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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum Nachweis von Human-Papillomavirus
(HPV) neutralisierenden Antikörpern
in einem Serum oder Plasma.
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Hintergrund
der Erfindung
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Human-Papillomaviren
(HPV) infizieren den Genitaltrakt und wurden mit verschiedenen Dysplasien, Krebsarten
und anderen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Diese Erkrankungen
sind gegenwärtig
Ziele für
Vakzin-Entwicklungen und Vakzine auf der Basis von virusähnlichen
Partikeln (VLPs), welche nur L1- oder L1 + L2-Kapsidproteine enthalten,
befinden sich gegenwärtig
in klinischen Versuchen.
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Zum
Testen von Kandidaten-Vakzinen wären
Neutralisationsassays wünschenswert.
Während
es derzeit über
100 beschriebene HPV-Typen gibt, gibt es nur einige wenige HPV-Typen,
für die
Neutralisationsassays existieren. Nachdem HPV nicht in Gewebekultur
wächst,
ist die Entwicklung von Neutralisationsassays für HPV schwierig gewesen.
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Zur
Erleichterung der Vakzin-Entwicklung wäre es wünschenswert, einen grundlegenden
Neutralisationsassay zu entwickeln, welcher leicht modifiziert werden
könnte,
um einen Neutralisationsassay für
einen beliebigen HPV-Typ zur Verfügung zu haben.
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Roden
et al., J. Virol., 1996, 5875–5883,
und Kawana et al., J. Virol., 1998, 10298–10300, offenbaren einen Assay
zur Feststellung, ob neutralisierende Anti-HPV-Antikörper in
einer Probe vorliegen.
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US-A-5795754
(Merck & Co.,
Inc.) offenbart synthetische VLPs und Assays unter deren Verwendung, um
VLPs, welche mittels rekombinanter DNA-Techniken hergestellt wurden,
zu validieren.
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Beschreibung
der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft ein Papillomavirus-"Pseudovirion", welches ein virusähnliches Partikel (VLP) umfasst,
das kovalent mit einem Reportergen-DNA-Konstrukt verknüpft ist.
In bevorzugten Ausführungsformen
sind die VLPs Human-Papillomavirus (HPV)-VLPs.
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Diese
Erfindung beinhaltet auch Assays zur Feststellung, ob ein Anti-VLP-Antikörper in
einer Probe vorliegt, umfassend die Schritte: Kombinieren einer
Zellkultur, die einer Infektion durch die Pseudovirionen zugänglich ist,
der Probe und Pseudovirionen, und Messen des Maßes an Aufnahme der Pseudovirionen
durch die Zelle. Die Aufnahme kann mit einer Kontrolle verglichen
werden, bei der keine Probe vorhanden ist oder die Probe eine Vorimmunprobe
ist, wobei eine Abnahme der Zellaufnahme von Pseudovirionen die
Anwesenheit neutralisierender Antikörper in der Probe anzeigt.
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Ein
weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
des Pseudovirion-Konstrukts, umfassend
die Herstellung relativ reiner VLPs und Verknüpfung des Reportergen-Konstrukts
mit einem heterobifunktionellen Verknüpfungsmittel (Linker).
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Ein
noch weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren zum Transport
eines Transportergens in eine Zelle, umfassend das Infizieren einer
Zelle mit einem Pseudovirion.
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Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist ein Diagramm, welches ein Reportergen-Konstrukt
auf Basis des Beta-Lactamasegens (BLAM) zeigt.
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2 zeigt
die Inhibierung der HPV16-Pseudovirionen-Aufnahme in Zellen durch
den HPV16-neutralisierenden monoklonalen Antikörper H16.V5.
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3 zeigt
die Inhibierung der HPV16-Pseudovirionen-Aufnahme in Zellen durch
einen neutralisierenden Antikörper
in den Seren von Individuen, die mit HPV16-VLPs immunisiert wurden.
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Wie
in der Beschreibung und den Ansprüchen durchgehend verwendet,
gelten die folgenden Definitionen:
"Pseudovirion" bedeutet ein papillomavirus-ähnliches
Partikel, welches chemisch verknüpft
mit oder gebunden an ein Reportergen-Konstrukt ist, entweder direkt
oder über
eine Verknüpfungsgruppe.
"Reportergen-Konstrukt" bedeutet irgendeine
für ein
Protein kodierende Nukleinsäure,
deren Transkription, Translation oder posttranslationale Aktivität günstig nachgewiesen
werden kann, zusammen mit bekannten erforderlichen Elementen, um
deren Transkription und Translation zu steuern (einschließlich beispielsweise
Promotoren, Enhancer, Transkriptions terminationssequenzen und dgl.).
Beispiele von Reportergen-Konstrukten umfassen Gene für Beta-Galactosidase,
Luciferase und Grünes
Fluoreszenzprotein und dgl.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
Pseudovirionen und Verfahren zu deren Verwendung hängen nicht
von irgendeinem speziellen Papillomavirus-Stamm oder irgendeinem
anderen viralen Kapsid ab. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Papillomavirus
ein Human-Papillomavirus (HPV) und es ist besonders bevorzugt, dass
das HPV einer der Stämme
ist, welche mit Genitalwarzen und/oder Genitaltumoren assoziiert
sind, und kann ausgewählt
sein aus der Gruppe, bestehend aus: HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16,
HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV51, HPV52
und HPV56.
