JP3828570B2 - パピローマウイルスワクチン - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、パピローマウイルス、特に、かかるウイルスによって引き起こされる感染の治療において有効である得る抗原およびワクチンに関する。
発明の背景
パピローマウイルス感染は、ヒトにおいてのみならず、ヒツジ、テヌ、ウシ、コヨーテ、オオカミ、オポッサム、シカ、カモシカ、ビーバー、カメ、クマ、トカゲ類、サル、チンパンジー、ジラフ、アフリカ産大カモシカ、ゾウ、クジラ、ネコ、ブタ、ネズミ（gerbil）、オオシカ、ヤク、イルカ、オウム、ヤギ、サイ、ラクダ、レミング、シァモア、スカンク、フクログマ、アナグマ、キツネザル、カリブー、アルマジロ、イモリおよびヘビのごとき動物においても知られている（例えば、ジェイ・ピイ・サンドバーグ（J P Sundberg）による「動物におけるパピローマウイルス感染（Papilloma Virus Infections in Animals）」の「パピローマウイルスおよびヒトの病気（Papilloma viruses and Human Disease）」に記載、ケイ・シルヤネン、エル・ギスマンおよびエル・ジイ・コス（K Syrjanen, L Gissman and L G Koss）編、シュブリンゲル・フェアラーク（Springer Verlag）１９８７参照））。
また、パピローマウイルスは、ＤＮＡ配列の相同性に応じてタイプ１〜５６に分けられるヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）のごときいくつかの異なる群に包含されることも知られている（例えば、エイチ・フィスター（H Pfister）によって編集され、シイアールシイ・プレス・インコーポレイテッド（CRC Press Inc）によって発行された「パピローマウイルスおよびヒト癌(Papilloma viruses and Human Cancer)」）。ＨＰＶの臨床病理学的グループ分けおよびそれが最も頻繁に関連し得る障害の悪性の可能性は以下のとおり分けられる。
第１群には、良性足底イボを引き起こすタイプ１および４、良性尋常性ユウゼイを引き起こすタイプ２、２６、２８および２９、良性偏平イボを引き起こすタイプ３、１０および２７ならびにブッチャーズ（butcher's）ユウゼイを引き起こすタイプ７がリストされ得る。感染のこの第１の群は、正常なまたは免疫適格個体で起こる。
免疫無防備個体に関する第２群には、高度に悪性の斑状病変（macular lesion）を引き起こすタイプ５および８、良性または稀には悪性である斑状ももしくは偏平病変を引き起こすタイプ９、１２、１４、１５、１７、１９−２５、３６および４６−５０がリストされ得る。さもなければ、これらの斑状病変は、イボ状表皮異形成（ＥＶ）として知られている。
特に性器に感染する第３群には、稀に悪性であるコンジロームを引き起こすタイプ６、１１、３４および３９、４１−４４、および５１−５５、良性病巣上皮肥厚を引き起こすタイプ１３および３２、上皮形成異常およびその他丘疹症を含めたかなりの程度の病変を引き起こすタイプ１６および１８、中程度の悪性可能性を有するコンジロームを引き起こすタイプ３０、３１、３３、３５、４５および５６がリストされ得る。該コンジロームは、ほとんど、肛門性器管、特に頸部に出現する。タイプ１６および１８は、頸部、膣、外陰部および管部のin situおよび侵入性癌腫の大多数と関連する。また、コンジロームはアエロダイジェスティブ（aerodigestive）管で起こり得る。
特に、ＨＰＶ１６は、尿生殖器管の前悪性および悪性疾患に関連し、特に、頸部の癌腫に関連する（ドゥルスト（Durst）ら、ＰＮＡＳ ８０、３８１２−３８１５、１９８３；ギスマン（Gissman）ら、ジャーナル・オブ・インベスティガティブ・デルマトロジー（J. Invest. Dermatol.）８３ ３６５−２８５、１９８４）。現在ＨＰＶ１６の中和における液性応答の役割についての情報はない。
ＨＰＶ１６感染を持つ患者の血清中のＨＰＶ融合蛋白（ジェニソン（Jenison）ら、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J. Virol.）６５ １２０８−１２１８、１９９０；

インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Int. J. Cancer）４８ ６８２−６８８、１９９１）および合成ＨＰＶ１６Ｌ１ペプチド（ディルナー（Dillner）ら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Int. J. Cancer）４５ ５２９−５３５、１９９０）に対する抗体の検出により、これらの技術によって同定されたＨＰＶ １６ Ｌ１−特異的抗体を有する患者はほとんどいなかったにも拘わらず、ＨＰＶのキャプシド蛋白内にＢエピトープがあることが確認される。in vitroにてのＨＰＶ１６増殖についての系はなく、ヒト性器病巣はＨＰＶ１６ビリオンをほとんど産生せず；従って、免疫学的研究用にＨＰＶ１６粒子は入手できなかった。
また、動物パピローマウイルスは、ウシ・パピローマウイルス（ＢＰＶ）および、特に、ＤＮＡ配列の相同性によっても区別されるタイプＢＰＶ１、ＢＰＶ２、ＢＰＶ３、ＢＰＶ４、ＢＰＶ５およびＢＰＶ６を包含し得る。一般に、他の動物パピローマウイルスは、シカ、ウマ、ウサギ、イヌ、囓歯類および鳥類に感染する。パピローマウイルスは、８つまでの初期遺伝子および２つの後期遺伝子をコードする小さなＤＮＡウイルスである。（レビューについては、ランカスターおよびジェンソン（Lancaster and Jenson）、１９８７、キャンサー・メタスタシス・レビューズ（Cancer Metast. Rev.）６６５３−６６６４頁；およびフィスター（Pfister）１９８７、アドバーンシズ・イン・キャンサー・リサーチズ（Adv. Cancer Res.）４８、１１３−１４７参照）。後期遺伝子の組織は前期遺伝子よりも単純である。後期遺伝子Ｌ１およびＬ２は、ほとんどの場合、相互にわずかに重複する。推定Ｌ２蛋白、特にＣ−末端の１０の塩基性アミノ酸の配列は、異なるパピローマウイルス間で高度に保存されている。中央部における広いドメインは、小さいクラスターの類似性のみを明らかにする。しかしながら、Ｌ１ＯＲＦは、すべての公知ケースにおいて、変化なく保存されているようどある。（シルヤネン（Syrjanen）ら、前掲、参照）。アミノ酸配列の相同性は、ＨＰＶ１ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＢＰＶ１およびＣＲＰＶ（コトンテールウサギ（cotton tail rabbit）・パピローマウイルス）の間で比較して、５０％に達する。
パピローマウイルス感染に関する免疫療法に関しては、イボおよび上皮病変の従前の治療方法は、苦痛および外傷となり得る外科手術の使用を含むものであり、傷を残し、再感染が起こりかねない危険をしばしば伴うものであった。また、化学品での治療も使用されてきた。通常の治療剤はサリチル酸であり、これはチンキおよびプラスター中の１０％ないし４０％の範囲の強さの主成分である。また、３％ないし２０％の強さのホルマリンも提案されている。寒冷療法は皮膚のイボの治療に使用されてきた。治療剤としてのグルテルアルデヒドもまた使用されてきた。ポドフィリン（podophyllin）もまた種々の成功度をもって皮膚のイボおよび肛門性器コンジロームに使用されてきた。肛門性器コンジロームに使用されてきた外科手術のタイプは、外科的切除、冷凍外科およびレーザー外科を含むものであった。また、インターフェロンの使用も提案されてきた（例えば、シルヤネン（Syrjanen）ら、前掲、参照）。
ウシ・パピローマウイルス（ＢＰＶ）のＬ１蛋白に対する抗体は、ウイルス中和活性（ピラチンスキー（Pilacinski）ら、１９８６）を有し、ＨＰＶ１１ビリオンは特異的抗血清（クリステンセンおよびクレイダー（Christensen and Kreider）、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J. Virol.）６４ ３１５１−３１５６、１９９０）によるin vitroモデルで不活化できる。また、ＨＰＶ１−誘発皮膚イボの自然発生的退行は、イボ蛋白に対する液性免疫応答の増大に関連するといういくらかの証拠もある（キルヒナー（Kirchner）、プログ・メド・バイロル（Prog. Med. Virol.）３３ １−４１、１９８６）。
また、ワクチンも提案されており、通常の成功を収めている。自原性腫瘍ホモジネートを含有するワクチンを使用することが提案されている［アブカリアン（Abcarian）ら、ジャーナル・オブ・サージカル・リサーチ（J. Surg. Res.）２２：２３１−２３６（１９７７）、ディジージス・オブ・コロン・アンド・レクタム（Dis Colon Rectum）２５：６４８−５１（１９８２）、ディジージズ・オブ・コロン・アンド・レクタム（Dis Colon Rectum）１９：２３７−２４４（１９７６）］。しかしながら、最近、ウイルスＤＮＡの可能な腫瘍性効果のため、もはや自原性ワクチンで患者を治療すべきでないということが提唱されている（ブンネイ（Bunney）、１９８６、ブリティッシュ・メディカル・ジャーナル（Br. Med. J.）２９３、１０４５−１０４７）。
遺伝子工学により作成されるワクチンの生産に関しては、この事項は、フィスター［（Pfister）（１９９０）、前掲］で考察されており、異なるパピローマウイルスタイプの体液過剰のため、効果的なワクチンを得るのが困難なようである。しかしながら、フィスター（Pfister）は、いわゆる初期蛋白（すなわち、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７またはＥ８）に注意が向けられるべきと指摘している。なぜならば、これらの蛋白は、上方表皮層で発現される構造蛋白とは対照的に、イボ感染の増殖する基底細胞で合成されるようである。従って、フィスター（Pfister）（１９９０）によると、ウイルスキャプシド蛋白はワクチンにおける使用では限られているようである。真核細胞におけるパピローマウイルス初期蛋白についてのin vitroテスト系での組換えワクシニアウイルスの使用もまたフィスター（Pfister）（１９９０）で考察されている。これは、パピローマウイルス蛋白を発現する遺伝的に修飾したワクシニアウイルス、あるいはin vitroにてワクシニア組換体で感染させたまたは他の発現ベクターでトランスフェクトしたパラホルムアルデヒド固定自己由来細胞の表面で発現する遺伝的に修飾したワクシニアウイルスからなる生ワクチンの形態をとり得る。フィスター(Pfister)（１９９０）で考察されたワクチン開発についてのもう１つの戦略は、グリコシドQuil Aの免疫刺激複合体を用いるものである。
