JPH05500607A

JPH05500607A - 組み換えネガティブ鎖ｒｎａウイルス発現系及びワクチン

Info

Publication number: JPH05500607A
Application number: JP2513011A
Authority: JP
Inventors: パレス，ピーター; パルビン，ジェフリー，ディー．; クリスタル，マーク
Original assignee: ザ　マウント　シナイ　スクール　オブ　メディスン　オブ　ザ　シティー　ユニバーシティー　オブ　ニューヨーク
Priority date: 1989-08-28
Filing date: 1990-08-27
Publication date: 1993-02-12
Anticipated expiration: 2017-06-17
Also published as: DE122008000060I2; EP0490972A4; PT95124A; NL300367I1; CA2065245A1; AU636916B2; DE122007000069I2; NL300366I1; DE122007000069I1; DE122007000059I1; AU6411890A; DE122008000060I1; EP0490972B1; EP0490972A1; CA2065245C; ES2075901T3; JP3293620B2; NL300341I1; US5578473A; DE69021575D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】組み換えネガティブ鎖ＲＮＡウィルス発現系及びワクチン１、序論（技術分野）本発明は、適当な宿主細胞系中で異種の遺伝子産物を発現し、かつ／又は異種の遺伝子産物を発現、パッケージング、及び／又は提供する組み換えウィルスを構築するために用いることのできる、組み換えネガティブ鎖ウィルスＲＮＡ鋳型に関する。発現産物及びキメラウィルスはワクチン製造に有利に用い得る。

本発明は、ネガティブ極性（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｐｏｌａｒｉｔｙ）における異種遺伝子コード配列を含む組み換えインフルエンザウィルスＲＮＡ鋳型を構築する実施例を用いて示される。これらの組み換え鋳型は、精製ウィルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと組み合わせるとき、感染性であり、適当な宿主細胞中で複製され、高レベルで異種遺伝子産物を発現した。更に、異種遺伝子は得られた組み換えインフルエンザウィルスによって発現され、パッケージ多くのＤＮＡウィルスが宿主細胞系において異種タンパク質の発現を指示するように遺伝子操作されてきた（例えば、ワクシニアウィルス、バキュロウィルスなど）。最近になって、ポジティブ鎖ＲＮＡにも同様の進歩があった（例えば、ポリオウィルス）。

これら構築物の発現産物、即ち異種遺伝子産物、又は異種遺伝子産物を発現するキメラウィルスは、ワクチン製造（サブユニット又は全ウィルスワクチン）に極めて有用であることが知られている。ワクチン製造用の組み換え又はキメラウィルス構築のためにワクシニアのようなウィルスを使用することの欠点は、その主要エピトープの変化に欠けることである。ウィルス株の変化に欠けることは、複数の予防接種が該株に宿主耐性をもたらし、それゆえに接種したウィルスが宿主に影響を及ぼさなくなるという点において、キメラワクシニアの繰り返し使用に厳しい限定を付すことになる。従って、耐性個体にキメラワクシニアを予防接種しても免疫刺激を誘発しない。

これとは対照的に、ネガティブ鎖ＲＮＡウィルスであるインフルエンザウィルスは、その主要エピトープが広い変化に富む。実際、何千というインフルエンザの変異株が同定されており、各棟は抗原ドリフトによって進化する。インフルエンザのようなネガティブ鎖ウィルスはワクチンに使用するためのキメラウィルス構築には魅力的な候補である。何故なら、その遺伝子変異性のために、耐性を形成する危険性なしに免疫を刺激する、多くの種類のワクチン製剤の構築が可能となるからである。しかしながら、今までのところ、感染性である組み換え又はキメラネガティブ鎖ＲＮＡ粒子を構築することが不可能であったという事実のために、この目的は達成されていなかった。

２．１．インフルエンザウィルスネガティブ性（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）ゲノムのエンベロープ化−重鎖ＲＮＡを含むウィルス属は、非−セグメント化ゲノムを有するグループ（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）又はセグメント化ゲノムを有するグループ（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ。

（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ及び　Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）に分類される。

以下に詳述し、また実施例に用いたＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ属はインフルエンザウィルス、タイプＡ、Ｂ及びＣのみを含む。

インフルエンザピリオン（ウィルス粒子）は、−木繊ＲＮＡゲノムを含む内部リボヌクレオタンパク質コア（螺旋ヌクレオキャプシド）、及びマトリックスタンパク質で内部を縁取りされた外部リポタンパク質エンベロープとからなる。インフルエンザＡのセグメント化ゲノムは、直線状、ネガティブ極性、−重鎖ＲＮＡ［これはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＰＢ２゜ＰＢＩ及びＰＡ）及びヌクレオキャプシドを形成する核タンパク質（ＮＰ）；マトリックスタンパク質（Ｍｌ、Ｍ２）；リポタンパク質エンベロープから放出する２つの表面糖タンパク質：ヘマグルチニン（ＨＡ）及びニューラミニダーゼ（ＮＡ）；及び機能未知の非構造タンパク質（ＮＳＩ及びＮ５２）を含む１０個のポリペプチドをコードする］の８個の分子（７個はインフルエンザＣのためのもの）からなる。

ゲノムの転写及び複製は核で実施され、組み立ては形質膜上ての出芽を介して起こる。ウィルスは混合感染中に遺伝子の再分類をすることかできる。

インフルエンザウィルスは細胞脱糖タンパク質及び糖脂質中のシリルオリゴ糖にＨＡを介して吸着する。ピリオンのエンドサイト−シスに次いで、細胞エンドソーム内てＨＡ分子内のコンホメーション変化か起こり、これにより膜溶解か可能になり、脱外被の引き金となる。感染における本質的な初期の出来事としてウィルスｍＲＮＡが転写される核に、ヌクレオキャプシドは移る。ウィルスｍＲＮＡは独特のメカニズムて転写され、そこではウィルスエンドヌクレアーゼか細胞性異種ｍＲＮＡからキャップされた５−末端を切り出し、これか次いてウィルス転写酵素によるウィルスＲＮＡ鋳型の転写のためのプライマーとして作用する。ポリ（Ａ）束（ｔｒａｃｔｓ）の鋳型−非依存性付加のためのシグナルとしてオリゴ（Ｕ）が作用する、その鋳型の末端から１５から２０塩基の部位て転写物は終結する。このようにして生産された８個のウィルス性ｍＲＮＡ分子のうち、６個はＨＡ、ＮＡ、ＮＰを表すタンパク質、及びウィルス性ポリメラーゼタンパク質、ＰＢ２．ＰＢＩ及びＰＡに直接転写されるモノシストロン性メツセージである。他の２個の転写物はスプライシングされ、各々異なる読み取り枠に転写される２個のｍＲＮＡを生産し、Ｍｌ、　Ｍ２゜ＮＳＩ及びＮＳ２を生産する。言い換えると、８個のウィルス性ｍＲＮＡは１０個のタンパク質、８個の構造タンパク質と２個の非構造タンパク質をコードする。インフルエンザウィルス遺伝子及びそのタンパク質産物のまとめを以下の表１に示す。

（本頁以下余白）表ＩインフルエンザウィルスゲノムＲＮＡセグメント及びコード割り当て・セグメント　長さ５　コードされる　長さ６　ビ吋ン当り　コメント（ヌクレオチド）　ポリペプチドｅ　（アミノ酸）　の分子１　２３４１　ＰＢ２　７５９　３０−６０　ＲＮＡ転写酵素成分：宿主細胞ＲＮＡキャップ結合２　２３４１　ＰＢＩ　７５７　３０−６０　ＲＮＡ転写酵素成分：転写開始　；　エンドサイト了−ゼ　活性？３　２２３３　ＰＡ　７１６　３０−６０　ＲＮＡ転写酵素成分；　ｍＲＮＡ鎖の伸長？４　１７７８　ＨＡ　５６６　５００　ヘ７グルチニン、トリ７−；　エンベローブ糖タンパク質；細胞への固着仲介（表■続き）セグメント　長さｂ　コードされる　長さｄ　どりオン当り　コメント（ヌクレオチド）　ポリペプチドＣ（アミノ酸）　の分子５　１５６５　ＮＰ　４９８　１０００　核タンパク質、ＲＮＡと関連：ＲＮＡ転写酵素の構造成分６　１４１３　ＮＡ　４５４　１００　ニューラミこダーゼ；四量体；　エンベドブ糖タンパク質７　１０２７　Ｍｌ　２５２　３０００　？Ｌ’ｈクスタｍり質Ｍ２　９６　形質膜における構造タンパク質？　？　９　未同定タンパク質（表工続き）セグメント　長さ５　コードされる　長さ６　ピリオン当り　コメント（ヌクレオチド）　ポリペプチド°　（アミノ酸）　の分子８　８９０　ＮＳＩ　２３０　非構造タンパク質：機能米知ＮＳ２　１２１　非構造タンパク質；機能未知：スプライシング化ｍＲＮＡａ　：　Ｒ，Ａ、Ｌａｍｂ　ａｎｄ　Ｐ、Ｗ、Ｃｈｏｐｐｉｎ（１９８３）より転用、Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌｕｍｅ　５２．　４６７−５０６より再生ｂ：Ａ／ＰＲ／８／３４株Ｃ：生化学的及び遺伝的アプローチにより決定ｄ：ヌクレオチド配列分析及びタンパク質配列により決定（本頁以下余白）転写に次いでは、ウィルスゲノム複製がネガティブ鎖ＲＮＡウィルスによる第２の本質的出来事である。他のネガティブ鎖ＲＮＡウィルスについては、インフルエンザにおけるウィルスゲノム複製はウィルス−特定化タンパク質によって仲介される。インフルエンザウィルスｍＲＮＡセグメントを転写するウィルスタンパク質のほとんど又は全てかその複製も実施することが仮定される。

恐らくは各セグメントを同じ効率で認識するためのＲＮＡ−合成装置を可能にするために、全てのウィルスＲＮＡセグメントは共通の３′及び５°末端を有している。タンパク質（ＰＢ２．ＰＢｌ、ＦＡ及びＮＰ）の同じ補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）二者択一的な使用（即ち、転写又は複製）を制御するメカニズムはまだ明らかではないが、■又はそれ以上のヌクレオキャプシドタンパク質、特にＮＰの多くの遊離型が関与していると思われる。核が転写部位であるのと同様に、ウィルスＲＮＡ複製部位でもあると思われる。

複製可能なＲＮＡ合成の最初の産物は、全てのインフルエンザウィルスゲノムＲＮＡセグメントの双補的コピー（即ちプラス極性）（ｃＲＮＡ）である。これらのプラス鎖コピー（抗−ゲノム：　ａｎｔｉ−ｇｅｎｏｍｅｓ）は、その末端における構造がプラス鎖ｍＲＮＡ転写物と異なる。ｍＲＮＡ転写物とは異なり、抗 −ゲノムＣＲＮＡは５′末端がキャップされておらず、メチル化されており、３ ′末端が末端切断されておらず、ポリアデニル化されている。

ｃ’ＲＮＡはそのネガティブ鎖鋳型と共通末端であり、双補的型中の各ゲノム性ＲＮＡセグメントに全ての遺伝情報を含んでいる。

ＣＲＮＡはゲノム性ネガティブ鎖ｖＲＮＡの合成に対する鋳型として作用する。

インフルエンザウィルスネガティブ鎖ゲノム（ｖＲＮＡ）及び抗−ゲノム（ｃＲＮＡ）は、常にヌクレオキャプシドタンパク質でキャップされており、唯一のキャップされていないＲＮＡ種はウィルスｍＲＮＡである。他のエンベロープ化ＲＮＡウィルスとは対照的に、ヌクレオキャプシドの組み立ては細胞質よりもむしろ核で起こっているように思われる。細胞質側又は出芽エンベロープの内部表面上にＭタンパク質を取り込む細胞の頂上表面から出芽することによって、ウィルスは成熟する。ＨＡ及びＮＡはグリコジル化され、脂質エンベロープに取り込まれる。許容細胞において、ＨＡは実際には切断されるか、生じた２つの鎖はジスルフィド結合で結合されたままである。

８個のゲノム性ウィルスＲＮＡの各々のうちの１コピーがどのようなメカニズムで各新規ピリオンへの取り込みに選択されるのかはまだ解明されていない。欠陥干渉（Ｄ　Ｉ）粒子か、多数の感染後に特にしばしば生産される。

２．２．ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ動物ウィルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、タンパク質構造及び反応条件に関して広く研究されてきた。しかしながら、ポリメラーゼによる最適の発現を促進する鋳型ＲＮＡの要素については、現存するウィルスＲＮＡ配列を用いる干渉の研究かなされたのみであった。

ウィルスポリメラーゼが、感染細胞中に見られる多くの宿主−コード化ＲＮＡの中からどのようにして特定のウィルスＲＮＡを認識するのかが未知であるので、このプロモーター分析は興味がある。

プラスミド由来のＲＮＡかトランスフェクションによって細胞中に導入されるとき、プラス性ゲノムＲＮＡを含む動物ウィルスは複製され得る（例えば、Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１．５ｃｉｅｎｃｅ　２１４：９１６ −９１９；　Ｌｅｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４４：１３７−１４５）、ポリオウィルスの場合、精製されたポリメラーゼはｉｎ　Ｖｉｔｒｏ反応てゲノムＲＮＡを複製し、この調製物が細胞中にトランスフェクションされるとき、感染性となる（Ｋａｐｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２：８４２４−８４２８　）　、しかしながら、ポリオウィルス−コード化ポリメラーゼのための転写プロモーターとして作用する鋳型要素は、ＲＮＡホモポリマーがコピーされるとしても、未知である（Ｗａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　ＪＪｉｒｏｌ、　６２：５５８−５６２）　、　Ｓ　Ｐ　６転写物もまた、シンドビスウィルスゲノムのための欠陥干渉（ＩＤ）ＲＮＡモデルを生産するために用いられてきた。感染細胞中にＲＮＡが導入されると、ＲＮＡは複製されパッケージングされる。シンドビスウィルスポリメラーゼの認識と、ウィルス粒子中へのゲノムのパッケージングとの両方を司るＲＮＡ配列は、ゲノムの５°末端の１６２ヌクレオチド（ｎ　ｔ）と３′末端の１９ｎｔとの間にあることが示された（Ｌｅｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４４　：１３７−１４５）。ブロムモザイクウィルス（ＢＭＶ）の場合、ポジティブ鎖ＲＮＡ植物ウィルスであるＳＰ６転写物が、１３４ｎｔのｔＲＮＡ様３°末端としてのプロモーターを同定するために用いられた（Ｄｒｅｈｅｒ　ａｎｄ　Ｈａｌｌ、　１９８８．　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　２０１：３ｌ−４０）。ポリメラーゼ認識及び合成は配列と二次構造特質の両方に依存することが示された（Ｄｒｅｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１１：１７１−１７５）。

ネガティブ性ＲＮＡウィルスは、レプリカーゼの配列要求の研究には手に負えないものであった。水底性口内炎ウィルスの精製ポリメラーゼは、ウィルス由来のリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）か鋳型として含まれる場合の転写においてのみ活性である（Ｄｅ　ａｎｄ　Ｂａｎｅｒｊｅｅ、　１９８５．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　１２６：４０−４９；　Ｅｍｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｙｕ、１９７５．　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、１５：１３４８−１３５６；　Ｎａ１ｔｏ　ａｎｄＩｓｈｉｈａｍａ、　１９７６、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５１：４３０７−４３１４）。ＰＮＰはタンパク質源として感染細胞抽出物を用いる、ＶＳＶ　０１粒子の裸の（ｎａｋｅｄ、）　ＲＮ　Ａから再構成された。次いてこれらのＰＮＰは感染細胞に戻されたときに複製された（Ｍｉｒａｋｈｕｒ　ａｎｄ　Ｐｅ１ｕｓｏ。

１９８８、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌｓＡ　８５ニア５１１−７５１５）。インフルエンザウィルスに関しては、ウィルスから精製された裸のＲＮＡかＲＮＰ再構成に用いられたことが最近報告された。ウィルスヌクレオキャプシド及びポリメラーゼタンパク質をゲル精製して、チオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉ口）を用いてウィルスＲＮＡ上に再生した（Ｓｚｅｗｃｚｙｌ　ｅｔ　ａｌ、＋　１９８８．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５ニア９０７−７９１１）。しかし、これらの著者は調製物の活性かインフルエンザウィルスＲＮＡに特異的であることを示していないし、また転写を促進するシグナルを分析してもいない。

インフルエンザウィルス感染の過程において、ポリメラーゼは３つの異なる転写活性を触媒する。これは、（ａ）５’　キャップ及び３゛ポリ−Ａテイルを含むサブゲノム性ｍＲＮＡ　；　（ｂ）ゲノムＲＮＡからコピーされた全長プラス鎖又は抗−ゲノム（ｃＲＮＡ）；及び（Ｃ）全長ｃＲＮＡから合成されたゲノム性ｖＲＮＡ、の合成を含む（Ｉｓｈｉｈａｒａ　ａｎｄ　Ｎａｇａｔａ、１９８８．　ＣＲＣＣｒ１ｔ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２３：２７−７６の総説；　Ｋｒｕｇ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ、Ｅｄ、、Ｐａ１ｅｓｅ、Ｐ、ａｎｄ　Ｋｉｎｇｓｂｅｒｙ、Ｄ、Ｗ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　１９８３．　ｐ、７Ｏ−９８）　ｏウィルスタンパク質ＰＢ２゜ＰＢＩ及びＰＡは、過剰のヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ：上記総説参照）か存在するとき、全てのインフルエンザウィルス−特異的ＲＮＡ合成を触媒すると考えられている。これらのポリメラーゼ機能は、洗剤 −粉砕化ウィルスに由来するＰＮＰコア及び感染細胞の核抽出物からのＰＮＰを用いて研究されてきた。

粉砕化ウィルスに由来するＰＮＰからの転写は、ジヌクレオチドアデニリルー（３°−５゛）−グアノシン（ＡｐＧ）又はキャップされたｍＲＮＡで促進するときに起こる。プラス性ｍＲＮＡ産物はＲＮＡ鋳型の５°末端の１７−２０ヌクレオチド上流で合成を終結させ、ポリＡテイルを加えることによって処理された。

これらの産物は、末端配列を欠くために、ウィルス性ゲノムのための鋳型として作用することはできない（Ｈａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７７、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ８３　：３３７−３５５）。感染細胞の核抽出物に由来するＲＮＰもまた、キャップされたＲＮＡプライマーの存在下にポリアデニル化ｍＲＮＡを合成することができる。しかしながら、もしもこの条件てＡｐＧを用いるならば、ＲＮＡとポリアデニル化された全長ｃＲＮＡとの両方が得られる（Ｂｅａｔｏｎ　ａｎｄ　Ｋｒｕｇ、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ　８３：６２８２−６２８６；　Ｔａｋｅｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．　Ｊ。

８ｉｏｃｈｅｍ、　１０１：８３７−８４５）　、最近になって、もしも感染後に核抽出物を数回で回収するならば、外因性プライマーが存在しなくてもｃＲＮＡの複製可能な合成が起こり得ることか示された。この同じ調製物において、ｃＲＮＡ鋳型からのネガティブ性ｖＲＮＡの合成も観察された（Ｓｈａｐｉｒｏ　ａｎｄ　Ｋｒｕｇ、　１９８８．　Ｊｊ／１ｒｏ１．６２：２２８５−２２９０）。全長ｃＲＮＡの合成は、溶液中で遊離しているヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ）の存在に依存していることが示された（Ｂｅａｔｏｎ　ａｎｄ　Ｋｒｕｇ、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　８３：６２８２−６２８６；　５ｈａｐｉｒｏ　ａｎｄ　Ｋｒｕｇ、　１９８８．　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６２：２２８５−２２９０）。

これらの知見によって、ＲＮＰ複合体によるｍＲＮＡとｃＲＮＡとの間の制御的コントロールは、過剰の可溶性ＮＰの存在に対する要求性に依存することが示唆された（Ｂｅａｔｏｎ　ａｎｄ　Ｋｒｕｇ、　１９８６゜Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３：６２８２−６２８６）。

他の研究は、洗剤−粉砕化ウィルスからのＰＮＰに由来するポリメラーゼ−ＲＮ　Ａの調製に注目してきた。ＰＮＰ複合体をＣｓＣ１−グリセロールグラジェントで遠心すると、グラジェントの底部に３つのポリメラーゼ（Ｐ）タンパク質と関連するＲＮＡか見いだされた。グラジェントの頂部付近には遊離のＮＰタンパク質が見いだされた（Ｈｏｎｄａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０４：１０２１−１０２６；　Ｋａｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３．１１５−１２７）　ｏ精製されたポリメラーゼ−ＲＮＡ複合体（グラジェントの底部）は、Ｒ，Ｎ　ＡのＡｐＧ−促進合成の開始に活性であるが、１２−１９ヌクレオチド以上に伸長することはできない。ＮＰタンパク質を含むグラジェントの頂部からの分画をポリメラーゼ− ＲＮＡ複合体に戻すと、伸長かなされる（Ｈｏｎｄａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０２：４ｌ−４９）。これらのデータは、ＮＰタンパク質か伸長に必要であるか、開始はＮＰが存在しなくても起こることを示唆する。

インフルエンザウィルスのゲノム性ＲＮＡは、１５−１６ｎｔのフライパンの柄のような形を形成する末端同士の塩基ペアを介して環状コンホメーションをとっている（　Ｈｏｎｄａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８゜Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０４：１０２１−１０２６；　Ｈｓｕ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８４：８１４０−８１４４）。ウィルスポリメラーゼはフライパンの柄に結合していることが見いだされているので、フライパンの柄の構造かウィルスポリメラーゼによる認識に必要であることか示唆される（　ｔ（ｏｎｄａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０４：１０２１−１０２６）。従って、これら２つの報告では、ウィルスＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターはフライパンの柄のコンホメーションをとる２本鎖ＲＮＡであるという仮説かなされた。

３、発明の要約組み換えネガティブ鎖ウィルスＲＮＡ鋳型が記載されており、これは精製したＲＮＡ誘導ＲＮＡポリメラーゼ複合体と共に適当な宿主細胞中で異種遺伝子生産物を発現し、且つ／またはウィルス粒子中で異種遺伝子を保護するのに使用し得る。ＲＮＡ鋳型はＲＮＡ誘導ＲＮＡポリメラーゼによる適当なりＮＡ配列の転写に −より調製される。得られるＲＮＡ鋳型は負の極性であり、しかも適当な末端配列を含んでおり、これらの配列はウィルスＲＮＡ合成装置か鋳型を認識することを可能にする。

本明細書に記載された実施例により示されるように、組み換えネガティブセンスインフルエンザＲＮＡ鋳型はｆｆ４’Ｅｌしたウイルスポリメラーゼタンパク質及び核タンパク質（即ち、精製したウィルスポリメラーゼ複合体）と混合でき、感染性組換えＲＮＰを生成し得る。これらは宿主細胞中で異種遺伝子生産物を発現するのに使用でき、または組み換えＰＮＰ及びウィルスによる宿主細胞の同時形質移入によりウィルス粒子中で異種遺伝子を保護するのに使用し得る。また、組み換えＲＮＡ鋳型または組み換えＲＮＰは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ−ポリメラーゼを発現し、相補を与える形質転換細胞系を形質移入するのに使用し得る。また、インフルエンザウィルスに関する非ウィルス依存性の複製系が記載される。

インフルエンザウィルスポリペプチドを発現するワクシニアベクターが、合成により誘導されたＲＮＰを複製し、転写し得るタンパク質の源として使用された。

ウィルスＰＮＰの特異的な複製及び発現に必要とされるインフルエンザウィルスタンパク質の最小のサブセットは三つのポリメラーゼタンパク質（ＰＨ１、ＰＢＩおよびＰＡ）および核タンパク質（ＮＰ）であることがわかった。これは、非構成タンパク質、ＮＳＩおよびＮＳ２かウィルスＲＮＰの複製及び発現に絶対に必要とされないことを示唆する。

得られる発現生産物および／またはキメラヴイリオンはワクチン製剤中に有利に使用し得る。この目的のための組み換えインフルエンザの使用は特に魅力的である。何となれば、インフルエンザはワクチン製剤の広いレパートリイの構成を可能にする多大の棟受異性を示すからである。キメラウィルスを構成するために数千のインフルエンザ変異体から選択する能力は、ワクシニアの如きその他のウィルスを使用する場合に見られる宿主抵抗性の問題をなくす。加えて、インフルエンザは激しい分泌性の細胞毒性のＴ細胞応答を刺激するので、インフルエンザウィルスバックグラウンド中の外来エピトープの提示はまた分泌免疫および細胞媒介免疫の誘発を与えることができる。

