-
Gebiet der
Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft infektiöse chimäre Human-Papillomaviren (HPVs)
und Verfahren zu deren Herstellung. Sie umfasst auch verschiedene
Assays, welche von diesen Viren Gebrauch machen.
-
Hintergrund
der Erfindung
-
Das
Vermögen
zur Herstellung infektiöser
Human-Papillomaviren wurde durch die Schwierigkeit bei der Vermehrung
von Virus in vivo oder in vitro behindert. Mehrere Verfahren wurden
dazu eingesetzt, um einige wenige Virustypen zu vermehren, diese
sind jedoch aufgrund der spezifischen Replikationsbedingungen eines jeden
Typs nicht für
alle Viren geeignet.
-
Raft-Kulturen
wurden zur Herstellung von infektiösem HPV 18 (US-Patent 5,994,115
(Meyers) und Meyers et al., 1997, J. Virol. 71(10):7381-6) und HPV
31 b (Meyers et al., 1992, Science 257:971-973, 1992) eingesetzt.
Die Herstellung von infektiösem
HPV 11 wurde ebenfalls unter Verwendung des Xenograph-Mausmodells
erreicht (Kreider et al., 1987, J. Virol. 61:590).
-
Die
Typen von infektiösem
HPV, die bisher hergestellt wurden, repräsentieren nur eine kleine Anzahl der über 80 HPV-Typen,
die identifiziert wurden. Es wäre äußerst wünschenswert,
ein System zu entwickeln, mit dem andere HPV-Serotypen bequem kultiviert
werden können,
einschließlich
chimärer
HPVs. Ferner wäre es
wünschenswert,
einen empfindlichen Assay zu entwickeln, welcher zum Nachweis der
Anwesenheit von Infektivität
und neutralisierenden Antikörpern
verwendet werden kann. WO 00/39151 beschreibt einen Assay hinsichtlich
neutralisierender Antikörper
unter Einsatz virus-ähnlicher
Partikel.
-
Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
-
Diese
Erfindung betrifft infektiöse
chimäre
Papillomaviren. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Papillomaviren
Chimären,
wobei die frühen
Gene (beispielsweise E1, E2, E3, E4, E5, E6 und E7) von HPV 18 stammen
und die späten
Gene (L1 und L2) von einem zweiten Papillomavirus-Typ stammen. Die
späten Gene
können
in bevorzugten Ausführungsformen
andere Human-Papillomavirus-Serotypen oder sogar nicht-humane Papillomaviren
(d.h. Rinder-Papillomavirus BPV, Baumwollschwanzkaninchen-Papillomavirus (Sylvilagus-Papillomavirus)
CRPV und oraler Hunde-Papillomavirus COPV) einschließen.
-
In
Ausführungsformen,
bei denen die späten
Gene von einem Human-Papillomavirus stammen, sind sie vorzugsweise
aus der Gruppe bestehend aus Serotypen, welche mit menschlichen
Erkrankungen, wie z.B. Genitaltumoren und -warzen assoziiert sind,
d.h. HPV 6a, HPV 6b, HPV 11 und HPV 16, ausgewählt. Andere bevorzugte Serotypen
schließen
ein: HPV 1, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 41, HPV 47, HPV
51, HPV 57 und HPV 58.
-
Ein
weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung
eines infektiösen
chimären
Papillomavirus, umfassend:
- a) Herstellen eines
chimären
Papillomavirus, wobei die frühen
Gene von HPV 18 stammen und die späten Gene von einem zweiten
Papillomavirus stammen;
- b) Herstellen einer Raft-Zellkultur von differenzierenden Epithelzellen;
- c) Infizieren der Zellkultur mit dem chimären Papillomavirus, und
- d) Inkubieren der Zellkultur unter Bedingungen, welche die Virusreplikation
unterstützen.
-
Ein
noch weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein Assay zum Nachweis
der Anwesenheit eines Antikörpers,
der ein humanes Papillomavirus neutralisiert, in einem Serum, umfassend:
- a) Kontaktieren einer Zellkultur, die ein infektiöses chimäres Papillomavirus
umfasst, mit dem Serum, und
- b) Feststellen, ob die Replikation des chimären Papillomavirus in der Zellkultur
in Anwesenheit des Serums stattfindet.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen
erfolgt dieser Nachweis durch Kontaktieren der RNA aus Zellen, die
mit dem chimären
Virus infiziert sind, mit reverser Transkriptase, um eine cDNA zu
erhalten. Die cDNA wird dann in einem PCR-Assay amplifiziert. Gegebenenfalls
wird die Menge amplifizierter DNA mit einer Kontrollgruppe verglichen,
wie z.B. einer ansonsten identisch identifizierten Zelllinie, die
nicht dem Serum ausgesetzt wurde.
-
Ein
noch weiterer Aspekt dieser Erfindung sind Vektoren, welche zur
Konstruktion der chimären
Viren eingesetzt wurden, und Wirtszellen, welche die infektiösen chimären Papillomaviren
enthalten.
-
Kurzbeschreibung
der Zeichnungen
-
1:
schematische Darstellung des Verfahrens zur Herstellung eines chimären HPV
-
2A und 2B zeigen
die Herstellung von Plasmiden mit chimären Sequenzen. 2A zeigt
ein Plasmid, welches die genomische Sequenz von HPV 18 enthält, wobei
die codierende Sequenz für
die Strukturproteine L1 und L2 durch eine Bgl II-Klonierungsstelle
ersetzt ist. 2B zeigt die Herstellung eines
Plasmids, welches die genomische Sequenz von HPV 18 enthält, wobei
die codierende Sequenz für
die Strukturproteine L1 und L2 durch die homologen Proteine von
HPV 16 ersetzt ist.
