KR100240480B1 - 파필로마 바이러스 백신 - Google Patents

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Abstract

파필로마 바이러스에 의해 일어나는 감염에 대하여 백신으로 사용하거나 진단목적으로 사용할 수 있는 파필로마 바이러스성 입자들을 제공하는 방법.
상기 방법은 파필로마 바이러스 L1 단백질 또는 파필로마 바이러스 L1 단백질과 파필로마 바이러스 L2 단백질의 조합을 암호하는 하나 또는 그 이상의 재조합 DNA분자들을 구성하는 제1단계와 하나 또는 그 이상의 재조합 DNA분자들을 적당한 숙주 세포에 트란스펙션하여 L1 또는 L1과 L2조합의 단백질을 발현한 후 세포내에서 바이러스성 입자들(VLPs)을 생성토록 하는 제2단계로 이루어진다. VLP와 VLPs에 관련된 백신들을 또한 특허 청구한다.

Description

[발명의 명칭]
파필로마 바이러스 백신
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 파필로마 바이러스 백신에 관한 것으로서 상세하게는 파필로마 바이러스에 의해 발생되는 감염들을 치료함에 효과적일 수 있는 항원과 백신에 관한 것이다.
[발명의 배경]
파필로마 바이러스 감염은 사람에게만 국한되지 않고 양, 개, 소, 코요테, 늑대, 포슘, 사슴, 영양, 비버, 거북, 곰, 도마뱀, 원숭이, 침팬지, 기린, 임파라, 코끼리, 고래, 고양이, 돼지, 게르빌, 엘크, 야크, 돌고래, 앵무새, 염소, 코뿔소, 낙타, 레밍, 알프스 산양, 스컹크, 타스마니아 데빌, 오소리, 여우 원숭이, 순록, 아르마딜로, 뉴트 및 뱀 등에서도 이루어진다고 알려져 있다(K Syrjanen, L Gissman 및 LG Koss 편집, Springen Verlag 1987, 파필로마 바이러스와 사람 질병에 기술된 J.P Sundberg 저술 “Papillona Virus Infections in Animals”참조).
또한, 파필로마 바이러스는 DNA 서열 상관 관계에 따라 타입 1∼56으로 분화되는 사람 파필로마 바이러스와 같은 여러 군을 포함하고 있다고 알려져 있다(H Pfister, CRC Press Inc 1990, 파필로마 바이러스와 사람 암 참조). HPV와 그에 관련된 병변의 약성 잠새성의 임상병리학적 분류는 다음과 같이 할 수 있다.
제1부류에는 양성 발바닥 유두종을 일으키는 타입 1과 타입 4, 양성 일반 유두종을 일으키는 타입 2, 26, 28 및 29, 양성 평면 유두종을 일으키는 타입 3, 10 및 27, 그리고 붓처 종양을 일으키는 타입 7이 포함된다.
감염의 제1부류는 정상인 또는 면역적격인에서 발생된다.
면역 타협된 사람에 관련되는 제2부류에는 매우 악성 반점 병소를 일으키는 타입 5와 8, 양성 또는 드물게는 악성의 반점 또는 평면 병소를 일으키는 타입 9, 12, 14, 15, 17, 19∼25, 36 및 46∼50이 포함된다.
이들 반점 병소들은 다르게는 우상표피이형성(EV)으로 알려져 있다.
특히 생식기관을 감염시키는 제3부류에는 드물게는 악성이 되는 콘딜로마타(Condylomata)를 유발하는 타입 6, 11, 34 및 39, 41∼44, 그리고 51∼55, 양성 병소 상피 이상 증식을 유발하는 타입 13 및 32, 상피 이형성 및 역행성 구진증을 포함한 심각한 병소를 유발하는 타입 16과 18, 중간 정도의 악성 잠재성이 있는 콘딜로마타를 유발하는 타입 30, 31, 33, 35, 45 및 46이 포함된다. 콘딜로마타는 통상 항문기관에서 발생하며 특히 경부에 많이 나타난다.
타입 16과 18은 경부, 질, 외음문, 항문관의 대부분 감염성 카시노마스와 관련 있다. 콘딜로마타는 또한 호흡-소화기관에서도 발생할 수 있다.
특히 HPV 16은 생식-비뇨기 기관의 준악성 악성질환과 관련되어 있다.(Durst 등, PNAS 80 3812∼3815, 1983; Gissmann등, J Invest. Dermato; 83 265∼285, 1984)
현재에는, HPV 16 중성화에 대한 체액성 반응에 대한 어떠한 정보도 알려진 바가 없다.
HPV 16 감염 환자의 혈장에서 HPV 16 융합 단백질(Jenison 등, J. Virol 65 1208∼1218, 1990; 쾨첼 등, Int. J. Cancer 48 682∼688, 1991)과 합성 HPV 16 L1 펩티드들(Dillner 등, Int. J Cancer 45 529∼535, 1990)에 대한 항체의 검출은, 비록 몇몇의 환자들에서만 HPV 16 L1-특이성 항체가 이 기술에 의해 확인되지만, HPV의 캡시드 단백질내에 B 에피토피(epitope)들이 존재함을 확인시켜 준다.
실험관 내에서 HPV 16을 증식할 수 있는 시스템이 없고, 더욱 사람 생식 병소가 HPV 16 비리온(Virion)들을 미량 생산하기 때문에, HPV 16 입자들을 면역학 연구들에 이용하지 못하여 왔다.
동물 파필로마 바이러스들 역시 송아지 파필로마 바이러스를 포함하며 특히 DNA 서열 상관관계에 따라 분류되어지는 BPV 1, BPV2, BPV3, BPV4, BPV5 및 BPV6을 포함한다.
일반적으로 기타 동물 파필로마 바이러스들은 사슴, 말, 토끼, 개, 기타 설치류등을 감염시킨다.
파필로마 바이러스들은 여덟개의 초기 및 두개의 후기 유전자를 암호화하는 작은 DNA 바이러스이다(Lancaster와 Jenson, 1987, Cancer Metast. Rev. P 6653∼6664; Pfister 1987. Adv. Cancer Res 48, 113∼147 참조).
후기 유전자의 기구화는 초기 유전자들에 비하여 간단하다.
후기 유전자 L1과 L2는 대부분의 경우 서로 약간 오버랩되어 있다.
가상적인 L2 단백질은 서로 다른 파필로마 바이러스들에 있어서 매우 높게 보존되어 있으며 특히 C-말단으로부터 10개의 염기성 아미노산의 서열은 공통되어 있다.
중간의 넓은 도메인은 오직 작은 덩어리진 유사성을 갖고 있다고 밝혀져 있다. 그러나 L1 ORF는 모든 경우에 반복되어 보존되어 있다고 밝혀져 있다(Syrjanen등의 상기한 문헌 참조).
아미노산 서열 상관 관계는 HPV 1a, HPV 6b, BPV 1과 CRPV를 비교할 때 50%에 이른다(Cotton의 꼬리 래비트 파필로마 바이러스). 파필로마 바이러스들에 대한 면역요법에 관련하여 유두종과 경피 병소에 대한 종래의 치료 방법들은 고통스럽고 재감염의 위험성이 있는 외상을 남기는 수술행위가 있어 왔다.
통상적인 치료약은 텅크쳐 또는 고약에 10% 내지 40% 함유되는 살리시릭산(Salicylic aeid)가 있어 왔다. 또한, 3%∼20%의 포리말린도 제안되어 있다. 저온 치료법인 피부 유두종의 치료에 사용되어 왔다. 또한 치료약으로서 글루타르알데히드(Gluteraldehyde)가 사용되어 왔다.
포도필린(Podophyllin)이 피부 유두종과 항문성 콘틸로마타에 다양한 효과가 있다고 하여 사용되어 왔다.
항문성 콘딜로마타에 사용되어진 수술의 유형들로는 수술제거, 저온수술 및 레이져 수술을 들 수 있다. 인터페론(Interferon)류의 사용도 제안되어 있다(Syrjanen등의 상기한 문헌 참조).
송아지 파필로마 바이러스(BPV)의 L1 단백질에 대한 항체들은 바이러스-중성화 활성이 있으며(Pilacinski 등, 1986) HPV 11 비리온들은 특정의 항 혈청에 의해 실험관 실험에서 불활성화 될 수 있다.(Christensen과 Kreider, J. Virol 64 3151∼3156, 1990).
또한 HPV 1-유발성 피부 유두종의 자연 발생적인 억제는 유두종 단백질에 대한 증가된 체악성 면역 대응과 관련 있다는 몇몇 확증도 있다(Kirchner, Prog. Med. Virol 33 1∼41, 1986).
또한 서로 다른 성공적인 결과들을 갖는 백신들이 개발되어 있다.
체내발생 종양 균질물들을 포함하는 백신의 사용이 또한 제안되어 있다[Abcarian 등 J. Surg Res 22:231∼236(1977) Dis Colon Rectum 25:648∼51(1982) Dis Colon Rectum 19:237∼244(1976)]. 그러나 최근에는 이러한 체내 발생 종양 균질물을 사용한 백신들이 바이러스 유래 DNA의 잠재적 종양 형성 효과가 있기 때문에 사용되어서는 안된다는 주장들이 있다(Bunney 1986 Br Med J 239 1045∼1047).
유전 공학 백신의 생산에 관련하여 이와 같은 문제점들은 상기한 Pfister(1990) 문헌에서 제기되었으며, 서로 다른 파필로마 바이러스 유형들이 과다하게 많이 있기 때문에 효과적인 백신을 얻는 것이 불가능하다고 경험하고 있다.
그러나 Pfister는 상부 경피층에서 발현되는 구조 단백질에 대비할 때 유두종 감염의 증식 기본 세포에서 초기 단백질들이 가장 비슷하게 합성되기 때문에 이들 단백질(즉 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7 또는 E8)에 주목해야 한다고 밝히고 있다.
그러므로 Pfister(1990)에 따라 바이러스 캡시드 단백질은 백신에 사용될 수 있음이 밝혀졌다.
진핵 세포에서 파필로마 바이러스 초기 단백질에 대한 실험관내 시스템에서 재조합 백신 바이러스의 이용이 또한 Pfister(1990)의 문헌이 개시되어 있다.
이것은 파필로마 바이러스 단백질들을 발현하는 유전적으로 변형된 백신 바이러스 또는 파파포룸알데히드(Paraformaldehyde) 표면에 고정화된 실험관적으로 백신 제조합 바이러스로 감염되거나 다른 발현 백신으로 전사되어진 생체 유래 세포로 구성되어지는 생 백신의 형태를 취할 수 있다.
Pfister(1990) 문헌에서 언급되어진 백신개발의 또 다른 형태는 글리코시드 큐일 A(Glycoside Quil A)의 면역 증강 콤플렉스(Immune Stimulating complex)를 사용하는 것이다.
성공적인 프로필라틱(Propylactic) 백신화에 대한 자료는 오직 송아지 피브로파필로마스의 송아지 피브로파필로마스 균진화된 균진물에서만 있으며 제한적인 면역성만을 제공한다고 보고되고 있다[Olseon 등 J. Am Vet Med Assoc 135, 499(1959) Cancer Res 22 463(1962)].
유전공학처리된 L1 융합 단백질(Pilacinski 등, UCLA Symp Molecular and Cellular Biology New Series Vol 32 Papilloma Viruses Molecullar and Clinical Aspects Alan R Liss New York 1985 257)으로 이루어진 백신 또한 송아지에게 사용되고 있으나 사람에게는 성공적이지 못함이 보고되고 있다(Barthold 등 J. Am vet Med Assoc. 165, 276, 1974).
Pfister(1990) 문헌에서는 캡시드 단백질 백신의 사용으로 HPV 감염을 확실하게 방지할 수 있다는 증거는 없지만, 항 종양 세포의 면역성 유발은 가능성 있다고 기술되어 있다.
L1과 L2 유전자들은 파필로마 바이러스 감염의 방지와 치료를 위한 백신 및 파필로마 바이러스의 진단과 검출에 사용될 면역소의 기초를 이룬다(International patent WO 8605816 및 WO8303623).