３．１．定義本明細書に使用される以下の用語は、以下に示された意味を有する。

ｃＲＮＡ−抗ゲツムＲＮＡＨＡ　＝ヘマグルチニン（外膜機タンパク質）Ｍ　−マトリックスタンパク質（外膜の内部の系）ＭＤＣＫ＝マシン・ダービイ犬の腎臓細胞ＭＤＢＫ＝マシン・ダービイ牛の腎臓細胞ｍｏｉ　＝感染の多重度ＮＡ　＝ノイラミニダーゼ（外膜機タンパク質）ＮＰ　＝核タンパク質（ＲＮＡと混在し、ポリメラーゼ活性に必要とされる）ＮＳ　＝非構成タンパク質（未知の機能）ｎｔ　＝ヌクレオチドＰＡ、　ＰＢＩ　、　ＰＨ１＝ＲＮＡ誘導ＲＮＡポリメラーゼ成分ＲＮＰ　＝リポヌクレオタンパク質（ＲＮＡ、　ＰＨ１、ＰＢＩ　、ＰＡおよびＮＰ）ｒＲＮＰ＝組換えＲＮＰｖＲＮＡ−ゲノムウィルスＲＮＡウィルスポリメラーゼ複合体＝ＰＡ、　ＰＢＩ　、ＰＨ１およびＮＰＷＳＮ　＝インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウィルスＷＳＮ−ＨＫウイルスニＷＳＮウィルスからの７個の遺伝子およびインフルエンザＡ／）ＩＫ／８／６８ウィルスからのＮＡ遺伝子を含むリアソートメントウイルス４、図面の説明第１図、ポリメラーゼ製剤の精製。ＲＮＰコアーを全ウィルスから精製し、次にＣｓＣ１−グリセロール勾配遠心分離にかけた。ポリメラーゼを１．５〜２．０ＭのＣｓＣ１で分画から精製した。次に試料を０．１％のドデシル硫酸ナトリウムの存在下に於ける７−１４％の線形勾配ゲルによるポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いて銀による染色により分析した。タンパク質試料は１．４μｇの全ウィルス（レーン１）、０．３μｇの全ウィルス（レーン２）、５μｌのＰＮＰコアー（レーン３）および２５μｌのＲＮＡポリメラーゼ（レーン４）を含んでいた。タンパク質の既知の帰属が左側に示される。

第２図、ＲＮＡ鋳型を調製するのに使用されたプラスミド構造。プラスミド設計はｐＵＣ−１９配列を表すソリッドボックスで示され、陰影付きのボックスはバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより特異的に認識されるトランケートプロモーターを表し、実線はＭｂｏｌｌで消化されたプラスミドから転写されるＤＮＡを表す。ホワイトボックスは、その順序でＭｂｏＩＴ、Ｅｃ。

ＲＩおよびＰｓｔＩに関する認識部位をコードする配列を表す。

制限エンドヌクレアーゼによる開裂の部位が示されている。線図の下に、Ｍｂｏｌｌ消化プラスミドからのＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる合成から生じるＲＮＡの全配列が示されている。Ｖ　−ｗ　ｔＲＮＡは、１６の“スペーサー”ヌクレオチドにより分離されたインフルエンザウィルスのＲＮＡセグメント８に見られるのと同じ５゛末端及び３′末端を有する。ＲＮＡ、Ｍ−ｗｔ　はＶ−ｗｔの正確な反対のスタンド、即ち“メツセージ−センス“を表す。

ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩＳＰｓｔＩおよびＳｍａＩに関する制限エンドヌクレアーゼ部位が示されている。これらの酵素により開裂されたプラスミドのＴ７転写産物は、それぞれ、３２．５８．６６および９１のヌクレオチドの長いＲＮＡを生じる。Ｖ−ｄ５’　ＲＮＡの配列が示されている。プラスミド設計は、“スペーサー”配列のわずかな変化以外はＶ−ｗｔ　ＲＮＡに使用されたものと実質的に同じである。研究されたＶ−ｄ５’　ＲＮＡ０点突然変異体が第１表に示されている。

第３図、インフルエンザウィルスポリメラーゼの生産物の分析。第３Ａ図：　０．４ｍＭのＡｐｇを含むポリメラーゼ反応混合物（レーン２）またはプライマーを含まないポリメラーゼ反応混合物（レーン３）を、７．７Ｍの尿素を含む８％のポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけた。第３Ｂ図：新生ＲＮＡは一本鎖の特異的ヌクレアーゼＳ１に対し抵抗性である。通常のポリメラーゼ反応に続いて、溶液をヌクレアーゼＳｌ緩衝液で希釈しくレーン１）、酵素を添加した（レーン２）。Ｓｌ消化条件の対照として、放射能でラベルした一重鎖Ｖ−ｗｔＲＮＡをヌクレアーゼＳ１（レーン３）または緩衝液単独（レーン４）で処理した。

第３Ｃ図ニゲル精製した反応生成物のりボヌクレアーゼＴ１分析。Ｖ−ｗｔＲＮＡ鋳型を使用するウィルスポリメラーゼの反応生成物を８％のポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけた。５３ｎｔバンドおよび更に小さい転写産物を切除し、ゲルマトリックスから溶離した。これらのＲＮＡをＲＮＡ５　ｅＴｌで消化し、７．７Ｍの尿素を含む２０％のポリアクリルアミドゲルによる電気泳動により分析した。また、比較のため、α−”Ｐ−ＵＴＰの存在下で合成したＭ−ｗｔＲＮＡおよびＶ−ｗｔＲＮＡのＴ７転写産物をＲＮＡ５ｅＴ１で分析した。対照ＲＮＡの予想される放射能ラベルしたオリゴヌクレオチドが示されている。レーン１１５３ヌクレ才チドの全長（ＦＬ）生産物：レーン２．４０−４５ヌクレオチドの小さい（Ｓｍ）ＲＮＡ生産物；レーン３．３２Ｐ−ＵＭＰの混入によりラベルしたＭ−ｗｔＲＮＡ：およびレーン４、レーン３のようにしテラヘルしたＶ− ｗｔＲＮＡ。

第４図、ウィルスポリメラーゼに最適の反応条件。第４Ａ図：Ｖ−ｗｔ鋳型との反応を氷の上で行い、次に示された温度で９０分間インキュベートした。第４Ｂ図：Ｖ−ｗｔ鋳型との反応を、示されたＮａＣ１濃度またはＫＣＩ濃度で平行して調製し、３０°Ｃて９０分間インキュベートした。第４Ｃ図；Ｖ−ｗｔ鋳型との単−反２を３０°Ｃてインキュベートし、そして示された時間で試料を取り出し、直ちにフェノール−クロロホルム抽出により処理した。全てのゲルは、７．７Ｍの尿素と共に８％のポリアクリルアミドを含んでいた。

第５図、ウィルスポリメラーゼの鋳型特異性。第５Ａ図：ウイルスボリメラーゼ反応は３′末端プロモ一ター配列を必要とする。

種々の鋳型ＲＮＡを通常の条件下で反応に使用した。レーン１、Ｖ−ＰｓｔＲＮＡ、これは３′末端で１３ｎ　を拡張部を有する以外はＶ−ｗｔと同じである；レーン２、Ｖ−３ｍａＲＮＡ、これは３′末端で３８ｎｔ拡張部を有する；レーン３、Ｖ−ｗｔＲＮＡ；レーン４、Ｖ−ｗｔＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡポリヌクレオチド、レーン５、Ｈｉｎｄｌｌｌて消化されたｐＩＢＩ−３１プラスミドのバクテリオファージＴ３ＲＮＡポリメラーゼ転写により生じた８０ｎ　ｔＲＮＡｏこれらのその他の鋳型を使用した場合に、特異的な反応生成物の不在を強調するために、オートラジオグラフを過剰露出した。第５Ｂ図、それぞれの鋳型ＲＮ　Ａ　１０ｎｇをウィルスポリメラーゼとインキュベートし、次に生産物を７．７Ｍの尿素を含む８％のポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけた。レーン１、Ｖ−ｗｔＲＮＡ；レーン２、Ｖ−ＤｒａＲＮＡ；レーン３、Ｖ−ＥｃｏＲＮＡ：レーン４、Ｍ−ｗｔＲＮＡか示されている：そしてレーン５．５３ｎｔマーカーすりゴヌクレオチド。正確な配列の相違に関して、第２図および以下の項目６．１を参照のこと。

第６図、ＲＮＡプロモーターは末端パンハンドル（ｐａｎｈａｎｄｌｅ）を必要としない。二つの鋳型ＲＮＡを使用するポリメラーゼ反応。

それぞれの反応はＶ−ｗｔＲＮＡ５ｎｇを含んでいた。第二の鋳型として、反応はＶ−ｄ５’　ＲＮＡＯｎｇ（レーン１）　、０．６ｎｇ　（レーン２）、および３．Ｏｎｇ　（レーン３）を含んでいた。得られるモル比は図に示されるとうりである。反応生成物を７．７Ｍの尿素の存在下で８％のポリアクリルアミドゲルで分析した。オートラジオグラフのデンシトメトリイ分析に続いて、それぞれのピークの相対強度をそれぞれの生産物に含まれる放射性ＵＭＰの量について修正した。

第７図、プロモーター配列の特異性。５°末端を欠き、点突然変異を含んだＲＮＡ　（第２表）を通常のポリメラーゼ反応に於いてＶ−ｄ５’　ＲＮＡと比較した。右のパネルは別個の反応の組からのものである。定量的な比較が第２表に概説される。

第８図、高濃度のポリメラーゼ製剤は感作されたキャップ−エンドヌクレアーゼ中て活性であり、そしてプライマーを含まないＲＮＡ合成反応て活性である。第８Ａ図：高濃度の酵素のプライマー特異性。放射性の合成した３０ｎｔ鋳型かレーン１中にある。

Ｖ−ｄ５’　ＲＮＡ生産物ｇおよびウィルスポリメラーゼ５μｍを使用する反応は、プライマーとして、無プライマー（レーン２）；キャップ０構造を含むＢＭＶＲＮＡ　（Ｄｅ　ａｎｄ　Ｂａｎｅｒｊｅｅ、　１９８５゜Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　６：４４０−４９）１００ｎ　（レーン３）、キャップ１構造を含むウサギグロビンｍ　ＲＮ　Ａ　１０１００ｎレーン４）：およびＡｐＧｏ、４ｍＭ　（レーン５）を含んでいた。レーン５の更に軽度の暴露がレーン６として示されている。第８Ｂ図・ゲル精製したＲＮＡのヌクレアーゼ８１分析。プライマーとしてＡｐＧ（レーン１および２）；無プライマー（レーン３および４）；またはグロビンｍＲＮＡ　（レーン５および６）を使用する反応からの生産物を尿素の不在下で電気泳動にかけ、そして適当なゲル片を切除し、ＲＮＡを溶離した。次に、このＲＮＡをヌクレアーゼＳ１で消化しくレーン２．４、および６）、そして生産物を変性し、７．７Ｍの尿素を含む８％のポリアクリルアミドゲルで分析した。

第９図、再構成したＲＮＰからのゲノム長さのＲＮＡの合成。

ポリメラーゼ１０μＩおよび鋳型としてウィルスＡ／ＷＳＮ／３３のセグメント８の配列と同じ８９０　ｎ　ｔ　ＲＮＡそしてＡ／ＰＲ／８／３４ウィルスから抽出したＲＮＡを使用する反応生成物を、７．７Ｍの尿素を含む４９６のポリアクリルアミドゲルで分析した。レーン１には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで合成した放射性の８９０　ｎ、　を鋳型か示されている。８９０ｎ　ｔプラスミドで誘導されたＲＮＡをレーン２．３．８および９て鋳型として使用した。ウィルスから抽出したＲ、　Ｎ　Ａをレーン４．５．１０および１１て鋳型として使用した。レーン６および７ては鋳型を使用しなかった。レーン２〜５てはプライマーを使用せず、そしてレーン６〜１１ではＡｐＧをプライマーとして使用した。レーン３．５．７．９および１１ては、反応生成物をヌクレアーゼＳｌて処理した。

第１０図、ウィルス遺伝子セグメント内のウィルスコード配列を置換するのに使用し得るＰＣＲ誘導突然変異法の線図。

第１１図（Ａ）、　ｐＩＶＣＡＴｌの関係のある部分の線図。種々の領域かラベルされ、そして左から右に、トランケートＴ７プロモーター：インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウィルスセグメント８の５′非翻訳末端（２２のセグメント）；リンカ−配列の８のヌクレオチド；全ネコ遺伝子コード領域（６６０のヌクレオチド）、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウィルスセグメント８の全３′非翻訳末端（２６のヌクレオチド）；およびＨｇａｌ制限酵素部位を含むリンカ− 配列である。ネコ遺伝子に関する関係のある制限酵素部位並びに開始部位および停止部位か示されている。（Ｂ）Ｈｇａｌ消化そしてＴ７ＲＮＡポリメラーゼによるｐｌＶｃＡＴｌの転写後に得られる７１６の塩基のＲＮＡ生産物。インフルエンザウィルス配列がボールド体の文字により示され、ネコ遺伝子配列がブレーン文字により示され、そしてリンカ−配列がイタリック体で示されている。

ネコ遺伝子の開始コドンおよび停止コドンを表すトリブレット（アンチセンス方向性）がそれぞれ矢印および下線により示されている。

図１２．Ｔ７ポリメラーゼ転写のＲＮＡ生産物および試験管内のインフルエンザウイルスポリメラーゼ転写のＲＮＡ生産物。レーン１〜４　：　ｐ　ＩＶＣＡＴＬ、およびｐＨｇａＮＳからの放射能でラベルしたＴ７ボリメラーゼ転写産物のポリアクリルアミドゲル分析。レーン５および６：ラベルしないＩＶＡＣＡＴＩＲＮＡ鋳型およびＨｇａＮＳＲＮＡ鋳型を使用する精製したインフルエンザＡポリメラーゼタンパク質による試験管内の転写の放射能でラベルした生産物のポリアクリルアミドゲル分析。レーン１：８０ｎｔのＨｇａＮＳＲＮＡ０レーン２〜４　：　ＩＶＡＣＡＴＩＲＮＡの種々の製剤。レーン５　：　ＩＶＡＣＡＴＩＲＮＡのポリメラーゼ転写産物。レーン６　：　ＨｇａＮＳＲＮＡのウィルスポリメラーゼ転写産物。

第１３図、ＲＮＰ−形質移入およびその後の実験の略図。

第１４図、ＩＶＡＣＡＴＩＲＮＡでＲＮＰ−形質移入した細胞のネコアッセイ。

（Ａ）２９３の細胞に於けるＲＮＰ−形質移入の経過時間。細胞を一１時間で組み換えＰＮＰで形質移入し、そして０時間でウィルスて感染させた。細胞を示された時点で回収し、そしてネコ活性についてアッセイした。（Ｂ）反応混合物の２９３の細胞のパラメーターのＲＮＰ−形質移入の要件は示されるとうりであった。（Ｃ）ＭＤＣＫ細胞のＲＮＰ−形質移入。ＭＤＣＫ細胞をウィルス感染に対して一１時間または＋２時間てＩＶＡＣＡＴＩＲＮＡ−ポリメラーゼで形質移入した。細胞を回収し、そしてネコ活性を示された時間でアッセイした。成分／反応条件は示されるとうりであった。“時間”は細胞を回収する時点を示す。Ｔ＝Ｏはヘルパーウィルスの添加の時間を示す。”ＲＮＡ’はＩＶＡＣＡＴＩＲＮＡを表す。“Ｐｏｌ”は精製したインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ポリメラーゼタンパク質複合体である。“ＷＳＮ”はインフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ヘルパーウィルスを示す。“Ｐｒｅ−Ｉｎｃ、”は３０℃で３０分間の転写緩衝液中のＲＮＡおよびポリメラーゼのブレインキュベーションを示す。“ＰＮＰ形質移入 ”はウィルス感染に対するＲＮＰ形質移入の時間を示す。“＋／−″は特別な成分／特徴の存在または不在を示す。“Ｃ”は市販のネコ酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用する対照アッセイを示す。

第１５図１組み換えウィルスで感染させたＭＤＣＫ細胞に於けるネコ活性。ＲＮＰ−形質移入しヘルパーウィルスで感染させたＭＤＣＫ細胞からの上澄を使用して新しいＭＤＣＫ細胞を感染させた。接種物を感染の１時間後に除去し、細胞を１１時間後に回収し、ネコ活性をアッセイした。レーンｌ：ヘルパーウィルスのみで感染させた細胞の抽出物。レーン２　：　ＲＮＰ−形質移入しヘルパーウィルスで感染させたＭＤＣＫ細胞からの上澄１００μＩで感染させた細胞の抽出物。レーン３：レーン２からの細胞の上澄液（８０μｌ）。レーン４：ヘルパーウィルス（ＭＯＩ４）を接種物に添加した以外はレーン２と同じ。第４図に示された実験と対照的に、これらのアッセイは１４Ｃクロラムフエニコール２０μｌを含んでいた。

第１６図、形質移入実験に使用されたプラスミド中に含まれるノイラミニダーゼ（ＮＡ）の関係のある部分の線図。ｐＵｃ１９誘導プラスミドｐＴ３ＮＡｖはインフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウィルスＮＡ遺伝子およびバクテリオファージＴ３ＲＮＡポリメラーゼにより特異的に認識されるトランケートプロモーターを含む。使用されたＴ３プロモーターは、初期の転写ヌクレオチド（アデニン）がＷＳＮ　ＮＡ遺伝子の５”アデニンに相当するようにトランケートされる。ＮＡ遺伝子のｃＤＮＡコピーの３′末端で、Ｋｓｐ６３２■制限酵素部位は、開裂部位がＮＡ遺伝子配列の３′末端の直後に生じるように挿入された。１４０９のヌクレオチドの長い転写産物かＫｓｐ６３２Ｉ消化およびＰＴ３ＮＡｖのＴ３ＲＮＡポリメラーゼによる転写（下記の項目８．１に説明される）後に得られた。１５の５′末端ヌクレオチド、制限エンドヌクレアーゼ部位ＮｃｏＩとＰｓｔＩの間の領域に相当する５２のヌクレオチドおよび１２の３′末端ヌクレオチドが示されている。ｐＴ３ＮＡｖ変異体１の転写産物は、単一の欠失、野生型ＲＮＡの５ °末端から下流の１１のヌクレオチド以外はｐＴ３ＮＡｖの転写産物と同じである。ｐＴ３ＮＡｖ変異体２の転写産物は、中央領域（下線により示される）に配置された５の突然変異以外はｐＴ３ＮＡｖの転写産物と同じである。これらの５の突然変異は、その遺伝子の開放読み取り枠中のアミノ酸配列を変化させない。

位置８８７〜８８９のセリンコドンＵＣＣ（＋センスＲＮＡ）は同枠中でセリンコドンＡＧＵで置換された。ヌクレオチドのナンバリングはＨｉｔｉ　ら、１９８２、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４１　ニア３０−７３４に従う。

第１７図、保護されたインフルエンザウィルスから精製したＲＮＡのポリアクリルアミドゲル電気泳動。インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウィルスから誘導されたフェノール−抽出したＲＮＡのｐＴ３ＮＡｓのＲＮＡ転写産物（第１６図）を、下記の項目６．　１．　１に記載されたプロトコル後に精製ポリメラーゼ製剤と混合した。次に、これらの再構成したＲＮＰを、ＷＳＮ−ＨＫヘルパーウィルスで１時間前に感染させたＭＤＢＫ細胞に形質移入した。プラスミノーゲン２８ μｇ／ｍｌを含む培地を１６時間後に回収し、ウィルスを増幅し、プロテアーゼの不在下でＭＤＢＫ細胞にプラーク形成させた。次にプラークから得られたウィルスをＭＤＢＫ細胞で更に増幅し、下記の項目６．　１および下記の項目７．１に記載されたようにしてＲＮＡを精製したウィルス製剤からフェノール−抽出した。ＲＮＡをＴＢＥ緩衝液中で７．７Ｍの尿素を含む２．８％のポリアクリルアミド−０，０７５％のビスアクリルアミドゲルで分離し、そして下記の項目６．１に記載されたようにして銀染色により視覚化した。レーン１および６　：ＷＳＮ−ＨＫウィルスＲＮＡ、レーン２　：　ｐＴ３ＮＡｖ誘導ＮＡ　ＲＮＡでＲＮＰ−形質移入しヘルパーウィルスＷＳＮ−ＨＫで感染させた後にＭＤＢＫ細胞から保護されたウィルスのＲＮＡ０レーン３　：　ｐＴ３ＮＡｖから試験管内で転写されたＮＡ　ＲＮＡ０レーン４：対照ＷＳＮウィルスのＲＮＡ、レーン５：フェノール−抽出したＷＳＮウィルスでＲＮＰ−形質移入しヘルパーウィルスＷＳＮ−ＨＫで感染させた後にＭＤＢＫ細胞から保護されたウィルスのＲＮＡ。

第１８図、五つの部位特異的な突然変異を含む保護されたインフルエンザウィルスから得られたＲＮＡの配列分析。ＷＳＮ−ＨＫヘルパーウィルスによる感染後に、ＭＤＢＫ細胞を、ｐＴ３ＮＡＶ変異体２から転写により得られたＴ３ＮＡｖ変異体２ＲＮＡでＲＮＰ−形質移入した。２８μｇ／ｍｌのプラスミノーゲンの存在下で一夜インキユベートした後に、培地をプロテアーゼの不在下のＭＤＢＫ細胞での増殖およびプラーク形成に使用した。次に、プラークからのウィルスを増幅し、そして精製したウィルスのフェノール抽出後にＲＮＡを得た。ウィルス粒子中への変異体ＮＡ遺伝子の保護を、プライマーとしての５°−ＴＡＣＧＡＧＧＡＡＡＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＡ−３’　（位置８００−８１９に相当するＨ　Ｈｉｔｉら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４１ニア３Ｏ−７３４）および逆転写酵素（Ｙａｍａｓｈ　ｉ　ｔａら、１９８８゜Ｖｉｒｏｌ、　１６３：１１２−１２２）を使用する直接ＲＮＡ配列決定により確かめた。示された配列はＮＡ遺伝子の位置８７８−９３０に相当する（Ｈｉｔｉら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　４１ニア３Ｏ −７３４）。矢印および下線を施したヌクレオチドは、野生型のＲＮＡと較へた変異体ＲＮＡの変化を示す。左側・インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウィルスから得られた対照ＲＮＡ０右側：Ｔ３ＮＡｖ変異体２のＲＮＡてＲＮＰ−形質移入しヘルパーウィルスＷＳＮ−ＨＫて感染させたＭＤＢＫ細胞から保護された変異体ウィルスのＲＮＡ。

第１９図、ワクシニアウィルスで感染させ、ＩＶＡＣＡＴ−１で形質移入した細胞中のネコ発現。３５ｍｍの皿中の約１０’のマウスＣ１２７細胞を、それぞれのベクターに関して約ｌＯのＭ、○、■。

て組み換えワクシニアウィルス（Ｓｍｉｔｈら、１９８６）の混合物で感染させた。１．５時間後に、合成ＩＶＡＣＡＴ−Ｉ　ＲＮＰをＬｕｔ　ｊｙｅｓら、１９８９に記載されたようにしてウィルス感染細胞に形質移入した。細胞を一夜インキユベートし、回収し、そして通常の操作（Ｇｏｒｍ−ａｎら、＋９８２）に従ってネコ活性についてアッセイした。そのアッセイは０．０５μＣＩの［”Ｃ］　クロラムフェニコール、２０μｌの４０ｍＭのアセチル−Ｃｏ　Ａ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）及び０．２５Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ７，５）中の細胞抽出物５０μｌを含んでいた。インキュヘーション時間は約４時間であった。レーン数の下のラベルは細胞の処理を示す。レーン１一対照、レーン２−裸のＲＮＡ形質移入（ポリメラーゼを添加しなかった）、ヘルパーウィルスで感染させなかった。レーン３−ＰＮＰ形質移入、ヘルパーウィルスで感染させなかった。レーン４−ＰＮＰ形質移入、ヘルパーとしてのインフルエンザウィルス；レーン５−１ｌ−ＲＮＰ形質移入、へルバーウィルスとしてのワクシニアウィルスベクターは示されたインフルエンザウィルスタンパク質を発現する。

