JP2002535965A

JP2002535965A - ヒトパピローマウイルス・ウイルス様粒子を使用した中和アッセイ

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Publication number: JP2002535965A
Application number: JP2000591062A
Authority: JP
Inventors: ヤンセン，カトリン・ウー; イエイガー，マーク・デイ; ケラー，ポール・エム; ロウ，ロバート・エス; アステ−アメサガ，ミゲル
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-20
Publication date: 2002-10-29
Also published as: EP1140974A1; ATE290013T1; DE69924007D1; CA2355883A1; WO2000039151A1; EP1140974A4; EP1140974B1; DE69924007T2; AU2371000A; AU763853B2; ES2237204T3

Abstract

(57)【要約】レポーター遺伝子構築物と連結したパピローマウイルス様粒子（ＶＬＰ）からなる偽ビリオンが記載される。偽ビリオンは、抗ＶＬＰ中和抗体の存在を検出するためのアッセイにおいて使用されうる。偽ビリオンを作成するための方法も記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、血清又は血漿中のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）中和抗体を検
出する新規な方法に関する。

【０００２】発明の背景ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、生殖管に感染するものであり、様々な
形成異常、癌及びその他の疾患と関連付けられている。これらの疾患は現在、ワ
クチン開発のための標的となっており、Ｌ１カプシドタンパク質のみ又はＬ１＋
Ｌ２カプシドタンパク質を含有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）に基づくワクチン
が現在試験中である。

【０００３】ワクチン候補を試験するためには、中和アッセイが望ましいであろう。今日１
００を越えるＨＰＶ型が記載されているが、中和アッセイが存在するＨＰＶ型は
ほんの数個である。ＨＰＶは組織培養で増殖しないため、ＨＰＶのための中和ア
ッセイの開発は困難であった。

【０００４】ワクチン開発を促進するためには、任意のＨＰＶ型のための中和アッセイを得
るため容易に修飾されうる、基本的な中和アッセイを開発することが望ましであ
ろう。

【０００５】発明の説明本発明は、レポーター遺伝子ＤＮＡ構築物と共有結合したウイルス様粒子（Ｖ
ＬＰ）を含むパピローマウイルス「偽ビリオン（ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎ）」
に関する。好ましい実施態様において、ＶＬＰはヒトパピローマウイルス（ＨＰ
Ｖ）ＶＬＰである。

【０００６】本発明は、偽ビリオンに感染されうる細胞培養物と、試料と、偽ビリオンとを
合わせる工程、及び細胞による偽ビリオンの取り込み量を測定する工程を含む、
抗ＶＬＰ抗体が試料中に存在するか否かを決定するためのアッセイも含む。試料
が存在しない、又は試料が免疫前試料である対照と、取り込みを比較し、その際
、細胞による偽ビリオンの取り込みの減少を、試料中の中和抗体の存在の指標と
することができる。

【０００７】本発明のもう一つの態様は、比較的純粋なＶＬＰを生成させること、及びヘテ
ロ二官能性クロスリンカーを用いてレポーター遺伝子構築物を接着させることを
含む、偽ビリオン構築物を作成する方法である。

【０００８】本発明のさらにもう一つの態様は、細胞に偽ビリオンを感染させることを含む
、細胞へレポーター遺伝子を輸送する方法である。

【０００９】図面の簡単な説明図１は、ベータ−ラクタマーゼ遺伝子（ＢＬＡＭ）に基づくレポーター遺伝子
構築物を示す図である。

【００１０】図２は、ＨＰＶ１６中和モノクローナル抗体Ｈ１６．Ｖ５による、細胞へのＨ
ＰＶ１６偽ビリオン取り込みの阻害を示す図である。

【００１１】図３は、ＨＰＶ１６ＶＬＰで免疫感作された個体の血清中の中和抗体による
、細胞へのＨＰＶ１６偽ビリオン取り込みの阻害を示す図である。

【００１２】明細書及び請求の範囲の全体にわたり使用されるように、以下の定義が適用さ
れる。

【００１３】「偽ビリオン」とは、直接的に、又は結合基を介して、レポーター遺伝子構築
物と化学的に連結又は結合されたパピローマウイルス・ウイルス様粒子を意味す
る。

【００１４】「レポーター遺伝子構築物」とは、その転写及び翻訳の調節に必要な既知の必
要因子（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写終結配列等を含む）と共に
存在する、その転写活性、翻訳活性又はポストトランスレーション活性が好都合
に検出されうる、タンパク質をコードする任意の核酸を意味する。レポーター遺
伝子構築物の例には、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ及びグリーン
蛍光タンパク質等の遺伝子が含まれる。

【００１５】発明の詳細な説明偽ビリオン及びそれらを使用する方法は、特定のパピローマウイルス株又は他
のウイルスカプシドに依存しない。好ましい実施態様において、パピローマウイ
ルスはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）であり、特に好ましくは、ＨＰＶは性
器いぼ及び／又は性器癌と関連している株の一つであり、ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６
ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３
５、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５
２及びＨＰＶ５６からなる群より選択されうる。

