DE19925234A1 - Capsomere, stabile Capsomere, Capside, VLPs, oder CVLPs bzw. damit beladenen Zellen und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie - Google Patents
Capsomere, stabile Capsomere, Capside, VLPs, oder CVLPs bzw. damit beladenen Zellen und ihre Verwendung in Diagnostik und TherapieInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP oder mindestens eine Antigen-präsentierende Zielzelle, insbesondere B-Zelle, Makrophage, Dendritische Zelle, embryonalen Zelle oder Fibroblast, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP inkubiert wurde, zum in vitro Nachweis einer Antigen-spezifischen Immunantwort, insbesondere zellulären Immunantwort von Effektorzellen des Immunsystems, insbesondere B-Zellen, NK-Zellen vorzugsweise T-Zellen, in besonders bevorzugter Weise zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen, sowie ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capso
mer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP oder min
destens eine Antigen-präsentierende Zielzelle, insbesondere B-Zelle, Makrophage, Dendriti
sche Zelle, embryonalen Zelle oder Fibroblast, die mit mindestens einem Capsomer, minde
stens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder
mindestens einem CVLP inkubiert wurde, zum in vitro Nachweis einer Antigen-spezifischen
Immunantwort, insbesondere zellulären Immunantwort von Effektorzellen des Immunsy
stems, insbesondere B-Zellen, NK-Zellen, vorzugsweise T-Zellen, in besonders bevorzugter
Weise zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen, sowie ihre Verwendung in Diagnostik und
Therapie.
Die Papillomviren, auch Warzenviren genannt, sind doppelsträngige DNA-Viren mit einer
Genomgröße von etwa 8000 Basenpaaren und einem Ikosaeder-förmigen Kapsid mit einem
Durchmesser von ca. 55 nm. Bis heute sind mehr als 100 verschiedene humane Papillomavi
rustypen bekannt, von denen einige, z. B. HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39,
HPV-45, HPV-52 oder HPV-58, bösartige Tumore und andere, z. B. HPV-6, HPV-11 oder
HPV-42 gutartige Tumore verursachen können.
Das Genom der Papillomaviren läßt sich in drei Bereiche unterteilen: Der erste Bereich be
trifft eine nicht-kodierende Region, die Regulationselemente für die Transkription und Repli
kation des Virus enthält. Die zweite Region, sogenannte E-(Early)Region enthält verschiede
ne Protein-kodierende Abschnitte E1-E7, von denen z. B. das E6- und das E7-Protein für die
Transformation von Epithelzellen verantwortlich sind und das E1-Protein die DNA-
Kopienzahl kontrolliert. Bei der E6- und E7-Region handelt es sich um sogenannte Onkoge
ne, die auch in bösartig entarteten Zellen exprimiert werden. Die dritte Region, auch L-
(Late)Region genannt, enthält zwei Protein-kodierende Abschnitte L1 und L2, die für Struk
turkomponenten des Viruskapsids kodieren. Das L1-Protein ist zu über 90% im viralen Kap
sid vorhanden, wobei das Verhältnis von L1 : L2 im allgemeinen 30 : 1 ist. Unter dem Begriff
L1-Protein versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung das Hauptkapsidprotein der
Papillomaviren (Baker T. et al. (1991) Biophys. J. 60, 1445).
HPV-6 und HPV-11 werden u. a. für Genitalwarzen verantwortlich gemacht, einige Papillo
mavirustypen wie HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-S2 und
HPV-58 sind mit bösartigen Tumoren des anogenitalen Traktes assoziiert. In über 50% der
Fälle wird HPV-16 mit Gebärmutterhalskrebs (Cervixcarcinom) in Verbindung gebracht.
HPV-16 ist der Hauptrisikofaktor für die Ausbildung von cervicalen Neoplasien. Das Immun
system spielt eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Krankheit. So sind vermutlich zellu
läre Immunantworten und insbesondere Antigen-spezifische T-Lymphozyten wichtig für den
Abwehrmechanismus. Es wurde weiterhin gefunden, daß in hochgradig malignen cervicalen
intraepithelialen Neoplasien (CIN II/III) und cervicalen Tumoren das E7-Gen konstitutiv in
allen Schichten des infizierten Epithels exprimiert wird. Daher wird vor allem das E7-Protein
als potentielles Tumorantigen und als Zielmolekül für aktivierte T-Zellen betrachtet (siehe
z. B. WO 93/20844). Die E7-induzierte zelluläre Immunantwort im Patienten ist aber anschei
nend nicht stark genug, um den Krankheitsverlauf zu beeinflussen. Die Immunantwort kann
eventuell durch geeignete Impfstoffe verstärkt werden.
Es konnte gezeigt werden, daß die Expression des L1-Gens bzw. die Coexpression des L1-
und L2-Gens zur Bildung von Capsomeren, stabilen Capsomeren, Capsiden oder Virus
ähnliche Partikel (VLPs für virus-like particle) führen kann (siehe z. B. WO 93/02184, WO
94/20137 oder WO94/05792). Unter Capsomeren versteht man eine oligomere Konfigurati
on, die aus fünf L1-Proteinen aufgebaut ist. Das Capsomer ist der Grundbaustein, aus denen
virale Capside aufgebaut sind. Unter stabilen Capsomeren versteht man Capsomere, die nicht
dazu in der Lage sind sich zu Capsiden zusammenzusetzen. Unter Capsiden versteht man die
Hülle des Papillomavirus, die beispielsweise aus 72 Capsomeren zusammengesetzt ist (Baker
T. et al. (1991) Biophys. J. 60, 1445). Unter VLP versteht man ein Capsid, das morphologisch
und in seiner Antigenität einem intakten Virus gleicht. Die VLPs konnten zur Auslösung einer
humoralen Immunantwort, die durch Bildung von neutralisierenden Antikörpern charakteri
siert ist, in verschiedenen tierischen Systemen verwendet werden. Die Bildung von virus
neutralisierenden Antikörpern gegen L1- und/oder L2-Protein ist jedoch von geringerer klini
scher Bedeutung, wenn die Virusinfektion bereits stattgefunden hat, da für die Eliminierung
virus-infizierter Zellen keine Antikörper, sondern eine virus-spezifische zytotoxische T-Zell-
(CTL)-Antwort notwendig zu sein scheint. Und obwohl VLPs in der Lage sind eine zytotoxi
sche T-Zell-Antwort auszulösen, scheint eine ausschließlich gegen die Kapsidproteine L1
und/oder L2 gerichtete Immunantwort nicht zur Bekämpfung eines durch Papillomaviren be
dingten Tumors geeignet.
Es wurden daher sogenannte chimäre Papillomavirus-ähnliche Partikel (CVLPs für chimeric
virus-like particle) entwickelt, die aus einem Fusionsprotein des Kapsidproteins L1 und des
potentiellen Tumorantigen E7 bestehen (WO 96/11272 und Müller, M. et al. (1997) Virology,
234, 93). Die CVLPs lösten nur im geringen Maße eine gegen das E7-Protein gerichtete hu
morale Immunantwort aus (Müller, M. et al. (1997), supra). Einige der getesteten CVLPs in
duzieren jedoch tatsächlich die erwünschte E7-spezifische zytotoxische T-Zellantwort in
Mäusen (siehe auch Peng S. et al. (1998) Virology 240, 147-57). Des weiteren scheinen neu
tralisierende Antikörper von HPV-assoziierten Erkrankungen in Patienten die Immunantwort
auf verabreichtes L1-Protein zu limitieren (Müller, M. et al. (1997), supra). CVLPs sind je
doch für die Entwicklung eines Impfstoffes nach wie vor interessant, da die über MHC-Mole
küle der Klasse I-präsentierten E7-Proteine von Tumorzellen Zielmoleküle von CTLs dar
stellen würden.
Peng S. et al. (1998; Virology, 240, 147) beschrieben nun CVLPs bestehend aus C-terminal
verkürztem L1 des Rinderpapillomavirus (BPV) und HPV-16 E749-57, welche nach Impfung
von C57B1/6-Mäusen E7-spezifische zytotoxische T-Zellen induzieren und vor dem Aus
wachsen E7-exprimierender Tumore schützen. Greenstone H. L. et al. (1998; Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 95, 1800-5) beschreiben CVLPs bestehend aus HPV-16 L1 und HPV-16 L2 fusio
niert mit dem Vollängen HPV-16 E7-Protein, welche nach Immunisierung von C57B1/6-
Mäusen vor dem Auswachsen epithelialer E7-exprimierender Tumorzellen schützen, wobei
jedoch zytotoxische T-Zellen nicht nachgewiesen wurden und somit die Induktion der zellulä
ren Immunantwort weniger effizient erscheint.
Während die Immunantwort auf Standardvakzine wie z. B. Tetanol über Antikörper vermittelt
wird und somit serologisch nachweisbar ist, mußte für eine derartige therapeutische Vakzine
ein auch für den Menschen standardisierbares Testsystem für die zelluläre Immunantwort ent
wickelt werden.
Bisher bestehende Systeme beruhen auf dem Grundprinzip, daß "peripheral blood mononu
clear cells" (PBMC), bei denen es sich um periphere Blutzellen mit einem Nukleus handelt,
unter anderem also Lymphozyten, Macrophagen und Dendritische Zellen aus einem Orga
nismus isoliert, in Kultur gebracht und mit einer bestimmten Form eines Antigens inkubiert
werden. Die Antigene werden durch Antigen-präsentierende Zellen (B-Lymphozyten, Macro
phagen, Dendritische Zellen) aufgenommen, intrazellulär prozessiert und über Histo
kompatibilitätsantigene (major histocompatibility complex MHC) auf der Oberfläche den T-
Zellen präsentiert. Dabei gibt es zwei Wege:
- - Peptide, die über MHC I-Moleküle präsentiert werden, werden von CD8-positiven T- Zellen erkannt, die sich durch diese Stimulation somit zu aktivierten zytotoxischen T- Zellen entwickeln bzw. die Antigen-präsentierenden Zellen lysieren können;
- - Peptide, die über MHC II-Moleküle präsentiert werden, werden von CD4-positiven T- Zellen erkannt, die sich durch diese Stimulation somit zu aktivierten T-Helferzellen ent wickeln können.
