DE69021575T3 - Expressionssysteme für rekombinante negativstrang-rna-viren und impfstoffe. - Google Patents

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Description

  • 1 EINFÜHRUNG
  • Diese Erfindung betrifft rekombinante Minusstrang-Influenzavirus-RNA-Matrizen ("templates"), die sich zur Expression von heterologen Genprodukten in geeigneten Wirtszeil-Systemen und/oder zur Herstellung von rekombinanten Influenzaviren, die dieses heterologe Genprodukt exprimieren, verpacken und/oder darstellen, verwenden lassen. Die Expressionsprodukte und chimärischen Viren lassen sich vorteilhafterweise in Impfstoffzubereitungen verwenden.
  • Die Erfindung wird anhand der Konstruktion von rekombinanten Influenzavirus-RNA-Matrizen aufgezeigt, die ein heterologes Gen enthalten, welches für die Sequenz mit negativer Polarität codiert. Diese rekombinanten Matrizen, wenn mit gereinigter viraler RNA- anhängiger RNA-Polymerase kombiniert, waren infektiös, replizierten in geeigneten Wirtszellen und exprimierten das heterologe Genprodukt in hohen Graden. Außerdem wurde das heterologe Gen durch die resultierenden rekombinanten Influenzaviren exprimiert und verpackt.
  • 2 HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es sind eine Reihe von DNA-Viren gentechnisch hergestellt worden, um die Expression von heterologen Proteinen in Wirtszeil-Systemen (z.B. Vacciniavirus, Baculovirus, usw.) zu steuern. Vor kurzem sind ähnliche Schritte mit Plusstrang-RNA-Viren (z.B. Poliovirus) unternommen worden. Die Expressionsprodukte dieser Konstruktionen, d.h. das heterologe Genprodukt oder das das heterologe Genprodukt ausdrückende chimärische Virus, werden für außerordentlich nützlich in Impfstoffzubereitungen erachtet (sowohl für Untereinheiten als auch ganze Viren enthaltende Impfstoffe). Ein Nachteil bei der Verwendung von Viren wie z.B. Vaccinia-Virus zur Herstellung von rekombinanten oder chimärischen Viren zur Verwendung in Impfstoffen ist der Variationsmangel in deren wichtigsten Epitopen. Durch diese mangelnde Variabilität in den Virusstämmen werden der wiederholten Verwendung von chimärischen Vacciniaviren strenge Grenzen auferlegt, und dies insoweit, als durch Mehrfachimpfungen eine Wirtsresistenz gegenüber dem Stamm erzeugt wird, so daß das geimpfte Virus den Wirt nicht infizieren kann. Die Impfung einer resistenten Person mit chimärischem Vacciniavirus wird daher keine Immunstimulation induzieren.
  • Im Gegensatz dazu zeigt das Influenzavirus, ein Minusstrang-RNA-Virus, eine breite Variabilität seiner wichtigsten Epitope. Tatsächlich konnten schon Tausende von Influenzavarianten identifiziert werden, wobei sich jeder Stamm durch Antigendrift entwickelt. Die Minusstrang-Viren wie z.B. Influenza wären attraktive Kandidaten für die Herstellung von chimärischen Viren zur Verwendung in Impfstoffen, da ihre genetische Variabilität die Herstellung eines breiten Spektrums an Impfstoffzubereitungen gestattet, die die Immunität ohne das Risiko, daß sich eine Toleranz entwickelt, stimulieren. Das Erreichen dieses Ziels war jedoch von Anfang an durch die Tatsache ausgeschlossen, daß es bis heute nicht möglich ist, rekombinante oder chimärische Influenza-Minusstrang-RNA-Partikel herzustellen, die infektiös sind.
  • 2.1 DAS INFLUENZAVIRUS
  • Virusfamilien, die eingehüllte Einzelstrang-RNA des Genoms mit negativer Polarität enthalten, werden eingeteilt in solche mit nichtsegmentierten Genomen (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae) und solche mit segmentierten Genomen (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae und Arenaviridae). Die Familie der Orthomyxoviridae, auf die im folgenden näher eingegangen wird und die in den angeführten Beispielen eingesetzt wird, umfaßt nur die Influenzaviren Typ A, B und C.
  • Die Influenza-Virionen bestehen aus einem inneren, das Einzelstrang-RNA-Genom enthaltenden Ribonukleoproteinkern (einem helixförmigen Nukleokapsid) und einer äußeren Lipoproteinhülle, die innen mit einem Matrixprotein (M) ausgekleidet ist. Das segmentierte Genom von Influenza A besteht aus acht (sieben im Falle von Influenza C) linearen einzelsträngigen RNA-Molekülen mit negativer Polarität, die für zehn Polypeptide codieren, nämlich: die RNA-abhängigen RNA-Polymeraseproteine (PB2, PB1 und PA) und Nukleoprotein (NP), die das Nukleokapsid bilden; die Matrixproteine (M1, M2); zwei aus der Lipoproteinhülle herausragende Oberflächen-Glycoproteine (Protrusionen): Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA); und Nicht-Strukturproteine, deren Funktion unbekannt ist (NS1 und NS2). Die Transkription und Replikation des Genoms erfolgt in dem Kern, der Zusammenbau ("Assembly") erfolgt durch Knospung ("Budding") an der Plasmamembran. Die Viren können im Verlauf von Mischinfektionen Gene austauschen ("Reassortment").
  • Influenzavirus lagert sich über HA an Sialyloligosaccharide in Zellmembran-Glycoproteinen und -Glycolipiden an ("Adsorption"). Nach Endozytose des Virions kommt es zu einer Konformationsänderung in dem HA-Molekül innerhalb des zellulären Endosoms, das die Membranfusion erleichtert, was zum Abbau der Hülle ("Uncoating") führt. Das Nukleokapsid wandert zum Kern, wo virale mRNA als wichtigstes Initiationsmoment des Infektionsprozesses transkribiert wird. Virale mRNA wird durch einen einzigartigen Mechanismus transkribiert, bei dem virale Endonuklease das cap-tragende 5'-Ende von zellulären heterologen mRNAs abspaltet, die dann als Startermolekül ("Primer") für die Transkription von viralen RNA-Matrizen durch die virale Transkriptase dienen. Transkripte enden an der 15. bis 22. Basenstelle ab den Enden ihrer Matrizen, wo Oligo(U)-Sequenzen als Signale für die matrizenunabhängige Addition von Poly(A)-Strängen ("tracts") agieren. Von den so hergestellten acht viralen mRNA-Abschnitten sind sechs monocistronische, d.h. die Information eines Gens enthaltende Abschnitte, die direkt in die HA, NA und NP repräsentierenden Proteine sowie in die viralen Polymeraseproteine PB2, PB1 und PA übersetzt werden. Die beiden anderen Transkripte werden geschnitten ("Splicing"), wobei jedes zwei mRNAs ergibt, die in verschiedene Leserahmen übersetzt werden, um M1, M2, NS1 und NS2 hervorzubringen. Mit anderen Worten, die acht viralen mRNA-Abschnitte codieren für zehn Proteine: acht Struktur- und zwei Nicht-Strukturproteine. Eine Übersicht über die Gene des Influenzavirus und deren Proteinprodukte findet sich in nachstehender Tabelle I. TABELLE I Influenzavirus-Genom-RNA-Segmente und Codier-Zuordnunga
    Figure 00040001
    Figure 00050001
    • a In Anlehnung an R.A. Lamb und P. W. Choppin (1983); Quelle: Annual Review of Biochemistry, Volume 52,467-506
    • b Für Stamm A/PR/8/34
    • c Bestimmt durch biochemische und genetische Ansätze
    • d Bestimmt durch Nukleotidsequenzanalyse und Proteinsequenzanalyse
  • Nach der Transkription ist die Virusgenom-Replikation das zweite wichtige Ereignis bei einer Infektion durch Minusstrang-RNA-Viren. Wie auch bei anderen Minusstrang-RNA-Viren wird die Virusgenom-Replikation im Falle des Influenzavirus durch virusspezifizierte Proteine vermittelt. Es wird vermutet, daß die meisten oder alle der viralen Proteine, die Influenzavirus-mRNA-Segmente transkribieren, auch deren Replikation tragen. Alle viralen RNA-Segmente haben gleiche 3'- und 5'-Enden, vermutlich, um den RNA-Syntheseapparat zu befähigen, jedes Segment mit gleicher Effizienz zu erkennen. Der Mechanismus, der die alternativen Verwendungen (d.h. Transkription oder Replikation) desselben Proteinkomplements (PB2, PB1, PA und NP) steuert, ist noch nicht eindeutig identifiziert worden, scheint jedoch den Überfluß an freien Formen von einem oder mehreren der Nukleokapsidproteine, insbesondere des NP, zu implizieren. Der Kern scheint der Ort der Virus-RNA-Replikation zu sein, so wie er auch der Ort für die Transkription ist.
  • Die ersten Produkte replikativer RNA-Synthese sind komplementäre Kopien (d.h. mit positiver Polarität) sämtlicher Influenzavirus-Genom-RNA-Segmente (cRNA). Diese Plusstrang-Kopien (Anti-Genome) unterscheiden sich von den Plustrang-mRNA-Transkripten in dem Aufbau ihrer Enden. Die antigenomischen cRNAs, verglichen mit den mRNA-Transkripten, besitzen kein cap, werden an dem 5'-Ende nicht methyliert und werden an dem 3'-Ende nicht gekürzt und nicht polyadenyliert. Die cRNAs sind coterminal mit ihren Minusstrang-Matrizen und enthalten alle genetischen Informationen in jedem genomischen RNA-Segment in komplementärer Form. Die cRNAs dienen als Matrizen für die Synthese von genomischen Minusstrang-vRNAs.
  • Die Minusstrang-Genome (vRNAs) und Anti-Genome (cRNAs) des Influenzavirus werden immer von Nukleokapsid-Proteinen eingebaut ("Enkapsidation"); die einzigen nicht eingebauten RNA-Spezies sind Virus-mRNAs. Im Gegensatz zu den anderen umhüllten RNA-Viren scheint der Nukleokapsid-Zusammenbau ("Assembly") eher im Kern als im Zytoplasma stattzufinden. Das Virus reift heran, die Freisetzung erfolgt durch Knospung ("Budding") durch die apikale Oberfläche der Zelle, die das M-Protein auf der zytoplasmischen Seite oder Innenseite der Knospungshülle trägt. HA und NA werden glycosyliert und in die Lipidhülle eingebaut. In permissiven Zellen wird HA schließlich gespaltet, jedoch bleiben die beiden resultierenden Ketten durch Disulfid-Bindungen verbunden.
  • Es ist nicht bekannt, durch welchen Mechanismus eine Kopie einer jeden der acht genomischen viralen RNAs für den Einbau in jedes neue Virion ausgewählt wird. DI-("defective interfering"-)Partikel werden häufig produziert, insbesondere nach mehrfacher Infektion.
  • 2.2 RNA-ABHÄNGIGE RNA-POLYMERASE
  • Die RNA-abhängige RNA-Polymerasen von Viren vom Tier sind im Hinblick auf viele Aspekte der Proteinstruktur und der Reaktionsbedingungen eingehend untersucht worden. Jedoch konnten die Elemente der Matrizen-RNA, die die optimale Expression durch die Polymerase fördern, nur durch logische Schlußfolgerung ausgehend von vorhandenen viralen RNA-Sequenzen untersucht werden. Diese Promotor-Analyse ist interessant, weil nicht bekannt ist, wie eine virale Polymerase spezifische virale RNAs unter den vielen in einer infizierten Zelle zu findenden wirtscodierten RNAs erkennt.
  • Viren vom Tier, die Genom-RNA mit positiver Polarität enthalten, lassen sich replizieren, wenn plasmid-abgeleitete RNA durch Transfektion in Zellen eingebracht wird (z.B. Racaniello u.a., 1981, Science 214: 916-919; Levis u.a., 1986, Cell 44:137-145). Im Falle von Poliovirus repliziert die gereinigte Polymerase eine Genom-RNA unter In-vitro-Reaktionsbedingungen, und wenn dieses Präparat in Zellen transfiziert wird, ist sie infektiös (Kaplan u.a., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:8424-8428). Die Matrizenelemente jedoch, die als Transkriptionspromotor für die polioviruscodierte Polymerase dienen, sind unbekannt, da sogar RNA-Homopolymere kopiert werden können (Ward u.a., 1988. J. Virol. 62:558-562). Auch SP6-Transkripte sind zur Herstellung von Muster-DI-RNAs für das Sindbisvirus-Genom eingesetzt worden. Wird die RNA in infizierte Zellen eingebracht, so wird sie repliziert und eingepackt. Die RNA-Sequenzen, die sowohl für die Erkennung durch die virale Sindbis-Polymerase und als auch für die Packung des Genoms in Viruspartikel verantwortlich waren, lagen festgestelltermaßen zwischen 162 Nukleotiden (nt) des 5'-Endes und 19 nt des 3'-Endes des Genoms (Levis u.a., 1986, Cell 44:137-145). Im Falle des Brom-Mosaik-Virus (BMV), einem planzlichen Plusstrang-RNA-Virus, wurden SP6-Transkripte zur Identifizierung des Promotors als ein 134 nt langes tRNA-artiges 3'-Ende verwendet (Dreher und Hall, 1988, J. Mol Biol. 201: 31-40). Es wurde gezeigt, daß Polymerase-Erkennung und -Synthese sowohl von der Sequenz als auch von sekundären Strukturmerkmalen abhängen (Dreher u.a., 1984, Nature 311:171-175).
  • Die Minusstrang-RNA-Viren waren für die Untersuchung der Sequenz-Anforderungen der Replicase schwer aufschließbar. Die gereinigte Polymerase des vesikulären Stomatitisvirus (VSV) ist in der Transkription nur aktiv, wenn virusabgeleitete Ribonukleoprotein-Komplexe (RNPs) als Matrize enthalten sind (De und Banerjee, 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun. 126: 40-49; Emerson und Yu, 1975, J. Virol. 15:1348:1356; Naito und Ishihama, 1976, J. Biol. Chem. 251: 4307-4314). RNPs sind aus nackter RNA von DI-Partikeln des VSV neu gebildet worden unter Verwendung von infizierten Zellextrakten als Proteinquelle. Diese RNPs wurden sodann repliziert bei der Rückführung in die infizierten Zellen (Mirakhur und Peluso, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 7511-7515). In Bezug auf Influenzavirus wurde neulich gemeldet, daß nackte vom Virus gereinigte RNA zur Neubildung von RNPs verwendet worden sei. Die viralen Nukleokapsid- und Polymeraseproteine wurden gelgereinigt und auf der viralen RNA unter Verwendung von Thioredoxin renaturiert (Szewczyk u.a., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85: 7907-7911). Die Verfasser jedoch zeigten nicht, daß die Aktivität des Präparats speziell auf influenzavirale RNA gerichtet war, und sie analysierten auch nicht die Signale, die die Transkription fördern.
  • Im Verlauf der Influenzavirus-Infektion katalysiert die Polymerase drei verschiedene Transkriptions-Aktivitäten. Diese sind u.a. die Synthese von (a) subgenomischer mRNA, die einen cap-Komplex am 5'-Ende und ein Poly-A-Schwanzstück am 3'-Ende besitzt; (b) eines Plusstrangs oder Anti-Genoms (cRNA) voller Länge, kopiert von der Genom-RNA; und (c) Genom-vRNA, synthetisiert aus der cRNA voller Länge (rezensiert in Ishihama und Nagata, 1988, CRC Crit. Rev. Biochem. 23: 27-76; und Krug, "Transcription and replication of influenza viruses", in: Genetics of influenza viruses, Palese, P., und Kingsbury, D.W. (Hrsg.), New York, Springer-Verlag 1983, S. 70-98). Die viralen Proteine PB2, PB1 und PA, so wird vermutet, katalysieren alle influenzavirus-spezifischen RNA-Synthesevorgänge, wenn überschüssiges Nukleokapsid-Protein vorliegt (NP; siehe oben angeführte Abhandlungen). Diese Polymerasefunktionen wurden anhand von RNP-Kernen, gewonnen aus durch Detergenzien zerstörtem Virus, sowie von RNPs, gewonnen aus den Kernextrakten infizierter Zellen, untersucht. Zur Transkription von aus dem zerstörten Virus gewonnenen RNPs kommt es, wenn dieser Vorgang entweder mit Dinukleotid-adenylyH3'-5')-guanosin (ApG) oder mit cap-tragenden mRNAs in Gang gesetzt wird. Die mRNA-Produkte mit positiver Polarität beendeten die Synthese 17-20 Nukleotide nach dem 5'-Ende der RNA-Matrize und wurden durch Hinzufügen von Poly-A-Schwanzstücken bearbeitet. Diese Produkte können nicht als Matrize für das virusorientierte Genom dienen, da ihnen Endsequenzen fehlen (Hay u.a., 1977, Virology 83: 337-355). Aus Kernextrakten infizierter Zellen gewonnene RNPs synthetisieren außerdem polyadenylierte mRNA in Gegenwart von als Startermolekül ("Primer") agierender RNA mit cap-Komplex. Wird jedoch ApG unter diesen Bedingungen verwendet, so lassen sich beide RNAs, polyadenylierte cRNA und cRNA voller Länge, gewinnen (Beaton und Krug, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6282-6286; Takeuchi u.a., 1987, J. Biochem. 101: 837-845). Vor kurzem wurde gezeigt, daß eine replikative Synthese von cRNA in Abwesenheit von exogenem Primer möglich wäre, wenn das Kernextrakt zu bestimmten Zeiten nach Infizierung aufgefangen und gesammelt würde. In denselben Präparaten wurde auch die Synthese von vRNA negativer Polarität ausgehend von einer cRNA-Matrize beobachtet (Shapiro und Krug, 1988, J. Virol. 62: 2285-2290). Die Synthese von cRNA voller Länge hing, wie aufgezeigt wurde, von der Gegenwart von Nukleokapsidprotein (NP) ab, das sich frei in Lösung befand (Beaton und Krug, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 6282-6286; Shapiro und Krug, 1988, J. Virol. 62: 2285-2290). Diese Erkenntnisse führten zu der Vermutung, daß der regulatorischen Steuerung zwischen mRNA- und cRNA-Synthese durch den RNP-Komplex die Notwendigkeit zugrunde liegt, daß lösliches NP im Überschuß vorliegt (Beaton und Krug, 1986, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 83: 6282-6286).
  • Eine andere Untersuchungsreihe konzentrierte sich auf die Bereitung von Polymerase-RNA-Komplexen aus RNPs von durch Detergenzien zerstörtem Virus. Wird der RNP-Komplex durch einen CsCl-Glycerol-Gradienten zentrifugiert, kann man feststellen, daß die RNA mit den drei Polymerase-(P-)Proteinen am untersten Niveau des Gradienten assoziiert ist. In der Nähe der Gradienten-Spitze läßt sich freies NP-Protein finden (Honda u.a., 1988, J. Biochem. 104:1021-1026; Kato u.a., 1985, Virus Research 3, 115-127). Der gereinigte Polymerase-RNA-Komplex (unterstes Niveau des Gradienten) zeigt Aktivität bei der Initiation der RNA-Synthese mit ApG als Primer, wächst jedoch nicht auf mehr als 12-19 Nukleotide an. Wenn NP-Protein enthaltende Fraktionen aus dem oberen Bereich des Gradienten dem Polymerase-RNA-Komplex wieder hinzugefügt werden, kann dies eine Elongation zur Folge haben (Honda u.a., 1987, J. Biochem. 102: 41-49). Diese Daten lassen vermuten, daß das Protein NP für die Elongation benötigt wird, daß eine Initiation jedoch in Abwesenheit von NP eintreten kann.
  • Es wurde gezeigt, daß die genomische RNA von Influenzaviren eine kreisförmige Konformation aufweist durch Basenpaarbildung der Enden zur Bildung eines Pfannenstiels von 15-16 nt (Honda u.a., 1988. J. Biochem. 104: 1021-1026; Hsu u.a., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8140-8144). Die virale Polymerase war, wie man festgestellt hat, an den Pfannenstiel gekoppelt, was Grund zu der Annahme gab, daß eine Pfannenstiel-Struktur für die Erkennung durch die virale Polymerase erforderlich war (Honda u.a., 1988, J. Biochem. 104: 1021-1026). Es wurde daher in diesen zwei Abhandlungen vermutet, daß der Promotor für die virale RNA-Polymerase die Doppelstrang-RNA in Pfannenstiel-Konformation sei.
  • 3 ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es werden rekombinante virale Influenza-RNA-Matrizen gemäß Anspruch 1 beschrieben, die zusammen mit gereinigtem RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Komplex verwendet werden können, um heterologe Genprodukte in geeigneten Wirtszellen auszudrücken und/oder um das heterologe Gen in Viruspartikeln zu sichern. Die RNA-Matrizen werden durch Transkription geeigneter DNA-Sequenzen mit einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase hergestellt. Die resultierenden RNA-Matrizen sind negativer Polarität und enthalten geeignete terminale Sequenzen, die es dem viralen RNA-Syntheseapparat gestatten, die Matrize zu erkennen.
  • Wie anhand der hier beschriebenen Beispiele aufgezeigt, können rekombinante Influenza-RNA-Matrizen negativer Polarität mit gereinigten viralen Polymeraseproteinen und Nukleoprotein gemischt werden (d.h. dem gereinigten viralen Polymerasekomplex), um infektiöse rekombinante RNPs zu bilden. Diese lassen sich einsetzen zur Exprimierung von heterologen Genprodukten in Wirtszellen oder zur Sicherung des heterologen Gens in Viruspartikeln durch Kotransfektion der Wirtszellen mit rekombinanten RNPs und Virus. Alternativ können die rekombinanten RNA-Matrizen oder rekombinanten RNPs eingesetzt werden, um transformierte Zellinien, die die RNA-abhängige DNA-Polymerase exprimieren und die Komplementierung gestatten, zu transfizieren. Außerdem wird ein nichtvirusabhängiges Replikationssystem für Influenzavirus beschrieben. Influenzavirus-Polypeptide ausdrückende Vaccinia-Vektoren wurden als Quelle für Proteine verwendet, die in der Lage waren, synthetisch gewonnene RNPs zu replizieren und zu transkribieren. Die für die spezifische Replikation und Expression der viralen RNP erforderliche Mindestuntermenge von Influenzavirusprotein umfaßt, wie man feststellte, die drei Polymeraseproteine (PB2, PB1 und PA) und das Nukleoprotein (NP). Dies läßt vermuten, daß die Nicht-Strukturproteine, NS1 und NS2, für die Replikation und Expression von viralem RNP nicht absolut erforderlich sind.
  • Die gewonnenen Expressionsprodukte und/oder chimärischen Virionen können vorteilhafterweise in Impfstoffzusammensetzungen verwendet werden. Der Einsatz von rekombinantem Influenzavirus zu diesem Zweck ist besonders attraktiv, da Influenza eine enorme Stammvariabilität zeigt, was die Herstellung eines breiten Spektrums von Impfstoffpräparaten gestattet. Die Möglichkeit, aus Tausenden von Influenzavarianten wählen zu können, um chimärische Viren herzustellen, läßt das Problem der Wirtsresistenz in Vergessenheit geraten, das sich bei Verwendung anderer Viren wie z.B. dem Vacciniavirus stellt. Hinzu kommt, daß, da Influenza eine kräftige sekretorische und zytotoxische T-Zellen-Response auslöst, die Präsentation von fremden Epitopen in dem Influenzavirus-Hintergrund auch für die Induktion von sekretorischer Immunität und zellvermittelter Immunität sorgen kann.
  • 3.1 DEFINITIONEN
  • In dieser Unterlage haben die folgenden Begriffe die nachgenannte Bedeutung:
    • cRNA
    antigenomische RNA
    HA
    Hämagglutinin(Hüllenglykoprotein)
    M
    Matrixprotein (kleidet Hülleninnenseite aus)
    MDCK
    Madin Darby canine kidney-Zellen (Madin-Darby-Hundenieren-Zellen)
    MDBK
    Madin Darby bovine kidney-Zellen (Madin-Darby-Rindernieren-Zellen)
    Moi
    Multiplizität ('Mehrfachheit') der Infektion
    NA
    Neuraminidase (Hüllenglykoprotein)
    NP
    Nukleoprotein (assoziiert mit RNA und erforderlich für Polymerase-Aktivität)
    NS
    Nicht-Strukturprotein (Funktion unbekannt)
    nt
    Nukleotid
    PA, PB1, PB2
    RNA-abhängigeRNA-Polymerase-Komponenten
    RNP
    Ribonukleoprotein (RNA, PB2, PB1, PA und NP)
    rRNP
    rekombinantes RNP
    vRNA
    genomische Virus-RNA
    viraler Polymerasekomplex
    PA, PB1, PB2 und NP
    WSN
    Influenza-A/WSN/33-Virus
    WSN-HK-Virus:
    reassortiertes Virus, das sieben Gene vom WSN-Virus und das NA-Gen vom Influenza-A/HK/8/68-Virus enthält
  • 4 BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • 1. Reinigung ("Purification") des Polymerasepräparats. RNP-Kerne wurden von kompletten Viren gereinigt und dann in einer CsCl-Glycerol-Gradientenzentrifuge zentrifugiert. Die Polymerase wurde von Fraktionen mit 1,5 bis 2,0 M CsCl abgetrennt. Sodann wurden Proben mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese über einem 7- bis 14%igem Linear- Gradientengel in Gegenwart von 0,1 % Natriumdodecylsulfat untersucht mit anschließendem Anfärben mit Silber. Die Proteinproben enthielten 1,4 (μg koplettes Virus (Streifen .1), 0,3 μg komplettes Virus (Streifen 2), 5 μl RNP-Kerne (Streifen 3) und 25 μl RNA-Polymerase (Streifen 4). Bekannte Zuordnungen der Proteine sind auf der linken Seite angegeben.