-
3A und 3B sind
Southernblot-Analysen von klonalen Zelllinien, die HPV enthalten.
Mehrere Zelllinien, die mit chimärer
HPV 18/16-DNA transfiziert worden waren, wurden hinsichtlich der
Anwesenheit episomaler viraler DNA untersucht. DNA wurde aus jeder
Zelllinie isoliert, mit der Restriktionsendonuklease Eco Rl oder
der Restriktionsendonuklease Bgl II verdaut oder nicht verdaut und
mit einem Southernblot untersucht. DNA, die mit einer HPV 18-spezifischen
Sonde sondiert wurde (3A), demonstrierte, dass die
Klone 2a, 3a, 3b, 3c, 4c und 5c bei Verdau mit Eco Rl eine Bande
von etwa 8 kb enthielten, welches anzeigt, dass alle viralen Sequenzen
episomal waren. Eine 5,6-kb-Bande wurde nach Bgl II-Verdauung nachgewiesen,
was weiter demonstriert, dass die episomale DNA die für HPV 16-L2/L1
codierende Sequenz enthält.
Unverdaute DNA zeigt superspiralisierte und "genickte" genomische virale DNA. Eine Southernblot-Analyse
unter Verwendung einer HPV 16-L2/L1-spezifischen Sonde (3B)
bestätigte
die episomale Natur der viralen DNA und verifizierte die Anwesenheit
der 2,4-kb-HPV 16-L2/L1-Sequenz innerhalb der chimären viralen
DNA.
-
4 ist
ein RNA-Schutz-Assay klonaler Zelllinien, die HPV enthalten. Ein
RNA-Schutz-Assay
wurde mit RNA durchgeführt,
die aus den als Raft-Kulturen gezüchteten Zelllinien 2a und 5c
extrahiert worden war. Unter Verwendung einer HPV 16-L1-spezifischen
Ribosonde wird gezeigt, dass der Klon 2c eine große Menge an
HPV 16-L1-spezifischer RNA erzeugt, während der Klon 5a eine geringere
Menge erzeugt. Y1 ist eine hefe-abgeleitete RNA-Kontrolle, verdaut mit RNAsen. Y2 ist
eine unverdaute Hefe-RNA-Kontrolle.
-
5 ist
eine Demonstration der Anwesenheit von infektiösem chimären Virus. HaCat-Zellen wurden mit
Virusverdünnungen
von dem chimären
HPV 18/16-Klon 2A infiziert. Die Zellen wurden nach 7 Tagen geerntet
und die Virusinfektion wurde durch die Anwesenheit eines 486-bp-HPV
18-E1^E4-Produkts einer verschachtelten RT-PCT (Pfeil) nachgewiesen.
-
Virusverdünnungen
sind oberhalb der Figur angezeigt. "Schein" zeigt an, dass die Zellen scheininfiziert
wurden.
-
6A und 6B sind
eine Demonstration von HPV 16-spezifischer Neutralisation. HaCat-Zellen wurden in
Anwesenheit von Verdünnungen
von Rhesus-Vorseren oder Seren nach Immunisierung mit HPV 16-L1-VLP
inkubiert und dann wurde der chimäre Virusklon 2A zugegeben.
Die Zellen wurden nach 7 Tagen geerntet und Virusinfektion wurde
durch die Anwesenheit eines 486-bp-HPV 18-E1^E4-Produkts einer verschachtelten
RT-PCR (Pfeil) nachgewiesen. Serumverdünnungen sind oberhalb der Figur
angezeigt. Die Figuren A und B repräsentieren die Ergebnisse von
zwei verschiedenen Rhesus-Affen.
-
Wie
in dieser Patentbeschreibung und den Ansprüchen durchgehend verwendet,
gelten die folgenden Begriffe:
Infektiös – Ein Virus ist infektiös, falls
es in einer geeigneten Wirtszelle replizieren kann. Dies unterscheidet
das Virus von einem virus-ähnlichen
Partikel (VLP), welches aus (einem) leeren Kapsidprotein(en) besteht,
das bzw. die keine Nukleinsäure
enthält/enthalten,
und somit in keiner Zelle replizieren kann.
-
HPV
war ein besonders schwieriges Virus für die Züchtung in Zellkultur, da seine
frühen
Gene nur in undifferenzierten Zellen aktiv zu sein scheinen, während seine
späten
Gene (codierend für
Strukturproteine für die
Kapsidbildung) in differenzierten Zellen aktiv sind. Es ist jedoch
bekannt, dass infektiöses
HPV 18 in Raft-Kulturen gezüchtet
werden kann, wie in
US 5,994,115 beschrieben.
-
Gemäß dieser
Erfindung wurde festgestellt, dass das für HPV 18 verwendete Raft-Kultursystem das Wachstum
von infektiösen
chimären
Papillomaviren unterstützen
wird.
-
Die
chimären
Viren dieser Erfindung haben im allgemeinen zwei Quellen für ihr Genom.
Die erste Quelle trägt
die viralen frühen
Gene bei. Frühe
Gene codieren für
und exprimieren die Nicht-Strukturproteine von Papillomavirus, welche
für die
Produktion von infektiösem
Virus erforderlich sind. Diese Gene umfassen E1, E1^E4 (ein gespleisstes
Transkript, ein Teil der RNA stammt von E1 und der andere von E4),
E2, E3, E4, E5, E6 und E7.