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Ein
Pseudovirion kann praktisch aus jedem Papillomavirus-VLP hergestellt
werden. Ein Wildtyp-VLP besteht gewöhnlich überwiegend aus L1- und einer
kleineren Menge an L2-Protein.
Es ist jedoch bekannt, dass VLPs nur L1-Protein enthalten können. Darüber hinaus
wurden VLPs beschrieben, welche modifiziertes L1-Protein, modifizierte
L2-Proteine, Proteine (welche natürlich vorkommen können oder
nicht, wie z.B. HPV-E-Proteine), welche mit mindestens einem Teil
der L1- oder L2-Proteine fusioniert wurden, und/oder ein zusätzliches
nicht natürlich
vorkommendes Protein enthalten. Für die Zwecke dieser Erfindung
können
beliebige der Vorgenannten als Ausgangsmaterial für die Konstruktion
von Pseudovirionen verwendet werden. Im allgemeinen enthalten bevorzugte
VLPS entweder L1- oder die Kombination von L1- und L2 ("L1 + L2")-Protein.
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Die
VLPs, welche L1-Protein oder L1 + L2-Protein enthalten, können hergestellt
werden durch Transformation einer ausgewählten Wirtszelle mit Genen,
welche für
die L1- oder L1 + L2-Proteine
kodieren. Allgemeine Techniken, die Gene für verschiedene Arten von L1
und L2 und Verfahren zur rekombinanten Expression von L1- und L2-Proteinen
sind im Stand der Technik bekannt und können eingesetzt werden. Bevorzugte Wirtszellen
umfassen Hefe, Insektenzellen, Säugerzellen
und E, coli.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
dieser Erfindung werden Hefen mit Plasmid-DNA transformiert, welche
die für
L1-Protein kodierenden Gene unter der Kontrolle bekannter Hefepromotoren,
wie z.B. die Hefe-Gal1- und -Gal10-Promotoren, enthält. Die
Expression des Genprodukts wird durch Zugabe von Galactose zu den
Wachstumsmedien induziert und VLPs werden aus den induzierten Zellysaten
isoliert.
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Praktisch
jedes Reportergen-Konstrukt kann mit den VLPs gekoppelt werden,
um ein Pseudovirion herzustellen. Ein bevorzugtes Reportergen-Konstrukt,
welches verwendet wird, ist das Beta-Lactamasegen ("BLAM"), jedoch können auch
andere Reporter-Konstrukte, die für Enzyme oder Proteine wie
Beta-Galactosidase, Luciferase und Grünes Fluoreszenzprotein kodieren,
oder Gene die für
gespleißte
Transkripte kodieren, verwendet werden.
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Das
Reporter-Konstrukt kann mit dem VLP unter Anwendung bekannter Kopplungsreaktionen
gekoppelt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Reportergen-Konstrukt mit einem
Verknüpfungsmittel
(Linker) verknüpft,
welches im Handel erhältlich
ist, und der Linker wird mit dem VLP verknüpft. Ein bevorzugtes Verknüpfungsreagens
ist Succinimidyl-maleimidomethyl-cyclohexan-carboxylat ("SMCC"). Andere potentiell
geeignete Verknüpfungsreagenzien
neben SMCC würden
die folgenden Eigenschaften aufweisen: 1) heterobifunktionelle oder
sequenziell aktivierte Linker, welche eine störende Oligo-Oligo- oder VLP-VLP-Verknüpfung eliminieren
würden,
2) stabile Reaktionen mit entweder 5'-amino- oder 5'-thiol-modifizierten Oligonukleotiden,
3) stabile Reaktionen mit primären
Amin-, freien Sulfhydryl- oder Kohlenhydratgruppierungen auf dem
VLP-Protein. Diese Reagenzien würden
einschließen,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, die folgenden und deren sulfatierte Derivate: SMPB (Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat),
STAB (Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat), GMBS (n-(4-Maleimidobutyryloxy)succinimid),
MBS (m-Maleimidobenzoylsulfosuccinimidester) und MPBH (4-(4-N-Maleimidophenyl)buttersäurehydrazid-Hydrochlorid).
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Bei
der Konstruktion eines solchen Linkers kann das Molverhältnis von
Reportergen-Konstrukten zu dem VLP variieren. Erfindungsgemäß sollte
das Verhältnis
von Reportergen-Konstrukt
zu VLP etwa 0,1 bis 50, vorzugsweise etwa 1 bis 5 und bevorzugter
im wesentlichen etwa 1 zu 1 betragen.
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Einer
der Vorteile dieser Erfindung ist, dass Pseudovirionen unschwer
für eine
Vielfalt von HPVs unter Verwendung derselben Reporter- und Testsysteme
hergestellt werden können.
Ein weiterer Vorteil liegt darin, das die Reportersysteme gewünschtenfalls
leicht modifiziert werden können.
