ES2213185T3 - Particulas de tipo virus hpv11 sinteticas. - Google Patents
Particulas de tipo virus hpv11 sinteticas.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION ES UNA SERIE DE PARTICULAS VIRALES UTILES EN LA CARACTERIZACION DE LA INFECCION POR PAPILLOMAVIRUS HUMANO Y ENSAYOS QUE EMPLEAN LAS PARTICULAS VIRALES SINTETICAS. LAS PARTICULAS VIRALES SINTETICAS SE GENERAN A PARTIR DE ESTRUCTURAS DESIGNADAS POR HPV6:4; HPV6:5; HPV11:G131S; HPV11: DL 132; HPV11:Y246F; HPV11:N278G; HPV11:S346T; HPV6:2; HPV6:4 DL 132; Y HPV6:4,S131G.
Description
Partículas de tipo virus HPV11 sintéticas.
La presente invención es una serie de partículas
de tipo virus sintéticas (VLP) sintéticas, útiles en la
caracterización de la infección por papilomavirus humano y ensayos
que usan las partículas de tipo virus sintéticas.
Las infecciones por papilomavirus ocurren en una
diversidad de animales, incluyendo los humanos, ovinos, perros,
gatos, conejos, monos, ofidios y vacuno. Los papilomavirus infectan
las células epiteliales, induciendo, generalmente, tumores
epiteliales o fibroepiteliales benignos en el sitio de la infección.
Los papilomavirus son agentes infectivos específicos de las
especies; un papilomavirus humano no puede infectar a un animal no
humano.
Los papilomavirus pueden clasificarse en grupos
diferentes, en base al huésped al cual infectan. Los papilomavirus
humanos (HPV) se clasifican además en más de 60 tipos, en base a la
homología de la secuencia de ADN (para una revisión, véase
Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (ed.), CRC
Press, Inc., (1990)). Los tipos de papilomavirus parecen ser
inmunógenos específicos del tipo, dado que una inmunidad
neutralizante a la infección a un tipo de papilomavirus, no
confiere inmunidad contra otro tipo de papilomavirus.
En los humanos, tipos de HPV diferentes causan
distintas enfermedades. Los HPV tipos 1, 2, 3, 4, 7, 10 y
26-29 causan verrugas benignas tanto en individuos
normales como inmunocomprometidos. Los HVP tipos 5, 8, 9, 12, 14,
15, 17, 19-25, 36 y 46-50, causan
lesiones planas en individuos inmunocomprometidos. Los HPV tipos 6,
11, 34, 39, 41-44 y 51-55, causan
condilomatas no malignas de la mucosa genital o respiratoria. Los
HPV tipos 16 y 18 causan displasia epitelial de la mucosa genital y
se les asocia con la mayoría de los carcinomas in situ e
invasivos del cervix, vagina, vulva y canal anal. El HPV6 y HPV11
son los agentes causantes de más del 90% de todos los condilomas
(verrugas genitales) y papilomas laríngeos. El subtipo más
abundante de HPV tipo 6 es el HPV6a.
Los estudios inmunológicos en animales han
mostrado que la producción de anticuerpos neutralizantes de
antígenos de papilomavirus, previenen la infección con los virus
homólogos. El desarrollo de vacunas eficaces contra papilomavirus
ha sido retardado por dificultades asociadas con el cultivo de
papilomavirus in vitro. El desarrollo de una vacuna eficaz
contra HPV ha sido particularmente retardado por la ausencia de un
modelo animal adecuado. La neutralización de papilomavirus por
anticuerpos, parece ser específico del tipo y dependiente de los
epítopos conformadores sobre la superficie del virus.
Los papilomavirus son virus de ADN icosahédricos,
sin envoltura, pequeños (50-60 nm), que contienen
la codificación para hasta ocho genes tempranos y dos tardíos. Los
marcos de lectura abiertos (ORF) de los genomas de los virus se
designan como E1 a E7 y L1 a L2, en donde "E" indica temprano y
"L" indica tardío. El L1 y L2 contienen el código para
proteínas cápsidas del virus. Los genes tempranos (E) se asocian
con funciones tales como replicación vírica y transformación
celular.
La proteína L1 es la proteína de cápsida
principal y tiene un peso molecular de 55-60 kDa.
La proteína L2 es una proteína de cápsida menor que tiene un peso
molecular previsto de 55-60 kDa y un peso molecular
real de 75-100 kDa, determinado mediante
electroforesis de gel de poliacrilamida. Los datos inmunológicos
sugieren que la mayor parte de la proteína L2 está interna con
respecto a la proteína L1. Las proteínas L2 están altamente
conservadas entre papilomavirus diferentes, especialmente los 10
aminoácidos básicos en el C-terminal. El ORF de L1
está altamente conservado entre papilomavirus diferentes.
Los genes L1 y L2 se han usado para generar
vacunas para la prevención y tratamiento de infecciones por
papilomavirus en animales. Zhou y otros, (1991; 1992), han clonado
genes L1 y L2 de HPV tipo 16 dentro de vectores de virus vaccinia e
infectado células de mamífero CV-1 con el vector
recombinante para producir partículas de tipo virus (VLP).
Se han generado L1 y L2 de papilomavirus bovinos
recombinantes derivados bacterialmente. Los sueros neutralizantes
para las proteínas bacterianas recombinantes tienen reactividad
cruzada con virus nativos a bajos niveles, debido, presumiblemente,
a diferencias en las conformaciones de las proteínas nativas y
derivadas bacterialmente.
Los baculovirus recombinantes que expresan los
ORFs de L1 de HPV6, L1 de HPV11, L1 de HPV16, L1 de HPV18, L1 de
HPV31 o L2 de HPV16, se han usado para infectar células Sf9 de
insectos y para producir proteínas L1 y L2. Los análisis mediante
transferencia Western, han mostrado que las proteínas L1 y L2
derivadas de baculovirus, reaccionan con el anticuerpo de HPV16. El
L1 derivado de baculovirus forma VLP.
Carter y otros (1991) han demostrado la
producción de proteínas L1 de HPV16 y L2 de HPV16, mediante cepas
recombinantes de Saccharomyces cerevisiae. Carter y otros,
han demostrado, igualmente, la producción de proteínas L1 y L2 de
HPV6b. La proteína L1 de HPV6b no fue la proteína L1 de longitud
total. Las proteínas recombinantes se produjeron como productos
intracelulares así como secretados. Las proteínas L1 y L2
recombinantes fueron de pesos moleculares similares a las proteínas
nativas. Cuando las proteínas se expresaron intracelularmente, se
encontró que la mayor parte de la proteína era insoluble cuando se
lisaron en ausencia de reactivos desnaturalizantes. Aunque esta
insolubilidad puede facilitar la purificación de la proteína, puede
impedir el análisis de los epítopos nativos de la proteína.