【００１６】偽ビリオンは、事実上任意のパピローマウイルスＶＬＰから作成されうる。野
生型ＶＬＰは、一般的に、主要なＬ１と微量のＬ２タンパク質とから構成されて
いる。しかし、ＶＬＰはＬ１タンパク質のみを含有しうることが知られている。
さらに、修飾されたＬ１タンパク質、修飾されたＬ２タンパク質、Ｌ１タンパク
質又はＬ２タンパク質の少なくとも一部と融合したタンパク質（天然に存在する
ものであっても、そうでなくてもよい。例えば、ＨＰＶＥ−タンパク質）、及
び／又は付加的な天然に存在しないタンパク質を含有するＶＬＰが記載されてい
る。本発明の目的のため、前記ＶＬＰのうちの任意のものを、偽ビリオンの構築
のための出発材料として使用することができる。一般的に、好ましいＶＬＰは、
Ｌ１タンパク質、又はＬ１タンパク質とＬ２タンパク質との組み合わせ（「Ｌ１
＋Ｌ２」）のいずれかを含有する。

【００１７】Ｌ１タンパク質又はＬ１＋Ｌ２タンパク質を含有するＶＬＰは、Ｌ１タンパク
質又はＬ１＋Ｌ２タンパク質をコードする遺伝子で、選択された宿主細胞を形質
転換することにより作成されうる。一般的な技術、様々な型のＬ１及びＬ２の遺
伝子、並びにＬ１タンパク質及びＬ２タンパク質の組換え発現のための方法が、
当分野において既知であり、使用されうる。好ましい宿主細胞には、酵母、昆虫
細胞、哺乳動物細胞及び大腸菌が含まれる。

【００１８】本発明の一つの好ましい実施態様においては、酵母のＧａｌ１プロモーター及
びＧａｌ１０プロモーターのような既知の酵母プロモーターの調節下でＬ１タン
パク質をコードする遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡで、酵母を形質転換する
。増殖培地へのガラクトースの添加により、遺伝子産物の発現を誘導し、誘導さ
れた細胞の溶解物からＶＬＰを単離する。

【００１９】偽ビリオンを作成するため、事実上任意のレポーター遺伝子構築物をＶＬＰと
カップリングさせることができる。使用される一つの好ましいレポーター遺伝子
構築物は、ベータ−ラクタマーゼ遺伝子（「ＢＬＡＭ」）であるが、ベータ−ガ
ラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ及びグリーン蛍光タンパク質のような酵素もし
くはタンパク質をコードするその他のレポーター構築物、又は重ね継ぎした転写
物をコードする遺伝子も、使用されうる。

【００２０】レポーター構築物は、既知のカップリング反応を使用してＶＬＰとカップリン
グされうる。好ましい実施態様においては、レポーター遺伝子構築物を市販のリ
ンカーに結合させ、リンカーをＶＬＰに結合させる。好ましいクロスリンキング
試薬は、（スクシンイミジル−マレイミドメチル−シクロヘキサン−カルボキシ
ラート「ＳＭＣＣ」）である。ＳＭＣＣに加え、有用であるかもしれないその他
のクロスリンキング試薬は、以下の特性を有するであろう。１）妨害的なオリゴ
−オリゴ又はＶＬＰ−ＶＬＰのクロスリンキングを排除するであろうヘテロ二官
能性クロスリンカー又は段階的に活性化されたクロスリンカー、２）５’−アミ
ノ又は５’−チオールで修飾されたオリゴヌクレオチドとの安定な反応、３）Ｖ
ＬＰタンパク質上の第一級アミン部、遊離のスルフヒドリル部、又は炭水化物部
との安定な反応。これらの試薬には、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４−（ｐ−
マレイミドフェニル）ブチラート、ＳＩＡＢ（スクシンイミジル（４−ヨードア
セチル）アミノベンゾアート、ＧＭＢＳ（ｎ−（４−マレイミド−ブチリルオキ
シ）−スクシンイミド、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミ
ドエステル及びＭＰＢＨ（４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド
ヒドロクロリド、並びにそれらの硫酸化誘導体が含まれるであろうが、これらに
限定されない。

【００２１】そのようなリンカーの構築において、レポーター遺伝子構築物とＶＬＰとのモ
ル比は変動しうる。本発明によると、レポーター遺伝子構築物とＶＬＰとのモル
比は、約０．１から５０、好ましくは約１から５、より好ましくは実質的に約１
から１であるべきである。

【００２２】本発明の利点の一つは、同一のレポーター系及び試験系を使用して、多様なＨ
ＰＶのための偽ビリオンが容易に作製されうるという点である。もう一つの利点
は、所望により、レポーター系を容易に修飾することができる点である。

【００２３】本発明の重要な態様は、中和抗体の存在を検出するための偽ビリオンの使用で
ある。ＨＰＶ及びその他のパピローマウイルスの生物学に関しては多少の情報が
既知であるが、未だｉｎｖｉｔｒｏでの培養は成功していない。さらに、多数
の動物種がパピローマウイルスにより感染されうるが、それぞれの種はそれ自身
のパピローマウイルス株にのみ感染されうる。そのため、例えば、ワタオウサギ
パピローマウイルス（ＣＲＰＶ）をワタオウサギにおいて研究し、ヒト疾患のた
めのモデルとして使用することは成功しているが、ヒトパピローマウイルスをウ
サギにおいて直接研究することはできない。ＨＰＶＶＬＰに基づく様々なワク
チンが現在開発中であるが、現在のところ、中和アッセイは全てのＨＰＶ株につ
いて利用可能ではない。