-
Eine
zweite DNA-Quelle trägt
die Gene bei, welche für
die späten
Gene codieren, L1 und L2. Diese Sequenzen erlauben die Produktion
der L1- und L2-Strukturproteine, die zu infektiösen Viruspartikeln assemblieren,
welche die chimäre
virale genomische DNA enthalten.
-
In
dieser Erfindung ist die Quelle der frühen Gene ein Human-Papillomavirus,
HPV 18.
-
Die
Quelle der späten
Gene kann irgendein Papillomavirus, human oder nicht-human, sein.
Besonders bevorzugte Quellen umfassen HPV 6a, 6b, 11, 16 und andere
krankheitsassoziierte HPVs. Andere Serotypen umfassen HPV 1, HPV
31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 41, HPV 47, HPV 51, HPV 57 und HPV
58. Ebenfalls bevorzugte Serotypen umfassen tierische Papillomaviren,
insbesondere diejenigen von Papillomaviren, die in Tierkrankheitsmodellen
verwendet werden, wie z.B. Baumwollschwanzkaninchen-Papillomavirus
(Sylvilagus-Papillomavirus) (CRPV), Rinder-Papillomavirus (BPV)
und oraler Hunde-Papillomavirus
(COPV). Alles was der Forscher benötigt, ist Zugang zu einer L1-
und/oder L2-Gensequenz zu haben, so dass sie unter Verwendung von
hier beschriebenen Techniken kloniert werden kann. Die Sequenzen
zahlreicher humaner und tierischer Papillomavirus-L-Gene sind bekannt.
-
Somit
ist ein Aspekt dieser Erfindung ein infektiöses chimäres Papillomavirus. In bevorzugten
Ausführungsformen
ist das chimäre
Papillomavirus dieser Erfindung aus einem der folgenden Viren ausgewählt (der erste
Teil der Nomenklatur bezieht sich auf die Quelle der frühen Gene;
der zweite Teil der Nomenklatur bezieht sich auf die Quelle der
späten
Gene): HPV 18-16, HPV 18-11, HPV 18-6a, HPV 18-6b, HPV 18-31, HPV
18-33, HPV 18-35, HPV 18-39, HPV 18-41, HPV 18-42, HPV 18-47, HPV
18-51, HPV 18-57, HPV 18-58, HPV 18-COPV, HPV 18-BPV, HPV 18-CRPV.
-
Das
chimäre
Virusgenom kann unter Verwendung von Plasmiden und Standardtechniken
der Molekularbiologie assembliert werden. In Kürze, dies wird erreicht durch
Erzeugung eines DNA-Fragments, welches die codierende Sequenz der
Papillomavirus-L1- und -L2-Strukturgene
enthält,
und Klonierung dieser DNA in die geeignete Stelle eines Plasmids,
das die frühen
Gene von HPV 18 enthält,
welche für
die Virusreplikation erforderlich sind.
-
Die
chimären
Viren dieser Erfindung werden in einem Raft-Kultursystem gezüchtet (auch
bezeichnet als ein organotypisches Kultursystem). In Kürze, ein
Hautäquivalent
wird aus einer Mischung von Typ I-Kollagen und Fibroblasten hergestellt.
Zellen von einer Zelllinie, die von differenzierenden Epithelzellen
stammt, werden auf das Hautäquivalent
platziert und, während
sie untergetaucht sind, bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Das
Hautäquivalent
mit Epithelzellen darauf wird dann auf ein Drahtgitter gehoben,
wo es auf einer Luft/Flüssigkeitsgrenzfläche bleibt.
Von diesem Zeitpunkt an kommen die Epithelzellen niemals in Kontakt
mit den Kulturmedien. Die Nahrungsversorgung der Epithelzellen erfolgt
mittels Diffusion durch das Hautäquivalent.
Die Epithelzellen werden eine Schicht bilden und über einen
Zeitraum von etwa zwei Wochen differenzieren. Vorzugsweise wird
ein Induktor von Proteinkinase C den Medien zugegeben und die Zellen,
welche episomale Kopien der chimären
viralen DNA beibehalten haben, werden Virionen biosynthetisieren.
-
Eine
der signifikanten Verwendungen der chimären Viren dieser Erfindung
ist die in Assays und insbesondere Neutralisationsassays. Obwohl
es Assays im Stand der Technik gibt, welche ermitteln, ob ein Serum neutralisierende
Antikörper
enthält,
verwenden diese Assays alle entweder ein nicht-infektiöses Virus
oder finden in vivo statt. Der Assay dieser Erfindung kann im Gegensatz
dazu in vitro durchgeführt
werden, was für den
Forscher viel bequemer ist, und kann infektiöse Partikel verwenden. Somit
ist es wahrscheinlicher, dass die Ergebnisse das nachbilden, was
tatsächlich
während
einer Infektion geschieht, als das, was in vitro geschieht. Ferner
kann, nachdem im wesentlichen das gleiche Verfahren für praktisch
jeden chimären
Papillomavirus angewandt werden kann, eine große Anzahl Serotypen unschwer
unter Verwendung eines identischen Kulturverfahren untersucht werden.