成功した予防ワクチン接種についてのデータは、ウシ線維乳頭腫のウシ線維乳頭腫ホモゲナイズしたホモジネートについてのみ存在し、それは限定的な免疫性を提供することが示されている(オルソン(Olson)ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ベテリナリ・メディカル・アソーシエーション(J. Am. Vet. Med. Assoc.)１３５、４９９（１９５９）、キャンサー・リサーチ（Cancer Res.）２２ ４６３（１９６２）)。遺伝子工学的に作成したＬ１融合蛋白（ピラチンスキー（Pilacinski）ら、ＵＣＬＡシンポジウム、モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー・ニュー・シリーズ(Molecular and Cellular Biology New Series)Ｖｏｌ３２、パピローマ・ヴィルシズ・モレキュラー・アンド・クリニカル・アスペクツ（Papilloma Viruses Molecular and Clinical Apects）、アラン・アール・リス（Alan R Liss）ニューヨーク、１９８５、２５７）を含むワクチンもウシで使用されてきたが、ヒトでは成功しなかった（バルトホールド(Barthold)ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ベテリナリ・メディカル・アソーシエーション(J. Am. Vet. Med. Assoc.)１６５、２７６、１９７４）。フィスター（Pfister）（１９９０）において、キャプシド蛋白ワクチンの使用によるＨＰＶ感染の可能な予防についての証拠は現在ないが、抗腫瘍細胞免疫性の誘導は可能なようであると述べられている。
Ｌ１およびＬ２遺伝子はパピローマウイルス感染の予防および治療用のワクチンならびに診断で用いる免疫原およびパピローマウイルスの検出の基礎であった（国際出願ＷＯ８６０５８１６およびＷＯ８３０３６２３）。しかしながら、これらのワクチンの商業的用法は行われていないようである。
発明の概要
従って、本発明の目的は、診断剤ならびにパピローマウイルス感染で用いるワクチンの成分の形成で有用であり得るウイルス様粒子（ＬＶＰ）を提供することにある。
従って、１の態様において本発明は、
（ｉ）パピローマウイルスＬ１蛋白またはパピローマウイルスＬ１蛋白およびパピローマウイルスＬ２蛋白の組合せを各々コードする１種またはそれを超える組換えＤＮＡ分子を構築し；次いで
（ii）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が、Ｌ１またはＬ１およびＬ２蛋白の組合せの発現の後に細胞内で生産されるように、該１種またはそれを超える組換えＤＮＡ分子で適当な宿主細胞をトランスフェクトする工程よりなるパピローマウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生産方法を含む。
もう１つの態様において本発明は、適当なアジュバントと組み合わせたパピローマウイルスＶＬＰを含有するワクチンを含む。
工程（ｉ）に関しては、いくらかのパピローマウイルスのＶＬＰを形成するのにパピローマウイルスＬ１蛋白のみ要する。適当には、ＢＶＰ１、ＨＰＶ１１およびＨＰＶ６ｂを含めたＨＰＶ６のＶＬＰを形成するのに、Ｌ１蛋白のみが必要である。しかしながら、Ｌ１およびＬ２蛋白を共に含有するＢＶＰ１、ＨＰＶ１１またはＨＰＶ６ｂに関しては、ＶＬＰが形成され得る。ＨＰＶ１６のごとき他のパピローマウイルスのＶＬＰの形成には、Ｌ１およびＬ２蛋白が共に必要である。さらに、Ｌ１およびＬ２遺伝子は同一のＤＮＡ組換え分子または異なるＤＮＡ組換え分子に包含させ得ることが理解されるであろう。
好ましくは、組換えＤＮＡ分子は、宿主細胞をトランスフェクトし得る組換えウイルスに含有される。この目的で使用できる適当なウイルスは、バクロウイルス、ワクシニア、シンドビスウイルス、ＳＶ４０、センダイウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスまたはポックスウイルスを包含する。適当な宿主細胞は、前記ウイルスに適合する宿主を包含し、これらはスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）のごとき昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、ＢＨＫ細胞、ヒトＳＷ１３細胞、ショウジョウバエ、アエデス・アルボピクタス（Aedes albopictus）由来のカ細胞またはサル上皮細胞を包含する。また、他の真核細胞は酵母細胞または他の哺乳動物細胞を含み得ることは認識されるであろう。
それにより、Ｌ１蛋白およびＬ２蛋白が、後記にて考察する適当に設計したプライマーを用いてＰＣＲ増幅によって増幅されるパピローマウイルスゲノムの入手源から得られたＤＮＡ組換え分子が適当である。好ましくは、Ｌ１蛋白をコードする遺伝子を、適当なプロモーターを含有するプラスミドに挿入し、該Ｌ１蛋白およびプロモーターを含有するＤＮＡ断片を、組換えＤＮＡ分子を構成し得る一次プラスミドに組み込み、これを前記したごとく組換えウイルスベクターに挿入できる。
Ｌ２蛋白をコードする遺伝子もまた適当なプロモーターに連結でき、好ましくは、Ｌ２遺伝子およびプロモーターを組み込んだＤＮＡ断片を一次プラスミドに挿入して、二重組換えプラスミドまたは二次プラスミドが得られ、このプラスミドもまた前記したごとく組換えウイルスベクターに挿入して、二重組換えウイルスベクターが得られる。
しかしながら、また、本発明は、一次プラスミドおよび／または二次プラスミドが適当な宿主細胞を感染させて、適当な実験条件下でＬ１蛋白を含有するＶＬＰまたはＬ１およびＬ２蛋白を含有するＶＬＰが得られる具体例も含む。後者のＶＬＰは、Ｌ２蛋白が天然感染において免疫優性であるので、パピローマウイルス特異的ワクチンについて理想的な免疫原である。
他の適当なＤＮＡ組換え分子はコスミドならびに組換えウイルスを包含する。適当な発現系はイー・コリおよびいずれかのプラスミドもしくはコスミド発現ベクターを含めた原核細胞発現系、あるいは組換えウイルスベクターと組み合わせた前記宿主細胞または酵母細胞および酵母プラスミドを含めた真核細胞系を包含する。
Ｌ１またはＬ１およびＬ２を共にコードする遺伝子を組み込んだプラスミドを用いる状況、およびかかるプラスミドがＶＬＰの生産のために適当な宿主を感染させ得る状況では、かかるプラスミドはＶＬＰ構造蛋白の発現を促進するための適当なプロモーターも含有すべきであり、また関連するプロモーターと関係のあるポリメラーゼも利用し得る。しかしながら、この状況においては、ＶＬＰは特別の実験条件下で得られるにすぎない。
Ｌ１およびＬ２遺伝子は、哺乳動物またはウイルスのポリアデニレーションシグナルで、いずれの哺乳動物またはウイルスプロモーターもオフとし得る。好ましくは、Ｌ１およびＬ２遺伝子は、適当と考えられる初期プロモーターまたは後記プロモーターであり得るいずれのワクシニアウイルスプロモーターからも転写される。かかるプロモーターのリストは、ダビシオンおよびモス（Davision and Moss）（１９８９）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）２１０ ７４９−７６９および（１９８９）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）２１０ ７７１−７８４に記載されている。
行った実験において、Ｌ１遺伝子はワクシニア４ｂプロモーターの下流に位置させ、Ｌ２遺伝子は合成ワクシニア２８ｋ後期プロモーターの下流に位置させる。宿主細胞はサル上皮細胞である。
ＶＬＰはいずれかの適当な精製手段によってトランスフェクトした細胞から得ることができる。ＶＬＰはＩＳＣＯＭ、ミョウバン、フロイントの不完全もしくは完全アジュバント、Quil Aおよびバンセロウ・エス［(Vanselow S.)(１９８７)、例えばベテリナリ・ブレチン（Vet. Bull.）５７ ８８１−８９６］に記載されている他のサポニンもしくは他のアジュバントと組み合わせることができる。
添付図面に例示されている本発明の種々の好ましい具体例を参照されたし。これらの好ましい具体例では、特別のパピローマウイルス、ＶＬＰおよびＤＮＡ組換え分子の特別の構築は例として挙げられていることに注意すべきである。
図面の簡単な記載
図１は、ＨＰＶ１６組換えワクシニアウイルスを構築するために用いるプラスミドの模式図である。
図２Ａは、ワクシニアウイルスで感染したＣＶ−１細胞における組換えＨＰＶ１６ Ｌ１のサザーンブロット分析である。
図３は、組換えワクシニアウイルスで感染させたＣＶ−１細胞のノーザンブロット分析である。
図４Ａおよび４Ｂは、組換えワクシニアウイルスで感染させたＣＶ−１からのＨＰＶウイルス様粒子の電子顕微鏡写真である。
図５は、ＨＰＶ１６の空のキャプシドのＣｓＣｌ平衡密度勾配沈降を示す。
図６は、精製したウイルス粒子におけるＬ１蛋白のグリコシル化を示す。
図７は、Ｌ１をコードするプラスミドｐＬＣ２００ならびにＬ１およびＬ２をコードするｐＬＣ２０１の構築の流れ図である。
図８は、マウス血清のバクロウイルス組換えＬ１蛋白との反応性のウェスタンブロット分析である。
図９および１０は、合成ＨＰＶ１６キャプシドで免疫したＢＬＡＢ／ｃ、Ｃ５７Ｂ１／６およびＣＢＡマウスからの血清、ならびにプールしたＣＦＡ免疫化対照血清についてのマッピング結果を示す。
図１１および１１Ａは、ＨＰＶ１６ Ｌ１分子の重複する一連のペプチドとの、Ｌ１に特異的な２つのＭＡｂの反応性を示す。
図１１Ｂは、ＨＰＶ１６ Ｌ１の抗原性指標の予測を示す。
図１２は、ＨＰＶ１６ Ｌ１のエピトープマップを示す。
図１３Ａは、免疫化で用いる合成ＨＰＶ１６ ＶＬＰを示す。
図１３Ｂは、ウェスタンブロットによる、抗ＨＰＶ１６ Ｌ２抗血清との、精製したＶＬＰの反応性を示す。
図１３Ｃは、ＢＰＶ１との関係における組換えワクシニアウイルスを構築するのに用いるプラスミドを示す。
図１４Ａおよび１４Ｂは、野生型および組換えワクシニアウイルスで感染させたＣＶ−１細胞におけるＢＰＶ１ Ｌ１およびＬ２発現の分析を示す。
図１５Ａおよび１５Ｂは、組換えワクシニアウイルスで感染させた細胞から得られたＢＰＶ１キャプシドの電子顕微鏡写真を示す。
実施例１：ＨＰＶ１６由来のＶＬＰ
第２のＡＴＧからのＨＰＶ−１６ Ｌ１遺伝子（ｎｔ５６３７）を、以下のプライマー：

を用い、（エル・ギスマン（L. Gissmann）によって提供された）ｐＨＰＶ１６からのポリメラーゼ鎖反応によって増幅させた。
最初のメチオニンコドンおよび停止コドンは下線によって示し、ＢｇｌＩＩ部位はサブクローニングを容易にするために含ませた。増幅させた１５２７ｂｐ断片をフェノールで抽出し、１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。