第２０図０種々の細胞系の試験。Ａ）細胞を、ＰＢ２　、ＦＢＩおよびＰＡタンパク質を発現するワクシニアウィルスで感染させ（レーン１．３．５．７）、またはＰＢ２　、ＰＢＩ　、ＰＡおよびＮＰタンパク質を発現するワクシニアウィルスで感染させ（レーン２．４．６．８）、ＩＶＡＣＡＴ−Ｉ　ＲＮＰて形質移入し、記載されたようにしてネコ活性について試験した。レーン１．２：マーデンーダービイ犬腎臓（ＭＤ　ＣＫ）細胞：レーン３．４：ヒーラ−細胞、レーン５．６：２９３細胞（Ｇｒａ、ｈａｍら、１９７７Ｊ、　ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ　３６　：５９−７２）　；　レーン７．８：Ｌ細胞。Ｂ）細胞系３ＰＮＰ−４を宿主細胞として使用した。それぞれの試料で発現されたインフルエンザウィルスタンパク質かそれぞれのレーンの下に示されている。Ｃ）２９３の細胞を四つの必要とされるワクシニアで感染させ、そしてＩＶＡＣＡＴ−Ｉ　ＲＮＡ（レーン１）またはＩＶＡＣＡＴ−２ＲＮＡ（レーン２）を使用してつくった合成ＲＮＰて形質移入した。

−夜インキユベートした後、細胞を回収し、そしてネコアッセイ本発明は、適当な宿主細胞内で異種遺伝子産物を発現させるために、そして／またはウィルス粒子中に異種遺伝子を救助するために、ウィルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと共に使用しうる組み換えネガティブ鎖ウィルスＲＮＡ鋳型の構築および使用に関する。ＲＮＡ鋳型はバクテリオファージＴ７、Ｔ３またはＳｐ６ボリメラーゼのようなりＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて適当なりＮＡ配列を転写することにより作製できる。インフルエンザを使用する場合、例えば、ＤＮＡはインフルエンザのウイルスポリメラーゼ結合部位／プロモーターの相補鎖、すなわちインフルエンザのゲノムセグメントの３′末端の相補鎖、にＡＴＧの上流で隣接した異種遺伝子配列のメツセージ−センスをコードするように構築される。ウィルス粒子への救助の場合には、異種コード配列をインフルエンザのゲノムセグメントの３′末端と５′末端の両方の相補鎖に隣接させることか好適である。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる転写後、得られるＲＮＡ鋳型は異種遺伝子配列のネガティブ極性をコードし、ウィルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼか鋳型を認識できるようにするｖＲＮＡ末端配列を含むだろう。

組み換えネガティブセンスＲＮＡ鋳型は、全ウィルスから調製されたＰＮＰコアから単離しうるウィルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｐタンパク質）と核タンノくり質（ＮＰ）から成る精製ウィルスポリメラーゼ複合体と混合して、“組み換えＰＮＰ“　（ｒＲＮＰ）を形成させる。これらのｒＲＮＰは感染性であり、適当な宿主細胞で異種遺伝子産物を発現させるために、またはｒＲＮＰとウィルスによる宿主細胞の同時トランスフェクションによりウィルス粒子中に異種遺伝子を救助するために使用される。また、組み換えＲＮＡ鋳型は相補性を可能にするＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質を発現する形質転換細胞株をトランスフェクトするために使用される。

本発明は、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスＮ５ＲＮＡの２２個の５ ′末端および２６個の３′末端ヌクレオチドに挟まれた、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のｍ−ネガティブセンス方向のｍ −コード領域を含むクローン化ＤＮＡのＲＮＡ転写産物か単離したインフルエンサＡウィルスポリメラーゼタンパク質と混合された実施例により実証される。この再構築されたリボ核タンパク質（ＰＮＰ）複合体はインフルエンザウィルスを感染させたＭＤＣＫ　（または２９３）細胞にトランスフェクトした。ＣＡＴ活性はウィルス感染前と直後にはごくわずかであったか、ウィルス感染の７時間後では容易に証明できた。この“救助（ｒｅｓｃｕｅ）“実験からの出芽ウィルスを含む細胞上清を使ってＭＤＣＫ細胞の新たな単層に感染させると、ＣＡＴ活性がやはり検出され、このことは組み換えＣＡ、Ｔ遺伝子を含むＲＮＡがウィルス粒子内にパッケージングされたことを示唆している。これらの結果は、組み換えネガティブ鎖ウィルスＲＮＡ鋳型と精製ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用することにより、組み換えインフルエンザウィルスＰＮＰを再構築しうろことを示している。さらに、データは、インフルエンザウィルスＲＮＡの２２個の５′ 末端および２６個の３′末端配列かＲＮＡ転写、ＲＮＡ複製およびインフルエンザウィルス粒子へのＲＮＡのパッケージングのためのシグナルを与えるのに十分であることを示唆している。

この方法論を使って、我々はまた、安定した感染性インフルエンザウィルスへの、適当な組み換えプラスミドＤＮＡ由来の、合成ＲＮＡの救助を立証した。特に、インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウィルス（ＷＳＮ）のノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子に対応するＲＮＡをプラスミドＤＮＡからｉｎ　ＶｉｔｒＯで転写し、精製インフルエンザウィルスポリメラーゼ複合体の添加後、ＭＤＢＫ細胞へトランスフェクトした。ＷＳＮ　ＮＡ遺伝子を欠くヘルパーウィルスと重感染させると、ＷＳＮ　ＮＡ遺伝子を含むウィルスが放出された。その後、我々は、プラスミドＤＮＡのカセット式変異誘発によりＷＳＮ　ＮＡ遺伝子に５つの点変異を導入した。

救助されたウィルスの配列分析により、このゲノムは変異プラスミド中に存在する５つの変異を全て含むことが明らかになった。

この技法を使って部位特異的変異誘発によりウィルスをつ（ることかでき、これにより特定の生物学的性質を有するインフルエンザウィルスを遺伝子操作することができる。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＲＮＰを再構築する能力は、外来遺伝子を発現する新規なキメラインフルエンザウィルスのデザインを可能にする。

この目標を達成させる１つの方法は、現存するインフルエンザウィルス遺伝子を修飾することを含む。例えば、ＨＡ遺伝子はその外部ドメインに外来配列を含むように修飾しつる。異種配列が病原体のエピトープまたは抗原である場合、これらのキメラウィルスを使って病気の原因物質（これから抗原決定基か誘導される）に対する防御免疫反応を引き出すことかできる。表面タンパク質をコードする遺伝子を修飾するほかに、非表面タンパク質をコードする遺伝子も変更しつる。

後者の遺伝子はインフルエンザウィルス系において大部分の重要な細胞免疫反応と関係していることが判明した（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８５．　Ｃｅ１ｌ　４２：４７５−４８２）　、従って、インフルエンザウィルスのＮＰまたはＮＳ遺伝子中に外来抗原決定基を導入すると、感染後に、この抗原決定基に対する効果的な細胞免疫反応を引き起こすだろう。この種の手法は、防御免疫が細胞免疫反応の誘発に依存する場合（例えば、マラリアなど）に特に役立つだろう。

キメラインフルエンザウィルスを介して外来タンパク質（またはこのようなタンパク質のドメイン）を発現させる別の手法は、ウィルスへの完全な異種遺伝子の導入に関係がある。８本より多いＲＮＡセグメントを有するインフルエンザウィルス調製物は以前に開示された（Ｎａｙａｋ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ＩｎｆｌｕｅｎｚａＶｉｒｕｓ、　Ｐ、　Ｐａ１ｅｓｅ　ａｎｄ　Ｄ、　Ｗ、　Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ、　ｅｄｓ、、　Ｓｐｒｉｎｇ− Ｖｅｒｌａｇ。

Ｖｉｅｎｎａ、　ｐｐ、　２５５−２７９　）　。かくして、９本以上のＲＮＡセグメントを有するインフルエンザウィルスが生存可能であり、このようなキメラウィルスの正しいパッケージングが容易に起こるだろう。

本発明は、制限するためではなく、単に説明するために、次の段落に分割される＝　（ａ）組み換えＲＮＡ鋳型の構築：　（ｂ）組み換えＲＮＡ鋳型を使用する異種遺伝子産物の発現：および（Ｃ）組み換えウィルス粒子への異種遺伝子の救助。議論を明確にするために、インフルエンザを使用する以下のサブセクションにおいて本発明を説明する。あらゆるインフルエンザ株（例えばＡ、Ｂ、Ｃ）が使用される。しかし、この原理は他のネガティブ鎖ＲＮＡウィルス鋳型およびキメラウィルス（バラミクソウィルス、例えばパラインフルエンザウィルス、麻疹ウィルス、ＲＳウィルス；プンヤウイルス；アレナウイルスなどを含み、これらに限定されない）を構築するために同様に適用される。本発明に従って使用される特に興味のもてるウィルス系はＤｈｏｒｉと呼ばれるオルトミクソ様昆虫ウィルスである（Ｆｕｌｌｅｒ、　１９８７．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６０：　８１８７）。

５．１１組み換えＲＮＡ鋳型の構築異種遺伝子コード配列は、ウィルスポリメラーゼ結合部位／プロモーターの相補鎖、例えば３゛−インフルエンザウィルス末端の相補鎖、或いは３″及び５゛− インフルエンザウィルス末端の両者の相補鎖に接しているが、当該技術において知られた手法を用いて構築される。これらの雑種配列を組み換えＤＮＡ分子をクローニングして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えばバクテリオファージＴ７、Ｔ３又はＳｐ６ポリメラーゼ等によって転写すると、適当なウィルス配列を有する組み換えＲＮＡ鋳型を生成し、これらのウィルス配列はウィルスポリメラーゼの認識および活性を可能にする。

これらの雑種分子を構築する一つの試みは、異種コード配列をインフルエンザウィルスのゲノムセグメントのＤＮＡ相補鎖に挿入することであり、そうすることによって、異種配列はウィルスポリメラーゼ活性に必要とされるウィルス配列；すなわちウィルスポリメラーゼ結合部位／プロモーター（以下ウィルスポリメラーゼ結合部位と言う）に隣接される。その他の試みでは、ウィルスポリメラーゼ結合部位をコードするオリゴヌクレオチド、例えばウィルスゲノムセグメントの３°−末端または両末端を異種コード配列に連結することにより、雑種分子を構築することができる。

ターゲット配列への外来遺伝子又は外来遺伝子セグメントの配置は以前にはターゲット配列内の適当な制限酵素部位の存在により支配された。しかし、分子生物学における最近の進歩は、この問題を非常に小さなものとしている。制限酵素部位は、部位特異的突然変異誘発（例えば、この技術については、Ｋｕｎｋｅｌ、　１９８５゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪ、Ｓ、Ａ、　８２：　４８８参照）の使用によりターゲット配列のどこへても容易に挿入することができる。以下に記載されるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術の製法により、配列（すなわち、制限酵素部位）の特異的挿入ができるようになり、そして雑種分子の容易な構築ができるようになった。一方、ＰＣＲ反応は、クローニングの必要なしに組み換え鋳型を作製するために使用できるだろう。例えば、ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、バクテリオファージＴ３、Ｔ７又は５ｐ６）を含有する二重ｆｆ１ＤＮＡ分子及び異種遺伝子とインフルエンザウィルスポリメラーゼ結合部位を含有する雑種配列を作製するために使用されるだろう。次いで、ＲＮＡ鋳型は、この組み換えＤＮＡから直接的に転写することができる。さらに別の実施態様においては、組み換えＲＮＡ鋳型は、異種遺伝子のネガティブ極性を特定するＲＮＡとウィルスポリメラーゼ結合部位をＲＮＡリガーゼを使用して連結することにより製造される。本発明に関して使用される、ウィルスポリメラーゼ活性及び構築物に関する配列必要条件は、以下のサブセクションで説明する。

５　、１．１　ポリメラーゼ活性に要求されるウィルス３−末端以下のセクション６以後に記載されている実験は、ネガティブ−センスＲＮＡウィルスのポリメラーゼに対するプロモーター配列を特定することが最初であり、その特異性は３ °−末端１５ヌクレオチドに位置していることが見い出された。これ等のウィルスポリメラーゼ結合部位配列並びに機能上回等の配列は、本発明にしたがって使用される。例えば、置換、挿入、欠失、付加又は逆位を包含する、類似した活性を示す機能的に同等の配列か利用されている。以下に記載されているウィルスポリメラーゼによるＲＮＡ合成は、以下の理由のためにインフルエンサウイルスポリメラーゼによる特異的確認及び伸長のためのモデルである：（ａ）ＡｐＧてブライミングしたとき、このポリメラーゼは高い活性を持ち、ウィルスポリメラーゼに特徴的である；　（ｂ）ウィルスＲＮＰに有効であることか以前に示された、温度及びイオン条件でそれは最適の活性を示す：　（Ｃ）このポリメラーゼは、モデルＲＮＡ鋳Ｙでインフルエンザウィルス配列に対して特異的である：（ｄ）このポリメラーゼは、インフルエンザウィルスの特徴であるＣａｐ−エンドヌクレアーゼ開始ＲＮＡ合成に活性がある：（ｅ）ｃａｐ供与ＲＮＡの認識は、ｃａｐｌ構造に特異的である；そして（ｆ）ゲノムＲＮＡセグメン１〜か特異的にコピーされる。

５　、１．２　末端パンハンドル（ＰＡＮＨＡＮＤＯＬＥ）は最適認識及びウィルスポリメラーゼによる合成に必要てない本発明者等は、インフルエンザウィルスセグメントＲＮＡ塩基対かそれらの末端においてパンハンドル構造を形成することを既に示した。これは、２つの方法によって成し遂げられる。ブソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）の架橋試薬誘導体は、完全ウィルス又は感染細胞からのＲＮＰ中の各々のセグメントの末端に共存結合させた（Ｈｓｕ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４：８１４０−８１４４）。

処理されたＲＮＡは、架橋末端のために電子顕微鏡で環状に見えた。同様に、ＲＮＰ中のＲＮＡ末端は、二本鎖ＲＮ　Ａを認識して切断するりボヌクレアーゼＶｌに感受性であることか見い出されたか、ウィルスポリメラーゼはパンハンドル構造へ両末端が結合していることが見い出された（Ｈｏｎｄａ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１０４：　１０２１−１０２６）。これらの研究において、ゲノムＲＮＡのパンハンドル構造の存在か示され、そしてポリメラーゼ認識の役割を演じていると推論される。記載した実施例に使用された鋳型ＲＮＡは、もともとパンハンドル特異的タンパク質結合を示すために作製されたか、末端パンハンドルは、ここで研究したポリメラーゼ反応において明らかな役割をもたないことか分かった。

鋳型か、野生型ネガティブセンス３”末端を持つ場合、ウィルスポリメラーゼは、最大効率でＲＮＡを合成することが分かった。

無関係の配列のＲＮＡはコピーされず、また３゛末端に追加のポリリンカー配列をもつものはあまり効率よくコピーされないことが判明した。正確な配列のＤＮＡは、同様に鋳型として不適当てあった。Ｍ−ｗｔ鋳型は、非常に低レベルのみで転写されたのて、この反応は高度に特異的であった。たとえ、本発明者らのポリメラーゼ供給源か、完全なウィルスであっても、ウィルスセンスＲＮＡを認識するポリメラーゼかプラスセンス鎖を効率よくコピーし。

ないということは、今まてに示唆されていないので、この発見は非常に驚くべきことであった。相補鎖ＲＮＡがゲノム鋳型にコピーされる感染後の時点で感染細胞から精製したポリメラーゼの特異性を調べるための研究が進行中である。現在のデータは、プロモーターの認識によりｖＲＮＡをコピーするウィルスポリメラーゼかｃＲＮＡからｖＲＮＡを合成するものと機能的に相違するというモデルを支持する。感染細胞中のポリメラーゼの調節された修飾によって、それかプラスセンスＲＮＡの３゛末端を認識できるようになる可能性かある。プロモーター変異株を分析することにより、本発明者等は、この反応の優れた特異性を研究し、そして有意に低いレベルの合成をもたらしたたった１つの突然変異はＶＡ　ｘ　ＲＮ　Ａのものてあったことを見いだした。さらに、３，５゜８および１０位での２以上の点変異の組合わせは合成レベルを非常ＰＢ２、ＰＢＩ、ＰＡおよびＮＰタンパク質をコードする遺伝子セグメントは、それらの５′末端の２４−４５個の非翻訳ヌクレオチドと、それらの３′末端の２２−５７個の非翻訳ヌクレオチドと共に単一のオープン・リーディング・フレームを含む。これらのセグメントへの外来遺伝子配列の挿入は、外来遺伝子によるウィルスコード領域の完全置換または部分置換により達成されるだろう。多分、完全置換はＰＣＲ誘導突然変異誘発の使用により最大限に達成されるだろう。この突然変異誘発法の原理は図１Ｏに示しである。簡単に説明すると、ＰＣＲ−プライマーＡは、５′から３′ の方向−２、唯一の制限酵素部位、例えばクラスＪＩＳ制限酵素部位（すなわら、“シフター（ｓｈｉｆｔｅｒ）”酵素：これは特定の配列を認識するが、その配列の上流または下流のＤＮＡを切断する）、インフルエンサ遺伝子セグメントの全３′非翻訳領域、および外来遺伝子産物のカルボキシ末端コード部分に相補的なヌクレオチドの広がりを含むだろう。ＰＣＲ−プライマーＢは、５′末端から３′末端の方向へ、唯一の制限酵素部位；末端切断型であるか活性なファージポリメラーゼ配列；インフルエンザ遺伝子セグメントの全５′非翻訳領域（ネガティブセンスｖＲＮＡに関して）；および外来遺伝子の５′コ一ド部分に対応するヌクレオチドの広がりを含むだろう。外来遺伝子のクローン化コピーと共にこれらのプライマーを使用するＰＣＲ反応の後で、唯一の制限部位を使って生成物を切りだし、クローニングする。クラスＩＩＳ酵素ての消化および精製ファージポリメラーゼによる転写は、外来遺伝子挿入と共にインフルエンザウィルス遺伝子セグメントの正確な非翻訳末端を含むＲＮＡ分子を生成するだろう。このような構築物は以下のセクション７に記載の実施例において使用するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子に関して説明する。別の実施態様ては、Ｒ，Ｎ　Ａ鋳型かクローニングせずに直接転写されるように、バクテリオファージプロモーター配列とハイブリッド遺伝子配列を含む二本鎖ＤＮＡを作製するためにＰＣＲ反応が利用されるだろう。

外来遺伝子産物の完全性と構築の目的によれば、融合タンパク質の発現を導くハイブリッド配列を構築することが望ましい。例えば、４種類のインフルエンザウィルスタンパク質ＰＢ２、ＰＢｌ、ＰＡまたはＮＰは、そのタンパク質中に存在する特定配列により感染細胞の核に導かれるポリメラーゼタンパク質である。ＮＰの場合、このアミノ酸配列は（−文字表記）ＯＬＶＷＭＡＣＮＳＡＡＦＥＤＬＲＶＬＳであることか分かった（Ｄａｖｅｙ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８５、　Ｃｅ１ｌ　４０：６６７−６７５　）　。従って、外来遺伝子産物を核へ導くことを望む場合（単独では通常そのようにしない場合）、ハイブリッドタンパク質はそれをそこへ指向させるドメインを含むように遺伝子操作されるだろう。このドメインは、必ずしもそうではないが、インフルエンザウィルス由来のものであり得る。また、ハイブリッドタンパク質は、それらかインフルエンザウィルスによる複製に必要な配列（３′非翻訳領域など）を含む限り、非つ° 　イルス源からも作ることができる。

他の例としては、ウィルス遺伝子産物のある種の抗原領域を外来配列と置換することかできる。Ｔｏｗｎｓｅｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８５，Ｃｅ１１４２　：　４７５−４８２）は、活発なＣＴＬ　（細胞障害性Ｔ細胞）反応を誘発しうるＮＰ分子内のエピトープを同定した。このエピトープはＮＰタンパク質の残基１４７−１６１にわたり、アミノ酸ＴＹＱＲＴＲＱＬＶＲＬＴＧＭＤＰから成る。二〇ＮＰ配列の代わりに短い外来エピトープを使用すると、外来抗原に対する強い細胞免疫反応が誘起される。逆に、この１５アミノ酸領域を含む外来遺伝子産物の発現はまた外来タンパク質に対する強い細胞免疫反応を誘発させるのに役立つだろう。

５．１．５　ＨＡまたはＮＡ遺伝子配列への異種遺伝子配列の挿入側々の遺伝子セグメントによりコードされるＨＡおよびＮＡタンパク質は、このウィルスの主要な表面積タンパク質である。その結果、これらのタンパク質は感染後の体液免疫反応の主要なターゲットである。それらは全てのインフルエンザウィルスタンパク質のうちで最も広範に研究されており、両タンパク質の三次元構造が解明されている。

Ｈ３赤血球凝集素の三次元構造は多数の変異体の配列情報と共にＨＡ分子上の抗原部位の解明を可能にした（Ｗｅｂｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８３、　Ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｖｉｒｕｓ、　Ｐ、　Ｐａ１ｅｓｅ　ａｎｄ　Ｄ、　Ｗ。

Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ、ｅｄｓ、、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−’／ｅｒｌａｇ、Ｖｉｅｎｎａ、ｐｐ、１２７−１６０　）。

これらの部位はＨＡの表面上の４つの異なる非重複領域にある。

これらの領域は高度に可変的であり、挿入や欠失を許容しうろことが分かった。

かくして、外来タンパク質の一部によるＨＡ内のこれらの部位（例えば、部位Ａ：Ａ／ＨＫ／６８　ＨＡのアミノ酸１２２−１４７）の置換は、この外来ペプチドに対する活発な体液免疫反応を与えるだろう。異なる手法では、ウィルス配列を欠失せずに抗原部位内に外来ペプチド配列を挿入することかできる。このような構築物の発現産物は外来抗原に対するワクチンに有用であり、実際、初期に論じられた問題、すなわちワクチン接種宿主内での組み換えウィルスの増殖を回避しつる。抗原部位にのみ置換を有する完全なＨＡ分子はＨＡ機能を可能にし、従って生存可能なウィルスの構築を可能にするだろう。かくして、このウィルスは追加のヘルパー機能を必要とせずに増殖することができる。もちろん、事故による漏れの危険を避けるためにウィルスを他の方法で弱毒化すべきである。

他のハイブリッド構築物は細胞表面のタンパク質を発現させるために、あるいはそれらを細胞から放出させるために作られる。

表面積タンパク質として、ＨＡは細胞表面への輸送に必要なアミノ末端の切断可能なシグナル配列と、膜定着に必要なカルボキシ末端配列をもっている。細胞表面で完全な外来タンパク質を発現させるために、これらのＨＡシグナルを使ってハイブリッドタンパク質を作る必要があるだろう。また、輸送シグナルだけが存在して膜定着ドメインが存在しない場合は、タンパク質は細胞から分泌されるだろう。

ＮＡタンパク質の場合、その三次元構造は知られているが、抗原部位は分子の表面に広がっており、重複している。このことは、ある配列をＮＡ分子内に挿入して、ＮＡの外面でそれを発現させる場合に、それが免疫原性であることを示している。さらに、表面積タンパク質として、ＮＡはＨＡタンパク質と２つの点で非常に相違している。第一に、ＮＡは切断可能なシグナル配列を含まない；実際に、アミノ末端シグナル配列は膜定着ドメインとして作用する。この結果、ＮＡとＨＡとの第二の相違は、ＮＡが膜中でアミノ末端により方向づけられ、一方ＨＡが膜中でカルボキシ末端により方向づけられる点である。従って、ハイブリッドＮＡタンパク質はＨＡ融合ハイブリッドと反対に方向づけられるので、いくつかの場合にはハイブリッドＮＡタンパク質を構築することが育利であるだろう。

５．１．６　ＮＳおよびＭ遺伝子セグメントへの異種遺伝子の挿入インフルエンザウィルスの他の６本の遺伝子セグメントと比べてＮＳおよびＭセグメントの特異な性質は、これらのセグメントが少なくとも２つのタンパク質産物をコードすることである。それぞれの場合に、一方のタンパク質はゲノムＲＮＡと共直線性であるｍＲＮＡによりコードされ、他方のタンパク質はスプライスされたメツセージによりコードされる。しかしながら、スプライス供与部位は共直線性転写産物のコード領域内に存在するので、ＮＳＩとＮＳ２タンパク質は同一の１０アミノ酸アミノ末端をもち、一方ＭｌとＭ２は同一の１４アミノ酸アミノ末端をもつ。