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Ein
wichtiger Aspekt dieser Erfindung ist die Verwendung von Pseudovirionen
zum Nachweis der Anwesenheit neutralisierender Antikörper. Obwohl
einige Informationen über
die Biologie von HPV und anderen Papillomaviren bekannt sind, wurden
sie noch nicht erfolgreich in vitro kultiviert. Ferner ist, obwohl
eine große Anzahl
von Tierspezies für
eine Papillomavirus-Infek tion anfällig ist, jede Spezies nur
für ihre
eigenen Papillomavirus-Stämme
anfällig.
Somit kann zwar beispielsweise Baumwollschwanzkaninchen-Papillomavirus
(CRPV) erfolgreich in dem Baumwollschwanzkaninchen studiert und
als Modell für
die humane Erkrankung verwendet werden, jedoch kann Human-Papillomavirus
nicht direkt in dem Kaninchen studiert werden. Verschiedene Vakzine
auf Basis von HPV-VLPs sind derzeit in Entwicklung, jedoch waren
bisher nicht für
alle Stämme von
HPV Neutralisationsassays verfügbar.
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In
dem Assay dieser Erfindung werden ein Pseudovirion der Erfindung,
eine Probe, von der angenommen wird, dass sie neutralisierende Antikörper enthält, und
eine Zellkultur in Kontakt gebracht. Die in diesem Assay verwendeten
Zellen können
beliebige Zellen sein, die bekanntermaßen für eine Papillomavirus-Infektion anfällig sind.
Für HPV-Pseudovirionen
können
die Zellen humane Karzinomzellen sein, wie z.B. C33A (erhältlich von
der ATCC), HeLa-Zellen und dgl. Falls die Probe (welche in bevorzugten
Ausführungsformen
Serum eines Patienten sein kann) neutralisierende Antikörper enthält, werden
die neutralisierenden Antikörper
dann mit den Pseudovirionen wechselwirken und die Aufnahme der Pseudovirionen
durch die Zelle stören.
Optional kann ein Kontrollassay durchgeführt werden, worin die gleichen
Pseudovirionen und Zellen verwendet werden, jedoch die Probe entweder
weggelassen wird oder durch eine Probe ersetzt, welche bekanntermaßen keine neutralisierenden
Antikörper
enthält.
Ein weiteres Beispiel einer Kontrollprobe ist eine aus einer Vorimmunquelle.
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Bei
dem Assay ist die verringerte Aufnahme von Pseudovirionen in die
Zelle mit der Menge an neutralisierendem Antikörper, die in der Probe vorliegt,
korreliert. In Abhängigkeit
von dem eingesetzten Reportergen-Konstrukt kann die Menge quantitativ
bestimmt werden. Eine quantitative Bestimmung der Anzahl der Zellen,
welche das Reportergen exprimieren, und des Ausmaßes der
Expression kann mittels Durchflusszytometrie vorgenommen werden.
Eine gleichzeitige Messung des 520 nm/450 nm-Verhältnisses
von Emissionswellenlängen
steht in direktem Verhältnis
zu dem Anteil gespaltenen CCF2-Substrats in individuellen Zellen
und ist unabhängig
von der Substratkonzentration oder den Zelldimensionen und ergibt
somit ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis als mit jeder Wellenlänge allein
erhältlich.
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Darüber hinaus
könnten
Subpopulationen von Zellen, welche auf eine Infektion reagieren,
durch fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung angereichert und kultiviert
werden, um die Population ansprechender Zellen zu expandieren, beispielsweise
unter Verwendung eines quantitativen RT-PCR-Assays einer Reporter-Spleißvariante.
Diese Assays der vorliegenden Erfindung können miniaturisiert und/oder
automatisiert sein und in einem 96-Mulden-Format für Screens
mit hohem Durchsatz verwendet werden.
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Die
Erfindung erlaubt auch die Markierung von Pseudovirionen mit verschiedenen
Reportern, um multivalente neutralisierende Seren oder eine Mischung
dieser Pseudovirionen zu testen. Dies kann zur Verfolgung der Reaktion
auf ein multivalentes Vakzin in einem Individuum verwendet werden.
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Ein
weiterer Aspekt dieser Erfindung ist die Verwendung von Pseudovirionen,
um unterschiedliche genetische Materialien in einer Vielfalt von
Zielzellen einzutragen. Im wesentlichen das gleiche Linkersystem
wird zur Konstruktion des Pseudovirions verwendet, jedoch wird das
Reportergen-Konstrukt durch ein Gen-Konstrukt ersetzt, welches ein
Gen der Wahl exprimiert.
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Die
folgenden nicht beschränkenden
Beispiele werden zur besseren Erläuterung der Erfindung gegeben.
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BEISPIEL 1
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Expression von HPV16-VLPs
in Hefe
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HPV16-VLPs
werden im wesentlichen hergestellt wie in WO 95/31532 beschrieben.