Las proteínas recombinantes secretadas a partir
de levadura mostraron contener carbohidratos derivados de la
levadura. La presencia de estos oligosacáridos unidos mediante N,
puede enmascarar epítopos nativos. Además, las proteínas
recombinantes secretadas pueden contener otras modificaciones, tal
como la retención de la secuencia conductora secretora.
La presente invención está dirigida a la
producción de proteínas de papilomavirus recombinantes que tienen
las propiedades que confieren la inmunidad de las proteínas de
papilomavirus nativos, así como procedimientos para su producción y
uso. La presente invención es una serie de partículas de tipo virus
sintéticas útiles en la caracterización de la infección por
papilomavirus humanos y ensayos que usan las partículas de tipo
virus sintéticas.
La invención implica el diseño de restos
específicos de L1 de HPV11, los cuales se requieren para la unión
de anticuerpos neutralizantes. La invención implica, además, el
diseño de dos restos específicos de L1 de HPV11, los cuales
conjuntamente son necesarios y suficientes para la unión de
anticuerpos neutralizantes.
La L1 de HPV11 contiene únicamente 38 diferencias
de aminoácidos con respecto a la L1 de HPV6, más un resto de
inserción. A pesar de la fuerte identidad entre estas dos
proteínas, se han generado un panel de anticuerpos monoclonales
neutralizantes que son específicos para VLP de HPV11. Los presentes
autores han determinado cuales de estas posiciones de aminoácidos
son importantes para la unión de los anticuerpos monoclonales
neutralizantes. Esto se llevó a cabo mediante la comprobación de la
unión de los anticuerpos monoclonales a una familia de clones
HPV11, los cuales contenían substituciones de restos de aminoácidos
de HPV6b por restos de aminoácidos HPV11 en estas posiciones y, a
continuación, mediante mutación a HPV6b para comparar la secuencia
de HPV11 en estas posiciones críticas. Los presentes autores han
demostrado que los anticuerpos neutralizantes se unían a VLP de
HPV6b con tan pocas como dos de estas substituciones, y que ambas
dichas substituciones son esenciales para la unión. Este trabajo
define la unidad mínima para la unión de anticuerpos
neutralizantes.
El panel de anticuerpos monoclonales
neutralizantes para HPV11 se obtuvo de Neil Christiansen
(Pennsylvania State University, Hersey, PA). Los anticuerpos
monoclonales en el panel son específicos de HPV11 y dependientes de
VLP. Los anticuerpos pueden distinguirse unos de otros en cuanto a
qué restos de aminoácidos afectan la unión de los anticuerpos
individuales, aunque existen posiciones de solapamiento para todos
los anticuerpos monoclonales.
De manera colectiva, estos restos definen el
epítopo para anticuerpos conocidos por neutralizar el HPV11. En
principio, la mutación de L1 de HPV6 únicamente en estas posiciones
seleccionadas, da como resultado la unión a estos anticuerpos
monoclonales neutralizantes específicos de HPV11. Las VLP derivadas
de HPV6 pueden usarse para generar anticuerpos monoclonales al
epítopo neutralizante de HPV11. Esta es la base de un ensayo de
liberación para verificar que las VLP de HPV11 fabricadas contienen
el epítopo neutralizante.
Este problema no ha sido solucionado en el pasado
y, hasta donde alcanza el conocimiento de los presentes autores, es
la primera demostración de la transferencia de un epítopo
dependiente de la conformación.
Existían dos dificultades a evitar. En primer
lugar, el epítopo es conformacional, y no podían usarse medios
convencionales de mapeado de epítopos, de unión a fragmentos de
péptidos. Fue necesario expresar cualquier ensayo de proteína L1 de
una manera que facilitara la formación de partículas de tipo virus
que imitaran la estructura del virus. En segundo lugar, el gran
número de clones L1 requeridos para el mapeado hizo necesaria la
generación de un medio fácil para expresar el ensayo de proteínas
de cubierta vírica.
Sin el conocimiento del epítopo neutralizante,
sería difícil validar la fabricación de VLP para uso comercial.
Un uso de la VLP derivada es un reactivo en un
ensayo de liberación para HPV11. La L1 de HPV se muta para comparar
HPV11 en las posiciones definidas mediante estos estudios. Se ha
demostrado la unión de los anticuerpos monoclonales neutralizantes
de HPV11 a estas VLP derivadas de HPV6.
Estas VLP derivadas de HPV6 pueden usarse en un
ensayo de unión de competencia con VLP de HPV11 fabricadas para
determinar la unión a los anticuerpos monoclonales neutralizantes
de HPV11. Unicamente las derivadas de HPV6 que han demostrado
unirse a anticuerpos monoclonales, compiten con material
auténtico.
Como alternativa, pueden generarse anticuerpos
monoclonales al epítopo neutralizante sobre HPV6 derivado;
posteriormente, se ha demostrado que la vacuna HPV11 fabricada se
une a estos anticuerpos.
La presente invención es una serie de partículas
de tipo virus sintéticas, útiles en la caracterización de la
infección por papilomavirus humano y en ensayos que usan las
partículas sintéticas. Las partículas de tipo virus sintéticas se
generan a partir de constructos designados como HPV6:2;
HPV64\Delta132 y HPV6:4,S131G.
La Figura 1 muestra que se generan VLP con
propiedades específicas del tipo con transfección transitoria. Las
células Sf9 se co-transfectaron con ADN
BaculoGold^{R} y, o bien pVL1393:CRPV, o bien pVL1393:HPV11. Las
células se recolectaron seis días después, se prepararon los
extractos y los ensayos ELISA se realizaron tal como se describe en
el texto. Columna 1, VLP de CRPV; columna 2, VLP de HPV11; columna
3, extracto Sf9; columna 4, ADN de vaculovirus; columna 5,
pVL1393:CRPV; columna 6, pVL1393:HPV11.
A. El anticuerpo primario está a una dilución
10^{-5} de fluido ascítico CRPV.5A.
B. El anticuerpo primario está a una dilución
10^{-5} de fluido ascítico H11.F1.