  • 2. Verwendung von Plasmid-Konstruktionen zur Herstellung von RNA-Matrizen. Die Plasmid-Konstruktion ist durch das dunkle Kästchen dargestellt, das die pUC-19-Sequenzen zeigt; das schraffierte Kästchen zeigt den gekürzten Promotor, der speziell von Bakteriophage-T7-RNA-Polymerase erkannt wird; die durchgezogene Linie zeigt die DNA, die von Plasmiden, die mit MboII geschnitten worden sind, transkribiert wurde. Das weiße Kästchen zeigt Sequenzen, die für die Erkennungsstellen für MboII, EcoRI und PstI, und zwar in dieser Reihenfolge, codieren. Spaltstellen für Restriktionsendonukleasen sind angegeben. Unter dem Diagramm sind die kompletten Sequenzen der RNAs angegeben, die aus der Synthese durch T7-RNA-Polymerase aus MboII-geschnittenem Plasmid resultieren. Das 5'-Ende und das 3'-Ende von V-wt-RNA sind identisch mit den in Segment 8 von Influenza-A-Virus-RNA vorgefundenen Enden, getrennt durch 16 "Platzhalter"-Nukleotide ("Spacers"). Die RNA, M-wt, repräsentiert genau die entgegengesetzte Position oder "Informationsrichtung" ("message-sense") von V-wt. Restriktionsendonuklease-Stellen für DraI, EcoRI, PstI und SmaI sind angegeben. T7-Transkripte von Plasmiden, die durch diese Enzyme geschnitten werden, ergeben jeweils 32, 58, 66 bzw. 91 Nukleotide lange RNAs. Die Sequenzen von V-d5'-RNA sind angegeben. Die Plasmid-Konstruktion ist bis auf geringfügige Änderungen in der "Platzhalter"-Sequenz im wesentlichen dieselbe wie die, die für die V-wt-RNA verwendet wurde. Die Punktmutanten der untersuchten V-d5'-RNAs sind in Tabelle I angegeben.
  • 3. Analyse von Influenzavirus-Polymerase-Produkten. 3A: Polymerasereaktionsgemische, die 0,4 mM Apg (Streifen 2) oder keinen Starter ("Primer") (Streifen 3) enthielten, wurden mittels Elektrophorese auf 8 % Polyacrylamidgelen, denen 7,7 M Harnstoff zugesetzt war, analysiert. 3B: Die naszierende RNA ist gegenüber einzelsträngiger spezifischer Nuklease S1 resistent. Nach der standardmäßigen Polymerasereaktion wurden die Lösungen in Nuklease-S1-Puffer (Streifen 1) verdünnt und es wurde Enzym hinzugegeben (Streifen 2). Zur Überwachung der S1-Spaltbedingungen wurde radioaktiv markierte einzelsträngige V-wt-RNA mit Nuklease S1 (Streifen 3) oder nur mit Puffer (Streifen 4) behandelt. 3C: Ribonuklease-T1-Analyse von gelgereinigten Reaktionsprodukten. Die Reaktionsprodukte der viralen Polymerase bei Verwendung der V-wt-RNA-Matrize wurden elektrophoretisch auf 8 % Polyacrylamidgel getrennt. Das 53-nt-Band und das kleinere Transkript wurden excidiert und aus der Gelmatrix eluiert. Diese RNAs wurden mit RNAse T1 aufgespalten und mittels Elektrophorese auf 20 % Polyacrylamidgel, dem 7,7 M Harnstoff zugesetzt war, analysiert. Zum Vergleich wurden außerdem T7-Transkripte von M-wt- und V-wt-RNAs, die in Gegenwart eines α-32P-UTP synthetisiert worden waren, mit RNAse T1 analysiert. Die vorgenannten radioaktiv markierten Oligonukleotide der Kontroll-RNAs sind angegeben. Streifen 1,53 Nukleotide FL-Produkt (FL: full length – volle Länge); Streifen 2,40-45 Nukleotide Sm-RNA-Produkt (Sm: smaller – kleiner); Streifen 3, M-wt-RNA markiert durch Einbau von 32P-UMP; und Streifen 4, V-wt-RNA markiert wie in Streifen 3.
  • 4. Optimale Reaktionsbedingungen für die virale Polymerase. 4A: Reaktionen mit V-wt-Matrize wurden auf Eis zusammengestellt und dann unter den angegebenen Temperaturen 90 Minuten lang inkubiert. 4B: Reaktionen mit der V-wt-Matrize wurden parallel mit den angegebenen NaCl- oder KCl-Konzentrationen durchgeführt und bei 30 °C 90 Minuten lang inkubiert. 4C: Eine einzelne Reaktion mit der V-wt-Matrize wurde bei 30 °C inkubiert, und es wurden zu den angegebenen Zeitpunkten Proben entnommen und sofort durch Phenol-Chloroform- Extraktion verarbeitet. Alle Gele enthielten 8 % Polyacrylamid mit 7,7 M Harnstoff-Zusatz.
  • 5. Matrizenspezifität der viralen Polymerase. 5A: Die virale Polymerasereaktion erfordert 3'-terminale Promotorsequenzen. Verschiedene Matrizen-RNAs wurden in Reaktionen unter Standardbedingungen eingesetzt. Streifen 1, die V-Pst-RNA, die bis auf eine 13-nt-Verlängerung am 3'-Ende mit V-wt identisch ist; Streifen 2, V-Sma-RNA, die eine 38-nt-Verlängerung am 3'-Ende aufweist; Streifen 3, V-wt-RNA; Streifen 4, ein DNA-Polynukleotid mit identischer Sequenz wie die V-wt-RNA; Streifen 5, eine 80-nt-RNA, generiert durch Bakteriophage-T3-RNA-Polymerase-Transkription eines pIBI-31-Plasmids, aufgespalten mit HindIII. Die autoradio- graphische Aufnahme wurde überbelichtet, um das Fehlen spezifischer Reaktionsprodukte bei Verwendung dieser anderen Matrizen hervorzuheben. 5B: 10 ng einer jeden Matrizen-RNA wurden mit der viralen Polymerase inkubiert und die Produkte wurden dann elektrophoretisch in 8 % Polyacrylamidgelen, denen 7,7 M Harnstoff zugesetzt war, aufgespalten. Gezeigt werden: Streifen 1, V-wt-RNA; Streifen 2, V-Dra-RNA; Streifen 3, V-Eco-RNA; Streifen 4, M-wt-RNA; und Streifen 5, ein 53-nt-Marker-Oligonukleotid. Siehe 2 und Absatz 6.1 ff für die genauen Sequenzunterschiede.
  • 6. Der RNA-Promotor erfordert keinen terminalen "Pfannenstil". Polymerasereaktionen bei Einsatz von zwei Matrizen-RNAs. Jede Reaktion enthielt 5 ng V-wt-RNA. Als eine zweite Matrize enthielten die Reaktionen 0 ng (Streifen 1), 0,6 ng (Streifen 2) und 3,0 ng (Streifen 3) V-d5-RNA. Die resultierenden Molarverhältnisse entsprechen den Angaben in der Abbildung. Die Reaktionsprodukte wurden auf 8 % Polyacrylamidgel in Gegenwart von 7,7 M Harnstoff analysiert. Nach einer densitometrischen Untersuchung der autoradiographischen Aufnahmen wurde die relative Intensität einer jeden Spitze ("Peak") um den Betrag der in jedem Produkt inkorporierten radioaktiven UMP korrigiert.
  • 7. Spezifität von Promotorsequenzen. RNAs, denen das 5'-Ende fehlte und die Punktmutationen (Tabelle II) aufwiesen, wurden mit V-d5'-RNA in Standard-Polymerasereaktionen verglichen. Die rechte Tafel stammt von einem separaten Reaktionssatz. Eine quantitative vergleichende Gegenüberstellung ist in Tabelle II zusammengefaßt.
  • 8. Hochkonzentrierte Polymerasepräparate sind aktiv in durch cap-Endonuklease gestartete RNA-Synthesereaktionen und in RNA-Synthesereaktionen ohne Startermolekül ("Primer"). 8A: Primer-Spezifität des hochkonzentrierten Enzyms. Radioaktiv synthetisierte 30-nt-Matrize ist in Streifen 1. Reaktionen, die 20 ng V-d5'-RNA und 5 jxl virale Polymerase einsetzten, enthielten als Startermolekül: keinen Starter (Streifen 2); 100 ng BMV RNA (De und Banerjee, 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun. 6:40-49), eine cap-0-Struktur enthaltend (Streifen 3); 100 ng Kaninchen-Globin-mRNA, eine cap-1-Struktur enthaltend (Streifen 4); und 0,4 mM ApG (Streifen 5), Eine geringer belichtete Aufnahme von Streifen 5 ist als Streifen 6 gezeigt. 8B: Nuklease-S1-Analyse von gelgereinigten RNAs. Produkte aus Reaktionen, die ApG als Primer (Streifen 1 und 2), keinen Primer (Streifen 3 und 4) bzw. Globin-mRNA als Primer verwendeten (Streifen 5 und 6), wurden elektrophoretisch ohne Harnstoff-Zusatz aufgetrennt, und das geeignete Gelstück wurde excidiert und die RNA wurde eluiert. Diese RNA wurde sodann mit Nuklease S1 gespalten (Streifen 2, 4 und 6), und die Produkte wurden denaturiert und auf 8 % Polyacrylamidgel, dem 7,7 M Harnstoff zugesetzt war, analysiert.
  • 9. Synthese von RNAs genomischer Lange ausgehend von neu gebildeten RNPs. Produkte aus Reaktionen, bei denen 10 μl Polymerase und als Matrize ein 890 nt langes RNA-Fragment, identisch mit der Sequenz von Segment 8 von Virus A/WSN/33, sowie aus Virus A/PR/8/34 extrahierte RNA eingesetzt wurden, wurden anhand von 4 % Polyacrylamidgel, dem 7,7 M Harnstoff zugesetzt war, analysiert. In Streifen 1 wird die durch T7-RNA-Polymerase radioaktiv synthetisierte 890 nt lange Matrize gezeigt. Die 890 nt lange, plasmid-abgeleitete RNA wurde in den Streifen 2, 3, 8 und 9 als Matrize verwendet. Virus-extrahierte RNA wurde in den Streifen 4, 5, 10 und 11 als Matrize verwendet. In den Streifen 6 und 7 wurde keine Matrize eingesetzt. In den Streifen 2 bis 5 wurde kein Primer eingesetzt, während in den Streifen 6 bis 11 ApG als Primer eingesetzt wurde. In den Streifen 3, 5, 7, 9 und 11 wurden die Reaktionsprodukte mit Nuklease S1 behandelt.
  • 10. Schematische Darstellung eines PCR-(Polymerase-Kettenreaktion-)abhängigen Mutageneseverfahrens, das sich zum Austausch von viralen Codierungssequenzen innerhalb von viralen Gensegmenten anwenden läßt.
  • 11. (A) Schematische Darstellung der relevanten Abschnitte von pIVCAT1. Die verschiedenen Domainen sind bezeichnet und sind, von links nach rechts: ein gekürzter T7-Promotor; das nichtübertragene 5'-Ende von Segment 8 des Influenza-A/PR/8/34-Virus (22 Nukleotide); eine 8 Nukleotide umfassende Linker-Sequenz; die vollständige Codierungsregion des Gens der Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) (660 Nukleotide); das vollständige nichtübertragene 3'-Ende von Segment 8 des Influenza-A/PR/8/34-Virus (22 Nukleotide); und die HgaI-Restriktionsenzym-Stelle enthaltende Linker-Sequenz. Relevante Restriktionsenzym-Stellen und Start- und Stop-Stellen für das CAT-Gen sind angegeben. (B) Das durch HgaI-Aufspaltung und Transkription von pIVACAT1 durch T7-RNA-Polymerase gewonnene 716-Basen-RNA-Produkt. Influenzavirus-Sequenzen sind durch Fettdruck, CAT-Gen-Sequenzen durch Normaldruck und Linker-Sequenzen durch Kursivdruck angegeben. Die Tripletts – in gegensinniger Ausrichtung – die die Initiations- und Terminationscodons des CAT-Gens darstellen, sind durch Pfeil bzw. Unterstreichung angegeben.
  • 12. RNA-Produkte von 77-Polymerase-Transkription und In-vitro-Influenzavirus-Polymerase-Transkription. Streifen 1-4: Polyacrylamidgel-Analyse von radioaktiv markierten T7-Polymerase-Transkripten von pIVACAT1 und pHgaNS. Streifen 5 und 6: Polyacrylamidgel-Analyse der radioaktiv markierten Produkte von Invitro-Transkription durch gereinigtes Influenza-A-Polymerase-Protein unter Verwendung von unmarkierten IVACAT1-RNA- und HgaNS-RNA-Matrizen. Streifen 1:80 nt umfassende HgaNS-RNA. Streifen 2-4: verschiedene Präparate von IVACAT1-RNA. Streifen 5: virales Polymerase-Transkript von IVACAT1-RNA. Streifen 6: virales Polymerase-Transkript von HgaNS-RNA.
  • 13. Schematische Darstellung der RNP-Transfektion und der während des Prozesses durchgeführten Experimente ("passaging experiments").
  • 14. CAT-Analysen von mit IVACAT1-RNA RNP-transfizierten Zellen. (A) Zeitverlauf der RNP-Transfektion in 293-Zellen. Die Zellen wurden zum Zeitpunkt –1 mit der rekombinanten RNP transfiziert und zum Zeitpunkt 0 mit Virus infiziert. Die Zellen wurden zu den angegebenen Zeiten geerntet und auf CAT-Aktivität hin untersucht. (B) Anforderungen für RNP-Transfektion von 293-Zellen; Parameter der Reaktionsgemische wie angegeben. (C) RNP-Transfektion von MDCK-Zellen. MDCK-Zellen wurden entweder zum Zeitpunkt –1 oder zum Zeitpunkt +2 bezogen auf den Zeitpunkt der Virusinfektion mit IVACAT1-RNA-Polymerase transfiziert. Die Zellen wurden zu den angegebenen Zeiten geerntet und auf CAT-Aktivität hin untersucht. Reaktionsteilnehmer/-bedingungen wie angegeben. "Zeit" gibt den Zeitpunkt an, an dem die Zellen geerntet wurden. T = 0 markiert die Zeit der Zugabe von Helfervirus. "RNA" entspricht der IVACAT1-RNA. "Pol" steht für den gereinigten Influenza-A/PR/8/34-Polymerase-Protein-Komplex. "WSN" steht für das Influenza-A/PR/8/34-Helfervirus. "Preink." steht für 30-minütige Preinkubation von RNA und Polymerase in Transkriptionspuffer bei 30 °C. "RNP-Transfektion" steht für den Zeitpunkt der RNP-Transfektion bezogen auf den Zeitpunkt der Virusinfektion. "+/–" zeigt das Vorhandensein bzw. das Fehlen des bestimmten Bestandteils/Merkmals an. "C" steht für Kontrolluntersuchungen unter Verwendung von im Handel erhältlichem CAT-Enzym (Boehringer-Mannheim).
  • 15. CAT-Aktivität in mit rekombinantem Virus infizierten MDCK-Zellen. Überstand von RNP-transfizierten und mit Helfervirus infizierten MDCK-Zellen wurde zur Infizierung von frischen MDCK-Zellen verwendet. Der Impfstoff wurde 1 Stunde nach Infektion entfernt, 11 Stunden später wurden Zellen geerntet und auf CAT-Aktivität hin untersucht. Streifen 1: Extrakt von nur mit Helfervirus infizierten Zellen. Streifen 2: Extrakt von mit 100 μl Überstand von RNP-transfizierten und helfervirus-infizierten MDCK-Zellen infizierten Zellen. Streifen 3: Überstand (80 μl) von Zellen aus Streifen 2. Streifen 4: Wie in Streifen 2, nur daß dem Inokulum Helfervirus (MOI4) zugesetzt war. Im Gegensatz zu den in 4 gezeigten Versuchen enthielten die Proben 20 μl 14C-Chloramphenicol.
  • 16. Diagramm der relevanten Abschnitte des in für Transfektionsversuche verwendeten Plasmiden enthaltenen Neuraminidase- (NA-)Gens. Das pUC19-abgeleitete Plasmid pT3NAv enthält das Influenza-A/WSN/33-Virus-NA-Gen sowie einen gekürzten Promotor, der speziell von Bakteriophage-T3-RNA-Polymerase erkannt wird. Der verwendete T3-Promotor ist so gekürzt, daß das zuerst transkribierte Nukleotid (ein Adenin) dem 5'-Adenin des WSN-NA-Gens entspricht. Am 3'-Ende der cDNA-Kopie des NA-Gens wurde eine Ksp632I-Restriktionsenzymstelle so eingefügt, daß sich die Spaltstelle direkt nach dem 3'-Ende der NA-Gensequenz befindet. Die Ksp632I-Spaltung und Transkription von PT3NAv durch T3-RNA-Polymerase (wie in Abschnitt 8.1 beschrieben) brachte ein 1409 Nukleotide langes Transkript hervor. Die 15 5'-terminalen Nukleotide, die 52 dem Abschnitt zwischen den Restriktions-Endonukleasestellen NcoI und PstI entsprechenden Nukleotide und die 12 3'-terminalen Nukleotide sind angegeben. Das Transkript von pT3NAv mut 1 ist mit dem von pT3NAv bis auf eine einzige Deletion, 11 Nukleotide hinter dem 5'-Ende der Wildtyp-RNA, identisch. Das Transkript von pT3NAv mut 2 ist bis auf 5 Mutationen, die sich in der mittleren Region (durch Unterstreichung hervorgehoben) befinden, mit dem von pT3NAv identisch. Diese 5 Mutationen ändern nicht die Aminosäuresequenz in dem offenen Leserahmen des Gens. Das Serin-Kodon UCC an Position 887-889 (RNA mit positiver Polarität) wurde durch das Serin-Kodon AGU in demselben Rahmen ersetzt. Die Numerierung der Nukleotide entspricht Hiti u.a., 1982, J. Virol. 41: 730-734.
  • 17. Polyacrylamidgel-Elektrophorese von aus sichergestellten Influenzaviren gereinigten RNAs. RNA-Transkripte von pT3NAs (16) von phenol-extrahierter RNA, abgeleitet von Influenza-A/WSN/33-Virus, wurde mit gereinigten Polymerasepräparaten entsprechend dem in Absatz 6.1.1 beschriebenen Protokoll gemischt. Diese neu gebildeten RNPs wurden dann in MDBK-Zellen transfiziert, die eine Stunde zuvor mit WSN-HK-Helfervirus infiziert worden waren. Das Medium, das 28 μg/ml Plasminogen enthielt, wurde nach 16 Stunden geerntet, und Virus wurde zur Amplifikation und Plaquesbildung in Abwesenheit von Protease in MDBK-Zellen eingebracht. Aus diesen Plaques gewonnenes Virus wurde dann weiter in MDBK-Zellen vermehrt, und RNA wurde aus gereinigten Viruspräparaten wie in den Absätzen 6.1 ff und 7.1 ff beschrieben phenol-extrahiert. Die RNAs wurden auf 2,8 -Polyacrylamid-0,075 %-Bisacrylamid-Gelen, die 7,7 M Harnstoff in TBE-Puffer enthielten, aufgetrennt und durch Silbereinfärbung wie in Absatz 6.1 ff beschrieben sichtbar gemacht. Streifen 1 und 6: WSN-HK-Virus-RNA. Streifen 2: RNA eines Virus, das aus MDBK-Zellen nach RNP-Transfektion mit von pT3NAv abgeleiteter NA-RNA und Infektion mit WSN-HK-Helfervirus sichergestellt wurde. Streifen 3: NA-RNA, transkribiert in vitro aus pT3NAv. Streifen 4: RNA von Kontroll-WSN-Virus. Streifen 5: RNA eines Virus, das aus MDBK-Zellen nach RNP-Transfektion mit phenol-extrahierter WSN-Virus-RNA und Infektion mit WSN-HK-Helfervirus sichergestellt wurde.
  • 18. Sequenzanalyse von RNA, gewonnen aus gesichertem, fünf ortsspezifische Mutationen enthaltendem Influenzavirus. Nach Infektion mit dem WSN-HK-Helfervirus wurden MDBK-Zellen mit T3NAv mut 2-RNA, gewonnen durch Transkription aus pT3NAv mut 2, RNP-transfiziert. Nach Inkubation über Nacht in Gegenwart von 28 μg/ml Plasminogen wurde Medium zur Vermehrung und Plaquesbildung in MDBK-Zellen in Abwesenheit von Protease verwendet. Dann wurde Virus aus Plaques amplifiziert, und RNA wurde nach Phenol-Extraktion von gereinigtem Virus gewonnen. Die Sicherung des Mutanten-NA-Gens in Viruspartikeln wurde überprüft durch direkte RNA-Sequenzanalyse unter Einsatz von 5'-TACGAGGAAATGTTCCTGTTA-3' als Primer (entspricht Position 800-819; Hiti u.a.,}. Virol. 41: 730-734) und Reverser Transcriptase (Yamashita u.a., 1988, Virol. 163:112-122) überprüft. Die gezeigten Sequenzen entsprechen Position 878-930 in dem NA-Gen (Hiti u.a., J. Virol. 41: 730-734). Die Pfeile und die unterstrichenen Nukleotide zeigen die Änderungen in der Mutanten-RNA im Vergleich zu der Wildtyp-RNA. Links: Kontroll-RNA, gewonnen aus Influenza-A/WSN/33-Virus. Rechts: RNA von mutiertem Virus, sichergestellt aus MDBK-Zellen, die mit T3NAv mut 2-RNA RNP-transfiziert und mit WSN-HK-Helfervirus infiziert worden waren.
  • 19. CAT-Expression in mit Vacciniavirus infizierten/IVACAT-1-RNP transfizierten Zellen. Ungefähr 106 C127-Zellen von der Maus in 35-mm-Schalen wurden mit Gemischen aus rekombinanten Vacciniaviren (Smith u.a., 1986) mit einer MOI von ungefähr 10 je Vektor infiziert. Nach 1,5 Stunden wurde synthetisches IVACAT-1-RNP in die virusinfizierten Zellen wie beschrieben transfiziert (Lutjyes u.a., 1989). Die Zellen wurden über Nacht inkubiert, sodann geerntet und auf CAT-Aktivität hin gemäß Standardverfahren analysiert (Gorman u.a., 1982). Die Proben enthielten 0,05 uCL [14C] Chloramphenicol, 20 μl 40 mM Acetyl-CoA (Boehringer) und 50 μl Zellextrakte in 0,25 Tris-Puffer (pH 7,5). Die Inkubationszeiten betrugen ungefähr 4 Stunden. Die Bezeichnungen unter den Streifennummern geben die Behandlung der Zellen an. Streifen 1 – Kontrolle; Streifen 2 – Transfektion von nackter RNA (ohne Zugabe von Polymerase), keine Helfervirus-Infektion; Streifen 3 – RNP-Transfektion, kein Helfervirus; Streifen 4 – RNP-Transfektion, Influenzavirus als Helfer; Streifen 5-11 – RNP-Transfektion, Vacciniavirus-Vektoren als Helferviren exprimieren die angegebenen Influenzavirus-Proteine.
  • 20. Tests mit verschiedenen Zellinien. A) Zellen wurden mit Vaccinia-Vektoren, die die Proteine PB2, PB1 und PA (Streifen 1, 3, 5, 7) oder die Proteine PB2, PB1, PA und NP (Streifen 2, 4, 6, 8) exprimieren, infiziert, mit IVACAT-1-RNP transfiziert und auf CAT-Aktivität hin untersucht wie beschrieben. Streifen 1, 2: Madin-Darby-Hundenieren-(MDCK-)Zellen; Streifen 3, 4: HeLa-Zellen; Streifen 5, 6: 293-Zellen (Graham u.a., 1977, J. gen. Virol 36: 59-72); Streifen 7, 8: L-Zellen. B) Zellinie 3-PNP-4 wurde als Wirtszelle verwendet. Unter jedem Streifen sind die Influenzavirus-Proteine angegeben, die in jeder Probe exprimiert werden. C) 293-Zellen wurden mit den vier erforderlichen Vaccinia infiziert und mit synthetischer RNP, hergestellt unter Verwendung von IVA-CAT-1-RNA (Streifen 1) oder IVA-CAT-2-RNA (Streifen 2), transfiziert. Nach Inkubation über Nacht wurden Zellen geerntet und CAT-Analysen durchgeführt.
  • 5 BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft die Herstellung und Verwendung von rekombinanten Influenzavirus-RNA-Matrizen gemäß Anspruch 1, die zusammen mit viraler RNA-abhängiger RNA-Polymerase zur Exprimierung heterologer Genprodukte in geeigneten Wirtszellen und/oder zur Sicherstellung des heterologen Gens in Influenza-Viruspartikeln eingesetzt werden können. Die RNA-Matrizen können durch Transkription geeigneter DNA-Sequenzen unter Verwendung einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase wie z.B. Bakteriophage T7, T3 oder der SP6-Polymerase hergestellt werden. Bei Verwendung von Influenza. wird die DNA so aufgebaut, daß sie für die Informationsrichtung der heterologen Gensequenz codiert, flankiert vor dem ATG von dem Komplement der viralen Polymerasebindungsstelle/Promotor von Influenza, d.h. dem Komplement des 3'-Endes eines Genomsegments von Influenza. Zur Sicherstellung in Viruspartikeln kann es unter Umständen günstig sein, die heterologe Gen-Codierungssequenz mit dem Komplement sowohl des 3'-Endes als auch des 5'-Endes eines Genomsegments von Influenza zu flankieren. Nach Transkription mit einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase wird die resultierende RNA-Matrize für die negative Polarität der heterologen Gensequenz codieren und die vRNA-terminalen Sequenzen enthalten, die die virale RNA-abhängige RNA-Polymerase befähigen, die Matrize zu erkennen.
  • Die rekombinanten RNA-Matrizen gemäß Anspruch 1 mit negativer Polarität können gemischt werden mit gereinigtem viralem Polymerase-Komplex, der virale RNA-abhängige RNA-Polymeraseproteine (die P-Proteine) und Nukleoprotein (NP) umfaßt, das von aus komplettem Virus dargestellten RNP-Kernen isoliert werden kann, um "rekombinante RNPs" (rRNPs) zu bilden. Diese RNPs sind infektiös und können dazu verwenden werden, das heterologe Genprodukt in geeigneten Wirtszellen auszudrücken und das heterologe Gen in Viruspartikeln sicherzustellen durch Co-Transfektion von Wirtszellen mit den rRNPs und Virus. Wahlweise können die rekombinanten RNA-Matrizen gemäß Anspruch 1 zur Transfektion von transformierten Zellinien eingesetzt werden, die die RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Proteine, die eine Komplementierung gestatten, exprimieren.
