CN101548009A - 偏肺病毒株及其在疫苗制备和作为抗原序列表达载体的应用以及增殖该病毒的方法 - Google Patents

偏肺病毒株及其在疫苗制备和作为抗原序列表达载体的应用以及增殖该病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及副黏病毒科副黏病毒亚科中的哺乳动物负链RNA病毒，偏肺病毒(MPV)的改良毒株。本发明还涉及没有胰蛋白酶存在时增殖哺乳动物MPV的方法。可利用本发明方法和组合物制备抗，例如MPV感染的疫苗。

Description

偏肺病毒株及其在疫苗制备和作为抗原序列表达载体的应用以及增殖该病毒的方法
相关申请
本申请要求2005年3月10日提交的美国临时申请号60/660,735的优先权，该申请的全部内容纳入本文作为参考。
1.引言
本发明涉及哺乳动物副黏病毒科副黏病毒亚科中的一种负链RNA病毒，偏肺病毒(metapneumovirus)(MPV)的改良毒株。本发明还涉及没有胰蛋白酶存在时增殖哺乳动物MPV的方法。可利用本发明方法和组合物制备抗，例如MPV感染的疫苗。
2.发明背景
人偏肺病毒(hMPV)是近年来鉴定的呼吸道病毒，最初从病因未明的急性呼吸道疾病症状的荷兰儿童中分离。hMPV导致的呼吸道疾病从轻度上呼吸道症状到严重的下呼吸道疾病，例如支气管炎和肺炎(Boivin等，2002；van den Hoogen等，2001，2003)。根据取样的患者群体，幼儿中5-15％的呼吸道感染归因于hMPV感染(Boivin，2003；Williams等，2004；van den Hoogen，2004b)。hMPV也与12-50％的儿童中耳炎有关(Boivin，2003；Peiris，2003；van den Hoogen，2004b)。在荷兰，2岁的测试个体中有55％是hMPV血清阳性，几乎所有5岁以上个体是血清阳性(vanden Hoogen，2001)。hMPV分布于全世界，欧洲、北美洲、澳大利亚、非洲、以色列、日本和香港均有报道(Bastien等，2003b；Howe，2002；Hamelin等，2004；Jpma等，2004；Maggi等，2003；Nissen等，2002；Peiris，2003；Peret等，2002；Stockton等，2002；Wolf等，2003)。对存档血清样品的测试表明hMPV在人群中至少已流行了50年(van de Hoogen等，2001)。为何直到近年才鉴定到的一个原因是它在细胞培养中生长不佳，致细胞病变作用很弱(Hamelin等，2004；van denHoogen等，2001)。
hMPV是副黏病毒科(Paramyxoviridae)副黏病毒亚科(Pneumovirinae)的一种包膜单链负链RNA病毒，该科也包括呼吸道合胞体病毒(RSV)、禽肺病毒(APV)和小鼠肺病毒(Van den Hoogen等，2001)。根据与其它肺病毒的同源性，已鉴定到以下顺序的8个转录单元：3′N-P-M-F-M2-SH-G-L5′(Toquin等，2003；van den Hoogen，2002)。系统发生分析将hMPV毒株分为两种遗传簇(genetic cluster)，称为不同于APV病毒的亚群A和B(Bastien等，2003a和b；Biacchesi等，2003；Peret等，2002和2004；van den Hoogen，2002)。在这些亚群中，hMPV还可再分为A1、A2、B1和B2亚型(van den Hoogen，2003)。
估计亚群A和B之间高度保守的融合糖蛋白(F)介导了病毒侵入和合胞体形成。肺病毒，例如RSV和APV的F蛋白先合成为全长前体(F0)，随后在多元弗林蛋白酶样(polybasic furin-like)切割位点切割形成F1和F2。切割F0暴露了F1N末端的融合肽(Collins，2001；Lamb，1993；Morrison，2003；Russell等，2001；White，1990)。与RSV和APV不同，hMPV含有不符合弗林蛋白酶样基序的推定切割位点RQS/PR(Barr，1991)。
已有报道说从临床样品细胞培养中分离到的hMPV依赖于胰蛋白酶(Bastien等，2003a；Biacchesi等，2003；Boivin等，2002；Skiadopoulos等，2004；van denHoogen等，2001和2004a)。因此，hMPV的两种分离物，毒株hMPV/NL/1/00和hMPV/NL/1/99能在Vero细胞中生长而无需加入胰蛋白酶出乎意料。没有和有胰蛋白酶存在时均得到相等的高滴度。
测序野生型(wt)hMPV/NL/1/00和wt hMPV/NL/1/99的RT-PCR产物，与公开的序列GI：20150834和GI：50059145比较时发现在编码F蛋白的推定切割位点的RQSR基序中含有氨基酸取代S101P突变。本文报道的结果证明对于分别代表hMPV的A1和B1亚型的两种毒株hMPV/NL/1/00和hMPV/NL/1/99，在F糖蛋白推定切割位点的RQSR基序中含有101P的病毒无需外源性添加胰蛋白酶即能在Vero细胞中复制。相反，在F蛋白中含有101S的hMPV为生长需要加入蛋白酶，例如胰蛋白酶。此报道评估了在没有和有胰蛋白酶存在时hMPV F糖蛋白变体的体外生长特性、切割特性和在接近该推定切割位点处含有氨基酸取代的重组病毒的合胞体形成。发现hMPV F的S101P是提高F的切割效率和增强其融合活性的主要遗传决定簇，两种情况均可能导致wt hMPV/NL/1/00和wt hMPV/NL/1/99在没有胰蛋白酶存在时在Vero细胞中有效生长。所引用参考文献的目录见第6章结尾处。
3.发明概述
本发明提供增殖哺乳动物偏肺病毒的方法，该方法包括用胰蛋白酶比活性低于20毫单位/毫升培养基的培养基培养哺乳动物偏肺病毒。在某些方面，所述哺乳动物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些方面，培养基中未外源性添加胰蛋白酶。在某些方面，培养基中未添加血清。在某些方面，所述哺乳动物偏肺病毒F蛋白质切割位点中的RQSR切割基序含有至少一个氨基酸取代。在某些方面，与SEQ ID NO：314相比，所述哺乳动物偏肺病毒的F蛋白质包含至少一个其它的氨基酸取代。在某些方面，RQSR切割基序中的氨基酸取代是丝氨酸被脯氨酸取代，从而产生RQPR序列。在某些方面，F蛋白中的其它氨基酸取代至少是以下之一：E93K、Q100K、E92K、E93V、I95S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K或N97H。在某些方面，F蛋白中的其它氨基酸取代是E93K。在某些方面，所述其它氨基酸取代稳定了RQSR基序中的氨基酸取代。
在某些实施方式中，本发明提供了分离的哺乳动物偏肺病毒，其中所述哺乳动物偏肺病毒能在没有胰蛋白酶存在下生长。在某些方面，所述哺乳动物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些方面，所述哺乳动物偏肺病毒F蛋白质的切割位点中的RQSR切割基序包含至少一个氨基酸取代。在某些方面，与SEQ ID NO：314相比，所述哺乳动物偏肺病毒的F蛋白质包含至少一个其它氨基酸取代。在某些方面，RQSR切割基序中的氨基酸取代是丝氨酸被脯氨酸取代，从而产生RQPR序列。在某些方面，F蛋白中的其它氨基酸取代至少是以下之一：E93K、Q100K、E92K、E93V、I95S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K或N97H。在某些方面，所述其它氨基酸取代稳定了RQSR基序中的氨基酸取代。在某些方面，F蛋白中的其它氨基酸取代是E93K。在某些方面，所述分离的核酸编码哺乳动物偏肺病毒的F蛋白，其中所述F蛋白含有S101P氨基酸取代和至少一个以下氨基酸取代：E93K、Q100K、E92K、E93V、I95S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K或N97H。在某些方面，所述哺乳动物偏肺病毒是人偏肺病毒。
在某些实施方式中，本发明提供鉴定哺乳动物偏肺病毒F蛋白的方法，该F蛋白能支持哺乳动物偏肺病毒在没有胰蛋白酶时稳定生长，该方法包括：(a)在没有胰蛋白酶存在下培养哺乳动物偏肺病毒，至少传代两次，所述哺乳动物偏肺病毒F蛋白的切割位点中含有RQPR基序；和(b)检测合胞体形成；其中与步骤(a)之前哺乳动物偏肺病毒形成合胞体相比，合胞体的形成增加表明哺乳动物偏肺病毒的F蛋白已获得能支持所述哺乳动物偏肺病毒在没有胰蛋白酶存在下稳定生长的其它氨基酸取代。在某些方面，所述哺乳动物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些方面，所述哺乳动物偏肺病毒携带S101P突变。
在某些实施方式中，本发明提供鉴定哺乳动物偏肺病毒的F蛋白的方法，该F蛋白能支持哺乳动物偏肺病毒在没有胰蛋白酶时稳定生长，该方法包括：(a)在没有胰蛋白酶存在下培养哺乳动物偏肺病毒，至少传代两次，所述哺乳动物偏肺病毒F蛋白的切割位点中含有RQPR基序；和(b)检测F蛋白切割；其中与步骤(a)之前哺乳动物偏肺病毒的F蛋白切割相比，F蛋白切割增加表明所述哺乳动物偏肺病毒的F蛋白已获得能支持所述哺乳动物偏肺病毒在没有胰蛋白酶存在下稳定生长的其它氨基酸取代。在某些方面，所述哺乳动物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些方面，所述哺乳动物偏肺病毒携带S101P突变。
在某些实施方式中，本发明提供鉴定哺乳动物偏肺病毒的F蛋白突变体的方法，该蛋白突变体能提高该F蛋白不依赖胰蛋白酶的切割，其中所述F蛋白在切割位点包含RQPR基序，所述方法包括：(a)在没有胰蛋白酶存在下培养所述哺乳动物偏肺病毒，至少传代两次；和(b)检测所述F蛋白的切割效率，当F蛋白的切割效率提高表明其已获得能提高不依赖胰蛋白酶切割的突变。在某些方面，所述哺乳动物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些方面，所述哺乳动物偏肺病毒携带S101P突变。
在某些实施方式中，本发明提供鉴定能催化哺乳动物偏肺病毒F蛋白切割的蛋白酶的方法，其中所述F蛋白在切割位点包含RQPR基序，所述方法包括：(a)使F蛋白与检验的蛋白酶接触；和(b)检测是否发生了F蛋白的切割；其中F蛋白发生切割表明该蛋白酶能催化F蛋白切割。在某些方面，所述哺乳动物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些方面，所述哺乳动物偏肺病毒携带S101P突变。
3.1 惯用语和缩写
cDNA      互补DNA
L         大蛋白
M              基质蛋白(被膜内的谱系)
F              融合糖蛋白
HN             血凝素-神经氨酸酶糖蛋白
N、NP或NC      核蛋白(与RNA结合和聚合酶活性所需)
P              磷蛋白
MOI            感染复数
NA             神经氨酸酶(被膜糖蛋白)
PIV            副流感病毒
hPIV           人副流感病毒
hPIV3          3型人副流感病毒
APV/hMPV       含hMPV序列的重组APV
hMPV/APV       含APV序列的重组hMPV
哺乳动物MPV    哺乳动物偏肺病毒
nt             核苷酸
RNP            核糖核蛋白
rRNP           重组RNP
vRNA           基因组病毒RNA
cRNA           反基因组(antigenomic)病毒RNA
hMPV           人偏肺病毒
APV            禽肺病毒
MVA            修饰痘苗病毒，Ankara
FACS           荧光激活细胞分选仪
CPE            细胞病变作用
位置1          病毒基因组中待转录的第一个基因的位置
位置2          天然病毒基因组中第一和第二开放读框之间的位置，或
               者，病毒基因组中待转录的第二个基因的位置
位置3          天然病毒基因组中第二和第三开放读框之间的位置，或
               者，病毒基因组中待转录的第三个基因的位置
位置4          天然病毒基因组中第三和第四开放读框之间的位置，或
               者，病毒基因组中待转录的第四个基因的位置
位置5          天然病毒基因组中第四和第五开放读框之间的位置，或
               者，病毒基因组中待转录的第五个基因的位置
位置6          天然病毒基因组中第五和第六开放读框之间的位置，或
               者，病毒基因组中待转录的第六个基因的位置
Ab             抗体
dpi            感染后的天数
F              融合
HAI            血凝抑制
HN             血凝素-神经氨酸酶
hpi            感染后的小时
MOI            感染复数
POI            感染点
bPIV-3        3)型牛副流感病毒
hPIV-3        3型人副流感病毒
RSV           呼吸道合胞体病毒
SFM           无血清培养基
TCID50        50％组织培养物感染剂量
4.附图说明
图1：hMPV4种亚型的滴度和噬斑。将0.1PFU/细胞MOI的各种所示生物学衍生病毒(+/-0.2μg/ml TPCK胰蛋白酶)接种于亚汇合单层Vero细胞。接种6天后收集细胞和上清液，冷冻于-70℃，通过噬斑试验滴定Vero细胞。将感染的细胞单层在1％甲基纤维素中培养，接种6天后用甲醇固定并依次用雪貂抗-hMPV多克隆抗体和马-辣根过氧化物酶-偶联的抗雪貂抗体免疫染色。用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)目测观察噬斑，用Nikon eclipse TE2000-U显微镜摄影。滴度以log10PFU/ml表示。
图2：比较代表亚型A1的rhMPV/NL/1/00/101P和rhMPV/NL/1/00/101S的生长特性。(A)rhMPV/NL/1/00/101P和rhMPV/NL/1/00/101S(+/-0.2μg/ml胰蛋白酶)在Vero细胞中培养产生噬斑，接种6天后依次用雪貂抗-hMPV多克隆抗体和马-辣根过氧化物酶-偶联的抗雪貂抗体作免疫染色，加入3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)色原(Dako)显色。(B)感染rhMPV/NL/1/00/101P(空心正方形)或rhMPV/NL/1/00/101S(实心三角形)的Vero细胞的6-天生长曲线。在左图中，在Vero细胞中病毒增殖期间和噬斑试验期间加入0.2μg/ml胰蛋白酶。在中图中，不使用胰蛋白酶。在右图中，病毒增殖期间不用胰蛋白酶，但在噬斑试验期间中加入0.2μg/ml胰蛋白酶。通过材料与方法所述的噬斑试验测定滴度。(C)Vero细胞单层接种rhMPV/NL/1/00/101P或rhMPV/NL/1/00/101S(+/-0.2ug/ml胰蛋白酶)。用3％低聚甲醛固定感染的细胞单层，依次用针对hMPV F的仓鼠Mab 121-1017-133和FITC-偶联的抗-仓鼠Ab作免疫染色，用Nikon eclipse TE2000-U显微镜目测观察hMPV F的表面表达。(D)如材料与方法所述，用rhMPV/NL/1/00/101P或rhMPV/NL/1/00/101S(+/-0.2ug/ml胰蛋白酶)感染的Vero细胞单层的蛋白质印迹。用12％ SDS-PAGE凝胶分离病毒样品，转移到PVDF膜，依次用针对hMPV F的仓鼠Mab 121-1017-133和HRP-偶联的仓鼠Ab作免疫印迹，用电化学发光(electrochemoluminescence)溶液处理并与曝光胶片。左侧的数字是以千道尔顿计的分子量标记。右侧的箭头表明对应于全长hMPV F(F0)和切割片段hMPV F1的预计大小的两条带位置。
图3：蛋白质印迹检测以b/h PIV3为载体的hMPV F表达。如教材所述，用wthMPV/NL/1/00、b/h PIV3/hMPV F/101P或b/h PIV3/hMPV F/101S(+/-胰蛋白酶)接种亚汇合单层Vero细胞。如材料与方法所述，用针对hMPV F的仓鼠Mab121-1017-133进行蛋白质印迹分析。左侧的数字是以千道尔顿计的分子量标记。右侧的箭头表明对应于全长hMPV F(F0)和切割片段hMPV F1的预计大小的两条带位置。
图4：重组、变体和野生型hMPV病毒的核苷酸序列图谱。如材料与方法所述进行RT-PCR。所示的图谱从核苷酸3348延伸至3373。标出了对应于F糖蛋白的预计氨基酸93(矩形)、100(椭圆形)和101(下划线的)密码子。星号表明突变或多态性。
图5：蛋白质印迹检测的hMPV F蛋白的相对切割效率。将所示hMPV病毒(+/-0.2ug/ml胰蛋白酶)以0.1PFU/细胞的MOI接种Vero细胞。这些病毒是：rhMPV/NL/1/00/101S(第1、6、13和18泳道)、rhMPV/NL/1/00/101P(第2、7、11和16道)、vhMPV/93K/101P(第3和8泳道)、vhMPV/100K/101P(第4和9泳道)、wt hMPV/NL/1/00(第5、10、15和20泳道)、rhMP′V/93K/101P(第12和17泳道)或rhMPV/93K/101S(第14和19泳道)。如教材所述，应注意wt hMPV/NL/1/00是含E93K的hMPV与含Q100K的hMPV的混合物。接种6天后收集细胞和上清液，冷冻于-70℃，融化后用12％ SDS-PAGE凝胶分离。将蛋白质转移到PVDF膜，用针对hMPV F的Mab 122-1017-133检测。左侧的数字是以千道尔顿计的分子量标记。右侧的箭头表明对应于全长hMPV F(F0)和切割片段hMPV F1的预计大小的两条带。在印迹上方标注了各泳道中各病毒的hMPV F氨基酸93、100和101位。印迹下方标注了是否存在胰蛋白酶。
图6：在F蛋白中含有101P的重组、变体和野生型hMPV病毒的多轮生长曲线。以0.1PFU/细胞MOI(无胰蛋白酶)接种亚汇合的单层Vero细胞。在6天中以24小时间隔收集细胞和上清液。采用噬斑试验测定所收集病毒的滴度。
图7：受hMPV病毒感染的Vero细胞单层的相对融合效率。将3PFU/细胞MOI的所示hMPV病毒(+/-0.2ug/ml TPCK胰蛋白酶)接种于汇合的单层Vero细胞，用含1％甲基纤维素的培养基培养。在第48小时用甲醇固定这些单层。用Heochst染色剂培育来目测观察核，用Nikon eclipse TE2000-U荧光显微镜的DAPI透镜摄影。所示的照片代表了3个独立实验之一的一个视野。计数10个视野中融合细胞的聚集核与未融合细胞的单核，图示了融合细胞的百分比。所示数据是3个实验之一。
图8：比较代表B1亚型的wt hMPV/1/99/101P和rhMPV/1/99/101S的生长特性。(A)接种6天后免疫染色wt hMPV/NL/1/99/101P或rhMPV/NL/99/101S(各+/-0.2μg/ml胰蛋白酶)在Vero细胞中生长产生的噬斑。(B)感染wt hMPV/NL/1/99/101P(空心正方形)或rhMPV/NL/1/99/101S(实心三角形)的Vero细胞的6-天生长曲线。在左图中，在病毒增殖期间和噬斑试验期间加入0.2μg/ml胰蛋白酶。在中图中，不使用胰蛋白酶。在右图中，病毒增殖期间不使用胰蛋白酶，但在噬斑试验期间加入0.2μg/ml胰蛋白酶。通过材料与方法所述的噬斑试验测定滴度。(C)Vero细胞单层接种wt hMPV/NL/1/99/101P或rhMPV/NL/1/99/101S(+/-0.2ug/ml胰蛋白酶)。用3％低聚甲醛固定感染的细胞单层，依次用针对hMPV F的仓鼠Mab121-1017-133和FITC-偶联的抗-仓鼠Ab作免疫染色，用Nikon TE2000-U显微镜目测观察hMPV F的表面表达。(D)如材料与方法所述，用wt hMPV/NL/1/99/101P或rhMPV/NL/1/99/101S(+/-0.2ug/ml胰蛋白酶)感染的Vero细胞单层的蛋白质印迹。在用12％ SDS-PAGE凝胶上分离病毒样品，转移到PVDF膜，依次用针对hMPVF的仓鼠Mab 121-1017-133和HRP-偶联的仓鼠Ab作免疫印迹，用电化学发光溶液处理并曝光胶片。左侧的数字是以千道尔顿计的分子量标记。右侧的箭头表明对应于全长hMPV F(F0)和切割片段hMPV F1的预计大小的两条带位置。
图9：hMPV基因组分析：显示了相对于hMPV基因组构成(genomic organization)的hMPV基因组序列的PCR片段。在表示PCR片段的竖条下面标出了突变的位置。
图10：hMPV分离物00-1(A1)和hMPV分离物99-1(B1)的限制性图谱。在显示hMPV的基因组构成的图下方标出了各分离物中的限制性位点。图上面的比例尺表明以kb计的hMPV基因组的位置。
5.发明详述
偏肺病毒毒株
本发明提供在没有胰蛋白酶存在下能增殖的分离的哺乳动物偏肺病毒毒株。在某些实施方式中，本发明提供经工程改造在没有胰蛋白酶存在下能增殖的重组哺乳动物(例如人)偏肺病毒。不想局限于理论，本发明的哺乳动物偏肺病毒毒株能在没有胰蛋白酶存在下增殖是因为其F蛋白的切割不依赖胰蛋白酶。在某些具体实施方式中，所述哺乳动物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些方面，所述哺乳动物偏肺病毒是重组偏肺病毒。在某些具体实施方式中，所述哺乳动物偏肺病毒是重组人偏肺病毒(rhMPV)。
在某些实施方式中，本发明提供无需外源性添加胰蛋白酶而能增殖的哺乳动物偏肺病毒毒株。在某些实施方式中，本发明提供能在胰蛋白酶比活性低于以下值的胰蛋白酶浓度下增殖的哺乳动物偏肺病毒毒株：低于40毫单位/毫升培养基、低于35毫单位/毫升培养基、低于30毫单位/毫升培养基、低于25毫单位/毫升培养基、低于20毫单位/毫升培养基、低于15毫单位/毫升培养基、低于10毫单位/毫升培养基、低于5毫单位/毫升培养基、低于2毫单位/毫升培养基、低于1毫单位/毫升培养基或低于0.5毫单位/毫升培养基。在某些实施方式中，本发明提供能在培养基胰蛋白酶低于以下浓度时增殖的哺乳动物偏肺病毒毒株：低于0.1微克胰蛋白酶/毫升培养基；低于0.05微克胰蛋白酶/毫升培养基；低于0.01微克胰蛋白酶/毫升培养基；低于0.005微克胰蛋白酶/毫升培养基；低于0.001微克胰蛋白酶/毫升培养基；或低于0.0005微克胰蛋白酶/毫升培养基。
在本发明的某些实施方式中，F蛋白切割位点中RQSR基序的一个或多个氨基酸被取代或缺失。在某些实施方式中，本发明哺乳动物偏肺病毒的F蛋白切割位点中RQSR基序的丝氨酸被不同的氨基酸取代。在更具体的实施方式中，该F蛋白切割位点中RQSR基序的丝氨酸被脯氨酸取代，从而产生RQPR基序。为减少回复成野生基因型的可能性，可在编码某氨基酸的密码子中至少引入两个核苷酸变化来工程改造该氨基酸取代。
在一示范性实施例中，该F蛋白具有SEQ ID NO：314所示的氨基酸序列(人偏肺病毒毒株NL/1/00的F蛋白氨基酸序列)，和氨基酸位置101的丝氨酸被脯氨酸取代从而得到不依赖胰蛋白酶亦能增殖的哺乳动物偏肺病毒。本领域技术人员知道如何通过将不同毒株F蛋白的氨基酸序列与，例如SEQ ID NO：314所示氨基酸序列作排列对比来鉴定哺乳动物偏肺病毒不同毒株F蛋白中的同源性氨基酸位置。例如，将SEQ ID NO：314与另一种人偏肺病毒毒株F蛋白氨基酸序列作排列对比，定位SEQ ID NO：314的RQSR序列(氨基酸位置99-102)，从而鉴定哺乳动物偏肺病毒不同毒株F蛋白中相应的氨基酸。
在本发明的某些实施方式中，所述F蛋白包含一个或多个其它突变(“第二位点突变”)，例如除F蛋白切割位点RQSR基序中的丝氨酸取代外，相对于SEQ IDNO：314具有其它氨基酸取代、添加或缺失。不想局限于理论，这种第二位点突变可稳定F蛋白切割位点RQSR基序中的丝氨酸取代，使得在没有胰蛋白酶存在下生长时，哺乳动物偏肺病毒毒株F蛋白中发生任何其它突变的频率低于不含这种第二位点突变的哺乳动物偏肺病毒毒株。此外，不想局限于理论，这种第二位点突变提高了F蛋白的胰蛋白酶不依赖性切割。在某些实施方式中，携带第二位点突变的本发明哺乳动物偏肺病毒毒株可在没有胰蛋白酶存在下传代至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或至少25代，而不会在F蛋白中获得除F蛋白切割位点的RQSR基序中丝氨酸取代之外的任何自发突变。
在本发明的某些实施方式中，第二位点突变发生在不同于F基因的某基因中。不想局限于理论，F蛋白的切割取决于该F蛋白的分子环境(molecule context)，因而这些蛋白质中影响(例如)病毒颗粒中F蛋白折叠或F蛋白取向的变化也能影响F蛋白的切割。
在某些实施方式中，第二位点突变位于F蛋白切割位点中RQPR基序附近。在某些实施方式中，第二位点突变在距离RQPR基序氨基末端20个氨基酸之内、15个氨基酸之内、10个氨基酸之内或5个氨基酸之内。在某些实施方式中，第二位点突变在距离RQPR基序的羧基末端20个氨基酸之内、15个氨基酸之内、10个氨基酸之内或5个氨基酸之内。
在某些更具体的实施方式中，第二位点突变在F蛋白中的氨基酸位置对应于SEQ ID NO：314的氨基酸位置92、93、94、95、96、97或100。在某些甚至更具体的实施方式中，其它突变可以是E93K、Q100K、E92K、E93V、I95S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K或N97H，其中第一个字母指SEQ ID NO：314中的氨基酸，数字指氨基酸位置，第二个字母指取代SEQ ID NO：314中相应位置氨基酸的氨基酸。
在某些实施方式中，本发明偏肺病毒含有RQPR基序(例如通过携带S101P突变)和第二位点突变。在一具体的示范性实施方式中，本发明提供含有F蛋白的重组人偏肺病毒，其中所述F蛋白含E93K和S101P氨基酸取代。
在某些实施方式中，本发明病毒F蛋白中的突变不会导致哺乳动物偏肺病毒的宿主特异性改变。在某些实施方式中，本发明病毒F蛋白中的突变不会导致哺乳动物偏肺病毒的宿主细胞特异性改变。
本发明哺乳动物偏肺病毒毒株可用于，例如开发减毒活病毒疫苗。
在某些实施方式中可将两个或三个突变引入一个密码子中来影响氨基酸取代。不想局限于理论，一个密码子中含有多个突变会降低野生基因型的回复率。
可遗传修饰本发明偏肺病毒毒株使其编码异源序列。在某些实施方式中，可修饰本发明偏肺病毒毒株来编码抗原性肽、多肽或蛋白质。如下文进一步描述的，这种修饰的偏肺病毒可用作疫苗。可进一步遗传修饰本发明偏肺病毒毒株，使之在特定宿主体内减毒(见下文；见章节5.7)。
增殖方法
本发明提供在没有胰蛋白酶存在下增殖哺乳动物偏肺病毒的方法。在某些实施方式中，所述哺乳动物偏肺病毒是经工程改造能在没有胰蛋白酶存在下增殖的重组哺乳动物(例如人)偏肺病毒。不想局限于理论，如果哺乳动物偏肺病毒毒株F蛋白的切割不依赖胰蛋白酶，它们能在没有胰蛋白酶存在下增殖。在某些更具体的实施方式中，所述哺乳动物偏肺病毒是人偏肺病毒。在某些方面，所述哺乳动物偏肺病毒是重组偏肺病毒。在某些具体实施方式中，所述哺乳动物偏肺病毒是重组人偏肺病毒(rhMPV)。
在某些实施方式中，本发明提供无需外源性添加胰蛋白酶而增殖哺乳动物偏肺病毒的方法。在某些实施方式中，本发明提供能在胰蛋白酶比活性低于以下值的胰蛋白酶浓度下增殖哺乳动物偏肺病毒毒株的方法：低于40毫单位/毫升培养基、低于35毫单位/毫升培养基、低于30毫单位/毫升培养基、低于25毫单位/毫升培养基、低于20毫单位/毫升培养基、低于15毫单位/毫升培养基、低于10毫单位/毫升培养基、低于5毫单位/毫升培养基、低于2毫单位/毫升培养基、低于1毫单位/毫升培养基或低于0.5毫单位/毫升培养基。在某些实施方式中，本发明提供在含以下浓度胰蛋白酶的培养基中增殖哺乳动物偏肺病毒的方法：低于0.1微克胰蛋白酶/毫升培养基；低于0.05微克胰蛋白酶/毫升培养基；低于0.01微克胰蛋白酶/毫升培养基；低于0.005微克胰蛋白酶/毫升培养基；低于0.001微克胰蛋白酶/毫升培养基；或低于0.0005微克胰蛋白酶/毫升培养基。在某些其它实施方式中，用胰蛋白酶活性抑制剂灭活胰蛋白酶。
在本发明的某些实施方式中，F蛋白切割位点中RQSR基序的一个或多个氨基酸被取代或缺失。在某些实施方式中，采用本发明方法增殖的哺乳动物偏肺病毒F蛋白切割位点中RQSR基序的丝氨酸被不同氨基酸取代，从而赋予该偏肺病毒不依赖胰蛋白酶的生长(能力)。在更具体的实施方式中，采用本发明方法增殖的哺乳动物偏肺病毒F蛋白切割位点中RQSR基序的丝氨酸被脯氨酸取代。
在一示范性实施例中，采用本发明方法增殖的哺乳动物偏肺病毒F蛋白具有SEQ ID NO：314所示的氨基酸序列，氨基酸位置101的丝氨酸被脯氨酸取代。本领域技术人员知道如何将不同毒株的F蛋白的氨基酸序列与，例如SEQ ID NO：314所示氨基酸序列作排列对比来鉴定哺乳动物偏肺病毒不同毒株F蛋白中的同源性氨基酸位置。
在本发明的某些实施方式中，采用本发明方法增殖的哺乳动物偏肺病毒F蛋白包含一个或多个其它突变(“第二位点突变”)，例如除F蛋白切割位点RQSR基序中的丝氨酸取代外，相对于SEQ ID NO：314具有其它氨基酸取代、添加或缺失。不想局限于理论，这种第二位点突变可稳定F蛋白切割位点RQSR基序中的丝氨酸取代，从而使得该病毒在没有胰蛋白酶存在下生长时，该哺乳动物偏肺病毒毒株F蛋白中发生任何其它突变的频率低于不含这种第二位点突变的哺乳动物偏肺病毒毒株。在某些实施方式中，含有这种第二位点突变以及在F蛋白切割位点的RQSR基序中含有丝氨酸取代的哺乳动物偏肺病毒毒株可在没有胰蛋白酶存在下传代至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或至少25代，而不会在F蛋白中获得任何自发突变。
在某些实施方式中，第二位点突变位于F蛋白切割位点中RQPR基序附近。在某些实施方式中，第二位点突变在距离RQPR基序氨基末端20个氨基酸之内、15个氨基酸之内、10个氨基酸之内或5个氨基酸之内。在某些实施方式中，第二位点突变在距离RQPR基序羧基末端20个氨基酸之内、15个氨基酸之内、10个氨基酸之内或5个氨基酸之内。
在某些更具体的实施方式中，第二位点突变在F蛋白中的氨基酸位置对应于SEQ ID NO：314的氨基酸位置92、93、94、95、96、97或100。在某些甚至更具体的实施方式中，第二位点突变可以是E93K、Q100K、E92K、E93V、I95S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K或N97H，其中第一个字母指SEQ ID NO：314中的氨基酸，数字指氨基酸位置，第二个字母指取代SEQ ID NO：314中相应位置氨基酸的氨基酸。
在本发明的某些实施方式中，第二位点突变位于不同于F基因的基因中。不想局限于理论，F蛋白的切割取决于F蛋白的分子环境，因而这些蛋白质中影响(例如)病毒颗粒中F蛋白折叠或F蛋白取向的变化也可能影响F蛋白的切割。
在一具体的示范性实施方式中，本发明提供在没有胰蛋白酶存在下增殖含F蛋白的重组人偏肺病毒的方法，其中所述F蛋白含E93K和S101P氨基酸取代。
在某些实施方式中，本发明提供无需向培养基中添加血清而增殖哺乳动物偏肺病毒的方法。在没有血清存在下培养受感染细胞的详述见章节5.6。
本发明方法所用的示范性细胞系包括但不限于：Vero细胞和LLC-MK2恒河猴肾(细胞)。如果本发明方法利用重组病毒，可用BHK细胞来拯救哺乳动物偏肺病毒。
在某些实施方式中，本发明方法可用的病毒F蛋白中的突变不会导致哺乳动物偏肺病毒的宿主特异性改变。在某些实施方式中，本发明方法可用的病毒F蛋白中的突变不会导致哺乳动物偏肺病毒的宿主细胞特异性改变。
筛选试验
本发明也提供哺乳动物偏肺病毒F蛋白的胰蛋白酶不依赖性切割的第二位点突变的鉴定方法，所述F蛋白在切割位点含有RQPR基序。在某些实施方式中，本发明提供鉴定哺乳动物偏肺病毒F蛋白的胰蛋白酶不依赖性切割的增强剂(enhancer)的筛选方法，所述F蛋白在切割位点含有RQPR基序。不想局限于任何具体的机制或理论，含RQPR基序的哺乳动物偏肺病毒F蛋白的胰蛋白酶不依赖性切割的这种第二位点突变(例如，增强剂)可稳定病毒基因组，从而使得该病毒在没有胰蛋白酶存在下生长不会导致F基因中积累其它自发突变。在某些实施方式中，这种第二位点的修饰位于F基因中。在某些其它实施方式中，这种第二位点修饰位于哺乳动物偏肺病毒的其它基因中。
可采用本领域技术人员已知的任何方法将突变引入哺乳动物偏肺病毒的F基因中。可采用以下方法引入突变，例如随机诱变DNA和采用反向遗传学(方法)来拯救含突变的病毒颗粒；定点诱变DNA和采用反向遗传学(方法)来拯救含突变的病毒颗粒；或在选择压力，即没有胰蛋白酶存在下培养该病毒。
可在不同水平选择合适的第二位点突变。在某些实施方式中，诱变编码F蛋白的DNA，表达F蛋白并检验其胰蛋白酶不依赖性切割的能力(示范性试验如下文所述)。胰蛋白酶不依赖性切割提高表明第二位点突变是F蛋白的胰蛋白酶不依赖性切割的增强剂。在其它实施方式中，诱变编码F的基因DNA，采用反向遗传学(方法)拯救病毒，检验该病毒的胰蛋白酶不依赖性F蛋白切割(是否)提高或合胞体形成(是否)增加。在还有其它实施方式中，在没有胰蛋白酶存在下，即在选择压力下培养该病毒，然后检验任何第二位点突变的影响，例如胰蛋白酶不依赖性F蛋白切割(是否)提高或合胞体形成(是否)增加。
一旦选择了在F基因中携带有第二位点修饰的突变体，可测序F基因。随后，将该突变引入充分表征的毒株中(例如但不限于rhMPV/NL/1/00/101P)以确认该第二位点突变的作用并产生适合于疫苗生产的病毒株。
为鉴定能切割含RQPR基序的偏肺病毒F蛋白的蛋白酶，可采用技术人员已知的任何方法检测和定量蛋白酶活性。在某些实施方式中，将切割位点中含有RQPR基序的可检测标记的F蛋白固定在固体支持物上，因而切割该F蛋白便导致标记丧失(即，与切割位点相比，标记远离固定位点)。因此，可依靠可检测标记的减少来检测和定量测定蛋白酶活性。其它实施方式检测了释放入反应缓冲液的可检测标记的氨基酸或肽或多肽。在某些其它实施方式中，采用FRET或荧光极化来检测和定量测定蛋白酶的反应。在一示范性实施例中，F蛋白在未与固体支持物相连的一端作荧光标记。与检验蛋白酶培育后，荧光标记因蛋白水解而丧失，因而荧光降低表明存在能切割含RQPR基序的F蛋白的蛋白酶活性。在某些实施方式中，所述固体支持物是珠。
可采用技术人员已知的任何方法可检测地标记F蛋白。在某些实施方式中，放射性标记该蛋白或多肽。在某些实施方式中，将该蛋白或多肽的一端与固体支持物表面相连，另一端作可检测标记。固体支持物表面可检测标记的减少是可衡量蛋白酶的活性。
可用作检验蛋白酶的各类蛋白酶包括但不限于：菠罗蛋白酶、组织蛋白酶、糜蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、血管舒缓素、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纤维蛋白溶酶、肾素、链激酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、凝血酶、胰蛋白酶和尿激酶。在一具体实施方式中，蛋白酶是类胰蛋白酶Clara或其同系物。
5.1 哺乳动物偏肺病毒的结构特征
本发明提供一种哺乳动物MPV。该哺乳动物MPV是属于副黏病毒科，肺病毒亚科的负义单链RNA病毒。此外，该哺乳动物MPV在系统发育上鉴定为对应于偏肺病毒属(Metapneumovirus)，所述哺乳动物MPV在系统发育上更接近CNCM(巴黎)以I-2614保藏的病毒分离物(SEQ ID NO：19)，而不是火鸡鼻气管炎病毒(禽鼻气管炎的病原体)。可通过，例如获得某病毒的核酸序列信息后采用系统发育分析检验将该病毒鉴定为在系统发育上对应于偏肺病毒属。可采用技术人员已知的任何技术测定病毒的各毒株之间的系统发育关系。示范性方法可参见章节5.9。其它技术公开于全文纳入本文作为参考的国际专利申请PCT/NL02/00040，其公布为WO 02/057302。具体地说，PCT/NL02/00040在第12页第27行到第19页第29行公开了适合于系统发育分析的核酸序列，这些序列纳入本文作为参考。根据下文更加详述的序列相似性将病毒进一步鉴定为哺乳动物MPV。
除了某病毒与本文所述哺乳动物MPV的系统发育上相关和序列相似外，也可利用某病毒的基因组构成与本文所述哺乳动物MPV的基因组构成的相似性将该病毒鉴定为哺乳动物MPV。哺乳动物MPV的代表性基因组构成见图9。在某些实施方式中，在副黏病毒科的肺病毒亚科内，哺乳动物MPV的基因组构成不同于肺病毒属的基因组构成。此两属(偏肺病毒属和肺病毒属)的分类主要依据它们的基因构象(gene constellation)；偏肺病毒通常缺乏非结构蛋白，例如NS1或NS2(也参见Randhawa等，1997，J.Virol.71：9849-9854)，基因顺序(gene order)不同于肺病毒的(RSV：‘3-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5’，APV：‘3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5’)(Lung等，1992，J.Gen.Virol.73：1709-17 15；Yu等，1992，Virology 186：426-434；Randhawa等，1997，J.Virol.71：9849-9854)。
此外，可通过免疫学特性来鉴定本发明哺乳动物MPV。在某些实施方式中，可产生针对哺乳动物MPV的能中和哺乳动物MPV的特异性抗血清。可产生针对MPV的也能中和哺乳动物MPV的单克隆抗体和多克隆抗体。参见纳入本文作为参考的PCT WO 02/057302第__页到第__页。
可通过感染哺乳动物宿主(即哺乳动物培养细胞或哺乳动物)的能力来进一步表征本发明哺乳动物MPV。与APV不同，哺乳动物MPV在鸡和火鸡中不能复制或只有低水平复制。然而，哺乳动物MPV能在哺乳动物宿主，例如弥猴(cynomolgous macaques)中复制。在某些更具体的实施方式中，可通过在哺乳动物宿主中复制的能力进一步表征哺乳动物MPV。在某些更具体的实施方式中，通过导致哺乳动物宿主表达哺乳动物MPV基因组所编码蛋白质的能力进一步表征哺乳动物MPV。在甚至更具体的实施方式中，哺乳动物MPV表达的病毒蛋白可插入哺乳动物宿主的细胞质膜。在某些实施方式中，本发明哺乳动物MPV能感染哺乳动物宿主并导致哺乳动物宿主产生该哺乳动物MPV的新感染性病毒颗粒。本发明哺乳动物MPV的功能特征的更详细描述见章节5.12。
在某些实施方式中，可利用该病毒在电子显微镜下的外观或其对氯仿的敏感性将病毒鉴定为哺乳动物MPV。本发明哺乳动物MPV在电子显微镜下呈副黏病毒样颗粒。哺乳动物MPV一贯对氯仿处理敏感；最好用tMK细胞或其功能等价细胞培养哺乳动物MPV，其在大多数细胞培养中必须依赖于胰蛋白酶。此外，哺乳动物MPV具有典型的细胞病变效应(CPE)，对各种红细胞缺乏凝血活性。MPV分离物诱导的CPE类似于hRSV诱导的CPE，特征为合胞体形成，然后细胞内快速破坏，接着与培养板脱离。虽然大多数副黏病毒具有凝血活性，但大多数肺病毒无此活性(Pringle，C.R.，刊于：The Paramyxoviruses(《副黏病毒》)，(D.W.Kingsbury编)1-39(Plenum Press，纽约，1991))。哺乳动物MPV在编码M2蛋白的核酸片段中含有第二重叠ORF(M2-2)。如Ahmadian等，1999，J.Gen.Vir.80：2011-2016所示，其它肺病毒中也出现该第二重叠ORF。
在某些实施方式中，本发明提供将病毒分离物鉴定为哺乳动物MPV的方法。检验样品可以得自，例如动物或人。然后检验样品中是否存在肺病毒亚科的病毒。如果存在肺病毒亚科病毒，可检验该病毒(是否具有)本文所述哺乳动物MOV的特征，例如但不限于：与哺乳动物MPV在系统发育上相关、与哺乳动物MPV核苷酸序列的核苷酸序列相同性、与哺乳动物MPV氨基酸序列的氨基酸序列相同性/同源性和基因组构成。此外，可通过利用MPV分离物核酸序列作交叉杂交实验，利用哺乳动物MPV特异性引物作RT-PCR或利用针对哺乳动物MPV分离物的抗体作经典交叉血清学实验将病毒鉴定为哺乳动物MPV。在某些其它实施方式中，可根据免疫学差异，例如用动物抗血清定量中和来鉴定哺乳动物MPV。抗血清可得自，例如感染了哺乳动物MPV的雪貂、猪或弥猴(参见，例如实施例8)。
在某些实施方式中，所述血清型不与除哺乳动物MPV以外的病毒交叉反应。在其它实施方式中，所述血清型显示两种方向的同源-异源滴度比例均>16。如果中和(反应)显示在一种或两种方向上两种病毒之间有某种程度的交叉反应(同源-异源滴度比例为8或16)，如果DNA序列存在实质性的生物物理/生物化学差异则可假定血清型不同。如果中和(反应)显示在一种或两种方向上两种病毒之间有明显程度的交叉反应(同源-异源滴度比例小于8)，则可假定所研究二分离物血清型相同。分离物I-2614(本文也称为MPV分离物00-1)可用作原型。
在某些实施方式中，可利用保藏物的序列，通过比较病毒蛋白或核酸与本文所述病毒分离物的氨基酸序列和核苷酸序列的序列同源性/相同性将病毒鉴定为哺乳动物MPV。具体地说，当病毒所含的核酸序列与CNCM(巴黎)保藏为I-2614的病毒分离物有以下所述百分比的核酸相同性时，该病毒可鉴定为哺乳动物MPV，所述百分比高于本文鉴定的编码L蛋白、M蛋白、N蛋白、P蛋白或F蛋白的核酸(如下文鉴定的)与APV-C相比的百分比(见表1)。参见纳入本文作为参考的PCTWO 02/05302，第12-19页。不想受理论的限制，通常知道病毒种类(特别是RNA病毒种类)常构成其中一簇病毒显示序列有异质性的拟种(quasi species)。因此，当与APV-C相比时，估计各分离物的序列相同性百分比可能稍有不同。
迄今为止，MPV的蛋白质与同科其它已知病毒的蛋白质之间的最高氨基(酸)序列相同性是APV-C与人MPV之间的相同性。当与序列表所示序列比较时，可以推测在人MPV与APV-C之间，基质蛋白质的氨基酸序列相同性是87％、核蛋白是88％，磷蛋白是68％，融合蛋白是81％，聚合酶蛋白的各部分是56-64％，也参见表1。与这些最大值相比，可认为含有编码同源性较高蛋白质的ORF的病毒分离物是哺乳动物MPV。应该注意，与其它病毒相似，发现在哺乳动物MPV的不同分离物之间有一定程度差异。
表1：MPV的ORF与其它副黏病毒的ORF之间的氨基酸序列相同性
         N     P     M     F     M2-1     M2-2     L
APV A    69    55    78    67    72       26       64
APV B    69    51    76    67    71       27       -2
          N      P      M      F      M2-1      M2-2      L
APV C     88     68     87     81     84        56        -2
hRSVA     42     24     38     34     36        18        42
hRSV B    41     23     37     33     35        19        44
bRSV      42     22     38     34     35        13        44
PVM       45     26     37     39     33        12        -2
其它3     7-11   4-9    7-10   10-18  -4        -4        13-14
脚注：
1.已知与G和SH蛋白未发现序列同源性，因而排除。
2.未得到序列。
3.其它：2型和3型人副流感病毒、仙台病毒、麻疹病毒、尼帕病毒(nipah)、海豹(phocine)瘟热病毒和新城疫病毒。
4.病毒基因组中缺乏ORF
在某些实施方式中，本发明提供哺乳动物MPV，其中该哺乳动物MPV中SH蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：382所示氨基酸序列(分离物NL/1/00的SH蛋白；参见表14)有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。所含SH蛋白与SEQ ID NO：382(分离物NL/1/00的SH蛋白；参见表14)有至少30％相同的分离的负义单链RNA偏肺病毒能感染哺乳动物宿主。在某些实施方式中，所含SH蛋白与SEQ ID NO：382(分离物NL/1/00的SH蛋白；参见表14)有至少30％相同的分离的负义单链RNA偏肺病毒能在哺乳动物宿主中复制。在某些实施方式中，哺乳动物MPV所含核苷酸序列编码的SH蛋白与SEQ ID NO：382(分离物NL/1/00的SH蛋白；参见表14)有至少30％相同。
在某些实施方式中，本发明提供哺乳动物MPV，其中该哺乳动物MPV中G蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：322所示氨基酸序列(分离物NL/1/00的G蛋白；参见表14)有至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。所含G蛋白与SEQ ID NO：322(分离物NL/1/00的G蛋白；参见表14)有至少20％相同的分离的负义单链RNA偏肺病毒能感染哺乳动物宿主。在某些实施方式中，所含G蛋白与SEQ ID NO：322(分离物NL/1/00的G蛋白；参见表14)有至少20％相同的分离的负义单链RNA偏肺病毒能在哺乳动物宿主中复制。在某些实施方式中，哺乳动物MPV所含核苷酸序列编码的G蛋白与SEQ ID NO：322(分离物NL/1/00的G蛋白；参见表14)有至少20％相同。
在某些实施方式中，本发明提供哺乳动物MPV，其中该哺乳动物MPV中L蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：330所示氨基酸序列(分离物NL/1/00的L蛋白；参见表14)有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。所含L蛋白与SEQ ID NO：330(分离物NL/1/00的L蛋白；参见表14)有至少85％相同的分离的负义单链RNA偏肺病毒能感染哺乳动物宿主。在某些实施方式中，所含L蛋白与SEQ ID NO：330(分离物NL/1/00的L蛋白；参见表14)有至少85％相同的分离的负义单链RNA偏肺病毒能在哺乳动物宿主中复制。在某些实施方式中，哺乳动物MPV所含核苷酸序列编码的L蛋白与SEQ ID NO：330(分离物NL/1/00的L蛋白；参见表14)有至少20％相同。
在某些实施方式中，本发明提供哺乳动物MPV，其中该哺乳动物MPV中N蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：366所示氨基酸序列有至少90％、至少95％或至少98％相同。所含N蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：366有至少90％相同的分离的负义单链RNA偏肺病毒能感染哺乳动物宿主。在某些实施方式中，所含N蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：366有至少90％相同的分离的负义单链RNA偏肺病毒能在哺乳动物宿主中复制。以N蛋白的全长计算氨基酸相同性。在某些实施方式中，哺乳动物MPV所含核苷酸序列编码的N蛋白与SEQ ID NO：366所示氨基酸序列有至少90％、至少95％或至少98％相同。
本发明还提供哺乳动物MPV，其中该哺乳动物MPV中P蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：374所示氨基酸序列有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。所含P蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：374有至少70％相同的哺乳动物MPV能感染哺乳动物宿主。在某些实施方式中，所含N蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：374有至少70％相同的哺乳动物MPV能在哺乳动物宿主中复制。以P蛋白的全长计算氨基酸相同性。在某些实施方式中，哺乳动物MPV所含核苷酸序列编码的P蛋白与SEQ ID NO：374所示氨基酸序列有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。
本发明还提供哺乳动物MPV，其中该哺乳动物MPV中M蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：358所示氨基酸序列有至少90％、至少95％或至少98％相同。所含M蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：358有至少90％相同的哺乳动物MPV能感染哺乳动物宿主。在某些实施方式中，所含M蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：358有至少90％相同的分离的负义单链RNA偏肺病毒能在哺乳动物宿主中复制。以M蛋白的全长计算氨基酸相同性。在某些实施方式中，哺乳动物MPV所含核苷酸序列编码的M蛋白与SEQ ID NO：358所示氨基酸序列有至少90％、至少95％或至少98％相同。
本发明还提供哺乳动物MPV，其中该哺乳动物MPV中F蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：314所示氨基酸序列有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同。所含F蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：314有至少85％相同的哺乳动物MPV能感染哺乳动物宿主。在某些实施方式中，所含F蛋白的氨基酸序列与SEQID NO：314有至少85％相同的分离的负义单链RNA偏肺病毒能在哺乳动物宿主中复制。以F蛋白的全长计算氨基酸相同性。在某些实施方式中，哺乳动物MPV所含核苷酸序列编码的F蛋白与SEQ ID NO：314所示氨基酸序列有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同。
本发明还提供哺乳动物MPV，其中该哺乳动物MPV中M2-1蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：338所示氨基酸序列有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同。所含M2-1蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：338有至少85％相同的哺乳动物MPV能感染哺乳动物宿主。在某些实施方式中，所含M2-1蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：338有至少85％相同的分离的负义单链RNA偏肺病毒能在哺乳动物宿主中复制。以M2-1蛋白的全长计算氨基酸相同性。在某些实施方式中，哺乳动物MPV所含核苷酸序列编码的M2-1蛋白与SEQ ID NO：338所示氨基酸序列有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同。
本发明还提供哺乳动物MPV，其中该哺乳动物MPV中M2-2蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：346所示氨基酸序列有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。所含M2-2蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：346有至少60％相同的哺乳动物MPV能感染哺乳动物宿主。在某些实施方式中，所含M2-2蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：346有至少60％相同的分离的负链单链RNA偏肺病毒能在哺乳动物宿主中复制。以M2-2蛋白的全长计算氨基酸相同性。在某些实施方式中，哺乳动物MPV所含核苷酸序列编码的M2-2蛋白与SEQ ID NO：346所示氨基酸序列有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。
在某些实施方式中，本发明提供哺乳动物MPV，其中该负义单链RNA偏肺病毒编码选自以下的至少两种蛋白质、至少三种蛋白质、至少四种蛋白质、至少五种蛋白质或至少六种蛋白质：(i)与SEQ ID NO：366具有至少90％氨基酸序列相同性的N蛋白；(ii)与SEQ ID NO：374具有至少70％氨基酸序列相同性的P蛋白；(iii)与SEQ ID NO：358具有至少90％氨基酸序列相同性的M蛋白；(iv)与SEQ IDNO：314具有至少85％氨基酸序列相同性的F蛋白；(v)与SEQ ID NO：338具有至少85％氨基酸序列相同性的M2-1蛋白；和(vi)与SEQ ID NO：346具有至少60％氨基酸序列相同性的M2-2蛋白。
本发明提供两种亚群的哺乳动物MPV，亚群A和亚群B。本发明也提供4种变体A1、A2、B1和B2。如果与分离物99-1(SEQ ID NO：18)相比，某哺乳动物MPV在系统发育上与分离物00-1(SEQ ID NO：19)更密切相关，则其可鉴定为亚群A的成员。如果与分离物00-1(SEQ ID NO：19)相比，某哺乳动物MPV在系统发育上与分离物99-1(SEQ ID NO：18)更密切相关，则其可鉴定为亚群B的成员。在其它实施方式中，可用各ORF的核苷酸序列或氨基酸序列同源性将哺乳动物MPV分类为属于A或B亚群。
可将哺乳动物MPV的不同分离物分成四种不同变体：变体A1、变体A2、变体B2和变体B2。分离物00-1(SEQ ID NO：19)是哺乳动物MPV变体A1的例子。分离物是99-1(SEQ ID NO：18)哺乳动物MPV变体B1的例子。采用系统发育分析可将某哺乳动物MPV归类为四种变体之一。因此，如果与另一变体的成员相比，某哺乳动物MPV在系统发育上与哺乳动物MPV某特定变体的成员更密切相关，则该MPV属于该特定变体。可利用任何ORF和所编码多肽，包括N、P、L、M、SH、G、M2或F多肽的序列将MPV分离物分型为属于特定亚群或变体。在一具体的实施方式中，可根据G蛋白的序列将某哺乳动物MPV分类为某变体。不想受理论的限制，G蛋白序列因在哺乳动物MPV不同变体之间差异程度高而良好适合于系统发育分析。
在本发明的某些实施方式中，可通过两条序列在下文所示特定条件下杂交的能力确定序列同源性。本发明方法可利用能与哺乳动物MPV的核酸或其反向互补核酸或其互补核酸杂交的核酸来确定它们彼此的序列同源性和相同性。在某些实施方式中，在高度严格的条件下杂交核酸。
本领域技术人员熟知的杂交条件例如但不限于：温度、盐浓度、pH、甲酰胺浓度(参见，例如全文纳入本文作为参考的Sambrook等，1989，第9-11章，MolecularCloning，A Laboratory Manual(《分子克隆，实验室手册》)，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)。在某些实施方式中，在水溶液中进行杂交，溶液的离子强度维持恒定，而杂交温度根据待杂交序列之间的序列同源性程度而不同。对于彼此100％相同且长于200个碱基对的DNA序列，在比完美杂交的解链温度(Tm)约低15-25℃下进行杂交。可利用以下方程式计算解链温度(Tm)(Bolton和McCarthy，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：1390)：
Tm＝81.5℃-16.6(log10[Na+])+(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/1)
其中(Tm)是解链温度，[Na+]是钠浓度，G+C是鸟嘌呤和胞嘧啶含量，1是以碱基对计的杂交物长度。可用Bonner等(Bonner等，1973，J.Mol.Biol.81：123-135)的公式计算序列间错配的影响：杂交物中碱基每错配1％，解链温度降低1-1.5℃。
因此，通过测定两条序列的杂交温度，本领域技术人员能估计某序列与已知序列有多相似。这可以通过，例如将凭经验确定的杂交温度与该已知序列与其完美匹配(序列)杂交计算的杂交温度作比较来进行。采用Bonner等的公式，可用杂交温度和错配百分比之间的关系来提供有关序列相似性的信息。
例如但不限于，采用这种高严格性条件的方法如下所示。65℃，将含DNA的滤膜在由6×SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.02％ BSA和500μg/ml变性鲑鱼精子DNA组成的缓冲液中预杂交8小时到过夜。在65℃，将滤膜在含100μg/ml变性鲑鱼精子DNA和5-20×106cpm的32P-标记探针的预杂交混合物中杂交48小时。在37℃，用含2×SSC、0.01％ PVP、0.01％Ficoll和0.01％ BSA的溶液洗涤滤膜1小时。然后在50℃先用0.1×SSC洗涤45分钟，再进行放射自显影。本领域熟知可用的其它高严格性条件。在本发明的其它实施方式中，在技术人员熟知的中等到低严格性条件下进行杂交(参见，例如Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(《分子克隆，实验室手册》)，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；也参见Ausubel等编，刊于Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory techniquemanuals(《分子生物学最新方法，实验室技术手册丛书》)，1987-1997，CurrentProtocols，