La Figura 2 muestra que el material inmunógeno
producido mediante transfección transitoria es sensible a la
desnaturalización. Las células Sf9 se
co-transfectaron con pVL1393:HPV11 y ADN
BaculoGold^{R}. Las células se recolectaron seis días después, y
los extractos se prepararon tal como se describe en el texto. Una
porción de los extractos se desnaturalizó mediante dilución en
carbonato sódico 0,1 M, pH 10,5, y se incubó a temperatura ambiente
durante 1 hora. A continuación, estos extractos se recubrieron sobre
una placa de microvaloración y se dejaron secar. Los extractos no
tratados se recubrieron sobre placas de microvaloración y se
incubaron durante una noche a 4ºC. Los ensayos ELISA se realizaron
tal como se describe en Procedimientos, usando una dilución
10^{-5} de, o bien fluido ascítico H11.F1, o bien H6.C6. Columna
1, extracto Sf9; columna 2, extracto pVL1393.
A. El extracto no se desnaturalizó.
B. El extracto se trató con tampón carbonato.
La Figura 3 muestra las secuencias de aminoácidos
de la proteína L1 de HPV11 y HPV6. Estas secuencias se encuentran
igualmente disponibles en el EMBI Gene Bank.
La Figura 4 muestra que las VLP producidas a
partir del clon HPV6:2 (con substitución en la posición 131,
seguido por la inserción de tirosina en la posición creada 132),
une los anticuerpos H11.B2, H11.F1 y H11.G5. Por el contrario, las
VLP producidas a partir de HPV6:4 que retro-mutaron,
o bien a la posición 131 (HPV6:4,S131G), o bien a la 132
(HPV64\Delta132), no se unieron a estos anticuerpos, a pesar de
la presencia de los otros tres cambios de restos críticos. Los
anticuerpos H11B2, H11F1 y H11G5 son MAbs neutralizantes en el
sistema xenoinjerto. El H6C6 mide el nivel total de producción de L1
tal como se describe en el Ejemplo 4. El ensayo ELISA se realizó
tal como se describe en el Ejemplo 3.
La presente invención es una serie de partículas
de tipo virus sintéticas (VLP), útiles en la caracterización de la
infección por papilomavirus humano y en ensayos que usan las
partículas sintéticas, las cuales pueden usarse para monitorizar y
validar VLP fabricadas a través de tecnologías de ADN recombinante.
Las partículas de tipo virus sintéticas se generan a partir de
constructos designados como HPV6:2; HPV64\Delta132 y HPV6:4,S131G.
Otros constructos se incluyen con fines de referencia.
Las infecciones por papilomavirus ocurren en una
diversidad de animales, incluyendo los humanos, ovinos, perros,
gatos, conejos, monos, ofidios y vacuno. Los papilomavirus infectan
las células epiteliales, induciendo, generalmente, tumores
epiteliales o fibroepiteliales benignos en el sitio de la
infección.
Los papilomavirus pueden clasificarse en grupos
diferentes, en base al huésped al cual infectan. Los papilomavirus
humanos (HPV) se clasifican además en más de 60 tipos, en base a la
homología de la secuencia de ADN (para una revisión, véase
Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (ed.), CRC
Press, Inc., (1990)). Los tipos de papilomavirus parecen ser
inmunógenos específicos del tipo, dado que una inmunidad
neutralizante a la infección a un tipo de papilomavirus no confiere
inmunidad contra otro tipo de papilomavirus.
En los humanos, tipos de HPV diferentes causan
distintas enfermedades. Los HPV tipos 1, 2, 3, 4, 7, 10 y
26-29 causan verrugas benignas tanto en individuos
normales como inmunocomprometidos. Los HVP tipos 5, 8, 9, 12, 14,
15, 17, 19-25, 36 y 46-50, causan
lesiones planas en individuos inmunocomprometidos. Los HPV tipos 6,
11, 34, 39, 41-44 y 51-55, causan
condilomatas no malignas de la mucosa genital o respiratoria. Los
HPV tipos 16 y 18 causan displasia epitelial del tracto genital y
se les asocia con la mayoría de los carcinomas in situ e
invasivos del cervix, vagina, vulva y canal anal. El HPV6 y HPV11
causan la mayoría de las verrugas genitales y papilomas
laríngeos.
Los estudios inmunológicos en animales han
mostrado que la producción de anticuerpos neutralizantes de
proteínas cápsidas de papilomavirus, previenen la infección con los
virus homólogos. El desarrollo de vacunas eficaces contra
papilomavirus ha sido retardado por dificultades asociadas con el
cultivo de papilomavirus in vitro. El desarrollo de una
vacuna eficaz contra HPV ha sido particularmente retardado por la
ausencia de un modelo animal adecuado. La neutralización de
papilomavirus por anticuerpos, parece ser específico del tipo y
dependiente de los epítopos conformadores sobre la superficie del
virus.
Los papilomavirus son virus de ADN icosahédricos,
sin envoltura, pequeños (50-60 nm), que contienen
la codificación para hasta ocho genes tempranos y dos tardíos. Los
marcos de lectura abiertos (ORF) de los genomas de los virus se
designan como E1 a E7 y L1 a L2, en donde "E" indica temprano y
"L" indica tardío. El L1 y L2 contienen el código para
proteínas de cápsida del virus. Los genes tempranos (E) se asocian
con funciones tales como replicación y transformación vírica.
La proteína L1 es la proteína de cápsida
principal y tiene un peso molecular de 55-60 kDa.
La proteína L2 es una proteína de cápsida menor que tiene un peso
molecular previsto de 55-60 kDa y un peso molecular
real de 75-100 kDa, determinado mediante
electroforesis de gel de poliacrilamida.
Se ha informado de la producción de proteínas L1
de HPV16, L2 de HPV16 y L1 de HPV tipo 6 mediante cepas
recombinantes de Saccharomyces cerevisiae. Sería útil el
desarrollar procedimientos de producción de grandes cantidades de
proteínas de papilomavirus de cualquier especie y tipo mediante el
cultivo de levaduras recombinantes. Igualmente, sería útil el
producir grandes cantidades de proteínas de papilomavirus que
tuvieran las propiedades que confieren inmunidad de las proteínas
nativas, tal como la conformación de la proteína nativa. Con el fin
de lograr este último objetivo, sería necesario el analizar el
efecto de numerosas mutaciones en el gen L1 sobre la unión de
anticuerpos de propiedades conocidas (dependientes de VLP,
reactividad cruzada, etc.).