-
Somit
ist ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ein Assay zur Feststellung,
ob ein neutralisierender Antikörper,
der spezifisch für
ein auf einem Papillomavirus-Kapsid gefundenes Epitop ist, in einer
Probe vorliegt, umfassend:
- (a) Kontaktieren
der Probe mit einem infektiösen
chimären
Papillomavirus gemäß der Erfindung;
und
- (b) Feststellen, ob die Infektivität des chimären Virus moduliert wird.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen
dieser Erfindung stammen die späten
Gene von HPV 6, 11 oder 16. In anderen Ausführungsformen ist die Probe
eine Serumprobe von einem Individuum, von dem angenommen wird, dass
es demselben HPV-Serotyp ausgesetzt wurde, der die Quelle der späten Gene
war. Falls man beispielsweise feststellen will, ob ein Individuum
neutralisierende Antikörper
gegen HPV 16 aufweist, sollte das chimäre Virus späte HPV 16-Gene haben; ein Beispiel
wäre eine
HPV 18-16-Chimäre.
Dieser Assay ist auch von Nutzen bei der Unterscheidung zwischen
Serotypen, welche genetisch eng verwandt sind, wie z.B. HPV 6 und
11, deren späte
Proteine sich nur um einige wenige Aminosäuren unterscheiden.
-
Man
kann auf einer Reihe von Wegen feststellen, ob die Infektivität des chimären Virus
moduliert ist. Eine Änderung
der Virusinfektivität
ist eine relative Messung, d.h. eine Standard-Viruspräparation
kann hergestellt werden, mit der alle anderen Typen verglichen werden.
In bevorzugten Ausführungsformen
des Neutralisationsassays ist beispielsweise die positive Kontrolle "ohne Serum" der Standard, an
dem die gesamte Reduktion der Infektivität gemessen wird.
-
Ein
weiterer Assay, der Teil dieser Erfindung ist, weist nach, ob ein
chimäres
Virus Zellen tatsächlich infiziert
hat (d.h. eingedrungen ist) oder ob es nur lediglich an die Oberfläche gebunden
wurde, jedoch noch nicht in die Zelle gelangt ist. In diesem Assay
kann eine RT-PCR(reverse
Transkriptase-PCR)-Analyse von RNA-Transkripten, die von den frühen Genen
stammen, eingesetzt werden. Wenn das chimäre Virus sich innerhalb einer
humanen Zelle repliziert, wird eine Spleissvariante des E1^E4-Gens
hergestellt, welche 486 bp lang ist, statt mehrere kb (welches die
Länge des
ungespleissten viralen Genoms ist). Somit kann der Nachweis der
Spleissvariante als Indiz dafür
verwendet werden, dass eine Infektion stattgefunden hat. Die E1^E4-Spleissvariante
kann irgendeine sein. Sequenzen von E1 und E4 sind im Stand der
Technik bekannt. Bevorzugte Sequenzen sind (Oligonukleotide, die
als Primer bei der PCR-Amplifizierung verwendet wurden, sind unterstrichen):
-
Darüber hinaus
können
Reportergene in die genomische DNA eingeführt werden, um das Vermögen zum
Nachweis einer Infektion zu verbessern. Diese chimären Viren
wären von Nutzen
bei der Beurteilung von Vakzinen, welche zur Hervorrufung von Immunreaktionen
gegen Papillomavirus-Proteine vorgesehen sind. Darüber hinaus
würden
sie ein Werkzeug bieten für
die Untersuchung der molekularen Aspekte viraler Replikation und
könnten
eine wichtige Rolle bei der Entwicklung therapeutischer Behandlungen,
die mit Papillomavirus-Infektionen
assoziiert sind, spielen.
-
Die
folgenden nicht-beschränkenden
Beispiele werden zur besseren Erläuterung der Erfindung gegeben.
-
BEISPIEL 1
-
Herstellung eines HPV
18ΔL2/L1-Transferplasmids
-
20 μg PBS-HPV
18-Plasmid (von Dr. Craig Meyers, Hershey Medical Center, Hershey,
Pa.) wurde mit Aat II (Boehringer Mannheim Katalog-Nr. 775207) verdaut.
Verdaute DNA wurde mit einer Centrisep-Säule (Princeton Separations
Katalog-Nr. CS-901) gereinigt und dann mit Afl II (New England Biolabs
Katalog-Nr. 520S) verdaut. Die resultierende 6647-bp-Bande wurde
unter Verwendung eines QIAEX-Gelextraktionskits (QIAGEN Katalog-Nr.
20021) gelgereinigt.
-
Unter
Verwendung der folgenden Oligonukleotide (Midland Co.) und Pfu-Turbo-DNA-Polymerase (Stratagene)
wurden zwei PCR-Fragmente erzeugt:
- 1. Ein 720-bp-PCR-Produkt,
enthaltend genomische HPV 18-DNA von Nukleotid 3542 an der Aat II-Stelle bis
zum Beginn der HPV 18-L2-Sequenz bei Nukleotid 4246. Die 5'-Seite des PCR-Fragments
enthält
eine Aat II-Restriktionsstelle, während die 3'-Stelle eine Bgl II-Restriktionsstelle enthält. Die
zur Erzeugung des PCR-Produkts verwendeten Oligonukleotide waren
18
Aat II: 5' CGG CCA
GAC GTC GGC TGC TAC ACG 3' (SEQ-ID-Nr.
1)
18 Bgl II B: 5' GCT
AGC AGA TCT ACT TTT ATT ACA AAA ATA CAA AAA GC 3' (SEQ-ID-Nr. 2).
- 2. Ein 593-bp-PCR-Produkt, enthaltend genomische HPV 18-DNA
von Nukleotid 7137 an der Stoppstelle von HPV 18-L1 bis zur Afl
II-Restriktionsstelle bei Nukleotid 7730. Die 5'-Seite
des PCR-Fragments enthält eine
Bgl II-Restriktionsstelle, während
die 3'-Seite eine
Afl II-Restriktionsstelle enthält.
