JP2008537482A - メタニューモウイルス株、およびワクチン製剤におけるその使用および抗原配列発現用ベクターとしてのその使用、ならびにウイルスの増殖法 - Google Patents

メタニューモウイルス株、およびワクチン製剤におけるその使用および抗原配列発現用ベクターとしてのその使用、ならびにウイルスの増殖法 Download PDF

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Abstract

本発明は、パラミクソウイルス科のニューモウイルス亜科に属する、哺乳動物ネガティブ鎖RNAウイルスであるメタニューモウイルス(MPV)の改良株に関する。本発明は更に、トリプシン非存在下で哺乳動物MPVを増殖させる方法に関する。本発明の方法および組成物は、例えばMPV感染症に対するワクチンの調製に使用できる

Description

本出願は、2005年3月10日に出願し、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮出願第60/660,735号の優先権の利益を請求する。
1. 緒言
本発明は、パラミクソウイルス科のニューモウイルス亜科に属する、哺乳動物ネガティブ鎖RNAウイルスであるメタニューモウイルス(MPV)の改良株に関する。本発明は更に、トリプシン非存在下で哺乳動物MPVを増殖させる方法に関する。本発明の方法および組成物は、例えばMPV感染症に対するワクチンの調製に使用できる。
2. 本発明の背景
ヒトメタニューモウイルス(hMPV)は、原因不明の急性呼吸器疾患の症状を示すオランダ人児童から最初に分離された、最近同定された呼吸器ウイルスである。hMPVは、軽度の上気道症状から細気管支炎、肺炎などの重度の下気道疾患に及ぶ呼吸器病を起こす(Boivin等, 2002年; van den Hoogen等, 2001年, 2003年)。調査対象とした患者集団に応じて、幼児の呼吸器疾患の5〜15%は、その原因をhMPV感染に求め得る(Boivin, 2003年; Williams等, 2004年; van den Hoogen, 2004b年)。hMPVは、子供の中耳炎の12〜50%とも関係している(Boivin, 2003年; Peiris, 2003年; van den Hoogen, 2004b年)。オランダでは、2歳までの被験者の55%がhMPVに対して血清反応陽性であり、5歳以上のほぼ全員が血清反応陽性であった(van den Hoogen, 2001年)。hMPVの分布は世界中に及んでおり、その報告は欧州、北米、豪州、アフリカ、イスラエル、日本および香港から得られている(Bastien 等, 2003b年; Howe, 2002年; Hamelin等, 2004年; IJpma等, 2004年; Maggi等, 2003年; Nissen等, 2002年; Peiris 2003年; Peret等, 2002年; Stockton等, 2002年; Wolf等, 2003年)。記録保管された血清試料の試験では、hMPVは少なくとも50年間その集団で広まってきたことが示された(van de Hoogen等, 2001年)。その同定がようやく最近になってなされた理由の1つは、hMPVの増殖が細胞培養中で乏しく、細胞変性作用が殆ど見られないことである(Hamelin等, 2004年; van den Hoogen等, 2001年)。
hMPVは、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、トリニューモウイルス(APV)およびマウスニューモウイルスも含むパラミクソウイルス科中のニューモウイルス亜科のエンベロープ型一本鎖ネガティブセンスRNA ウイルスである(van den Hoogen等, 2001年)。他のニューモウイルスとの相同性に基づいて、8つの転写単位が以下の順に同定された: 3' N-P-M-F-M2-SH-G-L 5' (Toquin等, 2003年; van den Hoogen, 2002年) 。系統学的解析の結果、hMPV株は、APVウイルスとは異なるサブグループAおよびBと称する2遺伝子集団に分類される(Bastien等, 2003年aおよびb; Biacchesi等, 2003年; Peret等, 2002年および2004年; van den Hoogen, 2002年)。これらのサブグループ内で、hMPVは、A1、A2、B1およびB2の各サブタイプに更に細分類できる(van den Hoogen, 2003年)。
サブグループA、Bの間で高度に保存されている融合糖タンパク質(F)は、ウイルス侵入および合胞体形成を媒介していると推測される。RSV、APVなどのニューモウイルスのFタンパク質は、全長前駆体(F0)として合成され、それが次いで多塩基性のフューリン様切断部位で切断され、F1およびF2を形成する。F0の切断で、F1のN末端に融合ペプチドが露出する(Collins 2001年; Lamb 1993年; Morrison 2003年, Russell等, 2001年; White 1990年)。RSVおよびAPVと異なり、hMPVは、フューリン様モチーフに合致しない推定上の切断部位RQS/PRを含んでいる(Barr, 1991年)。
細胞培養物中の臨床試料からのhMPVの分離は、トリプシン依存性であると報告された(Bastien等 2003a年, Biacchesi等 2003年; Boivin等, 2002年; Skiadopoulos等, 2004年; van den Hoogen等, 2001年and 2004a年)。したがって、hMPVの2つの分離株、hMPV/NL/1/00およびhMPV/NL/1/99の株が、トリプシンを添加せずにVero細胞中で増殖することは予想外であった。トリプシンの有無に関わらず、同等な高い力価が得られた。
野生型(wt) hMPV/NL/1/00およびwt hMPV/NL/1/99のRT-PCR産物に関して、配列を決定し、更に、公表された配列GI:20150834およびGI:50059145と比較した場合、Fタンパク質の推定上の切断部位RQSRモチーフ中にアミノ酸置換S101Pをコードする突然変異が示された。本明細書で報告する結果では、hMPVの各々A1およびB1サブタイプを代表するhMPV/NL/1/00およびhMPV/NL/1/99の両株について、F糖タンパク質の推定切断部位のRQSRモチーフ中に101Pを保持するウイルスが、トリプシンを外部から添加せずにVero細胞中で複製できたことが実証されている。それに対し、Fタンパク質中に101Sを保持するhMPVでは、ウイルスの増殖にトリプシンなどのプロテアーゼの添加が必要であった。本報告では、推定切断部位近傍にアミノ酸置換を有する組換えウイルスのin vitro増殖特性、hMPV F糖タンパク質変異体の切断特性、および合胞体形成を、トリプシンの非存在下および存在下で評価した。hMPV F中のS101Pは、Fの切断効率を向上させ、その融合活性を増加させる主要な遺伝的決定要因であることが判明したが、この向上や増加の双方とも、トリプシン非存在下でのwt hMPV/NL/1/00およびwt hMPV/NL/1/99の効率的なVero細胞内増殖に寄与したと思われる。引用した参考文献の書誌事項は、第6節の末尾に記載してある。
3. 本発明の概要
本発明は、培地1ミリリットル当たり20ミリ単位未満のトリプシン比活性を有する培地中で、哺乳動物メタニューモウイルスを培養することを含む、哺乳動物メタニューモウイルスを増殖させる方法を提供する。
ある種の態様では、該哺乳動物メタニューモウイルスはヒトメタニューモウイルスである。ある種の態様では、培地にトリプシンを外部から添加しない。ある種の態様では、培地に血清を添加しない。ある種の態様では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質の切断部位にあるRQSR切断モチーフは、少なくとも1つのアミノ酸置換を含んでいる。ある種の態様では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質は、配列番号314と比較して少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を含んでいる。ある種の態様では、RQSR切断モチーフ中のアミノ酸置換は、RQPR配列を生じるセリンからプロリンへの置換である。ある種の態様では、Fタンパク質における追加の該アミノ酸置換は、以下のE93K、Q100K、E92K、E93V、I95S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97KまたはN97Hの少なくとも1つである。ある種の態様では、Fタンパク質における追加の該アミノ酸置換はE93Kである。ある種の態様では、追加の該アミノ酸置換は、RQSRモチーフ中のアミノ酸置換を安定化させる。
ある種の実施形態では、本発明は、トリプシンの非存在下で増殖できる、分離された哺乳動物メタニューモウイルスを提供する。ある種の態様では、該哺乳動物メタニューモウイルスはヒトメタニューモウイルスである。ある種の態様では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質の切断部位にあるRQSR切断モチーフは、少なくとも1つのアミノ酸置換を含んでいる。ある種の態様では、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質は、配列番号314と比較して少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を含んでいる。ある種の態様では、RQSR切断モチーフ中のアミノ酸置換は、RQPR配列を生じるセリンからプロリンへの置換である。ある種の態様では、Fタンパク質中の追加の該アミノ酸置換は、以下のE93K、Q100K、E92K、E93V、I95S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97KまたはN97Hの少なくとも1つである。ある種の態様では、追加の該アミノ酸置換は、RQSRモチーフ中のアミノ酸置換を安定化させる。ある種の態様では、Fタンパク質における追加の該アミノ酸置換はE93Kである。ある種の態様では、S101Pアミノ酸置換と、以下のアミノ酸置換E93K、Q100K、E92K、E93V、I95S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K、またはN97Hの少なくとも1つとを含む哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質を、その単離された核酸がコードする。ある種の態様では、該哺乳動物メタニューモウイルスはヒトメタニューモウイルスである。
ある種の実施形態では、本発明は、トリプシン非存在下で哺乳動物メタニューモウイルスの安定増殖を支持する、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質を同定する方法であって、(a)Fタンパク質の切断部位中にRQPRモチーフを含む哺乳動物メタニューモウイルスを、トリプシンの非存在下で少なくとも2継代の間増殖させるステップと、(b)合胞体形成を測定するステップと、を含み、ステップ(a)前の哺乳動物メタニューモウイルスによる合胞体形成に比して増加した合胞体形成は、該哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質が、トリプシンの非存在下で哺乳動物メタニューモウイルスの安定増殖を支持する追加のアミノ酸置換を獲得したことを示す方法を提供する。ある種の態様では、該哺乳動物メタニューモウイルスはヒトメタニューモウイルスである。ある種の態様では、該哺乳動物メタニューモウイルスはS101P変異を保持している。
ある種の実施形態では、本発明は、トリプシン非存在下で哺乳動物メタニューモウイルスの安定増殖を支持する、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質を同定する方法であって、(a)Fタンパク質の切断部位中にRQPRモチーフを含む哺乳動物メタニューモウイルスを、トリプシン非存在下で少なくとも2継代の間増殖させるステップと、(b)Fタンパク質の切断を測定するステップと、を含み、ステップ(a)前の哺乳動物メタニューモウイルスによるFタンパク質の切断に比したFタンパク質の切断の増加は、該哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質が、トリプシン非存在下で哺乳動物メタニューモウイルスの安定増殖を支持する追加のアミノ酸置換を獲得したことを示す方法を提供する。ある種の態様では、該哺乳動物メタニューモウイルスはヒトメタニューモウイルスである。ある種の態様では、該哺乳動物メタニューモウイルスはS101P変異を保持している。
ある種の実施形態では、本発明は、切断部位にRQPRモチーフを含むFタンパク質のトリプシン非依存的切断を促進する、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質変異体を同定する方法であって、(a)哺乳動物メタニューモウイルスをトリプシン非存在下で少なくとも2継代の間増殖させるステップと、(b)Fタンパク質の切断効率を決定するステップと、を含み、Fタンパク質の増加した切断効率は、該Fタンパク質が、Fタンパク質のトリプシン非依存的切断を促進する変異を獲得したことを示す方法を提供する。ある種の態様では、該哺乳動物メタニューモウイルスはヒトメタニューモウイルスである。ある種の態様では、該哺乳動物メタニューモウイルスはS101P変異を保持している。
ある種の実施形態では、本発明は、切断部位中にRQPRモチーフを含む、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質の切断を触媒するプロテアーゼを同定する方法であって、(a)Fタンパク質を試験プロテアーゼと接触させるステップと、(b)Fタンパク質の切断が起こったか否かを決定するステップと、を含み、Fタンパク質の切断が起きたことは、該プロテアーゼがFタンパク質の切断を触媒することを示す方法を提供する。ある種の態様では、該哺乳動物メタニューモウイルスはヒトメタニューモウイルスである。ある種の態様では、該哺乳動物メタニューモウイルスはS101P変異を保持している。
3.1 慣例および略称
cDNA 相補DNA
L 巨大タンパク質
M マトリックスタンパク質(エンベロープ内側の裏打ち)
F 融合糖タンパク質
HN 赤血球凝集素-ノイラミニダーゼ糖タンパク質
N、NPまたはNC 核タンパク質(RNAと結合し、ポリメラーゼ活性に必要とされる)
P リンタンパク質
MOI 感染多重度
NA ノイラミニダーゼ(エンベロープ糖タンパク質)
PIV パラインフルエンザウイルス
hPIV ヒトパラインフルエンザウイルス
hPIV3 ヒトパラインフルエンザウイルス3型
APV/hMPV hMPV配列を有する組換えAPV
hMPV/APV APV配列を有する組換えhMPV
哺乳動物MPV 哺乳動物メタニューモウイルス
nt ヌクレオチド
RNP リボ核タンパク質
rRNP 組換えRNP
vRNA ウイルスゲノムRNA
cRNA ウイルスアンチゲノムRNA
hMPV ヒトメタニューモウイルス
APV トリニューモウイルス
MVA 改変ワクシニアウイルスアンカラ(Ankara)
FACS 蛍光活性化細胞選別装置
CPE 細胞変性作用
位置1 転写されるウイルスゲノムの第1遺伝子の位置
位置2 元のウイルスゲノムの第1および第2オープンリーディングフレーム間 の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第2遺伝子の位置
位置3 元のウイルスゲノムの第2および第3オープンリーディングフレーム間
の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第3遺伝子の位置
位置4 元のウイルスゲノムの第3および第4オープンリーディングフレーム間
の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第4遺伝子の位置
位置5 元のウイルスゲノムの第4および第5オープンリーディングフレーム間
の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第5遺伝子の位置
位置6 元のウイルスゲノムの第5および第6オープンリーディングフレーム間
の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第6遺伝子の位置
Ab 抗体
dpi 感染後日数
F 融合
HAI 血球凝集阻止
HN 赤血球凝集素-ノイラミニダーゼ
hpi 感染後時間数
MOI 感染多重度
POI 感染点
bPIV-3 ウシパラインフルエンザウイルス3型
hPIV-3 ヒトパラインフルエンザウイルス3型
RSV 呼吸器合胞体ウイルス
SFM 無血清培地
TCID50 50%組織培養感染用量
4. 図面の説明
（図面の説明については後述）
5. 本発明の詳細な説明
メタニューモウイルス株
本発明は、トリプシンの非存在下で増殖できる、分離された哺乳動物メタニューモウイルス株を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、トリプシンの非存在下で増殖できるように操作された、哺乳動物、例えばヒトの組換えメタニューモウイルスを提供する。理論に拘るわけではないが、本発明の哺乳動物メタニューモウイルス株は、そのFタンパク質がトリプシン非依存的に切断されるため、トリプシンの非存在下で増殖できる。ある種の特定の実施形態では、該哺乳動物メタニューモウイルスはヒトメタニューモウイルスである。ある種の態様では、該哺乳動物メタニューモウイルスは組換えメタニューモウイルスである。ある種の特定の実施形態では、該哺乳動物メタニューモウイルスは組換えヒトメタニューモウイルス(rhMPV)である。
ある種の実施形態では、本発明は、外部からトリプシンを添加せずに増殖できる哺乳動物メタニューモウイルス株を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、培地1ミリリットル当たり40ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり35ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり30ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり25ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり20ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり15ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり10ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり5ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり2ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり1ミリ単位未満、または培地1ミリリットル当たり0.5ミリ単位未満のトリプシン比活性を生じると思われるトリプシン濃度で増殖できる、哺乳動物メタニューモウイルス株を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、培地1ミリリットル当たりトリプシン0.1マイクログラム未満、培地1ミリリットル当たりトリプシン0.05マイクログラム未満、培地1ミリリットル当たりトリプシン0.01マイクログラム未満、培地1ミリリットル当たりトリプシン0.005マイクログラム未満、培地1ミリリットル当たりトリプシン0.001マイクログラム未満、または培地1ミリリットル当たりトリプシン0.0005マイクログラム未満の培地中トリプシン濃度にて増殖できる、哺乳動物メタニューモウイルス株を提供する。
本発明のある種の実施形態では、Fタンパク質の切断部位にあるRQSRモチーフ中の1個または複数のアミノ酸は、置換または欠失されている。ある種の実施形態では、本発明の哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質の切断部位にあるRQSRモチーフ中のセリンが、異なるアミノ酸で置換されている。より特定の実施形態では、Fタンパク質の切断部位にあるRQSRモチーフ中のセリンが、プロリンで置換されてRQPRモチーフを生じている。野性型の遺伝子型に復帰する可能性を低下させるために、該アミノ酸をコードするコドン中に少なくとも2個のヌクレオチド置換を導入することによって、アミノ酸置換を操作できる。
例示的な例では、該Fタンパク質は、配列番号314のアミノ酸配列(ヒトメタニューモウイルス株NL/1/00のFタンパク質のアミノ酸配列)を有し、かつアミノ酸101位のセリンをプロリンで置換することにより、トリプシン非依存的に増殖できる哺乳動物メタニューモウイルスを得る。当業者は、異なる哺乳動物メタニューモウイルス株のFタンパク質のアミノ配列を例えば配列番号314のアミノ酸配列とアラインメントすることにより、該異なる株のFタンパク質中の相同なアミノ酸位置を同定する方法を知っている。例えば、配列番号314を別のヒトメタニューモウイルス株のFタンパク質のアミノ酸配列とアラインメントさせ、配列番号314のRQSR配列(アミノ酸99〜102位)の位置を決定し、異なる哺乳動物メタニューモウイルス株のFタンパク質中の対応アミノ酸を同定する。
本発明のある種の実施形態では、該Fタンパク質は、Fタンパク質中の切断部位のRQSRモチーフにあるセリンの置換以外に、配列番号314に対してアミノ酸の置換、付加、欠失などの追加の1つまたは複数の変異(「第2部位突然変異」)を含む。理論に拘るわけではないが、このような第2部位突然変異は、Fタンパク質中の切断部位のRQSRモチーフにあるセリンの置換を安定化させ、その結果、トリプシン非存在下で増殖させた際、該哺乳動物メタニューモウイルス株のFタンパク質中での更なる任意の変異が、第2部位突然変異を含まない哺乳動物メタニューモウイルス株よりは低い頻度で起こる。更に、理論に拘るわけではないが、このような第2部位突然変異は、Fタンパク質のトリプシン非存在的切断を促進する。ある種の実施形態では、第2部位突然変異を保持する本発明の哺乳動物メタニューモウイルス株は、Fタンパク質中の切断部位のRQSRモチーフにあるセリンの置換以外に、Fタンパク質中で自然発生変異を全く獲得せずに、トリプシンの非存在下で少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、または少なくとも25回の継代を経験しうる。
本発明のある種の実施形態では、第2部位突然変異はF遺伝子とは異なる遺伝子中にある。理論に拘るわけではないが、Fタンパク質の切断はFタンパク質の分子的背景に依存し、例えば、ウイルス粒子中のFタンパク質の折畳みまたはFタンパク質の配向に影響するタンパク質中の変化も、Fタンパク質の切断に影響し得る。
ある種の実施形態では、該第2部位突然変異はFタンパク質中の切断部位のRQPRモチーフ近傍にある。ある種の実施形態では、該第2部位突然変異は、RQPRモチーフからアミノ末端側に20アミノ酸以内、15アミノ酸以内、10アミノ酸以内、または5アミノ酸以内にある。ある種の実施形態では、該第2部位突然変異は、RQPRモチーフからカルボキシ末端側に20アミノ酸以内、15アミノ酸以内、10アミノ酸以内、または5アミノ酸以内にある。
ある種のより特定な実施形態では、該第2部位突然変異は、配列番号314のアミノ酸92、93、94、95、96、97または100位に相当する、Fタンパク質のアミノ酸位置にある。ある種のより一層特定な実施形態では、追加の該変異は、E93K、Q100K、E92K、E93V、I95S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K、またはN97Hであってもよく、その第1文字は配列番号314中のアミノ酸を指し、数字はアミノ酸位置を指し、第2文字は、各位置で配列番号314のアミノ酸を置換するアミノ酸を指す。
ある種の実施形態では、本発明のメタニューモウイルスは、例えばS101P変異を保持することにより、RQPRモチーフを有し、更に第2部位突然変異を有する。特定の例示的な実施形態では、本発明は、E93KとS101Pアミノ酸置換とを含んだFタンパク質を含む、組換えヒトメタニューモウイルスを提供する。
ある種の実施形態では、本発明のウイルスのFタンパク質における変異は、該哺乳動物メタニューモウイルスの宿主特異性に変化を起こさない。ある種の実施形態では、本発明のウイルスのFタンパク質における変異は、該哺乳動物メタニューモウイルスの宿主細胞特異性に変化を起こさない。
本発明の哺乳動物メタニューモウイルス株は、例えば弱毒化生ウイルスワクチンの開発に有用である。
ある種の実施形態では、アミノ酸置換を起こすために、2個または3個の変異が1個のコドン中に導入される。理論に拘るわけではないが、1コドン中に複数の変異を持つと、野生型の遺伝子型に復帰する率は低下するであろう。
本発明のメタニューモウイルス株は、遺伝的改変によって異種配列をコードすることができる。ある種の実施形態では、本発明のメタニューモウイルス株は、抗原性のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするように改変することができる。このような改変メタニューモウイルスは、以下に更に説明するようにワクチンに使用できる。本発明のメタニューモウイルス株は、更に遺伝的改変によって特定の宿主中で弱毒化されるようにすることができる(以下を参照されたい、また5.7節を参照されたい)。
増殖の方法
本発明は、トリプシンの非存在下で哺乳動物メタニューモウイルスを増殖させる方法を提供する。ある種の実施形態では、該哺乳動物メタニューモウイルスは、トリプシンの非存在下で増殖できるように操作された哺乳動物、例えばヒトの組換えメタニューモウイルスである。理論に拘るわけではないが、哺乳動物メタニューモウイルス株は、そのFタンパク質がトリプシン非依存的に切断される場合、トリプシンの非存在下で増殖できる。ある種のより特定な実施形態では、該哺乳動物メタニューモウイルスはヒトメタニューモウイルスである。ある種の態様では、該哺乳動物メタニューモウイルスは組換えメタニューモウイルスである。ある種の特定な実施形態では、該哺乳動物メタニューモウイルスは組換えヒトメタニューモウイルス(rhMPV)である。
ある種の実施形態では、本発明は、外部からトリプシンを培地に添加せずに哺乳動物メタニューモウイルスを増殖する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、培地1ミリリットル当たり40ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり35ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり30ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり25ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり20ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり15ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり10ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり5ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり2ミリ単位未満、培地1ミリリットル当たり1ミリ単位未満、または培地1ミリリットル当たり0.5ミリ単位未満のトリプシン比活性をもたらすと思われるトリプシン濃度で増殖できる、哺乳動物メタニューモウイルス株を増殖する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、培地1ミリリットル当たりトリプシン0.1マイクログラム未満、培地1ミリリットル当たりトリプシン0.05マイクログラム未満、培地1ミリリットル当たりトリプシン0.01マイクログラム未満、培地1ミリリットル当たりトリプシン0.005マイクログラム未満、培地1ミリリットル当たりトリプシン0.001マイクログラム未満、または培地1ミリリットル当たりトリプシン0.0005マイクログラム未満の培地中トリプシン濃度で哺乳動物メタニューモウイルスを増殖させる方法を提供する。ある種の実施形態では、トリプシンはトリプシン活性阻害剤で不活化されている。