B-Zellen binden ein Antigen über ihre Antigen-Rezeptoren auf der Oberfläche (IgM oder
IgD). NK(natural killer)-Zellen haben zwei Rezeptoren: Der eine erkennt Zucker auf der
Zelloberfläche Antigen-präsentierender Zellen, der andere erkennt MHC I-Moleküle. Die
Stimulation der NK-Zellen erfolgt nach Erkennung eines Zuckers und gleichzeitiger Abwe
senheit von MHC I-Molekülen.
Die durch die Stimulation mit einem Antigen erreichte Aktivierung einer Immunzelle kann
beispielsweise durch die Synthese von Cytokinen wie z. B. Interferon γ, Interleukin 3 (IL3)
nachgewiesen werden. Das entsprechende Cytokin sammelt sich in diesen Testsystemen in
trazellulär an und kann dann beispielsweise über fluoreszenzgekoppelte Antikörper nach
gewiesen werden (Kern F. et al. (1998) Nat. Med. 4, 975-8) In einem FACS (fluorescens ac
tivated cell sorter) kann dann schließlich der Anteil der Immunzellen bestimmt werden, die
sich durch das jeweilige Antigen aktivieren ließen. Ausgeschiedene Cytokine können bei
spielsweise auch im ELISA nachgewiesen werden. Andere mögliche Nachweisverfahren für
die Aktivierung von Immunzellen sind ELISPOT, Proliferationstests oder 51Cr-
Freisetzungstests.
In den Systemen von Kast, W. M. et al. (1989; (Cell, 17, 603-14), Rock, K. L. et al. (1992;
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8918-22) und Cerundolo, V. et al. (1990; Nature, 345, 449-52)
werden als Antigen einzelne, definierte Peptide (8-, 9- oder 10-mere) verwendet. Die
Peptide werden durch die auf der Zelloberfläche exprimierten MHC-Moleküle der Klasse I,
die unter Säugern von Organismus zu Organismus sehr stark variieren, gebunden. Dies be
deutet wiederum, daß ein Peptid, das für den einen Organismus sehr gut zum Nachweis für T-
Zellantworten geeignet ist, für einen anderen Organismus derselben Art nicht verwendet wer
den kann, da dieser den entsprechenden MHC-I-Haplotyp nicht besitzt. Für Mäuse aus In
zuchtstämmen, die einen identischen MHC-I-Haplotyp besitzen, hat sich dieses System
durchgesetzt; dieser Versuchsansatz ist jedoch beispielsweise für den Menschen in der Praxis
nicht anwendbar, da für jeden Patienten unterschiedliche Peptide zur Stimulation der T-Zellen
benützt werden müßten. Zudem sind für die meisten Antigene die Proteinfragmente oder Pep
tide, die ein zytotoxisches T-Zellepitop darstellen können, nicht bekannt.
Werden wie in Allen, P. M. und Unanue, E. R. (1984; Immunobiology, 168, 182-8) beschrie
ben größere Peptide bzw. Proteine zur Stimulation von PBMCs verwendet, so werden diese
Antigene ins Cytoplasma oder über Endosomen aufgenommen und prozessiert. Entstehende
Peptide binden an MHC II-Moleküle und werden auf der Zelloberfläche den CD4-positiven
Zellen präsentiert. Ein derartiges System ist somit auf den Nachweis der Aktivierung von T-
Helferzellen limitiert und kann beispielsweise für die Evaluierung therapeutischer Impfstoffe,
die auch auf der Auslösung einer zellulären Immunantwort beruhen, nicht bzw. nicht aus
schließlich verwendet werden.
Somit herrscht das Dilemma, daß die Peptide bzw. Proteine entweder MHC-restringiert sind
oder aber lediglich T-Helferzellen aktivieren können.
Diese Nachteile werden von den Systemen von Tarpey, I. et al. (1994; Immunology, 81, 222-7)
und Nimako, M. et al. (1997; Cancer Res 57, 4855-61) dadurch umgangen, daß sie rekom
binante Vakzinia- bzw. Adenoviren, als Antigenfähren verwenden. Das jeweilige Virus führt
die Information für das entsprechende Antigen als Teil seines Genoms durch Infektion in die
Zelle ein. Anschließend kommt es zur Expression sowohl viraler Proteine als auch des Anti
gens innerhalb der Zelle. Die viralen Antigene werden genauso wie auch das spezifische An
tigen anschließend prozessiert und über MHC-I-Moleküle den T-Zellen präsentiert. Somit ist
für diese Systeme die Aufnahme des spezifischen Antigens im Gegensatz zu dem zuvorge
nanntem System MHC-unabhängig, so daß Zellen unterschiedlicher Organismen Teile des
spezifischen Antigens den T-Zellen präsentieren können, auch wenn die jeweils präsentierten
Teile des Antigens sich von Haplotyp zu Haplotyp unterscheiden können.
Das Vakzinia- und das Adenovirus-System hat den Nachteil, daß eine derartige Virusinfekti
on der Zellen mit viraler Genexpression und viraler Replikation verbunden ist. Durch diese
zusätzliche Beeinflussung der Antigen-präsentierenden Zellen wird eine quantitative Messung
einer zytotoxischen T-Zellantwort, die sich auf das spezifische Antigene beschränkt, deutlich
erschwert. Zum anderen ist die Handhabung dieser Systeme schwierig und kostspielig, da im
Umgang mit rekombinanten Vakzinia- bzw. Adenoviren die Sicherheitsstufe S2 erforderlich
ist.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es somit, ein Testsystem für die zelluläre Immunantwort
zu entwickeln,
- - in dem die Immunantwort insbesondere von zytotoxischen T-Zellen, aber auch z. B. von T-Helferzellen, B-Zellen oder NK(natural killer)-Zellen getestet werden kann, wobei die Möglichkeit zur Differenzierung zwischen den Immunzellen möglich sein soll;
- - in dem die Aufnahme des Antigens in die Zelle unabhängig ist von MHC-Molekülen;
- - in dem keine virale Infektion stattfindet, die verbunden ist mit viraler Proteinexpression und viraler Replikation;
- - das standardisiert werden kann.
Die Lösung dieser Aufgabe gelang dadurch, daß überraschenderweise gezeigt werden konnte,
daß in einem in vitro Versuch die Inkubation von PBMCs mit beispielsweise CVLPs zu einer
Antigen-spezifischen Immunantwort, insbesondere zytotoxischer Immunantwort von Immun
zellen, wie z. B. zytotoxischen T-Zellen, T-Helferzellen oder B-Zellen führt. Deshalb ist der
grundlegende Unterschied zwischen den bisherigen Nachweisverfahren und der vorliegenden
Erfindung die Art des Antigens, das zur Stimulation bzw. Restimulation verwendet wird.
Die beobachtete zytotoxische Immunantwort setzt voraus, daß die exogenen Proteine der
CVLPs tatsächlich über MHC-Moleküle der Klasse I den CD8-positiven Zellen präsentiert
wurden. Deshalb muß eine intrazelluläre Beladung der MHC-I-Moleküle nach Inkubation mit
CVLPs angenommen werden. Wie jedoch beispielsweise der Versuchsansatz von Allen P. M.
und Unanue E. R. (supra) lehrt, werden normalerweise exogene Proteine über MHC-Moleküle
der Klasse II den CD4-positiven Zellen präsentiert und gelangen nicht in das MHC-I-System.
Dieses überraschende, grundlegend unterschiedliche Verhalten der exogenen Proteine und der
CVLPs ist möglicherweise darin zu begründen, daß CVLPs durch ihre partikuläre Struktur
und rezeptorvermittelte Aufnahme in die Zelle die Fähigkeit der "Pseudoinfektion" von Zel
len haben. Die partikuläre Struktur der CVLPs würde in diesem Fall erst im Cytoplasma
durch Disassembly und Prozessierung aufgehoben, so daß anders als bei exogenen Proteinen
vornehmlich, aber nicht ausschließlich MHC-I-Moleküle Zugang zu Antigen-Fragmenten
erhalten, diese binden, auf die Zelloberfläche transportieren und dort den CD8-positiven Zel
len präsentieren. Parallel dazu werden auch intrazelluläre MHC-II-Moleküle mit Antigen-
Fragmenten beladen, die analog zum MHC-I die Peptide den CD4-positiven Zellen präsentie
ren. Somit werden sowohl MHC-I- als auch MHC-II-Moleküle der Antigen-präsentierenden
Zellen durch die Inkubation mit CVLPs mit CVLP-Peptiden "beladen" ("CVLP-beladene
Zellen"). Unter Präsentation im Sinne der vorliegenden Erfindung wird verstanden, wenn ein
Peptid oder Proteinfragment an ein MHC-Molekül bindet, wobei diese Bindung beispielswei
se im endoplasmatischen Retikulum oder extrazellulären Raum stattfinden kann, und wenn
dann dieser MHC-Molekül-Peptid-Komplex auf der extrazellulären Seite der Zellmembran
gebunden ist, so daß er durch Immunzellen spezifisch erkannt werden kann.