ＢｇｌＩＩでの消化の後、Ｌ１遺伝子を、強力なワクシニアウイルスプロモーター（４ｂ）を含有するＰＫ１９プラスミド（ケント（Kent）、１９８８、Ｐｈ．Ｄ．論文、ケンブリッジ大学）のＢａｍＨＩ部位にサブクローンした。得られたプラスミドを配列決定し（サンガー（Sanger）ら、１９７７、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc. Natl. Acad. Sci.）ＵＳＡ ７４、５４６３−５４６７）、ＭｌｕＩおよびＳｓｔ１での消化によって、４ｂプロモーターに連結したＨＰＶ１６ Ｌ１遺伝子を含有する断片を調製するのに使用した。この断片をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ワクシニアウイルスのＢ２４Ｒ遺伝子（コットワルおよびモス（Kotwal and Moss）、１９８９、ジャーナル・オブ・バイロロジー(J. Virol.)６３、６００−６０６；スミス（Smith）ら、１９８９、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J. Gen. Virol.）７０、２３３３−２３４３）、イー・コリｇｐｔ遺伝子（ファルクナーおよびモス（Falkner and Moss）、１９８８、ジャーナル・オブ・バイロロジー(J. Virol.)６４、１８４９−１８５４；ボイルおよびクパール（Boyle and Coupar）、１９８８、ジーン（Gene）６５、１２３−１２８）およびプラスミドｐＬＣ２００を生産するための多重クローニング部位を含有する、ワクシニア中間体ベクターｐＬＣ１のＢａｍＨＩにクローンした。
ＨＰＶ１６ Ｌ２遺伝子は、Ａｃｃ１でｐＨＰＶ１６を部分消化して断片（４１３８ｎｔ−５６６８ｎｔ）を得、これをクレノウで満たし、合成ＢａｍＨ１リンカーに連結することによって調製した。このＬ２断片を、合成ワクシニア２８Ｋ後期プロモーターを有するｐ４８０なるプラスミドに由来し、いくらか修飾した（デイビソンおよびモス（Davison and Moss）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）２１０、７７１−７８４）のＢａｍＨＩ部位にクローンした。プロモーターの配列は以下の通りである。

後期プロモーターのモチーフには下線を施した。２８Ｋプロモーターに連結したＬ２遺伝子を含有する断片をＳｓｔＩ／ＳａｌＩでの消化によって単離し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端化し、次いで、ｐＬＣ２００のＳｓｔＩおよびＳａｌＩ部位にクローンしてｐＬＣ２０１を得た（図１）。
図１において、ＨＰＶ１６ Ｌ１、Ｌ２（中空の箱形）はワクシニア後期プロモーター（塗り潰した箱形）の制御下にある。イー・コリ（E. coli）ｇｐｔ遺伝子（陰影を付けた箱形）は選択マーカーとして用いる。同種組換えのためのフランキング配列。転写の方向は矢印で示す。
次いで、ｐＬＣ２０１プラスミドを用いて、従前に記載されているごとくに（マケット（Mackett）ら、１９８４、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J. Virol.）、４９、８５７−８６４）組換えワクシニアウイルスを構築した。ミコフェノール酸、キサンチン、およびヒポキサンチンの存在下、プラークアッセイによって、組換えウイルスｐＬＣ２０１ＶＶおよびｐＬＣ２０２ＶＶを選択した（ファルクナーおよびモス（Falkner and Moss）、１９８８）。ＨＰＶ１６Ｌ１、ＨＰＶ１６Ｌ２を発現する組換えワクシニアウイルス（ＶＶ）を調製し、従前に記載されているごとくに用いた（ゾウ（Zhou）ら、１９９０、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J. Gen. Virol.）、８１、２１８５−２１９０）。
組換えプラスミドｐＬＣ２０１は、１９９２年３月２７日に、米国、マジソン州２０８５２、ロックビル（Rockville）、パークローン・ドライブ（Parklawn Drive）１２３０１番地、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託し、受託番号７５２２６が付与された。
組換えワクシニアウイルスｐＬＣ２０１ＶＶは、１９９２年４月３日に、米国、マジソン州２０８５２、ロックビル（Rockville）、パークローン・ドライブ（Parklawn Drive）１２３０１番地、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託し、受託番号ＶＲ２３７１が付与された。
ウイルス様粒子の精製
組換えウイルスｐＬＣ２０１ＶＶで感染させたＣＶ−１細胞を、感染後３２時間に、１０ｍＭトリス（ｐＨ９．０）中に収穫し、ダウンス（Dounce）のホモゲナイザーでホモジナイズした。ホモジナイズ物を２０００ｇでの遠心によって清澄化して、細胞夾雑物を除去し、３０％（wt／vol）ショ糖クッションに重ねた。ＳＷ３８ローター中、１１０，０００ｇにての９０分間遠心によって形成されたペレットを１０ｍＭトリス、ｐＨ９．０に懸濁し、２０−６０％不連続ショ糖勾配に重ねた。１００，０００ｇでの１８時間の遠心の後、０．２５ｍｌの１０の同等の画分を収集した。試料を０．６ｍｌエタノールと混合した。４℃における１２０００ｇでの２０分間の遠心の後に得られたペレットをさらに分析のために収集した。ウイルス様粒子の密度を測定するため、平衡密度勾配沈降をＣｓＣｌ（１．３０ｇ／ｍｌ）で行った。１２５，０００×ｇでの２０時間の遠心の後、０．２５ｍｌの１１の画分を収集した。各画分の密度を測定し、各々を透過型電子顕微鏡によってウイルス様粒子につき調べた。
図２Ａにおいて、細胞を、ｗｔ ＶＶ（レーン１）およびｐＬＣ２０１ＶＶ（レーン２）で、１０ｐｆｕ／細胞にて感染させ、感染４８時間後に収穫した。Ｌ１蛋白はＨＰＶ１６ Ｌ１特異的ＭＡｂ Camvir １で検出した。５７ｋＤａ Ｌ１蛋白は矢印によって示す。すべての３つのレーンにおける、Camvir １の該３５ｋＤａ蛋白への結合は非特異的である。
図３において、ＨＰＶ蛋白Ｅ１およびＥ４をコードする遺伝子ならびにＨＰＶ１６ Ｌ１およびＬ２をコードする遺伝子を組み込んだｐＬＣ２０１ＶＶ（レーン２）、ｐＬＣ２０２ＶＶ（レーン３）またはｗｔ ＶＶ（レーン４）で感染させた細胞から抽出したＲＮＡを１．２％ホルムアルデヒド−アガロースゲル上で解像した。ＲＮＡをナイロン膜に移し、³²Ｐ−標識化Ｌ２プローブとハイブリダイズさせた。ホルムアルデヒド−処理したラムダＤＮＡ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断マーカーを示す（レーン１）。
電子顕微鏡
組換えワクシニアウイルスで感染させたＣＶ−１細胞を、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中の３％（vol/vo/）グルタルアルデヒドで固定し、１％四酸化オスミウムで後固定し、グレード物のアルコールで脱水し、エポキシ樹脂に埋め込んだ。薄い切片を切り出し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。ショ糖勾配からの画分をＥＭグリッド上に乾燥し、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）リンタングステン酸（ｐＨ７．０）で染色した。ＪＥＯＬ １２００Ｅｘ透過型電子顕微鏡を用い、画分を調べた。
図４Ａでは、ｐＬＣ２０１ＶＶで３２時間にて感染させたＣＶ−１細胞を示す。ＣＶ−１核において、ほぼ４０ｎｍ直径の粒子（矢印）が頻繁に見い出された。棒線は１００ｎｍに対応する。
図４Ｂでは、ショ糖勾配の画分５を示す。見た所、キャップソメアの規則的な配列からなるパピローマウイルス様粒子が観察された（矢印）。棒線は５０ｎｍに対応する。
ＨＰＶ ＯＲＦ産物の分析
ＨＰＶ１６ Ｌ１の発現は免疫沈降およびイムノブロットによって分析した。免疫沈降については、³⁵Ｓで代謝的に標識した組換えＶＶ感染ＣＶ−１細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液０．１％ＳＤＳ、１％トリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５μｇ／ｍｌアプロチニン、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中で溶解させた。Ｌ１特異的ＭＡｂ Camvir １（マクリーン（Mclean）ら、１９９０、ジャーナル・オブ・クリニカル・パソロジー（J. Clin. Pathol.））および¹²⁵Ｉ抗−マウスＩｇＧ（アメルスハム（Amersham））を用いる、部分的に精製したウイルス様粒子のイムノブロット分析を、２−メルカプトエタノールを含有する２×ＳＤＳゲル負荷緩衝液に可溶化した試料を用いて、従前に記載されているごとくに行った。ＨＰＶ１６ Ｌ２遺伝子発現の分析は図１３Ｂに示す。Ｎ−グリコシル化の分析については、部分的に精製したウイルス様粒子を１００μｌの緩衝液（０．２５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）まで採り、イムノブロッティングに先立って、３７℃で０．５ｕのEndoglycosidaseＦ（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Manheim））と１８時間反応させた。
ミコフェノール酸を用いて、ｇｐｔプラスミドｐＬＣ２０１につきワクシニアウイルス組換体を選択し、これをｐＬＣ２０１ＶＶと命名した。ｐＬＣ２０１ＶＶで感染させた細胞中でのＬ１の合成は、イムノブロッティングおよび免疫沈降によって確認した。Ｌ１蛋白はほぼ５７ｋＤａのオートラジオグラフィーでのバンドとして示された。これらの組換えウイルスで感染させたＣＶ−１細胞から抽出したＲＮＡのノーザンブロットにより、これらのウイルスいずれで感染させた細胞におけるＬ２ ｍＲＮＡ転写の高レベルが確認された（図３）。合成ワクシニアウイルス後期プロモーターからのＬ２の転写により、異種ノーザンブロットのパターンが得られた。何故ならば、ＶＶ後期ＲＮＡは特異的転写終止シグナルを使用しないからである。
ＣＶ−１細胞をｐＬＣ２０１ＶＶで感染させ、ウイルス様粒子について調べた。ｐＬＣ２０１ＶＶで感染させた細胞の薄い断面の電子顕微鏡写真は細胞核でほぼ４０ｎｍのウイルス様粒子を示したが、野生型ワクシニアのみで感染させた対照細胞は示さなかった。ほとんどの場合、これらの粒子は、核膜の近くで、鎖で連結されていた（図４ａ）。ＨＰＶ１６ Ｌ１のみ、またはＬ２のみを発現し、対応する蛋白（Ｌ１）またはｍＲＮＡ（Ｌ２）を産生した組換えワクシニアウイルスで感染させた細胞は、ウイルス様粒子を含有していなかった。同時に２つの異なる組換えワクシニアウイルス（これは、各々、ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１６ Ｌ２を発現した）で感染させた細胞は、いずれのＨＰＶウイルス様粒子も作製しなかった；Ｌ１蛋白およびＬ２ ｍＲＮＡはこれらの二重感染細胞のプールで同定できなかったが、個々の細胞内でのＬ１およびＬ２双方の同時合成は示されなかった。
図５において、ｐＬＣ２０１ＶＶで感染させたＣＶ−１細胞から得られた５つのＨＰＶ１６ウイルス様粒子をショ糖クッション上で遠心し、次いで、ＣｓＣｌ等密度沈降に付した。ウイルス様粒子（＋）は画分８および９に見い出された。画分８からのネガティブ染色した粒子の透過型電子顕微鏡写真はインサート中に示される。各の勾配画分の密度（ｇ／ｍｌ）が示される。