  • Diese Erfindung wird anhand von Arbeitsbeispielen veranschaulicht, in denen RNA-Transkripte von klonierter, die Codierungsregion – in negativer Polarität – des Chloramphenicol-Acetyltransferase-(CAT-)Gens enthaltenden DNA, eingerahmt von den 22 5'terminalen und den 26 3'-terminalen Nukleotiden der Influenza-A/PR/8/34-Virus-NS-RNA, mit isolierten Influenza-A-Virus-Polymeraseproteinen gemischt wurden. Dieser neu gebildete Ribonukleinprotein/RNP-Komplex wurde in MDCK-(oder 293-)Zellen transfiziert, die mit Influenzavirus infiziert waren. Die CAT-Aktivität war vor und kurz nach der Virusinfektion vernachlässigbar, jedoch bis sieben Stunden nach der Virusinfektion nachweisbar. Als Zellüberstand, der "geknospeten" Virus aus diesem "Sicherstellungsexperiment" enthielt, zum Zwecke der Infektion einer neuen "Monolayer" aus MDCK-Zellen verwendet wurde, konnte ebenso CAT-Aktivität nachgewiesen werden, was vermuten läßt, daß die das rekombinante CAT-Gen enthaltende RNA in Viruspartikel gepackt worden war. Diese Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Verwendung von rekombinanten Influenzavirus-RNA-Matrizen und gereinigter RNA-abhängiger RNA-Polymerase zur Neubildung von rekombinantem Influenzavirus-RNP. Desweiteren lassen die Daten vermuten, daß die 22 5'-terminalen und die 26 3'-terminalen Sequenzen der Influenza-A-Virus-RNA ausreichen, um die Signale für die RNA-Transkription, RNA-Replikation und Packung der RNA in Influenzaviruspartikeln zu liefern.
  • Ebenso demonstrierten wir anhand dieser Methodik die Sicherstellung von synthetischen, von geeigneten rekombinanten Plasmid-DNAs abgeleiteten RNAs, in stabilen und infektiösen Influenzaviren. Insbesondere wurde dem Neuraminidase-(NA-)Gen von Influenza-A/WSN/33-Virus (WSN) entsprechende RNA in vitro aus Plasmid-DNA transkribiert und nach Addition von gereinigtem Influenzavirus-Polymerasekomplex in MDBK-Zellen transfiziert. Eine Reinfektion mit Helfervirus, dem das WSN-NA-Gen fehlte, führte zur Freisetzung von Virus, das das WSN-NA-Gen enthielt. Sodann brachten wir fünf Punktmutationen in das WSN-NA-Gen ein durch Kassettenmutagenese der Plasmid-DNA. Eine Sequenzanalyse des sichergestellten Virus enthüllte, daß das Genom alle fünf in dem mutierten Plasmid vorkommenden Mutationen enthielt. Diese Technik kann eingesetzt werden zur Schaffung von Viren mit ortsspezifischen Mutationen, so daß sich Influenzaviren mit definierten biologischen Eigenschaften konstruieren lassen.
  • Die Möglichkeit der Neubildung von RNPs in vitro erlaubt die Konstruktion von neuen chimärischen Influenzaviren, die Fremd-Gene exprimieren. Ein Weg, um dieses Ziel zu erreichen, impliziert die Modifizierung von vorhandenen Influenzavirus-Genen. Beispielsweise kann das HA-Gen so modifiziert werden, daß es fremde Sequenzen in seinen äußeren Domänen enthält. Wo die heterologe Sequenz Epitopen oder Antigenen von Pathogenen entspricht, können diese chimärischen Viren benutzt werden, um eine schützende Immunantwort auf den Krankheitserreger, von dem diese Determinanten abgeleitet sind, zu induzieren. Neben der Änderung von Genen, die für Oberflächenproteine codieren, können auch Gene geändert werden, die für Nichtoberflächenproteine codieren. Letztgenannte Gene stehen nachweislich mit den wichtigsten zellulären Immunantworten in dem Influenzavirussystem in Zusammenhang (Townsend u.a., 1985, Cell 42:475-482). D.h., der Einschluß einer fremden Determinanten in das NP- oder das NS-Gen eines Influenzavirus kann – nach Infektion – eine wirksame zelluläre Immunantwort auf diese Determinante induzieren. Ein solcher Ansatz kann besonders hilfreich sein in Situationen, in denen schützende Immunität in starkem Maße von der Induktion zellulärer Immunantworten abhängt (z.B. Malaria usw.).
  • Ein anderer Ansatz, der die Expression von fremden Proteinen (oder Domänen solcher Proteine) über chimärische Influenzaviren gestatten würde, betrifft die Einbringung kompletter heterologer Gene in das Virus. Influenzaviruspräparate mit mehr als acht RNA-Segmenten sind früher bereits beschrieben worden (Nayak, D., u.a. in Genetics of Influenza Virus, P. Palese und D. W. Kingsbury, Hrsg., Springer-Verlag, Wien, S. 255-279). Entsprechend können Influenzaviren mit neun oder mehr RNA-Segmenten lebensfähig sein, und die korrekte Verpackung solcher chimärischer Viren kann leicht erfolgen.
  • Diese Erfindung läßt sich – rein zum Zwecke der Beschreibung – in die nachgenannten Abschnitte untergliedern: (a) Herstellung von rekombinanten RNA-Matrizen; (b) Expression von heterologen Genprodukten unter Verwendung von rekombinanten RNA-Matrizen; und (c) Sicherstellung des heterologen Gens in rekombinanten Viruspartikeln. Aus Gründen der Klarheit der Erörterung wird diese Erfindung im folgenden am Beispiel von Influenza beschrieben. Es kann jeder beliebige Influenzavirusstamm (A, B oder C) verwendet werden.
  • 5.1 KONSTRUKTION DER REKOMBINANTEN RNA-MATRIZEN
  • Heterologe Gen-Codierungssequenzen, flankiert von dem Komplement der viralen Influenza-Polymerasebindungsstelle/Promotor, z.B. dem Komplement des 3'-Influenzavirus-Terminus oder den Komplementen von sowohl dem 3'-Influenzavirus-Terminus als auch dem 5'-Influenzavirus-Terminus, können unter Anwendung von Verfahren, die auf diesem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden. Rekombinante DNA-Moleküle, die diese Hybridsequenzen enthalten, können kloniert werden und durch eine DNA-abhängige RNA-Polymerase wie z.B. Bakteriophage T7, T3 oder die SP6-Polymerase u.a. transkribiert werden, um die rekombinanten RNA-Matrizen hervorzubringen, die die entsprechenden viralen Sequenzen beinhalten, welche die virale Polymeraseerkennung und -aktivität ermöglichen.
  • Ein Ansatz für die Herstellung dieser Hybridmoleküle besteht in der Einfügung ("Insertion") der heterologen Codierungssequenz in ein DNA-Komplement eines Influenzavirus-Genomsegments, so daß die heterologe Sequenz flankiert wird von den viralen Sequenzen, die für virale Polymeraseaktivität erforderlich sind; d.h. viralen Polymerasebindungsstellen/Promotor, im folgenden die virale Polymerasebindungsstelle genannt. In einem alternativen Ansatz lassen sich Oligonucleotide, die für die influenzavirale Polymerasebindungsstelle codieren, z.B. das Komplement des 3'-Terminus oder beider Termini der Virus-Genomsegmente, an die heterologe Codierungssequenz binden, um das Hybridmolekül herzustellen. Die Plazierung eines Fremd-Gens oder Segments eines Fremd-Gens innerhalb einer Zielsequenz wurde früher von der Gegenwart geeigneter Restriktionsenzymstellen innerhalb der Zielsequenz bestimmt. Jüngste Fortschritte in der Molekularbiologie jedoch haben dieses Problem weitgehend abgebaut. Restriktionsenzymstellen lassen sich problemlos überall innerhalb einer Zielsequenz plazieren durch die Anwendung von ortsabhängiger Mutagenese (siehe z.B. die von Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:488 beschriebenen Verfahren). Änderungen der weiter unten beschriebenen Polymerase-Kettenreaktions-(PCR-)Technik gestatten ebenso die spezifische Einfügung von Sequenzen (d.h. Restriktionsenzymstellen) und erlauben die problemlose Herstellung von Hybridmolekülen. Wahlweise könnten PCR-Reaktionen zur Herstellung von rekombinanten Matrizen ohne Notwendigkeit des Klonierens eingesetzt werden. PCR-Reaktionen könnten z.B. eingesetzt werden zur Herstellung von einen DNA-abhängigen RNA-Polymerase-Promotor (z.B. Bakteriophagen T3, T7 oder Sp6) enthaltenden, doppelsträngigen DNA-Molekülen und der das heterologe Gen und die Influenzavirus-Polymerase-Bindungsstelle enthaltenden Hybridsequenz. RNA-Matrizen könnten dann direkt von dieser rekombinanten DNA aus transkribiert werden. In einer anderen Verkörperung können die rekombinanten RNA-Matrizen hergestellt werden durch Ligation von die negative Polarität des heterologen Gens und die influenzavirale Polymerase-Bindungsstelle spezifizierenden RNAs durch Einsatz einer RNA-Ligase. Erforderliche Sequenzen für virale Polymerase- Aktivität und Konstruktionen, die gemäß dieser Erfindung verwendet werden können, werden in den folgenden Abschnitten beschrieben.
  • 5.1.1 DER VIRALE 3'-TERMINUS IST FÜR POLYMERASE-AKTIVITÄT ERFORDERLICH
  • Bei den in Abschnitt 6 ff beschriebenen Experimenten handelt es sich um die ersten Versuche einer Definition von Promotorsequenzen für eine Polymerase eines RNA-Virus negativer Polarität, und es wurde festgestellt, daß die Spezifizität in den 15 3'-terminalen Nukleotiden liegt. Diese influenzaviralen Polymerase-Bindungsstellen-Sequenzen sowie funktional äquivalente Influenzasequenzen können gemäß dieser Erfindung verwendet werden. So können beispielsweise funktional äquivalente Influenzasequenzen, die Substitutionen, Insertionen, Deletionen, Additionen oder Inversionen enthalten, die vergleichbare Aktivität zeigen, verwendet werden. Die im folgenden beschriebene RNA-Synthese durch die virale Polymerase ist ein Muster für spezifische Erkennung und Elongation durch die Influenzavirus-Polymerase aus den folgenden Gründen: (a) die Polymerase besitzt hohe Aktivität, wenn ApG als Primer verwendet wird, eine Eigenschaft, die auf Influenzavirus- Polymerase beschränkt ist; (b) sie besitzt optimale Aktivität unter Temperatur- und Ionenbedingungen, die bereits als wirksam für die viralen RNPs aufgezeigt worden sind; (c) die Polymerase besitzt Spezifität für Influenzavirus-Sequenzen auf den Muster-RNA-Matrizen; (d) die Polymerase ist aktiv in der durch cap-Endonuklease ausgelösten RNA-Synthese, was als Kennzeichen für influenza-virale Polymerase gilt; (e) die Erkennung von cap-Donor-RNA ist kennzeichnend für cap-1-Strukturen; und (f) genomische RNA-Segmente werden speziell kopiert.
  • 5.1.2 EIN TERMINALER "PFANNENSTIL" IST FÜR OPTIMALE ERKENNUNG UND SYNTHESE DURCH DIE VIRALE POLYMERASE NICHT ERFORDERLICH
  • Wie zuvor gezeigt wurde, bilden die Influenzavirussegment-RNAs Basenpaare an ihren Enden, so daß pfannenstilförmige Strukturen entstehen. Dieses wurde auf zweierlei Art und Weise erreicht. Ein quervernetzendes Reagenzderivat von Psoralen verknüpfte kovalent die Enden eines jeden Segments in intaktem Virus oder in RNPs von infizierten Zellen (Hsu u.a., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8140-8144). Die behandelte RNA war, wie die elektronenmikroskopische Untersuchung ergab, dank der quervernetzten Enden kreisförmig. Ebenso wurde festgestellt, daß die RNA-Enden in RNPs empfindlich gegenüber Ribonuklease VI sind, die doppelsträngige RNA erkennt und spaltet, und daß die virale Polymerase mit beiden Enden in der Pfannenstil-Konformation verbunden ist (Honda u.a., 1988, J. Biochem. 104: 1021-1026), Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde die Existenz der pfannenstilförmigen Struktur der genomischen RNA nachgewiesen und es wurde rückgeschlossen, daß sie bei der Polymeraseerkennung eine Rolle spielt. Wenngleich auch die in den angeführten Beispielen eingesetzten Matrizen-RNAs ursprünglich dargestellt worden waren, um pfannenstil-spezifische Proteinbindung aufzeigen, zeigte sich, daß der terminale Pfannenstil offensichtlich keine Rolle in den hier untersuchten Polymerasereaktionen spielte.
  • 5.1.3 DAS RNA-POLYMERASEPRÄPARAT KOPIERT SPEZIELL MATRIZEN MIT NEGATIVER POLARITÄT
  • Die virale Polymerase synthetisiert festgestelltermaßen RNA mit optimaler Effizienz, wenn die Matrize den 3'-Terminus des Wildtyps mit negativer Polarität aufweist. Es wurde nachgewiesen, daß RNAs von unzusammenhängender Sequenz nicht kopiert wurden, und daß solche mit zusätzlichen Polylinker-Sequenzen an dem 3'-Ende mit weitaus geringerer Effizienz kopiert wurden. Eine DNA mit der richtigen Sequenz war ebenso als Matrize ungeeignet. Die Reaktion war hochspezifisch, da die M-wt-Matrize nur in sehr geringem Umfang repliziert wurde. Auch wenn unsere Polymerasequelle ein intaktes Virus war, überraschte dieser Feststellung doch sehr, da niemals vermutet worden war, daß die Polymerase, die die RNA mit viraler Polarität erkennt, den Strang mit positiver Polarität nicht effizient kopieren würde. Untersuchungen sind im Gange, um die Spezifität der von infizierten Zellen gereinigten Polymerase zu Zeitpunkten nach der Infektion erforschen, wenn die komplementäre RNA in genomische Matrizen kopiert wird. Die aktuellen Daten unterstützen ein Modell, wonach sich die virale Polymerase, die vRNA kopiert, funktional von der Polymerase unterscheidet, die die vRNA aus cRNA synthetisiert, und zwar dank ihrer Promotor-Erkennung. Es ist möglich, daß sie durch kontrollierte Änderung der Polymerase in infizierten Zellen in die Lage versetzt wird, das 3'-Ende von RNA mit positiver Polarität zu erkennen. Durch Analyse von Promotor-Mutanten untersuchten wir die Feinspezifität der Reaktion und stellten fest, daß die einzige Einfachmutation, die einen erheblich geringeren Synthesegrad zeigte, die der V-A3-RNA war. Desweiteren reduzierten Kombinationen aus zwei oder mehr Punktmutationen an den Positionen 3,5,8 und 10 erheblich die Synthesegrade.
  • 5.1.4 INSERTION DER HETEROLOGEN GENSEQUENZ IN DIE PB2-, PB1-, PA- ODER NP-GENSEGMENTE
  • Die Gensegmente, die für die PB2-, PB1-, PA- und NP-Proteine codieren, enthalten einen einzigen offenen Leserahmen mit 24-45 unübersetzten Nukleotiden an ihrem 5'-Ende und 22-57 unübersetzten Nukleotiden an ihrem 3'-Ende. Das Einfügen einer Fremd-Gensequenz in eines dieser Segmente könnte entweder durch einen vollständigen Austausch der viralen Codierungsregion durch das Fremd-Gen oder durch einen teilweisen Austausch vorgenommen werden. Ein vollständiger Austausch ließe sich wahrscheinlich am besten bewerkstelligen durch die Anwendung der PCR-gesteuerten Mutagenese. Das Prinzip dieses Mutagenese-Verfahrens wird in 10 veranschaulicht. Kurz gesagt, PCR-Primer A würde enthalten, von 5' bis 3': eine einzige Restriktionsenzymstelle, wie z.B. eine Restriktionsenzymstelle der Klasse HS (d.h. ein "Schaltenzym" ("shifter enzyme"); dieses erkennt eine spezifische Sequenz, schneidet die DNA jedoch entweder vor oder nach dieser Sequenz); die komplette unübersetzte 3'-Region dieses Influenza-Gensegments; und eine dem carboxy-terminalen Codierungsabschnitt des Fremd-Genprodukts komplementäre Reihe von Nukleotiden. PCR-Primer B würde enthalten, vom 5'-Ende bis zum 3'-Ende: eine einzige Restriktionsenzymstelle; eine gekürzte jedoch aktive Phagen-Polymerasesequenz; das Komplement der vollständigen unübersetzten 5'-Region des Influenzagensegments (hinsichtlich der vRNA mit negativer Polarität) und eine Reihe von dem 5'-Codierungsabschnitt des Fremd-Gens entsprechenden Nukleotiden. Nach einer PCR-Reaktion unter Einsatz dieser Primer mit einer klonierten Kopie des Fremd-Gens kann das Produkt unter Verwendung der einzigartigen Restriktionsstellen herausgeschnitten und kloniert werden. Aufschluß mit dem Enzym der Klasse IIS und Transkription mit der gereinigten Phagenpolymerase würden ein RNA-Molekül hervorbringen, das die exakten unübersetzten Enden des Influenzavirus-Gensegments mit einem Fremd-Geneinschluß enthielte. Solch eine Konstruktion wird für das Gen der Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) beschrieben, das in den in Abschnitt 7 angeführten Beispielen eingesetzt wird. In einer alternativen Verkörperung könnten PCR-eingeleitete Reaktionen genutzt werden, um doppelsträngige DNA herzustellen, die die Bakteriophagen-Promotorsequenz enthält, sowie die Hybridgensequenz, so daß RNA-Matrizen direkt ohne Klonieren transkribiert werden könnten.
  • In Abhängigkeit von der Unversehrtheit des Fremd-Genprodukts und dem Zweck der Konstruktion kann es wünschenswert sein, Hybridsequenzen aufzubauen, die die Expression von Fusionsproteinen steuern. Beispielsweise sind die vier Influenzavirus-Proteine PB2, PB1, PA und NP Polymeraseproteine, die zu dem Kern der infizierten Zelle durch spezifische in dem Protein vorkommende Sequenzen gelenkt werden. Für das NP wurde die folgende Aminosäuresequenz festgestellt (Einzelbuchstabencode):
    QLVWMACNSAAFEDLRVLS (Davey u.a., 1985, Cell 40: 667-675). D.h., soll das Fremd-Genprodukt zu dem Kern dirigiert werden (wenn es dies von sich aus normalerweise nicht tun würde), dann sollte das Hybridprotein so konstruiert werden, daß es eine Domaine beinhaltet, die es dorthin lenkt. Diese Domäne könnte von dem Influenzavirus abstammen, muß jedoch nicht. Hybridproteine können auch aus nichtviralen Quellen hergestellt werden, solange sie die notwendigen Sequenzen für die Replikation durch Influenzavirus enthalten (unübersetzte 3'-Region, usw.).
  • Ebenso könnten, um ein anderes Beispiel zu nennen, bestimmte Antigen-Regionen der viralen Genprodukte durch fremde Sequenzen ersetzen werden. Townsend u.a. (1985, Cell 42: 475-482) identifizierten ein Epitop innerhalb des NP-Moleküls, das in der Lage ist, eine kräftige CTL-Antwort ("cytotoxic T-cell" – zytotoxische T-Zelle) auszulösen. Dieses Epitop erstreckt sich über die Reste 147-161 des NP-Proteins und besteht aus den Aminosäuren TYQRTRQLVRLTGMDP. Durch Setzen eines kurzen fremden Epitops anstelle dieser NP-Sequenz kann eine starke Zellimmunantwort auf das intakte fremde Antigen entlockt werden. Umgekehrt kann die Expression eines Fremd-Genprodukts, das diese 15 Aminosäuren umfassende Region enthält, auch dazu beitragen, eine starke Zellimmunantwort gegenüber dem fremden Protein zu induzieren.
  • 5.1.5 INSERTION DER HETEROLOGEN GENSEQUENZ IN DIE HA- ODER NA-GENSEGMBNTE
  • Die Proteine HA und NA, für die separate Gensegmente codieren, sind die wichtigsten Oberflächen-Glycoproteine des Virus. Folglich sind diese Proteine die Hauptziele für die humorale Immunantwort nach Infektion. Sie sind unter allen Influenzavirus-Proteinen die bisher am weitesten erforschten, da die dreidimensionalen Strukturen dieser beiden Proteine aufgedeckt sind.
  • Die dreidimensionale Struktur des H3-Hämagglutinin zusammen mit Sequenzinformationen über eine große Anzahl von Varianten hat es gestattet, die Antigen-Stellen auf dem HA-Molekül aufzudecken (Webster u.a., 1983, in: Genetics of Influenza Virus, P. Palese und D. W. Kingsbury, Hrsg., Springer-Verlag, Wien, S. 127-160). Diese Stellen lassen sich in vier gesonderte nichtüberlappende Regionen auf der Oberfläche des HA gliedern. Diese Regionen sind äußerst variabel und gestatten, wie gezeigt werden konnte, sowohl Insertionen als auch Deletionen. Daher kann die Substitution dieser Stellen innerhalb von HA (z.B. Stelle A; Aminosäuren 122-147 des A/HK/68-HA) durch einen Abschnitt eines fremden Proteins für eine kräftige humorale Antwort auf dieses fremde Peptid sorgen. In einem anderen Ansatz kann die fremde Peptidsequenz in die Antigenstelle ohne Deletion von viralen Sequenzen inseriert werden. Expressionsprodukte solcher Konstruktionen können in Impfstoffen gegen das fremde Antigen nützlich sein und können tatsächlich ein zuvor bereits angesprochenes Problem umgehen, nämlich das der Verbreitung des rekombinanten Virus in dem geimpften Wirt. Ein intaktes HA-Molekül mit einer Substitution nur in Antigenstellen kann eine HA-Funktion gestatten und kann somit den Aufbau eines lebensfähigen Virus ermöglichen. Dieses Virus kann daher ohne Bedarf an zusätzlichen Helferfunktionen gezüchtet werden. Natürlich sollte dieses Virus auf andere Weisen attenuiert werden, um jeder Gefahr eines unbeabsichtigten Entweichens vorzubeugen.
  • Andere Hybridkonstruktionen gemäß den beigefügten Ansprüchen lassen sich herstellen, um Proteine auf der Zelloberfläche zu exprimieren oder um diese in die Lage zu versetzen, aus der Zelle freigesetzt zu werden. Als ein Oberflächen-Glycoprotein umfaßt das HA eine amino-terminale spaltbare Signalsequenz, die für den Transport zur Zelloberfläche erforderlich ist, sowie eine carboxy-terminale Sequenz, die für die Verankerung an der Membran erforderlich ist. Zur Expression eines intakten Fremd-Proteins auf der Zelloberfläche bedarf es unter Umständen der Verwendung dieser HA-Signale zur Bildung eines Hybridproteins. Alternativ kann, wenn nur die Transportsignalsequenz vorhanden ist, die Membranverankerungsdomäne jedoch fehlt, das Protein aus der Zelle ausgeschieden werden.
  • Im Falle des NA-Proteins ist die dreidimensionale Struktur zwar bekannt, jedoch verteilen sich die Antigenstellen über die Oberfläche des Moleküls und überlappen sich. Dies weist darauf hin, daß wenn eine Sequenz in das NA-Molekül eingefügt und auf der äußeren Oberfläche von NA exprimiert wird, es immunogen sein wird. Außerdem zeigt NA als ein Oberflächen-Glycoprotein zwei auffallende Unterschiede gegenüber dem Protein HA auf. Zum einen beinhaltet NA keine spaltbare Signalsequenz; tatsächlich agiert die amino-terminale Signalsequenz als eine Membranverankerungsdomäne. Die Folge daraus, und zugleich der zweite Unterschied zwischen der NA und dem HA, ist, daß die NA mit dem Amino-Ende in der Membran ausgerichtet ist, während das HA mit dem Carboxy-Ende in der Membran ausgerichtet ist. Es kann daher in einigen Fällen vorteilhaft sein, ein Hybrid-NA-Protein herzustellen, da das Fusions-Protein die entgegengesetzte Ausrichtung von ein HA-Fusionshybrid haben wird.
  • 5.1.6 INSERTION DES HETEROLOGEN GENS IN DIE NS- UND M-GENSEGMENTE
  • Die kennzeichnende Eigenschaft des NS-Segments und des M-Segments im Vergleich zu den anderen sechs Gensegmenten des Influenzavirus besteht darin, daß diese Segmente für mindestens zwei Proteinprodukte codieren. In beiden Fällen codiert eine mRNA, die co-linear mit Genom-RNA ist, für ein Protein, und codiert eine gespleißte Information für das andere Protein. Da die Spleiß-Donor-Stelle innerhalb der Codierungsregion für das co-lineare Transkript liegt, weisen die Proteine NS1 und NS2 ein identisches 10 Aminosäuren umfassendes Amino-Ende auf, während M1 und M2 ein identisches 14 Aminosäuren umfassendes Amino-Ende aufweisen.
  • Als ein Ergebnis dieser einmaligen Struktur können rekombinante Influenzaviren gemäß den beigefügten Ansprüchen hergestellt werden, um ein Gen-Produkt innerhalb des Segments zu ersetzen bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Unversehrtheit des zweiten Produkts. Beispielsweise könnte der Austausch der gesamten NS2- oder M2-Codierungs-region gegen ein Fremd-Genprodukt (unter Beibehaltung der Spleiß-Akzeptor-Stelle) zur Expression eines intakten NS1- oder M1-Proteins und eines Fusionsproteins anstelle von NS2 oder M2 führen. Alternativ kann ein Fremd-Gen in das NS-Gensegment eingefügt werden, ohne die NS1-Expression oder die NS2-Expression zu berühren. Wenngleich auch die meisten NS-Gene eine erhebliche Überlappung der NS1- und NS2-Leserahmen aufweisen, so ist dies bei einigen natürlichen NS-Genen nicht der Fall. Wir haben das NS-Gensegment des A/Ty/Or/71-Virus analysiert (Norton u.a., 1987, Virology 156: 204-213) und festgestellt, daß in diesem speziellen Gen das NS1-Protein an Nukleotidposition 409 des NS-Gensegments endet, während die Spleiß-Akzeptor-Stelle für das NS2 an Nukleotidposition 528 liegt. Somit könnte ein Fremd-Gen zwischen das Terminations-Kodon der NS1-Codierungsregion und die Spleiß-Akzeptor-Stelle der NS2-Codierungsregion ohne Auswirkungen auf das eine oder das andere Protein eingebaut werden. Es kann sich als notwendig erweisen, eine mögliche Spleißstelle am 5'-Ende der Fremd-Gensequenz einzufügen, um die Proteinproduktion sicherzustellen (dies würde für ein Hybridprotein codieren, das das Amino-Ende des NS1 aufweist). So gesehen sollte das rekombinante Virus nicht fehlerhaft sein und sollte zur Fortpflanzung in der Lage sein, ohne hierzu Helfer-Funktionen zu bedürfen.