この特異な構造の結果として、組み換えウィルスは第二の産物を損なわないようにしつつこのセグメント内に遺伝子産物を置くように構築することができる。例えば、外来遺伝子産物による大部分のＮＳ２またはＭ２コード領域の置換（スプライス受容部位を保持する）は、完全なＮＳＩまたはＭ１タンパク質とＮＳ２またはＭ２の代わりに融合タンパク質の発現をもたらすだろう。これとは別に、ＮＳＩまたはＮＳ２の発現に影響を与えずに、ＮＳ遺伝子セグメント内に外来遺伝子を挿入することもできる。大抵のＮＳ遺伝子はＮＳＩおよびＮＳ２リーデイング・フレームの実質的な重複を含むが、ある種の天然ＮＳ遺伝子は含まない。我々は、Ａ／Ｔｙ／○ｒ／７１ウィルスからのＮＳ遺伝子セグメントを分析しくＮｏｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５６：２０４ −２１３　）　、この特殊な遺伝子では、ＮＳＩタンパク質がＮＳ遺伝子セグメントのヌクレオチド位置４０９で終結し、ＮＳ２のスプライス受容部位がヌクレオチド位置５２８にあることを見いだした。従って、外来遺伝子はいずれのタンパク質にも影響を与えずにＮＳＩコード領域の終結コドンとＮＳ２コード領域のスプライス受容部位の間に配置することができるだろう。タンパク質の生産を確実にするために、外来遺伝子配列の５′末端にスプライス受容部位を含めることが必要であるかもしれない（これはＮＳＩのアミノ木端を含むハイブリッドタンパク質をコードするだろう）。この方法では、組み換えウィルスを損なわずに、しかもヘルパー機能を必要とせずに増殖させることができるだろう。

インフルエンザウィルスゲノムは８本の機能的な遺伝子セグメントから成るが、ウィルスが実際のセグメントを何本パッケージしているのか分かっていない。インフルエンザは８本より多い、恐らく１２本までの、セグメントをパッケージしうることが示唆された（Ｌａｍｂ　ａｎｄ　Ｃｈｏｐｐｉｎ、１９８３．　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５２：４６７−５０６）。コノコとは、“ ９番目”の遺伝子セグメントが外来遺伝子産物を発現するようにデザインしつるという点て、組み換えウィルスのより簡単な増殖を可能にするだろう。この“９番目”のセグメントは一部のウィルスに組み込むことかできるが、し１くつかの選択が与えられない限り、それはウィルスの増殖中に速やかに失われるだろう。

これはＮＳまたはＭ遺伝子セグメントを“アンカップリング（ｕｎｃｏｕｐ　ｌ　ｉｎｇ）”することにより達成される。ＮＳ２コ一ド部分をＮＳ遺伝子セグメントから取り出し、（適当なスプライシングシグナルと共に）外来タンノ（り質をコードする遺伝子セグメント上に配置する。あるいは、内部開始点かこれらのウィルス配列を“アンスプライス（ｕｎｓｐｌｉｃｅ）”できるようにニジストロンｍＲＮＡを構築する：例えば、Ｐｅ１ｌｅｔｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８、　Ｎａｔｕｒｅ　３３４：３２０−３２５に記載される配列を使用する。

得られた“アンカップリングされたＮＳまたはＭ遺伝子をもつ組み換えウィルスは独力で増殖することかでき、また必然的に“９番目”の遺伝子セグメントをパッケージしなければならず、かくして外来遺伝子の発現が確実になるだろう。

５．２９組み換えＲＮＡ鋳型を使用する異種遺伝子産物の発現上記のようにして作製した組み換え鋳型は、適当な宿主細胞で異種遺伝子産物を発現させるために、または異種遺伝子産物を発現するキメラウィルスを作るために、いろいろな方法で使用される。一実施態様ては、組み換え鋳型を以下のセクション６に記載した通りに精製したウィルスポリメラーゼ複合体と組み合わせて感染性のｒＲＮＰを形成することかできる。また、組み換え鋳型は組み換えＤＮＡ法を使って調製したウィルスポリメラーゼ複合体と混合してもよい（例えば、Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７゜Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５６：３９６−４０３　）。このようなｒＲＮＰは、適当な宿主細胞をトランスフェクトするために使用する場合、異種遺伝子産物を高レベルで発現させることができる。高レベル発現を与える宿主細胞系にはウィルス機能を補足する連続細胞株、例えばインフルエンザと重感染される細胞株、インフルエンザウィルス機能を補足するように遺伝子操作された細胞株などが含まれる。

本発明の別の実施態様では、組み換え鋳型またはｒＲＮＰは、異種遺伝子産物の発現を達成するために、ウィルスポリメラーゼタンパク質を発現する細胞株をトランスフェクトするために使用される。このために、３Ｐ−３８や３　Ｐ　−１３３（Ｋｒｙｓｔａｌ　ｅｔａｌ、、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：２７０９−２７１３）のような３種類全てのポリメラーゼタンパク質を発現する形質転換細胞株が適当な宿主細胞として利用しうる。宿主細胞は他のウィルス機能やＮＰのような追加の機能を与えるように同様に遺伝子操作することができる。

５．２．１　ウィルスポリメラーゼの精製ｒＲＮＰを作るために使用するウィルスポリメラーゼタンパク質は、全ウィルスから単離された解離ＰＮＰコアから精製することかできる。一般に、ＰＮＰコアは標準方法を使って調製する（Ｐｌｏｔｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、１９８１．　Ｃｅ１ｌ　２３：８４７−８５８；　Ｒｏｃｈａｖａｎｓｋｙ、１９７６゜Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７３：３２７−３３８）、その後、プールしたＲＮＰ：ＩアをＨｏｎｄａｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０４：１０２１−１０２６に記載されるようにＣｓＣ１の第二勾配（１，５−３，０Ｍ）およびグリセロール（３０−４５％）で遠心する。勾配の頂部、すなわち１．５−２．０Ｍ　Ｃ５ｃＩに関係しかつＨｏｎｄａ　ｅｔ　ａｌ、か“ＮＰ”と同定した画分に相当する勾配の領域から、活性ウィルスポリメラーゼ画分を単離する。意外にも、この両分は活性複合体に必要とされるウィルスポリメラーゼタンパク質を全部含んでいる。さらに、勾配の底部から回収されるＰタンパク質は必要でなく、実際に全長ウィルスＲＮＡの転写をもたらさない。従って、いわゆる“ＮＰ”画分は、ＮＰのほかに、活性型のＰＢ２、ＰＢＩおよびＰＡタンノくり質を含むと考えられる。

高濃度のウィルスポリメラーゼ複合体は、このウィルス特異的キャップ−エンドヌクレアーゼプライム転写を触媒することができる。下記６項で明記された条件下で、２００９ｇの３個のＰタンノくり質と約５０ｎｇのＮＰが５−１０ｎｇのＲＮＡ反応と最適に反応するのが見い出された。ＮＰはインビボでインフルエンザｖＲＮＡまたはｃＲＮＡを選択的にキャプシドに包むが、ＮＰはＲＮＡにインビトロて非特異的に結合することが観察されている（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙら、１９８７．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５６：　３９６−４０３；　５ｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋおよびＢｅｃｈｔ。

１９７１、．１．　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　１０：　１ｌ−１６）　、恐らくウィルスポリメラーゼか我々のインビトロ反応中でウィルス鋳型ＲＮＡ５を認識するためには、それらかＮＰによりキャプシドに包まれねばならない。

したかって、キャップしたｍＲＮＡプライマーを添加することは、ＮＰ結合をめざして鋳型ＲＮＡと本質的に競合するであろう。ジヌクレオチドＡｐＧはＮＰに結合することか期待されていないので、低濃度ポリメラーゼはＡｐＧを有する短い鋳型だけを用いることかできた。この仮定を支持するのは高濃度のポリメラーゼ調製物か漸増量の鋳型ＲＮＡまたは任意の非特異的ＲＮＡの添加により阻害されるという観察である。ウィルスＲＮＰｓに以前示されたｍ７ＧｐｐｐＸｍキャップｌ構造への異常な特異性は再構成したＲＮＰｓにも見い出されることにもまた注目すべきである。

５．２．３　ゲノム長ＲＮＡ鋳型は効率的にコピーされるＡ／ＷＳＮ／３３ウィルスのセグメント８と同一のプラスミド由来ＲＮＡはポリメラーゼにより特異的にコピーされた（図１Ｏに記載されたＰＣＲ法を用いて）。ウィルスから抽出されたＲＮＡを用いる反応において、８セグメントは全てコピーされるが、ＨＡ遺伝子は低いレベルでコピーされた。これらの反応におけるノくツクグランドは、３Ｏ−５３ｎｔ鋳型に比べて低下するが、恐らくポリメラーゼ調製物中の混合しているＲＮＡ５か圧倒的な小さなサイズの欠陥ＲＮＡ５だからである。この系において転写される外来遺伝子をコードしている鋳型はウィルス粒子中の遺伝子操作された遺伝子をレスキューするために用いられる。

５．３．キメラネガティブ鎖ＲＮＡウィルスの調製キメラウィルスを調製するために、外来タンノくり質をコードする修飾インフルエンザウィルスＲＮＡ５またはＲＮＡを含存する再構成されたＲＮＰｓは“親″インフルエンザウィルスにも感染されている細胞をトランスフェクトするのに用いられる。一方、再構成ＰＮＰ調製物は野生型親ウィルスのＲＮＰｓと混合され間接的にトランスフェクションに用いられる。再組み合せに続いて、新規ウィルスは単離され、それらのゲノムはハイブリダイゼーション分析により固定される。感染性キメラ状ウィルスを産生ずるためにこの中で記載された補足的な方法において、ｒＲＮＰｓはインフルエンザウィルスポリメラーゼタンパク質を発現する宿主細胞系中で複写される（例　ウィルス／宿主細胞発現系、ポリメラーゼタンパク質は発現するために遺伝子操作された形質転換細胞系、等）。したがって感染性キメラウィルスはレスキューされる。すなわちこの場合においてヘルパーウィルスは利用される必要はない。なぜならこの機能は発現されたウィルスポリメラーゼタンパク質により提供されるからである。特に所望の方法において、インフルエンザウィルス８セグメント全てを遺伝子操作されたｒＲＮＰｓで感染された細胞は所望の遺伝子型を含有する感染性キメラウィルスの産生を生じる。したがって選択方法の必要を除外する。

理論的には８遺伝子セグメントのどれかまたは８セグメントのどれかの一部を外来配列で置換することができる。しかしながら、この等式の必要な部分は欠陥ウィルスを増殖させる能力である（欠陥というのは正常なウィルス遺伝子産物が失われているかまたは変化しているからである）。多くの方法がこの問題を回避するために可能である。ＰＢ２およびＮＰタンパク質に欠陥のあるインフルエンザウィルスの突然変異株がポリメラーゼおよびＮＰタンパク質を構成的に発現するように構築された細胞系において実質的により高い力価に増殖できることを我々は示した（Ｋｒｙｓｔａｌら、１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３：　２７０９−２８１３）。類似の方法は、どのインフルエンザ遺伝子も構成的に発現する形質転換細胞系を構築するために用いられる。ウィルスタンパク質を発現するために作られたこれらの細胞系は組み換えウィルスの欠陥を補完し、したかってそれを増殖させるために用いられる。

一方、いくつかの、天然宿主範囲方法が組み換えウィルスを増殖させるために入手可能である。この方法の一例は天然インフルエンザ単離体ＣＲ４３−３に関する。このウィルスは第１次ヒヨコ腎臓細胞（Ｐ　ＣＫ）で継代した場合正常に増殖するが、インフルエンザの天然の宿主であるマディンーダービイ（Ｍａｄｉｎ −Ｄａｒｂｙ）犬腎臓細胞（ＭＤＣＫ）では増殖しない（Ｍａａｓｓａｂ　＆　ＤｅＢｏｒｄｅ、１９８３゜Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１３０：　３４２−３５０）　。我々がコノウィルスを分析しり時、それが１２アミノ酸の欠失により生じた欠陥ＮＳＩタンパク質をコードすることを我々は見い出した。ＰＣＫ細胞は欠陥ＮＳＩタンパク質を補完するかまたは欠陥タンパク質を完全に置換することができるある活性を含有している。

組み換えウィルスを増殖させる３番目の方法は野生型ウィルスとの共同培養を必要とする。これは単に組み換えウィルスを取り出し、これともうひとつの野生型ウィルス（好ましくはワクチン用株）で細胞を共感染させることによりなされうる。この野生型ウィルスは欠陥ウィルス遺伝子産物を補完し野生型および組み換えウィルス両方の増殖を可能にすべきである。これはインフルエンザウィルスの欠陥干渉粒子の増殖に類似の状況であろう（Ｎａｙａｋら、１９８３．　Ｉｎ：　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、　Ｐ、　Ｐａ１ｅｓｅおよび　Ｄ、Ｗ、Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ、ｅｄｓ、、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ −Ｖｅｒｌａｇ、Ｖｉｅｎｎａ、ｐｐ、２５５−２７９）。欠陥干渉ウィルスの場合、増殖したウィルスの大部分が野生型ウィルスでなくむしろ欠陥粒子となるように条件を改変することができる。したかって、この方法は組み換えウィルスの高力価ストックを生成するのに育用である。しかしながら、これらのストックは、いくらかの野生型ウィルスも必ず含有しているであろう。

一方、合成ＲＮＰｓはインフルエンザウィルスポリメラーゼタンパク質を発現する組み換えウィルスで共感染された細胞中で複写される。事実、この方法は本発明によれば組み換え感染性ウィルスをレスキューするのに用いられる。このために、インフルエンザウィルスポリメラーゼタンパク質は、ウィルス発現ベクター（例えばバキュロウィルス、アデノウィルス、バキュロウィルス等）またはポリメラーゼタンパク質（例えばＫｒｙｓｔａｌら、１９８６゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８３：　２７０９−２７１３）を発現する細胞系に限定されないが、それらを包含するどんな発現ベクター／宿主細胞系においても発現させる。さらに宿主細胞をインフルエンザウィルス８タンパク質全てをコードするｒＲＮＰｓで感染することは感染性キメラウィルス粒子の産生を生じる。この方法は選択方法の必要性を除外するであろう。なぜならば産生された全ての組み換えウィルスは所望の遺伝子型であろうから。ここの実施例において、我々はインフルエンザウィルスにより細胞を感染させるのでなくむしろ、合成ＲＮＰｓは組み換えバクシニアベクターにより発現されるインフルエンザウィルスタンパク質の作用により細胞内で複写される完全な合成による複写方法を記載している。

この方法により我々はＲＮＰの転写および複写に本質的なインフルエンザウィルスタンパク質だけは３個のポリメラーゼタンパク質および核タンパク質であることを示している。

ウィルスの生存能力を変えることなしに組み換えウィルスを構築することが可能であることに注目すべきである。これらの変化したウィルスはその時に増殖能力かあり、複写するためにヘルパー機能を必要としない。例えば、上記のへマグルチニン遺伝子セグメントおよびＮＳ遺伝子セグメント中の変化は、かかる生存可能なキメラウィルスを構築するのに用いられる。

下記の実施例において、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に続いてインビトロでインフルエンザウィルスポリメラーゼにより認識され転写されるＲＮＡ鋳型を生じる組み換えプラスミドの構築が記載されている。このＲＮＡ鋳型は、ウィルスコード配列がＣＡＴ遺伝子のそれらにより取り換えられていることを除けば“インフ　。

ルエンザウイルスのＮＳ　ＲＮＡに相当する。続いてこの組み換えネガティブ鎖ウィルスＲＮＡ鋳型を精製インフルエンザウィルスポリメラーゼと混合しＲＮＰ複合体を再構築した。組み換えＲＮＰ複合体を細胞にトランスフェクトし、続いてその細胞をインフルエンザウィルスで感染させＣＡＴ活性発現させた。

この方法が、インフルエンザウィルスＲＮＡ５の転写複写およびゲノムつめ込みのシグナルの厳重な制御下にある生物学的に作用のある組み換えＲＮＰ複合体を代表することを多くのファクターが示している。第一にＣＡＴ遺伝子はＲＮＰ　トランスフェクションに用いられる組み換えウィルスＲＮＡ中でネガティブな極性である。したがって、入ってくるＲＮＡは細胞中で直接翻訳されずＣＡＴ遺伝子の翻訳および発現を可能にするインフルエンザウィルスポリメラーゼにより、はじめに転写されなければならない。

第二に、感染ヘルパーウィルスの存在下でトランスフェクトしたありのままの組み換えＲＮＡのみだけ、また感染ヘルパーウィルスの非存在下の組み換えＰＮＰ複合体もＣＡＴ活性を誘導するのに成功しない。これは、入ってくるＰＮＰならびに感染ヘルパーウィルスによって与えられるインフルエンザウィルスタンパク質か組み換えＲＮＡ鋳型の増幅に必要であることを示唆している。

最後に、ヘルパーウィルスによるＲＮＰ−１ランスフエクシヨンおよび感染の後、組み換えＲＮＡを明らかに含有するウィルス粒子か現われる。なぜならこれらの粒子は新たに感染した細胞中で再びＣＡＴ活性を誘導するからである。これらの結果はインフルエンザウィルスＮＳ　ＲＮＡ中の末端ヌクレオチドに相当する２６、３’末端および２２．５’末端ヌクレオチドが転写および複写ならびにＲＮＡの粒子中への包みこみのシグナルを与えるのに十分であることを示唆する。

インフルエンザウィルスＲＮＡ５の転写、複写および包み込みに必要なシス作用のある配列を定義した上記の結果は組み換えＤＮＡ技術により部位特異的突然変異を感染性インフルエンザウィルスに導入することかできることを示した下記の補足的実施例により拡張された。

インビトロでのプラスミドＲＮＡの転写に由来する合成ＲＮＡ５は感染性インフルエンザウィルスをレスキューするためにＰＮＰ−ｈランスフェクション実験で用いられた。このウィルスの選択を可能にするために、我々はレスキューウィルス中にＷＳＮＳＮ様ミラダーゼ遺伝子の存在を必要とする方法を選択した。この遺伝子を含有するウィルスは培地中のプロテアー七の非存在下のＭＤＢＫ細胞中で増殖することかできる（Ｓｃｈｕｌｍａｎら、１９７７、　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、　２４：　１７０−１７６）。ヘルパーウィルスＷＳＮ−ＨＫはこれらの条件下では増殖しない。明らかに、他の選択方法が存在する。

例えば、抗体スクリーンまたは条件致死変異かプラスミドＤＮＡ５由来のＲＮＡ５を含有するレスキューウィルスを単離するのに用いることかできる。下記のウィルスの実験において、ＷＳＮウィルス様ウィルスを取り出した。ＷＳＮ　ＮＡ遺伝子はプラスミドＤＮＡ５からまたは精製ＷＳＮ粒子ＲＮＡより由来していた（ＩＩＮＩ７．　レーン２および５）。後者の場合、ＰＮＰ　トランスフェクションに完全な粒子ＲＮＡを用いて我々は、他の遺伝子もまたレスキューウィルスに転移されるかどうかわからない。なぜならばヘルパーウィルスはＷＳＮウィルスと残る７遺伝子を共有するからである。レスキューウィルスは期待したＲＮＡパターンを有しく図１７）、ＭＤＢＫまたはＭＤＣＫ細胞において野生型ＷＳＮウィルスの力価と区別できなしルベルにまで増殖した。５゛非翻訳領域中の単一ヌクレオチド欠失を含有するＮＡ　ＲＮＡのレスキューは可能ではないことに注目すべきである。これもまたインフルエンザウィルスＲＮＡ５の非翻訳領域中に存在する調節配列の重要性を説明する。我々はまた３９ヌクレオチド長領域中に５ヌクレオチド変化を含有するように遺伝子操作されたＲＮＡを用いウィルスをレスキューした（図１６）。我々はＲＮＡを直接配列決定によりレスキュー変異ウィルス中のこれらの突然変異の存在を証明した（ＩＮ　１８）。これらの突然変異はノラミニダーゼタンパク質中のどのアミノ配変化も生じず、したかってウィルスの生物学的性質を変化させることは期待されてぃなかった。このウィルスは徹底的には研究されていないが、そのブラック行動およびその増殖の特徴は野生型ＷＳＮウィルスのそれと区別できない。かかる技術を用いて、インフルエンザウィルスの生物学的特徴を変化させる突然変異を導入することかできる。これらの研究は非構造的タンパク質の機能を包含するウィルスタンパク質すべての正確な機能を区別する助けとなるであろう。さらにゲノムの非翻訳領域は突然変異誘発により研究され、このことはウィルスＲＮＡ５中に存在する調節シグナルのよりよい理解となるへきである。最も関心のあるもうひとつの分野はワクチンベクターとしてインフルエンザウィルスシステムの開発に関する。

５．４．キメラウィルスを用いるワクチン製剤実際、いかなる異種遺伝子配列もワクチン用として、本発明のキメラウィルス中に構築することかできる。好ましくは、各種病原のいかなるものに対する保護的免疫応答をも含むエピトープ、又は中和抗体に結合する抗原かキメラウィルスによって、又はその一部として発現される。例えば、ワクチン用として本発明のキメラウィルス中に構築されうる異種遺伝子配列を少したけ列挙すれば、ｇｐ１２０のようなヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）；ヘパティティスＢウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）；ヘルペスウィルスの糖タンパク質（例えば、ｇＤ、ｇＥ）；ポリオウィルスのＶＰＩ；バクテリアや寄生虫のような非−ウィルス性病原の抗原決定基を含むか、これに限定されるものではない。他の態様においては、免疫グロブリンの全部又は一部か発現されうる。例えば、このようなエピトープに似た抗イデイオタイプの免疫グロブリンの各種領域か本発明のキメラウィルス中に構築される。

生組み換えウィルスワクチン又は不活化組み換えウィルスワクチンのいずれも製造することかできる。宿主中における増殖が天然感染で起きるものと同様の種類と大きさの刺激を長引かせることになり、従って実質的に長く続く免疫を与えることになるので、生ワクチンか好ましいてあろう。このような生組み換えウィルスワクチン製剤の製造は、細胞培養又はひよこ胚中の尿嚢中でのウィルス増殖、及びそれに続く精製を含む定法を用いて実施される。

この点に関し７て、ワクチン製剤のために遺伝子操作されたインフルエンザウィルス（ベクター）を使用するには、これらの株にアテニュエーション性か存在することが必要であろう。ヒトに使用する生ウイルスワクチンの現在の候補としては、トリウィルスから幾つかの（６個の）遺伝子を引き出し、アテニュエーションをもたらすことのできる、寒冷適合性、温度鋭敏性、又は継代された（　ｐａｓｓａｇｅｄ）ものか挙げられる。トランスフェクションに用いる鋳型に適当な突然変異（例えば削除）を導入することにより、アテニュエーション性を有する新規ウィルスを提供することができる。例えば、温度鋭敏性又は寒冷適合性と関連する特定のミスセンス変異を削除突然変異に実施することかできる。このような変異は、寒冷又は温度鋭敏性突然変異体と関連する点変異よりも安定であり、逆戻り頻度が極めて低いはずである。

若しくは、“自殺“性を有するキメラウィルスか構築される。

このようなウィルスは宿主中で１又は数回の複製のみを行う。例えば、複製の再開をさせるためには、ＨＡの切断が必要である。

従って、ＨＡ切断部位における変化か、ヒト宿主ではない適当な細胞系において複製するウィルスを生産する。ワクチンとして使用するとき、組み換えウィルスは１回の複製サイクルを行い、十分なレベルの免疫応答を誘導するが、ヒト宿主中ではそれ以上は進行せず、病気を引き起こす。１又はそれ以上の本質的インフルエンザウィルス遺伝子を欠く組み換えウィルスは、連続的に複製を実施することができない。このような欠陥ウィルスは、特定遺伝子（群）を永久的に発現する細胞系に、この遺伝子（群）を欠く再構成されたＰＮＰを同時トランスフェクションすることによって生産することができる。本質的遺伝子（群）を欠くウィルスは、このような細胞系中で複製されるが、ヒト宿主に投与されると、複製過程を完了することができない。このような調製物は、この不稔サイクル中において、免疫応答を誘導するのに十分な数の遺伝子を転写及び翻訳することができる。若しくは、大量の株を投与して、この調製物を不活化（死）ウィルスワクチンとして作用させることもてきる。不活化ワクチンのためには、遺伝子産物がピリオンと関連するように、異種遺伝子産物かウィルス成分として発現されることが好ましい。このような調製物の利点は、これらが天然タンパク質を含んでおり、死ウィルスワクチンの大量生産中に使用するホルマリン又は他の薬剤処理によっても不活化されないことである。