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Klonierung von HPV16-L1-
und -L2-Genen
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Genomische
Gesamt-DNA wurde aus Caski-Zellen (ATCC # CRL 1550) nach Standardtechniken
extrahiert. Die DNA wurde mit den Endonukleasen Bst1107I und SphI
verdaut und einer Elektrophorese durch ein 0,8%iges präparatives
Agarosegel mit niedriger Schmelztemperatur unterworfen. Eine Region,
die DNA von etwa 3,5 kbp entsprach, wurde aus dem Gel ausgeschnitten
und die Agarose mit GelaseTM-Enzym (Epicentre
Technologies, Inc.) verdaut. Die gelgereinigte DNA wurde mit T4-DNA-Polymerase
glattendig gemacht und mit glattendigen, phosphorylierten Oligodesoxynukleotid-Linkern,
welche eine verborgene HindIII-Stelle enthalten, ligiert. Die Ligierungsmischung
wurde vollständig
mit HindIII verdaut und die DNA von etwa 3,5 kbp wurde durch ein
Agarosegel wie oben beschrieben größenfraktioniert. Die gelgereinigte
DNA wurde mit pUC18-Plasmid-DNA, welche mit HindIII verdaut und
dephosphoryliert worden war, ligiert. Nach der Transformation von
kompetenten E. coli-DH5-Zellen (BRL) wurde die Plasmid-Bank hinsichtlich
HPV16-positiver Klone durch Koloniehybridisierung unter Verwendung
eines 32P-markierten Antisense-Oligodesoxynukleo tids,
welches komplementär
zu dem 3'-Ende des
HPV16-L1-Gens ist (5'-GAG
AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3') (SEQ-ID-Nr. 1), gescreent. Ein pUC18-Plasmid,
enthaltend ein genomisches HPV16-Fragment von 3,3 kbp, wurde isoliert
und mittels Restriktionsenzym- und Southernblot-Analysen charakterisiert. Dieses
Plasmid wurde als pUC18-HPV16-L1/L2 bezeichnet und enthält alle
für L1
und L2 kodierenden DNA-Sequenzen. Plasmid-DNA wurde mittels des
QiagenTM-Plasmid Maxi-Kits (Qiagen, Inc.)
präpariert.
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Konstruktion des HPV16-L1-Hefeexpressionsvektors
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Der
Klon pUC18-HPV16-L1/L2 wurde als Matrize für PCR verwendet. Das HPV16-L1-Gen
wurde mittels PCR unter Verwendung von Vent-Polymerase (New England
Biolabs, Inc.), 10 Amplifizierungszyklen (94°C, 1 Min.; 48°C, 1 Min.;
72°C, 1
Min 45 Sek.) und den folgenden Oligodesoxynukleotid-Primern, welche flankierende
BglII-Stellen enthalten (unterstrichen), amplifiziert:
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Der
Sense-Primer führt
eine untranslatierte Hefe-Leadersequenz unmittelbar stromaufwärts des HPV16-L1-Initiationsmethionin-Codons
(in Fettdruck hervorgehoben) ein. Das 1,5-kbp-L1-PCR-Produkt wurde mit BglII verdaut,
gelgereinigt und mit dem BamHI-verdauten pC1/1-GAL-Vektor ligiert. Ein pC1/1-GAL-Plasmid
wurde isoliert, welches das HPV16-L1-Gen enthielt, und als p14049-37-1
bezeichnet. Das L1-Gen in p14049-37-1 wurde unter Verwendung des
PRISMTM-Kits (ABI, Inc.) und eines ABI-Sequenzierers,
Modell # 373A, nach den Anweisungen des Herstellers sequenziert.
Von dem L1-Gen in diesem Isolat wurde gezeigt, dass es drei Nukleotidaustausche
gegenüber
der korrigierten veröffentlichten
Prototyp-Sequenz
(Kirnbauer, R., et al. (1993), J. Virol. 67: 6929–6936) enthält, was
zu zwei Aminosäureaustauschen
führt:
His-202 zu Asp; Thr-266 zu Ala. Eine Sequenzanalyse der ursprünglichen
Matrizen-DNA bestätigte,
dass diese Änderungen auch
in dem genomischen Klon pUC18-HPV16-L1/L2 vorlagen und nicht durch
die PCR eingeführt
wurden.
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Konstruktion des HPV16-L1-
und -L2-Hefe-Expressionsvektors
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Das
Plasmid p14049-37-1 (pC1/1-GAL+HPV16-L1) wurde mit SmaI verdaut,
welches zwischen dem Gal10-Promotor und dem ADH1-Transkriptionsterminator
spaltet. Das 1,4- kbp-HPV16-L2-Gen
wurde mittels PCR unter Verwendung der pUC18-HPV16-L1/L2-DNA als
Matrize, Vent-Polymerase (New England Biolabs, Inc.), 10 Zyklen
PCR-Amplifizierung (94°C,
1 Min.; 48°C,
1 Min.; 72°C,
1 Min. 45 Sek.) und den folgenden Oligodesoxynukleotid-Primern,
welche flankierende SmaI-Stellen (unterstrichen) enthalten, amplifiziert:
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Der
Sense-Primer führt
eine untranslatierte Hefe-Leadersequenz unmittelbar stromaufwärts des HPV16-L2-Initiationsmethionin-Codons
(in Fettdruck hervorgehoben) ein. Das 1,4-kbp-L2-PCR-Produkt wurde mit SmaI verdaut,
gelgereinigt und mit dem SmaI-verdauten p14049-37-1-Vektor ligiert. Ein pC1/1-GAL-Plasmid,
enthaltend sowohl das HPV16-L1- als auch das -L2-Gen, wurde isoliert
und als p14049-42-2 bezeichnet. Das L2-Gen in p14049-42-2 wurde
mittels des PRISMTM-Kits (ABI, Inc.) und
eines ABI-Sequenzierers, Modell # 373A, nach den Anweisungen des
Herstellers sequenziert. Von dem L2-Gen in diesem Isolat wurde gezeigt, dass
es fünf
Nukleotidaustausche gegenüber
der korrigierten veröffentlichten
Prototypsequenz (Kirnbauer, R., et al. (1993) oben) enthält, was
zu einer Aminosäureänderung
führte:
Ser-269 zu Pro. Eine Sequenzanalyse des genomischen Klons pUC18-HPV16-L1/L2
bestätigte,
dass dieser Austausch auch in der ursprünglichen Matrizen-DNA vorlag
und nicht durch die PCR eingeführt
wurde.