Figure A200680015321D0027082529QIETU
1994-1997，John Wiley and Sons，Inc.，二者各自全文纳入本文作为参考)。示范性的低严格性条件为以下缓冲液系统所提供：40℃，在含有35％甲酰胺、5×SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.2％ BSA、100μg/ml变性鲑鱼精子DNA和10％(重量/体积)硫酸葡聚糖的缓冲液中杂交18-20小时，在55℃用由2×SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％ SDS构成的缓冲液洗涤1.5小时，和在60℃用由2×SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％ SDS构成的缓冲液洗涤1.5小时。
在某些实施方式中，可用哺乳动物MPV特定变体的特异性探针将某哺乳动物MPV可分类为变体之一。这种探针包括RT-PCT的引物和抗体。将某哺乳动物MPV鉴定为特定变体的示范性方法描述于下文章节5.9。
在本发明的某些实施方式中，哺乳动物MPV的不同变体可经由不同病毒蛋白的氨基酸序列而彼此区分。在其它实施方式中，哺乳动物MPV的不同变体可经由该病毒基因组编码的不同ORF的核苷酸序列而彼此区分。哺乳动物MPV的变体可以是但不限于：A1、A2、B1或B2。然而，本发明也考虑作为尚未鉴定的另一种变体成员的哺乳动物MPV分离物。本发明也考虑具有在系统发育上与一种变体更密切相关的一个或多个ORF和在系统发育上与另一种变体更密切相关的一个或多个ORF的病毒。这种病毒可分类为其大多数ORF在系统发育上更密切相关的变体。也可用非编码序列来确定系统发育相关性。
如果与其它病毒分离物之一相比，某哺乳动物MPV分离物在系统发育上与病毒分离物NL/1/99(SEQ ID NO：18)更密切相关，则其分类为变体B1，所述其它病毒分离物为：NL/1/00(SEQ ID NO：19)、NL/17/00(SEQ ID NO：20)和NL/1/94(SEQID NO：21)。可利用哺乳动物MPV的一个或多个ORF将该哺乳动物MPV分类成某变体。如果某哺乳动物MPV符合以下条件，其可分类为MPV变体B1：其G蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B1的G蛋白(如原型NL/1/99(SEQ ID NO：324)所示)有至少66％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同；其N蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B1的N蛋白(如原型NL/1/99(SEQ ID NO：368)所示)有至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同；其P蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B1的P蛋白(如原型NL/1/99(SEQ ID NO：376)所示)有至少96％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同；其M蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B1的M蛋白(如原型NL/1/99(SEQ ID NO：360)所示)相同；其F蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B1的F蛋白(如原型NL/1/99(SEQ ID NO：316)所示)有至少99％相同；其M2-1蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B1的M2-1蛋白(如原型NL/1/99(SEQ ID NO：340)所示)有至少98％、至少99％或至少99.5％相同；其M2-2蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B1的M2-2蛋白(如原型NL/1/99(SEQ IDNO：348)所示)有至少99％或至少99.5％相同；其SH蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B1的SH蛋白(如原型NL/1/99(SEQ ID NO：384)所示)有至少83％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同；和/或其L蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B1的L蛋白(如原型NL/1/99(SEQ ID NO：332)所示)有至少99％或至少99.5％相同。
如果与其它病毒分离物之一相比，某哺乳动物MPV分离物在系统发育上与病毒分离物NL/1/00(SEQ ID NO：19)更密切相关，则其分类为变体A1，所述其它病毒分离物为：NL/1/99(SEQ ID NO：18)、NL/17/00(SEQ ID NO：20)和NL/1/94(SEQID NO：21)。可利用哺乳动物MPV的一个或多个ORF将该哺乳动物MPV分类成某变体。如果某哺乳动物MPV符合以下条件，其可分类为MPV变体A1：其G蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A1的G蛋白(如原型NL/1/00(SEQ ID NO：322)所示)有至少66％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同；其N蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A1的N蛋白(如原型NL/1/00(SEQ ID NO：366)所示)有至少99.5％相同；其P蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A1的P蛋白(如原型NL/1/00(SEQ ID NO：374)所示)有至少96％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同；其M蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A1的M蛋白(如原型NL/1/00(SEQ ID NO：358)所示)有至少99％或至少99.5％相同；其F蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A1的F蛋白(如原型NL/1/00(SEQ ID NO：314)所示)有至少98％、至少99％或至少99.5％相同；其M2-1蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A1的M2-1蛋白(如原型NL/1/00(SEQ ID NO：338)所示)有至少99％或至少99.5％相同；其M2-2蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A1的M2-2蛋白(如原型NL/1/00(SEQ ID NO：346)所示)有至少96％、至少99％或至少99.5％相同；其SH蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A1的SH蛋白(如原型NL/1/00(SEQ IDNO：382)所示)有至少84％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同；和/或其L蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A1的L蛋白(如原型NL/1/00(SEQ ID NO：330)所示)有至少99％或至少99.5％相同。
如果与其它病毒分离物之一相比，某哺乳动物MPV分离物在系统发育上与病毒分离物NL/17/00(SEQ ID NO：20)更密切相关，则其分类为变体A2，所述其它病毒分离物为：NL/1/99(SEQ ID NO：18)、NL/1/00(SEQ ID NO：19)和NL/1/94(SEQID NO：21)。可利用哺乳动物MPV的一个或多个ORF将该哺乳动物MPV分类成某变体。如果某哺乳动物MPV符合以下条件，其可分类为MPV变体A2：其G蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A2的G蛋白(如原型NL/17/00(SEQ ID NO：323)所示)有至少66％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同；其N蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A2的N蛋白(如原型NL/17/00(SEQ ID NO：367)所示)有至少99.5％相同；其P蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A2的P蛋白(如原型NL/17/00(SEQ ID NO：375)所示)有至少96％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同；其M蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A2的M蛋白(如原型NL/17/00(SEQ ID NO：359)所示)有至少99％或至少99.5％相同；其F蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A2的F蛋白(如原型NL/17/00(SEQ ID NO：315)所示)有至少98％、至少99％或至少99.5％相同；其M2-1蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A2的M2-1蛋白(如原型NL/17/00(SEQ ID NO：339)所示)有至少99％或至少99.5％相同；其M2-2蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A2的M2-2蛋白(如原型NL/17/00(SEQ ID NO：347)所示)有至少96％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同；其SH蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A2的SH蛋白(如原型NL/17/00(SEQ ID NO：383)所示)有至少84％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同；和/或其L蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体A2的L蛋白(如原型NL/17/00(SEQ ID NO：331)所示)有至少99％或至少99.5％相同。
如果与其它病毒分离物相比，某哺乳动物MPV分离物在系统发育上与病毒分离物NL/1/94(SEQ ID NO：21)更密切相关，则其分类为变体B2，所述其它病毒分离物为：NL/1/99(SEQ ID NO：18)、NL/1/00(SEQ ID NO：19)和NL/17/00(SEQ IDNO：20)。可利用哺乳动物MPV的一个或多个ORF将该哺乳动物MPV分类成某变体。如果某哺乳动物MPV符合以下条件，其可分类为MPV变体B2：其G蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B2的G蛋白(如原型NL/1/94(SEQ ID NO：325)所示)有至少66％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同；其N蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B2的N蛋白(如原型NL/1/94(SEQ ID NO：369)所示)有至少99％或至少99.5％相同；其P蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B2的P蛋白(如原型NL/1/94(SEQ ID NO：377)所示)有至少96％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同；其M蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B2的M蛋白(如原型NL/1/94(SEQ ID NO：361)所示)相同；其F蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B2的F蛋白(如原型NL/1/94(SEQ ID NO：317)所示)有至少99％或至少99.5％相同；其M2-1蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B2的M2-1蛋白(如原型NL/1/94(SEQ ID NO：341)所示)有至少98％、至少99％或至少99.5％相同；(其M2-2蛋白的)氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B2的M2-2蛋白(如原型NL/1/94(SEQ ID NO：349)所示)有至少99％或至少99.5％相同；其SH蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B2的SH蛋白(如原型NL/1/94(SEQ ID NO：385)所示)有至少84％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同；和/或其L蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPV变体B2的L蛋白(如原型NL/1/94(SEQ ID NO：333)所示)有至少99％或至少99.5％相同。
在某些实施方式中。序列相同性百分比是依据全长蛋白质的排列对比。在其它实施方式中，序列相同性的百分比是依据蛋白质的毗连氨基酸序列的排列对比，其中所述的氨基酸序列可以长25个氨基酸、50个氨基酸、75个氨基酸、100个氨基酸、125个氨基酸、150个氨基酸、175个氨基酸、200个氨基酸、225个氨基酸、250个氨基酸、275个氨基酸、300个氨基酸、325个氨基酸、350个氨基酸、375个氨基酸、400个氨基酸、425个氨基酸、450个氨基酸、475个氨基酸、500个氨基酸、750个氨基酸、1000个氨基酸、1250个氨基酸、1500个氨基酸、1750个氨基酸、2000个氨基酸或2250个氨基酸。
5.2 哺乳动物MPV的功能特征
除了哺乳动物MPV的结构限定外，也可通过其功能特征确定哺乳动物MPV。在某些实施方式中，本发明哺乳动物MPV能感染哺乳动物宿主。所述哺乳动物宿主可以是哺乳动物细胞、组织器官或某种哺乳动物。在一具体实施方式中，哺乳动物宿主是人或人细胞、组织或器官。可采用技术人员已知的任何方法检验哺乳动物宿主是否已受哺乳动物MPV的感染。某些实施方式检验该病毒黏附哺乳动物细胞的能力。某些实施方式检验该病毒将其基因组转移入哺乳动物细胞中的能力。在一示范性实施方式中，可检测性地标记(例如，放射性标记)该病毒基因组。然后使该病毒与哺乳动物细胞培育至少1分钟、至少5分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少12小时或至少1天。随后洗涤细胞以去除细胞上的任何病毒颗粒，再通过该可检测标记检验是否有病毒基因组存在。另一实施方式利用哺乳动物MPV特异性引物以RT-PCR检测细胞中是否存在病毒基因组。(参见，纳入本文作为参考的PCT WO 02/057302，第37-44页)。
在某些实施方式中，哺乳动物病毒能感染哺乳动物宿主并将该哺乳动物MPV的蛋白质插入哺乳动物宿主的胞质膜中。所述哺乳动物宿主可以是培养的哺乳动物细胞、器官、组织或哺乳动物。在一示范性实施方式中，哺乳动物细胞与哺乳动物病毒一起培育。然后在能去除细胞表面的病毒的条件下洗涤这些细胞。可采用技术人员已知的任何技术检测插入哺乳动物细胞的胞质膜的新表达病毒蛋白。例如，在感染该病毒后，将细胞培养在含有可检测标记的氨基酸的培养基中。然后收集、裂解细胞，将胞质组分与膜组分分开。然后溶解膜组分中的蛋白质，利用该哺乳动物MPV蛋白质(例如但不限于F蛋白或G蛋白)的特异性抗体进行免疫沉淀。再对免疫沉淀的蛋白质进行SDS PAGE。然后通过放射自显影检测是否存在病毒蛋白质。在另一实施方式中，可用哺乳动物MPV蛋白质的一种或多种特异性抗体通过免疫细胞化学方法检测宿主细胞的胞质膜中是否存在病毒蛋白。
在其它实施方式中，本发明哺乳动物MPV能感染哺乳动物宿主和在哺乳动物宿主中复制。所述哺乳动物宿主可以是培养的哺乳动物细胞、器官、组织或哺乳动物。可采用技术人员已知的任何技术测定病毒是否能感染哺乳动物细胞和在该哺乳动物宿主体内复制。在一具体的实施方式中，用该病毒感染哺乳动物细胞。然后培养这些细胞至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少12小时、至少1天或至少2天。可利用该病毒基因组的特异性探针，采用Northern印迹分析、RT-PCR或原位杂交来监测细胞中病毒基因组RNA的水平。病毒基因组RNA增加证明该病毒能感染哺乳动物细胞和在哺乳动物细胞中复制。
在其它实施方式中，本发明哺乳动物MPV能感染哺乳动物宿主，其中该感染导致该哺乳动物宿主产生新的感染性哺乳动物MPV。所述哺乳动物宿主可以是培养的哺乳动物细胞或哺乳动物。可采用技术人员已知的任何技术测定病毒是否能感染哺乳动物宿主和导致该哺乳动物宿主产生新的感染性病毒颗粒。在一示范性实施例中，哺乳动物细胞感染有哺乳动物病毒。然后洗涤这些细胞，培育至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少12小时、至少1天、至少2天、至少1周或至少12天。可采用技术人员已知的任何方法监测病毒的滴度。示范性方法见章节5.8。
在某些具体实施方式中，哺乳动物MPV是人MPV。也可用人MPV进行本章节所述的检验。在某些实施方式中，所述人MPV能感染哺乳动物宿主，例如哺乳动物或培养的哺乳动物细胞。
在某些实施方式中，所述人MPV能感染哺乳动物宿主而将人MPV的蛋白插入该哺乳动物宿主的胞质膜中。
在其它实施方式中，本发明的人MPV能感染哺乳动物宿主和在该哺乳动物宿主中复制。
在其它实施方式中，本发明的人MPV能感染哺乳动物宿主和在该哺乳动物宿主中复制，其中所述感染和复制导致该哺乳动物宿主产生以及包装新的感染性人MPV。
在某些实施方式中，虽然哺乳动物MPV能感染哺乳动物宿主，但也能感染禽类宿主，例如鸟或培养的禽细胞。在某些实施方式中，哺乳动物MPV能感染禽类宿主和导致该哺乳动物MPV的蛋白插入该禽类宿主的胞质膜中。在其它实施方式中，本发明哺乳动物MPV能感染禽类宿主和在该禽类宿主中复制。在其它实施方式中，本发明MPV能感染禽类宿主和在该禽类宿主中复制，其中所述感染和复制导致该禽类宿主产生以及包装新的感染性哺乳动物MPV。
5.3 重组和嵌合型偏肺病毒
本发明包括源自偏肺病毒(包括哺乳动物和禽变体)基因组的病毒载体所编码的重组或嵌合型病毒。按照本发明，重组病毒是内源性或天然基因组序列或非天然基因组序列所编码的源自哺乳动物MPV或APV的病毒。按照本发明，非天然序列是因基因组序列中发生可能造成或不造成表型改变的一个或多个突变(包括但不限于点突变、重排、插入、缺失等)而不同于天然或内源性基因组序列的序列。本发明重组病毒包括病毒载体编码的那些病毒，所述病毒载体衍生自偏肺病毒(包括哺乳动物和禽变体)基因组，可包含或不包含对于该病毒基因组为非天然的核酸。按照本发明，衍生自偏肺病毒基因组的病毒载体中所含的核酸序列编码哺乳动物偏肺病毒一个ORF的至少一部分，其中该ORF所编码多肽与章节5.1(同上)和表1所示具有氨基酸序列相同性。
按照本发明，本发明重组病毒包括源自哺乳动物偏肺病毒(MPV)，特别是人偏肺病毒基因组的病毒载体所编码的那些病毒。在本发明的具体实施方式中，所述病毒载体衍生自偏肺病毒A1、A2、B1或B2变体的基因组。本发明的这些病毒载体可包含或不包含对于该病毒基因组为非天然的核酸。
按照本发明，本发明重组病毒包括衍生自禽肺病毒(APV)，也称为火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)的病毒载体所编码的那些病毒。在本发明的具体实施方式中，该病毒载体衍生自APV亚群A、B、C或D的基因组。在一优选的实施方式中，病毒载体衍生自APV亚群C的基因组。本发明的这些病毒载体可包含或不包含对于该病毒基因组为非天然的核酸。
在本发明另一优选的实施方式中，本发明重组病毒包括源自APV基因组的病毒载体所编码的那些病毒，所述基因组含有编码APV亚群C的F-ORF的核酸序列。在某些实施方式中，源自APV基因组的病毒载体所含的核酸序列能编码APV的N-ORF、P-ORF、M-ORF、F-ORF、M2-1-ORF、M2-2-ORF或L-ORF中至少一种。
本发明的嵌合型病毒是还包含异源核苷酸序列的重组MPV或APV。本发明的嵌合型病毒由向基因组中加入了异源核苷酸序列或者用异源核苷酸序列替代了内源性或天然核苷酸序列的核苷酸序列编码。
本发明的嵌合型病毒由还含有异源核苷酸序列的本发明病毒载体编码。本发明的嵌合型病毒由可能包含或不包含对于该病毒基因组为非天然的核酸的病毒载体编码。本发明的嵌合型病毒由加入、插入了异源核苷酸序列，或用异源核苷酸序列取代天然或非天然序列的病毒载体编码。本发明的嵌合型病毒可由衍生自哺乳动物MPV不同毒株的核苷酸序列编码。具体地说，衍生自MPV不同毒株的编码抗原性多肽的核苷酸序列编码该嵌合型病毒。
本发明的嵌合型病毒可由衍生自APV(特别是亚群C)基因组的病毒载体编码，所述载体还编码异源序列，而该异源序列编码衍生自MPV一种或多种毒株的抗原性多肽。
嵌合型病毒特别可用于产生重组疫苗以提供保护力抵御两种或多种病毒感染(Tao等，J.Virol.72，2955-2961；Durbin等，2000，J.Virol.74，6821-6831；Skiadopoulos等，1998，J.Virol.72，1762-1768；Teng等，2000，J.Virol.74，9317-9321)。例如，可以设想，表达另一负链RNA病毒，如RSV的一种或多种蛋白的MPV或APV病毒载体，或表达一种或多种MPV蛋白的RSV载体可保护接种该载体疫苗的个体抵御两种病毒感染。对于PIV或其它副黏病毒，可以设想有相似的方法。如其它病毒所提示的，对于利用活疫苗作疫苗接种，可用减毒和复制缺陷型病毒。(参见，纳入本文作为参考的PCT WO 02/057302，第6和23页)。
按照本发明，要掺入编码本发明重组或嵌合型病毒的病毒载体的异源序列包括得自或源自偏肺病毒的不同毒株，禽肺病毒各毒株和其它负链RNA病毒(包括但不限于RSV、PIV和流感病毒)以及其它病毒(包括麻疹病毒)的序列。
在本发明的某些实施方式中，衍生自病毒基因组的病毒载体编码本发明嵌合型或重组病毒，所述基因组中用异源或非天然序列取代了一条或多条序列、基因间区域、末端序列或部分或整个ORF。在本发明某些实施方式中，衍生自病毒基因组的病毒载体编码本发明嵌合型病毒，其中该载体中已加入了一条或多条异源序列。
在某些实施方式中，本发明病毒含有异源核酸。在一优选实施方式中，异源核苷酸序列插入或加入该病毒基因组的位置1。在另一优选实施方式中，异源核苷酸序列插入或加入该病毒基因组的位置2。在还有另一优选实施方式中，异源核苷酸序列插入或加入该病毒基因组的位置3。与插入编号较高的位置相比，将核酸序列插入或加入病毒基因组中编号较低的位置因存在横跨该病毒基因组的转录梯度(transcriptional gradient)而导致异源核苷酸序列的表达水平较强或较高。因此，如果需要高水平地表达异源核苷酸序列，将异源核苷酸序列插入或加入到编号较低的位置是本发明的优选实施方式。
不想局限于理论，异源序列的插入或加入的位置可影响到重组或嵌合型病毒的复制速率。如果该异源序列插入或加入到该病毒基因组的位置2或位置1，复制速率较高。如果异源序列插入或加入到该病毒基因组的位置3、位置4、位置5或位置6，复制速率较低。
不想局限于理论，病毒基因和异源序列之间的基因间区域的大小进一步决定了病毒的复制速率和异源序列的表达水平。
在某些实施方式中，本发明的病毒载体含有两种或多种不同的异源核苷酸序列。在一优选实施方式中，一条异源核苷酸序列位于该病毒基因组的位置1，第二条异源核苷酸序列位于病毒基因组的位置2。在另一优选的实施方式中，一条异源核苷酸序列位于该病毒基因组的位置1，第二条异源核苷酸序列位于位置3。在另一优选的实施方式中，一条异源核苷酸序列位于该病毒基因组的位置2，第二条异源核苷酸序列位于位置3。在某些其它实施方式中，将异源核苷酸序列插入该病毒基因组的其它编号较高的位置。按照本发明，异源序列的位置指这些序列从病毒基因组转录的顺序，例如位置1的异源序列是首先从基因组转录的基因序列。
可按照待治疗或要保护以抵御病毒感染的对象的物种来选择病毒载体。如果对象是人，则可用减毒的哺乳动物偏肺病毒或禽肺病毒提供抗原性序列。
按照本发明，可工程改造所述病毒载体以提供能赋予抵御偏肺病毒感染保护作用的抗原性序列，包括衍生自哺乳动物偏肺病毒，人偏肺病毒，MPV变体A1、A2、B1或B2的序列，衍生自禽肺病毒，包括APV亚群A、B、C或D的序列，虽然优选C。可工程改造所述病毒载体以提供能赋予抵御另一种病毒，包括负链RNA病毒(包括流感病毒、RSV或PIV，包括PIV3)感染或疾病保护作用的抗原性序列。可工程改造病毒载体以提供一种、两种、三种或更多种抗原性序列。本发明的抗原性序列可源自同一病毒，同一类型病毒的不同毒株或变体，或不同病毒，包括麻疹病毒。
在本发明的某些实施方式中，要插入本发明病毒基因组的异源核苷酸序列源自偏肺病毒。在本发明的某些具体实施方式中，所述异源核苷酸序列源自人偏肺病毒。在另一具体实施方式中，所述异源核苷酸序列源自禽肺病毒。更具体地说，本发明异源核苷酸序列编码人偏肺病毒的F基因。更具体地说，本发明异源核苷酸序列编码人偏肺病毒的G基因。更具体地说，本发明异源核苷酸序列编码禽肺病毒的F基因。更具体地说，本发明异源核苷酸序列编码禽肺病毒的G基因。在具体的实施方式中，此异源核苷酸序列可以是SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：14和SEQ ID NO：15中任一条。在某些具体的实施方式中，此核苷酸序列编码SEQ ID NO：6到SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17中任一条所示的蛋白质。
在本发明一具体实施方式中，所述异源核苷酸序列编码嵌合型F蛋白。在一示范性实施方式中，嵌合型F-蛋白的胞外域是人MPV的胞外域，而跨膜区和腔内域(luminal domain)源自禽偏肺病毒的F蛋白。不想局限于理论，编码由人胞外域和禽腔内/跨膜区构成的嵌合型F-蛋白的嵌合型人MPV因为该F-蛋白的禽部分而是减毒的，虽然其因为人胞外域而对hMPV具有高度免疫原性。
在某些实施方式中，将源自偏肺病毒基因组(包括哺乳动物偏肺病毒和禽偏肺病毒)的两种不同异源核苷酸序列插入或加入本发明病毒载体。例如，所述异源核苷酸序列衍生自人偏肺病毒、禽偏肺病毒、RSV、PIV或流感病毒。在一优选的实施方式中，所述异源序列分别编码人偏肺病毒、禽偏肺病毒、RSV或PIV的F-蛋白。在另一实施方式中，所述异源序列编码流感病毒的HA蛋白。
在某些实施方式中，本发明病毒载体含有两种不同的异源核苷酸序列，其中第一异源核苷酸序列源自偏肺病毒，例如人偏肺病毒或禽肺病毒，第二核苷酸序列源自呼吸道合胞体病毒(参见表2)。在具体实施方式中，源自呼吸道合胞体病毒的异源核苷酸序列是呼吸道合胞体病毒的F基因。在其它具体实施方式中，源自呼吸道合胞体病毒的异源核苷酸序列是呼吸道合胞体病毒的G基因。在一具体实施方式中，源自偏肺病毒的异源核苷酸序列插入位置的编号低于源自呼吸道合胞体病毒的异源核苷酸序列。在另一具体实施方式中，源自偏肺病毒的异源核苷酸序列插入位置的编号高于源自呼吸道合胞体病毒的异源核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明病毒含有两种不同的异源核苷酸序列，其中第一异源核苷酸序列源自偏肺病毒，例如人偏肺病毒或禽肺病毒，第二核苷酸序列源自副流感病毒，例如但不限于PIV3(参见表2)。在具体实施方式中，源自PIV的异源核苷酸序列是PIV的F基因。在其它实施方式中，源自PIV的异源核苷酸序列是PIV的G基因。在一具体实施方式中，源自偏肺病毒的异源核苷酸序列插入位置的编号低于源自PIV的异源核苷酸序列。在另一具体实施方式中，源自偏肺病毒的异源核苷酸序列插入位置的编号高于源自PIV的异源核苷酸序列。
按照本发明获得的表达产物和/或重组或嵌合型病毒体可优选用于疫苗制剂。可工程改造本发明的表达产物和嵌合型病毒体以产生抗广泛病原体，包括病毒和细菌抗原、肿瘤抗原、变应原抗原和参与自身免疫疾病的自身抗原的疫苗。具体地说，可工程改造本发明的嵌合型病毒体以产生能保护对象抵御PIV、RSV和/或偏肺病毒感染的疫苗。
在另一实施方式中，可工程改造本发明的嵌合型病毒体以产生抗-HIV疫苗，其中将源自gp160和/或HIV内部蛋白质的免疫原性多肽工程改造成糖蛋白HN以构建能引发脊椎动物体液和细胞介导免疫应答的疫苗。在还有另一实施方式中，本发明涉及经工程改造编码突变型抗原的重组偏肺病毒载体和病毒。与衍生它的野生型病毒蛋白质相比，突变型抗原含有至少一个氨基酸取代、缺失或添加。
在某些实施方式中，本发明涉及包含本发明重组或嵌合型病毒的三价疫苗。在具体的实施方式中，用作三价疫苗骨架的病毒是含有源自RSV的第一异源核苷酸序列和源自PIV的第二异源核苷酸序列的嵌合型禽-人偏肺病毒或嵌合型人-禽偏肺病毒。在一示范性实施方式中，这种三价疫苗分别对以下产物具有特异性：a)根据所用的嵌合型禽-人或嵌合型人-禽偏肺病毒，而分别对人偏肺病毒或禽肺病毒的F基因和/或G基因的基因产物具有特异性；b)源自RSV的异源核苷酸序列编码的蛋白质；和c)源自PIV的异源核苷酸序列编码的蛋白质。在一具体实施方式中，所述第一异源核苷酸序列是呼吸道合胞体病毒的F基因，插入位置1中；所述第二异源核苷酸序列是PIV的F基因，插入位置3中。本发明包括更多的组合，其中一些示例于表2。此外，可使用编码嵌合型F蛋白的核苷酸序列(见上文)。在一些不太优选的实施方式中，可将所述异源核苷酸序列插入病毒基因组中编号较高的位置。
表2.三价疫苗所用的病毒中异源核苷酸序列的示范性配置
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Figure A200680015321D00381
在某些实施方式中，可工程改造本发明的表达产物和重组或嵌合型病毒体以产生抗各种病原体，包括病毒抗原、肿瘤抗原和参与自身免疫疾病的自身抗原的疫苗。实现此目标的一种方法包括修饰现有的偏肺病毒基因，使其各自外部结构域中含有外来序列。当所述异源序列是病原体的表位或抗原时，可利用这些嵌合型病毒诱导产生针对衍生这些决定簇病原体的保护性免疫应答。
因此，本发明涉及使用病毒载体和重组或嵌合型病毒来配制抗各种病毒和/或抗原的疫苗。可用本发明病毒载体和嵌合型病毒来激发体液免疫应答、细胞免疫应答或激发对抗原的耐受，从而能调节对象的免疫系统。本文所用的对象指：人、灵长类动物、马、牛、绵羊、猪、山羊、狗、猫、禽类和啮齿类动物。
可将本发明分成以下阶段，这只是为了说明而非限制：(a)构建重组cDNA和RNA模板；(b)利用重组cDNA和RNA模板表达异源基因产物；(c)拯救重组病毒颗粒中的异源基因；和(d)制备和使用含有本发明重组病毒颗粒的疫苗。
5.4 构建重组cDNA和RNA
在某些实施方式中，所述病毒载体衍生自本发明的人或哺乳动物偏肺病毒基因组。在其它实施方式中，所述病毒载体衍生自禽肺病毒基因组。在某些实施方式中，所述病毒载体含有衍生自哺乳动物MPV和APV的序列，因而该病毒载体能编码嵌合型人MPV/APV病毒。在一示范性实施方式中，用禽肺病毒的F-基因和/或G-基因取代人偏肺病毒的F-基因和/或G-基因以构建嵌合型hMPV/APV病毒。在其它实施方式中，病毒载体含有源自APV和哺乳动物MPV的序列，因而该病毒载体能编码嵌合型APV/hMPV病毒。在更多示范性实施方式中，用人偏肺病毒的F-基因和/或G-基因取代禽肺病毒的F-基因和/或G-基因以构建嵌合型APV/hMPV病毒。
本发明也包括含有衍生自哺乳动物MPV或APV基因组的病毒载体的重组病毒，所述病毒载体含有该病毒基因组的内源性或天然序列，可以含有或不含有该病毒基因组的非天然序列。非天然序列包括与天然或内源性序列不同，可能导致或不导致表型变化的那些序列。本发明重组病毒含有的序列可导致病毒具有更适用于疫苗制剂的表型，例如减毒表型或抗原性提高。这些突变和修饰可以发生在该病毒的编码区，基因间区域及前导序列和尾序列(trailer sequences)中。
在某些实施方式中，本发明的病毒载体包含源自hMPV、APV、hMPV/APV或APV/hMPV的核苷酸序列，其中已用异源序列取代了天然核苷酸序列或者已将异源序列加入天然偏肺病毒序列中。
在一更具体的实施方式中，嵌合型病毒包含源自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒载体，其中已加入了源自PIV的异源序列。在一更具体的实施方式中，重组病毒包含源自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒载体，其中已用源自PIV的异源序列取代了(天然)序列。在其它具体的实施方式中，嵌合型病毒包含源自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒载体，其中已加入了源自RSV的异源序列。在一更具体的实施方式中，重组病毒包含源自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒载体，其中已用源自RSV的异源序列取代了(天然)序列。
可采用本领域已知技术构建侧接该病毒聚合酶结合位点/启动子的互补序列(例如本发明hMPV病毒3’-末端的互补序列或hMPV病毒3’-和5’末端的互补序列)的异源基因编码序列。在更具体的实施方式中，本发明重组病毒含有hMPV或APV的前导序列或尾序列。在某些实施方式中，所述基因间区域得自hMPV或APV。得到的RNA模板可以是负极性(negative-polarity)含有能使该病毒的RNA合成部件识别该模板的合适末端序列。或者，也可使用正极性(positive-polarity)的RNA模板，其含有能使该病毒的RNA合成部件识别该模板的合适末端序列。可以克隆含有这些杂交序列的重组DNA分子，用DNA-指导的RNA合成酶，例如噬菌体T7、T3、SP6合成酶或真核生物聚合酶，如聚合酶I等转录，从而能在体外或体内产生重组RNA模板，该模板含有能识别病毒聚合酶和具有活性的合适病毒序列。在一更具体的实施方式中，所述RNA聚合酶是禽痘病毒T7RNA聚合酶或MVA T7 RNA聚合酶。
构建这些杂交分子的示范性方法是将异源核苷酸序列插入与hMPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV基因组互补的DNA中，因而该异源序列侧接了病毒聚合酶活性所需的病毒序列(即病毒聚合酶结合位点/启动子，下文称为病毒聚合酶结合位点)和聚腺苷酸化位点。在一优选的实施方式中，该异源编码序列侧接了含有5’和3’末端的复制启动子、基因起始序列和基因终序列以及在5’和/或3’末端发现的包装信号的病毒序列。在另一方法中，可将编码该病毒聚合酶结合位点的寡核苷酸，例如该病毒基因组区段的3’-末端或两末端的互补序列与异源编码序列相连而构建杂交分子。以上描述了通过靶序列内存在的合适限制性酶切位点将外来基因或外来基因区段置于该靶序列内。然而，近年来分子生物学的发展极大减少了该问题。采用定点诱变不难将限制性酶切位点置于靶序列内任何位置(例如，参见Kunkel，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82；488描述的技术)。下文所述聚合酶链式反应(PCR)技术的改进也能特异性地插入序列(即，限制性酶切位点)并有助于构建杂交分子。或者，可采用PCR反应制备重组模板而无需克隆。例如，可采用PCR反应制备含有DNA指导的RNA聚合酶启动子(例如噬菌体T3、T7或SP6)的双链DNA分子及含有异源基因和PIV聚合酶结合位点的杂交序列。然后可从该重组DNA直接转录RNA模板。在还有另一实施方式中，可利用RNA连接酶连接对异源基因负极性特异的RNA与病毒聚合酶结合位点来制备重组RNA模板。
此外，可在非翻译区中加入一个或多个核苷酸以满足对于获得病毒拯救至关重要的“六碱基规则(Rule of Six)”。“六碱基规则”适用于许多副黏病毒，其表述为RNA核苷酸基因组必须能被6整除才能起作用。可采用本领域已知的技术，例如使用商品化诱变试剂盒，如QuikChange诱变试剂盒(Stratagene)加入核苷酸。加入数量合适的核苷酸后，用相应的限制性内切酶消化和凝胶纯化来分离正确的DNA片段。以下章节描述了病毒聚合酶活性的序列要求和本发明可用的构建物。
不想局限于理论，几种参数可影响重组病毒的复制速率和异源序列的表达水平。具体地说，hMPV、APV、hMPV/APV或APV/hMPV中异源序列的位置和侧接该异源序列的基因间区域的长度决定了复制速率和该异源序列的表达水平。
在某些实施方式中，与野生型病毒相比，这些病毒的前导序列和尾序列已作修饰。某些更具体的实施方式改变了前导序列和/或尾序列的长度。在其它实施方式中，与野生型病毒相比，这些病毒的前导序列和尾序列发生突变。更多细节见章节5.7。
本发明重组病毒的产生依赖于负义病毒RNA(vRNA)基因组的部分或全长拷贝或其互补拷贝(cRNA)的复制。该vRNA或cRNA可从感染性病毒中分离，在体外转录后产生或核酸转染后在细胞中产生。第二，重组负链病毒的产生依赖于功能性聚合酶复合物。肺病毒的聚合酶复合物通常由N、P、L和可能的M2蛋白(但不一定限于这些)构成。
聚合酶复合物或其组分可从病毒颗粒中分离，从表达一种或多种组分的细胞中分离，或在特定表达载体转染后产生。
当通过上述聚合酶复合物16复制了上述vRNA、cRNA或表达这些RNA的载体时可获得MPV的感染性拷贝(Schnell等，1994，EMBO J 13：4195-4203；Collins等，1995，PNAS 92：11563-11567；Hoffmann等，2000，PNAS 97：6108-6113；Bridgen等，1996，PNAS 93：15400-15404；Palese等，1996，PNAS 93：11354-11358；Peeters等，1999，J.Virol.73：5001-5009；Durbin等，1997，Virology 235：323-332)。
本发明提供含有本发明核酸或载体的宿主细胞。用能在相关细胞类型(细菌、昆虫细胞、真核细胞)中表达诸组分的原核细胞产生含有MPV的聚合酶组分(大致是N、P、L和M2，但不一定限于这些)的质粒或病毒载体。可利用能表达病毒核酸的原核细胞在体内或体外产生含有MPV基因组的全长或部分拷贝的质粒或病毒载体。后一种载体可含有其它病毒序列来产生嵌合型病毒或嵌合型病毒蛋白，可缺失一部分病毒基因组来产生复制缺陷型病毒，可含有突变、缺失或插入来产生减毒的病毒。
可通过上述现有技术共同表达该聚合酶组分后产生MPV的感染性拷贝(可以是野生型、减毒的、复制缺陷型或嵌合型)。
此外，可使用能暂时或稳定表达一种或多种全长或部分MPV蛋白的真核细胞。可通过转染(蛋白载体或核酸载体)、感染(表达载体)或转导(病毒载体)制备这种细胞，这种细胞可用于补充上述野生型、减毒的、复制缺陷型或嵌合型病毒。
5.4.1 要插入的异源基因序列
按照本发明，可以进一步工程改造本发明病毒载体以表达异源序列。在本发明一实施方式中，异源序列得自除病毒载体以外的来源。例如但不限于，该异源序列可编码某病毒的抗原性蛋白、多肽或肽，该病毒属于衍生该病毒载体的病毒种类、亚群或变体以外的偏肺病毒的不同种类、亚群或变体。例如但不限于，该异源序列编码除偏肺病毒以外某病毒的抗原性蛋白、多肽或肽。例如但不限于，该异源序列不是病毒来源的。按照该实施方式，异源序列可编码具有所需生物学特性或活性的部分、肽、多肽或蛋白质。这种异源序列可编码标签或标记。这种异源序列可编码生物学反应调节物，例如包括淋巴因子、白介素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和粒细胞集落刺激因子。
在某些实施方式中，要插入的异源核苷酸序列源自偏肺病毒。更具体地说，要插入的异源核苷酸序列源自人偏肺病毒和/或禽肺病毒。
在某些实施方式中，该异源序列编码PIV核衣壳磷蛋白、PIV L蛋白、PIV基质蛋白、PIV HN糖蛋白、PIV RNA-依赖性RNA聚合酶、PIV Y1蛋白、PIV D蛋白、PIV C蛋白、PIV F蛋白或PIV P蛋白。在某些实施方式中，该异源核苷酸序列编码的蛋白质与PIV核衣壳磷蛋白、PIV L蛋白、PIV基质蛋白、PIV HN糖蛋白、PIV RNA-依赖性RNA聚合酶、PIV Y1蛋白、PIV D蛋白、PIV C蛋白、PIV F蛋白或PIV P蛋白有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源。可获得1型PIV、2型PIV或3型PIV的异源序列。在更具体的实施方式中，可获得人1型PIV、2型PIV或3型PIV的异源序列。在其它实施方式中，该异源序列编码RSV核蛋白、RSV磷蛋白、RSV基质蛋白、RSV小疏水性蛋白、RSV的RNA-依赖性RNA聚合酶、RSV F蛋白、RSV G蛋白或RSV M2-1或M2-2蛋白。在某些实施方式中，该异源序列编码的蛋白质与RSV核蛋白、RSV磷蛋白、RSV基质蛋白、RSV小疏水性蛋白、RSV的RNA-依赖性RNA聚合酶、RSV F蛋白或RSV G蛋白有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源。可获得RSV A亚型和B亚型的异源序列。在更具体的实施方式中，可获得人RSV A亚型和B亚型的异源序列。在其它实施方式中，该异源序列编码APV核蛋白、APV磷蛋白、APV基质蛋白、APV小疏水性蛋白、APV的RNA-依赖性RNA聚合酶、APV F蛋白、APV G蛋白或APV M2-1或M2-2蛋白。在某些实施方式中，该异源序列编码的蛋白质与APV核蛋白、APV磷蛋白、APV基质蛋白、APV小疏水性蛋白、APV的RNA-依赖性RNA聚合酶、APV F蛋白或APV G蛋白有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源。禽肺病毒可以是APV的A亚群、B亚群或C亚群。在其它实施方式中，该异源序列编码hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基质蛋白、hMPV小疏水性蛋白、hMPV的RNA-依赖性RNA聚合酶、hMPV F蛋白、hMPV G蛋白或hMPV M2-1或M2-2。在某些实施方式中，该异源序列编码的蛋白质与hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基质蛋白、hMPV小疏水性蛋白、hMPV的RNA-依赖性RNA聚合酶、hMPV F蛋白或hMPV G蛋白有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源。人偏肺病毒可以是hMPV变体A1、变体A2、变体B1或变体B2。
在某些实施方式中，可将PIV、RSV、人偏肺病毒或禽肺病毒的不同异源序列的任何组合插入本发明病毒中。
在本发明的某些优选实施方式中，要插入的异源核苷酸序列源自RSV、PIV、APV或hMPV的F基因。
在某些实施方式中，该异源核苷酸序列编码嵌合型蛋白。在更具体的实施方式中，该异源核苷酸序列编码RSV、PIV、APV或hMPV的嵌合型F蛋白。嵌合型F蛋白可包含不同病毒，例如人偏肺病毒、禽肺病毒、呼吸道合胞体病毒和副流感病毒的F蛋白诸部分。在某些其它实施方式中，该异源序列编码嵌合型G蛋白。嵌合型G蛋白可包含不同病毒，例如人偏肺病毒、禽肺病毒、呼吸道合胞体病毒和副流感病毒的G蛋白诸部分。在一具体实施方式中，所述F蛋白包含偏肺病毒F蛋白的胞外域、副流感病毒F蛋白的跨膜区和副流感病毒F蛋白的腔内域。在某些具体的实施方式中，本发明的异源核苷酸序列是SEQ ID NO：1到SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15中任一条。在某些具体的实施方式中，这些核苷酸序列编码SEQ ID NO：6到SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16和SEQ IDNO：17中任一条所示的蛋白质。
对于源自呼吸道合胞体病毒的异源核苷酸序列，参见例如全文纳入本文作为参考的PCT/US98/20230。
在一优选的实施方式中，可表达成本发明重组病毒的异源基因序列包括但不限于能导致呼吸道疾病的病毒的抗原性表位和糖蛋白(的基因序列)，例如流感病毒糖蛋白(特别是血凝素H5、H7)、呼吸道合胞体病毒的表位、新城疫病毒的表位、仙台病毒和禽传染性喉气管炎病毒(ILV)。在一优选的实施方式中，这些异源核苷酸序列源自RSV或PIV。在本发明还有一实施方式中，可经工程改造加入本发明嵌合型病毒中的这些异源基因序列包括但不限于以下病毒表位和病毒糖蛋白(的基因序列)，例如乙肝病毒表面抗原、甲肝或丙肝病毒表面(抗原)、E-B病毒糖蛋白、人乳头瘤病毒糖蛋白、猿猴病毒5或腮腺炎病毒、西尼罗病毒、登革热病毒、疱疹病毒糖蛋白、脊髓灰质炎病毒的VPI和源自慢病毒的序列，优选但不限于1型或2型人免疫缺陷病毒(HIV)。在还有另一实施方式中，可工程改造入本发明嵌合型病毒中的异源基因序列包括但不限于：马雷克病病毒(MDV)的表位、传染性粘液囊病病毒(IBDV)的表位、鸡贫血病毒的表位、禽传染性喉气管炎病毒(ILV)、禽流感病毒(AIV)、狂犬病、猫白血病病毒、犬瘟热病毒、水泡性口膜炎病毒和猪痘病毒(参见全文纳入本文作为参考的Fields等(编)，1991，Fundamental Virology(《基础病毒学》)，第二版，Raven Press，纽约)。
本发明的其它异源序列包括自身免疫疾病的特征性抗原。这些抗原通常源自哺乳动物组织的细胞表面、细胞质、核、线粒体等，包括作为以下疾病的特征性抗原：糖尿病、多发性硬化症、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、恶性贫血、阿狄森病、硬皮病、自身免疫性萎缩性胃炎、青少年糖尿病和盘状红斑狼疮。
可作为变应原的抗原通常包括蛋白质或糖蛋白，包括源自花粉、灰尘、霉菌、孢子、皮屑、昆虫和食物的抗原。此外，作为肿瘤特征性抗原的抗原通常源自肿瘤组织细胞的细胞表面、细胞质、核、细胞器等。例子包括肿瘤蛋白的特征性抗原，包括突变的致癌基因编码的蛋白质；肿瘤相关的病毒蛋白；和糖蛋白。肿瘤包括但不限于以下癌症类型的那些肿瘤：唇癌、鼻咽癌、咽癌和口腔癌、食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、喉癌、肺和支气管癌、皮肤的黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、膀癌胱、肾癌、子宫癌(uterus)、脑和神经系统其它部分的癌症、甲状腺癌、前列腺癌、睾丸癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。
在本发明一具体实施方式中，这些异源序列衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)，优选1型人免疫缺陷病毒或2型人免疫缺陷病毒的基因组。在本发明的另一实施方式中，可将该异源编码序列插入编码病毒骨架序列的基因中，从而表达在偏肺病毒蛋白中含有异源肽序列的嵌合型基因产物。在本发明的这种实施方式中，异源序列也可衍生自人免疫缺陷病毒，优选1型人免疫缺陷病毒或2型人免疫缺陷病毒的基因组。
在异源序列源自HIV的情况中，这种序列可以包括但不限于源自以下基因的序列：env基因(即，编码gp160、gp120和/或gp41的全部或部分的序列)、pol基因(即，编码逆转录酶、核酸内切酶、蛋白酶和/或整合酶的全部或部分的序列)、gag基因(即，编码p7、p6、p55、p17/18、p24/25的全部或部分的序列)、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr和/或vpx。
在还有另一实施方式中，可工程改造嵌合型病毒使加入的异源基因序列包含编码具有免疫增强活性蛋白质的序列。免疫增强活性蛋白的例子包括但不限于：细胞因子、1型干扰素、γ干扰素、集落刺激因子和白介素-1、-2、-4、-5、-6、-12。
此外，可工程改造嵌合型病毒使加入的其它异源基因序列包含源自细菌的抗原(例如细菌表面糖蛋白)，源自真菌的抗原和源自各种其它病原体和寄生虫的抗原。源自细菌病原体的异源基因序列的例子包括但不限于源自以下属的细菌的抗原：沙门菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、衣原体属(Chlamydia)、螺杆菌属(Helicobacter)、耶尔森菌属(Yersinia)、博德特菌属(Bordatella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、奈瑟菌属(Neisseria)、弧菌属(Vibrio)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、支原体属(Mycoplasma)、链霉菌属(Streptomyces)、密螺旋体属(Treponema)、柯克斯体属(Coxiella)、埃里希体属(Ehrlichia)、布鲁杆菌属(Brucella)、链杆菌属(Streptobacillus)、梭-螺菌丛(Fusospirocheta)、螺菌属(Spirillum)、脲原体属(Ureaplasma)、螺旋体属(Spirochaeta)、支原体属(Mycoplasma)、放线菌属(Actinomycetes)、疏螺旋体属(Borrelia)、拟杆菌属(Bacteroides)、毛发菌属(Trichomoras)、布兰汉球菌属(Branhamella)、巴斯德菌属(Pasteurella)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、李斯特菌属(Listeria)、芽胞杆菌属(Bacillus)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、红球菌属(Rhodococcus)、埃希杆菌属(Escherichia)、克雷白杆菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomanas)、肠细菌属(Enterobacter)、沙雷菌属(Serratia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、军团杆菌属(Legionella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、变形菌属(Proteus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、摩根菌属(Morganella)、莫拉菌属(Moraxella)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、立克次氏体属(Rickettsia)、(Rochlimeae)以及例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、大肠杆菌(E.coli)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)、表皮葡萄球菌(S.epidermis)、粪肠球菌(E.faecalis)、肺炎链球菌(S.pneumonias)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)、酿脓葡萄球菌(S.pyogenes)、出血败血性巴斯德菌(Pasteurella multocida)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)和奇异变形杆菌(P.mirabilis)。
源自致病性真菌的异源基因序列的例子包括但不限于源自以下真菌的抗原：例如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)；皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)；(Aiellomyces dermatitidis)；夹膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)；粗球孢子菌(Coccidioides immitis)；念珠菌种(Candida species)，包括白色念珠菌(C.albicans)、热带念珠菌(C.tropicalis)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、吉利蒙念珠菌(C.guilliermondii)和克鲁斯念珠菌(C.krusei)；曲霉种(Aspergillus species)，包括烟曲霉(A.fumigatus)、黄曲霉(A.flavus)和黑曲霉(A.niger)；根霉(Rhizopus species)；根毛霉种(Rhizomucor species)；小克银汉霉种(Cunninghammella species)；鳞质霉种(Apophysomyces species)，包括(A.saksenaea)、(A.mucor)和(A.absidia)；申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)；巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)；波氏假阿利什菌(Pseudallescheria boydii)；光滑球拟酵母菌(Torulopsis glabrata)；发癣菌种(Trichophyton species)；小孢菌种(Microsporum species)和Dermatophyres种以及目前已知或将来鉴定为致病性的其它酵母菌或真菌。
最后，源自寄生虫的异源基因序列的例子包括但不限于源自以下的抗原：例如顶复门(Apicomplexa phylum)的成员，如巴贝虫属(Babesia)、弓形体属(Toxoplasma)、疟原虫属(Plasmodium)、艾美球虫属(Eimeria)、等孢子球虫属(Isospora)、Atoxoplasma、囊等孢虫属(Cystoisospora)、哈蒙德虫属(Hammondia)、贝诺孢子虫属(Besniotia)、肉孢子虫属(Sarcocystis)、弗伦克虫属(Frenkelia)、变形血原虫属(Haemoproteus)、住白虫属(Leucocytozoon)、泰勒虫属(Theileria)、伯金斯虫属(Perkinsus)和簇虫属(Gregarina spp.)；卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)；微孢子门的成员，如小孢子虫属(Nosema)、肠胞虫属(Enterocytozoon)、脑胞内原虫属(Encephalitozoon)、Septata、Mrazekia、钝孢子属(Amblyospora)、Ameson、格留虫属(Glugea)、具褶孢虫属(Pleistophora)和微孢子虫属(Microsporidium spp.)；和囊孢子虫门(Ascetospora phylum)的成员，如隐孢子虫属(Haplosporidium spp.)以及包括以下的种类，镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)、间日疟原虫(P.malaria)；鼠弓形体(Toxoplasma gondii)；墨西哥利什曼原虫(Leishmania mexicana)、热带利什曼原虫(L.tropica)、硕大利什曼原虫(L.major)、埃塞俄比亚利什曼原虫(L.aethiopica)、杜氏利什曼原虫(L.donovani)；克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、布氏锥虫(T.brucei)；曼森血吸虫(Schistoso mamansoni)、埃及血吸虫(S.haematobium)、S.japonium；旋毛(线)虫(Trichinella spiralis)；班克罗夫特吴策线虫(Wuchereria bancrofti)；布鲁[丝虫]属(Brugia malayli)；溶组织阿米巴原虫(Entamoeba histolytica)；Enterobius vermiculoarus；猪肉绦虫(Taenia solium)、牛肉绦虫(T.saginata)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginatis)、人毛滴虫(T.hominis)、口腔毛滴虫(T.tenax)；兰伯贾第虫(Giardia lamblia)；小球隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)；卡氏肺囊虫(Pneumocytis carinii)；牛巴贝虫(Babesia bovis)、分歧巴贝虫(B.divergens)、果氏巴贝虫(B.microti)；贝氏等孢子球虫(Isospora belli)；Lhominis；脆双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)；旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)；人蛔虫(Ascaris lumbricoides)；美国板口线虫属(Necator americanis)；十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)；粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)；菲律宾毛细线虫(Capillaria philippinensis)；广州圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)；短膜壳绦虫(Hymenolepis nana)；阔节裂头绦虫(Diphyllobothrium latum)；细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)、多房棘球绦虫(E.multilocularis)；卫氏并殖吸虫(Paragonimus westermani)、卡里并殖吸虫(P.caliensis)；华支睾吸虫(Chlonorchissinensis)；Opisthorchis felineas；麝猫后睾吸虫(G.Viverini)；肝片吸虫(Fasciolahepatica)；疥螨(Sarcoptes scabiei)；人虱(Pediculus humanus)；Phthirlus pubis和人皮蝇(Dermatobia hominis)以及目前已知或将来鉴定为致病性的任何其它寄生虫。
