in
vitro-Mutagenesekits erzeugt, durch Sequenzierung verifiziert und
in pVL1393 für
die Expression in Sf9-Zellen subkloniert.
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BEISPIEL 2
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Transiente Expression
von L1-VLPs in Sf9-Zellen
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Sf9-Zellen
wurden mit Hilfe des BaculoGold-Transfektionskits (Pharmingen) transfiziert.
Die Transfektionen erfolgten im wesentlichen nach den Anweisungen
des Herstellers mit den folgenden Modifizierungen. 8 × 108 Sf9-Zellen wurden in einer 100-mm-Schale
mit 4 mg BaculoGold-DNA und 6 μg
Test-DNA transfiziert. Zellen wurden nach 6 Tagen geerntet und hinsichtlich
VLP-Produktion einem Assay unterworfen.
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BEISPIEL 3
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Herstellung von Sf9-Extrakten
und ELISA-Assays
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Zellen
wurden 6 Tage nach der Transfektion durch Abkratzen, gefolgt von
einer Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, geerntet. Die
Zellen wurden in 300 ml Aufbruchpuffer (1 M NaCl, 0,2 M Tris, pH
7,6) resuspendiert und 30 Sekunden lang auf Eis mit Hilfe eines
Polytron PT 1200 B mit einer PT-DA 1205/2-A-Sonde (Brinkman) in
einem Falcon-1259-Röhrchen homogenisiert.
Die Proben wurden drei Minuten lang bei 2500 UpM zentrifugiert,
um die Zelltrümmer
zu pelletieren. Die Röhrchen
wurden mit zusätzlichen
150 ml Aufbruchpuffer gewaschen, die Überstände in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt
und erneut fünf
Minuten lang in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge (Brinkman) zentrifugiert.
Die Überstände wurden
gesammelt und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert. ELISA-Assays wurden
typischerweise am selben Tag durchgeführt.
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5
ml Extrakt wurden in 50 ml 1%iges BSA in PBS (phosphatgepufterte
Salzlösung;
20 mM NaPO4, pH 7,0, 150 mM NaCl) verdünnt und
auf eine Polystyrolplatte ausplattiert. Die Platte wurde über Nacht
bei 4°C inkubiert.
Die Extrakte wurden entnommen und die Platte mit 5% Milchpulver
in PBS blockiert. Alle anschließenden
Waschschritte wurden mit 1%igem BSA in PBS durchgeführt. Die
Platte wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang mit primärem Antikörper inkubiert.
Primäre
Antikörper,
monoklonale Antikörper,
die gegen HPV11-VLPs gebildet worden waren, wurden als Ascites-Stammlösung von
Dr. Neil Christensen (Pennsylvania State University) erhalten. Sie
wurden vor der Verwendung 105 in 1%igem
BSA-PBS verdünnt. Nach
dem Waschen wurden die Platten eine Stunde lang mit sekundärem Antikörper inkubiert.
Der sekundäre
Antikörper, mit
Peroxidase markiertes Anti-Maus-Ziegen-IgG(g) wurde von Kirkegaard & Perry Laboratories,
Inc., bezogen und in einer 103-Verdün nung in
1%igem BSA in PBS eingesetzt. Nach einem letzten Waschschritt wurde
ein Assay mit alkalischer Phosphatase durchgeführt und die Extinktion bei
405 nm abgelesen.
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BEISPIEL 4
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HPV11-Scan
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Zur
Kartierung der kritischen Reste für ein HPV11-spezifisches neutralisierendes
Epitop nutzten wir zwei Bedingungen. Zuallererst verwendeten wir
eine Gruppe monoklonalen Antikörper,
welche spezifisch für HPV11-L1
sind und L1 nur erkennen, wenn es zu einem VLP assembliert ist.
Von diesen fünf
Antikörpern
ist von vier gezeigt worden, daß sie
HPV11 in dem Kreider-Xenograft-System neutralisieren (Kreider et
al., 1987, J. Virol. 61: 590–593).
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Wir
demonstrierten bereits früher,
daß die
Typspezifität
der Bindung von drei der neutralisierenden MAbs auf Gly131-Tyr132 der HPV11-L1-Sequenz zurückzuführen ist
und daß der
vierte neutralisierende monoklonale Antikörper an eine unterschiedliche
Stelle bindet. Nachdem das Epitop ein Konformationsepitop ist, ist eine
vollständigere
Beschreibung des Epitops erwünscht.