本発明の他の態様によれば、不活化ワクチンはキメラウィルスを“殺す”ための定法を用いて製造できる。不活化ワクチンは、その感染性か破壊されているという意味において“死亡”している。理想的には、ウィルスの感染性はその免疫原性に影響を与えることなく破壊される。不活化ワクチンを製造するためには、キメラウィルスを細胞培養又はひよこ胚の尿嚢中で成長させ、ゾーン超遠心によって精製し、ホルムアルデヒド又はβ−プロピオラクトンで不活化して貯蔵する。

得られるワクチンは通常筋肉内接種される。

不活化ワクチンは、免疫応答を増加するために適当なアジュバントと共に製剤とされる。このようなアジュバントは水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル：リソレシチン、プルロニ・ツクポリオール、ポリアニオンのような界面活性剤：ペプチド：オイルエマルジョン；及びＢＣＧやＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍのような有用なヒトアジュバントを含むが、これに限定されるものではない。

上記のワクチン製剤を投与するには多くの方法を用い得ることができ、経口、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下及び経鼻投与を含むが、これに限定されるものではない。そのためのワクチンかデザインされる病原の自然感染経路を介してキメラウィルスワクチン製剤を投与することが好ましい。化キメラウィルスワクチン製剤を用いる場合には、インフルエンザウィルスの自然感染経路を介して投与することが好ましい。活発な分泌性及び細胞免疫応答性を誘導するインフルエンザウィルスの能力を用いることが有利である。例えば、キメラインフルエンザウィルスによる呼吸器の感染は、特定の病気を引き起こす因子に対する保護と共に、尿性器系などにおける強い分泌性免疫応答を誘導する。

（本質以下余白）６、実施例：インフルエンザウィルスＲＮＡポリメラーゼの以下に記載する実施例において、ゲノム性ＲＮＡを抜いた（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ポリメラーゼを、ＣｓＣ１−グリセロールグラジェント遠心の上部分画から調製した。このポリメラーゼは、配列特異的方法でバクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼで適当なプラスミドＤＮ’Ａの転写に由来する、短いモデル鋳型をコピーすることができる。このモデルＲＮＡの両末端は全てのインフルエンザウィルスＲＮＡからのセグメント８中に保持される３゜１５及び５′　２２ヌクレオチドと同じである。鋳型として作用する異なるＲＮＡを調製するためにプラスミドを操作して、このモデルＲＮＡの認識及びこのモデルＲＮＡからの合成は３′末末端列にあるプロモーターに特異的であって、フライノくンの柄構造を必要としないことを我々は示した。更に、部位特異的突然変異誘発によって、ゲノム性センス鋳型から双補的センスＲＮＡへの合成を有利にするウィルス性ポリメラーゼを司るヌクレオチド位置を同定した。またモデルＲＮＡを用いて、キャップー二ンドヌクレアーゼ促進化ＲＮＡ合成が観察される条件を見いだした。更に、再構成された系は、プラスミド又はフェノール抽出中にウィルスから精製されるＲＮＡのいずれかに由来する、ゲノム性長さのＲＮＡからのウィルス−特異的合成を可能にした。

ＲＮＰコアーで標準法（Ｐｌｏｔｃｈら、１９８１．　Ｃｅ１ｌ　２３：　８４７−８５８：Ｒｏｃｈａｖａｎｓｋｙ、　１９７６、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７３：　３２７−３３８）、ウィルスの２７３ｇを１．５％トリトン、１０ｍｇ／ｍｌリゾレシチン、１００ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、　ｐｔｔ８．０．１００ｍＭ　ＫＣＩ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．　５％グリセロールおよび１．５ｍＭジチオスレイトール中でインキュベートすることにより崩壊した。

試料は５０ｍＭ　）リス−ＭＣ１，ｐＨ７，８および５０ｍＭ　ＮａＣ１の存在下に３０〜７０％段階勾配で遠心分離することにより分別した。コアー調製品はＳ　Ｗ２Ｏ，１ローター中で４℃、４ｈｒ、　４５．００Ｏｒｐｍで遠心分離した。

ＲＮＰを豊富に含むフラクションは各フラクションからのプロティン試料の５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動及び銀染色により同定された。それから、コアーフラクションはＨｏｕｄａら、１９８８゜Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０４：　１０２１−１０２６に記載されている如く第２の勾配遠心分離に供した。第２の勾配は０．５ｍｌ　３．０Ｍ　ＣｓＣ１および４５％（ｗ／ｖ）グリセロール、１．７５ｍ１２．５Ｍ　ＣｓＣ１および４０％グリセロール、１．２５ｍ１２．ＯＭ　ＣｓＣ１および３５％グリセロール並びに１．０ｍｌ　１．５Ｍ　ＣｓＣ１および３０％グリセロールを有するものである。全ての段階は５０ｍＭトリス−ＭＣＩ、　ｐＨ７，６および１００ｍＭ　ＮａＣ１で緩衝されている。ＲＮＰコアー０．５ｍｌを頂部に置き、そして、試料を５Ｗ５０．１０−ター中、４ °Ｃ，２５ｈｒｓ、　４５．００Ｏｒｐｍで遠心分離した。ポリメラーゼフラクションはプロティン試料の５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動および銀染色により再び同定した。活性ポリメラーゼフラクションは一般に１．５Ｍから２０ＭのＣｓＣｌと関連する勾配の領域で見出された。これらのフラクションはプールされ、次いで５０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，６，１００ｍＭ　ＮａＣ１および１０ｍＭ　ＭｇＣ１＊に対して透析を行い、そしてセントリコン−１０チユーブ（Ａｍｉｃｏｎ）中で濃縮した。或いは、これらフラクションは５０ｍＭ　）リス−ＨＣ１，ｐＨ７，６，１００ｍＭ　ＮａＣ１゜１０ｍＭ　ＭｇＣＬ、２　ｍＭジチオスレイトールおよび５０％グリセロールに対してバッグ中で透析した。

６．１．２　プラスミドの調製プラスミドデザインは図２に示す。ｐＶ−ｗｔプラスミド用の挿入ＤＮＡはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＤＮＡ合成器を用いて調製された。

“ボトム”鎖はプライマーとしての５−ＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＴＧＡ−３’ て非沈澱及びＮＡＣ３−プレパックイオン交換カラム（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を通過させて精製した。このＤＮＡは、換するために用いた。バクテリアをＸ−ｇａｌ及びＩ　ＰＴＧを含む寒天上に広げた。小さい挿入物はＩａｃＺリーディングフレームを保持し、停止コドンを含まないから、青色のコロニーは予測される挿入物を含むプラスミドを持つことが判った。

ｐＭ−ｗ　ｔプラスミドは、両鎖か次の配列５’−ＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＴＧＡＪＩＩＧＴＴＴＡＡＡＴＧＡＴＡＴ−ＧＡＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＴＴＧＴＴｒＣＴＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧ−３’を有するアッパー鎖て化学的に合成される以外は同様な方法により調製された。

ｐＶ−ｄ５°プラスミド（図２）は、オリゴヌクレオチド５ｌ−ＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＡＧＡＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴ−ＴＣＡＣＣＣＴＧＣＴＴＴＴＧＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＴＴＣＴＧＣＡ−３’及び５　’　− ＧＡＡＧＡＡＴＧＡＡＴ−ＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＡＡＴＡＧＡＴＣＴＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’を用いて調製された。ＤＮＡ５はアニールされ、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｐｓｔ　Ｉで消化したｐＵＣ− １９中に連結されて、そして白色コロニーは、この挿入物が１ａｃＺ遺伝子におけるフレームシフトを結果ずけるものである故に、正しいプラスミドを含むことが判った。点変異物か分離され、次いでｐＶ−ｄ５’をＢｇｌＩ［及びＰｓｔｌて消化し、直線化したプラスミドを混合組成物の一重鎖オリゴヌクレオチドに結合する。

Ｂｇｌ、ＩＩＩは５′側の伸長を形成し、ＰｓｔＩは３゛側の伸長を形成するから、単オリゴヌクレオチドは挿入物の連結に必要な全てである。

それから、宿主細胞は、相補的なオリゴヌクレオチドの欠落によって起るギャップを修復することがてきる。オリゴヌクレオチドを１ａｃＺ遺伝子におけるフレームシフトを修復するためにデザイ：）したので、変異プラスミドを含むプラスミドはそれらの青色により選択された。

Ａ／ＷＳＮ／３３のセグメント８と同一のＲＮＡを調製するために用いられるプラスミドｐＨｇａＮＳは、プライマー５　’　−ＣＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＧＴＧ−３’及び５’−ＣＣＴＣＴＡＧＡＣＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＴＧ−１’ を用いてｃＤＮＡクローンのポリメラーゼ連鎖反応て調製された。

プラスミドＤＮＡかＭｂｏＩ［または他の適当なエンドヌクレアーゼ（図２参照）て消化され、直線化したＤＮＡがバクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写された。ランオフＲＮＡ転写物はＲＮＡエースを含まないＤＮＡエース１て処理され、そしてＲＮＡはプロティンから精製されＱｉａｇｅｎ　ｔｉｐ−５イオン交換カラムを用いてヌクレオチドを除去した。エタノール沈澱に引き続いて精製されたＲＮＡを水に懸濁し、試料を電気泳動にかけ、ポリアクリルアミドゲルの銀染色を行うことにより分析してＲＮＡの収量を分析した。

６．１．４　インフルエンザウィルスポリメラーゼ反応全容量２５μｌ中で、ヌクレオプロティン約３０μｇおよび３種のポリメラーゼプロティンの２００ｐｇが鋳型ＲＮ　Ａ　１０ｎｇと混合され、その溶液は最終濃度：　５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ７，９，５０ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２゜１ｍＭジチオスレイトール、０．０５％ＮＰ−４０，０，４ｍＭアデニルイル−（３’　、　５°）−グアノシル（ＡｐＧ）ジヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、　０．５ｍＭ　ＡＴＰ、　０．５ｎｌＪ　ＧＴＰ、　０．５ｍＭ　ＣＴＰおよび約０．６　μＭ　（２−”Ｐ−ＵＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅで４０μｃｉ）に調整した。反応物は氷上に集められ、次いで３０°Ｃのウォーターバスに移し９０分間温める。反応はＯ５１８ｍｌ水冷０．３Ｍ酢酸ナトリウム／　］、ＯｍＭ　ＥＤＴＡを添加することにより停止され、次いでフェノール／クロロホルム（１：１容量比）て抽出された。第１の抽出に引き続いて、１５μｇポリ■−ポリＣＲＮＡが担体（Ｃａｒｒｉｅｒ）として加えられ、この試料が再びフェノール／クロロホルムで抽出された。次いで、この試料はエーテルで抽出され、エタノール中で沈澱させた。遠心分離に続いて、ＲＮＡベレットを７０％エタノールで２回洗浄し、真空下で乾燥する。

高濃度ポリメラーゼを用いる反応において、条件は鋳型ＲＮＡの２０ｎｇを添加する以外は上記と同一である。ゲノム長ＲＮＡを用いる反応において、使用されるポリメラーゼの量は２倍であり、鋳型ＲＮＡ　５０ｎｇか用いられ、そして、ＵＴＰ濃度は２．６μＭに高められた。

ＲＮＡか７８％ホルムアミド、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％キシレンシアツール及び０．０５％ブロモフェノールブルーを含む染料混合物中に再懸濁する。典型的に、このＲＮＡからの試料は尿素の不存在下に８％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけられ、残りは１００°Ｃ，１５ｍ１ｎ加熱することにより変性させ、エリコートを７゜７Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲル上に置いた。ゲルを二段階の手続、すなわち、最初は１０％酢酸次いで２５％メタノール／８９６酢酸で固定した。ゲルはフィルターペーパー上で乾燥し、次いでＸ −線フィルムに感光させた。

異なったＲＮＡが鋳型としての使用をテストするとき異なったＲＮＡの調製物は各鋳型の等量を使用し、常にポリアクリルアミドゲル上で分析し銀で染色させた。生成物の量を定量するためにゲルをデンシトメーターの読みの直線性を改善するために強化したスクリーンの不存在下にＸ−線に感光させた。オートラジオグラフィーはＦＢ９１０スキャニングデニノシトメーター（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｂｉｏ −ｔｅｃｋ）を用いて分析され、ピークはＦｉｓｈｅｒ　Ｂｉｏｔｅｃｋからのコンピューターソフトウェア−を用いて評価された。

６．１．５　反応生成物のヌクレアーゼ分析２つの基本的ＲＮＡ生成物のりポヌクレアーゼＴＩ分析のため、反応生成物か８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素使用せず）により分析し、ゲルは固定化物で処理しなかった。湿潤なゲルをＸ−線フィルムに感光させ、適当なゲル片を位置づけ、試験した。ゲル片は、　１０ｍＭ　）リスｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％ナトリウムドデシルサルフェート及びキャリヤーとしての１ＭｇｔＲＮＡを含む０．３ｍｌ中で破砕された。ＲＮＡはこの溶液に３　ｈｒｓ拡散させ、次いでゲルをペレット化し、上溝を酢酸ナトリウムで０．３Ｍとした。この上清をフェノール／クロロホルムで２回、エーテルで１回抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。ＲＮＡベレットをホルムアミド５ｍｌに再懸濁し沸騰水中１．５分間変性させ、１０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５の０．１ｍｌ及びＥＤＴＡｌｍＭを添加して希釈した。リボヌクレアーゼＴＩ（５０単位、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｅｓ）が加えられ、試料は３７℃で６０分間インキュベートされた。α−”Ｐ−ＵＴＰの不存在下にＴ７　ＲＮＡポリメラーゼで合成されたＶ−ｗｔ及びＭ−ｗｔ　ＲＮＡはＲＮＡエースＴ１で同様に消化された。反応生成物は、フェノール／クロロホルム中に抽出され、エタノールで沈澱し、次いで７．７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。

反応生成物のヌクレアーゼ８１分析は、転写されたＲＮＡ上で、０．２６Ｍ　ＮａＣ１，０，０５Ｍ酢酸ソーダ、　ｐＨ４，６及び４．５ｍＭ硫酸亜鉛を含む０．２ｍｌ容量のＳＩバッファーの添加により標準ポリメラーゼ反応の第１の停止を行うことにより行われた。試料は２つの０．１ｍｌ容に分割され、ＳＩヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　１００単位が１つのチューブに加えられた。試料を３７°Ｃ９６０分間インキュベートした。インキュベートに引き続いて、ＥＤＴＡ　（１０ｍＭ最終濃度）及びポリ■−ポリＣＲＮＡ　１０Ｍｇを加え、試料をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱する。次いで試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供する。

インフルエンザウィルスＡ／プエルトリコ８／３４のＲＮＰコアーは、リソレシチン及びトリトンＮ−１０１中のウィルスの崩壊、およびグリセロール勾配遠心法によって調製された（　Ｒｏｃｈａｖａｎｓｋｙ。

１９７６、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７３：　３２７−３３８）　、　：ｌアーを包含する留分は、続いて、ＣｓＣ１−グリセロール段階勾配における第二遠心法に供された（Ｈｏｎｄａ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０４：　１０２１−１０２６）　Ｏポリメラーゼを包含する留分は、サンプルのゲル電気泳動、及びこれに続く銀染色によって同定された。図１は、ＣｓＣ１遠心分離後のポリメラーゼ調製を示す。ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）は、プロティン損失を防止するための透析中に添加された。レーン１及びレーン２中で認知された全ウィルスの数量に対比されたレーン４のデンジトメトリック（Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ）スキャンによると、レーン４中のプロティンは、１５０ｎｇのＮＰ、及び全体として約１ｎＨの３種のポリメラーゼから成ると見積もることができた。反応当り、このゲルの調製物の５分の１を使用した。

この研究における鋳型ＲＮＡの調製に使用されるプラスミドの全デザインは、図２に描かれている。挿入物全体は、ＤＮＡ合成器によりオリゴヌクレオチドを使用して調製され、そして、このオリゴヌクレオチドはｐＵｃ１９のポリリンカーにクローンされた。

その挿入物は、バクチリオフエイジＴ７　ＲＮＡポリメラーゼにより認識された末端切断プロモーター配列を包含していたため（Ｓｔｕｄｉｅｒ　ａｎｄ　Ｄｕｎｎ、１９８３．　１９８３．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉａｏｎ　Ｑｕａｎｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　ＸＬＶＩＩ、　９９９−１００７）　、合成された第一ヌクレオチドは、ゲノムＲＮＡの５′末端からの保存された配列の端末２２ヌクレオチド（ｎｔ）となった。プラスミドは、制限エンドポリメラーゼ転写から生じたＲＮＡは、インフルエンザウィルス配列の末端３゛ヌクレオチド終端した。少なくとも末端アデニヌカシグナル部分を包含すると考えられる保存端末の５′末端に隣接するポリＵの広がりがその配列に包含される（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、。

１９８１、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　３８．１５７−１６３）。１６個のヌクレオチドのスペーサは末端の保存された配列を分離しているので、このゲノムＲＮＡモデルの全長は５３個のヌクレオチドとなった。ｖＲＮＡの両末端と同一の両末端を包含したＲＮＡモデルはＶ−ｗｔと命名された。

ＲＮＡ　Ｍ−ｗｔは、その両末端が相補ＲＮＡ　（ｃＲＮＡ）の両末端に一致するように、Ｖ−ｗｔの正確な相補鎖をコードした。Ｖ−ｗｔ及びＭ−ｗｔは、それぞれインフルエンザウィルス特異的ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡのモデルとして供するように構築される。

インフルエンザウィルスポリメラーゼを使用する反応において、Ｖ−ｗｔ鋳型及びＡｐＧプライマーは、変性ゲル上の５３ヌクレオチドＲＮＡと同時泳動させて得られた。約４０−４５ヌクレオチドの位置にダブレットとして泳動するＲＮＡもまた見られた。この短い方の産物は、ウィルス粒子センス鋳型の４３−４８ヌクレオチドの間に存在するアデノシンの広がり部位で終わっているＲＮＡとして下方に示されている。鋳型特異転写に加えて、ＣｓＣ１−グリセロール遠心分離段階で取り除かれなかったウィルスゲノムＲＮＡから転写された末端切断ＲＮＡ生産物に対応する光のバンドの普通のバックグランドを見ることができる。どのプライマーも用いられない場合には、どの特異転写生産物も見ることができない（図３Ａ、レーン３）。さらなる実験が示すとおり、末端キャップ１構造を包含するグロビンｍＲＮＡは、ポリメラーゼの初期調製を用いるプライマーとして不活性であった。

ヌクレアーゼ反応中化に好都合の過度のバッファの添加によってポリメラーゼ反応が終了し、ヌクレアーゼか添加されると、放射活性的に標識化された生産物は消化に対し抵抗を存するに至った（図３Ｂ、レーン２）。対照的に、これら条件はＴ７　ＲＮＡポリメラーゼと放射活性的に合成されたＶ−ｗｔ−木組ＲＮＡを非常に効率的に消化した（図３Ｂ、レーン３及び４）。これらヌクレアーゼＳｌのデータは、反対の鎖はこれらの反応において実際に合成されていたことを確証した。その反応の生産物は二本鎖ＲＮＡかもしれないが、その生産物は実際に一本鎖であり、かつ、ヌクレアーゼ反応中に使用される高張下で鋳型ＲＮＡに後でアニールされたものとすることを不適切なものとすることはできない。

ＲＮＡ生成物は、８％ゲルでの電気泳動により精製され、ゲルから切り取られ、溶出され、そしてリボヌクレアーゼＴ１により消化される。生成物は電気泳動により分析され、内部ラベルされたＭ−ｗｔ及びＶ−ｗｔ対照プローブのＲＮＡアーゼＴ１消化によって作られたパターンと比較される。図３Ｃに見られるように、ＲＮＡ全長（レーン１）は、プラス・センスＲＮＡ、Ｍ−ｗｔ（レーン３）が有しているパターンと同一のパターンを有しているが、Ｖ−ｗｔ　ＲＮＡ　（レーン４）のパターンは有していない。観察されたパターンは、ＲＮＡの配列から予測されるパターンと本質的に同一であり、かようにして、ポリメラーゼは忠実にＶ−ｗｔ鋳型をコピーしたことを示した。小さい方のＲＮＡ生成物、すなわちほとんどの鋳型を有するダブレットはまた、ＲＮアーゼＴ１により消化された。

そのパターンは、１４塩基オリゴヌクレオチドか存在しない場合を除いて、ＲＮＡ生成物の全長のパターン（図３Ｃ，レーン２）と同様であった。それよりむしろ、微量の１３塩基オリゴヌクレオチドが検出され、このようにして、短いＲＮＡの末端を部位４４にマツピングした。その部位４４には２個のウリジンが組み込まれているはずである。より小さいＲＮＡ生成物量は、ＵＴＰ高密度下において減少しまたＣＴＰかラベルとして用いられた時に消失するので、これらのバンドはポリメラーゼ反応においてＵＴＰ低密度のアーティファクトとなったと推定された。

ＮＰタンパク約３０ｎｇ及び３つのＰタンパクの計約２００ｐｇを含むタンパク試料は５から１０ｎｇのＲＮＡと光学的に反応するであろうことが分かった。冷却拮抗ＲＮＡ、ポリ■−ポリＣを用いることにより、恐らくはＮＡタンパクの非特異的結合を介して、過剰ＲＮＡは非特異的に転写を阻害したことか分か−、た（　Ｋｉｎｇｓｇｕｒｙ　ら、１９８７．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５６：　３９６−４０３；　５ｘｈｏｌｔｉｓｓｅｋ及びＢｅｃｈｔ、　１９７１．　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　ｔｏ：　１ｌ−１６）　。非特異的拮抗体かない場合に、鋳型が１から１０ｎｇの間で変化した場合でも、ＲＮＡ合成効率に格別の変化はなかった。ＮＰタンパク及びＲＮＡは等モル濃度て現れ、かつこれらは典型的な反応における３つのＰタンパクにより形成される複合体（それは１：１：１と推定される）のモルよりも１０００倍過剰であった。

これらの再構築ＲＮＰはグロブリンｍＲＮＡではなくＡｐＧをプライマーとして用いることができることから、我々は、転写反応の他の変形のためにこれらのモデルＲＮＡを試験した。試験された他のすべての方法において、再構築されたＲＮＡは、溶液中で洗剤崩壊ウィルスから精製されたＲＮＡと同様な行動を示した。

ＲＮＡ合成のための最適温度はウィルスポリメラーゼについて繰り返し発見されている（Ｂｉｓｈｏｐら、１９７１．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　８：　６６−７３；Ｔａｋｅｕｃｈｉら　１９８７．　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０２：　８３７− ８４５；　Ｕｌｍａｎｅｎら、１９８３、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４５：　２７ −３５）ように３０°Ｃであった（図４Ａ、レーン２）。また、最も活性な塩条件は６０ｍＭＮａＣ１であり（図４Ｂ、レーン２）、幾つかグループで用いられた条件（Ｂｉｓｈｏｐら、１９７１、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、８：　６６−７３；　Ｈｏｎｄａ　ら、１９８８．　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ−１０４：１０２１−１０２６；　５ｈａｐｉｒｏ、Ｋｒｕｇ、１９８８．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６２：　２２８５−２２９０）と再び一致していた。図４０は経時的実験を示している。ＲＮＡ合成量は最初の９０分はほぼ直線的に増加しているようであり、それは、ウィルスＲＮＡに見られたと同様である（　Ｔａｋｅｇｕｃｈ　ｉ　ら、１９８７、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０１：　８３７−８４５）。

６　、２．４　伸長反応の特異性ウィルスＲＮＡをインフルエンサウィルスのＲＮＡポリメラーゼの鋳型としての適合性について試験した。ｐ　Ｖ　−ｗ　ｔプラスミドクローンをＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ又はＳｍａｌのいずれかで消化し、Ｔ７ボリメラーゼをＲＮＡ転写に用いた。この結果、３゛末端に５個、１３個及び３８個のｎｔを付加することを除いて、ＲＮＡはＶ−ｗｔと同一てあった。図５Ａに、鋳型として、３′末端に１３個及び３８個のｎｔを追加配列として持つ点を除きＶ−ｗｔと同一の二つのＲ，ＮＡ（レーンＩ及び２）二上記のＶ−ｗｔと同一の配列の一本鎖ＤＮＡ　（レーン４）：及び、ｐｌＢＩ−３１のポリリンカーＴ３ＲＮＡボリメーゼで転写することによってえられた非関連８０ｎｔＲＮＡ（レーン５）、を含む反応においては、バックグランドを越えた転写が観察されないことを現す目的から過剰露出のオートラジオダラムを示した。しかし、３゛末端に５個の付加されたヌクレオチドを含むＶ−Ｅｃｏ鋳型は認識され、野性型Ｖ−ｗｔＲＮＡの効率の約１／３の効率ではあるが忠実に転写されていた（図５Ａ、レーン３）。転写されたＲＮＡはＶ−ｗｔ鋳型からの産出物と同じ大きさであったことから、インフルエンザウィルスポリメラーゼによるＶ−ＥｃｏＲＮＡ上の開始は、正しい塩基て起こっているらいしことに注目することは興味深いことである。