5.4.2 插入异源基因序列
可用异源序列完全取代或部分取代病毒编码区或将异源核苷酸序列加入病毒基因组来将外来基因序列插入本发明病毒载体。可能最好采用PCR-指导的诱变实现完全取代。简言之，PCR-引物A自5’到3’端含有：独特的限制性酶切位点，例如IIS类限制性酶切位点(即，能识别特定序列，但在该序列的上游或下游切割DNA的“移位”酶)；与待替换的基因区域互补的核苷酸延伸段；和与该异源序列羧基末端编码部分互补的核苷酸延伸段。PCR-引物B自5’到3’端含有：独特的限制性酶切位点；与待替换的基因互补的核苷酸延伸段；和对应于该异源或非天然基因5’编码部分的核苷酸延伸段。用这些引物和异源或非天然基因的克隆拷贝进行PCR反应后，可利用独特的限制性位点切下和克隆产物。用IIS类酶消化和用纯化的噬菌体聚合酶转录可得到含有该病毒基因的精确非翻译末端的RNA分子，该分子现在携带了异源或非天然基因插入物。在另一实施方式中，可采用PCR引发的反应来制备含有噬菌体启动子序列和杂交基因序列的双链DNA，因而可直接转录RNA模板而无需克隆。
可将异源核苷酸序列加入或插入本发明病毒的各种位置。在一实施方式中，将异源核苷酸序列加入或插入位置1。在另一实施方式中，将异源核苷酸序列加入或插入位置2。在另一实施方式中，将异源核苷酸序列加入或插入位置3。在另一实施方式中，将异源核苷酸序列加入或插入位置4。在另一实施方式中，将异源核苷酸序列加入或插入位置5。在还有另一实施方式中，将异源核苷酸序列加入或插入位置6。本文所用的术语“位置”指异源核苷酸序列在待转录的病毒基因组上的位置，例如位置1表示首先转录基因的位置，位置2表示第二个转录基因的位置。与插入编号较高的位置相比，将异源核苷酸序列插入病毒中编号较低的位置会因存在横跨病毒基因组中的转录梯度而导致该异源核苷酸序列表达较强。然而，转录梯度也产生了病毒mRNA的特定比例。插入外来基因会干扰这些比例，导致合成不同量的可能影响病毒复制的病毒蛋白。因此，在选择插入位点时必须考虑转录梯度的影响和复制动力学。如果需要高水平地表达异源核苷酸序列，将该异源核苷酸序列插入编号较低的位置是本发明的优选实施方式。在一优选实施方式中，将异源序列加入或插入位置1、2或3。
当将异源核苷酸序列插入本发明病毒时，可改变异源基因编码序列的末端与下游基因编码序列的起始点之间的基因间区域以达到所需效果。本文所用的术语“基因间区域”指某一基因的终止信号与下一个下游开放读框编码序列的起始密码子(例如，AUG)之间的核苷酸序列。基因间区域可包含某基因的非编码区，即该基因的转录起始位点与其编码序列的起点(AUG)之间的区域。某些病毒基因中天然存在这种非编码区。
在各种实施方式中，可彼此独立地工程改造异源核苷酸序列和下游基因之间的基因间区域使之长度至少为10个nt、至少20个nt、至少30个nt、至少50个nt、至少75个nt、至少100个nt、至少125个nt、至少150个nt、至少175个nt或至少200个nt。在某些实施方式中，可彼此独立地工程改造异源核苷酸序列和下游基因之间的基因间区域使之长度最多为10个nt、最多20个nt、最多30个nt、最多50个nt、最多75个nt、最多100个nt、最多125个nt、最多150个nt、最多175个nt或最多200个nt。在各种实施方式中，也可彼此独立地工程改造病毒基因组中所需基因的非编码区使之长度至少为10个nt、至少20个nt、至少30个nt、至少50个nt、至少75个nt、至少100个nt、至少125个nt、至少150个nt、至少175个nt或至少200个nt。在某些实施方式中，也可彼此独立地工程改造病毒基因组中所需基因的非编码区使之长度最多为10个nt、最多20个nt、最多30个nt、最多50个nt、最多75个nt、最多100个nt、最多125个nt、最多150个nt、最多175个nt或最多200个nt。
插入异源核苷酸序列时，可联用位置效应和基因间区域操作以实现所需效果。例如，可将异源核苷酸序列加入或插入选自位置1、2、3、4、5和6的位置，可改变异源核苷酸序列与下一个下游基因之间的基因间区域(见表3)。例如，表3显示了本发明所包括的一些组合。
表3.异源核苷酸序列的插入模式例子
      位置1     位置2    位置3    位置4    位置5    位置6
IGRa  10-20     10-20    10-20    10-20    10-20    10-20
IGR   21-40     21-40    21-40    21-40    21-40    21-40
IGR   41-60     41-60     41-60     41-60     41-60     41-60
IGR   61-80     61-80     61-80     61-80     61-80     61-80
IGR   81-100    81-100    81-100    81-100    81-100    81-100
IGR   101-120   101-120   101-120   101-120   101-120   101-120
IGR   121-140   121-140   121-140   121-140   121-140   121-140
IGR   141-160   141-160   141-160   141-160   141-160   141-160
IGR   161-180   161-180   161-180   161-180   161-180   161-180
IGR   181-200   181-200   181-200   181-200   181-200   181-200
IGR   201-220   201-220   201-220   201-220   201-220   201-220
IGR   221-240   221-240   221-240   221-240   221-240   221-240
IGR   241-260   241-260   241-260   241-260   241-260   241-260
IGR   261-280   261-280   261-280   261-280   261-280   261-280
IGR   281-300   281-300   281-300   281-300   281-300   281-300
a基因间区域，以核苷酸检测
根据所插入异源核苷酸序列的目的(例如，具有强免疫原性)，可用各种指数检测所插入异源核苷酸序列的插入位置和其基因间区域的长度，所述指数包括但不限于通过以下试验检测的复制动力学和蛋白质或mRNA表达水平，所述试验的非限制性例子是：噬菌斑测定、荧光聚焦试验、侵染中心试验、转化试验、终点稀释试验、接种效率、电子显微镜、血凝、检测病毒的酶活性、病毒中和、血凝抑制、补体结合、免疫染色、免疫沉淀和免疫印迹、酶联免疫吸附测定、核酸检测(例如，Southern印迹分析、Northern印迹分析、蛋白质印迹分析)、生长曲线、利用报道基因(例如，使用报道基因，如绿色荧光蛋白(GFP)或增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、以与感兴趣异源基因相同的方式整合入病毒基因组来观察蛋白质表达)或它们的组合。本领域熟知实施这些试验的方法(参见，例如全文纳入本文作为参考的Flint等，
Figure A200680015321D0050104725QIETU
《病毒学、分子生物学、发病机制和控制的原理》)，2000，ASM Press，第25-56页)，非限制性例子见下文实施例章节。
例如，可通过以下步骤检测表达水平：用本发明病毒感染培养的细胞，然后通过，例如利用该异源序列基因产物的特异性抗体作蛋白质印迹分析或ELISA检测蛋白质表达水平，或通过，例如用该异源序列的特异性探针作Northern印迹分析来检测RNA表达水平。类似地，可通过感染动物模型，检测该动物模型中本发明重组病毒中异源序列所表达的蛋白质水平来检测异源序列的表达水平。可通过获得受感染动物的组织样品，然后用异源序列基因产物的特异性抗体对该组织样品进行蛋白质印迹分析或ELISA来检测蛋白质水平。此外，如果使用动物模型，可采用技术人员已知的任何技术，包括但不限于ELISA测定该动物产生的抗异源序列基因产物的抗体滴度。
由于异源序列可以与该病毒基因组中的核苷酸序列同源，应小心探针和抗体实际上对异源序列或其基因产物特异。
在某些具体的实施方式中，可采用本领域技术人员已知的任何技术测定嵌合型禽-人偏肺病毒hMPV的F-蛋白表达水平。可通过以下步骤检测F-蛋白表达水平：用本发明嵌合型病毒感染培养的细胞，通过，例如利用hMPV F-蛋白和/或G-蛋白的特异性抗体作蛋白质印迹分析或ELISA来检测蛋白质表达水平，或通过，例如利用人偏肺病毒F-基因和/或G-基因的特异性探针作Northern印迹分析来检测RNA表达水平。类似地，可利用动物模型，通过感染动物并检测该动物模型中F-蛋白和/或G-蛋白的水平来检测异源序列的表达水平。可通过获得受感染动物的组织样品，然后利用异源序列F-蛋白和/或G-蛋白的特异性抗体对该组织样品进行蛋白质印迹分析或ELISA来检测蛋白质水平。此外，如果使用动物模型，可采用技术人员已知的任何技术，包括但不限于ELISA测定该动物产生的抗F-蛋白和/或G-蛋白的抗体滴度。
可采用技术人员已知的任何技术测定本发明重组病毒的复制速率。
在某些实施方式中，通过异源序列编码的报道基因来促进鉴定异源序列在病毒基因组中的最佳位置和基因间区域的最佳长度。一旦测定了最佳参数，用编码所选抗原的异源核苷酸序列替代该报道基因。本发明方法可使用技术人员已知的任何报道基因。更多细节可参见章节5.8。
可采用技术人员已知的任何标准技术测定重组病毒的复制速率。病毒的生长速率代表了复制速率，可通过将病毒滴度对感染后时间作图来测定复制速率。可采用技术人员已知的任何技术检测病毒滴度。在某些实施方式中，一起培育病毒混悬液与易受病毒感染的细胞。本发明方法可用的细胞类型包括但不限于：Vero细胞、LLC-MK-2细胞、Hep-2细胞、LF 1043(HEL)细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、tMK细胞、293 T细胞、QT 6细胞、QT 35细胞或鸡胚成纤维细胞(CEF)。病毒与细胞培育后，测定受感染细胞的数量。在某些具体的实施方式中，所述病毒包含报道基因。因此，表达报道基因的细胞数量代表了受感染细胞的数量。在一具体实施方式中，所述病毒包含编码eGFP的异源核苷酸序列，采用FACS测定表达eGFP的细胞数量，即受该病毒感染的细胞数量。
在某些实施方式中，相同条件下本发明重组病毒的复制速率最多是产生该重组病毒的野生型病毒复制速率的20％。相同条件指病毒的起始滴度相同、细胞株相同、培育温度、生长培养基、细胞数量和可能影响复制速率的其它测试条件相同。例如，在位置1含有PIV F基因的APV/hMPV复制速率最多是APV复制速率的20％。
在某些实施方式中，相同条件下本发明重组病毒的复制速率最多是产生该重组病毒的野生型病毒复制速率的5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、80％、90％。在某些实施方式中，相同条件下本发明重组病毒的复制速率至少是产生该重组病毒的野生型病毒复制速率的5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、80％、90％。在某些实施方式中，相同条件下本发明重组病毒的复制速率在产生该重组病毒的野生型病毒复制速率的5％-20％之间、10％-40％之间、25％-50％之间、40％-75％之间、50％-80％之间或75％-90％之间。
在某些实施方式中，相同条件下本发明重组病毒中异源序列的表达水平最多是产生该重组病毒的野生型病毒F-蛋白表达水平的20％。相同条件指病毒的起始滴度相同、细胞株相同、培育温度、生长培养基、细胞数量和可能影响复制速率的其它测试条件相同。例如，hMPV位置1中PIV3 F蛋白的异源序列表达水平最多是hMPV的F-蛋白表达水平的20％。
在某些实施方式中，相同条件下本发明重组病毒中异源序列的表达水平最多是产生该重组病毒的野生型病毒F-蛋白表达水平的5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、80％、90％。在某些实施方式中，相同条件下本发明重组病毒中异源序列的表达水平至少是产生该重组病毒的野生型病毒F-蛋白表达水平的5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、80％、90％。在某些实施方式中，相同条件下本发明重组病毒中异源序列的表达水平在产生该重组病毒的野生型病毒F-蛋白表达水平的5％-20％之间、10％-40％之间、25％-50％之间、40％-75％之间、50％-80％之间或75％-90％之间。
5.4.3 将异源基因序列插入G基因中
G蛋白是偏肺病毒的跨膜蛋白。一具体实施方式将异源序列插入编码胞外域的G-ORF区域中，因而其表达在病毒被膜的表面。一种方法可将此异源序列插入抗原性位点内而无需删除任何病毒序列。另一种方法用异源序列替代G-ORF。可将这种构建物的表达产物用于抵御外来抗原的疫苗，这些产物实际上可克服重组病毒在该疫苗接种宿主中增殖的相关问题。只在抗原性位点含有取代的完整G分子可行使G(分子)功能，因而能构建活的病毒。因此，可培养该病毒而无需额外的辅助功能物。也可通过其它方法使病毒减毒以避免任何意外逃避的危险。
可制备其它杂交构建物在细胞表面表达蛋白质或使它们从细胞释放。
5.4.4 构建双顺反子RNA
可构建双顺反子mRNA以使从常规的末端起始位点内部启动病毒序列翻译和表达外源蛋白质编码序列。或者，可构建双顺反子mRNA序列，其中从常规的末端开放读框翻译此病毒序列，而外来序列从内部位点开始翻译。可利用某些内部核糖体进入位点(IRES)序列。所选择的IRES序列应足够短，从而不干扰MPV的包装限度。因此，这种双顺反子方法所选的IRES长度宜不超过500个核苷酸。在一具体实施方式中，IRES源自小RNA病毒，不包含任何其它小RNA病毒序列。具体IRES元件包括但不限于：哺乳动物BiP IRES和丙肝病毒IRES。
或者，可从含有起始位点和聚腺苷酸化位点的新内部转录单位表达外源蛋白。另一实施方式将外源基因插入MPV基因中，因而得到的表达产物是融合蛋白。
5.5 利用重组cDNA和RNA模板表达异源基因产物
在各种方法中可使用上述制备的病毒载体和重组模板在合适的宿主细胞中表达异源基因产物，或产生表达该异源基因产物的嵌合型病毒。在一个实施方式中，可用重组cDNA转染合适的宿主细胞，得到的RNA可指导异源基因产物高水平地表达。能提供高水平表达的宿主细胞系统包括能支持病毒功能的连续生长细胞系(continuous cell line)，例如分别用APV或MPV超感染的细胞系，经工程改造以补充APV或MPV功能的细胞系等。
在本发明的另一实施方式中，可用重组模板转染表达病毒聚合酶蛋白的细胞系以实现异源基因产物的表达。为此目的，可将表达聚合酶蛋白，例如L蛋白的转化细胞系用作合适的宿主细胞。可以类似地工程改造宿主细胞以提供其它病毒功能物或额外的功能物，例如G或N。
在另一实施方式中，辅助病毒可提供细胞所用的RNA聚合酶蛋白以实现异源基因产物的表达。在还有另一实施方式中，可用编码病毒蛋白，例如N、P、L和M2-1蛋白的载体转染细胞。
5.6 拯救重组病毒颗粒
为制备本发明的嵌合型和重组病毒，可用编码本发明重组或嵌合型病毒的基因组的正义或反义(minus sense)cDNA转染细胞以提供复制和拯救所需的病毒蛋白和功能物。或者，可在编码本发明重组病毒的DNA或RNA转染之前、期间或之后用辅助病毒转染细胞。可通过本领域已知的任何技术复制本发明的合成重组质粒DNA和RNA并拯救转变成传染性病毒颗粒，所述技术描述于，例如1992年11月24日授权的美国专利号5,166,057；1998年12月29日授权的美国专利号5,854,037；1996年2月20日公布的欧洲专利公布EP0702085A1；美国专利申请系列号09/152,845；1997年4月3日公布的国际专利公布PCT WO97/12032；1996年11月7日公布的WO96/34625；欧洲专利公布EP-A780475；1999年1月21日公布的WO 99/02657；1998年11月26日公布的WO 98/53078；1998年1月22日公布的WO 98/02530；1999年4月1日公布的WO 99/15672；1998年4月2日公布的WO 98/13501；1997年2月20日公布的WO 97/06270；和1997年6月25日公布的EPO 780 47SA1，这些文献各自全文纳入本文作为参考。
在本发明一实施方式中，可制备含负链病毒RNA的非编码区(前导序列和尾序列)的合成重组病毒RNA，这些非编码区对于病毒聚合酶的识别和产生成熟病毒体所需的包装信号至关重要。可采用许多不同的方法将反向遗传学方法应用于拯救负链RNA病毒。首先，从重组DNA模板合成重组RNA，在体外用纯化的病毒聚合酶复合物重建，从而形成可用于转染细胞的重组核糖核蛋白(RNP)。在另一种方法中，如果在体外或体内转录合成的RNA期间存在此病毒聚合酶蛋白，可实现更有效的转染。可用此方法从cDNA质粒转录合成的RNA，这些质粒可以在体外与编码聚合酶蛋白的cDNA质粒共同转录，或者在体内聚合酶蛋白存在下，即在瞬时或组成型表达聚合酶蛋白的细胞中转录。
在本文所述的其它方法中，可用能表达偏肺病毒聚合酶蛋白的宿主细胞系统(例如，病毒/宿主细胞表达系统；工程改造能表达聚合酶蛋白的转化细胞系等)复制传染性嵌合型或重组病毒，因而能复制和拯救传染性嵌合型或重组病毒。在此情况中，由于所表达的病毒聚合酶蛋白提供了该功能，无需使用辅助病毒。
按照本发明，可采用本领域技术人员已知的任何技术实现重组和嵌合型病毒的复制和拯救。一种方法包括先提供体外复制所需的病毒蛋白和功能物，再转染宿主细胞。在这种实施方式中，提供的病毒蛋白可以是以下形式：野生型病毒的、辅助病毒的、纯化的病毒蛋白或重组表达的病毒蛋白。可以在转录编码该嵌合型病毒的合成cDNA或RNA之前、期间或之后提供这些病毒蛋白。可用此整个混合物转染宿主细胞。在另一方法中，可在转录编码此嵌合型病毒的合成cDNA或RNA之前或期间提供复制所需的病毒蛋白和功能物。在这种实施方式中，提供的复制所需病毒蛋白和功能物是可通过感染或转染而引入宿主细胞的以下形式：野生型病毒、辅助病毒、病毒提取物，表达病毒蛋白的合成cDNA或RNA。这种感染/转染可以在引入编码此嵌合型病毒基因组的合成cDNA或RNA之前或同时。
在特别理想的方法中，经工程改造以表达所有病毒基因或本发明嵌合型或重组病毒(即，APV、MPV、MPV/APV或APV/MPV)的细胞可产生含有所需基因型的传染性病毒；因而无需选择系统。在理论上，可以用外源序列取代编码MPV的结构蛋白的任一ORF或任一ORF的一部分。然而，该综合体(equation)必需能增殖缺陷型病毒(因正常病毒基因产物丢失或改变而有缺陷)。现有许多方法可能克服该问题。在一种方法中，含有突变型蛋白的病毒能用构建为组成型表达该蛋白的野生型形式细胞系培养。通过此方法，这些细胞系可补充此病毒中的突变。可采用类似的技术构建能组成型表达任何MPV基因的转化细胞系。可利用所制备的这些细胞系表达此病毒蛋白来补充嵌合型或重组病毒的缺陷，从而增殖病毒。或者，可用某些天然的宿主系统来增殖这些嵌合型或重组病毒。
在还有另一实施方式中，作为遗传物质提供的复制所需病毒蛋白和功能物可以是合成的cDNA或RNA形式，因而它们可与编码嵌合型病毒的合成cDNA或RNA共同转录。在一特别理想的方法中，将表达嵌合型病毒和病毒聚合酶和/或病毒功能物的数个质粒共同转染入宿主细胞中。例如，可将编码基因组或反基因组APV、MPV、MPV/APV或APV/MPV RNA的质粒(含或不含一条或多条异源序列)与编码偏肺病毒聚合酶蛋白N、P、L或M2-1的质粒共同转染入宿主细胞。或者，可利用编码T7RNA聚合酶的修饰痘苗病毒Ankara(MVA)或联用MVA与编码聚合酶蛋白(N、P和L)的质粒来拯救本发明的重组病毒。例如，可将MVA-T7或禽痘-T7感染入Vero细胞、LLC-MK-2细胞、HEp-2细胞、LF 1043(HEL)细胞、tMK细胞、LLC-MK2、HUT292、FRHL-2(恒河猴)、FCL-1(绿猴)、WI-38(人)、MRC-5(人)细胞、293 T细胞、QT 6细胞、QT 35细胞和CEF细胞。用MVA-T7或禽痘-T7感染后，可将编码本发明重组病毒的全长反基因组或基因组cDNA与编码N、P、L和M2-1的表达质粒一起转染入细胞。或者，可采用质粒转染提供此聚合酶。然后收集细胞和细胞上清液，进行一轮冻融。然后可在有1-β-D-呋喃阿拉伯糖基胞嘧啶(arabinofuranosylcytosine)(ara C，一种痘苗病毒复制抑制剂)存在下用得到的细胞裂解液感染新鲜的单层Vero细胞以产生储备病毒。然后可收集这些平板的上清液和细胞，冻融一次，利用特定病毒的特异性抗血清免疫染色病毒噬斑来检验是否存在本发明重组病毒颗粒。
增殖嵌合型或重组病毒的另一种方法可包括与野生型病毒共同培养。简言之，取重组病毒，将该病毒与另一种野生型病毒共同感染细胞。野生型病毒应能弥补提供缺陷病毒所需的基因产物，并使野生型病毒和重组病毒均能生长。或者，可用辅助病毒支持该重组病毒增殖。
在另一种方法中，共同转染了重组病毒的细胞中复制合成模板而表达偏肺病毒聚合酶蛋白。事实上，可采用该方法拯救本发明的重组传染性病毒。为此目的，可用任何表达载体/宿主细胞系统表达偏肺病毒聚合酶，包括但不限于病毒表达载体(例如，痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒等)或表达聚合酶蛋白的细胞系(参见，例如Krystal等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2709-2713)。此外，感染能表达所有偏肺病毒蛋白的宿主细胞能产生传染性嵌合型病毒颗粒。应该注意，现已能构建重组病毒而不改变病毒存活力。然后在感受态细胞中培育这些改变的病毒，无需辅助病毒即可复制。
为产生本发明方法所用的重组病毒，必须转录编码病毒基因组的遗传物质(转录步骤)。可以在体外(宿主细胞外)或体内(宿主细胞内)进行该步骤。可从该遗传物质转录病毒基因组以产生该病毒基因组的有义拷贝(反基因组拷贝)或该病毒基因组的反义拷贝(基因组拷贝)。下一步骤需要复制该病毒基因组并将复制的基因组包装入病毒颗粒(复制和包装步骤)。该步骤在经工程改造而能提供病毒复制和包装所需的足够水平的病毒聚合酶和结构蛋白的宿主细胞胞内进行。
体外进行转录步骤，然后进行病毒基因组的胞内复制和包装。体内进行转录步骤时，可在表达编码病毒基因组的病毒遗传物质之前、同时或之后转录该病毒基因组，所述病毒基因组可从各种来源，采用本领域技术人员已知的各种方法获得或产生。可分离病毒本身的遗传物质。例如，可分离完整病毒的病毒RNA基因组和聚合酶蛋白的复合物、核糖核蛋白复合物(RNP)。然后可剥去与病毒RNA基因组相结合的蛋白，例如病毒RNA聚合酶和核蛋白。
可采用标准重组技术产生编码该病毒基因组的遗传物质。该遗传物质可编码全长病毒基因组或其一部分。或者，该遗传物质可编码侧接有病毒基因组前导序列和/或尾序列的异源序列。可采用本领域已知的技术从较小的PCR片段装配全长病毒基因组。图10显示了hMPV不同分离物的限制性图谱。可利用其限制性位点装配全长构建物。在某些实施方式中，设计的PCR引物应使PCR反应所得的片段在接近其5’端含有一限制性位点，在接近其3’端含有一限制性位点。然后用各自的限制性酶消化该PCR产物，再连接毗邻的PCR片段。
为复制和包装病毒基因组，前导序列和尾序列保留的病毒聚合酶识别所需信号至关重要。可优化或改变病毒RNA基因组的前导序列和尾序列以改进和提高病毒的复制和拯救。或者，可修饰前导序列和尾序列以降低病毒复制和包装的效率，从而得到具有减毒表型的被拯救病毒。不同前导序列和尾序列的例子包括但不限于副黏病毒的前导序列和尾序列。在本发明一具体实施方式中，所述前导序列和尾序列是野生型或突变型hMPV的前导序列和尾序列。在本发明另一实施方式中，所述前导序列和尾序列是PIV、APV或RSV的前导序列和尾序列。在本发明还有另一实施方式中，前导序列和尾序列是不同病毒来源的前导序列和尾序列组合。例如(不表示限制可能的组合)，所述前导序列和尾序列可以是hMPV、PIV、APV、RSV或任何其它副黏病毒的任何前导序列和尾序列的组合。对前导序列和尾序列进行修饰的例子包括改变与病毒启动子的间距(spacing)；改变序列，例如改变G残基的数目(通常是0-3)和利用核酶序列(包括丁型肝炎病毒(HDV)核酶序列、锤头核酶序列或它们保留核酶催化活性的片段)与体外产生的失控RNA(run-off RNA)所用的限制性酶来限制其5’或3’端。
在另一实施方式中，如果该病毒基因组的长度是六聚物，则可以提高病毒复制和拯救的效率。为确保病毒基因组的长度合适，可用核酶序列(包括丁型肝炎病毒(HDV)核酶序列、锤头核酶序列或它们保留核酶催化活性的片段)与体外产生的失控RNA所用的限制性酶来限制其5’或3’端。
为编码待转录病毒基因组的遗传物质，可工程改造此遗传物质，将其置于合适转录调控序列，例如聚合酶识别的启动子序列的控制下。优选的实施方式是T7、Sp6或T3聚合酶识别启动子序列。还有另一实施方式是细胞的DNA依赖性RNA聚合酶，例如RNA聚合酶I(Pol I)或RNA聚合酶II(Pol II)识别的启动子序列。可将编码所述病毒基因组的遗传物质置于这种转录调控序列的控制下，因而能转录产生该病毒基因组的正链或负链拷贝。将编码所述病毒基因组的遗传物质重组改造与表达载体中的转录调控序列操作性相连，所述表达载体例如是质粒载体，如含pol II启动子的质粒(如CMV的立即早期启动子)，含有T7启动子的质粒，或病毒载体，如痘病毒载体，包括痘苗载体、MVA-T7和禽痘载体。
可修饰编码病毒基因组的遗传物质以提高所选聚合酶的表达，例如改变前导序列或尾序列上游G残基的数目(通常是0-3)以优化T7启动子驱动的表达。
在允许病毒复制和包装的宿主细胞胞内进行所述病毒基因组的复制和包装。有许多方法改造宿主细胞以提供复制和包装所需的足够水平病毒聚合酶和结构蛋白，包括用合适的辅助病毒感染宿主细胞，工程改造宿主细胞以稳定或组成型地表达该病毒聚合酶和结构蛋白，或者工程改造宿主细胞以瞬时或可诱导地表达所述病毒聚合酶和结构蛋白。
MPV病毒复制和包装所需的功能蛋白质包括但不限于聚合酶蛋白P、N、L和M2-1。
在一实施方式中，表达的蛋白质是天然或野生型MPV蛋白。在另一实施方式中，可采用标准重组技术修饰表达的蛋白质以提高它们的表达水平和/或聚合酶活性。或者，可表达保留了聚合酶活性的聚合酶蛋白的片段、衍生物、类似物或截短形式。在还有另一实施方式中，可表达其它肺病毒，例如APV或任何其它副黏病毒的相似聚合酶蛋白。此外，可通过表达一种MPV毒株的蛋白与另一种毒株的基因组来产生减毒的病毒。例如，可以表达一种MPV毒株的聚合酶蛋白与另一种毒株的基因组来产生减毒表型。
可用辅助病毒提供病毒聚合酶蛋白。本发明所用的辅助病毒包括天然表达聚合酶病毒蛋白的那些辅助病毒，例如MPV或APV。或者，可利用已经重组改造的辅助病毒以提供聚合酶病毒蛋白。
或者，可通过表达载体提供此病毒聚合酶蛋白。工程改造编码此病毒聚合酶蛋白的序列，将其置于聚合酶识别的合适转录调控序列，例如启动子序列的控制下。优选的实施方式是T7、Sp6或T3聚合酶识别的启动子序列。还有另一实施方式是PolI或Pol II聚合酶识别的启动子序列。或者，是病毒聚合酶，例如CMV识别的启动子序列。将编码所述病毒聚合酶蛋白的序列重组改造与表达载体中的转录调控序列操作性相连，所述表达载体例如是质粒载体，如CMV驱动的质粒、T7驱动的质粒，或病毒载体，如痘病毒载体，包括痘苗载体、MVA-T7和禽痘载体。
为实现有效的病毒复制和包装，优选高水平地表达该聚合酶蛋白。可将编码副黏病毒蛋白的100-200ng L/pCITE、200-400ng N/pCITE、200-400ng P/pCITE和100-200ng M2-1/pCITE质粒与2-4ug编码全长病毒cDNA的质粒一起转染入受MVA-T7感染的细胞来获得这种高水平。另一实施方式使用0.1-2.0μg的pSH25(表达CAT)、0.1-3.0μg的pRF542(表达T7聚合酶)、0.1-0.8μg含N cDNA插入物的pCITE载体和0.1-1.0μg含P、L和M2-1 cDNA插入物的三种pCITE载体中的任一种。或者，可用纯化的核糖核蛋白转染细胞将一种或多种聚合酶和结构蛋白与所述遗传物质一起引入细胞。优选允许MPV病毒复制和包装的宿主细胞。优选的宿主细胞的例子包括但不限于：293T、Vero、tMK和BHK。宿主细胞的其它例子包括但不限于：LLC-MK-2细胞、Hep-2细胞、LF 1043(HEL)细胞、LLC-MK2、HUT292、FRHL-2(恒河猴)、FCL-1(绿猴)、WI-38(人)、MRC-5(人)细胞、QT 6细胞、QT 35细胞和CEF细胞。
在本发明的其它实施方式中，可采用许多方法处理宿主细胞以提高转染和/或感染效率、蛋白质表达水平，优化病毒的复制和包装。这种处理方法包括但不限于：超声处理、冻融和热休克(heat shock)。此外，可采用本领域技术人员已知的标准技术优化转染和/或感染方案，包括但不限于：DEAE-葡聚糖-介导的转染、磷酸钙沉淀、脂质转染试剂处理、脂质体介导的转染和电穿孔。技术人员也熟悉优化转染/感染方案所用的标准技术。例如，而不限于现有的技术，可用的方法包括当用病毒提供所需蛋白时，操纵相对于转染的感染时间，操纵不同质粒的转染时间和改变病毒与转染质粒的相对含量。
在另一实施方式中，本发明涉及利用除所拯救病毒以外的病毒的聚合酶从cDNA拯救或产生活病毒。在某些实施方式中，使用许多聚合酶，包括但不限于种间和种内聚合酶从cDNA拯救hMPV。在某些实施方式中，用能表达hMPV复制所需最小复制单位的宿主细胞拯救hMPV。例如，可用许多聚合酶，包括但不限于RSV、APV、MPV或PIV的聚合酶从cDNA拯救hMPV。在本发明一具体实施方式中，使用RNA病毒的聚合酶拯救hMPV。在本发明一更具体的实施方式中，用负链RNA病毒的聚合酶拯救hMPV。在本发明甚至更具体的实施方式中，使用RSV聚合酶拯救hMPV。在本发明另一实施方式中，使用APV聚合酶拯救hMPV。在本发明还有另一实施方式中，使用MPV聚合酶拯救hMPV。在本发明另一实施方式中，使用PIV聚合酶拯救hMPV。
在本发明更确定的实施方式中，使用hMPV聚合酶蛋白的复合物从cDNA拯救hMPV。例如，可利用含L、P、N和M2-1蛋白的聚合酶复合物拯救hMPV微小复制子(minireplicon)。在本发明另一实施方式中，此聚合酶复合物含L、P和N蛋白。在本发明还有另一实施方式中，可用含其它病毒(例如但不限于RSV、PIV和APV)的聚合酶蛋白的聚合酶复合物从cDNA拯救hMPV。具体地说，可用含RSV、PIV、APV、MPV的L、P、N和M2-1蛋白或它们的任何组合的聚合酶复合物从cDNA拯救hMPV。在本发明还有另一实施方式中，用于从cDNA拯救hMPV的聚合酶复合物可含RSV、PIV、APV、MPV的L、P和N蛋白或它们的任何组合。在本发明的另一实施方式中，可利用各种病毒的不同聚合酶组成此聚合酶复合物。在这种实施方式中，用于拯救hMPV的聚合酶可由RSV、PIV、APV或MPV聚合酶的不同组分构成。例如(不表示限制构成此复合物的可能组合)，RSV、APV、PIV或MPV的N基因编码N蛋白，而RSV、APV、PIV或MPV的L基因编码L蛋白，RSV、APV、PIV或MPV的P基因编码P蛋白。本领域技术人员能确定可用于组成从cDNA拯救hMPV所需聚合酶复合物的可能组合。
某些实施方式优化病毒增殖条件以产生可靠且产量高的细胞培养物(这有利于，例如制备本发明的候选病毒疫苗物)。可鉴定关键参数，首先用小规模实验来测定可放大性、可靠性和重现性来优化生产工艺，然后使该工艺适应于病毒的大规模生产。在某些实施方式中，采用本发明方法增殖的病毒是hMPV。在某些实施方式中，采用本发明方法增殖的病毒是重组或嵌合型hMPV。在某些实施方式中，采用本发明方法增殖的病毒是以下病毒科之一的病毒：腺病毒科、沙粒病毒科、星状病毒科、杆状病毒科、本扬病毒科、杯状病毒科、花椰菜花叶病毒、冠状病毒科、囊病毒科、纤丝病毒科、黄病毒科、肝DNA病毒科、疱疹病毒科、减毒病毒科、悬钩子病毒属、丝形病毒科、虹彩病毒科、光滑病毒科、脂毛病毒科、黄症病毒属、玉米退绿斑驳病毒属(Machlomovirus)、玉米雷亚多非纳病毒属、微病毒科、肌病毒科、坏死病毒属、罗达病毒科、正黏病毒科、乳多空病毒科、副黏病毒科、双组分双链RNA球状真菌病毒属、细小病毒科、藻DNA病毒科、小RNA病毒科、原生病毒科、短尾病毒科、多DNA病毒科、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、痘病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科、欧防风黄点病毒科、长尾噬菌体科、南方菜豆花叶病毒属、盖病毒科、纤细病毒属、四病毒科、烟草花叶病毒、烟草脆裂病毒、披膜病毒科、蕃茄丛矮病毒科、单组分双链RNA球状真菌病毒属、苹果退绿叶斑病毒(Trichovirus)、单分子负链RNA病毒目。在某些实施方式中，采用本发明方法增殖的病毒是RNA病毒。在某些实施方式中，所述病毒不是疱疹病毒科的病毒。在某些实施方式中，所述病毒不是HSV。
与标准细胞培养温度相比，在某些实施方式中，用感兴趣的病毒或病毒构建物感染的细胞感染后在较低培育温度下培育。在一具体实施方式中，在33℃或约33℃(例如，33±1℃)培育用感兴趣的病毒构建物感染的细胞培养物。在某些实施方式中，感染后培育温度是约25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃。
在某些实施方式中，通过以下步骤增殖病毒：病毒感染前将细胞在细胞生长的优化温度下培育，用病毒感染细胞后(即感染后)，将温度调节到较低温度。在某些实施方式中，所述温度调节至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃或至少12℃。在某些实施方式中，所述温度调节最多1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃或最多12℃。在一具体实施方式中，所述温度调节4℃。
在某些实施方式中，感兴趣的病毒或病毒构建物感染前，用含血清的培养基培养细胞，用病毒或病毒构建物感染后用不含血清的培养基收集细胞。不用血清培养受感染细胞的更多细节见名为“回收无血清培养基中只含质粒的病毒”的章节。在一具体实施方式中，所述血清是胎牛血清，其浓度为培养液体积的5％、培养液体积的2％或培养液体积的0.5％。
在某些实施方式中，通过在无血清存在时培育受病毒感染的细胞来增殖病毒。在某些实施方式中，用含血清低于5％、低于2.5％、低于1％、低于0.1％、低于0.01％或低于0.001％的培养基培育受病毒感染的细胞来增殖病毒。
在某些实施方式中，病毒感染前用含血清培养基培育细胞。在某些实施方式中，病毒感染细胞后，在无血清存在下培育细胞。在其它实施方式中，首先用含血清培养基培育细胞，然后将细胞转移入无血清的培养基，再用病毒感染细胞，接着在无病毒存在下培育。
在某些实施方式中，通过去除含血清培养基并加入无血清培养基而将细胞从含血清培养基转移至无血清培养基中。在其它实施方式中，离心细胞，除去含血清培养基，加入无血清培养基。在某些实施方式中，用无血清培养基洗涤细胞以确保细胞一旦感染了病毒即在无血清存在下培育。在某些更具体的实施方式中，用无血清培养基洗涤细胞至少一次、两次、三次、四次、五次或至少十次。
在还有其它实施方式中，用病毒或病毒构建物感染前，在细胞生长的优化温度下用含血清培养基培养细胞，用感兴趣的病毒构建物感染细胞后，在较低温度(与相应的病毒或病毒载体的标准培育温度相比)下培育细胞培养物。在一具体实施方式中，用感兴趣的病毒构建物感染细胞前，在37℃用含血清培养基培养细胞，用感兴趣的病毒构建物感染细胞后，在33℃或约33℃(例如，33±1℃)培育细胞培养物。
在其它实施方式中，用病毒或病毒构建物感染前，在细胞生长的优化温度下用含血清培养基培养细胞，用感兴趣的病毒构建物感染细胞后，在较低温度(与相应的病毒或病毒载体的标准培育温度相比)无血清存在下培育细胞培养物。在一具体实施方式中，用感兴趣的病毒构建物感染细胞前，在37℃用含血清培养基培养细胞，用感兴趣的病毒构建物感染细胞后，在33℃或约33℃(例如，33±1℃)无血清存在下培育细胞培养物。
可利用本发明的病毒构建物和方法商品化生产病毒，例如用于疫苗生产。对于疫苗的商品化生产，优选该疫苗宜只含有完全不含传染性病毒或完全未污染病毒核酸的灭活病毒或病毒蛋白，或者宜含有不能回复毒力的减毒活疫苗。也应避免在生产期间引入意外物质而污染疫苗。可采用本领域已知的大规模生产病毒或病毒蛋白的方法来商品化生产本发明疫苗。在一实施方式中，对于商品化生产本发明疫苗，用生物反应器或发酵罐培养细胞。可用容积从1升以下到100升以上的生物反应器，例如Cyto3生物反应器(Osmonics，Minnetonka，MN)；NBS生物反应器(NewBrunswick Scientific，Edison，N.J.)；和B.Braun Biotech International(B.BraunBiotech，Melsungen，德国)的实验室与商业规模的生物反应器。在另一实施方式中，在商品化生产此病毒之前进行小规模工艺优化研究，选择优化条件并用于病毒的商品化生产。
在无血清培养基中拯救质粒
在本发明的某些实施方式中，可不用辅助病毒回收病毒。更具体地说，可将编码病毒基因组的质粒和编码复制和拯救所需病毒蛋白的质粒引入细胞来回收病毒。在某些实施方式中，用无血清培养基培养和维持细胞。在某些实施方式中，通过电穿孔将质粒引入细胞。在一具体实施方式中，通过电穿孔将在T7启动子控制下的编码该病毒的反基因组cDNA的质粒，在T7启动子控制下的编码T7RNA聚合酶的质粒和分别编码N蛋白、P蛋白和L蛋白的质粒引入SF Vero细胞。Vero细胞得自ATCC，按照以下步骤(Mike Berry实验室开发)使之适应于在无血清培养基中生长。
1.在T-25培养瓶P121中用DMEM+5％ v/v FBS液融化ATCC CCL-81小管；
2.用DMEM+5％ v/v FBS P126扩增5代；
3.将FBS培养的细胞直接转移至T-225瓶的OptiPRO(InvitrogenCorporation)中；
4.用OptiPRO扩增7代；
5.冷冻第133-7代前原始细胞库储液(Pre-Master Cell Bank Stock)；
6.用OptiPRO扩增4代；
7.冷冻第137代原始细胞库储液(Master Cell Bank Stock)；
8.用OptiPRO扩增4代；
9.冷冻第141代工作细胞库储液(Working Cell Bank Stock)；和
10.融化和扩增以进行电穿孔和病毒扩增。
拯救病毒颗粒的方法描述于名为“拯救重组病毒颗粒”的章节。
在某些实施方式中，用于病毒拯救的细胞是能在不用加入动物和人的组分下生长和/或维持的细胞。在某些实施方式中，用于病毒拯救的细胞是适应于在无血清存在下生长的细胞。在一具体实施方式中，用SF Vero细胞拯救病毒。在某些实施方式中，用补加了4mM L-谷氨酰胺的OptiPRO SFM(Invitrogen Corporation)培养和/或维持细胞。在某些实施方式中，用补加了血清的培养基培养细胞，但对于拯救病毒颗粒，将此细胞转移至无血清培养基中。在一具体实施方式中，用无血清培养基洗涤细胞以确保在无血清环境拯救该病毒。
通过技术人员已知可用于细胞的任何方法将质粒引入细胞，例如通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖转染、电穿孔或脂质体介导的转染(参见Short Protocols inMolecular Biology(《分子生物学简单方法》)的第9章，Ausubel等(编)，JohnWiley & Sons，Inc.，1999)。在具体实施方式中，采用电穿孔将质粒DNA引入细胞。SF Vero细胞耐受脂质转染。为选出转染了所需质粒的细胞，这些质粒也可携带某些标记。这种标记包括但不限于：对某些抗生素(例如，卡那霉素、杀稻瘟菌素、氨苄西林、潮霉素B、嘌呤霉素和ZeocinTM)的抗性、对不含标记时缺乏自养特性的细胞赋予该特性，或者标记也可以是细胞生长所需的基因，但该基因在质粒所引入的细胞中已突变。
病毒基因组和/或病毒基因的转录在启动子的转录控制下。因此，编码此病毒基因组或病毒蛋白的序列应与启动子序列操作性相连。本发明方法可利用技术人员已知的任何启动子/RNA聚合酶系统。在某些实施方式中，所述启动子可以是通过细胞的内源性RNA聚合酶转录的启动子，例如细胞的DNA依赖性RNA聚合酶，如RNA聚合酶I(Pol I)或RNA聚合酶II(Pol II)识别的启动子序列。在某些实施方式中，所述启动子可以是可诱导性启动子。在某些实施方式中，所述启动子可以是通过细胞的非内源性RNA聚合酶转录的启动子。在某些更具体的实施方式中，所述启动子是T3启动子、T7启动子、SP6启动子或CMV启动子。依照所用启动子的类型，也可将编码识别该启动子的RNA聚合酶的质粒引入细胞以提供相应的RNA聚合酶。在具体的实施方式中，所述RNA聚合酶是T3 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或CMV RNA聚合酶。在一具体实施方式中，在T7启动子控制下转录此病毒基因和病毒基因组，引入编码T7 RNA聚合酶的质粒以提供T7 RNA聚合酶。能在所用细胞类型中起作用的任何启动子系统均可控制所述聚合酶的转录。一具体实施方式利用CMV启动子。
病毒基因组可以是正取向(plus orientation)或负取向(minus orientation)。因此，可从遗传物质转录病毒基因组产生病毒基因组的有义拷贝(反基因组拷贝)或病毒基因组的反义拷贝(基因组拷贝)。在某些实施方式中，所述病毒基因组是本发明的重组、嵌合型和/或减毒病毒。在某些实施方式中，如果病毒基因组的长度是六聚物，则可以提高病毒复制和拯救的效率。为确保病毒基因组的长度合适，可用核酶序列，包括丁型肝炎病毒(HDV)核酶序列、锤头核酶序列或它们保留核酶催化活性的片段来限制其5’或3’端。
在某些实施方式中，复制和拯救所需的病毒蛋白包括N、P和L基因(的蛋白)。在某些更具体的实施方式中，复制和拯救所需的病毒蛋白包括N、P、M2-1和L基因(的蛋白)。
5.7 重组病毒的减毒
可进一步遗传改造本发明重组病毒使其成为减毒表型。具体地说，本发明重组病毒在给予此病毒疫苗的对象中显示为减毒表型。可通过技术人员已知的任何方法实现减毒。不想局限于理论，可通过，例如使用在预期宿主中天然复制不佳的病毒(例如，在人中使用APV)，或与该病毒的野生型毒株相比，通过降低病毒基因组复制的能力，降低病毒感染宿主细胞的能力，降低病毒蛋白装配成传染性病毒颗粒的能力来获得重组病毒的减毒表型。可采用微小基因组试验(minigenome assay)(参见章节5.8)检测病毒的某些序列，例如前导序列和尾序列的存活力。
可采用技术人员已知的任何方法检测本发明重组病毒的减毒表型(参见，例如章节5.8)。例如，可检测候选病毒感染宿主细胞的能力或在细胞培养系统中复制的速率。在某些实施方式中，当改变的基因是N、P、L、M2、F、G、M2-1、M2-2基因或它们的组合时，可使用小基因组系统检验减毒病毒。在某些实施方式中，利用不同温度的生长曲线检验病毒的减毒表型。例如，减毒病毒能在35℃但不能在39℃或40℃生长。在某些实施方式中，可用不同细胞系评估病毒的减毒表型。例如，减毒病毒只能在猴细胞系中而不能在人细胞系中生长，或者减毒病毒在不同细胞系中可达到的病毒滴度不同。在某些实施方式中，利用病毒在小动物模型(包括但不限于仓鼠、棉鼠、小鼠和豚鼠)的呼吸道中的复制(情况)评估病毒的减毒表型。在其它实施方式中，利用病毒诱导的免疫应答，包括但不限于抗体滴度(例如，通过噬斑减少中和试验或ELISA来测试)评估病毒的减毒表型。在一具体实施方式中，以低剂量进行噬斑减少中和试验或ELISA。在某些实施方式中，可检验重组病毒在动物模型中引发病理学症状的能力。病毒在动物模型系统中引发病理学症状的能力降低表明其为减毒表型。在一具体实施方式中，在猴子模型中利用粘液产量指标，检验候选病毒的鼻部感染(情况)。
可使本发明病毒减毒，从而削弱该病毒的一种或多种功能特征。在某些实施方式中，与产生该减毒病毒的病毒的野生型毒株作比较来检测减毒(情况)。在其它实施方式中，通过比较减毒病毒在不同宿主系统中的生长来测定减毒(情况)。因此，对于非限制性例子，如果与APV在人宿主中的生长相比于在禽类宿主中生长减缓时，APV可称为减毒的。
在某些实施方式中，本发明的减毒病毒能感染宿主，能在宿主中复制从而能产生传染性病毒颗粒。然而，与野生型毒株相比，减毒毒株生长达到的滴度较低或生长较慢。可采用技术人员已知的任何技术测定减毒病毒的生长曲线并将其与野生型病毒的生长曲线比较。对于示范性方法可参见下文的实施例章节。在一具体实施方式中，减毒病毒在如实施例22所述的条件下在Vero细胞中生长达到的滴度小于105pfu/ml、小于104pfu/ml、小于103pfu/ml或小于102pfu/ml。
在某些实施方式中，本发明减毒的病毒(例如，嵌合型哺乳动物MPV)不能在人细胞中复制，而野生型病毒(例如，野生型哺乳动物MPV)可以。然而，该减毒的病毒在缺乏干扰素的细胞系，例如Vero细胞中复制良好。
在其它实施方式中，本发明的减毒病毒能感染宿主、能在宿主中复制、能将本发明病毒的蛋白质插入胞质膜中，但该减毒病毒不能导致宿主产生新的传染性病毒颗粒。在某些实施方式中，该减毒病毒感染宿主、在宿主中复制和将病毒蛋白插入宿主的胞质膜中的效率与野生型哺乳动物病毒相同。在其它实施方式中，与野生型病毒相比，减毒病毒将病毒蛋白插入宿主细胞的胞质膜中的能力降低。在某些实施方式中，与野生型病毒相比，减毒的哺乳动物病毒在宿主中复制的能力降低。可采用技术人员已知的任何技术测定病毒是否能感染哺乳动物细胞、在宿主中复制和将病毒蛋白插入宿主的胞质膜中。示范性方法见章节5.8。
在某些实施方式中，本发明的减毒病毒能感染宿主。然而，与野生型哺乳动物MPV相反，该减毒的哺乳动物MPV不能在宿主中复制。在一具体实施方式中，该减毒的哺乳动物病毒能感染宿主，能导致宿主将病毒蛋白插入其胞质膜中，但该减毒病毒不能在宿主中复制。可采用技术人员已知的任何方法检验减毒的哺乳动物MPV是否已感染哺乳动物细胞、是否已导致宿主将病毒蛋白插入其胞质膜中。
在某些实施方式中，与野生型病毒感染宿主相比，该减毒的哺乳动物病毒感染同一宿主的能力降低。可采用技术人员已知的任何技术测定病毒是否能感染宿主。示范性方法见章节5.8。
在某些实施方式中，将突变(例如，错义突变)引入病毒基因组以产生具有减毒表型的病毒。可将突变(例如，错义突变)引入该重组病毒的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因中。突变可以是添加、取代、缺失或它们的组合。在具体的实施方式中，在N、P、L、F、G、M2-1、M2-2或M2蛋白中引入单氨基酸缺失突变，采用微小基因组试验系统(mini-genomeassay system)筛选具有功能非突变，并评估其在病毒中的预期功能。在更具体的实施方式中，所述错义突变是冷敏感突变。在其它实施方式中，所述错义突变是热敏感突变。一个实施方式除去了该病毒P蛋白的主要磷酸化位点。在另一实施方式中，将一个或多个突变引入该病毒的L-基因中产生温度敏感性毒株。在还有另一实施方式中，使F基因的切割位点发生突变使得不能发生切割或效率非常低。在某些更具体的实施方式中，使hMPV F蛋白的氨基酸位置99-102的氨基酸序列RQSR的基序发生突变。突变可以是(但不限于)一个或多个氨基酸缺失、一个或多个氨基酸添加、一个或多个氨基酸取代(保守性或非保守性)或它们的组合。在hMPV的一些毒株中，所述切割位点是RQPR(参见实施例“P101S”)。在某些实施方式中，使切割位点的氨基酸序列RQPR发生突变。在更具体的实施方式中，使hMPVF蛋白的切割位点发生突变而降低hMPV的感染力。在某些实施方式中，hMPV感染力降低的因数至少是5、10、50、100、500、103、5×103、104、5×104、105、5×105或至少106。在某些实施方式中，hMPV感染力降低的因数最多是5、10、50、100、500、103、5×103、104、5×104、105、5×105或最多106。
在其它实施方式中，在该重组病毒的基因组中引入缺失。在更具体的实施方式中，可在该重组病毒中引入N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因缺失。在具体的实施方式中，本发明重组病毒缺失M2-基因。在其它具体实施方式中，本发明重组病毒缺失SH-基因。在还有另一具体实施方式中，M2-基因和SH-基因均缺失。
某些实施方式改变重组病毒的基因间区域。一个实施方式改变基因间区域的长度。在另一实施方式中，此基因间区域从病毒基因组的5’改组到3’端。
其它实施方式改变重组病毒的一个或多个基因在基因组中的位置。在一个实施方式中，F或G基因移到基因组的3’端。在另一实施方式中，将N基因移到基因组的5’端。
某些实施方式用不同种(例如，RSV、APV、PIV3或小鼠肺病毒)、不同亚群或不同变体病毒的同类基因替换野生型病毒的基因而实现该病毒的减毒。在示范性实施方式中，分别用APV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因替换哺乳动物MPV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因。在其它示范性实施方式中，分别用哺乳动物MPV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因替换APV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因。在一优选的实施方式中，用不同种病毒的基因替换一个或多个聚合酶相关基因(例如，N、P、L或M2)来实现病毒的减毒。
在某些实施方式中，用源自不同种病毒的相应蛋白的结构域替换野生型病毒蛋白的一个或多个特定结构域来实现该病毒的减毒。在一示范性实施方式中，用哺乳动物MPV F蛋白的胞外域替换APV F蛋白的胞外域。在一优选的实施方式中，用源自不同种病毒的相应蛋白的结构域替换L、N或P蛋白的一个或多个特定结构域。某些其它实施方式通过删除野生型病毒蛋白的一个或多个特定结构域实现该病毒的减毒。一具体实施方式删除了F-蛋白的跨膜区。
在本发明的某些实施方式中，可修饰本发明重组病毒的前导序列和/或尾序列以获得减毒表型。在某些更具体的实施方式中，与野生型病毒相比，将所述前导序列和/或尾序列的长度减短至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸或至少6个核苷酸。在某些更具体的其它实施方式中，使该重组病毒的前导序列和/或尾序列发生突变。在一具体实施方式中，前导序列和尾序列彼此100％互补。在其它实施方式中，前导序列和尾序列有1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸或10个核苷酸彼此不互补，而其余核苷酸彼此互补。在某些实施方式中，不互补的核苷酸彼此相同。在某些实施方式中，不互补的核苷酸彼此不同。在其它实施方式中，如果尾序列中不互补的核苷酸是嘌呤，则前导序列中的相应核苷酸也是嘌呤。在其它实施方式中，如果尾序列中不互补的核苷酸是嘧啶，则前导序列中相应的核苷酸也是嘌呤。在本发明的某些实施方式中，可用以下序列替换本发明重组病毒的前导序列和/或尾序列：另一病毒的前导序列和/或尾序列，例如RSV、APV、PIV3、小鼠肺病毒的引导序列和/或尾序列，或者与产生该重组病毒蛋白质编码部分的人偏肺病毒不同亚群或变体的人偏肺病毒的前导序列和/或尾序列。
使用减毒的活疫苗也必须考虑安全性。疫苗必须不会致病。本发明可采用本领域已知技术制备安全疫苗。除了减毒技术外，可采用其它技术。一个非限制性例子是利用不能掺入病毒体膜中的可溶性异源基因。例如，可利用可溶性RSV F基因的单拷贝，即缺乏跨膜区和胞质区的RSV基因形式。由于它不能掺入病毒体膜中，预计不会改变该病毒的嗜性。
可采用各种试验检验疫苗的安全性。参见下文的章节5.8。具体地说，可采用蔗糖梯度和中和试验来检验安全性。可采用蔗糖梯度试验测定异源蛋白质是否插入病毒体中。如果该异源蛋白插入到病毒体中，则应检验该病毒体是否能导致症状，即使亲代毒株不导致症状。不想局限于理论，如果该异源蛋白掺入病毒体中，该病毒可能获得新的致病性能。
某些实施方式删除了hMPV基因组的一个或多个基因以产生减毒病毒。更具体的实施方式中删除了M2-2 ORF、M2-1 ORF、M2基因、SH基因和/或G2基因。
在其它实施方式中，将少量单氨基酸缺失引入参与病毒复制的基因中以产生减毒病毒。在更具体的实施方式中，将少量单氨基酸缺失引入N、L或P基因中。在某些更具体的实施方式中，重组hMPV的L基因(编码的蛋白)中发生一个或多个以下氨基酸突变，从而产生减毒病毒：氨基酸位置456的Phe、氨基酸位置749的Glu、氨基酸位置1246的Tyr、氨基酸位置1094的Met和氨基酸位置746的Lys。突变可以是，例如氨基酸缺失或取代。氨基酸取代可以是保守性氨基酸取代或非保守性氨基酸取代。保守性氨基酸替换的示范性例子是能维持这些氨基酸侧链的结构和/或功能特性的氨基酸取代，例如芳族氨基酸取代另一芳族氨基酸、酸性氨基酸取代另一酸性氨基酸、碱性氨基酸取代另一碱性氨基酸和脂族氨基酸取代另一脂族氨基酸。相反，非保守性氨基酸替换是不能维持这些氨基酸侧链的结构和/或功能特性的氨基酸取代，例如芳族氨基酸取代碱性、酸性或脂族氨基酸，酸性氨基酸取代芳族、碱性或脂族氨基酸，碱性氨基酸取代酸性、芳族或脂族氨基酸和脂族氨基酸取代芳族、酸性或碱性氨基酸。在甚至更具体的实施方式中，Leu替代氨基酸位置456的Phe。
在某些实施方式中，取代一个核酸以编码氨基酸更换。在其它实施方式中，取代两个或三个核酸以编码一个氨基酸更换。优选取代两个或三个核酸以降低回复成野生型蛋白质序列的风险。
在其它实施方式中，将少量单氨基酸缺失引入参与病毒装配的基因中以产生减毒的病毒。在更具体的实施方式中，将少量单氨基酸缺失引入M基因或M2基因中。在优选的实施方式中，M基因发生突变。
在其它实施方式中，病毒基因组中的基因顺序与野生型病毒的基因顺序相比发生改变，从而产生了减毒的病毒。在一更具体的实施方式中，F、SH和/或G基因移到病毒基因组的3’端。在另一实施方式中，N基因移到病毒基因组的5’端。
在其它实施方式中，一个或多个基因起始位点(基因起始位点的位置参见，例如表8)发生突变，或者用另一病毒(例如RSV、PIV3、APV或小鼠肺病毒)或与产生该重组病毒的蛋白质编码部分的人偏肺病毒不同亚群或变体的人偏肺病毒的相似基因起始位点取代。在更具体的实施方式中，使N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和/或L-基因的基因起始位点发生突变，或用另一病毒(例如RSV、PIV3、APV或小鼠肺病毒)或与产生该重组病毒的蛋白质编码部分的人偏肺病毒不同亚群或变体的人偏肺病毒的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因分别取代。
5.7.1 通过取代病毒基因的减毒
本发明的某些实施方式通过用不同病毒、不同毒株或不同病毒分离物的相类似基因替代病毒的一个或多个基因来实现减毒。在某些实施方式中，用另一种副黏病毒的一个或多个同类基因取代偏肺病毒，例如哺乳动物偏肺病毒(如hMPV或APV)的一个或多个基因。在一更具体的实施方式中，用另一病毒种类、毒株或分离物的相似基因替代哺乳动物偏肺病毒，例如hMPV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、M2-1 ORF、M2-2 ORF、SH-基因、G-基因或L-基因或这些基因中两个或多个的任何组合，其中所述其它病毒种类可以是但不限于另一种哺乳动物偏肺病毒、APV或RSV。
在更具体的实施方式中，用人偏肺病毒的另一分离物的一个或多个相似基因替代人偏肺病毒的一个或多个基因。例如，用不同分离物，如NL/1/99(99-1)、NL/1/00(00-1)、NL/17/00或NL/1/94的相似基因或基因组合(即N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、M2-1 ORF、M2-2 ORF、SH-基因、G-基因或L-基因)替代分离物NL/1/99(99-1)、NL/1/00(00-1)、NL/17/00或NL/1/94的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、M2-1 ORF、M2-2 ORF、SH-基因、G-基因或L-基因或这些基因中两个或多个的任何组合。
在某些实施方式中，用不同病毒种类、毒株或分离物基因组的相似区域替代病毒基因组的一个或多个区域。在某些实施方式中，所述区域是该病毒基因组编码区中的区域。在其它实施方式中，所述区域是该病毒基因组的非编码区中的区域。在某些实施方式中，如果两个病毒的两个区域支持该两病毒的相同或相似功能，则两病毒的该两区域彼此相似。在某些其它实施方式中，如果两种病毒的两个区域提供该两病毒中相同或相似的结构元件，则两病毒的该两区域相似。在更具体的实施方式中，如果两个区域编码两病毒中相似的蛋白质结构域，则该两区域相似，其中相似的蛋白质结构域是具有相同或相似功能和/或结构的结构域。