図６において、ＣＶ−１細胞を３２時間でｐＬＣ２０１ＶＶで感染させ、ウイルス様粒子をショ糖勾配で精製した。試料をエタノールで沈殿させ、一昼夜のエンドグリコシダーゼＦでの処理の後における抗−ＨＰＶ１６ Ｌ１抗体Camvir １、レーン１：精製したウイルス様粒子；レーン２および３；でのイムノブロッティングによって分析前にエンドグリコシダーゼＦで処理した。Ｌ１ダブレットは（＝）によって示し、脱グリコシル化Ｌ１は矢印によって示す。分子量マーカーは左側に示す。
電子顕微鏡によって観察されたウイルス様粒子がＨＰＶ１６ Ｌ１蛋白を含有することを確認するために、ｐＬＣ２０１ＶＶ感染細胞からの細胞抽出物を２０％−６０％ショ糖勾配中での部分的精製に付した。１０の画分を収集し、Ｌ１蛋白について調べた。画分３ないし７から、Ｌ１は検出することができ、画分５では、最高レベルのＬ１が見い出された。各画分をウイルス様粒子についてＥＭによって調べ：これらは画分５で観察された。リンタングステン酸ナトリウムでネガティブ染色した典型的なパピローマウイルスは、７２の規則的な密に詰められたキャップソメア（フィンチおよびクルーグ（Finch and Klug）、１９６５、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）１３、１−１２；ロウソンおよびマーヒィ（Rowson and Mahy）、１９６７、バクテリオル・レブ（Bacteriol. Rev.）３１、１１０−１３１）を有し、直径約５０ｎｍを有する。感染したＣＶ−１細胞から精製したウイルス様粒子の直径は３５ｎｍと４０ｎｍとの間で変化した。しかしながら、これらのウイルス様粒子はパピローマウイルスと同様のＥＭ外観を有し、キャップソメアの規則的配列が認められた(図４ｂ)。従って、ショ糖勾配の画分５で同定されたウイルス様粒子は空であって、ＨＰＶキャップソメアの正しくない会合配列であると推定された。ＣｓＣｌにおいて、ＨＰＶ１６ウイルス様粒子は約１．３１ｇ／ｍｌ（図５）で沈降し、透過型電子顕微鏡下で典型的な空のパピローマウイルスキャップシドの外観を示した（図５、インサート）。
ｐＬＣ２０１ＶＶ感染ＣＶ−１細胞から精製したウイルス様粒子のウェスタンブロットにおいてCamvir １は蛋白タブレットと同定された（図６）。ＨＰＬ１６ Ｌ１は４つの可能なＮ−グリコシル化部位を含有する（アスパラギン１５７、２４２、３６７および４２１）。該タブレットがＬ１ポリペプチドのグリコシル化変異体を表すか否かをテストするために、部分的に精製したウイルス様粒子を、ＤＳＤ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングに先立ち、エンドグリコシダーゼＦでの処理に付した。この結果、約５７ｋＤａの予期される分子量にて、わずかに低い見掛け分子量の単一のバンドによって該タブレットが置き換えられた（図６、レーン２、３）。
１．２９−１．３０ｇ／ｍｌの浮遊密度を持つＣｓＣｌ勾配の画分から収集したウイルス様粒子を、エライサ法アッセイにおいて抗原として用いた。ＶＬＰで免疫したマウスからのすべての抗血清は陽性であった（表２）。野生型ワクシニアで感染させたＣＶ−１細胞の溶解物で調製した密度勾配の同様の画分で免疫したマウスからの対照血清はウイルス様粒子と非反応性であった。ウイルス様粒子をエライサ法プレートにコートするための２つの異なるプロトコル（ディルナー（Dillner）ら、１９９１、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J. Virol.）６５、６８６２−６８７１）を用い、天然ＨＰＶウイルス様粒子との反応性を、破壊した粒子の部分的変性蛋白との反応性と区別する試みを行った。ＶＬＰに対して生起したマウス抗血清は天然（ＯＤ １．００±０．２０）および変性（ＯＤ １．６０±０．４５）粒子と同等に反応性であった。はっきりとしたＬ１エピトープに特異的な６のモノクローナル抗体のパネルは、天然ＶＬＰと弱い反応性（ＯＤ ０．０６４）のただ１つ（Camvir １）を包含し、天然粒子とよりも変性粒子（ＯＤ ０．１０７）とより反応性であることが判明し、これは、該反応性は天然ＶＬＰ調製中の変性Ｌ１蛋白とのものであることを示唆する。
図８において、¹²⁵Ｉ−標識抗−マウスＩｇＧを第２抗体として使用した。５７−ｋＤａ Ｌ１バンドは矢印によって示す。解説：ＶＬＰで免疫した個々のマウスからの血清：レーン１−５、ＢＡＬＢ／ｃ；レーン６−１０、Ｃ５７Ｂ１／６；レーン１１−１５、Ｂ１０Ａ；ＣＦＡで免疫した個々のマウスからの血清；レーン１６、ＢＡＬＢ／ｃ；レーン１７、Ｃ５７Ｂ１／６；レーン１８、Ｂ１０Ａ；抗−ＨＰＶ １６Ｌ１ＭＡｂ Camvir １、レーン１９。分子量は左側に示す。
ＨＰＶ１６のＬ１およびＬ２蛋白との抗−ＶＬＰ抗血清の反応性は、バクロウイルス組換えＨＰＶ１６ Ｌ１およびＬ２蛋白を用いるイムノブロットにより確認した。ウイルス様粒子で免疫したすべてのマウスからの血清、およびモノクローナル抗-ＨＰＶ１６ Ｌ１抗体の各々は、Ｌ１組換え−バクロウイルス−感染のエス・フルギペルダ(S. frugiperda)細胞溶解物で５７−ｋＤａ蛋白を認識し(図８)、野生型バクロウイルスで感染させたエス・フルネギペルダ(S. frugiperda)細胞の溶解物では匹敵する反応性は何等観察されなかった。Ｌ１蛋白との反応性の強度はマウス間で変動したが、すべての血清はイムノブロットの長い暴露と反応性であった。同様の結果がＬ２組換え−バクロウイルス−感染細胞溶解物で得られ：マウス抗−ＶＬＰ抗血清およびＬ２蛋白に対するウサギ抗血清は共に溶解物中の単一の蛋白と反応した。ＣＦＡ単独で免疫したマウスからの血清は、Ｌ１またはＬ２組換え−バクロウイルス−感染エス・フルギペルダ（S. frugiperda）の溶解物からの蛋白と反応しなかった。
実施例２：ＨＰＶ１６ Ｌ１の線状抗原性領域の明確化
ＶＬＰを用いる蛋白
さらなる一連の実験において、合成ＶＬＰを用いたＨＰＶ１６ Ｌ１キャプシド蛋白の線状抗原性領域を決定した。かかる実験において、３つのハプロタイプ（Ｈ−２^d、Ｈ−２^b、およびＨ−２^d/b）のマウスを、ＨＰＶ１６のＬ１およびＬ２蛋白についてのワクシニアウイルス二重組換え体用いて生産した、合成ＨＰＶ１６ウイルス様粒子（ＶＬＰ）で免疫した。得られた抗−ＶＬＰ抗血清は、エライサ法アッセイによるとＨＰＶ１６キャプシドを、イムノブロットではバクロウイルス組換えＨＰＶ１６ Ｌ１およびＬ２蛋白を認識した。ＨＰＶ１６ Ｌ１アミノ酸配列に対応する重複ペプチドを用いて、Ｌ１蛋白の免疫反応性領域を明確化させた。大部分のＬ１ペプチドは、合成ＨＰＶ１６キャプシドで免疫したマウスからのＩｇＧと反応性であった。コンピューターアルゴリズムにより、ＨＰＶ１６ Ｌ１には７つのＢエピトープがあり、このうち５つはマウス抗血清と強力に反応するペプチド内に存在すると予測された。マウス抗−ＶＬＰ抗血清は、組換えＬ１融合蛋白に対する他の物によって生起された抗−ＨＰＶ１６ Ｌ１モノクローナル抗体によって認識された２つのペプチドと反応しなかった。本発明者らは、ウイルス様粒子を用いて明確化させたＨＰＶ１６の免疫反応性エピトープは、組換えＨＰＶ１６ Ｌ１融合蛋白を用いて明確化させたものと有意に異なると結論したが、これは、かかる融合蛋白はＨＰＶ−感染患者におけるＨＰＶ１６ Ｌ１特異的免疫応答を捜し出すための抗原とはなり得ないであろうことを意味する。
ＨＰＶ１６キャプシドの生産
ワクシニアウイルスプロモーター４ｂ（天然）およびｐ４８０（合成）の制御下にあるＨＰＶ１６ Ｌ１およびＬ２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するプラスミドｐＬＣ２０１を用いて、後記することを除き従前に記載されているごとくに、組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ）ｐＬＣ２０１ＶＶを構築した。ＨＰＶ１６ウイルス様粒子は、従前に言及されているごとくにｐＬＣ２０１ＶＶ−感染ＣＶ−１細胞から調製したが、ワクシニアウイルスの集合および成熟を妨げるために、１００μｇ／ｍｌにてリファンピシンを含有する培地で細胞を培養した（モス（Moss）、「バイロロジー（Virology）」、６８５−７０３頁、ラベン（Raven）、ニューヨーク、１９８５；カラコスタス（Karacostas）ら、ＰＮＡＳ８６、８９６４−８９６７、１９８９）。感染した細胞を収穫し、凍結し、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）中のダウンス(Dounce)ホモゲナイズ化により解凍することによって溶解した。溶解物を２０００ｇでの遠心によって清澄化し、次いで、ＰＢＳ緩衝液中の２０％ショ糖クッション上、１０００００ｇにて２時間回転させた。ペレットをＣｓＣｌと混合して１．３０ｇ／ｍｌの初期密度として、１８°に、１００００ｇで１８時間遠心した。画分を収集し、エタノール沈殿させた蛋白でイムノブロットを行った。Ｌ１蛋白に陽性につきテストする画分をプールし、前記したごとき電子顕微鏡によってウイルス様粒子の存在が確認された。
抗血清の生産
５匹のマウスＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^d）、Ｃ５７Ｂ１／６（Ｈ−２^b）、およびＢ１０Ａ（Ｈ−２^b/d）の群を、ＣｓＣｌ勾配精製したＨＰＶ１６ウイルス様粒子で免疫した。皮下注射によって５μｇのキャプシド蛋白で動物を接種した。最初の注射はフロイントの完全アジュバントと共に投与し、３週間間隔にて３つのさらなる注射は生理食塩水中にて投与した。第４の注射後１４日目に、血清を収集し、−２０°で貯蔵した。野生型ワクシニアウイルスで感染させたＣＶ−１細胞から調製し、ｐＬＣ２０１ＶＶ感染細胞についてと正確に同じに加工した物質を用いて同一のプロトコルに従ってマウスの対照群を免疫した。
ペプチド
５つの残基だけ重複し、ＨＰＶ１６ Ｌ１蛋白の推定されるアミノ酸配列にわたる一連の１５量体（シードルフ（Seedorf）ら、１９８５、バイロロジー（Virology）１４５ １８１−１８５；パルトン（Parton）、１９９０、ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）１８ ３６３）を、標準的なプロトコルによるＦｍｏｃ化学（フィールズおよびノーベル（Fields and Noble）、１９９０、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプタイド・アンド・プロテイン・リサーチ（Int. J. Pept. Protein Res.）、３５ １６１−２１４）を用い、デュポン社製のＲａＭＰＳ多重ペプチド合成システムで合成し、次いで、グリタルアルデヒドでウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に連結した。Ｌ１蛋白におけるアミノ酸（ａａ）の位置を調べるために、推定される第１の開始コドンをアミノ酸番号１とした（表１）。技術的な理由により、ａａ５２１−５３１に対応するＣ−末端ペプチドを使用しなかった。用いたすべてのペプチドは、ＨＰＬＣ分析で判断して、８５％純度を超えるものであった。