Die zur Erzeugung des PCR-Produkts verwendeten Oligonukleotide waren:
18
Afl II: 5' GTA TGC
AAT TAG CTT AAG TAA AAA CAA AC 3' (SEQ-ID-Nr.
3)
18 Bgl II F: 5' GCT
AGC AGA TCT TAT GTG TGT GTG TAT ATA TAT ATA CAT C 3' (SEQ-ID-Nr. 4).
-
Die
Aat II/Bgl II- und Afl II/Bgl II-PCR-Produkte wurden unter Verwendung
eines QIAquick-PCR-Reinigungskits
(Qiagen Katalog-Nr. 28104) gereinigt. Das Aat II/Bgl II-PCR-Produkt
wurde mit Aat II verdaut. Das Afl II/Bgl II-PCR-Produkt wurde mit
Afl II verdaut. Die verdauten PCR-Produkte wurden unter Verwendung
eines QIAquick-PCR-Reinigungskits (Qiagen Katalog-Nr. 28104) gereinigt.
-
Das
Afl II/Aat II-verdaute Plasmid wurde mit den beiden verdauten Aat
II/Bgl II- und Afl II/Bgl II-PCR-Produkten ligiert. Die resultierende
Ligierung wurde mit Bgl II verdaut, mit Genieprep gereinigt und
ligiert.
-
DH5
Alpha (BRL Katalog-Nr. 18258) wurde transformiert und Kolonien wurden
hinsichtlich des richtigen Plasmids gescreent, bei dem die HPV 18-L2/L1-Sequenz
durch eine Bgl II-Klonierungsstelle
ersetzt ist. Dieses neue 7932-bp-Plasmid wird als pBS-HPV 18ΔL2/L1 bezeichnet.
-
BEISPIEL 2
-
Herstellung des Plasmids
pBS-HPV 18/16, welches für
HPV 16-L2/L1 codierende Sequenzen enthält
-
Die
im folgenden aufgeführten
Oligonukleotide (Midland Co.) und Pfu-Turbo-DNA-Polymerase (Stratagene) wurden zur Erzeugung
eines 2,9-kb-PCR-Produkts, das offene Leserahmen für HPV 16-L2
und -L1 enthält,
verwendet. Die für
die PCR-Matrize verwendete DNA wurde von genomischer HPV 16-L1/L2-DNA
aus CasKi-Zellen, welche in pUC18 kloniert worden waren, abgeleitet.
Sowohl die 5'- als
auch 3'-Seiten des PCR-Fragments
enthalten eine Bgl II-Restriktionsstelle. Die zur Erzeugung des
PCR-Produkts verwendeten Oligonukleotide waren:
16 L2 Bgl II
F: 5' GCT AGC AGA
TCT ATG CGA CAC AAA CGT TCT GCA AAA CG 3' (SEQ-ID-Nr. 5)
16 L1 Bgl II B:
5' GCT AGC AGA TCT
TTA CAG CTT ACG TTT TTT GCG TTT AGC AG 3' (SEQ-ID-Nr. 6).
-
Das
HPV 16-L2/L1-PCR-Produkt von 2,9 kb wurde mit Hilfe des QIAEX II-Reinigungskits
(QIAGEN) gelgereinigt. Das gereinigte Produkt wurde mit Bgl II verdaut,
hitzeinaktiviert und mittels Genieprep (Ambion Katalog-Nr. 1950)
gereinigt.
-
pBS-HPV
18ΔL2/L1
wurde mit Bgl II verdaut, mit alkalischer Krabben-Phosphatase (Boehringer
Mannheim Katalog-Nr. 1758250) dephosphoryliert und mit Phosphatase
bei 65°C
für 15
Minuten hitzeinaktiviert.
-
Das
Bgl II-verdaute 2,9-kb-PCR-Produkt, repräsentierend die offenen Leserahmen
für HPV
16-L2 und -L1, wurden mit Bgl II-verdautem pBS-HPV 18ΔL2/L1 ligiert,
was in einem 10857-bp-Plasmid
resultierte, welches die gesamte genomische Sequenz von HPV 18 enthielt,
mit Ausnahme der für
L2/L1 codierenden Sequenz, welche durch die für HPV 16-L2/L1 codierende Sequenz
ersetzt war. Dieses Plasmid wurde als pBS-HPV 18/16 bezeichnet.
-
BEISPIEL 3
-
Herstellung des Plasmids
pBS-HPV 18/16, welches für
HPV 16 L2/L1 codierende Sequenzen und eine mutierte Eco Rl-Stelle
enthält
-
Das
Protokoll zur Herstellung eines infektiösen Virus in Raft-Kulturen
erfordert die Freisetzung der genomischen HPV-DNA vor der Transfektion
in J2-Zellen. Die genomische HPV 18-Sequenz enthält keine Eco-Rl-Stelle und
diese Restriktionsendonuklease wurde dazu verwendet, um genomische
DNA aus dem Plasmid freizusetzen. Das chimäre DNA-Plasmid pBS-HPV 18/16
enthält
eine Eco Rl-Stelle innerhalb der für HPV 16-L2/L1 codierenden
Sequenz. Es wurde eine stellengerichtete Mutagenese unter Verwendung
des "Quick Change
Site Directed Mutagenesis Kit" (Stratagene
Katalog-Nr. 200518) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die
folgenden Oligonukleotide wurden zur Veränderung der Eco Rl-Stelle ohne
Veränderung
der Aminosäuresequenz
verwendet: 5' CAT
ACA TAC ATT CTA TGA ACT CCA CTA TTT TGG AG 3' (SEQ-ID-Nr. 7) und 5' CTC CAA AAT AGT
GGA GTT CAT AGA ATG TAT GTA TG 3' (SEQ-ID-Nr.