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Expression von HPV16-L1
und Coexpression von HPV16-L1- und -L2 in Hefe
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Die
Plasmide p14049-37-1 (pC1/1-GAL+HPV16-L1) und p14049-42-2 (pC1/1-GAL+HPV16-L1 und -L2) wurden
zur Transformation des S. cerevisiae-Stammes # 1558 verwendet. Die
resultierenden rekombinanten Stämme
waren # 1678 (HPV16-L1) und # 1679 (HPV16-L1+L2) wie in der Tabelle gezeigt. Klonale
Isolate wurden bei 30°C
in YEHD-Medium, enthaltend 2% Galactose, 68–78 h lang gezüchtet. Nach
Ernten der Zellen wurden die Zellpellets mit Glasperlen aufgebrochen
und Zellysate hinsichtlich der Expression von HPV16-L1- oder HPV16-L2-Protein
mittels Immunoblot-Analyse analysiert. Proben, die 40 μg zellulären Gesamtproteins
enthielten, wurden auf 10%igen Tris-Glycin-Gelen unter reduzierenden
und denaturierenden Bedingungen einer Elektrophorese unterzogen
und auf Nitrocellulosefilter elektrogeblottet. Das HPV16-L1-Protein
wurde unter Verwendung von polyklonalen Kaninchenantiseren, die
gegen ein trpE-HPV11-L1-Fusionsprotein induziert worden waren (D.
Brown et al., Virology 201: 46–54),
als primärer
Antikörper
und HRP-verknüpftem
Anti kaninchen-Esel-IgG-Antikörper
(Amersham, Inc.) als sekundärer
Antikörper
einem Immunnachweis unterzogen. Die Filter wurden mit Hilfe des
Chemolumineszenz-ECL-Nachweiskits (Amersham, Inc.) aufgearbeitet.
Eine L1-Proteinbande von 50–55
kD wurde in allen Proben mit Ausnahme der negativen Kontrolle (pC1/1
ohne L1- oder L2-Gen) nachgewiesen. Das L2-Protein wurde als eine
70-kD-Proteinbande durch einen Immunoblot unter Verwendung von Anti-HPV16-L2-Mausseren,
induziert gegen in E. coli exprimierte trpE-L2-Fusionsproteine,
als primärer
Antikörper
nachgewiesen. Antimaus-Ziegen-IgG, HRP-verknüpft, (Amersham, Inc.) wurde
als sekundärer
Antikörper
verwendet und die Filter wurden wie oben beschrieben aufgearbeitet.
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BEISPIEL 2
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Reinigung von VLPS
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Die
Reinigung erfolgte im wesentlichen wie in WO 00/09671 beschrieben.
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Hefezellen,
die zur Expression von VLPs transformiert worden waren, wurden geerntet
und zur Lagerung bei –70°C eingefroren.
Eingefrorene Hefezellsuspension wurde aus der Lagerung entnommen
und etwa 3 h lang bei Raumtemperatur, gefolgt von etwa 18 h bei
4°C, aufgetaut.
BENZONASE® (Nycomed
Pharma A/S, Kopenhagen, Dänemark)
(2,8 × 105 Einheiten/ml und 0,21 mg Protein/ml) wurde
der Zellsuspension bis zu einer Endkonzentration von 750 Einheiten
pro Gramm Nasszellgewicht zugegeben und wurde in einem Versuch auf
335 Einheiten pro Gramm Nasszellgewicht verringert. Die Zellen wurden
15 Minuten lang gerührt,
dann durch zwei Durchgänge
durch einen sterilisierten APV Gaulin 30CD-Homogenisator bei Kammerdrücken von 14.500
bis 16.000 psi aufgebrochen, was zu einem 95%igen Zellaufbruch führte. Das
verbleibende Lysat wurde sanft 18 h lang bei 4°C gerührt.
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Reinigung durch Mikrofiltration
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Das
Zelllysat wurde durch Querstrom-Mikrofiltration in einem Diafiltrationsmodus
wie folgt geklärt.
Das Lysat wurde in einen sterilen Prozesstank mit Eintritts- und
Austrittsöffnungen
von einem Zoll Durchmesser überführt. Der
Mikrofilter war eine Hohlfaser-Filterkartusche von 0,65 Micron Porengröße und 5
Quadratfuß Oberfläche (A/G
Technologies # CFP-6-D-8A, Needham, MA), die in einem A/G Technologies
FlexStand® Benchtop
Pilot Hollow Fiber-System
untergebracht war. Das Retentat wurde mit drei Volumina Diafiltrationspuffer
(unten) diafiltriert, um das geklärte Lysat zu ergeben. Der Diafiltrationspuffer
war 0,2 M (Na+) MOPS, pH 7,0, + 0,4 M NaCl.