在某些实施方式中，用另一种副黏病毒基因组的一个或多个相似区域替代偏肺病毒，例如哺乳动物偏肺病毒(如hMPV或APV)基因组的一个或多个区域。在某些实施方式中，用哺乳动物偏肺病毒(如hMPV或APV)基因组的一个或多个相似区域替代副黏病毒基因组的一个或多个区域。在更具体的实施方式中，用另一病毒种类、毒株或分离物的相似区域替代哺乳动物偏肺病毒，例如hMPV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、M2-1 ORF、M2-2 ORF、SH-基因、G-基因或L-基因区域或这些基因的两个或多个区域的任何组合，其中所述其它病毒种类可以是但不限于另一种哺乳动物偏肺病毒、APV或RSV。
在更具体的实施方式中，用人偏肺病毒的另一分离物的相似区域替代人偏肺病毒的一个或多个区域。例如，用hMPV的不同分离物，如NL/1/99(99-1)、NL/1/00(00-1)、NL/17/00或NL/1/94的相似区域替代分离物NL/1/99(99-1)、NL/1/00(00-1)、NL/17/00或NL/1/94的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、M2-1 ORF、M2-2 ORF、SH-基因、G-基因或L-基因的一个或多个区域或两个或多个区域的任何组合。
在某些实施方式中，所述区域的长度为至少5个核苷酸(nt)、至少10nt、至少25nt、至少50nt、至少75nt、至少100nt、至少250nt、至少500nt、至少750nt、至少1kb、至少1.5kb、至少2kb、至少2.5kb、至少3kb、至少4kb或至少5kb。在某些实施方式中，所述区域的长度为最多5个核苷酸(nt)、最多10nt、最多25nt、最多50nt、最多75nt、最多100nt、最多250nt、最多500nt、最多750nt、最多1kb、最多1.5kb、最多2kb、最多2.5kb、最多3kb、最多4kb或最多5kb。
5.8 本发明所用的试验
按照本发明，可采用许多试验来测定嵌合型或重组病毒在细胞培养系统、动物模型系统或对象中的生长速率。按照本发明，也可采用许多试验来确定嵌合型和重组病毒实现感染、复制和病毒体包装的要求。
可采用本文所述的试验来随时间检验病毒滴度以确定病毒的生长特征。在一具体实施方式中，通过获得感染细胞或感染对象的样品、制备该样品的一系列稀释液和用能产生单个噬斑的病毒稀释液感染对该病毒易感的单层细胞来测定病毒滴度。然后可计数噬斑，病毒滴度表示为每毫升样品的噬斑形成单位。在本发明一具体的实施方式中，根据对象中抗该病毒抗体的滴度来估计本发明病毒在对象中的生长速率。不想局限于理论，对象中的抗体滴度不只反映对象中的病毒滴度，也反映其抗原性。如果该病毒的抗原性恒定，可利用对象中抗体滴度的升高来测定该病毒在对象中的生长曲线。在一优选实施方式中，最好通过在感染后的多个时间点取得宿主的生物学液体样品和检测病毒滴度来检验该病毒在动物或人中的生长速率。
可采用技术人员已知的任何技术测定细胞培养系统或对象中异源基因序列的表达。在某些实施方式中，通过定量测定转录物水平来检测异源基因的表达。可利用转录物的特异性探针或引物通过Northern印迹分析或RT-PCR检测转录物水平。因为该病毒是反义取向而转录物是有义取向，故可以区分该病毒的转录物和基因组。在某些实施方式中，通过定量测定异源基因的蛋白产物水平来检测该异源基因的表达。可利用蛋白质的特异性抗体通过蛋白质印迹分析检测蛋白质水平。
在一具体实施方式中，该异源基因带有肽标签。可利用抗肽标签的抗体检测该肽标签。所检测的肽标签水平代表了该异源基因表达的蛋白质水平。或者，可利用肽标签分离该异源基因表达的蛋白质。纯化蛋白质的量与该异源基因的表达水平相关。本领域熟知这种肽标签和分离与这种肽标签相融合的蛋白质的方法。可利用本领域已知的各种肽标签修饰该异源基因，所述肽标签是例如但不限于：免疫球蛋白恒定区、多组氨酸序列(Petty，1996，Metal-chelate affinity chromatography(“金属螯合亲和层析”)，刊于Current Protocols in Molecular Biology(《最新分子生物学方法》)，第1-3卷，(1994-1998)，Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kunston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.和Struhl，K.编，John Wiley and sons，Inc.出版，美国，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience)、谷胱甘肽S-转移酶(GST；Smith，1993，Methods Mol.Cell Bio.4：220-229)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(Guan等，1987，Gene 67：21-30)、各种纤维素的结合功能域(美国专利5,496,934；5,202,247；5,137,819；Tomme等，1994，Protein Eng.7：117-123)和FLAG表位(ShortProtocols in Molecular Biology(《分子生物学简单方法》)，1999，Ausubel等编，JohnWiley & Sons，Inc.，第10.11单元)等。特异性结合伴侣能识别其它肽标签，因而促进了通过与结合伴侣发生亲和力结合而分离，该结合伴侣优选固定和/或位于固体支持物上。本领域技术人员应该理解，可采用许多方法获得上述肽标签的编码区，包括但不限于DNA克隆、DNA扩增和合成方法。一些肽标签和检测及分离它们的试剂可商品化购得。
可通过技术人员已知的任何方法获得对象的样品。在某些实施方式中，所述样品包括鼻抽吸物、咽喉拭子、痰或支气管肺泡灌洗液。
5.8.1 小复制子构建物
从cDNA产生活病毒为表征hMPV，也为产生减毒的疫苗毒株和免疫原性化合物提供了方法。为实现此目的，可利用编码含报道基因的vRNA的cDNA或小复制子构建物来拯救病毒，也可用于鉴定参与RNA扩增、表达和掺入病毒体的核苷酸序列和蛋白质。本发明可使用技术人员已知的任何报道基因(参见章节5.8.2)。例如，可用的报道基因包括但不限于：编码GFP、HRP、LUC和AP的基因(报道基因的例子的更广泛清单也参见章节5.8.2)。在一具体实施方式中，所用的报道基因编码CAT。在本发明另一具体实施方式中，报道基因侧接前导序列和尾序列。可用于侧接报道基因的前导序列和尾序列可以是负义病毒，包括但不限于MPV、RSV和APV。例如，报道基因可侧接与丁肝核酶(Hep-d Ribo)和T7聚合酶终止(T-T7)信号相连的负义hMPV或APV的前导序列，所述hMPV或APV尾序列之前是T7RNA聚合酶启动子。
某些实施方式将编码小复制子的质粒转染入宿主细胞。在本发明一更具体的实施方式中，在表达T7 RNA聚合酶、N基因、P基因、L基因和M2.1基因的宿主细胞中拯救hMPV。某些实施方式用编码T7 RNA聚合酶、N基因、P基因、L基因和M2.1基因的质粒转染宿主细胞。其它实施方式将编码小复制子的质粒转染入宿主细胞并用辅助病毒感染该宿主细胞。
可使用许多聚合酶(包括但不限于物种间和物种内聚合酶)拯救hMPV小复制子。在某些实施方式中，在表达hMPV复制所需的最小复制单位的宿主细胞中拯救hMPV小复制子。例如，可用许多聚合酶，包括但不限于RSV、APV、MPV或PIV的聚合酶从cDNA拯救hMPV。在本发明一具体实施方式中，使用RNA病毒的聚合酶拯救hMPV。在本发明一更具体的实施方式中，使用负链RNA病毒的聚合酶拯救hMPV。在本发明甚至更具体的实施方式中，使用RSV聚合酶拯救hMPV。在本发明另一实施方式中，使用APV聚合酶拯救hMPV。在本发明还有另一实施方式中，使用MPV聚合酶拯救hMPV。在本发明另一实施方式中，使用PIV聚合酶拯救hMPV。
在本发明另一实施方式中，使用hMPV聚合酶蛋白的复合物从cDNA拯救hMPV。例如，可用含L、P、N和M2-1蛋白的聚合酶复合物拯救hMPV小复制子。在本发明另一实施方式中，所述聚合酶复合物包含L、P和N蛋白。在本发明还有另一实施方式中，可用含其它病毒(例如但不限于RSV、PIV和APV)的聚合酶蛋白的聚合酶复合物从cDNA拯救hMPV。具体地说，可用含RSV、PIV或APV的L、P、N和M2-1蛋白的聚合酶复合物拯救hMPV小复制子。在本发明还有另一实施方式中，用于拯救hMPV小复制子的聚合酶复合物可含RSV、PIV或APV的L、P和N蛋白。在本发明另一实施方式中，可利用各种病毒的不同聚合酶组成此聚合酶复合物。在这种实施方式中，用于拯救hMPV小复制子的聚合酶可由RSV、PIV或APV聚合酶的不同组分构成。例如(不表示限制可能的组合)，构成复合物时，RSV、APV或PIV的N基因编码N蛋白，而RSV、APV或PIV的L基因编码L蛋白，RSV、APV或PIV的P基因编码P蛋白。本领域技术人员能确定可用于构成拯救hMPV小复制子所需的聚合酶复合物的可能组合。为确认是否成功拯救了该病毒并表征该病毒，可检测小复制子系统中的报道基因表达。可采用技术人员已知的任何方法检验报道基因的表达水平和/或其活性，例如但不限于章节5.8.2所述的。
在某些更具体的实施方式中，所述小复制子含有按照所列顺序的以下元件：T7 RNA聚合酶或RNA聚合酶I、前导序列、基因起始点、GFP、尾序列、丁肝核酶或RNA聚合酶I终止序列。如果T7用作RNA聚合酶，丁肝核酶序列应用作终止序列。如果使用RNA聚合酶I，RNA聚合酶I终止序列可用作终止信号。根据拯救系统，小复制子的序列可以是有义或反义取向。在某些实施方式中，与hMPV的野生型前导序列相比，可修饰前导序列。该前导序列前任选含有AC。T7启动子序列可含有或不含G-双联体或三联体，这种G-双联体或三联体可增强转录。
在一具体实施方式中，细胞在T0时感染hMPV。24小时后，用小复制子构建物转染该细胞。T0后第48小时和T0后第72小时，检验细胞中报道基因的表达。如果使用荧光报道基因产物(例如，GFP)，可采用FACS检验报道基因的表达。
在另一实施方式中，在T＝0时用6种质粒转染细胞。然后在T＝40小时和T＝60小时收集细胞并分析CAT或GFP表达。
在另一具体实施方式中，在T0时用MVA-T7转染细胞。1小时后(T1时)，用小复制子构建物转染细胞。T0后第24小时，用hMPV感染该细胞。T0后第72小时检验细胞中报道基因的表达。如果用荧光报道基因产物(例如，GFP)，可采用FACS检验报道基因的表达。
5.8.2 报道基因
在某些实施方式中，本发明方法可采用检测组织培养物或动物模型中报道基因表达的试验。将报道基因的核苷酸序列克隆入病毒，例如APV、hMPV、hMPV/APV或APV/hMPV，其中(i)改变报道基因的位置和(ii)改变侧接该报道基因的基因间区域的长度。检验不同组合来确定报道基因的最佳表达速率和含报道基因的病毒的最佳复制速率。
在某些实施方式中，制备含报道基因的小复制子构建物。小复制子构建物如本文所述构建。
可采用技术人员已知的任何技术测定报道基因产物的丰度。这种技术包括但不限于：分别利用所述报道基因的特异性探针或抗体作Northern印迹分析或蛋白质印迹分析。
在某些实施方式中，报道基因发射可用FACS检测的荧光信号。FACS可用于检测表达了报道基因的细胞。
除非另有指出，实施本发明具体方面的技术可采用分子生物学、微生物学和重组DNA操作及生产的常规技术，本领域技术人员可常规实施这些技术。参见，例如Sambrook等，Molecular cloning，a laboratory manual(《分子克隆，实验室手册》)，第二版，第1-3卷，(冷泉港实验室，1989)，一本实验室手册，第二版；DNA Cloning(《DNA克隆》)，第I和II卷，(Glover编，1985)；和Transcriptionand Translation(《转录和翻译》)，(Hames和Higgins编，1984)。
报道基因产物的生物化学活性代表了报道基因的表达水平。报道基因活性的总水平也取决于本发明重组病毒的复制速率。因此，为确定重组病毒的报道基因的真实表达水平，应将细胞培养物或动物模型中的总表达水平除以重组病毒的滴度。
本发明方法所用的报道基因包括但不限于下表4所列的基因：
表4：报道基因和各报道基因产物的生物化学特性：
Figure A200680015321D00761
Figure A200680015321D00771
可通过蛋白质印迹分析或Northern印迹分析或用于定量测定核苷酸序列转录、其mRNA和其蛋白丰度的任何其它技术检测报道基因的丰度(参见ShortProtocols in Molecular Biology(《分子生物学的简单方法》)，Ausubel等编，JohnWiley & Sons，Inc.，第四版，1999)。某些实施方式中测定的报道基因产物活性为重组病毒的报道基因表达的读出值(readout)。可利用报道基因产物的生物化学特征来定量测定报道基因产物的活性(参见表4)。技术人员熟知检测报道基因产物的生物化学活性的方法。本发明方法可用的示范性报道基因的更详细描述如下所示。
5.8.3 检测感染发生率
可通过本领域熟知的任何方法测定感染发生率，例如但不限于可分别利用抗-APV-抗原的抗体、抗-hMPV-抗原的抗体、抗-APV-抗原的抗体和/或抗该异源核苷酸序列基因产物的特异性抗体，通过免疫荧光试验(IFA)检验临床样品(如鼻拭子)中是否存在本发明病毒。
在某些实施方式中，可直接加工含完整细胞的样品，而对于不含完整细胞的分离物应首先用允许细胞系(例如，HEp-2细胞)培养。在一示范性实施方式中，应离心(例如室温下，300×g，5分钟)以澄清培养的细胞混悬液，然后在同一条件下用PBS，pH 7.4(无Ca++和Mg++)洗涤。将细胞沉淀物重悬在小体积PBS中用于分析。将含完整细胞的原始临床分离物与PBS混合，室温下以300×g离心5分钟。用无菌移液管吸头除去界面的粘液，在同一条件下用PBS洗涤细胞沉淀物多次。然后将沉淀物重悬在小体积PBS中用于分析。在丙酮洗涤的12-孔HTC超硫化(supercured)载玻片的每个5mm孔上点样5-10微升各细胞混悬液，风干。用冷(-20℃)丙酮固定载玻片10分钟。向各孔加入PBS-1％BSA阻断反应，然后在室温下培育10分钟。用PBS-0.1％吐温-20洗涤载玻片三次，风干。每孔加入用封闭缓冲液稀释至250ng/ml的10微升各第一抗体试剂，反应物在加湿的37℃环境中培育30分钟。然后用PBS-0.1％吐温-20更换洗涤载玻片三次，风干。每孔中加入用封闭缓冲液稀释至250ng/ml的10微升合适的第二抗体试剂，反应物在加湿的37℃环境中再培育30分钟。然后用PBS-0.1％吐温-20更换洗涤载玻片三次。每个反应孔中加入5微升PBS-50％甘油-10mM Tris pH 8.0-1mMEDTA。给载玻片加上盖玻片。然后用荧光显微镜的B-2A滤镜(EX 450-490nm)放大200倍分析各反应孔。根据未染色细胞或只用第二抗体试剂染色的细胞自发荧光(autofluorescent)背景对阳性反应评分。阳性反应的特征为受感染细胞的胞质中小包涵体发出标点状鲜明荧光。
5.8.4 检测血清滴度
可采用本领域熟知的方法测定血清抗体滴度，例如但不限于可通过夹心ELISA定量测定血清样品中抗体或抗体片段的含量。简言之，ELISA包括用能识别血清中的抗体或抗体片段的抗体包被微量滴定板，4℃过夜。然后在室温用PBS-吐温-0.5％BSA封闭各板约30分钟。使用以PBS-吐温-BSA稀释的纯化抗体或抗体片段和以PBS-BSA稀释的样品制作标准曲线。将样品和标准品加入试验平板的双复孔中，在室温培育约1小时。然后在室温用PBS-吐温洗去未结合的抗体，用标记的第二抗体(例如，辣根过氧化物酶偶联的山羊抗-他IgG)处理结合的抗体约1小时。加入该标记物的特异性生色底物并测量底物转化速率(例如，利用分光光度计)来检测标记抗体的结合情况。可通过比较特定稀释度时样品的底物转化速率与标准曲线的底物转化速率来测定血清中抗体的浓度或抗体片段水平。
5.8.5 血清学检验
本发明某些实施方式检测是否存在能与哺乳动物MPV的组分结合的抗体。具体地说，可检测对象中是否存在针对哺乳动物MPV的蛋白质的抗体来诊断该对象中是否存在哺乳动物MPV。可采用技术人员已知的任何方法检测是否存在针对哺乳动物MPV某组分的抗体。
在另一实施方式中，可使怀疑感染了MPV的宿主样品与抗MPV或其组分的抗体接触，检测形成的复合物来进行血清学检验。在这种实施方式中，血清学检验可检测是否存在针对MPV接触的宿主抗体应答。可采用本领域已知的任何方法制备本发明试验用于检测宿主抗体或MPV组分的抗体。可工程改造这种抗体来检测各种表位，包括但不限于：核酸、氨基酸、糖、多核苷酸、蛋白质、碳水化合物或它们的组合。在本发明另一实施方式中，可通过使怀疑感染了MPV的宿主样品与MPV的某组分接触，检测形成的复合物来进行血清学检验。本领域熟知这种方法的例子，包括但不限于：直接免疫荧光法、ELISA、蛋白质印迹、免疫层析法。
一示范性实施方式将哺乳动物MPV的组分与固体支持物相连。在一具体实施方式中，所述哺乳动物MPV的组分可以是但不限于F蛋白或G蛋白。然后，在有助于抗体与哺乳动物MPV组分结合的条件下培育待测物质与所述固体支持物来检测是否存在针对哺乳动物MPV的抗体。接着在能除去任何非特异性结合抗体的条件下洗涤该固体支持物。洗涤步骤后，采用技术人员已知的任何技术检测是否存在结合的抗体。在一具体实施方式中，在有助于可检测标记的抗体与结合了哺乳动物MPV组分的抗体结合的条件下，培育哺乳动物MPV蛋白-抗体复合物与能识别对象种类所产生抗体的可检测标记抗体，例如，如果对象是棉鼠，该可检测标记抗体是抗大鼠抗体。在一具体实施方式中，该可检测标记抗体与酶活性偶联。在另一实施方式中，放射性标记可检测标记抗体。然后洗涤哺乳动物MPV蛋白-抗体-可检测标记抗体的复合物，再通过技术人员已知的任何技术定量测定是否存在可检测标记的抗体，其中所用的技术取决于可检测标记抗体的标记物类型。
5.8.6 BIACORE试验
可通过，例如将含0.05％吐温-20的HBS缓冲液配制的各种浓度的250μL单克隆抗体(“mAb”)注射到其上固定了抗原的传感器芯片表面来测定抗体结合的动力学参数。所述抗原可以是哺乳动物MPV的任何组分。在一具体实施方式中，所述抗原可以是但不限于：哺乳动物MPV的F蛋白或G蛋白。流速可以恒定维持在75μL/分钟。收集15分钟，或更长时间(如果需要)的解离数据。每轮注射/解离后，简单地用1分钟稀酸(通常是10-100mM HCl)脉冲从抗原表面除去结合的mAb，虽然如果条件许可可以使用其它再生剂。
更具体地说，为检测缔合速率(kon)和解离速率(koff)，采用标准胺偶联化学方法，即EDC/NHS法(EDC＝N-二乙基氨基丙基)-碳二亚胺)将抗原直接固定在传感器芯片表面。简言之，用10mM NaOAc，pH4或pH5制备5-100nM抗原溶液，使之流过EDC/NHS-激活的表面，直至固定了约30-50RU(Biacore共振单位)值的抗原。接着注射1M Et-NH2除去(cap off)未反应的活性酯。在相同固定条件下制备不含抗原的空白表面作参比。一旦制备了合适的表面，用HBS/吐温-20制备各抗体试剂的一系列合适稀释液，使之流过串联的抗原和参比小室表面。制备的抗体浓度范围根据估计的平衡结合常数KD而不同。如上所述，每轮注射/解离后用合适的再生剂除去结合的抗体。
一旦收集了完整的数据，采用仪器制造商BIAcore，Inc.(Piscataway，新泽西)提供的算法整体拟合得到的结合曲线。所有数据拟合成1:1朗缪尔结合模型。这些算法计算出kon和koff，接着从kon和koff推导作为两种速率常数之比(即koff/kon)的表观平衡结合常数KD。如何得到各速率常数的更详细处理方法见BIA评估软件手册(BIAcore，Inc.，Piscataway，新泽西)。
5.8.7 微量中和试验
可通过微量中和试验测定抗体或其抗原结合片段中和病毒传染力的能力。该微量中和试验是Anderson等(1985，J.Clin.Microbiol.，22：1050-1052，其内容全文纳入本文作为参考)所述方法的改进形式。Johnson等(1999，J.InfectiousDiseases 180：35-40，其内容全文纳入本文作为参考)也描述了该方法。
使用96-孔板制备一式三份的抗体稀释液。37℃将106TCID50的哺乳动物MPV与待检验的抗体或其抗原结合片段的连续稀释液在96-孔板的孔中培育2小时。然后向每孔加入易受哺乳动物MPV感染的细胞，例如但不限于Vero细胞(2.5×104)，37℃，在5％ CO2中培养5天。5天后，抽出培养液，用80％甲醇和20％PBS洗涤细胞并固定于平板。然后通过病毒抗原，例如F蛋白的表达测定病毒复制。培育固定的细胞与生物素-偶联的抗病毒抗原，例如抗-F蛋白的单克隆抗体(如，泛F蛋白，C-位点特异性MAb 133-1H)，洗涤，将辣根过氧化物酶偶联的亲和素加入各孔。再次洗涤各孔，在450nm检测底物TMB(硫代硝基苯甲酸)的转化情况。中和滴度表达为与只有病毒的对照细胞相比，导致450nm吸光度(OD450)至少降低50％的抗体浓度。
本文所述的微量中和试验是仅有的例子。或者，可采用标准中和试验测定抗体对病毒的影响有多显著。
5.8.8 病毒融合抑制试验
该试验大体上与微量中和试验相同，除了先用各种病毒感染细胞4小时，再加入抗体，读取有或没有融合细胞存在时的吸光度(Taylor等，1992，J.Gen.Virol.73：2217-2223)。
5.8.9 等温滴定量热法
从抗体与其各自抗原的相互作用的等温滴定量热法(ITC)测量值测定热力学结合亲和力与焓。
用透析液稀释抗体，利用消光系数为217,000M-1cm-1的Perkin-ElmerLambda 4B分光光度计测量280nm的紫外光谱吸光度峰值来测定浓度。由于其消光系数太低因而不能确定精确浓度，从原始样品质量与稀释样品质量之比计算稀释的哺乳动物MPV-抗原浓度而无需使用及损失大量样品。
ITC检测
使用Microcal，Inc.VP滴定热量计从ITC测量值测定抗体的结合热力学(特性)。VP滴定热量计由绝热外壳包围的一对匹配的样品容器和参比容器(1.409ml)以及将配体溶液滴入样品容器所用的旋振搅拌-注射器(rotatingstirrer-syringe)构成。ITC检测在25℃和35℃进行。样品容器含有磷酸缓冲液配制的抗体，而参比容器只含有缓冲溶液。磷酸缓冲溶液是HyClone，Inc的盐水67mM PO4，pH 7.4。以3-4分钟为间隔将5或10μl等份试样的0.05-0.1mM RSV抗原、PIV-抗原和/或hMPV抗原溶液滴入抗体样品溶液中，直至热交换信号消失表明结合已饱和。
按照以下方程(I)，利用Microcal，Inc.，Origin 5.0的非线性最小二次方最小化软件程序将总热量Qt的第i次滴定的渐增热量(ΔQ(i))拟合成总滴定浓度Xt，从而得到Kb、ΔHb。和n的值：
Qt＝nCtΔHb°V{1+Xt/nCt+1/nKbCt-[(1+Xt/nCt+1/nKbCt)2-4Xt/nCt]1/2}/2(1a)
ΔQ(i)＝Q(i)+dVi/2V{Q(i)+Q(i-1)}-Q(i-1)(1b)
其中Ct是样品容器中的初始抗体浓度，V是样品容器的体积，n是结合反应的化学计量。测定样品浓度Kb的最佳范围取决于Kb的值，其限定关系如下所示：
CtKbn≤500(2)
因此，1μM时可测定的Kb到小于2.5×108M-1。如果加入第一种滴定抗原不能与结合等温线拟合，将其在最终分析中省去，因为它可能反映了注射器开口的溶液界面有气泡释放。
5.8.10 免疫测定
免疫沉淀方法通常包括用裂解缓冲液，例如补加了蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(如EDTA、PMSF、159抑肽酶、钒酸钠)的RIPA缓冲液(I％ NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％ SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸钠、pH 7.2，1％特斯乐(Trasylol))裂解细胞群，向细胞裂解液中加入感兴趣的抗体，4℃培育一定时间(例如，4小时)，向细胞裂解液中加入A蛋白和/或G蛋白琼脂糖珠，4℃培育约1小时或更多时间，用裂解缓冲液洗涤珠，将这些珠重悬在SDS/样品缓冲液中。可通过，例如蛋白质印迹分析评估感兴趣抗体免疫沉淀特定抗原的能力。本领域技术人员应知道可以改进这些参数以提高抗体与抗原的结合，降低背景(例如，事先用琼脂糖珠澄清细胞裂解液)。有关免疫沉淀方法的进一步讨论参见，例如Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology(《最新分子生物学方法》)，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，纽约，第10，16，1页。
蛋白质印迹分析通常包括制备蛋白质样品，用聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质样品进行电泳(例如，根据抗原的分子量进行8％-20％ SDS-PAGE)，将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶转移至膜，例如硝酸纤维素膜、PVDF或尼龙膜，用封闭溶液(例如，含3％BSA的PBS或脱脂奶)封闭膜，用洗涤缓冲液(例如PBS吐温20)洗涤膜，培育膜与用封闭缓冲液稀释的第一抗体(感兴趣的抗体)，用洗涤缓冲液洗涤该膜，培育该膜与用封闭缓冲液稀释的与酶物质(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如，12P或121I)偶联的第二抗体(能识别第一抗体，例如抗-人抗体)，用洗涤缓冲液洗涤膜和检测是否存在抗原。本领域技术人员应知道可改进这些参数以增强检测信号，降低背景噪声。有关蛋白质印迹方法的进一步讨论参见，例如Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology(《最新分子生物学方法》)，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，纽约，第10.8.1页。
ELISA包括制备抗原，用抗原包被96-孔微量滴定板的孔，洗去未与孔结合的抗原，将与可检测化合物，例如酶物质(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)偶联的感兴趣抗体加入各孔并培育一定时间，洗去未结合的抗体或非特异性结合的抗体，和检测是否存在与包被孔的抗原特异性结合的抗体。在ELISA中，感兴趣的抗体不与可检测化合物偶联；而是将与可检测化合物偶联的第二抗体(能识别感兴趣的抗体)加入孔。此外，不用抗原包被孔，而是用抗体包被孔。在此情况中，可检测分子可以是与可检测化合物，例如酶物质(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)偶联的抗原。本领域技术人员熟知可以改进这些参数以增强检测的信号以及ELISA的其它变化。ELISA的进一步讨论参见，例如Ausubel等编，1994，Current Protocols inMolecular Biology(《最新分子生物学方法》)，第1卷，John Wiley & Sons，Inc.，纽约，第11.2.1页。
可通过竞争性结合试验测定抗体(包括scFv或含有或由抗体片段构成的其它分子或其变体)对抗原的结合亲和力与抗体-抗原相互作用解离速率。竞争性结合试验的一个例子是放射性免疫测定，包括在含量增加的未标记抗原存在下培育标记抗原(例如，3H或121I)与感兴趣抗体，和检测与标记抗原结合的抗体。
5.8.11 蔗糖梯度试验
可采用技术人员已知的任何生物化学试验进一步研究所述异源蛋白是否掺入到病毒体中。在一具体实施方式中，采用蔗糖梯度试验确定异源蛋白是否掺入病毒体。
可将感染细胞的裂解液在20-60％蔗糖梯度中分级，收集各组分并通过，例如蛋白质印迹分析法分析异源蛋白和载体蛋白的存在和分布情况。也可通过噬斑试验检验各组分和病毒蛋白的峰值病毒滴度。如果所述异源蛋白与病毒体共同迁移，则该异源蛋白与病毒体结合。
5.9 鉴定MPV新分离物的方法
本发明涉及哺乳动物MPV，特别是hMPV。虽然本发明表征了MPV的两种血清学亚群，A和B以及表征了四种变体A1、A2、B1和B2，但本发明不限于这些亚群和变体。本发明包括MPV的任何尚未鉴定的分离物，包括经表征属于本文所述亚群和变体，或属于尚未表征的亚群或变体的那些分离物。
可采用免疫测定来表征给定样品中存在的蛋白质组分。使用所鉴定病毒的肽组分的免疫测定是比较病毒分离物的有效方法。例如，本发明提供鉴定本文提供的MPV其它分离物的方法，该方法包括用原型分离物I-2614或相关的分离物接种基本上未感染MPV或无特异性病原体的豚鼠或雪貂(在发明详述中，鼻内接种动物，但也可能采用其它接种方式，例如肌肉内或真皮内接种以及使用其它实验动物)。在第0天、接种两周和三周后收集动物的血清。可利用病毒中和(VN)试验(VN试验的例子见实施例16)检测到特异性血清转化的动物，针对各分离物I-2614进行间接IFA(IFA的例子见实施例11或14)和用血清转化动物的血清来免疫学检测所述的其它分离物。例如，本发明表征了副黏病毒科的新成员，可在人类中导致严重RTI的人偏肺病毒或偏肺病毒样病毒(由于其最终分类学尚待病毒分类学委员会讨论，本文将MPV(例如)描述为在分类学上对应于APV)(MPV)。MPV所致疾病的临床体征基本上类似于hRSV所致体征，例如咳嗽、肌痛、呕吐、发热、支气管炎或肺炎、可能的结膜炎或它们的组合。如hRSV感染的儿童所见的一样，特别年幼的儿童可能需要住院治疗。本文提供2001年1月19日由CNCM(Institute Pasteur(巴斯德研究院)，巴黎)保藏为I-2614的MPV或其在系统发育上相应的病毒分离物作为例子。于是，本发明提供的病毒含有在系统发育上对应于SEQ ID NO：19所示核酸序列或在结构上对应于该核酸序列的核酸或功能片段。具体地说，本发明提供病毒的特征在于系统树分析(其中用100个自展引导(bootstrap)和3个混杂(jumble)产生最大相似性树)检验后，发现其在系统发育上更接近对应于CNCM(巴黎)保藏为I-2614的病毒分离物，而不是禽肺病毒(APV)，也称为火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)(禽鼻气管炎的病原体)的病毒分离物。将AVP-C病毒分离物用作所述系统树分析的远交群特别有用，它亲缘最近，虽然其基本上是非哺乳动物病毒。
5.9.1 序列的生物信息学对比
可通过BLAST(Altschul，S.F.等，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)比较两条或多条氨基酸序列来确定它们彼此的序列同源性和序列相同性。可通过BLAST(Altschul，S.F.等，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)比较两条或多条核苷酸序列来确定它们彼此的序列同源性和序列相同性。可采用Clustal W方法(MacVector(tm))执行BLAST比较。在某些实施方式中，通过计算机程序对比两条或多条序列后可以进行手工再调整。
可采用数学算法确定两条序列间的相同性百分比。用于比较两条序列的数学算法的优选非限制性例子是由Karlin和Altschul(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877)改进的Karlin和Altschul(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264-2268)算法。Altschul等(1990，J.Mol.Biol.215：403-410)的NBLAST和XBLAST程序整合了这种算法。可利用NBLAST程序执行BLAST核苷酸比较。可利用XBLAST程序执行BLAST氨基酸序列比较。为获得比较目的的空位对比，可进行如Altschul等(1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)所述的空位BLAST。或者，可利用PSI-Blast执行迭代检索来检测分子之间的远亲关系(Altschul等，1997，同上)。使用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序时，可采用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。用于序列比较的数学算法的另一优选非限制性例子是Myers和Miller(1988，CABIOS 4：11-17)的算法。作为GCC序列对比软件包的ALIGN程序(2.0版)整合了这种算法。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可利用PAM120加权残差表(weight residue table)。技术人员可设定空位长度罚分。可采用与上述相似的技术(设有或不设空位)测定两条序列间的相同性百分比。在计算相同性百分比时，一般只计算精确的匹配。
5.9.2 杂交条件
本发明方法可利用能与哺乳动物MPV的核酸、或其反向互补核酸或其互补核酸杂交的核酸来测定它们彼此的序列同源性和相同性。在某些实施方式中，这些核酸可在高度严格的条件下杂交。例如(不限于)采用这种高度严格性条件的方法如下所示。65℃，在由6×SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.02％ BSA和500μg/ml变性鲑鱼精子DNA组成的缓冲液中将含DNA的滤膜预杂交8小时到过夜。65℃，在含100μg/ml变性鲑鱼精子DNA和5-20×106cpm 32P-标记探针的预杂交混合物中杂交滤膜48小时。37℃，用含2×SSC、0.01％ PVP、0.01％ Ficoll和0.01％ BSA的溶液洗涤滤膜1小时。然后在37℃先用0.1×SSC洗涤45分钟，再进行放射自显影。本领域熟知可采用的其它高度严格性条件。本发明的其它实施方式在中等到低严格性条件下进行杂交，技术人员熟知这种条件(参见，例如Sambrook等，1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual(《分子克隆，实验室手册》)，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；也参见Ausubel等编，刊于Current Protocols in Molecular Biologyseries of laboratory technique manuals(《最新分子生物学方法的实验室技术手册丛书》)，1987-1997 Current Protocols，
Figure A200680015321D0027082529QIETU
1994-1997 John Wiley and Sons，Inc.)。
5.9.3 系统发育分析
本发明涉及推定哺乳动物MPV分离物之间的系统发育关系。可采用许多方法分析系统发育关系；这些方法包括远距、最大可能性和最大简约方法(Swofford，DL.等，Phylogenetic Inference(系统发育推定)，刊于Molecular Systematics(《分子系统学》)，Hillis，DM，Mortiz，C和Mable，BK编，1996，Sinauer Associates：Massachusetts，美国，第407-514页；Felsenstein，J.，1981，J.Mol.Evol.17：368-376)。此外，自引技术是制备和检测所得系统树的置信区间的有效方法(Felsenstein，J.，1985，Evolution.29：783-791)。利用核苷酸序列或肽序列信息来比较哺乳动物MPV分离物的任何方法可用于建立系统发育关系，所述方法包括但不限于远距、最大可能性和最大简约方法。可采用本领域已知的任何方法分析系统发育数据，包括但不限于自引的质量。系统发育方法所用的核苷酸或肽序列数据的对比包括但不限于手工对比、计算机配对对比和计算机多重对比。本领域技术人员熟悉根据所需信息和允许的时间而使用的优选对比方法或系统发育方法。
一个实施方式采用DNA最大可能性方法来推定hMPV分离物之间的关系。另一实施方式采用自引技术测定用所述系统发育方法产生的系统发育数据的确定性。另一实施方式先将混杂技术应用于系统发育方法，再输入数据以尽可能降低序列指令进入(sequence order entry)对系统发育分析的影响。一具体实施方式采用含有自展引导的DNA最大可能性方法。另一具体实施方式采用具有自展引导和混杂的DNA最大可能性方法。另一更具体的实施方式采用含有50个自展引导的DNA最大可能性方法。另一具体实施方式采用具有50个自展引导和3个混杂的DNA最大可能性方法。另一具体实施方式采用含有100个自展引导和3个混杂的DNA最大可能性方法。
一个实施方式比较或对比了hMPV分离物的核酸序列或肽序列或与其它hMPV分离物的序列。所述氨基酸序列可以是L蛋白、M蛋白、N蛋白、P蛋白或F蛋白的氨基酸序列。另一实施方式比较或对比了一个hMPV分离物或多个hMPV分离物的核酸序列或肽序列信息或与其它病毒的序列。另一实施方式将系统发育方法应用于序列对比数据，从而可推定系统发育关系和/或构建系统发育树。利用核苷酸序列或肽序列信息来比较MPV分离物的任何方法可用于推定所述系统发育关系，所述方法包括但不限于远距、最大可能性和最大简约方法。
系统发育分析的其它方法公开于以WO 02/057302公布的国际专利申请PCT/NL02/00040中，其内容全文纳入本文作为参考。具体地说，PCT/NL02/00040在第12页、第27行到第19页、第29行公开了适用于系统发育分析的核酸序列，其纳入本文作为参考。
对于系统发育分析，获得非MPV的核酸序列作为远交群与病毒比较是最有用的，非常有用的远交群可以得自禽肺病毒血清型C(APV-C)。
可利用本领域已知的许多方法和程序推定系统发育关系，包括但不限于：BioEdit、ClustalW、TreeView和NJPlot。用于对比序列并产生系统树或关系的方法需要输入待比较的序列信息。可采用本领域已知的许多方法或格式输入序列信息，包括但不限于：FASTA、NBRF、EMBL/SWISS、GDE蛋白、GDE核苷酸、CLUSTAL和GCG/MSF。用于对比序列并产生系统树或关系的方法需要输出结果。可采用许多方法或格式输出信息或结果，包括但不限于：CLUSTAL、NBRF/PIR、MSF、PHYLIP和GDE。一个实施方式联用ClustalW与具有100个自引和3个混杂的DNA最大可能性方法来产生系统发育关系。
5.10 产生抗体
本发明也涉及产生抗哺乳动物MPV所编码蛋白的抗体。具体地说，本发明涉及制备抗所有MPV抗原，包括哺乳动物MPV的F蛋白、N蛋白、M2-1蛋白、M2-2蛋白、G蛋白或P蛋白的抗体。按照本发明，可利用哺乳动物MPV编码的任何蛋白质、其衍生物、类似物或片段作为免疫原来产生能与这种免疫原免疫特异性结合的抗体。本发明抗体包括但不限于：多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合型抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗-Id)抗体(包括，例如抗本发明抗体的抗-Id抗体)和表位结合片段。本文所用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有能与抗原免疫特异性结合的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白分子的免疫学活性部分的例子包括可用例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的酶处理抗体而产生的F(ab)和F(ab’)2片段。一具体实施方式产生抗人MPV所编码蛋白质的抗体。另一实施方式产生了抗人MPV所编码蛋白的结构域的抗体。
可采用本领域已知的各种方法产生抗哺乳动物MPV编码蛋白质、其衍生物、类似物或片段的多克隆抗体。为产生抗体，可注射天然蛋白质或其合成形式或衍生物(例如，片段)来免疫各种宿主动物，包括但不限于：家兔、小鼠、大鼠等。按照宿主种类，可用各种佐剂增强免疫应答，包括但不限于：弗氏佐剂(完全和不完全)，矿物凝胶，如氢氧化铝，表面活性物质，如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子；肽，油乳剂，匙孔
Figure A200680015321D0088085701QIETU
蓝蛋白，二硝基苯酚和可能有用的人佐剂，如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(corynebacterium parvum)。
为制备针对哺乳动物MPV编码蛋白质、其衍生物、类似物或片段的单克隆抗体，可采用培养连续细胞系产生抗体分子的技术。例如，可采用Kohler和Milstein(1975，Nature 256：495-497)首先开发的杂交瘤技术以及三源杂交瘤技术(triomatechnique)、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，Immunology Today 4：72)和EBV-杂交瘤技术来产生人单克隆抗体(Cole等，1985，刊于MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy(《单克隆抗体和癌症治疗》)，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)。在本发明其它实施方式中，可采用最新技术(PCT/US90/02545)在无菌动物中产生单克隆抗体。按照本发明，可利用人杂交瘤(Cote等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：2026-2030)或用EBV病毒体外转染人B细胞(Cole等，1985，刊于Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R.Liss，第77-96页)以获得可用的人抗体。事实上，按照本发明，可采用为产生“嵌合型抗体”而开发的技术(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851-6855；Neuberger等，1984，Nature 312：604-608；Takeda等，1985，Nature 314：452-454)，该技术剪接对哺乳动物MPV所编码蛋白质、其衍生物、类似物或片段具有特异性的小鼠抗体分子的基因与具有合适生物学活性的人抗体分子的基因；这种抗体属于本发明的范围。
按照本发明，可改进美国专利号4,946,778所述产生单链抗体的技术来产生特异性单链抗体。本发明另一实施方式采用构建Fab表达文库所述的技术(Huse等，1989，Science 246：1275-1281)来快速而简单地鉴定对哺乳动物MPV所编码蛋白质、其衍生物、类似物或片段具有所需特异性的单克隆Fab片段。
可通过已知技术产生含独特型分子的抗体片段。例如，这种片段包括但不限于：胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’)2片段；通过还原F(ab’)2片段的二硫键而产生的Fab’片段；用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子所产生的Fab片段；和Fv片段。
在制备抗体的过程中，可通过本领域已知技术，例如ELISA(酶联免疫吸附测定)筛选所需抗体。例如，为选出能识别哺乳动物MPV所编码蛋白质特定结构域的抗体，可检验所制备杂交瘤的产物是否能与哺乳动物MPV所编码并含有这种结构域的蛋白质片段结合。
本发明提供的抗体可用于检测MPV以及治疗MPV感染的治疗方法。
可通过本领域技术人员已知的任何技术检验本发明方法所产生抗体的特异性和结合亲和力。在某些实施方式中，可如章节5.8.5、5.8.6、5.8.7、5.8.8或5.8.9所述检验本发明方法所产生抗体的特异性和结合亲和力。
5.11 鉴定抗病毒剂的筛选试验
本发明提供鉴定能抑制哺乳动物MPV感染宿主或宿主细胞的化合物的方法。在某些实施方式中，本发明提供鉴定能降低哺乳动物MPV在宿主或宿主细胞中复制能力的化合物的方法。可采用技术人员熟知的任何技术筛选能消除或降低哺乳动物MPV感染宿主或宿主细胞和/或在宿主或宿主细胞中复制的化合物。在一具体实施方式中，所述哺乳动物MPV是人MPV。
在某些实施方式中，本发明提供鉴定能抑制哺乳动物MPV在宿主或宿主细胞中复制的化合物的方法。更具体地说，本发明提供鉴定能抑制哺乳动物MPV感染哺乳动物或哺乳动物细胞的化合物的方法。在某些实施方式中，本发明提供鉴定能抑制哺乳动物MPV在哺乳动物细胞中复制的化合物的方法。在一具体实施方式中，所述哺乳动物细胞是人细胞。可用于测定病毒滴度的试验的详述见章节5.7。
在某些实施方式中，使细胞与检验化合物接触并用哺乳动物MPV感染。在某些实施方式中，在没有检验化合物存在下用哺乳动物病毒感染对照培养物。可在用哺乳动物MPV感染之前、同时或之后使细胞与检验化合物接触。在一具体实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在甚至更具体的实施方式中，所述细胞是人细胞。在某些实施方式中，细胞与检验化合物培育至少1分钟、至少5分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少12小时或至少1天。可在试验期间的任何时间检测病毒滴度。某些实施方式测定了培养液中病毒生长的时程。如果检验化合物的存在使病毒生长受抑制或降低，则该检验化合物鉴定为能有效抑制或降低哺乳动物MPV的生长或感染。一具体实施方式检验能抑制或降低哺乳动物MPV生长的化合物抑制或降低其它病毒生长速率的能力来检验其对哺乳动物MPV的特异性。
在某些实施方式中，将检验化合物给予模型动物，并用哺乳动物MPV感染该模型动物。在某些实施方式中，用哺乳动物病毒感染对照模型动物而不给予检验化合物。可在哺乳动物MPV感染之前、同时或之后给予检验化合物。在一具体实施方式中，所述模型动物是哺乳动物。在一甚至更具体的实施方式中，所述模型动物可以是但不限于：棉鼠、小鼠或猴子。可在试验期间的任何时间检测病毒滴度。某些实施方式测定了培养液中病毒生长的时程。如果检验化合物的使病毒生长受抑制或降低，则该检验化合物鉴定为能有效抑制或降低哺乳动物MPV的生长或感染。一具体实施方式检验能抑制或降低哺乳动物MPV在模型动物中生长的化合物抑制或降低其它病毒生长速率的能力来检验其对哺乳动物MPV的特异性。
5.12 疫苗、抗体和抗病毒制剂
在一优选的实施方式中，本发明提供由本发明核酸编码的蛋白分子或偏肺病毒特异性病毒蛋白或其功能片段。例如，有用的蛋白分子源自可从本发明病毒获得的任何基因或基因组片段。例如，本文提供的这种分子或其抗原性片段可用于诊断方法或试剂盒以及药物组合物中(例如，亚单位疫苗)。对于例如抗原或亚单位免疫原的包涵体，特别有用的是F、SH和/或G蛋白或其抗原性片段，但也可用灭活的完整病毒。为系统发育分析而鉴定的重组核酸片段所编码的那些蛋白质物质也特别有用，当然优选属于系统发生学分析所用的优选ORF边界内的，特别是无论在体内(例如，为保护目的或提供诊断性抗体)或体外(例如，通过噬菌体展示技术或用于产生合成抗体另一种技术)均能引发MPV特异性抗体或T细胞应答的那些蛋白物质。
本文也提供抗体，其可以是能与含有本发明蛋白分子或其MPV-特异性功能片段的抗原特异性反应的天然多克隆或单克隆或合成(例如，(噬菌体)文库衍生的结合分子)抗体。这种抗体可用于鉴定病毒分离物，例如MPV的方法，包括将所述病毒分离物或其组分与本文提供的抗体反应。例如，这可采用ELISA、RIA、FACS或不同形式的抗原检测试验(Current Protocols in Immunology(《最新免疫学方法》)，利用纯化或未纯化的MPV或其诸组分(蛋白质、肽)来实现。或者，可采用经典免疫荧光或免疫组织化学技术，用受感染的细胞或细胞培养物来鉴定病毒抗原。
例如，可将含有本发明病毒、核酸、蛋白分子或其片段、抗原和/或抗体的药物组合物用于MPV感染和/或呼吸道疾病的治疗或预防方法，包括提供给个体本发明药物组合物。当所述个体包括人时，特别是当所述人在5岁以下时最有用，因为这种婴儿和幼儿最易受本文提到的人MPV感染。在急性阶段，患者通常患有易感染其它呼吸道疾病或其它疾病导致的上呼吸道症状。也可能发生易感染更多其它严重疾病导致的下呼吸道疾病。可用本发明组合物治疗免疫力受损的个体，包括癌症患者、移植受者和老年人。
本发明也提供获得可用于治疗呼吸道疾病的抗病毒剂的方法，包括建立含本发明病毒的细胞培养物或实验动物，用候选的抗病毒剂处理所述培养物或动物，测定所述抗病毒剂对所述病毒或其感染的培养物或动物的作用。这种抗病毒剂的例子包括本文提供的MPV-中和抗体或其功能组分，但也获得了其它性质的抗病毒剂。本发明也提供本发明抗病毒剂在制备可用于治疗或预防MPV感染或呼吸道疾病方法中的药物组合物，特别是制备治疗呼吸道疾病(特别是该疾病由MPV感染所致)或相关疾病的药物组合物中的应用，以及提供含本发明抗病毒剂的药物组合物用于治疗或预防MPV感染或呼吸道疾病的方法，所述方法包括提供给个体这种药物组合物。
在本发明的某些实施方式中，本发明疫苗包含本文定义的哺乳动物偏肺病毒。在某些更具体的实施方式中，所述哺乳动物偏肺病毒是人偏肺病毒。在一优选实施方式中，所述哺乳动物偏肺病毒可用于具有减毒表型的疫苗制剂中。获得减毒表型的方法参见章节5.6。
本发明提供用于预防和治疗PIV、RSV、APV和/或MPV感染的疫苗制剂。在某些实施方式中，本发明疫苗含有本发明重组和嵌合型病毒。在某些实施方式中，所述病毒是减毒的。
在一具体实施方式中，所述疫苗含有APV，该疫苗可用于预防和治疗人hMPV感染。不想局限于理论，因为APV的F蛋白与hMPV的F蛋白同源性高，APV感染会导致宿主产生能与hMPV交叉反应的抗体而保护宿主抵御hMPV感染和相关疾病。
在另一具体实施方式中，所述疫苗含有hMPV，该疫苗可用于预防和治疗鸟，例如但不限于火鸡的APV感染。不想局限于理论，因为APV的F蛋白与hMPV的F蛋白同源性高，hMPV感染会导致宿主产生能与APV交叉反应的抗体而保护宿主抵御APV感染和相关疾病。
在一具体实施方式中，本发明包括将经修饰的重组和嵌合型APV/hMPV病毒用于疫苗制剂中以赋予抵御APV和/或hMPV的保护作用。某些实施方式将APV/hMPV用于要给予鸟类的疫苗中以保护鸟类抵御APV感染。不想局限于理论，用hMPV基因或核苷酸序列取代APV基因或核苷酸序列可获得能将该嵌合型病毒用作疫苗的减毒表型。在其它实施方式中，将APV/hMPV嵌合型病毒给予人。不想局限于理论，APV病毒载体在人中提供减毒表型，hMPV序列的表达能引发hMPV特异性免疫应答。
在一具体实施方式中，本发明包括将经修饰的重组和嵌合型hMPV/APV病毒用于疫苗制剂中以赋予抵御APV和/或hMPV的保护作用。某些实施方式将hMPV/APV用于要给予人类的疫苗中以保护人类抵御hMPV感染。不想局限于理论，用APV基因或核苷酸序列取代hMPV基因或核苷酸序列可获得能将该嵌合型病毒用作疫苗的减毒表型。在其它实施方式中，将hMPV/APV嵌合型病毒给予鸟类。不想局限于理论，hMPV骨架在鸟中可提供减毒表型，APV序列的表达能引发APV特异性免疫应答。
某些优选的实施方式利用本发明疫苗制剂提供保护以抵御偏肺病毒感染和相关疾病。更具体地说，利用本发明疫苗制剂提供保护以抵御人偏肺病毒和/或禽肺病毒感染和相关疾病。在某些实施方式中，利用本发明疫苗制剂提供保护以抵御以下病毒感染：(a)人偏肺病毒和呼吸道合胞体病毒；和/或(b)禽肺病毒和呼吸道合胞体病毒。
在某些实施方式中，利用本发明疫苗制剂提供保护以抵御(a)人偏肺病毒和人副流感病毒；和/或(b)禽肺病毒和人副流感病毒感染，以及相关疾病。
在某些实施方式中，利用本发明疫苗制剂提供保护以抵御(a)人偏肺病毒、呼吸道合胞体病毒和人副流感病毒；和/或(b)禽肺病毒、呼吸道合胞体病毒和人副流感病毒感染，以及相关疾病。
在某些实施方式中，利用本发明疫苗制剂提供保护以抵御人偏肺病毒、呼吸道合胞体病毒和人副流感病毒感染以及相关疾病。在某些其它实施方式中，利用本发明疫苗制剂提供保护以抵御禽肺病毒、呼吸道合胞体病毒和人副流感病毒感染以及相关疾病。
由于不同病毒种类的F蛋白之间的高度同源性，可利用本发明疫苗制剂提供保护以抵御与产生编码F蛋白的异源核苷酸序列的病毒不同的病毒感染。在一具体的示范性实施方式中，疫苗制剂所含的病毒含有源自A型禽肺病毒的异源核苷酸序列，可用该疫苗制剂提供保护以抵御A型禽肺病毒和B型禽肺病毒所致感染。本发明包括要给予人和动物的疫苗制剂，所述制剂可用于提供保护以抵御APV(包括APV-C和APV-D)、hMPV、PIV、流感病毒、RSV、仙台病毒、腮腺炎(病毒)、禽传染性喉气管炎病毒、猿猴病毒5、人乳头瘤病毒、麻疹(病毒)、腮腺炎(病毒)及其它病毒和病原体以及相关疾病。本发明还包括要给予人和动物的疫苗制剂，所述制剂可提供保护以抵御人偏肺病毒感染和禽肺病毒感染以及相关疾病。
在一个实施方式中，本发明包括可用于抵御引起家养动物疾病的致病因子，包括狂犬病病毒、猫白血病病毒(FLV)和犬瘟热病毒的疫苗制剂。在还有另一实施方式中，本发明的疫苗制剂可用于保护家畜抵御水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒、牛瘟麻疹病毒、猪痘病毒，还能保护野生动物抵御狂犬病病毒感染。
可采用反向遗传学方法产生的减毒病毒可用于本文所述的疫苗和药物制剂中。也可采用反向遗传学技术在产生疫苗至关重要的其它病毒基因中加入突变，即可将有用的疫苗毒株变体的表位经工程改造加入减毒病毒中。或者，可将完整的外源表位，包括源自其它病毒或非病毒病原体的抗原经工程改造加入减毒株中。例如，可将不相关病毒的抗原，如HIV(gp160、gp120、gp41)、寄生虫抗原(如疟原虫)、细菌或真菌抗原或肿瘤抗原经工程改造加入减毒株中。或者可将改变病毒体内嗜性的表位经工程改造加入本发明的嵌合型减毒病毒中。
实际上可将任何异源基因序列构建入用于疫苗的本发明嵌合型病毒中。部分和肽最好用作生物反应修饰剂。能诱导针对各种病原体的保护性免疫应答的表位或能结合中和抗体的抗原可由该嵌合型病毒表达或表达为嵌合型病毒的一部分。例如，可构建入本发明嵌合型病毒中的异源基因序列包括但不限于流感和副流感血凝素神经氨酸酶和融合糖蛋白(的基因)，例如人PIV3的HN基因和F基因。在还有另一实施方式中，可经工程改造入嵌合型病毒中的异源基因序列包括编码具有免疫调节活性蛋白质的那些序列。免疫调节活性蛋白质的例子包括但不限于：细胞因子、1型干扰素、γ干扰素、集落刺激因子、白介素-1、-2、-4、-5、-6、-12和这些因子的拮抗剂。
此外，可构建加入用于疫苗的本发明嵌合型病毒中的异源基因序列包括但不限于：源自人免疫缺陷型病毒(HIV)，优选1型或2型的序列。在一优选的实施方式中，可将可能作为抗原来源的HIV-衍生的免疫原性肽构建加入嵌合型PIV中，再用于引发脊椎动物免疫应答。这种HIV-衍生的肽可包括但不限于：源自env基因(即，编码gp160、gp120和/或gp41的全部或部分的序列)、pol基因(即，编码逆转录酶、核酸内切酶、蛋白酶和/或整合酶的全部或部分的序列)、gag基因(即，编码p7、p6、p55、p17/18、p24/25的全部或部分的序列)、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr和/或vpx的序列。
其它异源序列可源自乙肝病毒表面抗原(HBsAg)；甲肝或丙肝病毒表面抗原；EB病毒的糖蛋白；人乳头瘤病毒的糖蛋白；呼吸道合胞体病毒、副流感病毒、仙台病毒、猿猴病毒5或腮腺炎病毒的糖蛋白；流感病毒的糖蛋白；疱疹病毒的糖蛋白；脊髓灰质炎病毒的VP1；非病毒病原体，例如细菌和寄生虫的抗原性决定簇，仅举几例。在另一实施方式中，可以表达免疫球蛋白基因的所有或一部分。例如，可将能模拟这种表位的抗独特型免疫球蛋白的可变区构建加入本发明嵌合病毒中。
其它异源序列可源自肿瘤抗原，可产生的嵌合型病毒在体内诱导能导致肿瘤消退的抗肿瘤细胞免疫应答。为治疗肿瘤，可联用这些疫苗和其它治疗方案，包括但不限于化疗、放疗、外科手术、骨髓移植等。按照本发明，可工程改造重组病毒以表达肿瘤相关抗原(TAA)，包括但不限于T细胞能识别的人肿瘤抗原(全文纳入本文作为参考的Robbins和Kawakami，1996，Curr.Opin.Immunol.8：628-636)，黑色素瘤谱系蛋白，包括gp100，MART-1/MelanA，TRP-1(gp75)，酪氨酸酶；广泛共有的肿瘤特异性抗原，MAGE-1、MAGE-3，BAGE、GAGE-1、GAGE-1、N-乙酰葡糖氨基转移酶-V、p15；突变的肿瘤特异性抗原、β-连环蛋白、MUM-1、CDK4；乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和胰腺癌的非黑色素瘤抗原、HER-2/neu、人乳头瘤病毒-E6、-E7、MUC-1。
在甚至其它实施方式中，异源核苷酸序列源自偏肺病毒，例如人偏肺病毒和/或禽肺病毒。在甚至其它实施方式中，本发明病毒含有两种不同的异源核苷酸序列，其中一种源自偏肺病毒，例如人偏肺病毒和/或禽肺病毒，另一种源自呼吸道合胞体病毒。所述异源核苷酸序列编码各病毒的F蛋白或G蛋白。在一具体实施方式中，异源核苷酸序列编码嵌合型F蛋白，所述嵌合型F蛋白含有偏肺病毒F蛋白的胞外域和副流感病毒F蛋白的跨膜结构域以及腔内结构域。
可以配制重组活病毒疫苗或灭活的重组病毒疫苗。优选活疫苗，因为在宿主中扩增导致的长期刺激与天然感染中发生的刺激在类型和幅度上相似，因而能赋予实质上持续时间长的免疫力。可采用常规方法制备这种重组的活病毒疫苗制剂，包括在细胞培养物或鸡胚的尿囊中增殖病毒，然后纯化。
在一具体实施方式中，重组病毒对于所给予的对象不致病。就这点而言，用于疫苗目的经遗传工程改造的病毒可能需要这些毒株存在减毒特征。将合适的突变(例如，缺失)引入用于转染的模板中可提供具有减毒特征的新型病毒。例如，可在缺失突变中制作与温度敏感性或冷适应性有关的特异性错义突变。这些突变应比冷适应或温度敏感性突变体有关的点突变更稳定，回复频率应极低。
