ES2210587T3 - Particulas sinteticas tipo virus hpv16. - Google Patents
Particulas sinteticas tipo virus hpv16.Info
- Publication number
- ES2210587T3 ES2210587T3 ES97945270T ES97945270T ES2210587T3 ES 2210587 T3 ES2210587 T3 ES 2210587T3 ES 97945270 T ES97945270 T ES 97945270T ES 97945270 T ES97945270 T ES 97945270T ES 2210587 T3 ES2210587 T3 ES 2210587T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- hpv11
- hpv16
- samples
- antibodies
- vlp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]
Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A UNA SERIE DE PARTICULAS SINTETICAS DE TIPO VIRUS UTILES EN LA CARACTERIZACION DE LA INFECCION DE VIDA AL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO Y A UNAS TECNICAS QUE EMPLEAN LAS PARTICULAS SINTETICAS DE TIPO VIRUS.
Description
Partículas sintéticas tipo virus HPV16.
La presente invención es una serie de partículas
sintéticas tipo virus (VLP) útiles para caracterizar la infección
por los papilomavirus humanos, y los ensayos que utilizan las
partículas similares a virus sintéticas.
Las infecciones por papilomavirus pueden aparecer
en una variedad de animales, que incluyen seres humanos, ovejas,
perros, gatos, conejos, monos, serpientes y vacas. Los papilomavirus
infectan células epiteliales, y habitualmente inducen tumores
epiteliales o fibroepiteliales benignos en el punto de infección.
Los papilomavirus son agentes infecciosos específicos de especie; un
papilomavirus humano no puede infectar a un animal que no sea un ser
humano.
Se pueden clasificar los papilomavirus en
diferentes grupos de acuerdo con el huésped al que infectan. Los
papilomavirus humanos (HPV) se subclasifican en más de 60 tipos de
acuerdo con la homología de la secuencia de ADN (para más
información, véase Papillomaviruses and Human Cancer, H.
Pfister [ed.], CRC Press, Inc., 1990). Los tipos de papilomavirus
parecen ser inmunógenos tipoespecíficos, porque la inmunidad
neutralizante frente a la infección por un tipo de papilomavirus no
confiere inmunidad frente a otro tipo de papilomavirus.
En los seres humanos, diferentes tipos de HPV
producen enfermedades diferentes. Los HPV de los tipos 1, 2, 3, 4,
7, 10 y 26-29 producen verrugas benignas en
pacientes normales e inmunodeprimidos. Los HPV de los tipos 5, 8, 9,
12, 14, 15, 17, 19-25, 36 y 46-50
producen lesiones planas en los pacientes inmunodeprimidos. Los HPV
de los tipos 6, 11, 34, 39, 41-44 y
51-55 producen condilomas no malignos de la mucosa
genital y respiratoria. Los HPV de los tipos 16 y 18 producen
displasia epitelial de la mucosa genital y se asocian a la mayoría
de los carcinomas in situ e invasivos del cuello del útero,
vagina, vulva y canal anal. HPV6 y HPV11 son los agentes causales de
más del 90% de todos los condilomas (verrugas genitales) y papilomas
laríngeos.
Los estudios inmunológicos en animales han
mostrado que la producción de anticuerpos neutralizantes frente a
los antígenos de los papilomavirus previene la infección por el
virus homólogo. El desarrollo de vacunas efectivas frente a los
papilomavirus se ha visto ralentizado por dificultades asociadas al
cultivo de los papilomavirus in vitro. El desarrollo de una
vacuna efectiva frente a los HPV se ha visto ralentizado de manera
concreta por la ausencia de un modelo animal adecuado. La
neutralización de los papilomavirus por los anticuerpos parece ser
tipoespecífica y depende de epítopes conformacionales de la
superficie del virus.
Los papilomavirus son virus ADN pequeños
(50-60 nm), icosaédricos y sin envoltura, que
codifican hasta ocho genes tempranos y dos genes tardíos. Los marcos
de lectura abiertos (ORF) de los genomas víricos se denominan E1 a
E7 y L1 y L2, donde "E" se refiere a temprano y "L" a
tardío. L1 y L2 codifican las proteínas de la cápside vírica. Los
genes tempranos (E) se asocian a funciones como la replicación
vírica y la transformación celular.
La proteína L1 es la principal proteína de la
cápside y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La
proteína L2 es una proteína secundaria de la cápside para la que se
ha predicho un peso molecular de 55-60 kDa y un peso
molecular aparente de 75-100 kDa mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida. Los datos inmunológicos
indican que la mayoría de la proteína L2 se sitúa en una posición
interna a la proteína L1. Las proteínas L2 están muy conservadas en
diferentes papilomavirus, especialmente los 10 aminoácidos básicos
del extremo carboxiterminal. El ORF L1 está muy conservado en
diferentes papilomavirus.
Se han usado los genes L1 y L2 para generar
vacunas para la prevención y tratamiento de las infecciones por
papilomavirus en animales. Zhou y col. (1991; 1992) clonaron los
genes L1 y L2 del HPV de tipo 16 en un vector del virus de la vacuna
e infectaron células de mamífero CV-1 con el vector
recombinante para producir partículas similares a virus (VLP).
Se han usado baculovirus recombinantes que
expresan los ORF HPV6 L1, HPV11 L1, HPV16 L1, HPV18 L1, HPV31 L1 o
HPV16 L2 para infectar células de insecto Sf9 y para producir
proteínas L1 y L2. El análisis de inmunotransferencia mostró que las
proteínas L1 y L2 derivadas del baculovirus reaccionaban con
anticuerpos frente a HPV16. La proteína L1 derivada del baculovirus
forma VLP.