本発明のある種の実施形態では、Fタンパク質の切断部位にあるRQSRモチーフ中の1個または複数のアミノ酸は、置換または欠失されている。ある種の実施形態では、本発明の方法を用いて増殖される哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質の切断部位にあるRQSRモチーフのセリンを、異なるアミノ酸で置換することにより、メタニューモウイルスにトリプシン非依存的な増殖をもたらす。より特定の実施形態では、本発明の方法を用いて増殖される哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質の切断部位にあるRQSRモチーフ中のセリンが、プロリンで置換される。
例示的な例では、本発明の方法を用いて増殖される、哺乳動物メタニューモウイルスの該Fタンパク質は、配列番号314のアミノ酸配列を有し、アミノ酸101位のセリンがプロリンで置換されている。当業者は、異なる哺乳動物メタニューモウイルス株のFタンパク質のアミノ配列を例えば配列番号314のアミノ酸配列とアラインメントすることにより、該異なる株のFタンパク質中の相同なアミノ酸位置を同定する方法を知っている。
本発明のある種の実施形態では、本発明の方法を用いて増殖される、哺乳動物メタニューモウイルスの該Fタンパク質は、Fタンパク質中の切断部位のRQSRモチーフにあるセリンの置換（例えばRQPRモチーフ）に加えて、配列番号314に対してアミノ酸の置換、付加、欠失などの1つまたは複数の変異(「第2部位突然変異」)を含む。理論に拘るわけではないが、このような第2部位突然変異は、Fタンパク質中の切断部位のRQSRモチーフにあるセリンの置換を安定化させ、その結果、トリプシン非存在下でウイルスを増殖させた際、該哺乳動物メタニューモウイルス株のFタンパク質中での更なる任意の変異が、第2部位突然変異を含まない哺乳動物メタニューモウイルス株よりは低い頻度で起こる。ある種の実施形態では、このような第2部位突然変異と、Fタンパク質中の切断部位のRQSRモチーフにあるセリンの置換とを有する哺乳動物メタニューモウイルス株は、Fタンパク質中で自然発生変異を全く獲得せずに、トリプシンの非存在下で少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、または少なくとも25継代を経過することができる。
ある種の実施形態では、該第2部位突然変異はFタンパク質の切断部位中のRQPRモチーフ近傍にある。ある種の実施形態では、該第2部位突然変異は、RQPRモチーフからアミノ末端側に20アミノ酸以内、15アミノ酸以内、10アミノ酸以内、または5アミノ酸以内にある。ある種の実施形態では、該第2部位突然変異は、RQPRモチーフからカルボキシ末端側に20アミノ酸以内、15アミノ酸以内、10アミノ酸以内、または5アミノ酸以内にある。
ある種のより特定な実施形態では、該第2部位突然変異は、配列番号314のアミノ酸92、93、94、95、96、97または100位に相当する、Fタンパク質のアミノ酸位置にある。ある種のより一層特定な実施形態では、該第2部位突然変異は、E93K、Q100K、E92K、E93V、I95S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K、またはN97Hであってもよく、その第1文字は配列番号314中のアミノ酸を指し、数字はアミノ酸位置を指し、第2文字は、各位置で配列番号314のアミノ酸を置換するアミノ酸を指す。
本発明のある種の実施形態では、第2部位突然変異はF遺伝子とは異なる遺伝子中にある。理論に拘るわけではないが、Fタンパク質の切断はFタンパク質の分子的背景に依存し、それにより、例えば、ウイルス粒子中のFタンパク質の折畳みまたはFタンパク質の配向に影響するタンパク質中の変化も、Fタンパク質の切断に影響し得る。
特定の例示的な実施形態では、本発明は、トリプシンの非存在下でE93KとS101Pアミノ酸置換とを含んだFタンパク質を含む、組換えヒトメタニューモウイルスを増殖させる方法を提供する。
ある種の実施形態では、本発明は、培地に血清を添加せずに、哺乳動物メタニューモウイルスを増殖させる方法を提供する。血清の非存在下での感染細胞の増殖に関するより詳細な説明については、5.6章を参照されたい。
本発明の方法で使用できる例示的な細胞系には、それだけに限らないが、Vero細胞、LLC-MK2アカゲザル腎臓などが挙げられる。組換えウイルスを本発明の方法で使用する場合、哺乳動物メタニューモウイルスのレスキューのためにBHK細胞を使用できる。
ある種の実施形態では、本発明の方法で使用できるウイルスのFタンパク質における変異は、該哺乳動物メタニューモウイルスの宿主特異性に変化を起こさない。ある種の実施形態では、本発明の方法で使用できるウイルスのFタンパク質における変異は、該哺乳動物メタニューモウイルスの宿主細胞特異性に変化を起こさない。
スクリーニングアッセイ
本発明は、切断部位にRQPRモチーフを有する哺乳動物メタニューモウイルスFタンパク質のトリプシン非依存的切断に関する第2部位突然変異を同定する方法も提供する。ある種の実施形態では、本発明は、切断部位にRQPRモチーフを有する哺乳動物メタニューモウイルスFタンパク質のトリプシン非依存的切断の増強因子を同定するスクリーニング法を提供する。特定の機構や理論に何ら拘るわけではないが、RQPRモチーフを有する哺乳動物メタニューモウイルスFタンパク質のトリプシン非依存的切断に関するこのような第2部位突然変異、例えば増強因子は、ウイルスゲノムを安定化し、そのためトリプシン非存在下での増殖がF遺伝子中の自然発生的な追加的変異の蓄積をもたらさない。ある種の実施形態では、このような第2部位修飾因子はF遺伝子中にある。他のある種の実施形態では、このような第2部位修飾因子は、哺乳動物メタニューモウイルスの他の遺伝子中にある。
変異は、当業者に公知の任意の方法によって、哺乳動物メタニューモウイルスのF遺伝子中に導入することができる。変異は、例えば、DNAのランダム変異誘発およびその変異を有するウイルス粒子をレスキューするための逆遺伝学的方法の使用、DNAの部位特異的変異誘発およびその変異を有するウイルス粒子をレスキューするための逆遺伝学的方法の使用、または選択圧下、即ちトリプシン非存在下でのウイルスの増殖によって、導入することができる。
適切な第2部位突然変異は異なるレベルで選択することができる。ある種の実施形態では、Fタンパク質をコードするDNAについて変異誘発し、Fタンパク質を発現させ、トリプシン非依存的に切断される能力について試験する(例示的アッセイは以下で説明する)。トリプシン非依存的切断の増加は、第2部位突然変異がFタンパク質のトリプシン非依存的切断の増強因子であることを示している。他の実施形態では、Fタンパク質をコードするDNAについて変異誘発し、逆遺伝学的方法を使用してウイルスをレスキューし、該ウイルスをトリプシン非依存的Fタンパク質切断の増強または合胞体形成の増加について試験する。更に他の実施形態では、ウイルスをトリプシン非存在下、即ち選択圧下で増殖させた後、トリプシン非依存的Fタンパク質切断の増強や合胞体形成の増加などの任意の第2部位突然変異の効果について試験する。
一旦、F遺伝子中に第2部位修飾因子を保持する変異体を選択すれば、そのF遺伝子を配列決定することができる。その後、それだけに限らないが、rhMPV/NL/1/00/101Pなどの特性決定が十分になされた株中にその変異を導入することにより、第2部位突然変異の効果を検証し、ワクチン生産に適当なウイルス株を生成することができる。
RQPRモチーフを有するメタニューモウイルスFタンパク質を切断するプロテアーゼを同定するために、当業者に公知の任意の方法を用いることにより、プロテアーゼ活性を検出し、定量化することができる。ある種の実施形態では、切断部位にRQPRモチーフを有する検出可能に標識したFタンパク質を、Fタンパク質の切断により標識が失われる(即ち、該標識は、切断部位に対して固定化部位から遠位にある)ように、固体支持体上に固定化する。したがって、プロテアーゼ活性は、検出可能な標識の減少により検出し、定量化することができる。他の実施形態では、ポリペプチドの検出可能に標識したアミノ酸またはペプチドの反応緩衝液中への放出が測定される。ある種の他の実施形態では、FRETまたは蛍光偏光を使用してプロテアーゼ反応を検出し、定量化する。例示的な例では、Fタンパク質は、固体支持体に結合していない末端に蛍光標識される。試験プロテアーゼとインキュベーションすると、該蛍光標識はタンパク質分解で失われ、その結果、蛍光の減少は、RQPRモチーフを有するFタンパク質を切断できるプロテアーゼ活性の存在を示す。ある種の実施形態では、該固体支持体はビーズである。
該Fタンパク質は、当業者に公知の任意の方法により検出可能に標識できる。ある種の実施形態では、該タンパク質またはポリペプチドは放射標識される。ある種の実施形態では、該タンパク質またはポリペプチドは、固体支持体の表面に一方の端で結合され、他方の端で検出可能に標識される。固体支持体の表面上の検出可能な標識の減少は、プロテアーゼ活性の活性尺度である。
試験プロテアーゼとして使用できるプロテアーゼのクラスには、それだけに限らないが、ブロメライン、カテプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、カリクレイン、パパイン、ペプシン、プラスミン、レニン、ストレプトキナーゼ、スブチリシン、サーモリシン、トロンビン、トリプシン、ウロキナーゼなどが挙げられる。特定の実施形態では、該プロテアーゼはトリプターゼクララまたはその同族体である。
5.1 哺乳動物メタニューモウイルス
哺乳動物メタニューモウイルスの構造的特徴
本発明は、哺乳動物MPVを提供する。哺乳動物MPVは、パラミクソウイルス科のニューモウイルス亜科に属する一本鎖ネガティブセンスRNAウイルスである。更に、哺乳動物MPVは、メタニューモウイルス属に系統学的に相当するものとして同定可能であり、この哺乳動物MPVは、鳥類鼻気管炎の病原因子であるシチメンチョウ鼻気管炎ウイルスよりも、パリのCNCMにI-2614として寄託されたウイルス分離株(配列番号19)に系統学的により密接に関連している。ウイルスは、例えば、ウイルスの核酸配列情報を得て、系統学的分析でそれを試験することによって、メタニューモウイルス属に系統学的に相当するものとして同定可能である。当業者に公知の任意の技術を使用して、ウイルスの株間の系統学的関連性を決定できる。例示的な方法については、第5.9節を参照のこと。他の技術は、本明細書中でその全体が参照により組み込まれる、WO 02/057302として公開された国際特許出願PCT/NL02/00040に開示されている。特に、本明細書中で参照により組み込まれるPCT/NL02/00040は、第12頁27行目から第19頁29行目にて、系統学的分析に適切な核酸配列を開示している。ウイルスは、以下により詳細に記載するように、配列類似性に基づいて哺乳動物MPVとして更に同定できる。
ウイルスと本明細書中に開示される哺乳動物MPVとの系統学的関連性および配列類似性に加えて、ウイルスゲノム構造と本明細書中に開示される哺乳動物MPVのゲノム構造との類似性もまた、このウイルスを哺乳動物MPVとして同定するために使用できる。哺乳動物MPVの代表的なゲノム構造については図9を参照のこと。特定の実施形態において、哺乳動物MPVのゲノム構造は、パラミクソウイルス科のニューモウイルス亜科内のニューモウイルスゲノム構造とは異なる。2つの属、メタニューモウイルスおよびニューモウイルスの分類は、それらの遺伝子配列に主に基づく。メタニューモウイルスは一般に非構造タンパク質(例えば、NS1またはNS2)を欠き(Randhawa et al., 1997, J. Virol. 71:9849-9854もまた参照のこと)、遺伝子の順序はニューモウイルスのものとは異なる (RSV: '3-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5', APV: '3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5') (Lung, et al., 1992, J. Gen. Virol. 73:1709-17 15; Yu, et al., 1992, Virology 186:426-434; Randhawa, et al., 1997, J. Virol. 71:9849-9854)。
更に、本発明の哺乳動物MPVは、その免疫学的特性によって同定できる。特定の実施形態において、哺乳動物MPVを中和できる、哺乳動物MPVに対する特異的抗血清を産生させることができる。哺乳動物MPVを中和できる、MPVに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体もまた、産生させることができる(PCT WO 02/057302の第__頁から第__頁を参照のこと。これは、本明細書中で参照により組み込まれる)。
本発明の哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主(即ち、哺乳動物培養細胞または哺乳動物)に感染するその能力によって更に特徴付けられる。APVとは異なり、哺乳動物MPVは、ニワトリおよびシチメンチョウにおいて複製しないか、または低レベルでのみ複製する。しかし、哺乳動物MPVは、カニクイザルなどの哺乳動物宿主において複製する。特定のより具体的な実施形態において、哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主において複製するその能力によって更に特徴付けられる。特定のより具体的な実施形態において、哺乳動物MPVは、哺乳動物MPVのゲノムによりコードされるタンパク質を哺乳動物宿主に発現させるその能力によって、更に特徴付けられる。なおより具体的な実施形態において、哺乳動物MPVにより発現されるウイルスタンパク質は、哺乳動物宿主の細胞膜中に挿入される。特定の実施形態において、本発明の哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染でき、哺乳動物MPVの新たな感染性ウイルス粒子を哺乳動物宿主に産生させることができる。本発明の哺乳動物MPVの機能的特徴のより詳細な記載については、第5.1.2節を参照のこと。
特定の実施形態において、電子顕微鏡におけるウイルスの外観またはクロロホルムに対するその感受性を使用して、そのウイルスを哺乳動物MPVと同定することができる。本発明の哺乳動物MPVは、電子顕微鏡において、パラミクソウイルス様粒子のように見える。これと一致して、哺乳動物MVPは、クロロホルムによる処理に感受性である。哺乳動物MPVは、tMK細胞またはこの細胞と機能的に等価な細胞で最適に培養され、ほとんどの細胞培養物中で本質的にトリプシン依存的である。更に、哺乳動物MPVは、典型的な細胞変性効果(CPE)を有し、赤血球の種に対する血球凝集活性を欠く。MPV分離株により誘導されるCPEは、hRSVにより誘導されるCPEと類似しており、特徴的なシンシチウム形成の後に、細胞の迅速な内部破壊が起こり、引き続いて培養プレートからの剥離が生じる。ほとんどのパラミクソウイルスは血球凝集活性を有するが、ほとんどのニューモウイルスは有していない(Pringle, C.R., The Paramyxoviruses; (D.W. Kingsbury編) 1-39 (Plenum Press, New York, 1991))。哺乳動物MPVは、M2タンパク質をコードする核酸断片中に第2の重複ORF(M2-2)を含む。この第2の重複ORFの存在は、Ahmadian et al., 1999, J. Gen. Vir. 80:2011-2016中に示される他のニューモウイルス中に存在する。
特定の実施形態において、本発明は、哺乳動物MPVとしてウイルス分離株を同定する方法を提供する。試験試料は、例えば動物またはヒトから得ることができる。次いで、試料を、ニューモウイルス亜科のウイルスの存在について試験する。ニューモウイルス亜科のウイルスが存在する場合、このウイルスは、本明細書中で考察される哺乳動物MPVの特徴(例えば、哺乳動物MPVに対する系統学的関連性、哺乳動物MPVのヌクレオチド配列に対するヌクレオチド配列同一性、哺乳動物MPVのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の同一性/相同性、ならびにゲノム構造であるが、これらに限定されない)のいずれかについて試験され得る。更に、このウイルスは、MPV分離株由来の核酸配列を使用するクロスハイブリダイゼーション実験、哺乳動物MPVに特異的なプライマーを使用するRT-PCR、または哺乳動物MPV分離株に対する抗体を使用する古典的交差血清学実験によって、哺乳動物MPVとして同定できる。特定の他の実施形態において、哺乳動物MPVは、動物抗血清での定量的中和によって決定される、その免疫学的独自性に基づいて同定できる。抗血清は、哺乳動物MPVに感染した、例えば、フェレット、ブタまたはマカクから得ることができる(例えば、実施例8を参照のこと)。
特定の実施形態において、血清型は、哺乳動物MPV以外のウイルスとは交差反応しない。他の実施形態において、血清型は、両方向で16より高い同種対異種力価比率を示す。中和が、いずれかまたは両方向で2つのウイルス間の特定の程度の交差反応(8または16の同種対異種力価比)を示す場合、DNA配列の実質的な生物物理学的/生化学的差異が存在する場合に血清型の独自性が推定される。中和が、いずれかまたは両方の方向で2つのウイルス間の区別できる程度の交差反応(8より小さい同種対異種力価比)を示す場合、研究中の分離株の血清型の同一性が推定される。分離株I-2614(本明細書中でMPV分離株00-1としても知られる)が、原型(prototype)として使用できる。
特定の実施形態において、ウイルスは、配列または寄託によって本明細書中に開示されるウイルス分離株のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列と比較したそのウイルスタンパク質または核酸の配列相同性/同一性によって、哺乳動物MPVとして同定できる。特に、そのウイルスゲノムが、APV-Cと比較して本明細書で後述の通り同定したLタンパク質、Mタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質またはFタンパク質をコードする核酸に対して本明細書中で規定したパーセンテージ(表1を参照のこと)よりも高いパーセンテージである、パリのCNCMにI-2614として寄託されたウイルス分離株に対する核酸同一性(％)を有する核酸配列を含む場合、ウイルスは哺乳動物MPVとして同定される(本明細書中で参照により組み込まれる、PCT WO 02/05302の第12頁から第19頁を参照のこと)。理論に束縛されないが、ウイルス種、特にRNAウイルス種はしばしば亜種を構成し、このとき、これらのウイルスのクラスターのメンバーは、配列の不均一性を示すことが一般に知られている。したがって、個々の分離株それぞれは、APV-Cと比較した場合、いくらか異なるパーセンテージの配列同一性を有し得ると予測される。
MPVのタンパク質と、今日まで同じ科の既知の他のウイルスのいずれかのタンパク質との間の最高のアミノ配列同一性は、APV-CとヒトMPVとの間の同一性である。ヒトMPVとAPV-Cとの間のアミノ酸配列同一性は、配列表中に与えられる配列を比較した場合に推定できるとおり、マトリックスタンパク質に対して87%であり、核タンパク質に対しては88%であり、リンタンパク質に対しては68%であり、融合タンパク質に対しては81%であり、ポリメラーゼタンパク質の一部に対しては56〜64%である。表1もまた参照のこと。これらの最大値と比較してより高い相同性を有するタンパク質をコードするORFを含むウイルス分離株が、哺乳動物MPVとみなされる。他のウイルスと同様に、特定の程度のバリエーションが、哺乳動物MPVの種々の分離株間で見出されることに留意すべきである。
Figure 2008537482
特定の実施形態において、本発明は哺乳動物MPVを提供し、この哺乳動物MPVのSHタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号382のアミノ酸配列(分離株NL/1/00のSHタンパク質;表14を参照のこと)に対して、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である。配列番号382(分離株NL/1/00のSHタンパク質;表14を参照のこと)に対して少なくとも30%同一のSHタンパク質を含む単離されたネガティブセンス一本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主に感染することが可能である。特定の実施形態において、配列番号382(分離株NL/1/00のSHタンパク質;表14を参照のこと)に対して少なくとも30%同一のSHタンパク質を含む単離されたネガティブセンス一本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主において複製することが可能である。特定の実施形態において、哺乳動物MPVは、配列番号382(分離株NL/1/00のSHタンパク質;表14を参照のこと)に対して少なくとも30%同一のSHタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、本発明は哺乳動物MPVを提供し、この哺乳動物MPVのGタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号322のアミノ酸配列(分離株NL/1/00のGタンパク質;表14を参照のこと)に対して、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である。配列番号322(分離株NL/1/00のGタンパク質;表14を参照のこと)に対して少なくとも20%同一のGタンパク質を含む分離されたネガティブセンス一本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主に感染することが可能である。特定の実施形態において、配列番号322(分離株NL/1/00のGタンパク質;表14を参照のこと)に対して少なくとも20%同一のGタンパク質を含む分離されたネガティブセンス一本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主において複製することが可能である。特定の実施形態において、哺乳動物MPVは、配列番号322(分離株NL/1/00のGタンパク質;表14を参照のこと)に対して少なくとも20%同一のGタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、本発明は哺乳動物MPVを提供し、この哺乳動物MPVのLタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号330のアミノ酸配列(分離株NL/1/00のLタンパク質;表14を参照のこと)に対して、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である。配列番号330(分離株NL/1/00のLタンパク質;表14を参照のこと)に対して少なくとも85%同一のLタンパク質を含む単離されたネガティブセンス一本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主に感染することが可能である。特定の実施形態において、配列番号330(分離株NL/1/00のLタンパク質;表14を参照のこと)に対して少なくとも85%同一のLタンパク質を含む単離されたネガティブセンス一本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主において複製することが可能である。特定の実施形態において、哺乳動物MPVは、配列番号330(分離株NL/1/00のLタンパク質;表14を参照のこと)に対して少なくとも20%同一のLタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、本発明は哺乳動物MPVを提供し、この哺乳動物MPVのNタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号366のアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一である。配列番号366に対してアミノ酸配列において少なくとも90%同一のNタンパク質を含む単離されたネガティブセンス一本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主に感染することが可能である。特定の実施形態において、配列番号366に対してアミノ酸配列において少なくとも90%同一のNタンパク質を含む単離されたネガティブセンス一本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主において複製することが可能である。アミノ酸同一性は、Nタンパク質の全長にわたって計算される。特定の実施形態において、哺乳動物MPVは、配列番号366のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一のNタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
本発明は更に哺乳動物MPVを提供し、この哺乳動物MPVのPタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号374のアミノ酸配列に対して、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一である。配列番号374に対してアミノ酸配列において少なくとも70%同一のPタンパク質を含む哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することが可能である。特定の実施形態において、配列番号374に対してアミノ酸配列において少なくとも70%同一のPタンパク質を含む哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主において複製することが可能である。アミノ酸同一性は、Pタンパク質の全長にわたって計算される。特定の実施形態において、哺乳動物MPVは、配列番号374のアミノ酸配列に対して、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一のPタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
本発明は更に哺乳動物MPVを提供し、この哺乳動物MPVのMタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号358のアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一である。配列番号358に対してアミノ酸配列において少なくとも90%同一のMタンパク質を含む哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することが可能である。特定の実施形態において、配列番号358に対してアミノ酸配列において90%同一のMタンパク質を含む単離されたネガティブセンス一本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主において複製することが可能である。アミノ酸同一性は、Mタンパク質の全長にわたって計算される。特定の実施形態において、哺乳動物MPVは、配列番号358のアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一のMタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