或者，可构建具有“自杀”特征的嵌合型病毒。这种病毒在宿主体内只复制一轮或几轮。当将该重组病毒用作疫苗时，其可经历有限的几轮复制并诱导足够水平的免疫应答，但它在人宿主中不会再复制而致病。与野生型毒株相比，分别缺乏野生型APV和hMPV的一种或多种基因或具有突变基因的重组病毒不能连续复制。缺陷型病毒可以在能永久表达这样的一种或多种基因的细胞系中复制。缺乏必须基因的病毒可以在这些细胞系中复制，但当给予人宿主时不能完成一轮复制。这种制品可以转录和翻译(在该不完整的轮次中)足够数量的基因来诱导免疫应答。或者，可以给予大量的毒株，从而这些制品可用作灭活(杀伤)病毒疫苗。对于灭活疫苗，优选将异源基因产物表达为病毒组分，从而使得该基因产物可与病毒体结合。这种制品的优点在于它们是天然病毒并且不必在生产杀伤病毒疫苗过程中用福尔马林或其它试剂处理使之灭活。或者，从cDNA制备的本发明重组病毒可以高度减毒，因而其只能复制几轮。
在某些实施方式中，本发明疫苗包含减毒的哺乳动物MPV。不想局限于理论，减毒病毒可以是有效的疫苗，即使该减毒病毒不能使细胞产生新的传染性病毒颗粒，因为病毒蛋白插入宿主的胞质膜，从而刺激了免疫应答。
在本发明该方面的另一实施方式中，可采用常规技术“杀伤”嵌合型病毒来制备灭活疫苗制剂。在其传染力被破坏的意义上，灭活疫苗是“死的”。优选破坏病毒的传染力而不影响其免疫原性。可用细胞培养物或鸡胚的尿囊培养该嵌合型病毒，然后进行区带超离心纯化，甲醛或β-丙内酯灭活以及合并。得到的疫苗通常肌肉内接种。
可用合适的佐剂配制灭活的病毒以增强免疫应答。这种佐剂可包括但不限于矿物凝胶，例如氢氧化铝；表面活性物质，例如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子；可能有用的人佐剂，例如BCG、短小棒状杆菌、ISCOMS和病毒颗粒。
可采用许多方法引入上述疫苗制剂，这些方法包括但不限于口服、真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、经皮和鼻内以及吸入途径。优选通过设计该疫苗的病原体天然感染途径接种此嵌合型病毒疫苗制剂。
在某些实施方式中，本发明涉及免疫原性组合物。该免疫原性组合物含有哺乳动物MPV。在一具体实施方式中，该免疫原性组合物含有人MPV。在某些实施方式中，该免疫原性组合物含有减毒的哺乳动物MPV或减毒的人MPV。在某些实施方式中，该免疫原性组合物还含有药学上可接受的载体。
5.13 剂量方案、给药和制剂
本发明提供含有能表达一种或多种异源或非天然抗原序列的MPV和APV的疫苗和免疫原性制品，包括减毒形式的病毒、重组形式的MPV和APV、嵌合型MPV和APV。本发明疫苗或免疫原性制品包括单价疫苗或多价疫苗，包括双价和三价疫苗。本发明疫苗或免疫原性制剂可用于提供抵御各种病毒感染的保护作用。特别是，本发明疫苗或免疫原性制剂可在宿主中提供抵御呼吸道感染的保护作用。
可单独给予本发明的重组病毒和/或疫苗或免疫原性制剂，或可与其它疫苗联合给予。本发明疫苗或免疫原性制剂优选与能提供抵御呼吸道疾病保护作用的其它疫苗或免疫原性制剂联合给予，所述其它疫苗或免疫原性制剂例如但不限于：呼吸道合胞体病毒疫苗、流感疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、肺炎球菌疫苗、立克次氏体疫苗、葡萄球菌疫苗、百日咳疫苗或抵御呼吸道癌症的疫苗。在一优选实施方式中，本发明病毒和/或疫苗与相应年龄推荐的儿科疫苗同时给予。例如，在2、4或6月龄时，将本发明病毒和/或疫苗与DtaP(肌肉内)、Hib(肌肉内)、脊髓灰质炎疫苗(IPV或OPV)和乙肝疫苗(肌肉内)同时给予。在12或15月龄时，将本发明病毒和/或疫苗与Hib(肌肉内)、脊髓灰质炎疫苗(IPV或OPV)、MMRII
Figure A200680015321D0097085900QIETU
(SubQ)、Varivax
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(SubQ)和乙肝疫苗(肌肉内)同时给予。以下各种出版物总结了本发明方法可用的疫苗，例如，The Jordan Report2000(《乔丹报告》)，Division of Microbiology and Infectious Diseases(微生物和传染性疾病分册)，National Institute of Allergy and Infectious Diseases(国家变态反应和传染性疾病研究院)，National Institutes of Health(国家卫生研究院)，美国，其内容全文纳入本文作为参考。
可将本发明疫苗或免疫原性制剂本身单独给予或以药物组合物或治疗性组合物的形式给予。可通过常规的混合、溶解、成粒、制锭、研磨、乳化、包裹、截留或冻干方法生产含有佐剂和本发明免疫原性抗原(例如，病毒、嵌合型病毒、突变病毒)的药物组合物。可用有助于将本发明抗原制备成药学上可用的制品的一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅助物质，以常规方式配制药物组合物。合适的制剂取决于所选择的给药途径等。
当本发明疫苗或免疫原性组合物包含佐剂或与一种或多种佐剂一起给予时，可用的佐剂包括但不限于：矿物盐佐剂或矿物盐凝胶佐剂、颗粒佐剂、微粒佐剂、粘膜佐剂和免疫刺激性佐剂。佐剂的例子包括但不限于：氢氧化铝、磷酸铝凝胶、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、角鲨烯或角鲨烯水包油佐剂制剂、生物可降解和生物相容的聚酯、多聚脂质体、三萜糖苷或皂苷(如QuilA和QS-21，也以商品名STIMULON、ISCOPREP销售)、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(苏氨酰基-MDP，以商品名TERMURTIDE出售)、LPS、单磷酰脂质A(3D-MLA，以商品名MPL出售)。
本发明疫苗或免疫原性组合物所给予的对象优选哺乳动物、最优选人，但也可以是非人动物，包括但不限于：灵长类动物、牛、马、绵羊、猪、家禽(如鸡、火鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、小鼠和啮齿类动物。
可采用许多方法引入本发明疫苗或免疫原性组合物，包括但不限于口服、真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、经皮、鼻内和吸入途径以及通过划痕法(例如，使用分叉针头在皮肤表层划痕)。
如本领域熟知的那样，对于局部给药，可将本发明疫苗或免疫原性制品配制成溶液、凝胶、软膏、乳膏、混悬液等。
对于鼻内或吸入给药，本发明所用的制品不难以气溶胶喷剂形式递送，所述气溶胶用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体装在加压袋或喷雾器中。以加压气溶胶为例，可用阀门确定单位剂量来递送计量用量。可在用于吸入器或吹入器的(例如)明胶胶囊和药盒中装入由化合物和合适粉基，例如乳糖或淀粉构成的粉末混合物。
对于注射，可用水溶液，优选生理相容的缓冲液，例如汉克斯液、林格液或生理盐水缓冲液配制疫苗或免疫原性制品。所述溶液可含有配制剂(formulatoryagent)，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，蛋白质可以是粉末形式，从而能在临用前用合适的载体，例如无菌无热原水构建。
本领域技术人员熟知如何确定给予的疫苗或免疫原性制剂的有效量，特别是借鉴本文的详述。
首先可通过体外试验估计有效剂量。例如，可采用本领域熟知的技术在动物模型中确定诱导免疫应答的剂量。本领域普通技术人员根据本文所述结果不难优化各种动物种类的给药。可个别调整剂量和间隔。例如，当用作免疫原性组合物时，合适剂量是如上所述给予该组合物时能引发抗体反应的用量。当用作疫苗时，可在1-36周内分成约1-3剂量给予本发明疫苗或免疫原性制剂。优选以约2周-约4个月的间隔给予1或2剂量，此后可定期给予加强接种。交替方案可能适合于单个动物。合适剂量是如上所述给予时，能在免疫动物体内产生足以保护该动物免遭感染至少4-12个月的免疫应答的疫苗制剂用量。一剂量中存在的抗原量一般是每公斤宿主体重约1pg-约100mg，通常是约10pg-约1mg，优选约100pg-约1μg。合适的剂量范围根据注射途径和患者体积而有所不同，但通常是约0.1mL-约5mL。
在一具体实施方式中，给予本发明病毒和/或疫苗的起始单剂量是至少103TCID50、至少104TCID50、至少105TCID50、至少106TCID50。另一具体实施方式给予多剂量的本发明病毒和/或疫苗。一优选实施方式采用在第2、4和6月龄给予初免给药方案，在出生第二年开始时给予加强剂量。更优选多剂量方案中每剂量给予了至少105TCID50或至少106TCID50。
5.13.1 攻击研究
采用本试验确定本发明重组病毒和本发明疫苗在动物模型，例如但不限于棉鼠或仓鼠中防止下呼吸道病毒感染的能力。可通过静脉内(IV)途径、肌肉内(IM)途径或鼻内途径(IN)给予该重组病毒和/或疫苗。可通过技术人员熟知的任何技术给予该重组病毒和/或疫苗。也可采用该试验使抗体的血清浓度与结合该抗体的病毒的肺滴度降低相关联。
在第0天，通过肌肉内注射、静脉内注射或鼻内途径给予各动物组，例如但不限于棉鼠(Sigmodon hispidis，平均体重100g)、弥猴(平均体重2.0kg)感兴趣的重组病毒或疫苗或BSA。可在给予本发明重组病毒或疫苗之前、同时或随后用野生型病毒感染动物，其中所述野生型病毒是用于产生该疫苗的病毒。在某些实施方式中，给予本发明重组病毒和/或疫苗至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、1周或1个月或几个月后用野生型病毒感染动物。
感染后，处死棉鼠，收集它们的肺组织，通过噬斑滴定测定肺部病毒滴度。10mg/kg的牛血清白蛋白(BSA)用作阴性对照。采用夹心ELISA测定攻击时血清中抗体的浓度。类似地，检测弥猴的鼻和肺灌洗液中的病毒滴度。
5.13.2 靶群体
在本发明的某些实施方式中，通过年龄确定本发明治疗和诊断方法的靶群体。在某些实施方式中，本发明治疗和/或诊断方法的靶群体的特征是患有除呼吸道感染外的疾病。
在一具体实施方式中，靶群体包括小于2岁的幼儿。在一更具体的实施方式中，小于2岁的儿童未患除呼吸道感染以外的疾病。
在其它实施方式中，靶群体包括大于5岁的患者。在一更具体的实施方式中，大于5岁的患者患有其它疾病或病症，包括囊性纤维化、白血病和非霍奇金淋巴瘤或最近接受了骨髓或肾脏移植。
在本发明一具体实施方式中，靶群体包括其中hMPV感染伴有宿主免疫抑制的对象。在一具体实施方式中，所述对象是免疫受损的个体。
在某些实施方式中，本发明方法的靶群体包括老年人。
在一具体实施方式中，要用本发明方法治疗或诊断的对象在冬季受到hMPV感染。
5.13.3 临床试验
还可在正常健康成年志愿者组中评估经体外试验和动物模型检验的本发明疫苗或其片段的安全性、耐受性和药物动力学。可经肌肉内、静脉内或肺部递送系统给予志愿者单剂量的本发明重组病毒和/或本发明疫苗。各志愿者在接受单剂量的本发明重组病毒和/或本发明疫苗之前至少监测24小时，各志愿者在临床部位接受剂量后至少监测48小时。然后在给药后第3、7、14、21、28、35、42、49和56天监测作为门诊病人的志愿者。
在以下间隔时通过留置导管或用10ml红头Vacutainer试管直接静脉穿刺收集血样：(1)给予本发明重组病毒和/或本发明疫苗剂量前；(2)给予本发明重组病毒和/或本发明疫苗剂量期间；(3)给予本发明重组病毒和/或本发明疫苗剂量5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、和48小时后；和(4)给予本发明重组病毒和/或本发明疫苗剂量3天、7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天和56天后。使样品在室温下凝固，离心后收集血清。
可通过ELISA定量测定患者样品中本发明重组病毒和/或本发明疫苗产生的抗体量。也可监测PBMC和肺及鼻灌洗液中的T-细胞免疫力(细胞毒性和辅助应答)。
从给予本发明重组病毒和/或本发明疫苗剂量后各收集间隔的血清抗体水平中扣除给药前血清抗体水平(背景水平)来校正志愿者血清中抗体的浓度水平。按照不依赖于模型的方法(Gibaldi等编，1982，Pharmacokinetics(《药物动力学》)，第二版，Marcel Dekker，纽约)从校正的血清抗体浓度或抗体片段浓度计算各志愿者的药物动力学参数。
5.14 哺乳动物MPV的检测和诊断方法
本发明提供诊断和/或检测MPV的手段和方法，所述手段和方法用于检测MPV、其组分及其转录、翻译、表达、增殖和代谢过程的产物。更具体地说，本发明提供诊断哺乳动物和人MPV感染的手段和方法，所述手段和方法包括但不限于检测MPV的各组分、MPV生命周期的产物和宿主对MPV表达或感染起反应的产物。
本领域熟知用于检测MPV或其组分及其转录、翻译、表达、增殖和代谢过程的产物的方法，包括但不限于：分子方法、抗体方法和细胞方法。分子方法的例子包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶转录PCR(RT-PCR)、实时RT-PCR、核酸序列扩增(NASBA)、寡核苷酸探针、sourthern印迹杂交、northern印迹杂交、涉及使样品与MPV互补的或与MPV相似或相同的核酸接触的方法和这些方法彼此或与本领域那些方法的任何组合。可用本文描述的本领域也熟知的相同或相似核酸来区分MPV与其它病毒和生物的基因组物质或相关产物。抗体方法的例子包括但不限于：使抗体与怀疑含MPV的样品接触，直接免疫荧光法(DIF)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹分析、免疫层析。细胞方法的例子包括但不限于：当与MPV、其组分或其产物接触时能发出信号的报道试验。在另一实施方式中，所述报道试验是体外试验，从而在与MPV、其组分或其产物接触后表达报道(基因)产物。本领域熟知上述方法的例子，本文也描述了这些例子。一更具体的实施方式利用NASBA扩增总核酸库的特异性RNA或DNA。
在一个实施方式中，本发明提供诊断和检测MPV的手段和方法，所述手段和方法包括但不限于：检测与MPV相关或互补的基因组物质和其它核酸，检测MPV的转录和翻译产物(所述产物经过加工或未加工)，检测宿主对MPV接触或感染起反应的组分。
在一个实施方式中，本发明涉及通过制备和使用与MPV基因组中存在的核酸序列及核酸序列转录产物互补的寡核苷酸来检测MPV。此外，本发明涉及利用所述寡核苷酸作为引物拷贝或扩增MPV基因组及其转录物的特定区域来检测MPV基因组及其转录产物中存在的核酸或其序列。可拷贝或扩增的MPV基因组及其转录物的区域包括但不限于以下一个或多个基因的完整和不完整的延伸段：N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在一具体实施方式中，为鉴定目的，将寡核苷酸用作引物结合拷贝或扩增MPV的N-基因或其转录物的方法。所述方法包括但不限于：利用MPV的遗传物质或其转录物和互补物作为延伸所述寡核苷酸核酸序列的模板的PCR试验、RT-PCR试验、实时RT-PCR试验、引物延伸或连缀试验、NASBA和其它方法。另一实施方式采用组合方法检测样品中是否存在MPV。本领域技术人员熟悉各试验的要求和适用性。例如，PCR和RT-PCR可用于扩增或检测核酸。一更具体的实施方式采用实时RT-PCR来常规而可靠地定量测定PCR产物。
在另一实施方式中，本发明涉及通过制备和使用与MPV基因组中存在的核酸序列及核酸序列转录产物互补的寡核苷酸来检测MPV。此外，本发明涉及利用所述寡核苷酸序列作为探针杂交和检测MPV基因组及其转录物内或与之互补的特定区域来检测MPV基因组及其转录产物中存在或与之互补的核酸或其序列。可利用杂交探针检测的MPV基因组及其转录物的区域包括但不限于以下一个或多个基因的完整和不完整的延伸段：N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在一具体实施方式中，为鉴定目的，将寡核苷酸用作探针，联合检测MPV的N-基因或其转录物或与N-基因或其转录物退火或杂交。所述方法包括但不限于：利用MPV的遗传物质或其转录物和互补物作为靶标来杂交、退火或检测MPV基因组内或与其互补的序列或序列延伸段的Northern印迹、Sourthern印迹和其它方法。
本发明方法可用能与哺乳动物MPV的核酸杂交的核酸或其反向互补物或其互补物来检测是否存在哺乳动物MPV。在某些实施方式中，核酸在高度严格性条件下杂交。例如(但不限于)，采用这种高度严格性条件的方法如下所示。65℃，将含DNA的滤膜在由6×SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.02％ BSA和500μg/ml变性鲑鱼精子DNA组成的缓冲液中预杂交8小时到过夜。65℃，将滤膜在含100μg/ml变性鲑鱼精子DNA和5-20×106cpm的32P-标记探针的预杂交混合物中杂交48小时。37℃，用含2×SSC、0.01％ PVP、0.01％ Ficoll和0.01％ BSA的溶液洗涤滤膜1小时。然后在50℃先用0.1×SSC洗涤45分钟，再进行放射自显影。本领域熟知可用的其它高严格性条件。在本发明的其它实施方式中，在技术人员熟知的中等到低严格性条件下进行杂交(参见，例如Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(《分子克隆，实验室手册》)，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；也参见Ausubel等编，刊于Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory techniquemanuals(《分子生物学最新方法，实验室技术手册丛书》)，1987-1997，CurrentProtocols，
Figure A200680015321D0103090125QIETU
1994-1997，John Wiley and Sons，Inc.，二者各自全文纳入本文作为参考)。
本发明方法可用任何大小的寡核苷酸。如本文所述，这种寡核苷酸可用于各种方法，例如作为各种检测或分析方法的引物或探针。在优选的实施方式中，寡核苷酸探针和引物长至少5个、至少8个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少70个、至少80个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少2000个、至少3000个、至少4000个或至少5000个碱基。在另一更可靠的实施方式中，寡核苷酸探针和引物含有至少5个、至少8个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少70个、至少80个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少2000个、至少3000个、至少4000个或至少5000个碱基，与靶序列，例如MPV基因组序列或其互补序列有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％、至少99.5％同源。在另一具体实施方式中，用作引物或探针的寡核苷酸可以是任何长度，在严格性条件下可通过其大多数3’末端碱基的至少8个与靶序列特异性杂交。在另一具体实施方式中，用作引物或探针的寡核苷酸可以是任何长度，在严格性条件下可通过其大多数3’末端碱基的至少10个与靶序列特异性杂交。在另一具体实施方式中，用作引物或探针的寡核苷酸可以是任何长度，在严格性条件下可通过其大多数3’末端碱基的至少12个与靶序列特异性杂交。在另一具体实施方式中，用作引物或探针的寡核苷酸可以是任何长度，在严格性条件下可通过其大多数3’末端碱基的至少15个与靶序列特异性杂交。在另一具体实施方式中，用作引物或探针的寡核苷酸可以是任何长度，在严格性条件下可通过其大多数3’末端碱基的至少20个与靶序列特异性杂交。在另一具体实施方式中，用作引物或探针的寡核苷酸可以是任何长度，在严格性条件下可通过其大多数3’末端碱基的至少25个与靶序列特异性杂交。另一实施方式利用寡聚物的简并组(degenerate set)来取代特定位置或核苷酸。简并可发生在严格性条件下能与靶序列杂交区域任何位置或任何数量的位置，最优选在至少一个位置，但也可在至少两个位置、至少三个位置、至少十个位置。
本领域技术人员熟悉本领域已知试验对寡核苷酸上结构的要求。也可用多种系统方法设计寡核苷酸引物和探针。例如，本领域技术人员根据优选的试验或退火温度和寡聚物，即序列的结构能确定寡核苷酸引物或探针的合适长度和序列。此外，本领域技术人员通过调节试验的温度能确定试验所用寡核苷酸引物或探针的特异性，从而能根据温度增强或减弱该寡聚物对靶序列的特异性。一优选实施方案采用本领域已知方法测定引物或探针的退火温度后，在所述退火温度进行该试验。本领域技术人员熟悉这些方法来计算寡核苷酸与其特异性靶序列结合的退火温度。例如，可通过将与靶序列杂交的寡核苷酸中各G或C核苷酸的退火温度设定为4℃来粗略计算退火温度。在另一实例中，可通过将与靶序列杂交的寡核苷酸中各A或T核苷酸的退火温度设定为2℃来粗略计算退火温度。寡核苷酸的退火温度必定依赖于该寡核苷酸的长度和序列，也依赖于该寡聚物与其靶序列的互补程度，因此退火温度只考虑寡聚引物或探针之间的结合情况。本文所述计算退火温度的例子只是例子，不表示本发明不包括测定退火温度的其它方法。本领域技术人员熟悉其它的可用方法，此外，本文描述了计算寡核苷酸退火温度或解链温度的其它更复杂的方法。在一更具体的实施方式中，寡核苷酸探针和引物在至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少45℃、至少50℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少80℃、至少90℃或至少99℃的温度下退火。
本发明提供鉴定或检测样品中MPV的细胞试验和无细胞试验。可采用各种方法进行本发明的细胞试验和无细胞试验，包括但不限于利用报道(基因)的那些方法。本文描述了报道(基因)的例子，这些报道(基因)可用于高通量筛选MPV的鉴定或检测，也可用于本领域技术人员熟悉的其它目的。本发明报道试验可采用许多方法。例如，可使样品与包含核酸序列(其含有报道基因)的细胞接触，和检测与MPV或MPV的组分接触后该报道基因的表达来进行细胞试验，其中所述报道基因与MPV基因的启动子相连，或与MPV基因产物所识别的启动子相连。在细胞试验的另一实施方式中，用编码一种或多种报道基因的核酸构建物转染MPV能感染的宿主细胞，因而报道基因可在有MPV或MPV组分存在下表达。在这种实施方式中，报道基因与MPV或其组分所识别的核酸序列操作性相连，从而导致该报道基因表达。可采用本领域已知的任何方法检测样品中MPV诱导的报道基因表达，本文也描述了这些报道基因(章节5.8.2)。在细胞检测试验中可用于转染的宿主细胞例子包括但不限于：Vero、tMK、COS7细胞。在另一实施方式中，宿主细胞是可用MPV感染的任何细胞。因此，报道基因表达表明存在MPV或其组分。在无细胞试验中，使样品与含报道基因的核酸接触，所述报道基因与该核酸序列操作性相连，因而存在的MPV或其组分诱导了报道基因的体外表达。例如，可使怀疑含有MPV或其组分的样品与含报道基因的核酸接触，和检测与MPV或MPV的组分接触后该报道基因的表达来进行无细胞试验，其中所述报道基因与MPV基因的启动子相连，或与MPV基因产物识别的启动子相连。因此，报道基因的表达表明存在MPV或其组分。尽管本领域已知大量报道化合物，但本文提供了各种例子(参见，例如章节5.8.2)。
在另一实施方式中，本发明涉及利用小复制子系统检测MPV感染。例如，可用编码一种或多种报道基因的hMPV小复制子构建物转染宿主细胞，因而报道基因在有hMPV或hMPV聚合酶存在下表达。本文在章节5.8.2描述了报道基因的例子。在这种实施方式中，hMPV用作辅助病毒来促进小复制子系统所编码的一种或多种报道基因表达。不想局限于理论，hMPV提供的聚合酶能驱动小复制子系统的拯救，因而驱动了一种或多种报道基因的表达。在某些实施方式中，将用编码报道基因的hMPV小复制子系统转染的宿主细胞与怀疑含有hMPV的样品接触。可采用本领域已知的任何方法检测样品中存在hMPV诱导的报道基因表达，本文也描述了这些报道基因(章节5.8.2)。宿主细胞的例子包括但不限于：Vero、tMK、COS7细胞。在另一实施方式中，宿主细胞是能用hMPV感染任何细胞。
在另一实施方式中，本发明涉及通过制备和使用特异性能识别MPV或其基因产物的特征性肽或核酸的抗体，例如单克隆抗体(MAb)来检测动物或人宿主中的MPV感染。所述MAb识别的表位或抗原性决定簇包括但不限于参与MPV生命周期和增殖的代谢过程中合成的蛋白与核酸产物。可用作抗原性决定簇来产生合适抗体的蛋白或核酸产物包括但不限于以下一种或多种MPV组分的完整和不完整转录和表达产物：N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在一具体实施方式中，将产生的针对G-基因的蛋白质产物或其诸部分的MAb与其它方法联用来检测或验证生物学样品，例如体液中MPV表达的G肽。所述方法包括但不限于：利用MPV基因的转录或表达产物作为靶标来检测产生的抗所述靶标或其诸部分及相关物质的MAb的ELISA、放射性免疫或竞争试验、免疫沉淀和其它方法。在本发明的另一实施方式中，可用于检测hMPV的抗体能识别所有四种亚型的F、G、N、L、M、M2-1、P和SH蛋白。
在另一实施方式中，本发明涉及检测宿主对MPV接触或感染的免疫应答有关的和特征性的因素。接触或感染MPV后，宿主的免疫系统对所述接触或感染引发应答反应，包括宿主产生的能消除或减轻病毒作用和/或增殖的抗体。本发明提供通过检测宿主因接触或感染MPV而产生的上述抗体来诊断MPV相关疾病的手段和方法。所述抗体识别的表位包括但不限于宿主免疫应答可接近并且在宿主对病毒产生免疫应答中可用作抗原性决定簇的肽及其暴露的表面。可用作表位诱导宿主免疫应答产生抗体的一些蛋白质与核酸物质包括但不限于以下一种或多种MPV组分的产物：N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在一个实施方式中，在宿主样品中检测到针对MPV N-基因编码肽的部分或完全可接近部分的抗体。在一具体实施方式中，将针对G-基因的蛋白产物或其诸部分与其它方法联用来检测生物学样品，例如体液中存在的宿主抗体。所述方法包括但不限于：利用MPV基因的转录或表达产物作为靶标来检测识别所述产物并在生物学样品中发现的宿主抗体的ELISA、放射性免疫或竞争试验和其它方法。
本发明也提供诊断试验用的手段和方法，或检验试剂盒以检测各种来源，包括但不限于生物学样品，例如体液中MPV感染的方法。在一个实施方式中，本发明涉及适用于鉴定MPV核酸或其互补物的试验、试剂盒、方法和工艺。在另一实施方式中，本发明涉及适用于鉴定MPV表达的肽或其一部分的试验、试剂盒、方法和工艺。在另一实施方式中，本发明涉及适用于鉴定针对MPV接触或感染的宿主免疫应答诸组分的试验、试剂盒、方法和工艺。
除了诊断性验证宿主的MPV感染外，本发明也提供将MPV分类成不同系统发育群或亚群的手段和方法。在一个实施方式中，优选利用该特征区分MPV的不同变体，变体A1、A2、B1和B2来设计更有效的亚群特异性治疗方法。可根据以下一种或多种基因的核苷酸序列或氨基酸序列来区分MPV的变体：N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在一具体实施方式中，可利用G基因或糖蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列和使用也能识别G糖蛋白的单克隆抗体的中和检验将MPV分成具体亚群。
在一个实施方式中，采用本领域技术人员熟知的任何技术，例如免疫测定诊断人的MPV感染。可用于分析免疫特异性结合与交叉反应性的免疫测定包括但不限于采用以下技术的竞争性和非竞争性试验系统：例如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、夹心免疫测定、免疫沉淀试验、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散试验、凝集试验、补体结合试验和荧光免疫测定，仅举几例。这些试验是本领域常规和熟知的(参见，例如全文纳入本文作为参考的Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology(《最新分子生物学方法》)，第一卷，John Wiley & Sons，Inc.，纽约)，免疫测定的非限制性例子描述于章节5.8.。
在一个实施方式中，本发明涉及联用寡核苷酸检测MPV感染和用PCR或引物延伸方法来拷贝或扩增MPV基因组的区域，所述区域包括但不限于基因或基因的诸部分，例如N、M、F、G、L、M、P和M2基因。在一具体实施方式中，联用寡核苷酸与RT-PCR方法。在另一实施方式中，可用与特定序列互补的寡核苷酸检测扩增产物和/或遗传物质，所述特定序列是各hMPV毒株之间保守的或在各hMPV毒株之间独特的序列。后一组寡核苷酸可以鉴定导致宿主感染的特定MPV毒株。
本发明提供区分能感染宿主的hMPV不同亚群和变体的方法。一具体实施方式将导致宿主感染的hMPV分类成特定亚群，例如亚群A或亚群B。另一具体实施方式将导致宿主感染的hMPV分成某亚群的特定变体，例如变体A1、A2、B1和B2。在另一实施方式中，本发明提供将导致宿主感染的hMPV分类成新亚群和/或新的或现有亚群新变体的手段和方法。本领域技术人员已知将hMPV毒株分类成亚群和/或变体群的方法。在一个实施方式中，利用多克隆抗体将感染病原分类为hMPV某毒株，利用第二抗体将所述毒株区分为hMPV新的或已知的亚群和/或新的或已知的变体。一个实施方式联用对hMPV具有选择性的抗体与免疫反应试验，例如ELISA或RIA来鉴定生物学样品中是否接触或感染了hMPV。另一实施方式利用对hMPV蛋白的肽序列中特定表位具有选择性的第二抗体将鉴定的所述hMPV感染的病原进一步分类成亚群或变体。在一具体实施方式中，利用产生的针对hMPV所有亚群之间共有的肽表位的抗体将感染病原鉴定为hMPV。在另一具体实施方式中，利用产生的针对hMPV不同亚群和/或变体的独特肽表位的抗体将导致宿主感染的hMPV鉴定为已知的或新的亚群和/或变体。在一具体实施方式中，能区分hMPV不同亚群和/或变体的抗体能识别亚群或变体独特hMPV肽的诸区段，所述肽包括但不限于N、M、F、G、L、M、P和M2基因编码的那些肽。可利用各种hMPV蛋白的已知肽序列中的差异与亲水性图来选择可用于产生能区分不同hMPV亚群或变体的抗体的肽或肽区段，所述亲水性图可用于鉴定预计在诊断试验中溶剂可接触或可接近的合适肽区段。在一个实施方式中，能区分hMPV不同亚群的抗体能识别hMPV不同亚群F蛋白中的独特差异，例如全长F蛋白的286、296、312、348和404位的氨基酸。在另一具体实施方式中，能区分hMPV不同亚群和/或变体的抗体能识别hMPV特定亚群或变体G蛋白中独特的区段，例如可利用对应于SEQ ID NO：119氨基酸50-60的G肽序列区分亚群A和B以及变体A1、A2、B1和B2。本发明另一实施方式利用hMPV分离物的核苷酸序列区分hMPV的不同亚群和/或不同变体。一个实施方式联用与hMPV基因组中序列相互补的寡核苷酸序列、引物和/或探针和本领域技术人员已知的方法，例如RT-PCR、PCR、引物连缀试验和各种印迹技术将hMPV感染病原分类为不同亚群和/或变体。一具体实施方式采用RT-PCR，利用生物学样品拷贝或扩增hMPV基因组的特定区段。另一实施方式获得了所述区段的序列，将其与hMPV的已知序列比较，采用所述比较将hMPV毒株分类为不同亚群或变体或将hMPV毒株分类为新的亚群或变体。在另一实施方式中，本发明涉及可用于区分hMPV不同亚群和/或变体的诊断试剂盒。
一优选实施方式用对导致所述感染的所述具体病毒最特异的试剂诊断和/或治疗该病毒感染。在此情况中，这表示优选用对MPV最特异的试剂进行MPV感染的诊断和/或治疗。然而，这绝非表示不能使用特异性较低但交叉反应性足够的试剂，例如因为这些试剂易于获得并足以解决手头的任务。例如，本文在详述中提供了利用源自APV的试剂，特别是源自APV-C的试剂进行病毒学和/或血清学诊断哺乳动物的MPV感染，例如已证明采用专为检测鸟类APV抗体设计的ELISA进行血清学诊断哺乳动物的MPV感染足够可靠。为此目的的特别有用的检验是为检测APV抗体(例如，在血清或蛋黄中)设计的ELISA检验，已知其一种可商品化购得的形式是SVANOVA Biotech AB(Uppsal Science Park Glunten SE-751 83Uppsala，瑞典)生产的APV-Ab SVANOVIR
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。反过来也是一样，例如，本文在详述中提供了利用MPV衍生的试剂进行病毒学和/或血清学诊断哺乳动物的APV感染，例如已证明采用为检测MPV抗体设计的ELISA进行血清学诊断鸟类的APV感染足够可靠。考虑到抗原和抗体具有锁与钥匙的关系，可选择具有足够交叉反应性的合适抗体来检测各种抗原。当然，由于依赖于这种交叉反应性，最好选择对各种病毒的各种(糖)蛋白之间存在同源性氨基酸的试剂(例如，抗原或抗体)，因而与最高同源性蛋白相关的试剂在依赖于所述交叉反应性的检验中最有用。
核酸检测甚至更简单，无需根据各种病毒的异源核酸序列设计引物或探针，因而检测实质上哺乳动物或禽偏肺病毒之间的差异足以根据显示高度同源性的病毒特异性核酸序列的那些延伸段设计或选择引物或探针。对于核酸序列，90％或更高的同源性百分比通常能保证采用严格杂交条件的诊断检验具有充分交叉反应性。
例如，本发明提供病毒学诊断动物，特别是哺乳动物，更具体地说是人的MPV感染的方法，包括通过使所述样品与MPV特异性核酸或本发明抗体反应来测定所述动物样品中是否存在病毒分离物或其组分；还提供血清学诊断哺乳动物MPV感染的方法，包括通过使所述样品与MPV特异性蛋白分子或其片段或本发明抗原反应来测定所述哺乳动物的样品中是否存在特异性抗MPV或其组分的抗体。本发明也提供诊断MPV感染的诊断试剂盒，所述试剂盒中装有MPV、MPV-特异性核酸、蛋白分子或其片段、本发明抗原和/或抗体，优选装有检测所述MPV、MPV-特异性核酸、蛋白分子或其片段、抗原和/或抗体的装置，例如，所述装置含有可激发的基团，如本领域使用的荧光团或酶检测系统(合适的诊断试剂盒形式的例子包括IF、ELISA、中和试验、RT-PCR试验)。为确定尚未鉴定的病毒组分或其合成类似物，例如核酸、蛋白分子或其片段是否能鉴定为MPV特异性，采用本文提供的(例如)系统发育分析通过与已知的MPV序列和已知的非MPV序列(优选用APV-C)进行序列同源性比较，足以分析所述组分的核酸序列或氨基酸序列，例如对于所述核酸或所述氨基酸的延伸段，分别优选比较至少10个、更优选至少25个、还要优选至少40个核苷酸或氨基酸。可以根据所述MPV或非MPV序列的相关程度鉴定该组分或合成类似物。
本发明也提供病毒学诊断哺乳动物MPV感染的方法，包括通过使所述样品与源自APV(优选血清型C)的交叉反应性核酸反应，或能与所述APV反应的交叉反应性抗体反应来测定所述哺乳动物样品中是否存在病毒分离物或其组分；还提供血清学诊断哺乳动物MPV感染的方法，包括使所述样品与源自APV的蛋白分子或其片段或抗原反应来测定所述哺乳动物的样品中是否存在也对APV或其组分具有交叉反应性的抗体。此外，本发明提供最初为检测AVP或AVP-抗体设计的诊断试剂盒在诊断MPV感染，特别是检测人的MPV感染中的应用。
本发明也提供病毒学诊断鸟类APV感染的方法，包括使所述鸟类样品与源自MPV的交叉反应性核酸或能与所述MPV反应的交叉反应性抗体反应来测定所述样品中是否存在病毒分离物或其组分；还提供血清学诊断鸟类APV感染的方法，包括使所述鸟类样品与源自MPV的蛋白分子或其片段或抗原反应来测定所述样品中是否存在也对MPV或其组分具有交叉反应性的抗体。此外，本发明提供最初为检测MPV或MPV-抗体设计的诊断试剂盒在诊断APV感染，特别是检测家禽，例如鸡、鸭或火鸡的APV感染中的应用。
对于用于治疗的诊断，特别是当手头条件造成不能直接采用更同源的方法时，可利用不同哺乳动物MPV间的高度同源性和MPV与其它病毒，例如APV之间的高度同源性。得不到所需疫苗接种，例如抵御MPV感染的紧急疫苗，如当无法得到更具同源性的MPV疫苗时，可用源自APV(优选C型)分离物的疫苗制品，反之亦然，可考虑用源自MPV的疫苗制品接种来抵御APV感染。反向遗传技术也可能产生用作疫苗的嵌合型APV-MPV病毒构建物，其与待减毒至理想水平的各毒株的现场分离物(field isolate)十分不同。相似的反向遗传技术也可能产生用于疫苗制品的嵌合型副黏病毒-偏肺病毒构建物，例如RSV-MPV或P13-MPV构建物。这些构建物尤其可用作组合疫苗来抵御呼吸道疾病。
由于实际上不能区分tMK或其它细胞培养物中MPV导致的CPE与hRSV或hPIV-1导致的CPE，迄今为止未能充分注意到MPV。由于tMK(第三代猴肾细胞，即细胞培养中第三代的MK细胞)与原代或二代培养物相比成本较低而优选使用。此种CPE以及经典副黏病毒科产生的一些CPE特征在于形成合胞体，然后细胞显示快速内部破裂，随后细胞从单层脱离。感染此病毒的细胞通常(但不总是)在原始病毒传代3次后(接种后第10-14天)出现CPE，稍晚于其它病毒，例如hRSV或hPIV-1所致的CPE。
例如，本发明提供的28位严重RTI患儿的鼻咽抽吸物样品中以前未鉴定到副黏病毒。这些儿童的临床症状很大程度上类似于hRSV导致的那些症状。27位患者是5岁以下的儿童，这些患者中有一半年纪在1-12个月之间。另一患者18岁。所有个体患有上呼吸道RTI，症状从咳嗽、肌痛、呕吐和发热到支气管炎和严重的肺炎。这些患者中的大多数住院治疗1-2周。
这些患者的病毒分离物在负对比电子显微镜(negative contrast electronmicroscopy)中显示副黏病毒形态，但不与已知的人和动物副黏病毒的特异性抗血清反应。用产生的针对两种分离物的血清作间接免疫荧光试验(IFA)测定它们彼此紧密相关。这些分离物中9种的序列分析揭示此病毒与APV稍许相关。根据病毒学数据、序列同源性以及基因组构成，我们提出此病毒是偏肺病毒属的成员。血清学检测显示该病毒是一种相当常见的病原体，因为在荷兰5岁人的血清阳性率接近100％。此外，发现1958年收集的人血清中血清阳性率同样高，表明在人群中已流行了40年以上。鉴定到偏肺病毒属所提出的新成员也为开发病毒性呼吸道感染的诊断试验或检验试剂盒和疫苗或血清或抗体组合物的装置和方法，及检验或筛选用于治疗MPV感染的抗病毒剂的方法提供了依据。
本文提供的病毒学或血清学方法和手段特别可用于诊断MPV感染的诊断试剂盒。例如，这种试剂盒或试验可包含本发明病毒、核酸、蛋白分子或其片段、抗原和/或抗体。本发明病毒、核酸、蛋白分子或其片段、抗原和/或抗体也可用于产生，例如治疗或预防MPV感染和/或治疗或预防呼吸道疾病(特别是人中)的药物组合物。为此目的开发的已有方法可实现病毒的减毒，包括但不限于：利用其它种类的相关病毒，通过实验室动物或/和组织/细胞培养物连续传代，分子克隆的定点诱变及相关病毒之间的基因或基因片段交换。
已描述了hMPV的四种不同亚型，称为亚型A1、A2、B1和B2。本发明涉及利用对所有四种亚型敏感的一次试验检测宿主的hMPV感染。可采用本领域已知的任何方法检测宿主中是否存在hMPV。本发明一更具体的实施方式采用灵敏的Taqman试验检测宿主中是否存在hMPV。本领域技术人员熟悉用于这种试验中的寡核苷酸和探针的设计要求。可将这种寡核苷酸和探针设计成能特异性识别hMPV基因组的任何区域、其转录物或加工和未加工产物。在本发明一更具体实施方式中，本发明寡核苷酸和探针与hMPV所有亚型中的某序列、其转录物或其加工和未加工产物，例如A1、B1、A2和B2互补、相同或相似。具体地说，所述寡核苷酸和探针与hMPV所有四种亚型的序列、其转录物或加工和未加工产物的负拷贝(negative copy)或正拷贝(positive copy)有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99.5％相同。在另一实施方式中，其与hMPV所有四种亚型的序列的负拷贝或正拷贝互补。任何长度的寡核苷酸和探针可用于本发明检测试验。本领域已知可用的典型杂交和洗涤条件。这些条件优选能使探针特异性结合和防止非特异性结合或易于清除非特异性结合。在本发明还有另一更具体的实施方式中，本发明寡核苷酸和探针与hMPV基因组内的任何开放读框，包括但不限于N-基因、P-基因、F-基因、M-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因，或其加工和未加工产物互补。在本发明甚至更具体的实施方式中，本发明寡核苷酸和探针识别N-基因、其转录物或其加工和未加工产物。在还有另一实施方式中，以相同特异性识别所有四种亚型的hMPV。
可分离获自宿主的任何生物学样品中的病毒。在本发明一更具体的实施方式中，收集宿主鼻咽样品用于本发明检测试验。为检测目的可用能支持hMPV的各种细胞系，包括但不限于Vero和tMK细胞增殖病毒。可采用技术人员已知的许多方法检测病毒RNA。在一具体实施方式中，采用Taqman PCR方法检测病毒RNA。
5.15 本发明组合物与哺乳动物偏肺病毒组分
本发明也涉及哺乳动物MPV的核酸序列、哺乳动物MPV的蛋白质和针对哺乳动物MPV的抗体。本发明还涉及哺乳动物MPV的核酸序列的同系物和哺乳动物MPV的蛋白质的同系物。本发明还涉及编码融合蛋白核酸序列，其中所述融合蛋白含有哺乳动物MPV的蛋白质或其片段和并非源自哺乳动物MPV的一种或多种肽或蛋白质。在一具体实施方式中，本发明融合蛋白含有哺乳动物MPV的蛋白质或其片段和肽标签，例如但不限于聚组氨酸标签。本发明还涉及融合蛋白，其中所述融合蛋白含有哺乳动物MPV的蛋白质或其片段和并非源自哺乳动物MPV的一种或多种肽或蛋白质。本发明也涉及编码哺乳动物MPV蛋白质的核酸的衍生物。本发明也涉及哺乳动物MPV的蛋白质的衍生物。衍生物可以是但不限于蛋白质的突变形式，例如但不限于添加、缺失、截短、取代和翻转。衍生物还可以是嵌合形式的哺乳动物MPV蛋白质，其中所述蛋白质的至少一个结构域衍生自不同蛋白质。衍生物也可以是与另一种分子，例如药物共价或非共价相连的哺乳动物MPV蛋白质形式。
称为NL/1/00(也称为00-1)的病毒分离物是哺乳动物MPV的变体A1，其基因组序列见SEQ ID NO：19。称为NL/17/00的病毒分离物是哺乳动物MPV的变体A2，其基因组序列见SEQ ID NO：20。称为NL/1/99(也称为99-1)的病毒分离物是哺乳动物MPV的变体B1，其基因组序列见SEQ ID NO：18。称为NL/1/94的病毒分离物是哺乳动物MPV的变体B2，其基因组序列见SEQ ID NO：21。本申请中公开了序列表及相应的SEQ ID No见表14。
哺乳动物MPV的蛋白质可以是N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白或M2-2蛋白或其片段。哺乳动物MPV蛋白质片段的长度可以是至少25个氨基酸、至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、至少100个氨基酸、至少125个氨基酸、至少150个氨基酸、至少175个氨基酸、至少200个氨基酸、至少225个氨基酸、至少250个氨基酸、至少275个氨基酸、至少300个氨基酸、至少325个氨基酸、至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸、至少425个氨基酸、至少450个氨基酸、至少475个氨基酸、至少500个氨基酸、至少750个氨基酸、至少1000个氨基酸、至少1250个氨基酸、至少1500个氨基酸、至少1750个氨基酸、至少2000个氨基酸或至少2250个氨基酸。哺乳动物MPV蛋白质的片段的长度可以是最多25个氨基酸、最多50个氨基酸、最多75个氨基酸、最多100个氨基酸、最多125个氨基酸、最多150个氨基酸、最多175个氨基酸、最多200个氨基酸、最多225个氨基酸、最多250个氨基酸、最多275个氨基酸、最多300个氨基酸、最多325个氨基酸、最多350个氨基酸、最多375个氨基酸、最多400个氨基酸、最多425个氨基酸、最多450个氨基酸、最多475个氨基酸、最多500个氨基酸、最多750个氨基酸、最多1000个氨基酸、最多1250个氨基酸、最多1500个氨基酸、最多1750个氨基酸、最多2000个氨基酸或最多2250个氨基酸。
在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是N蛋白，该N蛋白在系统发育上更接近哺乳动物MPV的N蛋白，例如SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21(SEQ ID No的描述也参见表14)所示病毒基因组编码的N蛋白，而不是C型APV的N蛋白。在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是P蛋白，该P蛋白在系统发育上更接近哺乳动物MPV的P蛋白，例如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒基因组编码的P蛋白，而不是C型APV的P蛋白。在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是M蛋白，该M蛋白在系统发育上更接近哺乳动物MPV的M蛋白，例如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒基因组编码的M蛋白，而不是C型APV的M蛋白。在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是F蛋白，该F蛋白在系统发育上更接近哺乳动物MPV的P蛋白，例如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒基因组编码的F蛋白，而不是C型APV的F蛋白。在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是M2-1蛋白，该M2-1蛋白在系统发育上更接近哺乳动物MPV的M2-1蛋白，例如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒基因组编码的M2-1蛋白，而不是C型APV的M2-1蛋白。在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是M2-2蛋白，该M2-2蛋白在系统发育上更接近哺乳动物MPV的M2-2蛋白，例如SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒基因组编码的M2-2蛋白，而不是C型APV的M2-2蛋白。在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是G蛋白，该G蛋白在系统发育上更接近哺乳动物MPV的G蛋白，例如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒基因组编码的G蛋白，而不是C型APV的任何蛋白。在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是SH蛋白，该SH蛋白在系统发育上更接近哺乳动物MPV的SH蛋白，例如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒基因组编码的SH蛋白，而不是C型APV的任何蛋白。在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是L蛋白，该L蛋白在系统发育上更接近哺乳动物MPV的L蛋白，例如SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒基因组编码的SH蛋白，而不是C型APV的任何蛋白。
在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是N蛋白，该N蛋白与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒基因组编码的N蛋白的氨基酸序列(各N蛋白的氨基酸序列公开于SEQID NO：366-369；也参见表14)有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是N蛋白，该P蛋白与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒基因组编码的P蛋白的氨基酸序列(各P蛋白的氨基酸序列公开于SEQID NO：374-377；也参见表14)有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是M蛋白，该M蛋白与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒基因组编码的M蛋白的氨基酸序列(各M蛋白的氨基酸序列公开于SEQ ID NO：358-361；也参见表14)有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是F蛋白，该F蛋白与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒基因组编码的F蛋白的氨基酸序列(各F蛋白的氨基酸序列公开于SEQ ID NO：314-317；也参见表14)有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是M2-1蛋白，该M2-1蛋白与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQID NO：21所示病毒基因组编码的M2-1蛋白的氨基酸序列(各M2-1蛋白的氨基酸序列公开于SEQ ID NO：338-341；也参见表14)有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是M2-2蛋白，该M2-2蛋白与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20或SEQ ID NO：21所示病毒基因组编码的M2-2蛋白的氨基酸序列(各M2-2蛋白的氨基酸序列公开于SEQ ID NO：346-349；也参见表14)有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是G蛋白，该G蛋白与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒基因组编码的G蛋白的氨基酸序列(各G蛋白的氨基酸序列公开于SEQ ID NO：322-325；也参见表14)有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是SH蛋白，该SH蛋白与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒基因组编码的SH蛋白的氨基酸序列(各SH蛋白的氨基酸序列公开于SEQ ID NO：382-385；也参见表14)有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。在本发明的某些实施方式中，所述哺乳动物MPV的蛋白质是L蛋白，该L蛋白与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒基因组编码的L蛋白的氨基酸序列(各L蛋白的氨基酸序列公开于SEQ ID NO：330-333；也参见表14)有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。
哺乳动物MPV蛋白质的片段与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒编码的同源性蛋白在该蛋白与该片段同源的部分上有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。在一具体的示范性实施方式中，本发明提供含有F蛋白胞外域的哺乳动物MPV的F蛋白片段及其同源物。所述含有胞外域的F蛋白片段的同源物与含有SEQ ID NO：18、SEQID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示病毒编码的F蛋白胞外域(各F蛋白的氨基酸序列公开于SEQ ID NO：314-317；也参见表14)的相应片段有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。
在某些实施方式中，本发明提供哺乳动物MPV亚群A的蛋白及其片段。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的N蛋白，该N蛋白在系统发育上更接近SEQ IDNO：19或SEQ ID NO：20所示病毒编码的N蛋白，而不是SEQ ID NO：18或SEQ IDNO：21所编码病毒编码的N蛋白。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的G蛋白，该G蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示病毒编码的G蛋白，而不是SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21所编码病毒编码的G蛋白。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的P蛋白，该P蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示病毒编码的P蛋白，而不是SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21所编码病毒编码的P蛋白。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的M蛋白，该M蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示病毒编码的M蛋白，而不是SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21所编码病毒编码的M蛋白。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的N蛋白，该F蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示病毒编码的F蛋白，而不是SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21所编码病毒编码的F蛋白。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的M2-1蛋白，该M2-1蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示病毒编码的M2-1蛋白，而不是SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21所编码病毒编码的M2-1蛋白。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的M2-2蛋白，该M2-2蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示病毒编码的M2-2蛋白，而不是SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21所编码病毒编码的M2-2蛋白。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的SH蛋白，该SH蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示病毒编码的SH蛋白，而不是SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21所编码病毒编码的SH蛋白。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的L蛋白，该L蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示病毒编码的L蛋白，而不是SEQ IDNO：18或SEQ ID NO：21所编码病毒编码的L蛋白。