8).
-
Das
resultierende Plasmid wurde als pBS-HPV 18/16M bezeichnet.
-
BEISPIEL 4
-
Herstellung von chimärem Virus
-
Keratinozyten-Elektroporationsprotokoll
mit chimärer
viraler DNA
-
Zur
Kultivierung der Zellen wurde im Wesentlichen das im US-Patent 5,994,115
(welches hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen ist) beschriebene
Raft-Kulturverfahren angewandt. In Kürze war die angewandte Prozedur
wie folgt:
Platten von mit Mitomycin C behandelten 3T3-J2-Zellen
(10-cm-Schalen) wurden am Tag vor der Elektroporation vorbereitet.
Diese Zellen wurden 1:3 aufgeteilt und mit E-Medium + 5 FCS versorgt
und über
Nacht inkubiert. pBS-HPV 18/16M-Plasmid-DNA wurde mit Eco Rl verdaut,
um die genomische chimäre
virale DNA zu linearisieren und freizusetzen. Virale DNA wurde mit
Phenol/Chloroform-Extrakt und einem Chloroform-Extrakt extrahiert,
mit Ethanol gefällt
und mit 10 μg/10 λ in TE [pH
8]-Puffer (basierend auf dem Ausgangsgewicht) resuspendiert. Lachssperma-DNA
wurde präpariert
(denaturiert und beschallt) mit 10 mg/ml. 500 mM BES [pH 7,2]-Stammlösung in
destilliertem sterilem Wasser wurde präpariert.
-
Transfektion
-
Lachssperma-DNA
wurde fünf
Minuten lang gekocht und unmittelbar auf Eis platziert und 10 λ verdauter
Plasmid-DNA und 4,25 λ Lachssperma-DNA
wurden in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen aliquotiert.
-
Trypsinbehandlung
und Zählung
von Keratinozyten. Resuspension unter Verwendung der folgenden Gleichung
und Mediumformulierung. Zellen = ml E + 10% FCS
+ 5 mM BES [pH 7,2]
20 × 106 Zellen/ml
-
Eine
250-λ-Zelllösung (etwa
5 × 106 Zellen) wurde mit den obigen DNA-Mischungen
hergestellt. Sie wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Lösungen
wurden in eine Elektroporationsküvette (BIO-RAD
Gene Pulser Cuvette; Katalog-Nr. 165-2088) überführt. Die Elektroporation fand
bei 210 V/960 μFd unter
Verwendung eines BIO-RAD Gene Pulsers statt. Die Zellen wurden dann
10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
-
Jede
Elektroporationsprobe wurde anschließend auf 10 ml E + 10% FCS
geschichtet und dann bei etwa 300 UpM für 10 Minuten zentrifugiert.
Jede Probe wurde in 6 ml E + 10% FCS resuspendiert.
-
Die
mit Mitomycin behandelten J2-Zellen wurden mit E + 10% FCS (etwa
8 ml) versorgt, dann auf Platten von Mitomycin C-behandelten J2-Zellen
platziert.
-
Am
folgenden Tag wurden die Platten erneut mit 10 ml E + 10% FCS +
EGF versorgt und für
etwa 7 Tage alle zwei Tage unter Verwendung von E + 10% FCS + EGF
mit Nährstoffen
versorgt. Nach diesem Zeitpunkt wurden die Platten alle zwei Tage
mit E + 5% FCS + EGF versorgt. Mitomycin C-behandelte Feeder-Zellen
befanden sich auf den Kulturen.
-
BEISPIEL 5
-
Erzeugung von Raft-Kulturen
-
Raft-Kulturen
wurden hergestellt, um die virale DNA in einem episomalen Zustand
zu halten und um infektiöse
Virusstammlösungen
zu erzeugen. J2-Feeder-Zellen wurden trypsinbehandelt und die Konzentration
an lebensfähigen
Zellen wurde mittels Trypanblau-Anfärbung bestimmt.
Insgesamt 6,25 × 105 Zellen/ml wurden für jedes Raft verwendet.
-
J2-Zellen
wurden 6 Minuten lang zentrifugiert und auf 6,25 × 105 Zellen/ml in Rekonstitutionspuffer resuspendiert.
Rattenschwanz-Kollagen (Typ I) wurde jedem Röhrchen zugegeben, zusammen
mit 3 μl
10 N NaOH pro ml Kollagenmischung pro Röhrchen. Die Röhrchen wurden
durch Umdrehen fünf
Minuten lang gemischt. 2,5 ml wurden als Aliquots jeder Mulde einer
6-Mulden-Clusterplatte zugegeben und die Platten wurden für 12–16 h bei
37°C inkubiert.
-
2
ml E-Medium wurden der Mulde zugegeben und inkubiert. Epithelzellen
wurden auf dem Raft in einer Konzentration von etwa 0,5–1,0 × 106 Epithelzellen pro Raft ausgesät. Sie wurden
bei 37°C
für 4 h
bis über Nacht
inkubiert und das Medium wurde erforderlichenfalls ersetzt.
-
Den
Zellen wurde erlaubt, Konfluenz zu erreichen, dann wurde ein Drahtgitter
in eine 100-mm-Petrischale
platziert. Das Kollagengel wurde auf das Drahtgitter gehoben und
E-Medium wurde zugegeben, bis die Unterseite des Gitters voller
Medium war, dem Medium wurde jedoch nicht gestattet, durch die Löcher des
Gitters zu kommen. Den Epithelzellen wurden Schichtbildung und Differenzierung
an der Luft/Flüssigkeitsgrenzfläche gestattet.