Carter y col. (1991) demostraron la producción de
las proteínas HPV16 L1 y HPV16 L2 por cepas recombinantes de
Saccharomyces cerevisiae. Carter y col. también demostraron
la producción de las proteínas HPV6b L1 y L2. La proteína HPV6b L1
no era una proteína L1 completa. Las proteínas recombinantes se
produjeron como productos intracelulares y segregados. Las proteínas
recombinantes L1 y L2 tenían pesos moleculares similares a los de
las proteínas nativas. Cuando las proteínas se expresaban
intracelularmente, se encontró que la mayor parte de la proteína era
insoluble cuando las células se lisaban en ausencia de reactivos
desnaturalizantes. Aunque esta insolubilidad puede facilitar la
purificación de la proteína, puede dificultar el análisis de los
epítopes nativos de la proteína.
Se mostró que las proteínas recombinantes
segregadas por la levadura contenían carbohidratos derivados de la
levadura. La presencia de estos oligosacáridos
N-unidos puede enmascarar los epítopes. Además, las
proteínas recombinantes segregadas pueden contener otras
modificaciones, como la retención de la secuencia secretora
guía.
El documento
WO-A-9420137 (Universidad de
Rochester) describe un procedimiento para hacer VLP HPV6L1 y
HPV11L1, y las VLP así obtenidas. Se afirma que el procedimiento
tiene aplicabilidad general.
Las VLP HPV16L1 se describen en el documento
DE-4435907 (Lutz Gissmann, Jian Zhou, Martin Müller,
MediGene Gessellschaft für Molekularbiologische Diagnostik, Therapie
und Technologie mbH).
La presente invención se dirige a la producción
de proteínas de papilomavirus recombinantes que tienen las
propiedades de las proteínas nativas de papilomavirus que confieren
inmunidad, así como los procedimientos para su producción y uso. La
presente invención es una serie de partículas sintéticas tipo virus
(VLP) útiles para caracterizar la infección por los papilomavirus
humanos, y los ensayos que utilizan las partículas similares a virus
sintéticas.
La invención implica la descripción de los
residuos específicos de HPV11 L1 que son necesarios para unirse a
los anticuerpos neutralizantes, y de un gen HPV16 L1 modificado con
sustituciones similares a HPV11 de modo que las VLP que se producen
a partir del gen HPV16 L1 modificado también se unen a anticuerpos
monoclonales neutralizantes frente a HPV11.
Previamente hemos demostrado que los residuos
Gly^{131}-Tyr^{132} de HPV11 L1 eran
responsables de la especificidad de la unión de HPV11 a varios
anticuerpos monoclonales neutralizantes de HPV11. Puesto que la
unión de estos anticuerpos depende de la conformación, siguió sin
resolverse si el epítope es continuo y comprende residuos
localizados unos al lado de otros con una conformación que precisaba
el ensamblaje de las VLP, o si es discontinuo y comprende residuos
separados en la secuencia lineal de L1 pero que se aproximan entre
sí después del plegado y ensamblaje adecuados de las partículas.
Hicimos un barrido de los residuos en una secuencia de 20 residuos
centrada en Gly^{131}-Tyr^{132} e identificamos
cinco residuos cuya sustitución produjo la pérdida significativa de
la unión a los anticuerpos monoclonales neutralizantes, sin efecto
sobre otros anticuerpos específicos de HPV y dependientes de VLP.
Esto demuestra que el epítope es continuo. Esto se confirmó
demostrando que las sustituciones de HPV11 en estas posiciones en la
secuencia de HPV16 L1 forma la base de la transferencia de la unión
de estos anticuerpos monoclonales a las VLP HPV16 modificadas.
El panel de anticuerpos monoclonales
neutralizantes para HPV11 se obtuvo de Neil Christensen
(Pennsylvania State University, Hershey, PA). Los anticuerpos
monoclonales del panel son específicos de HPV11 y dependientes de
las VLP. Los anticuerpos se pueden distinguir entre sí por qué
residuos de aminoácidos afectan a la unión de los anticuerpos
individuales. Otros anticuerpos que se usaron en estos estudios
también se obtuvieron del Dr. Neil Christensen.
Estos residuos definen de manera colectiva el
epítope de los anticuerpos que se sabe que neutralizan el HPV11.
También demostramos que la sustitución de estos residuos en
posiciones equivalentes de la secuencia de HPV16 L1 forman la base
de la transferencia de la unión de estos anticuerpos a VLP HVP16
modificadas. Las VLP HPV16 modificadas se pueden usar para
desarrollar ensayos serológicos específicos frente a HPV11. Debido a
la elevada identidad entre las secuencias de HPV16 y HPV11 L1, los
ensayos serológicos actuales no pueden distinguir muy bien las
respuestas entre estos dos tipos. Las VLP HPV16 modificadas con un
solo epítope específico de HPV11 y sin reactividad cruzada con las
VLP HVP6 deberían poder identificar las respuestas inmunitarias
frente a HPV11 tras la infección o la inmunización.
Este problema no se ha resuelto en el pasado y,
que nosotros sepamos, es la primera demostración de que un epítope
que depende de la conformación es continuo.
Hubo que superar dos dificultades. Primero, el
epítope es conformacional, y no se pudieron utilizar los
procedimientos convencionales de mapeo del epítope y de unión a los
fragmentos peptídicos. Era necesario expresar todas las proteínas L1
que se estudiaban de una manera que facilitara la formación de
partículas similares a virus que recuerdan la estructura del virus.
Segundo, el gran número de clones de L1 que se necesitan para el
mapeo exigió la generación de un procedimiento fácil de expresar las
proteínas de la cubierta vírica.
Sin el aislamiento de un epítope tipoespecífico,
sería difícil distinguir las respuestas inmunitarias frente a HPV6 y
HPV11.
Un uso de las VLP HPV16 en forma de derivados es
como reactivos en un ensayo serológico. Puesto que HPV6 y HPV11
comparten la mayoría de los epítopes, el suero policlonal frente a
uno compite con la unión al otro de un anticuerpo monoclonal
tipoespecífico debido a impedimento estérico por la unión de
anticuerpos a puntos vecinos. Hay muy pocos epítopes que dan
reacción cruzada entre HPV16 y HPV11 o HPV6. Por lo tanto, la
presentación de un epítope específico de HPV11 sobre una VLP HPV16
debería eliminar el problema de la competición estérica por epítopes
vecinos. Sólo la presencia de anticuerpos en una respuesta
policlonal frente al epítope que se ha transferido de manera
específica debería competir con la unión del anticuerpo
monoclonal.