그러나, 이들 백신을 상업적으로 실시하였다는 어떤 보고도 없다.
[발명의 요약]
이에 따라 본 발명은 파필로마 바이러스 감염중에 사용할 수 있는 백신의 성분을 형성함과 동시에 진단 시약으로도 사용할 수 있는 바이러스성 입자들(VLPs)를 제공하려는 목적을 갖는다.
이에 따라 본 발명은,
ⅰ) 파필로마 바이러스 L1 단백질 또는 파필로마 바이러스 L1 단백질과 파필로마 바이러스 L2 단백질의 조합을 각각 암호하는 하나 또는 2 이상의 재조합 DNA 분자를 제조하고;
ⅱ) L1 단백질 또는 L1과 L2 단백질의 조합을 발현한 후 세포내에서 바이러스성 입자들(VLPs)을 생성하도록 상기한 하나 또는 2 이상의 재조합 DNA 분자들을 적당한 숙주 세포에 이식시키는 것으로 이루어지는; 단계들로 이루어지는 파필로마 바이러스성 입자들의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 적당한 부활제와 조합한 파필로마 바이러스 VLPs를 함유하는 백신을 제공한다.
(ⅰ) 단계에 있어서 오직 파필로마 바이러스 L1 단백질만이 몇가지 파필로마 바이러스의 VLPs 형성에 필요하다.
오직 절절한 L1 단백질 만이 BVP1, HPV 11 및 HPV6b를 포함하는 HPV6의 VLPs를 형성함에 요구되어진다.
HPV 16과 같은 다른 파필로마 바이러스의 VLPs를 형성할 때는 L1과 L2 단백질 모두가 요구된다.
이와 같은 현상은 HPV 16과 병리적 현상이 비슷하고 비슷한 DNA 서열 상관관계를 갖는 HPV 18에서도 적용할 수 있을 것으로 믿어진다. 또한 동일한 DNA 재조합 분자 또는 다른 DNA 재조합 분자에 L1과 L2 유전자가 포함되어 있을 것으로 예측되어진다.
바람직하게는 재조합 DNA 분자는 숙주 세포에 이식되어지는 재조합 바이러스내에 포함되는 것이다. 이 목적으로 사용될 수 있는 적절한 바이러스들로서는 바큘로 바이러스, 백시니아, 신디브리스 바이러스, SV-40, 센 다이 바이러스, 아데노 바이러스, 레트로 바이러스 또는 폭스 바이러스들을 예로 들 수 있다.
적절한 숙주 세포들로는 상기한 바이러스들과 조화를 이룰 수 있는, 스포도프테라 프루지페르다와 같은 곤충세포, CHO 세포, 치킨 엠브리오 피브로브라스트, BHK 세포, 사람 SW 13 세포, 드로소필라, 아세데스 알보픽투스로부터 유래한 모기 세포, 또는 원숭이 상피 세포들을 예로 들 수 있다.
또한 이스트 세포 또는 다른 포유류 세포들로 이루어지는 기타 진핵 세포들도 예측할 수 있다.
DNA 재조합 분자는 L1 단백질 또는 L2 단백질의 파필로마 바이러스 제놈(genome)의 소스(soucre)를 아래에 기술한 바에 의해 적절하게 설계된 프라이머(primer)를 사용하여 PCR로 증폭하여 바람직하게 얻을 수 있다.
바람직하게는 L1 단백질을 암호하는 유전자를 적절한 프로모터(promoter)를 갖는 플라스미드(plasmid)에 삽입하고 L1 단백질과 프로모터를 갖는 DNA 절편을 상기한 바와 같은 재조합 바이러스 벡터(Vector)내에 삽입되어지는 재조합 DNA 분자를 구성할 수 있는 제1플라스미드 내에 편입시킨다.
L2 단백질을 암호하는 유전자는 또한 적절한 프로머터에 결합시키며, 바람직하게는 L2 유전자와 프로모터를 편입한 DNA 절편을 이중 재조합 플라스미드 또는 상기한 바와 같은 재조합 바이러스 벡터내에 삽입하여 이중 재조합 바이러스 벡터를 형성할 수 있는 제2플라스미드를 얻을 수 있도록 제1플라스미드에 삽입시킨다.
또한 본 발명은 적절한 숙주 세포를 감염시켜 적절한 실험 조건에 따라 L1 및 L2 단백질을 포함한 VLPs 또는 L1 단백질을 포함하는 VLPs를 생성할 수 있는 제1플라스미드 및/또는 제2플라스미드를 제공한다.
후자의 VLPs들은, L2 단백질이 자연감염에서 면역도미넌트(immunodominant)이기 때문에, 파필로마 바이러스 특이성 백신에 대한 이상적인 면역원이다.
다른 적절한 DNA 재조합 분자들을 재조합 바이러스와 같은 코스미드(cosmid)들이다. 적절한 발현 시스템은 E. coli 및 어떠한 플라스미드 또는 코스미드 발현 벡터를 포함하는 위핵세포 발현계 또는 재조합 바이러스 벡터와 조합된 상기한 숙주세포 또는 이스트 세포와 이스트 플라스미드를 포함하는 진핵세포계가 있을 수 있다.
L1 또는 L1과 L2 모두를 암호화하고 VLPs를 생산하기 위하여 적절한 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 플라스미들을 사용하는 경우 이들 플라스미드들은 VLP 구조 단백질의 발현을 향상시키기 위하여 적절한 프로모터를 또한 가져야 하며 그에 따른 폴리머라제(polymerase)가 사용되어진다. 그러나 이러한 경우 VLPs는 특이성 실험 조건하에서만 얻어질 수 있다.
L1과 L2 유전자들은 포유류 또는 바이러스의 폴리아데닐화 신호에 따라 포유류 또는 바이러스 프로모터에 따라 활동되어진다.
바람직하게는 L1과 L2 유전자는 생각하기에 따라 초기 프로모터 또는 후기 프로모터일 수 있는 백시니아 바이러스 프로모터로부터 전사되어진다.
이와 같은 프로모터들은 Davision과 Moss(1989) J. Mol. Biol 210 749-769 및 (1989) J. Mol. Biol 210 771-784에 열거되어 있다.
실험의 결과에서 보면 L1 유전자는 백시니아(Vaccinia) 4b 프로모터의 다운스트림(downstream)에 위치하며 L2 유전자는 합성 백시니아 28K 후기 프로모터의 다운스트림에 위치한다.
숙주세포는 원숭이 경피 세포이다.
VLPs는 트란스펙트(transfected)된 세포에서 적절한 정제로 얻어진다.
VLPs는 ISCOMS, alum, Freunds Incomplete 또는 Complete Adjuvant, Quil A 및 기타 사포닌스 또는 Vanselow(1987) S. Vet. Bull. 57 881-896에 열거되어진 기타 보조제들과 같은 적절한 보제들과 조제될 수 있다.
본 발명의 여러가지 바람직한 양태들을 첨부되어지는 도면들에 따라 설명하고자 한다.
이들 바람직한 양태들에게 특별한 파필로마 바이러스들, VLPs 및 DNA 재조합 분자들의 특이한 구조들을 실시예에 기술되어 있다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 HPV 16 재조합 백시니아 바이러스들을 구성하기 위하여 사용되는 플라스미드를 개략적으로 나타낸 것이다.
제2(a)도는 백시니아 바이러스로 감염된 CV-1 세포에서 재조합 HPV 16 L1의 웨스턴 블럿(western blot) 분석을 나타낸 것이다.
제3도는 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 CV-1 세포의 노던 블럿(northern blot) 분석을 나타낸 것이다.
제4(a)도 및 제4(b)도는 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 CV-1 세포로부터의 HPV 바이러스성 입자들의 전자 현미경을 나타낸 것이다.
제5도는 HPV 16 엠피티 캐비드(empty capsid)의 CsCl 평형 밀도 경사 침강을 나타낸 것이다.
제6도는 정제된 바이러스 입자들에서 L1 단백질의 글리코실화(glycosylation)을 나타낸 것이다.
제7도는 L1을 암호하는 pLC 200 플라스미드와 L1 및 L2를 포함하는 pLC 201의 구성에 대한 흐름도(flow diagram)이다.
제8도는 바큘로 바이러스 재조합 L1 단백질에 대한 뮤린(murine) 혈장의 반응성을 나타낸 웨스턴 블럿 분석도이다.
제9도 및 제10도는 합성 HPV 16 캡시드로 면역화한 BLAB/C, C57B1/6 및 CBA 마우스 및 CFA 면역화된 대조 혈장의 결과들을 매핑(mapping)한 것이다.
제11도 및 제11(a)도는 HPV 16 L1 분자의 오버랩핑 펩티드에 대한 L1에 특이적인 두개의 Mabs의 반응성을 나타낸 것이다.
제11(a)도는 HPV 16 L1에 대한 항원성 지수 예측을 나타낸 것이다.
제12도는 HPV 16 L1의 에피도프 맵(map)을 나타낸 것이다.
제13(a)도는 면역화에 사용되어진 합성 HPV 16 VLPs를 나타낸 것이다.
제13(b)도는 항 HPV 16 L2 항혈청에 대한 정제되어진 VLPs의 반응성을 웨스턴 블럿으로 나타낸 것이다.
제13(c)도는 BPV 1에 관련된 재조합 백시니아 바이러스의 구성에 사용되어진 플라스미드들을 나타낸 것이다.
제14(a)도 및 제14(b)도는 야생형 및 재조합 백시니아 바이러스들로 감염되어진 CV-1 세포에서 BPV 1 L1과 L2 발현의 분석을 나타낸 것이며; 또한
제15(a)도 및 제15(b)도는 재조합 백시니아 바이러스로 감염되어진 세포들로부터 얻어진 BPV 1 캡시드의 전자 현미경을 나타낸 것이다.
[실시예 1]
[HPV 16에서 발현된 VLPs]
제2ATG(nt 5637)에서 유래된 HPV-16 L1 유전자를, 다음의 프라이머들을 사용하여, PHPV 16(L. Gissmann로부터 제공받았음)으로부터 폴리머라제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)으로 증폭시켰다.
첫번째 메티오닌(methionine) 코든(codon)과 중지 코든은 밑줄친 부위이며, BgL II 부위는 서브 크로닝을 촉진한다.
증폭된 1527 염기쌍 절편을 페놀 추출하여 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. BgL II로 처리한 다음 L1 유전자를 강력한 백신 바이러스 프로모터(4b)를 포함하고 있는 RK 19 프라스미드(plassmid).(Kent 1988, pH.D 학위 논문, Cambridge 대학)의 BamH I 부위에 서브크론(subclone)시킨다.
얻어진 프라스미드는 그 염기 서열이 밝혀졌으며(Sanger et al, 1977, proc. Nalt. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) Mlu I과 Sstl 처리에 의해 4b 프로모터에 결합되는 HPV 16 L1 유전자를 포함하는 절편을 제작하는 데에 사용되어진다. 이 절편을 T4 DNA 폴리머라제로 처리한 후 백신 바이러스의 B24R 유전자(Kotwal과 Moss, 1989, J. Virol. 63, 600-606; Smith 등, 1989. J. Gen. Virol. 70, 2333-2343), E. Coli gpt 유전자(Falkner와 Moss, 1988, J. Virolo 64, 1849-1854, Boyle와 Coupar, 1988, Gene 65, 123-128) 및 프라스미드 pLC 200을 생성할 수 있는 복스 복제 부위들을 갖는 백신 중간 벡터 pLC 1의 Bam HI 부위에서 복제한다.
HPV 16 L2 유전자는 pHPV 16을 ACCl로 부분 처리하여 크레노브(Klenow)에 끼워지고 합성 Bam H1 결합자에 결합된 절편(4138 뉴크레오티드 5668 뉴크레오티드)을 생성하도록 하여 얻어졌다.
상기의 L2 절편을 합성 백백 28K 후기 프로모터를 약간 변형한(Davison과 Moss, 1989, J. Mol. Biol. 210, 771-784) p480으로 명명한 PUC 파생 프라스미드의 Bam HI 부위에서 복제한다.
프로모터 염기 서열은 다음과 같다.