El escaneo empírico de secuencias de péptidos
naturales o manipulados genéticamente para determinar los restos
funcionales, depende, intrínsecamente, de la expresión de grandes
números de variantes de secuencias con el fin de ensayar su
potencia funcional relativa. El nivel de expresión de la proteína
obtenido puede particularmente ser crítico en el caso de proteínas
estructurales víricas auto-ensamblables, ya que la
eficacia del auto-ensamble frecuentemente depende
de la concentración. El sistema de vector de expresión de
baculovirus de insecto, ha sido ampliamente usado para estudiar el
auto-ensamble vírico, pero, generalmente, requiere
el previo aislamiento y expansión de una cepa vírica recombinante
purificada en placa, para generar cantidades útiles de partículas
auto-ensambladas. Al examinar un cierto número de
posibilidades para la expresión de niveles analíticos de proteína
de cubierta L1 de papilomavirus tipo 11 humano y de conejo de cola
de algodón (Sylvilagus floridanus), los presentes autores
han encontrado que incluso una breve co-transfección
transitoria de células de insecto con vectores de transferencia de
baculovirus y ADN vírico, proporcionó partículas ensambladas, las
cuales fueron inmunológicamente indistinguibles de las partículas
previamente obtenidas a partir de cepas purificadas en placa.
Dentro de los seis días de la co-transfección
plásmido/ADN vírico de células Sf9, pudo demostrarse al menos
1-2 \mug de partículas L1 ensambladas/100 mm de
placa. Este nivel de expresión es más que suficiente como para
ensayar su funcionalidad, y tiene varias ventajas sobre sistemas de
expresión transitorios de células de mamífero comparables.
Con el fin de definir epítopos neutralizantes en
infecciones por HPV, los presentes autores precisaron identificar
los restos de aminoácidos que confieren especificidad tipo
antigénica sobre subtipos de papilomavirus humanos (Christensen,
N.D., y otros, "Neutralización mediada por anticuerpo monoclonal
de papilomavirus humano infeccioso tipo 11", J. Virol.,
vol. 64, págs. 1936-1944, (1990)). Muchos de los
epítopos específicos del tipo son conformacionalmente dependientes
y son detectables únicamente mediante ensamble con VLP. La proteína
de cubierta estructural L1 de varios papilomavirus animales y
humanos ha demostrado ser eficazmente
auto-ensamblada cuando se expresa en células de
insectos a través de cepas de baculovirus recombinantes
(Christensen, N.D., y otros, "Las partículas de tipo virus de
proteína de cápsida L1 de papilomavirus humano tipo 11 expresadas en
baculovirus ensamblados son reconocidas por anticuerpos
monoclonales neutralizantes e inducen altos títulos de anticuerpos
neutralizantes", J. Gen. Virol., vol. 75, págs.
2271-2276, (1994)). El tiempo y trabajo implicado
en la generación de fago recombinante impide el uso de este
procedimiento para rastrear un gran número de variantes de VLP
producidas a través de mutagénesis dirigida al sitio. Sin embargo,
los presentes autores han observado previamente que, cuando se
expresa en el sistema baculovirus, es detectable una proteína
recombinante en forma de un producto secretado en cantidades de
\mug/ml dentro de los 5-7 días de la transfección
inicial de células de insectos con ADNs plásmido y vírico. En base a
esta observación, los presentes autores han examinado si se
acumularían cantidades suficientes de proteína L1 de papilomavirus
como para permitir el auto-ensamble dentro de VLP
mediante expresión transitoria, particularmente si se usara un
sistema de transfección de baculovirus más eficaz, tal como el
sistema BaculoGold^{R} (Pharmigen, San Diego, CA). Usando un
protocolo de transfección transitoria de 6 días rápido, se produjo
la proteína de cubierta L1 de numerosos tipos de papilomavirus,
adecuadamente ensamblados dentro de VLP. Los extractos preparados a
partir de células transfectadas transitoriamente con constructos
del gen L1 de CRPV o HPV11, contenían material inmunógeno reconocido
por anticuerpos monoclonales dependientes de VLP y específicos del
tipo, generados contra VLP de o bien CRPV o bien HPV11. El material
expresado transitoriamente no mostró reactividad cruzada con otros
anticuerpos específicos del tipo, y el reconocimiento fue sensible
a la desnaturalización alcalina, demostrando además fidelidad en la
formación de VLP.
Con el fin de mapear el epítopo neutralizante de
HPV11, los presentes autores mutaron HPV11 en los restos en los que
las secuencias divergen de la secuencia HPV6b. Las secuencias se
mutaron para comparar la secuencia HPV6b (la tirosina en la
posición 132 se eliminó con el fin de analizar el efecto de esta
inserción). Usando el sistema de expresión transitoria de Sf9
descrito anteriormente, estos genes L1 de HPV11 mutantes se
expresaron y analizaron para determinar la unión mediante
anticuerpos monoclonales específicos de HPV11.
Los ejemplos siguientes se proporcionan con el
fin de definir adicionalmente la invención sin limitar, por ello,
la invención a los aspectos particulares de estos ejemplos.
El gen estructural L1 de HPV11 se clonó a partir
de aislados clínicos usando PCR con cebadores diseñados a partir de
la secuencia de L1 publicada. A continuación, el gen L1 se subclonó
tanto dentro de BlueScript (Pharmacia) para mutagénesis, como de
pVL1393 (Stratagene) para expresión en células Sf9.
Las mutaciones se introdujeron dentro del gen L1
usando el juego para mutagénesis in vitro Amersham Scultor.
La aparición de la mutación deseada se confirmó mediante
secuenciación, y el gen mutado se subclonó dentro de pVL1393 para
su expresión dentro de células Sf9.
El gen estructural L1 de HPV6 se subclonó tanto
dentro de pAlt-1 (Promega) para mutagénesis, como
dentro de VL1393 (Stratagene) para su expresión en células Sf9. Las
mutaciones se generaron usando los sistemas de mutagénesis in
vitro Altered Sites II (Promega), verificadas mediante
secuenciación, y se subclonaron dentro de pVL1393 para su expresión
en células Sf9.
Las secuencias de los genes L1 de HPV6 y HPV11 se
verificaron con las secuencias publicadas [(Dartmann, K., y otros,
EMBO J., vol. 2, pág. 2341, (1993); EMBL GeneBank, Nº de
Registro M14119 (HPV11 L1) y Nº de Registro X00203 (HPV6B L1)].
Las células Sf9 se transfectaron usando el juego
de transfección BaculoGold (Pharmingen). Las transfecciones se
realizaron esencialmente de acuerdo con las instrucciones del
fabricante con la modificaciones siguientes. Se transfectaron
8x10^{8} células Sf9 en un disco 100 mm, con 4 \mug de ADN de
BaculoGold y 6 ug de ADN de ensayo. Las células se recolectaron
después de 6 días y se ensayaron para determinar la producción de
VLP.