Insbesondere war nicht bekannt, ob das Epitop zusammenhängend ist,
mit Kontaktresten in enger Nachbarschaft in der linearen Sequenz
und einer Konformation, die eine korrekte L1-Faltung und Assemblierung
erfordert, oder nicht zusammenhängend,
wobei die Kontaktreste an verschiedenen Positionen der linearen
Sequenz vorliegen und sich eine positionelle Nähe nur nach der Assemblierung
ergibt.
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Wir
folgerten, daß,
falls das Epitop zusammenhängend
ist, mehrere kritische Reste für
die Bindung innerhalb einer kurzen Entfernung von dem Gly131-Tyr132-Paar lokalisiert
sein sollten. Nachdem ein typisches lineares Epitop 10–12 Reste überspannt,
scannten wir Reste innerhalb von 12 Positionen von Gly131-Tyr132 für eine
Folge von etwa 25 Resten. Nachdem die Bindung spezifisch für HPV11-VLPs
ist, konzentrierten wir uns auf diejenigen Reste, bei denen die
Sequenz zwischen HPV11 und HPV16 divergiert. Jenseits dieser Region von
25 Resten nimmt die Homologie zwischen den beiden Sequenzen dramatisch
zu. Substitutionen in HPV11-L1 wurden aus der HPV16-Sequenz ausgewählt, um
die Möglichkeit
zu minimieren, daß die
Substitution zu einer allgemeineren Störung der VLP-Struktur führen würde.
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Zur
Feststellung der Wirkung auf die Bindung irgendeines speziellen
Rests wurden sowohl HPV11 als auch das korrespondierende HPV11-Derivat
in dem transienten Expressionssystem exprimiert. Ein ELISA wurde
unter Verwendung der Gruppe von HPV11-spezifischen monoklonalen
Antikörpern
vorgenommen und die Ergebnisse der beiden wurden verglichen. Die
L1-Produktion wurde mit dem monoklonalen Antikörper H6.C6 normalisiert. H6.C6- Antikörper ist
kreuzreaktiv mit HPV11 und sein Epitop ist linear und wird unabhängig von der
VLP-Bildung erkannt. Somit mißt
es die L1-Produktion.
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Die
Ergebnisse wurden einer doppelten Normalisierung unterworfen. Zuerst
wird das Verhältnis
der Extinktion des Testantikörpers
zu H6.C6 für
die Testposition berechnet. Das gleiche Verhältnis wird für HPV11 bestimmt
und durch das Verhältnis
für die
Testposition geteilt. Somit bedeutet ein doppeltes Verhältnis in
der Nähe
von 1, daß es
keinen nachweisbaren Unterschied in der Antikörperbindung des Testklons im
Verhältnis zu
HPV11 gibt. Ein doppeltes Verhältnis
von weniger als 1 bedeutet, daß der
Testantikörper
schlechter an den Testklon bindet als an Wildtyp. In der Theorie
bedeutet ein Verhältnis
von größer als
1, daß der
Antikörper
besser an den Testklon bindet als an HPV11. In der Praxis wurde
dies nicht beobachtet. Ein Verhältnis
im Bereich von 0,1 bis 0,2 ist im wesentlichen Hintergrund, was
bedeutet, daß wir
keine Bindung des Antikörpers
an das Mutanten-VLP nachweisen können.
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Die
Positionen in HPV11-L1 zwischen Rest 120 und 145, welche sich von
HPV16-L1 unterscheiden, wurden individuell durch den HPV16-Rest
substituiert. Die Klone wurden in Sf9-Zellen durch eine baculovirus-exprimierende
Rekombinante exprimiert und die Wirkung der Bindung durch die Gruppe
von HPV11-spezifischen monoklonalen Antikörpern bestimmt (Tabelle 1).
Nur Substitutionen, welche zu einer Bindungsbeeinträchtigung
für einen
oder mehrere Antikörper
führten,
sind in der Tabelle eingeschlossen. Man beachte, daß die Bindung
von H11.A3.2 und H11.H3 von keiner Substitution beeinträchtigt ist.
Beide sind HPV11-spezifische VLP-abhängige Mabs, von denen gezeigt
wurde, daß sie
an andere Regionen von VLPs binden als H11.B2, H11.F1 und H11.G5.
Die Bindung von H11.A3.2 und H11.H3 verifiziert die Assemblierung
von VLPs und demonstriert, daß die
Wirkung der Substitution für
Antikörper
spezifisch ist, die an diese Region binden.
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BEISPIEL 5
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Übertragung des HPV11-neutralisierenden
Epitops auf HPV16
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Auf
Grundlage der Studien in Beispiel 4 mutierten wir das HPV16-L1-Gen
an den Aminosäureresten 126,
133, 134, 141 und 145, um der HPV11-L1-Sequenz zu entsprechen. Wir
bezeichnen diesen Klon als HPV16:5. Zu unserer Überraschung sahen wir keine
Bindung von monoklonalen HPV11-Antikörpern an VLPs, die von diesem
Klon produziert wurden. Wir vermuteten, daß wir die wichtigen Kontaktpositionen
bereitgestellt hatten, jedoch dieses stark konformationsabhängige Epitop
nicht korrekt präsentierten.