【００２４】本発明のアッセイにおいては、偽ビリオンと、中和抗体を含有することが疑わ
れる試料と、細胞培養物とを接触させる。このアッセイにおいて使用される細胞
は、パピローマウイルスに感染されうることが知られている任意の細胞でありう
る。ＨＰＶ偽ビリオンの場合、細胞は、Ｃ３３Ａ（ＡＴＣＣより入手可能）、Ｈ
ｅＬａ細胞等のようなヒト癌細胞でありうる。（好ましい実施態様においては患
者由来の血清であり得る）試料が中和抗体を含有している場合には、中和抗体が
偽ビリオンと相互作用し、細胞による偽ビリオンの取り込みを妨害するであろう
。同一の偽ビリオン及び細胞が使用されるが、試料が、排除されているか、又は
中和抗体を含有しないことが既知の試料に置き換えられている対照アッセイを、
場合により実施することができる。対照試料のもう一つの例は、免疫前の起源に
由来するものである。

【００２５】アッセイにおいて、細胞への偽ビリオンの取り込みの減少は、試料中に存在す
る中和抗体の量と相関している。利用されるレポーター遺伝子構築物により、量
が定量されうる。レポーター遺伝子を発現している細胞の数、及び発現の程度の
定量は、フローサイトメトリーを使用して達成されうる。放出波長の５２０ｎｍ
／４５０ｎｍ比の同時測定は、個々の細胞中の切断されたＣＣＦ２基質の割合と
直接関係しており、基質濃度又は細胞の容積には依存しないため、いずれかの波
長単独で得られるよりも良好な、ノイズに対するシグナルが得られる。

【００２６】さらに、感染に応答する細胞亜集団を、蛍光標示式細胞分取法により濃縮し、
例えばレポーター・スプライス異型の定量的ＲＴＰＣＲアッセイを使用して、
応答性細胞の集団を拡大するため培養することができる。本発明のこれらのアッ
セイは、小型化及び／又は自動化され、ハイスループットスクリーニングのため
９６穴フォーマットで使用されうる。

【００２７】本発明は、これらの偽ビリオンの混合物上の多価中和血清を試験するための、
異なるレポーターによる偽ビリオンの標識も可能にする。これは、対象における
多価ワクチン応答を追跡するために使用されうる。

【００２８】本発明のもう一つの態様は、異なる遺伝子材料を多様な標的細胞へ輸送するた
めの偽ビリオンの使用である。実質的に同一のリンカー系が偽ビリオンを構築す
るために使用されるが、レポーター遺伝子構築物は、選択された遺伝子を発現す
る遺伝子構築物に置き換えられる。

【００２９】本発明を制限するものではない以下の実施例は、本発明をさらに例示するため
提示される。

【００３０】実施例１酵母におけるＨＰＶ１６ＶＬＰの発現参照して本明細書に組み込まれる公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９５／３１５３２
の記載と本質的に同様に、ＨＰＶ１６ＶＬＰが作成される。

【００３１】ＨＰＶ１６のＬ１遺伝子及びＬ２遺伝子のクローニング標準的な技術により、Ｃａｓｋｉ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５５０）から、全
ゲノミックＤＮＡを抽出した。ＤＮＡをＢｓｔ１１０７Ｉエンドヌクレアーゼ及
びＳｐｈＩエンドヌクレアーゼで消化し、調製用０．８％低融点アガロースゲル
で電気泳動した。およそ３．５ｋｂｐのＤＮＡに相当する領域をゲルから切り出
し、アガロースをＧｅｌａｓｅ（登録商標）酵素（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で消化した。ゲル精製されたＤＮＡをＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、内部にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有する平滑末
端化されたリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドリンカーと連結した。連
結混合物をＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化し、およそ３．５ｋｂｐのＤＮＡを前記
のようなアガロースゲルでサイズ分画した。ゲル精製されたＤＮＡを、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで消化され脱リン酸化されたｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡと連結した。コ
ンピテント大腸菌ＤＨ５細胞（ＢＲＬ）の形質転換後、ＨＰＶ−１６Ｌ１遺伝
子の３’末端と相補的なアンチセンス^３２Ｐ−標識オリゴデオキシヌクレオチド
（５’−ＧＡＧＡＧＡＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＡＣＧＴＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴ
ＡＧＣ−３’）（配列番号１）を使用したコロニーハイブリダイゼーションによ
り、ＨＰＶ１６陽性クローンについてプラスミドライブラリーをスクリーニング
した。３．３ｋｂｐのＨＰＶ１６ゲノミック断片を含有するｐＵＣ１８プラスミ
ドを単離し、制限酵素分析及びサザンブロット分析により特徴決定した。このプ
ラスミドは、ｐＵＣ１８−ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２と名付けられ、Ｌ１及びＬ２
のコーディングＤＮＡ配列を全て含有している。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇ
ｅｎ（登録商標）プラスミドマキシキット（ＰｌａｓｍｉｄＭａｘｉｋｉｔ
）（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を使用して調製した。

【００３２】ＨＰＶ１６Ｌ１酵母発現ベクターの構築クローンｐＵＣ１８−ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２を、ＰＣＲのための鋳型として
使用した。Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，
Ｉｎｃ．）、１０サイクルの増幅（９４℃１分；４８℃１分；７２℃１分４５秒
）及び隣接するＢｇｌＩＩ部位（下線）を含有する以下のオリゴデオキシヌクレ
オチドプライマーを使用したＰＣＲにより、ＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子を増幅した
。