この研究のために用いられた元となる構成は、塩基対を構成し従ってパンハンドルを形成する染色体ＲＮＡの双方のＲＮＡ末端の配列を含んでいた。このことは、感染された細胞中のウィルス粒子及びＲＮＡ内のｖＲＮＡは１５から１６ｎｔ長パンツ＼ンドルを介して環状の形状をとることか分かったことによる（　Ｈｏｎｄａら。

１９８８、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０４：　１０２１−１０２６ＨＨｓｕら、１９８９．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｕｓａ　８４：　８１４０−８１４４　）。さらに、ウィルスポリメラーゼは２本鎖構造に結合することか示され（Ｈｏｎｄａら、１９８８．　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０４：　１０２１−１０２６）、そのことは、ＲＮＡ合成のためのプロモータはパンハンドルであることの示唆となった。パンハンドルが認識のための絶対的要件であるかどうかを試験するために、次のような鋳Ｙか用いられたニブラスミドｐ　Ｖ　−ｗ　ｔかＴ７ボリメラーゼにより転写される前にＤｒａＩで消化した（図２）。このことは、そのＲＮＡの５′末端からのウィルス特異性配列のみを含む３２ｎｔのＲＮＡ分子という結果になるべきである。このＲＮＡを鋳型として用いた時、明確な産物は生産されなかった（図５Ｂ、レーン２）。従って、ウィルス粒子ＲＮＡの３′末端はこの反応のために必要であった。この結果は、Ｖ−ｗｔの３′末端における開始部位はＶ−Ｄｒａには存在しないという事実と一致している。５“末端は欠失しているが３゛末端はそのまま保持されている第２のプラスミドクローンが産出された。このクローンｐＶ−ｄ５は、ＭｂｏＩＩて消化されＴ７ボリメラーゼによる転写の目的で用いられたとき、３０ｎｔの主転写並びに２９及び３１ｎｔの微量種を産出した。驚くべきことに、この鋳型はインフルエンサウィルスボリメラーセにより認識されかつ複写された。

図７、レーン１は、ウィルスＲＮＡポリメラーゼのＶ−ｄ５との反応の産物は接種ＲＮＡを反映する複数のバンドを含んでいることを示している。図７、レーンｌに示される産物をゲルから溶出しＲＮアーセＴ１分析に供することにより、Ｖ −ｄ５°の転写産物に期待されるパターンが観察された。Ｖ−ｄ５’　ＲＮＡ鋳型はコピーされたので、ウィルスポリメラーゼの結合及び合成にはパンハンドルは不必要であった。

その５′末端はポリメラーゼによる合成には必要とされないか、Ｖ−ｗｔＲＮＡがＶ−ｄ５と比較してより好ましい鋳型であろうことにはきわめて高い可能性がある。このことを試験するために、鋳型を混合して反応を行った。各反応において、Ｖ−ｗｔＲＮＡは５ｎｇ産出した。Ｖ−６５’　は存在しないか（図６、レーン１）、１１５モル比で現れるか（図６、レーン２）、１／１モル比で現れた（図６、レーン３）。各ＲＮＡがらのバンドの相対的濃さはオートラジオグラフの濃度により決定した。その値を各産物中に取り込むことのできる放射活性ヌクレオチド値、ＵＴＰ、により校正し、該校正値を各レーン中の合成レベルヵ月となるように標準化した。Ｖ−ｗｔのコピーレベルは減少し、Ｖ−ｄ５’は増加した。Ｖ−ｄ５’が５分の１モル比に存在している、合成の校正したレベルはＶ− ｗｔからの合成レベルの約４分のｌである（図６、レーン２）。二つの鋳型か等モル量に存在しているとき、Ｖ−ｗｔからの合成量のレベルは合計の約６０％であり（図６、レーン３）、その値は合成の等しいレベルのための予測できる実験誤差の範囲内であろう。Ｖ−ｄ５’　ＲＮＡを一定に維持しＶ−ｗｔＲＮＡを変化させたときにも同様な結果が得られた。従って、パンハンドルを含んでいるＶ −ｗｔＲＮＡは適当な３″末端のみを含む鋳型ＲＮＡと比へてさほど利点がないという結論に達する。

６．２．６　ウィルスポリメラーゼはプラス−センス末端を含むＲＮＡ末端をコピーしない前記したように、インフルエンザＲＮＡポリメラーゼは感染経路にお−いて３つの顕著な活性を示す。２つの活性はゲノムセンスＲＮＡの翻訳を含み、３つ目は相補センスＲＮＡをｖＲＮＡにコピーすることを含む。従って、我々は、セグメント８の相補センスＲＮＡの５′及び３′末端を含むＲＮＡ鋳型を構築した（Ｍ −ｗｔ；図２）。

そのＭ−ｗｔＲＮＡを鋳型として用いたとき、合成はほとんど観察されなかった（図５Ｂ、レーン４）。定量のために使われた二つの実験において、Ｍ−ｗｔＲＮＡからの合成の平均レベルはＶ−ｗｔのそれの４％であった。Ｖ−ｗｔとＭ− ｗｔＲＮＡプロモータを比較すると、Ｍ−ｗｔは単に３つのトランジッション変移と３°末端と１５ヌクレオチドに１つのインサージョンを有している。これらは、３位でのＧがらＡへの変移、５位でのＵからＣへの変移、８位でのＣがらＵへの変移、及び９番目と１０番目の間の挿入されたＵを含んでいる（表■の下方参照）。３″末端における４つの点変移が特異性にどの様に関与するかを決定するために、これらの多くの組合せを準備しかつ鋳型としての有効性をアッセイした（図７）。これらの鋳型は、５′末端を含んでないのてＶ−ｄ５’　の誘導体であった。幾つか実験のデンシトメトリースキャンの結果を表■に示す。

（本質以下余白）表■ Ｖ−ｄ５　’　ＣＡＣＣＣ”ＬＪＧＣＵＵＷＧＣＵ−ＯＨＩＶ−ｗｔ、Ｍ−ｗｔ及びＶ−ｄ５’　の配列は図２に示される。

他のＲＮＡは支持された位置を除きＶ−ｄ５’　と同一である。下添えの数字は変移の３°端からの距離を示しており、ｄ及びｉは除去されたあるいは挿入されたヌクレオチドである。

表■に示すように、Ｖ−ｃ！５における一点変移は、４０％の効率でコピーされたＶ−Ａ、ＲＮＡを除き、Ｖ−ｄ５’　自身と同様によくコピーされた。二つの変移を持つＲＮＡを試験したときに、その活性は一般に低いレベルに下降した（図７、レーン３．４、及び５）。従って、Ｍ−ｗｔに対するＶ−ｗｔの反応の特異性はＭ−ｗｔの３′末端の現れるヌクレオチド変移の結合の結果であることをこの実験は示していた。

を低減する目的で改良した。アミコンコンセントリコン−１０（Ａｍｉｃｏｎ　ｃｏｎｔｒｉｃｏｎ−１０）を用いる代わりに、酵素を標準の膜により透析したところ、４種全てのウィルスコアタンパクの密度は向上した。この調製物のタンパクゲルのパターンはＢＳＡ由来バンドかないことを除き、図１のレーン４に示されるものと同一であった。この調製物の５μＬはＮＰを１５ｎｇ及び３つのポリメラーゼタンパクの合計５ｎｇを含んでおり、モデルＲＮＡ鋳型１０〜４０ｎｇと光学的に反応した。しがし、より高いレベルのタンパクを用いることによりバックグランドは増加したが、これは、混入ＲＮＡ（ＣｓＣ１遠心分離により除去されないウィルス粒子ＲＮＡ）のレベルか向上し、５０ｎｔ長を含むＲＮＡ鋳型の分析を悪化させる大きさクラスが約５Ｏ−７５ｎｔの産物が産出したことによると解される。

この高い密度のポリメラーゼ調製物はキャップエンドヌクレアーゼに誘導されるＲＮＡ合成（図８Ａ、レーン４）及び鋳型ＲＮＡのプライマー独立複写（図８Ａ、レーン２）において活性であった。グロビンｍＲＮＡを３０ｎｔＶ−ｄ５’鋳型からの転写のためのプライマとして使用したときに、約４２〜４４ｎｔのサイズのトリプレットバンドか産生物として明らかとなり、このことは、ｍＲＮＡの５′端から約１２ｎｔでのキャップ構造の切断及び３Ｑｎｔモデル鋳型からの合成を開始するためのオリゴヌクレオチドの使用と矛盾しない。おそらく上記のようにインビトロでのＮＰの非特異的結合により余剰ＲＮＡはＲＮＡ合成を阻害することから、各反応に付加されるキャップドナーＲＮＡの光学的量は１１００ｎてあり、この値は予め形成されたＲＮＰ構造で通常用いられるもの（例えば、Ｂｏｕｌｏｙら、１９８０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７：３９５２−３９５６）よりも低いものであった。最も効率的なプライマはＡｐＧであった（図８Ａ、レーン５及びレーン６光による感光）。産生物の泳動は中に入れた鋳型の泳動（図８Ａ、レーン１）あるいはプライマ欠如による産生物の泳動より（図８Ａ、レーン２）低くいものであったが、これはＡｐＧ産生物の５′末端がリン酸化されていないことによるものであろう。ＡｐＧに誘因された産生物の濃さはキャップ誘因産生物の濃さの約１０倍であったか、０．４ｍＭにおいて、ＡｐＧはギャップドナーの濃度の６００００倍モルであった。従って、キャップ誘因からの産生物バンドの濃さはＡｐＧ誘因のものより４倍低いものであったか、キャップ誘因反応は分子ベースにおいて約６０００倍効果的であった。この値は以前にウィルスポリメラーゼについて観察されたほぼ４０００倍の効率（Ｂｏｕｌｏｙら、１９８０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７：３９５２−３９５６）と類似している。ＢＭＶＲＮＡにおけるように、キャップ０構造を含むキャップドナーＲＮＡはインフルエンザウィルスポリメラーゼをプライム化するにおいて１０倍低い活性であることはすてに開示されている（　Ｂｏｕｌ、ｏｙら、１９８０゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ　７７：３９５２−３９５６）。この普通でないキャップ特異性は、モデルＲＮＡからの特異的産生物はギャップトナーとしてＢＭＶＲＮＡを含む反応において大きく低減するとじてここで知見した再構築ＰＮＰにより共通に持たれた。３０ｎｔ産生物がレーン２−４に観察されたかこれは恐らくモデル鋳型のプライマのない複写物によるものであろう。

産生ＲＮＡは挿入した鋳型Ｖ−ｄ５’　のオポシットセンスであることはヌクレオチド８１分析により示された（図８Ｂ）。ＡｐＧ誘因（図８Ｂ、レーンｌ及び２）及びプライマのない（図８Ｂ。

レーン３及び４）ＲＮＡ産生物は基本的にヌクレアーゼ耐性であった。キャップ誘因反応による産生物（図８Ｂ、レーン５及び６）は約１２ｎｔが産生物から消化されたことから部分的にヌクレアーゼに感受性であった。これらの結果はインフルエンザウィルス特異性ｍＲＮＡ合成について多く示されているように、５′ １２ｎｔはｍＲＮＡ起源であることと矛盾しない。

ＡｐＧでプライムされる反応におけるポリメラーゼ調製物のプロモータ特異性はすてに示したようにより低い濃度の酵素の場合と基本的に一致していることか分かった。しかし、これまでのところ、プライムのないかつキャップ誘因された反応でプロモータ特異性の同様な分析を行おうとする試みは、バックグランドか比較的レベルであり定量化を困難にしいしていることから挫折していた。

６　、２．８　ゲノム長ＲＮＡ鋳型の複製Ａ／ＷＳＮ／３３のセグメント８の配列と同じ全長８９０ｎｔＲＮＡは、制限エンドヌクレアーゼＨｇａＩて消化された、プラスミドＤＮＡＳｐＨｇａＮＳのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写により調製した。このＲＮＡは高濃度ポリメラーゼを１０μ■、含むＡｐＧ誘因反応においてコピーされた（図９、レーン８）。そのＲＮＡは実際その鋳型のコピーであったことはヌクレアーゼＳＬに対するその抵抗によって明らかにされた（図９、レーン８）。同様な産生物はプライマの非存在下においても観察されるた（図９、レーン２及び３）。これらの産生ＲＮＡは鋳型の全長のコピーであることの確認はＲＮアーセＴ１分析により行った。フェノール抽出Ａ／ＰＲ／８／３４ウィルスから精製されたウィルス粒子ＲＮＡは、ＡｐＧ誘因反応において（図９、レーン１０及び１１）及びプライマの非存在下において（図９、レーン４及び５）同様にコピーされた。興味のあることに、ＨＡ遺伝子の複製物からの産生物はきわめて低減したレベルであった。このＲＮＡの３′端はヌクレオチド１４及び１５においてのみセグメント８のものと異なっており、これらのヌクレオチドがＲＮＡ合成のプロモータにおいて重要であることを暗示している。加えて、我々は全てのウィルスＲＮＡを再構築ＲＮＰにおいて使用したとき、酸性の沈澱しうる数（ａｃｉｄ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｂｌｅ　ｃｏｕｎｔｓ）のレベルは天然のＲＮＰて観察されたものの約７０％てあった。ウィルスポリメラーゼは同様に、キャップ誘因反応においてグロブリンｍＲＮＡを用いたときこれらの全長ＲＮＡをコピーすることがてきた。

７、実施例二組み換えインフルエンザウィルスによる外来遺伝子の発現およびパッケージングｒＲＮＰを使用するクロラムフエニコールトランスフエラーセ遺伝子（ＣＡＴ）の発現を記載する。ｒＲＮＰはＣＡＴ遺伝子を含む組み換えプラスミドｐｌＶＡｃＡＴ（最初はｐＣＡＴｃＮＳと呼ばれた）を用いて作製した。ｐ　ＩＶＡＣＡＴプラスミドは順に：Ｔ７プロモーター：インフルエンザＡ／ＰＲ８／３４　ＲＮＡセグメント８　（ＮＳタンパク質をコードする）の５′　（ウィルス−センス）非コードフランキング配列；ＢｇｌＩ［クローニング部位：逆向きの相補順序でクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の完全なコード配列；３′　（ウィルス−センス）非コードＮＳ　ＲＮＡ配列、および鋳型のラン−オフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）転写を可能にするいくつかの制限部位：を含むｐＵＣ１９プラスミドである。ｐ　ＩＶＡＣＡＴをＴ７ボリメラーゼにより転写すると、逆方向のＣＡＴ遺伝子のまわりにインフルエンザＡウィルスーセンスフランキング配列を存するＲＮＡを作ることかできる。

以下のサブセクションに記載したｉｎ　ｖｉｖｏ実験は、ＣＡＴ遺伝子のアンチセンス−配向オーブン・リーディング・フレームに隣接するインフルエンザウィルスＡ／ＰＲ／８／３４のＮＳ　ＲＮＡの非翻訳３′および５′末末端列に対応する配列を含む組み換えＲＮＡ分子を利用した。このＲＮＡを精製インフルエンザウィルスポリメラーゼ複合体と混合し、ＭＤＣＫ　（または２９３）細胞にトランスフェクトした。インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウィルスの感染後、ＲＮＰ−トランスフェクト細胞でＣＡＴ活性が測定され、この遺伝子の増幅か明らかになった。さらに、ＣＡＴ活性は組み換えウィルス調製物の感染後に細胞で立証されたので、組み換えインフルエンザウィルス遺伝子はウィルス粒子にノス・ソケＣＡＴ遺伝子のコード配列に融合されるＮＳ　ＲＮＡのフランキング配列を得るために、次の戦略を使用した。３′−および５’−ＮＳ　ＲＮＡ配列によるｐＣＭ７ブラスミド中のＣＡＴ遺伝子に隣接した配列の置換を可能にする、ＣＡＴ遺伝子の開始および停止コドンに近接した、２つの適当な内部制限部位が選択された。５′末端では、５ｆａＮ１部位か選ばれ（ＡＴＧから５７ヌクレオチドで切断する）、３′末端ではこの遺伝子（停止コドンを含む）の末端から２８ヌクレオチドで切断する５ｃａｒ部位が選ばれた。次に、クローニングのための正しい突出部分を有する２つの二本鎖ＤＮＡ断片を形成するために、Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤＮＡ合成機を使って４種の合成オリゴヌクレオチドを製造した。

開始コドンのまわりに、これらのオリゴヌクレオチドはＸｂａｌ突出部分、これに続＜Ｈｇａ１部位およびＰ’ｓ　ｔ　Ｉ部位、３′（ウィルス−センス）ＮＳ配列、この直後に開始コドンから５ｆａＮＩ突出部分まてのＣＡＴ配列（下線が引いである）を含む１本のＤＮＡを形成した。さらに、今後の修飾を可能にするために、開始コドンに近接してＡｃｃ１部位を作るべくサイレント変異を組み込んだ。

（本質以下余白）停止コドンのまわりに、２つの他のオリゴヌクレオチドは次のような１本のＤＮＡを形成した：平滑末端化５ｃａＩ部位、この部位から停止コドンまての（停止コドンを含む）ＣＡＴ配列（下線か引いである）、これに続＜ＢｇｌＩ［部位およびＸｂａｌ突出部、分。

３　’　−ｔｇａｃｇＣｔａＣｔｃａｃｃｇｔｃＣＣｑＣＣＣＣｑＣａｔｔａｔｃ亀北笠−５’　オリゴ４η也工ＣＡＴ配列中の単一の内部ＥｃｏＲＩ部位を使って、ｐＣＭ７から５ｆａＮＩ／ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＩ／５ｃａｌ断片を別々に切りだし、アクリルアミドゲルから精製した。その後、５ｆａＮＩ／ＥｃｏＲＩ断片はオリゴヌクレオチド１および２をアニーリングして得た合成りＮＡ断片と連結させ、ＸｂａｌおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＵｃ１９プラスミドにクローニングした。

同様に、ＥｃｏＲＩ／５ｃａｌ断片は、オリゴヌクレオチド３および４を使って、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ−消化ｐＵｃ１９プラスミドにクローニングした。

連結したＤＮＡはコンピテントＤＨ５ａ細菌へ形質転換し、増幅し、単離し、そして標準技法を用いて制限分析によりスクリーニングした。

５ｆａＮＩ挿入物を有する組み換え体はＸｂａＴとＥｃｏＲＩて切断し、５ｃａｒ挿入物を有するプラスミドはＥｃｏＲＩとＢ［■で切断した。これらの断片はアクリルアミドゲルから精製し、ＸｂａＩとＢｇｌｌＩて切断したｐＰＨＶベクターへ一緒にクローニングした。形質転換後、白色コロニーを増殖させ、エンドヌクレアーゼ消化で分析し、選別したクローンの塩基配列を決定した。最後のクローンのｐｃＡＴｃＮｓ２を大量に増殖し、フランキングｐＵＣ配列からＣＡＴ遺伝子へ３００ｎｔまでの塩基配列を決定し、ＣＡＴ遺伝子中のＧ−Ａトランジッション（サイレントであるようだ）を除いて、意図する配列との不一致はないことが分かった。

７．１．１　ウィルスおよび細胞インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４及びＡ／ＷＳＮ／３３ウィルスはそれぞれ胚含有卵とＭＤＣＫ細胞で増殖させた（Ｒｉｔｃｈｅｙｅｔ　ａｌ、、　１９７６、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　１８ニア３６−７４４；　Ｓｕｇｉｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７２゜Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　１０：６３９−６４７）　。ＲＮＰ　 −）ランスフェクションはヒト２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７７、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　３６＋５９−７２）及びＭａｄｉｎ −Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞（Ｓｕｇｉｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、。

１９７２、前掲）で行った。

７．１．２　プラスミドの構築ｐＵＣ１９由米のプラスミドｐＩＶＡｃＡＴ１は、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４　ＲＮＡセグメント８の非コード配列に隣接したクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含む。この構築物は、ＲＮＡ転写産物ＩＶＡＣＡＴｌが５′から３′の方向で：インフルエンザウィルスＮＳ　ＲＮＡの５′末端から誘導される２２ヌクレオチド、ＢｇｌＩＩ制限部位を含む８ｎｔリンカ−配列、ネガティブ極性のＣＡＴ遺伝子、およびインフルエンザウィルスＮＳ　ＲＮＡの３′末端から誘導される２６ｎｔを含むように、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターの支配下に配置する（図１１）。

ｐ　Ｉ　ＶＡＣＡＴ　Ｉ　ハ次のようにして構築した：　ｐ　ｒＶＡＣＡＴｌにおいて正しい５′末端を得るために、プラスミドｐＣＭ７（Ｐｈａｒ＋ｒ＋ａｃ　ｉａ）由来のＣＡＴ遺伝子のＥｃｏＲＩ−８ｃａｌ断片を２つの合成オリゴヌクレオチドにより形成されたＤＮＡ断片に連結した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は＋　５’　−ＡＣＴＧＣＧＡＴＧＡＣ；ＴＧＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧＡＴ−３’（）ツブ鎖）、および５’　−ＣＴＡＧＡＴＣＴＡＴＴＡＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣＡＴＣＧＣＡＧＴ−３’（ボトム鎖）である。ｐｌＶＡｃＡＴｌ中の挿入物の３′末端の場合は、ＣＡＴ遺伝子の５ｆａＮＩ−ＥｃｏＲＩ断片を合成オリゴヌクレオチド：　５’　−ＣＴＡＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＡＣＡＴＡＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＧＧＴＡＴＡＣＣＡＣＣＧＴＴＧＡＴＡＴＡＴＣＣＣＡＡＴＣＧＣＡＴＣＧＴＡＡＡ−３’　（トップ鎖）、および５’ 　−ＧＴＴＣＴＴＴＡＣＧＡＴＧＣＧＡＴＴＧＧＧＡＴＡＴＡＴＣＡＡＣＧＧＴＧＧＴＡＴＡｃｃｃＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴＴＡＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＡＣＣＣＴＧＣＴＴＴＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＧＴ〜３′　（ボトム鎖）がら作製したＤＮＡ断片に連結した。オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＤＮＡ合成機で合成した。これらの５′および３′構築物はＸｂａｌとＥｃｏＲＩで消化したｐＵｃ１９シャｌ〜ルベクターに連結し、増殖し、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩ［（５’領域）およヨン６で述べたｐｖ−ｗ’ｒに類似しているが、それはインフルエンザＡウィルスＮＳ　ＲＮＡセグメントの非コード末端配列を分離するＢｇｌＩＩ部位を含む。最終クローンｐｌＶＡｃＡＴＩ　Ｃ図１）は増殖させ、フランキングｐＵＣ配列から出発してＣＡＴ遺伝子に至るＤＮＡは部分的に配列を決定した。ＩＶＡＣＡ、ＴｌＲＮＡの開始点に対して１０６位のＣＡＴ遺伝子中のサイレントＧ→Ａトランジッションを除いて、意図した配列に比べて変異か見られなかった。

７．１．３　Ｔ７　ＲＮＡ転写ラン−オフ転写を可能にするために、プラスミドｐ　ＩＶＡＣＡＴｌをＨｇａＩて消化した（図１１）。この酵素により生成した５ｎｔ突出部分をフレノウ酵素（ＢＲＬ）で修復し、このＤＮＡをスピンカラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）にかけて精製した。Ｔ７ポリメラーゼ反応はＲｎ　ａ　ｓ　ｉ　ｎ　（Ｐｒｏｍｅｇａ　）の存在下に標準方法を使って行った。鋳型ＤＮＡはＲｎａｓｅ不含Ｄ　ｎ　ａ　ｓ　ｅ　Ｉ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）から分離した。ＲＮＡはＱｉａｇｅｎ　ｔｉｐ−５カラム（Ｑｉａｇｅｎ。

Ｉｎｃ、　）にかけて精製し、４％ポリアクリルアミドゲル（銀染色を行った）を用いて定量した。ＮＳ　ＲＮＡは同じ方法でプラスミドｐＨｇａＮＳから調製した。

７．１．４　インフルエンザＡウィルスポリメラーゼの精製およびＲＮＡポリメラーゼ複合体はセクション６に記載したインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４から精製した。冷却ＩＶＡＣＡＴＩまたはＨｇａＮＳ　ＲＮＡ鋳型のｉｎ　ｖｉｔｒａ転写はセクション６に記載した条件を使って実施した。放射性標識転写産物は４％アクリルアミドゲルで分析した。