-
Für die Analyse
wurden Rafts durch Fixierung in 4 %igem Paraformaldehyd geerntet
und das Raft wurde in Paraffin eingebettet. 4-μm-Sektionen wurden für die Immunhistochemie
geschnitten.
-
Gesamt-Zell-DNA
wurde aus infizierten Zellen für
eine Southernblot-Analyse isoliert. RNA wurde aus infizierten Zellen
für RNA-Schutz-Assays
isoliert.
-
Virionen
wurden auf Raft-Kulturen durch isopyknische CsCl-Gradienten gereinigt
und für
die EM-Analyse sowie Infektivitäts-
und Neutralisationsassays verwendet.
-
BEISPIEL 6
-
Infektivitäts- und
Neutralisationsassays
-
HaCat-Zellen
wurden in 12-Mulden-Platten in einer Dichte von 105 Zellen/Mulde
mit Wachstumsmedium (10% fötales
Kalbsserum (Gibco), DMEM mit hohem Glucosegehalt (Gibco) 1 × Penicillin
und Streptomycin) ausgesät.
Am nächsten
Tag wurde das Medium von den Zellen abgesaugt und 100 μl von Virusstammlösungen,
die reihenmäßig in Optimem
(Gibco) verdünnt
worden waren, wurden auf den Zellen platziert und 1 h lang in einem
Inkubator bei 37°C,
5% CO2 inkubiert. Für den Neutralisationsassay
wurden den Zellen vor der Zugabe von Virus Testseren zugegeben.
Nach Virus-Adsorption wurde frisches Medium den Mulden zugegeben
und die Zellen wurden weitere 7 Tage lang inkubiert. Gesamt-RNA
wurde dann aus den Zellen mit Trizol (Life Technologies) nach den
Instruktionen des Herstellers isoliert. 2 μg Gesamt-RNA wurden in einer
einstufigen RT-PCR-Reaktion (Titan One Tube RT-PCR System, Boehringer
Mannheim) verwendet. Die bei der RT-PCR verwendeten Oligonukleotide
waren:
Vorwärtsprimer;
nt 530-552: 5' CAA
CCG AGC ACG ACA GGA ACG AC 3' (SEQ-ID-Nr.
9)
und
reverser Primer; nt 3603-3582: 5' CAG GTC CAC AAT
GCT GCT TCT C 3' (SEQ-ID-Nr.
10).
-
Der
RT-Schritt wurde 30 Minuten lang bei 50°C durchgeführt. Diesem folgte eine PCR-Reaktion mit den
folgenden Bedingungen: 95°C,
5 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen von 95°C, 15 Sekunden; 55°C für 30 Sekunden;
72°C für 30 Sekunden
und einer schließlichen Verlängerung
von 72°C,
7 Minuten. 2 μl
wurden aus der ersten RT-PCR-Reaktion entnommen und in einer anschließenden PCR-Reaktion
mit verschachtelten Oligonukleotid-Primern (Oligonukleotide 5' TCC AAC GAC GCA
GAG AAA CAC 3' (Vorwärtsprimer;
nt 553-573) (SEQ-ID-Nr.
11) und 5' GAG TCC
ACA GTG TCC AGG TC 3' (reverser
Primer; nt 3578-3558)
(SEQ-ID-Nr. 12) verwendet.
-
Die
Bedingungen für
die zweite PCR-Reaktion waren wie folgt: 96°C, 60 Sekunden, gefolgt von
30 Zyklen von 94°C,
15 Sekunden; 65°C
für 30
Sekunden; 72°C
für 30
Sekunden und einer schließlichen
Verlängerung
von 72°C,
7 Minuten. Die verschachtelten PCR-Produkte wurden auf einem 1 %igen
Agarosegel, das EtBr enthielt, sichtbar gemacht. Die Anwesenheit
eines 486-bp-PCR-Produkts demonstriert, dass HaCat-Zellen durch
Virus infiziert waren, das ein HPV 18-spezifisches E1^E4-Spleisstranskript
produzierte.
-
BEISPIEL 7
-
Herstellung von Zelllinien,
die chimäre
HPV18/16-DNA enthalten
-
Mehrere
Zelllinien, die mit chimärer
HPV 18/16-DNA transfiziert worden waren, wurden hinsichtlich der Anwesenheit
von episomaler viraler DNA untersucht. DNA wurde aus jeder Zelllinie
isoliert, mit Restriktionsendonuklease Eco Rl oder Restriktionsendonuklease
Bgl II verdaut oder nicht verdaut und mit einem Southernblot untersucht.
Eco Rl wird genomische virale DNA linearisieren, was zu einer 7,9-kb-Bande
führt,
falls die DNA episomal ist, während
Bgl II die für
HPV 16-L2/L1 codierende Sequenz von 2,4 kb aus der chimären genomischen
viralen DNA freisetzen wird. Eine Southernblot-Analyse der DNA,
sondiert mit einer HPV 18-spezifischen Sonde, demonstrierte, dass
die Klone 2a, 3a, 3b, 3c, 4c und 5c bei Verdauung mit Eco Rl eine
Bande von etwa 8 kb enthielten, was anzeigt, dass alle viralen Sequenzen
episomal waren. Eine 5,6-kb-Bande wurde nach Bgl II-Verdauung nachgewiesen,
was weiter demonstriert, dass die episomale DNA die für HVP 16-L2/L1 codierende
Sequenz enthält.