組換えＬ１＋Ｌ２蛋白
ＨＰＣ１６Ｌ１またはＨＰＶ１６Ｌ２ ＯＲＦを発現する組換えバクロウイルスを用いて昆虫ＳＦ９細胞を感染させた。２５°での３日間のインキュベーションの後、１４０００ｇにおける５分間の遠心によって細胞をペレット化した。該ペレットをＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６；２ｍＭ ＥＤＴＡ；５０ｍＭ ＮａＣｌ；１％デオキシコレート；１％トリトンＸ−１００；０．２５％ＳＤＳ；１％アプロチニン；１ｍＭ ＰＭＳＦ）に溶解した。
ウェスタンブロット
ウイルス様蛋白または組換えＬ１もしくはＬ２蛋白を、２％ＳＤＳ／ＤＴＴを含有する２×負荷緩衝液と混合し、５分間沸騰させた。蛋白を１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースフィルターにブロットした（トウビン（Twobin）ら、１９７９、バイロロジー（Virology）１７５ １−９）。フィルターを切片に切断し、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡにて、３７°で１時間インキュベートした。ブロックした切片を種々のマウス抗血清(１：２００)またはモノクローナル抗体に４°で一昼夜暴露した。反応性蛋白を、¹²⁵Ｉ−連結抗−マウスＩｇＧ（０．２μＣｉ／ｍｌ）（アメルスハム（Amersham））との反応の後にオートラジオグラフィーによって可視化した。
エライサアッセイ
従前に記載されているごとくに（クリステンセン（Christensen）ら、１９９０、ＰＮＡＳ ７６ ４３５０−４３５４、コウサート（Cowsert）ら、１９８７、ＪＮＣ１ ７９ １０５３−１０５７）、酵素免疫法（エライサ）によって、ポリクローナル抗血清を合成ＨＰＶ１６キャプシドとの反応性についてテストした。「生の」合成ＨＰＶ１６キャプシドでのアッセイにつき、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中の１００ｎｇの蛋白を、３７°での１時間のインキュベーションによって各エライサプレートウェル（フロウ・ラブズ（Flow Labs））に付着させた。「変性した」粒子についてのアッセイでは、該粒子を炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６に懸濁し、３７°にて一昼夜プレートに吸着させた。すべての引き続いてのインキュベーションは室温で行った。該プレートをＰＢＳで洗浄し、非付着部位をブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の５％ミクル粉、ｐＨ７．５）中の１時間のインキュベーションによってブロックした。予め野生型ＶＶ−感染ＣＶ−１細胞抽出物で吸着させたマウス抗血清（１：２００）を添加し、１時間インキュベートし、該プレートをＰＢＳで洗浄させた。ブロッキング緩衝液中の１：１０００希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ−連結抗−マウスＩｇＧ（シグマ（Sigma））を添加し、１時間インキュベートし、続いてＰＢＳで１０回洗浄した。ＡＢＴＳ（ベーリンガー（Boehringer））およびＨ₂Ｏ₂を含有する基質緩衝液（ｐＨ４．６）を添加し、１５分後にＯＤ ４１５で読み取った。
線状Ｂエピトープのマッピング
エライサ法によって、重複するＨＰＶ１６ Ｌ１ペプチドの組に対して免疫化した動物からの抗血清をスクリーニングすることによってＢエピトープを同定した。ＢＳＡにカップリングさせた合成ペプチドを１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．３）に稀釈し、４°で一昼夜エライサ法プレートに吸着させた。ＰＢＳ中の３％ＢＳＡを用い、プレート上の残存する結合部位のブロッキングを３７°で２時間行った。希釈したマウス抗血清（１：５００）を室温にて２時間、被覆されたプレートとともにインキュベートした。該プレートを、ツイーン（Tween）２０（０．１％）を含有するＰＢＳで洗浄し、ペルオキシダーゼ−連結抗−マウスＩｇＧ（１：１０００）（シグマ（Sigma））またはＩｇＡ（１：２０００）（シグマ（Sigma））とともに２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、４１５ｎｍで吸光度値を記録する前に、基質緩衝液(ｐＨ４．６)中の０．５ｍｇ／ｍｌＡＢＴＳで１５分間展開した。テスト血清でのＯＤ４１５値が対照血清についての平均値を超えて３ＳＤよりも大きければ、ペプチドは反応性と考えられ；これは、０．２６０のカットオフ値を与えた。対照血清で得られた平均ＯＤ４１５（０．５５）の５倍のＯＤ４１５は、主要な反応性エピトープを定義すると考えられた。
モノクローナル抗体および抗血清
ＨＰＶ１６Ｌ１融合蛋白に対して生起した５種のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を用いた。ＭＡｂ ５Ａ４、１Ｄ６、３Ｄ１、および８Ｃ４（ケイソン（Cason）ら、１９８９、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J. Gen. Virol.）７０ １２９７６−２９８７）は英国ロンドンのフィル・シェファード（Phil Shepherd）博士から提供され、ＭＡｂ Cambir １（マクリーン（McLean）ら、１９９０、ジャーナル・オブ・クリニカル・パソロジー（J. Clin. Pathol.）４３ ４８８−４９２）はシイ・マクリーン（C. McLean）博士（ケンブリッジ大学、病理学部）から入手した。ＨＰＶ１６ Ｌ２−Ｔｒｐ−Ｅ融合蛋白に対するウサギ抗血清はデニゼ・ガロウェイ（Denise Galloway）博士（ワシントン大学、シアトル）から提供された。
アミノ酸配列分析および抗原性指標の予測
抗原性指標(Ａ１)（ジェイムスンおよびウェルフ(Jameson and Wolf)、１９８８、コンプ・アプル・バイオサイ（Comp. Appl. Biosci.）４ １８１−１８６）は、ペプチド配列が抗原性である確率の測定である。それは、二次構造のいくつかの重みを付けた測定を合計することによって計算される。予測されるＨＰＶ１６ Ｌ１配列についての値は、PLOTSTRUCTUREソフトウェアを用いて計算される。
図９および１０において、ＨＰＶ１６ Ｌ１の配列に対応する一連の重複ペプチドとのエライサ法における血清の反応性(ＯＤ４１５)が示される。ＨＰＶ１６Ｌ１配列（表１）に対応するペプチド数を示す。
図１１および１１Ａにおいて、アミノ酸についてのナンバリングシステムは第１の推定開始コドンからのＨＰＶ１６ Ｌ１に対応する。１．５を超えるＡＩ値の領域が示される。
図１２において、その中にＢエピトープがマッピングシステムの範囲にあることが示されるＨＰＶ１６ Ｌ１の領域を示す。ＶＬＰ(粒子)で免疫したマウスからの血清での結果、および頸部癌を持つヒトからの血清中のＩｇＡおよびＩｇＧ抗体（ヒトＩｇＡおよびヒトＩｇＧ）（ディルナー（Dillner）ら、１９９０、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Int. J. Cancer）４５ ５２９−５３５）での結果は、重複するペプチドを用いて得られた。ＯＤが０．５５を超えた場合、マウス抗ＶＬＰ抗血清はペプチドと有意に反応性が保持された。Ｌ１融合蛋白で免疫したウサギ（ウサギ血清）（ミュラー（Muller）ら、１９９０、ジャーナル・オブ・ジョネラル・バイロロジー（J. Gen. Virol.）７１ ２７０９−２７１７）からの結果をプロットする：これらは、一連の部分長発現クローンを用いて決定し、その中にエピトープがある配列の全長を示す。また、アルゴリズムで予測されるＢエピトープ（コンピューター）（ジェイムソンおよびウォルフ（Hameson and Wolf）、コンプ・アプル・バイオサイ（Comp. Appl. Biosci.）４ １８１−１８６、１９８８）および公表されている抗−ＨＰＶ１６ Ｌ１モノクローナル抗体（Monoclonals）（ケイソン（Cason）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー(J. Gen. Virol.)７０ ２９７３−２９８７；マクリーン(McLean)ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・パソロジー(J. Clin. Pathol.)４３ ４８８−４９２、１９９０）によって認識されるエピトープを示す。スケールは、５３１ａａ Ｌ１蛋白に沿ったエピトープの位置を示し、Ｎ−末端メチオニン（残基１）からナンバー付けする。ペプチドを含有する各エピトープについては、Ｎ−末端メチオニンに対する正確な位置も示す。
５つのａａの重複で蛋白の全長をカバーする、ＨＰＶ１６ Ｌ１蛋白の一連の１５量体合成ペプチドを用いて、種々の免疫血清によって認識されるＬ１中のエピトープを明確化させた。３つのテストした近交系マウス株からの１６の抗血清の各々。ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^d）、Ｃ５７Ｂ１／６（Ｈ−２^b）、およびＢ１０Ａ（Ｈ−２^b／d）は、Ｌ１蛋白の多重線状ペプチドを認識し、ＨＰＶ１６ Ｌ１からの実質的に同一のペプチドはすべてのテスト株によって認識された（図１０）。５つの個々の血清は各株からテストした。血清でのＯＤが平均値＋陰性対照血清のＯＤの３ＳＤより大きいと、ペプチドを反応性とし；これは、０．２６０の反応性についてのカットオフを与えた。ＣＦＡ単独で免疫したマウスからの血清は、すべてのＬ１ペプチドでの０．２６０未満のＯＤ４１５反応性を有していた。いくらかの変動が、所与の株からの各抗−ＶＬＰ血清の各ペプチドとの反応性の強度で観察されたが、各ペプチドはマウスの各株からの抗−ＶＬＰ血清のすべてと反応性であるか（ＯＤ＞０．２６０）、いずれとも反応性ではなかった。抗−ＶＬＰ血清中のペプチド特異的抗体のイソタイプはＩｇＧおよびＩｇＡ特異的抗−マウス免疫グロブリン抗体を用いて調べた。ＩｇＧ応答は示す通りであり（図９および１０）、有意なＩｇＡ反応性はいすべれのペプチドに対しても検出されなかった（ＯＤ＜０．０５０）。ほとんどのペプチドは抗−ＶＬＰ血清と反応性であるので、平均陰性値の５倍の任意ＯＤ値を用いてＬ１蛋白の主要反応性領域を明確化させ：主要免疫反応性Ｌ１ペプチドはＬ１蛋白の長さに沿って均等に分布し、７つは当該分子のアミノ末端の３番目で見られ、７つは中央の３番目で見られ、８つはカルボキシ末端の３番目で見られた。対照的に、ＨＰＶ１６ Ｌ１につき特異的なモノクローナル抗体は従前に記載されているごとく（ケイスン（Cason）ら、前掲、マクリーン（McLean）ら、１９９０、前掲）単一の主要線状エピトープを認識した。５つのうち４つの反応性抗−ＨＰＶ１６ Ｌ１モノクローナル抗体（５Ａ４、１Ｄ６、３Ｄ１、８Ｃ４）はペプチド３０（２９１−３０５）と反応性である一方、Camvir １はペプチド２４（２３１−２４５）を認識した（図１１および１１Ａ）。ウイルス様粒子で免疫したマウスからの血清はこれらのいずれの粒子とも反応しなかった。