  • Wenngleich man auch weiß, daß das Influenzavirus-Genom acht funktionale Gen-Segmente umfaßt, so ist nicht bekannt, wieviele Segmente tatsächlich in einem Virus gepackt sind. Es gibt Vermutungen dahingehend, daß das Influenzavirus mehr als acht Segmente packen kann, möglicherweise bis zu 12 (Lamb und Choppin, 1983, Ann. Rev. Biochem. 52:467:506). Dies würde eine leichtere Verbreitung des rekombinanten Virus ermöglichen, indem dieses "neunte" Gensegment so konzipiert werden könnte, daß es das Fremd-Genprodukt ausdrückt. Wenn dieses "neunte" Segment auch in einige Viren eingebaut werden könnte, so ginge es doch im Zuge der Virusausbreitung bald verloren, wenn nicht eine gewisse Selektion erfolgen würde. Dies läßt sich durch "Abkoppeln" ("Uncoupling") des NS- oder M-Gensegments erzielen. Die NS2-Codierungsregion könnte von dem NS-Gensegment entfernt und auf dem Gensegment plaziert werden, das für das fremde Protein codiert (zusammen mit entsprechenden Spleiß-("Splicing"-)Signalen. Wahlweise könnte eine bicistronische mRNA hergestellt werden, um die interne Initiaton zum "Unsplicen" dieser viralen Sequenzen zu gestatten; z.B. durch Verwendung der von Pelletier u.a. (1988, Nature 334: 320-325) beschriebenen Sequenzen.
  • Das resultierende rekombinante Virus mit dem "abgekoppelten" NS- oder M-Gen wäre in der Lage, sich selbst fortzupflanzen, und würde außerdem notwendigerweise das "neunte" Gensegment einpacken müssen und würde so die Expression des Fremd-Gens sicherstellen.
  • 5.2 EXPRESSION VON HETEROLOGEN GENPRODUKTEN MITTELS REKOMBINANTER RNA-MATRIZE
  • Die rekombinanten Matrizen, die wie oben beschrieben hergestellt worden sind, lassen sich auf vielerlei Weisen zur Exprimierung von heterologen Gen-Produkten in geeigneten Wirtszellen oder zur Herstellung von chimärischen Viren gemäß den beigefügten Ansprüchen, die die heterologen Gen-Produkte exprimieren, verwenden. In einer Verkörperung kann die rekombinante Matrize gemäß Anspruch 1 mit viralem Polymerasekomplex, gereinigt wie in Abschnitt 6 beschrieben, kombiniert werden, um rRNPs herzustellen, die infektiös sind. Alternativ kann die rekombinante Matrize mit viralem Polymerasekomplex unter Anwendung von rekombinanten DNA-Verfahren mischen (siehe z.B. Kingsbury u.a., 1987, Virology 156:396-403). Solche rRNPs, wenn zur Transfektion geeigneter Wirtszellen verwendet, können die Expression des heterologen Gen-Produkts auf hohem Niveau steuern. Wirtszellsysteme, die für einen hohen Expressionsgrad sorgen, sind u.a. Zellinien, die virale Funktionen liefern, so z.B. Zellinien, die mit Influenza reinfiziert sind, Zellinien, die konstruiert wurden, um Influenzavirus- Funktionen zu ergänzen, usw.
  • In einer anderen Verkörperung dieser Erfindung können die rekombinanten Matrizen oder die rRNPs gemäß den beigefügten Ansprüchen verwendet werden, um Zellinien, die die viralen Polymeraseproteine exprimieren, zu dem Zweck zu transfizieren, eine Expression des heterologen Genprodukts zu bewirken. Hierzu können transformierte Zellinien, die alle drei Polymeraseproteine exprimieren, wie z.B. 3P-38 und 3P-133 (Krystal u.a., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 2709-2713), als geeignete Wirtszellen verwendet werden. Ebenso können Wirtszellen so konstruiert werden, daß sie andere virale Funktionen oder zusätzliche Funktionen wie z.B. NP liefern.
  • 5.2.1 REINIGUNG DER VIRALEN POLYMERASE
  • Die zur Herstellung der rRNPs verwendeten viralen Polymerase-Proteine können von aus kompletten Influenzaviren isolierten, dissoziierten RNP-Kernen gereinigt werden. Generell können RNP-Kerne anhand von Standardverfahren hergestellt werden (Plotch u.a., 1981, Cell 23: 847-858); Rochavansky, 1976, Virology 73:327-338). Die gesammelten RNP-Kerne können dann über einem zweiten Gradienten von CsCl (1,5-3,0 M) und Glycerol (30 %-45 %) zentrifugiert werden, wie von Honda u.a. (1988, J Biochem. 104:1021-1026) beschrieben. Die aktiven viralen Polymerase- Fraktionen können im oberen Bereich des Gradienten isoliert werden, d.h. in der Region des Gradienten, der mit 1,5 bis 2,0 M CsCl korreliert und der Fraktion entspricht, die Honda u.a. als "NP" identifizierten. Überraschenderweise enthält diese Fraktion all die viralen Polymerase-Proteine, die für den aktiven Komplex erforderlich sind. Darüber hinaus werden die P-Proteine, die aus dem unteren Bereich des Gradienten gewonnen werden können, nicht benötigt, und sie sorgen nicht für die Transkription viraler RNA voller Länge. Es scheint also, daß die sogenannte "NP"-Fraktion neben dem NP die aktiven Formen der Proteine PB2, PB1 und PA enthält.
  • 5.2.2 HOHE POLYMERASE-KONZENTRATIONEN SIND FÜR DIE DURCH CAP GESTARTETE RNA-SYNTHESE ERFORDERLICH
  • Hohe Konzentrationen des viralen Polymerase-Komplexes vermögen es, diese durch virusspezifische cap-Endonuklease gestartete Transkription zu katalysieren. Unter den in Abschnitt 6 spezifizierten Bedingungen zeigte sich, daß ca. 50 ng NP mit 200 pg der drei P-Proteinen optimal mit 5 bis 10 ng RNA-Reaktion reagieren. Es konnte festgestellt werden, daß wenngleich das NP Influenza-vRNA oder -cRNA in vivo selektiv eingebaut ("Enkapsidation"), das NP sich in vitro nichtspezifisch an RNA bindet (Kingsbury u.a., 1987, Virology 156:396-403; Scholtissek und Becht, 1971, J. Gen. Virol. 10:11-16). Damit die virale Polymerase die viralen Matrizen-RNAs in unseren In-vitro-Reaktionen erkennt, müssen sie von dem NP wahrscheinlich eingebaut worden sein. Die Addition eines cap-tragenden mRNA-Primers würde daher im wesentlichen mit der Matrizen-RNA um die NP-Bindung konkurrieren. Da eine NP-Bindung des Dinukleotids ApG nicht zu erwarten ist, wäre die niedrigkonzentrierte Polymerase in der Lage, nur die kurzen Matrizen mit ApG als Startermolekül zu verwenden. Diese Hypothese wird auch von der Feststellung gestützt, daß das höher konzentrierte Polymerasepräparat durch die Addition von allmählich wachsenden Mengen von entweder Matrizen-RNA oder irgendeiner nichtspezifischen RNA gehemmt wird. Es sollte ebenso festgehalten werden, daß die zuvor in Verbindung mit viralen RNPs gezeigte ungewöhnliche Spezifität für die cap 1-Struktur m7GpppXm ebenso bei den rekonstituierten RNPs festgestellt wurde.
  • 5.2.3 RNA-MATRIZEN MIT GENOM-LÄNGE WERDEN EFFIZIENT KOPIERT
  • Plasmid-abgeleitete, mit Segment 8 des A/WSN/33-Virus identische RNA wurde durch die Polymerase genau kopiert (unter Anwendung des in 10 beschriebenen PCR-Verfahrens). In Reaktionen, bei denen aus Virus extrahierte RNA eingesetzt wurde, wurden alle acht Segmente kopiert, wenngleich auch das HA-Gen in geringerem Umfang kopiert wurde. Der Hintergrund dieser Reaktionen wurde gegenüber den Matrizen mit 30 bis 53 nt reduziert, wahrscheinlich weil es sich bei den verschmutzenden RNAs in dem Polymerasepräparat um überwiegend defekte RNAs geringerer Größe handelte. Rekombinante Matrizen, die in dieses System transkribierte Fremd-Gene codieren, können eingesetzt werden, um das konstruierte Gen in einem Viruspartikel sicherzustellen.
  • 5.3 HERSTELLUNG VON CHIMÄRISCHEM INFLUENZA-VIRUS
  • Um ein chimärisches Influenzavirus herzustellen, können rekonstituierte RNPs, die modifizierte Influenzavirus-RNAs oder für Fremdproteine codierende RNA enthalten, zur Transfektion von Zellen eingesetzt werden, die ebenso mit einem "elterlichen" Influenzavirus infiziert sind.
  • Alternativ können die rekonstituierten RNP-Präparate mit den RNPs vom elterlichen Wildtyp-Influenzavirus gemischt werden und direkt zur Transfektion verwendet werden. Nach Neuordnung ("Reassortment") können die neuartigen Influenzaviren isoliert und können ihre Genome durch Hybridisierungsanalyse identifiziert werden. In weiteren hier beschriebenen Ansätzen zur Herstellung von infektiösen chimärischen Viren gemäß den beigefügten Ansprüchen können rRNPs in Wirtszeil-Systemen repliziert werden, die die Influenzavirus-Polymeraseproteine exprimieren (z.B. in Virus/Wirtszell-Expressionssystemen; transformierten Zellinien, die speziell mit Blick auf Expression des Polymeraseproteine konstruiert wurden, usw.), so daß infektiöse chimärische Viren gewonnen werden; in diesem Falle brauchen keine Helferviren eingesetzt werden, da diese Funktion von den exprimierten viralen Polymeraseproteinen übernommen wird. In einem besonders wünschenswerten Ansatz können mit für alle acht Influenzavirus-Segmente konstruierten rRNPs infizierte Zellen zur Produktion von infektiösem chimärischem Virus führen, der den gewünschten Genotyp aufweist; somit entfällt der Bedarf an einem Selektionssystem.
  • Rein theoretisch kann man jedes beliebige der acht Gensegmente oder irgendeinen Teil eines solchen Segments durch die fremde Sequenz ersetzen. Eine Bedingung dieser Gleichung ist jedoch die Fähigkeit zur Fortpflanzung des defekten Virus (defekt, weil ein normales virales Genprodukt fehlt oder verändert ist). Es gibt eine Reihe möglicher Ansätze zur Umgehung dieses Problems. Wir haben aufgezeigt, daß Mutanten des Influenzavirus, die in bezug auf die Proteine PB2 und N''P defekt sind, in Zellinien, die konstruiert worden waren, um die Polymerase- und NP-Proteine richtungsgebend zu exprimieren, zu wesentlich höheren Titern gezüchtet werden können (Krystal u.a., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 2709-2813). Ähnliche Verfahren können angewandt werden, um transformierte Zellinien zu konstruieren, die irgendeines der Influenzavirus-Gene richtungsgebend exprimieren. Alternativ können bestimmte natürliche Wirtsbereich-Systeme verfügbar sein, um rekombinante Viren zu vermehren. Ein Beispiel für diesen Ansatz betrifft das natürliche Influenza-Isolat CR43-3. Dieses Virus wächst normal, wenn in primäre PCK-Zellen ("chick kidney cells" – Hühnernierenzellen) eingeschleust, es wächst jedoch nicht in MDCK-Zellen ("Madin-Darby canine kidney cells" – Madin-Darby-Hundenierenzellen), einem natürlichen Wirt für Influenza (Maassab & DeBorde, 1983, Virology 130: 342-350). Bei der Analyse dieses Virus stellten wir fest, daß es für ein defektes NS1-Protein codiert, daß das Ergebnis einer Deletion von 12 Aminosäuren war. Die PCK-Zellen weisen eine gewisse Aktivität auf, die entweder das defekte NS1-Protein komplementiert oder die das defekte Protein komplett ersetzen kann.
  • Ein dritter Ansatz, das rekombinante Influenzavirus gemäß den beigefügten Ansprüchen zu vermehren, kann die gleichzeitige Kultivierung mit Wildtyp-Virus implizieren. Dies ließe sich bewerkstelligen, indem man einfach das rekombinante Virus nimmt und gleichzeitig Zellen mit diesem Virus und einem anderen Wildtyp-Virus (vorzugsweise einem Impfstoff-Stamm) infiziert. Das Wildtyp-Virus sollte das Genprodukt des defekten Virus komplementieren und das Wachstum sowohl des Wildtyp-Virus als auch des rekombinanten Virus ermöglichen. Dies wäre analog zu der Situation der Vermehrung von DI-("defective interfering"-) Partikeln des Influenzavirus (Nayak u.av 1983, in: Genetics of Influenza Viruses, P. Palese und D. W. Kingsbury, Hrsg., Springer-Verlag, Wien, S. 255-279). Im Falle von DI-Viren können die Bedingungen so geändert werden, daß der größte Teil des vermehrten Virus eher dem defekten Partikel als dem Wildtyp-Virus entspricht. Dieser Ansatz kann daher brauchbar sein zur Erzeugung von Vorräten an rekombinantem Virus mit hohem Titer. Diese Vorräte jedoch würden zwangsläufig einen gewissen Anteil an Wildtyp-Virus enthalten.
  • Alternativ können synthetische Ribonukleoproteine (RNPs) in Zellen vermehrt ("repliziert") werden, die gleichzeitig mit rekombinanten Viren infiziert worden sind, die die Influenzavirus-Polymeraseproteine exprimieren. Dieses Verfahren läßt sich in der Tat dazu anwenden, rekombinantes infektiöses Virus entsprechend dieser Erfindung zu retten. Zu diesem Zweck können die Influenzavirus-Polymeraseproteine in irgendeinem Expressionsvektor/Wirtszellen-System exprimiert werden, einschließlich – jedoch nicht ausschließlich – viraler Expressionsvektoren (z.B. Vacciniavirus, Adenovirus, Baculovirus, usw.) oder Zellinien, die die Polymeraseproteine exprimieren (z.B. siehe Krystal u.a., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 2709-2713). Überdies kann die Infizierung von Wirtszellen mit rRNPs, die für alle acht Influenzavirus-Proteine codieren, zur Produktion von infektiösen chimärischen Viruspartikeln führen. Mit diesem System würde die Notwendigkeit eines Selektionssystems wegfallen, da alle hergestellten rekombinanten Viren von dem gewünschten Genotyp wären. In den hier angeführten Beispielen wird ein vollständig synthetisches Replikationssystem beschrieben, bei dem statt der Infizierung von Zellen mit Influenzavirus synthetische RNPs in repliziert werden durch die Wirkung von Influenzavirus-Proteinen, die von rekombinanten Vacciniavektoren exprimiert werden. Wir zeigen so auf, daß die einzigen für die Transkription und Replikation von RNP wesentlichen Influenzavirus-Proteine die drei Polymeraseproteine und das Nucleoprotein sind.
  • Es sollte festgehalten werden, daß die Möglichkeit besteht, ein rekombinantes Influenzavirus zu konstruieren, ohne dadurch die Lebensfähigkeit des Virus zu verändern. Diese geänderten Viren würden sich zur Kultivierung eignen und würden keine Helferfunktionen zu ihrer Replikation erfordern. Beispielsweise könnten Änderungen in dem bereits erörterten Hämagglutinin-Gensegment und dem NS-Gensegment gemäß den beigefügten Ansprüchen genutzt werden, um solche lebensfähigen chimärischen Viren zu konstruieren.
  • In den nachgenannten Beispielen wird die Herstellung eines rekombinanten Plasmids beschrieben, welches nach Transkription durch T7-Polymerase eine RNA-Matrize hervorbrachte, die von der Influenzavirus- Polymerase in vitro erkannt und transkribiert wurde. Diese RNA-Matrize entspricht der NS-RNA eines Influenzavirus bis auf die Tatsache, daß die viralen Codierungssequenzen durch solche eines CAT-Gens ersetzt sind. Diese rekombinante Minusstrang-Virus-RNA-Matrize wurde sodann mit gereinigter Influenzavirus-Polymerase gemischt, um wieder einen RNP-Komplex zu bilden. Der rekombinante RNA-Komplex wurde in Zellen eingeschleust (Transfektion), die dann mit Influenzavirus infiziert wurden, was zur Expression der CAT-Aktivität führte.
  • Eine Reihe von- Faktoren zeigt, daß dieses System einen biologisch aktiven rekombinanten RNP-Komplex darstellt, der unter strenger Kontrolle der Signale für Transkription, Replikation und Verpackung ("Packaging") von Influenzavirus-RNAs steht. Erstens weist das CAT-Gen negative Polarität in der zur RNP-Transfektion verwendeten rekombinanten Virus-RNA auf. D.h. die eingehende RNA kann nicht direkt in der Zelle übersetzt ("Translation") werden, sondern muß zunächst durch die Influenzavirus-Polymerase umgeschrieben werden ("Transkription")/um die Translation und Expression des CAT-Gens zu gestatten. Zweitens ist weder transfizierte nackte rekombinante RNA alleine in der Gegenwart von infizierendem Helfervirus noch rekombinanter RNP-Komplex in Abwesenheit von infizierendem Helfervirus erfolgreich bei der Induzierung von CAT-Aktivität. Dies läßt vermuten, daß von dem eingehenden RNP – sowie von dem infizierenden Helfervirus – gelieferte Influenzavirus-Proteine zur Amplifikation der rekombinanten RNA-Matrize erforderlich sind. Drittens und letztlich tauchen nach RNP-Transfektion und Infektion durch Helfervirus Viruspartikel auf, die offensichtlich die rekombinante RNA enthalten, da diese Partikel wiederum CAT-Aktivität in frisch infizierten Zellen induzieren. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß die 26 3'-terminalen und die 22 5'-terminalen Nukleotide, die den terminalen Nukleotiden in der Influenza-A-Virus-NS-RNA entsprechen, ausreichen, um die Signale zur Polymerase-Transkription und -Replikation sowie zur Packung ("Packaging") der RNA in Partikeln zu liefern.
  • Die vorgenannten Ergebnisse die die für die Transkription, Replikation und Verpackung von Influenzavirus-RNAs erforderlichen cis-agierenden Sequenzen definierten, wurden ergänzt durch zusätzliche Arbeitsbeispiele, die im folgenden beschrieben werden und die aufzeigen, daß rekombinante DNA-Techniken eingesetzt werden können, um punktspezifische Mutationen in die Genome infektiöser Influenzaviren einzuführen.
  • Synthetische RNAs, gewonnen durch In-vitro-Transkription von Plasmid-RNA, wurden in RNP-Transfektions-Experimenten zur Sicherstellung von infektiösem Influenzavirus eingesetzt. Um die Selektion dieses Virus zu ermöglichen, wählen wie ein System, daß die Präsenz eines WSN-ähnlichen Neuraminidase-Gens in dem geretteten Virus erfordert. Viren, die dieses Gen enthalten, können sich in MDBK-Zellen in Abwesenheit von Protease in dem Medium vermehren (Schulman u.a., 1977, J. Virol. 24:170-176). Das Helfervirus WSN-HK vermehrt sich unter solchen Bedingungen nicht. Natürlich gibt es alternative Selektionssysteme. Beispielsweise könnten Antikörper-Raster ("antibody screens") oder mit Vorbehalt letale Mutanten eingesetzt werden, um sichergestellte Viren, die von Plasmid-DNAs abgeleitete RNAs enthalten, zu isolieren. In den nachstehend beschriebenen Experimenten wurden Viren gewonnen, die den WSN-Viren ähnlich waren. Das WSN-NA-Gen wurde von Plasmid-DNAs oder von gereinigter WSN-Virionen-RNA abgeleitet (17, Streifen 2 und 5). Im letztgenannten Fall, bei dem komplette Virionen-RNA zur RNP-Transfektion verwendet wurde, wissen wir nicht, ob andere Gene ebenso auf das gerettete Virus transferiert worden sind, da das Helfervirus die verbleibenden sieben Gene mit dem WSN-Virus gemein hat. Die sichergestellten Viren wiesen die erwarteten RNA-Muster auf (17) und vermehrten sich in MDBK- oder MDCK-Zellen derart, daß die erreichten Titer von denen des Wildtyp-WSN-Virus nicht zu unterscheiden waren. Es ist festzuhalten, daß die Sicherstellung einer die Deletion eines einzigen Nukleotids in der nicht-übersetzten 5'-Region aufweisenden NA-RNA nicht möglich war. Dies wiederum zeigt die Bedeutung von in den nichtübersetzten Regionen von Influenzavirus-RNAs vorkommenden Regulatorsequenzen auf. Daneben stellten wir Virus sicher unter Verwendung von RNA, die so konstruiert war, daß sie 5 Nukleotidänderungen in einer 39 Nukleotide umfassenden Region aufwies (16). Wir vergewisserten uns der Präsenz dieser Mutationen in dem sichergestellten mutierten Virus durch direkte Sequenzanalyse ("Sequenzierung") der RNA (18). Diese Mutationen bewirkten keine Aminosäureänderung in dem Protein Neuraminidase, so daß Auswirkungen auf die biologischen Eigenschaften des Virus nicht erwartet wurden. Wenngleich dieses Virus auch nicht eingehend untersucht wurde, waren sein Plaques-Bildungsverhalten und seine Wachstumseigenschaften nicht von denen des Wildtyp-WSN-Virus zu unterscheiden. Anhand derartiger Techniken lassen sich Mutationen herbeiführen, die die biologischen Eigenschaften der Influenzaviren verändern. Diese Untersuchungen werden dabei helfen, die genauen Funktionen aller viralen Proteine voneinander zu unterscheiden, die der Nicht-Strukturproteine eingeschlossen. Außerdem können die nichtübersetzten Regionen der Genome durch Mutagenese untersucht werden, was zu einem besseren Verständnis der regulativen Signale führen sollte, die in viralen RNAs vorkommen. Ein weiteres sehr interessantes Gebiet ist die Entwicklung des Influenzavirus-Systems als ein Impfstoff-Vektor.
  • 5.4 IMPFSTOFFZUSAMMENSETZUNGEN, DIE DIE CHIMÄRISCHEN INFLUENZAVIREN EINSETZEN
  • Es läßt sich praktisch jede heterologe Gensequenz in die chimärischen Influenzaviren gemäß den beigefügten Ansprüchen zur Verwendung in Impfstoffen einbauen. Vorzugsweise können Epitope, die eine schützende Immunantwort auf eine Vielzahl von Pathogenen induzieren, oder Antigene, die neutralisierende Antikörper binden, durch die oder als Teil der chimärischen Viren exprimiert werden. Zu den heterologen Gensequenzen, beispielsweise, die sich in die chimärischen Viren gemäß den beigefügten Ansprüchen zum Zwecke der Verwendung in Impfstoffen einbauen lassen, gehören u.a. Epitope des HIV-Virus (humanen Immundefizienzvirus) wie gp120; Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus (HBsAg); die Glycoproteine des Herpesvirus (z.B. gD, gE); VP1 des Poliovirus; Antigendeterminanten nichtviraler Pathogene wie z.B. Bakterien und Parasiten, um nur einige wenige zu nennen. In einer anderen Verkörperung können alle oder Teile der Immunglobulingene exprimiert werden. So können beispielsweise variable Regionen von antiidiotypischen Immunglobulinen, die solche Epitope imitieren, in die chimärischen Viren gemäß den beigefügten Ansprüchen eingebaut werden.
  • Es kann entweder ein Impfstoff aus lebenden rekombinanten Viren oder ein Impfstoff aus inaktivierten rekombinanten Viren formuliert werden. Ein Lebendvirusimpfstoff wird unter Umständen bevorzugt, weil eine Vermehrung in dem Wirt zu einem verlängerten Stimulus derselben Art und Stärke wie der führt, der bei natürlichen Infektionen auftritt, und daher wesentliche, langanhaltende Immunität verleiht. Die Produktion solcher Impfstoffpräparate aus lebenden rekombinanten Viren läßt sich anhand von herkömmlichen Verfahren bewerkstelligen, was die Vermehrung des Virus in einer Zellkultur oder im Harnsack des Hühnerembryos mit anschließender Reinigung impliziert.
  • In dieser Hinsicht kann die Verwendung von gentechnisch hergestelltem Influenzavirus (Vektoren) zu Impfstoffzwecken das Vorhandensein von Attenuierungsmerkmalen in diesen Stämmen bedingen. Derzeitige Lebendvirusvakzine-Kandidaten für die Verwendung beim Menschen sind entweder kälteadaptiert, temperaturempfindlich oder so verarbeitet, daß sie verschiedene (sechs) Gene von Avianviren ableiten, was eine Abschwächung ("Attenuation") zur Folge hat. Die Einbringung geeigneter Mutationen (z.B. Deletionen) in die zur Transfektion verwendeten Matrizen kann die neuartigen Viren mit Abschwächungsmerkmalen ausstatten. Beispielsweise können spezielle "falschsinnige" ("missense") Mutationen, die mit Temperaturempfindlichkeit oder Kälteadaption einhergehen, in Deletionsmutationen geändert werden. Diese Mutationen sollten stabiler als die mit den kälte- oder temperaturempfindlichen Mutanten assoziierten Punktmutationen sein, und die Umkehrhäufigkeit sollte extrem gering sein.
  • Alternativ können chimärische Influenzaviren mit "Selbstmord"-Eigenschaften konstruiert werden. Solche Viren würden nur eine oder einige wenige Replikationszyklen in dem Wirt durchlaufen. Beispielsweise ist die Spaltung des HA notwendig, um die Reinitiierung der Replikation zu gestatten. Somit können Änderungen in der HA-Spaltstelle ein Virus hervorbringen, das sich in einem geeigneten Zellsystem, nicht jedoch in dem menschlichen Wirt vermehrt. Bei einer Verwendung als Impfstoff würde das rekombinante Virus einen einzigen Replikationszyklus durchlaufen und eine Immunantwort ausreichender Stärke induzieren, es würde sich jedoch in dem menschlichen Wirt nicht weiterentwickeln und krank machen. Rekombinante Viren, denen ein oder mehrere der wesentlichen Influenzavirusgene fehlen, wären nicht in der Lage, mehrere Replikationszyklen hintereinander zu durchlaufen. Solche defekten Viren lassen sich durch gleichzeitiges Einschleusen (Transfektion) von rekonstituierten RNPs, denen ein spezifisches Gen oder mehrere spezifische Gene fehlen, in Zellinien herstellen, die dieses Gen bzw. diese Gene ständig exprimieren. Viren, denen ein oder mehrere wesentliche Gene fehlen, werden in diesen Zellinien zwar vermehrt, jedoch sind sie nach Verabreichung an den menschlichen Wirt nicht in der Lage, einen Replikationszyklus zu durchlaufen. Solche Präparate können – in diesem abbrechenden Zyklus – eine ausreichende Zahl von Genen transkribieren und übersetzen, um eine Immunantwort zu bewirken. Alternativ könnten größere Mengen dieser Stämme verabreicht werden, so daß diese Präparate als Impfstoffe aus inaktivierten (abgetöteten) Viren dienen. Bei Vakzinen aus inaktivierten Viren wird bevorzugt, daß das heterologe Genprodukt als eine Viruskomponente exprimiert wird, so daß das Genprodukt mit dem Virion assoziiert ist. Der Vorteil solcher Präparate besteht darin, daß sie native Proteine enthalten und keine Inaktivierung durch Behandlung mit Formalin oder anderen Mitteln erfahren, die bei der Herstellung von Vakzinen aus abgetöteten Viren eingesetzt werden.