Esta invención incluye partículas sintéticas tipo
virus (VLP) HPV16 L1 que muestran las siguientes sustituciones:
L126Y, S133G, A134G, A136G, A137G, A139P, V141Q y E145V, útiles en
la caracterización de la infección por los papilomavirus humanos de
los tipos 11 y 16, y los ensayos que utilizan las partículas
sintéticas.
La Figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos
de la proteína L1 de HPV11 y de HPV16 en la región sometida a
mutación (residuos 121 a 147), y también muestra las sustituciones
específicas que se hacen en este estudio. Estas secuencias están
disponibles en el EMBL Gene Bank.
La Figura 2 muestra las secuencias de aminoácidos
de la proteína L1 de HPV16 y varios clones sustituidos (HPV16:5,
HPV16:8 y HPV16:10).
La Figura 3 muestra que las sustituciones de
aminoácidos en posiciones críticas no son suficientes para
transferir la unión de los anticuerpos monoclonales (MAb) frente a
HPV11 a las VLP HPV16.
La Figura 4 muestra que ocho sustituciones de
aminoácidos en la secuencia de HPV16 L1 confieren la unión del
anticuerpo monoclonal a HPV11 y demuestran un epítope conformacional
continuo.
La presente invención es una serie de partículas
sintéticas tipo virus (VLP) útiles para caracterizar la infección
por los papilomavirus humanos 11, y los ensayos que utilizan las
partículas sintéticas, que se pueden usar para monitorizar las
respuestas serológicas frente a la infección por HPV11 y la
inmunización frente a HPV11.
Las infecciones por papilomavirus aparecen en una
variedad de animales, que incluyen seres humanos, ovejas, perros,
gatos, conejos, monos, serpientes y vacas. Los papilomavirus
infectan células epiteliales, y habitualmente inducen tumores
epiteliales o fibroepiteliales benignos en el punto de
infección.
Los papilomavirus se pueden clasificar en
diferentes grupos de acuerdo con el huésped al que infectan. Los
papilomavirus humanos (HPV) se subclasifican en más de 60 tipos de
acuerdo con la homología de la secuencia de ADN (para más
información, véase Papillomaviruses and Human Cancer, H.
Pfister [ed.], CRC Press, Inc., 1990). Los tipos de papilomavirus
parecen ser inmunógenos tipoespecíficos, porque la inmunidad
neutralizante frente a la infección por un tipo de papilomavirus no
confiere inmunidad frente a otro tipo de papilomavirus.
En los seres humanos, diferentes tipos de HPV
producen enfermedades diferentes. Los HPV de los tipos 1, 2, 3, 4,
7, 10 y 26-29 producen verrugas benignas en
pacientes normales e inmunodeprimidos. Los HPV de los tipos 5, 8, 9,
12, 14, 15, 17, 19-25, 36 y 46-50
producen lesiones planas en los pacientes inmunodeprimidos. Los HPV
de los tipos 6, 11, 34, 39, 41-44 y
51-55 producen condilomas no malignos de la mucosa
genital y respiratoria. Los HPV de los tipos 16 y 18 producen
displasia epitelial de la mucosa genital y se asocian a la mayoría
de los carcinomas in situ e invasivos del cuello del útero,
vagina, vulva y canal anal. HPV6 y HPV11 son los agentes causales de
más del 90% de todos los condilomas (verrugas genitales) y papilomas
laríngeos.
Los estudios inmunológicos en animales han
mostrado que la producción de anticuerpos neutralizantes frente a
los antígenos de los papilomavirus previene la infección por el
virus homólogo. El desarrollo de vacunas efectivas frente a los
papilomavirus se ha visto ralentizado por dificultades asociadas al
cultivo de los papilomavirus in vitro. El desarrollo de una
vacuna efectiva frente a los HPV se ha visto ralentizado de manera
concreta por la ausencia de un modelo animal adecuado. La
neutralización de los papilomavirus por los anticuerpos parece ser
tipoespecífica y depende de epítopes conformacionales de la
superficie del virus.
Los papilomavirus son virus ADN pequeños
(50-60 nm), icosaédricos y sin envoltura, que
codifican hasta ocho genes tempranos y dos genes tardíos. Los marcos
de lectura abiertos (ORF) de los genomas víricos se denominan E1 a
E7 y L1 y L2, donde "E" se refiere a temprano y "L" a
tardío. L1 y L2 codifican las proteínas de la cápside vírica. Los
genes tempranos (E) se asocian a funciones como la replicación
vírica y la transformación celular.
La proteína L1 es la principal proteína de la
cápside y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La
proteína L2 es una proteína secundaria de la cápside para la que se
ha predicho un peso molecular de 55-60 kDa y un peso
molecular aparente de 75-100 kDa mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida.
Se ha descrito la producción de proteínas HPV
16L1, HPV16 L2 y HPV tipo 6 L1 por cepas recombinantes de
Saccharomyces cerevisiae. Sería útil desarrollar
procedimientos para producir grandes cantidades de proteínas de
papilomavirus de cualquier especie y tipo mediante el cultivo de
levaduras recombinantes. También sería útil producir grandes
cantidades de proteínas de papilomavirus que tuvieran las
propiedades de las proteínas nativas de conferir inmunidad, como la
conformación de la proteína nativa. Para conseguir este último
objetivo sería necesario analizar el efecto de numerosas mutaciones
del gen L1 sobre la unión de anticuerpos de propiedades conocidas
(dependientes de VLP, con reactividad cruzada, etc.).