アルゴリスムを用いて、予測される蛋白二次構造に基づき、ＨＰＶ１６Ｌ１のＢエピトープを同様に推定した。可能な抗原性領域は、鎖のフレキシビリティ、高接近性および高度な親水性に基づいて、抗原性指標（Ａ１）（ジェイムソンおよびウォルフ(Jameson and Wolf)、１９８８、前掲）として計算した（図１１）。Ａ１値が１．５を超える領域は予測されるＢエピトープとみなした。７つのかかる領域（アミノ酸７９−８４、１０５−１０８、１２０−１２２、１３４−１３５、２６７、２６９、２９８−２９９、３６３−３６７）が見い出され、これらの７つの領域のうち５つは、合成ＨＰＶ１６キャプシドで免疫したマウスからの抗血清で主要反応性が見られた２２ペプチド内にあった。異なる入手源からの抗血清のＢエピトープ特異性の合計を図１２に示す。
実施例１−２をさらに考慮すると、パピローマウイルスは、一般に、感染したケラチノサイト中にビリオンを生ずることに注意すべきであり、これは、電子顕微鏡によって容易に同定でき（アルメイダ（Almeida）、１９６２、ジャーナル・オブ・インベスティガティブ・デルマトロジー（J. Invest. Dermatol.）３８、３３７−３４５）、ある場合には精製でき、感染性であることが示される（ロウソンおよびマヒィ（Rowson and Mahy）、１９６７、バクテリアル・レオ（Bacterial. Reo.）３１、１１０−１３１）。しかしながら、ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＬ２後期遺伝子の転写は分化した生殖器上皮で起こり（クルム（Crum）ら、１９８８、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J. Virol.）６２、８４−９０）、またＬ１転写はこれらの組織で免疫反応性Ｌ１蛋白を生じる（スタンレイ（Stanley）ら、１９８９、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Int. J.Cancer）４３、６７２−６７６）にも拘わらず、ＨＰＶ１６ビリオンはＨＰＶ１６感染頸部上皮組織で見られない。本明細書では、本発明者らは、上皮細胞におけるＨＰＶ１６ Ｌ１およびＬ２遺伝子の発現は、ＨＰＶ１６ビリオン様粒子の集合を可能とするのに必要である共にそれで十分であり、かくして、ＨＰＶ１６のＬ１およびＬ２蛋白はビリオン集合に関して欠陥があるのではないことを示した。組織におけるＨＰＶ１６後期遺伝子の発現は上皮環境によって厳格に調節されているようである（タイキマン（Taichman）ら、１９８３、ジャーナル・オブ・インベスティガティブ・デルマトロジー（J. Invest., Dermatol.）１、１３７−１４０）。in vivoにてＨＰＶ１６ビリオンを検出できないことは、Ｌ１およびＬ２の転写ならびにＬ１の翻訳にも拘わらず、頸部上皮細胞におけるＬ２産生への後転写ブロック、あるいはビリオン集合の阻害剤いずれかがあることを示唆する。頸部組織に由来する、細胞系Ｗ１２を含有するＨＰＶ１６において、細胞がマウスのミクロ環境でin vivoの末端分化を受けると、ウイルス様粒子が観察され（スターリング（Sterling）ら、１９９０、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J. Virol.）６４、６３０５−６３０７）、これは、かかる細胞はビリオンの集合に対してブロックしないこと、およびＬ２の不十分な翻訳または他の知られていない理由で、頸部組織においてＨＰＶ１６ビリオンを示すことができないのが説明されることを示唆する。
本発明者らのＥＭ実験は、空のＨＰＶ１６ビリオンは他のパピローマウイルスよりも小さい約４０ｎｍの平均サイズを有するが、ウサギ・パピローマウイルス（フィンチおよびクルーグ（Finch and Klug）、１９６５、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、１３、１−１２）、またはヒト・イボウイルス（ロウソンおよびマーヒィ（Rowson and Mahy）ら、１９６７、前掲）のごとき他のパピローマウイルスと比較して同様の表面構造を有することを示す。沈降は、約１．３１ｇ／ｍｌの空のキャプシド密度、無傷ＨＰＶ１ａビリオンについての約１．３６ｇ／ｍｌと比較して空のパピローマウイルスに予測される密度を示した（ドーバーおよびガリモア（Doorbar and Gallimore）、１９８７、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J. Virol.）、６１、２７９３−２７９９）。
ＨＰＶからのＬ１蛋白は可能なグリコシル化部位を有し、また精製したＢＰＶ粒子は、その移動度がエンドグリコシダーゼ処理に感受性であるＬ１の少量の電気泳動形態を有する（ラルセン（Larsen）ら、１９８７、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J. Virol.）、６１、３５９６−３６０１）。ＨＶＰ １ａからのＬ２およびＨＰＶ１１はダブレットであることが観察されており（ローズ（Rose）ら、１９９０、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J. Gen. Virol.）、７１、２７２５−２７２９；ドーバーおよびガリモア（Doorbar and Gallimore）、１９８７、前掲；ジン（Jin）ら、１９８９、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J. Gen. Virol.）、９０、１１３３−１１４０）、これはグリコシル化の差異のためとされている。本発明者らのデータは、ＨＰＶ１６キャップソメアにおけるＬ１蛋白もグリコシル化されており、２つの異なるグリコシル化状態が存在することを示す。
本明細書において、本発明者らは、合成ウイルス様粒子を用いて、真核細胞系で生産されたＨＰＶ１６キャプシド蛋白の免疫原性を研究した。真核細胞で生産されたパピローマウイルスのキャプシド蛋白は抗原提示の重要な決定基となり得る翻訳後修飾を受けたので（ブロウネ（Browne）ら、１９８８、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J. Gen. Virol.）６９、１２６３−１２７３；ゾウ（Zhou）ら、１９９１、バイロロジー(Virology)、１８５、６２５−６３２）、真核細胞で生産されたキャプシド蛋白を用いた。天然ＨＰＶ１６粒子は臨床的病巣、あるいは細胞培養におけるウイルス増殖から入手できないゆえ、組換えワクシニア発現ベクターを選択した。本発明者らは、ＨＰＶ１６ ＶＬＰを用いて、マウスにおいてポリクローナル抗−ＶＬＰ抗血清を生産し、これらの血清はエライサ法によると、ＨＰＶ１６キャプシドと強力に反応した。本発明者らは、イムノブロッティングにより、抗−ＶＬＰ抗血清は変性Ｌ１（図２）およびＬ２中のエピトープを認識したことを証明した。さらに、抗−ＶＬＰ血清は、Ｌ１の一連の５１の１５量体ペプチドにおいて２２の主要反応性ペプチドを明確化した。これらのデータは、ウイルス粒子に対して生起した抗血清は、それに拘わらず、線状決定基をしばしば認識することを示す。一組のＬ１ペプチドとの液性反応性のプロフィールは２つのＭＨＣ不一致マウス株を横切ってほとんど同一であり、これは、ここでテストしたマウス株においてＨＰＶ１６ Ｌ１蛋白に対する液性応答を決定するにおいてＭＨＣ制限が限定的でないＬ１中の充分なＴエピトープがあることを示唆する。
本発明者のマウス抗−ＶＬＰ抗血清で得られたＢエピトープ特異性についてのデータは、頸部形成異常を持つ婦人からの「免疫」血清の同様の研究（ディルナー(Dillner)ら、１９９０、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Int. J. Cancer）４５ ５２９−５３５）と比較することができる（図１２）。いくつかのペプチドは免疫ヒト血清および抗−ＶＬＰ抗血清双方によって認識されたが、マウス抗−ＶＬＰ抗血清と反応するペプチドの大部分は免疫ヒト血清と反応性でなかった（図１２）。Ｌ１−特異的モノクローナル抗体（ケイスン（Cason）ら、１９８９；マクリーン（McLean）ら、１９９０）によって認識されるＬ１の領域（２２１−２３５、２９１−３０５）のいずれも本発明者らのマウス抗−ＶＬＰ抗血清によって認識されなかった。Ｌ１融合蛋白をこれらのＭＡｂを生起させるのに用い、またヒト血清においてＬ１に対する抗体についてスクリーニングするのに用いたので、ヒト血清のＬ１融合蛋白との反応性の欠損（ジェニセン（Jenisen）ら、１９９０、

１９９０、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Int. J. Cancer）４８ ６８２−６８８）は、天然Ｌ１蛋白によってヒト免疫系に提示されたＬ１のエピトープをＬ１融合蛋白が示さないことにより説明され得る。
ペプチドでのＬ１蛋白に対する抗体についてのスクリーニングは線状エピトープのみを検出できる。
マウス血清における反応性が線状および立体配置決定基双方に対して向けられているか否かを決定する試みにおいて、本発明者らは、２つの方法でテスト粒子につきエライサ法を行った：１つは、天然粒子を保持すると言われているもので、もう１つは変性蛋白を生産すると言われているものである（ディルナー(Dillner)ら、１９９１、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J. Virol.）、６５、６６８２−６８７１）。本発明者らは、１または他の方法で処理した粒子と絶対的に反応性のいずれの血清またはモノクローナル抗体も見い出さなかったが、１つのＭＡＢ（Camvir １）は、変性された「生の」粒子とより強力に反応した。変性粒子との大部分のＭＡｂの反応性の欠損は、同一抗体はウェスタンブロットにて変性蛋白と反応するので、それらは部分的に変性されたにすぎないことを示唆する。逆に、天然粒子とのCamvir １の反応性は、この抗体によって認識される線状エピトープは天然粒子調製中にいくらかの量で存在する変性Ｌ１蛋白を認識するとの証拠とはならず、本発明者らは、無傷ＶＬＰは本発明者らのエライサ法条件下で保持されるという証拠を有しない。