  • In einer anderen Verkörperung dieses Aspekts der hier beschriebenen Erfindung können Impfstoffpräparate aus inaktivierten Viren anhand von herkömmlichen Verfahren zur "Abtötung" der chimärischen Influenzaviren gemäß den beigefügten Ansprüchen hergestellt werden. Impfstoffe aus inaktivierten Viren sind "tot" in dem Sinne, daß ihre Infektiosität zerstört worden ist. Idealerweise wird die Infektiosität des Virus ohne Beeinträchtigung seiner Immunogenität zerstört. Zum Zwecke der Herstellung von Impfstoffen aus inaktivierten Viren kann das chimärische Virus in Zellkultur oder im Harnsack des Hühnerembryos gezüchtet, durch zonale Ultrazentrifugation gereinigt, mittels Formaldehyd oder β-Propiolacton inaktiviert und gesammelt werden. Der resultierende Impfstoff wird üblicherweise intramuskulär injiziert.
  • Inaktivierte Viren können mit einem geeigneten Adjuvans kombiniert werden, um die immunologische Antwort zu verstärken. Solche Adjuvantien können u.a. sein: mineralische Gele wie z.B. Aluminiumhydroxid; oberflächenaktive Substanzen wie z.B. Lysplecithin, pluronische Polyole, Polyanione; Peptide; Ölemulsionen; und potentiell nützliche humane Adjuvantien wie z.B. BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
  • Die Verabreichung der oben beschriebenen Impfstoffpräparate kann auf viele Arten erfolgen, so u.a. auf dem oralen, intradermalen, intramuskulären intraperitonalen, intravenösen, subkutanen und intranasalen Wege. Es ist unter Umständen vorzuziehen, das Impfstoffpräparat aus chimärischem Influenzavirus auf dem natürlichen Infektionswege des Pathogens, für das der Impfstoff konzipiert ist, zuzuführen. Bei Verwendung eines Impfstoffes aus lebenden chimärischen Viren kann es günstig sein, das Präparat auf dem natürlichen Infektionswege von Influenzavirus zuzuführen. Die Fähigkeit des Influenzavirus, eine starke sekretorische und zelluläre Immunantwort zu induzieren, kann hier vorteilhaft genutzt werden. Eine Infektion des Respirationstraktes durch chimärische Influenzaviren, beispielsweise, kann eine starke sekretorische Immunantwort z.B. im Urogenitalsystem induzieren mit einhergehendem Schutz vor einem bestimmten krankheitsverursachenden Mittel.
  • 6 BEISPIEL: PROMOTORANALYSE DER INFLUENZA-VIRALEN RNA-POLYMERASE
  • In den im folgenden beschriebenen Beispielen wurde eine an genomischer RNA verarmte Polymerase aus den oberen Fraktionen der CsCl-Glycerol-Gradientenzentrifugation dargestellt. Diese Polymerase ist in der Lage, kurze Modellmatrizen zu kopieren, die auf dem Wege der Transkription geeigneter Plasmid-DNA mit Bacteriophage-T7-RNA-Polymerase auf sequenzspezifische Weise gewonnen werden. Die Termini dieser Modell-RNA sind mit den 15 3'-terminalen Nukleotiden und den 22 5'-terminalen Nukleotiden identisch, die in Segment 8 von allen Influenza-A-viralen RNAs konserviert sind. Durch Manipulation des Plasmids zum Zwecke der Darstellung verschiedener für den Einsatz als Matrize vorgesehener RNAs haben wir gezeigt, daß die Erkennung sowie die Synthese ausgehend von dieser Modell-RNA für den Promotor an der 3'-terminalen Sequenz spezifisch war und den Pfannenstil ("panhandle") nicht erforderte. Zusätzlich identifizierte punktspezifische Mutagenese Nukleotidpositionen, die dafür verantwortlich sind, daß die virale Polymerase eine Synthese ausgehend von genom-orientierten Matrizen vor komplementärorientierter RNA favorisiert. Es wurden ferner Bedingungen festgestellt, unter denen eine cap-endonuclease-initiierte RNA-Synthese mit Hilfe von Modell-RNAs beobachtet werden konnte. Überdies erlaubte das rekonstituierte System eine virusspezifische Synthese ausgehend von RNAs mit Genomlänge, abgeleitet entweder von Plasmiden oder von durch Phenolextraktion vom Virus gereinigter RNA.
  • 6.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • 6.1.1 REINIGUNG DER VIRALEN RNA-POLYMERASE
  • RNP-Kerne wurden aus komplettem Influenzavirus anhand von Standardverfahren präpariert (Plotch u.a., 1981, Cell 23: 847-858; Rochavansky, 1976, Virology 73: 327-338). Zwei bis drei Milligramm Virus wurden zerstört durch Inkubation in 1,5 % Triton N-101, 10 mg/ml Lysolecithin, 100 mM Tris-HCL, pH 8,0, 100 mM KCl, 5mM MgCl2, 5 % Glycerol und 1,5 mM Dithiothreitol. Die Probe wurde einem Gradienten von 30 %-70 % Glycerol (M/V) in Gegenwart von 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 und 150 mM NaCl überschichtet und durch Gradientenzentrifugation fraktioniert. Das Kern-Präparat wurde in einem SW50.1-Rotor 4 Stunden lang bei 4°C mit 45.000 U/min zentrifugiert. An RNP angereicherte Fraktionen wurden durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese der Proteinproben aus jeder Fraktion und Färbung mit Silber identifiziert. Die Kemfraktionen wurden sodann einer zweiten Gradientenzentrifugation unterzogen, wie von Honda u.a., 1988, J. Biochem. 104:1021-1026 beschrieben. Dieser zweite Gradient bestand aus Stufen aus 0,5 ml 3,0 M CsCl und 45 % (M/V) Glycerol, 1,75 ml 2,5 M CsCl und 40 % Glycerol, 1,25 ml 2,0 M CsCl und 35 % Glycerol sowie 1,0 ml 1,5 M CsCl und 30 % Glycerol. Alle Stufen wurden mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, und 100 mM NaCl gepuffert. Der Gradient wurde mit 0,5 ml RNP-Kernen überschichtet, und die Probe wurde in einem SW50.1-Rotor 25 Stunden lang bei 4°C mit 45.000 U/min zentrifugiert. Polymerasefraktionen wurden wiederum mittels SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese der Proteinproben und Färbung mit Silber identifiziert. Aktive Polymerasefraktionen wurden allgemein in der Zone des Gradienten gefunden, die 1,5 bis 2,0 M CsCl entsprach. Diese Fraktionen wurden gesammelt, gegen 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM NaCl und 10 mM MgCl2 dialysiert und in Centricon-10-Röhrchen (Amicon) konzentriert, oder die Fraktionen wurden in Beuteln gegen 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 2 mM Dithiothreitol und 50 % Glycerol dialysiert.
  • 6.1.2 PLASMIDPRÄPARATION
  • Der Aufbau des Plasmids ist in 2 dargestellt. Insertions-DNA für das Plasmid pV-wt wurde mit Hilfe eines DNA-Synthesegeräts (DNA-Syntheziser) von Allied Biosystems konstruiert. Der "obere" Strang lautete
    Figure 00410001
  • Der "untere" Strang wurde durch Starter-Verlängerung mit 5'-CCTGCAGAAGAA TGA-3' als Starter ("Primer") synthetisiert. Die 95 pb lange DNA wurde mit HindIII und PstI aufgespalten und anschließend gereinigt mittels Phenol/Chloroform-Extraktion, Ethanolausfällung und Ionenaustauschchromatographie unter Einsatz einer NACS-Prepack-Ionenaustauschsäule (Bethesda Research Laboratories). Diese DNA wurde in das Plasmid pUC-19 ligiert, welches mit HindHI und PstI aufgespalten worden war, und wurde dann genutzt, um den E. coli-Stamm DHS-α zu transformieren, der zuvor anhand von Standardprotokollen kompetent gemacht worden war. Bakterien wurden auf Agar-Platten, die X-gal und IPTG enthielten, aufgebracht, und es wurde festgestellt, daß blaue Kolonien das die zuvor erwähnte Einfügung ("Insert") enthaltende Plasmid enthielten, da das kurze Insert den lacZ-Leserahmen konserviert hatte und keinen Terminationscodon enthielt. Das Plasmid pM-wt wurde auf ähnliche Weise präpariert, abgesehen davon, daß beide Stränge chemisch synthetisiert wurden, wobei der obere Strang die Sequenz
    Figure 00410002
    hatte.
  • Das Plasmid pV-d5' (2) wurde präpariert unter Verwendung der Oligonucleotide
    Figure 00410003
  • Die DNAs wurden zu einem Doppelstrang verschmolzen ("Annealing") und in das mittels HindIII/PstI aufgespaltene Plasmid pUC-19 ligiert, und es wurde festgestellt, daß weiße Kolonien das korrekte Plasmid enthielten, da dieses Insert eine Rahmenverschiebung ("Frameshift") in dem lacZ-Gen bewirkte. Die Punktmutanten wurden isoliert nach Aufspaltung des Plasmids pV-d5' mit BgIII und PstI und Ligation des linearisierten Plasmids mit einem einzelsträngigen Oligonucleotid gemischter Zusammensetzung. Da die Aufspaltung mit BgIII eine 5'-Verlängerung und mit PstI eine 3'-Verlängerung zurückläßt, war nur ein einziges Oligonucleotid zur Ligation des Insertionsabschnitts erforderlich. Die Wirtszelle war anschließend in der Lage, durch das Fehlen eines komplementären Oligonucleotids hervorgerufene Lücken zu schließen. Es wurden Oligonucleotide konstruiert, die die Rahmenverschiebung in dem lacZ-Gen so korrigierten, daß Bakterien, die Mutanten-Plasmide enthielten, aufgrund ihrer blauen Farbe ausgewählt wurden.
  • Das Plasmid pHgaNS, das zur Präparierung einer mit Segment 8 von A/WSN/33 identischen RNA verwendet wurde, wurde mit Hilfe der Starter
    Figure 00420001
    in einer Polymerasekettenreaktion ausgehend von einem cDNA-Klon konstruiert. Das Produkt wurde anschließend in dem XbaI/EcoRI-Fenster von pUC19 kloniert.
  • 6.1.3 HERSTELLUNG VON RNA-MATRIZEN
  • Plasmid-DNAs wurden mit Hilfe von MboII oder anderen geeigneten Endonukleasen (siehe 2) aufgespalten, und die linearisierte DNA wurde unter Verwendung der Bacteriophage-T7-RNA-Polymerase transkribiert. Abfließende RNA-Transkripte wurden mit RNAse-freier DNAse 1 behandelt; anschließend wurde die RNA mittels Ionenaustauschsäulen vom Typ Qiagen tip-5 (Qiagen, Inc.) von den Proteinen und freien Nucleotiden gereinigt und isoliert. Nach Ausfällung in Ethanol wurden gereinigte RNAs in Wasser resuspendiert, und eine Probe wurde mittels Elektrophorese analysiert, gefolgt von einer Silbereinfärbung des Polyacrylamidgels zum Zwecke einer quantitativen Bestimmung der RNA-Ausbeute.
  • 6.1.4 INFLUENZAVIRALE POLYMERASEREAKTIONEN
  • In einem Gesamtvolumen von 25 μl wurden ca. 30 μl Nucleoprotein und insgesamt 200 pg der drei Polymeraseproteine mit 10 ng Matrizen-RNA gemischt, und die Lösung wurde aufgefüllt bis zu einer Endkonzentration von: 50 mM Hepes, pH 7,9, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol, 0,05 % NP-40,0,4 mM Adenylyl-(3'-5')-guanosyl-(APG)-dinucleotide (Pharmacia), 0,5 mM ATP, 0,5 mM GTP, 0,5 mM CTP und ca. 0,6 μM α-32P-UTP (40 μCi bei 3000 Ci/mmol, New England Nuclear). Die Reaktionen wurden auf Eis zusammengestellt und anschließend für 90 Minuten in ein 30°C warmes Wasserbad verlegt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 0,18 ml eiskaltem 0,3 M Natriumacetat/10 mM EDTA beendet und anschließend mit Phenol/Chloroform (Volumenverhältnis 1:1) extrahiert. Nach der ersten Extraktion wurden 15 μg polyI-polyC-RNA als Träger ("Carrier") hinzugegeben, und die Probe wurde erneut mit Phenol/Chloroform extrahiert. Anschließend wurden die Proben mit Äther extrahiert und in Ethanol aufgefällt. Nach Zentrifugation wurde das RNA-Pellet zweimal mit 70%igem Ethanol gewaschen und anschließend vakuumgetrocknet.
  • Die Reaktionen, bei denen die hochkonzentrierte Polymerase verwendet wurde, erfolgten unter identischen Bedingungen wie oben angegeben, nur wurden hier 20 ng Matrizen-RNA hinzugegeben. Bei den Reaktionen, in denen RNAs mit Genom-Lange zum Einsatz kamen, wurden die eingesetzte Polymerasemenge verdoppelt, 50 ng Matrizen-RNA verwendet und die UTP-Konzentration auf 2,6 μM angehoben.
  • Die RNA wurde resuspendiert in einem Farbgemisch aus 78 % Formamid, 10 mM ETDA, 0,1 % Xylen-cyanol und 0,05 % Bromphenolblau. Typischerweise wurde eine Probe dieser RNA mittels Elektrophorese unter Verwendung von 8%igem Polyacrylamidgel ohne Harnstoff-Zusatz analysiert; der Rest wurde durch 1,5-minütiges Erhitzen auf 100°C denaturiert, und eine Aliquote wurde auf ein 8%iges Polyacrylamidgel, dem 7,7 M Harnstoff zugesetzt waren, aufgebracht. Die Gele wurden durch ein zweistufiges Verfahren fixiert, zunächst in 10%iger Essigsäure, anschließend in 25 % Methanol/8 % Essigsäure. Die Gele wurden auf Filterpapier getrocknet, sodann wurden ein Röntgenfilm aufgelegt und das Ganze exponiert.
  • Wenn verschiedene RNAs für eine Verwendung als Matrizen getestet wurden, dann wurden die verschiedenen RNA-Präparate immer auf Polyacrylamidgelen analysiert und mit Silber angefärbt, damit gleiche Mengen einer jeden Matrize zur Verwendung kamen. Zum Zwecke der quantitativen Bestimmung der Produktmenge wurden die Gele mit einem Röntgenfilm belegt und exponiert, und zwar ohne einen verstärkenden Filter, um die Linearität der Densitometer-Ablesungen zu verbessern. Autoradiographische Aufnahmen wurden mit Hilfe eines Rasterdensitometers vom Typ FB910 (Fisher Biotech) analysiert, und Peaks wurden mittels Computer unter Einsatz entsprechender Programme von Fisher Biotech ausgewertet.
  • 6.1.5 NUKLEASEANALYSE VON REAKTIONSPRODUKTEN
  • Zum Zwecke einer Ribonuklease-T1-Analyse der beiden grundlegenden RNA-Produkte wurden Reaktionsprodukte mittels Elektrophorese unter Verwendung von 8%igem Polyacrylamidgel (ohne Harnstoff-Zusatz) analysiert, wobei das Gel nicht mit Fixiermittel behandelt wurde. Das nasse Gel wurde mit einem Röntgenfilm bedeckt und exponiert, und die entsprechenden Gelstücke wurden lokalisiert und herausgetrennt. Das Gelstück wurde in 0,3 ml [Lösung] aus 10 mM Tris (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 % Natriumdodecylsulfat und 1 μg tRNA als Träger zerlegt. Die RNA diffundierte 3 Stunden lang in diese Lösung; anschließend wurde das Gel pelletiert und wurde der Überstand 0,3 M in Natriumacetat gegeben. Sodann wurde der Überstand zweimal in Phenol/Chloroform und einmal in Äther extrahiert und anschließend in Ethanol ausgefällt. Das RNA-Pellet wurde in 5 μl Formamid resuspendiert, 1,5 Minuten lang in kochendem Wasser denaturiert und sodann durch Zugabe von 0,1 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA verdünnt. Es wurde Ribonuclease T1 (50 Einheiten, Boehringer Mannheim Biochemicals) hinzugegeben, und die Proben wurden 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Synthetisch mit T7-RNA-Polymerase in Gegenwart von α-32P-UTP hergestellte V-wt- und M-wt-RNAs wurden ebenso mit RNAse T1 aufgespalten. Die Reaktionsprodukte wurden in Phenol/Chloroform extrahiert, sodann in Ethanol ausgefällt und schließlich mittels Elektrophorese unter Verwendung von 20%igen Polyacrylamidgelen, denen 7,7 M Harnstoff zugesetzt waren, analysiert.
  • Nuklease-S1-Analyse von Reaktionsprodukten erfolgte an transkribierter RNA, indem zunächst die Standard-Polymerasereaktion durch die Ergänzung von S1-Puffer bis zu einem Volumen von 0,2 ml mit 0,26 M NaCl, 0,05 M Natriumacetat (pH 4,6) und 4,5 mM Zinksulfat. Die Probe wurde in zwei Teile mit je 0,1 ml geteilt, und einem Röhrchen wurden 100 Einheiten der Nuklease S1 (Sigma Chemical Company) hinzugegeben. Die Proben wurden 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden EDTA (10 mM Endkonzentration) und 15 μg polyl-polyC-RNA hinzugefügt; die Probe wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und in Ethanol ausgefällt. Anschließend wurden die Proben einer Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen.
  • 6.2 ERGEBNISSE
  • 6.2.1 DARSTELLUNG VON INFLUENZAVIRALER RNA-FOLYMERASE UND VON MATRIZEN-RNA
  • RNP-Kerne von Influenzavirus A/Puerto Rico/8/34 wurden präpariert durch Zerstörung des Virus in Lysolecithin und Triton N-101 und anschließender Glycerol-Gradientenzentrifugation (Rochavansky, 1976, Virology 73: 327-338). Sodann wurden Fraktionen, die Kerne enthielten, einer zweiten Zentrifugation unter Einsatz eines CsCl-Glycerol-Stufengradienten unterzogen (Honda u.a., 1988, J. Biochem. 104:1021-1026). Die Fraktionen, die die Polymerase enthielten, wurden mittels Gelelektrophorese der Proben und anschließender Silbereinfärbung identifiziert. Die 1 zeigt das Polymerasepräparat nach CsCl-Gradientenzentrifugation. Zum Schutz vor einem Proteinverlust wurde während der Dialyse Rinderserumalbumin zugesetzt. Eine densitometrische Abtastung von Streifen 4 mit anschließendem Vergleich mit bekannten Mengen des kompletten Virus in den Streifen 1 und 2 ließ uns vermuten, daß es sich bei den Proteinen in Streifen 4 um 150 ng NP und ca. 1 ng der drei Polymeraseproteine zusammen handelte. Ein Fünftel des für dieses Gel eingesetzten Präparats wurde pro Reaktion verbraucht.
  • Der allgemeine Aufbau der in dieser Studie zur Herstellung von Matrizen-RNAs verwendeten Plasmide ist in 2 dargestellt. Das komplette Insert wurde ausgehend von aus einem DNA-Synthesegerät stammenden Oligonucleotiden hergestellt, die in dem Polylinker des Plasmids pUC19 kloniert wurden. Das Insert wies eine stumpfendige Promotorsequenz auf, die von der RNA-Polymerase der Bacteriophage T7 (Studier and Dünn, 1983, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, XL VII, 999-1007) erkannt wurde, so daß die ersten synthetisierten Nucleotide die terminalen 22 Nucleotide (nt) der konservierten Sequenz des 5'-Endes der genomischen RNA waren. Nachdem das Plasmid durch Restriktionsendonuklease MboII geschnitten worden war (welche 7 Basen in 5'-Richtung ("upstream") von ihrer Erkennungsstelle schneidet), endete die aus der T7-RNA-Polymerase-Transkription resultierende RNA mit den terminalen 3'-Nukleotiden der influenzaviralen Sequenz. In dieser Sequenz enthalten war der Poly-U-Abschnitt, der an das 5'-Ende des konservierten Endes grenzt, bei dem man davon ausgeht, daß er zumindest einen Teil des Terminations-Polyadenylierungssignals umfaßt (Robertson u.a., 1981, J. Virol. 38,157-163). Die Gesamtlänge dieser Modell-Genom-RNA betrug 53 nt, da ein 16 nt langer Abstandshalter ("Spacer") die konservierten Endsequenzen trennte. Die Modell-RNA, deren beide Enden mit denen der vRNA identisch waren, wurde V-wt genannt. Die RNA M-wt codierte für den genau komplementären Strang von V-wt, so daß die Enden denen der komplementären RNA (cRNA) entsprechen. V-wt und M-wt wurden konstruiert, um jeweils als Muster für influenzavirusspezifische vRNA bzw. cRNA zu dienen.
  • 6.2.2 VIRALE POLYMERASE KATALYSIERT DIE SYNTHESE EINER VOLLSTÄNDIGEN KOPIE DER MATRIZE
  • Aus der Reaktion, bei der die influenzavirale Polymerase, die V-wt-Matrize und der Starter ApG zum Einsatz kamen, ging ein Produkt hervor, das gleichzeitig mit einem 53 nt langen RNA-Fragment auf Denaturierungsgelen wanderte. Ebenso erkennbar war ein RNA-Fragment, das an einer Position von ca. 40 bis 45 Nucleotiden als ein Doublet wanderte (3A, Streifen 2). Bei diesem kürzeren Produkt handelt es sich, wie im folgenden gezeigt, um ein RNA-Fragment, das an einem Abschnitt aus Adenosinen endete, der sich zwischen den Nukleotiden 43-48 in der virionorientierten Matrize befindet. Neben den matrizenspezifischen Transkripten war ein allgemeiner Hintergrund aus schwachen Banden zu sehen, die gestutzten RNA-Produkten entsprachen, die das Ergebnis der Transkription viraler genomischer RNA waren, welche während der CsCl-Gradientenzentrifugation nicht entfernt worden war. Dort, wo kein Starter eingesetzt worden ist, war kein spezifisches Transkriptionsprodukt zu erkennen (3A, Streifen 3). Weitere Experimente zeigten, daß Globin-mRNA, die eine terminale cap-1-Struktur aufweist, als Starter inaktiv war bei Verwendung von primären Polymerase-Präparaten.
  • Nach Beendigung der Polymerasereaktion durch Zugabe von die Nuklease-S1-Aufschließung begünstigenden Puffer im Überschuß und nach Zugabe von Nuklease war das radioaktiv markierte Produkt resistent gegen Aufspaltung (3B, Streifen 2). Im Gegensatz dazu bewirkten diese Bedingungen eine sehr effiziente Aufspaltung der V-wt-Einzelstrang-RNA, radioaktiv synthetisiert mit T7-RNA-Polymerase 3B, Streifen 3 und 4). Diese Nuklease-S1-Daten bestätigten, daß der gegenüberliegende Strang tatsächlich im Zuge dieser Reaktionen synthetisiert worden war. Das Produkt dieser Reaktion könnte eine doppelsträngige RNA sein, jedoch konnte nicht ausgeschlossen werden, daß das Produkt nicht eigentlich doch einzelsträngig war und erst später in der Gegenwart von in der Nuklease-Reaktion verwendetem starkem Salz mit der Matrizen-RNA zu einem Doppelstrang verschmolzen ist.
  • Die RNA-Produkte wurden elektrophoretisch unter Einsatz eines 8%igen Gels gereinigt, herausgeschnitten, aus dem Gel eluiert und anschließend mittels Ribonuklease T1 aufgeschlossen. Die Produkte wurden mittels Elektrophorese analysiert und mit den Mustern verglichen, die durch RNase-T1-Aufschließung von intern markierten M-wt- und V-wt-Kontrollproben erzeugt worden waren. Wie die 3C zeigt, weist die RNA voller Länge (Streifen 1) ein identisches Muster auf wie die RNA mit Plus-Polarität, M-wt (Streifen 3), und nicht das Muster der V-wt-RNA (Streifen 4). Die festgestellten Muster waren im wesentlichen mit dem Muster identisch, das ausgehend von der Sequenz der RNA vorhergesagt worden war, und sie zeigten somit, daß die Polymerase die V-wt-Matrize genau kopiert hatte. Das kleinere RNA-Produkt, ein Doublet zu den meisten Matrizen, wurde ebenso mit RNAse T1 aufgespalten. Sein Muster ähnelte dem des RNA-Produkts voller Länge (3C, Streifen 2) bis auf die Tatsache, daß das 14 Basen-Oligonukleotid nicht vorhanden war. Statt dessen war ein schwaches 13 Basen-Oligonukleotid zu erkennen, was die Termination der kurzen RNA auf Position 44 abbildete, einem Ort, an dem zwei Uridine eingebaut würden. Da die Menge des kleineren RNA-Produkts mit steigenden UTP-Konzentrationen abnahm und schließlich verschwand, nachdem CTP als Marker verwendet wurde, schienen diese Streifen eine durch niedrige UTP-Konzentrationen in der Polymerase-Reaktion hervorgerufene Struktur ("Artefact") zu sein.
  • 6.2.3 BEDINGUNGEN FÜR DIE POLYMERASE-REAKTIONEN BEI EINSATZ VON MUSTER-RNA-MATRIZEN
  • Wie man festgestellt hat, reagieren Proteinproben, die ca. 30 ng NP-Protein und ca. 200 pg der drei P-Proteine zusammengenommen enthalten, optimal mit 5 bis 10 ng RNA reagieren. Bei Verwendung von gleichgültiger Konkurrenz-RNA, polyl-polyC, zeigte sich, daß überschüssige RNA eine Transkription nichtspezifisch verhinderte, möglicherweise durch nichtspezifische Bindung des NP-Proteins (Kingsbury u.a., 1987, Virology 156: 396-403; Scholtissek and Becht, 1971, J. Gen. Virol. 10:11-16). In Abwesenheit eines nichtspezifischen Konkurrenten bewirkten Schwankungen in der Matrizen-Menge zwischen 1 ng und 10 ng geringfügige Änderungen in bezug auf den Wirkungsgrad der RNA-Synthese. Das NP-Protein und RNA lagen in ungefähr gleichen molaren Konzentrationen vor, und diese lagen jeweils ungefähr ein Tausendfaches über den Molwerten des aus den drei P-Proteinen in der typischen Reaktion gebildeten Komplexes (dessen Verhältnis mit 1:1:1 angenommen wurde).