【００３３】センスプライマー：５’−ＣＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＴＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＣＴＡＴＧＴＡＧＧＣＣ−３’（配列番号２）アンチセンスプライマー：５’−ＧＡＧＡＧＡＴＣＴＴＡＣＡＧＣ
ＴＴＡＣＧＴＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＡＧＣ−３’（配列番号３）センスプライマーは、ＨＰＶ１６Ｌ１開始メチオニンコドンの直上流に、酵
母非翻訳リーダー配列を導入する（太字で強調）。１．５ｋｂｐのＬ１ＰＣＲ
産物をＢｇｌＩＩで消化し、ゲル精製し、ＢａｍＨＩで消化されたｐＣ１／１−
ＧＡＬベクターと連結した。ＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子を含有するｐＣ１／１−Ｇ
ＡＬプラスミドを単離し、ｐ１４０４９−３７−１と名付けた。ＰＲＩＳＭ（登
録商標）キット（ＡＢＩ，Ｉｎｃ）及びＡＢＩシーケンサーモデル＃３７３Ａを
製造業者の指示に従い使用して、ｐ１４０４９−３７−１中のＬ１遺伝子を配列
決定した。この単離物中のＬ１遺伝子は、修正され発表された原型配列（Ｋｉｒ
ｎｂａｕｅｒ，Ｒ．ら，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６９２９−６９３
６）と比して、Ｈｉｓ−２０２からＡｓｐ、Ｔｈｒ−２６６からＡｌａという２
個のアミノ酸変化を生じる３個のヌクレオチド変化を含有することが示された。
最初の鋳型ＤＮＡの配列分析により、これらの変化がゲノミッククローンｐＵＣ
１８−ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２にも存在しており、ＰＣＲにより導入されたので
はないことが確認された。

【００３４】ＨＰＶ１６Ｌ１及びＬ２酵母発現ベクターの構築プラスミドｐ１４０４９−３７−１（ｐＣ１／１−ＧＡＬ＋ＨＰＶ１６Ｌ１
）を、ＧＡＬ１０プロモーターとＡＤＨ１転写終結因子の間を切断するＳｍａＩ
で消化した。鋳型としてのｐＵＣ１８−ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２ＤＮＡ、Ｖｅｎ
ｔポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）、１０
サイクルのＰＣＲ増幅（９４℃１分；４８℃１分；７２℃１分４５秒）及び隣接
するＳｍａＩ部位（下線）を含有する以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライ
マーを使用したＰＣＲにより、１．４ｋｂｐのＨＰＶ１６Ｌ２遺伝子を増幅し
た。

【００３５】センスプライマー：５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＣＧＡＣＡＣＡＡＡＣＧＴＴＣＴＧＣＡＡＡＡＣ
−３’（配列番号４）アンチセンスプライマー：５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＣＴＡＧＧＣ
ＡＧＣＣＡＡＡＧＡＧＡＣＡＴＣＴＧＡ−３’（配列番号５）センスプライマーは、ＨＰＶ１６Ｌ２開始メチオニンコドンの直上流に、酵
母非翻訳リーダー配列を導入する（太字で強調）。１．４ｋｂｐのＬ２ＰＣＲ
産物をＳｍａＩで消化し、ゲル精製し、ＳｍａＩで消化されたｐ１４０４９−３
７−１ベクターとライゲートした。ＨＰＶ１６Ｌ１遺伝子及びＨＰＶ１６Ｌ
２遺伝子の両方を含有するｐＣ１／１−ＧＡＬプラスミドを単離し、ｐ１４０４
９−４２−２と名付けた。ＰＲＩＳＭ（登録商標）キット（ＡＢＩ，Ｉｎｃ）及
びＡＢＩシーケンサーモデル＃３７３Ａを製造業者の指示に従い使用して、ｐ１
４０４９−４２−２中のＬ２遺伝子を配列決定した。この単離物中のＬ２遺伝子
は、修正され発表された原型配列（Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ，Ｒ．ら（１９９３）、
前記）と比して、Ｓｅｒ−２６９からＰｒｏという１個のアミノ酸変化を生じる
５個のヌクレオチド変化を含有することが示された。ゲノミッククローンｐＵＣ
１８−ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２の配列分析により、これらの変化が最初の鋳型Ｄ
ＮＡにも存在しており、ＰＣＲにより導入されたのではないことが確認された。