Nach der Erkennung des MHC-Moleküls mit seinem gebundenen Peptid durch die jeweilige,
spezifische T-Zelle über den jeweils spezifischen T-Zellrezeptor kommt es zur Proliferation
der zytotoxischen T-Zellen bzw. T-Helferzellen. Diese Zellpopulationen produzieren bei an
haltender Stimulation durch mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer,
mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP und/oder eine
Zelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens
einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP inkubiert wurde,
Cytokine, wie beispielsweise Interferon γ oder Interleukin 4 (IL4), die sich in diesem System
im Cytoplasma anreichern. Wie in Current Protocols of Immunology (Chapter 6.2 bis 6.24
(1999), edited by Coligan J. E, Kruisbeek A. M., Margulies D. H., Shevach E. M. und Strober
W., John Wiley & Sons) beschrieben, kann z. B. das intrazelluläre Interferon γ zur Detektion
spezifisch aktivierter T-Zellen verwendet werden.
Dies bedeutet, daß sich Capsomere, stabile Capsomere, Capside, VLPs, und/oder CVLPs hin
sichtlich der ausgelösten Immunantwort überraschenderweise wie Viren und nicht wie Protei
ne verhalten, obwohl sie keine Expression von viralen Proteinen bzw. virale Replikation aus
lösen. Diese Verbindungen vereinen somit aufgrund ihrer Fähigkeit der Pseudoinfektion die
Vorteile der Ansätze mit freien Peptiden/Proteinen mit denen von rekombinanten Viren.
Analog zu Viren sind Capsomere, stabile Capsomere, Capside, VLPs, und/oder CVLPs in der
Lage, als Partikel in das Cytoplasma zu gelangen und sind somit nicht MHC-restringiert. Im
Gegensatz zu dem viralen System ist jedoch keine Genexpression zum Freisetzen bzw. zur
Expression des spezifischen Antigens und zur Beladung von MHC I-Molekülen notwendig.
Anders als im Versuchsaufbau mit freien Peptiden oder Proteinen, die vorwiegend entweder
CD4- oder CD8-positive Zellen stimulieren, aktivieren Capsomere, stabile Capsomere, Cap
side, VLPs, und/oder CVLPs sowohl CD4- als auch CD8-positive T-Zellen gleichermaßen.
Schließlich sind Capsomere, stabile Capsomere, Capside, VLPs, und/oder CVLPs hinsichtlich
ihrer Sicherheitsstandards lediglich mit S1 eingestuft, so daß die technische Durchführung
sich gegenüber S2-Sicherheitsstandards, die bei viralen Systemen notwendig sind, verbilligt
und vielerorts mit geringerem technischen Aufwand verwirklicht werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles
Capsomere, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP oder
mindestens eine Antigen-präsentierenden Zielzelle, insbesondere B-Zell, Makrophage, Den
dritische Zelle, embryonalen Zelle oder Fibroblast, die mit mindestens einem Capsomer, min
destens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP,
und/oder mindestens einem CVLP inkubiert wurde, zum in vitro Nachweis einer Antigen
spezifischen Immunantwort, insbesondere zellulären Immunantwort von Effektorzellen des
Immunsystems, insbesondere B-Zellen, NK-Zellen, vorzugsweise T-Zellen, in besonders be
vorzugte Weise zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen, sowie ihre Verwendung in Dia
gnostik und Therapie.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Effektorzellen Säugerzellen, insbesondere
humane oder murine Zellen.
Die im Testsystem verwendeten Capsomere, stabilen Capsomere, Capside, VLPs, und/oder
CVLPs enthalten mindestens ein L1-Protein eines oder mehrerer Papillomaviren, oder minde
stens ein L1-Protein und mindestens ein Papillomavirus L2-Protein, insbesondere L1-Proteine
oder L1- und L2-Proteine von humanen, bovinen und/oder "cottontail rabbit" Papillomaviren.
In einer besonderen Ausführungsform enthalten die Capsomere, stabilen Capsomere, Capside,
und/oder CVLPs mindestens ein L1-Fusionsprotein, bestehend aus einem L1-Proteinanteil
eines oder mehrerer Papillomaviren und einem zum L1-Protein heterologen Proteinanteil.
Das verwendete L1-Protein kann ein natürlich vorkommendes L1-
Protein sein, oder es kann eine oder mehrere Deletionen, die beispielsweise C-terminal, N
terminal, und/oder intern sein können, und/oder eine oder mehrere Mutationen enthalten. In
einer besonderen Ausführungsform werden vom C-Terminus des L1-Proteins bis zu minde
stens ca. 35 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens ca. 25 bis ca. 35, insbesondere minde
stens ca. 32 bis ca. 34 Aminosäuren deletiert.
Der zum L1-Protein heterologe Proteinanteil kann ein natürlich vorkommendes Protein sein
oder es kann eine oder mehrere Deletionen, die beispielsweise C-terminal, N-terminal,
und/oder intern sein können, und/oder mehrere Mutationen enthalten. Dieses zum L1-Protein
heterologe Protein kann in einer besonderen Ausführungsform bakteriellen oder viralen Ur
sprungs sein, beispielsweise von HIV, HBV, HCV oder CMV, vorzugsweise von Papilloma
viren, insbesondere von humanem Papillomavirus abstammen, wie z. B. aber nicht aus
schließlich von E6 oder E7. In einer bevorzugten Ausführungsform werden vom C-Terminus
des E7-Proteins mindestens ca. 55 Aminosäuren, vorzugsweise mindestends ca. 5 bis ca. 55,
insbesondere mindestens ca. 38 bis ca. 55 Aminosäuren deletiert. Ferner können diese Protei
ne von Autoimmunantigenen wie z. B. Thyroglobulin, Myelin oder Zona Pellucida Glycopro
tein 3 (ZP3), die mit bestimmten Autoimmunkrankheiten wie z. B. Thyroiditis, Experimentelle
Autoimmun Encephalomyelitis (EAE), Oophoritis oder rheumatoider Arthritis assoziiert sind,
abgeleitet sein. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammt das zu L1 heterologe
Protein von Tumorantigenen ab, vorzugsweise Melanomaantigenen wie MART, Ova
rialcarcinomantigenen wie Her2 neu (c-erbB2), BCRA-1 oder CA125, Coloncarcino
mantigenen wie CA125 oder Mammacarcinomantigenen wie Her2 neu (c-erbB2), BCRA-1,
BCRA-2. Dieser Antigenanteil kann dabei, muß aber nicht, einzelne Domänen oder Epitope
eines Proteins umfassen. Der zum L1-Protein heterologe Proteinanteil liegt gebunden, vor
zugsweise fusioniert vor.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle die nach in vitro Inkubati
on mit Capsomeren, stabilen Capsomeren, Capsiden, VLPs, und/oder CVLPs Proteine
und/oder Proteinfragmente aus genannten Capsomeren, stabilen Capsomeren, Capsiden,
VLPs, und/oder CVLPs enthält, vorzugsweise präsentiert, insbesondere sowohl über MHC-I
als auch MHC-II-Komplexe. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine Anti
gen-präsentierende Zelle, insbesondere B-Zelle, Makrophage, Dendritische Zelle, embryo
nalen Zelle oder Fibroblast.
Die erfindungsgemäße Zelle enthält, insbesondere präsentiert Proteine, Proteinfragment,
und/oder Peptide aus Capsomeren, stabilen Capsomeren, Capsiden, VLPs, und/oder CVLPs,
die mindestens ein L1-Protein eines oder mehrerer Papillomaviren, oder mindestens ein L1-
Protein und mindestens ein Papillomavirus L2-Protein enthalten. In einer besonderen Ausfüh
rungsform enthält, insbesondere präsentiert die erfindungsgemäße Zelle Proteine, Protein
fragmente, und/oder Peptide aus Capsomeren, stabilen Capsomeren, Capsiden, und/oder
CVLPs, die mindestens ein L1-Fusionsprotein, bestehend aus einem L1-Proteinanteil eines
oder mehrerer Papillomaviren und einem zum L1-Protein heterologen Proteinanteil enthalten.
Das verwendete L1-Protein kann ein natürlich vorkommendes L1-Protein sein oder es kann
eine oder mehrere Deletionen, die beispielsweise C-terminal, N-terminal, und/oder intern sein
können, und/oder eine oder mehrere Mutationen enthalten. In einer bevorzugten Ausführungs
form werden vom C-Terminus des L1-Protein bis zu mindestens ca. 35 Aminosäuren, vor
zugsweise mindestens ca. 25 bis ca. 35, insbesondere mindestens ca. 32 bis ca. 34 Aminosäu
ren deletiert.