El rastreo empírico de secuencias peptídicas
naturales u obtenidas mediante ingeniería genética en busca de
residuos funcionales depende de manera inherente de la expresión de
grandes números de variantes de la secuencia para ensayar su
potencia funcional relativa. El nivel de expresión proteica que se
obtiene puede ser particularmente crítico en el caso de proteínas
estructurales víricas autoensamblables, porque la eficiencia del
autoensamblaje con frecuencia depende de la concentración. El
sistema vector de expresión del baculovirus del insecto se ha
utilizado mucho para estudiar el autoensamblaje vírico, pero
habitualmente precisa el aislamiento previo y la expansión de un
cultivo de virus recombinantes purificados en placa para generar
cantidades útiles de partículas autoensambladas. Al examinar
diversas posibilidades para la expresión de concentraciones
analíticas de la proteína L1 de la cubierta de los papilomavirus de
tipo 11 del conejo castellano y humano, encontramos que incluso una
breve cotransfección transitoria de las células del insecto con los
vectores de transferencia del baculovirus y con ADN vírico dio
partículas ensambladas que fueron inmunológicamente indistinguibles
de las partículas que se habían obtenido previamente a partir de
cultivos purificados en placa (Benincasa y col., 1996. Rapid,
high-level transient expression of
papillomavirus-like particles in insect cells.
BioTechniques 20,890-895). A los 6 días de la
cotransfección de las células Sf9 con plásmido/ADN vírico, se
pudieron demostrar al menos 1-2 mg de partículas de
L1 ensambladas /placa de 100 mm. Este nivel de expresión es más que
suficiente para ensayar la funcionalidad, y tiene varias ventajas
sobre sistemas comparables de expresión transitoria en células de
mamíferos.
Para definir epítopes neutralizantes en las
infecciones por HPV es necesario identificar los residuos de
aminoácidos que confieren la tipoespecificidad antigénica a los
subtipos de papilomavirus humanos (Christensen, N. D., y col., 1990.
Monoclonal antibody-mediated neutralization of
infectious human papillomavirus type 11). Muchos de los epítopes
tipoespecíficos dependen de la conformación, y son detectables sólo
después del ensamblaje de las VLP. Se ha demostrado que la proteína
estructural de la envoltura L1 de varios papilomavirus humanos y
animales se ensambla con eficiencia cuando se expresa en células de
insecto mediante cepas de baculovirus recombinante (Christensen, N.
D., y col., 1994, Assembled baculovirus-expressed
human papillomavirus type 11 L1 capsid protein
virus-like particles are recognized by neutralizing
monoclonal antibodies and induce high titres of neutralizing
antibodies. J. Gen. Virol. 75, 2271-2276). El tiempo
y el trabajo que son necesarios para generar un fago recombinante
impiden el uso de este procedimiento para hacer cribado de un gran
número de variantes de VLP producidas mediante mutagénesis
sitio-específica. Sin embargo, previamente hemos
observado que, cuando se expresa en un sistema de baculovirus, se
puede detectar una proteína recombinante como producto segregado en
cantidades de mg/ml a los 5-7 días de la
transfección inicial de las células de insecto con plásmidos y ADN
vírico. De acuerdo con esta observación, examinamos si se
acumularían cantidades suficientes de proteína L1 de papilomavirus
que permitieran el autoensamblaje en VLP tras la expresión
transitoria, particularmente si se utilizara un sistema de
transfección con baculovirus más eficiente, como Baculogold™
(Pharmingen, San Diego, CA). Utilizando un protocolo de transfección
transitoria rápida de 6 días, se produjo la proteína L1 de la
envoltura de numerosos tipos de papilomavirus, adecuadamente
ensamblada en VLP. Los extractos preparados a partir de células
transfectadas de manera transitoria con construcciones del gen L1 de
CRPV o de HPV11 contenían material inmunogénico reconocido por
anticuerpos monoclonales tipoespecíficos y dependientes de VLP
generados frente a VLP de CRPV o de HPV11. El material que se
expresó de manera transitoria no dio reacción cruzada con otros
anticuerpos tipoespecíficos, y el reconocimiento fue muy sensible a
la desnaturalización alcalina, lo que demuestra una vez más la
fidelidad de la formación de las VLP.
Previamente identificamos que los residuos
Gly^{131}-Tyr^{132} de HPV11 L1 eran
responsables de la unión tipoespecífica de varios anticuerpos
monoclonales neutralizantes frente a HPV11 (Ludmerer y col. 1996.
Two amino acid residues confer type specificity to neutralizing,
conformationally dependent epitope on human papillomavirus type 11.
J. Virol. 70, 4791-4794). Para mapear el
epítope neutralizante HPV11 mutamos de manera individualizada HPV11
en los residuos en los que la secuencia diverge de la secuencia de
HPV16 en una cadena de 20 residuos centrada en
Gly^{131}-Tyr^{132}. Se sometieron a mutación
las posiciones para ajustarlas a la secuencia de HPV16. Usando el
sistema de transfección transitoria Sf9 que se ha descrito más
arriba, se expresaron estos genes mutantes HPV11 L1 y se analizó la
unión a anticuerpos monoclonales específicos frente a HPV11.
Se presentan los siguientes ejemplos para definir
más la invención sin que ello quiera decir que limitamos la
invención a los aspectos concretos de estos ejemplos.
Se clonó el gen estructural HVP11 L1 a partir de
aislados clínicos utilizando PCR con cebadores diseñados a partir de
la secuencia publicada de L1. Posteriormente se subclonó el gen L1
en BlueScript (Pharmacia) para estudiar la mutagénesis y en pVL1393
(Stratagene) para estudiar la expresión en las células Sf9.
Se introdujeron las mutaciones en el gen L1
usando el kit de mutagénesis in vitro Amersham Sculptor. Se
confirmó la aparición de la mutación deseada mediante secuenciación,
y el gen mutado se subclonó en pVL1393 para la expresión en células
Sf9.