28K 프로모터에 결합된 L2 유전자를 포함하는 절편을 SstI/SalI으로 처리하여 분리하고, T4 DNA 폴리머라제로 처리한 다음 pLC 200의 SstI과 Sal I 부위에서 복제하여 pLC 201을 제조하였다(제1도).
제1도에서, HPV 16 L1, L2(백색칸)은 백신 후기 프로모터(검은색칸)의 통제에 놓이게 된다. E. Coli gpt 유전자(빗금친 칸)은 선택 마커로써 사용되어진다.
전사 방향은 화살표로 나타낸다.
pLC 201 프라스미드는 전제 언급한 바와 같은 재조합 백신 바이러스(Mackett et al, 1984, J. Virol. 49, 857-864)를 구축하기 위하여 사용되어진다.
재조합 바이러스 pLC 201 VV와 pLC 202 VV는 마이코페놀린산, 잔틴 및 하이포잔틴(Falkner와 Moss, 1988)의 존재하에 반점(plaque) 에세이(assay)에 의해 선택되어진다. HPV 16 L1, 및 HPV 16 L2로 표현된 재조합 백신 바이러스(VV)는 전에 기술한 방법에 따라 제조되고 사용되었다(Zhou 등, 1990, J. Gen. Viral 71, 2185-2190).
재조합 프라스미드 pLC 201은 1992년 3월 27일 U.S.A. MD 20852, Rockville, Parklawn Drive 12301 소재의 the American Type Culture collection에 기탁하였으며 기탁번호 75226을 부여받았다.
재조합 백신 바이러스 pLC 201 VV는 1992년 4월 3일 U.S.A. MD 20852, Rockville, Parklawn Drive 12301 소재의 the American Type culture Collection에 기탁하였으며 기탁번호 VR 2371을 부여받았다.
[바이러스-성 입자의 분리]
재조합 바이러스 pLC 201 VV에 감염된 CV-1 세포들을 감염 32시간 후 10mM Tris(pH 9.0)에서 회수하고 다운스(Downce) 균질기로 균질화 하였다. 균질물을 2000g에서 원심분리하여 세포 부스러기들을 제거하고 30%(w/vol) 스크로스(sucrose) 큐션에 배열시켰다. SW 38 로타(rotor)에서 110,000g로 90분간 원심분리하여 획득한 펠렛을 10mM Tris pH 9.0에서 분산시키고 20∼60%의 불연속 스크로스 경사용액에 배열시켰다.
100,000g에서 18시간 동안 원심 분리한 후 10개의 분획들을 0.25㎖씩 모았다. 시료들을 에탄올 0.6㎖와 혼합시켰다. 4℃, 12,000g에서 20분간 원심분리하여 얻어진 펠렛들을 다음 분석을 위하여 모았다.
바이러스-성 입자의 농도를 결정하기 위해, 평형 밀도-경사 침강을 CsCl(1.30g/㎖)에서 행하였다.
125,000×g에서 20시간 동안 원심분리한 후 0.25㎖씩의 11개 분획들을 모았다.
각 분획들의 밀도를 결정한 후, 각각의 분획들을 전송 전자 현미경(Transmission electron microscopy:TEM)으로 측정하여 바이러스-성 입자들을 확인하였다.
제2도 2(a)에는 wt VV(라인 1) 및 pLC 201 VV(라인 2) 10pfu/cell로 감염되고 감염 후 48시간에 수확한 세포들을 보여준다. L1 단백질들이 HPV 16 L1 특이성 MAb Camvir 1으로 확인되었다.157kDa L1 단백질은 화살표로 나타내었다. Camvirl의 35kDa 단백질 결합은 세라인 모두 비-특이성이다.
제3도는 HPV 16 L1과 L2 또는 wt VV(라인 4)를 코딩하는 유전자와 같이 HPV 16 단백질 E1과 E4를 코딩하는 유전자들을 포함하는 pLC 201 VV(라인 2), pLC 202 VV(라인 3)에 의해 감염된 세포들로부터 분리한 RNA를 1.2% 포름알데히드-아가로즈 겔에서 분리한 것을 나타낸 것이다.
RNA를 나일론 막으로 전사시키고32p으로 라벨링된 L2 프로브로 혼성화시킨다. 포름알데히드-처리된 람다 DNA-Hi′nd III 컷 마커가 나타나 있다(라인 1).
[전자 현미경]
재조합 백신 바이러스로 감염된 CV-1 세포들을 3%(v/v) 글루타르알데히드가 포함된 0.1M 나트륨 카고딜레이트 완충 용액에서 고정시키고 1% 오스모늄데트라옥사이드에 재차 고정시킨 다음, 무수 알콜에서 탈수시킨 다음, 에폭시 수지에 탐침시켰다.
이를 박판으로 절개하여 초산 우라늄과 구연산 납으로 염색한다. 스크로스 경사용액의 분획들을 EM 그리드상에 건조시키고, 1%(wt/vol) 인산 텅스텐산(pH 7.0)으로 네가티브 염색한다. 분획들은 JEOL 1200EX Transmission 전자 현미경을 사용하여 측정한다.
제4(a)도에는 pLc 201 VV로 32시간 동안 감염된 CV-1이 나타나 있다. CV-1 핵에, 약 40′nm 직경(화살표된)의 입자들이 많이 보여진다. 바(bar)는 100′nm이다.
제4(b)도에는 스크로스 경사의 분획 5를 나타내었다.
파필로마 바이러스-성 입자들이 캡소머(capsomer)의 규칙적 배열로 구성되어 확실하게 보여진다(화살표).
바의 크기는 50′nm이다.
[HPV ORF 생성물들의 분석]
HPV 16 L1 발현은 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역얼룩(immunoblot) 방법으로 분석하였다.
면역 침강은,35S가 대사적으로 라벨링된 조합 VV 감염 CV-1 세포들을 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 1% 소디움 데옥시콜레이트, 150mM NaCl, 0.5㎍/㎖ 아프로티닌, 10mM Tris-HCl, (pH 7.4)로 구성되는 RIPA 완충액에 분해시켰다.
부분적으로 정제된 바이러스-성 입자의 면역얼룩 분석은, L1 특이성 Mab Camvirol(Mclean 등, 1990, J. Clin, Pathol. 43, 488-492)와125I 안티마우스 IgG(Amersham)을 사용하여, 2-메캅토에탄올을 포함하는 2×SDS 겔 적하(loading) 완충액에 용해시켜 행한다.
HPV 16 L2 유전자 발현의 분석결과를 제13b도에 나타내었다.
N-글리코시화(N-glycosylation)의 분석을 위하여, 부분적으로 정제된 바이러스-성 입자들을 100㎕ 완충액(0.25M 소디움 아세테이트, pH 6.5, 20mM EDTA 및 10mM 2-메캅토에탄올)에 취하고 면역 얼룩 실시전에 엔도글리코시다제 F(Boehringen Mannhein) 0.5μ와 37℃에서 18시간동안 반응시킨다.
마이코페놀린산을 gpt 플라스미드 pLC 201 백신 재조합 바이러스, pLC 201 VV로 명명되어짐,을 선택하기 위하여 사용되어졌다.
pLC 201 VV로 감염되어진 세포에서 L1의 합성은 면역 얼룩과 면역 침강에 의해 확인되었다. L1 단백질은 오토래드오그래피(Autoradiography) 상에서 약 57kDa의 단일 밴드로 나타난다. 이 재조합 바이러스에 의해 감염되어진 CV-1 세포들로부터 추출한 RNA의 노던 블롯(northern blot)으로부터 이들 바이러스의 어느 것이든지 관계없이 바이러스에 의해 감염되는 세포에서 L2 mRNA 전사가 높다는 것을 확인할 수 있었다(제3도).
합성 백신 바이러스 후기 프로모터로부터 L2 전사는 VV 후기 RNAs가 특이성 전사 말단화 시그날을 이용하지 않기 때문에 불규칙한 노던 블롯(Northern Blot) 양상을 보인다.
CV-1 세포들은 pLC 201 VV로 감염되었으며 바이러스-성 입자들에 대해 시험되었다.
pLC 201 VV로 감연된 세포들의 박면 전자 현미경에서는 세포 핵에 약 4.0′nm 바이러스-성 입자들이 나타나 야생-타입 백신으로만 감염된 대로 세포군에서는 나타나지 않는다. 대부분의 경우 이들 입자들은 사슬로 연결되어 있으며, 핵막에 인접되어 있다(제4(a)도).
HPV 16 L1 단독 또는 L2 단독만을 발현하고, 그에 따른 단백질(L1) 또는 mRNA(L2)를 생성하는 재조합 백신 바이러스로 감연된 세포들은 바이러스-성 입자들을 갖지 않는다.
HPV 16 L1과 HPV 16 L2 각각을 발현하는 서로 다른 두종의 재조합 백신 바이러스에 의해 동시에 감연된 세포들에서도, 비록 L1 단백질과 L2 mRNA가 개개의 세포에서는 L1과 L2의 동시 합성이 나타나지 않는 이들 이중 감염 세포의 풀에서 확인된다 하더라도, 어떠한 HPV 바이러스-성 입자들을 만들지 않는다.
제5도에는 pLC 201 VV로 감연된 CV-1 세포군으로부터 획득되어진 HPV 16 바이러스-성 입자들을 스크로스 큐션에서 원심 분리하고 CsCℓ 아이노 피닉(isopynic) 침강 처리하는 것을 나타낸다.
바이러스-성 입자들(+) 분획 8과 9에서 발견 되어진다. 분획 8의 입자를 네가티브 염색한 전이 전자현미경 사진을 삽입하였다. 각 경사 분획의 밀도(g/㎖)를 나타내었다.
제6도에서는 pLC 201 VV로 32시간 감염시킨 CV-1 세포들과 스크로스 경사에서 정제되어진 바이러스-성 입자들이 나타나 있다.
시료들을 에탄올 침강하고 항-HPV 16 L1 항체 Camvir I. Lane 1으로 면역 얼룩 분석하기 전에 엔도글리코시다제 F로 처리한다; 즉, 바이러스-성 입자들; Lane 2와 Lane 3을 정제하고; 엔도글리코시다제 F로 하루밤 처리한 후 면역 얼룩 분석을 행한다.
(=)는 L1 이중 밴즈를 가르키며 화살표는 탈글리코실화된 L1을 가르킨다.
분자량 마커는 왼쪽에 나타내었다.
전자현미경 상에 관찰된 HPV 16 L1 단백질을 갖는 바이러스-성 입자를 확인하기 위하여, pLC 201 VV 감연된 세포들로부터 얻은 세포 추출물을 20∼60% 스크로스 경사에서 부분 정제를 행하였다.
10개의 분획을 모우고 L1 단백질에 대한 실험을 행하였다. 분획 3에서 7에서 L1이 검출되었으며, 분획 5에서 L1의 가장 높은 수준이 발견되었다. 각각의 분획들은 또한 바이러스-성 입자에 대해 전자현미경 시험을 실시하였다.
인산 텅스텐산 나트륨으로 네가티브 염색한 전형적인 파필로마 바이러스는 12개의 규칙적인 클로즈-팩키드 캡소머(close-packed capsomer)를 갖으며 직명은 대략 50′nm쯤 된다.(Finch and klng, 1965, J. Mol. Biol. 13, 512; Rowson and Mohy, 1967, Bacterial. Rev. 31, 110-131)
감연된 CV-1 세포로부터 정제된 바이러스-성 입자들의 직경은 35′nm∼40′nm 사이에서 다양한 값을 갖는다. 그러나 이들 바이러스-성 입자들이 전자 현미경 상에서 파필로마 바이러스와 비슷한 모습을 나타내며, 캡소머의 규칙적인 배열이 확인된다(제4(b)도).
그러므로 스크로스 경사의 분획 5에서 확인되어진 바이러스-성 입자들은 HPV 캡소머들 중 일부가 빠지고 부정확하게 조립된 배열이라고 추론되어진다.