本発明は更に哺乳動物MPVを提供し、この哺乳動物MPVのFタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号314のアミノ酸配列に対して、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一である。配列番号314に対してアミノ酸配列において少なくとも85%同一のFタンパク質を含む哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することが可能である。特定の実施形態において、配列番号314に対してアミノ酸配列において85%同一のFタンパク質を含む単離されたネガティブセンス一本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主において複製することが可能である。アミノ酸同一性は、Fタンパク質の全長にわたって計算される。特定の実施形態において、哺乳動物MPVは、配列番号314のアミノ酸配列に対して、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一のFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
本発明は更に哺乳動物MPVを提供し、この哺乳動物MPVのM2-1タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号338のアミノ酸配列に対して、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一である。配列番号338に対してアミノ酸配列において少なくとも85%同一のM2-1タンパク質を含む哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することが可能である。特定の実施形態において、配列番号338に対してアミノ酸配列において85%同一のM2-1タンパク質を含む分離されたネガティブセンス一本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主において複製することが可能である。アミノ酸同一性は、M2-1タンパク質の全長にわたって計算される。特定の実施形態において、哺乳動物MPVは、配列番号338のアミノ酸配列に対して、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一のM2-1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
本発明は更に哺乳動物MPVを提供し、この哺乳動物MPVのM2-2タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号346のアミノ酸配列に対して、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一である。配列番号346に対してアミノ酸配列において少なくとも60%同一のM2-2タンパク質を含む単離された哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することが可能である。特定の実施形態において、配列番号346に対してアミノ酸配列において少なくとも60%同一のM2-2タンパク質を含む分離されたネガティブセンス一本鎖RNAメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主において複製することが可能である。アミノ酸同一性は、M2-2タンパク質の全長にわたって計算される。特定の実施形態において、哺乳動物MPVは、配列番号346のアミノ酸配列に対して、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%同一のM2-2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、本発明は哺乳動物MPVを提供し、このネガティブセンス一本鎖RNAメタニューモウイルスは、(i)配列番号366に対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するNタンパク質、(ii)配列番号374に対して少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するPタンパク質、(iii)配列番号358に対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するMタンパク質、(iv)配列番号314に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するFタンパク質、(v)配列番号338に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するM2-1タンパク質、および(vi)配列番号346に対して少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有するM2-2タンパク質からなる群から選択される、少なくとも2種のタンパク質、少なくとも3種のタンパク質、少なくとも4種のタンパク質、少なくとも5種のタンパク質または少なくとも6種のタンパク質をコードする。
本発明は、2つのサブグループ(サブグループAおよびサブグループB)の哺乳動物MPVを提供する。本発明はまた、4つの変異体A1、A2、B1およびB2を提供する。哺乳動物MPVは、分離株99-1(配列番号18)よりも分離株00-1(配列番号19)に系統学的に密接に関連する場合、サブグループAのメンバーとして同定され得る。哺乳動物MPVは、分離株00-1(配列番号19)よりも分離株99-1(配列番号18)に系統学的に密接に関連する場合、サブグループBのメンバーとして同定され得る。他の実施形態において、個々のORFのヌクレオチド配列相同性またはアミノ酸配列相同性は、サブグループAまたはBに属するとして哺乳動物MPVを分類するために使用できる。
哺乳動物MVPの種々の分離株は、4つの異なる変異体、変異体A1、変異体A2、変異体B1および変異体B2に分割できる。分離株00-1(配列番号19)は、哺乳動物MPVの変異体A1の一例である。分離株99-1(配列番号18)は、哺乳動物MPVの変異体B1の一例である。哺乳動物MPVは、系統学的分析を使用して4つの変異体の1つに分類できる。したがって、哺乳動物MPVは、哺乳動物MPVの別の変異体のメンバーに系統学的に関連するよりも、特定の変異体の既知のメンバーに系統学的により密接に関連する場合、その変異体に属する。任意のORFおよびコードされたポリペプチド(N、P、L、M、SH、G、M2またはFポリペプチドを含む)の配列を使用して、MPV分離株を、特定のサブグループまたは変異体に属するとタイプ分けし得る。特定の実施形態において、哺乳動物MPVの変異体への分類は、Gタンパク質の配列に基づく。理論に束縛されないが、Gタンパク質の配列は、哺乳動物MPVの異なる変異体のGタンパク質間のバリエーションの程度が高いため、系統学的分析に充分適している。
本発明の特定の実施形態において、配列相同性は、以下に示されるように、2つの配列が特定の条件下でハイブリダイズできるかどうかによって決定され得る。哺乳動物MPVの核酸またはその逆相補体またはその相補体にハイブリダイズ可能な核酸は、互いに対するそれらの配列相同性および同一性を決定するために、本発明の方法において使用され得る。特定の実施形態において、これらの核酸は、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズされる。
ハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、塩濃度、pH、ホルムアミド濃度などであるが、これらに限定されない)は、当業者に周知である(例えば、Sambrook et al., 1989, Chapters 9 to 11, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照のこと。これは、本明細書中でその全体が参照により組み込まれる)。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションは水溶液中で実施され、その溶液のイオン強度は一定に維持されるが、ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリダイズされる配列間の配列相同性の程度に依存して変動する。互いに100%同一であり、200塩基対より長いDNA配列について、ハイブリダイゼーションは、完全ハイブリッドの融解温度(Tm)を下回る約15〜25℃で実施される。融解温度(Tm)は、以下の方程式を使用して計算できる(Bolton and McCarthy, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1390):
Tm = 81.5℃ - 16.6(log10[Na+]) + (%G+C) - 0.63(%ホルムアミド) - (600/l)
式中、(Tm)は融解温度であり、[Na+]はナトリウム濃度であり、G+Cはグアニンおよびシトシンの含量であり、lは塩基対中のハイブリッドの長さ(塩基対)である。配列間のミスマッチの影響は、Bonner et al. (Bonner et al., 1973, J. Mol. Biol. 81:123-135)による式を使用して計算でき、ハイブリッド中の塩基のミスマッチ1%につき、融解温度を1〜1.5℃低下させる。
このように、2つの配列がハイブリダイズする温度を決定することによって、当業者は、ある配列が既知の配列にどの程度類似しているかを推定できる。これは例えば、実験的に決定されたハイブリダイゼーション温度の、完全一致でハイブリダイズする既知の配列について計算したハイブリダイゼーション温度との比較によって、実施できる。Bonner et al.による式の使用によって、ハイブリダイゼーション温度と%ミスマッチとの間の関係を利用して、配列類似性に関する情報を提供できる。
限定ではなく例として、このような高ストリンジェンシーの条件を使用する手順は以下の通りである。DNAを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションは、6×SSC、50 mM Tris HCl (pH 7.5)、1 mM EDTA、0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.02% BSAおよび500μg/mlの変性サケ精子DNAからなる緩衝液中、65℃で8時間〜一晩実施される。フィルターは、100μg/mlの変性サケ精子DNAおよび5〜20×106cpmの32P標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中で65℃で48時間ハイブリダイズされる。フィルターの洗浄は、2×SSC、0.01% PVP、0.01% Ficollおよび0.01% BSAを含む溶液中で37℃で1時間実施される。その後、0.1×SSC中で50℃で45分間の洗浄を実施し、その後オートラジオグラフィーを実施する。使用され得る高いストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。本発明の他の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、中程度または低いストリンジェンシーの条件下で実施され、このような条件は当業者に周知である(例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照のこと。Ausubel et al.,編, the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1997 Current Protocols,(著作権) 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.もまた参照のこと。これらは各々、本明細書中でその全体が参照により組み込まれる)。例示的な低いストリンジェンシーの条件は、以下の緩衝液系により提供される:35% ホルムアミド、5×SSC、50mM Tris HCl (pH7.5)、5mM EDTA、0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.2% BSA、100μg/mlの変性サケ精子DNAおよび10% (wt/vol)デキストラン硫酸を含む緩衝液中での、40℃で18〜20時間のハイブリダイゼーション、2×SSC、25mM Tris HCl (pH7.4)、5mM EDTAおよび0.1% SDSからなる緩衝液中での、55℃で1.5時間の洗浄、ならびに2×SSC、25 mM Tris HCl (pH7.4)、5mM EDTAおよび0.1% SDSからなる緩衝液中での、60℃で1.5時間の洗浄。
特定の実施形態において、哺乳動物MPVは、哺乳動物MPVの特定の変異体に特異的なプローブを使用して、変異体の1つへと分類され得る。このようなプローブには、RT-PCR用のプライマーおよび抗体が含まれる。哺乳動物MPVを特定の変異体のメンバーとして同定するための例示的な方法は、以下の第5.9節に記載される。
本発明の特定の実施形態において、哺乳動物MPVの種々の変異体が、異なるウイルスタンパク質のアミノ酸配列によって互いに識別され得る。他の実施形態において、哺乳動物MPVの種々の変異体が、ウイルスゲノムによってコードされる異なるORFのヌクレオチド配列によって互いに識別され得る。哺乳動物MPVの変異体は、A1、A2、B1またはB2であり得るが、これらに限定されない。しかし、本発明は、未だ同定されていない別の変異体のメンバーである哺乳動物MPVの分離株をも企図する。本発明はまた、1つの変異体により密接に関連する1つまたは複数のORF、および別の変異体に系統学的により密接に関連する1つまたは複数のORFを有し得るウイルスを企図する。このようなウイルスは、そのORFの大部分が系統学的により密接に関連する変異体へと分類されよう。非コード配列もまた、系統学的関連性を決定するために使用され得る。
哺乳動物MPVの分離株は、以下の他のウイルス分離株:NL/1/00(配列番号19)、NL/17/00(配列番号20)およびNL/1/94(配列番号21)、のいずれかに関連するよりも、ウイルス分離株NL/1/99(配列番号18)に系統学的により密接に関連する場合、変異体B1として分類される。哺乳動物MPVの1つまたは複数のORFを使用して、哺乳動物MPVをいずれかの変異体に分類できる。哺乳動物MVPは、以下の場合に、MPV変異体B1として分類され得る:そのGタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/99によって示される哺乳動物MPV変異体B1のGタンパク質(配列番号324)に対して、少なくとも66%,、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのNタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/99によって示される哺乳動物MPV変異体B1のNタンパク質(配列番号368)に対して、少なくとも98.5%または少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのPタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/99によって示される哺乳動物MPV変異体B1のPタンパク質(配列番号376)に対して、少なくとも96%、少なくとも98%または少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのMタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/99によって示される哺乳動物MPV変異体B1のMタンパク質(配列番号360)に対して同一である場合;そのFタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/99によって示される哺乳動物MPV変異体B1のFタンパク質(配列番号316)に対して少なくとも99%同一である場合;そのM2-1タンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/99によって示される哺乳動物MPV変異体B1のM2-1タンパク質(配列番号340)に対して、少なくとも98%または少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのM2-2タンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/99によって示される哺乳動物MPV変異体B1のM2-2タンパク質(配列番号348)に対して、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのSHタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/99によって示される哺乳動物MPV変異体B1のSHタンパク質(配列番号384)に対して、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;および/またはそのLタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/99によって示される哺乳動物MPV変異体B1のLタンパク質(配列番号332)に対して、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合。
哺乳動物MPVの分離株は、以下の他のウイルス分離株:NL/1/99(配列番号18)、NL/17/00(配列番号20)およびNL/1/94(配列番号21)、のいずれかに関連するよりも、ウイルス分離株NL/1/00(配列番号19)に系統学的により密接に関連する場合、変異体A1として分類される。哺乳動物MPVの1つまたは複数のORFを使用して、哺乳動物MPVを特定の変異体に分類できる。哺乳動物MPVは、以下の場合に、MPV変異体A1として分類され得る:そのGタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/00によって示される哺乳動物MPV変異体A1のGタンパク質(配列番号322)に対して、少なくとも66%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのNタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/00によって示される哺乳動物MPV変異体A1のNタンパク質(配列番号366)に対して、少なくとも99.5%同一である場合;そのPタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/00によって示される哺乳動物MPV変異体A1のPタンパク質(配列番号374)に対して、少なくとも96%、少なくとも98%または少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのMタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/00によって示される哺乳動物MPV変異体A1のMタンパク質(配列番号358)に対して、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのFタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/00によって示される哺乳動物MPV変異体A1のFタンパク質(配列番号314)に対して、少なくとも98%または少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのM2-1タンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/00によって示される哺乳動物MPV変異体A1のM2-1タンパク質(配列番号338)に対して、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのM2-2タンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/00によって示される哺乳動物MPV変異体A1のM2-2タンパク質(配列番号346)に対して、少なくとも96%または少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのSHタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/00によって示される哺乳動物MPV変異体A1のSHタンパク質(配列番号382)に対して、少なくとも84%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;および/またはそのLタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/00によって示される哺乳動物MPV変異体A1のウイルスのLタンパク質(配列番号330)に対して、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合。
哺乳動物MPVの分離株は、以下の他のウイルス分離株:NL/1/99(配列番号18)、NL/1/00(配列番号19)およびNL/1/94(配列番号21)、のいずれかに関連するよりも、ウイルス分離株NL/17/00(配列番号20)に系統学的により密接に関連する場合、変異体A2として分類される。哺乳動物MPVの1つまたは複数のORFを使用して、哺乳動物MPVを特定の変異体に分類できる。哺乳動物MPVは、以下の場合に、MPV変異体A2として分類され得る:そのGタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/17/00によって示される哺乳動物MPV変異体A2のGタンパク質(配列番号323)に対して、少なくとも66%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのNタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/17/00によって示される哺乳動物MPV変異体A2のNタンパク質(配列番号367)に対して、少なくとも99.5%同一である場合;そのPタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/17/00によって示される哺乳動物MPV変異体A2のPタンパク質(配列番号375)に対して、少なくとも96%、少なくとも98%、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのMタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/17/00によって示される哺乳動物MPV変異体A2のMタンパク質(配列番号359)に対して、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのFタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/17/00によって示される哺乳動物MPV変異体A2のFタンパク質(配列番号315)に対して、少なくとも98%、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのM2-1タンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/17/00によって示される哺乳動物MPV変異体A2のM2-1タンパク質(配列番号339)に対して、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのM2-2タンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/17/00によって示される哺乳動物MPV変異体A2のM2-2タンパク質(配列番号347)に対して、少なくとも96%、少なくとも98%、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのSHタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/17/00によって示される哺乳動物MPV変異体A2のSHタンパク質(配列番号383)に対して、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのLタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/17/00によって示される哺乳動物MPV変異体A2のLタンパク質(配列番号331)に対して、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合。
哺乳動物MPVの分離株は、以下の他のウイルス分離株:NL/1/99(配列番号18)、NL/1/00(配列番号19)およびNL/17/00(配列番号20)、のいずれかに関連するよりも、ウイルス分離株NL/1/94(配列番号21)に系統学的により密接に関連する場合、変異体B2として分類される。哺乳動物MPVの1つまたは複数のORFを使用して、哺乳動物MPVを特定の変異体に分類できる。哺乳動物MPVは、以下の場合に、MPV変異体B2として分類され得る:そのGタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/94によって示される哺乳動物MPV変異体B2のGタンパク質(配列番号325)に対して、少なくとも66%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのNタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/94によって示される哺乳動物MPV変異体B2のNタンパク質(配列番号369)に対して、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのPタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/94によって示される哺乳動物MPV変異体B2のPタンパク質(配列番号377)に対して、少なくとも96%、少なくとも98%または少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのMタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/94によって示される哺乳動物MPV変異体B2のMタンパク質(配列番号361)に対して同一である場合;そのFタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/94によって示される哺乳動物MPV変異体B2のFタンパク質(配列番号317)に対して、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのM2-1タンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/94によって示される哺乳動物MPV変異体B2のM2-1タンパク質(配列番号341)に対して、少なくとも98%または少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのアミノ酸配列が、原型NL/1/94によって示される哺乳動物MPV変異体B2のM2-2タンパク質(配列番号349)に対して、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;そのSHタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/94によって示される哺乳動物MPV変異体B2のSHタンパク質(配列番号385)に対して、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合;および/またはそのLタンパク質のアミノ酸配列が、原型NL/1/94によって示される哺乳動物MPV変異体B2のLタンパク質(配列番号333)に対して、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である場合。