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Chromatographie von geklärtem Lysat
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Das
geklärte
Lysat wurde durch Säulenchromatographie
unter Verwendung des starken Kationenaustauschchromatographieharzes
POROS® 50HS
(PerSeptive Biosystems, Framingham, MA), in eine Chromatographiesäule gepackt,
fraktioniert. Die Säule
wurde mit 0,5 N NaOH vor der Verwendung sterilisiert. Die Säule wurde
mit HPV-Diafiltrationspuffer [0,2 M (Na+)
MOPS, pH 7,0, + 0,4 M NaCl] bei Raumtemperatur äquilibriert. Das kalte (4°C) geklärte Lysat
wurde mit 125 ml/Minute auf die Säule gepumpt und die Säule wurde
mit 8 Säulenvolumina
von HPV-Säulenpuffer
A [0,05 M (Na+) MOPS, pH 7,0, + 0,5 M NaCl]
bei Raumtemperatur mit 125 ml/Minute mit einem linearen Gradienten
von 100% HPV-Säulenpuffer
A bis 100% HPV-Säulenpuffer
B [0,05 M (Na+) MOPS, pH 7,0, + 1,5 M NaCl]
gewaschen. Der gesamte lineare Gradient betrug 10 Säulenvolumina und
wurde in 10 gleichvolumigen Fraktionen gesammelt. Nach dem Gradienten
wurde die Säule
mit zwei Säulenvolumina
von HPV-Säulenpuffer
B bei Raumtemperatur mit 125 ml/Minute gewaschen, welche in zwei
zusätzlichen
Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden in sterilen 2-Liter-Kunststofflaschen
gesammelt und bei 4°C
gelagert. Fraktionen, welche den letzten UV-Absorptionspeak (A280
nm und A230 nm) in dem Gradienten enthielten, wurden vereinigt,
unter Verwendung einer MILLIPAK-200-Einmalfiltereinheit (Millipore, Bedford,
MA) filtriert und bei 4°C
gelagert.
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Hydroxylapatit-Chromatographie
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Alle
Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Eine Chromatographiesäule (13
mm Innendurchmesser × 36
mm), gepackt mit keramischem Hydroxylapatit, Typ II (BioRad, Katalog-Nr.
7320081, Hercules, CA), wurde in 50 mM MOPS, pH 7,0, + 1,25 M NaCl
voräquilibriert.
Die partiell gereinigte HPV-Lösung aus
dem vorhergehenden Schritt wurde auf die Säule mit einer linearen Flussrate
von 90 cm/h aufgebracht. Nachdem die Probenauftragung vollständig war,
wurde die Säule
mit 8 Volumina Voräquilibrierungspuffer
gewaschen, bis die optische Dichte des Säulenausflusses nahezu Null
war. Das HPV-Produkt wurde mit einem linearen Gradienten von 0%
bis 100% Elutionspuffer (0,2 M Natriumphosphat, pH 7,0, + 1,25 M
NaCl) ebenfalls bei einer linearen Flussrate von 90 cm/h eluiert.
Das Gesamtvolumen des Gradienten betrug 4 Säulenvolumina. Fraktionen, welche
das Vakzin-Produkt enthielten, wurden mittels RIA und Bradford-Proteinassay
identifiziert. Die Proteinkonzentration des Produkts betrug 100 μg/ml.
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Assays:
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Bradford-Proteinassays
wurden durchgeführt
unter Verwendung von Coomassie Plus Assay Reagens (Pierce, Rockford,
IL) unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) als Standard.
Lowry-Proteinassays wurden nach dem Verfahren von Lowry et al.,
1951, J. Biol. Chem. 193: 265–270
und unter Verwendung von BSA als Eichstandard durchgeführt. Antigen
wurde mit einem mehrschichtigen ELISA unter Verwendung eines monoklonalen
Antikörpers
nachgewiesen, welcher ein Konformationsepitop des VLP erkannte.
Mikrotiterplatten wurden mit polyklonalen Anti-HPV-VLP-Ziegenantikörpern beschichtet.
Standard- und Testproben wurden mit PBS, enthaltend 1% Gew./Vol.
BSA, 0,1% TWEEN-20 und 0,1% Natriumazid, verdünnt und den Mulden zugegeben,
wo Antigen durch die plattengebundenen Antikörper eingefangen wurde. Monoklonaler
Anti-HPV-L1-VLP-Antikörper
(Chemicon, Temecula, CA) wurde den Mulden zugegeben, um das von
den plattengebundenen Antikörpern
eingefangene Antigen zu binden. Die monoklonalen Anti-HPV-VLP-Antikörper wurden
mittels meerrettichperoxidase-konjugierten Antimaus-IgG-Antikörpern nachgewiesen.
Ein chromogenes Substrat für
Meerrettichperoxidase, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin
(Pierce), wurde zugegeben und die Extinktion bei 450 nm war proportional
der Konzentration von L1-VLP in der Probe.