CsCl에서, HPV 16 바이러스-성 입자들은 약 1.31g/㎖에서 침강되어지며(제5도), 전자현미경 상에서 전형적인 엠피티(empty) 파필로마 바이러스 캡시드(capsid)를 나타낸다.(제5도, 삽입도)
Camvir-1은 pLC 201 VV로 감연된 CV-1 세포군에서 정제되어진 바이러스-성 입자들의 웨스턴 블럿(western blot)에서 하나의 단백질 이중 밴드를 확인한다(제6도).
HPV 16 L1은 네개의 잠재적 N-글리코실화 부위(아스파라진 157,242,367 및 421)를 갖는다.
L1 폴리펩티드의 이중 밴드로 나타난 글리코실화된 변종을 시험하기 위하여, 부분적으로 정제 되어진 바이러스-성 입자들을 엔도글리코시다제 F로 처리한 후, SDS-PAGE하고 면역 얼룩을 실시하였다.
이 결과 이중 밴드가 약간 분자량이 줄어 약 57kDa되는 곳에 단일 밴드로 나타난다.(제6도, 라인 2.3)
CsCℓ 경사의 1.29∼1.30g/㎖ 분획으로부터 얻어진 바이러스-성 입자들을 ELISA 아세이의 항원으로 사용하였다.
VLPs로 면역화된 마우스로부터 얻은 모든 항혈청(antisera)은 양성이였다(Table 2).
양생 타입 백신으로 감연된 CV-1 세포군의 분쇄물로부터 제조되어진 밀도 경사의 유사한 분획으로 면역시킨 마우스의 대조 혈청은 바이러스-성, 입자들에 대해 비반응성이 였다.
바이러스-성 입자들을 BLISA 플레이트(Dillner et al., 1991, J. Viral 65, 6862-6871)에 도포함에 있어서 두가지의 다른 프로토콜(protocol)을 사용하여 본성 HPV 바이러스-성 입자의 반응성과 손상된 입자들의 부분적으로 변성된 단백질의 반응성을 비교하고자 하였다.
VLPs에 대해 발생한 뮤린(murine) 항혈청은 본성(OD 1.00±0.20) 및 변성(OD 1.60±0.45) 입자들과 동일하게 반응하였다.
특정 L1 에피토프(epitopes)에 대해 특이적인 6 단일 배양 항체 판넬은 본성 VLP와는 약한 반응성(OD 0.0064)를 갖는 1(Camvir 1)를 갖으며, 이것은 본성 입자들 보다는, 변성 입자에 대하여 보다 반응성이 큰 것으로 나타난 것(OD 0.107)으로 미루어 보아, 반응성은 본성 VLP 제조에 변성 L1 단백질이 관련 있는 것으로 여기어진다.
제8도에125I-라벨된 안티마우스 IgG가 제2항체로서 사용되었다.
57-kDa L1 밴드는 화살표를 나타내었다.
라인 1∼5는 VLP로 면역화시킨 마우스의 혈청,
라인 6∼10은 BALB/C로 면역화시킨 마우스의 혈청,
라인 11∼15은 C57B1/16으로 면역화시킨 마우스의 혈청,
라인 16은 CFA로 면역화시킨 마우스의 혈청,
라인 17은 BALB/C으로 면역화시킨 마우스의 혈청,
라인 18은 C57B1/6으로 면역화시킨 마우스의 혈청,
라인 19는 항-HPV 16 L1 Mab Camvir인 B10A로 면역화시킨 마우스의 혈청이다.
분자량은 왼쪽에 나타내었다.
HPV 16 단백질의 L1과 L2 단백질에 대한 항-VLP 항혈청의 반응성은 바큘로바이러스(baculovirus) 재조합 HPV 16 L1 및 L2 단백질을 사용한 면역 얼룩으로 확인하였다.
바이러스-성 입자로 면역화된 모든 마우스의 혈청 및, 단일배양 안티-HPV 16 L1 항체는 1L 재조합-바큘로바이러스-감연된 S. frugiperda 세포 분쇄체에서 57-kDa 단백질(제8도)이 확인되었으나, 야생형 바큘로바이러스에 의해 감연된 S. frugiperda의 분쇄물과는 주의할만한 반응성이 나타나지 않았다.
L1 단백질에 대한 반응성의 크기는 마우스의 계통에 따라 서로 다르나, 모든 혈청은 면역 얼룩에 연장 노출되면 반응성을 나타내었다.
이와 비슷한 결과들이 L2 재조합-바큘로바이러스-감염 세포 분쇄물에서 얻어졌다. 즉 L2 단백질에 대한 뮤린 안티-VLP 항혈청과 래빗 항혈청 모두는 분쇄물의 단일 단백질과 반응하였다.
CFA 단독만으로 면역화 한 마우스의 혈청은 L1 또는 L2 제조합-바큘로 바이러스-감염된 S. frugiperda의 분쇄물로부터 얻어진 단백질과 반응하지 않았다.
[실시예 2]
[HPV 16 L1의 선형 항원 지역의 정의]
[VLPs를 사용하는 단백질]
또 다른 실험에 있어서 합성 VLP 이용한 HPV 16 L1 캡시드 단백질의 선형 항원 영역을 결정하였다. 이 실험에서 있어서 HPV 16 L1 및 L2 단백질에 대한 이중 재조합 백신 바이러스를 이용해 획득한 합성 HPV 16 바이러스-성 입자(VLP)로 세가지의 하프로타입(haplotypes)(H-2d, H-2b, 및 H-2d/b)의 마우스를 면역화시켰다.
얻어진 안티-VLP 항혈청으로부터 바큘로바이러스 재조합 HPV 16 L1 및 L2 단백질을 사용한 면역 얼룩 및 ELISA 아세이로 HPV 16 캡시드를 확인하였다.
HPV 16 L1에 관련된 펍티드들을 오버랩핑하여 L1 단백질의 면역활성 부위의 아미노산 서열을 결정하였다.
L1 펩티드의 대부분은 합성 HPV 16 캡시드로 면역화시킨 마우스에서 얻은 IgG과 반응하였다.
컴퓨터 알고리즘으로 HPV 16 L1에는 7개의 B 에피토프가 있으며 이들 중 5개는 뮤린 항혈청과 강하게 반응하는 펩티드 내에 존재한다고 예측되었다.
뮤린 항-VLP 항혈청은 재조합 L1 융합 단백질에 반해서 생성되는 항-HPV 16 L1 단일 배양 항체에 의해 확인되는 두개의 펩티드와 반응하지 않는다.
이것은 바이러스-성 입자들에 의해 정의되어진 HPV 16의 면역 활성 에피토프들이 재조합 HPV 16 L1 융합 단백질을 사용하여 정의된 에피토피들과는 완전히 다른 것이며, 이와 같은 융합 단백질들은 HPV-감염 환자에 있어서 HPV 16 L1 특이성 면역 대응을 유발하는 항원이 아닐 수 있음을 시사한다고 결론 지을 수 있다.
[HPV 16 캡시드의 생산]
백신 바이러스 프로모터 4b(천연) 및 P480(합성)의 조절하에 있는 HPV 16 L1과 L2 오픈 리딩 프레임(open reading frames)(ORFs)를 갖는 프라스미드 pLC 201을 아래와 같은 약간의 수정을 가한 것을 제외하고는 기술한 방법과 동일하게 하여 재조합 백신 바이러스(rVV) pLC 201 VV를 구축(construct)하는 데에 사용하였다.
HPV 16 바이러스-성 입자들은 전에 기술한 방법에 따라 pLC 201 VV-감염된 CV-1 세포들로부터 획득하였으나 이때 세포들은 백신 바이러스의 숙성과 응결을 방지하기 위하여 리팜피신(rifampicin) 100㎍/㎖을 함유하는 배지에서 배양하였다.(Moss. Virology P685-703 Raven, New York, 1985; Karacostas et al., PNAS 86, 8964-8967, 1989).
감염된 세포들을 회수하고, 동결, 해동 및 10mM Tris-1+Cal(P1+9.0)에서 도운스(Dounce) 균질화하여 분쇄하였다.
분쇄물을 2000g에서 원심 분리하여 여액을 분리한 다음 20% 스크로스의 PBS 완충액에서 100,000g에서 2시간만 원심분리를 더욱 행하였다.
펠렛을 CsCℓ과 혼합하여 시초 농도가 1.30g/㎖ 되도록 한 후, 18℃에서 100,000g로 18시간 동안 원심분리 하였다.
분획들을 모우고 에탄올-침강 단백질들에 대한 면역 얼룩 시험을 행하였다.
L1 단백질에 대하여 양성 반응을 보인 분획물을 모우고, 바이러스-성 입자들의 존재를 상기한 바와 같은 전자현미경으로 확인하였다.
[항혈청(antisera)의 생산]
BALB/C(H-2d), (57B1/6 CH-2b), 및 B10A(H02b/d) 각 계통의 각각 5마리의 마우스 군들을 CsCl 경사-정제된 HPV 16 바이러스-성 입자들로 면역화시켰다.
이들 동물들은 피하 주사로 캡시드 단백질 5㎍씩으로 접종시켰다.
첫번째 주사는 프레운드의 완전 보제(Freund′s complete adjuvant) 내에 투여 되었으며, 3주간의 간격으로 3번의 추가적 접종은 생리 식염수로 투여되었다.
4번째 접종후 14일에 혈장을 모아 -20℃에 보관하였다. 야생형 백시니아 바이러스로 감연된 CV-1 세포에서 pLC 201 VV 감염된 세포와 동일한 방법으로 얻어진 물질들은 동일한 프로토콜에 따라 대조군으로 사용하기 위해 마우스들을 면역화시켰다.
[펩티드]
다섯개의 잔기들로 오버랩되고, HPV 16 L1 단백질의 아미노산 서열(Seedrof 등, 1985, Virology 145 181-185; panton, 1990, Nuelcie Aeido Res 18 363)에서 유래된 일연의 15-머펩티드를 표준 프로토콜(Fields and Noble, 1990 Int. J. Pept. Protein Res 36 161-214)에 따른 Fmoc 화학을 사용하여 Dupon RanPs 멀티플 펩티드 합성 장치로 합성한 다음, 글루타르알데히드(glutaraldehyle)로 송아지 혈장 알부민(bovine sermm albumin)(B.S.A)에 결합시켰다.
L1 단백질에서 아미노산의 위치를 나타내기 위하여, 가상적인 첫번째 개시 코든을 아미노산 번호 1로 표시하였다(표 1). 기술적 이유로 아미노산 521-531에 따른 C-말단 펩티드는 사용하지 않았다. 사용된 모든 펩티드들은 PHLC 분석으로 85% 순도 이상으로 나타났다.
[재조합 L1+L2 단백질]
HPV 16 L1 또는 HPV 16 L2 ORF를 발현하는 재조합 바큘로바이러스를 곤충 SF 9 세포를 감염시키는 데에 사용하였다.
25℃에서 3일간 배양한 후, 14,000g에서 5분간 원심 분리하여 세포들을 침강시켜 펠렛화 하였다.
펠렛을 RIPA 완충액(20mM Tris-Itel, pH 7.6; 2mN EDTA; 50mM NaCl; 1% 데옥시클레이즈; 1% Triton X-100; 0.25% SDS; 1% 아프롭티닌; 1mM PMSF)에 용해시켰다.
[웨스턴 블로팅(Western blotting)]
바이러스-성 입자 또는 재조합 L1 또는 L2 단백질를 2% SDS/DTT를 함유하는 2×로딩 완충액과 혼합한 후 5분간 끓였다.
단백질들은 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리한 다음, 니트로셀룰로스에서 블로팅하였다(Towbin 등., 1979, Virology 1751-9).
필터를 스트립(strip)으로 짜른 후, 3% BSA를 함유하는 PBS에서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
블록된(Blocked) 스트립들을 여러가지 뮤린 항 혈청(1:200) 또는 단일 복제 항체에 4℃에서 하루밤 동안 노출시킨다.
반응성 단백질들은125I-콘주케이티드(conjugated)된 항-마우스 IgG(0.2μ Ci/㎖)(Amersham)과 반응시킨 후 오토래디오그래피(autoradiography)로 확인하였다.