【００３６】酵母におけるＨＰＶ１６Ｌ１の発現、並びにＨＰＶ１６Ｌ１及びＬ２の共発現プラスミドｐ１４０４９−３７−１（ｐＣ１／１−ＧＡＬ＋ＨＰＶ１６Ｌ
１）及びｐ１４０４９−４２−２（ｐＣ１／１−ＧＡＬ＋ＨＰＶ１６Ｌ１及び
Ｌ２）を、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株＃１５５８を形質転
換するために使用した。得られた組換え株は、表に示されたような＃１６７８（
ＨＰＶ１６−Ｌ１）及び＃１６７９（ＨＰＶ１６Ｌ１＋Ｌ２）であった。クロ
ーン単離物を３０℃で２％ガラクトースを含有するＹＥＨＤ培地で６８〜７８時
間増殖させた。細胞を採取した後、細胞ペレットをガラスビーズで破壊し、イム
ノブロット分析により、ＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質又はＨＰＶ１６Ｌ２タン
パク質の発現に関して細胞溶解物を分析した。４０ｍｃｇの全細胞タンパク質を
含有する試料を、還元条件下及び非変性条件下で１０％トリス−グリシンゲルで
電気泳動し、ニトロセルロースフィルターへ電気泳動的に転写した。ＨＰＶ１６
Ｌ１タンパク質は、ｔｒｐＥ−ＨＰＶ１１Ｌ１融合タンパク質に対するウサ
ギポリクローナル抗血清（Ｄ．Ｂｒｏｗｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２０１：４６
−５４）を一次抗体として使用し、ＨＲＰ結合ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）を二次抗体として使用して免疫学的に検出した。フィル
ターを、化学発光ＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）を使用して
処理した。５０〜５５ｋＤａのＬ１タンパク質のバンドが陰性対照（Ｌ１又はＬ
２の遺伝子を含まないｐＣ１／１）を除く全ての試料中に検出された。Ｌ２タン
パク質は、大腸菌で発現されたｔｒｐＥ−Ｌ２融合タンパク質に対するマウス抗
ＨＰＶ１６Ｌ２血清を一次抗体として使用したイムノブロットにより、７０ｋ
Ｄａのタンパク質のバンドとして検出された。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（
Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）を二次抗体として使用し、フィルターは前記と同
様に処理した。

【００３７】実施例２ＶＬＰの精製精製は、参照して本明細書に組み込まれる同時係属中の米国仮特許出願第６０
／０９６，５６８号の記載と本質的に同様に行った。

【００３８】ＶＬＰを発現するよう形質転換された酵母細胞を採取し、−７０℃で保存のた
め凍結させた。凍結酵母細胞懸濁液を保存庫から取り出し、室温でおよそ３時間
、その後、４℃でおよそ１８時間解凍させた。ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）
（ＮｙｃｏｍｅｄＰｈａｒｍａＡ／Ｓ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａ
ｒｋ）（２．８×１０^５単位／ｍＬ及び０．２１ｍｇタンパク質／ｍＬ）を、湿
重量で細胞１グラム当たり７５０単位という最終濃度で細胞懸濁液に添加し、１
回の実験においては、湿重量で細胞１グラム当たり３３５単位に減じた。細胞を
１５分間攪拌し、次いで１４，５００から１６，０００ｐｓｉのチャンバー圧で
、消毒されたＡＰＶＧａｕｌｉｎ３０ＣＤホモジナイザーに２回通すことに
より破砕し、９５％細胞破砕物を得た。残存した溶解物を、４℃で１８時間穏和
に攪拌した。

【００３９】微小濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）による清澄化細胞溶解物を、
以下のような透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）様式で交差流（ｃｒｏｓ
ｓ−ｆｌｏｗ）微小濾過により清澄化した。溶解物を直径１インチの投入口及び
排出口を有する無菌の処理漕へ移した。微小フィルターは、Ａ／Ｇテクノロジー
ズ（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＦｌｅｘＳｔａｎｄ（登録商標）ベンチトップ
・パイロット・ホロー・ファイバー・システム（ＢｅｎｃｈｔｏｐＰｉｌｏｔ
ＨｏｌｌｏｗＦｉｂｅｒｓｙｓｔｅｍ）に収納された、５平方フィートの
表面積を有する０．６５ミクロンの孔サイズの中空繊維フィルターカートリッジ
（Ａ／ＧＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＣＦＰ−６−Ｄ−８Ａ、Ｎｅｅｄｈａ
ｍ、ＭＡ）であった。保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を３容量の透析濾過バッフ
ァー（下記）を用いて透析濾過し、清澄化された溶解物を作製した。透析濾過バ
ッファーは、０．２Ｍ（Ｎａ^＋）ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）＋０．４ＭＮａＣｌ
であった。

【００４０】清澄化された溶解物のクロマトグラフィクロマトグラフィカラムに充填され
たＰＯＰＯＳ（登録商標）５０ＨＳ強陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂（Ｐｅ
ｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を使
用したカラムクロマトグラフィにより、清澄化された溶解物を分画した。カラム
を、使用前に０．５ＮＮａＯＨで消毒した。ＨＰＶ透析濾過バッファー［０．
２Ｍ（Ｎａ^＋）ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）＋０．４ＭＮａＣｌ］で、室温で、カ
ラムを平衡化した。冷却された（４℃）清澄化された溶解物を、１２５ｍＬ／分
でカラムに注入し、１００％ＨＰＶカラムバッファーＡから１００％ＨＰＶカラ
ムバッファーＢ［０．０５Ｍ（Ｎａ^＋）ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）＋１．５ＭＮ
ａＣｌ］という直線勾配で、１２５ｍＬ／分で、８カラム容量の室温ＨＰＶカラ
ムバッファーＡ［０．０５Ｍ（Ｎａ^＋）ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）＋０．５ＭＮ
ａＣｌ］でカラムを洗浄した。全直線勾配は１０カラム容量であり、１０等分の
容量の画分で収集した。勾配後、１２５ｍＬ／分で２カラム容量の室温ＨＰＶカ
ラムバッファーＢでカラムを洗浄し、それをさらに２画分で収集した。画分は、
無菌の２リットルのプラスチックボトルに収集し、４℃で保存した。勾配中の最
後のＵＶ吸収ピーク（Ａ２８０ｎｍ及びＡ２３０ｎｍ）を含有する画分は、プー
ルし、ＭＩＬＬＩＰＡＫ−２００ディスポーザブルフィルターユニット（Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して濾過し、４℃で保存した。