在某些实施方式中，本发明提供哺乳动物MPV亚群B的蛋白及其片段。本发明提供哺乳动物MPV亚群B的N蛋白，该N蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：2所示病毒编码的N蛋白，而不是SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所编码病毒编码的N蛋白。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的G蛋白，该G蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21所示病毒编码的G蛋白，而不是SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所编码病毒编码的G蛋白。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的P蛋白，该P蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21所示病毒编码的P蛋白，而不是SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所编码病毒编码的P蛋白。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的M蛋白，该M蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21所示病毒编码的M蛋白，而不是SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所编码病毒编码的M蛋白。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的N蛋白，该F蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21所示病毒编码的F蛋白，而不是SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所编码病毒编码的F蛋白。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的M2-1蛋白，该M2-1蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21所示病毒编码的M2-1蛋白，而不是SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所编码病毒编码的M2-1蛋白。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的M2-2蛋白，该M2-2蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21所示病毒编码的M2-2蛋白，而不是SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所编码病毒编码的M2-2蛋白。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的SH蛋白，该SH蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21所示病毒编码的SH蛋白，而不是SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所编码病毒编码的SH蛋白。本发明提供哺乳动物MPV亚群A的L蛋白，该L蛋白在系统发育上更接近SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21所示病毒编码的L蛋白，而不是SEQ IDNO：19或SEQ ID NO：20所编码病毒编码的L蛋白。
本发明还提供哺乳动物MPV变体A1、A2、B1和B2的蛋白质。在本发明的某些实施方式中，哺乳动物MPV不同变体的蛋白质可通过它们的氨基酸序列相同性而彼此相区分。哺乳动物MPV的变体可以是但不限于A1、A2、B1或B2。然而，本发明也考虑了哺乳动物MPV的另一变体成员的分离物。
本发明提供哺乳动物MPV变体B1的G蛋白，该哺乳动物MPV变体B1的G蛋白在系统发育上更接近变体B1的原型(分离物NL/1/99)G蛋白，而不是变体A1的原型(分离物NL/1/00)G蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)G蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)G蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的G蛋白，该G蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/99(SEQ ID NO：324)所示哺乳动物MPV变体B1的G蛋白有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的N蛋白，该哺乳动物MPV变体B1的N蛋白在系统发育上更接近变体B1的原型(分离物NL/1/99)N蛋白，而不是变体A1的原型(分离物NL/1/00)N蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)N蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)N蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的N蛋白，该N蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/99(SEQID NO：368)所示哺乳动物MPV变体B1的N蛋白有至少98.5％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的P蛋白，该哺乳动物MPV变体B1的P蛋白在系统发育上更接近变体B1的原型(分离物NL/1/99)P蛋白，而不是变体A1的原型(分离物NL/1/00)P蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)P蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)P蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的P蛋白，该P蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/99(SEQ ID NO：376)所示哺乳动物MPV变体B1的P蛋白有至少96％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的M蛋白，该哺乳动物MPV变体B1的M蛋白在系统发育上更接近变体B1的原型(分离物NL/1/99)M蛋白，而不是变体A1的原型(分离物NL/1/00)M蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)M蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)M蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的M蛋白，该M蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/99(SEQ ID NO：360)所示哺乳动物MPV变体B1的M蛋白相同。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的F蛋白，该哺乳动物MPV变体B1的F蛋白在系统发育上更接近变体B1的原型(分离物NL/1/99)F蛋白，而不是变体A1的原型(分离物NL/1/00)F蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)F蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)F蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的F蛋白，该F蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/99(SEQ ID NO：316)所示哺乳动物MPV变体B1的F蛋白有至少99％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的M2-1蛋白，该哺乳动物MPV变体B1的M2-1蛋白在系统发育上更接近变体B1的原型(分离物NL/1/99)M2-1蛋白，而不是变体A1的原型(分离物NL/1/00)M2-1蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)M2-1蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)M2-1蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的M2-1蛋白，该M2-1蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/99(SEQ ID NO：340)所示哺乳动物MPV变体B1的M2-1蛋白有至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的M2-2蛋白，该哺乳动物MPV变体B1的M2-2蛋白在系统发育上更接近变体B1的原型(分离物NL/1/99)M2-2蛋白，而不是变体A1的原型(分离物NL/1/00)M2-2蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)M2-2蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)M2-2蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的M2-2蛋白，该M2-2蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/99(SEQ ID NO：348)所示哺乳动物MPV变体B1的M2-2蛋白有至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的SH蛋白，该哺乳动物MPV变体B1的SH蛋白在系统发育上更接近变体B1的原型(分离物NL/1/99)SH蛋白，而不是变体A1的原型(分离物NL/1/00)SH蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)SH蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)SH蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的SH蛋白，该SH蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/99(SEQ ID NO：384)所示哺乳动物MPV变体B1的SH蛋白有至少83％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的L蛋白，该哺乳动物MPV变体B1的L蛋白在系统发育上更接近变体B1的原型(分离物NL/1/99)L蛋白，而不是变体A1的原型(分离物NL/1/00)L蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)L蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)L蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B1的L蛋白，该L蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/99(SEQ ID NO：332)所示哺乳动物MPV变体B1的L蛋白有至少99％或至少99.5％相同。
本发明提供哺乳动物MPV变体A1的G蛋白，该哺乳动物MPV变体A1的G蛋白在系统发育上更接近变体A1的原型(分离物NL/1/00)G蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)G蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)G蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)G蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的G蛋白，该G蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/00(SEQ ID NO：322)所示哺乳动物MPV变体A1的G蛋白有至少66％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的N蛋白，该哺乳动物MPV变体A1的N蛋白在系统发育上更接近变体A1的原型(分离物NL/1/00)N蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)N蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)N蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)N蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的N蛋白，该N蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/00(SEQID NO：366)所示哺乳动物MPV变体A1的N蛋白有至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的P蛋白，该哺乳动物MPV变体A1的P蛋白在系统发育上更接近变体A1的原型(分离物NL/1/00)P蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)P蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)P蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)P蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的P蛋白，该P蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/00(SEQ ID NO：374)所示哺乳动物MPV变体A1的P蛋白有至少96％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的M蛋白，该哺乳动物MPV变体A1的M蛋白在系统发育上更接近变体A1的原型(分离物NL/1/00)M蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)M蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)M蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)M蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的M蛋白，该M蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/00(SEQ ID NO：358)所示哺乳动物MPV变体A1的M蛋白相同。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的F蛋白，该哺乳动物MPV变体A1的F蛋白在系统发育上更接近变体A1的原型(分离物NL/1/00)F蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)F蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)F蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)F蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的F蛋白，该F蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/00(SEQ IDNO：314)所示哺乳动物MPV变体A1的F蛋白有至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的M2-1蛋白，该哺乳动物MPV变体A1的M2-1蛋白在系统发育上更接近变体A1的原型(分离物NL/1/00)M2-1蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)M2-1蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)M2-1蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)M2-1蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的M2-1蛋白，该M2-1蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/00(SEQ IDNO：338)所示哺乳动物MPV变体A1的M2-1蛋白有至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的M2-2蛋白，该哺乳动物MPV变体A1的M2-2蛋白在系统发育上更接近变体A1的原型(分离物NL/1/00)M2-2蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)M2-2蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)M2-2蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)M2-2蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的M2-2蛋白，该M2-2蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/00(SEQ ID NO：346)所示哺乳动物MPV变体A1的M2-2蛋白有至少96％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的SH蛋白，该哺乳动物MPV变体A1的SH蛋白在系统发育上更接近变体A1的原型(分离物NL/1/00)SH蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)SH蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)SH蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)SH蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的SH蛋白，该SH蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/00(SEQ ID NO：382)所示哺乳动物MPV变体A1的SH蛋白有至少84％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的L蛋白，该哺乳动物MPV变体A1的L蛋白在系统发育上更接近变体A1的原型(分离物NL/1/00)L蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)L蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)L蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)L蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A1的L蛋白，该L蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/00(SEQ ID NO：330)所示哺乳动物MPV病毒变体A1的L蛋白有至少99％或至少99.5％相同。
本发明提供哺乳动物MPV变体A2的G蛋白，该哺乳动物MPV变体A2的G蛋白在系统发育上更接近变体A2的原型(分离物NL/17/00)G蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)G蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)G蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)G蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的G蛋白，该G蛋白的氨基酸序列与原型NL/17/00(SEQ ID NO：332)所示哺乳动物MPV变体A2的G蛋白有至少66％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的N蛋白，该哺乳动物MPV变体A2的N蛋白在系统发育上更接近变体A2的原型(分离物NL/17/00)N蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)N蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)N蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)N蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的N蛋白，该N蛋白的氨基酸序列与原型NL/17/00(SEQ ID NO：367)所示哺乳动物MPV变体A2的N蛋白有至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的P蛋白，该哺乳动物MPV变体A2的P蛋白在系统发育上更接近变体A2的原型(分离物NL/17/00)P蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)P蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)P蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)P蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的P蛋白，该P蛋白的氨基酸序列与原型NL/17/00(SEQ ID NO：375)所示哺乳动物MPV变体A2的P蛋白有至少96％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的M蛋白，该哺乳动物MPV变体A2的M蛋白在系统发育上更接近变体A2的原型(分离物NL/17/00)M蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)M蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)M蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)M蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的M蛋白，该M蛋白的氨基酸序列与原型NL/17/00(SEQ ID NO：359)所示哺乳动物MPV变体A2的M蛋白相同。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的F蛋白，该哺乳动物MPV变体A2的F蛋白在系统发育上更接近变体A2的原型(分离物NL/17/00)F蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)F蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)F蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)F蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的F蛋白，该F蛋白的氨基酸序列与原型NL/17/00(SEQ ID NO：315)所示哺乳动物MPV变体A2的F蛋白有至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的M2-1蛋白，该哺乳动物MPV变体A2的M2-1蛋白在系统发育上更接近变体A2的原型(分离物NL/17/00)M2-1蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)M2-1蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)M2-1蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)M2-1蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的M2-1蛋白，该M2-1蛋白的氨基酸序列与原型NL/17/00(SEQ ID NO：339)所示哺乳动物MPV变体A2的M2-1蛋白有至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的M2-2蛋白，该哺乳动物MPV变体A2的M2-2蛋白在系统发育上更接近变体A2的原型(分离物NL/17/00)M2-2蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)M2-2蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)M2-2蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)M2-2蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的M2-2蛋白，该M2-2蛋白的氨基酸序列与原型NL/17/00(SEQ ID NO：347)所示哺乳动物MPV变体A2的M2-2蛋白有至少96％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的SH蛋白，该哺乳动物MPV变体A2的SH蛋白在系统发育上更接近变体A2的原型(分离物NL/17/00)SH蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)SH蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)SH蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)SH蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的SH蛋白，该SH蛋白的氨基酸序列与原型NL/17/00(SEQ ID NO：383)所示哺乳动物MPV变体A2的SH蛋白有至少84％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的L蛋白，该哺乳动物MPV变体A2的L蛋白在系统发育上更接近变体A2的原型(分离物NL/17/00)L蛋白，而不是变体的B1原型(分离物NL/1/99)L蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)L蛋白或B2的原型(分离物NL/1/94)L蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体A2的L蛋白，该L蛋白的氨基酸序列与原型NL/17/00(SEQ ID NO：331)所示哺乳动物MPV病毒变体A2的L蛋白有至少99％或至少99.5％相同。
本发明提供哺乳动物MPV变体B2的G蛋白，该哺乳动物MPV变体B2的G蛋白在系统发育上更接近变体B2的原型(分离物NL/1/94)G蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)G蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)G蛋白、或A2的原型(分离物NL/17/00)G蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的G蛋白，该G蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/94(SEQ ID NO：325)所示哺乳动物MPV变体B2的G蛋白有至少66％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的N蛋白，该哺乳动物MPV变体B2的N蛋白在系统发育上更接近变体B2的原型(分离物NL/1/94)N蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)N蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)N蛋白或A2的原型(分离物NL/17/00)N蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的N蛋白，该N蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/94(SEQID NO：369)所示哺乳动物MPV变体B2的N蛋白有至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的P蛋白，该哺乳动物MPV变体B2的P蛋白在系统发育上更接近变体B2的原型(分离物NL/1/94)P蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)P蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)P蛋白或A2的原型(分离物NL/17/00)P蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的P蛋白，该P蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/94(SEQ ID NO：377)所示哺乳动物MPV变体B2的P蛋白有至少96％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的M蛋白，该哺乳动物MPV变体B2的M蛋白在系统发育上更接近变体B2的原型(分离物NL/1/94)M蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)M蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)M蛋白或A2的原型(分离物NL/17/00)M蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的M蛋白，该M蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/94(SEQ ID NO：361)所示哺乳动物MPV变体B1的M蛋白相同。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的F蛋白，该哺乳动物MPV变体B2的F蛋白在系统发育上更接近变体B2的原型(分离物NL/1/94)F蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)F蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)F蛋白或A2的原型(分离物NL/17/00)F蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的F蛋白，该F蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/94(SEQ ID NO：317)所示哺乳动物MPV变体B2的F蛋白有至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的M2-1蛋白，该哺乳动物MPV变体B2的M2-1蛋白在系统发育上更接近变体B2的原型(分离物NL/1/94)M2-1蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)M2-1蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)M2-1蛋白、A2的原型(分离物NL/17/00)M2-1蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的M2-1蛋白，该M2-1蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/94(SEQ IDNO：341)所示哺乳动物MPV变体B2的M2-1蛋白有至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的M2-2蛋白，该哺乳动物MPV变体B2的M2-2蛋白在系统发育上更接近变体B2的原型(分离物NL/1/94)M2-2蛋白，而不是变体B2的原型(分离物NL/1/94)M2-2蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)M2-2蛋白或A2的原型(分离物NL/17/00)M2-2蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的M2-2蛋白，该M2-2蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/94(SEQ IDNO：349)所示哺乳动物MPV变体B2的M2-2蛋白有至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的SH蛋白，该哺乳动物MPV变体B2的SH蛋白在系统发育上更接近变体B2的原型(分离物NL/1/94)SH蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)SH蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)SH蛋白或A2的原型(分离物NL/17/00)SH蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的SH蛋白，该SH蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/94(SEQ ID NO：385)所示哺乳动物MPV变体B2的SH蛋白有至少84％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的L蛋白，该哺乳动物MPV变体B2的L蛋白在系统发育上更接近变体B2的原型(分离物NL/1/94)L蛋白，而不是变体B1的原型(分离物NL/1/99)L蛋白、A1的原型(分离物NL/1/00)L蛋白或A2的原型(分离物NL/17/00)L蛋白。本发明提供哺乳动物MPV变体B2的L蛋白，该L蛋白的氨基酸序列与原型NL/1/94(SEQ ID NO：333)所示哺乳动物MPV变体B2的L蛋白有至少99％或至少99.5％相同。
在某些实施方式中，序列相同性百分比依据全长蛋白质的对比。在其它实施方式中，序列相同性百分比依据蛋白质的毗连氨基酸序列的对比，所述氨基酸序列的长度可以是25个氨基酸、50个氨基酸、75个氨基酸、100个氨基酸、125个氨基酸、150个氨基酸、175个氨基酸、200个氨基酸、225个氨基酸、250个氨基酸、275个氨基酸、300个氨基酸、325个氨基酸、350个氨基酸、375个氨基酸、400个氨基酸、425个氨基酸、450个氨基酸、475个氨基酸、500个氨基酸、750个氨基酸、1000个氨基酸、1250个氨基酸、1500个氨基酸、1750个氨基酸、2000个氨基酸或2250个氨基酸。
在某些具体实施方式中，本发明提供哺乳动物MPV的G蛋白，该G蛋白具有SEQ ID NO：119-153；SEQ ID NO：322-325所示氨基酸序列之一或其片段。在某些具体实施方式中，本发明提供哺乳动物MPV的F蛋白，该F蛋白具有SEQID NO：234-317所示氨基酸序列之一。在某些具体实施方式中，本发明提供哺乳动物MPV的L蛋白，该L蛋白具有SEQ ID NO：330-333所示氨基酸序列之一或其片段。在某些具体实施方式中，本发明提供哺乳动物MPV的M2-1蛋白，该M2-1蛋白具有SEQ ID NO：338-341所示氨基酸序列之一或其片段。在某些具体实施方式中，本发明提供哺乳动物MPV的M2-1蛋白，该M2-2蛋白具有SEQ IDNO：346-349所示氨基酸序列之一或其片段。在某些具体实施方式中，本发明提供哺乳动物MPV的M蛋白，该M蛋白具有SEQ ID NO：358-361所示氨基酸序列之一或其片段。在某些具体实施方式中，本发明提供哺乳动物MPV的N蛋白，该N蛋白具有SEQ ID NO：366-369所示氨基酸序列之一或其片段。在某些具体实施方式中，本发明提供哺乳动物MPV的P蛋白，该P蛋白具有SEQ ID NO：374-377所示氨基酸序列之一或其片段。在某些具体实施方式中，本发明提供哺乳动物MPV的SH蛋白，该SH蛋白具有SEQ ID NO：382-385所示氨基酸序列之一或其片段。
在本发明的某些实施方式中，片段的长度至少为25个氨基酸、50个氨基酸、75个氨基酸、100个氨基酸、125个氨基酸、150个氨基酸、175个氨基酸、200个氨基酸、225个氨基酸、250个氨基酸、275个氨基酸、300个氨基酸、325个氨基酸、350个氨基酸、375个氨基酸、400个氨基酸、425个氨基酸、450个氨基酸、475个氨基酸、500个氨基酸、750个氨基酸、1000个氨基酸、1250个氨基酸、1500个氨基酸、1750个氨基酸、2000个氨基酸或2250个氨基酸。在本发明的某些实施方式中，片段的长度最多为25个氨基酸、50个氨基酸、75个氨基酸、100个氨基酸、125个氨基酸、150个氨基酸、175个氨基酸、200个氨基酸、225个氨基酸、250个氨基酸、275个氨基酸、300个氨基酸、325个氨基酸、350个氨基酸、375个氨基酸、400个氨基酸、425个氨基酸、450个氨基酸、475个氨基酸、500个氨基酸、750个氨基酸、1000个氨基酸、1250个氨基酸、1500个氨基酸、1750个氨基酸、2000个氨基酸或2250个氨基酸。
本发明还提供源自哺乳动物MPV的核酸序列。本发明也提供源自哺乳动物MPV的核酸序列的衍生物。在某些具体实施方式中，所述核酸经修饰。
在某些实施方式中，本发明核酸编码上述哺乳动物MPV的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在某些实施方式中，本发明核酸编码上述哺乳动物MPV亚群A的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在某些实施方式中，本发明核酸编码上述哺乳动物MPV亚群B的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在某些实施方式中，本发明核酸编码上述哺乳动物MPV变体A1的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在某些实施方式中，本发明核酸编码上述哺乳动物MPV变体A2的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在某些实施方式中，本发明核酸编码上述哺乳动物MPV变体B1的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在某些实施方式中，本发明核酸编码上述哺乳动物MPV变体B2的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。
在某些实施方式中，本发明提供的核苷酸序列与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示核苷酸序列有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同。在某些实施方式中，本发明核苷酸序列与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示核苷酸序列的片段有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同，其中所述片段的长度为至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少750个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少1,250个核苷酸、至少1,500个核苷酸、至少1,750个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少2,00个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少5,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少12,500个核苷酸或至少15,000个核苷酸。在一具体实施方式中，本发明核苷酸序列与以下所示核苷酸序列有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％或100％相同：SEQ ID NO：84-118；SEQ ID NO：154-233；SEQ ID NO：318-321；SEQ ID NO：326-329；SEQ ID NO：334-337；SEQ ID NO：342-345；SEQ ID NO：350-353；SEQ ID NO：354-357；SEQ ID NO：362-365；SEQ ID NO：370-373；SEQ ID NO：378-381；或SEQ ID NO：386-389。
在本发明的具体实施方式中，本发明核苷酸序列能在低严格性、中等严格性或高度严格性条件下与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQID NO：21所示核酸序列之一杂交。在本发明的具体实施方式中，本发明核苷酸序列能在低严格性、中等严格性或高度严格性条件下与以下核酸序列之一杂交：SEQID NO：84-118；SEQ ID NO：154-233；SEQ ID NO：318-321；SEQ ID NO：326-329；SEQ ID NO：334-337；SEQ ID NO：342-345；SEQ ID NO：350-353；SEQ ID NO：354-357；SEQ ID NO：362-365；SEQ ID NO：370-373；SEQ ID NO：378-381；或SEQ ID NO：386-389。在某些实施方式中，核酸与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示核酸序列杂交的长度为：至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少750个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少1,250个核苷酸、至少1,500个核苷酸、至少1,750个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少2,00个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少5,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少12,500个核苷酸或至少15,000个核苷酸。
本发明还提供能与哺乳动物MPV的蛋白质特异性结合的抗体和抗原结合片段。本发明抗体能与哺乳动物MPV的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白特异性结合。在具体实施方式中，所述抗体是人抗体或人源化抗体。在某些实施方式中，本发明抗体能与哺乳动物MPV亚群A病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白特异性结合。在某些实施方式中，本发明抗体能与哺乳动物MPV亚群B病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白特异性结合。在某些更具体的实施方式中，本发明抗体能与哺乳动物MPV变体A1病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白特异性结合。在其它实施方式中，本发明抗体能与哺乳动物MPV变体A2病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白特异性结合。在某些实施方式中，本发明抗体能与哺乳动物MPV变体B1病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白特异性结合。在某些其它实施方式中，本发明抗体能与哺乳动物MPV变体B2病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-2蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白特异性结合。
5.16 利用七残基重复序列抑制病毒细胞融合
病毒-宿主细胞融合是包括MPV在内的许多被膜病毒感染生命周期的必须阶段。因此，抑制病毒细胞融合代表了控制这些病毒的新方法。该抑制方法代表了防止MPV在宿主中增殖和MPV感染宿主的其它方法。抑制病毒-细胞融合有赖于所需结合蛋白的类型。Wang等，Biochem Biophys Res Comm 302(2003)469-475。因此，本发明的一个实施方式采用试验鉴定病毒细胞融合对各种结合蛋白的依赖性。
在某些实施方式中，本发明提供预防、治疗或控制对象感染hMPV的方法，所述方法包括给予药学上有效量的七残基重复序列(HR)肽。在某些实施方式中，药学上有效量的(七残基重复序列肽)能降低病毒宿主细胞融合至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％、至少99.5％。在一具体实施方式中，所述HR是导致对象感染的病毒HR。在一特定实施方式中，所述HR是A1亚型hMPV的HR。在一更具体的实施方式中，所述HR序列是hMPV的F蛋白的HR序列(命名为HRA或HRB)之一，其中HRA是该肽N末端附近的七重复序列，HRB是C末端附近的七重复序列。在某些实施方式中，给予对象以治疗、预防或控制hMPV感染的HR是A1、A2、B1或B2亚型hMPV的HR。
在某些实施方式中，所述HR与导致对象感染的病毒HR有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或至少99.5％相同。某些实施方式可用HR衍生物防止病毒融合。这种衍生物包括但不限于已用非天然氨基酸取代的、截短除去了氨基酸延伸段的或添加了单个氨基酸(single amino acids)或其延伸段而延长的HR肽。还有另一实施方式利用一种HR肽治疗、控制或预防hMPV感染。在另一实施方式中，给予HR肽混合物来治疗、控制或预防hMPV感染。
可采用下述检验来确定HR在防止hMPV与细胞融合中的效力，因此可用这些检验来确定哪种HR或其类似物或衍生物最适用于治疗、预防或控制hMPV感染对象。
在本发明另一实施方式中，检验可溶性合成HR肽来确定这些肽是否能防止病毒-细胞融合。可用任何HR序列抑制hMPV病毒-细胞融合，包括但不限于针对RSV、PIV、APV和hMPV的HR序列。在一优选的实施方式中，所述HR序列是hMPV的HR序列。在一更具体的实施方式中，所述HR序列是hMPV的F蛋白的HR序列(命名为HRA或HRB)之一，其中HRA是该肽N末端附近的七重复序列，HRB是C末端附近的七重复序列。在本发明的另一实施方式中，用于抑制hMPV病毒-细胞融合的HRA和HRB衍生肽包括但不限于：RSV、APV和PIV的HRA和HRB肽。本发明的另一实施方式利用HRA和HRB肽的衍生物来抑制hMPV病毒-细胞融合。例如，利用HRA或HRB肽中的至少一个氨基酸残基突变制备的衍生物来抑制hMPV病毒-细胞融合。本发明的另一实施方式通过截短或切除HRA或HRB肽的特定区域来制备衍生物。在还有另一实施方式中，采用内源性HR序列延长的HRA或HRB肽。另一实施方式利用多组由HRA或HRB肽不同区域的序列组成的短肽来抑制hMPV病毒-细胞融合。本发明的另一实施方式利用hMPVHRA和HRB衍生肽来抵御hMPV的同源毒株或hMPV的异源毒株。本发明的另一实施方式联用HRA和HRB肽或其类似物或衍生物来抑制病毒-细胞融合。一更优选的实施方式单用HRA肽或HRB肽或其类似物或衍生物。在另一实施方式中，所用的HRA肽或HRB肽的衍生物与内源性HR肽有至少90％、80％、70％、60％或50％相同。
为测定七重复序列抑制病毒融合的能力，可表达并纯化七重复序列从而能检验它们抑制病毒融合的能力。可表达并纯化可溶性七重复序列，然后用于试验与内源性七重复序列竞争以检验对病毒融合的阻断作用。在本发明一实施方式中，可制备合成的重组DNA来编码hMPV的F蛋白的七重复序列(分别命名为HRA或HRB)。在本发明的另一实施方式中，可制备合成的重组DNA来编码hMPV的F蛋白的七重复序列，该序列也含有用于促进纯化的序列尾标。在本发明一优选的实施方式中，促进七重复序列纯化的尾标不干扰其活性。在本发明还有另一实施方式中，所述尾标由一系列组氨酸构成，例如位于肽末端之一的6个毗连组氨酸，称为组氨酸尾标。可采用许多不同的方法表达并纯化可溶性HRA和HRB。首先，可采用本领域技术人员已知的方法制备编码HRA和HRB的DNA载体。随后，将这些质粒转染入合适的表达宿主细胞中，例如大肠杆菌菌株BL21(DE3)，采用本领域常规方法表达并纯化此蛋白质。例如，可用IPTG诱导pET载体中编码含组氨酸尾标的HR肽的基因表达。然后裂解细胞，固定到Ni-螯合琼脂糖亲和柱后用反荷电(counter charged)物质，例如咪唑洗脱来分离表达的肽。
为测定表达的七重复序列肽抑制病毒融合的潜在效力，可用试验证实HR肽之间装配成的复合物。该方法优于细胞试验，因为能无细胞地筛选肽来测定其抑制病毒融合的效力。在本发明的一个实施方式中，同时将HR肽培育一段时间使之足以形成复合物。在一更具体的实施方式中，28℃培育1小时以形成复合物。可采用本领域已知的任何方法检测复合物形成，所述方法包括但不限于：层析、紫外-可见光光谱、NMR光谱、X-射线晶体学、离心或电泳。在本发明的另一具体实施方式中，采用凝胶过滤方法结合电泳检测复合物形成来测定复合物的分子量。本发明还有另一实施方式采用该复合物形成试验来鉴定用于抑制病毒融合的候选对象，例如测定突变的HR肽抑制病毒融合的效力。本发明还有另一实施方式采用该复合物形成试验来检测HR肽衍生物抑制病毒融合的效力。
已知这些肽的七重复序列区段天然是螺旋构象。为此原因，可采用许多方法来测定表达的HR肽是否能形成α螺旋来鉴定用于抑制病毒融合的合适候选对象。这种方法包括但不限于：光谱学、X-射线晶体学和显微镜法。本发明的一个实施方式采用CD(圆二色性)光谱法来测定HR肽的结构特征。
可采用细胞试验测HR肽抑制病毒融合的效力。该试验可用能被MPV感染的任何细胞，包括但不限于：tMK、Hep2或Vero细胞。在一具体实施方式中，所用的细胞类型是Hep2细胞。用MPV感染宿主细胞后，将细胞与HR蛋白质制品一起培育，培育合适的时间后对融合情况评分。然后染色细胞的合胞体/多核体形成以测定病毒-细胞融合是否成功。
参考以下作为本发明示范而提供的非限制性实施例可更好地理解本发明。给予以下实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方式。然而，它们决不应理解为限制了本发明的范围。
6.实施例：人偏肺病毒融合(F)蛋白的推定切割位点的S101P取代是在Vero细胞中不依赖胰蛋白酶生长的主要决定因素
材料与方法
细胞和病毒.用补加了10％胎牛血清(FBS)(Hyclone)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco BRL)、非必需氨基酸(Gibco BRL)和2％青霉素/链霉素(Biowhittaker)的极限必需培养基中(MEM)(JHR Biosciences)培养Vero细胞。用补加了10％FBS、5％胰蛋白
Figure A200680015321D0132091244QIETU
磷酸肉汤(tryptose phosphate broth)(Sigma)、非必需氨基酸和2％青霉素/链霉素的Glasgow MEM(Gibco BRL)培养BSR/T7细胞(由KKConzelmann博士馈赠)。如现有技术所述(van den Hoogen等，2001)培养tMK细胞。在Vero细胞中用optiMEM(Gibco/BRL)和2％青霉素/链霉素培养液增殖hMPV和嵌合型b/h PIV3病毒。一些病毒用0.2ug/ml TPCK胰蛋白酶(Sigma)增殖。用SPG(10×SPG是2.18M蔗糖、0.038M KH2PO4、0.072M K2HPO4、0.054M L-谷氨酸，pH 7.1)将细胞和上清液一起刮下，终浓度为1×SPG，-70℃冷冻。
病毒分离物wt hMPV/NL/1/93、wt hMPV/NL/1/94、wt hMPV/NL/1/99和wthMPV/NL/1/00如现有技术(Hersft等，2004；van den Hoogen，2001)所述。利用反向遗传技术从全长cDNA质粒制备以下重组病毒：rhMPV/NL/1/00/101P、rhMPV/NL/1/00/101S、rhMPV/NL/1/99/101S、rhMPV/93K/101S、rhMPV/93K/101P、b/h PIV3/hMPV F/101P和b/h PIV3/hMPV F/101S。变体病毒vhMPV/93K/101P和vhMPV/100K/101P衍生自rhMPV/93K/101P。
通过免疫染色hMPV噬斑滴定.通过Vero细胞的噬斑试验测定病毒滴度(噬斑形成单位(PFU)/ml)。在TC6-孔板中培养Vero细胞接近汇合。35℃用optiMEM稀释的病毒吸附1小时后，用2％甲基纤维素(用含2％青霉素/链霉素的optiMEM作1:1稀释)覆盖细胞，35℃培育6天。为进行免疫染色，除去覆盖层，用甲醇固定细胞15分钟。用得自wt hMPV/NL/1/00(MedImmune Vaccines，Inc.)免疫的雪貂的hMPV抗血清免疫染色噬斑。用含5％奶粉(w/v)的PBS(PBS-milk)约1:500稀释的抗血清。然后依次用辣根过氧化物酶偶联的抗-雪貂Ab(Dako)和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)(Dako)培育细胞来目测观察计数噬斑。
构建全长hMPV cDNA质粒.按照现有技术(Herfst等，2004)所述构建hMPV/NL/1/00(含有101S)和hMPV/NL/1/99(含有101S)的cDNA，用于回收命名为rhMPV/NL/1/00/101S和rhMPV/NL/1/99/101S的重组病毒。为构建用于回收重组病毒rhMPV/NL/1/00/101P的质粒，用引物GCAAATTGAAAATCCCAGACAACCTAGATTCGTTCTAGG及其反义引物将编码hMPV F糖蛋白的预计氨基酸序列中S101P的核苷酸取代T3367C引入。类似地，用引物GCTGATCAACTGGCAAGAGAGA AGCAAATTGAAAATCCC及其反义引物将编码hMPV F糖蛋白中预计氨基酸取代E93K的核苷酸取代G3343A引入。
通过反向遗传技术回收重组hMPV病毒.通过如现有技术(Herfst等，2004)所述的反向遗传技术回收重组病毒。简言之，将用含10uL脂质转染胺2000(Invitrogen)的500uL optiMEM配制的1.2ug pCITE hMPV N、1.2ug pCITEhMPV P、0.9ug pCITE hMPV M2、0.6ug pCITE hMPV L和5ug全长cDNA质粒施加于106BSR/T7细胞单层上。转染15小时后，用optiMEM替换培养基，35℃培育2-3天。一轮冻融后，用细胞和上清液感染90％汇合的Vero细胞单层，培育6天以扩增所拯救的病毒。使用抗hMPV的雪貂多克隆Ab，通过阳性免疫染色验证回收的病毒。以0.1PFU/细胞的感染复数(MOI)接种Vero细胞，加入optiMEM和35℃培育扩增回收的病毒，6天后收集中。一些转染和培育(操作)在有0.2ug/ml TPCK胰蛋白酶(Sigma)存在下进行。
回收病毒的RT-PCR.以0.1PFU/细胞的MOI的hMPV病毒接种Vero细胞单层来制备测序用DNA。接种6天后收集细胞和上清液，进行一轮冻融。按照生产商的使用说明书用Trizol试剂提取RNA。用一步RT-PCR试剂盒(Invitrogen)和多组重叠引物进行RT-PCR。用凝胶提取试剂盒(Qiagen凝胶提取试剂盒)从琼脂糖凝胶分离DNA，产生RT-PCR片段的色谱图。
hMPV病毒在Vero细胞中的多轮生长.在含或不含0.2ug/ml TPCK胰蛋白酶(Sigma)时，将用optiMEM稀释的hMPV病毒以0.1PFU/细胞的MOI接种于TC6-孔板中的Vero细胞亚汇合单层。抽出病毒接种液，每孔细胞加入2ml optiMEM+/-0.2ug/ml TPCK胰蛋白酶。24小时间隔收集细胞和上清液，共6天，-70℃冷冻。在Vero细胞(+/-0.2ug/ml TPCK胰蛋白酶)中滴定收集的样品。用上述雪貂抗-hMPV多克隆Ab(MedImmune Vaccines，Inc.)免疫染色来目测观察噬斑。
hMPV F糖蛋白表面表达的免疫染色.将Vero细胞接种在玻璃盖玻片上。以5PFU/细胞的MOI接种Vero细胞亚汇合单层。抽出病毒接种液，给细胞加入含2％青霉素/链霉素的optiMEM。35℃培育3天后，用3％多聚甲醛固定细胞10分钟。然后用PBS洗涤单层，用PBS-牛奶封闭。室温下将细胞与用PBS-牛奶作1:250稀释的抗-hMPV F单克隆抗体(Mab)121-1017-133(未发表)培育1小时，然后用PBS洗涤2次。然后在室温将细胞与用PBS-牛奶作1:1000稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗-亚美尼亚仓鼠Ab(Jackson Laboratories)培育1小时，用PBS洗涤2次。用10uL Vecta-屏蔽封固剂(shield mounting medium)(Vector Laboratories)将翻转的盖玻片固定在玻璃载玻片上，用Nikon eclipseTE2000-U显微镜观察。