  • Da diese rekonstituierten RNPs in der Lage waren, ApG, nicht jedoch Globin-mRNA, als Starter zu nutzen, prüften wir diese Muster-RNPs auf andere Variablen der Transkriptionsreaktion. Bei allen anderen untersuchten Möglichkeiten verhielten sich die rekonstituierten RNPs in Lösung ähnlich wie die aus durch Detergentien zerstörtem Virus gereinigten RNPs. Die optimale Temperatur für die RNA-Synthese betrug 30°C (4A, Streifen 2), wie wiederholt für die virale Polymerase festgestellt (Bishop u.a., 1971, J. Virol. 8: 66-73; Takeuchi u.a., 1987, J. Biochem. 101: 837-845; Ulmanen u.a., 1983, J. Virol. 45: 27-35). Daneben erwies sich als aktivste Salzbedingung 60 mM NaCl (4B, Streifen 2), was wiederum mit den Bedingungen übereinstimmte, die von verschiedenen Teams angesetzt wurden (Bishop u.a., 1971,}. Virol. 8: 66-73; Honda u.a., 1988, J. Biochem. 104:1021-1026; Shapiro and Krug, 1988, J. Virol. 62:2285-2290). Die 4C zeigt ein Zeit-Verlaufs-Experiment. Hierbei zeigte sich ein annähernd linearer Anstieg des Umfangs der RNA-Synthese während der ersten 90 Minuten, wie auch für virale RNPs beobachtet (Takeguchi u.a., 1987, J. Biochem. 101: 837-845).
  • 6.2.4 SPEZIFITÄT DER ELONGATIONSREAKTION
  • Verschiedene RNAs wurden auf ihre Eignung als Matrizen für die RNA-Polymerase des Influenzavirus hin getestet. Der pV-wt-Plasmid-Klon wurde entweder mit EcoRI, PstI oder SmaI aufgespalten, und T7-Polymerase wurde zur RNA-Transkription eingesetzt. Dies brachte RNAs hervor, die bis auf den Zusatz von 5,13 und 38 nt am 3'-Ende mit V-wt identisch waren. Die 5A zeigt eine überbelichtete autoradiographische Aufnahme, um aufzuzeigen, daß keine Transkripte vor einem Hintergrund in Reaktionen festzustellen waren, die als Matrize enthielten: zwei der mit V-wt bis auf eine zusätzliche Sequenz von 13 bzw. 38 nt an dem 3-Ende (Streifen 1 und 2) identische RNAs; eine einzelsträngige DNA mit identischer Sequenz wie V-wt (Streifen 4); und eine nicht in Beziehung stehende 80 nt lange RNA, generiert durch Transkription des Polylinkers von pIBI-31 mit T3-RNA-Polymerase (Streifen 5). Die V-Eco-Matrize jedoch, mit fünf zusätzlichen Nukleotiden an dem 3-Ende, konnte erkannt und verläßlich transkribiert werden, wenngleich auch nur mit ca. einem Drittel des Wirkungsgrades der Wildtyp-V-wt-RNA (5B, Streifen 3). Eine interessante Feststellung ist, daß im Falle der V-Eco-RNA die Initiation durch die influenzavirale Polymerase an der korrekten Base zu erfolgen schien, da die transkribierte RNA dieselbe Länge aufwies wie das Produkt bei Verwendung der V-wt-Matrize.
  • 6.2.5 ANALYSE DER PROMOTORREGION FÜR DIE VIRALE RNA-POLYMERASE
  • Die ursprüngliche für diese Untersuchungen verwendete Konstruktion enthielt die Sequenzen beider RNA-Enden genomischer RNAs, die zur Basenpaarbildung und somit zur Ausbildung eines Pfannenstils ("panhandle") in der Lage waren. Dies geschah, da aufgezeigt worden war, daß die vRNA in Virionen und in RNPs in infizierten Zellen eine kreisrunde Konformation über dem 15 nt bis 16 nt langen Pfannenstil aufwies (Honda u.a. 1988, J. Biochem. 104:1021-1026; HSU u.a., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8140-8144). Es war desweiteren gezeigt worden, daß die virale Polymerase an die doppelsträngige Struktur gekoppelt war (Honda u.a., 1988, J. Biochem. 104: 1021-1026), was Anlaß zu der Vermutung gab, daß der Promotor für die RNA-Synthese der Pfannenstil war. Zur Prüfung, ob der Pfannenstil eine unbedingte Voraussetzung für die Erkennung war, wurden die nachgenannten Matrizen verwendet: das Plasmid pV-wt wurde vor der Transkription durch die T7-Polymerase mit DraI aufgespalten (2). Dies sollte ein 32 nt langes RNA-Molekül hervorbringen, das nur virusspezifische Sequenzen von dem 5'-Ende der RNA enthielt. Die Verwendung dieser RNA als Matrize brachte kein sichtbares Produkt hervor (5B, Streifen 2). D.h., das 3'-Ende der Virion- RNA war für diese Reaktion erforderlich. Diese Feststellung deckte sich mit der Tatsache, daß die Initiationsstelle an dem 3'-Ende von V-wt in V-Dra nicht vorkam. Ein zweiter Plasmid-Klon wurde hergestellt, der die 5-terminalen Sequenzen auslöschte, jedoch das 3'-Ende intakt hielt. Dieser Klon, pV-d5' bezeichnet, brachte bei Aufschluß mit MboII und Verwendung zur Transkription durch T7-Polymerase ein bedeutendes Transkript mit einer Länge von 30 nt sowie zwei weniger bedeutende Ausgaben von 29 nt bzw. 31 nt Länge hervor. Überraschenderweise wurde diese Matrize von der influenzaviralen Polymerase erkannt und kopiert. Die 7, Streifen 1, zeigt, daß das Produkt der viralen RNA-Polymerase-Reaktion mit V-d5' zahlreiche Banden enthält, die die Eingangs-RNA widerspiegeln. Nach Elution der in 7, Streifen 1, gezeigten Produkte aus Gelen und RNase-T1-Analyse wurde das für das Transkriptionsprodukt von V-d5' erwartete Muster festgestellt. Da die V-d5'-RNA-Matrize kopiert worden war, war der Pfannenstil für die Bindung und Synthese durch virale Polymerase nicht erforderlich.
  • Wenngleich auch das 5'-Ende für eine Synthese durch die Polymerase nicht erforderlich war, bestand eindeutig die Möglichkeit, daß die V-wt-RNA im Vergleich zur V-d5' eine bevorzugte Matrize sein könnte. Um dies zu untersuchen, wurden Reaktionen durchgeführt, bei denen die Matrizen gemischt wurden. Die V-wt-RNA lag in jeder Reaktion in einer Menge von 5 ng vor. V-d5' fehlte (6, Streifen 1) oder lag in einem molaren Verhältnis von 1/5 (6, Streifen 2) oder 1/1 (6, Streifen 3) vor. Die relativen Intensitäten der Streifen einer jeden RNA wurden densitometrisch ausgehend von der autoradiographischen Aufnahme ermittelt. Die Werte wurden um die Menge des radioaktiven Nucleotids, UTP, das in jedem Produkt eingebaut sein konnte, korrigiert, und der Wert wurden so normalisiert, daß der Synthesegrad in jedem Streifen gleich 1 war. Der Grad des Kopierens von V-wt nahm mit steigendem Anteil an V-d5' ab. Bei Vorliegen von V-d5' in einem molaren Verhältnis von einem Fünftel betrug sein korrigierter Synthesegrad ungefähr ein Viertel des Synthesegrades von V-wt (6, Streifen 2). Bei Vorliegen der beiden Matrizen in äquimolekularen Mengen belief sich der Grad der Synthese ausgehend von V-wt auf ungefähr 60 % des Gesamtumfangs (6, Streifen 3), was in dem erwarteten Rahmen experimenteller Fehler für äquivalente Synthesegrade liegen könnte. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt in dem Falle, wo der V-d5'-RNA-Anteil konstant gehalten und der V-wt-RNA-Anteil verändert wurde. Die Schlußfolgerung lautete daher, daß der die Pfannenstilstruktur aufweisenden V-wt-KNA kein wesentlicher Vorzug gegenüber der Matrizen-RNA eingeräumt wurde, die nur das richtige 3'-Ende enthielt.
  • 6.2.6 DIE VIRALE POLYMERASE KOPIERT KEINE RNA-MATRIZEN, DIE ENDEN MIT PLUS-POLARITÄT ENTHALTEN
  • Wie bereits beschrieben übt die Influenza-RNA-Polymerase drei unterschiedliche Aktivitäten im Verlauf einer Infektion aus. Zwei Aktivitäten implizieren die Transkription der RNA mit Genom-Polarität, die dritte Aktivität impliziert das Kopieren der RNA mit komplementärer Polarität in vRNA. Wir konstruierten daher eine RNA-Matrize, die das 5'-Ende sowie das 3'-Ende der RNA komplementärer Polarität von Segment 8 enthielt (M-wt; 2).
  • Bei Verwendung der M-wt-RNA als Matrize wurde eine Synthese in nur geringem Umfang festgestellt (5B, Streifen 4). In zwei zum Zwecke einer Quantitierung durchgeführten Experimenten belief sich der durchschnittliche Grad der Synthese ausgehend von M-wt-RNA auf 4 % des Synthesegrades von V-wt. Eine vergleichende Gegenüberstellung der V-wt-RNA- und M-wt-RNA-Promotoren ergab, daß das M-wt nur drei Übergangsänderungen und eine Punktinsertion innerhalb der 3'-terminalen 15 Nukleotide aufwies. Nämlich eine G-in-A-Änderung an Position 3, eine U-in-C-Änderung an Position 5, eine C-in-U-Änderung an Position 8 und ein inseriertes U zwischen dem neunten und dem zehnten Nucleotid (Siehe Tabelle II unten). Um herauszufinden, welche der vier punktuellen Unterschiede in den 3'-Enden für die Spezifität maßgeblich waren, wurden viele Kombinationen derselben dargestellt und auf ihre Effizienz als eine Matrize hin analysiert (7). Bei diesen Matrizen handelte es sich um Abkömmlinge von V-d5', da ihnen das 5'-Ende fehlte. Die Ergebnisse densitometrischer Abtastungen verschiedener Experimente sind in Tabelle II zusammengefaßt.
  • TABELLE II QUANTITATIVER VERGLEICH DER WIRKUNG VON PUNKTMUTATIONEN IN DER PRQMOTORSEOUENZ*
    Figure 00510001
  • Wie in Tabelle II gezeigt, wurden einzelne punktuelle Änderungen in V-d5' genauso gut kopiert wie V-d5' als solches, abgesehen von der V-A3-RNA, die mit einem Wirkungsgrad von 40 % kopiert worden war (7, Streifen 10; Tabelle II). Bei der Prüfung von RNAs mit zwei Änderungen fiel die Aktivität generell auf sehr niedrige Grade ab (7, Streifen 3, 4 und 5). Diese Experimente bestätigten somit, daß die Spezifität der Reaktionen für V-wt über M-wt das Ergebnis der Kombination der an dem 3'-Ende von M-wt vorliegenden Nukleotidänderungen war.
  • 6.2.7 CAP-ENDONUCLEASE-INITIIERTERNA-SYNTHESE
  • Das Verfahren der Reinigung der viralen Polymerase wurde abgeändert, um den Proteinverlust während der Dialyse zu verringern. Statt mit Hilfe des Dialysesystems vom Typ Amicon centricon-10 wurde das Enzym in Standardmembranen dialysiert, was zu höheren Konzentrationen von allen vier viralen Kernproteinen führte. Das Muster des Proteingels dieses Präparats war, wenn man davon absieht, daß es keine BSA-abgeleitete Band gibt, mit dem gezeigten Muster in 1, Streifen 4, identisch. Es wurde festgestellt, daß 5 μl dieses Präparats, das 150 ng NP und insgesamt 5 ng der drei Polymeraseproteine zusammen enthielt, mit 10 bis 40 ng Modell-RNA-Matrize optimal reagierte. Der Einsatz höherer Proteinmengen jedoch bewirkte eine Verstärkung des Hintergrundes, möglicherweise infolge höherer Mengen von verunreinigenden RNAs (Virion-RNAs, die durch CsCl-Zentrifugation nicht entfernt worden waren), die Produkte der Größenklasse von ca. 50-75 nt hervorbrachten, was die Analyse von RNA-Matrizen mit einer Länge von 50 nt komplizierte.
  • Dieses hochkonzentrierte Polymerase-Präparat zeigte nun Aktivität in der mit cap-Endonuklease gestarteten RNA-Synthese (8A, Streifen 4) sowie auch bei der starterunabhängigen Replikation der Matrizen-RNA (8A, Streifen 2). Wurde Globin-mRNA als Starter für die Transkription ausgehend von der 30 nt langen V-d5'-Matrize verwendet, so zeigte sich eine Dreiergruppe von Banden der Größe von ca. 42 bis 44 nt als Produkt (8A, Streifen 4), in Übereinstimmung mit dem Schneiden ("Cleavage") der Cap-Struktur ungefähr 12 nt entfernt von dem 5'-Ende der mRNA und Verwendung dieses Oligonukleotids zur Initiierung der Synthese ausgehend von der 30 nt langen Modellmatrize. Da das überschüssige RNA die RNA-Synthese hemmt, wahrscheinlich über nichtspezifische Bindung von NP in vitro wie oben erörtert, wurde als optimale Menge der zu jeder Reaktion hinzugegebenen cap-Donor-RNA 100 ng ermittelt, was weit weniger ist, als normalerweise mit vorgeformten RNP-Strukturen verwendet wird (z.B. Bouloy u.a., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3952-3956). Der wirkungsvollste Starter war ApG (8A, Streifen 5, und geringere Belichtung in Streifen 6). Das Produkt wandert langsamer als das der Eingangs-Matrize (8A, Streifen 1) oder das Produkt bei Nichtvorhandensein eines Starters (8A, Streifen 2), und dies wahrscheinlich, weil das 5'-Ende des ApG-Produkts unphosphoryliert ist. Die Intensität des bei Verwendung von ApG als Starter erzielten Produkts lag ungefähr ein Zehnfaches über der des mit cap als Starter erzielten Produkts, bei 0,4 mM jedoch lag ApG in einem 60.000fachen molaren Überschuß im Verhältnis zur Konzentration der cap-Spender ("Donors") vor. D.h., obgleich die Intensität des Produktstreifens bei Einsatz von cap als Starter ungefähr um ein Zehnfaches kleiner war als die Intensität bei Verwendung von ApG als Starter, war die Reaktion, bei der cap als Starter eingesetzt worden war, um ungefähr ein 6000faches effizienter auf molarer Basis. Dieser Wert entspricht ungefähr der 4000fachen Überschuß-Effizienz, die zuvor für die virale Polymerase festgestellt worden war (Bouloy u.a., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3952-3956). Wie bereits gezeigt, sind cap-Donor-RNAs, die eine cap-0-Struktur enthalten, wie in BMV-RNA, ungefähr ein Zehnfaches weniger aktiv bei der Initiierung der influenzaviralen Polymerase (Bouloy u.a., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3952-3956). Diese ungewöhnliche cap-Spezifität war den hier untersuchten rekonstituierten RNAs gemein bei starkem Rückgang des spezifischen Produkts von Modell-RNA in Reaktionen, die BMV-RNA als cap-Donor enthielten. Ein 30 nt langes Produkt wurde in den Streifen 2 bis 4 festgestellt, was wahrscheinlich auf eine starterlose Replikation der Modellmatrize zurückzuführen ist. Daß die Produkt-RNAs die entgegengesetzte Polarität wie die Eingangsmatrize V-d5' aufwiesen, wurde anhand der Nuklease-S1-Analyse gezeigt. Die RNA-Produkte der mit ApG gestarteten (8B, Streifen 1 und 2) und die der starterlosen Reaktion (8B, Streifen 3 und 4) waren in hohem Maße nukleaseresistent. Das Produkt der mit cap-gestarteten Reaktion (8B, Streifen 5 und 6) war zum Teil empfindlich gegenüber Nuclease, da ca. 12 nt von dem Produkt abgebaut wurden. Diese Ergebnisse deckten sich in hohem Maße damit, daß die 5'-terminalen 12 nt von mRNA abstammen, wie mehrfach für influenzavirus-spezifische mRNA-Synthese aufgezeigt.
  • Die Promotor-Spezifität dieses Polymerase-Präparats in mit cap initiierten Reaktionen erwies sich als im wesentlichen identisch mit der für das geringer konzentrierte Enzym, wie bereits gezeigt. Bisherige Versuche, ähnliche Untersuchungen der Promotor-Spezifität mit Hilfe der primer-losen Reaktionen und der cap-initiierten Reaktionen durchzuführen, waren durch die vergleichsweise starken Hintergrundgrade frustrierend, was eine quantitative Bestimmung erschwerte.
  • 6.2.8 REPLIKATION VON RNA-MATRIZEN GENOMISCHER LÄNGE
  • Eine vollständige, 890 nt lange RNA mit einer identischen Sequenz wie die von A/WSN/33 Segment 8 wurde durch T7-RNA-Polymerase-Transkription von Plasmid-DNA, pHgaNS, die mit Restriktionsendonuklease HgaI aufgeschlossen worden war, präpariert. Diese RNA wurde in Reaktionen mit ApG als Starter, die 10 fil der hochkonzentrierten Polymerase enthielten, kopiert (9, Streifen 8). Daß es sich bei der RNA eigentlich um eine Kopie der Matrize handelte, zeigte sich an ihrer Resistenz gegenüber der Nuklease S1 (9, Streifen 9). Ein ähnliches Produkt wurde bei Nichtvorhandensein eines Startermoleküls festgestellt (9, Streifen 2 und 3). Eine Bestätigung dessen, daß es sich bei diesen Produkt-RNAs um vollständige Kopien der Matrize handelte, brachte die RNase-T1-Analyse. Ebenso wurde von phenol-extrahiertem A/PR/8/34-Virus gereinigte Virionen-RNA in ApG-initiierten Reaktionen (9, Streifen 10 und 11) sowie in Reaktionen ohne Gegenwart eines Starters kopiert (9, Streifen 4 und 5). Interessanterweise lag das Produkt aus der Replikation des HA-Gens in stark reduzierten Graden vor. Das 3'-Ende dieser RNA unterscheidet sich von der von Segment 8 nur in den Nukleotiden 14 und 15, was vermuten läßt, daß diese Nukleotide in dem Promotor für die RNA-Synthese von Bedeutung sind. Außerdem stellten wir fest, daß bei Verwendung von kompletter viraler RNA in den rekonstituierten RNPs die Höhe der säure-ausfällbaren Zählungen ungefähr 70 % des mit nativen RNPs festgestellten Umfangs betrug. Die virale Polymerase war überdies imstande, diese vollständigen RNAs bei Einsatz von Globin-mRNA in cap-initiierten Reaktionen zu kopieren.
  • 7 BEISPIEL: EXPRESSION UND VERPACKUNG EINES FREMD-GENS DURCH REKOMBINANTEN INFLUENZA-VIRUS
  • Es wird die Expression des Chloramphenicol-Transferase-(CAT-)Gens bei Verwendung von rRNPs beschrieben. Die rRNPs wurden anhand von pIVACAT (ursprünglich mit pCATcNS bezeichnet) hergestellt. Das Plasmid pIVACAT ist ein pUC19-Plasmid, das folgende Sequenz aufweist: den T7-Promotor; die 5'-(virusorientierte-)nichtcodierende Nachbarsequenz der Influenza-A/PR8/34-RNA Segment 8 (codiert für die NS-Proteine); eine BgIII-Klonierungsstelle; die vollständige Codierungssequenz des Chloramphenicol-Transferase-(CAT-)Gens in der umgekehrten und komplementierten Reihenfolge; die 3'-(virusorientierte-) nichtcodierende NS-RNA-Sequenz; und verschiedene Restriktionsstellen, die eine fortlaufende Transkription ("runoff transcription") der Matrize gestatten. Das pIVACAT kann mit Hilfe von T7-Polymerase transkribiert werden, um eine RNA mit Influenza-A-Virus-orientierten Nachbarsequenzen um ein CAT-Gen in umgekehrter Orientierung herzustellen.
  • Bei den in den nachfolgenden Abschnitten beschriebenen In-vivo-Experimenten wurde das beschriebene rekombinante RNA-Molekül eingesetzt, das Sequenzen enthält, die den unübersetzten 3'- und 5'-terminalen Sequenzen der NS-RNA von Influenza-A/PR/8/34 entsprechen, das den in Gegenrichtung orientierten Leserahmen des CAT-Gens flankiert. Diese RNA wurde mit gereinigtem Influenzavirus- Polymerase-Komplex gemischt und in MDCK-(oder 293-)Zellen transfiziert. Nach erfolgter Infektion mit dem Influenza-A/WSN/33-Virus wurde CAT-Aktivität in den RNP-transfizierten Zellen gemessen, und es zeigte sich eine Amplifikation des Gens. Darüber hinaus war das rekombinante Influenzavirus-Gen in Viruspartikel verpackt, da CAT-Aktivität in Zellen nach Infektion mit dem rekombinanten Viruspräparat aufgezeigt wurde.
  • 7.1 MATERIAL UND VERFAHREN
  • Um eine Fusion der Nachbarsequenzen der NS-RNA mit der Codierungssequenz des CAT-Gens zu bewirken, wurde nach der nachgenannten Strategie verfahren. Zwei geeignete interne Restriktionsstellen in der Nähe des Start- und des Stop-Codons des CAT-Gens wurden ausgewählt, die den Austausch der das CAT-Gen in dem Plasmid pCM7 flankierenden Sequenzen gegen die 3'- und 5'-NS-RNA-Sequenzen gestatten würden. An dem 5-Ende wurde eine SfaNI-Stelle gewählt (die einen Schnitt 57 nt von dem ATG entfernt erzeugt), und an dem 3'-Ende wurde eine ScaI-Stelle gewählt, die einen Schnitt 28 nt von dem Ende des Gens (einschließlich Stop-Codon) entfernt erzeugt. Anschließend wurden vier synthetische Oligonucleotide mit Hilfe eines DNA-Synthesegeräts von Applied Biosystems, um zwei doppelstrangige DNA-Fragmente mit korrekten Überständen für das Klonieren zu erzeugen. Um das Start-Codon herum bildeten diese Oligonucleotide ein Stück DNA, das einen XbaI-Überstand gefolgt von einer HgaI-Stelle und einer PstI-Stelle enthielt, wobei unmittelbar auf die 3-(virusorientierte-)NS-Sequenz die CAT-Sequenz von dem Start-Codon bis zu dem SfaNI-Überstand folgte (unterstrichen). Außerdem wurde eine stumme Mutation eingefügt, um eine AccI-Stelle in größerer Nähe zu dem Start-Codon zu generieren, um zukünftige Modifikationen zu ermöglichen.
  • Figure 00550001
  • Um das Stop-Codon herum generierten zwei andere Oligonucleotide ein Sück DNA wie folgt: eine stumpf endende ScaI-Stelle, die CAT-Sequenz ab dieser Stelle bis zum Stop-Codon (einschließlich) (unterstrichen) gefolgt von einer BglII-Stelle und einem Xba I-Überstand.
  • Figure 00560001
  • Durch Nutzung einer einzigen internen EcoRI-Stelle in der CAT-Sequenz wurden das SfaNI/EcoRI- sowie das EcoRI/ScaI-Fragment von pCM7 unabhängig voneinander herausgeschnitten und von Acrylamidgelen gereinigt. Das SfaNI/EcoRI-Fragment wurde sodann mit dem durch Verschmelzen ("Annealing") der Oligonucleotide 1 und 2 gewonnenen synthetischen DNA-Fragment in ein pUC19-Plasmid ligiert, das mit XbaI und EcoRI geschnitten worden war. Das EcoRI/Seal-Fragment wurde auf gleiche Weise in ein XbaI- und EcoRI-aufgeschlossenes pUC19-Plasmid unter Verwendung der Oligonucleotide 3 und 4 kloniert. Die ligierte DNA wurde in kompetente DH5a- Bakterien transformiert, amplifiziert, isoliert und mittels Restriktionsanalyse unter Anwendung von Standardverfahren sortiert.
  • Die Rekombinanten mit dem SfaNI-haltigen Insertionsabschnitt wurden mit XbaI und EcoRI geschnitten, und die Plasmide mit dem Scal-Insert wurden mit EcoRI und BglII geschnitten. Die Fragmente wurden von Acrylamidgel gereinigt und zusammen in dem Vektor pPHV kloniert, der mit XbaI und BglII geschnitten worden war. Nach erfolger Transformation wurden weiße Kolonien gezüchtet, durch Endonuclease-Aufschließung analysiert, und wurden die Sequenzen ausgewählter Klone analysiert. Der endgültige Klon, pCATcNS2, wurde in großen Mengen gezüchtet, und die Sequenz ab den flankierenden pUC-Sequenzen bis zu 300 nt in das CAT-Gen hinein wurde analysiert, wobei keine Unstimmigkeiten mit der gewünschten Sequenz festgestellt werden konnten, abgesehen von einer stummen G/A-Austauschmutation in dem CAT-Gen.
  • 7.1.1 VIREN UND ZELLEN
  • Influenza-A/P/8/34- und -A/WSN/33-Viren wurden in embryonierten Eiern bzw. in MDCK-Zellen (Ritchey u.a., 1976, J. Virol. 18: 736-744; Sugiura u.a., 1972, J. Virol. 10: 639-647) gezüchtet. Eine RNP-Transfektion wurde an 293-Zellen vom Menschen (Graham u.a., 1977, J. Gen. Virol. 36: 59-72) sowie an Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK-Zellen) (Sugiura u.a., 1972, Ref. wie oben) durchgeführt.
  • 7.1.2 KONSTRUIEREN VON PLASMIDEN
  • Das von pUC19 abgeleitete Plasmid pIVACAT1 enthält den Codierungsbereich des Chloramphenicol-Acetyltransferase-(CAT-)Gens, flankiert von den nichtcodierenden Sequenzen von Influenza-A/PR/8/34-RNA-Segment 8. Dieses Gebilde wird unter der Steuerung des T7-Polymerase-Promotors so plaziert, daß das RNA-Transkript IVACAT1 folgendes beinhaltet – gelesen von 5' nach 3': 22 Nukleotide, abgeleitet von dem 5'-Ende der Influenzavirus-NS-RNA, eine 8 nt lange Linker-Sequenz einschließlich einer BglII-Restriktionsstelle, das CAT-Gen in Minus-Polarität und 26 nt, abgeleitet von dem 3'-Ende der Influenzavirus-NS-RNA (11).