特定の実施形態において、配列同一性パーセンテージは、全長タンパク質のアラインメントに基づく。他の実施形態において、配列同一性のパーセンテージは、タンパク質の連続アミノ酸配列のアラインメントに基づくものであり、この連続アミノ酸配列は、長さが25アミノ酸、50アミノ酸、75アミノ酸、100アミノ酸、125アミノ酸、150アミノ酸、175アミノ酸、200アミノ酸、225アミノ酸、250アミノ酸、275アミノ酸、300アミノ酸、325アミノ酸、350アミノ酸、375アミノ酸、400アミノ酸、425アミノ酸、450アミノ酸、475アミノ酸、500アミノ酸、750アミノ酸、1000アミノ酸、1250アミノ酸、1500アミノ酸、1750アミノ酸、2000アミノ酸または2250アミノ酸であり得る。
5.2 哺乳動物MPVの機能特性
哺乳動物MPVの構造上の定義に加えて、哺乳動物MPVを、その機能特性によって定義することもできる。ある種の実施形態では、本発明の哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することができる。哺乳動物宿主は、哺乳動物の細胞、組織、器官、または哺乳動物であってよい。特定の一実施形態では、哺乳動物宿主は、ヒトまたはヒトの細胞、組織、もしくは器官である。当業者に公知の任意の方法を用いて、哺乳動物宿主が哺乳動物MPVに感染しているか否かを試験することができる。ある種の実施形態では、ウイルスを、哺乳動物細胞に付着するその能力について試験する。他のある種の実施形態では、ウイルスを、哺乳動物細胞中にそのゲノムを導入するその能力について試験する。例示的な一実施形態では、ウイルスゲノムを、例えば、放射標識し、検出可能に標識する。次いで、ウイルスを、哺乳動物細胞と、少なくとも1分、少なくとも5分、少なくとも15分、少なくとも30分、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも5時間、少なくとも12時間、または少なくとも1日インキュベートする。引き続き細胞を洗浄して細胞からウイルス粒子を除去し、次いで、細胞を検出可能な標識によって、ウイルスゲノムの存在について試験する。別の実施形態では、細胞におけるウイルスゲノムの存在を、哺乳動物MPVに特異的なプライマーを用いてRT-PCRを用いて検出する(本明細書に参照として組み入れられる、PCT国際公開第02/057302号、37〜44頁を参照されたい)。
ある種の実施形態では、哺乳動物のウイルスは哺乳動物宿主に感染し、哺乳動物MPVのタンパク質の哺乳動物宿主の細胞膜中への挿入をもたらすことができる。哺乳動物宿主は、培養した哺乳動物の細胞、器官、組織、または哺乳動物であってよい。例示的な一実施形態では、哺乳動物細胞を、哺乳動物ウイルスとインキュベートする。引き続き、細胞の表面からウイルスを除去する条件下で、細胞を洗浄する。当業者に公知の任意の技術を用いて、哺乳動物細胞の細胞膜に挿入された、新しく発現されたウイルスタンパク質を検出することができる。例えば、細胞をウイルスに感染させた後、細胞を、検出可能に標識したアミノ酸を含む培地で維持する。細胞を引き続き回収し、溶解させ、細胞質画分を、膜画分から分離する。膜画分のタンパク質を、次いで可溶化し、次いで、それだけには限定されないがFタンパク質またはGタンパク質などの哺乳動物MPVのタンパク質に特異的な抗体を用いて免疫沈降にかける。次いで、免疫沈降したタンパク質を、SDS PAGEにかける。次いで、ウイルスのタンパク質の存在を、オートラジオグラフィーにより検出することができる。別の実施形態では、宿主細胞の細胞膜におけるウイルスタンパク質の存在を、哺乳動物MPVのタンパク質に特異的な1つまたは複数の抗体を用いて免疫細胞化学によって検出することができる。
更に他の実施形態では、本発明の哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することができ、かつ哺乳動物宿主で複製することができる。哺乳動物宿主は、培養した哺乳動物の細胞、器官、組織、または哺乳動物であってよい。当業者に公知の任意の技術を用いて、ウイルスが哺乳動物細胞に感染することができ、かつ哺乳動物宿主内で複製することができるか否かを決定することができる。特定の一実施形態では、哺乳動物細胞をウイルスに感染させる。引き続き、細胞を、少なくとも30分、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも5時間、少なくとも12時間、少なくとも1日、または少なくとも2日維持する。細胞におけるウイルスゲノムRNAのレベルを、ウイルスゲノムに特異的であるプローブを用いてノーザンブロット分析、RT-PCR、またはインサイチューハイブリダイゼーションを用いてモニターすることができる。ウイルスゲノムRNAの増大は、ウイルスが哺乳動物細胞に感染することができ、かつ哺乳動物細胞内で複製することができることを実証するものである。
更に他の実施形態では、本発明の哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することができ、この場合、感染により、哺乳動物宿主は、新たな感染性の哺乳動物MPVを生成する。哺乳動物宿主は、培養された哺乳動物細胞または哺乳動物であってよい。当業者に公知の任意の技術を用いて、ウイルスが哺乳動物宿主に感染することができ、哺乳動物宿主に新たな感染性ウイルス粒子を生成させるか否かを決定することができる。例示的な一例では、哺乳動物細胞を、哺乳動物のウイルスに感染させる。引き続き、細胞を洗浄し、少なくとも30分、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも5時間、少なくとも12時間、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも1週間、または少なくとも12日インキュベートする。ウイルスの力価を、当業者に公知の任意の方法によりモニターすることができる。例示的な方法については、第5.8節を参照されたい。
ある特定の実施形態では、哺乳動物MPVはヒトのMPVである。この節に記載されている試験を、ヒトのMPVで行うこともできる。ある種の実施形態では、ヒトのMPVは、哺乳動物または哺乳動物の培養細胞などの、哺乳動物宿主に感染することができる。
ある種の実施形態では、ヒトのMPVは、哺乳動物宿主に感染することができ、ヒトのMPVのタンパク質の、哺乳動物宿主の細胞膜中への挿入をもたらすことができる。
更に他の実施形態では、本発明のヒトのMPVは、哺乳動物宿主に感染することができ、かつ哺乳動物宿主で複製することができる。
更に他の実施形態では、本発明のヒトMPVは、哺乳動物宿主に感染することができ、かつ哺乳動物宿主で複製することができ、その感染および複製が、哺乳動物宿主に、新たな感染性のヒトのMPVの生成、およびパッケージングを引き起こす。
ある種の実施形態では、哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することができるが、トリまたはトリの培養細胞などのトリの宿主に感染することもできる。ある種の実施形態では、哺乳動物MPVは、トリの宿主に感染することができ、哺乳動物MPVのタンパク質のトリの宿主の細胞膜中への挿入をもたらす。更に他の実施形態では、本発明の哺乳動物MPVは、トリの宿主に感染することができ、トリの宿主で複製することができる。更に他の実施形態では、本発明の哺乳動物MPVは、トリの宿主に感染し、トリの宿主で複製することができ、この場合、感染および複製は、トリの宿主に、新たな感染性の哺乳動物MPVの生成、およびパッケージングを引き起こす。
5.3 組換えおよびキメラメタニューモウイルス
本発明は、哺乳動物およびトリ両方の変異体を含む、メタニューモウイルスゲノムに由来するウイルスベクターによってコードされる、組換えまたはキメラウイルスを包含する。本発明によると、組換えウイルスは、内在性もしくは天然のゲノム配列、または非天然のゲノム配列によってコードされる哺乳動物MPVまたはAPVに由来するものである。本発明によると、非天然の配列は、それだけには限定されないが、表現型の変化をもたらすこともあり、またはもたらさないこともあるゲノム配列に対する点突然変異、再配列、挿入、欠失などを含む1つまたは複数の突然変異により、天然もしくは内在のゲノム配列とは異なるものである。本発明の、組換えウイルスは、哺乳動物およびトリ両方の変異体を含むメタニューモウイルスゲノムに由来し、かつそのウイルスゲノムにとって非天然である核酸を含んでも含まなくてもよいウイルスベクターによってコードされるウイルスを、包含する。本発明によると、メタニューモウイルスゲノムに由来するウイルスベクターは、哺乳動物のメタニューモウイルスのORFの少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むものであり、この場合、ORFによってコードされるポリペプチドは、上記第5.1節および表1に述べたのと同一のアミノ酸配列を有する。
本発明によると、本発明の組換えウイルスは、哺乳動物のメタニューモウイルス(MPV)、特にヒトのメタニューモウイルスゲノムに由来するウイルスベクターによってコードされるこれらのウイルスを包含する。本発明の特定の実施形態では、ウイルスベクターは、メタニューモウイルスA1、A2、B1、またはB2変異体のゲノムに由来する。本発明によると、これらのウイルスベクターは、ウイルスゲノムに非天然である核酸を含むこともあり、または含まないこともある。
本発明によると、本発明の組換えウイルスは、シチメンチョウ鼻気管支炎ウイルス(TRTV)としても知られているトリのニューモウイルス(APV)のゲノムに由来するウイルスベクターによってコードされるウイルスを包含する。本発明の特定の実施形態では、ウイルスベクターは、APVのサブグループA、B、C、またはDのゲノムに由来する。特定の一実施形態では、ウイルスベクターは、APVのサブグループCのゲノムに由来する。本発明によると、これらのウイルスベクターは、ウイルスゲノムに非天然である核酸を含むこともあり、または含まないこともある。
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明の組換えウイルスは、APVのサブグループCのF-ORFをコードする核酸配列を含むAPVのゲノムに由来するウイルスベクターによってコードされるウイルスを包含する。ある種の実施形態では、APVのゲノムに由来するウイルスベクターは、少なくとも、APVのN-ORF、P-ORF、M-ORF、F-ORF、M2-1-ORF、M2-2-ORF、またはL-ORFをコードする核酸配列を含むものである。
本発明によると、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列を更に含む、組換えMPVまたはAPVである。本発明によると、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列がゲノムに付加されているヌクレオチド配列、または内在性もしくは天然のヌクレオチド配列が異種ヌクレオチド配列で置き換わっているヌクレオチド配列によってコードされていることがある。
本発明によると、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列を更に含む本発明のウイルスベクターによってコードされる。本発明によると、キメラウイルスは、ウイルスゲノムに非天然である核酸を含むことがあり、または含まないことがあるウイルスベクターによってコードされる。本発明によると、キメラウイルスは、それに対して異種ヌクレオチド配列が付加され、挿入され、または天然もしくは非天然の配列に置換されているウイルスベクターによってコードされる。本発明によると、キメラウイルスは、哺乳動物MPVの様々な株に由来するヌクレオチド配列によってコードされることがある。特に、キメラウイルスは、MPVの様々な株に由来する抗原のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によってコードされる。
本発明によると、キメラウイルスは、APVのゲノム、特にサブグループCに由来するウイルスベクターによってコードされることがあり、これは、MPVの1つまたは複数の株に由来する抗原のポリペプチドをコードする異種配列を更にコードする。
キメラウイルスは、2つ以上のウイルスに対して防御する組換えワクチンの産生に特に有用でありうる(Taoら、J.Virol.、72巻、2955〜2961頁;Durbinら、2000年、J.Virol.、74巻、6821〜6831頁;Skiadopoulosら、1998年、J.Virol.、72巻、1762〜1768頁;Tengら、2000年、J.Virol.、74巻、9317〜9321頁)。例えば、別のネガティブ鎖RNAウイルスの1つまたは複数のタンパク質を発現するMPVまたはAPVウイルスベクター、例えば、MPVの1つまたは複数のタンパク質を発現するRSVまたはRSVのベクターは、このようなベクターでワクチン接種した個体を、両ウイルスの感染から守ることを想定することができる。同様の手法を、PIVまたは他のパラミクソウイルスについて想定することができる。弱毒化した、複製欠損ウイルスは、他のウイルスで提唱されているように生ワクチンでのワクチン接種の目的で有用であり得る(本明細書に参照として組み入れられるPCT国際公開第02/057302号、6および23頁を参照されたい)。
本発明によると、本発明の組換えまたはキメラのウイルスをコードするウイルスベクター中に組み入れられる異種配列には、メタニューモウイルス、トリのニューモウイルスの株、ならびに、それだけには限定されないが、RSV、PIV、およびインフルエンザウイルス、ならびに麻疹ウイルス(morbillivirus)を含めた他のウイルスを含む、他のネガティブセンスRNAウイルスの様々な株から得られ、またはそれらに由来する配列が含まれる。
本発明のある種の実施形態では、本発明のキメラウイルスまたは組換えウイルスは、ウイルスゲノムに由来するウイルスベクターによってコードされ、この場合、1つまたは複数の配列、遺伝子間領域、末端配列、またはORF全体の部分は、異種性または非天然の配列で置換されている。本発明のある種の実施形態では、本発明のキメラウイルスは、1つまたは複数の異種配列がそのベクターに付加されているウイルスゲノムに由来ウイルスベクターによってコードされる。
ある種の実施形態では、本発明のウイルスは異種性の核酸を含む。好ましい一実施形態では、異種ヌクレオチド配列を、ウイルスゲノムの位置1に挿入または付加する。別の好ましい実施形態では、異種ヌクレオチド配列を、ウイルスゲノムの位置2に挿入または付加する。更に別の好ましい実施形態では、異種ヌクレオチド配列を、ウイルスゲノムの位置3に挿入または付加する。ウイルスゲノムのより小さい番号の位置に核酸配列を挿入または付加することで、ウイルスゲノムにわたる転写の勾配により、より大きい番号の位置での挿入に比べて、異種ヌクレオチド配列のより強力な、またはより高いレベルの発現がもたらされる。したがって、異種ヌクレオチド配列の高レベルの発現が望ましい場合は、より小さい番号の位置に異種ヌクレオチドを挿入し、または付加することが、本発明の好ましい実施形態である。
理論に拘泥するわけではないが、異種配列を挿入または付加する位置は、組換えまたはキメラウイルスの複製速度に影響を及ぼす。異種配列を、ウイルスゲノムの位置2または位置1に挿入または付加する場合に、より速い速度の複製を達成することができる。異種配列が位置3、位置4、位置5、または位置6に挿入または付加される場合に、複製の速度は低減する。
理論に拘泥するわけではないが、ウイルスの遺伝子と異種配列との間の遺伝子間領域のサイズは、ウイルスの複製の速度、および異種配列の発現レベルを更に決定する。
ある種の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、2つ以上の異なる異種ヌクレオチド配列を含む。好ましい一実施形態では、異種ヌクレオチド配列の1つはウイルスゲノムの位置1にあり、第2の異種ヌクレオチドは位置2にある。別の好ましい実施形態では、異種ヌクレオチド配列の1つはウイルスゲノムの位置1にあり、第2の異種ヌクレオチド配列は位置3にある。更に別の好ましい実施形態では、1つの異種ヌクレオチド配列はウイルスゲノムの位置2にあり、第2の異種ヌクレオチドは位置3にある。ある他の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムの、他の、高番号位置に挿入される。本発明によると、異種配列の位置は、配列がウイルスゲノムから転写される順番を意味し、例えば、位置1の異種配列は、ゲノムから転写されるべき最初の遺伝子の配列である。
ウイルスベクターの選択は、ウイルス感染を治療し、またはウイルス感染から保護すべき対象の種に依存することがある。対象がヒトの場合は、弱毒化した哺乳動物のメタニューモウイルスまたはトリのニューモウイルスを用いて抗原の配列を提供することができる。
本発明によると、ウイルスベクターを操作して、哺乳動物のメタニューモウイルス、ヒトのメタニューモウイルス、MPV変異体A1、A2、B1、またはB2に由来する配列;APVのサブグループA、B、C、またはDを含む(Cが好ましいが)トリのニューモウイルスに由来する配列を含む、メタニューモウイルスによる感染からの保護を与える抗原配列を提供することができる。ウイルスベクターを操作して、インフルエンザ、RSV、またはPIV3を含むPIVを含むネガティブセンスRNAウイルスを含めた別のウイルスによる感染または疾患からの保護を与える抗原の配列を提供することができる。ウイルスベクターを操作して、1つ、2つ、3つ、またはそれ以上の抗原の配列を提供してもよい。本発明によると、抗原の配列は、同じウイルスに由来してもよく、同じタイプのウイルスの異なる株もしくは変異体に由来してもよく、またはモルビリウイルスを含む異なるウイルスに由来してもよい。
本発明のある種の実施形態では、本発明のウイルスゲノム中に挿入すべき異種ヌクレオチド配列は、メタニューモウイルスに由来する。本発明のある特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ヒトのメタニューモウイルスに由来する。別の特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、トリのニューモウイルスに由来する。より詳しくは、本発明の異種ヌクレオチド配列は、ヒトのメタニューモウイルスのF遺伝子をコードする。より詳しくは、本発明の異種ヌクレオチド配列は、ヒトのメタニューモウイルスのG遺伝子をコードする。より詳しくは、本発明の異種ヌクレオチド配列は、トリのニューモウイルスのF遺伝子をコードする。より詳しくは、本発明の異種ヌクレオチド配列は、トリのニューモウイルスのG遺伝子をコードする。特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、配列番号1から配列番号5まで、配列番号14、および配列番号15の任意の1つであることができる。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号6から配列番号13まで、配列番号16、および配列番号17の任意の1つのタンパク質をコードする。
本発明の特定の一実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、キメラFタンパク質をコードする。例示的な一実施形態では、キメラFタンパク質の外部ドメインは、ヒトのMPVの外部ドメインであり、膜貫通ドメインおよび内腔ドメインはトリのメタニューモウイルスのFタンパク質に由来する。理論に拘泥するわけではないが、ヒトの外部ドメインおよびトリの内腔/膜貫通ドメインからなるキメラFタンパク質をコードするキメラヒトMPVは、Fタンパク質のトリ性部分のために弱毒化されるが、それでもヒトの外部ドメインのためにhMPVに対して高度に免疫原性である。
ある種の実施形態では、2つの異なる異種ヌクレオチド配列が、本発明のウイルスベクターに挿入または付加され、哺乳動物およびトリを含むメタニューモウイルスゲノムに由来する。例えば、異種ヌクレオチド配列は、ヒトのメタニューモウイルス、トリのニューモウイルス、RSV、PIV、またはインフルエンザに由来する。好ましい一実施形態では、異種配列は、それぞれ、ヒトのメタニューモウイルス、トリのニューモウイルス、RSV、またはPIVのFタンパク質をコードする。別の実施形態では、異種配列は、インフルエンザのHAタンパク質をコードする。
ある種の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、2つの異なる異種ヌクレオチド配列を含み、この場合、第1の異種ヌクレオチド配列は、ヒトのメタニューモウイルスまたはトリのニューモウイルスなどのメタニューモウイルスに由来し、第2のヌクレオチド配列は呼吸器合胞体ウイルスに由来する(表2を参照されたい)。特定の実施形態では、呼吸器合胞体ウイルス由来の異種ヌクレオチド配列は、呼吸器合胞体ウイルスのF遺伝子である。他の特定の実施形態では、呼吸器合胞体ウイルスに由来する異種ヌクレオチド配列は、呼吸器合胞体ウイルスのG遺伝子である。特定の一実施形態では、メタニューモウイルスに由来する異種ヌクレオチド配列は、呼吸器合胞体ウイルスに由来する異種ヌクレオチド配列よりも小さい番号の位置に挿入される。別の特定の実施形態では、メタニューモウイルスに由来する異種ヌクレオチド配列は、呼吸器合胞体ウイルスに由来する異種ヌクレオチド配列よりも大きい番号の位置に挿入される。
ある種の実施形態では、本発明のウイルスは、2つの異なる異種ヌクレオチド配列を含み、この場合、第1の異種ヌクレオチド配列は、ヒトのメタニューモウイルスまたはトリのニューモウイルスなどのメタニューモウイルスに由来し、第2のヌクレオチド配列は、それだけには限定されないがPIV3などのパラインフルエンザウイルスに由来する(表2を参照されたい)。特定の実施形態では、PIVに由来する異種ヌクレオチド配列は、PIVのF遺伝子である。他の特定の実施形態では、PIVに由来する異種ヌクレオチド配列は、PIVのG遺伝子である。特定の一実施形態では、メタニューモウイルスに由来する異種ヌクレオチド配列は、PIVに由来する異種ヌクレオチド配列よりも小さい番号の位置に挿入される。別の特定の実施形態では、メタニューモウイルスに由来する異種ヌクレオチド配列は、PIVに由来する異種ヌクレオチド配列よりも大きい番号の位置に挿入される。
本発明によって得られた、発現産物、および/または組換えもしくはキメラウイルス粒子を、ワクチン製剤に利用すると有利であり得る。本発明の発現産物およびキメラウイルス粒子を操作して、ウイルスおよび細菌抗原、腫瘍抗原、アレルゲン抗原、および自己免疫疾患に関与する自己抗原を含む、広範囲の病原体に対するワクチンを作製してもよい。特に、本発明のキメラウイルス粒子を操作して、PIV、RSV、および/またはメタニューモウイルス感染症から対象を保護するためのワクチンを作製してもよい。
別の実施形態では、本発明のキメラウイルス粒子を操作して、抗HIVワクチンを作製してもよく、この場合、gp160から、および/またはHIVの内部タンパク質からの免疫原性のポリペプチドを操作して、糖タンパク質のHNタンパク質中に入れて、脊椎動物の体液性および細胞媒介性の免疫反応の両方を誘発することができるワクチンを構築する。更に別の実施形態では、本発明は、突然変異の抗原をコードするように操作された組換えメタニューモウイルスベクターおよびウイルスに関する。突然変異の抗原は、それが由来する野生型ウイルスのタンパク質に比べて、少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失、または付加を有する。
ある種の実施形態では、本発明は、本発明の組換えまたはキメラウイルスを含む三価のワクチンに関する。特定の実施形態では、三価ワクチンの中心として用いられるウイルスは、RSVに由来する第1の異種ヌクレオチド配列およびPIVに由来する第2の異種ヌクレオチド配列を含む、トリ/ヒトキメラメタニューモウイルスまたはヒト/トリキメラメタニューモウイルスである。例示的一実施形態では、このような三価のワクチンは、(a)トリ/ヒトキメラまたはヒト/トリキメラメタニューモウイルスのどちらを用いるかに応じて、それぞれ、ヒトメタニューモウイルスまたはトリニューモウイルスの、F遺伝子および/またはG遺伝子の遺伝子産物に、(b)RSVに由来する異種ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に、および(c)PIVに由来する異種ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に特異的である。特定の一実施形態では、第1の異種ヌクレオチド配列は、呼吸器合胞体ウイルスのF遺伝子であり、位置1に挿入され、第2の異種ヌクレオチド配列はPIVのF遺伝子であり位置3に挿入される。本発明は多くのさらなる組合せを包含し、幾つかを表2に例として示す。更に、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を用いることができる(上記を参照されたい)。幾つかのあまり好ましくない実施形態では、異種ヌクレオチド配列を、ウイルスゲノムのより大きい番号の位置に挿入することができる。
Figure 2008537482
ある種の実施形態では、本発明の発現産物、および組換えまたはキメラウイルス粒子を操作して、ウイルス抗原、腫瘍抗原、および自己免疫疾患に関与する自己抗原を含めた広範囲の病原体に対するワクチンを作製することができる。この目標を達成する一方法は、既存のメタニューモウイルス遺伝子を、それらのそれぞれの外部ドメインに外来配列を含むように改変することを含む。異種配列が病原体のエピトープまたは抗原である場合は、これらのキメラウイルスを用いて、これらの決定基が由来する該病原体に対して防御免疫反応を誘発し得る。
したがって、本発明は、広範囲のウイルスおよび/または抗原に対するワクチンを製剤化するための、ウイルスベクター、および組換えまたはキメラウイルスの使用に関する。本発明のウイルスベクターおよびキメラウイルスを用いて、体液性免疫反応を刺激し、細胞性免疫反応を刺激し、または抗原に対する抵抗性を刺激することによって、対象の免疫系をモジュレートしてもよい。本明細書で用いられる対象は、ヒト、霊長動物、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、トリ種、および齧歯動物を意味する。
本発明は、限定的ではなく、記載の目的だけのために、以下の段階に分類することができる:(a)組換えcDNAおよびRNA鋳型の構築、(b)組換えcDNAおよびRNA鋳型を用いた異種遺伝子産物の発現、(c)組換えウイルス粒子における異種遺伝子のレスキュー、および(d)本発明の組換えウイルス粒子を含むワクチンの産生および使用。
5.4 組換えcDNAおよびRNAの構築
ある種の実施形態では、ウイルスベクターは、本発明のヒトまたは哺乳動物のメタニューモウイルスゲノムに由来する。他の実施形態では、ウイルスベクターは、トリのニューモウイルスゲノムに由来する。ある種の実施形態では、ウイルスベクターは哺乳動物MPVおよびAPVに由来する配列を含み、したがってウイルスベクターはキメラのヒトMPV/APVウイルスをコードする。例示的一実施形態では、ヒトのメタニューモウイルスのF遺伝子および/またはG遺伝子は、トリのニューモウイルスのF遺伝子および/またはG遺伝子で置換されて、キメラhMPV/APVウイルスを構築する。他の実施形態では、ウイルスベクターはAPVおよび哺乳動物MPVに由来する配列を含み、したがってウイルスベクターはキメラAPV/hMPVウイルスをコードする。より例示的な実施形態では、トリのニューモウイルスのF遺伝子および/またはG遺伝子は、ヒトのメタニューモウイルスのF遺伝子および/またはG遺伝子で置換されて、キメラAPV/hMPVウイルスを構築する。