El gen estructural HPV16 L1 se subclonó tanto en
BlueScript (Pharmacia) para la mutagénesis como en pVL1393
(Stratagene) para la expresión en las células Sf9. Se generaron las
mutaciones usando el kit de mutagénesis in vitro Amersham
Sculptor, se verificaron mediante secuenciación, y se subclonaron en
pVL1393 para la expresión en células Sf9.
Las células Sf9 se transfectaron usado el kit de
transfección BaculoGold (Pharmingen). Las transfecciones se
realizaron esencialmente según las instrucciones del fabricante con
las siguientes modificaciones. Se transfectaron 8\cdot10^{8}
células Sf9 en una placa de 100 mm, con 4 mg de ADN BaculoGold y 6
\mug de ADN de prueba. Se recogieron las células después de 6 días
y se hicieron ensayos de la producción de VLP.
Se recogieron las células 6 días después de la
transfección, mediante raspadura seguida de centrifugación a baja
velocidad. Se volvieron a suspender las células en 300 ml de tampón
de lisis (NaCl 1M, Tris pH 7,6 0,2 M) y se homogeneizaron durante 30
s sobre hielo usando un Polytron PT 1200 B con una sonda
PT-DA 1205/2-A (Brinkman) en un tubo
Falcon 1259. Las muestras se hicieron girar a 2500 rpm durante 3 min
para aglomerar los detritus. Se lavaron los tubos con otros 150 ml
de tampón de lisis, se recogieron los sobrenadantes en un tubo de
microfuga de 1,5 ml y se volvieron a centrifugar durante 5 minutos
en una microfuga Eppendorf (Brinkman). Se recogieron los
sobrenadantes y se almacenaron a 4ºC hasta que se usaron. Los
ensayos de ELISA se realizaron de manera típica el mismo día.
Se diluyeron 5 ml del extracto en 50 ml de BSA al
1% en PBS (suero salino tamponado con fosfato; NaPO_{4} 20 mM, pH
7,0, NaCl 150 mM) y se colocó en una placa de poliestireno. Se
incubó la placa durante una noche a 4ºC. Se retiraron los extractos
y se bloqueó la placa con leche en polvo al 5% en PBS. Todos los
pasos posteriores de lavado se realizaron con BSA al 1% en PBS. Se
incubó la placa a temperatura ambiente con anticuerpos primarios
durante 1 hora. Los anticuerpos primarios, anticuerpos monoclonales
generados frente a las VLP de HPV11, se obtuvieron del Dr. Neil
Christensen (Pennsylvania State University) a partir de un cultivo
de células de ascitis. Se diluyeron 10^{5} en BSA al 1% en PBS
antes de su uso. Después del lavado se incubaron las placas durante
1 hora con un anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario, IgG
(g) de cabra anti-ratón marcada con peroxidasa, se
compró a Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., y se usó a una
dilución de 10^{3} en BSA al 1% en PBS. Después del último lavado
se realizó un ensayo de fosfatasa alcalina con lectura de la
absorbancia a 405 nm.
Para mapear los residuos críticos para un epítope
neutralizante específico de HPV11, aprovechamos dos situaciones. En
primer lugar, usamos un panel de anticuerpos monoclonales que son
específicos para HPV11 L1 y que reconocen L1 sólo cuando está
ensamblada en VLP. De estos 5 anticuerpos, se ha demostrado que 4
neutralizan el HPV11 en el sistema Kreider Xenograft (Kreider y
col., 1987, J. Virol. 61:590-593).
Previamente demostramos que la tipoespecificidad
de la unión de tres de los MAb neutralizantes se debe a los residuos
Gly^{131}-Tyr^{132} de la secuencia de HPV11 L1,
y que el cuarto anticuerpo monoclonal neutralizante se une a un
punto diferente. Puesto que el epítope es conformacional, se desea
una descripción más completa del epítope. En concreto, no se sabía
si el epítope era continuo, con los residuos de contacto próximos
entre sí en la secuencia lineal de modo que la conformación
precisaba un plegado y ensamblaje adecuados de L1, o discontinuo,
con los residuos de contacto en posiciones diferentes de la
secuencia lineal de modo que la proximidad posicional surge sólo
después del ensamblaje.
Razonamos que si el epítope es continuo, entonces
varios residuos críticos para la unión deben estar localizados a
escasa distancia del par Gly^{131}-Tyr^{132}.
Puesto que un epítope lineal típico abarca 10-12
residuos, hicimos un barrido de los residuos a 12 posiciones de
Gly^{131}-Tyr^{132} para una secuencia de
aproximadamente 25 residuos. Puesto que la unión es específica para
las VLP de HPV11, nos centramos en los residuos en los que la
secuencia diverge entre HPV11 y HPV16. Más allá de esta región de 25
residuos aumenta mucho la homología entre las dos secuencias. Las
sustituciones en HPV11 L1 se seleccionaron a partir de la secuencia
de HPV16 para minimizar la posibilidad de que la sustitución dé
lugar a una alteración más general de la estructura de la VLP.
Para determinar el efecto de cualquier residuo
concreto sobre la unión, se expresó tanto HPV11 como el derivado
correspondiente de HPV11 en el sistema de expresión transitoria. Se
realizó una prueba de ELISA utilizando el panel de anticuerpos
monoclonales específicos frente a HPV11, y se compararon los
resultados de los dos. La producción de L1 se normalizó con el
anticuerpo monoclonal H6.C6. El anticuerpo H6.C6 da reacción cruzada
con HPV11, y su epítope es lineal y se reconoce independientemente
de la formación de VLP. Así, mide la producción de L1.
Los resultados se someten a una doble
normalización. Primero, se calcula el cociente de absorbancia del
anticuerpo de prueba frente a H6.C6 para la posición de prueba. Se
determina el mismo cociente para HPV11 y se divide entre el cociente
de la primera posición de prueba. Así, un doble cociente próximo a 1
significa que no hay diferencias detectables en la unión del
anticuerpo al clon de prueba en relación con HPV11. Un doble
cociente menor de 1 significa que el anticuerpo de prueba se une
menos al clon de prueba que el de tipo salvaje. En teoría, un
cociente mayor de 1 significa que el anticuerpo se une mejor al clon
de prueba que a HPV11. En la práctica no se observó esto. Un
cociente en el rango de 0,1 a 0,2 es esencialmente el valor de
fondo, lo que significa que no podemos detectar la unión del
anticuerpo a la VLP mutante.