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BEISPIEL 3
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Bildung des Beta-Lactamase-Reporters
und Kopplung an HPV16-VLPs, um "Pseudovirionen" herzustellen
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Das
Beta-Lactamase-Reportergen wurde wie folgt konstruiert: 5'-amin-modifizierte
Oligos wurden konzipiert, synthetisiert (Midland Certified Reagents;
Midland, TX) und zur Amplifizierung des Abschnitts des Aurora-Vektors
pcDNA3-BLAM (Zlokarnik et al., 1998, Science, 279: 84–88), enthaltend
den CMV-Promotor + BLAM + poly-A-Ende (1),
verwendet. Primer für
beide Kopplungsorientierungen können
eingesetzt werden (d.h. Amin am 5'-Ende des Sense-Stranges oder Amin am
5'-Ende des Antisense-Stranges).
Die Stromabwärts-Primer wurden 5'-biotinyliert, um
den Abbau durch DNA-Exonuklease in dem endgültigen Assay zu verringern
und um die Möglichkeit
zum Nachweis der DNA zu bieten. Hinsichtlich der Primersequenzen
siehe Tabelle 1.
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Die
Primer A und B wurden zunächst
verwendet, um eine 1798-Basenpaar (bp)-Sequenz, kodierend für den humanen
CMV-Promoter von 591 bp, die Beta-Lactamase von 809 bp und die Rinderwachstumshormon-Poly-A-Terminatorsequenzen
von 135 bp, zu amplifizieren. Die PCR-Produkte wurden mittels Gelfiltration (Schleudersäulen mit
einer Silicagel-Membran, QIAGEN, Inc.) gereinigt, mittels UV-Spektrometrie
bei OD 260 nm quantitativ bestimmt und mit dem NHS-Ester des heterobifunktionellen
Linkers SMCC (Succinimidyl-maleimidomethyl-cyclohexancarboxylat) (Pierce) nach
den Anweisungen des Herstellers 1 h lang bei 20°C konjugiert.
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Das
konjugierte Reportergen wurde mittels Gelfiltration gereinigt (Microspin
G-25, Pharmacia), dann mit freien Sulfhydrylgruppen auf konzentrierten
HPV16-VLPs (0,97 mg/ml) über
die Maleimidgruppe (etwa ein freies Sulfhydryl pro L1-Monomer) umgesetzt.
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Die
Pseudovirionen wurden dann steril filtriert, um in dem Neutralisationsassay
eingesetzt zu werden. Anfangsexperimente wiesen darauf hin, dass
dieses niedrige Kopplungsverhältnis
von Reporter zu VLP vorteilhaft war (Daten nicht gezeigt). Die Reaktion
fand 12 h lang bei 4°C
statt.
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BEISPIEL 4
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Infektion von C33A-Zellen
mit HPV-Pseudovirionen
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2000
C33A-Zellen (ATCC # HTB 31) wurden drei Tage lang bei 37°C in vollständigem DMEM
(Dulbecco's Modified
Eagle Medium (GIBCO BRL), enthaltend Penicillin und Streptomycin
(100 E/ml bzw. 100 μg/ml) und
10% fötales
Kalbsserum, kultiviert. Vor der Infektion wurde das serumhaltige
Medium entfernt und 200 ng HPV16-Pseudovirionen in 50 μl Opti-MEM (GIBCO BRL) wurden
zugegeben. 24 h nach der Infektion wurden die Zellen mit 100 μl vollständigem DMEM-Medium
versorgt. Zwei Tage nach der Infektion wurde Beta-Lactamase-Reportergenexpression
in infizierten CA33A-Zellen unter Verwendung von CCF2 (Aurora),
einem Substrat für
die Beta-Lactamase (Zlokarnik, oben), nachgewiesen.
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In
Kürze,
die Zellen wurden mit Opti-MEM-Medium gewaschen, bevor 50 μl Auftragspuffer,
enthaltend CCF2, jeder Mulde einer 96-Mulden-Platte (FALCON, Becton-Dickinson)
zugegeben wurden. Die CCF2-Endkonzentration betrug 5 μM. Die Platten
wurden 3 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Umsetzung von CCF2
in Beta-Lactamase exprimierenden Zeilen wurde verfolgt durch Überwachung
der Verschiebung der Fluoreszenzemissionswellenlänge zu Blau bei 460 nm unter
Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Olympus, Modell IX70). Im
Mittel konnten 204 +/– 55
(n = 12) blaue Zellen zwei Tage nach der Infektion nachgewiesen
werden.