Der zum L1-Protein heterologe Proteinanteil kann ein natürlich vorkommendes Protein sein
oder er kann eine oder mehrere Deletionen, die beispielsweise C-terminal, N-terminal,
und/oder intern sein können, und/oder mehrere Mutationen enthalten. Dieses zum L1-Protein
heterologe Protein kann in einer besonderen Ausführungsform bakteriellen oder viralen Ur
sprungs sein, beispielsweise von HIV, HBV, HCV, HSV, EBV, HTLV oder CMV, vorzugs
weise von Papillomaviren, insbesondere von humanem Papillomavirus abstammen, wie bei
spielsweise von E6 oder E7. In einer bevorzugten Ausführungsform werden vom C-Terminus
des E7-Proteins mindestens ca. 55 Aminosäuren, vorzugsweise mindestends ca. 5 bis ca. 55,
insbesondere mindestens ca. 38 bis ca. 55 Aminosäuren deletiert. Ferner können diese Protei
ne von Autoimmunantigenen wie z. B. Thyroglobulin, Myelin oder Zona Pellucida Glycopro
tein 3 (ZP3), die mit bestimmten Autoimmunkrankheiten wie z. B. Thyroiditis, Experimentelle
Autoimmun Encephalomyelitis (EAE), Oophoritis oder rheumatoider Arthritis assoziiert sind,
abgeleitet sein. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammt das zu L 1 heterologe
Protein von Tumorantigenen ab, vorzugsweise Melanomaantigenen wie MART, Ova
rialcarcinomantigenen wie Her2 neu (c-erbB2), BCRA-1 oder CA125, Coloncarcino
mantigenen wie CA125 oder Mammacarcinomantigenen wie Her2 neu (c-erB2), BCRA-1,
BCRA-2. Dieser Antigenanteil kann dabei, muß aber nicht, einzelne Domänen oder Epitope
eines Proteins umfassen. Der Antigenanteil liegt an das L1-Protein gebunden, vorzugsweise
fusioniert vor.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer
Zielzelle, daß auf der Inkubation der Zielzelle mit mindestens einem Capsomer, mindestens
einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder min
destens einem CVLP in vitro beruht.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines
Testsystems bei dem mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, minde
stens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP gentechnisch und die
Zielzelle durch Inkubation mit mindestens einem Capsomer, einem stabilen Capsomer, einem
Capsid, einem VLP, und/oder CVLP hergestellt wird, und die Effektorzelle eine Immunzelli
nie und/oder kultivierte primäre Immunzelle, vorzugsweise eine murine oder humane Immun
zellinie und/oder kultivierte primäre Immunzelle, ist. Die gentechnisch hergestellten Proteine,
die Bestandteil der Capsomere, stabilen Capsomere, Capside, VLPs, und/oder CVLPs sind,
werden in einer bevorzugten Ausführungsform in Bakterien wie beispielsweise E. coli, Hefen
wie beispielsweise S. cerevisiae, insbesondere Insektenzellen wie beispielsweise Spodoptera
frugiperda Zellen oder Trichoplusia ni Zellen oder Säugerzellen wie beispielsweise COS-
Zellen oder HeLa-Zellen, exprimiert.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum in vitro Nachweis
der Aktivierung von Effektorzellen des Immunsystems durch mindestens ein Capsomer, min
destens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder minde
stens ein CVLP und/oder mindestens eine Zelle, die mit mindestens einem Capsomer, minde
stens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder
einem CVLP inkubiert wurde, das folgende Schritte enthält:
- a) In einem ersten Schritt wird ein erfindungsgemäßes Testsystems verwendet. In ei ner bevorzugten Ausführungsform erfolgt für mindestens ca. 5 h, insbesondere ca. 17 h eine Inkubation von Immunzellen (Effektorzellen) beispielsweise PBMCs, T- Zellininen oder kultivierten primären T-Zellen mit Antigenen, bevorzugt mit min destens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP und/oder min destens einer Zelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabi len Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt lediglich für mindestens ca. 5 h eine Inkubation von beispielsweise PBMCs, T- Zellininen oder kultivierten primären T-Zellen mit Antigenen, bevorzugt mit min destens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP und/oder min destens einer Zelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabi len Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde. Während dieser kurzen Zeit werden lediglich die Zellen durch das Antigen aktiviert, die schon zuvor durch dasselbe bzw. ein ähnliches Antigen stimuliert wurden.
- b) In einem zweiten Schritt wird die möglichen Aktivierung von Effektorzellen be stimmt. Beispielsweise lassen sich stimulierte T-Zellen durch verschiedene Ver fahren wie beispielsweise die Produktion oder Sekretion von Cytokinen durch die T-Zellen, der Expression von Oberflächenmolekülen auf T-Zellen, der Lyse von Zielzellen oder der Proliferation von Zellen nachweisen. Hierfür geeignete Metho den sind beispielsweise ein Cytokinassay (Chapter 6.2 bis 6.24 in Current Proto cols in Immunology (1999) supra), ELISPOT (Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra), ein 51Cr-Freisetzungstest (Chapter 3.11 in Current Protocols in Immunology, supra) oder der Nachweis der Proliferation (Chapter 3.12 in Cur rent Protocols in Immunology, supra). Je nach verwendeter Methode kann dabei auch zwischen den Immunzellen wie zytotoxischen T-Zellen, T-Helferzellen, B- Zellen, NK-Zellen und anderen Zellen unterschieden werden.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird vor Schritt a) folgender zusätzlichen
Schritt a') eingefügt
- 1. a') Mindestens eine Effektorzelle des Testsystems wird für mindestens ca. 8 Wochen, insbesondere mindestens ca. 3 Wochen mit mindestens einem Capsomer, minde stens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder CVLP und/oder mindestens einer Zielzelle, die mit mindestens ei nem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, cokultiviert be vor sich Schritt a) anschließt. Diese Voraktivierung der Effektorzellen hat zur Folge, daß die Effektorzellen im sich anschließenden Schritt a) durch die Zugabe von mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, minde stens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder CVLP und/oder mindestens einer Zielzelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, restimuliert wird. Unter Cokultivierung ist das Wachsen von mindestens einer Effektorzelle in der Gegenwart von mindestens einem Cap somer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, minde stens einem VLP, und/oder CVLP und/oder mindestens einer Zielzelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, im selben Wachstumsmedium und selben Gewebekulturbehälter zu verstehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dient eine Kom
ponente des Testsystems, nämlich mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capso
mer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP und/oder
mindestens eine Zelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Cap
somer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert
wurde, als Standard während eine zweite Komponente des Testsystems, die Effektorzellen,
die tatsächliche Testkomponente ist. Die in der Reaktion beider Komponenten beobachteten
Aktivierung der Effektorzelle wird mit der aktivierenden Wirkung von einem beispielsweise
aus einem großtechnischen Produktionsprozess stammenden Capsomer, stabilen Capsomer,
Capsid, VLP, und/oder CVLP und/oder einer Zelle, die mit mindestens einem Capsomer,
mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP,
und/oder einem CVLP inkubiert wurde, verglichen. Diese Ausführungsform erlaubt bei
spielsweise die Qualitätskontrolle von Chargen prophylaktischer und/oder therapeutischer
Impfstoffe enthaltend mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, minde
stens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP oder mindestens eine
Zelle die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens
einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde.
Eine weiteres bevorzugtes Verfahren, daß sich des erfindungsgemäßen Testsystems bedient,
ist die Auswahl besonders wirksamer Epitope für die Entwicklung von Vakzinen beruhend
auf Teilen von Proteinen. Untersucht man in getrennten Ansätzen beispielsweise verschiedene
CVLPs, die jeweils kurze Peptide eines Proteins oder eines Erregers als Fusionsanteil enthal
ten, im Hinblick auf ihre Fähigkeit, eine Stimulation von Immunzellen zu vermitteln, so las
sen sich durch den quantitativen Vergleich der Immunantworten auf die jeweiligen CVLP
besonders wirksame Peptide identifizieren. Derartige Peptide können dann für neue Impfstof
fe kombiniert werden. Analog hierzu können Proteine getestet werden. Ein weiterer Gegen
stand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Identifizierung von Epitopen, Peptiden oder
Proteinfragmenten, die eine Immunantwort, insbesondere zelluläre Immunantwort auslösen.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum in vitro Nachweis
der Aktivierung von Effektorzellen des Immunsystems durch mindestens ein Capsomer, min
destens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder minde
stens ein CVLP und/oder mindestens eine Zelle, die mit mindestens einem Capsomer, minde
stens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder
einem CVLP inkubiert wurde, das folgende Schritte enthält:
- A) In einem ersten Schritt werden beispielsweise PBMCs, insbesondere T-Zellen aus dem Blut eines Spenders gewonnen, insbesondere aus dem Blut eines Spenders, der bereits mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capso mer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder CVLP und/oder mindestens mit einer Zielzelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, geimpft wurde und die erhaltenen Effek torzellen kultiviert oder es werden Milzzellen einer Maus gewonnen, insbesondere Milzzellen einer Maus die bereits mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder CVLP und/oder mindestens mit einer Zielzelle, die mit mindestens ei nem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, geimpft wurde.
- B) In einem zweiten Schritt wird beispielsweise zu den isolierten und/oder kultivier ten Zellen für mindestens ca. 5 h, insbesondere ca. 17 h mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP und/oder mindestens eine Zelle, die mit minde stens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, hinzuge geben. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Inkubation für mindestens ca. 5 h. Während dieser kurzen Stimulationszeit werden lediglich die Zellen durch das hinzu gegebene Antigen aktiviert, die schon zuvor durch dasselbe bzw. ein ähnliches Antigen stimuliert wurden.
- C) In einem zweiten Schritt wird die möglichen Aktivierung von Effektorzellen be stimmt. Beispielsweise lassen sich stimulierte T-Zellen durch verschiedene Ver fahren wie beispielsweise der Nachweis der Produktion oder Sekretion von Cyto kinen durch die T-Zellen, der Expression von Oberflächenmolekülen auf T- Zellen, der Lyse von Zielzellen oder der Proliferation von Zellen. Hierfür geeig nete Methoden sind beispielsweise ein Cytokinassay (Chapter 6.2 bis 6.24 in Cur rent Protocols in Immunology (1999), supra), ELISPOT (Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra), ein 51Cr-Freisetzungstest (Chapter 3.11 in Cur rent Protocols in Immunology, supra) oder der Nachweis der Proliferation (Chap ter 3.12 in Current Protocols in Immunology, supra). Je nach verwendeter Metho de kann dabei auch zwischen den Immunzellen wie zytotoxischen T-Zellen, T- Helferzellen, B-Zellen, NK-Zellen und anderen Zellen unterschieden werden.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird nach Schritt I) folgender zusätzlichen
Schritt I') eingefügt
- 1. I') Die isolierten Zellen werden für mindestens ca. 8 Wochen, insbesondere minde stens ca. 3 Wochen mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder CVLP und/oder mindestens einer Zielzelle, die mit mindestens einem Capsomer, minde stens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, cokultiviert bevor sich Schritt II) anschließt. Diese Voraktivierung der Effektorzellen hat zur Folge, das im sich an schließenden Schritt II) die Effektorzellen durch die Zugabe von mindestens ei nem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder CVLP und/oder mindestens einer Zielzelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, minde stens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, restimuliert wird.