Las células se recolectaron seis días después de
la transfección, mediante rascado, seguido de centrifugación a baja
velocidad. Las células se resuspendieron en 300 \mul de tampón de
interrupción (NaCl 1 M, Tris 0,2 M, pH 7,6) y se homogeneizaron
durante 30 segundos sobre hielo usando un Polytron PT 1200 B con
una sonda PT-DA 1205/2-A (Brinkman)
en un tubo Falcon 1259. Las muestras se centrifugaron a 2500 rpm
durante 3 minutos para granular los residuos. Los tubos se lavaron
con 150 \mul adicionales de tampón de interrupción, los
sobrenadantes se recogieron en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml
y se volvieron a centrifugar durante 5 minutos en una
microcentrífuga Eppendorf (Brinkman). Los sobrenadantes se
recogieron y se almacenaron a 4ºC hasta su uso. Típicamente, los
ensayos ELISA se realizaron el mismo día.
Se diluyeron 5 \mul de extracto en 50 \mul de
BSA al 1% en PBS (solución salina tamponada en fosfato; NaPO_{4}
20 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM) y se cultivaron sobre una placa de
poliestireno. La placa se incubó durante una noche a 4ºC. Los
extractos se retiraron y la placa se bloqueó con leche en polvo al
5% en PBS. Todas las etapas posteriores de lavado se realizaron con
BSA al 1% en PBS. La placa se incubó a temperatura ambiente con
anticuerpo primario durante 1 hora. Los anticuerpos primarios,
anticuerpos monoclonales generados contra VLP de HPV11, se
obtuvieron en forma de cepa ascitis del Dr. Neil Christensen
(Pennsylvania State University). Estos se diluyeron 10^{5} en BSA
al 1% en PBS antes de su uso. Después de lavadas, las placas se
incubaron durante 1 hora con anticuerpo secundario. El anticuerpo
secundario, IgG(\gamma) anti-ratón de
cabra marcado con peroxidasa, se adquirió a Kirkegaard & Perry
Laboratories, Inc., y se usó a una dilución 10^{3} en BSA al 1%
en PBS. Después de un lavado final, se realizó un ensayo con
peroxidadsa de rábano picante y la absorbancia se leyó a 405
nm.
Con el fin de mapear los residuos críticos para
un epítopo neutralizante específico de HPV11, los presentes autores
aprovecharon dos ventajas. En primer lugar, se usó un panel de
anticuerpos monoclonales los cuales son específicos para la L1 de
HPV11 y reconocen únicamente L1 cuando existe presente una VLP. Las
condiciones del ensayo descrito en el Ejemplo 3 son tales que estos
anticuerpos no muestran reactividad cruzada con la VLP de L1 de
HPV6b íntimamente relacionada. Entre estos cinco anticuerpos, 4 han
demostrado neutralizar a HPV11 en el sistema Xenograft de Kreider
(Kreider, y otros, J. Virol., vol. 61, págs.
590-593, (1987)).
Las L1 de HPV6 y HPV11 son las proteínas L1 más
íntimamente relacionadas dentro de la familia de papilomavirus. La
L1 de HPV6 tiene una longitud de 500 aminoácidos. La L1 de HPV11
tiene 501 restos. Estos pueden alinearse de manera tal que el
aminoácido extra en HPV11 esté en la posición 132. Con esta
alineación, son idénticos en toda la secuencia de aminoácidos,
excepto en 39 posiciones (92,4%), incluyendo la inserción.
Los presentes autores han deducido que la
especificidad del tipo 11 de los anticuerpos monoclonales debe
residir dentro de estas 39 diferencias de restos. Cambiando
sistemáticamente un resto del tipo 11 dentro de un tipo 6, los
restos críticos para la respuesta del tipo 11 se pondrían de
manifiesto mediante una pérdida en la afinidad de unión por los
anticuerpos monoclonales específicos del tipo 11. Dado que los
restos mutarían a restos que aparecen de forma natural en el tipo
6, la probabilidad de que dichas substituciones afecten a la
formación de VLP sería pequeña.
Con el fin de determinar el efecto sobre la unión
de cualquier resto particular, tanto el HPV11 como el derivado de
HPV11 correspondiente se expresaron en el sistema de expresión
transitorio. Se realizó un ensayo ELISA usando el panel de
anticuerpos monoclonales específicos de HPV11, y se comparon los
resultados entre los dos. La producción de L1 se normalizó con
anticuerpo monoclonal H6.C6. El anticuerpo H6.C6 muestra
reactividad cruzada con HPV11, el epítopo es lineal e independiente
de la formación de VLP. De acuerdo con ello, mide la producción de
L1.
Los resultados se llevaron a cabo mediante una
doble normalización. En primer lugar, se calculó la relación de
absorbancia del anticuerpo de ensayo para el H6.C6 para la misma
posición. La misma relación se determinó para HPV11 y se dividió
por la relación para la posición del ensayo. De esta forma, una
doble relación próxima a 1 significa que no existe una diferencia
detectable en la unión del anticuerpo al clon de ensayo con
respecto a HPV11. Una doble relación menor de 1 significa que el
anticuerpo de ensayo se une más pobremente al clon de ensayo que al
de tipo salvaje. En teoría, una relación mayor de 1 significa que
el anticuerpo se une mejor al clon de ensayo que al HPV11. En la
práctica, esto no se ha observado. Una relación dentro del intervalo
de 0,1 a 0,2 es, esencialmente, el valor base, lo cual significa
que no puede detectarse la unión del anticuerpo a la VLP
mutante.
Las posiciones de LI en HPV11 que difieren de
HPV6, se mutaron individualmente con el fin de comparar el resto
correspondiente en HPV6. Los clones se expresaron en células Sf9 a
través de un recombinante que expresa baculovirus y afecta la
unión, mediante el panel determinado de anticuerpos monoclonales
específicos de HPV11 (Tabla 1). Los restos que aparecen en la
columna 2, indicada como "pierden unión", son posiciones
consideradas como críticas para la unión de uno o más de los
anticuerpos monoclonales. Los restos enumerados en la columna 1,
indicada como "mantienen la unión", se consideran como no
críticos para la unión con cualquiera de los anticuerpos
monoclonales.