本発明は、ウイルスゲノムに内在する、すなわち天然の配列を含む哺乳動物MPVまたはAPVのゲノムに由来し、かつ該ウイルスゲノムに非天然の配列を含んでもよく、または含まなくてもよいウイルスベクターを含む組換えウイルスも包含する。非天然の配列には、表現型の変更をもたらしてもよく、またはもたらさなくてもよい、天然または内在の配列と異なるものを含む。本発明の組換えウイルスは、ワクチン製剤での使用により適切な表現型、例えば、弱毒表現型、または抗原性の増強を有するウイルスをもたらす配列を含んでもよい。突然変異および修飾は、ウイルスの、コード領域に、遺伝子間領域に、ならびにリーダー配列およびトレーラー配列におけるものであってよい。
ある種の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、hMPV、APV、hMPV/APV、またはAPV/hMPVに由来するヌクレオチド配列を含み、天然のヌクレオチド配列が異種配列で置換され、または異種配列が天然のメタニューモウイルスの配列に付加されている。
より詳しい一実施形態では、キメラウイルスは、PIVに由来する異種配列が付加されているMPV、APV、APV/hMPV、またはhMPV/APVに由来するウイルスベクターを含む。より詳しい一実施形態では、組換えウイルスは、PIVに由来する異種配列によって配列が置換されているMPV、APV、APV/hMPV、またはhMPV/APV由来のウイルスベクターを含む。他の特定の実施形態では、キメラウイルスは、RSVに由来する異種配列が付加されているMPV、APV、APV/hMPV、またはhMPV/APVに由来するウイルスベクターを含む。より詳しい一実施形態では、キメラウイルスは、RSVに由来する異種配列によって配列が置換されているMPV、APV、APV/hMPV、またはhMPV/APVに由来するウイルスベクターを含む。
ウイルスポリメラーゼ結合性部位/プロモーターの相補体が隣接する異種遺伝子コード配列、例えば、本発明の3'-hMPVウイルス末端の相補体、または3'-および5'-hMPVウイルス末端両方の相補体を、当技術分野で公知の技術を用いて構築してもよい。より詳しい実施形態では、本発明の組換えウイルスは、hMPVまたはAPVのリーダー配列およびトレーラー配列を含む。ある種の実施形態では、遺伝子間領域を、hMPVまたはAPVから得る。得られたRNA鋳型は、ネガティブ極性のものであってよく、ウイルスRNA合成装置が鋳型を認識できるようにする好適な末端配列を含んでいてよい。あるいは、ウイルスRNA合成装置が鋳型を認識できるようにする好適な末端配列を含むポジティブ極性のRNA鋳型も用いてもよい。これらのハイブリッド配列を含む組換えDNA分子をクローニングし、バクテリオファージT7、T3、SP6ポリメラーゼ、またはポリメラーゼIなどの真核生物のポリメラーゼなどのDNA依存RNAポリメラーゼによって転写して、ウイルスポリメラーゼの認識および活性を可能にする好適なウイルス配列を有する組換えRNA鋳型を、in vitroまたはin vivoで生成することができる。より詳しい一実施形態では、RNAポリメラーゼは、鶏痘ウイルスT7のRNAポリメラーゼ、またはMVA T7のRNAポリメラーゼである。
これらのハイブリッド分子を構築するための例示の一手法は、ウイルスポリメラーゼ活性に必要とされるウイルス配列、即ち、以降ウイルスポリメラーゼ結合性部位と呼ばれるウイルスのポリメラーゼ結合性部位/プロモーター、およびポリアデニル化部位が、異種配列に隣接するように、異種ヌクレオチド配列を、hMPV、APV、APV/hMPV、またはhMPV/APVゲノムのDNA相補体中に挿入することである。好ましい一実施形態では、異種性コード配列は、5'および3'末端の複製プロモーター、遺伝子開始配列および遺伝子末端配列、ならびに5'および/または3'末端に見られるパッケージングシグナル、を含むウイルス配列によって隣接される。代替の手法では、ウイルスポリメラーゼ結合性部位をコードするオリゴヌクレオチド、例えば、3'末端、またはウイルスゲノムのセグメントの両末端の相補体を異種性コード配列に連結してハイブリッドの分子を構築することができる。外来遺伝子または外来遺伝子のセグメントの標的配列内での配置は、標的配列内の好適な制限酵素部位の存在によって、以前に指示されている。しかし、分子生物学における最近の進歩により、この問題は大幅に低減された。制限酵素部位は、部位特異的突然変異誘発の使用により、標的配列内の任意の場所に容易に配置することができる(例えば、Kunkel、1985年、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、82巻、488頁に記載されている技術を参照されたい)。また下記に記載したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術の変形により、配列(即ち、制限酵素部位)の特異的挿入が可能になり、ハイブリッド分子の容易な構築が可能になっている。あるいは、PCR反応を用いて、クローニングの必要なしに組換え鋳型を調製することができる。例えば、PCR反応を用いて、DNA依存RNAポリメラーゼプロモーターを含む2重鎖DNA分子(例えば、バクテリオファージT3、T7、またはSP6)、ならびに異種遺伝子およびPIVポリメラーゼ結合性部位を含むハイブリッドの配列を調製することができる。次いで、RNA鋳型を、この組換えDNAから直接転写することができる。更に別の実施形態では、組換えRNA鋳型を、RNAリガーゼを用いて、異種遺伝子のネガティブ極性を特定するRNAとウイルスポリメラーゼ結合性部位とを連結することにより調製することができる。
更に、ウイルスのレスキューを得るのに重要であり得る「6のルール(Rule of Six)」を順守するために、1つまたは複数のヌクレオチドを非翻訳領域に加えることができる。「6のルール」は、多くのパラミクソウイルスに当てはまり、RNAヌクレオチドゲノムが機能的であるためには6で割り切れるはずであることを示している。ヌクレオチドの付加は、Quik Change突然変異誘発キット(Stratagene)などの市販の突然変異誘発キットを用いるなど、当技術分野で公知の技術によって遂行することができる。好適な数のヌクレオチドを付加した後、次いで、正確なDNA断片を、好適な制限酵素での消化およびゲル精製によって単離することができる。ウイルスのポリメラーゼ活性に対する配列の必要性、および本発明に従って用いることができる構築体については、以下のサブセクションに記載する。
理論に拘泥するわけではないが、幾つかのパラメーターが、組換えウイルスの複製の速度、および異種配列の発現のレベルに影響を及ぼす。特に、hMPV、APV、hMPV/APV、またはAPV/hMPVにおける異種配列の位置、および異種配列に隣接する遺伝子間領域の長さは、異種配列の複製の速度および発現レベルを決定する。
ある種の実施形態では、ウイルスのリーダー配列、および またはトレーラー配列を、野生型のウイルスに対して改変する。より詳しいある種の実施形態では、リーダーおよび/またはトレーラーの長さを変える。他の実施形態では、リーダーおよび/またはトレーラーの配列を、野生型のウイルスに対して変異させる。より詳しくは、第5.7節を参照されたい。
本発明の組換えウイルスの生成は、ネガティブセンスウイルスRNA(vRNA)ゲノムまたはその相補コピー(cRNA)の、一部または全長のコピーの複製に依存する。このvRNAまたはcRNAは、感染性ウイルスから単離され、in-vitroの転写時に生成され、または核酸の形質移入時に細胞で生成され得る。第2に、組換えネガティブ鎖ウイルスの生成は、機能的ポリメラーゼ複合体に依存する。典型的には、ニューモウイルスのポリメラーゼ複合体は、N、P、L、およびおそらくM2タンパク質からなるが、必ずしもこれらに限定されない。
ポリメラーゼ複合体、またはその構成成分を、ウイルス粒子から単離し、1つもしくは複数の構成成分を発現する細胞から単離し、または特異的な発現ベクターの形質移入時に生成することができる。
MPVの感染性のコピーは、上記で述べたvRNA、cRNA、またはこれらのRNAを発現するベクターが、上記に述べたポリメラーゼ複合体16によって複製される場合に、得ることができる(Schnellら、1994年、EMBO J、13巻、4195〜4203頁;Collinsら、1995年、PNAS、92巻、11563〜11567頁;Hoffmannら、2000年、PNAS、97巻、6108〜6113頁;Bridgenら、1996年、PNAS、93巻、15400〜15404頁;Paleseら、1996年、PNAS、93巻、11354〜11358頁;Peetersら、1999年、J.Virol.、73巻、5001〜5009頁;Durbinら、1997年、Virology、235巻、323〜332頁)。
本発明は、本発明による核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。MPVのポリメラーゼ構成成分を含むプラスミドまたはウイルスベクター(おそらく、N、P、L、およびM2であるが、必ずしもこれらに限定されない)を、関連する細胞型(細菌、昆虫細胞、真核細胞)で構成成分を発現するため原核細胞で産生する。MPVのゲノムの全長または部分のコピーを含むプラスミドまたはウイルスベクターを、in-vitroまたはin-vivoでウイルスの核酸を発現するための原核細胞で産生する。後者のベクターは、キメラウイルスまたはキメラウイルスタンパク質を産生するための他のウイルスの配列を含むことがあり、複製の欠損したウイルスを産生するためのウイルスゲノムの部分を欠くことがあり、弱毒ウイルスを産生するための突然変異、欠失、または挿入を含むことがある。
MPVの感染性のコピー(野生型、弱毒化、複製欠損、またはキメラである)を、上記に記載した最先端の技術に従って、ポリメラーゼの構成成分の共発現時に生成することができる。
更に、1つまたは複数の全長または部分のMPVタンパク質を一過性に、または安定して発現する真核細胞を用いることができる。このような細胞は、形質移入(タンパク質または核酸のベクター)、感染(ウイルスベクター)、または形質導入(ウイルスベクター)によって作製することができ、記載されている野生型、弱毒化、複製欠損、またはキメラウイルスの相補体形成に有用となる得る。
5.4.1 挿入すべき異種遺伝子配列
本発明に従って、本発明のウイルスベクターを更に操作して、異種配列を発現させてもよい。本発明の一実施形態では、異種配列は、ウイルスベクター以外の供給源に由来する。例示によるものであり限定的なものではないが、異種配列は、ウイルスベクターが由来する種、サブグループ、または変異体と違うメタニューモウイルスの種、サブグループ、または変異体に属するウイルスの抗原のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする。例示によるものであり限定的なものではないが、異種配列は、メタニューモウイルス以外のウイルスの抗原のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする。例示によるものであり限定的なものではないが、異種配列の起源はウイルスではない。この実施形態によると、異種配列は、望ましい生物学的性質または活性を有する部分、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードしてもよい。このような異種配列は、タグまたはマーカーをコードしてもよい。このような異種配列は、生物学的応答修飾因子をコードしてもよく、その例には、リンホカイン、インターロイキン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、および顆粒球コロニー刺激因子が含まれる。
ある種の実施形態では、挿入すべき異種ヌクレオチド配列は、メタニューモウイルスに由来する。より詳しくは、挿入すべき異種ヌクレオチド配列は、ヒトのメタニューモウイルスおよび/またはトリのニューモウイルスに由来する。
ある種の実施形態では、異種配列は、PIVヌクレオカプシドリンタンパク質、PIV Lタンパク質、PIVマトリックスタンパク質、PIV HN糖タンパク質、PIV RNA依存RNAポリメラーゼ、PIV Y1タンパク質、PIV Dタンパク質、PIV Cタンパク質、PIV Fタンパク質、またはPIV Pタンパク質をコードする。ある種の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、PIVヌクレオカプシドリンタンパク質、PIV Lタンパク質、PIVマトリックスタンパク質、PIV HN糖タンパク質、PIV RNA依存RNAポリメラーゼ、PIV Y1タンパク質、PIV Dタンパク質、PIV Cタンパク質、PIV Fタンパク質、またはPIV Pタンパク質に、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同であるタンパク質をコードする。異種配列は、PIV1型、PIV2型、またはPIVタイプ3から得ることができる。より詳しい実施形態では、異種配列は、ヒトPIV1型、PIV2型、またはPIVタイプ3から得られる。他の実施形態では、異種配列はRSV核タンパク質、RSVリンタンパク質、RSVマトリックスタンパク質、RSV小型疎水性タンパク質、RSV RNA依存RNAポリメラーゼ、RSV Fタンパク質、RSV Gタンパク質、またはRSV M2-1もしくはM2-2タンパク質をコードする。ある種の実施形態では、異種配列は、RSV核タンパク質、RSVリンタンパク質、RSVマトリックスタンパク質、RSV小型疎水性タンパク質、RSV RNA依存RNAポリメラーゼ、RSV Fタンパク質、またはRSV Gタンパク質に、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同であるタンパク質をコードする。異種配列は、RSVサブタイプA、およびRSVサブタイプBから得ることができる。より詳しい実施形態では、異種配列は、ヒトRSVサブタイプAおよびRSVサブタイプBから得る。他の実施形態では、異種配列は、APV核タンパク質、APVリンタンパク質、APVマトリックスタンパク質、APV小型疎水性タンパク質、APV RNA依存RNAポリメラーゼ、APV Fタンパク質、APV Gタンパク質、またはAPV M2-1もしくはM2-2タンパク質をコードする。ある種の実施形態では、異種配列は、APV核タンパク質、APVリンタンパク質、APVマトリックスタンパク質、APV小型疎水性タンパク質、APV RNA依存RNAポリメラーゼ、APV Fタンパク質、またはAPV Gタンパク質に、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同であるタンパク質をコードする。トリのニューモウイルスは、APVサブグループA、APVサブグループB、またはAPVサブグループCであることができる。他の実施形態では、異種配列は、hMPV核タンパク質、hMPVリンタンパク質、hMPVマトリックスタンパク質、hMPV小型疎水性タンパク質、hMPV RNA依存RNAポリメラーゼ、hMPV Fタンパク質、hMPV Gタンパク質、またはhMPV M2-1もしくはM2-2をコードする。ある種の実施形態では、異種配列は、hMPV核タンパク質、hMPVリンタンパク質、hMPVマトリックスタンパク質、hMPV小型疎水性タンパク質、hMPV RNA依存RNAポリメラーゼ、hMPV Fタンパク質、またはhMPV Gタンパク質に、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%相同であるタンパク質をコードする。ヒトのメタニューモウイルスは、hMPV変異株A1、hMPV変異株A2、hMPV変異株B1、またはhMPV変異株B2であることができる。
ある種の実施形態では、PIV、RSV、ヒトのメタニューモウイルス、またはトリのニューモウイルスからの異なる異種配列の任意の組合せを、本発明のウイルス中に挿入することができる。
本発明のある好ましい実施形態では、挿入すべき異種ヌクレオチド配列は、RSV、PIV、APV、またはhMPVからのF遺伝子に由来する。
ある種の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、キメラタンパク質をコードする。より詳しい実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、RSV、PIV、APV、またはhMPVのキメラFタンパク質をコードする。キメラFタンパク質は、ヒトのメタニューモウイルス、トリのニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、およびパラインフルエンザウイルスなどの異なるウイルスからのFタンパク質の部分を含むことができる。ある他の実施形態では、異種配列は、キメラGタンパク質をコードする。キメラGタンパク質は、ヒトのメタニューモウイルス、トリのニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、およびパラインフルエンザウイルスなどの異なるウイルスからのGタンパク質の部分を含む。特定の一実施形態では、Fタンパク質は、メタニューモウイルスのFタンパク質の外部ドメイン、パラインフルエンザウイルスのFタンパク質の膜貫通ドメイン、およびパラインフルエンザウイルスのFタンパク質の内腔ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、本発明の異種ヌクレオチド配列は、配列番号1〜配列番号5、配列番号14、および配列番号15のうち任意の1つである。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号6〜配列番号13、配列番号16、および配列番号17のうち任意の1つのタンパク質をコードする。
呼吸器合胞体ウイルスに由来する異種ヌクレオチド配列については、例えば、その全文が参照として本明細書に組み入れられるPCT/US98/20230を参照されたい。
好ましい一実施形態では、本発明の組換えウイルス中に発現され得る異種遺伝子配列には、それだけには限定されないが、インフルエンザの糖タンパク質、特に、赤血球凝集素H5、H7、呼吸器合胞体ウイルスのエピトープ、ニューカッスル病ウイルスのエピトープ、センダイウイルス、および感染性の喉頭気管炎ウイルス(ILV)など呼吸器疾患をもたらすウイルスの抗原性エピトープおよび糖タンパク質が含まれる。好ましい一実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、RSVまたはPIVに由来する。本発明の更に別の実施形態では、本発明のキメラウイルス中に操作して入れることができる異種遺伝子配列には、それだけには限定されないが、B型肝炎ウイルス表面抗原、エプスタイン・バーウイルスのAもしくはC型肝炎ウイルス表面糖タンパク質、ヒトパピローマウイルスの糖タンパク質、シミアンウイルス5もしくはおたふくかぜウイルス、ウェストナイルウイルス、デングウイルス、ヘルペスウイルスの糖タンパク質、ポリオウイルスのVPI、およびレンチウイルス、好ましくは、それだけには限定されないが、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)1型または2型に由来する配列などの、ウイルスのエピトープおよびウイルスの糖タンパク質が含まれる。更に別の実施形態では、本発明のキメラウイルス中に操作して入れることができる異種遺伝子配列には、それだけには限定されないが、マレック病ウイルス(MDV)のエピトープ、感染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のエピトープ、ニワトリ貧血ウイルスのエピトープ、感染性の喉頭気管支炎ウイルス(ILV)、トリインフルエンザウイルス(AIV)、狂犬病、ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、および豚痘ウイルスが含まれる(その全文が参照として本明細書に組み入れられる、Fieldsら(編集)、1991年、Fundamental Virology、第2版、Raven Press、New Yorkを参照されたい)。
本発明の他の異種配列には、自己免疫疾患に特徴的な抗原が含まれる。これらの抗原は、典型的には、哺乳動物の組織の細胞表面、細胞質、核、ミトコンドリアなどに由来し、真性糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、悪性貧血、アジソン病、強皮症、自己免疫性萎縮性胃炎、若年性糖尿病、および円板状エリテマトーデスに特徴的な抗原が含まれる。
アレルゲンである抗原には、花粉、ダスト、カビ、胞子、フケ、昆虫、および食品に由来する抗原を含む、タンパク質または糖タンパク質が一般に含まれる。更に、腫瘍抗原に特徴的な抗原は、典型的に腫瘍組織の細胞の、細胞表面、細胞質、核、細胞小器官などに由来する。例として、突然変異した発癌遺伝子によってコードされたタンパク質、腫瘍に関連するウイルスのタンパク質、および糖タンパク質を含む、腫瘍のタンパク質に特徴的な抗原が含まれる。腫瘍には、それだけには限定されないが、唇、上咽頭、咽頭および口腔、食道、胃、結腸、直腸、肝臓、胆嚢、膵臓、喉頭、肺および気管支、皮膚のメラノーマ、乳房、頚部、子宮(uterine)、卵巣、膀胱、腎臓、子宮(uterus)、脳および神経系の他の部分、甲状腺、前立腺、精巣、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、および白血病、の癌のタイプに由来するものが含まれる。
本発明の特定の一実施形態では、異種配列は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、好ましくはヒト免疫不全ウイルス1型、またはヒト免疫不全ウイルス2型のゲノムに由来する。本発明の別の実施形態では、異種性のコード配列を、メタニューモウイルスのタンパク質内に異種性のペプチド配列を含むキメラ遺伝子産物が発現されるように、ウイルスの中心の遺伝子コード配列内に挿入してもよい。本発明のそのような実施形態では、また、異種配列は、ヒト免疫不全ウイルス、好ましくはヒト免疫不全ウイルス1型、またはヒト免疫不全ウイルス2型のゲノムに由来してもよい。
異種配列がHIVに由来する場合は、そのような配列には、それだけには限定されないが、env遺伝子(即ち、gp160、gp120、および/またはgp41の全てまたは部分をコードする配列)、pol遺伝子(即ち、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、および/またはインテグラーゼの全てまたは部分をコードする配列)、gag遺伝子(即ち、p7、p6、p55、p17/18、p24/25の全てまたは部分をコードする配列)、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、ならびに/あるいはvpxに由来する配列が含まれ得る。
更に別の実施形態では、キメラウイルス中に操作して入れることができる異種遺伝子配列には、免疫強化活性のあるタンパク質をコードするものが含まれる。免疫強化のタンパク質の例には、それだけには限定されないが、サイトカイン、インターフェロン1型、ガンマインターフェロン、コロニー刺激因子、およびインターロイキン-1、-2、-4、-5、-6、-12が含まれる。
更に、キメラウイルス中に操作して入れることができる他の異種遺伝子配列には、細菌の表面の糖タンパク質、真菌に由来する抗原、ならびに様々な他の病原体および寄生体に由来する抗原など、細菌に由来する抗原が含まれる。細菌の病原体に由来する異種遺伝子配列の例には、それだけには限定されないが、以下の属の種:サルモネラ属(Salmonella)、赤痢菌属(Shigella)、クラミジア属(Chlamydia)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、エルシニア属(Yersinia)、ボルダテラ属(Bordatella)、シュードモナス属(Pseudomonas)、ナイセリア属(Neisseria)、ビブリオ属(Vibrio)、ヘモフィルス属(Haemophilus)、マイコプラズマ属(Mycoplasma)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、トレポネーマ属(Treponema)、コクシエラ属(Coxiella)、エーリキア属(Ehrlichia)、ブルセラ属(Brucella)、ストレプトバチルス属(Streptobacillus)、紡錘菌スピロヘータ属(Fusospirocheta)、スピリルム属(Spirillum)、ウレアプラズマ属(Ureaplasma)、スピロヘータ属(Spirochaeta)、マイコプラズマ属(Mycoplasma)、放線菌類(Actinomycetes)、ボレリア属(Borrelia)、バクテロイデス(Bacteroides)、トリコモナス属(Trichomoras)、ブランハメラ属(Branhamella)、パスツレラ属(Pasteurella)、クロストリジウム属(Clostridium)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、リステリア属(Listeria)、バチルス属(Bacillus)、エリジペロスリックス属(Erysipelothrix)、ロドコッカス属(Rhodococcus)、大腸菌属(Escherichia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、シュードモナス属(Pseudomanas)、エンテロバクター属(Enterobacter)、セラチア属(Serratia)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)、連鎖球菌属(Streptococcus)、レジオネラ属(Legionella)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、プロテウス属(Proteus)、カンピロバクター属(Campylobacter)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、モルガネラ属(Morganella)、モラキセラ属(Moraxella)、シトロバクター(Citrobacter)、リケッチア(Rickettsia)、ロクリミアエ(Rochlimeae);ならびに緑膿菌(P. aeruginosa)、大腸菌(E. coli)、シュードモナスセパシア(P. cepacia)、表皮ブドウ球菌(S. epidermis)、エンテロコッカスフェカリス(E. faecalis)、肺炎連鎖球菌(S. pneumonias)、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、髄膜炎菌(N.meningitides)、化膿連鎖球菌(S. pyogenes)、パスツレラマルトシダ(Pasteurella multocida)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、およびプロテウスミラビリス(P. mirabilis)などの細菌の種に由来する抗原が含まれる。
病原性の真菌に由来する異種遺伝子配列の例には、それだけには限定されないが、クリプトコッカスネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ブラストミセスデルマチチジス(Blastomyces dermatitidis)、アジエロミセスデルマチチジス(Aiellomyces dermatitidis);ヒストプラスマカプスラーツム(Histoplasma capsulatum);コクシジオイデスイミティス(Coccidioides immitis);カンジダアルビカンス(C. albicans)、カンジダトロピカリス(C. tropicalis)、カンジダパラシローシス(C. parapsilosis)、カンジダギリエルモンジィ(C. guilliermondii)、およびカンジダクルセイ(C. krusei)を含むカンジダ(Candida)種;アスペルギルスフミガーツス(A. fumigatus)、黄色コウジ菌(A. flavus)、およびクロカビ(A. niger)を含むアスペルギルス属(Aspergillus);クモノスカビ(Rhizopus)種;リゾムコール(Rhizomucor)種;クスダマカビ(Cunninghammella)種;アポフィソミセスサクセナエア(A. saksenaea)、アポフィソミセスムコール(A. mucor)、およびアポフィソミセスアブシディア(A. absidia)を含むアポフィソミセス(Apophysomyces)種;スポロトリクスシェンキー(Sporothrix schenckii)、ブラジルパラコクシジオイデス(Paracoccidioides brasiliensis);シュードアレシェリアボイディイ(Pseudallescheria boydii)、トルロプシスグラブラタ(Torulopsis glabrata);白癬菌(Trichophyton)種、小胞子菌(Microsporum)種、およびダーマトフィレス(Dermatophyres)種、ならびに病原性であると現在知られており、または後に同定された任意の他の酵母または真菌などの真菌に由来する抗原が含まれる。