Diese Art der Ausführung wird als Restimulation bezeichnet. Die erste Stimulation kann da
bei jedoch auch wie unter Punkt I) beschrieben innerhalb des Spenders z. B. durch eine Imp
fung, eine Infektion, einen Tumor oder im Rahmen einer Autoimmunkrankheit erfolgt sein.
Sie kann aber auch wie unter Punkt I') beschrieben in vitro durchgeführt werden, um spezifi
sche reaktive Zellklone oder -populationen zu erhalten.
In einer besonderen Ausführungsform kann durch das erfindungsgemäße Verfahren der Im
munstatus eines Organismus gegenüber einem Erreger getestet werden. Isoliert man bei
spielsweise PBMCs eines Organismus und restimuliert sie mit mit mindestens einem Capso
mer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, und/oder CVLP
und/oder mindestens einer Zielzelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem
stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, die als
Fusionsanteil ein erregerspezifisches Antigen oder einen Teil davon enthalten, so kann man
durch den Befund von reaktiven Immunzellen gegen das jeweilige Antigen, wie beispielswei
se zytotoxischen T-Zellen, reaktiven T-Helferzellen oder reaktiven B-Zellen eine vorange
gangene Infektion nachweisen. Durch das Quantifizieren der reaktiven Zellen kann man in
einer weiteren Ausführungsform den quantitativ bestimmen, so daß z. B. die Notwendigkeit
von Auffrischungsimpfungen analysiert werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform kann auch der Erfolg der Impfung und/oder der aktuelle
Immunstatus eines Patienten nach einer bereits länger zurückliegenden Impfung überprüft
werden. Dabei beschränkt sich die Überwachung nicht nur auf prophylaktischen und/oder
therapeutischen Impfung mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Cap
somer, mindestens einem Capsid, und/oder CVLP und/oder mindestens einer Zielzelle, die
mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem
Capsid, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, sondern ist genauso für herkömmlichen
Impfstoffen geeignet.
Der Nachweis spezifischer reaktiver T-Zellen durch das vorliegende Testverfahren kann dazu
benützt werden, um schwer nachweisbare Infektionen zu diagnostizieren. Konstruiert man
beispielsweise CVLPs mit Antigenen oder Teilen von Antigenen von bekannten, jedoch
schwer nachweisbaren Erregern, so kann die T-Zellantwort auf derartige Antigene Aufschluß
über eine bestehende Infektion geben.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die HLA-
Haplotypen von Patientengruppen, die gegen bestimmte Infektionskrankheiten immun sind
bzw. sich nicht oder nur schlecht immunisieren lassen, mit der Reaktivität ihrer T-Zellen ge
genüber Antigenen der entsprechenden Erreger korreliert, so kann man Haplotypen identifi
zieren, die die Immunität gegenüber dem Erreger vermitteln.
Kennt man die Antigene, die für bestimmte Autoimmunkrankheiten verantwortlich sind, so
können Capsomere, stabilen Capsomere, Capside, und/oder CVLPs und/oder Zielzellen, die
mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem
Capsid, und/oder einem CVLP inkubiert wurden, hergestellt werden, die dieses Autoim
munantigenen oder Teilen enthalten. Diese können dann zur Diagnose der jeweiligen Au
toimmunkrankheit dienen, indem in vitro die T-Zellantwort eines Patienten nach Stimulation
beispielsweise seiner isolierten PBMCs mit den jeweiligen Autoimmunantigen gemessen
wird.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Unterscheidung von
Tumortypen hinsichtlich unterschiedlicher spezifischer Tumorantigene. Kennt man hinsicht
lich eines Tumors verschiedene Typen, die sich unter anderem darin unterscheiden, daß sie
unterschiedliche Tumorantigene exprimieren, und hat man auf der anderen Seite verschiedene
T-Zellpopulationen, die sich spezifisch durch eines der jeweiligen Tumorantigene restimulie
ren lassen, so kann man durch den Nachweis einer Restimulation der reaktiven T-Zellen den
Tumor eines Patienten klassifizieren. Eine derartige Klassifizierung ließe sich dann z. B. dazu
nutzen, die Patienten-eigenen T-Zellen durch eine Impfung mit den jeweiligen Tumorantige
nen spezifisch zu stimulieren, um so eine zytotoxische T-Zellpopulation gegen die eigenen
Tumorzellen zu generieren.
Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich beispielsweise für die Qualitätskontrolle von
Impfstoffchargen während der Produktion, die Identifizierung von neuen antigenen Epitopen,
die Identifikation von Patienten Haplotypen, die Unterscheidung von Autoimmunkrankheiten
oder die Unterscheidung von Tumortypen eine hohe Bearbeitungsgeschwindigkeit und Repro
duzierbarkeit bei der Anwendung des Testsystems. Deshalb ist ein weiterer Gegenstand der
Erfindung ein Verfahren, das die Aktivierung von Effektorzellen durch mindestens ein Cap
somer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP,
und/oder mindestens ein CVLPs oder durch mindestens eine Zelle, die mit mindestens einem
Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens ei
nem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, in Hochdurchsatz-Systemen durchgeführt
wird. In Hochdurchsatz-Systemen können neben den genannten Verbindungen beispielsweise
auch Peptide oder Proteine im großen Maßstab hinsichtlich ihrer Auslösung von Immunant
worten, insbesondere T-Zellantworten untersucht werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von mindestens einem Capsomer,
mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP,
und/oder mindestens einem CVLP oder mindestens einer Antigen-präsentierenden Zielzelle,
insbesondere B-Zell, Makrophage, Dendritische Zelle, embryonalen Zelle oder Fibroblast, die
mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem
Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP inkubiert wurden und Ef
fektorzellen des Immunsystems, insbesondere B-Zellen, NK-Zellen, vorzugsweise T-Zellen,
in besonders bevorzugte Weise zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen zur Auslösung oder
zum Nachweis einer Immunantwort.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Diagnostikum enthaltend mindestens ein Cap
somer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP,
und/oder mindestens ein CVLP oder mindestens eine Antigen-präsentierenden Zielzelle, ins
besondere B-Zell, Makrophage, Dendritische Zelle, embryonalen Zelle oder Fibroblast, die
mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem
Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP inkubiert wurden, Effek
torzellen des Immunsystems, insbesondere B-Zellen, NK-Zellen, vorzugsweise T-Zellen, in
besonders bevorzugte Weise zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen und gegebenenfalls
einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Beispiele von dem Fachmann bekannten Trägern sind Glas, Polystyren, Polypropylen, Po
lyethylen, Dextran, Nylon, Amylase, natürliche oder modifizierte Zellulose, Polyacrylamide,
Agarose, Aluminiumhydroxid oder Magnitid.
Ein erfindungsgemäßes Diagnostikum kann in Lösung vorliegen, an eine feste Matrix gebun
den sein und/oder mit einem Adjuvans versetzt sein.
Das Diagnostikum kann auf verschiedene Weisen verabreicht werden. Beispiele von dem
Fachmann bekannten Verabreichungsformen sind parenterale, lokale und/oder systemische
Applikation durch z. B. orale, intranasale, intravenöse, intramuskuläre, und/oder topische Ap
plikation. Die bevorzugte Applikationsform wird beispielsweise durch den natürlichen Infek
tionsweg der jeweiligen Papillomavirusinfektion beeinflußt. Die verabreichte Menge richtet
sich nach Alter, Gewicht und allgemeinem Gesundheitszustand des Patienten und dem Typ
der Papillomavirusinfektion. Das Diagnostikum kann in Form von Kapseln, Lösung, Suspen
sion, Elixier (für orale Applikation) oder sterile Lösungen bzw. Suspensionen (für parenterale
oder intranasale Applikation) verabreicht werden. Als inerter und immunologisch akzeptabler
Träger kann beispielsweise Salzlösung oder phosphatgepufferte Salzlösung verwendet wer
den.
Die Figuren und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu
beschränken.
Fig. 1 zeigt die graphische Auswertung der Restimulation von murinen, HPV16L1-
spezifischen T-Zellen durch zwei murine Antigen-präsentierende Zellinien (C3 und B16F10),
die zuvor mit ansteigenden Mengen an CVLPs inkubiert worden waren. Aufgetragen sind die
ansteigenden Konzentrationen von CVLPs gegen die Prozent der stimulierten T-Zellen, die
über Interferon γ-Produktion nachgewiesen wurden.
Fig. 2 zeigt die graphische Auswertung der Restimulation von murinen, HPV16L1-Peptid
spezifischen T-Zellen durch murine C3-Zellen, die zuvor mit unterschiedlichen CVLP-
Präparationen in Ab- und Anwesenheit von virusneutralisierenden Antikörpern inkubiert
worden waren.
Fig. 3A zeigt die Auswertung von fünf FACScan-Experimenten nach Stimulation von huma
nen PBMC mit unterschiedlichen Konzentrationen von CVLPs (0-10 µg/ml), bei denen hu
mane T-Zellen, die für humanes Interferon γ positiv sind, in der Graphik nach oben verlagert
sind.