[ELISA 아세이]
복수 복제 항혈청을 주지되어 있는 효소-결합 면역 흡착 아세이(Enzyme-linked immosorbent assay)(ELISA)(Christensen 등, 1990, PNAS 76 4350-4354; Cowsent 등, 1987, JNCI 79 1053-1057)로 시험하였다.
“본성”합성 HPV 16 캡시드와의 에세이에 있어서, 단백질 100㎎를 PBS(pH 7.5)에 용해시켜 ELISA 플레이트 웰(plate well)(Flow Labs)에 37℃에서 1시간 동안 배양시켜 고착시킨다.
“변성”입자 아세이에 있어서, 입자들을 pH 9.6의 카보네이트 완충액에 분산시킨 후 37℃에서 하루밤 배양시켜 플레이트에 흡착시켰다.
그 다음의 모든 배양은 실온에서 행하였다. 플레이트를 PBS로 세척하고 비부착 부위를 블로킹 완충액 밀크 분말을 5% 포함하는 pH 7.5의 PBS)에서 1시간 동안 배양하여 블로킹 한다.
뮤린 항혈청(1:200), 야생형 VV-감연된 CV-1셀 추출물로 미리 흡수한, 을 가하고 1시간 동안 배양한 후, 플레이트를 PBS로 세척한다.
블로킹 완충액에 1:1000 희석한 호스타디시 퍼옥시다제-결합된 항-마우스 IgG(Horseradish peroxidasepconjugated anti-mouse IgG)(Sigma)를 가하고 1시간 동안 배양한 후, PBS로 10번 세척한다.
ABTS(Boehringer)와 H2O2를 함유하는 용질 완충액(pH 4.6)을 가하고 15분후 OD 415를 읽는다.
[선형 B 에피토피 매핑(mapping)]
B 에피토피를 오버래핑 HPV 16 L1 펩티드 세트에 대하여 면역화된 동물들로부터 얻은 항혈청을 ELISA로 스크링 함으로써 동종하였다. BSA에 결합된 합성 펩티드를 10mM 카보네이트 나트륨 완충액(pH 9.3)에 희석한 후 ELISA 플레이트에 4℃에서 하루밤 배양하여 흡착시켰다.
플레이트에 잔여 결합부를 블로킹하기 위해 BSA 3%를 함유하는 PBS에 37℃에서 2시간 처리하였다.
희석 마우스 항혈청(1:500)을 코팅된 플레이트에서 상온에서 2시간 동안 배양하였다.
플레이트를 Twee′n 20(0.1%)를 포함하는 PBS로 세척한 다음 퍼옥시다제-결합된 항-마우스 IgG(1:1000)(Sigma) 또는 IgA(1:2000)(Sigma)와 2시간 동안 배양하였다.
플레이트를 세척한 후 0.5mg/㎖ ABTS를 포함하는 용질 완충액(pH 4.6)으로 15분간 현상한 후 415′nm에서 흡광도를 측정하였다.
시험 혈청의 OD 415 값이 대조 혈청에 비하여 3SDs 이상 크면 펩티드는 반응성 있는 것으로 간주할 수 있다.
대조 혈장에서 측정된 OD 415(0.55)보다 OD 415 값이 5배된 것을 주 반응 에피도프로 간주하였다.
[단일 복제 항체 및 항혈청]
HPV 16 L1 융합 단백질에 대한 다섯개의 단일 배양 항체(MAb)를 사용하였다. MAb 5A4, 1D6, 3D1, 및 8C4(Cason 등, 1989, J. Gen Virol 70 297302987)은 영국 런던의 phil shephend 박사로부터 제공 받았으며, MAb Camvir 1(Mclean 등, 1990, J. Clin. Pathol. 43 388-492)는 C. Mclena(캠브리지 대학교 병리학과)로부터 제공 받았다.
HPV 16 L2 Trp-E 융합 단백질에 대한 래빗(Rabbit) 항혈청은 Denise Galloway(시에틀, 워싱턴 대학교)로부터 제공 받았다.
[아미노산 서열 분석 및 항원 지수예측]
항원 지수(A1)(Jameson과 Wolf, 1988, Comp. Appl., Biosci. 4 181-186)은 펩티드 아미노산 서열이 항원성을 갖을 수 있는 확율 지수이다.
이것은 2차 구조의 몇가지 평가 값들을 합산함으로써 계산되어진다.
예측된 HPV 16 L1 서열에 대한 값은 PLOTSTRUCTURE 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
제9도 및 제10도는 HPV 16 L1의 서열에 따른 오버랩핑 일군의 펩티드와 혈청의 ELISA에서의 반응성을 나타낸 것이다. HPV 16 L1 서열(표 1 참조)에 따른 펩티드 번호들이 표시되어 있다.
제11도 및 제11(a)도에, 첫번째 가정 개시 코든으로부터 HPV 16 L1에 관계되는 아미노산을 번호 넣는 시스템을 나타내었다.
AI 값이 1.5 이상되는 부위들을 나타낸다.
제12도는 B 에피도프가 매핑 시스템의 영역안에 놓여지는 HPV 16 L1 영역을 나타낸다.
VLPs(입자), 경부암 환자의 혈청에서 얻어진 IgA 및 IgG(사람 IgA 및 IgG)(Dillner 등, 1990 Int. J. Cancer 45 529-535)로 면역화시킨 생쥐의 혈장의 결과는 오버랩핑 펩티드를 사용하여 얻었다.
뮤린 항 VLP 항혈청은 OD값이 0.55보다 크면 펩티드와 상당히 반응성 있다고 간주하였다. L1 융합 단백질(래비트 혈청)(Muller 등, 1990, J. Gen. Virol. 71 2709-2717)으로 면역화시킨 래빗으로부터 부분-길이 발현 클론과 에피도프가 놓여진 전체 길이 서열을 사용하여 얻은 결과를 나타내었다.
또한 알고리즘-예측 B 에피도피(computer)(Jameson과 Wolf Corp. Appl. Biosci 4 181-186 1988) 및 발포된 항-HPV 16 L1 단일복제(Monoclonals)항체(Cason 등, J. Gen Virol. 70 2973-2987 488-492 1990)에 의해 확인된 에피도피들이 나타나 있다.
간격은 531 아미노산 L1 단백질에 따른 에피도프의 위치를 나타내며, N-말단메치오닌(잔기 1)로부터 자리수 매김하였다. 펩티드를 포함하는 각각의 에피도피에 대하여 N-말단메치오닌에 따른 정확한 위치들이 또한 주어져 있다.
다섯개의 아미노산 오버랩으로 구성된 단백질의 전체 길이를 확보하는 HPV 16 L1 단백질의 15-단량체로 구성된 일련의 합성 펩티드를 여러가지 면역 혈청에 의해 확인된 L1의 에피도피를 측정하기 위하여 사용하였다.
항혈청은 3가지의 마우스 계통으로부터 16군을 얻었다.
BALB/C(H-2d), (C57B1/6(H-2b), 및 B10A(H-2b/d), 확인된 L1 단백질의 다중 선형 펩티드 및 HPV 16 L1으로부터 얻은 근본적으로 동일한 펩티드들이 시험된 모든 계통에서 확인되었다(제10도).
다섯개의 각각의 혈청이 각각의 계통으로부터 시험되었다.
혈청의 OD값이 음성 대조 혈장의 OD값보다 평균 +3SD 이상이면 펩티드는 반응성 있다고 나타내었다. 반응성 컷오프는 0.260이였다.
CFA단독으로 면역화된 마우스로부터 얻은 혈청은 모든 L1 펩티드에 대하여 0.260 이하의 OD415 반응성을 갖었다. 각각의 펩티드에 대해 주어진 계통으로부터 얻은 각각의 항-VLP혈청의 반응성 크기가 약간 변통이 있기는 하지만, 각각의 펩티드는 마우스 각각 계통으로부터 얻은 항-VLP혈청 전체 또는 없음에 대하여 반응성이 있었다(OD＞0.260).
항-VLP 혈청에서 펩티드-특이성 항체의 아이소타입(isotype)은 IgG- 및 IgA-특이성 항-마우스 면역글로블린 항체를 사용하여 시험하였다.
IgG 반응성을 제9도 및 제10도에 나타내었으며 어떠한 펩티드에 대하여서도 주의할만한 IgA반응성이 나타나지 않았다(OD＜0.050).
대부분의 펩티드들이 항-VLP혈청에 대하여 반응성이 있으므로 평균 음성값에 대하여 5배 큰 임의의 OD값을 L1 단백질의 주반응 부위를 결정하는데 사용하였다:
주된 면역활성 L1 펩티드는, 일곱개가 분자의 아미노 말단 3번째 존재하며, 일곱개가 중간 세번째에 존재하며, 또한 8개가 카르복실말단 세번째에 존재하는 것과 같이 L1 단백질의 길이에 따라 무질서하게 분포되어 있다.
반면, HPV 16 L1에 대해 특이성의 단일배양 항체들은 전술한 바와 같이 단일 메이저 선형 에피도프들을 인식한다.(Cason등의 상기 문헌, Mclean 등의 1990년 상기한 문헌)
다섯개의 반응성 항-HPV 16 L1 단일배양 항체중 4개(5A4, 1D6, 3D1, 8C4)는 펩티드 30(291-305)에 대하여 반응성을 갖었으며, 반면에 Camvirl은 펩티드 24(231-2450(제11도 및 제11(a)도)를 인식하였다. 바이러스-성 입자들로 면역화된 마우스들로부터 얻은 혈청은 상기 펩티드중 어느 것과도 반응하지 않았다.
예측된 단백질의 2차 구조에 기초하여 HPV 16 L1의 B 에피도프를 유추하기 위하여 알고리즘을 사용하였다.
가능한 항원성 영역은 체인 유연성, 높은 접근 가능성 및 높은 친수성(제11도)에 기초하여 항원지수(A1)(Jameson 및 Wolf 1988, 상기 문헌)으로 계산하였다.
A1값이 1.5 이상인 영역을 예상 B 에피도프로 간주하였다.
이와 같은 영역은 7곳(아미노산 79-84, 105-108, 120-122, 134-135, 267, 269, 298-299, 3630367)이 발견되었으며, 상기 7곳중 5부위를 합성 HPV 16 캡시드에 의해 면역화된 마우스로부터 얻은 항 혈청에서 발견되어지는 주반응성을 나타내는 22 펩티드내에 존재한다.
여러원으로부터 얻은 항혈청의 B 에피도프 특이성을 제12도에 요약하여 나타내었다.
실시예 1-2에 덧붙여서 파필로마 바이러스는 일반적으로 전자 현미경으로 쉽게 확인할 수 있고(Almeida 등, 1962, J. Invest. Dermatol 38, 337-345) 몇몇 경우에 있어 정제할 수 있고 감염여부를 알 수 있는(Rowson과 Mahy, 1967, Bacterial, Reo. 31, 110-131) 감염된 카라티노사이드(Kerarinocyte)에서 비리온들을 생산함을 강조한다.
그러나 HPV 16 비리온들은, 비록 HPV 16 L1과 L2 후기 유전자 전사가 미분화된 생식상피에서 일어나며(Crum 등, 1988. J. Viral. 62, 84-90) L1 전이가 이 조직들에서 면역활성 L1 단백질을 생성한다고(Stanley 등 1989, Int. J. Cancer 43, 672-676)하더라도, HPV 16 감염된 경부 상피 조직에서는 발견되지 않는다.
이와 같은 특성에 따라, 본 발명자들은 상피세포에서 HPV 16 L1과 L2 유전자의 발현이 HPV 16 비리온-성 입자들의 결집(assembly)을 위하여 모두 필요하며 이에 따라 HPV 16 L1 단백질과 L2 단백질이 베리온 결집에 대하여 결핍되어서는 안된다는 것을 밝혀내었다.
조직에서 HPV 16 후기 유전자의 발현은 상피조직 환경에 의해 매우 엄격하게 통제되는 것으로 나타나다(Jaichman 등, 1983, J. Invest. Dermatol 1, 137-140).
L1과 L2의 전사 및 L1의 전이에도 불구하고, 생체내에서 HPV 16 비리온들을 검출할 수 없음은 경부 상피조직에서 L2 생성에 대한 후전사블럭(Post transcriptional block) 또는 비리온 결집의 방해인자(inhibitor)가 존재함을 시사한다.