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Mantienen la unión \+ Pierden unión \cr HPV11:K28T \+
HPV11:G131S\cr HPV11:Y49F \+ HPV11:Y132 \Delta \cr HPV11:K53R \+
HPV11:Y246F\cr HPV11:V54A \+ HPV11:N278G\cr HPV11:L119F \+
HPV11:S346T\cr HPV11:T170K\+\cr HPV11:S173T\+\cr HPV11:S166P\+\cr
HPV11:N179A\+\cr HPV11:L219I\+\cr HPV11:V225T\+\cr
HPV11:T263E\+\cr HPV11:D271T\+\cr HPV11:L273I\+\cr
HPV11:V274I\+\cr HPV11:G277S\+\cr HPV11:S281T\+\cr
HPV11:A294G\+\cr HPV11:H300N\+\cr HPV11:H325Q\+\cr
HPV11:K347T\+\cr HPV11:A349S\+\cr
HPV11:F366V\+\cr}
(Continuación tabla
I)
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
HPV11:Q434P\+\cr HPV11:D439N\+\cr HPV11:M440L\+\cr
HPV11:F458Y\+\cr HPV11:T474S\+\cr HPV11:A467I\+\cr
HPV11:P488A\+\cr
HPV11:T497A\+\cr}
Los clones que contienen la codificación de los
mutantes de L1 descritos en la Tabla 1 bajo la columna "pierden
unión", se designaron como HPV11:G13S, HPV11:Y132\Delta,
HPV11:Y246F, HPV11:N278G y HPV11:S346T. Como alternativa, puede
omitirse el prefijo "HPV".
Los cuatro restos que afectan a la unión se
espaciaron a distancias considerables unos de otros, abarcando la
separación total más de 200 restos a lo largo de la secuencia
lineal.
Las posiciones afectan a la unión de los
anticuerpos de manera diferenciada. No más de tres posiciones
afectan a la unión de cualquier único anticuerpo. Unicamente la
posición 246 afecta a la unión de los cinco anticuerpos. En todos
los casos, se observó alguna medida de unión detectable. Esto
indica que la formación de VLP no resulta afectada. El que la unión
resulte afectada por el cambio en la posición 278 parece ser
marginal y es cuestionable, pero se incluye en este caso dado que
la ligera disminución es reproducible. El modo en que afecta a la
unión, medida mediante la relación de afinidad normalizada de VLP,
se muestra en la Tabla 2. La Tabla 3 muestra las configuraciones de
unión para los anticuerpos monoclonales de HPV11, tal como se
deduce a partir de estos estudios.
| Posición | H11.A3.2 | H11.B2 | H11.F1 | H11.G5 | H11.H3 |
| G131S | 0,93 | 0,20 | 0,11 | 0,12 | 0,96 |
| \Delta132 | 1,0 | 0,36 | 0,08 | 0,11 | 0,64 |
| Y246F | 0,48 | 0,33 | 0,52 | 0,45 | 0,32 |
| N278G | 1,4 | 0,79 | 0,69 | 0,81 | 0,92 |
| S173T | 0,82 | 1,14 | 0,85 | 0,85 | 0,94 |
| S346T | 0,98 | 1,6 | 0,74 | 0,79 | 0,32 |
| ^{*}Relación de afinidad normalizada = | |||||
| PosiciónX(A_{405}H11.Y/A_{405}H6.C6)/HPV11((A_{405}H11.Y/A_{405}H6 .C6) |
| Posición | H11.A3.2 | H11.B2 | H11.F1 | H11.G5 | H11.H3 |
| G131S | + | - | - | - | + |
| \Delta132 | + | -/+ | - | -/+ | + |
| Y246F | -/+ | -/+ | -/+ | -/+ | -/+ |
| N278G | + | +/- | +/- | +/- | +/- |
| S346T | + | + | + | + | - |
Para controlar la producción de VLP de HPV11 con
el fin de asegurar que contienen el epítopo neutralizante
importante, se usó el ensayo de competencia ELISA siguiente. Las
VLP derivadas de HPV6, pero no las VLP de HPV6, compiten por la
unión a VLP de HPV11 con anticuerpos monoclonales H11.B2, H11.F1 y
H11.G5. Esto muestra la presencia de epítopo neutralizante sobre las
VLP, mediante la demostración de unión competitiva, específica, al
epítopo neutralizante. El ensayo se realiza de la manera
siguiente.
1. Cultivar en placa de 10-100 ng
del lote de ensayo de VLP de HPV11 por cavidad de una placa ELISA
de 96 cavidades. Diluir la muestra en BSA al 1% en PBS (tampón
ELISA). Cultivar en placa 50 \mul de muestra. Incubar durante una
noche a 4ºC.
2. Retirar los sobrenadantes de las cavidades.
Bloquear durante una hora con leche en polvo al 5% en PBS a
temperatura ambiente.
3. Lavar con tampón ELISA.
4. Preparar diluciones de anticuerpo monoclonal
H11.F1.
A. Preparar un grupo de diluciones con cantidades
crecientes de VLP derivadas de HPV6.
B. Preparar un grupo por duplicado de diluciones
con cantidades crecientes de VLP de HPV6.
C. Preparar una dilución sin VLP agregados.
5. Agregar 50 \mul de muestras de anticuerpo a
las cavidades de la placa ELISA. Incubar durante una hora a
temperatura ambiente.
6. Retirar los anticuerpos y lavar tres veces con
tampón ELISA.
7. Agregar 50 \mul de Ig(\gamma)
anti-ratón de cabra a la dilución apropiada.
Incubar durante una hora a temperatura ambiente.
8. Lavar tres veces con tampón ELISA. Revelar con
un ensayo de fosfatasa alcalina y leer a 405 nm.
9. Una señal fuerte a 405 nm que compite
fuertemente con las VLP derivadas de HPV6, pero no con las VLP de
HPV6, verificará la presencia del epítopo neutralizante sobre el
lote de ensayo de VLP de HPV11.
Las VLP derivadas de HPV11 se usan para
caracterizar lotes de ensayo de sueros policlonales con el fin de
determinar su actividad neutralizante. Un lote de sueros
policlonales se genera, por ejemplo, mediante un lote de ensayo de
VLP de HPV11. Como alternativa, la muestra es una muestra humana
para la cual se desea una caracterización de su capacidad
neutralizante.
Los sueros policlonales se aclaran previamente
con VLP de HPV6. Esto elimina los anticuerpos de reactividad
cruzada, tanto dependientes como no dependientes de VLP. El epítopo
neutralizante de HPV11 es específico del tipo 11, y los anticuerpos
generados contra él no son separados mediante
pre-incubación con VLP de HPV6. Sin embargo, las
partículas derivadas de HPV6 se unen a estos anticuerpos, y la
observación de dicha unión, por ejemplo, en un ensayo ELISA
estándar, demuestra la presencia de anticuerpos neutralizantes en
la muestra de sueros de ensayo.