Las posiciones de HPV11 L1 entre los residuos 120
y 145 que diferían de HPV16 L1 se sustituyeron de manera individual
por el residuo de HPV16. Los clones se expresaron en células Sf9
mediante un recombinante que expresaba el baculovirus, y se
determinó el efecto de la unión con el panel de anticuerpos
monoclonales específicos frente a HPV11 (Tabla 1). Sólo se incluyen
en la tabla las sustituciones que dieron lugar a la alteración de la
unión a uno o más anticuerpos. Obsérvese que la unión de H11.A3.2 y
H11.H3 no está alterada por ninguna sustitución. Ambos son MAb
específicos de HPV11 y dependientes de las VLP que se ha demostrado
que se unen a regiones de las VLP diferentes de las regiones a las
que se unen H11.B2, H11.F1 y H11.G5. La unión a H11.A3.2 y H11.H3
verifica el ensamblaje de las VLP, y demuestra que el efecto de la
sustitución es específico para los anticuerpos que se unen a esta
región.
| Posición | H11.A3.2 | H11.B2 | H11.F1 | H11.G5 | H11.H3 |
| Y123 | 0,65 | 0,48 | 0,17 | 0,22 | 1,34 |
| G130S | 0,88 | 0,44 | 0,08 | 0,11 | 1,3 |
| G131A | 0,99 | 0,11 | 0,08 | 0,10 | 1,03 |
| Q138V | 0,93 | 0,45 | 0,62 | 1,05 | 0,83 |
| V142E | 0,93 | nd | 0,40 | 0,57 | 1,27 |
Basándonos en los estudios del Ejemplo 4, mutamos
el gen HPV16 L1 a nivel de los residuos de aminoácidos 126, 133,
134, 141 y 145 para ajustarlos a la secuencia de HPV11 L1.
Denominamos este clon HPV16:5. Para nuestra sorpresa, no vimos
ninguna unión de anticuerpos monoclonales frente a HPV11 a las VLP
que se produjeron a partir de este clon. Razonamos que habíamos
suministrado las posiciones de contacto importantes, pero que no
estábamos presentando correctamente este epítope que depende mucho
de la conformación. Observamos que la secuencia de HPV11 L1 contiene
los residuos G^{133}, G^{134} y P^{136}, mientras que la
secuencia de HPV16 L1 tiene alanina en las tres posiciones
equivalentes a 136, 137 y 139. Los residuos de glicina y prolina
pueden introducir perturbaciones estructurales. Aunque las
sustituciones individuales en la secuencia de HPV11 L1 en estas
posiciones no tuvieron efecto, razonamos que esos tres cambios
precisamente en la región del epítope pueden afectar de manera
colectiva a la presentación del epítope. Usando el clon HPV16:5 como
plantilla, generamos un clon que tenía además las sustituciones
A136G, A137G y A139P para crear el clon HPV16:8. Este clon produjo
VLP que se unen a los anticuerpos frente a HPV11 H11.B2, H11.F1 y
H11.G5. La unión de dos anticuerpos monoclonales dependientes de un
VLP frente a HPV16 no está afectada. Utilizando HPV16:8 como
plantilla, generamos un tercer clon que tiene las sustituciones
T129V y A123S para generar HPV16:10. Este clon es idéntico a HPV11
L1 en la región que se evalúa, pero se mostró que estas 2 últimas
posiciones no eran esenciales para la unión. De manera compatible
con esto, el clon HPV16:10 no muestra ninguna mejora adicional de la
unión a MAb respecto a HPV16:8. La unión está se normaliza según la
producción de L1 utilizando el anticuerpo monoclonal H16.D9, que se
une a un epítope lineal interno que se presenta sólo después de la
desnaturalización de la muestra. La tabla se divide en dos partes
porque los pares de muestras fueron transfectados y ensayados por
separado.
| Clon | H11A3.2 | H11.B2 | H11.F1 | H11.G5 | H11.H3 | H16.U4 | H16.V5 |
| HPV16 | 0,07 | 0,07 | 0,07 | 0,07 | 0,13 | 1,16 | 1,7 |
| HPV16:8 | 0,10 | 1,51 | 0,50 | 1,27 | 0,16 | 1,60 | 2,17 |
| HPV16:10 | 0,10 | 1,26 | 0,26 | 1,20 | 0,17 | 1,70 | 2,40 |
| HPV16 | 0,12 | 0,12 | 0,12 | 0,12 | 0,12 | 1,0 | 1,6 |
| HPV16:5 | 0,11 | 0,11 | 0,12 | 0,11 | 0,11 | 0,47 | 0,85 |
El clon HPV16:8 también demuestra el mapeo del
epítope neutralizante HPV11, y la posibilidad de usar esta
información para transferirlo a una superficie distal. En principio,
estos datos de mapeo podrían ser la base de la transferencia a una
superficie incluso más distal, como las VLP CRPV. Este reactivo se
podría usar en un ensayo serológico de la misma manera que hemos
descrito para las VLP HPV16:8, con la ventaja añadida de que se
podría usar para hacer el cribado de la respuesta inmunológica de
los individuos inmunizados con múltiples tipos de VLP que incluyen
VLP HPV6, HPV11 y HPV16.