Wir stellten fest, daß die
HPV11-L1-Sequenz die Reste G133 G134 und P136 enthält, wobei
die HPV16-L1-Sequenz Alanin in den drei äquivalenten Positionen 136,
137 und 139 aufweist. Glycin- und Prolinreste können strukturelle Störungen einführen. Obwohl
individuelle Substitutionen in der HPV11-L1-Sequenz an diesen Positionen
ohne Wirkung waren, vermuteten wir, daß drei solche Änderungen
direkt am Bereich des Epitops zusammen die Epitop-Präsentation
beeinflussen könnten.
Unter Verwendung des Klons HPV16:5 als Matrize erzeugten wir einen
Klon, der die weiteren Substitutionen A136G, A137G und A139P aufwies,
um den Klon HPV16:8 zu erzeugen. Dieser Klon produzierte VLPs, welche
die HPV11-Antikörper
H11.B2, H11.F1 und H11.G5 binden. Die Bindung von zwei separaten
HPV16-VLP-abhängigen
monoklonalen Antikörpern
ist nicht beeinflußt.
Unter Verwendung von HPV16:8 als Matrize erzeugten wir einen dritten
Klon, der T129V- und A132S-Substitutionen aufwies, um HPV16:10 zu
erzeugen. Dieser Klon ist mit HPV11-L1 über den beurteilten Bereich
identisch, es wurde jedoch gezeigt, daß die letzteren beiden Positionen
für die
Bindung nicht essentiell sind. In Übereinstimmung damit zeigt
der Klon HPV16:10 keine weitere Verbesserung der MAb-Bindung im
Verhältnis
zu HPV16:8. Die Bindung wird hinsichtlich der L1-Produktion normalisiert
mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers
H16.D9, welcher ein internes lineares Epitop bindet, das nur nach
Denaturierung der Probe präsentiert
wird. Die Tabelle ist in zwei Sets unterteilt, da die Probenpaare
separat transfiziert und einem Assay unterworfen wurden.
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Bindung
von HPV11-neutralisierenden monoklonalen Antikörpern an modifizierte HPV16-VLPs
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Der
Klon HPV16:8 demonstriert auch die Kartierung des HPV11-neutralisierenden
Epitops und das Potential zur Verwendung dieser Information, um
es auf eine distale Oberfläche
zu übertragen.
Im Prinzip könnten
diese Kartierungsdaten die Grundlage für eine Übertragung auf eine noch stärker distale
Oberfläche, wie
z. B. CRPV-VLPs, sein. Ein solches Reagens könnte in der gleichen Weise
wie von uns für
HPV16:8-VLPs beschrieben in einem serologischen Assay eingesetzt
werden, mit dem zusätzlichen
Vorteil, daß es
zum Screenen der Immunreaktion von Individuen, welche mit mehreren
VLP-Typen, die HPV6-, HPV11- und HPV16-VLPs einschließen, immunisiert
wurden, eingesetzt werden könnte.
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BEISPIEL 6
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Überwachung serologischer Reaktionen
auf eine HPV11-Infektion oder -Immunisierung
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Modifizierte
HPV16-VLPs werden eingesetzt, um das Vorliegen einer Immunreaktion
auf HPV11 nach viraler Infektion oder Immunisierung mit HPV11-VLPs
festzustellen. Modifizierte HPV16-VLPs, welche das HPV11-neutralisierende
Epitop präsentieren,
werden die Mulde einer Mikrotiterplatte in nativer Form beschichten.
Nach der Blockierung wird ein monoklonaler HPV11-Antikörper, welcher
an dieses Epitop bindet, H11.B2, H11.F1 oder H11.G5, in einem ELISA-Format
mit zunehmenden Mengen an polyklonalen HPV11-Seren, polyklonalen
HPV6-Seren und polyklonalen Testseren inkubiert werden. Die Bindung
des monoklonalen HPV11-Antikörpers
wird mit Hilfe eines sekundären
Anti-Maus-Kaninchen-IgG-Antikörpers sichtbar
gemacht werden. Alternativ kann er mit I125 markiert
werden oder direkt an Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase
gekoppelt werden oder ein anderes Standard-ELISA-Visualisierungsprotokoll
angewandt werden. Zunehmende Mengen an polyklonalen HPV11-Seren
werden mit der Bindung konkurrieren, bis das Signal schließlich bis
zum Hintergrund reduziert wird. Polyklonale HPV6-Seren werden nicht
konkurrieren oder die Konkurrenz wird gegenüber der mit polyklonalen HPV11-Seren
beobachteten signifikant verringert sein. Eine Konkurrenz mit den
Testseren auf Niveaus, die mit polyklonalen HPV11-Seren vergleichbar
sind, wird eine Immunreaktion auf HPV11 demonstrieren. Eine fehlende
oder eine signifikante Verringerung der Konkurrenz wird eine fehlende
oder eine schwache Immunreaktion auf HPV11 anzeigen.