最後に、寄生虫に由来する異種遺伝子配列の例には、それだけには限定されないが、例えば、バベシア属(Babesia)、トキソプラズマ(Toxoplasma)、プラスモディウム(Plasmodium)、アイメリア属(Eimeria)、イソスポラ属(Isospora)、アトキソプラズマ属(Atoxoplasma)、シストイソスポラ(Cystoisospora)、ハモンディア(Hammondia)、ベスニオチア(Besniotia)、サルコシスティス属(Sarcocystis)、フレンケリア(Frenkelia)、ヘモプロテウス属(Haemoproteus)、ロイコシトゾーン属(Leucocytozoon)、タイレリア属(Theileria)、ペルキンスス(Perkinsus)、および簇虫属(Gregarina)種などのアピコンプレックス門(Apicomplexa phylum)のメンバー;ニューモシスチスカリニ(Pneumocystis carinii);例えば、ノセマ属(Nosema)、エンテロシトゾーン属(Enterocytozoon)、脳炎性胞子虫属(Encephalitozoon)、セプタータ(Septata)、ムラゼキア(Mrazekia)、アンブリオスポラ(Amblyospora)、アメソン(Ameson)、グルゲア(Glugea)、プリストフォーラ(Pleistophora)、およびミクロスポリジウム(Microsporidium)種などの微胞子虫門(Microspora phylum)のメンバー;ならびに、例えば、ハプロスポリジウム(Haplosporidium)種などのアセトスポラ門(Ascetospora phylum)、および熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(P. vivax)、卵形マラリア原虫(P.ovale)、四日熱マラリア原虫(P. malaria)を含む種;トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii);メキシコリーシュマニア(Leishmania mexicana)、リーシュマニアトロピカ(L. tropica)、森林型熱帯リーシュマニア(L. major)、エチオピアリーシュマニア(L. aethiopica)、ドノバンリーシュマニア(L. donovani)、クルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)、ブルーストリパノソーマ(T. brucei)、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)、ビルハルツ住血吸虫(S. haematobium)、日本住血吸虫(S. japonium);旋毛虫(Trichinella spiralis);バンクロフト糸状虫(Wuchereria bancrofti);マレー糸状虫(Brugia malayli); 赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica);ギョウチュウ(Enterobius vermiculoarus);有鉤条虫(Taenia solium)、無鉤条虫(T. saginata)、膣トリコモナス(Trichomonas vaginatis)、腸トリコモナス(T. hominis)、口腔トリコモナス(T. tenax);ランブル鞭毛虫(Giardia lamblia); クリプトスポリジウムパルバム(Cryptosporidium parvum);ニューモシスチスカリニ(Pneumocytis carinii)、バベシアボビス(Babesia bovis)、バベシアディバージエンス(B. divergens)、バベシアミクロチ(B. microti)、戦争イソスポラ(Isospora belli)、Lホミニス(L hominis);2核アメーバ(Dientamoeba fragilis);回施糸状虫(Onchocerca volvulus);回虫(Ascaris lumbricoides); アメリカ鉤虫(Necator americanis);ズビニ鉤虫(Ancylostoma duodenale);糞線虫(Strongyloides stercoralis);フィリピン毛頭虫(Capillaria philippinensis);カントン住血線虫(Angiostrongylus cantonensis);小型条虫(Hymenolepis nana);広節裂頭条虫(Diphyllobothrium latum);単包条虫(Echinococcus granulosus)、多包条虫(E. multilocularis);ウェステルマン肺吸虫(Paragonimus westermani)、パラゴニムスカリエンシス(P. caliensis);クロノルキスシネンシス(Chlonorchis sinensis);ネコ肝吸虫(Opisthorchis felineas)、Gビベリーニ(G. Viverini)、肝蛭(Fasciola hepatica)、ヒゼンダニ(Sarcoptes scabiei)、ヒトジラミ(Pediculus humanus);フチルルスピュビス(Phthirlus pubis);およびヒトヒフバエ(Dermatobia hominis)、ならびに病原性であると現在知られている、または今後同定される任意の他の寄生体に由来する抗原が含まれる。
5.4.2 異種遺伝子配列の挿入
外来の遺伝子配列の本発明のウイルスベクター中への挿入は、ウイルスのコード領域を異種配列で完全に置換するか、またはウイルスゲノムに異種ヌクレオチド配列を加えることにより部分的に置換するかのいずれかによって遂行することができる。完全な置換は、PCR依存突然変異の使用によって遂行するのがおそらく最良である。簡潔に述べると、PCRプライマーAは、5'末端から3'末端に:クラスIIS制限酵素(即ち、特異的な配列を認識するが、DNAをその配列の上流または下流のいずれかで切断する、「シフター(shifter)」酵素)部位などの独特の制限酵素部位;置換されるべき遺伝子の領域に相補的であるひと続きのヌクレオチド;および異種配列のカルボキシ末端コード部分に相補的なひと続きのヌクレオチドを含む。PCRプライマーBは、5'末端から3'末端に:独特の制限酵素部位、置換されるべき遺伝子に相補的なひと続きのヌクレオチド;および異種遺伝子または非天然遺伝子の5'コード部分に対応するひと続きのヌクレオチドを含む。これらのプライマーを、異種遺伝子または非天然遺伝子のクローニングしたコピーと共に用いてPCR反応を行った後、産物を切り出し、独特の制限部位を用いてクローニングすることができる。クラスIIS酵素で消化し、精製したファージポリメラーゼで転写すると、今度は異種遺伝子または非天然遺伝子の挿入を保有するウイルスの遺伝子の正確な非翻訳末端を含むRNA分子が産生される。代替の一実施形態では、プライマー使用PCR反応を用いて、RNA鋳型がクローニングなしで直接転写され得るように、バクテリオファージのプロモーター配列、およびハイブリッドの遺伝子配列を含む2重鎖のDNAを調製することができる。
異種ヌクレオチド配列を、本発明のウイルスの様々な位置に付加または挿入することができる。一実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置1に付加または挿入する。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置2に付加または挿入する。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置3に付加または挿入する。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置4に付加または挿入する。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置5に付加または挿入する。更に別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置6に付加または挿入する。本明細書に用いられる語である「位置」は、転写されるべきウイルスゲノム上の異種ヌクレオチド配列の位置を意味し、例えば、位置1は、転写されるべき第1の遺伝子であることを意味し、位置2は、転写されるべき第2の遺伝子であることを意味する。ウイルスのより小さい番号の位置に異種ヌクレオチド配列を挿入することにより、ウイルスゲノムにわたって生じる転写勾配のため、より大きい番号の位置に挿入するのに比べて異種ヌクレオチド配列のより強い発現が一般的にもたらされる。しかし、転写勾配は、ウイルスmRNAの特定比率も生じる。外来の遺伝子を挿入することによりこれらの比率を乱し、様々な量のウイルスのタンパク質の合成をもたらし、これはウイルスの複製に影響を及ぼすことがある。したがって、挿入部位を選択する場合は、転写勾配および複製速度を考慮しなければならない。本発明の好ましい実施形態では、異種ヌクレオチド配列の強力な発現が望まれる場合は、より小さな番号の位置に異種ヌクレオチド配列を挿入する。好ましい一実施形態では、異種配列を、位置1、2、または3に付加または挿入する。
異種ヌクレオチド配列を、本発明のウイルス中に挿入する場合は、異種遺伝子のコード配列の末端と、下流の遺伝子のコード配列の開始との間の遺伝子間領域を変更して、望ましい効果を達成することができる。本明細書で用いられる語である「遺伝子間領域」は、1つの遺伝子の停止シグナルと、次の下流のオープンリーディングフレームのコード配列の開始コドン(例えば、AUG)との間のヌクレオチド配列を意味する。遺伝子間領域は、遺伝子の非コード領域、即ち、遺伝子の転写開始部位とコード配列の開始(AUG)との間を含むことができる。この非コード領域は、幾つかのウイルスの遺伝子に天然に存在する。
様々な実施形態では、異種ヌクレオチド配列と下流の遺伝子との間の遺伝子間領域を、互いに独立して、少なくとも長さ10nt、少なくとも長さ20nt、少なくとも長さ30nt、少なくとも長さ50nt、少なくとも長さ75nt、少なくとも長さ100nt、少なくとも長さ125nt、少なくとも長さ150nt、少なくとも長さ175nt、または少なくとも長さ200ntであるように操作することができる。ある種の実施形態では、異種ヌクレオチド配列と下流の遺伝子との間の遺伝子間領域を、互いに独立して、多くとも長さ10nt、多くとも長さ20nt、多くとも長さ30nt、多くとも長さ50nt、多くとも長さ75nt、多くとも長さ100nt、多くとも長さ125nt、多くとも長さ150nt、多くとも長さ175nt、または多くとも長さ200ntであるように操作することができる。様々な実施形態では、ウイルスゲノムにおける望ましい遺伝子の非コード領域を、互いに独立して、少なくとも長さ10nt、少なくとも長さ20nt、少なくとも長さ30nt、少なくとも長さ50nt、少なくとも長さ75nt、少なくとも長さ100nt、少なくとも長さ125nt、少なくとも長さ150nt、少なくとも長さ175nt、または少なくとも長さ200ntであるように操作することもできる。ある種の実施形態では、ウイルスゲノムに置ける望ましい遺伝子の非コード領域を、互いに独立して、多くとも長さ10nt、多くとも長さ20nt、多くとも長さ30nt、多くとも長さ50nt、多くとも長さ75nt、多くとも長さ100nt、多くとも長さ125nt、多くとも長さ150nt、多くとも長さ175nt、または多くとも長さ200ntであるように操作することもできる。
異種ヌクレオチド配列を挿入する場合は、位置的な効果および遺伝子間領域操作を組み合わせて用いて望ましい効果を達成することができる。例えば、異種ヌクレオチド配列を、位置1、2、3、4、5、および6からなるグループから選択される位置に付加または挿入することができ、異種ヌクレオチド配列と次の下流の遺伝子との間の遺伝子間領域を変えることができる(表3を参照されたい)。本発明が包含する幾つかの組合せを、例として表3に示す。
Figure 2008537482
挿入される異種ヌクレオチド配列の目的(例えば、強力な免疫原性を有するため)に応じて、挿入の位置および挿入された異種ヌクレオチド配列の遺伝子間領域の長さを、それだけには限定されないが、以下の非限定的なアッセイ例によって測定される、複製速度、およびタンパク質もしくはmRNAの発現レベルを含む、様々な指標によって決定することができる:プラークアッセイ、蛍光焦点法、感染中心法、形質転換法、エンドポイント希釈法、塗抹の効率、電子顕微鏡、赤血球凝集、ウイルスの酵素活性の測定、ウイルスの中和、赤血球凝集阻害、補体結合、免疫染色、免疫沈降および免疫ブロット、酵素結合免疫吸着検定法、核酸検出(例えば、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析)、増殖曲線、レポーター遺伝子の使用(例えば、タンパク質の発現を観察するために、関与している異種遺伝子と同じ様式でウイルスゲノムに組み入れられる、緑色蛍光タンパク質(GFP)もしくは強化緑色蛍光タンパク質(eGFP)などのレポーター遺伝子を用いて)、またはこれらの組合せ。これらのアッセイを行う手順は、当技術分野ではよく知られており(例えば、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、Flintら、PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL、2000年、ASM Press、25〜56頁を参照されたい)、非限定的な実施例を、下記の実施例の節に示す。
例えば、培養細胞に本発明のウイルスを感染させ、引き続きタンパク質の発現のレベルを、例えば、異種配列の遺伝子産物に特異的な抗体を用いたウェスタンブロット分析もしくはELISAによって測定することにより、または、例えば、異種配列に特異的なプローブを用いたノーザンブロット分析によってRNA発現のレベルを測定することにより発現レベルを決定することができる。同様に、動物モデルを感染させ、動物モデルで本発明の組換えウイルスの異種配列から発現されるタンパク質のレベルを測定することにより、異種配列の発現レベルを決定することができる。タンパク質のレベルを、感染させた動物から組織試料を得、次いで組織試料を、異種配列の遺伝子産物に特異的な抗体を用いたウェスタンブロット分析またはELISAにかけることにより、測定することができる。更に、動物モデルを用いる場合は、異種配列の遺伝子産物に対して動物が生成した抗体の力価を、それだけには限定されないがELISAを含む、当業者に公知の任意の技術により決定することができる。
異種配列は、ウイルスゲノムにおけるヌクレオチド配列に相同となることがあるので、プローブおよび抗体が、異種配列またはその遺伝子産物に本当に特異的であるように注意を払うべきである。
ある特定の実施形態では、トリ/ヒトキメラメタニューモウイルスからのhMPVのFタンパク質の発現レベルを、当業者に公知の任意の技術により決定することができる。Fタンパク質の発現レベルは、培養細胞を本発明のキメラウイルスに感染させ、例えば、hMPVのFタンパク質および/またはGタンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロット分析またはELISAによってタンパク質の発現のレベルを測定することにより、あるいは、例えば、ヒトのメタニューモウイルスのF遺伝子および/またはG遺伝子に特異的なプローブを用いたノーザンブロット分析によってRNAの発現レベルを測定することにより決定することができる。同様に、異種配列の発現レベルを、動物モデルを用いて、動物に感染させ、動物モデルにおけるFタンパク質および/またはGタンパク質のレベルを測定することにより、決定することができる。感染させた動物から組織試料を得、次いで組織試料を、異種配列のFタンパク質および/またはGタンパク質に特異的な抗体を用いてウェスタンブロット分析またはELISAにかけることにより、タンパク質のレベルを測定することができる。更に、動物モデルを用いる場合は、Fタンパク質および/またはGタンパク質に対して動物が生成する抗体の力価を、それだけには限定されないがELISAを含む当業者に公知の任意の技術により決定することができる。
本発明の組換えウイルスの複製速度を、当業者に公知の任意の技術により決定することができる。
ある種の実施形態では、ウイルスゲノムにおける異種配列の最適な位置、および遺伝子間領域の最適な長さの同定を促進するために、異種配列はレポーター遺伝子をコードする。最適なパラメーターを決定した後、選抜した抗原をコードする異種ヌクレオチド配列によってレポーター遺伝子を置換する。当業者に公知の任意のレポーター遺伝子を、本発明の方法で用いることができる。より詳しくは、第5.8節を参照されたい。
組換えウイルスの複製速度を、当業者に公知の任意の標準的技法によって決定することができる。複製速度は、ウイルスの増殖速度によって表され、感染後の時間に亘ってウイルスの力価をプロットすることにより決定することができる。ウイルスの力価は、当業者に公知の任意の技術により測定することができる。ある種の実施形態では、ウイルスを含む懸濁液を、ウイルスによる感染に感受性である細胞と共にインキュベートする。本発明の方法で用いることができる細胞型には、それだけには限定されないが、Vero(ベロ)細胞、LLC-MK-2細胞、Hep-2細胞、LF 1043(HEL)細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、tMK細胞、293T細胞、QT 6細胞、QT 35細胞、またはトリ胚線維芽細胞(CEF)が含まれる。ウイルスを細胞とインキュベートした後、感染細胞の数を決定する。ある特定の実施形態では、ウイルスはレポーター遺伝子を含む。したがって、レポーター遺伝子を発現する細胞の数は、感染細胞の数を表している。特定の一実施形態では、ウイルスはeGFPに対してコードする異種ヌクレオチド配列を含み、eGFPを発現する細胞の数、即ちウイルスに感染細胞の数を、FACSを用いて決定する。
ある種の実施形態では、本発明の組換えウイルスの複製速度は、同じ条件下での、組換えウイルスが由来する野生型のウイルスの複製速度の、多くとも20%である。同じ条件とは、ウイルスの初期力価が同じであり、細胞系が同じであり、インキュベーション温度、増殖培地、細胞数、および複製速度に影響を及ぼし得る他の試験条件が同じであることを意味する。例えば、APV/hMPVがPIVのF遺伝子と位置1で複製する速度は、APVの複製速度の多くとも20%である。
ある種の実施形態では、本発明の組換えウイルスの複製速度は、同じ条件下での組換えウイルスが由来する野生型のウイルスの複製速度の、多くとも5%、多くとも10%、多くとも20%、多くとも30%、多くとも40%、多くとも50%、多くとも75%、多くとも80%、多くとも90%である。ある種の実施形態では、本発明の組換えウイルスの複製速度は、同じ条件下での、組換えウイルスが由来する野生型のウイルスの複製速度の、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%である。ある種の実施形態では、本発明の組換えウイルスの複製速度は、同じ条件下での、組換えウイルスが由来する野生型のウイルスの複製速度の、5%と20%の間、10%と40%の間、25%と50%の間、40%と75%の間、50%と80%の間、または75%と90%の間である。
ある種の実施形態では、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、同じ条件下での、組換えウイルスが由来する野生型のウイルスのFタンパク質の発現レベルの、多くとも20%である。同じ条件とは、ウイルスの初期力価が同じであり、細胞系が同じであり、インキュベーション温度、増殖培地、細胞数、および複製速度に影響を及ぼし得る他の試験条件が同じであることを意味する。例えば、hMPVの位置1におけるPIV3のFタンパク質の異種配列の発現レベルは、hMPVのFタンパク質の発現レベルの、多くとも20%である。
ある種の実施形態では、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、同じ条件下での、組換えウイルスが由来する野生型のウイルスのFタンパク質の発現レベルの、多くとも5%、多くとも10%、多くとも20%、多くとも30%、多くとも40%、多くとも50%、多くとも75%、多くとも80%、多くとも90%である。ある種の実施形態では、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、同じ条件下での、組換えウイルスが由来する野生型のウイルスのFタンパク質の発現レベルの、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%である。ある種の実施形態では、本発明の組換えウイルスの異種配列の発現レベルは、同じ条件下での、組換えウイルスが由来する野生型のウイルスのFタンパク質の発現レベルの、5%と20%の間、10%と40%の間、25%と50%の間、40%と75%の間、50%と80%の間、または75%と90%の間である。
5.4.3 異種遺伝子配列のG遺伝子中への挿入
Gタンパク質は、メタニューモウイルスの膜貫通タンパク質である。特定の一実施形態では、異種配列を、それがウイルスのエンベロープの表面上に発現されるように、外部ドメインに対してコードするG-ORFの領域中に挿入する。一手法では、異種配列を、任意のウイルスの配列を欠失しないで、抗原部位内に挿入してもよい。一手法では、異種配列は、G-ORFの配列に置換する。このような構築体の発現産物は、外来の抗原に対するワクチンで有用であることがあり、ワクチン接種した宿主で組換えウイルスの増殖に関連する問題を実際に回避することができる。抗原部位だけに置換のある完全なG分子は、Gの機能を発揮でき、したがって生存可能なウイルスの構築が可能となる。したがって、このウイルスは、さらなるヘルパー機能を必要としないで増殖することができる。偶発的な漏出の危険性を回避するための他の方法でウイルスを弱毒化してもよい。
他のハイブリッドの構築体を作製して、タンパク質を細胞表面上に発現させ、またはタンパク質を細胞から放出できるようにしてもよい。
5.4.4 バイシストロン性RNAの構築
バイシストロン性mRNAを構築することにより、ウイルスの配列の翻訳を内部開始を可能にし、また通常の末端開始部位から外来タンパク質コード配列を発現させることができる。あるいは、ウイルス配列は通常の末端オープンリーディングフレームから翻訳されるが、外来の配列は内部部位から開始されるようなバイシストロン性mRNA配列を構築してもよい。ある種の内部リボソーム進入部位(IRES)配列を利用してもよい。選択されるIRES配列は、MPVのパッケージング限界に干渉しない程度に十分短くなければならない。このように、このようなバイシストロニックな手法に選択されるIRESは、せいぜい長さ500ヌクレオチドであることが好ましい。特定の一実施形態では、IRESはピコルナウイルスに由来し、さらなるピコルナウイルスの配列を全く含まない。特定のIRESエレメントには、それだけには限定されないが、哺乳動物のBiP IRES、およびC型肝炎ウイルスのIRESが含まれる。
あるいは、外来のタンパク質を、転写単位が開始部位およびポリアデニル化部位を有するような新しい内部転写単位から発現させてもよい。別の実施形態では、得られる発現タンパク質が融合タンパク質となるように、外来の遺伝子をMPV遺伝子中に挿入する。
5.5 組換えcDNAおよびRNA鋳型を用いた異種遺伝子産物の発現
上記に記載したように調製したウイルスベクターおよび組換え鋳型を、好適な宿主細胞で異種遺伝子産物を発現させ、または異種遺伝子産物を発現するキメラウイルスを作製する様々な方法で用いることができる。一実施形態では、組換えcDNAを用いて、好適な宿主細胞に形質移入することができ、得られたRNAは高レベルの異種遺伝子産物の発現を指示することができる。高レベル発現をもたらす宿主細胞系には、それぞれAPVまたはMPVに重感染細胞系、APVまたはMPV機能を補うように操作された細胞系など、ウイルスの機能を提供する連続的な細胞系が含まれる。
本発明の代替の一実施形態では、異種遺伝子産物の発現を達成するために、組換え鋳型を用いて、ウイルスのポリメラーゼタンパク質を発現する細胞系に形質移入してもよい。この目的では、Lタンパク質などのポリメラーゼタンパク質を発現する、形質移入された細胞系を、好適な宿主細胞として利用してもよい。宿主細胞を同様に操作して、GまたはNなどの、他のウイルス機能またはさらなる機能をもたらしてもよい。
別の実施形態では、ヘルパーウイルスは、異種遺伝子産物の発現を達成するために細胞によって利用されるRNAポリメラーゼタンパク質を提供することがある。更に別の実施形態では、細胞に、N、P、L、およびM2-1タンパク質などのウイルスのタンパク質をコードするベクターを形質移入してもよい。
5.6 組換えウイルス粒子のレスキュー
本発明のキメラおよび組換えウイルスを調製するために、本発明の組換えまたはキメラウイルスゲノムをプラスまたはマイナスセンスでコードするcDNAを用いて、複製およびレスキューに必要とされるウイルスのタンパク質および機能を提供する細胞に形質移入してもよい。あるいは、本発明の組換えウイルスに対してコードするDNAまたはRNA分子によって形質移入する前、間、または後に、細胞にヘルパーウイルスを形質移入してもよい。本発明の合成組換えプラスミドDNAおよびRNAを、例えば、各々のその全文が参照として本明細書に組み入れられる、1992年11月24日発行の米国特許第5,166,057号、1998年12月29日発行の米国特許第5,854,037号、1996年2月20日公表の欧州特許公開第EP0702085A1号、米国特許出願第09/152,845号、1997年4月3日発行の国際特許公開PCT第WO97/12032号、1996年11月7日発行の第WO96/34625号、欧州特許公開第EP-A780475号、1999年1月21日発行の第WO 99/02657号、1998年11月26日発行の第WO 98/53078号、1998年1月22日発行の第WO 98/02530号、1999年4月1日発行の第WO 99/15672号、1998年4月2日発行の第WO 98/13501号、1997年2月20日発行の第WO 97/06270号、および1997年6月25日発行の欧州特許庁第780 47SA1号に記載されているように、当技術分野で公知の任意の幾種もの技術により、感染性ウイルス粒子中に複製し、レスキューすることができる。
本発明の一実施形態では、ウイルスのポリメラーゼによる認識に、および成熟したウイルス粒子を産生するのに必要なシグナルをパッケージングするのに不可欠なネガティブ鎖ウイルスRNAの非コード領域(リーダーおよびトレーラー)を含む、合成組換えウイルスのRNAを調製することができる。ネガティブ鎖RNAウイルスをレスキューするための逆遺伝学的方法の手法を適用するために用いることができる、幾種もの様々な手法が存在する。第1に、組換えRNAを組換えDNA鋳型から合成し、精製したウイルスのポリメラーゼ複合体とin vitroで再構築して、細胞に形質移入するのに用いることができる組換えリボヌクレオタンパク質(RNP)を形成する。一手法では、ウイルスのポリメラーゼタンパク質がin vitroまたはin vivoいずれかでの合成のRNAの転写の間に存在する場合は、より効率的な形質移入が実現する。この手法で、合成のRNAをcDNAのプラスミドから転写することができ、cDNAのプラスミドは、in vitroでポリメラーゼタンパク質をコードするcDNAプラスミドと同時転写され、またはin vivoでポリメラーゼタンパク質の存在下で、即ち、ポリメラーゼタンパク質を一過性に、または恒常的に発現する細胞で転写される。