ほとんどの抗体は、いくつかの非近接ポリペプチド配列（アミト（Amit）ら、１９８６、サイエンス（Science）２３３、７４７−７５３）を含み得る立体配置依存性決定基（ベンジャミン（Benjamin）ら、１９８４、アヌ・レブ・イミュノル（Ann. Rev, Immunol.）２、６７−１０１）を認識するので、ＨＰＶ１抗血清について示されているように（ステーレおよびガリモア（Steele and Gallimore）、１９９０、バイロロジー（Virolgy）、１７４、３８８−３９８）、ビリオンに対し誘導された抗体は融合もしくは変性蛋白ならびに天然蛋白を認識しないようである。いくつかの皮膚イボ関連ＨＰＶのビリオンは、イボペアリング（paring）につき、血清学アッセイに十分な量で入手可能である（アルメイダおよびゴフェ（Almeida and Goffe）、１９６５、ランセット（Lancet）２、１２０５−１２０７；キーンツラー（Kienzler）ら、１９８３、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・デルマトロジー（Br. J. Dermatol.）１０８ ６６５−６７２；フィスターおよびツル・ハウゼン（Pfister and Zur Hausen）、１９７８、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー(Int. J. Cancer)２１ １６１−１６５；ピルソネン（Pyrhsonen）ら、１９８０、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・デルマトロジー（Br. J. Dermatol）１０２ ２４７−２５４；パスおよびマイツェル（Pass and Maizel）、１９７３、ジャューナル・オブ・インベスティガティブ・デルマトロジー（J. Invest. Dermatol.）６０ ３０７−３１１）。ヒト免疫血清における精製したビリオンに対する抗体の罹患率は、用いた検出系に応じて、２０（ジェンナー（Genner）、１９７１、アクタ・デルム・ベネレエル（Acta. Serm. Venereol.）（Stockh）５１ ３６５−３７３）から８８％（モリソン（Morison）、１９７５、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・デルマトロジー（Br. J. Dermatol）９３ ５４５−５５２）変動する。しかしながら、最近まで、性器ＨＰＶタイプのビリオンは血清学的研究には入手できなかった。ヌードマウス異種移植系（クレイダー（Kreider）ら、１９８７、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J. Virol.）６１ ５９０−５９３）は、ヒト抗体の検出用のＨＰＶ１１粒子の生産を可能にした（ボネツ（Bonnez）ら、１９９１、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J. Gen. Virol.）７２ １３４３−１３４７）。本発明者らは、本明細書に記載したＨＰＶ１６ ＶＬＰは天然ＨＰＶ１６粒子に対する血清反応性と同様の研究が進展するのを可能し、ＨＰＶ１５Ｌ１融合蛋白に対するヒト血清中の反応性の欠損の観察（ジェニセン（Jenisen）ら、１９９１、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J. Virol.）６５ １２０８−１２１８；

１９９１、前掲）は、ＨＰＶ１での同様の観察（ステーレおよびガリモア（Steele and Gallomore）、１９９０、バイロロジー（Virol.）、１７４、３８８−３９８）に単純に類似すると予測する。
ＢＰＶ構造蛋白に対する抗体はウイルス中和活性を有しており（ピラチンスキー（Pilacinsky）ら、１９８６、チバ・ファウンド・シンポ(Ciba Found. Symp.）、１２０、１３６−１５６）、また精製したＨＰＶ１１ビリオンに対して生起した抗血清も胸腺欠損マウス異種移植系で感染性ＨＰＶ１１を中和できる（クリステンセンおよびクレイダー（Christensen and Kreider）、１９９０、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J. Virol.）、６４、３１５１−３１５６）。本発明者らの結果は、精製した合成ＨＰＶ１６キャプシドは免疫原性であり、この腫瘍ウイルスに特異的なウイルス中和抗体を生産し、および評価するのに使用できることを示す。エシェリキア・コリ（Esherichia coli）で発現されるＢＰＶ１ Ｌ１蛋白およびＢＰＶ粒子は共にイボの発生からウシを保護した（ピラチンスキー（Pilacinsky）ら、１９８６；ジャレット（Jarrett）ら、１９９０、ベテリナシ・レク（Wet. Rec.）１２６ ４４９−４５２）。ＨＰＶ１６ウイルス様粒子に対する同様の免疫応答はＨＰＶ１６−関連頸癌を予防する可能なワクチンのベースとなろう。
図１３Ａにおいて、ｐＬＣ２０１ＶＶでの注射後、ＣＶ１細胞溶解物を平衡勾配沈殿に付した。精製したウイルス様粒子を、リンタングステン酸でのネガティブ染色の後に透過型電子顕微鏡によって調べた［棒線＝１００ｎｍ］。
図１３Ｂにおいて、レーン１、野生型ウイルスで感染させたＣＶ−１細胞からの溶解物；レーン２、ウイルスｐＬＣ２０１ＶＶを発現するＬ１およびＬ２からの溶解物；レーン３、精製したウイルス様粒子。Ｌ２蛋白をウサギ抗ＨＰＶ１６ Ｌ２抗体、続いて¹²⁵Ｉ−蛋白Ａでプローブした。分子量は左側に示し、Ｌ２バントは矢印を付した。
図１３Ａおよび１３Ｂを参照し、ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＬ２二重組換えＶＶは、精製したＶＬＰおよびＶＶ組換えＬ２蛋白に対して生起したウサギ抗血清を用いるウェスタンブロットによって示したごとくＬ２蛋白を含有する。
実施例３：ＢＰＶ１ ＶＬＰ
ＢＰＶ１キャプシド蛋白についてのＶＶ組換体を用い、in vitroで同様に生産されたウシ・パピローマウイルス（ＢＰＶ）１ビリオンはＢＰＶ１ ＤＮＡをパッケージできることも確認した。Ｅ１ウイルス・オープンリーディングフレームの転写によって示すごとく、完全なビリオンは浸透可能なマウス線維芽細胞系を感染させることができ、感染は、ＢＰＶ１のキャプシド蛋白に対する抗体とのビリオンのインキュベーションにょって阻害される。ＨＰＶ１６についての観察とは対照的に、ウイルス様粒子は、ＢＰＶ１ Ｌ１キャプシド蛋白単独についてのＶＶ組換体で感染させた細胞で集合するが、Ｌ２蛋白は感染性ビリオンを生産するのにＢＰＶ１ ＤＮＡをパッケージする必要がある。
ＨＰＶ１６粒子の総じての形態は天然に存在するＨＰＶ１およびＢＰＶ１粒子とはむしろ異なるにも拘わらず、前記にて言及したＨＰＶ１６ ＶＬＰに関しては、これらの粒子は臨床的病巣から精製したＨＰＶ１およびＢＰＶ１粒子で観察されたものに典型的なキャツプソメアよりなるようである（ベイカー（Baker）ら、ジェイ・シイ・バイフィズ・ジェイ（J.C.Biophys.J.）、６０、１４４５−１４５６−１９９１、スタクエット（Staquet）ら、ジャーナル・オブ・デルマトロジカ（J. Dermatologica）１６２ ２１３−２１９、１９８１）。天然ＨＰＶ１６ビリオンは臨床的病巣から精製したものではなかったので、この形態学的差異がＨＰＶ１６、あるいは当該ビリオンを生産するのに使用した組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ）系の特性であるのか否かを確認するのが望ましいと考えられる。従って、一連のＶＶ、すなわちＨＰＶ６、ＨＰＶ１１の、およびＢＰＶ１のＬ１およびＬ２キャプシド蛋白についての各二重組換体を作製した。これらの二重組換体の各々でのＣＶ−１細胞の感染により、ウイルス様粒子が生産され、これらは標品ＨＰＶ１およびＢＰＶ１ビリオンにＨＰＶ１６粒子よりも似ている。天然ＢＰＶ−１粒子は形態学的にかつ免疫学的によく特徴付けられており（チェン（Chen）ら、ベイカー（Baker）ら、１９９１、コウサート（Cowsert）ら、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート(J. Natl. Cancer Inst.)、７９、１０５３−１０５７）、ＢＰＶ−１ ＤＮＡのエピソーム複製について許容される細胞系が入手可能であるので（ロー（Law）ら、１９８１、ＤＮＡＳ、７８、２７２７−２７３１）、本発明者らはＢＰＶ−１粒子を研究するのを選択した。
図１３Ｃにおいて、ＢＰＶ１Ｌ１はｐ４ｂ天然ワクシニア後期プロモーターから発現され、またＬ２はｐ４８０合成ワクシニア後期プロモーターから発現される。該イー・コリ(E. coli)ｇｐｔ遺伝子を選択マーカーとして用いる。フランキング配列はワクシニアＢ２４Ｒ遺伝子であり、これは、同種組換えについてのワクシニア配列を提供する。ＢＰＶ１ Ｌ１およびＬ２遺伝子はプラスミドｐｍｌ−１からＰＣＲによってクローンした。ＢＰＶ１ゲノムを線状化し、ＢＰＶ１ Ｌ２ ＯＲＦ中のＢａｍＨＩ部位にてこのプラスミドにクローンしたゆえ、ＢＰＶ１ゲノムはＢａｍＨＩ消化によってｐｍｌ−１からまず単離し、再環化し、環化したＢＰＶ−１ ＤＮＡをＰＣＲ鋳型として用いた。Ｌ１増幅について用いたオリゴヌクレオチドプライマーは：

であった。ＢａｍＨＩ部位に下線を施し、第１のメチオニンおよび停止コドンは裸で表す。Ｌ２増幅についてのオリゴヌクレオチドプライマーは：

であった。Ｂｇｌ II部位に下線を施し、第１メチオニンおよび停止コドンは裸で表す。増幅した１４７８ｂｐ Ｌ１断片をプラスミドＰＫ１９中のＢａｍＨＩ部位にクローンしてＰＫ１９ＢＰＶＬ１を得た。Ｌ１遺伝子およびワクシニア４ｂプロモーターを、ＭｌｕＩおよびＳｍａＩでの消化によってこのプラスミドから単離し、プラスミドｐＳＸ３に移してｐＳＸＢＰＶ１を得た。１４０９ｂｐ Ｌ２断片をＢｇｌ ＩＩで消化し、プラスミドｐ４８０中のＢａｍＨＩにクローンしてｐ４８０ＢＰＶＬ２を得た。合成ワクシニア後期プロモーターおよびＢＰＶ Ｌ２遺伝子をこのプラスミドからｐＳＸＢＰＶＬ１中のＳｍａｌ部位にクローンして二重組換えプラスミドｐＳＸＢＰＶＬ１Ｌ２を得た。ｐＳＸＢＰＶＬ１またはｐＳＸＢＰＶＬ１Ｌ２ ＤＮＡを、野生型（ｗｔ）ＶＶ ＷＲ株で感染させたＣＶ−１の単層にトランスフェクトして、ｒＶＶ ｐＳＸＢＰＶＬ１ＶＶ（Ｌ１発現）およびｐＳＸＢＰＶＬ１Ｌ２ＶＶ（Ｌ１およびＬ２発現）を得た。組換えワクシニアウイルスをミコフェノール酸の存在下で３回精製した。精製に続き、組換体の大規模調製を行い、これらの実験を通じて使用した。
図１４Ａにおいて、ワクシニア感染細胞中の組換えＢＰＶ１ Ｌ１の免疫沈降分析を示す。ＣＶ−１細胞を１０ｐｆｕ／細胞にてｗｔワクシニアウイルス（レーン１）；ｐＳＸＢＰＶＬ１ＶＶ（レーン２）；ｐＳＸＢＰＶＬ１Ｌ２ＶＶ（レーン３）で感染させ、感染後４８時間に収穫した。ＢＰＶ１Ｌ１蛋白をＢＰＶ１特異的ウサギ抗血清で検出した。５８ｋＤａのＬ１蛋白を矢印で示す。