Las VLP HPV16 modificadas se usan para determinar
la presencia de una respuesta inmunitaria frente a HPV11 después de
la infección vírica o la inmunización con VLP HPV11. Las VLP HPV16
que presentan el epítope neutralizante de HPV11 se recubrirán en el
pozo de una placa de microtitulación en forma nativa. Después del
bloqueo, se incuba un anticuerpo monoclonal frente a HPV11 que se
une a este epítope, H11.B2, H11.F1 o H11.G5, en formato ELISA con
cantidades crecientes de suero policlonal frente a HPV11, suero
policlonal frente a HPV6 y suero policlonal de prueba. La unión del
anticuerpo monoclonal frente a HPV11 se visualizará usando un
anticuerpo secundario IgG de ratón anti-conejo. Por
otro lado, se puede marcar con I^{125}, o se puede acoplar
directamente a la peroxidasa o a la fosfatasa alcalina del rábano
rusticano, o a otro protocolo de visualización estándar mediante
ELISA. Cantidades crecientes de suero policlonal frente a HPV11
competirán con la unión hasta que la señal finalmente se reduce al
nivel de fondo. El suero policlonal frente a HPV6 no competirá, o la
competición estará reducida de manera significativa respecto a la
que se observa con el suero policlonal frente a HPV11. La
competición con el suero de prueba a concentraciones comparables a
las del suero policlonal frente a HPV11 demostrará una respuesta
inmunitaria frente a HPV11. La ausencia o la reducción significativa
demostrará la ausencia de respuesta inmunitaria o una respuesta
inmunitaria débil frente a HPV11.
Se clonó el gen estructural HPV11 L1 a partir de
aislados clínicos usando la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) con cebadores diseñados a partir de la secuencia publicada de
L1 (8,17). Se clonó el gen estructural CRPV L1 mediante PCR a partir
de ADN del genoma vírico. Los genes se subclonaron en pVL1393
(Stratagene) para la expresión en células Sf9.
Las células Sf9 se cotransfectaron usando el kit
de transfección BaculoGold (Pharmingen, San Diego, CA). Se hicieron
las transfecciones según las instrucciones del fabricante con la
siguiente modificación: se transfectaron 8\cdot10^{6} células
Sf9 en una placa de 100 mm con 4 mg de ADN vírico BaculoGold y 6
\mug de ADN de prueba. Las células se recogieron después de 6
días, salvo que se especifique de otra manera, y se ensayaron para
la producción de VLP mediante ensayos de inmunotransferencia o de
ELISA (véase más adelante).
Se recogieron las células seis días después de la
transfección. Se rasparon las placas y se recogieron las células
mediante centrifugación a baja velocidad. Se volvieron a suspender
las células en 300 ml de tampón de lisis (NaCl 1M, Tris pH 7,6 0,2
M) y se homogeneizaron durante 30 s sobre hielo usando un Polytron
PT 1200 B con una sonda PT-DA
1205/2-A (Brinkman) en un tubo Falcon 1259. Las
muestras se hicieron girar a 2500 rpm en una centrífuga GPR (Beckman
Instruments, Inc. Palo Alto, CA) durante 3 min para aglomerar los
detritus. Se lavaron los tubos con otros 150 ml de tampón de lisis,
se recogieron los sobrenadantes en un tubo de microfuga de 1,5 ml y
se volvieron a centrifugar durante 5 minutos en una microfuga
Eppendorf (Brinkman). Los ensayos de ELISA se comenzaron el mismo
día.
Se diluyeron 5 ml del extracto en 50 ml de BSA al
1% en suero salino tamponado con fosfato (PBS), se dividió en
alícuotas en una placa de microtítulos de 96 pozos Immulon 2
(Dynatech Laboratories, Inc.) y se incubó durante una noche a 4ºC.
Se retiraron los extractos y se bloqueó la placa con leche en polvo
al 5%/ PBS. Todos los pasos posteriores de lavado se realizaron con
BSA al 1%/ PBS. Se incubó la placa a temperatura ambiente con
anticuerpos primarios durante 1 hora. Los anticuerpos primarios,
anticuerpos monoclonales CRPV.5A y H11.FR1, se obtuvieron del Dr.
Neil Christensen a partir de un cultivo de células de ascitis. Son
anticuerpos tipoespecíficos dependientes de VLP que reconocen las
VLP de CRPV y HPV11, respectivamente (Neil Christensen, comunicación
personal). Se diluyeron 10^{5} veces en BSA al 1%/ PBS antes de su
uso. Después del lavado en BSA al 1%/PBS, se incubaron las placas
durante 1 hora con un anticuerpo secundario, IgG (g) de cabra
anti-ratón marcada con peroxidasa (Kirkegaard &
Perry Laboratories, Inc.) y se usó a una dilución de 10^{3} en BSA
al 1% en PBS. Después del último lavado se realizó un ensayo de
fosfatasa alcalina con lectura de la absorbancia a 405 nm.
Claims (2)
1. Partículas sintéticas tipo virus (VLP) HPV16
L1 que tienen las siguientes sustituciones: L126Y, S133G, A134G,
A136G, A137G, A139P, V141Q y E145V.