Una muestra de ensayo de sueros policlonales se
aclaró de acuerdo con el procedimiento siguiente.
1. Se hizo una estimación del total de anticuerpo
de unión de VLP. Las VLP se inmovilizaron sobre una placa ELISA en
formato sandwich usando un monoclonal anti-HPV11
(existen varios disponibles). La cantidad de anticuerpo monoclonal
que se une, se estimó usando un segundo anticuerpo
anti-HPV11 de concentración conocida como un
patrón. Como alternativa, se determinó la concentración de IgG del
policlonal y se supuso que todo era anti-HPV11.
2. Se agregaron VLP de HPV6 a una parte alícuota
de sueros en un exceso en \mug de 10 veces con respecto a la
cantidad de anticuerpo monoclonal de HPV11 en los sueros
policlonales, tal como se determinó en la etapa 1.
3. La mezcla se incubó durante una noche a
temperatura ambiente, seguido de centrifugación a alta velocidad
(300.000xg) durante 5 horas para granular los complejos de
VLP-anticuerpo.
4. El procedimiento se repitió dos veces más.
5. Los sueros separados se ensayaron para
determinar su unión en un ensayo ELISA sandich. Las VLP de HPV6 y
las derivadas de HPV6 (las cuales unen los monoclonales
neutralizantes), se inmovilizaron mediante un anticuerpo monoclonal
de HPV6. Los sueros policlonales separados suelen mostrar únicamente
una unión mínima a las VLP de HPV6. Una fuerte señal contra VLP
derivadas de HPV6 demuestra unión al dominio neutralizante
principal de HPV11, y que los sueros policlonales contienen
anticuerpo neutralizante.
Puede llevarse a cabo un segundo ensayo con el
fin de demostrar la capacidad neutralizante en muestras de sueros
de ensayo, usando el ensayo de neutralización Xenograph
(Christiansen, y otros, J. Virol., vol. 64, págs.
1936-1944, (1990); Christiansen, y otros, J. Gen.
Virol., vol. 75, págs. 2271-2276, (1994)).
1. Los sueros separados contra VLP derivadas de
HPV6, se generaron de acuerdo con el protocolo indicado
anteriormente, substituyendo las VLP derivadas de HPV6 por VLP de
HPV6. Los sueros policlonales separados con VLP de HPV6 se
obtuvieron como un control.
2. Se hicieron unas series de diluciones de los
sueros policlonales y se analizaron en el ensayo de neutralización
Xenograph con el fin de establecer el valor de neutralización de
los sueros.
3. Se hicieron conjuntos paralelos de diluciones
de sueros separados derivados de HPV6 y separados de HPV6 y se
valoraron en el Xenograph.
4. La presencia de actividad neutralizante en el
ensayo Xenograph que es ampliamente eliminada mediante separación
con VLP derivadas de HPV6 pero no VLP de HPV6, demuestra, mediante
un ensayo biológico, la presencia de anticuerpos en los sueros
contra el epítopo neutralizante de HPV11.
El gen estructural L1 de HPV11 se clonó a partir
de aislados clínicos usando la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) con cebadores diseñados a partir de la secuencia de L1
publicada (8,17). El gen estructural L1 de CRPV se clonó mediante
PCR a partir de ADN genómico vírico. Los genes de L1 se subclonaron
dentro de pVL1393 (Stratagene) para expresión en células Sf9.
Las células Sf9 se
co-transfectaron usando el juego de transfección
BaculoGold (Pharmigen, San Diego, CA). La transfección se realizó de
acuerdo con las instrucciones del fabricante, con la siguiente
modificación: Se transfectaron 9x10^{6} células Sf9 en un disco
de 100 mm, con 4 \mug de ADN vírico de BaculoGold y 6 ug de ADN
plásmido de ensayo. Las células se recolectaron 6 días después,
excepto que se especifique lo contrario, y se ensayaron para
determinar la producción de VLP mediante transferencia Western o
ensayo ELISA (véase más abajo).
Las células se recolectaron seis días después de
la transfección. Las placas se rascaron para resuspender las
células, y las células se recogieron mediante centrifugación a baja
velocidad. Las células se resuspendieron en 300 \mul de tampón de
interrupción (NaCl, 1 M, Tris 0,2 M, pH7,6) y se homogeneizaron
durante 30 segundos sobre hielo usando un Polytron PT 1200 B con
una sonda PT-DA 1205/2-A (Brinkman)
en un tubo Falcon 2059. Las muestras se centrifugaron a 2500 rpm en
una centrífuga GPR (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA)
durante 3 minutos para granular los resíduos. Los tubos se lavaron
con una cantidad adicional de 150 \mul de tampón de interrupción,
los sobrenadantes se recogieron en un tubo de microcentrífuga de
1,5 ml, y se volvieron a centrifugar durante 5 minutos en una
microcentrífuga Eppendorf (Brinkman). Los ensayos ELISA comenzaron
el mismo día.
Se diluyeron 5 \mul de extracto en 50 \mul de
BSA al 1% en solución salina tamponada en fosfato (PBS), se
repartieron alícuotamente sobre una placa de microvaloración
Inmulon 2 de 96 cavidades (Dynatech Laboratories, Inc.), y se
incubaron durante una noche a 4ºC. Los extractos se retiraron y la
placa se bloqueó con leche el polvo al 5%/PBS. Todas las etapas de
lavado posteriores se realizaron con BSA al 1%/PBS. La placa se
incubó a temperatura ambiente con anticuerpo primario durante 1
hora. Los anticuerpos primarios, anticuerpos monoclonales CRPV.5A y
H11.F1, se obtuvieron en forma de cepa ascítica del Dr. Neil
Christensen. Son anticuerpos dependientes de la VLP y específicos
del tipo que reconocen las VLP de CRPV y HPV11, respectivamente
(Neil Christiansen, comunicación personal). Antes de su uso, se
diluyeron 10^{5} veces en BSA al 1%/PBS. Después de lavado en BSA
al 1%/PBS, las placas se incubaron durante 1 hora con anticuerpo
secundario, IgG(\gamma) anti-ratón de cabra
marcado con peroxidasa (Kirkegard & Perry Laboratories, Inc.) y
se usaron a una dilución 10^{3} en BSA al 1% en PBS. Después de
un lavado final, se realizó un ensayo con peroxidasa de rábano
picante y la absorbancia se leyó a 405 nm.