hMPV F蛋白的蛋白质印迹.用0.1PFU/细胞的MOI用hMPV病毒感染TC6-孔组织培养皿中的Vero细胞亚汇合单层，35℃培育。感染4-6天后，收集细胞和上清液，-70℃冷冻。融化样品，用含5％β-巯基乙醇(Sigma)的Laemmli缓冲液(Bio-Rad)裂解，用12％聚丙烯酰胺Tris-HCl即用凝胶(Ready Gel)(Bio-Rad)分离，用潮湿转移室(Bio-Rad)转移至Hybond-P PVDF膜(Amersham Biosciences)。用含5％(w/v)奶粉的PBS(PBS-牛奶)封闭膜，与用PBS-牛奶作1:1000稀释的抗-hMPV F Mab121-1017-133培育，然后与用PBS-牛奶作1:1000稀释的辣根过氧化物酶偶联的抗仓鼠Mab培育。用含0.5％(v/v)吐温20(Sigma)的PBS洗涤膜4次，用化学发光底物(Amersham Biosciences)显影，曝光Biomax MR胶片(柯达)来目测观察hMPV F蛋白。
b/h PIV3/hMPV F2全长cDNA.b/h PIV3/hMPV F2(表达含101S的hMPV F)如现有技术(Tang等，2003)所述。简言之，将hMPV F基因插入嵌合型牛/人3型副流感病毒(b/h PIV3)cDNA的N和P基因之间(Haller等，2000；Haller等，2001)。利用快速诱变试剂盒(Stratagene)将对应于hMPV/NL/1/00基因组中T3367C的核苷酸突变引入b/h PIV3/hMPV F2的hMPV F基因中，得到的b/h PIV3/hMPV/F2/101P表达的hMPV F的101位氨基酸是脯氨酸。
定量测定Vero细胞中融合的核.以3PFU/细胞的MOI接种TC6-孔板中的Vero细胞单层汇合或模拟感染，一式两份。35℃培育1小时后，抽去接种物，用2％甲基纤维素(与含2％青霉素/链霉素+/-0.2ug/ml TPCK胰蛋白酶(Sigma)的optiMEM进行1:1混合)覆盖细胞。在48小时或72小时，抽去培养基，用甲醇固定单层15分钟。用PBS洗涤固定的单层，用Hoechst染色溶液(PBS配制的0.25ug/ml双苯酰亚胺H 33258(Sigma))培育1小时，用装配有DAPI透镜的Nikoneclipse TE2000-U显微镜检测。计数10个随机选择的视野中融合与未融合的核(总和超过2000个核)，计算融合核的百分比。
结果
wt hMPV的四个代表性亚型在Vero细胞中生长的胰蛋白酶要求不同.代表所有4个亚型A1、A2、B1和B2的hMPV的生物学衍生毒株能在Vero细胞中生长。分别代表亚型A1和B1的wt hMPV/NL/1/00和wt hMPV/NL/1/99在没有与有胰蛋白酶存在下均能生长至峰值滴度106-107PFU/ml。在1％甲基纤维素下的Vero细胞中生长6天后，通过免疫染色目测观察到噬斑大小约为0.3-0.5mm直径(图1)。
明显相反的是，分别代表亚型A2和B2的wt hMPV/NL/1/93和wthMPV/NL/1/94只在培养基中有胰蛋白酶存在时生长。wt hMPV/NL/1/93生长的峰值滴度在106-107PFU/ml之间，wt hMPV/NL/1/94低一个对数。此外，当培养基覆盖层中胰蛋白酶不存在时，不产生噬斑。wt hMPV/NL/1/93和wt hMPV/NL/1/94在有胰蛋白酶存在时产生的噬斑直径明显小于wt hMPV/NL/1/00或wt hMPV/NL/1/99在有或没有胰蛋白酶存在时产生的噬斑(图1)。
预计所有4种hMPV亚型的F糖蛋白的公开序列在推定的切割位点为RQSR基序。正如所料，F基因测序证明wt hMPV/NL/1/93和wt hMPV/NL/1/94(分别是亚型A2和B2)具有预计的RQSR序列。然而，wt hMPV/NL/1/00和wthMPV/NL/1/99(分别是亚型A1和B1)的序列获得T3367C突变，导致F蛋白中有预计的S101P氨基酸取代，因而推定的切割位点是RQPR。进一步表征了S101P取代对hMPV不依赖胰蛋白酶生长的作用。
rhMPV/NL/1/00/101P而非rhMPV/NL/1/00/101S能不用胰蛋白酶从cDNA回收.为研究hMPV F中S101P氨基酸取代对hMPV/NL/1/00不依赖胰蛋白酶生长的作用，我们在核苷酸3367处引入一个T以产生rhMPV/NL/1/00/101S，或在核苷酸3367处引入一个C以产生rhMPV/NL/1/00/101P。在没有胰蛋白酶存在时，不难回收rhMPV/NL/1/00/101P，形成的噬斑与wt hMPV/NL/1/00相当。明显相反的是，只在有胰蛋白酶存在下才回收到rhMPV/NL/1/00/101S，其形成的噬斑明显小于rhMPV/NL/1/00/101P的噬斑(图2A)。
比较rhMPV/NL/1/00/101S和rhMPV/NL/1/00/101P在Vero细胞中的复制.为表征在F蛋白中含有101S或101P的重组hMPV/NL/1/00病毒不依赖胰蛋白酶的生长，制作了该病毒在有或没有胰蛋白酶存在下的多轮生长曲线。
通过噬斑试验定量测定在有或没有胰蛋白酶存在下各时间点的感染性病毒(图2B)。在有胰蛋白酶存在下，rhMPV/NL/1/00/101S和rhMPV/NL/1/00/101P均显示了有效的多轮生长。rhMPV/NL/1/00/101P在第3天达到峰值滴度为7.8log10PFU/ml，而rhMPV/NL/1/00/101S在第5天达到峰值滴度为7log10PFU/ml(图2B)。
在没有胰蛋白酶存在下，只有rhMPV/NL/1/00/101P经历多轮生长，在第3天达到峰值滴度7.6log10，类似于在有胰蛋白酶存在下的生长情况。当噬斑试验中省去胰蛋白酶时，未检测到rhMPV/NL/1/00/101S(图2B)。
然而，rhMPV/NL/1/00/101S看来在没有胰蛋白酶存在下发生了一轮生长，因为在没有胰蛋白酶的生长期间收集到的病毒加入胰蛋白酶后在噬斑试验中形成了传染性细胞灶。这提示在没有胰蛋白酶的复制期间产生了rhMPV/NL/1/00/101S的病毒颗粒，然而除非在培养基中加入胰蛋白酶，否则它们不具传染性。没有胰蛋白酶时，rhMPV/NL/1/00/101S增殖的峰值滴度比rhMPV/NL/1/00/101P低约2log10(图2B)。
S101P对rhMPV-感染的细胞中hMPV F蛋白的表面表达的影响.副流感病毒融合蛋白转运至质膜而促进膜融合。为测定hMPV F的细胞表面表达受损是否导致rhMPV/NL/1/00/101S生长不佳，以5PFU/细胞的MOI接种Vero细胞，接种3天后固定进行免疫染色。有和没有胰蛋白酶时，接种了rhMPV/NL/1/00/101P的细胞中几乎100％检测到hMPV F。在有胰蛋白酶存在下，接种了rhMPV/NL/1/00/101S的Vero细胞中观察到hMPV F的表达水平相似(图2C)。
相反，没有胰蛋白酶时，感染rhMPV/NL/1/00/101S的单层中只有少数几个细胞的质膜上检测到F蛋白的表面表达(图2C)。这提示，没有胰蛋白酶时，hMPVF/101S确实表达在质膜上，但导致rhMPV/NL/1/00/101S感染不足而不扩散至毗邻细胞。在没有胰蛋白酶存在下，hMPV F/101S不能促进rhMPV/NL/1/00/101S感染猛烈扩散的原因部分是不能产生传染性病毒颗粒。然而，细胞与细胞融合和病毒感染的扩散也要求有效切割该融合蛋白前体。
与rhMPV/NL/1/00/101P相比，切割rhMPV/NL/1/00/101S的hMPV F蛋白.不想局限于理论，将F0前体切割成F1和F2片段暴露出融合活性和多轮病毒生长所需的F1片段N末端融合肽。为证明S101P取代对F切割效率的作用，在有或没有胰蛋白酶时以0.1PFU/细胞的MOI接种Vero细胞。感染5天后，收集细胞和上清液，采用蛋白质印迹分析来目测观察hMPV F的相对切割。
对于含101P的F蛋白，约一半含量的全长hMPV F蛋白(F0)被切割成对应于推定F1片段预计大小的诸F物质。含101P的F蛋白的加工效率在有或没有胰蛋白酶时相当(图2D)。
相反，含有101S的hMPV F只在该蛋白接触胰蛋白酶时被切割。与hMPVF/101P相比，相对切割效率明显较低(图2D)。发现在有和没有胰蛋白酶时，含101S的F蛋白的相对切割量因所加入的胰蛋白酶比活性有差异而在各实验之间不同。然而，hMPV F/101S的相对切割总是低于hMPV F/101P。
当从b/h PIV3病毒载体表达时，含hMPV/101S与含hMPV/101P的F蛋白的切割比较.为测定hMPV F切割是否依赖于其它hMPV病毒蛋白所提供的天然病毒环境(viral context)，将含有预计的101S或101P的hMPV F蛋白克隆入b/h PIV3，一种F和HN基因被人PIV3 F和HN基因取代的牛PIV3病毒中。以前的研究显示b/h PIV3能插入各种副黏病毒融合糖蛋白(Skiadopoulos等，2002；Tang等，2003，2004a和2004b)。感染细胞的裂解液的蛋白质印迹检测到，在未外源性加入胰蛋白酶时，Vero细胞中载体表达的(vectored)hMPV/NL/1/00/101P F蛋白被部分切割，而hMPV/NL/1/00/101S F蛋白未被切割(图3)。然而，与hMPV感染的细胞中hMPV F/101P F蛋白的切割相比，载体表达的hMPVF/101P蛋白的切割程度降低(比较图70D和71)。加入胰蛋白酶时，该差异不再明显。在有胰蛋白酶存在时，hMPV/NL/1/00/101P和hMPV/NL/1/00/101S载体表达的F蛋白的部分被切割的程度与wthMPV/NL/1/00表达的F蛋白相同(图3)。
hMPV/NL/1/00的自发hMPV F变体.rhMPV/NL/1/00/101P在融合蛋白的推定切割位点处RQPR基序的上游或下游快速产生了其它密码子改变。rhMPV/NL/1/00/101P的一种储备物自发产生了编码F蛋白中预计的E93K氨基酸取代的突变G3343A(图4C中有框的密码子)。第二种储备物产生了编码F蛋白中预计的Q100K取代的突变G3364A(图4D中带圈的密码子)。在Vero细胞中再传代10次，这些突变能保持遗传学稳定。在这些传代中，F蛋白中未检测到其它突变。完整测序这些变体病毒之一，vhMPV/93K/101P(排除基因组3’和5’端尽头的30个核苷酸)，唯一检测到的突变是G3343A。在其它hMPV ORF或非编码区中未发现其它突变，提示通过聚合酶复合物复制hMPV基因组本身不易出错。
在独立拯救的rhMPV/NL/1/00/101P储备物中，G3343A处最频繁观察到多态性。rhMPV/NL/1/00/101P的5种不同病毒储备物中也发现在该推定切割位点的上游核苷酸处有5种其它多态性，虽然频率低于G3343A。G3340A、A3344T、T3350G、G3352A和A3355C可编码预计的氨基酸取代E92K、E93V、I95S、E96K和N97H(表20a和20b)。产生这些多态性之一的rhMPV/NL/1/00/101P的各病毒储备物只含有这些额外突变中的一种(从不是两种或多种)，在细胞培养物中传代不到6次即产生突变。因此，任何这些额外的突变各自能在Vero细胞中具有生长优势。
表20a和20b：rhMPV/NL/1/00/101P、wt hMPV/NL/1/00和wthMPV/NL/1/99的hMPV F基因的突变和多态性.所示hMPV病毒的储备物在Vero细胞中传代不到6次即在其F基因中产生了多态性。各列的上端标明了hMPV F蛋白中的突变和随之预计的氨基酸取代。
表20a
表20b
Figure A200680015321D01392
为证明没有胰蛋白酶的生长对rhMPV/NL/1/00/101P发生自发突变提供了选择压力，在有胰蛋白酶时用同样的全长cDNA克隆独立转染10次，在没有胰蛋白酶时也进行10次。有或没有胰蛋白酶时病毒回收同等有效。然而，没有胰蛋白酶时，传代3次后，10个病毒储备物中有7个产生了含G3343A或C3364A突变的亚群，而有胰蛋白酶培养时10个病毒储备物中只有1个产生了突变，该突变是G3343A。
类似地，对于rhMPV/NL/1/00/101S，在有胰蛋白酶时用同样的全长cDNA克隆独立转染10次，在没有胰蛋白酶时也进行10次。没有胰蛋白酶时未回收到病毒。测序有胰蛋白酶时回收和扩增的10个独立拯救的rhMPV/NL/1/00/101S储备物的RT-PCR片段，显示即使连续传代10次后F基因中也没有突变。
这些数据显示没有胰蛋白酶时，快速产生的rhMPV/NL/1/00/101P的G3343A或C3364A变体促进更有效地切割该融合蛋白。有胰蛋白酶存在时，hMPV F切割的功能推测是通过外源性蛋白酶而避免了切割增强型突变的选择压力。
研究了wt hMPV/NL/1/00和wt hMPV/NL/1/99融合基因中的核苷酸多态性。在第三代猴肾细胞中传代3次，在Vero细胞中再传代3次获得了wthMPV/NL/1/00病毒储备物(“P6”)。事先已对该P6病毒储备物的全部基因组进行了序列分析，显示101位为脯氨酸(图4E中带下划线的密码子)。精密检查图谱，发现在F基因的核苷酸3343和3364处有多态性(图4E中有框和带圈的密码子)。用源自wt hMPV/NL/1/00P6储备物的RT-PCR片段(跨越nt 3200-nt3500)进行克隆分析。对于分析的20个克隆，9个含有C3364A突变(Q100K)，4个含有G3343A突变(E93K)。这两种突变与rhMPV/NL/1/00中发现的优势突变相同。其余的克隆中3个含有A3344T，1个含有A3348C，1个含有T3357A，分别编码E93V、Q94H和N97K(表20)。克隆最多含有这些突变中的1种。分离wt hMPV/NL/1/00噬斑的努力未获成功，因为hMPV感染的细胞病变效应不佳。这些结果显示，扩增至P6的wt hMPV/NL/1/00是一混合群体，含有两种优势准种。因此，生物学衍生的和重组的hMPV不难在hMPV F基因中获得促进它们在组织培养中生长的突变。
E93K和Q100K对hMPV F切割的影响.为测定E93K和Q100K对hMPV F切割的影响，在有或没有胰蛋白酶时用野生型、重组和变体hMPV/NL/1/00病毒接种Vero细胞。感染6天后收集细胞和上清液，采用蛋白质印迹分析来目测观察hMPV F蛋白的相对切割效率(图5A)。没有胰蛋白酶时，与只含101P取代的融合蛋白相比，在含E93K或Q100K氨基酸取代的变体病毒中含101P的F蛋白切割明显更有效(比较图5的泳道3、4和5与泳道2)。有胰蛋白酶存在时，野生型和突变型hMPV F蛋白的相对切割相当(图5A的泳道6-10)。胰蛋白酶未进一步提高含切割增强型E93K或Q100K氨基酸取代的hMPV F的切割效率。
单一E93K不足以赋予hMPV F不依赖胰蛋白酶的切割.在重组hMPV/NL/1/00/101P中E93K是最频繁观察到的突变，含E93K的变体F蛋白导致切割活性增强。
将核苷酸突变G3343A引入各全长cDNA hMPV/NL/1/00/101S和hMPV/NL/1/00/101P中。采用反向遗传方法回收重组病毒rhMPV/93K/101P和rhMPV/93K/101S，在Vero细胞中传代10次后显示它们的基因型稳定。蛋白质印迹分析显示没有胰蛋白酶存在时，含101P的病毒F蛋白部分被切割，而含101S的F蛋白未被切割(图5B)。存在E93K极大提高了hMPV F/101P切割的效率(泳道11和12，图5B)。然而，E93K不能提高hMPV F/101S的切割效率(泳道13和14，图5B)。因此，只在101位是脯氨酸时E93K取代才能提高hMPVF的切割效率，证明101P和93K之间对hMPV F蛋白加工有协同作用。
Vero细胞中E93K和Q100K对生长动力学的影响.为测定F蛋白不依赖胰蛋白酶切割的提高对hMPV在Vero细胞中多轮生长的影响，在没有胰蛋白酶时用rhMPV/NL/1/00/101P、vhMPV/93K/101P、rhMPV/93K/101P、vhMPV/100K/101P或wt hMPV/NL/1/00以0.1PFU/细胞的MOI感染细胞。获得没有胰蛋白酶存在时的病毒滴度。含S101P的不依赖胰蛋白酶的各病毒生长曲线相似，表明病毒峰值滴度或生长动力学未提高，而hMPV F的切割效率的提高是获得E93K或Q100K突变所致(图6)。
hMPV F切割提高与hMPV感染Vero细胞的融合活性增强相关.与其它副黏病毒类似，将全长hMPV F蛋白(F0)切割成两片段(F1和F2)暴露出促进细胞间融合的F1片段N末端的融合肽(Morrison，2003；White，1990)。目测观察wthMPV/NL/1/00感染的Vero细胞单层显示在第2-3天，大多数细胞融合形成许多大的合胞体，而rhMPV/NL/1/00/101S-感染的细胞显示合胞体少且小。
为证明细胞与细胞的融合活性增强与F蛋白切割提高有关，在有或没有胰蛋白酶时用野生型、重组和变体hMPV/NL/1/00病毒接种Vero细胞汇合单层。通过计数10个随机选择的视野中融合与未融合的核来定量测定野生型和变体病毒的融合活性。到48小时，感染vhMPV/93K/101P、rhMPV/93K/101P、vhMPV/100K/101P或wt hMPV/NL/1/00的Vero细胞单层中观察到巨大合胞体。让其生长到80小时，多核的合胞体100％覆盖了感染这些病毒的单层。为计数融合与未融合的核，在融合低于100％的48小时时固定细胞(图7)。对于一个代表性实验，没有胰蛋白酶时65-75％感染vhMPV/93K/101P、rhMPV/93K/101P、vhMPV/100K/101P或wthMPV/NL/1/00的Vero细胞显示核融合，有胰蛋白酶时，80％和90％的细胞融合(图7)。对于不含hMPV F切割增强型突变的rhMPV/NL/1/00/101P，合胞体形成明显减少；没有胰蛋白酶时融合核的百分比是13％，有胰蛋白酶时是25％。对于rhMPV/NL/1/00/101S，只在有胰蛋白酶时观察到小合胞体形成，融合核占20％(图7)。图7所示数据代表3个独立进行的实验之一的结果。由于hMPV F切割的增强未提高hMPV的复制效率，hMPV F切割的效率与形成合胞体的融合活性之间直接相关。
表征在F蛋白的RQSR切割基序中含S101P取代的B1亚型hMPV/NL/1/99.以上实验所用的hMPV/NL/1/00是A1亚型。也发现生物学衍生的wthMPV/NL/1/99(一种代表性B1亚型)在其F蛋白的预计RQSR切割位点中含有S101P取代。现有技术(Herfst等，2003)描述了与hMPV/NL/1/00相比，hMPV/NL/1/99的生长情况。
与wt hMPV/NL/1/99相比，rhMPV/NL/1/99/101S的生长特征.与rhMPV/NL/1/00/101S相似，rhMPV/NL/1/99/101S也需要外源性加入胰蛋白酶才能在Vero细胞中形成噬斑、进行多轮生长、细胞与细胞传播和F蛋白切割(图8A-D)。相反，wt hMPV/NL/1/99(含有101P)在没有胰蛋白酶时能有效生长。即使有胰蛋白酶存在下，rhMPV/NL/1/99/101S的峰值滴度也比wt hMPV/NL/1/99所显示的峰值滴度低约2log10(图76B)。B1亚型hMPV F的蛋白质印迹也显示S101P取代导致切割提高而无需加入外源性胰蛋白酶。在没有胰蛋白酶存在下hMPV F/101S显示不被切割，但在有胰蛋白酶存在下，不难观察到F1片段。此外，针对hMPV F的Mab也能识别迁移到31kDa标记以下的小条带(可能是胰蛋白酶切割的产物)(图8D)。测序源自wt hMPV/NL/1/99的F基因RT-PCR片段表明有两个核苷酸多态性，C3346A和G3352A，二者分别编码F中预计的Q94K和E96K氨基酸取代。
因此，A1和B1二亚型融合蛋白的切割位点处RQSR基序中的S101P改变了蛋白酶特异性，从而导致hMPV能在没有胰蛋白酶存在下有效生长。
讨论
据报道，hMPV生长需要胰蛋白酶(Bastien等，2003a和2003b；Biacchesi等，2003；Boivin等，2002；Hamelin等，2004；Peret等，2002和2004；Skiadolopous等，2004；van den Hoogen等，2001和2004b)。然而，观察到有或没有胰蛋白酶存在时hMPV/NL/1/00(亚型A1)和hMPV/NL/1/99(亚型B1)在第三代猴肾细胞中传代3次，在Vero细胞中传代3次(毒株“P6”)显示生长动力学和峰值滴度相当。对于另一种副黏病毒—仙台病毒，已证明改变融合蛋白前体(F0)切割位点的突变明显影响了病毒生长对胰蛋白酶的需求(Ishida和M.Homma，1978；Kido等，1992；Tashiro和M.Homma，1983；Tashiro，M.等，1988和1992)。
为证明hMPV/NL/1/00和hMPV/NL/1/99不依赖胰蛋白酶生长的遗传学基础，测序hMPV融合基因以鉴定氨基酸突变(van den Hoogen，2001，2002)。发现推定的F1/F2切割位点RQSR基序附近的几个核苷酸和其中的一个核苷酸显示了核苷酸多态性。这些核苷酸突变之一编码RQSR基序中101位的S到P取代。通过与其它副黏病毒融合蛋白类比，在RQS/PR基序处切割可能暴露出宿主细胞膜融合、合胞体形成和病毒有效扩增所需的位于F1片段N末端处的融合结构域(Morrison，T.，2003；Scheid和Choppin，1974和1977)。
为研究S101P取代对(病毒在)Vero细胞中不依赖胰蛋白酶生长的作用，制备了在RQSR基序中101位含有丝氨酸或脯氨酸的重组hMPV/NL/1/00病毒。与rhMPV/NL/1/00/101P明显相反，发现不加入胰蛋白酶时表达含101S的融合蛋白的hMPV不能启动多轮生长。rhMPV/NL/1/00/101P显示在有和没有外源性胰蛋白酶时的生长动力学和平均峰值滴度相当，这与hMPV F/101P在有和没有胰蛋白酶存在下的切割效率相当有关。相反，只要加入外源性胰蛋白酶切割了hMPVF/101S，rhMPV/NL/1/00/F101S即能启动多轮生长。因此，RQSR基序的S101P取代是不依赖胰蛋白酶生长表型的主要决定因素，其在促进hMPV F1/F2切割中起主要作用。
表达hMPV F/101P的hMPV能在推定的F2片段(而不是F1片段)的其它氨基酸位置快速获得突变。大多数这些突变毗邻RQPR基序，虽然Q100K突变在该基序内。在RQPR基序外发生的F2突变中，最频繁鉴定到E93K，经工程改造而能表达hMPV F/93K/101P的hMPV显示F0加工和细胞融合活性增强。能提高hMPV F切割的突变的产生速度显示它们能在Vero细胞培养中赋予生长优势。虽然该生长优势在以0.1的MOI接种产生的比较性多轮生长曲线上不明显，但当在有胰蛋白酶时比较rhMPV/NL/1/00/101P和rhMPV/NL/1/00/101S的生长，hMPV F切割效率提高确实产生了更多的传染性病毒(图2)。然而，rhMPV/NL/1/00/101P的生长效率可能足够，因而进一步提高hMPV F切割效率不可能明显提高峰值滴度(图6)。
对于hMPV/NL/1/99，一种B1亚型hMPV也观察到该表型。A1和B1亚型的F蛋白的氨基酸同源性为94％，大多数非同源氨基酸位于包含推定跨膜区的hMPV F蛋白C末端(van den Hoogen等，2004a和b)。虽然该融合蛋白中101位的S到P取代也导致hMPV/NL/1/99不依赖胰蛋白酶的生长，但测序P6储备物显示大多数F2多态性发生在氨基酸94和96处，而不是在A1亚型hMPV F中的93和100处。由于两种亚型的F蛋白在F1/F2切割位点附近高度保守，发现不同的切割增强型突变出乎意料。不想局限于理论，hMPV/NL/1/99/F 101P更广泛地传代可导致类似于A1亚型F2片段中发现的氨基酸取代。然而，F2突变中的差异可能反映了结合能催化hMPV F切割的蛋白酶的灵活性或hMPV FA1和B1糖蛋白该区域中顺序构象的差异(order conformational difference)较高。
S101P取代也提高了从嵌合型牛/人PIV3病毒载体表达后hMPV F的切割效率，表明hMPV融合蛋白的切割不存在与其它hMPV蛋白的相互作用。然而，源自PIV3感染细胞的hMPV F1片段量低于受hMPV感染的细胞中观察到的量，显示与其它hMPV蛋白的相互作用也可能导致切割活性更高。其它可能性包括PIV3蛋白的抑制作用或hMPV与PIV3感染诱导的细胞状态存在的差异。然而，这些观察结果进一步证实Vero细胞中hMPV F的RQSR基序中S101P取代是切割活性的重要决定因素。
hMPV F/101S的表面表达提示未切割的hMPV F0前体被运输到细胞表面。在Vero细胞中，即使有胰蛋白酶存在时，也有相当数量的hMPV F0前体未被切割，这与RSV融合蛋白的加工相反(Gonzalez-Reyes，2001；Collins，1991)。这提示hMPV F前体加工不充分和/或hMPV F0在hMPV的体外复制周期中有作用。在与外源性加入的胰蛋白酶接触后，hMPV F/101S显示可在胞外被切割。然而，hMPV F/101P是在胞内或胞外被切割尚不清楚。据认为，该切割位点含有多个碱性残基的其它副黏病毒融合蛋白是通过胞内蛋白酶，例如弗林蛋白酶切割(Bosch，1981；Kawaoka等，1984；Klenk，1988和1994)。
对于副黏病毒融合蛋白，切割F0前体是其传染力和致病性的先决条件(Kido等，1996；Klenk，1994)。对于一些呼吸道病毒，例如流感病毒、新城疫病毒(NDV)、2型副流感病毒(PIV2)和仙台病毒(SeV)，F蛋白中组织特异性蛋白酶(例如支气管上皮分泌的克拉拉类胰蛋白酶)所识别基序改变为非特异性遍在蛋白酶(例如弗林蛋白酶)识别基序的突变将导致毒力增强。(Bosch等，1981；Collins等，1993和2001；Glickman等，1988；Kawoaka等，1984；Klenk等，1988和1994；Nagai等，1989，Seal等，2000；Toyoda等，1987；Towatari等，2002)。
参考文献
Barr，P.J.1991.Mammalian subtilisins：the long-sought dibasic processingendoproteases(哺乳动物枯草杆菌蛋白酶：长期找寻的二元加工内切酶).Cell.66：1-3.
Bastien，N.，S.Normand，T.Taylor，D.Ward，T.C.T.Peret，G.Boivin，L.J.Anderson，Y.Li.2003a.Sequence analysis of the N，P，M and F genes ofCanadian human metapneumovirus strains(加拿大人偏肺病毒毒株的N、P、M和F基因的序列分析).Virus Research.93：51-62.
Bastien，N，D.Ward，P.Van Caeseele，K.Brandt，S.H.Lee，G.McNabb，B.Klisko，E.Chan和Y.Li.2003b.Human metapneumovirus infection in theCanadian population(加拿大人中的人群偏肺病毒感染).J.Clin.Microbiol.41：4642-4646.
Biacchesi，S.，M.H.Skiadopoulos，G.Boivin，C.T.Hanson，B.R.Murphy，P.L.Collins和U.J.Buchholz.2003.Genetic diversity between humanmetapneumovirus subgroups(人偏肺病毒亚群之间的遗传多样性).Virology 315：1-9.
Boivin，G.，Y.Abed，G.Pelletier，L.Ruel，D.Moisan，S.Cote，T.C.T.Peret，D.D.Erdman和L.J.Anderson.2002.Virological features and clinicalmanifestations associated with human metapeumovirus：a new paramyxovirusresponsible for acute respiratory-tract infections in all age groups(人偏肺病毒相关的病毒学特征和临床表现：在所有年龄组中导致急性呼吸道感染的一种新副黏病毒).J.Infect.Dis.186：1330-1334.
Boivin，G.，G.De Serres，S.Cote，R.Gilca，Y.Abed，L.Rochette，M.G.Bergeron和P.Dery.2003.Human metapneumovirus infections in hospitalizedchildren(住院治疗儿童中的人偏肺病毒感染).Emerg.Infect.Dis.9：634-640.
Bosch，F.S.，W.Garten，H.-D.Klenk和R.Rott.1981.Proteolytic cleavageof influenza virus hemagglutinin(流感病毒血凝素的蛋白水解切割).Primarystructure of the connecting peptide between HA1 and HA2 determines proteolyticcleavability and pathogenicity of avian influenza viruses(HA1和HA2之间的连接肽的一级结构决定禽流感病毒的蛋白水解可切割性和致病性).Virology 113：725-735.
Chen，Y.，M.Shiota，M.Ohuchi，T.Towatari，J.Tashiro，M.Murakami，M.Yano，B.Yang和H.Kido.2000.Mast cell tryptase from pig lungs triggersinfection by pneumotropic Sendai and influenza A viruses(猪肺的肥大细胞类胰蛋白酶激发亲肺仙台和甲型流感病毒感染).Eur.J.Biochem.267：3189-3197.
Collins，M.S.，J.B.Bashiruddin，D.J.Alexander.1993.Deduced amino acidsequences at the fusion protein cleavage site of Newcastle disease viruses showingvariation in antigenicity and pathogenicity(抗原性和致病性变化的新城疫病毒融合蛋白切割位点的推导氨基酸序列).Arch.Virol.128：363-370.
Collins，P.L.和G.Mottett.1991.Post translational processing andoligomerization of the fusion glycoprotein of human respiratory syncytial virus(人呼吸道合胞体病毒的融合糖蛋白翻译后加工和寡聚化).J.Gen.Virol.72：3095-4101.
Collins，P.L.，R.M.Chanock，B.R.Murphy.2001.Respiratory syncytialvirus(呼吸道合胞体病毒).刊于：Knipe，D.M.，Howley，P.M.，D.E Griffin，R.A.Lamb，M.A.Martin，B.Roizman和S.E.Straus(编)，Fields Virology(《现场病毒学》)，第四版，Lippincott Williams and Wilkins，费城，宾夕法尼亚州，第1443-1486页.
Glickman，R.L.，R.J.Syddall，R.M.Iorio，J.P.Sheehan和M.A.Bratt.1988.Quantitative basic residue requirements in the cleavage-activation site of the fusionglycoprotein as a determinant of virulence for Newcastle disease virus(作为新城疫病毒毒力决定因素的融合糖蛋白的切割活化位点中的定量碱性残基要求).J.Virol.62：354-356.
Gonzalez-Reyes，L.，M.B.Ruiz-Arguello，B.Garcia-Barreno，L.Calder，J.A.Lopez，J.P.Albar，J.J.Skehel，D.C.Wiley和J.A.Melero.2001.Cleavage of thehuman respiratory syncytial virus fusion protein at two distinct sites is required foractivation of membrane fusion(激活膜融合需要切割人呼吸道合胞体病毒融合蛋白的两个不同位点).PNAS.98：9859-9864.
Haller，A.A.，T.Miller，M.Mitiku和K.Coelingh.2000.Expression ofthe surface glycoproteins of human parainfluenza virus type 3 by bovineparainfluenza virus type 3，a novel attenuated virus vaccine vector(通过3型牛副流感病毒，一种新型减毒病毒疫苗载体表达3型人副流感病毒的表面糖蛋白).J.Virol.74：11626-11635.
Haller，A.A.，M.MacPhail，M.Mitiku和R.S.Tang.2001.A single aminoacid substitution in the viral polymerase creates a temperature-sensitive andattenuated recombinant bovine parainfluenza virus type 3(病毒聚合酶中的单个氨基酸取代产生温度敏感的和减毒的3型重组牛副流感病毒).Virology.288：342-350.
Hamelin，M-E.，Y.Abed和G.Boivin.2004.Human metapneumovirus：anew player among respiratory viruses(人偏肺病毒：呼吸道病毒中的新手).Clinical Infectious Diseases 38：983-990.
Herfst，S.，M.de Graaf，J.H.Schickli，R.S.Tang，J.Kaur，R.R.Spaete，A.A.Haller，B.G.van den Hoogen，A.D.M.E.Osterhaus和R.A.M.Fouchier.2004.Recovery of human metapneumovirus genetic lineages A and B from clonedcDNA(从克隆的cDNA中回收人偏肺病毒遗传谱系A和B).J.Virol.78：8264-8270.
Howe，M.2002.Australian find suggests worldwide reach formetapneumovirus(澳大利亚的发现提示偏肺病毒遍布全球).Lancet Infect.Dis.2：202.
IJpma，F.F.，D.Beekhuis，M.F.Cotton，C.H.Pieper，J.L.Kimpen，B.G.vandenHoogen，G.J.van Doornum和D.M.Osterhaus.2004.Humanmetapneumovirus infection in hospital referred South African children(援引南非住院儿童中的人偏肺病毒感染).J.Med.Virol.73：486
Ishida，N.和M.Homma.1978.Sendai virus(仙台病毒).Adv.Virus Res.23：349-383.
Kawaoka，T.，C.W.Naeve和R.G.Webster.1984.Is virulence of H5N2influenza viruses in chickens associated with loss of carbohydrate from thehemagglutinin？(H5N2流感病毒在鸡中的毒力是否与血凝素中的碳水化合物丧失有关).Virology 139：303-316.
Kido，H.，T.Yokogoshi，K.Sakai，M.Tashiro，Y.A.Kishino，A.Fukutomi和N.Katunuma.1992.Isolation and characterization of a novel trypsin-like proteasefound in rat bronchiolar epithelial Clara cells：a possible activator of the viralfusion glycoprotein(大鼠支气管上皮卡拉拉细胞中发现的新型胰蛋白酶样蛋白酶的分离与表征：该病毒融合糖蛋白的可能激活物).J.Biol.Chem.267：13573-13579.
Kido，H.，Y.Niwa，Y.Beppu和T.Towatari.1996.Cellular proteasesinvolved in the pathogenicity of enveloped animal viruses，humanimmunodeficiency virus，influenza virus A and Sendai virus(参与被膜动物病毒、人免疫缺陷病毒、甲型流感病毒和仙台病毒致病性的细胞蛋白酶).Adv.Anzyme Regul.36：325-47.
Klenk，H-D.和W.Garten.1994.Host cell proteases controlling viruspathogenicity(控制病毒致病性的宿主细胞蛋白酶).Trends Microbiol.2(2)：39-43.
Klenk，H.-D.和R.Rott.1988.The molecular biology of influenza viruspathogenicity(流感病毒致病性的分子生物学).Adv.Virus Res.34：247-281.
Lamb，R.A.1993.Paramyxovirus fusion：A hypothesis for changes(副黏病毒融合：变化的假说).Virology.197：1-11.
Maggi，F.，M.Pifferi，M.Vatteroni，C.Fornai，E.Tempestini，S.Anzilotti，L.Lanini，E Andreoli，V.Ragazzo，M.Pistello，S.Specter，M.Bendinelli.2003.Human metapneumovirus associated with respiratory tract infections in a 3-yearstudy of nasal swabs from infants in Italy(意大利婴儿鼻拭子的3年研究中与呼吸道感染有关的人偏肺病毒).J.Clinical Microbiology.41：2987-2991.
Morrison，T.G.，2003.Structure and function of a paramyxovirus fusionprotein(副黏病毒融合蛋白的结构与功能).Biochimica et Biophysica Acta 1614：73-84.
Nagai，Y.，M.Hamaguchi和T.Toyoda.1989.Molecular biology of Newcastledisease virus(新城疫病毒的分子生物学).Prog.Vet.Microbiol.5：16-64.
Nagai，Y.，H.-D.Klenk和R.Rott.1976.Proteolytic cleavage of the viralglycoproteins and its significance for the virulence of Newcastle disease virus(病毒糖蛋白的蛋白水解切割及其对新城疫病毒毒力的意义).Virology 72：494-508.
Nissen M.D.，D.J.Siebert，I.M.，Mackay，T.P.，Sloots和S.J.Withers.2002.Evidence of human metapneumovirus in Australian children(澳大利亚儿童中人偏肺病毒的证据).Med.J.Aust.176：188.
Okada，H.，J.T.Seto，N.L.McQueen，H.-D.Klenk，R.Rott和M.Tashiro.1998.Determinants of pantropism of the F1-R mutant of Sendai virus：specificmutations involved are in the F and M genes(仙台病毒F1-R突变体泛嗜性的决定因素：所包括的特异性突变发生在F和M基因中).Arch.Virol.143：2342-2352.
Peiris，J.S.，W.H.Tang，K.H.Chan，P.L.Khong，Y.Guan，Y.L.Lau和S.S.Chiu.20023，Children with respiratory disease associated with metapneumovirusin Hong Kong(与偏肺病毒有关的香港呼吸道疾病患儿).Emerg.Infect.Dis.9：628-633.
Peret，T.C.T.，G.Boivin，Y.Li，M.Couillard，C.Humphrey，A.D.M.E.Osterhaus，D.D.Erdman和L.J.Anderson.2002.Characterization of humanmetapneumoviruses isolated from patients in North America(表征北美患者的人偏肺病毒分离物).J.Infect.Dis.185：1660-1663.
Peret，T.C.T.，Y.Abed，L.J.Anderson，D.D.Erdman和G.Boivin.2004.Sequence polymorphism of the predicted human metapneumovirus Gglycoprotein(预计的人偏肺病毒G糖蛋白的序列多态性).J.Gen Virol.85：679-686.
Russell，C.J.，T.S.Jardertzky，R.A.Lamb.2001.Membrane fusionmachines of paramyxoviruses：capture of intermediates of fusion(副黏病毒的膜融合机制：捕捉融合中间体).EMBO.J.20：4024-4034.
Seal，B.S.，H.S.Sellers，R.J.Meinersmann，2000.Fusion protein predictedamino acid sequence of the first US avian pneumovirus isolate and lack ofheterogeneity among other US isolates(首份美国禽肺病毒分离物融合蛋白的预计氨基酸序列在其它美国分离物中无异质性).Virus.Res.66：139-147.
Scheid，A和P.W.Choppin.1974.Identification of the biological activities ofparamyxovirus glycoproteins(鉴定副黏病毒糖蛋白的生物学活性).Activation ofcell fusion，hemolysis and infectivity by proteolytic cleavage of an inactiveprecursor protein of Sendaivirus(通过蛋白水解切割仙台病毒的无活性前体蛋白激活了细胞融合、溶血作用和传染力).Virology，57：475-490.
Scheid，A和P.W.Choppin，1977.Two disulfide linked polypeptide chainsconstitute the active F protein of paramyxoviruses(两条二硫键连接的多肽链构成了副黏病毒的活性F蛋白).Virology 80：54-66.
Skiadopoulos，M.H.，S.Biacchesi，U.J.Buchholz，J.M.Riggs，S.R.Surman，E.Amaro-Carambot，J.M.McAuliffe，W.R.Elkins，M.St.Claire，P.L.Collins和B.R Murphy.2004.The two major human metapneumovirus genetic lineagesare highly related antigenically，and the fusion(F)protein is a major contributor tothis antigenic relatedness(两种主要的人偏肺病毒遗传谱系在抗原性上高度相关和主要是融合(F)蛋白导致此抗原性相关).J.V.78：6927-6937.
Skiadopoulos，M.H.，S.R.Surman，J.M.Riggs，C.Orvell，P.L.Collins和B.R.Murphy.2002.Evaluation of the replication and immunogenicity of recombinanthuman parainfluenza virus type 3 vectors expressing up to three foreignglycoproteins(评估最多表达3种外源糖蛋白的重组3型人副流感病毒的复制和免疫原性).Virology 297：136-152.
Stockton，J.I.Stephenson，D.Fleming，M.Zambon，2002.Humanmetapneumovirus as a cause of community-acquired respiratory illness(作为社区获得性呼吸道疾病因子的人偏肺病毒).Emerg.Infect.Dis.8，897-901.
Tang，R.S.，M.MacPhail，J.H.Schickli，J.Kaur，C.L.Robinson，H.A.Lawlor，J.M.Guzzetta，R.R.Spaete和A.A.Haller.2004a.Parainfluenza virus type 3expressing the native or soluble fusion(F)protein of respiratory syncytial virus(RSV)confers protection from RSV infection in African green monkeys(表达呼吸道合胞体病毒(RSV)的天然或可溶性融合(F)蛋白的3型副流感病毒赋予了峰值RSV感染非洲绿猴的保护力).J.Virol.78：11198-11207.
Tang，R.S.，K.Mahmood，M.MacPhail，J.M.Guzzetta，A.A.Haller，H.Liu，J.Kaur，H.A.Lawlor，E.A.Stillman，J.H.Schickli R.A.M.Fouchier，A.D.M.E.Osterhaus，R.R.Spaete.2004b.A Host-range restricted parainfluenza virus type 3(PIV3)expressing the human metapneumovirus(hMPV)fusion protein elicitsprotective immunity in African green monkeys(表达人偏肺病毒(hMPV)融合蛋白的宿主范围限制性3型副流感病毒能在非洲绿猴中引发保护性免疫力).Vaccine(印刷中)
Tang，R.S.，J.H.Schickli，M.MacPhail，F.Fernandes，L.Bicha，J.Spaete，R.A.M.Fouchier，A.D.M.E.Osterhaus，R.Spaete和A.A.Haller.2003.Effectsof human metapneumovirus and respiratory syncytial virus antign insertion in two3’proximal genome positions of bovine/human parainfluenza virus type 3 on virusreplication and immunogenicity(将人偏肺病毒和呼吸道合胞体病毒抗原插入3型牛/人副流感病毒的两个3’近端基因组位置对病毒复制和免疫原性的影响).J.Virol.77：10819-10828
Tashiro，M.和M.Homma.1983.Pneumotropism of Sendai virus in relation toprotease-mediated activation in mouse lungs(小鼠肺中仙台病毒的亲肺性与蛋白酶介导的活化有关).Infect.Immun.39：879-888.
Tashiro，M.，N.L.McQueen，J.T.Seto，H.-D.Klenk和R.Rott.1996.Involvement of the mutated M protein in altered budding polarity of a pantropicmutant，F1-R，of Sendai virus(突变型M蛋白参与仙台病毒泛嗜性突变体F1-R的出芽极性改变).J.of Vir.70：5990-5997.
Tashiro，M.，E.Pritzer，M.A.Khoshnan，M.Yamakawa，K.Kuroda，H.-D.Klenk，R.Rott和J.T.Seto.1988.Characterization of a pantropic variant of Sendaivirus derivedfrom a host-range mutant(表征源自宿主范围突变体的仙台病毒的泛嗜性变体).Virology 165：577-583.
Tashiro，M.J.T.Seto，S.Choosakul，M.Yamakawa，H.-D.Klenk和R.Rott.1992a.Budding site of Sendai virus in polarized epithelial cells is one of thedeterminants for tropism and pathogenicity in mice(极化上皮细胞中仙台病毒的出芽部位是小鼠中嗜性和致病性的决定因素之一).Virology 187：413-422.
Tashiro，M.，S.T.Seto，H.-D.Klenk和R.Rott.1993.Possible involvementof microtubule disruption in bipolar budding of a Sendai virus mutant，F1-R，inepithelial MDCK cells(在上皮MDCK细胞中微管破坏可能参与仙台病毒突变体F1-R的双极性出芽).J.of Vir.67：5902-5910.
Tashiro，M.，M.Yamakawa，K.Tobita，H.-D.Klenk，R.Rott和J.T.Seto.1990 Organ tropism of Sendai virus in mice：proteolytic activation of the fusionglycoprotein in mouse organs and budding site at the bronchial epithelium(仙台病毒在小鼠中的器官嗜性：小鼠器官中融合糖蛋白的蛋白水解激活和支气管上皮的出芽部位).J.of Vir.64：3627-3634.
Tashiro，M.，Y.Yokogoshi，K.Tobita，J.T.Seto，R.Rott和H.Kondo.1992b.Tryptase Clara：an activating protease for Sendai virus in rat lungs that is involvedin pneumopathogenicity(卡拉拉类胰蛋白酶：参与仙台病毒在大鼠肺中肺致病性的活化蛋白酶).J.Viro.66：7211-7216.
Toquin，D.，C.de Boisseson，V.Beven，D.A.Senne和N Eterradossi.2003.Subgroup C avian metapneumovirus(MPV)and the recently isolated human MPVexhibit a common organization but have extensive sequence divergence in theirputative SH and G genes(C亚群禽肺病毒(MPV)和最近分离的人MPV显示有共同的结构，但在它们的推定SH和G基因中有广泛的序列差异).J.of GeneralVirology.84：2169-2178.
Towatari，T.，M.Ide，K.Ohba，Y.Chiba，M.Murakami，M.Shiota，M.Kawachi，H.Yamada和H.Kido.2002.Identification of ectopic anionic trypsin Iin rat lungs potentiating pneumotropic virus infectivity and increased enzyme levelafter virus infection(鉴定大鼠肺中能增强亲肺病毒传染力和提高病毒感染后酶水平的异位阴离子胰蛋白酶I).Eur.J.Biochem.269：2613-2621.
Toyoda，T.，T.Sakaguchi，K.Imai，N.M.Inocencio，B.Gotoh，M.Hamaguchi和T.Nagai.1987.Structural comparison of the cleavage-activation site of thefusion glycoprotein between virulent and avirulent strains of Newcastle diseasevirus(新城疫病毒毒力和无毒力毒株之间融合糖蛋白切割激活位点的结构比较).Virology 158：242-247.
van den Hoogen，B.G.，T.M.Bestebroer，A.D.M.E.Osterhaus和R.A.M.Fouchier.2002.Analysis of the genomic sequence of human metapneumovirus(分析人偏肺病毒的基因组序列).Virology.295：119-132.
van den Hoogen，B.G.，G.J.van Doornum，J.C.Fockens，J.J.Cornelissen，W.E.Beyer，R.deGroot，A.D.Osterhaus和R.A.Fouchier.2003.Prevalenceand clinical symptoms of human metapneumovirus infection in hospitalizedpatients(住院患者中人偏肺病毒感染的流行和临床症状).J.Infect.Dis.188：1571-1577.
van den Hoogen，B.G.，S.Herfst，L.Sprong，P.A.Cane，E.Forleo-Neto，R.L.de Swart，A.D.M.E.Osterhaus和R.A.M.Fouchier.2004a.Antigenic and geneticvariability of human metapneumoviruses(人偏肺病毒的抗原性和遗传变异性).2004b.Emerging Infectious Diseases(新出现的传染性疾病).10：658-666.
van den Hoogen，B.G.，J.C.de Jong，J.Groen，T.Kuiken，R.de Groot，R.A.M.Fouchier和A.D.M.E.Osterhaus.2001.A newly discovered human pneumovirusisolated from young children with respiratory tract disease(从患呼吸道疾病的幼儿分离到新发现的人肺病毒).Nat.Med.7：719-724.
van den Hoogen，B.G.，A.D.M.E.Osterhaus和R.A.M.Fouchier.2004b.Clinical impact and diagnosis of hMPV infections(hMPV感染的临床影响和诊断).Pediatric Infectious Disease Journal，23：S25-32.
White，J.M.1990.Viral and cellular membrane fusion proteins(病毒和细胞膜融合蛋白).Annual Review Physiology.52：675-697.
Willams，J.V.，P.A.Harris，S.J.Tollefson，L.L.Halburnt-Rush，J.M.Pingsterhaus，K.M.Edwards，P.F.Wright和J.E.Crowe Jr.2004.Humanmetapneumovirus and lower respiratory tract disease in otherwise healthy infantsand children(健康婴儿和儿童中的人偏肺病毒和下呼吸道疾病).N.Engl.J.Med.350：443-450.
Wolf，D.，Z.Zakay-Rones，A.Fadeela，D.Greenberg和R.Dagan.2003.High seroprevalence of human metapneumovirus among young children inIsrael(以色列幼儿中人偏肺病毒的血清阳性率高).J.Inf.Dis.188：1865-1867.