本明細書に記載したさらなる手法では、感染性のキメラまたは組換えウイルスが複製されレスキューされるように、感染性のキメラまたは組換えウイルスを、メタニューモウイルスのポリメラーゼタンパク質を発現する宿主細胞系で複製してもよい(例えば、ウイルス/宿主細胞の発現系で;形質転換した細胞系を操作してポリメラーゼタンパク質を発現させる、など)。この場合には、発現されたウイルスのポリメラーゼタンパク質によってこの機能がもたらされるので、ヘルパーウイルスを利用する必要はない。
本発明に従って、当業者に公知の任意の技術を用いて、組換えおよびキメラウイルスの複製およびレスキューを実現することができる。一手法は、宿主細胞に形質移入する前にin vitroで複製に必要とされるウイルスのタンパク質および機能を供給することを含む。そのような一実施形態では、ウイルスのタンパク質を、野生型のウイルス、ヘルパーウイルス、精製したウイルスのタンパク質、または組換えで発現されたウイルスのタンパク質の形態で供給してもよい。ウイルスのタンパク質を、キメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAの転写の前、間、または後に供給してもよい。混合物全体を、宿主細胞に形質移入するのに用いてもよい。一手法では、複製に必要とされるウイルスのタンパク質および機能を、キメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAの転写の前、または間に供給してもよい。このような一実施形態では、複製に必要とされるウイルスのタンパク質および機能を、野生型のウイルス、ヘルパーウイルス、ウイルス抽出物、感染または形質移入により宿主細胞中に導入されたウイルスのタンパク質を発現する合成のcDNAまたはRNAの形態で供給する。この感染/形質移入は、キメラウイルスゲノムをコードする合成のcDNAまたはRNAの導入の前に、またはそれと同時に起こる。
特に望ましい一手法では、全てのウイルスの遺伝子、または本発明のキメラもしくは組換えウイルス、即ち、APV、MPV、MPV/APV、またはAPV/MPVを発現するように操作された細胞は、望ましい遺伝子型を含む感染性ウイルスの生成をもたらすことがあり、したがって選択システムに対する必要性を排除する。理論上は、MPVの構造タンパク質をコードするORFの任意の1つ、またはORFの任意の1つの部分を、外来の配列で置換することができる。しかし、この方程式の必要な部分は、欠陥ウイルスを増殖させる能力である(欠陥は、正常のウイルスの遺伝子産物が欠損し、または変更しているためである)。この問題を回避するために、幾種もの可能な手法が存在する。一手法では、変異タンパク質を有するウイルスを、同じタンパク質の野生型バージョンを恒常的に発現するように構築された細胞系で増殖させることができる。この方法により、細胞系は、ウイルスで突然変異を相補する。同様の技術を用いて、任意のMPV遺伝子を恒常的に発現する、形質転換された細胞系を構築してもよい。ウイルスのタンパク質を発現するように作製されたこれらの細胞系を用いて、キメラウイルスまたは組換えウイルスにおける欠陥を相補し、それによってそれを増殖させてもよい。あるいは、キメラウイルスまたは組換えウイルスを増殖させるのに、ある種の天然の宿主範囲システムが入手可能であり得る。
更に別の実施形態では、複製に必要とされるウイルスのタンパク質および機能を、これらをキメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAと同時転写するように合成のcDNAまたはRNAの形態で遺伝物質として供給してもよい。特に望ましい一手法では、キメラウイルス、およびウイルスのポリメラーゼ、および/または他のウイルスの機能を発現するプラスミドを、宿主細胞中に同時形質移入する。例えば、ゲノムの、またはアンチゲノムのAPV、MPV、MPV/APV、またはAPV/MPVのRNAを、1つまたは複数の異種配列と共に、またはそれなしでコードするプラスミドを、メタニューモウイルスのポリメラーゼタンパク質N、P、L、またはM2-1をコードするプラスミドと宿主細胞中に同時形質移入してもよい。あるいは、本発明の組換えウイルスのレスキューを、T7 RNAポリメラーゼをコードする修飾ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)、またはMVAとポリメラーゼタンパク質(N、P、およびL)をコードするプラスミドとの組合せの使用により遂行することができる。例えば、MVA-T7または鶏痘-T7を、Vero(ベロ)細胞、LLC-MK-2細胞、Hep-2細胞、LF 1043(HEL)細胞、tMK細胞、LLC-MK2、HUT 292、FRHL-2(アカゲザル)、FCL-1(ミドリザル)、WI-38(ヒト)、MRC-5(ヒト)細胞、293 T細胞、QT 6細胞、QT 35細胞、およびCEF細胞中に感染させることができる。MVA-T7または鶏痘-T7で感染させた後、本発明の組換えウイルスをコードするアンチゲノムの、またはゲノムのcDNAの全長を、N、P、L、およびM2-1をコードする発現プラスミドと一緒に細胞中に形質移入してもよい。あるいは、プラスミド形質移入により、ポリメラーゼを提供してもよい。細胞および細胞上清を、引き続き回収し、単一の凍結解凍サイクルに曝すことができる。次いで、得られた細胞溶解液を用いて、ワクシニアウイルスの複製阻害物質である1-β-D-アラビノフラノシルシトシン(ara C)の存在下で、新鮮なベロ細胞の単層に感染させてウイルスストックを産生する。次いで、これらのプレートからの上清および細胞を回収し、一度凍結解凍し、本発明の組換えウイルス粒子の存在を、特定のウイルスに特異的な抗血清を用いてウイルスのプラークを免疫染色することによりアッセイすることができる。
キメラウイルスまたは組換えウイルスを増殖させるための一手法は、野生型のウイルスとの共培養を含むことがある。これは、単に組換えウイルスを取り、細胞を、これおよび別の野生型のウイルスに同時感染させることにより行うことができる。野生型のウイルスは、欠陥ウイルス遺伝子産物を相補するはずであり、野生型および組換えウイルス両方の増殖を可能にする。あるいは、ヘルパーウイルスを用いて、組換えウイルスの増殖を助けることができる。
一手法では、メタニューモウイルスのポリメラーゼタンパク質を発現する組換えウイルスに同時感染させた細胞で、合成鋳型を複製してもよい。実際、本発明による組換え感染性ウイルスをレスキューするのに、この方法を用いることができる。この目的では、メタニューモウイルスのポリメラーゼタンパク質を、それだけには限定されないが、ウイルスの発現ベクター(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスなど)、またはポリメラーゼタンパク質を発現する細胞系(例えば、Krystalら、1986年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、83巻、2709〜2713頁を参照されたい)を含む、任意の発現ベクター/宿主細胞系で発現させることができる。更に、メタニューモウイルスの全てのタンパク質を発現する宿主細胞が感染すると、感染性のキメラウイルス粒子の生成をもたらすことがある。ウイルスの生存性を変えずに組換えウイルスを構築するのが可能であり得ることに留意されたい。次いで、これらの変更されたウイルスは増殖能力があり、複製するのにヘルパー機能を必要としない。
本発明の方法に従ってウイルスを組換え法で産生するために、ウイルスゲノムをコードする遺伝物質を転写しなければならない(転写ステップ)。このステップは、in vitro(宿主細胞の外部)またはin vivo(宿主細胞で)のいずれかで遂行することができる。ウイルスゲノムを遺伝物質から転写して、ウイルスゲノムのポジティブセンスコピー(アンチゲノムのコピー)またはウイルスゲノムのネガティブセンスコピー(ゲノムのコピー)のいずれかを産生することができる。次のステップは、ウイルスゲノムの複製、および複製したゲノムのウイルス粒子へのパッケージング(複製およびパッケージングのステップ)を必要とする。このステップは十分なレベルのウイルスのポリメラーゼ、およびウイルスの複製およびパッケージングに必要な構造タンパク質を提供するように操作された宿主細胞で、細胞内で起こる。
in vitroで転写ステップが起こる場合は、ウイルスゲノムの細胞内複製およびパッケージングが続く。In vivoで転写ステップが起こる場合は、ウイルスゲノムの転写は、様々な供給源から得られ、または産生され得るウイルスゲノムをコードするウイルスの遺伝物質の発現の前に、同時に、またはそれに引き続いて、当業者に公知の様々な方法を用いて起こり得る。遺伝物質は、ウイルス自体から単離してもよい。例えば、ウイルスのRNAゲノムとポリメラーゼタンパク質との複合体、リボヌクレオタンパク質複合体(RNP)を、ウイルス全体から単離してもよい。次いで、ウイルスのRNAゲノムを、関連するタンパク質、例えば、ウイルスのRNAポリメラーゼおよび核タンパク質から剥ぎ取る。
ウイルスゲノムをコードする遺伝物質を、標準的組換え技術を用いて産生することができる。遺伝物質は、全長のウイルスゲノム、またはその部分をコードすることがある。あるいは、遺伝物質は、ウイルスゲノムのリーダーおよび/またはトレーラー配列が隣接する異種配列をコードすることがある。全長のウイルスゲノムを、当技術分野で公知の技術を用いて、幾つかのより小さいPCR断片から組み立てることができる。hMPVの様々な分離物の制限酵素地図を、図10に示す。制限部位を用いて、全長の構築体を組み立てることができる。ある種の実施形態では、PCR反応から生じる断片が、その5'末端に近い制限部位、およびその3'末端に近い制限部位を有するように、PCRプライマーをデザインする。次いで、PCR生成物をそれぞれの制限酵素で消化し、引き続き近接するPCR断片に連結する。
ウイルスゲノムの複製およびパッケージングを実現するためには、リーダーおよびトレーラー配列が、ウイルスのポリメラーゼ認識に必要なシグナルを保持していることが重要である。ウイルスのRNAゲノムに対するリーダーおよびトレーラー配列を最適化し、または変化させて、ウイルスの複製およびレスキューを改善および増強することができる。あるいは、リーダーおよびトレーラー配列を修飾して、ウイルスの複製およびパッケージングの効率を低減し、弱毒表現型を有するウイルスのレスキューをもたらすことができる。様々なリーダーおよびトレーラー配列の例には、それだけには限定されないが、パラミクソウイルスのリーダーおよびトレーラー配列が含まれる。本発明の特定の一実施形態では、リーダーおよびトレーラー配列は、野生型または突然変異したhMPVの配列である。本発明の別の実施形態では、リーダーおよびトレーラー配列は、PIV、APV、またはRSVの配列である。本発明の更に別の実施形態では、リーダーおよびトレーラー配列は、異なるウイルス起源の組合せの配列である。例示によるものであって、可能な組合せを限定しようとするものではないが、リーダーおよびトレーラー配列は、hMPV、PIV、APV、RSV、または任意の他のパラミクソウイルスの任意のリーダーおよびトレーラー配列の組合せであってよい。リーダーおよびトレーラー配列の修飾の例には、ウイルスのプロモーターに比べた間隔の変動、配列の変動、例えば、G残基の数の変動(典型的には0から3)、および、リボザイムの触媒活性を保持するデルタ型肝炎ウイルス(HDV)、リボザイム配列、ハンマーヘッド型リボザイム配列、またはそれらの断片を含む、リボザイム配列を用い、in vitroで生成されたランオフ(run-off)RNAに対する制限酵素を用いた5'または3'末端の規定が含まれる。
代替の一実施形態では、ウイルスゲノムが6量体の長さである場合、ウイルスの複製およびレスキューの効力を増強することができる。ウイルスゲノムが好適な長さであることを確実にするために、5'または3'末端を、リボザイムの触媒活性を保持するデルタ肝炎ウイルス(HDV)リボザイム配列、ハンマーヘッド型リボザイム配列、またはそれらの断片を含むリボザイム配列を用い、in vitroで生成されたランオフ(run-off)RNAに対する制限酵素を用いて規定することができる。
ウイルスゲノムをコードする遺伝物質を転写するために、遺伝物質を、好適な転写制御配列、例えばポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列の制御下に置くように操作する。好ましい実施形態では、プロモーター配列は、T7、Sp6、またはT3ポリメラーゼによって認識される。更に別の実施形態では、プロモーター配列は、RNAポリメラーゼI(Pol I)またはRNAポリメラーゼII(Pol II)などの、細胞のDNA依存RNAポリメラーゼによって認識される。ウイルスゲノムをコードする遺伝物質を、ウイルスゲノムのポジティブ鎖またはネガティブセンスいずれかのコピーが転写されるように、転写制御配列の制御下に配置してもよい。ウイルスゲノムをコードする遺伝物質を、プラスミド系ベクター(例えば、CMVの即時型プロモーター、T7プロモーターなどのpol IIプロモーターを有するプラスミド)、またはウイルス系ベクター(例えば、ワクシニアベクター、MVA-T7および鶏痘ベクターを含むポックスウイルスベクター)などの発現ベクターの枠内で転写制御配列に作動に連結するように組換え操作する。
ウイルスゲノムをコードする遺伝物質を改変して、例えば、T7プロモーターからの発現を最適化するためにリーダーまたはトレーラー配列の上流のG残基の数(典型的には0から3)を変化させ、選りすぐりのポリメラーゼによる発現を増強してもよい。
ウイルスゲノムの複製およびパッケージングは、ウイルスの複製およびパッケージングに許容的な宿主細胞で細胞内に生じる。それによって宿主細胞を操作して十分なレベルのウイルスのポリメラーゼ、ならびに複製およびパッケージングに必要な構造タンパク質を提供することができる方法は数多くあり、好適なヘルパーウイルスに感染した宿主細胞、ウイルスのポリメラーゼおよび構造タンパク質を安定して、または恒常的に発現するように操作された宿主細胞、またはウイルスのポリメラーゼおよび構造タンパク質を一過性もしくは誘導的に発現するように操作された宿主細胞が含まれる。
MPVのウイルスの複製およびパッケージングに必要とされるタンパク質の機能には、それだけには限定されないが、ポリメラーゼタンパク質P、N、L、およびM2-1が含まれる。
一実施形態では、発現されるタンパク質は、天然の、または野生型のMPVタンパク質である。別の実施形態では、発現されるタンパク質を、標準的組換え技術を用いて、それらの発現レベルおよび/またはポリメラーゼ活性を増強するように修飾してもよい。あるいは、ポリメラーゼ活性を保持する、ポリメラーゼタンパク質の断片、誘導体、類似体、または切断型を発現させてもよい。更に別の実施形態では、APVなどの他のニューモウイルスからの、または任意の他のパラミクソウイルスからの類似のポリメラーゼタンパク質を発現させてもよい。更に、別の株のゲノムと一緒にMPVの1株のタンパク質を発現させることにより、弱毒ウイルスを生成することができる。例えば、MPVの1株のポリメラーゼタンパク質を別の株のゲノムと発現させて、弱毒表現型を生成することができる。
ウイルスのポリメラーゼタンパク質を、ヘルパーウイルスによって提供することができる。本発明に従って用いることができるヘルパーウイルスには、MPVまたはAPVなど、ポリメラーゼウイルスタンパク質を天然に発現するものが含まれる。あるいは、ポリメラーゼウイルスタンパク質を提供するために組換え操作されたヘルパーウイルスを用いてもよい。
あるいは、ウイルスのポリメラーゼタンパク質を、発現ベクターによって提供することができる。ウイルスのポリメラーゼタンパク質をコードする配列を操作して、例えば、ポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列など、好適な転写制御配列の制御下に配置する。好ましい実施形態では、プロモーター配列は、T7、Sp6、またはT3ポリメラーゼによって認識される。更に別の実施形態では、Pol IまたはPol IIポリメラーゼによって認識される。あるいは、プロモーター配列は、CMVなどのウイルスのポリメラーゼによって認識される。ウイルスのポリメラーゼタンパク質をコードする配列を、プラスミドベースのベクター(例えば、CMVが駆動するプラスミド、T7が駆動するプラスミド)、またはウイルスベースのベクター(例えば、ワクシニアベクター、MVA-T7、および鶏痘ベクターを含むポックスウイルスベクター)などの発現ベクターの背景で転写制御配列に作動可能に連結するように組換え操作する。
効率的なウイルスの複製およびパッケージングを達成するために、ポリメラーゼタンパク質の高レベルの発現が好ましい。このようなレベルは、MVA-T7に感染細胞中に形質移入された全長のウイルスのcDNAをコードする2〜4μgのプラスミドと一緒にパラミクソウイルスのタンパク質をコードするプラスミド100〜200ng L/pCITE、200〜400ng N/pCITE、200〜400ng P/pCITE、および100〜200ng M2-1/pCITEプラスミドを用いて得られる。別の実施形態では、pSH25(CAT発現性)0.1〜2.0μg、pRF542(T7ポリメラーゼ発現性)0.1〜3.0μg、N cDNA挿入物を有するpCITEベクター0.1〜0.8μg、およびP、L、およびM2-1のcDNA挿入物を含む3つの各pCITEベクター0.1〜1.0μgが用いられる。あるいは、1つまたは複数のポリメラーゼおよび構造タンパク質を、精製したリボヌクレオタンパク質で細胞に形質移入することによって、遺伝物質と組み合わせて細胞中に導入することができる。MPVウイルスの複製およびパッケージングに許容的である宿主細胞が好ましい。好ましい宿主細胞の例には、それだけには限定されないが、293T、ベロ、tMK、およびBHKが含まれる。宿主細胞の他の例には、それだけには限定されないが、LLC-MK-2細胞、Hep-2細胞、LF 1043(HEL)細胞、LLC-MK2、HUT 292、FRHL-2(アカゲザル)、FCL-1(ミドリザル)、WI-38(ヒト)、MRC-5(ヒト)細胞、QT 6細胞、QT 35細胞、およびCEF細胞が含まれる。
本発明の代替実施形態では、形質移入のレベル、および/または感染の効率、タンパク質の発現を増強するために、ウイルスの複製およびパッケージングを最適化するために、宿主細胞を、幾種もの方法を用いて処理することができる。このような処理方法には、それだけには限定されないが、超音波処理、凍結/解凍、および熱ショックが含まれる。更に、それだけには限定されないが、DEAE-デキストラン媒介形質移入、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション処理、リポソーム媒介形質移入、および電気穿孔を含む、当業者に公知の標準的技法を用いて、形質移入および/または感染の手順を最適化することができる。当業者であれば、形質移入/感染の手順の最適化に利用可能な標準的技法にも精通されていよう。例示によるもので利用可能な技術を限定しようとするものではないが、用いることができる方法には、必要なタンパク質を提供するためにウイルスを用いる場合の形質移入に対する感染のタイミングを操作すること、様々なプラスミドの形質移入のタイミングのを操作すること、ならびにウイルスおよび形質移入したプラスミドの相対的な量に影響を及ぼすことが含まれる。
別の実施形態では、本発明は、レスキューされるウイルス以外のウイルスからのポリメラーゼを用いてcDNAから生ウイルスをレスキューまたは生成することに関する。ある種の実施形態では、それだけには限定されないが、種間および種内のポリメラーゼを含む幾種ものポリメラーゼのいずれを用いても、hMPVはcDNAからレスキューされる。ある種の実施形態では、hMPVの複製に必要な最小の複製単位を発現する宿主細胞で、hMPVをレスキューする。例えば、hMPVを、それだけには限定されないがRSV、APV、MPV、またはPIVのポリメラーゼを含む幾種ものポリメラーゼを用いてcDNAからレスキューすることができる。本発明の特定の一実施形態では、hMPVを、RNAウイルスのポリメラーゼを用いてレスキューする。本発明のより詳しい一実施形態では、hMPVを、ネガティブセンスのRNAウイルスのポリメラーゼを用いてレスキューする。本発明のいっそうより詳しい一実施形態では、hMPVを、RSVのポリメラーゼを用いてレスキューする。本発明の別の実施形態では、hMPVを、APVポリメラーゼを用いてレスキューする。本発明の更に別の実施形態では、hMPVを、MPVポリメラーゼを用いてレスキューする。本発明の別の実施形態では、hMPVを、PIVポリメラーゼを用いてレスキューする。
本発明のより特定的な一実施形態では、hMPVを、hMPVポリメラーゼタンパク質の複合体を用いてcDNAからレスキューする。例えば、hMPVのミニレプリコン(minireplicon)を、L、P、N、およびM2-1タンパク質からなるポリメラーゼ複合体を用いてレスキューすることができる。本発明の別の実施形態では、ポリメラーゼ複合体は、L、P、およびNタンパク質からなる。本発明の更に別の実施形態では、それだけには限定されないがRSV、PIV、およびAPVなどの他のウイルスからのポリメラーゼタンパク質からなるポリメラーゼ複合体を用いて、hMPVをcDNAからレスキューすることができる。特に、RSV、PIV、APV、MPV、またはそれらの任意の組合せの、L、P、N、およびM2-1タンパク質からなるポリメラーゼ複合体を用いて、hMPVをcDNAからレスキューすることができる。本発明の更に別の実施形態では、cDNAからhMPVをレスキューするのに用いられるポリメラーゼ複合体は、RSV、PIV、APV、MPV、またはそれらの任意の組合せのL、P、およびNタンパク質からなる。本発明の更にまた別の実施形態では、様々なウイルスからの異なるポリメラーゼタンパク質を用いて、ポリメラーゼ複合体を形成することができる。このような実施形態では、hMPVをレスキューするために用いられるポリメラーゼは、RSV、PIV、APV、またはMPVポリメラーゼの異なる構成成分によって形成され得る。例示によるものであって、複合体を形成する可能な組合せを限定しようとするものではないが、Nタンパク質は、RSV、APV、PIV、またはMPVのN遺伝子によってコードされ得、Lタンパク質はRSV、APV、PIV、またはMPVのL遺伝子によってコードされ、Pタンパク質は、RSV、APV、PIV、またはMPVのP遺伝子によってコードされ得る。当業者であれば、hMPVをcDNAからレスキューするのに必要なポリメラーゼ複合体を形成するのに用いることができる可能な組合せを決定することができる。
ある種の実施形態では、(例えば、本発明のウイルスワクチン候補を製造するのに有益と思われる)頑強で高収率の細胞培養物を生成するために、ウイルスの増殖条件を最適化する。肝要なパラメータを特定することができ、生成プロセスを、拡張性、頑強さ、および再現性を決定するために、小規模実験で最初に最適化し、その後ウイルスの大規模生成に適応させることができる。ある種の実施形態では、本発明の方法を用いて増殖させるウイルスは、hMPVである。ある種の実施形態では、本発明の方法を用いて増殖させるウイルスは、組換えまたはキメラhMPVである。ある種の実施形態では、本発明の方法を用いて増殖させるウイルスは、以下のウイルスのファミリーの1つのウイルスである:アデノウイルス科(Adenoviridae)、アレナウイルス科(Arenaviridae)、アストロウイルス科(Astroviridae)、バキュロウイルス科(Baculoviridae)、ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)、カリシウイルス科(Caliciviridae)、カリモウイルス属(Caulimovirus)、コロナウイルス科(Coronaviridae)、シストウイルス科(Cystoviridae)、フィロウイルス科(Filoviridae)、フラビウイルス科(Flaviviridae)、ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)、ハイポウイルス科(Hypoviridae)、イダエオウイルス属(Idaeovirus)、イノウイルス科(Inoviridae)、イリドウイルス科(Iridoviridae)、レヴィウイルス科(Leviviridae)、リポスリックスウイルス科(Lipothrixviridae)、ルテオウイルス属(Luteovirus)、マクロモウイルス属(Machlomovirus)、マラフィウイルス属(Marafivirus)、ミクロウイルス科(Microviridae)、ミオウイルス科(Myoviridae)、ネクロウイルス属(Necrovirus)、ノダウイルス科(Nodaviridae)、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、パポーバウイルス科(Papovaviridae)、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、パルティティウイルス科(Partitiviridae)、パルボウイルス科(Parvoviridae)、フィコドナウイルス科(Phycodnaviridae)、ピコルナウイルス科(Picornaviridae)、プラズマウイルス科(Plasmaviridae)、ポドウイルス科(Podoviridae)、ポリドナウイルス科(Polydnaviridae)、ポティウイルス科(Potyviridae)、ポックスウイルス科(Poxviridae)、レオウイルス科(Reoviridae)、レトロウイルス科(Retroviridae)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)、セキウイルス科(Sequiviridae)、シホウイルス科(Siphoviridae)、ソベモウイルス属(Sobemovirus)、テクチウイルス科(Tectiviridae)、テヌイウイルス属(Tenuivirus)、テトラウイルス科(Tetraviridae)、トバモウイルス属(Tobamovirus)、トブラウイルス属(Tobravirus)、トガウイルス科(Togaviridae)、トムブスウイルス科(Tombusviridae)、トティウイルス科(totiviridae)、トリコウイルス属(Trichovirus)、モノネガウイルス目(mononegavirales)。ある種の実施形態では、本発明の方法で増殖するウイルスは、RNAウイルスである。ある種の実施形態では、ウイルスは、ヘルペスウイルス科のウイルスではない。ある種の実施形態では、ウイルスはHSVではない。
ある種の実施形態では、対象とするウイルスまたはウイルス構築体を感染させた細胞培養物を、培養細胞の標準的インキュベーション温度に比べて低い感染後インキュベーション温度でインキュベートする。特定の一実施形態では、対象のウイルス構築体に感染細胞培養物を、33℃または約33℃(例えば、33±1℃)でインキュベートする。ある種の実施形態では、感染後のインキュベーション温度は、約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、または37℃である。
ある種の実施形態では、細胞の増殖に最適化した温度で細胞をウイルスに感染させる前に、インキュベートすることによりウイルスを増殖させ、細胞をウイルスに感染させた後、即ち、感染後、温度をより低温に移行する。ある種の実施形態では、移行は、少なくとも、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、または少なくとも12℃である。ある種の実施形態では、移行は、多くとも、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、または多くとも12℃である。ある種の実施形態では、移行は4℃である。
ある種の実施形態では、細胞を、対象のウイルスまたはウイルス構築体に感染させる前に血清を含む培地で培養し、ウイルスまたはウイルス構築体に感染させた後に血清を含まない培地で細胞を培養する。無血清で感染させた細胞を増殖させることについてのより詳しい記載に関しては、「無血清培地におけるウイルスのプラスミドだけの回復(Plasmid-Only Recovery of Virus in Serum Free Media)」という標題の節を参照されたい。特定の実施形態では、血清はウシ胎児血清であり、培地体積の5%、培地体積の2%、または培地体積の0.5%の濃度で存在する。