図１４Ｂにおいて、ＢＰＶ１ Ｌ２発現のノーザンブロット分析を示す。ｗｔ ＶＶ（レーン１）；ｐＳＸＢＰＶＬ１Ｌ２ＶＶ（レーン２）で感染したＣＶ−１細胞から抽出したＲＮＡをＢＰＶ１ Ｌ２遺伝子でプローブした。Ｌ２同種転写体の可変長はＶＶプロモーターから発現された転写体に典型的である。免疫沈降については、ｒＶＶで感染させた細胞をＲＩＰＡ緩衝液（０．１ＳＤＳ、１％トリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５μｇ／ｍｌアプロチニン、１０ｍＭ トリス、ｐＨ７．４）で溶解した。可溶性蛋白を、１：１０００希釈にて、ウサギ抗ＢＰＶ１抗体（ダコ（ＤＡＫＯ）、グロストラップ(Glostrup））で免疫沈降させた。沈殿した蛋白をプロテイン−Ａセファロースで収集し、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースフィルターにブロットした。スキムミルクでブロッキングした後、フィルターを抗ＢＰＶ１血清（１：１０００）、続いて¹²⁵Ｉ−蛋白Ａ（０．１μＣｉ／ｍｌ）に暴露し、オートラジオグラフィーによって可視化した。合計ＲＮＡを細胞から抽出し、前記したごとくにＣｓＣｌを通しす遠心によって精製した。合計ＲＮＡ（トラック当たり３０μｇ）を１．２％ホルムアメデヒド−アガロースゲルで泳動させ、³²Ｐ−標識ＢＰＶ１ Ｌ１遺伝子でプローブした。
図１５Ａにおいて、ｐＳＸＢＰＶＬ１Ｌ２ＶＶを参照されたし。ｐＳＸＢＰＶＬ１Ｌ２ＶＶで感染させたＣＯＮ／ＢＰＶ細胞からのいくらかの粒子は電子密度コアを有する（インサート）。
図１５Ｂにおいて、ｐＳＸＢＰＶＬ１ＶＶを参照されたし。（Ａ）における汚染ワクシニアウイルスは「Ｖ」で示す。尺度用の棒線は５０ｎｍを示す。細胞を感染後２日に収穫し、ＰＢＳで洗浄し、凍結によって溶解し、３回解凍し、ＰＢＳ中で超音波処理した。細胞夾雑物を低速遠心によって除去し、上澄みを２０％（ｗ／ｖ）ショ糖クッションに重ね、１００，０００×ｇにて２時間遠心した。ペレットをＰＢＳに再懸濁し、１％（ｗ／ｖ）リンタングステン酸（ｐＨ７．０）でネガティブ染色した後、ＪＯＥＬ １２００ＥＸ電子顕微鏡で分析した。
標品ＢＰＶ１粒子におけるＬ１のＬ２蛋白に対する比はほぼ５：１（フィスター，エイチ（Phister,H.）およびフックス・イー（Fucks,E.）、パピローマウイルスおよびヒトの病気（Papillomaviruses and human disease）（シルヤネン，ケイ、ギスマン，エルおよびコス，エル・ジイ（Dyrjannen,K.,Gissman,L & Koss,L.G.）１−１８巻（シュプリンゲル−フェアラーク（Springer-Verlag）、ベルリン、１９８７）であるので、本発明者らは、我々の二重組換えＶＶにつき、Ｌ１遺伝子についての強力な合成プロモーターおよびＬ２遺伝子電子についての弱い合成プロモーター（図１３Ｃ）を用い、ｒＶＶ感染ＣＶ−１細胞からのノーザンブロットで得られたＬ２ ｍＲＮＡに対するＬ１ ｍＲＮＡの比はほぼ１０：１であった。このｒＶＶで感染させたＣＶ−１細胞はＢＰＶ１ Ｌ１蛋白（図１４Ａ）およびＬ２ ｍＲＮＡ（図１４Ｂ）を発現し、明らかに標品形態（図１５ａ）の多数の５０ｎｍ二十面体ウイルス様粒子を感染細胞から精製できた。ＨＰＶ１６に関する本発明者らの仕事は、Ｌ１およびＬ２蛋白には前記したごときＨＰＶ１６ウイルス様粒子の集合が必要であることを示し、これは、パピローマウイルス（カジガワ（Kajigawa）ら、１９９１、ＤＮＡＳ、４６４６−４６５０）、ブルータングウイルス（ロウドン（Loudon）ら、１９９１、ＤＮＡＳ、バイロロジー（Vorolgy）、１８２、７９３−８０１）、およびポリオーマウイルス（サルンケ（Salunke）ら、１９８６、セル（Cell）、４６、８９５−９０４）については、主要キャプシド蛋白単独が組換え蛋白として発現されるならば、ウイルス様粒子が細胞中で集合するという観察と対照的である。従って、本発明者らは、ＢＰＶ１ Ｌ１につきＶＶ組換体を生産し(図１３Ｃ)、ＣＶ−１細胞をこのＶＶで感染させた場合に、Ｌ１およびＬ２二重組換えＶＶで得られたのと同様の形態のウイルス様粒子が精製できることを観察した(図１５ｂ)。同様の空の二十面体ビリオンが、ＨＰＶ６またはＨＰＶ１１のＬ１蛋白についてのＶＶ組換体でのＣＶ−１細胞の感染の後に得られた。ＨＰＶ１６Ｌ１およびＬ２ｒＶＶで感染させた細胞における形態学的標品ＰＶビリオンの欠如、および電子顕微鏡によってＨＰＶ１６Ｌ１感染組織で見られたＰＶビリオンの欠如（シュナイダー（Schneider）、（１９８７）、パピローマウイルスおよびヒトの病気（Papillomaviruses and Human Disease）１９−３９巻、シュプリンゲル・フェアラーク（Springer Verlag）、ベルリン）は、他のＰＶとは対照的に、ＨＰＶ１６はウイルスキャプシド形成に関して欠如しているらしいことを示唆する。
ＶＰＶ１ Ｌ１／Ｌ２ ｒＶＶで感染させた細胞からのウイルス粒子の大部分を図１５ａインサートに示す。
ＨＰＶ１１Ｌ１／Ｌ２およびＨＰＶ６ｂＬ１／Ｌ２二重発現組換えワクシニアウイルスについてのクローニング戦略を以下に記載する。
ＨＰＶ１１Ｌ１については：

である。
ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩによって消化し、４ｂプロモーターの制御下にあるＲＫ１９にクローンした。次いで、プロモーター／１１Ｌ１配列を、クレノウによって平滑末端化したｐＳＸ３ ＢａｍＨＩ部位にクローンした。得られたプラスミドはｐＳＸ１１Ｌ１であった。
１１Ｌ２については：

である。
Ｂａｍ／Ｈ１／Ｓｍａ１消化のＰＣＲ断片を合成２８ｋ後期プロモーター下のｐ４８０にクローンした。次いでプロモーター／１１Ｌ２断片をｐＳＸ１１Ｌ１に移した。１１Ｌ１／Ｌ２二重組換え発現プラスミドをｐＳＸ１１Ｌ１／Ｌ２と命名した。
ＨＰＶ６ＢＬ１については：

である。
ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＳｍａＩで切断し、４ｂプロモーターの制御下にあるＰＫ１９にクローンした。次いで、プロモーター／６Ｌ１をｐＳＸ３にクローンしてｐＳＸ３６Ｌ１を得た。
ＨＰＶ６Ｌ２については：
ＨＰＶ６Ｌ２をＡｃｃｌ／Ｘｂａｌによって６ｂゲノムから単離した（４４２２−５９０３）。断片をクレノウによってブロットし、ｐ４８０に挿入した。合成２８ｋプロモーター＋６ｂＬ２をｐＳＸ６Ｌ１にクローンして二重組換えプラスミドｐＳＸ３６Ｌ１/Ｌ２を得た。
しかる後、プラスミドｐＳＸ１１Ｌ１およびｐＳＸ１１Ｌ１／Ｌ２を宿主細胞（例えば、ＣＶ１細胞またはＣ１２７細胞）に感染させてＶＶ ｐ ＳＸ１１Ｌ１およびＶＶ ｐＳＸ１１ Ｌ１／Ｌ２が得られ、それは、野生型ワクシニアウイルスで感染させた宿主細胞のトランスフェクションの後に、Ｌ１蛋白（ＶＶ ｐＳＸ１１Ｌ１由来）ならびにＬ１およびＬ２蛋白（ＶＶ ｐＳＸ１１Ｌ１／Ｌ２由来）を含有するＶＬＰを形成した。同様に、宿主細胞のトランスフェクションの後にＶＶ ｐＳＸ６Ｌ１およびＶＶ ｐＳＸ６Ｌ１／Ｌ２は、ＨＰＶ６ｂ Ｌ１を含有するＶＬＰならびにＨＰＶ６ｂ Ｌ１およびＨＰＶ６ｂ Ｌ２を含有するＶＬＰを生産した。
また、本発明が、その範囲内に、パピローマウイルスキャプシド蛋白Ｌ１およびＬ２についてのウイルス二重組換体ならびにパピローマウイルスキャプシド蛋白Ｌ１を含有する組換えウイルスを包含することは認識されるであろう。
さらに、本発明が、その範囲内に、蛋白Ｌ１およびＬ２を含有するＶＬＰ粒子の検出工程を包含するエライサ法によるパピローマウイルス感染の診断法を包含することも認識されるであろう。

Claims (17)

1. パピローマウイルスＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１またはＢＰＶ−１のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製する方法であって、
   （ａ）細胞内で発現した場合にＶＬＰを形成するパピローマウイルスＬ１蛋白である単一のパピローマウイルス蛋白をコードする組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトした真核細胞を供し；次いで
   （ｂ）該真核細胞からＶＬＰを得る
   工程を含むことを特徴とする該方法。
2. さらに、請求項１（ｂ）の工程の後に、（ｃ）該ＶＬＰを精製する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 該真核細胞が、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞を含むことを特徴とする請求項１または２記載の方法。
4. 該組換えＤＮＡ分子が、組換えウイルスを用いて該真核細胞にトランスフェクトされることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１記載の方法。
5. 該組換えウイルスが、昆虫細胞を感染させるバクロウィルスから由来することを特徴とする請求項４記載の方法。
6. 該昆虫細胞が、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）から由来することを特徴とする請求項５記載の方法。
7. 該組換えウイルスが、ワクシニアウイルスから由来することを特徴とする請求項４記載の方法。
8. 該組換えＤＮＡ分子が、ワクシニア４ｂプロモーターの下流に位置するＬ１遺伝子を含むことを特徴とする請求項７記載の方法。
9. 請求項１ないし８のいずれか１記載の方法により得ることができるウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
10. パピローマウイルスＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＢＰＶ−１またはＨＰＶ−１６のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製する方法であって、
    （ａ）パピローマウイルスＬ１蛋白およびパピローマウイルスＬ２蛋白を共にコードし、細胞内で発現した場合にパピローマウイルスＬ１およびＬ２蛋白がＶＬＰを形成する組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトした真核細胞を供し；次いで
    （ｂ）該真核細胞からＶＬＰを得る
    工程を含むことを特徴とする該方法。
11. 該真核細胞が、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞を含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
12. 該組換えＤＮＡ分子が、組換えウイルスを用いて該真核細胞にトランスフェクトされることを特徴とする請求項１０または１１記載の方法。
13. 該組換えウイルスが、昆虫細胞を感染させるバクロウィルスから由来することを特徴とする請求項１２記載の方法。
14. 該昆虫細胞が、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）から由来することを特徴とする請求項１３記載の方法。
15. 該組換えウイルスが、ワクシニアウイルスから由来することを特徴とする請求項１２記載の方法。
16. 該組換えＤＮＡ分子が、ワクシニア４ｂプロモーターの下流に位置するＬ１遺伝子を含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
17. 請求項１０ないし１６のいずれか１記載の方法により得ることができるウイルス様粒子（ＶＬＰ）。

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