2. Un procedimiento para serotipar respuestas
inmunes que comprende la competición de la unión de anticuerpos
monoclonales específicos de HPV11 a las VLP HPV16 L1 según se ha
definido en la reivindicación 1 en un formato ELISA que
comprende:
- a)
- recubrir una placa de ELISA con las muestras de las VLP HPV16 modificadas del lote de prueba;
- b)
- incubar las muestras;
- c)
- bloquear las muestras;
- d)
- lavar las muestras;
- e)
- diluir los anticuerpos monoclonales H11.B2, H11.F1 o H11.G5 para hacer muestras de anticuerpos mediante:
- (1)
- preparar un conjunto de diluciones con cantidades crecientes de suero policlonal frente a HPV11;
- (2)
- preparar un duplicado del conjunto de soluciones con cantidades crecientes de suero policlonal frente a HPV6;
- (3)
- preparar otro conjunto de diluciones con el suero policlonal de prueba;
- f)
- añadir las muestras de anticuerpos a la placa de ELISA para formar una mezcla;
- g)
- incubar la mezcla;
- h)
- lavar la mezcla;
- i)
- añadir IgG (g) de cabra anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina;
- j)
- incubar las muestras;
- k)
- lavar las muestras;
- l)
- revelar con un ensayo de fosfatasa alcalina y leer a 405 nm.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2676396P | 1996-10-04 | 1996-10-04 | |
| US26763P | 1996-10-04 | ||
| GB9624320 | 1996-11-22 | ||
| GBGB9624320.9A GB9624320D0 (en) | 1996-11-22 | 1996-11-22 | Synthetic HPV16 virus-like particles |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2210587T3 true ES2210587T3 (es) | 2004-07-01 |
Family
ID=26310464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97945270T Expired - Lifetime ES2210587T3 (es) | 1996-10-04 | 1997-09-30 | Particulas sinteticas tipo virus hpv16. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0956349B1 (es) |
| JP (1) | JP2001506485A (es) |
| AT (1) | ATE256734T1 (es) |
| CA (1) | CA2267639C (es) |
| DE (1) | DE69726886T2 (es) |
| ES (1) | ES2210587T3 (es) |
| WO (1) | WO1998014564A1 (es) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69924262T3 (de) * | 1998-08-14 | 2009-07-23 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville | Verfahren zur herstellung von durch hefe exprimierte hpv typs 6 und 16 kapsid-proteinen |
| US7112330B1 (en) | 1998-08-14 | 2006-09-26 | Chiron Corporation | Method for producing yeast expressed HPV types 6 and 16 capsid proteins |
| EP1271151A1 (en) * | 2001-06-20 | 2003-01-02 | Virofem Diagnostika GmbH | Assay and process for the detection of HPV antibodies |
| WO2019011331A1 (zh) * | 2017-07-14 | 2019-01-17 | 厦门大学 | 一种人乳头瘤病毒16型l1蛋白的突变体 |
| CN117110606A (zh) * | 2023-08-21 | 2023-11-24 | 广东省一鼎生物技术有限公司 | 一种基于竞争法检测hpv不同型别中和抗体的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE122007000019I1 (de) * | 1991-07-19 | 2007-07-26 | Univ Queensland | Impfstoffen gegen Papillomavirus |
| ATE296111T1 (de) * | 1993-03-09 | 2005-06-15 | Univ Rochester | Herstellung von menschlichem papillomavirus hüllprotein und virus-ähnlichen teilchen |
| DE4447664C2 (de) * | 1994-10-07 | 1999-04-15 | Lutz Prof Dr Gissmann | Fusionsproteine, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Anwendung |
-
1997
- 1997-09-30 CA CA002267639A patent/CA2267639C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-30 ES ES97945270T patent/ES2210587T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-30 JP JP51663998A patent/JP2001506485A/ja active Pending
- 1997-09-30 AT AT97945270T patent/ATE256734T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-09-30 DE DE69726886T patent/DE69726886T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-30 EP EP97945270A patent/EP0956349B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-30 WO PCT/US1997/017097 patent/WO1998014564A1/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0956349B1 (en) | 2003-12-17 |
| DE69726886D1 (de) | 2004-01-29 |
| JP2001506485A (ja) | 2001-05-22 |
| EP0956349A1 (en) | 1999-11-17 |
| WO1998014564A1 (en) | 1998-04-09 |
| ATE256734T1 (de) | 2004-01-15 |
| EP0956349A4 (en) | 2001-09-05 |
| CA2267639A1 (en) | 1998-04-09 |
| CA2267639C (en) | 2005-11-22 |
| DE69726886T2 (de) | 2004-10-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Embers et al. | Protective immunity to rabbit oral and cutaneous papillomaviruses by immunization with short peptides of L2, the minor capsid protein | |
| Rubio et al. | The N-terminal region of the human papillomavirus L2 protein contains overlapping binding sites for neutralizing, cross-neutralizing and non-neutralizing antibodies | |
| Ludmerer et al. | A neutralizing epitope of human papillomavirus type 11 is principally described by a continuous set of residues which overlap a distinct linear, surface-exposed epitope | |
| Culp et al. | Binding and neutralization efficiencies of monoclonal antibodies, Fab fragments, and scFv specific for L1 epitopes on the capsid of infectious HPV particles | |
| US9884894B2 (en) | Fine epitope peptide capable of inducing cross-reactive antibodies among homologous proteins in human papilloma virus E6 protein | |
| Ilha et al. | Early antibody responses map to non-protective, PCV2 capsid protein epitopes | |
| Onda et al. | Characterization of IgA response among women with incident HPV 16 infection | |
| Orozco et al. | Humoral immune response recognizes a complex set of epitopes on human papillomavirus type 6 l1 capsomers | |
| ES2210587T3 (es) | Particulas sinteticas tipo virus hpv16. | |
| ES2213185T3 (es) | Particulas de tipo virus hpv11 sinteticas. | |
| US5795754A (en) | Synthetic HPV11 virus-like particles | |
| Embers et al. | Differential antibody responses to a distinct region of human papillomavirus minor capsid proteins | |
| ES2262359T3 (es) | Particulas tipo virus sinteticas con epitores heterologos. | |
| ES2258778T3 (es) | Particulas semejantes a virus sinteticas hpv11. | |
| ES2213841T3 (es) | Particulas sinteticas semejantes al virus hpv16. | |
| US5922588A (en) | Synthetic HPV16 virus-like particles | |
| US6689366B1 (en) | Synthetic virus like particles with heterologous epitopes | |
| US5738853A (en) | Synthetic HPV11 virus-like particles | |
| Li et al. | Identification of a conserved linear epitope using a monoclonal antibody against non-structural protein 3B of foot-and-mouth disease virus | |
| Li et al. | Antibodies against epstein-barr virus glycoprotein gp42 for the diagnosis of nasopharyngeal carcinoma | |
| Lobová et al. | Expression and serological reactivity of hemorrhagic enteritis virus hexon protein | |
| WO2007129218A2 (es) | Peptidos para detectar o inducir la produccion de anticuerpos anti el virus de papiloma humano, anti la proteina l1 o anti peptidos de esta proteina |