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BEISPIEL 5
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Neutralisation einer HPV16-Pseudovirionen-Infektion
durch monoklonale Antikörper
und Immunseren aus mit HPV16-VLP immunisierten Individuen
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2000
C33A-Zellen/Mulde (ATCC # HTB 31) wurden in 96-Mulden-Platten (FALCON,
Becton-Dickinson)
drei Tage lang bei 37°C
in vollständigem
DMEM (GIBCO BRL) kultiviert. 25 μl
von 1:40-Verdünnungen von
entweder (i) humanen Vorimmunseren, (ii) Immunseren aus Individuen,
die mit HPV16-VLPs immunisiert worden waren, (iii) Immunseren aus
Individuen, die mit anderen HPV-VLPs immunisiert worden waren, oder (iv)
verschiedenen Verdünnungen
von monoklonalen HPV-VLP-spezifischen Antikörpern, wurden den Mulden zugegeben,
gefolgt von 25 μl
Medium mit 200 ng Pseudovirionen. Die Platten wurden bei 37°C in einem CO2-Inkubator (5% CO2)
inkubiert und dann wie im Beispiel 3 beschrieben analysiert. Die
prozentuale Neutralisation wurde bestimmt durch Berechnung des Prozentsatzes
der Reduktion blauer Zellen in Mulden, die monoklonale HPV16-neutralisierende
Antikörper
oder humane Immunseren enthielten, gegenüber Mulden, die unspezifische
monoklonale Antikörper
oder Vorimmunseren enthielten. 2 zeigt
die prozentuale Neutralisation von HPV16-Pseudovirionen durch Reihenverdünnungen
von Aszites, enthaltend den bekannten monoklonalen HPV16-neutralisierenden
Antikörper
H16.V5. Eine 1:10.000 Verdünnung
von Aszites, enthaltend den unspezifischen monoklonalen Antikörper H18.J4,
neutralisierte nicht. Unter Verwendung des beschriebenen Assays
wurde eine Gruppe von 52 Seren von Individuen, die mit HPV16-VLPs
immunisiert worden waren, bei einer Serumendverdünnung von 1:80 getestet. Die
meisten Immunseren waren in diesem Assay neutralisierend (3).
Darüber
hinaus wurde eine gute Korrelation zwischen den HPV16-VLP-spezifischen
Antikörpertitern,
bestimmt mit einem HPV16-RIA-Antikörpertest, und dem Prozentsatz
der Neutralisation beobachtet (3).
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BEISPIEL 6
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Polystyrol-Perlen
(1/4 Zoll mit spiegelglatter Oberfläche) wurden mit normalem Ziegenserum
in einer 1:1000-Verdünnung
in phosphatgepufferter Salzlösung
(PBS) vorbeschichtet. Ansätze
von 3000 Perlen, 7,5 Perlen/ml, wurden über Nacht bei 4°C inkubiert.
Die Perlen wurden dann in fünf
Volumina entionisiertem Wasser gewaschen, auf Papierhandtücher trockengeblottet
und auf einem Tablett aus rostfreiem Stahl an der Luft trocknen
gelassen. HPV16-L1-VLP wurden auf die vorbeschichteten Perlen unter
Verwendung von MOPS-Puffer
(50 mM MOPS + 0,5 M NaCl, pH 7,0), enthaltend 50 ng VLP pro ml (5
Perlen pro ml), beschichtet. Antigen und Puffer wurden zuerst in
einer Corning®-Medienflasche
gemischt, dann wurden die Perlen zugegeben. Die Flasche, welche
das Beschichtungsantigen und die Perlen enthielt, wurde auf einer
Cole Palmer-Rotationsvorrichtung befestigt, die Beschichtung fand
1 h lang bei Raumtemperatur und 5 UpM statt. Die Perlen wurden in
fünf Volumina
MOPS-Puffer gewaschen und ausreichend Puffer wurde zugegeben, um
die Perlen untergetaucht zu halten. Diese wurden dann bei 4°C gelagert,
bis sie gebraucht wurden, für
maximal vier Monate.
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Der
HPV16-L1-VLP-Antikörper-RIA
ist ein kompetitiver Antikörper-Assay,
wobei Antikörper
um eine begrenzte Anzahl von Epitopen mit einer begrenzten Menge
des konformations-spezifischen
monoklonalen Antikörpers
H16.V5 konkurrieren. Aszites mit H16.V5 wurden in einer 1:800.000-Verdünnung in
PBS + 1% Rinderserumalbumin + 0,05% Tween 20 eingesetzt. Gleiche
Volumina (100 μl)
von Probenserum und verdünntem H16.V5
wurden in einer Mulde einer 20-Mulden-Abbott-Assayplatte gemischt.
Dann wurde eine einzelne mit HPV16-Antigen beschichtete Perle der Assaymulde
zugegeben. Die Proben wurden den Assays in doppelten Ansätzen unterworfen.
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Die
Assay-Platten wurden mit Klebefolien versiegelt und 17 bis 24 h
lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Die Platten wurden
mit entionisiertem Wasser unter Verwendung einer Abbott-Plattenwaschvorrichtung
gewaschen. Die Menge an Maus-MAB, welche erfolgreich an die mit
HPV16-VLP beschichtete Perle band, wurde mit 125I-[Antimaus-Ziegen-IgG] (NEN Life Sciences,
Boston, MA) nachgewiesen. Die Platten wurden mit frischer Klebefolie
versiegelt und 2 bis 2,5 h lang bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden
erneut mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die Perlen wurden dann
auf Trägerröhrchen überführt und
mit einem Gammazähler
abgelesen. Die relative Inhibierung der H16.V5-Bindung wurde mit
einer Standardkurve unter Verwendung einer logistischen Vier-Parameter-Kurvenanpassung
verglichen. Die Standardkurve wurde unter Verwendung eines HPV16-Immunserums
mit einer willkürlich
festgesetzten Anzahl von Einheiten (mME/ml) abgeleitet.
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