【００４１】ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ全工程を室温で実施した。ＩＩ型
セラミックハイドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄカタログ＃７３２００８１
、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が充填されたクロマトグラフィカラム（１３ｍｍ
ＩＤ×３６ｍｍ）を、５０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）＋１．２５ＭＮａＣ
ｌで予備平衡化した。前工程からの部分精製されたＨＰＶ溶液を、９０ｃｍ／時
間という直線的な流速でカラムに適用した。試料の適用が完了した後、カラム溶
出物の光学濃度がほぼゼロになるまで、８カラム容量の予備平衡化バッファーで
カラムを洗浄した。ＨＰＶ産物を、やはり９０ｃｍ／時間という直線的な流速で
、溶出バッファー（０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）＋１．２５ＭＮ
ａＣｌ）の０％から１００％直線勾配で溶出させた。全勾配容量は、４カラム容
量であった。ワクチン産物を含有する画分をＲＩＡ及びブラッドフォードタンパ
ク質アッセイにより同定した。産物のタンパク質濃度は１００μｇ／ｍＬであっ
た。

【００４２】アッセイ：ブラッドフォードタンパク質アッセイは、ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）を標準として使用したクーマシープラスアッセイリージェント（Ｃｏｏｍ
ａｓｓｉｅＰｌｕｓＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔ）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃ
ｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して実施された。ローリータンパク質アッセイは、較
正標準としてＢＳＡを使用したローリーら（Ｌｏｗｒｙら、１９５１Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７０）の手法に従い実施された。抗原は、
ＶＬＰのコンフォメーション依存エピトープを認識するモノクローナル抗体を使
用した多層ＥＬＩＳＡによりアッセイされた。マイクロタイタープレートは、ポ
リクローナルヤギ抗ＨＰＶＶＬＰ抗体でコートされた。標準及び被験試料は、
１％ｗ／ｖＢＳＡ、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０及び０．１％アジ化ナトリウム
を含有するＰＢＳで希釈され、プレートに結合した抗体により抗原が捕捉される
よう、ウェルへ添加された。プレートに結合した抗体により捕捉された抗原と結
合するよう、モノクローナル抗ＨＰＶＬ１ＶＬＰ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、
Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）がウェルに添加された。モノクローナル抗ＨＰＶＶ
ＬＰ抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体により検出さ
れた。西洋ワサビペルオキシダーゼの色原性基質、３，３’，５，５’−テトラ
メチルベンジジン（Ｐｉｅｒｃｅ）が添加され、４５０ｎｍにおける吸光度が試
料中のＬ１ＶＬＰの濃度に比例していた。

【００４３】実施例３「偽ビリオン」を作製するためのベータ−ラクタマーゼレポーターの生成及びＨＰＶ１６ＶＬＰとのカップリングベータ−ラクタマーゼレポーター遺伝子は以下のようにして構築された。５’
−アミン修飾されたオリゴを設計し、合成し（ＭｉｄｌａｎｄＣｅｒｔｉｆｉ
ｅｄＲｅａｇｅｎｔｓ；Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ）、そしてＡｕｒｏｒａベクタ
ーｐｃＤＮＡ３−ＢＬＡＭ（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら、１９８８Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７９：８４−８８）の、ＣＭＶプロモーター＋ＢＬＡＭ＋ポリＡテールを含
有する区画を増幅するため使用した（図１）。両方のカップリング方向のための
プライマー（即ち、センス鎖の５’末端にアミンが位置するもの、又はアンチセ
ンス鎖の５’末端にアミンが位置するもの）を使用することができる。最終アッ
セイにおけるＤＮＡエキソヌクレアーゼによる分解を減少させ、そしてＤＮＡを
検出可能にするため、下流プライマーは５’−ビオチン化した。プライマーの配
列については、表１を参照のこと。

【００４４】

【表１】まず、プライマーＡ及びＢを使用して、５９１ｂｐのヒトＣＭＶプロモーター
、８０９ｂｐのベータ−ラクタマーゼ及び１３５ｂｐのウシ成長ホルモンポリＡ
終結因子配列をコードする１７９８塩基対（ｂｐ）の配列を増幅した。ＰＣＲ産
物をゲル濾過（シリカゲルメンブレンを有するスピンカラム、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉ
ｎｃ．）を使用して精製し、ＯＤ２６０ｎｍにおけるＵＶ分光測定法により定量
し、ヘテロ二官能性クロスリンカーＳＭＣＣ（スクシニミジル−マレイミドメチ
ル−シクロヘキサン−カルボキシラート）のＮＨＳエステルと、製造業者の指示
に従い２０℃で１時間結合させた。

【００４５】結合したレポーター遺伝子をゲル濾過（ＭｉｃｒｏｓｐｉｎＧ−２５、Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）により精製し、次いで、マレイミド基を介して、濃縮されたＨ
ＰＶ１６ＶＬＰ（０．９７ｍｇ／ｍＬ）上の遊離のスルフヒドリルと反応させ
た（Ｌ１モノマー１個当たり、およそ１個の遊離スルフヒドリル）。