Fig. 3B zeigt die graphische Auswertung von Fig. 3A, in der die Konzentration an CVLPs
gegen die Prozent der stimulierten Zellen aufgetragen ist. Stimulierte Zellen definieren sich
durch den Nachweis von humanem Interferon γ.
Fig. 4 zeigt die graphische Auswertung der Restimulation von humanen PBMC durch ver
schiedene Antigene, nachdem die PBMC zuvor mit CVLPs stimuliert worden waren.
Fig. 5 zeigt die Auswertung von drei FACScan-Experimenten nach Restimulation humaner T-
Zellen mit verschiedenen Antigen-präsentierenden Zellen, nachdem die T-Zellen zuvor mit
CVLPs stimuliert worden waren. Von links nach rechts ist jeweils der Gehalt an CD3 aufge
tragen, das für T-Zellen spezifisch ist, und von unten nach oben der Gehalt an humanem Inter
feron das für aktivierte Zellen spezifisch ist.
Fig. 6A zeigt die graphische Auswertung der spezifischen Lyse von verschiedenen murinen,
Antigen-präsentierenden RMA-Zellen, durch eine E7-spezifische zytotoxische T-Zellinie.
Dabei wurden normale RMA-Zellen verwendet, RMA-Zellen, die E7 exprimierten oder
RMA-Zellen, die zuvor mit L1E71-60-CVLPs inkubiert worden waren. Aufgetragen ist das
Verhältnis der Effektorzellen zu den Zielzellen gegen die Prozent der spezifisch lysierten
Zellen.
Fig. 6B zeigt die graphische Auswertung der spezifischen Lyse von verschiedenen murinen,
Antigen-präsentierenden RMA-Zellen, durch eine E7-spezifische zytotoxische T-Zellinie.
Dabei wurden RMA-Zellen verwendet, die zuvor mit L1E71-60-CVLPs oder mit L1-VLPs,
also ohne E7-Anteil, inkubiert worden waren.
- - Die Herstellung von HPV16L1Δ C*E71-55 CVLPs erfolgte gemäß der deutschen Patentan meldung DE 198 12 941.6 (siehe auch Müller M. et al. (1997) Virology 234, 93-111).
- - Die Herstellung von HPV16L1Δ C*E71-60 CVLPs erfolgte gemäß Müller M. et al. (1997; supra).
- - Die Herstellung von L1-VLPs erfolgt gemäß Müller M. et al. (1997); Virology 234, 93-111.
- - C57B1/6-Mäuse wurden von Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA) bezo gen.
- - B6-Zellen bedeutet embryonale Stammzellen aus einer C57B1/6-Maus.
- - C3-Zellen bedeutet HPV16 und ras-transformierte B6-Embryozellen (siehe Feltkamp M. C. et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23, 2242-9).
- - RMA-Zellen stammt aus einem Thymom einer C57BL/6-Maus (siehe Ljunggren H. G. & Kärre K. (1985) J. Exp. Med. 162, 1745-59).
- - RMA-E7-Zellen stammen von RMA-Zellen ab, die jedoch durch stabile Transfektion konstitutiv ein HPV6E7 Protein exprimieren.
- - B16F10-Zellen bedeutet die unter ATCC CRL-6475 erhältliche Zellinie.
- - PBMC bedeuten periphere Blutmononukleäre Zellen, die beispielsweise gemäß dem in Rudolf M. P. et al. (1999) Biol. Chem. 380, 335-40 beschriebenen Verfahren hergestellt werden können.
- - MVA-L1Δ C bedeutet rekombinantes murines Vakziniavirus, das in infizierten Zellen HPV16 ∟1Δ C exprimiert.
- - IL-2 bedeutet rekombinantes Cytokin (Becton Dickinson, Hamburg, Deutschland). 25/C α-HPV16L1 bedeutet einen monoklonaler Maus-Antikörper, der gegen L1 gerichtet ist.
- - α-hu CD28 bedeutet einen monoklonalen Maus-Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil von humanem CD28 gerichtet ist (ATCC CRL-8001).
- - α-CD3/PE bedeutet einen monoklonalen Maus-Antikörper, der gegen den extrazellulären Teil von humanem CD3 (ε) gerichtet ist und einen Fluoreszensmarker Phycoerithrin ent hält (Medac, Hamburg, Deutschland).
- - α-CD4/Cychrome bedeutet einen monoklonalen Maus-Antikörper, der gegen den extra zellulären Teil von CD4 gerichtet ist und einen Fluoreszensmarker Cychrome enthält (DAKO; Glostrup, Dänemark).
- - α-CD4/Tricolor bedeutet einen monoklonalen Ratten-Antikörper, der gegen den extra zellulären Teil von CD4 gerichtet ist und einen Fluoreszensmarker Tricolor enthält (Me dac, Hamburg, Deutschland).
- - α-mus Interferon γ/FITC bedeutet einen monoklonalen Ratten-Antikörper, der gegen mus Interferon γ gerichtet ist und einen Fluoreszensmarker FITC enthält (Medac, Hamburg, Deutschland).
- - E-7-Peptid bedeutet Aminosäuren 49 bis 57 des Humanen Papillomavirus Typ 16, Se quenz: RAHYNIVTF (siehe Feltkamp M. C et al. (1993) supra).
- - P-12-Peptid bedeutet Amin 165 bis 173 des L1-Proteins vom HPV16, Sequenz: AGVDNRECI (siehe Genbank 5559. .7154).
- - AM-Peptid bedeutet Aminosäuren 366 bis 374 des Influenza Nukleoproteins, Sequenz:
- - ASNENMETM (siehe Townsend A. R. et al. (1986) Cell 44, 959-68).
- - HPV16L1 93-101 bedeutet Aminosäuren 93 bis 101 des L1-Proteins von HPV16, Se quenz: GLQYRVFRI.
- - Phytohämaglutinin (PHA) wurde von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen.
- - Golgi Plug wurde von Pharmingen (Hamburg, Deutschland) bezogen.
- - Zellen wurden jeweils bei 37°C und 5% CO2 in RPMI-Medium (Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland) mit 10% fötalem Kälberserum, Kanamycin und Ampicillin kultiviert.
- a) Immunisierung von Mäusen mit VLPs:
Zwei C57B1/6-Mäuse wurden mit 10 µg L1 VLPs immunisiert. Nach 6 Wochen wur den die Milzzellen isoliert. - b) Herstellung von Antigen-präsentierenden Zellen (Zielzellen):
B6-Zellen wurden für 2,5 Tage mit Interferon γ inkubiert, anschließend über Nacht mit MVA-L1Δ C-Viren (MOI = 5) für die Herstellung Antigen-präsentierender Zellen infi ziert und für 16 h kultiviert. In einem nächsten Schritt wurden die infizierten B6-Zellen bestrahlt und dadurch am weiteren Wachstum gehindert. - c) Restimulation der isolierten Milzzellen:
Die Milzzellen wurden jeweils gemeinsam mit den L1Δ C-exprimierenden B6-Zellen, die als Stimulatorzellen für die T-Zellen der Milzzellen fungierten, für 5 Tage kultiviert.
2 × 104 murine Antigen-präsentierende Zellen (C3 oder B16F10) wurden mit verschiedenen
Konzentrationen an HPV16 L1Δ C*E71-55 CVLPs bei 37°C über Nacht inkubiert. Daraufhin
wurden 2 × 105 murine CD8 positive T-Zellen (siehe Beispiel 2, die für ein spezifisches
HPV16 L1-Peptid spezifisch sind, zugegeben und für eine Stunde bei 37°C in Anwesenheit
von 10 IU/ml IL2 inkubiert. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C in Anwesen
heit von 1 µl golgi plug inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert,
mit α-Maus CD3/PE, mit α-Maus CD4/Tricolor und mit α-Maus Interferon γ/FITC gefärbt
und gewaschen. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur
(Becton Dickinson, Hamburg, Deutschland) untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von
cellquest software (Becton Dickinson, Hamburg, Deutschland) analysiert. Zellen mit einem
Interferon γ-Signal von größer 101 wurden als stimulierte Zellen definiert. T-Zellen wurden
über ein CD3-Signal von über 102 definiert.
Ergebnis: In Fig. 1 ist dargestellt, daß mit ansteigender Menge an CVLPs prozentual mehr T-
Zellen durch die Antigen-präsentierenden Zellen restimuliert wurden. Da die hier verwende
ten T-Zellen ausschließlich mit MHC I-präsentierten Peptiden wechselwirken, zeigt dieser
Versuch, daß die CVLPs eine Pseudoinfektion der Antigen-präsentierenden Zellen bewirkt
haben müssen. Nur so ist zu erklären, daß MHC I-Moleküle mit CVLP-Peptiden beladen
werden konnten, um dann auf der Zelloberfläche durch L1-Peptid-spezifische T-Zellen er
kannt zu werden.
Murine C3 Zielzellen wurden über Nacht bei 37°C Mit 6 verschiedenen HPV16 L1Δ C*E71-55
CVLPs-Präparationen oder mit dem P12-Peptid inkubiert, jeweils
- a) ohne Antikörper
- b) mit 25/C αHPV16L1 Antikörper (10 µg/ml).
Von diesem Antikörper ist bekannt, daß er durch Bindung an das HPVL1-Protein die Infekti
on der Antigen-präsentierenden Zellen durch HPV-Viren (bzw. virusähnliche Partikel) ver
hindert. Anschließend wurden HPV16L1-Peptid-spezifische, murine T-Zellen zugegeben und
für 6 Stunden inkubiert (CVLP 2-6 wurden in Anwesenheit von golgi plug inkubiert). Die
Zellen wurden hinsichtlich ihrer Interferon γ-Produktion analysiert (siehe vorheriges Bei
spiel). Als Negativkontrolle dienten C3-Zellen, die mit keinem Antigen inkubiert wurden
(siehe Fig. 2).