  • Das Plasmid pIVACAT1 wurde folgendermaßen hergestellt: Um das korrekte 5'-Ende in pIVCAT1 zu erhalten, wurde das von Plasmid pCM7 (Pharmacia) gewonnene EcoRI-Scal-Fragment an ein aus zwei synthetischen Oligonucleotiden gebildetes DNA-Fragment ligiert. Die Sequenz dieser Oligonukleotide lautet:
    Figure 00570001
  • Für das 3'-Ende des Insertionsabschnitts in pIVACAT1 wurde das SfaNI-EcoRI-Fragment des CAT-Gens an ein DNA-Fragment bestehend aus den nachgenannten synthetischen Oligonukleotiden ligiert:
    Figure 00570002
  • Die Oligonukleotide waren in einem DNA-Synthesegerät von Applied Biosystems synthetisiert worden. Diese 5'- und 3'-Konstruktionen wurden in pUC19-Schaukelvektoren ("shuttle vectors"), die mit XbaI und EcoRI aufgespalten worden waren, ligiert, aufgezogen, mit EcoRI/BglII (5'-Bereich) und XbaI/EcoRI (3'-Bereich) herausgeschnitten und in das mit BglII/XbaI geschnittene Plasmid pPHV ligiert. Letztgenanntes Plasmid entspricht dem in Abschnitt 6 beschriebenen pV-WT bis auf die Tatsache, daß es eine BglII-Stelle beinhaltet, die die nichtcodierenden terminalen Sequenzen des NS-RNA-Segments des Influenza-A-Virus trennt. Der fertige Klon pIVACAT1 (1) wurde gezüchtet, und die DNA-Sequenz wurde teilweise analysiert, beginnend bei den flankierenden pUC-Sequenzen und bis in das CAT-Gen hinein. Es wurden abgesehen von einer stummen G/A-Austauschmutation an Position 106 bezogen auf den Anfang der IVACATT1-RNA in dem CAT-Gen gegenüber den erwarteten Sequenzen keine Änderungen festgestellt.
  • 7.1.3 T7-RNA-TRANSKRIPTION
  • Das Plasmid pIVACAT1 wurde mit HgaI (Abb. II) aufgespalten, um eine ablaufende ("run-off'-)Transkription zu ermöglichen. Der durch dieses Enzym erzeugte 5 nt lange Überstand wurde mit Klenow-Enzym (BRL) aufgefüllt, und die DNA wurde über einer Spin-Säule (Boehringer) gereinigt. Die T7-Polymerase-Reaktion erfolgte anhand von Standardverfahren in Gegenwart von Rnasin (Promega). Matrizen-DNA wurde von Rnase-freier Dnase I (Promega) entfernt. Die RNA wurde über "Qiagen tip-5"-Säulen (Qiagen, Inc.) gereinigt und mit Hilfe von 4 % Polyacrylamidgelen, die Silber eingefärbt waren, quantitativ bestimmt. In gleicher Weise wurde NS-RNA aus dem Plasmid pHgaNS präpariert.
  • 7.1.4 REINIGUNG VON INFLUENZA-A-VIRUS-POLYMERASE UND IN-VITRO-TRANSKRIPTION
  • Der RNA-Polymerase-Komplex wurde von Influenza A/PR/8/34 wie in Abschnitt 6 beschrieben gereinigt. In-vitro-Transkriptionen von kalter IVACAT1- oder HgaNS-RNA-Matrize wurden unter Anwendung der in Abschnitt 6 beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Radioaktiv markierte Transkripte wurden auf 4 % Acrylamidgelen analysiert.
  • 7.1.5 RNP-TRANSFEKTION VON MDCK- und 293-ZELLEN
  • 35-mm-Schalen, die ca. 106 Zellen enthielten, wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1 ml einer Lösung aus 300 μg/ml DAEA-Dextrin, 0,5 % DMSO in PBS/Gelatine (0,1 mg/ml Gelatine) behandelt. Nach Entfernung dieser Lösung wurden 200 μg von μl PBS/Gelatine, die 1 μg IVACAT1-RNA (1-2 ml) enthielt, 20 μl des gereinigten Polymerase-Zubereitung und 4 μl Rnasin zu den Zellen hinzugegeben und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde gradienten-gereinigtes Influenza A/WSN/33-Virus (MOI 2-10) hinzugefügt. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C wurden 2,5 ml von entweder "DMEM + 10 % FCS"-Medium (293-Zellen) oder MEM-Medium (MDCK-Zellen) hinzugegeben. In einigen Experimenten wurden MDCK-Zellen zuerst infiziert und anschließend RNP-transfiziert. Die Zellernte erfolgte in NET-Puffer oder in Medium unter Verwendung einer Gummifahne ("rubber policemen") (MDCK-Zellen) oder durch leichte Suspension (293-Zellen). Die Zellen wurden nach unten geschleudert, und die Pellets wurden in 100 μl 0,25 M Tris-Puffer, pH-Wert 7,5, erneut suspendiert. Die Proben wurden anschließend drei Frost/Tau-Zyklen unterzogen, und die Zelltrümmer wurden pelletiert. Der Überstand wurde für CAT-Untersuchungen verwendet.
  • 7.1.6 ÜBERTRAGUNG VON VIRUS AUS RNP- TRANSFIZIERTEN ZELLEN
  • MDCK-Zellen wurden mit Helfervirus infiziert und zwei Stunden später wie oben beschrieben RNP-transfiziert. Nach 1 Stunde wurden Zellen und Medien gesammelt, und die Zellen wurden nach unten geschleudert. Es wurden 100 μl der überstehenden virushaltigen Medien zu den 35 mm Schalen mit MDCK-Zellen gegeben. Nach 12 Stunden wurden diese Zellen und Medien gesammelt und auf CAT-Aktivität hin analysiert. In diesen überstehenden Medien enthaltenes Virus wurde für anschließende Runden der MDCK-Zell-Infizierung in 35 mm Schalen verwendet.
  • 7.1.7 CAT-ANALYSEN
  • CAT-Analysen wurden entsprechend den Standardverfahren durchgeführt, adaptiert von Gorman u.a., 1982, Mol. Cell. Biol. 2: 1044-1051. Das zu untersuchende Material enthielt 10 μl 14C Chloramphenicol (0,5 μCi; 8.3 nM; NEN), 20 μl 40 mM Acetyl-CoA (Boehringer) und 50 μl Zellextrakte in 0,25 M Tris-Puffer (pH 7,5). Die Inkubationszeiten betrugen 16 bis 18 Stunden.
  • 7.2 ERGEBNISSE
  • Es wurden rRNA-Matrizen aus mit HgaI aufgeschlossenem, endenaufgefülltem/linearisiertem pCATcNS unter Verwendung von Bakteriophage-T7-RNA-Polymerase wie in Abschnitt 6 beschrieben hergestellt. Die rRNA-Matrizen wurden mit dem gemäß der Beschreibung in Abschnitt 6.1.1 hergestellten viralen RNA-Polymerase-Komplex kombiniert, und die resultierenden rRNPs wurden verwendet, um MDCK- und 293-Zellinien, die mit Influenza A/WSN/33 reinfiziert waren, zu transfizieren. In jeder mit den rRNPs transfizierten Zellinie wurden 6 Stunden nach Infizierung hohe CAT-Expressionsgrade erzielt. Außerdem erzeugten in 24 Stunden nach erfolgter Infektion erzielte Virus-Vorräte große Mengen an CAT-Enzym nach anschließender Übertragung in MDCK-Zellen. Das CAT-RNP wurde in Viruspartikel verpackt.
  • 7.2.1 SYNTHESE VON IVACAT1-MATRIZEN-RNA
  • Zum Zwecke der Untersuchung der Transkriptions- und Replikationssignale von Influenza A-Virus-RNAs in vitro konstruierten wir das Plasmid pIVACAT1 (H), das die Synthese eines NS-RNA-ähnlichen Transkripts steuert. Diese RNA teilt sich die 22 5'-terminalen- und die 26 3'-terminalen Nucleotide mit der NS-RNA des Influenza-A/PR/8/34-Virus und enthält statt der codierenden Sequenzen für die NS1- und NS2-Proteine diese für ein CAT-Protein voller Länge. Für Klonierungszwecken enthält es ferner acht zusätzliche Nucleotide einschließlich einer BglII-Stelle zwischen dem Stop-Codon des CAT-Gens und der Reihe von U's in dem nichtcodierenden 5'-Bereich. Der an die nichtcodierenden 5'-Sequenzen angrenzende T7-Promotor sowie die HgaI-Stelle hinter dem 3'-Ende erlauben einen Zuschnitt des 5'- und des 3'-Endes auf Maß. Eine ablaufende Transkription unter Hinzuziehung von T7-Polymerase generiert eine 716 nt lange RNA: die Streifen 2-4 in 12 zeigen, daß diese RNA von bestimmter Länge und kürzer ist als die 890 nt lange Marker-NS-RNA, die durch T7-Transkription von pHgaNS (Streifen 1) hergestellt worden ist.
  • 7.2.2 Die IVACAT1-RNA WIRD IN VITRO DURCH DIE INFLUENZA A-VIRUS-RNA-POLYMERASE TRANSKRIBIERT
  • In den in Abschnitt 6 beschriebenen Beispielen wurde aufgezeigt, daß synthetisch hergestellte RNAs, die an dem 3-Ende die 15 3'-terminalen Nucleotide von Segment 8 von Influenzavirus-RNA enthalten, in vitro anhand von gereinigter Influenza-A-Virus-RNA-Polymerase transkribiert werden können. Wir testeten, ob sich unmarkierte 3VACAT1-RNA auf ähnliche Weise transkribieren lassen würde. 12 Streifen 5 zeigt, daß die In-vitro-Transkriptionsreaktion eine RNA diskreter Länge und vergleichbarer Größe wie das Produkt der T7-Transkriptionsreaktion hervorbringt, was die Synthese eines die volle Länge aufweisenden Produkts vermuten läßt.
  • 7.2.3 RNA-TRANSKRIPTION UND CAT-AKTIVITÄT
  • Da sich die rekombinante CAT-RNA in vitro herstellen läßt, wurde ein System konstruiert, um zu testen, ob diese RNA in vitro erkannt und repliziert werden kann (13). Rekombinante RNA wurde mit gereinigter Polymerase gemischt, um die Bildung von viralen RNP-ähnlichen Partikeln zu ermöglichen. Um den Zusammenschluß zu erleichtern, wurde das RNA/Polymerase-Gemisch vor der RNP-Transfektion 30 Minuten lang bei 30°C in Transkriptionspuffer inkubiert. In einigen Experimenten wurde dieser Preinkubationsschritt ausgelassen. Vor oder nach den RNP-Transfektionen erfolgte die Infektion mit Influenza-A/WSN/33-Virus, da die Produktion von viralem Polymeraseprotein als erforderlich für eine effiziente Amplifikation des Gens vermutet wurde. Bei den eingesetzten Zellen handelte es sich entweder um MDCK-Zellen, die für eine Infektion mit Influenza-A/WSN/33-Virus leicht empfänglich sind, oder um 293-Zellen vom Menschen, die die Infektion mit geringerer Geschwindigkeit unterstützen.
  • Um herauszufinden, ob die IVACAT1-RNA mit Minus-Polarität in vivo amplifiziert und transkribiert werden könnte, wurde ein Experiment in 293-Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden mit RNP transfiziert, eine Stunde später mit Virus infiziert und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion geerntet. Die 14A zeigt, daß sich zu frühen Zeitpunkten nach der Infektion nur Hintergrundgrade von CAT-Aktivität feststellen lassen (Streifen 5, 7 und 9). Sieben Stunden nach der Virusinfektion jedoch zeigten sich bedeutende Grade an CAT-Aktivität (Streifen 11). Ein ähnliches Ausmaß an CAT-Aktivität wurde zwei Stunden später festgestellt (Streifen 13). Hintergrundgrade an CAT-Aktivität zeigte sich zu jedem Zeitpunkt in den schein-transfizierten Zellen (Streifen 6, 8, 10, 12 und 14) und in nicht mit A/WSN/33-Virus infizierten Kontrollzellen (Streifen 1 bis 4).
  • Eine vorausgehende Inkubation des RNA/Polymerase-Komplexes war für eine erfolgreiche RNP-Transfektion nicht erforderlich. Wie in 14B, Streifen 2 und 3, ersichtlich, könnte eine Preinkubation tatsächlich eine Abnahme der CAT-Aktivität bewirken, vermutlich wegen eines RNA-Abbaus ("Degradation") während der Preinkubation. In einem anderen Kontrollexperiment wurde der Schritt der Infektion von RNP-transfizierten Zellen durch Helfervirus ausgelassen. (14B, Streifen 4 und 5). Da diese Streifen keine CAT-Aktivität zeigen, folgern wir, daß die IVACATT1-RNA speziell durch die von dem Helfervirus beigesteuerte Protein-Mechanismus amplifiziert wird. In einem zusätzlichen Kontrollexperiment wurde nackte RNA in Zellen transfiziert, die anschließend mit Helfervirus infiziert oder schein-infiziert wurden. Wieder wurde keine CAT-Aktivität in diesen Proben festgestellt (14B, Streifen 6 bis 9). Und schließlich zeigten virusinfizierte Zellen, die nicht mit rekombinanter CAT-RNP transfiziert waren, auch keine endogene Acetylierungsaktivität (14B, Streifen 10). Es scheint somit, daß das Hinzufügen der gereinigten Polymerase zu der rekombinanten RNA sowie die Infizierung von Zellen mit Helfervirus für die erfolgreiche Expression des CAT-Enzyms von Bedeutung ist.
  • Es wurden ebenso Experimente unter Hinzuziehung von MDCK-Zellen durchgeführt, der üblichen Gewebekultur-Wirtszelle für Influenzavirus (14C). Bei einer Transfektion des rekonstituierten rekombinanten CAT-RNP-Komplexes eine Stunde vor der Virusinfektion zeigte sich 7 Stunden nach der Virusinfektion nur eine geringe CAT-Aktivität (14C, Streifen 1). Bei einer RNP-Transfektion 2 Stunden nach der Virusinfektion war die CAT-Expression 7 Stunden nach der Virusinfektion stark erhöht (14C, Streifen 3). Daher sind MDCK-Zellen auch lebensfähige Wirtszellen für diese Experimente.
  • 7.2.4 DIE CAT-RNP WIRD IN VIRUSPARTIKEL VERPACKT
  • Da die rekombinante CAT-RNA über Helfervirus-Funktionen in vivo repliziert werden kann, untersuchten wir, ob in RNP-transfizierten und mit Helfervirus infizierten Zellen produziertes Virus das CAT-Gen enthielten. In diesem Experiment wurden MDCK-Zellen eingesetzt, da sie höhere Titer von infektösem Virus liefern als 293-Zellen. MDCK-Zellen wurden mit A/WSN/33-Virus infiziert, 2 Stunden später RNP-transfiziert und über Nacht inkubiert. 14 Stunden nach der Infizierung wurden Medien geerntet und Zellen pelletiert. Virus-Überstand wurde dann zur Infizierung neuer MDCK-Zell-Monolayers verwendet. Das Inokulum wurde nach einer Stunde entfernt, und Zellen wurden 12 Stunden nach Infizierung geerntet und auf CAT-Aktivität hin analysiert. Die 15 zeigt, daß das Viruspräparat einen CAT- Aktivitätsgrad induziert (Streifen 2 und 3), der erheblich über dem des Kontrollexperiments liegt (Streifen 1). In diesem Fall bewirkte die Addition von Helfervirus zu dem Inokulum keine Erhöhung der CAT-Aktivität (Streifen 4). Eine weitere Impfung von frischen MDCK-Zellen mit Virus aus dem Überstand führte nicht zu einer meßbaren Induktion von CAT-Aktivität. Dies überrascht nicht, da es keinen selektiven Druck gibt, das CAT-Gen in diesen Viruspräparaten festzuhalten. Wir schlossen die Möglichkeit einer Übertragung des Original-RNA/Polymerase-Komplexes durch Vorbehandlung des Inokulums mit RNAse aus. Diese Behandlung zerstört virale RNPs von Influenzavirus (Pons u.a., 1969, Virology 39: 250-259; Scholtissek und Becht, 1971, J. Gen. Virol. 10:11-16.
  • 8 SICHERSTELLUNG VON INFEKTIÖSEN INFLUENZAVIREN MITTELS RNA ABGELEITET VON SPEZIELLEN REKOMBINANTEN DNAS
  • Die in den nachfolgenden Unterabschnitten beschriebenen Experimente zeigen die Sicherstellung von infektiösen Influenzaviren mittels RNA auf, die von speziellen rekombinanten DNAs abgeleitet ist. RNAs, die dem Neuraminidase-(NA-)Gen von Influenza-A/WSN/33-Virus (WSN-Virus) entsprechen, wurden in vitro ausgehend von den geeigneten Plasmid-DNAs transkribiert und – nach Hinzufügen von gereinigtem Influenzavirus-Polymerase-Komplex (wie in Abschnitt 6.1.1 beschrieben) – in MDBK-Zellen transfiziert, wie in Abschnitt 7 beschrieben. Eine Reinfektion mit Helfervirus, dem das WSN-NA-Gen fehlte, führte zur Freisetzung von Viren, die das WSN-NA-Gen enthielten. D.h., diese Technologie ermöglicht die Konstruktion von infektiösen Influenzaviren anhand von cDNA-Klonen und ortsspezifischer Mutagenese ihrer Genome. Desweiteren kann diese Technologie die Konstruktion von chimärischen Influenzaviren gestatten, die als wirksame Vektoren zur Genexpression in Gewebekulturen vom Menschen oder vom Tier eingesetzt werden können.
  • Die in den Abschnitten 6 und 7 beschriebenen Experimente zeigen, daß die 15 3'-terminalen Nucleotide von Minusstrang-Influenzavirus-RNAs ausreichen, um die Transkription in vitro anhand von gereinigten Influenzavirus-Polymeraseproteinen zu ermöglichen. Außerdem zeigen die Untersuchungen, bei denen die Reportergen-Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) eingesetzt wird, daß die 22 5'-terminalen und die 26 3'-terminalen Nucleotide der viralen RNAs all die Signale enthalten, die für die Transkription, Replikation und Verpackung von Influenzavirus-RNAs erforderlich sind. Als ein Zusatz zu diesen Ergebnissen wurde ein Plasmid, pT3NAv konstruiert, das das komplette NA-Gen von Influenza-A/WSN/33-Virus nach einem gestutzten T3- Promotor enthielt (16). Daher bringt die fortlaufende ("runoff'-)Transkription dieses an der Ksp632I-Stelle geschnittenen Plasmids eine RNA hervor, die mit dem echten genomischen NA-Gen des WSN-Virus identisch ist (17, Streifen 3). Diese RNA wurde sodann mit gereinigter Polymerase (gereinigt wie in Abschnitt 6.1.1 beschrieben) inkubiert und in einem Ribonucleoprotein-(RNP-)Transfektions-Experiment eingesetzt, um die Sicherstellung von infektiösem Virus mittels Helfervirus, das die WSN-Virus-NA nicht enthielt, zu gestatten. Die Auswahl des WSN-HK-Helfervirus basierte auf dem Bedarf an einem strengen Selektionssystem, mit dessen Hilfe ein sichergestelltes Virus isoliert werden kann. An früherer Stelle ist aufgezeigt worden, daß das WSN-HK-Virus in MDCK-Zellen nur dann Plaques bilden kann, wenn dem Medium Protease hinzugefügt wird. Dies steht in markantem Kontrast zu dem (mit WSN-HK-Virus bis auf das Neuraminidase-Gen isogenen) WSN-Virus, das in Abwesenheit von Protease sofort in MDBK-Zellen repliziert und große, leicht sichtbare Plaques bildet (Schulmann u.a., 1977, J. Virol. 24:170-176).
  • 8.1 MATERIAL UND VERFAHREN
  • 8.1.1. VIREN UND ZELLEN
  • Influenza-A/WSN/33-Virus und -A/WSN-HK-Virus wurden in Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK-Zellen) bzw. embryonierten Eiern gezüchtet (Sugiura u.a., 1972, J. Virol. 10: 639-647; Schulman u.a., 1977, J. Virol. 24:170-176). Ebenso wurde Influenza-A/PR/8-Virus in embryonierten Eiern gezüchtet. Madin-Darby-Rindernierenzellen (MDBK-Zellen) wurden für die Transfektionsexperimente sowie für die Selektion von sichergestelltem Virus eingesetzt (Sugiura u.a., 1972, J. Virol. 10: 639-647).
  • 8.1.2 KONSTRUIEREN VON PLASMIDEN
  • Die Plasmide pT3NAv, pT3NAv mut 1 und pT3NAv mut 2 wurden durch Polymerase-Kettenreaktion-(PCR-)gesteuerte Mutagenese unter Verwendung einer klonierten Kopie des WSN NA-Gens, das gemäß Standardverfahren gewonnen wurde, hergestellt (Buonagurio u.a., 1986, Science 232: 980-982). Zur Herstellung von pT3NAv wurden die nachgenannten Primer eingesetzt:
    Figure 00650001
  • Nach 35 Zyklen in einer Temperaturwechselbeanspruchungseinrichtung (Coy Lab Products, MI) wurde das Produkt der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit EcoRI und HindIII aufgeschlossen und in pUC 19 kloniert. Das Plasmid pT3NAv mut 1 wurde auf gleiche Weise konstruiert, abgesehen davon, daß die Primer-Sequenz verändert war (16). Das Plasmid pT3NAv mut 2 wurde durch Kassetten-Mutagenese konstruiert durch Aufschluß von pT3NAv mit PstI und NcoI und Religation in Gegenwart der synthetischen Oligonucleotide
    Figure 00650002
  • Die Oligonucleotide wurden in einem DNA-Synthetisiergerät von Applied Biosystems hergestellt. Die fertigen Klone pT3NAv, pT3NAv mut 1 und pT3NAv mut 2 wurden gezüchtet, und die DNAs wurden teilweise sequenziert, beginnend mit den flankierenden pUC19-Sequenzen und bis in die codierenden Sequenzen des NA-Gens hinein. Die Mutationen in pT3NAv mut 2 wurden ebenso durch Sequenzanalyse bestätigt.
  • 8.1.3 REINIGUNG VON INFLUENZA-A-VIRUS-POLYMERASE UND RNP-TRANSFEKTION IN MDBK-ZELLEN
  • Der RNA-Polymerase-Komplex wurde von Influenza-A/PR/8/34-Virus gereinigt wie in Abschnitt 6.1.1 beschrieben und wurde anschließend zur RNP-Transfektion in MDBK-Zellen eingesetzt unter Anwendung des in Abschnitt 7 beschriebenen Protokolls, wobei jedoch in Abweichung dazu WSN-HK-Virus als Helfervirus mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 1 eingesetzt wurde. Für die RNP-Transfektion verwendeten RNAs wurden durch Phenolextraktion des gereinigten Virus oder durch Transkription (unter Einsatz von T3-Polymerase) von pT3NAv, pT3NAv mut 1 und p3NAv mut 2 gewonnen. Alle Plasmide wurden mit Ksp632I aufgeschlossen, endengefüllt mit Klenow-Enzym (BRL) und anschließend in einer fortlaufenden ("runoff'-)Reaktion wie in Abschnitt 7 beschrieben transkribiert.
  • 8.2 ERGEBNISSE
  • 8.2.1 SICHERSTELLUNG VON INFEKTIÖSEM INFLUENZAVIRUS IN MDBK-ZELLEN MITTELS VON REKOMBINANTER PLASMID-DNA ABGELEITETER RNA
  • Es wurde ein Plasmid, pT3NAv, so konstruiert, daß es das vollständige NA-Gen des Influenza-A-Virus hinter (in 3'-Richtung) einem gestutzten T3-Promotor enthält (16). Eine fortlaufende ("runoff'-)Transkription des an der Ksp632I-Stelle geschnittenen Plasmids bringt eine RNA hervor, die in der Länge mit dem echten genomischen NA-Gen des WSN-Virus identisch ist (17, Streifen 3). Diese RNA wurde sodann mit gereinigter Polymerase inkubiert und in einem Ribonucleoprotein(RNP-)Transfektionsexperiment eingesetzt, um die Sicherstellung von infektiösem Virus anhand von Helfervirus zu ermöglichen. Die Auswahl des WSN-HK-Virus als Helfervirus basierte auf dem Bedarf an einem starken Selektionssystem zur Isolierung eines sichergestellten Virus. An anderer Stelle wurde bereits gezeigt, daß das WSN-N-Virus nur Plaques in MDBK-Zellen bilden kann, wenn dem Medium Protease hinzugefügt wird (Schulman u.a., 1977, J. Virol. 24:170-176). Dies steht in markantem Kontrast zu dem (bis auf das Neuraminidasegen mit WSN-HK-Helfervirus isogenen) WSN-Virus, das sich in Gegenwart von Protease problemlos in MDBK-Zellen repliziert und große, leicht sichtbare Plaques bildet (Sugiura u.a., 1972, J. Virol. 10: 639-647). MDBK-Zellen wurden zunächst mit dem WSN-HK-Helfervirus infiziert und dann eine Stunde nach der Virusinfektion RNP-transfiziert. Nach Inkubation über Nacht in Gegenwart von 20 μg/ml Plasminogen wurde Überstand von diesen Zellen in MDBK-Zellen in Abwesenheit von Protease in dem Medium zur Amplifikation und Plaques-Bildung eingebracht. Das Auftauchen von Plaques in MDBK-Zellen (Schulman u.a., 1972, J. Virol. 10:639-647) zeigte die Gegenwart von das WSN-Virus-NA-Gen enthaltendem Virus an, da in Kontrollexperimenten der Überstand von nur mit dem WSN-HK-Virus infizierten Zellen keine Plaques bildete. In einem typischen Experiment, das die Verwendung einer 35-mm-Schale für die RNP-Transfektion impliziert, wurden 2,5 × 102 Plaques festgestellt.
  • In einem anderen Kontrollexperiment wurde synthetische NA-RNA eingesetzt, die von dem Plasmid pT3NAv mut 1 (16) abgeleitet worden war. Diese RNA unterscheidet sich von der von pT3NAv durch eine einzige Nucleotid-Deletion in der nichtübersetzten Region des 5'-Endes gewonnenen Wildtyp-NA-RNA (16). Eine RNP-Transfektion von MDBK-Zellen mit dieser RNA sowie eine Reinfektion mit WSN-HK-Virus führte nicht zur Bildung von sichergestelltem Virus. Dieses negative Ergebnis läßt sich leicht dadurch erklären, daß, wie wir in den Abschnitten 6 und 7 erklärt haben, die wesentlichen Sequenzen für die Erkennung von viraler RNA durch virale Polymerase sowie die Verpackungssignale innerhalb der 3'- und 5'-terminalen Sequenzen der viralen RNAs angesiedelt sind. Wir können jedoch nicht die Möglichkeit ausschließen, daß die Sicherstellung von Virus unter Einsatz dieser mutierten RNA auftritt, obgleich in einer nichterfaßten Häufigkeit.