경부조직으로부터 유래된 세포주 W12를 포함하는 HPV 16에 있어서, 뮤린 미소 환경(Murine microenvironment)(Sterling 등 1990, J. Virol 64, 6305-6307)내의 생체에서 세포들이 종지 분화(Terminal Differention)를 할 때 바이러스-성 입자들이 발견되는 것은 이들 세포들이 비리온 결집을 방지하는 기구를 갖고 있지 않으며, L2의 불충분한 전이 또는 기타 다른 알려지지 않는 이유에 의해 경부조직에서 HPV 16 비리온들을 발견하지 못한 것이라고 설명할 수 있음을 시사하여 준다.
본 발명자들의 전자 현미경 실험은 엠피터 HPV 16 비리온은 평균 40′nm의 크기를 갖어 기타 파필로마 바이러스 보다는 작지만 래빗 파필로마 바이러스(Finch와 Klug, 1965, J. Mol. Biol B 1-12), 또는 사람 유두종 바이러스(Rowson과 Mahy 1967, 상기 문헌)과 같은 다른 파필로마 바이러스에 비교할 때 비슷한 표면 구조를 갖음을 보여준다.
침강실험에서 본래 HPV 1a 비리온의 밀도가 1.36g/㎖(Doorbar와 Gallimore, 1987, J. Virol 61, 2793-2799)인데 비하여 엠피티 파필로마 바이러스 캡시드의 기대된 밀도를 1.31g/㎖보였다.
HPV로부터의 L1 단백질은 잠재적인 글리코실화 부위들을 갖으며, 정제된 BPV 입자들은 엔도글리코시다제 처리에 대하여 L1의 이동성이 영향받는 마이너 전기영동 형상을 갖는다(Larsen 등, 1987. J. Virol. 61, 3596-3601).
HPV 1a와 HPV 11으로부터의 L2가 2중밴드(doublet)로 나타나며(Rose 등, 1990, J. Gen. Virol, 71, 2725-2729, Doorbar과 Gallinore, 1987, 상기 문헌; Jin 등 1989. J. Gen. Virol. 70, 1133-1140), 이것은 글리코실화에 따른 차이점에 기인한 것이다.
본 발명자들의 결과에서 HPV 16 캡소서들에서 L1 단백질은 또한 글리코실화되며, 두개의 서로 다른 글리코실화 상태가 존재함이 나타났다.
본 발명의 설명에서 본 발명자들은 진핵세포계에서 생성된 HPV 16 캡시드 단백질의 면역원성을 연구하기 위하여 합성 바이러스-성 입자들을 사용하였다.
진핵세포에서 생성되는 파필로마-바이러스 캡시드 단백질들이 항원 발현의 결정에 매우 중요한 전이-후 변경(post-transtional modification)되기 때문에(Browne 등, 1988. J. Gen. Virol. 69 1263-1273; Zhou 등, 1991, Virology 185 625-632) 진핵세포들에서 생성된 캡시드 단백질을 사용한다.
본성 HPV 16 입자들은 임상병소로부터도, 또한 세포배양을 통한 바이러스 증식으로도 얻을 수 없기 때문에 재조합 백시니아라 발현 벡터를 선택하였다.
본 발명자들은 폴리크로날 항-VLP항 혈청을 마우스로부터 얻기 위해 HPV 16 VLPs를 사용하였으며, 상기 혈청은 ELISA로 HPV 16 캡시드와 강하게 반응하였다.
본 발명자들은 면역얼룩방법으로 항-VLP항 혈청이 변성 L1(제2도)와 L2내의 에피토프들을 인식할 수 있음을 발견하였다. 뿐만 아니라, 항-VLP혈청으로 L1의 15-머 51개 펩티드의 군에서 22개의 주 반응성 펩티드들을 결정하였다.
이와 같은 실험결과들은 바이러스 입자들에 의해 생성된 항 혈청이 횟수에 관계없이 선형 결정자들을 인식한다는 것을 말해준다.
L1 단백질의 모음에 대한 체액 반응성의 프로파일(profile)에서 본질적으로 계통이 다른 두개의 MHC 마우스에서 거의 동일한 결과를 얻었다. 이와 같은 사실은 MHC 한정이 본 연구에 실험된 마우스 계통에서 HPV 16 L1 단백질에 대한 체액 대응을 결정하는데에 제한되지 않는 L1내에 충분한 T 에피도프가 존재함을 시사하여 준다.
본 발명의 뮤린 항-VLP항 혈청으로 얻어진 B 에피도프 특이성에 대한 데이타들(제12도)을 경부 디스프라시아 여자 환자에서 얻은 “면역”혈청(Dillner 등, 1990. Int. J. Cancer 45 529-535)의 유사한 연구와 비교할 수 있다.
몇몇 펩티드들이 면역사람 혈청 및 항-VLP항 혈청에 의해 인지되었으나, 뮤린 항-VLP에 반응하는 펩티드의 대부분은 면역 사람 혈청에는 반응하지 않았다(제12도).
L1-특이성 단일배양 항체들(Cason 등, 1989; Mclean 등, 1990)으로 인지되어진 L1영역(221-235, 291-305중 어느것도 본 발명자들의 항-VLP항 혈청으로 인지되지 않았다.
L1 융합 단백질들이 이들 MAbs를 발생하기 위하여 사용되어 왔고, 사람 혈장에서 L1에 대한 항체를 검출하기 위하여 또한 사용되어 왔으므로, L1 융합 단백질에 대한 사람 혈장의 반응성 결여(Jenison 등, 1990. J. Infeet. Dis. 162, 60-69; Kochel 등, 1991, Int. J. Cancer 48 482-688)에 대한 설명은 L1 융합 단백질이 본성 L1 단백질에 의한 사람 면역계에서 나타나는 L1의 에피도프를 발현하지 못하는 것으로 행하여질 수 있다.
[선형 에피도프만을 검출할 수 있는 펩티드를 갖는 L1 단백질에 대한 항체의 검색]
뮤린 혈장에서 반응성이 선형 및 구조적인 결정자 모두에 관계되는지 여부를 결정하기 위하여 본 발명자들은 하나는 본성 입자들을 보전하고 다른 하나는 변성된 단백질을 생산하는(Dillner 등, 1991. J. Virol. 65 6862-6871) 두가지로 처리된 입자들로 ELISA 아세이를 행하였다.
본 발명자들은, 비록 하나의 MAS(Camvir 1)이 “본성” 입자들에 비하여 변성입자에 대하여 더욱 강하게 반응하지만, 하나 또는 다른 방법으로 처리된 입자들에 대하여 배타적으로 반응하는 어떠한 혈청 또는 단일 배양항체를 발견하지 못하였다.
변성된 입자에 대하여 MAbs 대부분이 반응성을 결여하고 있음은, 동일한 항체들이 웨스턴 블럿에서 변성 단백질과 반응하기 때문에, 그들이 오직 부분적으로 변성되었음을 시사한다.
바꾸어서 말하면, 본성 입자들에 대한 Camvir 1의 반응성은 이 항체에 의하여 인식되어진 선형 에피토프가 본성 입자 제조에 동일한 양으로 존재하는 변성 L1 단백질을 인지한다는 것을 의미하는 것은 아니며, 이에 따른 본 발명자는 본 발명의 ELISA 조건하에서 본래 VLPs가 보존된다는 어떤 증거도 갖지 못하였다.
대부분의 항체들이, 여러가지 불연속적인 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있는(Amit 등, 1986. Science 233 747-753), 구조결정 결정자들을 인지하기 때문에(Denjamin 등, 1984, Ann. Rev. Immunal. 2, 67-1010), 비리온에서 유래된 항체들은 본성 단백질과 같이 융합되거나 변성된 단백질들을, HPV1항 혈청(steele와 Gallimore, 1990, Virology 174 388-398)에서 보는 바와 같이, 쉽게 인식하지 못한다.
몇몇 피부-유두종-관련 HPV의 비리온들은 유두종 깎아내기에 대한 혈청학적 아세이(Almeida와 Goffe, 1965, Lancet2, 1205-1207; Kienzler등, 1983, Br, J. Dermatol, 108, 665-672; pfister와 Zur Hausen, 1978, Int. J. Cancer 21 161-165; Pyrhsonen 등, 1980, Br. J. Dermatol 102 247-254; Pass와 Maizel, 1973, J. Invest. Dermatol 60. 307-311)에 사용하기에 충분한 양이 얻어진다.
사람면역 혈청에서 정제되어진 비리온에 대한 항체의 부여능은 사용되는 검출시스템에 따라서 20(Genner, 10971, Acta, Derm. Venereol(stockh) 51 365-373) 내지 88%(Morison, 1975, Br. J. Dermatol 93 545-552)에까지 달라진다.
그러나, 최근에 이르기까지, 생식기 HPV 타입들의 비리온들은 형청학적 연구에 이용되어 오지 못하였다.
누드마우스 제소그라프트 계(nude mice xenograft system)(Kreide 등, 1987. J. Viro 61 590-593)가 사람 항체들(Bonnez 등, 1991, J. Gen Virol 72 1343-1347)을 검출하기 위한 HPV 11 입자들을 생산할 수 있다.
본 발명자들은 여기에 기술된 HPV 16 VLPs가 발현되는 본성 HPV 16 입자들에 대한 혈청 반응성 연구에 사용될 수 있으며, HPV 15 L1 융합 단백질(Jenison 등, 1991. J. Virol 65 1208-1218; Kochel 등, 1991 상기 문헌)에 대한 사람혈청에서 관찰되는 반응성의 결여가 단순히 HPV1(steele와 Gallimore, 1990, Virology 174 388-398)에서 유사하게 관찰되는 것과 유사하다고 예측한다.
BPV구조 단백질에 대한 항체들은 바이러스-중화 활성(pilacinski 등, 1986. Ciba Found Symp. 120 136-156)을 갖으며, 정제된 HPV11 비리온에 대하여 발생한 항 혈청 또한 아티믹(athminc) 마우스 제소그라프트계(Christensen과 Kreider, 1990, J. Virol 64 3151-3156)에서 감염되는 HPV11을 중화시킬 수 있다.
본 발명자들의 결과는 정제된 합성 HPV 16 캡시드가 면역원성을 나타내며 이러한 종양성 바이러스에 대하여 특이적인 바이러스-중화성 항체를 평가하고 생산하는데 사용할 수 있다.
에스체리치아 콜아이(E. Coli)와 BPV 입자들에서 발현되어지는 BPV L1 단백질은 소를 유두종 발생으로부터 예방할 수 있다.(pilacinsk 등, 1986; Jarrett 등, 1990, Vet. Rec. 126 449-452) HPV 16 바이러스-성 입자들에 대한 유사한 면역반응이 HPV 16-관련 경부암을 예방하는 잠재적인 백신의 기초를 이룰 수 있다.
제13(a)도에, pLC 201 VV로 감염시킨 후, CV1 세포 분쇄물을 평형 경사 침강시킨 결과를 나타내었다.
정제된 바이러스-성 입자들을 인산 텅스텐 산으로 네가티브 염색한 후 전송 전자 현미경으로 측정하였다.[바는 100′nm]
제13(a)도에, 야생타입 바이러스를 감염된 CV1으로부터의 분쇄물, 라인 1; L1과 L2 발현 바이러스 pLC 201 VV의 분쇄물, 라인 2; 정제된 바이러스-성 입자들의 분쇄물, 라인 3;을 나타내었다.
L2 단백질을 래빗 항 HPV 16 L2 항체에 대한 프르브(probe)가 되며125I-protein A로 처리하였다.
분자량은 왼쪽에 나타내었으며 L2 밴드들을 화살표로 나타내었다.
제13(a)도 및 제13(b)도는 또한 HPV 16 L1과 L2 이중 재조합 VV가, VV 재조합 L2 단백질에 대하여 발생하는 래빗 항 혈청과 정제되어진 vLPs를 사용한, 웨스턴 블럿으로 나타나는 바와 같이 L2 단백질을 갖음을 나타낸다.