約１０６細胞を含む３５ｍｍ皿を、ＰＢＳ／ゼラチン（０，１ｍｇ／ｍｌゼラチン）中の０．５％ＤＭＳＯ１３００μｌ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストリンの溶液１ｍｌで室温で３０分間処理した。

この溶液の除去後、ｌμｇ　ＩＶＡＣＡＴＩ　ＲＮＡ　（１−２μ■）、２０μ ｌの精製ポリメラーゼ調製物および４μｍのＲｎａｓｌｎを含む２００μｍのＰＢＳ／ゼラチンを細胞に加え、３７°Ｃて１時間インキュベートした。その後、勾配精製したインフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウイルス（ｍｏｉ２−１０）を加えた。３７°Ｃで１時間インキュベーション後、２．５　ｍ　１のＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ３培地（２９３細胞）またはＭＥＭ培地（ＭＤＣＫ細胞）を加えた。いくつかの実験では、最初にＭＤＣＫ細胞に感染させ、その後ＲＮＰ−）ランスフェクトした。細胞の収穫はＮＥＴ緩衝液または培地中で、ラバーポリスマンを使って（ＭＤ　ＣＫ細胞）、あるいは穏やかな懸濁により（２９３細胞）行った。

細胞を遠心し、ベレットを１００μｍの０．２５Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ７，５）中に再懸濁した。続いて、試料は凍結−融解を３回繰り返し、細胞破片を沈殿させた。上清はＣＡＴ検定に使用した。

ＭＤＣＫ細胞はヘルパーウィルスを感染させ、上記のように２時間後ＰＮＰ−トランスフェクトした。１時間後細胞と培地を集め、細胞を沈殿させた。ウィルスを含む１００μ工の上清培地はＭＤＣＫ細胞を入れた３５ｍｍ培養皿に加えた。

１２時間後、これらの細胞と培地を集め、ＣＡＴ活性について検定した。この− り清培地に含まれるウィルスは３５ｍｍ培養皿中のＭＤＣＫ細胞のその後の感染に使用した。

７．１．７　ＣＡＴ検定ＣＡＴ検定はＧｏｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８２．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　２：ｌ０４４−１０５１から適合された標準方法に従って行った。検定は０．２５ＭトリスｔｌＪ衝液（ｐ　Ｈ７，５）中に１０μＩの＋４０クロラムフエニコール（０，５ｕＣｉ　；８．３ｎＭ；ＮＥＮ）、２０μｌの４０ｍＭアセチルＣｏ　Ａ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）および５０μｌの細胞抽出物を含んでいた。インキュベーションは１６−１８時間行った。

ｃＮＳから、セクション６に記載する通りにバクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いて作製した。ｒＲＮＡ鋳型はセクション６、１．１．に記載する通りに調製したウィルスＲＮＡポリメラーゼ複合体と組み合わせ、得られたｒＲＮＰを使用して、インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３を重感染させたＭＤＣＫおよび２９３細胞株をトランスフェクトした。ｒ　ＲＮ　Ｐでトランスフェクトしたそれぞれの細胞株において、高レベルのＣＡＴ発現か感染の６時間後に観察された。さらに、感染の２４時間後に得られたウィルスストックは、ＭＤＣＫ細胞での後続の継代後に高レベルのＣＡＴ酵素を合成した。ＣＡＴ−ＰＮＰはウィルス粒子にパッケインビボでのインフルエンザＡウィルスＲＮＡの転写及び複製シグナルを研究するために、ＮＳ　ＲＮＡ様のトランスクリプトの合成を指示するプラスミドｐｌＶＡｃＡＴ１　（第１１図）を構築した。

このＲＮＡはインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウィルスのＮ５ＲＮＡと５°− 末端の２２個のヌクレオチド及び３°−末端の１６個のヌクレオチドを共存し、そして−−ＮＳ１及びＮＳ２蛋白に対するコード化配列の代わりにｍ−完全な長さのＣＡＴ蛋白に対するコード化配列を存している。クローニングの目的のために、これは、また、ＣＡＴ遺伝子の終止コドンと５−非コード化領域におけるＵ ′ｓのストレッチの間にＢｇｌ　Ｉ［部位を含む８個の付加的なヌクレオチドを有している。５−非コード化配列に隣接するＴ７プロモーター及び３′−末端のＨｇａ　１部位下流は、５゛−及び３′−末端の正確な作成（ティラーリング）を可能とする。Ｔ７ボリメラーゼを使用するラン−オフ転写は７１６ヌクレオチドの長さのＲＮＡを産生ずる：第１２図の帯２〜４は、このＲＮＡが別個の長さものであり、ｐＨｇａＮＳのＴ７転写により合成された８９０ヌクレオチドの長さのマーカーＮＳ　ＲＮＡよりも短かいことを示している（帯１）。

第６節で記載した例において、３−末端にインフルエンザウィルスＲＮＡのセグメント８の３゛−末端の１５個のヌクレオチドを有する合成ＲＮＡは、精製されたインフルエンザＡウィルスＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロで転写されうろことか示された。我々は非ラベル化ＩＶＡＣＡＴＩ　ＲＮＡが同様な方法で転写しうるか否か試験した。第１２図の帯５は、インビトロでの転写反応は別個の長さで、Ｔ７転写反応の生成物と類似の大きさのＲＮＡを生成したことを示し、これは全長さの生成物の合成を示唆した。

７．２．３　ＰＮＰ−）ランスフェクション及びＣＡＴ活性組換えＣＡＴ　ＲＮＡはインビトロで転写しつるであろうから、このＲＮＡかインビボで認識され、かつ、複製されうるか否かを試験するためのシステムが設計された（第１３図）。組換えＲＮＡを精製したポリメラーゼと混合すると、ウィルスＲＮＰ様粒子の形成を許した。対合を促進させるために、ＲＮＰ　ｌ−ランスフェクションに先立って、ＲＮＡ／ポリメラーゼ混合物を転写緩衝液中でヌクレオチド抜きで３０ °Ｃで３０分間培養した。幾つかの実験において、この予備培養は省略した。ＲＮＰ−トランスフェクションはインフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウィルスによる感染に先立ち、又は、続けてなされた。というのはウィルスポリメラーゼ蛋白の製造か遺伝子の効率的な増幅のために必要であることが期待されたからであった。使用した細胞はＭＤＣＫ細胞、これは容易にインフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウィルス感染されやすいものである、又は、ヒト２９３細胞、これは一層ゆっくりした速度での感染を支持するものである、であった。

マイナスセンスＩＶＡＣＡＴＩ　ＲＮＡがインビボで増幅され、そして転写されうるか否かを決定するために、２９３細胞中で実験か実施された。細胞はＲＮＰてトランスフェクトされ、１時間後にウィルス感染され、そして感染後種々の時間において回収された。第１４図は、感染後の早い時期においては、単にＣＡＴ活性のバックグラウンドレベルのみが検出されることを示した（帯５．７及び９）。

しかしながら、ＣＡＴ活性の有意なレベルがウィルス感染後７時間して現れた（帯１１）。ＣＡＴ活性の同様なレベルはさらに２時間後にも検出された（帯１３）。ＣＡＴ活性のバックグラウンドレベルは模擬感染細胞において如何なる時点においても存在しく帯６、８．１０．１２及ヒ１４）　、マた、Ａ／ＷＳＮ／３３ウィルステ感染されなかったコントロール細胞においても存在した（帯１〜４）。

ＲＮＡとポリメラーゼ複合体の予備培養は、ＲＮＰ−１−ランスフェクションを成功させるために必要ではなかった。第１４Ｂ図の帯２及び３から判るように、予備培養は、恐らくは予備培養の間におけるＲＮＡ変成により、実際にはＣＡＴ活性の減少を生じたかもしれない。他のコントロール実験において、ＲＮＰ−トランスフェクトされた細胞のヘルパーウィルスによる感染は省略された（第１４Ｂ図、帯４及び５）。これらの帯はＣＡＴ活性を示さないから、我々はＩＶＡＣＡＴ　Ｉ　ＲＮＡはヘルパーウィルスにより提供されるプロテインマシナリーにより特異的に増幅されると結論している。付加的なコントロール実験において、裸のＲＮＡが細胞内にトランスフェクトされ、次いでこの細胞はヘルパー感染又は模擬感染された。これらの試料においては、再びＣＡＴ活性か検出されなかった（第１４Ｂ図、帯６〜９）。最後に、組換えＣＡＴ−ＲＮＰでトランスフェクトされなかったウィルス感染された細胞は、同様に内在性のアセチル化活性を示さなかった（第１４Ｂ図。

帯１０）。こうして、組換えＲＮＡへの精製ポリメラーゼの添加、並びに、細胞のヘルパーウィルスによる感染がＣＡＴ酵素の発現を成功させるために重要であるように思われる。

また、通常のエンフルエンザウイルスに対する組織培養宿主細胞であるＭＤＣＫ細胞を使用して、実験がなされた（第１４Ｃ図）。

ウィルス感染の１時間前に再構成された組換えＣＡＴ−ＰＮＰ複合体がトランスフェクトされると、ウィルス感染の７時間後においてＣＡＴ活性はほとんど観察されなかった（第１４Ｃ図、帯１）。

ウィルス感染後２時間してＰＮＰ−）ランスフエクションか完了されると、ウィルス感染後７時間でＣＡＴの発現が大いに増大された（第１４Ｃ図、帯３）。それゆえ、ＭＤＣＫ細胞もこれらの実験にとって有効な宿主細胞である。

７．２．４　ＣＡＴ−ＲＮＡがウィルス粒子にパッケージされる組換えＣＡＴ　ＲＮＡはインビボにおいてヘルパーウィルス機能により複写しうるから、我々はＲＮＰ−トランスフェクトされかつヘルパーウィルス感染された細胞において生成されたウィルスがＣＡＴ遺伝子を有するか否か調べた。ＭＤＣＫ細胞は２９３細胞よりも高い力価の感染性ウィルスを生成するので、ＭＤＣＫ細胞をこの実験で使用した。ＭＤＣＫ細胞をＡ／ＷＳＮ／３３ウィルスて感染させ、２時間後にＲＮＰ−）ランスフェクトし、そして、−晩培養した。感染後１４時間で媒質を回収し、細胞をベレット化した。ウィルス上澄みを次いで新しいＭＤＣＫ細胞の単層を感染させるために使用した。１時間後に接種物を除き、感染後１２時間で細胞を回収し、そしてＣＡＴ活性をアッセイした。第１５図は、コントロール（帯１）よりも有意に高いＣＡＴ活性レベル（層２及び３）をウィルス調製物が誘発したことを明らかにしている。

この場合、接種物にヘルパーウィルスを添加してもＣＡＴ活性を増大しなかった（帯４）。新鮮なＭＤＣＫｍ胞において上澄みウィルスをさらに継代してもＣＡＴ活性の測定可能な誘発を生じなかった。このことは、これらのウィルス調製物においてはＣＡＴ遺伝子を保持するための選択的圧力が存在しないから、驚くべきことではない。我々は、接種物をＲＮａｓｅで予め処理することにより、オリジナルのＲＮＡ／ポリメラーゼ複合体を伝達する可能性を排除した。この処理はインフルエンザウィルスのウィルスＲＮＰｓを破壊する（ボン（Ｐｏｎｓ）ら、　１９６９．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　３９：　２５０−２５９；ショルチセック（Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ）およびベット（Ｂｅｃｈｔ）、　１９７１．　Ｊ。

Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　１０：　ｌｌ−１６）。

以下のサブセクションにおいて記載された実験は、特異的組換えＤＮＡ５に由来するＲＮＡを使用する感染性インフルエンザウィルスのレスキュー（Ｒｅｓｃｕｅ）を示している。インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウィルス（ＷＳＮウィルス）のノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子に相当するＲＮＡ５をインビトロで相応のプラスミドＤＮＡ５から転写し、そして−一（前記６．１．１節において記載したように）精製したインフルエンザウィルスポリメラーゼ複合体の添加に続いてｍ−前記第７ｗ１において記載したようにしてＭＤＢＫｍ胞へトランスフェクトした。ＷＳＮ　ＮＡ遺伝子が欠除しているから、ヘルパーウィルスでスーパーインフエクションすると、ＷＳＮ　ＮＡ遺伝子を有するウィルスの放出か生した。

こうして、この手法は、ｃＤＮＡクローンとそれらのゲノムの部位特異的突然変異誘発を使用する感染性インフルエンザウィルス工学を可能にする。さらに、この技術は組織培養、動物又はヒトにおいて遺伝子発現のために効率的なベクターとして使用できる感染性キメラインフルエンザウィルスの構築を許すことになるかもしれない。

前記第６節及び第７節において記載した実験は、ネガティブ鎖インフルエンザウィルスＲＮＡの３−末端の１５個のヌクレオチドは精製したインフルエンザウィルスポリメラーゼ蛋白を使用してインビトロでの転写を可能とするのに十分であることを示している。加えて、リポータ−遺伝子のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を使用する研究は、ウィルスＲＮＡの５′−末端の２２個及び３′−末端の２６個のヌクレオチドか、インフルエンザウィルスＲＮＡの転写、複製及びパッケージングのために必要なすべてのシグナルを含むことを示している。これらの結果の延長として、プラスミド、ｐＴ３ＮＡｖか構築され、これは端を切り取ったＴ３プロモーターのインフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウィルス下流の完全なＮＡ遺伝子を有していた（第１６図）。それゆえ、Ｋｓｐ　６３２　Ｔ部位て切断された、このプラスミドのラン−オフ転写はＷＳＮウィルスの真のゲノムＮＡ遺伝子と同一であるＲＮＡを生ずる（第１７図、帯３）。このＲＮ　Ａは次いて精製ポリメラーゼ（第６．１．１節で記載されているようにして精製した）とともに培養し、そして、ＷＳＮウィルスＮＡを有しなかったヘルパーウィルスを使用して感染性ウィルスのレスキューを許すリホ核蛋白（ＲＮＰ））ランスフェクション実験において使用した。ＷＳＮ−ＨＫヘルパーウィルスの選択は、レスキューされたウィルスを分離するために、強力な選別システムが必要であることに基づいていた。以前、ＷＳＮ−ＨＫウィルスはプロテアーゼが培養液に添加される場合に、ＭＤＢＫ細胞においてプラークを形成しうるのみであることが示されていた。このことは、プロテアーゼの非存在下でＭＤＢＫ細胞において容易に複製し、大きくて、容易に視覚しうるプラークを形成するＷＳＮウィルス（ノイラミニダーゼ遺伝子を除いてＷＳＮ−ＨＫウィルスと同系である）と著しく対照的である（シュルマン（Ｓｃｈｕｌｍａｎ）ら、　１９７７、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　２４インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウイルスとＡ／ＷＳＫ−ＨＫウィルスはＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ　ｃａｎｉｎｅ腎細胞（ＭＤＣＫ）と胎児卵細胞とて培養した（Ｓｕｇｉｕｒａら、１９７２．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　１０：　６３９−６４７；Ｓｃｈｕｌｍａｎら、１９７７、　Ｊ、　Ｖｉｔｏｌ、　２４：　１７０−１７６）インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスも胎児卵細胞で培養した。Ｍａｄ　１ｎ−Ｄａｒｂｙｂｏｖｉｎｅｋｉｄｎｅｙ　（ＭＤＢＫ）細胞はトランスフェクション実験とレスキューされたウィルスの選択に使用された（Ｓｕｇｉｕｒａら、１，９７８゜Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　１０：　６３９−６４７）。

８．１．２　プラスミドの構築ｐＴ３ＮＡｖ、ｐＴ３ＮＡｖ　ｍｕｔ　Ｉ　及び１）Ｔ３ＮＡｖｍｕｔ　ｐ２プラスミドは以下の標準プロセス（Ｂｕｏｎａｇｒｉｏ、　１９８６゜５ｃｉｅｎｃｅ　２３２：　９８０−９８２）によって得られたＷＳＮ　ＮＡ遺伝子のクローン化されたコピーを用いてｐｃ′Ｒ法による変異導入によって構築された。

ｐＴ３ＮＡｖを構築するために、以トのプライマーか使用された。

５　／　−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＣＣ；ＡＧＣＧ患ＧＣＡＧＧＡＧＴＴ−：ｌ　’及びＬうＩ−ＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＡＧＴＴＴ−３’サーマルサイクラー（Ｃｏｙ　Ｌｏｂ　ｐｒｒｄｕｃｔｓ、　Ｍ　ｒ）て３５サイクル増幅した後、ＰＣＲ産物はＥＣＣ・ＲＩとＨｉｎｄＩＩＩて切断され、ｐＵｃ１９にクローン化された。プラスミドｐＴ３ＮＡｖ　ｍｕｔｌはプライマー配列か異なる（Ｆｉｇ、１６）ことを除いては類似した方法で構築された。プラスミドＩ）Ｔ３ＮＡ、ｖ　ｍｕｔ２はｐＴ３ＮＡｖのＰｓｔｒとＮｃｏＩ切断と合成オリゴヌクレオチド　−５’　−ＣＡＴＧＧＧＴＧＡＧＴＴＴＣＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴ−の存在下ての再結合によるカセット変異導入によって構築された。

オリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステムのＤＮＡ合成装置によって合成された。最終的なりローンであるｐＴ３ＮＡｖ、ｐＴ３ＮＡｖ　ｍｕｔｌ及びｐＴ３ＮＡｖ　ｍｕｔｐ２か培養され、ｐＵｃ１９の隣接配列からＮＡ遺伝子のコード配列に至る領域か部分的に配列決定された。またｐＴ３ＮＡｖ　ｍｕｔ２における変異は配列決定によって確認された。

８．１．３　インフルエンザＡウィルスポリメラーゼの精製とＭＤＢＫ細胞におけるＰＮＰのトランスフェクションンフルエンサＡ／ＰＲ／８／３４から精製され、ＷＳＮ−ＨＫウィルスかヘルパーウィルスとして多重感染度１て用いられた以外は前述の７に記載されたプロトコールによってＭＤＢＫ細胞のＲＮＰ）ランスフェクションに用いられた。ＲＮＰ　ｌ−ランスフェクションに用いられたＲＮＡは精製されたウィルスからのフェノール抽出かｐＴ３ＮＡｖ、ｐＴ３ＮＡｖ　ｍｕｔｌ及びｐＴ３ＮＡｖ　ｍｕｔｐ２の転写（Ｔ３ポリメラーゼを使用）によって得られた。全てのプラスミドはＫｓｐ６３２Ｉて切断され、クレノー酵素（ＢＲＬ）によってエンドフィルされ、前述の７に記載されたランオフ反応によって転写された。

プラスミドｐＴ３ＮＡｖは切断されたＴ３プロモータ（図１６）の下流のインフルエンザＷＳＮウィルスの完全なＮＡ遺伝子を含むように構築された。Ｋｓｐ６３２Ｉ認識部位で切断されたプラスミドのランオフ転写物は、ＷＳＮウィルスの真性のゲノムＮＡ遺伝子（図１７、レーン３）と完全に等長のＲＮＡを与えた。

次にこのＲＮＡは精製されたポリメラーゼとインキュベートされ、ヘルパーウィルスを用いた感染性ウィルスのレスキューを許容するリボ核タンパク（ＰＮＰ）の感染実験に使用された。レスキューされたウィルスの単離のための強力な選択システムの必要性から、Ｗ　Ｓ　Ｎ　−ＨＫウィルスがヘルパーウィルスとして選択された。先に、Ｗ　Ｓ　Ｎ　−Ｎ　Ｈウィルスは培地にプロテアーゼが添加された場合のみプラークを形成することか示された（Ｓｃｈｕｌｍａｎら、１９７７゜Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　２４：　１７０−１７６　）　、このことは、プロテアーゼ非存在下ではＭＤＢＫ細胞内で容易に複製し大きく簡単に識別できるプラークを形成する（Ｓｕｇｉｕｒａら、１９７２．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　１０：　６３９−６４７）ＷＳＮウィルス（ノイラミニダーゼ遺伝子を除いてはＷＳＮ−ＨＫヘルパーウィルスと同一）とは際だった対照を示す。ＭＤＢＫ細胞はＷＳＮ−ＨＫヘルパーウィルスで感染せられ、ＰＮＰをウィルス感染から１時間後に感染させた。２０μｇ／ｍｌのプラスミノーゲンの存在下での一晩のインキュベーションに続いて、これらの細胞の上清は増幅され、培地中にプロテアーゼが存在しない状態でＭＤＢＫ細胞にプラークを形成させた。ＭＤＢＫ細胞内のプラークの存在は（Ｓｃｈｕｌｍａｎら、Ｖｉｒｏｌ、　１０：　６３９−６４７）　ＷＳＮウィルスのＮＡ遺伝子を含むウィルスの存在を示した。なぜならば、ＷＳＮ−ＨＫウィルスの感染のみを受けた細胞の対照実験で得られた上溝はプラークを形成させなかったからである。ＰＮＰ感染のための３５ｍｍの皿を用いた典型的な実験では、２．５Ｘ１０２個のプラークが観察された。

別のコントロール実験では、プラスミドｐＴ３ＮＡｖ　ｍｕｔｌ　（図１６）由来の合成ＮＡ　ＲＮＡか使用された。このＲＮＡは５°末端の非翻訳領域において１ヌクレオチド欠失している点において、ｐＴ３ＮＡｖ由来の野生型ＮＡ　ＲＮＡと異なっている（図１６）。このＲＮＡを用いたＭＤＢＫ細胞のＲＮＰによる感染及びＷＳＮ−ＨＫウィルスによる重感染によるスキューされたウィルスの形成はみられなかった。我々が前記の６及び７に示した、パッケージングシグナル同様、ウィルスポリメラーゼによるウィルスＲＮＡの認識に必須の配列はウィルスＲＮＡの３′末末端列と５′末末端列の内部に位置しているという事実から、この否定的な結果は容易に理解される。しかし、我々は、検出不可能な頻度ながら、この変異したＲＮＡを利用したウィルスのレスキューが起こるという可能性を排除しきれない。

８．２．２　レスキューされたウィルスを用いたＲＮＡの分析レスキュー実験で得られたウィルスはプラーク精製され、ＭＤＢＫ細胞で増殖され、ＲＮＡがこの調製物から抽出された。このＲＮＡは次にポリアクリルアミド電気泳動によって分析された。

図１７はヘルパーウィルスＷＳＮ−ＨＫのＲＮＡ　（レーン１）、プラスミドｐＴ３ＮＡｖからＴ３ポリメラーゼによって転写された合成ＲＮＡ　（レーン３）を示す。レスキューされたウィルスのＲＮＡの泳動パターン（レーン２）は、コントロールのＷＳＮウィルスのパターン（レーン４）と同一であった。また、レーン２及びレーン４のＮＡ　ＲＮＡはｃＤＮＡ由来のＮＡＲＮＡ（レーン３）と同じ場所に泳動され、ヘルパーＷＳＮ−ＨＫウィルス内のＨＫウィルスのＮＡのバンド（レーンｌ）よりも速く泳動した。この実験はＲＮＰ感染の結果としてｃＤＮＡ由来のＷＳＮウィルスのＮＡのＲＮＡを含む感染ウィルスか形成されたという結論を支持する。

別の感染実験において、精製されたＷＳＶウィルスから抽出されたＲＮＡが用いられた。この純粋なＲＮＡがポリメラーゼ蛋白と共にヘルパーウィルスが感染した細胞に感染する際、ＭＤＢＫ細胞内で複製可能なＷＳＮウィルスのレスキューが観察された。