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BEISPIEL 7
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Transiente Expression
von VLPs in Sf9-Zellen
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Das
HPV11-L1-Strukturgen wurde aus klinischen Isolaten unter Anwendung
der Polymerasekettenreaktion (PCR) mit Primern, die anhand der veröffentlichten
L1-Sequenz konstruiert worden waren (8, 17), kloniert. Das CRPV-L1-Strukturgen
wurde mittels PCR aus viraler genomischer DNA kloniert. Die L1-Gene
wurden in pVL1393 (Stratagene) für
die Expression in Sf9-Zellen subkloniert.
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Sf9-Zellen
wurden unter Einsatz des BaculoGold-Transfektionskits (Pharmingen,
San Diego, CA) cotransfiziert. Die Transfektionen erfolgten nach
den Anweisungen des Herstellers mit der folgenden Modifizierung:
8 × 106 Sf9-Zellen wurden in einer 100-mm-Schale
mit 4 mg BaculoGold-Virus-DNA und 6 μg Test-Plasmid-DNA transfiziert.
Die Zellen wurden nach 6 Tagen geerntet, soweit nicht anders angegeben,
und hinsichtlich VLP-Produktion mit einem Westernblot oder ELISA-Assay
(unten) untersucht.
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BEISPIEL 8
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Herstellung von Sf9-Extrakten
und ELISA-Assays
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Zellen
wurden 6 Tage nach der Transfektion geerntet. Platten wurden abgekratzt,
um Zellen zu resuspendieren, und die Zellen wurden durch Zentrifugation
mit niedriger Geschwindigkeit gewonnen. Die Zellen wurden in 300
ml Aufbruchpuffer (1 M NaCl, 0,2 M Tris, pH 7,6) resuspendiert und
30 Sekunden lang auf Eis unter Verwendung eines Polytron PT 1200
B mit einer PT-DA 1205/2-A-Sonde (Brinkman) in einem Falcon-2059-Röhrchen homogenisiert.
Die Proben wurden bei 2500 UpM in einer GPR-Zentrifuge (Beckman
Instruments, Inc., Palo Alto, CA) 3 Minuten lang zentrifugiert,
um Zelltrümmer
zu pelletieren. Die Röhrchen
wurden mit zusätzlichen
150 ml Aufbruchpuffer gewaschen, Überstände wurden in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt
und 5 Minuten lang in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge (Brinkman)
erneut zentrifugiert. ELISA-Assays wurden am selben Tag begonnen.
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5
ml Extrakt wurden in 50 ml 1%iges BSA in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)
verdünnt,
auf eine 96-Mulden-Immulon 2-Mikrotiterplatte (Dynatech Laboratories,
Inc.) aliquotiert und über
Nacht bei 4°C
inkubiert. Die Extrakte wurden entfernt und die Platte mit 5% Milchpulver/PBS
blockiert. Alle anschließenden Waschschritte
wurden mit 1% BSA/PBS durchgeführt.
Die Platte wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit primärem Antikörper inkubiert.
Die primären
Antikörper,
monoklonale Antikörper
CRPV.SA und H11.F1, wurden als Ascites-Stammlösung von Dr. Neil Christensen
erhalten. Sie sind VLP-abhängige und
typspezifische Antikörper,
welche CRPV- bzw. HPV11-VLPs erkennen (Neil Christensen, persönliche Mitteilung).
Sie wurden vor der Verwendung 105-fach in
1% BSA/PBS verdünnt.
Nach dem Waschen in 1% BSA/PBS wurden die Platten eine Stunde lang
mit sekundärem
Antikörper,
mit Peroxidase markiertes Anti-Maus-Ziegen-IgG(g)(Kirkegaard & Perry Laboratories,
Inc.), inkubiert und bei einer 103-Verdünnung in
1%igem BSA in PBS eingesetzt. Nach einem letzten Waschschritt wurde
ein Assay mit alkalischer Phosphatase durchgeführt und die Extinktion bei
405 nm abgelesen.