[실시예 3]
[BPV1 VLPs]
BPV1 캡시드 단백질에 대하여 VV재조합 DNA를 사용하여 실험관에서 생산한 송아지 파필로마 바이러스(BPB) 1 비리온들은 BPV1 DNA를 둘러쌀 수 있다는 것을 또한 확인되었다. 완전한 비리온들은 E1 바이러스 오픈 리딩 프레임의 전사에 의해 나타난 바와 같이, 마우스 피브로브라스트 세포라인을 감염시킬 수 있으며, 이러한 감염은 BPV1 캡시드 단백질에 대한 항체들과 비리온들을 배양함에 의해 방해되어진다.
BPV 16의 결과와는 대조적으로, 바이러스성 입자들은 BPV1 L1 캡시드 세포에서 뭉쳐지나, L2 단백질은 감염 비리온들을 생산하기 위한 BPV1 DNA를 감싸는데에 요구되어진다.
상기에서 언급된 HPV 16 VLPs에 관련하여, 이들 입자들은 비록 HPV 16 입자들의 전체적인 형태가 자연적으로 발생하는 HPV1과 BPV1 입자들과는 상당히 다르기는 하지만 병리학적 병소들로부터 분리되어진 HPV1과 BPV1 입자들(Baker 등, J. C. Biphys J. 60 1445-1456-1991, Staguet 등, J. Dermatologica 162 213-219, 1981)에서 나타나는 전형적인 캡소머로 이루어져 있다고 보여진다.
천연 HPV 16 비리온들은 임상적인 병소로부터 분리되지 못한 것이므로, 이러한 형태학적인 차이점이 HPV 16의 특성과 관련이 있는지 또는 재조합 백시니아 바이러스(rVV)계가 비리온을 생산하는데에 사용되는지를 확인하는 것이 바람직할 것으로 생각되어진다.
이에 따른 일련의 VVs를 제조하였으며, 이들 각각은 HPV6, HPV11 및 BPV1의 L1과 L2 캡시드 단백질에 대한 이중 재조합하였다. 이들 이중재조합 VVs 각각으로 감염된 CV-1 세포들은 바이러스성 입자들을 생성하였으며, 이들은 HPV 16 입자들보다는 HPV1 및 BPV1 비리온들과 보다 확실하게 유사하였다. 본 발명자들은, 천연 BPV-1 입자들이 형태학적 및 면역학적으로 보다 자세하게 규명되어 있으며, (Chen 등, Baker 등 1991, Cowsert 등, J. Natl Cancer Inst. 79 1053∼1057) 세포 라인들을 BPV-1 DNA의 에피소말 복제(Episomal Replication)에 용이하게 사용할 수 있으므로, (Law 등 1991 DNAS 78 2727∼2731) BPV-1 입자들에 대한 연구를 행하기로 결정하였다.
제13(c)도를 보면 BPV1 L1은 P4b 백시니아 후기 프로모터로부터 발현되며 L2는 P480 합성 백시니아 후기 프로모터로부터 발현된다.
E. Coli gpt 유전자는 선택 마커로 사용되었다. 프랭킹(Flanking) 서열들은 유사성 재조합을 위한 백시니아 서열을 제공하는 백시니아 B24R 유전자이다.
BPV1 L1과 L2 유전자들은 프라스미드 PmL1-1으로부터 PCR으로 복제하였다. BPV1 제놈이 선형화 되었고 BPV1 L2 ORF의 Bam HI 부위에 상기 플라즈미드에서 복제되었기 때문에, BPV1 제놈은 Bam HI 다이제스쳔(Digestion)으로 Pm1-1으로부터 첫번째 분리되어 다시 원형화되었으며, 재 원형화된 BPV-1 DNA를 PCR 템플레이트(Template)로 사용하였다.
L1 증폭을 위해 사용되어진 올리고뉴크테오타이드 프라이머는 다음과 같다.
Bam HT 부위는 밑줄쳤으며 첫번째 메티오닌과 중지 코든이 확인되어 있다.
L2 증폭을 위한 올리고 뉴크테오타이드는 다음과 같다.
Bgl II 부위는 밑출쳤으며 첫번째 메티오닌과 중지 코든이 확인되어 있다.
증폭되어진 1478 염기쌍 L1 절편은 RK19BPVL1을 생산하기 위해 플라스미드 RK19의 Bam H1 부위에서 복제되었다. L1 유전자와 백시니아 4b 프로모터는 Mlu I과 Sma I으로 처리하여 첫번째로 분리하였으며 pSXBPVL1을 생산하기 위해 플라즈미드 pSX3에 전사시켰다. 1409 염기쌍 L2 절편은 BgI II로 소화시켜서 p480 BPVL2를 생산하기 위해 플라스미드 p480의 Bam H1 부위에서 복제하였다.
합성 백시니아 후기 프로모터 및 BPV L2 유전자는 상기 프라스미드로부터 이중 재조합 프라스미드 PSXBPVL1L2를 생산하기 위해 PSXBPVL1의 Sam 1 부위내에서 복제하였다.
야생형(wt) VV WR 계통으로 감염된 CV-1의 모노레이어(Monolayer)로 pSXBPVL1L2VV(L1과 L2 발현)을 얻었다.
재조합 백시니아 바이러스들을 미코페놀릭산(Mycophenolic acid)의 존재하에서 3회 정제하였다. 정제 후, 재조합 바이러스들을 대량 생산하여 본 실험에서 사용하였다.
제14(a)도에서 보면 백시니아-감염된 세포들에서 재조합 BPV1 L1의 면역침강 분석이 나타나 있다.
CV-1 세포들은 각각 wt 백시니아 바이러스(라인1); pSXBPVL1 VV(라인2); pSXBPVL1L2VV(라인3) 10pfu/cell으로 감염시켰으며 감염후 48시간지나 수확하였다.
BPV1L1 단백질은 BPV1 특이성 래빗 항 혈청으로 검출되었다. 58kDa L1 단백질을 화살표로 나타내였다.
제14(b)도에서 BPV1 L2 발현에 대한 노턴 블럿(Northerm Blot)분석을 나타내었다.
wt VV(라인1); pSBPVL1L2 VV(라인2)로 감염시킨 CV-1 세포로부터 추출한 RNA는 BPV1 L2 유전자를 증거한다.
L2 유사성 전사의 다양한 길이는 VV 프로모터에서 발현되는 전형적인 전사형태이다.
면역 침강 시험을 위하여, rVVS로 감염시킨 세포들은 RIPA 완충액(0.1% SDS, 1% Triton X-100, 1% 소디움 데옥시콜테이트, 150mM Nacl, 0.5㎍/㎖ aprotinin, 10mM Tris, pH 7.4)에 용해시켰다.
수용성 단백질들은 1:1000으로 희석한 래빗 항 BPV1 항체(DAKO, Glostrup)으로 면역침강시켰다.
침전된 단백질들을 Proteim-A 세파로스로 모우고, 10% SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분리된 다음 니트롤세룰로스 필터로 블롯팅하였다.
탈지유로 블로킹한 다음, 필터를 항 BPV1 혈청(1:1000)에 노출시킨 다음 125 I-Protein A(0.1μCi/㎖)로 처리하고 오토래디오크래피로 현상시켰다.
전체 RNA를 세포로부터 추출하고, 상기한 바와 같은 CsCl으로 원심분리하여 정제하였다. 전체 RNA를 트랙당 30㎍을 로딩하고 1.2% 포름알데히미드-아가로스 겔에서 런닝한 다음, 나일론 막에 전사시키고,32P-라벨된 BPV1 L1 유전자로 확인하였다.
제15(a)도에는 pSXBPVL1L2VV를 나타내였다. pSXBPVL1L2VV로 감염된 CON/BPV 세포들에 있어서 몇몇 입자들은 전자 밀도 코어(삽입칸)를 갖는다.
제15(b)도는 pSXBPVL1VV를 나타낸 것이다. (A)에서 오염된 백시니아 바이러스는 “V”로 나타내었다. 스케일 바는 50′nm를 나타낸다.
감염후 2일뒤에 세포들을 수확하고, PBS로 세척한 다음, 3번 얼렸다 녹이고 PBS에서 초음파 처리하여 분쇄하였다.
세포 잔해물들을 저속 원심분리하여 제거하고, 상층액을 20%(w/v) 스크로스(Sucrose) 큐션에 위치시킨 다음 2시간동안 100,000Xg로 원심 분리하였다.
펠렛을 PBS에 재분산시키고 1%(w/w) 인산텅스텐 산(Phosphotungstic accd)(pH 7.0)으로 네가티브 염색한 다음 JEOL 1200EX 전자 현미경으로 분석하였다.
확실한 BPV1 입자에서 L2에 대한 L1의 비가 5:1(Pfister, H ＆ Fuchs, E, 파필로마 바이러스와 사람 질병(Syrjannen K. Gissman, L ＆ Koss, L.G 편집) Vol. 1∼18(Syringer-Verlag, Berlin, 1987)이기 때문에, 본 발명자들은 본 발명의 이중 재조합 VV(제13(c)도)에 대한 L1 유전자에 대하여 강력한 천연 프로모터를 사용하고 L2 유전자에 대하여서는 약한 합성 프로모터를 사용하였으며, 그 결과 rVV 감염되 CV-1 세포로부터 노턴 블럿상에 L2 mRNA에 대한 L1mRNA비는 대략 10:1이였다.
상기한 rVV로 감염된 CV-1 세포들은 BPV L1 단백질(제14(a)도)와 L2 mRNA(제14(b)도)를 발현하였으며, 명백하게 확실한 형태를 갖는 많은 수의 50′nm의 20면체 바이러스-성 입자들을 감염세포로부터 분리할 수 있었다.
HPV16에 대한 본 발명자들의 종래의 연구 결과에서는 파르보 바이러스(Kajigaya 등, 1991, DANS 4646∼4560), 블루튱크 바이러스(Loudon 등, 1991, Virology 182, 793∼801), 및 폴리요마 바이러스(Salunhe 등, 1986, Cell 46, 895∼904)에 대한 바이러스성 입자들이 주 캡시드 단백질 만이 재조합 단백질로서 발현되는 경우 세포내에 결집된다는 발견과는 달리 HPV16 바이러스-성 입자의 결집에는 L1과 L2 단백질 모두가 요구된다는 사실을 알았다.
그러므로 본 발명가들은 BPV1 L1(제13(c)도)에 대한 VV 재조합을 제조한 다음 이 VV로 CV-1 세포를 감염시킬때 L1 및 L2 이중 재조합 VV로부터 얻어지는 것과 유사한 형태를 갖는 바이러스성 입자를 분리할 수 있을 것인가를 관출하였다.(제15(b)도)
HPV6 또는 HPV11의 L1 단백질에 대한 VV 재조합으로 CV-1 세포를 감염시킨후 유사한 엠피티 20면체의 비리온들을 얻었다.
HPV16 L1과 L2rVV로 감염된 세포들에서 형태학적으로 확실한 PV 비리온의 결여, 전자 현미경에 의해 확인되는 HPV16 감염조직에서 보여진 PV 비리온의 결여(Schneider(1987)) 파필로마 바이러스와 사람 질병 Vol 19∼39 Springer Verlag Berlin)은 HPV16가 다른 PVS와는 달리 바이러스 캡시드 형성을 결여하고 있다는 것을 시사한다.
VPV1 L1/L2 rVV로 감염된 세포로부터 얻은 바이러스성 입자의 소수가 제15(a)도의 삽입란에 나타나 있다.
HPV11 L1/L2 및 HPV6b L1/L2 이중 발현 재조합 백시니아 바이러스의 복제 전략은 아래와 같다.
HPV11 L1에 대한 것을 아래와 같다.
PCR 생성물은 BgI II/EcoRI로 소화한 다음 4b 프로모터의 통제하에 RK19에서 복제하였다.
프로모터/11 L1 서열을 크레노브(Klenow)로 둥글게 한 pSX3 BamHI 부위에서 복제하였다. 그 결과 얻어진 플라스미드는 pSX BamHI 부위에서 복제하였다. 그 결과 얻어진 플라스미드는 pSX11 L1이였다.