  • 8.2.2 RNA-ANALYSE VON SICHERGESTELLTEM VIRUS
  • In dem Sicherstellungsexperiment ("rescue experiment") gewonnenes Virus wurde plaques-gereinigt, in MDBK-Zellen amplifiziert, und RNA wurde aus diesem Präparat extrahiert. Die RNA wurde sodann mittels Gelelektrophorese unter Verwendung von Polyacrylamidgel analysiert. Die 17 zeigt die RNA des Helfervirus WSN-HK (Streifen 1) und die synthetische NA-RNA (Streifen 3), die durch T3-Polymerase vom Plasmid pT3NAv transkribiert worden war. Das Migrationsmuster der RNAs des sichergestellten Virus (Streifen 2) ist mit dem des Kontroll-WSN-Virus identisch (Streifen 4). Auch die NA-RNAs in den Streifen 2 und 4 wandern an derselben Stelle wie die von cDNA abgeleitete NA RNA (Streifen 3) und schneller als die HK-Virus-NA-Streifen in dem Helfer-WSN-HK-Virus (Streifen 1), Diese Versuche unterstützten die Schlußfolgerung, daß als Ergebnis der RNP-Transfektion infektiöses Virus gebildet wurde, das von cDNA abgeleitete WSN-Virus-NA-RNA enthält.
  • 8.2.3 SICHERSTELLUNG VON INFEKTIÖSEM INFLUENZAVIRUS UNTER VERWENDUNG VON VIRION-RNA
  • In einem anderen Transfektionsexperiment wurde aus gereinigtem WSN-Virus extrahierte RNA eingesetzt. Wird diese nackte RNA zusammen mit den Polymeraseproteinen in mit Helfervirus infizierte Zellen transfiziert, so läßt sich die Sicherstellung von zur Replikation in MDBK-Zellen fähigem WSN-Virus feststellen. Die in diesem Experiment aus einem amplifizierten Plaque isolierte RNA wird in 17, Streifen 5 analysiert und zeigt ein Muster, das von dem des Kontroll-WSN-Virus in Streifen 4 nicht unterscheidbar ist.
  • 8.2.4 EINBRINGUNG VON ORTSSPEZIFISCHEN MUTATIONEN IN DAS VIRUSGENOM
  • Die bislang beschriebenen Experimente implizieren die Gewinnung von Influenza-WSN-Virus. Da die in diesen Experimenten eingesetzte synthetische RNA mit dem echten WSN-NA-Gen identisch ist, konnte die unwahrscheinliche Möglichkeit der Verunreinigung mit Wildtyp-WSN-Virus nicht vollständig ausgeschlossen werden. Wir brachten daher fünf stumme Punktmutationen in dem Codierungsbereich des NA-Gens in dem Plasmid pT3NAv ein. Diese Mutationen wurden durch Kassetten-Mutagenese durch den Austausch des kurzen NcoI/PstI-Fragments in der Gegenwart des NA-Gens eingebracht. Die fünf Mutationen in der cDNA umfaßten eine C-in-T-Änderung an Stelle 901 und eine C-in-A-Änderung an Position 925, was die Schaffung einer neuen XbaI-Stelle bzw. die Zerstörung der ursprünglichen PstI-Stelle beinhaltete. Außerdem wurde der vollständige Serin-Codon an Position 887-889 des cDNA-Klons gegen ein Ersatz-Serin-Triplett ausgewechselt (17). Eine RNP-Transfektion dieser mutagenisierten RNA (pT3NAv mut 2) und eine Infizierung von MDBK-Zellen mit Helfervirus führte wiederum zur Sicherstellung eines WSN-ähnlichen Virus, das in MDBK-Zellen in Abwesenheit von zugesetzter Protease wuchs. Bei der Untersuchung der RNA dieses Virus durch Sequenzanalyse wurden alle fünf in der Plasmid-DNA (16) vorliegenden Punktmutationen in der viralen RNA (18) festgestellt. Da es äußerst unwahrscheinlich ist, daß sich diese Mutationen in dem Wildtyp-Influenza-WSN-Virus entwickelt haben, folgerten wir, daß die erfolgreiche Sicherstellung von fünf ortsspezifische Mutationen enthaltendem, infektiösem Influenzavirus durch RNP-Transfektion von gentechnisch hergestellter RNA erreicht wurde.
  • 9 BEISPIEL: SYNTHETISCHES REPLIKATIONSSYSTEM
  • In den im folgenden beschriebenen Experimenten wurde ein cDNA-Klon, der ein influenzavirus-ähnliches vRNA-Molekül produzieren kann, das für ein Reporter-Gen codiert, eingesetzt. Bei dieser resultierenden RNA handelt es sich um eine vRNA, die die Gegenrichtung der codierenden Region des Chloramphenicolacetyltransferase(CAT-)Gens anstelle der Gegenrichtung der codierenden Regionen für die Nicht-Strukturproteine NS1 und NS2 enthält (Lutjyes μ.a.,1989, Cell, 59:1107-1113). Diese rekombinante RNA (IVACAT-1) wurde mit gereinigten Influenzavirus-RNP-Proteinen inkubiert und in dem Versuch eingesetzt, ein nicht-influenzavirusabhängiges Replikationssystem zu entwickeln. Mäuse-Bindegewebs-C127-Zellen wurden mit Gemischen aus rekombinanten Vacciniaviren (Smith u.a., 1987, Virology, 160: 336- 345) infiziert und eine Stunde später mit der IVACAT-1-RNP transfiziert. Es wurden Gemische aus Vektoren eingesetzt, die die drei Polymerasen (PB2, PB1 und PA) sowie das Nucleoprotein exprimieren. Replikation und Transkription des synthetischen RNP wurden durch Überprüfen der Zellen auf CAT-Aktivität nach Inkubation über Nacht untersucht. Die 19 untersucht Zellen, die anfänglich mit vielen der möglichen Gemische aus den vier rekombinanten Vacciniaviren infiziert worden sind, auf die vorhandende CAT-Aktivität. 19, Streifen 4, ist eine positive Kontrolle, bei der das Influenza A/WSN/33-Virus anstelle der rekombinanten Vacciniaviren verwendet worden ist. CAT-Aktivität liegt sowohl in dieser Probe als auch in Zellen vor, die mit allen vier Vacciniavektoren Infiziert worden sind (19, Streifen 8 und 10). Zellen, die irgendwelche der Untersätze dieser vier Proteine exprimieren, produzierten kein nachweisbares CAT-Protein (19, Streifen 5-7, 9, 11, unveröffentlicht). Außerdem war auch transfizierte RNA, die nicht mit der gereinigten Polymerase inkubiert worden war, negativ in bezug auf CAT-Expression (Lutjyes u.w., 1989). Somit ist allein die Gegenwart der Proteine PB2, PB1, PA und NP erforderlich und ausreichend für RNP- Expression und Replikation in diesem System. Die erzielten CAT-Aktivitätsgrade in mit Vacciniavires infizierten Zellen sind reproduzierbar höher als die in Zellen, die mit Influenzavirus als Helfervirus infiziert worden sind. Die wahrscheinlichste Erklärung hierfür ist die, daß in mit Influenzavirus infizierten Zellen das CAT-RNP mit den endogenen viralen RNPs um aktive Polymerase konkurriert, während in dem von Vacciniavirus getragenen System das CAT-RNP das einzige vorhandene virusähnliche Molekül ist.
  • Eine Reihe von anderen Zellinien wurden sodann als Wirtszellen für dieses von Vacciniavirus getragene System getestet. Die 20A zeigt die Ergebnisse der Verwendung von MDBK-, HeLa-, 293- und L-Zellen. In keinem Fall wurde CAT-Aktivität festgestellt, wenn die Zellen mit Vektoren infiziert waren, die nur die 3 Polymeraseproteine exprimieren, während eine starke CAT-Aktivität erreicht wurde, wenn der zusätzliche, NP-Expression induzierende Vaccinia-Vektor noch hinzugefügt wurde.
  • An früherer Stelle wurde bereits eine Zellinie (bezeichnet mit 3PNP-4) konstruiert, die grundlegend geringe Grade der Proteine PB2, PB1 und PA und hohe Grade des Proteins NP exprimiert. Diese Zellen können das Wachstum von ts-Mutanten komplementieren, die entweder auf das PB2- oder das NP-Gensegment abbilden (Krystal u.a., 1986; Li u. a., 1989). Da die Replikation durch rekombinante Vacciniavirus-Vektoren nur von diesen Proteinen abhängt, war es denkbar, daß diese Zellinie in der Lage sein könnte, das synthetische CAT-RNP bei Nichtvorliegen irgendeiner Virusinfektion zu amplifizieren und zu exprimieren. Als dieses Experiment jedoch durchgeführt wurde, wurde keine nachweisbare CAT-Aktivität festgestellt (Daten nicht gezeigt). Um die Gründe zu erforschen, warum diese Zellinie eine Replikation nicht unterstützte, wurden Gemische aus rekombinanten Vacciniaviren eingesetzt, um 3PNP-4-ellen zu infizieren. Wie erwartet förderte das Hinzufügen der vier Polymerase-Proteine die Expression von CAT (20B, Streifen 2). Die 20B, Streifen 3, zeigt, daß das erforderliche Mindestgemisch an Vektoren zur Induzierung von CAT-Aktivität in 3PNP-4-Zellen die Vektoren beinhalten muß, die nur die Proteine PB1 und PA exprimieren. Die stabilen Grade von PB2- und NP-Protein in 3PNP-4-Zellen sind ausreichend, doch dieGrade von PB1 und PA liegen unter dem Schwellenwert für CAT-Expression bei Nichtvorhandensein von Helfervirus. Dies korreliert mit dem Komplementierungsphänotypus, der von diesen Zellen aufgezeigt wird, da nur das Wachstum von PB2- und NP-Mutanten und nicht von PB1- und PA- Mutanten bei nicht-permissiven Temperaturen abgefangen werden kann (Desselberger u.a., 1980).
  • Da die synthetische IVACAT-1-RNA negative Polarität aufweist, kann CAT nur über die Transkription ausgehend von dem RNP-Molekül synthetisiert werden. Theoretisch lassen sich nachweisbare Grade von CAT entweder durch Transkription ausgehend von der transfizierten Eingangs-RNP (äquivalent mit primärer Transkription) oder zuerst durch Amplifikation von RNP und anschließende Transkription (was die RNP-Replikation erforderlich macht) oder eine Kombination aus beidem erzielen. Frühere Arbeiten jedoch, die eine Infektion mit Influenzavirus einsetzten, um die Expression des CAT-Proteins zu fördern, zeigten, daß eine nachweisbare Expression nur dann auftrat, wenn die Eingangs-CAT-RNP repliziert wurde (Lutjyes u.a., 1989). Dies wurde durch die Verwendung einer zweiten CAT-RNA, IVACAT-2, gezeigt, die 3 Mutationen innerhalb der 12 Basen an dem 5'-Ende der viralen RNA enthält (Lutjyes u.a., 1989). Diese 12 Basen umfassende Region unter allen acht Gensegmenten wird in allen Influenza-A-Viren beibehalten (Lutjyes u.a., 1980). Diese synthetische IVACAT-2-RNP ist zur Transkription durch die Influenzavirus-Polymerase in der Lage, jedoch repliziert sie sich nicht, und die CAT-Aktivität blieb bei Transfektion in mit Influenzaviren infizierten Zellen unerkannt (Lutjyes u.a., 1989). Daher produziert die primäre Transkription ab der Eingangs-RNA nicht nachweisbare Proteingrade in virusinfizierten Zellen. Entsprechend verwendeten wir diese Mutanten-RNA zur Untersuchung der Frage, ob die von Vaccinia-Vektor exprimierten Influenzaproteine CAT-Aktivität nur durch primäre Transkription einer Eingangs-RNP induzieren oder eine Amplifikation durch Replikation und anschließende Transkription ermöglichen. C127-Zellen wurden mit den rekombinanten Vacciniaviren infiziert und anschließend entweder mit IVACAT-1- oder IVACAT-2-erzeugten RNPs transfiziert. Die 20C zeigt, daß sich geringe CAT-Aktivitätsgrade in mit IVACAT-2-RNP transfizierten Zellen nachweisen lassen (Streifen 2). Eine quantitative Bestimmung ergibt, daß 0,5-1 % des Chloramphenicols in eine acetylierte Form umgewandelt wird gegenüber 0,2 bis 0,4 % in scheintransfizierten Banden (nicht gezeigt). Weitaus höhere Aktivitätsgrade sind jedoch in Zellen gegeben, die mit CAT-1-RNP transfiziert sind (Streifen 1; routinemäßige 15- bis 50%ige Umwandlung von Chloramphenicol), was darauf hinweist, daß in diesen Zellen eine Amplifikation stattfindet. Daher ist dieses durch das rekombinante Vacciniavirus getragene System sequenzspezifisch und erfahren die RNPs eine Replikation.
  • In den beschriebenen Experimenten war weder das Protein NS1 noch das Protein NS2 für die RN-Replikation erforderlich. Zwar ist die Funktion dieser Proteine nicht bekannt, doch es wurde vermutet, daß sie eine wichtige Rolle bei der Replikation spielen könnten, da beide Proteine in großen Mengen synthetisiert wurden und in dem Zellkern vorliegen (Krug u.a., 1989; Young u.a., 1983; Greenspan u.a., 1985; Lamb u.a., 1984). Ausgehend von den präsentierten Daten sind diese Proteine für die Genom-Replikation nicht unbedingt erforderlich. Es ist anzunehmen, daß diese Proteine in bezug auf die Replikation von RNP in Wirklichkeit eine Nebenrolle spielen, wie z.B. Wechselwirkung mit Wirtsfaktoren, Regulation der Expression von viralen Genen oder irgendeine Funktion in Verbindung mit der Verpackung der RNP in infektiösen Virionen. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, daß eine Funktion dieser NS-Proteine durch ein Vacciniavirus-Protein komplementiert sein kann, wenngleich bei einer Überprüfung keine erkennbaren Ähnlichkeiten zwischen dem Protein NS1 bzw. NS2 und bekannten Vacciniavirus-Proteinen festgestellt werden konnten. Die gegensätzlichen Eigenschaften dieser beiden Viren widersprechen auch einem komplementierenden Vacciniavirus-Protein, da Vaccinia ein großes doppelsträngiges DNA-Virus ist, das sich ausschließlich im Cytoplasma repliziert, während das Influenzavirus ein RNA-Virus mit negativer Polarität ist, das sich ausschließlich im Zellkern repliziert. Außerdem kam es sogar in Gegenwart von Cytosin-arabinoside (ara-C, Daten nicht gezeigt), einem Inhibitor später Genexpression in Vacciniavirus (Oda u.a., 1967; Kaverin u.a., 1975; Cooper u.a.), 1979), zur Replikation der synthetischen RNPs.
  • Dieses vom rekombinanten Vacciniavektor abhängige System besitzt eine Reihe von Vorteilen gegenüber dem Ansatz, der die Infektion mit Influenzavirus zur Auslösung der Replikation von synthetischer RNA vorsieht. Zum einen wird es – weil die Expression von viralen Proteinen vollständig künstlich ist – eine präzise Aufschlüsselung der in der Replikation implizierten Prozesse ermöglichen. Die Replikation impliziert zunächst die Synthese einer Matrize mit Plus-Polarität aus der genomischen RNA mit Minus-Polarität. Diese cRNA mit Plus-Polarität wird sodann kopiert, um genomisch polarisierte RNP zu amplifizieren, die dann zur Proteinexpression und Verpackung verwendet wird (Krug u.a., 1989). Das hier beschriebene System zeigt, daß nur die influenzaviralen Proteine PB2, PB1, PA und NP für den Nachweis von exprimiertem Protein und für die Replikation von RNP erforderlich sind. Ein weiterer Vorteil dieses von Vaccinia-Vektor getragenen Replikationssystems ist der, daß weil die Influenza-Polymerase-Proteine von in das Vacciniavirus eingebauter cDNA exprimiert werden, die Mutagenese der Polymeraseproteine zu einem machbaren und leistungsfähigen Verfahren zur weiteren Analyse der Beziehungen zwischen Struktur und Funktion der viralen Polymeraseproteine wird. Derzeit versuchen wir außerdem, infektiöses Influenzavirus durch die Transfektion von Gemischen aus rekonstituierten viralen RNPs sicherzustellen. Diese Technik, sofern erfolgreich, sollte die problemlose Herstellung von definierten rekombinanten Viren durch das Hinzufügen von entweder auf natürliche Weise oder auf synthetische Weise gewonnene, definierte RNPs gestatten.
  • 10 HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
  • Eine das Plasmid pIVACAT enthaltende E. coli-Zellinie ist bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, IL, hinterlegt unter der nachgenannten Nummer:
    Figure 00720001
  • Funktionsäquivalente Enzyme gehören zum Umfang dieser Erfindung. Dem Fachmann werden sich neben den hier aufgezeigten und beschriebenen Modifikationen zahlreiche weitere Modifikationen der Erfindung aus der vorangehenden Beschreibung und den sie begleitenden Abbildungen erschließen. Derartige Änderungen gehören, so die Absicht, ebenso in den Umfang der als Anhang beigefügten Ansprüche.

Claims (40)

  1. Ein rekombinantes RNA-Molekül, das einen Bindungsort, eine 3'-nichtkodierenden Nachbarsequenz eines Influenza Gnom vRNA Segment enthält, mit Spezifität für eine RNA-abhängige RNA-Polymerase eines Influenzavirus umfaßt und das wirksam an eine heterologe RNA-Sequenz gebunden ist, die das umgekehrte Komplement einer mRNA-Kodierungssequenz beinhaltet.
  2. Das rekombinante RNA-Molekül gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Polymerase-Bindungsort die terminalen 15 Nukleotide des 3'-Terminus eines Influenza-Genom-Segments umfaßt.
  3. Das rekombinante RNA-Molekül gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die 3'-nichtkodierende virusorientierte Nachbarsequenz von Influenza die folgende Sequenz umfaßt: 5'-CACCCUGCUUUUGCU-3'.
  4. Das rekombinante RNA-Molekül gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die 3'-nichtkodierende virusorientierte Nachbarsequenz von Influenza die folgende Sequenz umfaßt: 5'-CACCCUGCUUCUGCU-3\
  5. Das rekombinante RNA-Molekül gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die 3'-nichtkodierende virusorientierte Nachbarsequenz von Influenza die folgende Sequenz umfaßt: 5'-CACCCUGUUUUUGCU-3\
  6. Das rekombinante RNA-Molekül gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die 3'-nichtkodierende virusorientierte Nachbarsequenz von Influenza die folgende Sequenz umfaßt: 5'-CACCCUUGCUUUUGCU-3'.
  7. Ein rekombinantes RNA-Molekül, das eine heterologe RNA-Sequenz beinhaltet, die das umgekehrte Komplement einer mRNA-Kodierungssequenz umfaßt, und das wirksam an eine 3'-nichtkodierende Nachbarsequenz einer den viralen Polymerase-Bindungsort umfassenden Influenza-vRNA sowie an eine 5'-nichtkodierende Nachbarsequenz einer Influenza-vRNA gebunden ist.
  8. Das rekombinante RNA-Molekül gemäß Anspruch 87 dadurch gekennzeichnet, daß die 5'-nichtkodierende Nachbarsequenz einer Influenza-vRNA die ersten 22 Nucleotide des 5'-Terminus eines Influenza-Genom-Segments umfaßt.
  9. Das rekombinante RNA-Molekül gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die 5'-nichtkodierende Nachbarsequenz einer Influenza-vRNA die folgende Sequenz umfaßt: 5'-AGUAGAAACAAGGGUGUUUUUU-3\
  10. Ein rekombinantes RNP, das das rekombinante RNA-Molekül nach Anspruch 1 gemischt mit gereinigter influenzaviraler Polymerase umfaßt.
  11. Das rekombinante RNP gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die influenzavirale Polymerase ausgehend von durch Zentrifugieren auf einem CsCl-Gradienten fraktionierten RNPs gewonnen wird und daß die gereinigte influenzavirale Polymerase aus dem Bereich des Gradienten isoliert wird, der 1,5 bis 2,0 M CsCl entspricht.
  12. Ein chimärisches Virus, das ein Influenzavirus umfaßt, das eine heterologe RNA-Sequenz enthält, die das umgekehrte Komplement einer mRNA-Kodierungssequenz umfaßt, wirksam gebunden an einen influenzaviralen Polymerase-Bindungsort.
  13. Das chimärische Virus gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe RNA-Sequenz innerhalb von Segment 1 von Influenza enthalten ist.
  14. Das chimärische Virus gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe RNA-Sequenz innerhalb von Segment 2 von Influenza enthalten ist.
  15. Das chimärische Virus gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe RNA-Sequenz innerhalb von Segment 3 von Influenza enthalten ist.
  16. Das chimärische Virus gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe RNA-Sequenz innerhalb von Segment 4 von Influenza enthalten ist.
  17. Das chimärische Virus gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe RNA-Sequenz innerhalb von Segment 5 von Influenza enthalten ist.
  18. Das chimärische Virus gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe RNA-Sequenz innerhalb von Segment 6 von Influenza enthalten ist.
  19. Das chimärische Virus gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe RNA-Sequenz innerhalb von Segment 7 von Influenza enthalten ist.
  20. Das chimärische Virus gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe RNA-Sequenz innerhalb von Segment 8 von Influenza enthalten ist.
  21. Ein chimärisches Virus, das Influenzavirus umfaßt, das neben seinen acht genomischen Segmenten ein zusätzliches RNA-Segment enthält, das eine heterologe RNA-Sequenz beinhaltet, die das umgekehrte Komplement einer mRNA-Kodierungssequenz umfaßt, wirksam gebunden an einen influenzaviralen Polymerase-Bindungsort.
  22. Das rekombinante RNA-Molekül gemäß Anspruch 1 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe RNA-Sequenz das umgekehrte Komplement einer bizistronischen mRNA umfaßt, die eine innere Sequenz aufweist, die interne Initiation vermittelt.
  23. Das rekombinante RNP gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe RNA-Sequenz das umgekehrte Komplement einer bizistronischen mRNA umfaßt, die eine innere Sequenz aufweist, die interne Initiation vermittelt.
  24. Das chimärische Virus gemäß Anspruch 12 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe RNA-Sequenz das umgekehrte Komplement einer bizistronischen mRNA umfaßt, die eine innere Sequenz aufweist, die interne Initiation vermittelt.
  25. Ein rekombinantes DNA-Molekül, das für das rekombinante RNA-Molekül nach Anspruch 1 kodiert, welches wirksam mit einem Transkriptions-Steuerungselement verknüpft ist, das eine DNA-abhängige RNA-Polymerase bindet.
  26. Ein rekombinantes DNA-Molekül, das für das rekombinante RNA-Molekül nach Anspruch 7 kodiert, welches wirksam mit einem Transkriptions-Steuerungselement verknüpft ist, das eine DNA-abhängige RNA-Polymerase bindet.
  27. Ein rekombinantes DNA-Molekül, das für das rekombinante RNA-Molekül nach Anspruch 22 kodiert, welches wirksam mit einem Transkriptions-Steuerungselement verknüpft ist, das eine DNA-abhängige RNA-Polymerase bindet.
  28. Ein Verfahren zur Genexpression, umfassend das Kultivieren einer mit dem rekombinanten RNP nach Anspruch 10 transfizierten Wirtszelle, so daß das heterologe Gen in der Kultur exprimiert wird.
  29. Ein Verfahren zur Genexpression, umfassend das Kultivieren einer mit dem rekombinanten RNP nach Anspruch 11 transfizierten Wirtszeile, so daß das heterologe Gen in der Kultur exprimiert wird.
  30. Ein Verfahren zur Genexpression, umfassend das Kultivieren einer mit dem rekombinanten RNP nach Anspruch 23 transfizierten Wirtszelle, so daß das heterologe Gen in der Kultur exprimiert wird.
  31. Ein Verfahren zur Herstellung eines chimärischen Influenzavirus, umfassend das Kultivieren einer mit dem rekombinanten RNP gemäß Anspruch 10 transfizierten und mit einer Stammkette des Influenzavirus infizierten Wirtszelle sowie das Gewinnen des chimärischen Influenzavirus aus der Kultur.
  32. Ein Verfahren zur Herstellung eines chimärischen Influenzavirus, umfassend das Kultivieren einer mit dem rekombinanten RNP gemäß Anspruch 23 transfizierten und mit einer Stammkette von Influenza infizierten Wirtszelle sowie das Gewinnen des chimärischen Influenzavirus aus der Kultur.
  33. Ein rekombinantes DNA-Molekül, das wirksam an ein Transkriptions-Steuerungselement geknüpft ist, weiches eine DNA-abhängige RNA-Polymerase bindet, und das für ein rekombinantes RNA-Molekül kodiert, das einen Bindungsort für eine RNA-abhängige RNA-Polymerase eines Influenzavirus umfaßt, wirksam gebunden an eine RNA-Sequenz, die das umgekehrte Komplement einer mRNA eines modifizierten Gens des Influenzavirus umfaßt.
  34. Ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Influenzavirus, umfassend die nachgenannten Verfahrensschritte: (a) Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem rekombinanten RNP transfiziert ist, das das rekombinante RNA-Molekül enthält, das durch das rekombinante DNA-Molekül nach Anspruch 33 kodiert wird, gemischt mit gereinigter RNA-abhängiger RNA-Polymerase eines Influenzavirus und infiziert mit einer Stammkette eines Influenzavirus; und (b) Gewinnen des rekombinanten Influenzavirus aus der Kultur.
  35. Das Verfahren gemäß Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das produzierte rekombinante Influenzavirusein attenuiertes rekombinantes Influenzavirusist.
  36. Ein chimärisches Influenzavirus, das eine heterologe RNA-Sequenz umfaßt, die das umgekehrte Komplement einer mRNA- Kodierungssequenz beinhaltet, wirksam geknüpft an einen Influenzavirus-Polymerase-Bindungsort.
  37. Das chimärische Influenzavirusgemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß die mRNA-Kodierungssequenz eine Sequenz ist, die für ein Humanes Immundefizienz-(HIV-)Epitop kodiert.
  38. Das chimärische Influenzavirusgemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein Humanes Immundefizienz-(HIV-)Epitop kodierende Sequenz eine gp120-Epitop-kodierende Sequenz ist.
  39. Das chimärische Influenzavirusgemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß die mRNA-Kodierungssequenz eine für ein Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen-(HBsAg-)Epitop, ein Herpes-Glycoprotein-Epitop, ein Poliovirus-VP1-Epitop, ein ein bakterielles Antigen determinierendes Epitop oder ein ein parasitäres Antigen determinierendes Epitop kodierende Sequenz ist.
  40. Das chimärische Influenzavirus nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Herpes-Glycoprotein-Epitop kodierende Sequenz eine für ein Herpes-Glycoprotein-gD- oder -gE-Epitop kodierende Sequenz ist.
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