この実験で増幅されたプラークから抽出されたＲＮＡは図１７のレーン５で分析され、レーン４のＷＳＮウィルスのコントロールのＲＮＡとは区別できないパターンを示した。

８．２．４　ウィルスゲノムへの部位特異的変異の導入ここまで述べられてきた実験は、インフルエンザＷＳＮウィルスのレスキューを含む。これらの実験において使用された合成ＲＮＡは、真正のＷＳＮ　ＮＡ遺伝子と一致することから、野生型ＷＳＮウィルスによる混入のありそうもない可能性は厳密に妨げられなかった。それゆえ、我々はプラスミドｐＴＳＮＡｖ中のＮＡ遺伝子のコード領域に５つのサイレントポイント変異を導入した。これらの変異は、ＮＡ遺伝子中に存在する短いＮｃｏＩ／ＰｓｔＩ断片の置き換えを介してカセット式変異誘発によって導入した。前記のｃＤＮＡにおける５つの変異は、９０１位置でのＣからＴへの変化及び９２５位置でのＣからＡへの変化を含み、それぞれ新しいＸｂａ　Ｉ部位を創製し、元のＰｓｔＩ部位を破壊した。更に、ｃＤＮＡクローンの８８７−８８９位置の完全なセリンコドンは代わりのセリントリプレットで置き換えられた（図１７）。この変異誘発されたＲＮ　Ａ　（１）Ｔ３ＮＡｖ　ｍｕｔ２）のＲＭＰ−トランスフェクション及びＭＤＢＫ細胞のヘルパーウィルス感染は、加えられたプロテアーゼの不存在下で増殖するＷＳＫ様ウィルスのレスキューとなった。このウィルスのＲＮＡを配列分析によって調べると、プラスミドＤＮＡに存在する全ての５つの変異（図１６）は、ウィルスＲＮＡ中に観察された（図１８）。これらの変異か野性型インフルエンザＷＳＮウィルス中で発展したことはきわめてありそうもないことから、我々は、５つの部位特異性変異を含む感染性インフルエンザウィルスの成功したレスキューは、遺伝子操作したＲＮＡのＲＮＰ−トランスフェクションを経てなし遂げられたと結論する。

９゜例：合成複製システム以下に述べる実験では、レポーター遺伝子をコードするインフルエンザウィルス様ｖＲＮＡ分子を産生ずることができるｃＤＮＡクローンを用いた。この合成されたＲＮＡは、非構造タンパク質、ＮＳＩおよびＮＳ２についての領域をコードするアンチセンス（Ｌｕｔｊｙｅｓ　ｅｔａｌ、　、　１９８９．　Ｃｅ１１．５９；１１０７−１１１３）の代わりにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）のコード領域のアンチセンスを含むＮＳ様ｖＲＮＡである。この組換えＲＮＡ（ＩＶＡＣＡＴ−１）を精製インフルエンザウィルスＰＮＰタンパク質とともにインキュベートし、非インフルエンザウィルス依存性複製システムを発達する試みに用いた。マウス繊維芽細胞Ｃ１２７を組換えワクシニアウィルス（Ｓｍｉ　ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８７．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１６０：３３６−３４５）の混合物て感染させ、１時間後にＩＶＡＣＡＴ−Ｉ　ＲＮＰ　でトランスフェクトした。３つのポリメラーゼ（ＰＨ１，ＦＢＩ及びＰＡ）を発現するベクター及び核タンパク質の混合物を用いた。合成ＰＮＰの複製及び転写は、−夜インキユベーションした後、細胞のＣＡＴ活性を分析することによって評価した。図１９は、４つの組換えワクシニアウィルスの可能な混合物の多くで最初に感染された細胞に存在するＣＡＴ活性を調べている。図１９のレーン４は、組換えワクシニアウィルスの代わりにインフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウィルスを用いた陽性対照である。ＣＡＴ活性は、全ての４つのワクシニアベクターで感染された細胞と同様に、この試料中に存在する（図１９、レーン８及び１０）。これらの４つのタンパク質の何らかのサブセットを発現する細胞は、検出しうるＣＡＴタンパク質を産生じなかった（図１９、レーン５−７．９．１１、未公開）。更に、精製ポリメラーゼとインキュベートされていないトランスフェクトされたＲＮＡは、またＣＡＴ発現陰性てあった（Ｌｕｔｊｙｅｓ、　ｅｔ　ａｌ、　１９８９）。このように、ＰＨ１，ＰＢＸ、　ＰＡ及びＮＰタンパク質は、このシステムにおけるＰＮＰ発現及び複製のために必要かつ充分なすべてのものである。ワクシニアベクター−感染細胞で得られたＣＡＴ活性のレベルは、ヘルパーウィルスとしてのインフルエンザで感染された細胞でのものよりも、再現可能的に高い。これについての最も有望な説明は、ワクシニア駆動システム（ｔｈｅ　ｖａｃｃｉｎｉａ　ｄｒｉｖｅｎ　ｓｙｓｔｅｍ）では、ＣＡＴ−ＰＮＰが存在する唯一のウィルス様分子であるのに対し、インフルエンザウィルス感染細胞ては、ＣＡＴ−ＲＮＰは活性ポリメラーゼについて内因性ウィルスＰＮＰと競争することである。

次いて、多くの他の細胞系を、このワクシニアウィルス駆動システム（ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ　ｄｒｉｖｅｎ　ｓｙｓｔｅｍ）についての宿主として試験した。図２０ＡはＭＤＢＫ、　Ｈｅ１ａ、　２９３及びＬ細胞を用いた結果を示す。それぞれの場合、細胞を、３つのポリメラーゼタンパク質だけを発現するベクターで感染させたとき、ＣＡＴ活性は観察されなかったか、更にＮＰ発現を誘導するワクシニア−ベクターも加えれば、有意なＣＡＴ活性か得られた。

予め、低レベルのＰＨ１，ＰＢＩ及びＰＡタンパク質、並びに高レベルのＮＰタンパク質を本質的に発現する細胞系（３ＰＮＰ−４と命名）を構築した。これらの細胞は、ＰＨ１又はＮＰ遺伝子セグメントのいずれかをマツピングするｔｓ変異株の増殖を補足することかできる（Ｋｒｙｓｔａｌ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８６：いｅｔ　ａｌ、、　１９８９）。組換えワクシニアウィルスベクターによる複製は、これらのタンパク質だけに依存することから、この細胞系は少しもウィルス感染かない状態て合成ＣＡＴ−ＲＮＰを増幅し発現することかできるてあろうと考えられた。

しかしなから、この実験を試みると、検出しうるＣＡＴ活性は得られなかった（データは示していない）。この細胞系か複製を支持しなかった理由を調べるため、組換えワクシニアウィルスの混合物を用いて３ＰＮＰ−４細胞を感染させた。

予想したように、４つのポリメラーゼタンパク質の追加はＣＡＴの発現を支持した（図２０Ｂ、レーン２）。図２０Ｂ、レーン３は、３ＰＮＰ−４細胞にＣＡＴ活性を誘導するのに必要な最小限のベクター混合物はＦＢＩ及びＰＡタンパク質だけを発現するそれであることを示す。それゆえ、３ＰＮＰ−４細胞におけるＰＨ１及びＮＢタンパク質の安定した状態のレベルは充分であるが、ＦＢＩ及びＰＡのレベルは、ヘルパーウィルスの不存在下でＣＡＴ発現の限界以下である。ＰＨ１及びＮＰ変異株の増殖だけが非許容温度て回復てき、ＰＢＩ及びＰＡ変異株の増殖は回復できないことから、これは、これらの細胞によって示される相補表現型と相関する（Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１．９８０）。

合成ＩＶＡＣＡＴ−ＩＲＮＡはネガティブな極性であるから、ＣＡＴのみか転写オフ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆｆ）ＲＮＰ分子を経由して合成されうる。

理論的には、ＣＡＴの検知可能なレベルは転写オフのトランスフェクトされたインプットＰＮＰ　（最初の転写に等価）を通じ、またはＰＮＰの増巾及びその後の転写（ＰＮＰ複製を必要とする）或いはその両者の結合のいずれかにより製造しうる。しかしながら、インフルエンザウィルス感染を用いるＣＡＴプロティンの発現を行った従来の業績は、検知しうる発現かインプラｌ−ＣＡＴ−ＰＮＰか複製されるならばその場合のみ起る（ＬｕｔＪｙｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９）ことを示していた。これはウィルスＲＮＡの５゛−末端の１２塩基の中に３つの変異を含む第２のＣＡＴ−ＲＮＡ　、すなわちＩＶＡＣＡＴ−２の使用により示される（い」ｔｊｙｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９）　（ｌこの１２塩基領域は、全てのインフルエンザＡウィルスにおける全ての８個の遺伝子セグメントに保持されている（Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｇｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０）ｏこの合成ＩＶＡＣＡＴ−２ＲＮＰはインフルエンザウィルスポリメラーゼによる転写には適しているか、複製されず、そしてインフルエンザ感染細胞にトランスフェクトされたとき、ＣＡＴ活性は未検知で残っていた（Ｌｕｔｊｙｅｓ　ｅｔａｌ、　、　１９８９）。それ故に、最初の転写オフインプットＲＮＡは、インフルエンザウィルス感染細胞において、検知しうるレベルの蛋白質を産出しなかった。従って、我々は、ワクチンのベクター発現インフルエンザ蛋白質かインプットＰＮＰの最初の転写を通じ単独でＣＡＴ活性を誘導するのか、または複製による増巾及びそれに続く転写をさせるのかを検査するためにこの変異ＲＮＡを用いた。Ｃ１２７細胞は、組み換え体ワクチンウィルスで感染され、次いてＩＶＡＣＡＴ刊及びＩＶＡＣＡＴ−２て産生したＲＮＰｓのいずれかでトランスフェクトサレタ。図２０Ｃｉ；！、低しヘルノＣＡＴ活性がｆＶＡｃＡＴ−２ＲＮＰ　（レ−ン２）でトランスフェクトされた細胞で検知された。定量したとき、にせのトランスフェクトしたレーン（図示せず）での０．２〜０．４％に比較して、クロラムフェニコール０．５〜１％がアセチル化型に変換されている。しかしながら、高レベルの活性かＣＡＴ−ＩＰＮＰでトランスフェクトされた細胞中に存在しており（レーン１：通常、クロラムフェニコール１５〜５０％変換）、増巾がこれらの細胞中で起っていることを示している。それ故に、この組み換えワクチンウィルス−発現（ｄｒｉｖｅｎ）システムは配列特異的てあり、ＲＮＰ’ Ｓは複製を受ける。

記載された実験では、ＮＳＩまたはＮＳ２蛋白質はＰＮＰ複製には要求されない。これらの機能は知られていないか、両者の蛋白質か大量に合成され、核中に存在するので、これら蛋白質は複製において、主役を演じることかできる旨か推測される（Ｋｎ＋ｇ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８９；　Ｙｏｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８５；　Ｌａｍｂ　ｅｔａｌ、、　１９８４）。示されるデーターに基づけば、これら蛋白質はゲノム複製には全く要求されない。これらの蛋白質は、ＰＮＰの複製に関して、宿主因子の相互作用、ウィルス遺伝子の発現の規則または感染性のピリオン中のＲＮＰのパッケイジに含まれるいくらかの機能のような補助的なルールを実質的に育しうることか推定される。しかしなから、検査でＮＳＩまたはＮＳ２蛋白質のいずれかの蛋白質と公知のワクチンウィルス蛋白質との間で自明の同一性は見出されなかったか、これらＮＳ蛋白質の機能はワクチンウィルス蛋白質により補足されうろことは排除され得ない。これら２つのウィルスの対照的な性質はまた補完バクシニアウィルスタンパク質に反する。なぜならばバクシニアは細胞質中だけで複写する大きな２本ｊＡＤＮＡウィルスであり一方インフルエンザウィルスは核の中のみて複写するネガティブセンスＲＮＡウィルスである。さらに合成ＰＮＰ’　ｓの複写はバクシニアウイルスの後期遺伝子の阻害剤である、シトシンアラビノシド（ａｒａ−Ｃ，データは今回示されている）の存在下でさえ起った（Ｏｄａら、　１９６７：　Ｋａｖｅｒｉｎら、　１９７５゜Ｃｏｏｐｅｒら、１９７９）。

この組み換えベクタニアベクター依存方法は合成ＲＮＡの複写を起すインフルエンザウィルス感染を使用するよりも多くの利点を有する。ひとつには、ウィルスタンパク質の発現は完全に人工的なので、複写にかかわる過程の正確な解剖を可能にする。複写は、１ネじめネガティブセンスゲノムＲＮＡからのポジティブセンス鋳型の合成を必要とする。続いてこのポジティブセンスｃＲＮＡはゲノムセンスＲＮＰを増幅するために増幅され、続いてゲノムセンスＲＮＰはタンパク質発現およびゲノム包み込みに用いられる（Ｋｒｕｇら。

１９８９）。ここで記載されている方法はインフルエンザウィルスＰＢ２、ＰＢＩ、ＰＡおよびＮＰタンパク質のみか、発現されたタンパク質の検出およびＰＮＰの複写に必要である。このベクシニアベクター駆動複写方法のもうひとつの利点は、インフルエンザポリメラーゼタンパク質がｃＤＮＡ組み込みベクシニアウイルスから発現されるので、ポリメラーゼタンパク質の突然変異誘発が実行可能でウィルスポリメラーゼタンパク質の構造−機能をさらに分析するために強力な方法となる。また我々は再構成されたウィルスＲＮＰＳの混合物のトランスフェクションにより感染性インフルエンザウィルスをレスキューすることを現在試している。この技術か、もし成功すれば、自然または合成より得られた明確なＲＮＰｓの添加により明確な組み換えウィルスの容易な構築を可能にする。この技術は他のネガティブ鎖ウィルスの複写機構の分析および解剖にもまた適用されるべきである。

１０、微生物の寄託プラスミドｐｌＶＡｃＡＴを含有するＥ、ｃｏｌｉ細胞系はイリノイ州ＰｅｏｒｉａのＡ＋ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）に寄託し、下記の受託番号を有する。

株　プラスミド　受託番号本発明は記載された特定の実施態様によって範囲を限定されるものではない。なぜなら記載された実施態様は本発明の一局面のひとつの説明として意図されたものにすぎず、機能的に同等の任意の構築物、ウィルスまたは酵素がこの発明の範囲内にある。事実、ここに示したり記述しことに加え本発明の種々の改変が前出の記載および図面から当業者には明らかであろう。かかる改変は本発明の範囲に該当することか意図される。

ＨＡ２＞９　− ５３　ｎｔママ−− １２３４５　．２３４５インプツトした鋳型のモル比Ｖ−ｄ５’：　ＯＯ，２１消化されたＤ　Ｎ　Ａ１−ν Ｏ−酪゛・争９ゆ　・ＷＳＮ／ＨＫ　ＷＳＮ／ＨＫＧＡＴＣＧＡＴＣ・・・・・　・　・補正書の翻訳文提出書（特許法　第１８４条の８） ■　国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０４８８９２、発明の名称組み換えネガティブ鎖ＲＮＡウィルス発現系及びワクチン３、特許出願人名　称　ザ　マウント　シナイ　スクール　オブ　メデイスン　オフ住　所　東京都港区虎ノ門１丁目１５番７号５　補正書の提出年月日　１９９１年ＩＯ月２１日補正された請求の〔囲１　ポリメラーゼ結合部位かｍ　ＲＮ　Ａコード配列の逆の相補鎖の３′側に位置４るように、ｒｎ　ＲＮ　Ａコード配列の逆の相補鎖から成る異種ＲＮＡ配列に機能しうる状態で連結された、ネガティブ酒ＲＮ　ｒヘウイルスから誘導されたＲ　Ｎ　Ａ依存性ＲｉＡポリメラーゼに特異的な結合部位を含む、組み換えネガティブ鎖Ｒｉ’Ｊ　Ａ分子。

２、ポリメラーで結合部位はインフルエンザケノムセグメントの３′　−非コードウィルスセンスフランニング配列から成る、請求項１の組み換えネガティブ道ＲＮＡ分−）。

３　ポリメラーゼ結合部位はインフルエンザケノムセグメントの３′　−末端の末端１５ヌクレオチドから成る、請求項〕の組み換えネガティブｉｌ　ＲＮ　Ａ分子。

４　インフルエンザの３′−非コートウィルスセンスフランキング配列は次の配列５’ＣＡＣＣＣＵＧＣＵＴＪｕ’ＴＪＧＣＵ−３’から成る、請求項２の組み換えネガティブ鎖ＲＮＡ分子。

５　インフルエンザの３′　−非コートウィルスセンスフランキング配列は次の配タリ５　’−ＣＡＣＣＣＵＧＣＵＵＣＵＧＣＵ−３１から成る、請求項２の組の換えネガティブ鎖Ｒ，Ｎ　Ａ分子。

６　インフルエンザの３′〜非コートウイルスセンスフランよ一ノグ配列は次の配Ｆ’１５　’−ＣＡＣＣＣＵＧＩＪＵＴＪＴＪＴＪＧＣＵ−３’から成る、請求項２の組み換えネガティブ鎖ＲＮＡ分子。

７　インフルエンザの３′　−非コートウィルスセンスフランキング配列は次の配列５　’　−ＣＡＣＣＣＵＴＪＧＣＵＬ’ＴＪＴＪＧＣＵ−３’から成る、請求項１０組み換えネガティブ鎖ＲＮＡ分子。

８　ポリメラーゼ結合邪位かｍＲＮＡコード配列の逆の相補鎖の３′側に位互するように、ウイルスポリメラーゼ結合部位を含むインフルエンザの３′　−非コードウィルスセンスフランキング配列、およびインフルエンザの５′　−非コードウィルスセンスフランキング配列に機能しうる状態で連結された、ｍ、　ＲＮ　Ａコード配列の逆の相補鎖から成る異種ＲＮＡ配列を含む、組み換えネガテップ鎖ＲＮＡ分子。

９　インフルエンザの５７−非コードウィルスセンスフランキング配列はインフルエンザケノムセグメントの５１−末端の最初の２２ヌクレオナトから成る、請求項８の組み換えネガティブｍ　ＲＮ　Ａ　分子。

１０、　インフルエンザの５′　−非コードウィルスセンスフランキング配列は次の配列１１．　ｍ製したインフルエンザウィルスポリメラーゼと混合した請求項１の組み換え分子から成る組み換えＲＮＰ。

１２、インフルエンザウィルスポリメラーゼはＣｓＣ１勾配遠心により分画化したＲＮＰから得られ、その際精製したインフルエンザウィルスポリメラーゼは１．　５−２．　０〜ｆ　ＣｓＣ１に関係した勾配の領域から単離される、請求項１１の組み換えＲＮＰ。

１３、精製したインフルエンザウィルスポリメラーゼと混合した請求項８の組み換え鋳型から成る組み換えＲＮＰｏ１４、インフルエンザウィルスポリメラーゼはＣｓＣ１勾配遠心により分画化したＲＮＰから得られ、その際精製したインフルエンザウィルスポリメラーゼは１ −　５−２．　０ＭＣｓＣ１に関係した勾配の領域から単離される、請求項１３の組み換えＲＮ　Ｐ　。

１５、ポリメラーゼ結合部位がｍＲＮＡコード配列の逆の相補鎖の３′側に位置するように、インフルエンザウィルスポリメラーゼ結合部位に機能しうる状態て連結された、ｍＲＮＡコート配列の逆の相補鎖から成る異種ＲＮＡ配列を含むインフルエンザウィルスから成るキメラウィルス。

１６、異種ＲＮＡ配列はインフルエンザのセグメント１内に含まれる、請求項１５のキメラウィルス。

１７　異種ＲＮＡ配列はインフルエンザのセグメント２内に含まれる、請求項１５の上メラウイルス。

１８　異種ＲＮＡ配列はインフルエンザのセグメント３内に含まれる、請求項１５のキメラウィルス。

１９、異種ＲＮＡ配列はインフルエンザのセグメント４内に含まれる、請求項１５のキメラウィルス。

２０、異種ＲＮＡ配列はインフルエンザのセグメントＳ内に含まれる、請求項１５のキメラウィルス。

２１　異種ＲＮ　Ａ配列はインフルエンザのセグメント６内に含まれる、請求項１５のキメラウィルス。

２２　異種ＲＮＡ配列はインフルエンザのセグメント７内に含まれる、請求項１５のキメラウィルス。

２３、異種ＲＮＡ配列はインフルエンザのセグメント８内に含まれる、請求項１５の位置するように、インフルエンザウィルスポリメラーゼ結合部位に機能しうる状態で連結された、ｍＲＮＡコード配列の逆の相補鎖から成る異種ＲＮＡ配列を含む追加のＲＮＡセグメントを、その８本のケノムセグメントのほかに、含むインフルエンザウィルスから成るキメラウィルス。

手続−補正書平成　４年　９月　２日

Claims

【特許請求の範囲】

１．ポリメラーゼ結合部位が対応する転写メッセージの開始点の上流に位置するように、そのメッセージの反対の極性を表す異種ＲＮＡ配列に連結されたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ結合部位から成る組み換えネガティブ鎖ＲＮＡ鋳型。
２．ポリメラーゼ結合部位はインフルエンザゲノムセグメントの３′−非コードウイルスセンスフランキング配列から成る、請求項１の組み換えネガティブ鎖ＲＮＡ鋳型。
３．ポリメラーゼ結合部位はインフルエンザゲノムセグメントの３′−末端の末端１５ヌクレオチドから成る、請求項１の組み換えネガティブ鎖ＲＮＡ鋳型。
４．インフルエンザの３′−非コードウイルスセンスフランキング配列は次の配列：【配列があります】から成る、請求項１の組み換えネガティブ鎖ＲＮＡ鋳型。
５．インフルエンザの３′−非コードウイルスセンスフランキング配列は次の配列：【配列があります】から成る、請求項１の組み換えネガティブ鎖ＲＮＡ鋳型。
６．インフルエンザの３′−非コードウイルスセンスフランキング配列は次の配列：【配列があります】から成る、請求項１の組み換えネガティブ鎖ＲＮＡ鋳型。
７．インフルエンザの３′−非コードウイルスセンスフランキング配列は次の配列：【配列があります】から成る、請求項１の組み換えネガティブ鎖ＲＮＡ鋳型。
８．ウイルスポリメラーゼ結合部位が対応する転写メッセージの開始点の上流に位置するように、ウイルスポリメラーゼ結合部位を含むインフルエンザの３′− 非コードウイルスセンスフランキング配列、およびインフルエンザの５′−非コードウイルスセンスフランキング配列に連結されたそのメッセージの反対の極性を表す異種ＲＮＡ配列から成る組み換えネガティブ領ＲＮＡ鋳型。
９．インフルエンザの５′−非コードウイルスセンスフランキング配列はインフルエンザゲノムセグメントの５′−末端の最初の２２ヌクレオチドから成る、請求項８の組み換えネガティブ鎖ＲＮＡ鋳型。
１０．インフルエンザの５′−非コードウイルスセンスフランキング配列は次の配列：【配列があります】から成る、請求項８の組み換えネガティブ鎖ＲＮＡ鋳型。
１１．精製したインフルエンザウイルスポリメラーゼと混合した請求項１の組み換え鋳型から成る組み換えＲＮＰ。
１２．インフルエンザウイルスポリメラーゼはＣｓＣ１勾配遠心により分画化したＲＮＰから得られ、その際精製したインフルエンザウイルスポリメラーゼは１．５−２．０Ｍ　ＣｓＣｌに関係した勾配の領域から単離される、請求項１１の組み換えＲＮＰ。
１３．精製したインフルエンザウイルスポリメラーゼと混合した請求項８の組み換え鋳型から成る組み換えＲＮＰ。
１４．インフルエンザウイルスポリメラーゼはＣｓＣｌ勾配遠心により分画化したＲＮＰから得られ、その際精製したインフルエンザウイルスポリメラーゼは１．５−２．０Ｍ　ＣｓＣｌに関係した勾配の領域から単離される、請求項１３の組み換えＲＮＰ。
１５．ウイルスポリメラーゼ結合部位が対応する転写メッセージの開始点の上流に位置するように、インフルエンザウイルスポリメラーゼ結合部位に連結されたそのメッセージの反対の極性を表す異種ＲＮＡ配列を含むインフルエンザウイルスから成るキメラウイルス。
１６．異種ＲＮＡ配列はインフルエンザのセグメント１内に含まれる、請求項１５のキメラウイルス。
１７．異種ＲＮＡ配列はインフルエンザのセグメント２内に含まれる、請求項１５のキメラウイルス。
１８．異種ＲＮＡ配列はインフルエンザのセグメント３内に含まれる、請求項１５のキメラウイルス。
１９．異種ＲＮＡ配列はインフルエンザのセグメント４内に含まれる、請求項１５のキメラウイルス。
２０．異種ＲＮＡ配列はインフルエンザのセグメント５内に含まれる、請求項１５のキメラウイルス。
２１．異種ＲＮＡ配列はインフルエンザのセグメント６内に含まれる、請求項１５のキメラウイルス。
２２．異種ＲＮＡ配列はインフルエンザのセグメント７内に含まれる、請求項１５のキメラウイルス。
２３．異種ＲＮＡ配列はインフルエンザのセグメント８内に含まれる、請求項１５のキメラウイルス。
２４．ウイルスポリメラーゼ結合部位が対応する転写メッセージの開始点の上流に位置するように、インフルエンザウイルスポリメラーゼ結合部位に隣接したネガティブ極性で表される異種遺伝子を含む追加のＲＮＡセグメントを、その８つのゲノムセグメントのほかに、含むインフルエンザウイルスから成るキメラウイルス。