引用的参考文献
本领域技术人员知道可对本发明作出许多改进和变化而不脱离其构思和范围。给予本文所述的具体实施方式只是举例，本发明只受限于附加的权利要求书的条款连同这些权利要求所赋予的等同全部范围。这种改进应属于附加的权利要求书的范围。
如同各篇单独的出版物或专利或专利申请专门且单独表明出于所有目的全文纳入本文作为参考的程度一样，本文引用的所有参考文献、专利和非专利出于所有目的全文纳入本文作为参考。
此外，2004年4月23日提交，2005年1月27日作为US 2005/0019891 A1公布的，名为“Metapneumovirus Strains And Their Use In Vaccine FormulationsAnd As Vectors For Expression Of Antigenic Sequences And Methods ForPropagating Virus”(偏肺病毒毒株及其在疫苗制剂中和作为表达抗原性序列的载体的应用以及增殖病毒的方法)的美国专利申请系列号10/831,780全文纳入本文作为参考。
表14：序列表的图例
SEQ ID NO：1     人偏肺病毒分离物00-1基质蛋白(M)和融合蛋白(F)基因
SEQ ID NO：2     禽肺病毒融合蛋白基因，部分cds
SEQ ID NO：3     禽肺病毒分离物1b融合蛋白mRNA，完整的cds
SEQ ID NO：4     火鸡鼻气管炎病毒的融合蛋白(F1和F2亚基)基因，完整的cds
SEQ ID NO：5     禽肺病毒基质蛋白(M)基因，部分cds和禽肺病毒融合糖蛋白(F)基因，完整的cds
SEQ ID NO：6     副黏病毒F蛋白hRSV B
SEQ ID NO：7     副黏病毒F蛋白hRSV A2
SEQ ID NO：8     人偏肺病毒01-71(部分序列)
SEQ ID NO：9     人偏肺病毒分离物00-1基质蛋白(M)和融合蛋白(F)基因
SEQ ID NO：10    禽肺病毒融合蛋白基因，部分cds
SEQ ID NO：11    禽肺病毒分离物1b融合蛋白mRNA，完整的cds
SEQ ID NO：12    火鸡鼻气管炎病毒的融合蛋白(F1和F2亚基)基因，完整的cds
SEQ ID NO：13    禽肺病毒融合糖蛋白(F)基因，完整的cds
SEQ ID NO：14    火鸡鼻气管炎病毒(毒株CVL14/1)连接蛋白(G)mRNA，完整的cds
SEQ ID NO：15    火鸡鼻气管炎病毒(毒株6574)连接蛋白(G)，完整的cds
SEQ ID NO：16    火鸡鼻气管炎病毒(毒株CVL14/1)连接蛋白(G)mRNA，完整的cds
SEQ ID NO：17    火鸡鼻气管炎病毒(毒株6574)连接蛋白(G)，完整的cds
SEQ ID NO：18    分离物NL/1/99(99-1)HMPV(人偏肺病毒)cDNA序列
SEQ ID NO：19    分离物NL/1/00(00-1)HMPV cDNA序列
SEQ ID NO：20    分离物NL/17/00HMPV cDNA序列
SEQ ID NO：21    分离物NL/1/94HMPV cDNA序列
SEQ ID NO：22    RT-PCR引物TR1
SEQ ID NO：23    RT-PCR引物N1
SEQ ID NO：24    RT-PCR引物N2
SEQ ID NO：25    RT-PCR引物M1
SEQ ID NO：26    RT-PCR引物M2
SEQ ID NO：27    RT-PCR引物F1
SEQ ID NO：28    RT-PCR引物N3
SEQ ID NO：29    RT-PCR引物N4
SEQ ID NO：30    RT-PCR引物M3
SEQ ID NO：31     RT-PCR引物M4
SEQ ID NO：32     RT-PCR引物F7
SEQ ID NO：33     RT-PCR引物F8
SEQ ID NO：34     RT-PCR引物L6
SEQ ID NO：35     RT-PCR引物L7
SEQ ID NO：36     寡核苷酸探针M
SEQ ID NO：37     寡核苷酸探针N
SEQ ID NO：38     寡核苷酸探针L
SEQ ID NO：39     分离物NL/1/00、BI/1/01、FI/4/01、NL/8/01、FI/2/01的TaqMan引物和探针序列
SEQ ID NO：40     分离物NL/30/01的TaqMan引物和探针序列
SEQ ID NO：41     分离物NL/22/01和NL/23/01的TaqMan引物和探针序列
SEQ ID NO：42     分离物NL/17/01的TaqMan引物和探针序列
SEQ ID NO：43     分离物NL/17/00的的TaqMan引物和探针序列
SEQ ID NO：44     分离物NL/9/01、NL/21/01和NL/5/01的TaqMan引物和探针序列
SEQ ID NO：45     分离物FI/1/01和FI/10/01的TaqMan引物和探针序列
SEQ ID NO：46     引物ZF1
SEQ ID NO：47      引物ZF4
SEQ ID NO：48     引物ZF7
SEQ ID NO：49     引物ZF10
SEQ ID NO：50     引物ZF13
SEQ ID NO：51     引物ZF16
SEQ ID NO：52      引物CS1
SEQ ID NO：53      引物CS4
SEQ ID NO：54     引物CS7
SEQ ID NO：55      引物CS10
SEQ ID NO：56      引物CS13
SEQ ID NO：57     引物CS16
SEQ ID NO：58     扩增HPIV-1的正向引物
SEQ ID NO：59     扩增HPIV-1的反向引物
SEQ ID NO：60     扩增HPIV-2的正向引物
SEQ ID NO：61     扩增HPIV-2的反向引物
SEQ ID NO：62     扩增HPIV-3的正向引物
SEQ ID NO：63     扩增HPIV-3的反向引物
SEQ ID NO：64     扩增HPIV-4的正向引物
SEQ ID NO：65     扩增HPIV-4的反向引物
SEQ ID NO：66     扩增腮腺炎病毒的正向引物
SEQ ID NO：67     扩增腮腺炎病毒的反向引物
SEQ ID NO：68     扩增NDV的正向引物
SEQ ID NO：69     扩增NDV的反向引物
SEQ ID NO：70     扩增Tupaia的正向引物
SEQ ID NO：71      扩增Tupaia的反向引物
SEQ ID NO：72     扩增Mapuera的正向引物
SEQ ID NO：73     扩增Mapuera的反向引物
SEQ ID NO：74     扩增Hendra的正向引物
SEQ ID NO：75     扩增Hendra的反向引物
SEQ ID NO：76     扩增Nipah的正向引物
SEQ ID NO：77     扩增Nipah的反向引物
SEQ ID NO：78     扩增HRSV的正向引物
SEQ ID NO：79     扩增HRSV的反向引物
SEQ ID NO：80     扩增麻疹病毒的正向引物
SEQ ID NO：81     扩增麻疹病毒的反向引物
SEQ ID NO：82     扩增普通副黏病毒(general paramyxoviridae viruses)的正向引物
SEQ ID NO：83     扩增普通副黏病毒的反向引物
SEQ ID NO：84     分离物NL/1/00(A1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：85     分离物BR/2/01(A1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：86     分离物FL/4/01(A1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：87     分离物FL/3/01(A1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：88     分离物FL/8/01(A1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：89     分离物FL/10/01(A1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：90     分离物NL/10/01(A1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：91     分离物NL/2/02(A1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：92     分离物NL/17/00(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：93     分离物NL/1/81(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：94     分离物NL/1/93(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：95     分离物NL/2/93(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：96     分离物NL/3/93(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：97     分离物NL/1/95(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：98     分离物NL/2/96(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：99     分离物NL/3/96(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：100    分离物NL/22/01(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：101    分离物NL/24/01(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：102    分离物NL/23/01(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：103    分离物NL/29/01(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：104    分离物NL/3/02(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：105    分离物NL/1/99(B1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：106    分离物NL/11/00(B1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：107    分离物NL/12/00(B1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：108    分离物NL/5/01(B1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：109    分离物NL/9/01(B1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：110    分离物NL/21/01(B1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：111    分离物NL/1/94(B2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：112    分离物NL/1/82(B2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：113    分离物NL/1/96(B2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：114    分离物NL/6/97(B2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：115    分离物NL/9/00(B2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：116    分离物NL/3/01(B2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：117    分离物NL/4/01(B2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：118     分离物UK/5/01(B2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：119     分离物NL/1/00(A1)的G蛋白序列
SEQ ID NO：120     分离物BR/2/01(A1)的G蛋白序列
SEQ ID NO：121     分离物FL/4/01(A1)的G蛋白序列
SEQ ID NO：122     分离物FL/3/01(A1)的G蛋白序列
SEQ ID NO：123     分离物FL/8/01(A1)的G蛋白序列
SEQ ID NO：124     分离物FL/10/01(A1)的G蛋白序列
SEQ ID NO：125     分离物NL/10/01(A1)的G蛋白序列
SEQ ID NO：126     分离物NL/2/02(A1)的G蛋白序列
SEQ ID NO：127     分离物NL/17/00(A2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：128     分离物NL/1/81(A2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：129     分离物NL/1/93(A2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：130     分离物NL/2/93(A2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：131     分离物NL/3/93(A2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：132     分离物NL/1/95(A2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：133     分离物NL/2/96(A2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：134     分离物NL/3/96(A2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：135     分离物NL/22/01(A2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：136     分离物NL/24/01(A2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：137     分离物NL/23/01(A2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：138     分离物NL/29/01(A2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：139     分离物NL/3/02(A2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：140     分离物NL/1/99(B1)的G蛋白序列
SEQ ID NO：141     分离物NL/11/00(B1)的G蛋白序列
SEQ ID NO：142     分离物NL/12/00(B1)的G蛋白序列
SEQ ID NO：143     分离物NL/5/01(B1)的G蛋白序列
SEQ ID NO：144     分离物NL/9/01(B1)的G蛋白序列
SEQ ID NO：145     分离物NL/21/01(B1)的G蛋白序列
SEQ ID NO：146     分离物NL/1/94(B2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：147     分离物NL/1/82(B2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：148     分离物NL/1/96(B2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：149     分离物NL/6/97(B2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：150     分离物NL/9/00(B2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：151     分离物NL/3/01(B2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：152     分离物NL/4/01(B2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：153     分离物NL/5/01(B2)的G蛋白序列
SEQ ID NO：154     分离物NL/1/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：155     分离物UK/1/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：156     分离物NL/2/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：157     分离物NL/13/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：158     分离物NL/14/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：159     分离物FL/3/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：160     分离物FL/4/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：161     分离物FL/8/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：162     分离物UK/1/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：163     分离物UK/7/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：164     分离物FL/10/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：165     分离物NL/6/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：166     分离物NL/8/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：167     分离物NL/10/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：168     分离物NL/14/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：169     分离物NL/20/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：170     分离物NL/25/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：171     分离物NL/26/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：172     分离物NL/28/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：173     分离物NL/30/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：174     分离物BR/2/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：175     分离物BR/3/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：176     分离物NL/2/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：177     分离物NL/4/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：178     分离物NL/5/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：179     分离物NL/6/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：180     分离物NL/7/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：181     分离物NL/9/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：182     分离物FL/1/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：183     分离物NL/1/81的F-基因编码序列
SEQ ID NO：184     分离物NL/1/93的F-基因编码序列
SEQ ID NO：185     分离物NL/2/93的F-基因编码序列
SEQ ID NO：186     分离物NL/4/93的F-基因编码序列
SEQ ID NO：187     分离物NL/1/95的F-基因编码序列
SEQ ID NO：188     分离物NL/2/96的F-基因编码序列
SEQ ID NO：189     分离物NL/3/96的F-基因编码序列
SEQ ID NO：190     分离物NL/1/98的F-基因编码序列
SEQ ID NO：191     分离物NL/17/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：192     分离物NL/22/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：193     分离物NL/29/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：194     分离物NL/23/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：195     分离物NL/17/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：196     分离物NL/24/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：197     分离物NL/3/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：198     分离物NL/3/98的F-基因编码序列
SEQ ID NO：199     分离物NL/1/99的F-基因编码序列
SEQ ID NO：200     分离物NL/2/99的F-基因编码序列
SEQ ID NO：201     分离物NL/3/99的F-基因编码序列
SEQ ID NO：202     分离物NL/11/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：203     分离物NL/12/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：204     分离物NL/1/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：205     分离物NL/5/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：206     分离物NL/9/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：207     分离物NL/19/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：208     分离物NL/21/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：209     分离物UK/11/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：210     分离物FL/1/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：211     分离物FL/2/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：212     分离物FL/5/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：213     分离物FL/7/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：214     分离物FL/9/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：215     分离物UK/10/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：216     分离物NL/1/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：217     分离物NL/1/94的F-基因编码序列
SEQ ID NO：218     分离物NL/1/96的F-基因编码序列
SEQ ID NO：219     分离物NL/6/97的F-基因编码序列
SEQ ID NO：220     分离物NL/7/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：221     分离物NL/9/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：222     分离物NL/19/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：223     分离物NL/28/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：224     分离物NL/3/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：225     分离物NL/4/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：226     分离物NL/11/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：227     分离物NL/15/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：228     分离物NL/18/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：229     分离物FL/6/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：230     分离物UK/5/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：231     分离物UK/8/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：232     分离物NL/12/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：233     分离物HK/1/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：234     分离物NL/1/00的F-蛋白序列
SEQ ID NO：235     分离物UK/1/00的F-蛋白序列
SEQ ID NO：236     分离物NL/2/00的F-蛋白序列
SEQ ID NO：237     分离物NL/13/00的F-蛋白序列
SEQ ID NO：238     分离物NL/14/00的F-蛋白序列
SEQ ID NO：239     分离物FL/3/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：240     分离物FL/4/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：241     分离物FL/8/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：242     分离物UK/1/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：243     分离物UK/7/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：244     分离物FL/10/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：245     分离物NL/6/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：246     分离物NL/8/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：247     分离物NL/10/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：248     分离物NL/14/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：249     分离物NL/20/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：250     分离物NL/25/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：251     分离物NL/26/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：252     分离物NL/28/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：253     分离物NL/30/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：254     分离物BR/2/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：255     分离物BR/3/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：256     分离物NL/2/02的F-蛋白序列
SEQ ID NO：257     分离物NL/4/02的F-蛋白序列
SEQ ID NO：258     分离物NL/5/02的F-蛋白序列
SEQ ID NO：259     分离物NL/6/02的F-蛋白序列
SEQ ID NO：260     分离物NL/7/02的F-蛋白序列
SEQ ID NO：261     分离物NL/9/02的F-蛋白序列
SEQ ID NO：262     分离物FL/1/02的F-蛋白序列
SEQ ID NO：263     分离物NL/1/81的F-蛋白序列
SEQ ID NO：264     分离物NL/1/93的F-蛋白序列
SEQ ID NO：265     分离物NL/2/93的F-蛋白序列
SEQ ID NO：266     分离物NL/4/93的F-蛋白序列
SEQ ID NO：267     分离物NL/1/95的F-蛋白序列
SEQ ID NO：268     分离物NL/2/96的F-蛋白序列
SEQ ID NO：269     分离物NL/3/96的F-蛋白序列
SEQ ID NO：270     分离物NL/1/98的F-蛋白序列
SEQ ID NO：271     分离物NL/17/00的F-蛋白序列
SEQ ID NO：272     分离物NL/22/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：273     分离物NL/29/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：274     分离物NL/23/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：275     分离物NL/17/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：276     分离物NL/24/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：277     分离物NL/3/02的F-蛋白序列
SEQ ID NO：278     分离物NL/3/98的F-蛋白序列
SEQ ID NO：279     分离物NL/1/99的F-蛋白序列
SEQ ID NO：280     分离物NL/2/99的F-蛋白序列
SEQ ID NO：281     分离物NL/3/99的F-蛋白序列
SEQ ID NO：282     分离物NL/11/00的F-蛋白序列
SEQ ID NO：283     分离物NL/12/00的F-蛋白序列
SEQ ID NO：284     分离物NL/1/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：285     分离物NL/5/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：286     分离物NL/9/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：287     分离物NL/19/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：288     分离物NL/21/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：289     分离物UK/11/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：290     分离物FL/1/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：291     分离物FL/2/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：292     分离物FL/5/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：293     分离物FL/7/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：294     分离物FL/9/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：295     分离物UK/10/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：296     分离物NL/1/02的F-蛋白序列
SEQ ID NO：297     分离物NL/1/94的F-蛋白序列
SEQ ID NO：298     分离物NL/1/96的F-蛋白序列
SEQ ID NO：299     分离物NL/6/97的F-蛋白序列
SEQ ID NO：300     分离物NL/7/00的F-蛋白序列
SEQ ID NO：301     分离物NL/9/00的F-蛋白序列
SEQ ID NO：302     分离物NL/19/00的F-蛋白序列
SEQ ID NO：303     分离物NL/28/00的F-蛋白序列
SEQ ID NO：304     分离物NL/3/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：305     分离物NL/4/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：306     分离物NL/11/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：307     分离物NL/15/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：308     分离物NL/18/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：309     分离物FL/6/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：310     分离物UK/5/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：311     分离物UK/8/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：312     分离物NL/12/02的F-蛋白序列
SEQ ID NO：313     分离物HK/1/02的F-蛋白序列
SEQ ID NO：314     HMPV分离物NL/1/00的F蛋白序列
SEQ ND NO：315     HMPV分离物NL/17/00的F蛋白序列
SEQ ID NO：316     HMPV分离物NL/1/99的F蛋白序列
SEQ ID NO：317     HMPV分离物NL/1/94的F蛋白序列
SEQ ID NO：318     HMPV分离物NL/1/00的F基因序列
SEQ ID NO：319     HMPV分离物NL/17/00的F基因序列
SEQ ID NO：320     HMPV分离物NL/1/99的F基因序列
SEQ ID NO：321     HMPV分离物NL/1/94的F基因序列
SEQ ID NO：322     HMPV分离物NL/1/00的G蛋白序列
SEQ ID NO：323     HMPV分离物NL/17/00的G蛋白序列
SEQ ID NO：324     HMPV分离物NL/1/99的G蛋白序列
SEQ ID NO：325     HMPV分离物NL/1/94的G蛋白序列
SEQ ID NO：326     HMPV分离物NL/1/00的G基因序列
SEQ ID NO：327     HMPV分离物NL/17/00的G基因序列
SEQ ID NO：328     HMPV分离物NL/1/99的G基因序列
SEQ ID NO：329     HMPV分离物NL/1/94的G基因序列
SEQ ID NO：330     HMPV分离物NL/1/00的L蛋白序列
SEQ ID NO：331     HMPV分离物NL/17/00的L蛋白序列
SEQ ID NO：332     HMPV分离物NL/1/99的L蛋白序列
SEQ ID NO：333     HMPV分离物NL/1/94的L蛋白序列
SEQ ID NO：334     HMPV分离物NL/1/00的L基因序列
SEQ ID NO：335     HMPV分离物NL/17/00的L基因序列
SEQ ID NO：336     HMPV分离物NL/1/99的L基因序列
SEQ ID NO：337     HMPV分离物NL/1/94的L基因序列
SEQ ID NO：338     HMPV分离物NL/1/00的M2-1蛋白序列
SEQ ID NO：339     HMPV分离物NL/17/00的M2-1蛋白序列
SEQ ID NO：340     HMPV分离物NL/1/99的M2-1蛋白序列
SEQ ID NO：341     HMPV分离物NL/1/94的M2-1蛋白序列
SEQ ID NO：342     HMPV分离物NL/1/00的M2-1基因序列
SEQ ID NO：343     HMPV分离物NL/17/00的M2-1基因序列
SEQ ID NO：344     HMPV分离物NL/1/99的M2-1基因序列
SEQ ID NO：345     HMPV分离物NL/1/94的M2-1基因序列
SEQ ID NO：346     HMPV分离物NL/1/00的M2-2蛋白序列
SEQ ID NO：347     HMPV分离物NL/17/00的M2-2蛋白序列
SEQ ID NO：348     HMPV分离物NL/1/99的M2-2蛋白序列
SEQ ID NO：349     HMPV分离物NL/1/94的M2-2蛋白序列
SEQ ID NO：350     HMPV分离物NL/1/00的M2-2基因序列
SEQ ID NO：351     HMPV分离物NL/17/00的M2-2基因序列
SEQ ID NO：352     HMPV分离物NL/1/99的M2-2基因序列
SEQ ID NO：353     HMPV分离物NL/1/94的M2-2基因序列
SEQ ID NO：354     HMPV分离物NL/1/00的M2基因序列
SEQ ID NO：355     HMPV分离物NL/17/00的M2基因序列
SEQ ID NO：356     HMPV分离物NL/1/99的M2基因序列
SEQ ID NO：357     HMPV分离物NL/1/94的M2基因序列
SEQ ID NO：358     HMPV分离物NL/1/00的M蛋白序列
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SEQ ID NO：360     HMPV分离物NL/1/99的M蛋白序列
SEQ ID NO：361     HMPV分离物NL/1/94的M蛋白序列
SEQ ID NO：362     HMPV分离物NL/1/00的M基因序列
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SEQ ID NO：366     HMPV分离物NL/1/00的N蛋白序列
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SEQ ID NO：368     HMPV分离物NL/1/99的N蛋白序列
SEQ ID NO：369     HMPV分离物NL/1/94的N蛋白序列
SEQ ID NO：370     HMPV分离物NL/1/00的N基因序列
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SEQ ID NO：374     HMPV分离物NL/1/00的P蛋白序列
SEQ ID NO：375     HMPV分离物NL/17/00的P蛋白序列
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SEQ ID NO：377     HMPV分离物NL/1/94的P蛋白序列
SEQ ID NO：378     HMPV分离物NL/1/00的P基因序列
SEQ ID NO：379     HMPV分离物NL/17/00的P基因序列
SEQ ID NO：380     HMPV分离物NL/1/99的P基因序列
SEQ ID NO：381     HMPV分离物NL/1/94的P基因序列
SEQ ID NO：382     HMPV分离物NL/1/00的SH蛋白序列
SEQ ID NO：383     HMPV分离物NL/17/00的SH蛋白序列
SEQ ID NO：384     HMPV分离物NL/1/99的SH蛋白序列
SEQ ID NO：385     HMPV分离物NL/1/94的SH蛋白序列
SEQ ID NO：386     HMPV分离物NL/1/00的SH基因序列
SEQ ID NO：387     HMPV分离物NL/17/00的SH基因序列
SEQ ID NO：388     HMPV分离物NL/1/99的SH基因序列
SEQ ID NO：389     HMPV分离物NL/1/94的SH基因序列
序列表
<110>米迪缪尼疫苗股份有限公司(MedImmune Vaccines，Inc.)
<120>偏肺病毒株及其在疫苗制备和作为抗原序列表达载体的应用以及增殖该病毒的方法
<130>7682-121-228
<140>
<141>
<150>60/660,735
<151>2005-03-10
<160>389
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>2507
<212>DNA
<213>偏肺病毒
<220>
<221>CDS
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<223>人偏肺病毒分离物00-1基质蛋白(M)和融合蛋白(F)基因
<400>1
Figure A200680015321D01701
<210>2
<211>1596
<212>DNA
<213>肺病毒
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1596)
<223>禽肺病毒融合蛋白基因，部分cds
<400>2
Figure A200680015321D01702
<210>3
<211>1666
<212>DNA
<213>肺病毒
<220>
<221>CDS
<222>(14)...(1627)
<223>禽肺病毒分离物1b融合蛋白mRNA，完整的cds
<400>3
Figure A200680015321D01711
<210>4
<211>1636
<212>DNA
<213>鼻气管炎病毒
<220>
<221>CDS
<222>(13)...(1629)
<223>融合蛋白(F1和F2亚基)的火鸡鼻气管炎病毒基因，完整的cds
<400>4
Figure A200680015321D01712
<210>5
<211>1860
<212>DNA
<213>肺病毒
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(110)
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<220>
<221>CDS
<222>(216)...(1829)
<223>禽肺病毒融合糖蛋白(F)基因，完整的cds
<400>5
Figure A200680015321D01722
Figure A200680015321D01731
<210>6
<211>574
<212>PRT
<213>副黏病毒
<220>
<223>副黏病毒F蛋白hRSV B
<400>6
Figure A200680015321D01732
Figure A200680015321D01741
<210>7
<211>574
<212>PRT
<213>副黏病毒
<220>
<223>副黏病毒F蛋白hRSV A2
<400>7
Figure A200680015321D01751
Figure A200680015321D01761
<210>8
<211>121
<212>PRT
<213>偏肺病毒
<220>
<223>人偏肺病毒01-71(部分序列)
<400>8
Figure A200680015321D01762
<210>9
<211>539
<212>PRT
<213>偏肺病毒
<220>
<223>人偏肺病毒分离物00-1基质蛋白(M)和融合蛋白(F)基因
<400>9
Figure A200680015321D01763
<210>10
<211>532
<212>PRT
<213>禽肺病毒
<220>
<223>禽肺病毒融合蛋白基因，部分cds
<400>10
Figure A200680015321D01781
Figure A200680015321D01791
<210>11
<211>537
<212>PRT
<213>禽肺病毒
<220>
<223>禽肺病毒分离物1b融合蛋白mRNA，完整的cds
<400>11
Figure A200680015321D01792
Figure A200680015321D01801
<210>12
<211>538
<212>PRT
<213>火鸡鼻气管炎病毒
<220>
<223>融合蛋白(F1和F2亚基)的火鸡鼻气管炎病毒基因，完整的cds
<400>12
Figure A200680015321D01802
Figure A200680015321D01811
<210>13
<211>537
<212>PRT
<213>禽肺病毒
<220>
<223>禽肺病毒融合糖蛋白(F)基因，完整的cds
<400>13
Figure A200680015321D01821
Figure A200680015321D01831
<210>14
<211>1193
<212>DNA
<213>鼻气管炎病毒
<220>
<221>CDS
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<223>火鸡鼻气管炎病毒(毒株CVL14/1)结合蛋白(G)mRNA，完整的cds
<400>14
Figure A200680015321D01832
<210>15
<211>1260
<212>DNA
<213>鼻气管炎病毒
<220>
<221>CDS
<222>(16)...(1260)
<223>火鸡鼻气管炎病毒(毒株6574)结合蛋白(G)，完整的cds
<400>15
Figure A200680015321D01841
<210>16
<211>391
<212>PRT
<213>火鸡鼻气管炎病毒
<220>
<223>火鸡鼻气管炎病毒(毒株CVL14/1)结合蛋白(G)mRNA，完整的cds
<400>16
Figure A200680015321D01842
Figure A200680015321D01851
<210>17
<211>414
<212>PRT
<213>鼻气管炎病毒
<220>
<223>火鸡鼻气管炎病毒(毒株6574)结合蛋白(G)，完整的cds
<400>17
Figure A200680015321D01852
<210>18
<211>13294
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<220>
<221>misc_feature
<222>(0)...(0)
<223>人MPV蛋白
<400>18
Figure A200680015321D01862
Figure A200680015321D01881
Figure A200680015321D01891
Figure A200680015321D01901
<210>19
<211>13350
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>19
Figure A200680015321D01902
Figure A200680015321D01911
Figure A200680015321D01921
Figure A200680015321D01941
<210>20
<211>13215
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>20
Figure A200680015321D01942
Figure A200680015321D01951
Figure A200680015321D01961
Figure A200680015321D01971
Figure A200680015321D01981
<210>21
<211>13135
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>21
Figure A200680015321D01982
Figure A200680015321D01991
Figure A200680015321D02011
Figure A200680015321D02021
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
Figure A200680015321D02022
<210>23
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
Figure A200680015321D02031
<210>24
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
Figure A200680015321D02032
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>25
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
<400>26
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
<400>29
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
<400>30
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
<400>31
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
<400>32
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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Figure A200680015321D02053
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<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
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Figure A200680015321D02054
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<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
<400>37
Figure A200680015321D02055
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<211>19
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<213>人工序列
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<223>引物
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<223>引物
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<211>66
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<213>人工序列
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<223>引物
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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Figure A200680015321D02114
<210>68
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>10，19
<223>n＝A，T，C或G
<220>
<221>misc_feature
<222>10，19
<223>n＝A，T，C或G
<400>68
Figure A200680015321D02121
<210>69
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>17
<223>n＝A，T，C或G
<220>
<221>misc_feature
<222>17
<223>n＝A，T，C或G
<400>69
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<210>70
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>70
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<210>71
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>71
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<210>72
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>72
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<210>73
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>73
Figure A200680015321D02132
<210>74
<211>27
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<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>74
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<211>28
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<400>76
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<210>77
<211>22
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<223>引物
<400>77
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<210>78
<211>21
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<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>78
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<210>79
<211>18
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<213>人工序列
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<400>79
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<211>21
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<220>
<223>引物
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<211>19
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>17
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<211>907
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<213>人偏肺病毒
<400>86
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<210>87
<211>907
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>87
Figure A200680015321D02163
<210>88
<211>907
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>88
Figure A200680015321D02164
Figure A200680015321D02171
<210>89
<211>907
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>89
Figure A200680015321D02172
<210>90
<211>908
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>90
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<210>91
<211>908
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>91
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<210>92
<211>888
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>92
Figure A200680015321D02183
<210>93
<211>888
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>93
Figure A200680015321D02184
Figure A200680015321D02191
<210>94
<211>888
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>94
Figure A200680015321D02192
<210>95
<211>887
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>95
Figure A200680015321D02193
<210>96
<211>888
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>96
Figure A200680015321D02201
<210>97
<211>888
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>97
Figure A200680015321D02202
<210>98
<211>888
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>98
Figure A200680015321D02203
Figure A200680015321D02211
<210>99
<211>888
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>99
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<210>100
<211>888
<212>DNA
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<400>100
<210>101
<211>888
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>101
Figure A200680015321D02214
Figure A200680015321D02221
<210>102
<211>888
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>102
Figure A200680015321D02222
<210>103
<211>888
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>103
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<211>888
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>104
Figure A200680015321D02231
<210>105
<211>901
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>105
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<211>901
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>106
Figure A200680015321D02233
Figure A200680015321D02241
<210>107
<211>860
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>107
Figure A200680015321D02242
<210>108
<211>861
<212>DNA
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<400>108
Figure A200680015321D02243
<210>109
<211>860
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<400>109
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<211>860
<212>DNA
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<400>110
Figure A200680015321D02252
<210>111
<211>886
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>111
Figure A200680015321D02253
Figure A200680015321D02261
<210>112
<211>889
<212>DNA
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<400>112
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<211>885
<212>DNA
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<400>113
Figure A200680015321D02263
<210>114
<211>885
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>114
Figure A200680015321D02264
Figure A200680015321D02271
<210>115
<211>886
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>115
Figure A200680015321D02272
<210>116
<211>887
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>116
Figure A200680015321D02281
<210>117
<211>887
<212>DNA
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<400>117
Figure A200680015321D02282
<210>118
<211>886
<212>DNA
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<400>118
Figure A200680015321D02283
<210>119
<211>236
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>119
Figure A200680015321D02284
<210>120
<211>236
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>120
Figure A200680015321D02292
Figure A200680015321D02301
<210>121
<211>236
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>121
Figure A200680015321D02302
<210>122
<211>236
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>122
Figure A200680015321D02303
<210>123
<211>236
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>123
Figure A200680015321D02312
<210>124
<211>236
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>124
Figure A200680015321D02322
<210>125
<211>236
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>125
<210>126
<211>236
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>126
Figure A200680015321D02332
<210>127
<211>228
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<220>
<221>VARIANT
<222>220
<223>Xaa＝未知的氨基酸或其它
<400>127
Figure A200680015321D02342
<210>128
<211>228
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>128
Figure A200680015321D02343
Figure A200680015321D02351
<210>129
<211>228
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>129
Figure A200680015321D02352
Figure A200680015321D02361
<210>130
<211>228
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<220>
<221>VARIANT
<222>81
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>130
Figure A200680015321D02362
<210>131
<211>228
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<220>
<221>VARIANT
<222>220
<223>Xaa＝未知的氨基酸或其它
<400>131
<210>132
<211>228
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<220>
<221>VARIANT
<222>220
<223>Xaa＝未知的氨基酸或其它
<400>132
Figure A200680015321D02372
Figure A200680015321D02381
<210>133
<211>228
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<220>
<221>VARIANT
<222>220
<223>Xaa＝未知的氨基酸或其它
<400>133
Figure A200680015321D02382
Figure A200680015321D02391
<210>134
<211>228
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>134
Figure A200680015321D02392
<210>135
<211>228
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>135
Figure A200680015321D02393
Figure A200680015321D02401
<210>136
<211>228
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>136
Figure A200680015321D02402
Figure A200680015321D02411
<210>137
<211>228
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>137
Figure A200680015321D02412
<210>138
<211>228
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>138
Figure A200680015321D02413
Figure A200680015321D02421
<210>139
<211>228
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>139
Figure A200680015321D02422
Figure A200680015321D02431
<210>140
<211>231
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<220>
<221>VARIANT
<222>225
<223>Xaa＝未知的氨基酸或其它
<400>140
Figure A200680015321D02432
<210>141
<211>231
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>141
Figure A200680015321D02433
Figure A200680015321D02441
<210>142
<211>231
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>142
Figure A200680015321D02442
Figure A200680015321D02451
<210>143
<211>231
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>143
Figure A200680015321D02452
<210>144
<211>231
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>144
Figure A200680015321D02453
Figure A200680015321D02461
<210>145
<211>231
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>145
Figure A200680015321D02462
<210>146
<211>236
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>146
<210>147
<211>236
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<220>
<221>VARIANT
<222>220，227
<223>Xaa＝未知的氨基酸或其它
<400>147
Figure A200680015321D02473
Figure A200680015321D02481
<210>148
<211>236
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<220>
<221>VARIANT
<222>208
<223>Xaa＝未知的氨基酸或其它
<400>148
Figure A200680015321D02482
Figure A200680015321D02491
<210>149
<211>236
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>149
Figure A200680015321D02492
<210>150
<211>236
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>150
Figure A200680015321D02501
<210>151
<211>236
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>151
Figure A200680015321D02502
Figure A200680015321D02511
<210>152
<211>236
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>152
Figure A200680015321D02512
<210>153
<211>236
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>153
Figure A200680015321D02513
<210>154
<211>449
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>154
Figure A200680015321D02522
<210>155
<211>449
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>155
Figure A200680015321D02523
Figure A200680015321D02531
<210>156
<211>449
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>156
Figure A200680015321D02532
<210>157
<211>449
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>157
Figure A200680015321D02533
<210>158
<211>449
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>158
Figure A200680015321D02534
<210>159
<211>449
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>159
Figure A200680015321D02535
Figure A200680015321D02541
<210>160
<211>449
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>160
Figure A200680015321D02542
<210>161
<211>449
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>161
Figure A200680015321D02543
<210>162
<211>449
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>162
Figure A200680015321D02544
<210>163
<211>449
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>163
Figure A200680015321D02545
Figure A200680015321D02551
<210>164
<211>449
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>164
Figure A200680015321D02552
<210>165
<211>449
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>165
Figure A200680015321D02553
<210>166
<211>449
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>166
Figure A200680015321D02554
<210>167
<211>449
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>167
Figure A200680015321D02561
<210>168
<211>449
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>168
Figure A200680015321D02562
<210>169
<211>449
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>169
<210>170
<211>449
<212>DNA
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<211>449
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<211>449
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<211>449
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Figure A200680015321D02691
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<211>149
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Figure A200680015321D02734
Figure A200680015321D02741
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<211>149
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<211>149
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<212>PRT
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<211>149
<212>PRT
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Figure A200680015321D02781
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<211>149
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Figure A200680015321D02791
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<211>149
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<212>PRT
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<211>149
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Figure A200680015321D02813
Figure A200680015321D02821
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<211>149
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<211>149
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Figure A200680015321D02833
Figure A200680015321D02841
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<211>149
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Figure A200680015321D02862
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Figure A200680015321D02871
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Figure A200680015321D02872
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<211>149
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Figure A200680015321D02881
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<211>149
<212>PRT
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<400>265
Figure A200680015321D02882
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<211>149
<212>PRT
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<400>266
Figure A200680015321D02891
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<211>149
<212>PRT
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Figure A200680015321D02892
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<211>149
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Figure A200680015321D02912
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<211>149
<212>PRT
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Figure A200680015321D02913
Figure A200680015321D02921
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<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>273
Figure A200680015321D02922
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<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>274
Figure A200680015321D02923
Figure A200680015321D02931
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<211>149
<212>PRT
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<400>275
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<211>149
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Figure A200680015321D02933
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<211>149
<212>PRT
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<400>277
Figure A200680015321D02942
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<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>278
Figure A200680015321D02951
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<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>279
Figure A200680015321D02952
<210>280
<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>280
Figure A200680015321D02961
<210>281
<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>281
Figure A200680015321D02962
<210>282
<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>282
Figure A200680015321D02963
Figure A200680015321D02971
<210>283
<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>283
<210>284
<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>284
Figure A200680015321D02973
Figure A200680015321D02981
<210>285
<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>285
Figure A200680015321D02982
<210>286
<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>286
Figure A200680015321D02983
Figure A200680015321D02991
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<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>287
Figure A200680015321D02992
<210>288
<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>288
Figure A200680015321D02993
Figure A200680015321D03001
<210>289
<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>289
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<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>290
Figure A200680015321D03003
Figure A200680015321D03011
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<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
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Figure A200680015321D03012
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<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>292
Figure A200680015321D03013
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<212>PRT
<213>人偏肺病毒
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Figure A200680015321D03022
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<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>294
Figure A200680015321D03023
Figure A200680015321D03031
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<212>PRT
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Figure A200680015321D03041
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<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>298
Figure A200680015321D03042
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<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>299
Figure A200680015321D03051
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<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>300
Figure A200680015321D03052
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<212>PRT
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<400>301
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Figure A200680015321D03062
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<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>304
Figure A200680015321D03072
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<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>305
Figure A200680015321D03073
Figure A200680015321D03081
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<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
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<211>149
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<213>人偏肺病毒
<400>307
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Figure A200680015321D03091
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<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>308
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<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>309
Figure A200680015321D03093
Figure A200680015321D03101
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<211>149
<212>PRT
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<400>310
Figure A200680015321D03102
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<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>311
Figure A200680015321D03103
Figure A200680015321D03111
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<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>312
Figure A200680015321D03112
<210>313
<211>149
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>313
Figure A200680015321D03113
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<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>314
Figure A200680015321D03122
Figure A200680015321D03131
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<211>539
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
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Figure A200680015321D03141
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<212>PRT
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<400>317
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Figure A200680015321D03171
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Figure A200680015321D03172
Figure A200680015321D03181
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Figure A200680015321D03183
Figure A200680015321D03191
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<211>1620
<212>DNA
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Figure A200680015321D03192
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<212>PRT
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Figure A200680015321D03201
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<400>323
Figure A200680015321D03202
Figure A200680015321D03211
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<211>224
<212>PRT
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Figure A200680015321D03212
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<211>236
<212>PRT
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<400>325
Figure A200680015321D03221
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<211>675
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>328
Figure A200680015321D03232
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<211>711
<212>DNA
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<211>2005
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
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Figure A200680015321D03271
Figure A200680015321D03281
<210>331
<211>2005
<212>PRT
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<400>331
Figure A200680015321D03282
Figure A200680015321D03291
Figure A200680015321D03301
Figure A200680015321D03321
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<211>2005
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
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Figure A200680015321D03331
Figure A200680015321D03341
Figure A200680015321D03351
Figure A200680015321D03361
Figure A200680015321D03371
<210>333
<211>2005
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>333
Figure A200680015321D03372
Figure A200680015321D03381
Figure A200680015321D03391
Figure A200680015321D03401
Figure A200680015321D03411
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<211>6018
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Figure A200680015321D03441
Figure A200680015321D03451
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Figure A200680015321D03491
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<211>187
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<212>PRT
<213>人偏肺病毒
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Figure A200680015321D03513
Figure A200680015321D03521
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Figure A200680015321D03531
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<212>PRT
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Figure A200680015321D03532
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<212>PRT
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Figure A200680015321D03533
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Figure A200680015321D03534
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Figure A200680015321D03554
Figure A200680015321D03561
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Figure A200680015321D03562
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<212>PRT
<213>人偏肺病毒
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Figure A200680015321D03563
Figure A200680015321D03571
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Figure A200680015321D03581
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<212>PRT
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Figure A200680015321D03592
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Figure A200680015321D03593
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Figure A200680015321D03601
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Figure A200680015321D03602
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Figure A200680015321D03603
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Figure A200680015321D03612
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<212>PRT
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Figure A200680015321D03622
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<211>394
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>369
Figure A200680015321D03632
Figure A200680015321D03641
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Figure A200680015321D03642
Figure A200680015321D03651
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Figure A200680015321D03653
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<211>1185
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Figure A200680015321D03662
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Figure A200680015321D03663
Figure A200680015321D03671
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<211>294
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>375
Figure A200680015321D03672
Figure A200680015321D03681
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<211>294
<212>PRT
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<213>人偏肺病毒
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Figure A200680015321D03691
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<211>885
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
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Figure A200680015321D03692
Figure A200680015321D03701
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Figure A200680015321D03702
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Figure A200680015321D03712
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<213>人偏肺病毒
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Figure A200680015321D03721
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<212>PRT
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Figure A200680015321D03722
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<211>177
<212>PRT
<213>人偏肺病毒
<400>385
Figure A200680015321D03731
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Figure A200680015321D03732
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Figure A200680015321D03741
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<400>388
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<211>534
<212>DNA
<213>人偏肺病毒
<400>389

Claims (26)

1.一种增殖哺乳动物偏肺病毒的方法，其中所述方法包括在胰蛋白酶比活低于20毫单位/毫升培养基的培养基中培养该哺乳动物偏肺病毒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物偏肺病毒是人偏肺病毒。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述培养基中不外源性加入胰蛋白酶。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述培养基中不加入血清。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物偏肺病毒的F蛋白切割位点中的RQSR切割基序含有至少一个氨基酸取代。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，与SEQ ID NO：314相比，所述哺乳动物偏肺病毒的F蛋白含有至少一个额外的氨基酸取代。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，RQSR切割基序中的氨基酸取代是丝氨酸被脯氨酸取代，从而得到RQPR序列。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，F蛋白中的所述额外氨基酸取代是E93K、Q100K、E92K、E93V、I95S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K或N97H中至少一个。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，F蛋白中的所述额外氨基酸取代是E93K。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述额外氨基酸取代稳定了RQSR基序中的氨基酸取代。
11.一种分离的哺乳动物偏肺病毒，其中所述哺乳动物偏肺病毒能在没有胰蛋白酶存在时生长。
12.如权利要求11所述的病毒，其特征在于，所述哺乳动物偏肺病毒是人偏肺病毒。
13.如权利要求11或12所述的病毒，其特征在于，所述哺乳动物偏肺病毒的F蛋白切割位点中的RQSR切割基序含有至少一个氨基酸取代。
14.如权利要求13所述的病毒，其特征在于，与SEQ ID NO：314相比，所述哺乳动物偏肺病毒的F蛋白含有至少一个额外的氨基酸取代。
15.如权利要求13所述的病毒，其特征在于，RQSR切割基序中的氨基酸取代是丝氨酸被脯氨酸取代，从而得到RQPR序列。
16.如权利要求14所述的病毒，其特征在于，F蛋白中的所述额外氨基酸取代是E93K、Q100K、E92K、E93V、I95S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K或N97H中至少一个。
17.如权利要求14所述的病毒，其特征在于，所述额外氨基酸取代稳定了RQSR基序中的氨基酸取代。
18.如权利要求16所述的病毒，其特征在于，F蛋白中的所述额外氨基酸取代是E93K。
19.一种分离的核酸，其中所述分离的核酸编码哺乳动物偏肺病毒的F蛋白，其中所述F蛋白含有S101P氨基酸取代和以下氨基酸取代中的至少一个：E93K、Q100K、E92K、E93V、I95S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K或N97H。
20.如权利要求19所述的核酸，其特征在于，所述哺乳动物偏肺病毒是人偏肺病毒。
21.一种鉴定哺乳动物偏肺病毒F蛋白的方法，该F蛋白支持该哺乳动物偏肺病毒在没有胰蛋白酶存在下稳定生长，所述方法包括：
(a)在没有胰蛋白酶存在下培养所述哺乳动物偏肺病毒，至少传代两次，其中所述哺乳动物偏肺病毒在F蛋白的切割位点中含有RQPR基序；和
(b)检测合胞体形成；
其中与步骤(a)之前哺乳动物偏肺病毒的合胞体形成相比，合胞体形成增加表明所述哺乳动物偏肺病毒F蛋白已获得支持所述哺乳动物偏肺病毒在没有胰蛋白酶存在下稳定生长的额外氨基酸取代。
22.一种鉴定哺乳动物偏肺病毒F蛋白的方法，所述F蛋白支持该哺乳动物偏肺病毒在没有胰蛋白酶存在下稳定生长，所述方法包括：
(a)在没有胰蛋白酶存在下培养所述哺乳动物偏肺病毒，至少传代两次，其中所述哺乳动物偏肺病毒在F蛋白的切割位点中含有RQPR基序；和
(b)检测F蛋白的切割；
其中与步骤(a)之前哺乳动物偏肺病毒的F蛋白切割相比，F蛋白切割增加表明所述哺乳动物偏肺病毒F蛋白已获得支持所述哺乳动物偏肺病毒在没有胰蛋白酶存在下稳定生长的额外氨基酸取代。
23.一种鉴定哺乳动物偏肺病毒F蛋白突变体的方法，该F蛋白突变体提高F蛋白不依赖胰蛋白酶的切割，其中所述F蛋白在切割位点中含有RQPR基序，所述方法包括：
(a)在没有胰蛋白酶存在下培养所述哺乳动物偏肺病毒，至少传代两次；和
(b)检测所述F蛋白的切割效率，
其中所述F蛋白的切割效率提高表明所述F蛋白已获得提高F蛋白不依赖胰蛋白酶切割的突变。
24.一种鉴定催化哺乳动物偏肺病毒F蛋白切割的蛋白酶的方法，其中所述F蛋白在切割位点中含有RQPR基序，所述方法包括：
(a)使所述F蛋白与检验蛋白酶接触；和
(b)检测是否发生了所述F蛋白的切割；
其中所述F蛋白发生切割表明该蛋白酶催化所述F蛋白的切割。
25.如权利要求21、22、23或24所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物偏肺病毒是人偏肺病毒。
26.如权利要求21、22、23或24所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物偏肺病毒携带有S101P突变。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282407A (zh) * 2016-08-11 2017-01-04 青岛易邦生物工程有限公司 一种b亚群禽肺病毒疫苗的效检方法
CN109628413A (zh) * 2018-12-29 2019-04-16 广东和信健康科技有限公司 一种人偏肺病毒的培养方法及其产物和应用

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1351981T3 (da) * 2001-01-19 2012-11-26 Vironovative Bv Et virus, der forårsager luftvejssygdom hos modtagelige pattedyr
US8715922B2 (en) * 2001-01-19 2014-05-06 ViroNovative Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US20040005545A1 (en) 2002-02-21 2004-01-08 Fouchier Ronaldus Adrianus Maria Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus
AU2003256823B9 (en) * 2002-07-25 2009-01-08 Medimmune, Llc Methods of treating and preventing RSV, hMPV, and PIV using anti-RSV, anti-hMPV, and anti-PIV antibodies
US20080213749A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-04 Melanie Feola Compositions and methods for detecting human metapneumovirus
US20090017517A1 (en) * 2007-07-13 2009-01-15 Medimmune, Llc Preparation of Negative-Stranded RNA Viruses by Electroporation
WO2009062532A1 (en) * 2007-11-16 2009-05-22 Vironovative Bv Live attenuated metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and chimeric metapneumovirus strains
US20090186050A1 (en) * 2007-11-16 2009-07-23 Fouchier Ron A M Live attenuated metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and chimeric metapneumovirus strains
GB0809881D0 (en) * 2008-05-30 2008-07-09 Genomica Sau Method for detecting respiratory viral agents in a test sample
US8715692B2 (en) 2008-12-09 2014-05-06 Novavax, Inc. Modified RSV F proteins and methods of their use
KR101425405B1 (ko) * 2009-07-17 2014-08-01 한림대학교 산학협력단 리포좀에 포집된 올리고뉴클레오타이드 및 에피토프를 포함하는 면역증강용 조성물
MX2015013065A (es) 2013-03-13 2016-06-06 Us Health Proteinas f de rsv de prefusion y su uso.
EP3436064A1 (en) 2016-03-29 2019-02-06 The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Substitutions-modified prefusion rsv f proteins and their use
CA3043790A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Institute For Research In Biomedicine Novel recombinant prefusion rsv f proteins and uses thereof

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5166057A (en) * 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US5824307A (en) * 1991-12-23 1998-10-20 Medimmune, Inc. Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus
EP0780475B2 (en) 1995-08-09 2006-07-19 SCHWEIZ. SERUM- &amp; IMPFINSTITUT BERN Process for the production of infectious negative-strand RNA viruses
US5869036A (en) * 1995-12-08 1999-02-09 St. Louis University Live attenuated vaccines based on CP45 HPIV-3 strain and method to ensure attenuation in such vaccine
US6180398B1 (en) * 1996-07-12 2001-01-30 Virogeneitics Corporation Two-step immunization procedure against the pyramyxoviridae family of viruses using recombinant virus and subunit protein preparation
US7192593B2 (en) * 1997-05-23 2007-03-20 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Use of recombinant parainfluenza viruses (PIVs) as vectors to protect against infection and disease caused by PIV and other human pathogens
US6146642A (en) * 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
US20020019891A1 (en) * 1999-12-30 2002-02-14 James Morrow Generic device controller unit and method
JP2002025374A (ja) 2000-07-07 2002-01-25 Matsushita Electric Ind Co Ltd Ｅｌシート及びこれを用いたスイッチ
US8715922B2 (en) * 2001-01-19 2014-05-06 ViroNovative Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
DK1351981T3 (da) * 2001-01-19 2012-11-26 Vironovative Bv Et virus, der forårsager luftvejssygdom hos modtagelige pattedyr
US20030232061A1 (en) * 2001-10-18 2003-12-18 Fouchier Ronaldus Adrianus Maria Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus
US20040005545A1 (en) * 2002-02-21 2004-01-08 Fouchier Ronaldus Adrianus Maria Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus
AU2004208057A1 (en) * 2003-01-31 2004-08-12 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vector encoding ribozyme and utilization thereof
CA2517394A1 (en) * 2003-02-28 2005-02-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Sec Retary Of The Department Of Health And Human Services Recombinant human metapneumovirus and its use
MXPA05011268A (es) * 2003-04-25 2006-06-20 Medimmune Vaccines Inc Sistemas de expresion de virus de parainfluenza recombinante y vacunas que comprenden antigenos heterologos derivados del metaneumovirus.
CA2523319A1 (en) * 2003-04-25 2004-11-11 Medimmune Vaccines, Inc. Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences and methods for propagating virus
WO2005007078A2 (en) * 2003-04-30 2005-01-27 The Boards Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Method of inhibiting human metapneumovirus and human coronavirus in the prevention and treatment of severe acute respiratory syndrome (sars)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282407A (zh) * 2016-08-11 2017-01-04 青岛易邦生物工程有限公司 一种b亚群禽肺病毒疫苗的效检方法
CN109628413A (zh) * 2018-12-29 2019-04-16 广东和信健康科技有限公司 一种人偏肺病毒的培养方法及其产物和应用

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Publication number Publication date
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CA2600484A1 (en) 2006-09-21
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