En base a los estudios del Ejemplo 4, los
presentes autores mutaron el gen L1 de HPV6 a los restos
aminoácidos 131, 245 y 277, para comparar la secuencia de L1 de
HPV11. Además, se insertó una tirosina después del resto 131,
extendiendo la longitud del gen de L1 de HPV6 mutado en un resto
hasta 501 aminoácidos. A este clon se le designó como HPV6:4. Los
presentes autores predijeron que estos cuatro cambios, todos los
cuales se emparejaron con la secuencia L1 de HPV11, facilitarían la
unión por los anticuerpos neutralizantes específicos de HPV11
H11.B2, H11.F1 y H11.G5. Esto fue de hecho cierto, tal como se
muestra en la tabla siguiente.
Valores de afinidad relativa a HPV6 y a un
derivado
| Anticuerpo | HPV6 | HPV6:4 |
| H11.A3 | 0,15 | 0,23 |
| H11.B2 | 0,18 | 0,82 |
| H11.F1 | 0,20 | 0,89 |
| H11.G5 | 0,14 | 0,84 |
| H11.H3 | 0,11 | 0,17 |
Esto da validez al hecho de que los cuatro restos
de aminoácidos 131, 132, 245 y 277, definen la especificidad del
sitio de unión a los anticuerpos neutralizantes H11.B2, H11.F1 y
H11.G5.
El anticuerpo H11.H3 puede distinguirse de los
otros tres anticuerpos neutralizantes por la sensibilidad a la
unión en la posición 346, y la carencia de sensibilidad a la unión
en la posición 131. Esto indica que la unión de este anticuerpo se
ha desplazado hacia el C-terminal, pero todavía
solapa el sitio de unión de los otros tres anticuerpos monoclonales
neutralizantes.
Los presentes autores derivaron adicionalmente el
clon derivado de HPV6 anteriormente definido, agregando de un
cambio adicional en la posición 345, con el fin de comparar la
secuencia de HPV11 en su posición 346. A este clon se le designó
como HPV6:5. La predicción era que se uniría a los cuatro
anticuerpos neutralizantes, incluyendo el H11.H3. Los datos se
muestran en la tabla siguiente.
Valores de afinidad relativa a HPV6 y a un
derivado
| Anticuerpo | HPV6 | HPV6:5 |
| H11.A3 | 0,15 | 0,23 |
| H11.B2 | 0,18 | 0,82 |
| H11.F1 | 0,20 | 0,89 |
| H11.G5 | 0,14 | 0,84 |
| H11.H3 | 0,11 | 0,17 |
Tal como se esperaba, este clon produjo VLP que
pudieron unirse a los anticuerpos neutralizantes H11.B2, H11.F1 y
H11.G5, y da validez a esta observación. De manera inesperada, no
se unió al anticuerpo H11.H3, lo cual indica que se requiere
también un cambio adicional en dicha posición 345 para la unión a
H11.H3.
Con el fin de estudiar adicionalmente la unión
del anticuerpo H11.H3, se agregó un cambio en resto 438 del gen L1
de HPV6, para comparar el resto de L1 de HPV11 en 439. El cambio se
agregó tanto al clon HPV6:4b (con cambios en 132, 245, 277 y 345)
como al HPV6:5. Esto generó el clon HPV5b (132, 245, 277, 345 y
435) así como el HPV6:6. El clon HPV6:5b se une al anticuerpo
H11.H3, y el clon HPV6:6 se une a los anticuerpos H11.B2, H11.F1,
H11.G5 y H11.H3. Estos clones extienden la sensibilidad obtenible
en los ensayos descritos más adelante en las Reivindicaciones 2 y
3, y anteriormente en los Ejemplos 7 y 8.
Con el fin de estudiar adicionalmente la unión de
los anticuerpos monoclonales, se retro-mutó el clon
HPV6:4 en las cuatro posiciones individuales, y se demostró que la
retro-mutación dió como resultado pérdida de unión
únicamente en los restos 131 y 132. La generación de un clon L1 de
HPV6 adicional con únicamente estos dos cambios, HPV6:2, demostró
que estos dos cambios solos son suficientes para la unión de los
anticuerpos monoclonales neutralizantes de HPV11. En consecuencia,
estos estudios definen en su conjunto el epítopo mínimo para los
anticuerpos neutralizantes.
Claims (1)
1. Partículas de tipo virus sintéticas generadas
a partir de cualquiera de los constructos siguientes:
a) HPV6:2, en el que el gen L1 de HPV6 ha sido
mutado de manera tal que contiene la codificación de una proteína
en la que el aminoácido 131 es el mismo que en la proteína L1 de
HPV11 y, adicionalmente, se ha insertado un resto tirosina como el
aminoácido 132;
b) HPV6:4\Delta132, el cual contiene las mismas
mutaciones que HPV6:4, excepto que no existe inserción de un resto
tirosina después del aminoácido 131; y
c) HPV6:4,S131G, el cual contiene las mismas
mutaciones que HPV6:4, excepto que el resto aminoácido 131 es
glicina;
siendo HPV6:4 un gen L1 de HPV6, el cual ha sido
mutado de manera tal que contiene la codificación de una proteína
en la que los restos aminoácidos 131, 245 y 277 son los mismos que
los restos aminoácidos 131, 246 y 278 en la proteína L1 de HPV11 y
que, después del resto aminoácido 131 de L1 de HPV6, se ha
insertado un resto tirosina.
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|---|---|---|---|---|
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| US6689366B1 (en) | 1998-12-17 | 2004-02-10 | Merck & Co., Inc. | Synthetic virus like particles with heterologous epitopes |
| DE69930960T2 (de) * | 1998-12-17 | 2007-04-19 | Merck & Co., Inc. | Synthetische virus-ähnliche partikel mit heterologen epitopen. |
| EP1501945A4 (en) * | 2002-04-30 | 2008-02-20 | Merck & Co Inc | MULTIPLEX ASSAY FOR HUMAN PAPILLOMA VIRUS |
| MA40624A (fr) * | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Cadila Healthcare Ltd | Antigènes supérieurs du papillomavirus présentant des propriétés immunologiques supérieures et vaccin les contenant |
| CN106831958B (zh) * | 2015-12-04 | 2020-12-29 | 厦门大学 | 一种人乳头瘤病毒11型l1蛋白的突变体 |
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| CA2227339A1 (en) * | 1995-07-19 | 1997-02-06 | Merck & Co., Inc. | Synthetic hpv11 virus-like particles |
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