【００４６】次いで、中和アッセイにおいて使用するため、偽ビリオンを無菌濾過した。初
期実験は、このレポーターとＶＬＰとの低いカップリング比が有益であることを
示した（データは示していない）。反応は４℃で１２時間行った。

【００４７】実施例４ＨＰＶ偽ビリオンによるＣ３３Ａ細胞の感染２０００個のＣ３３Ａ細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ３１）を、３７℃で３日間、ペ
ニシリン及びストレプトマイシン（それぞれ１００Ｕ／ｍＬ及び１００ｍｃｇ／
ｍＬ）並びに１０％ウシ胎児血清を含有する完全ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イー
グル培地）（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）中で培養した。感染前に、血清含有培地を除
去し、２００ｎｇのＨＰＶ１６偽ビリオンを含む５０ｍｃＬのｏｐｔｉ−ＭＥＭ
（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を添加した。感染の２４時間後、１００ｍｃＬの完全Ｄ
ＭＥＭ培地で細胞を培養した。感染の２日後、ベータ−ラクタマーゼの基質であ
るＣＣＦ２（Ａｕｒｏｒａ）を使用して、感染ＣＡ３３Ａ細胞において、ベータ
−ラクタマーゼレポーター遺伝子発現を検出した（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ、前記）
。

【００４８】簡単に説明すると、細胞をｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地で洗浄した後、５０ｍｃＬの
ＣＣＦ２を含有するローディングバッファーを、９６穴プレート（ＦＡＬＣＯＮ
、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の各ウェルに添加した。ＣＣＦ２の最終
濃度は５ｍＭであった。プレートを室温で３時間インキュベートした。ベータ−
ラクタマーゼを発現している細胞におけるＣＣＦ２の変換を、蛍光顕微鏡（Ｏｌ
ｙｍｐｕｓ、モデルＩＸ７０）を使用して、４６０ｎｍの青色への蛍光放出波長
のシフトをモニターすることにより追跡した。感染の２日後、平均して、２０４
＋／−５５（ｎ＝１２）の青色細胞が検出できた。

【００４９】実施例５モノクローナル抗体及びＨＰＶ１６ＶＬＰで免疫感作された個体由来の免疫血清によるＨＰＶ１６偽ビリオン感染の中和１ウェル当たり２０００個のＣ３３Ａ細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ３１）を、９６
穴プレート（ＦＡＬＣＯＮ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で、３７℃で
３日間、完全ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）中で培養した。（ｉ）ヒト免疫前
血清、（ｉｉ）ＨＰＶ１６ＶＬＰで免疫感作された個体由来の免疫血清、（ｉ
ｉｉ）他のＨＰＶＶＬＰで免疫感作された個体由来の免疫血清の１：４０希釈
物、又は（ｉｖ）ＨＰＶＶＬＰ特異的モノクローナル抗体の様々な希釈物を、
２５ｍｃｌ、ウェルに添加し、続いて２００ｎｇの偽ビリオンを含有する培地を
２５ｍｃｌ添加した。プレートを、ＣＯ_２インキュベーター（５％ＣＯ_２）内で
３７℃でインキュベートし、次いで実施例３の記載と同様に分析した。ＨＰＶ１
６中和モノクローナル抗体又はヒト免疫血清を含有するウェル中の青色細胞の、
非特異的モノクローナル抗体又は免疫前血清を含有するウェルに対する減少率（
％）を計算することにより、中和率（％）を決定した。図２は、既知のＨＰＶ１
６中和モノクローナル抗体Ｈ１６．Ｖ５を含有する腹水の段階希釈物による、Ｈ
ＰＶ１６偽ビリオンの中和率（％）を示す。非特異的モノクローナル抗体Ｈ１８
．Ｊ４を含有する腹水の１：１０，０００希釈物は、中和能力を示さなかった。
記載されたアッセイを使用して、ＨＰＶ１６ＶＬＰで免疫感作された個体の５
２個の血清のパネルを、１：８０最終血清希釈率で試験した。免疫血清の大部分
が、このアッセイにおいて中和能力を示した（図３）。さらに、ＨＰＶ１６Ｒ
ＩＡ抗体試験により決定されたＨＰＶ１６ＶＬＰ特異的抗体の力価と中和率（
％）との間には良好な相関が見られた（図３）。

【００５０】実施例６ポリスチレンビーズ（鏡面仕上げされた１／４インチ）を、１：１０００希釈
率の正常ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で予備コートした。３
０００ビーズのバッチ、７．５ビーズ／ｍＬを４℃で一夜インキュベートした。
次いで、ビーズを５容量の脱イオン水で洗浄し、ペーパータオルの上に乾燥ブロ
ットし、ステンレススチールトレー上で空気乾燥させた。１ｍｌ当たり５０ｎｇ
のＶＬＰを含有するＭＯＰＳバッファー（５０ｍＭＭＯＰＳ＋０．５ＭＮａ
Ｃｌ（ｐＨ７．０））を使用して、ＨＰＶ１６Ｌ１ＶＬＰで、予備コートさ
れたビーズをコートした（１ｍｌ当たり５ビーズ）。抗原及びバッファーを、ま
ずＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）培地ボトルで混合し、次いでビーズを添加した。
コーティング抗原及びビーズを含有するボトルを、コールパルマー（Ｃｏｌｅ
Ｐａｌｍｅｒ）回転機に固定し、コーティングを室温で１時間５ｒｐｍで行った
。ビーズを５容量のＭＯＰＳバッファーで洗浄し、ビーズの浸液状態が維持され
るよう十分なバッファーを添加した。次いで、最大４ヶ月間、必要時まで４℃で
それらを保存した。