11 L2에 대하여서는 다음과 같다.
Bam/HI/SmalI으로 소화시킨 PCR 절편을 합성 28K 후기 프로모터의 존재하에 p480에 복제시켰다. 그 다음 프로모터/11 L2 절편을 pSX11L1에 전사시켰다.
11 L1/L2 이중 재조합 발현 플라스미드를 pSX11 L1/L2로 명명하였다.
HPV6b11에 대하여서;
PCR 생성물은 BamHI/SamI으로 자른 후 4b 프로모터의 통제하여 RK19내에 복제하였다. 그 다음 프로모터/6 L1을 pSX4내에 복제하여 pSX6 L1을 제조하였다.
HPV6 L2에 대하여;
HPV6 L2를 AccI/XbaI(4422-5903)으로 6b 제놈으로부터 분리하였다.
절편을 크레노브로 블롯트하고 p480에 삽입하였다. 합성 28K 프로모터 프럴스 6b L2를 pSX6 L1내에 복제하여 이중 재조합 플라스미드 pSX6 L1/L2를 형성하였다.
그런 다음, 야생 타입 백시니아 바이러스 감염된 숙주세포를 트란스펙션하여 L1 단백질(VV SPX11 L1으로부터 유래)과 L1 및 L2 단백질(VV pSX11 L1/L2로부터 유래) 생성하는, VV pSX11 L1과 VV pSX11 L1/L2를 생산하기 위하여 플라스미드 pSX11 L과 pSX11 L1/L2를 숙주세포(예를 들어 CV1 세포 또는 C127 세포)를 감염시킨다.
비슷한 방법으로 VV pSX6 L1과 VV pSX6 L1/L2는 숙주세포에 트랜스펙션한후 HPV6b L1과 HPV6b L1을 포함하는 VLPs들을 생산한다.
또한 본 발명은 파필로마 바이러스 캡시드 단백질 L1을 포함하는 재조합 바이러스와 마찬가지로 파필로마 캡시드 단백질 L1 및 L2에 대한 이중 재조합 바이러스를 그의 범위에 갖는다는 것은 쉽게 예측할 수 있다.
단백질 L1과 L2를 포함하는 VLP 입자들을 검출하는 단계로 이루어지는 ELISA에 의해 파필로마 바이러스 감염의 진단 방법 또한 본 발명의 범위임을 예측할 수 있을 것이다.
[표 1]
[표 2]

Claims (39)

  1. 바필로마 바이러스 L1 단백질을 암호화하는 시퀀스를 함유하는 재조합 DNA 분자를 제조하고; 상기한 재조합 DNA 분자로 숙주 세포를 트랜스펙션하고; 상기한 숙주 세포에서 바필로마 바이러스 L1 단백질을 발현하여 상기한 트랜스펙션된 숙주 세포에서 파필로마 바이러스성 입자를 생성하는 단계들로 이루어지는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 재조합 DNA 분자들을 갖는 재조합 바이러스를 상기한 숙주 세포에 트랜스펙션시키는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  3. 제2항에 있어서, 제1플라스미드가 상기한 재조합 바이러스를 생산하기 위하여 야생 타입의 바이러스로 미리 감염된 숙주 세포를 계속적으로 감염시키는 상기의 재조합 DNA 분자(들)를 포함하여 형성되는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기한 제1플라스미드가 L1 또는 L1과 L2 단백질의 발현을 촉진하기 위하여 프로모터에 결합된 상기한 재조합 DNA 분자(들)를 포함하는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기한 제1플라스미드의 형성 전에 L1 또는 L2 단백질을 암호화하는 유전자가 제1플라스미드 형성전에 상기한 프로모터를 포함하는 제2플라스미드에 삽입되는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  6. 제3항에 있어서, 이중 재조합 발현 플라스미드를 형성하기 위해서 L1 단백질을 암호화하는 상기한 재조합 DNA 분자를 포함하는 제1플라스미드가 L2 단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자를 추가로 삽입하고, 이어서 상기한 제1플라스미드 및 상기한 이중 재조합 발현 플라스미드가 모두 상기한 야생형 바이러스에 의해서 감염된 상기한 숙주 세포를 트랜스펙션하는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기한 재조합 바이러스는 Spodoptera frugiperda와 같은 곤충 세포를 감염시키는 바큐로바이러스(baculovirus)로부터 유래되는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  8. 제2항에 있어서, 상기한 재조합 바이러스는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)에서 유래되는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기한 L1 단백질을 암호화하는 유전자를 강력한 백신 바이러스로 프로모터 4b를 포함하는 플라스미드에 혼입하고; 상기한 4b 프로모터에 연결된 유전자를 포함하는 DNA 단편은 상기한 플라스미드로부터 유도시키고; 이어서 상기한 DNA 단편을 플라스미드 pLC200을 생산하기 위하여 백신 바이러스의 B24R 유전자와 E. coli gpt 유전자 및 다중 클로닝 자리를 갖는 백신 중간 벡터에 삽입시키는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기한 L2 단백질을 암호화하는 유전자는 플라스미드 pLC201을 생성하기 위하여 합성 백시니아 28K 후기 프로모터를 가지는 pUC 유도 플라스미드에 혼입되고 이어서 28K 프로모터에 결합된 상기한 L2 유전자를 함유하는 단편을 얻고 상기한 단편이 플라스미드 pLC200에 삽입되는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서, 플라스미드 pLC201이 L1 및 L2 단백질을 포함하는 VLPs를 생성하기 위하여 포유류 세포를 계속적으로 감염시키는 재조합 백시니아 바이러스 pLC201VV를 제조하는데 이용되는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  12. 제8항에 있어서, PCR 증폭 이후 백시니아 4b 프로모터에 결합된 BPV L1 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 재조합 분자가 제조되고, 이어서 상기한 DNA 재조합 분자가 플라스미드 pSX3에 삽입되어서 플라스미드 pSXBPVL1를 형성하고 이후 야생형 백시니아 바이러스로 감염된 숙주세포를 감염시켜 rVVpSXBPVL1을 생성하고 숙주 세포를 트렌스팩션하여 BPV L1 단백질을 함유하는 VLP를 제조하는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  13. 제12항에 있어서, PCR 증폭 이후 합성 백시니아 28K 후기 프로모터에 결합된 BPV L2 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 재조합 분자가 제조되고, 상기한 DNA 재조합 분자는 플라스미드 p480 BPL2로서 이어서 플라스미드 p480 BPVL1에 삽입되어서 플라스미드 pSXBPVL1L2를 생성하고 이후 야생형 백시니아 바이러스로 감염된 숙주세포를 트렌스팩션하여 BPV L1 단백질을 함유하는 VLP를 제조하는 파필로마 바이러스성 입자의 생성 방법.
  14. 제8항에 있어서, PCR 증폭 이후 백시니아 4b 프로모터에 결합된 HPV11 L1 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 재조합 분자가 제조되고, 이어서 상기한 DNA 재조합 분자가 플라스미드 pSX3에 삽입되어서 플라스미드 pSX11L1이 형성되고 이후 숙주세포를 감염시켜 L1 단백질을 포함하는 HPV11 VLPs를 제조하는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  15. 제8항에 있어서, PCR 증폭 이후 백시니아 4b 프로모터에 결합된 HPV11 L2 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 재조합 분자가 제조되고, 이어서 상기한 DNA 재조합 분자가 백시니아 28K 후기 프로모터를 포함하는 플라스미드 p480에 삽입되고 이어서 상기한 프로모터에 결합된 유전자를 포함하는 DNA 단편이 플라스미드 pSX11L1로 트랜스펙션되어서 플라스미드 pSX11L1L2를 형성하고 이후 숙주세포를 감염시켜서 VVpSX11L1L2를 생성하고, 숙주세포를 트랜스펙션한 후 L1 및 L2 단백질을 포함하는 VLPs를 제조하는 파필로마 바이러스성 입자의 생성 방법.
  16. 제8항에 있어서, 백시니아 4b 프로모터에 결합된 HPV6b L1 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 재조합 분자가 제조되고, 이어서 플라스미드 pSX3에 삽입되어 플라스미드 pSX36L1을 생성하고 이어서 숙주세포를 감염시켜서 VVpSX36 L1을 생성하고, 숙주세포를 트랜스펙션한 후 HPV6b L1 단백질을 포함하는 VLPs를 제조하는 파필로마 바이러스성 입자의 생성 방법.
  17. 제8항에 있어서, 백시니아 28K 후기 프로모터에 결합된 HPV6b L2 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 재조합 분자가 제조되고, 이어서 pSX36 L1에 클로닝되어서 이중 재조합 플라스미드 pSX6L1L2를 형성하고, 숙주세포를 트랜스펙션한 후 HPV6b L1 단백질 및 HPV6b L2 단백질을 포함하는 VLPs를 제조하는 파필로마 바이러스성 입자의 생성 방법.
  18. 제1항의 방법에 의하여 제조되어지는 파필로마 바이러스성 입자.
  19. 제18항의 파필로마 바이러스성 입자에서 생성되는 파필로마 바이러스 감염의 치료에 효과적인 백신.
  20. 파필로마 바이러스 L1 단백질을 포함하는 바이러스성 입자.
  21. 제1항에 있어서, 상기한 파필로마 바이러스성 입자가 상기한 숙주세포에서 분리된 것이거나 수득된 것인 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기한 재조합 DNA 분자가 바필로마 바이러스 L2 단백질을 암호화하는 시퀀스를 함유하여 바필로마 바이러스 L1 단백질과 L2 단백질 모두가 상기한 숙주 세포에서 발현되는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기한 L1 및 L2 단백질들을 암호화하는 시퀀스가 동일한 DNA 분자내에 존재하는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기한 L1 및 L2 단백질들을 암호화하는 DNA 분자들은 서로 다른 DNA 재조합 분자내에 존재하는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  25. 제2항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 재조합 DNA 분자도 상기한 L2 단백질을 암호화하는 시퀀스를 함유하여 파필로마 바이러스 L1 및 L2 단백질이 모두 상기한 숙주 세포에서 발현되는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기한 L1 및 L2 단백질을 암호화하는 시퀀스가 동일한 재조합 DNA 분자내에 존재하는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기한 L1 및 L2 단백질을 암호화하는 시퀀스가 서로 다른 재조합 DNA 분자내에 존재하는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  28. 제1항에 있어서, 상기한 바필로마 바이러스가 HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18 및 BPV로 이루어진 군에서 선택되는 파필로마 바이러스성 입자의 생산 방법.
  29. 제1항, 제2∼17항, 및 제21∼28항 중 어느 하나의 항의 방법에 의해서 생성된 파필로마 바이러스성 입자를 동물에 투여하는 것을 포함하는 동물에서 항 바필로마 바이러스 항체의 생성 방법.
  30. 제1항, 제2∼17항, 및 제21∼28항 중 어느 하나의 항의 방법에 따라 생성된 파필로마 바이러스성 입자를 동물에 투여하는 것을 포함하는 바필로마 바이러스에 대해서 동물을 면역화시키는 방법.
  31. 제19항에 있어서, 애쥬번트를 추가로 포함하는 백신.
  32. 제20항에 있어서, 바필로마 바이러스 L2 단백질을 추가로 포함하는 바이러스성 입자.
  33. 제20항에 있어서, 상기한 바필로마 바이러스가 HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18 및 BPV로 이루어진 군에서 선택되는 바이러스성 입자.
  34. 제33항에 있어서, 상기한 바필로마 바이러스가 HPV6b를 포함하는 바이러스성 입자.
  35. 제33항에 있어서, 상기한 파피로마 바이러스가 HPV11을 포함하는 바이러스성 입자.
  36. 제33항에 있어서, 상기한 바필로마 바이러스가 HPV16을 포함하는 바이러스성 입자.
  37. 제33항에 있어서, 상기한 바필로마 바이러스가 HPV18을 포함하는 바이러스성 입자.
  38. 제33항에 있어서, 상기한 바필로마 바이러스가 BPV를 포함하는 바이러스성 입자.
  39. 제20항 및 제32항 내지 제38항중 어느 하나의 항의 파필로마 바이러스성 입자를 포함하는 바필로마 바이러스 감염의 치료에 효과적인 백신.
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