Unverdaute DNA zeigt superspiralisierte und "genickte" genomische virale DNA. Eine Southernblot-Analyse
unter Verwendung einer HPV 16-L2/L1-spezifischen Sonde bestätigte die
episomale Natur der viralen DNA und verifizierte die Anwesenheit
der HPV 16-L2/L1-Sequenz von 2,4 kb innerhalb der chimären viralen
DNA.
-
BEISPIEL 8
-
Demonstration von HPV
16-L1-Transkription
-
Zur
Feststellung, ob die für
HPV 16-L1 codierende Sequenz transkribiert wurde, wurde ein RNA-Schutzassay
mit RNA durchgeführt,
die aus den als Raft-Kulturen gezüchteten Zelllinien 2a und 5c
extrahiert worden war. Unter Verwendung einer HPV 16-L1-spezifischen
Ribosonde wurde gezeigt, dass der Klon 2a eine große Menge
von HPV 16-L1-spezifischer RNA erzeugt, während der Klon 5c eine geringere
Menge erzeugt. Y1 ist eine von Hefe abgeleitete RNA-Kontrolle, die
mit RNAsen verdaut wurde. Y2 ist eine unverdaute Hefe-RNA-Kontrolle. Wie
erwartet, wurde keine RNA bei Verwendung einer HPV 18-L1-spezifischen Sonde nachgewiesen.
-
BEISPIEL 9
-
Immunhistochemische Analyse
von Klonen
-
Raft-Kulturen
von vier Klonen wurden mittels Immunhistochemie hinsichtlich der
Anwesenheit von HPV 16-L1-Protein analysiert. Die Raft-Kulturen
der Klone 2a und 3a zeigen viel mehr HPV 16-L1-positive Zellen als
die Klone 5c und 5e. Interessanterweise demonstrieren die Klone
2a und 3a auch eine größere Anzahl an
Koilozyten und zeigen einen stärker
anormalen Phänotyp
als die Klone 5c und 5e. Diese Ergebnisse stehen in Einklang mit
der Tatsache, dass 2a mehr virale genomische DNA und HPV 16-L1-RNA
als der Klon 5c enthielt.
-
BEISPIEL 10
-
Infektivität von chimärem HPV
18/16-Virus
-
Zur
Feststellung, ob infektiöses
chimäres
Virus durch Raft-Kulturen gebildet wurde, die episomale Kopien von
chimärer
genomischer HPV 16/18-DNA enthielten, wurde eine Human-Karyotinozyten-Zelllinie
(HaCat) mit mehreren Reihenverdünnungen
von gereinigtem Virus aus den Klonen 2a und 5c infiziert. Der Nachweis
eines 486-bp-HPV 18-E1^E4-Spleisstranskripts
durch verschachtelte RT-PCR-Amplifizierung wurde dazu verwendet,
eine Infektion von HaCat-Zellen in vitro zu demonstrieren. Chimäres HPV
18/16-Virus, isoliert aus dem Klon 2a, wurde immer noch bei einer
Verdünnung
von 1:800 nachgewiesen, während
aus dem Klon 5c erhaltenes Virus nur bei der Verdünnung 1:50
nachgewiesen wurde. Dies steht in Einklang mit früheren Ergebnissen,
welche demonstrieren, dass der Klon 5c weniger virale genomische
DNA, HPV 16-L1-RNA und HPV 16-L1-Protein als der Klon 2a enthielt.
-
Kein
Virus wurde in RNA nachgewiesen, die aus scheininfizierten HaCat-Zellen
isoliert worden war, was die Spezifität dieses Assays demonstriert.
Diese Ergebnisse demonstrieren zum ersten Mal das Vermögen zur
Herstellung von chimärem
infektiösen
HPV-Virus.
-
BEISPIEL 11
-
HPV16-spezifische Virusneutralisation
-
Wir
waren daran interessiert festzustellen, ob dieses infektiöse chimäre HPV 18/16-Virus,
das die HPV 16-L2- und -L1-Strukturproteine enthält, durch HPV 16-spezifische
polyklonale Seren neutralisiert werden konnte. HaCat-Zellen wurden
in Anwesenheit von Verdünnungen
von entweder Rhesus-Vorseren oder Seren nach Immunisierung mit HPV
16-L1-VLP inkubiert und dann wurde entweder eine 1:50 oder 1:100-Verdünnung der
Stammlösung
von chimärem
Virus zugegeben. Nach 1 h Inkubation wurde den Zellen Medium zugegeben und
die Zellen wurden für
weitere 7 Tage kultiviert. Gesamt-RNA wurde isoliert und analysiert
mittels RT-PCR hinsichtlich der Anwesenheit eines 486-bp-HPV 18-E1^E4-Spleisstranskripts,
welches anzeigt, dass Virusinfektion stattgefunden hatte. Post-Immunisierungsserum
von zwei Rhesus-Affen war in der Lage, die virale Infektion in Verdünnungen
von 1:10 und 1:100 zu inhibieren. Eines der beiden Seren neutralisierte
Virus bei 1:1000. Ähnliche
Verdünnungen
von Vorseren hatten keine Wirkung auf die Infektivität, was zeigt,
dass die Virusneutralisation nicht auf unspezifische Serumeffekte
zurückzuführen ist.
Die Neutralisation mit Immunseren, die gegen HPV 18-VLPs erzeugt
worden waren, hatte ebenfalls keine Wirkung, was weiter die Spezifität der Ergebnisse
demonstriert.
-
-
-
-
-