【００５１】ＨＰＶ１６Ｌ１ＶＬＰ抗体ＲＩＡは、抗体が、限定された量のコンフォメ
ーション依存特異的モノクローナル抗体Ｈ１６．Ｖ５と、限定された数のエピト
ープについて競合する、競合的抗体アッセイである。Ｈ１６．Ｖ５を含有する腹
水を、ＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で１：８
００，０００希釈率で使用した。等量（１００ｍｃｌＬ）の試料血清及び希釈さ
れたＨ１６．Ｖ５を、２０穴アボット（Ａｂｂｏｔｔ）アッセイプレートのウェ
ルで混合した。次いで、単一のＨＰＶ１６抗原でコートされたビーズをアッセイ
ウェルに添加した。試料は、デュプリケートでアッセイされた。

【００５２】アッセイプレートを粘着シートで密封し、室温で１７から２４時間インキュベ
ートした。アボット（Ａｂｂｏｔｔ）プレートウォッシャーを使用して、プレー
トを脱イオン水で洗浄した。ＨＰＶ１６ＶＬＰでコートされたビーズと結合す
ることに成功したマウスＭＡＢの量を、^１２５Ｉ［ヤギ抗マウスＩｇＧ］（ＮＥ
ＮＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で検出した。プレート
を新たな粘着シートで密封し、３７℃で２から２．５時間インキュベートした。
プレートを脱イオン水で再び洗浄した。次いで、ビーズをキャリアーチューブに
移し、ガンマカウンターで読み取りを行った。Ｈ１６．Ｖ５結合の相対的な阻害
を、４パラメータロジスティック曲線適合を使用して標準曲線と比較した。標準
曲線は、任意に指定された単位数（ｍＭＵ／ｍＬ）をもつＨＰＶ１６免疫血清を
使用して得られた。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】ベータ−ラクタマーゼ遺伝子（ＢＬＡＭ）に基づくレポーター遺伝子構築物を
示す図である。

【図１Ｂ】ベータ−ラクタマーゼ遺伝子（ＢＬＡＭ）に基づくレポーター遺伝子構築物を
示す図である。

【図２】ＨＰＶ１６中和モノクローナル抗体Ｈ１６．Ｖ５による、細胞へのＨＰＶ１６
偽ビリオン取り込みの阻害を示す図である。

【図３】ＨＰＶ１６ＶＬＰで免疫感作された個体の血清中の中和抗体による、細胞へ
のＨＰＶ１６偽ビリオン取り込みの阻害を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者イエイガー，マーク・デイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ケラー，ポール・エムアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ロウ，ロバート・エスアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者アステ−アメサガ，ミゲルアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 4B024 AA14 BA32 CA02 DA20 EA02 FA20 HA11 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ10 QQ30 QR10 QR77 QR79 QS28 QS40 QX02 4B065 AA95X AB00 AC20 BA01 BA30 BD50 CA31 CA46 4H045 AA30 BA10 CA01 DA89 EA53 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】レポーター遺伝子構築物と共有結合したウイルス様粒子（Ｖ
ＬＰ）を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）偽ビリオン。
【請求項２】ＨＰＶが、ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１
６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ４
３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２及びＨＰＶ５６からなる
群より選択される、請求項１に記載の偽ビリオン。
【請求項３】ＶＬＰがＬ１タンパク質又はＬ１＋Ｌ２タンパク質からなる
、請求項１に記載の偽ビリオン。
【請求項４】レポーター遺伝子構築物が、ベータ−ラクタマーゼ遺伝子構
築物、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子構築物、ルシフェラーゼ遺伝子構築物及
びグリーン蛍光タンパク質遺伝子構築物からなる群より選択される、請求項３に
記載の偽ビリオン。
【請求項５】ＨＰＶＶＬＰと、ヘテロ二官能性クロスリンカーと、レポ
ーター遺伝子構築物とを含む偽ビリオン。
【請求項６】レポーター遺伝子構築物とＶＬＰとのモル比が約０．１から
５０である、請求項５に記載の偽ビリオン。
【請求項７】レポーター遺伝子構築物とＶＬＰとのモル比が約１から５で
ある、請求項５に記載の偽ビリオン。
【請求項８】レポーター遺伝子構築物とＶＬＰとのモル比が約１から１で
ある、請求項５に記載の偽ビリオン。
【請求項９】抗ＨＰＶ中和抗体が試料中に存在するか否かを決定するため
のアッセイであって、（ａ）偽ビリオンと、偽ビリオンに感染されうる細胞培養物と、試料とを接触
させる工程、及び（ｂ）細胞による偽ビリオンの取り込みが阻害されるか否かを決定する工程、
ここにおいて、取り込みの阻害は試料中の抗ＨＰＶ中和抗体を指す、を含むアッ
セイ。
【請求項１０】試料がヒト由来の血清を含む、請求項９に記載のアッセイ
。
【請求項１１】結果を、対照アッセイを使用して得られた結果と比較する
工程をさらに含む、請求項１０に記載のアッセイ。
【請求項１２】偽ビリオンがベータ−ラクタマーゼ遺伝子構築物を含む、
請求項９に記載のアッセイ。