Ergebnis: Wie bei einer viralen HPV-Infektion lassen sich CVLPs durch virusneutralisierende
Antikörper von einem Eindringen in Antigen-präsentierende Zellen abhalten. Die Zugabe der
Antikörper hat jedoch keinen Einfluß auf die Aufnahme von einzelnen Peptiden.
PBMC (4 × 106) wurden in 100 µl Medium über Nacht bei 37°C mit unterschiedlichen Kon
zentrationen HPV16L1Δ C*E71-55 CVLPs sowie 10 IU/ml IL2 und 0,5 µg/ml anti-human CD28
inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurde 1 µl golgi plug hinzugegeben. Die Zellen wurden
für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und per
meabilisiert, mit anti-human CD3/PE, mit anti-human CD4/ und mit anti-human Interferon
γ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur
Becton Dickenson untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von cellquest software analy
siert (siehe vorherige Beispiele).
Ergebnis: Es zeigte sich, daß mit ansteigender CVLP-Konzentration der Anteil an T-Zellen,
die Interferon γ im Cytoplasma akkumulieren, linear ansteigt (siehe Fig. 3A und B). Dieser
Anstieg macht somit die Stimulation der T-Zellen durch die CVLPs deutlich.
Humane PBMC (4 × 105) wurden für 3 Wochen mit HPV16L1Δ C*E71-55 CVLPs bei 37°C unter
wöchentlicher Zugabe von 1 µg/ml CVLPs sowie 105 Antigen-präsentierende PBMCs stimu
liert und geerntet. Anschließend wurden die Zellen in 100 µl Medium bei 37°C mit 10 µg/ml
verschiedener Antigene
- a) E7-Peptid
- b) HPV16L1Δ C*E71-55 CVLPs
- c) Influenza Peptid
- d) Phytohämaglutinin (PHA)
in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 und 0,5 µg/ml anti-human CD28 restimuliert. Nach einer
Stunde wurde 1 µl golgi plug zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C
inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α
-human CD3/PE,
mit α
-human CD4/Cychrome und mit α
-human Interferon γ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden
hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur Becton Dickenson untersucht und
die Meßergebnisse mit Hilfe von cellquest software analysiert (siehe vorherige Beispiele).
Ergebnis: Dreimal mehr T-Zellen ließen sich durch CVLPs restimulieren als durch das E7-
oder Influenza-Peptid (siehe Fig. 4). Phytohämaglutinin stimulierte als unspezifisches Stimu
lans wie erwartet die meisten T-Zellen. Durch die dreiwöchige Inkubation mit CVLPs wurde
somit ein Teil der humanen PBMC spezifisch durch CVLPs restimulierbar.
Humane PBMCs (4 × 105) wurden für 8 Wochen mit HPV16 L1Δ C*E71-55 CVLPs bei 37°C
unter wöchentlicher Zugabe von 1 µg/ml CVLPs sowie 105 bestrahlte PBMCs stimuliert und
geerntet. Anschließend wurden die Zellen in 100 µl Medium bei 37°C mit 10 µg/ml verschie
dener Antigene in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 und 0,5 µg/ml anti-human CD28 restimu
liert:
- a) über Nacht mit HPV 16 LIΔ C*E71-55 CVLP-inkubierten PBMC,
- b) über Nacht mit HPV16 L1 93-101-Peptid inkubierten PBMC.
Nach einer Stunde wurde 1 µl golgi plug zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden
bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit anti
human CD3/PE, mit anti-human CD4/Cychrome und mit anti-human Interferon γ/FITC ge
färbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur Becton
Dickenson untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von cellquest software analysiert (sie
he vorherige Beispiele).
Ergebnis: Fig. 5 zeigt, daß sowohl die CVLP-inkubierten PBMC eine Restimulation von
CVLP-stimulierten T-Zellen bewirkten, nicht aber die mit dem Kontroll-Peptid inkubierten
PBMC. Somit waren durch die achtwöchige Inkubation der humanen T-Zellen mit CVLPs
spezifisch restimulierbare T-Zellen entstanden. Des weiteren kann man daraus schließen, daß
die humanen Antigen-präsentierenden Zellen durch die CVLPs pseudoinfiziert wurden (wie
die Maus-Zellen aus Beispiel 3) und deshalb durch die CVLP-spezifischen T-Zellen erkannt
wurden.
RMA-Zellen wurden in Anwesenheit von 51Cr für 1 Stunde bei 37°C mit
- - HPV16L1Δ C*E71-60 CVLPs oder
- - L1-VLPs
inkubiert. Desgleichen wurden RMA-E7-Zellen in Anwesenheit von 51
Cr für 1 Stunde bei
37°C inkubiert, jedoch ohne Zugabe von Antigen. Anschließend wurden in unterschiedlichen
Verhältnissen zu den Zielzellen (RMA-Zellen) E7-spezifische zytotoxische T-Zellen
(C57BL/6-Maus (H2b
)) (siehe Beispiel 2) zugegeben. Die mit der Lyse der Zielzellen verbun
dene Freisetzung des 51
Cr wurde in einem β
-Counter gemessen und in Relation zu vollständig
lysierten Zellen gesetzt.
Fig. 6A zeigt, daß sowohl CVLP-inkubierte Zellen wie auch die Zellen, die E7 exprimieren,
effektiv durch die T-Zellen lysiert wurden, nicht aber die ohne Antigen inkubierten RMA-
Zellen.
Fig. 6B zeigt, daß im Gegensatz zu den CVLPs eine Inkubation der RMA-Zellen mit L1-
VLPs keine effektive Lyse der Zellen bewirkt.
Ergebnis: Somit ist E7 für die spezifische Stimulation der zytotoxischen T-Zellinie verant
wortlich, die zur Lyse der Antigen-präsentierenden RMA-Zellen führt. Dabei hat es kaum
einen Einfluß, ob E7 durch stabile Expression intrazellulär erzeugt wird oder durch eine
Pseudoinfektion über CVLPs in die Zelle gebracht wird.
Claims (44)
1. Testsystem zum in vitro Nachweis einer Antigen-spezifischen Immunantwort, insbe
sondere zellulären Immunantwort, enthaltend:
- a) mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP und/oder minde stens eine Antigen-präsentierenden Zielzelle, insbesondere B-Zelle, Makro phage, Dendritische Zelle, embryonalen Zelle oder Fibroblast, die mit minde stens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens ei nem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP inku biert wurden, und
- b) Effektorzellen des Immunsystems, insbesondere B-Zellen, NK-Zellen, vor zugsweise T-Zellen, in besonders bevorzugter Weise zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen.
2. Testsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Säugerzellen,
insbesondere humane oder murine Zellen sind.
3. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß das Capso
mer, stabile Capsomer, Capsid, VLP, und/oder CVLP mindestens ein L1-Protein eines
oder mehrerer Papillomaviren, oder mindestens ein L1-Protein und mindestens ein Pa
pillomavirus L2-Protein, insbesondere L1-Proteine oder L1- und L2-Proteine von hu
manen, bovinen und/oder "cottontail rabbit" Papillomaviren, enthält.
4. Testsystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Capsomer, stabile
Capsomer, Capsid, und/oder CVLP mindestens ein L1-Fusionsprotein, bestehend aus
einem L1-Proteinanteil eines oder mehrerer Papillomaviren und einem zum L1-Protein
heterologen Proteinanteil, enthält.
5. Testsystem nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der L1-Proteinan
teil ein natürlich vorkommendes L1-Protein ist.
6. Testsystem nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der L1-Proteinanteil
deletiert und/oder mutiert ist.
7. Testsystem nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, daß vom C-Terminus des L1-
Proteinanteils bis zu mindestens ca. 35 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens ca. 25
bis ca. 35, insbesondere mindestens ca. 32 bis ca. 34 Aminosäuren deletiert sind.
8. Testsystem nach einem der Ansprüche 3-7, dadurch gekennzeichnet, daß der zum L1-
Protein heterologe Proteinanteil ein natürlich vorkommendes Protein ist.
9. Testsystem nach einem der Ansprüche 3-7, dadurch gekennzeichnet, daß der zum L1-
Protein heterologe Proteinanteil deletiert und/oder mutiert ist.
10. Testsystem nach einem der Ansprüche 8 oder 9 dadurch gekennzeichnet, daß der zum
L1-Protein heterologe Proteinanteil von einem bakteriellen oder viralen Protein abge
leitet ist, vorzugsweise von einem Papillomavirus-Protein, insbesondere von einem
Protein eines humanen Papillomavirus.
11. Testsystem nach Anspruch 10 dadurch gekennzeichnet, daß das Papillomavirus-
Protein ein E-Protein, insbesondere ein E6- oder E7-Protein ist.
12. Testsystem nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, daß vom C-Terminus des E7-
Proteins mindestens ca. 55 Aminosäuren, vorzugsweise mindestends ca. 5 bis ca. 55,
insbesondere mindestens ca. 38 bis ca. 55 Aminosäuren deletiert sind.
13. Testsystem nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß der zum L1-Protein
heterologe Proteinanteil von einem Autoimmunantigen, insbesondere Thyroglobulin,
Myelin oder Zona Pellucida Glycoprotein 3 (ZP3) oder von einem Tumorantigen, ins
besondere einem Melanoma-, Ovarialcarcinom- oder Mammacarcinom-Antigen ab
geleitet ist.
14. Zelle dadurch gekennzeichnet, daß sie nach in vitro Inkubation mit Capsomeren, sta
bilen Capsomeren, Capsiden, VLPs, und/oder CVLPs Proteine und/oder Proteinfrag
mente aus genannten Capsomeren, stabilen Capsomeren, Capsiden, VLPs; und/oder
CVLPs enthält, vorzugsweise präsentiert.
15. Zelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Antigen
präsentierenden Zelle, insbesondere B-Zelle, Makrophage, Dendritische Zelle, em
bryonalen Zelle oder Fibroblast ist.
16. Zelle nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Capsomer, stabile
Capsomer, Capsid, VLP, und/oder CVLP mindestens ein L1-Protein eines oder mehre
rer Papillomaviren, oder mindestens ein L1-Protein und mindestens ein Papillomavirus
L2-Protein enthält.
17. Zelle nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Capsomer, stabile Capso
mer, Capsid, und/oder CVLP mindestens ein L1-Fusionsprotein, bestehend aus einem
L1-Proteinanteil eines oder mehrerer Papillomaviren und einem zum L1-Protein he
terologen Proteinanteil, enthält.
18. Zelle nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß der L1- Proteinanteil
ein natürlich vorkommendes L1-Protein ist.
19. Zelle nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß der L1-Proteinanteil
deletiert und/oder mutiert ist.
20. Zelle nach Anspruch 19 dadurch gekennzeichnet, daß vom C-Terminus des L1-
Proteinanteils bis zu mindestens ca. 35 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens ca. 25
bis ca. 35, insbesondere mindestens ca. 32 bis ca. 34 Aminosäuren deletiert sind.
21. Zelle nach einem der Ansprüche 16-20, dadurch gekennzeichnet, daß der zum L1-
Protein heterologe Proteinanteil ein natürlich vorkommendes Protein ist.
22. Zelle nach einem der Ansprüche 16-20, dadurch gekennzeichnet, daß der zum L1-
Protein heterologe Proteinanteil deletiert und/oder mutiert ist.
23. Zelle nach einem der Ansprüche 21 oder 22 dadurch gekennzeichnet daß der zum L1-
Protein heterologe Proteinanteil von einem bakteriellen oder viralen Protein abgeleitet
ist, vorzugsweise von einem Papillomavirus-Protein, insbesondere von einem Protein
eines humanen Papillomavirus.
24. Zelle nach Anspruch 23 dadurch gekennzeichnet, daß das Papillomavirus-Protein ein
E-Protein, insbesondere ein E6- oder E7-Protein ist.
25. Zelle nach Anspruch 24 dadurch gekennzeichnet, daß vom C-Terminus des E7-
Proteins mindestens ca. 55 Aminosäuren, vorzugsweise mindestends ca. 5 bis ca. 55,
insbesondere mindestens ca. 38 bis ca. 55 Aminosäuren deletiert sind.
26. Zelle nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß der zum L1-Protein
heterologe Proteinanteil von einem Autoantigen, insbesondere Thyroglobulin, Myelin
oder ZP3 oder von einem Tumorantigen, insbesondere einem Melanoma-, Ova
rialcarcinom- oder Mammacarcinom-Antigen abgeleitet ist.
27. Verfahren zur Herstellung einer Zielzelle nach einem der Ansprüche 14-26, dadurch
gekennzeichnet, daß die Zielzelle mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem
stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder min
destens einem CVLP in vitro inkubiert wird.
28. Verfahren zur Herstellung eines Testsystems nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch
gekennzeichnet, daß mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer,
mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP gentech
nisch und die Zielzelle gemäß Anspruch 27 hergestellt wird, und daß die Effektorzelle
eine Immunzellinie und/oder kultivierte primäre Immunzelle, vorzugsweise eine muri
ne oder humane Immunzellinie und/oder kultivierte primäre Immunzelle, ist.
29. Verfahren zur Herstellung eines Testsystems nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch
gekennzeichnet, daß das Capsomer, das stabile Capsomer, das Capsid, das VLP,
und/oder das CVLP in Bakterien wie beispielsweise E. coli, Hefen wie beispielsweise
S. cerevisiae, insbesondere Insektenzellen wie beispielsweise Spodoptera frugiperda
Zellen oder Trichoplusia ni Zellen oder Säugerzellen wie beispielsweise COS-Zellen
oder HeLa-Zellen, hergestellt wird.
30. Verfahren zum in vitro Nachweis der Aktivierung von Effektorzellen des Immunsy
stems durch mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens
ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP und/oder mindestens
eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 14-26, das folgende Schritte enthält:
- a) Verwenden eines Testsystems gemäß Ansprüchen 1-13;
- b) Bestimmen der möglichen Aktivierung von Effektorzellen.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß es vor Schritt a) folgenden
zusätzlichen Schritt a') enthält:
- 1. a') Cokultivieren der Effektorzelle des Testsystems gemäß Anspruch 1 oder 2 für mindestens ca. 8 Wochen, insbesondere mindestens ca. 3 Wochen mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Cap sid, mindestens einem VLP, und/oder CVLP, mindestens einer Zielzelle des Test systems gemäß einem der Ansprüche 1-13, und/oder mit mindestens einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 14-26, bevor sich Schritt a) anschließt.
32. Verfahren nach Anspruch 30 oder 31 dadurch gekennzeichnet, daß es für die Quali
tätskontrolle von Chargen prophylaktischer und/oder therapeutischer Impfstoffe ent
haltend mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein
Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP oder mindestens eine
Zelle gemäß einem der Ansprüche 14-26 verwendet wird.
33. Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Identifizie
rung von Epitopen, Peptiden oder Proteinfragmenten, die eine Immunantwort, insbe
sondere eine zelluläre Immunantwort auslösen, verwendet wird.
34. Verfahren zum in vitro Nachweis der Aktivierung von Effektorzellen des Immunsy
stems durch mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens
ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP und/oder mindestens
eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 14-26, das folgende Schritte enthält:
- A) Gewinnen und präparieren von Proben enthaltend Effektorzellen des Immunsy stems und anschließende Kultivierung.
- B) Zugeben von mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capso mer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens ei nem CVLP und/oder mindestens einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 14-26.
- C) Bestimmen der möglichen Aktivierung von Effektorzellen.
35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Schritt I) folgen
den zusätzlichen Schritt I') enthält:
- 1. I') Cokultivieren der Effektorzelle für mindestens ca. 8 Wochen, insbesondere min destens ca. 3 Wochen mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem sta bilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder CVLP und/oder mindestens einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 14-26, be vor sich Schritt II) anschließt.
36. Verfahren nach Anspruch 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, daß es für die Über
wachung des Immunstatus eines Organismus gegenüber einem Erreger, insbesondere
eines schwer nachweisbaren Erregers verwendet wird.
37. Verfahren nach Anspruch 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, daß es für die Überwa
chung einer Impfung verwendet wird.
38. Verfahren nach Anspruch 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, daß es für die Identifi
kation von HLA-Haplotypen verwendet wird, die die Immunität gegenüber einem be
stimmten Erreger vermitteln.
39. Verfahren nach Anspruch 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, daß es für die Unter
scheidung und Charakterisierung von Autoimmunerkrankungen hinsichtlich unter
schiedlicher spezifischer Autoimmunantigene verwendet wird.
40. Verfahren nach Anspruch 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, daß es für die Unter
scheidung von Tumortypen hinsichtlich unterschiedlicher spezifischer Tumorantigene
verwendet wird.
41. Verfahren nach einem der Ansprüche 30-40, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivie
rung der Effektorzelle durch mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Cap
somer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLPs
in Hochdurchsatz-Systemen durchgeführt wird.
42. Verwendung mindestes eines Testsystems gemäß einem der Ansprüche 1-13 und/oder
einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 14-26 zur Auslösung oder zum Nachweis ei
ner Immunantwort.
43. Diagnostikum enthaltend mindestens ein Testsystem gemäß einem der Ansprüche 1-13
und/oder einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 14-26 und gegebenenfalls einen
pharmazeutisch akzeptablen Träger.
44. Diagnostikum nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Testsy
stem gemäß einem der Ansprüche 1-13 und/oder eine Zelle gemäß einem der Ansprü
che 14-26 in Lösung vorliegt, an eine feste Matrix gebunden ist, und/oder mit einem
Adjuvans versetzt ist.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19925234A DE19925234A1 (de) | 1999-06-01 | 1999-06-01 | Capsomere, stabile Capsomere, Capside, VLPs, oder CVLPs bzw. damit beladenen Zellen und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie |
| JP2001500861A JP2003501628A (ja) | 1999-06-01 | 2000-05-31 | 抗原特異的免疫応答のインビトロ検出のための試験システム |
| EP00936845A EP1183533A1 (de) | 1999-06-01 | 2000-05-31 | Testsystem zum in vitro nachweis einer antigen-spezifischen immunantwort |
| CA002375191A CA2375191A1 (en) | 1999-06-01 | 2000-05-31 | Test system for in-vitro detection of an antigen-specific immune response |
| PCT/EP2000/005003 WO2000073790A1 (de) | 1999-06-01 | 2000-05-31 | Testsystem zum in vitro nachweis einer antigen-spezifischen immunantwort |
| AU52188/00A AU5218800A (en) | 1999-06-01 | 2000-05-31 | Test system for in-vitro detection of an antigen-specific immune response |
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| DE19925234A DE19925234A1 (de) | 1999-06-01 | 1999-06-01 | Capsomere, stabile Capsomere, Capside, VLPs, oder CVLPs bzw. damit beladenen Zellen und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie |
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| FR2828934B1 (fr) * | 2001-08-27 | 2004-08-13 | Inst Nat Sante Rech Med | Test de l'immunite cellulaire par des peptides fixes sur support solide |
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| WO1993002184A1 (en) * | 1991-07-19 | 1993-02-04 | The University Of Queensland | Papilloma virus vaccine |
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