ある種の実施形態では、血清の非存在下でウイルスに感染させた細胞をインキュベートすることにより、ウイルスを増殖させる。ある種の実施形態では、血清5%未満、血清2.5%未満、血清1%未満、血清0.1%未満、血清0.01%未満、または血清0.001%未満を含む培地でウイルスに感染させた細胞をインキュベートすることにより、ウイルスを増殖させる。
ある種の実施形態では、細胞を、血清を含む培地でウイルスに感染させる前にインキュベートする。ある種の実施形態では、細胞をウイルスに感染させた後、細胞を血清の非存在下でインキュベートする。他の実施形態では、血清を含む培地で最初に細胞をインキュベートし、次いで、血清のない培地中に細胞を移し、引き続き、細胞をウイルスに感染させ、ウイルスの非存在下で更にインキュベートする。
ある種の実施形態では、細胞を、細胞から血清を含む培地を除去し、血清のない培地に加えることにより、血清を含む培地から血清の非存在の培地中に移す。他の実施形態では、細胞を遠心分離し、血清を含む培地を除去し、血清のない培地を加える。ある種の実施形態では、細胞を、血清のない培地で洗浄して、ウイルスにかつて感染細胞を、確実に血清の非存在下でインキュベートする。ある、より詳しい実施形態では、細胞を、血清のない培地で、少なくとも1回、2回、3回、4回、5回、または少なくとも10回洗浄する。
更に他の実施形態では、細胞を、ウイルスまたはウイルス構築体に感染させる前に、血清を含む培地で、細胞の増殖に最適である温度で培養し、対象のウイルス構築体に感染させた後、細胞培養物を(対応するウイルスまたはウイルスベクターに対する標準的インキュベーション温度に比べて)より低い温度でインキュベートする。特定の一実施形態では、細胞を、対象のウイルス構築体に感染させる前に血清を含む培地で37℃で培養し、対象のウイルス構築体に感染させた後、細胞培養物を33℃または約33℃(例えば、33±1℃)でインキュベートする。
更に他の実施形態では、細胞を、ウイルスまたはウイルス構築体に感染させる前に、血清を含む培地で、細胞の増殖に最適である温度で培養し、対象のウイルス構築体に感染させた後、細胞培養物を(対応するウイルスまたはウイルスベクターに対する標準的インキュベーション温度に比べて)低温で無血清でインキュベートする。特定の一実施形態では、細胞を、対象のウイルス構築体に感染させる前に血清を含む培地で37℃で培養し、対象のウイルス構築体に感染させた後、細胞培養物を33℃または約33℃(例えば、33±1℃)で無血清でインキュベートする。
本発明のウイルス構築体および方法を、工業用のウイルス生成に、例えば、ワクチンの生成に用いることができる。ワクチンの商業生産には、ワクチンは、感染性ウイルスまたは汚染性のウイルスの核酸を完全に含まない不活性化したウイルスまたはウイルスのタンパク質だけを含み、あるいは、病原性に戻らない弱毒生ワクチンを含むことが望ましい。生成中に導入された外来性の物質でのワクチンの汚染も、避けなければならない。ウイルスまたはウイルスのタンパク質を大規模に生成するのに当技術分野で知られている方法を、本発明のワクチンの商業生産に用いることができる。一実施形態では、本発明のワクチンを工業用に生成するために、細胞をバイオリアクターまたは発酵槽で培養する。バイオリアクターは、1リットル未満から100リットルを超える体積で入手可能である(例えば、Cyto3 Bioreactor(Osmonics、Minnetonka、ミネソタ州)、NBSバイオリアクター(New Brunswick Scientific、Edison、ニュージャージー州)、およびB.Braun Biotech Internationl(B.Braun Biotech、Melsungen、ドイツ)からの実験室用および商業規模のバイオリアクター)。別の実施形態では、ウイルスの商業生産の前に小規模プロセスの最適化実験を行い、最適化した条件を選択し、ウイルスの商業生産に用いる。
無血清培地におけるプラスミドのレスキュー
本発明のある種の実施形態では、ウイルスを、ヘルパーウイルスなしで回収することができる。より詳しくは、細胞中に、ウイルスゲノムをコードするプラスミド、ならびに複製およびレスキューに必要とされるウイルスのタンパク質をコードするプラスミドを導入することによりウイルスを回収することができる。ある種の実施形態では、細胞を無血清培地で増殖させ維持する。ある種の実施形態では、電気穿孔によりプラスミドを細胞中に導入する。特定の一実施形態では、T7プロモーターの制御下でウイルスのアンチゲノムのcDNAをコードするプラスミド、T7 RNAポリメラーゼをコードするプラスミド、ならびにNタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質をそれぞれコードするプラスミドを、T7プロモーターの制御下で、電気穿孔によりSFベロ細胞中に導入する。ベロ細胞はATCCから得、以下のステップ(Mike Berryの研究室で開発された)に従って無血清培地中で増殖するように適応される。
1. ATCC CCL-81バイアルを、T-25フラスコP121中、DMEM+5%v/vFBSで解凍し、
2. DMEM+5%v/vFBS P126で、5継代増殖させ、
3. FBSで増殖させた細胞を、直接、T-225フラスコ中のOptiPRO(Invitrogen Corporation)に移し、
4. OptiPROで、7継代増殖させ、
5. 133〜7継代で、Pre-Master Cell Bank Stockに凍結させ、
6. OptiPROで、4継代増殖させ、
7. 137継代で、Master Cell Bank Stockに凍結させ、
8. OptiPROで、4継代増殖させ、
9. 141継代で、Working Cell Bank Stockに凍結させ、
10. 電気穿孔およびウイルスの増幅用に、解凍し、増殖させる。
ウイルス粒子をレスキューするための方法は、「組換えウイルス粒子のレスキュー」という標題の第5.6節に記載してある。
ある種の実施形態では、ウイルスのレスキューに用いられる細胞は、動物またはヒトに由来する成分を加えないで増殖させ、かつ/または維持することができる細胞である。ある種の実施形態では、ウイルスのレスキューに用いられる細胞は、無血清で増殖するように適応された細胞である。特定の一実施形態では、ウイルスをレスキューするためにSFベロ細胞を用いる。ある種の実施形態では、細胞を、L-グルタミン4mMを補ったOptiPRO SFM(Invitrogen Corporation)で増殖させ、かつ/または維持する。ある種の実施形態では、細胞を血清を補った培地で増殖させるが、ウイルス粒子をレスキューするために、細胞を無血清培地中に移す。特定の一実施形態では、細胞を無血清培地で洗浄し、ウイルスのレスキューが、確実に無血清の環境で行われるようにする。
プラスミドを、細胞と一緒に用いることができる当業者に公知の任意の方法によって、例えば、リン酸カルシウム形質移入、DEAE-デキストラン形質移入、電気穿孔、またはリポソーム媒介形質移入(Short Protocols in Molecular Biology、Ausubelら(編集)、John Wiley & Sons,Inc.、1999年の第9章を参照されたい)によって細胞中に導入する。特定の実施形態では、電気穿孔を用いてプラスミドのDNAを細胞中に導入する。SFベロ細胞は、リポフェクションに抵抗性である。必要とされるプラスミドが形質移入された細胞を選択するために、プラスミドもある種のマーカーを保有することができる。このようなマーカーには、それだけには限定されないが、ある種の抗生物質(例えば、カナマイシン、ブラストサイジン、アンピシリン、ハイグロマイシンB、ピューロマイシン、およびZeocin(商標))に対する耐性、ある種の独立栄養性の性質を当該マーカーを持たずその独立栄養性を欠いた細胞上に付与するマーカーが含まれるが、またはマーカーは細胞の増殖に必要とされるが、そのプラスミドが導入される細胞では突然変異している遺伝子でもあってもよい。
ウイルスゲノムおよび/またはウイルスの遺伝子の転写は、プロモーターの転写調節下にある。したがって、ウイルスゲノムまたはウイルスのタンパク質をコードする配列は、プロモーター配列に作動可能に連結している。当業者に公知の任意のプロモーター/RNAポリメラーゼ系を、本発明の方法で用いることができる。ある種の実施形態では、プロモーターは、細胞に内在するRNAポリメラーゼによる転写を可能にするプロモーター、例えば、細胞のDNA依存RNAポリメラーゼ、例えばRNAポリメラーゼI(Pol I)またはRNAポリメラーゼII(Pol II)などによって認識されるプロモーター配列であってよい。ある種の実施形態では、プロモーターは、誘導性のプロモーターであることができる。ある種の実施形態では、プロモーターは、細胞に内在しないRNAポリメラーゼによる転写を可能にするプロモーターであってよい。ある種のより特定な実施形態では、プロモーターはT3プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーター、またはCMVプロモーターである。用いられるプロモーターのタイプに応じて、プロモーターを認識するRNAポリメラーゼをコードするプラスミドを、また、細胞中に導入して好適なRNAポリメラーゼを提供する。特定の実施形態では、RNAポリメラーゼは、T3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼ、またはCMV RNAポリメラーゼである。特定の実施形態では、ウイルスの遺伝子およびウイルスゲノムを、Tプロモーターの制御下で転写し、T7 RNAポリメラーゼをコードするプラスミドを導入してT7 RNAポリメラーゼを提供する。ポリメラーゼの転写は、使用する細胞型で機能すると思われる任意のプロモーター系の制御下におくことができる。特定の一実施形態では、CMVプロモーターを用いる。
ウイルスゲノムは、プラス配向でもマイナス配向でもよい。したがって、ウイルスゲノムを遺伝物質から転写して、ウイルスゲノムのポジティブセンスコピー(アンチゲノムのコピー)またはウイルスゲノムのネガティブセンスコピー(ゲノムのコピー)のいずれかを産生することができる。ある種の実施形態では、ウイルスゲノムは、本発明のウイルスの組換え、キメラ、および/または弱毒化したものである。ある種の実施形態では、ウイルスゲノムが6量体の長さである場合、ウイルスの複製およびレスキューの効率を増強することができる。ウイルスゲノムが好適な長さであることを確実にするために、リボザイムの触媒活性を保持する、デルタ肝炎ウイルス(HDV)リボザイム配列、ハンマーヘッド型リボザイム配列、またはそれらの断片を含むリボザイム配列を用いて、5'または3'末端を規定してもよい。
ある種の実施形態では、複製およびレスキューに必要とされるウイルスのタンパク質には、N、P、およびL遺伝子が含まれる。ある、より詳しい実施形態では、複製およびレスキューに必要とされるウイルスのタンパク質には、N、P、M2-1、およびL遺伝子が含まれる。
5.7 組換えウイルスの弱毒化
本発明の組換えウイルスを、更に遺伝子操作して弱毒表現型を示すことができる。特に、本発明の組換えウイルスは、ウイルスがワクチンとして投与される対象において、弱毒表現型を示す。弱毒化は、当業者に公知の任意の方法によって実現することができる。理論に拘泥するわけではないが、弱毒表現型の組換えウイルスは、例えば、意図された宿主で自然に良好に複製しないウイルスを用いることにより(例えば、ヒトにおけるAPVを用いることにより)、ウイルスゲノムの複製を低減することにより、ウイルスが宿主細胞に感染する能力を低減することにより、またはウイルスの野生型株に比べてウイルスタンパク質が感染性ウイルス粒子を構築する能力を低減することにより、もたらすことができる。ウイルスのある配列、例えば、リーダーおよびトレーラー配列の生存性を、ミニゲノムアッセイを用いて試験することができる(第5.8節を参照されたい)。
弱毒表現型の本発明の組換えウイルスを、当業者に公知の任意の方法により試験することができる(例えば、第5.8節を参照されたい)。候補ウイルスを、例えば、宿主感染能力、または細胞培養系における複製速度について試験することができる。ある種の実施形態では、変更される遺伝子がN、P、L、M2、F、G、M2-1、M2-2またはそれらの組合せである場合に、ミニゲノム系を用いて、弱毒ウイルスを試験することができる。ある種の実施形態では、様々な温度での増殖曲線を用いて、弱毒表現型のウイルスを試験することができる。例えば、弱毒ウイルスは、35℃で増殖することができるが、39℃または40℃では増殖することができない。ある種の実施形態では、様々な細胞系を用いて、弱毒表現型のウイルスを評価することができる。例えば、弱毒ウイルスは、サル細胞系だけで増殖することができるが、ヒト細胞系では増殖することができないことがあり、あるいは様々な細胞系で達成可能なウイルスの力価は、弱毒ウイルスでは異なる。ある種の実施形態では、それだけには限定されないが、ハムスター、コトンラット、マウス、およびモルモットを含む小型動物モデルの気道におけるウイルスの複製を用いて、弱毒表現型のウイルスを評価する。他の実施形態では、それだけには限定されないが、抗体の力価(例えば、プラーク減少中和法またはELISAによりアッセイして)を含む、ウイルスによって誘発される免疫反応を用いて、弱毒表現型のウイルスを評価する。特定の一実施形態では、プラーク減少中和法またはELISAを低用量で行う。ある種の実施形態では、組換えウイルスが、動物モデルで病理学的症状を誘発する能力を試験することができる。ウイルスが動物モデル系で病理症状を誘発する能力が低減することは、その弱毒表現型を示す。特定の一実施形態では、候補ウイルスを、粘液生成によって示される鼻の感染に対するサルのモデルで試験する。
本発明のウイルスを、ウイルスの1つまたは複数の機能特性が損なわれるように、弱毒化することができる。ある種の実施形態では、弱毒ウイルスの由来源野生型ウイルス株と比較して、弱毒化を測定する。他の実施形態では、様々な宿主系において弱毒ウイルスの増殖を比べることによって、弱毒化を決定する。したがって、非限定的な例では、ヒト宿主におけるAPV増殖がトリ宿主におけるAPV増殖に比べて低減した場合に、APVをヒト宿主で増殖させると弱毒化するという。
ある種の実施形態では、本発明の弱毒ウイルスは、感染性ウイルス粒子が生成されるように、宿主に感染することができ、宿主で複製することができる。しかし、野生型株に比べると、弱毒系はより低い力価に増殖し、またはより緩慢に増殖する。当業者に公知の任意の技術を用いて、弱毒ウイルスの増殖曲線を決定し、それを野生型のウイルスの増殖曲線と比べることができる。例示的な方法については、下記の、実施例の節を参照されたい。特定の一実施形態では、弱毒ウイルスは、例えば、実施例22に記載した条件下、ベロ細胞で、105pfu/ml未満、104pfu/ml未満、103pfu/ml未満、または102pfu/ml未満の力価に増殖する。
ある種の実施形態では、本発明の弱毒ウイルス(例えば、キメラ哺乳動物MPV)は、ヒトの細胞で複製することができず、野生型ウイルス(例えば、野生型の哺乳動物MPV)もそうである。しかし、弱毒ウイルスは、ベロ細胞など、インターフェロン機能を欠く細胞系で良好に複製することができる。
他の実施形態では、本発明の弱毒ウイルスは、宿主に感染することができ、宿主で複製することができ、本発明のウイルスタンパク質の細胞膜中への挿入をもたらすことができるが、弱毒ウイルスは、新しい感染性ウイルス粒子の生成を宿主にもたらさない。ある種の実施形態では、弱毒ウイルスは、野生型哺乳動物ウイルスと同じ効率で、宿主に感染し、宿主で複製し、宿主の細胞膜へのウイルスタンパク質の挿入をもたらす。他の実施形態では、弱毒ウイルスが、宿主細胞の細胞膜中へのウイルスタンパク質の挿入をもたらす能力は、野生型ウイルスに比べて低減する。ある種の実施形態では、弱毒化哺乳動物ウイルスが宿主で複製する能力は、野生型ウイルスに比べて低減する。当業者に公知の任意の技術を用いて、ウイルスが哺乳動物細胞に感染することができるか否か、宿主内で複製することができるか否か、およびウイルスタンパク質の宿主細胞膜中への挿入をもたらすことができるか否かを決定することができる。例示的な方法については、第5.8節を参照されたい。
ある種の実施形態では、本発明の弱毒ウイルスは、宿主に感染することができる。しかし、野生型の哺乳動物MPVとは対照的に、弱毒化した哺乳動物MPVは宿主で複製することができない。特定の一実施形態では、弱毒化した哺乳動物のウイルスは、宿主に感染することができ、宿主にその細胞膜でウイルスのタンパク質の挿入をもたらすことができるが、弱毒ウイルスは宿主で複製することができない。当業者に公知の任意の方法を用いて、弱毒化した哺乳動物MPVが宿主に感染し、宿主にその細胞膜でウイルスのタンパク質の挿入をもたらしたか否かを試験することができる。
ある種の実施形態では、弱毒化した哺乳動物のウイルスが宿主に感染する能力は、野生型のウイルスが同じ宿主に感染する能力に比べて低減する。当業者に公知の任意の技術を用いて、ウイルスが宿主に感染することができるか否かを決定することができる。例示的な方法については、第5.8節を参照されたい。
ある種の実施形態では、突然変異(例えば、ミスセンス変異)をウイルスゲノム中に導入して、弱毒表現型のウイルスを産生する。突然変異(例えば、ミスセンス変異)を、組換えウイルスの、N遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、またはL遺伝子中に導入することができる。突然変異は、付加、置換、欠失、またはそれらの組合せであってよい。特定の実施形態では、N、P、L、F、G、M2-1、M2-2、またはM2タンパク質に対する単一アミノ酸の欠失の突然変異が導入され、これは、ミニゲノムアッセイ系で機能性に対してスクリーニングすることができ、ウイルスで予測された機能性について評価することができる。より詳しい実施形態では、ミスセンス変異は、低温感受性変異である。他の実施形態では、ミスセンス変異は高温感受性変異である。一実施形態では、ウイルスのPタンパク質の主なリン酸化部位を除去する。別の実施形態では、ウイルスのL遺伝子中に、1つの突然変異または突然変異(複数)を導入して、温度感受性株を作製する。更に別の実施形態では、F遺伝子の切断部位を、切断が起こらない、または非常に低い効率で起こるような方法で変異させる。ある、より詳しい実施形態では、hMPVのFタンパク質のアミノ酸99位から102位までにおけるアミノ酸配列RQSRを有するモチーフが突然変異する。突然変異は、それだけには限定されないが、1つもしくは複数のアミノ酸の欠失、1つもしくは複数のアミノ酸の付加、1つもしくは複数のアミノ酸の置換(保存的もしくは非保存的)、またはそれらの組合せであることができる。hMPVの幾つかの株では、切断部位はRQPR(実施例「P101S」を参照されたい)である。ある種の実施形態では、アミノ酸配列RQPRを有する切断部位が突然変異する。より詳しい実施形態では、hMPVのFタンパク質の切断部位は、hMPVの感染性が低減するように突然変異する。ある種の実施形態では、hMPVの感染性は、少なくとも5、10、50、100、500、103、5×103、104、5×104、105、5×105または少なくとも106の係数で低減する。ある種の実施形態では、hMPVの感染性は、多くとも5、10、50、100、500、103、5×103、104、5×104、105、5×105、または多くとも106の係数で低減する。
他の実施形態では、組換えウイルスゲノム中に欠失を導入する。より詳しい実施形態では、欠失を、組換えウイルスのN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、またはL遺伝子中に導入することができる。特定の実施形態では、欠失は、本発明の組換えウイルスのM2遺伝子にある。他の特定の実施形態では、欠失は、本発明の組換えウイルスのSH遺伝子にある。更に別の実施形態では、M2遺伝子およびSH遺伝子の両方が欠失する。
ある種の実施形態では、組換えウイルスの遺伝子間領域が変化する。一実施形態では、遺伝子間領域の長さが変化する。別の実施形態では、遺伝子間領域は、ウイルスゲノムの5'から3'末端をシャッフルする。
他の実施形態では、組換えウイルスの1つの遺伝子または遺伝子(複数)のゲノム位置が変更される。一実施形態では、FまたはG遺伝子が、ゲノムの3'末端に移動する。別の実施形態では、N遺伝子が、ゲノムの5'末端に移動する。
ある種の実施形態では、野生型のウイルスの遺伝子を異種の(例えば、RSV、APV、PIV3、もしくはマウスのニューモウイルスの)、異なるサブグループの、または異なる変異株のウイルスの類似の遺伝子で置換することによって、ウイルスの弱毒化を実現する。例示の実施形態では、哺乳動物MPVのN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、またはL遺伝子を、それぞれAPVのN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、またはL遺伝子で置換する。他の例示の実施形態では、APVのN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、またはL遺伝子を、それぞれ哺乳動物MPVのN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、またはL遺伝子で置換する。好ましい実施形態では、1つまたは複数のポリメラーゼに関連する遺伝子(例えば、N、P、L、またはM2)を、異種のウイルスの遺伝子で置換することによって、ウイルスの弱毒化を実現する。
ある種の実施形態では、野生型ウイルスのタンパク質の1つまたは複数の特異的なドメインを、異種のウイルスの対応するタンパク質に由来するドメインで置換することによって、ウイルスの弱毒化を実現する。例示的一実施形態では、APVのFタンパク質の外部ドメインを、哺乳動物MPVのFタンパク質の外部ドメインで置換する。好ましい一実施形態では、L、N、またはPタンパク質の1つまたは複数の特異的なドメインを、異種のウイルスの対応するタンパク質に由来するドメインで置換する。ある他の実施形態では、野生型のウイルスのタンパク質の1つまたは複数の特異的なドメインを欠失することにより、ウイルスの弱毒化を実現する。特定の一実施形態では、Fタンパク質の膜貫通ドメインが欠失する。
本発明のある種の実施形態では、本発明の組換えウイルスのリーダーおよび/またはトレーラー配列を改変して、弱毒表現型を実現することができる。ある、より詳しい実施形態では、リーダーおよび/またはトレーラー配列を、野生型のウイルスに比べて、少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、または少なくとも6ヌクレオチドの長さで低減する。ある、他の、より詳しい実施形態では、組換えウイルスのリーダーおよび/またはトレーラー配列を変異させる。特定の一実施形態では、リーダーおよびトレーラー配列は、相互に100%相補的である。他の実施形態では、リーダーおよびトレーラー配列の残りのヌクレオチドが相互に相補的である場合に、1ヌクレオチド、2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、または10ヌクレオチドが相互に相補的ではない。ある種の実施形態では、非相補的なヌクレオチドは、相互に同一である。ある他の実施形態では、非相補的なヌクレオチドは、相互に異なる。他の実施形態では、トレーラーにおける非相補的なヌクレオチドがプリンである場合は、リーダー配列における対応するヌクレオチドもプリンである。他の実施形態では、トレーラーにおける非相補的なヌクレオチドがピリミジンである場合は、リーダー配列における対応するヌクレオチドもプリンである。本発明のある種の実施形態では、本発明の組換えウイルスのリーダーおよび/またはトレーラー配列を、別のウイルスのリーダーおよび/またはトレーラー配列で、例えば、RSV、APV、PIV3、マウスのニューモウイルスのリーダーおよび/またはトレーラー配列で、あるいは、組換えウイルスのタンパク質をコードする部分がそれに由来するヒトのメタニューモウイルスとは異なる1サブグループもしくは変異株のヒトのメタニューモウイルスのリーダーおよび/またはトレーラー配列で置換することができる。
弱毒生ワクチンを用いる場合、その安全性も考慮しなければならない。ワクチンが疾患を引き起こしてはならない。ワクチンを安全にすることができる当技術分野で周知の任意の技術を、本発明で用いることができる。弱毒化技術の他に、他の技術を用いることができる。非限定的な一例は、ウイルス粒子の膜中に組み入れられることができない可溶性の異種遺伝子を用いることである。例えば、膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインを欠くRSV遺伝子の1種である、可溶性RSVF遺伝子の単一コピーを用いることができる。これはウイルス粒子の膜中に組み入れられることができないので、ウイルスの指向性が変化しないと予想される。
様々なアッセイを用いて、ワクチンの安全性を試験することができる。下記の第5.8節を参照されたい。特に、ショ糖勾配および中和のアッセイを用いて安全性を試験することができる。ショ糖勾配アッセイを用いて、異種タンパク質がウイルス粒子に挿入されるか否かを決定することができる。異種タンパク質がウイルス粒子に挿入される場合は、親株が症状を引き起こさない場合でも、ウイルス粒子の症状を引き起こす能力についてウイルス粒子を試験しなければならない。理論に拘泥するわけではないが、異種タンパク質がウイルス粒子に組み入れられる場合、ウイルスは、新しい、おそらくは病原性を獲得した可能性がある。
ある種の実施形態では、hMPVのゲノムから1つまたは複数の遺伝子が欠失して弱毒ウイルスが産生される。より詳しい実施形態では、M2-2 ORF、M2-1 ORF、M2遺伝子、SH遺伝子、および/またはG2遺伝子が欠失する。
他の実施形態では、弱毒ウイルスを産生するために、小型の単一アミノ酸欠失を、ウイルスの複製に関与する遺伝子に導入する。より詳しい実施形態では、小型の単一アミノ酸欠失を、N、L、またはP遺伝子に導入する。ある特定の実施形態では、弱毒ウイルスを産生するために、組換えhMPVのL遺伝子において、1つまたは複数の以下のアミノ酸:アミノ酸位置456におけるPhe、アミノ酸位置749におけるGlu、アミノ酸位置1246におけるTyr、アミノ酸位置1094におけるMet、およびアミノ酸位置746におけるLysが突然変異する。突然変異は、例えば、アミノ酸の欠失または置換であってよい。アミノ酸の置換は、保存されたアミノ酸の置換、または非保存のアミノ酸の置換であってよい。保存されたアミノ酸の交換についての例示的な例は、アミノ酸の側鎖の構造上の、および/または機能上の性質を維持するアミノ酸の置換であり、例えば、芳香族アミノ酸を別の芳香族アミノ酸に置換し、酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸に置換し、塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸に置換し、脂肪族のアミノ酸を別の脂肪族アミノ酸に置換する。それとは対照的に、非保存のアミノ酸の交換の例は、アミノ酸の側鎖の構造上の、および/または機能上の性質を維持しないアミノ酸の置換であり、例えば、芳香族アミノ酸を塩基性、酸性、または脂肪族のアミノ酸に置換し、酸性アミノ酸を芳香族、塩基性、または脂肪族のアミノ酸に置換し、塩基性アミノ酸を酸性、芳香族、または脂肪族のアミノ酸に置換し、脂肪族のアミノ酸を芳香族、酸性、または塩基性のアミノ酸に置換する。更により詳しい実施形態では、アミノ酸位置456のPheをLeuによって置換する。
ある種の実施形態では、1個のアミノ酸の交換をコードするように1つの核酸が置換される。他の実施形態では、1個のアミノ酸の交換をコードするように2個または3個の核酸が置換される。野生型のタンパク質の配列への復帰変異の危険性を低減するために、2個または3個の核酸を置換することが好ましい。
他の実施形態では、小型の単一アミノ酸欠失をウイルスの構築に関与する遺伝子に導入して、弱毒ウイルスを産生する。より詳しい実施形態では、小型の単一アミノ酸欠失を、M遺伝子またはM2遺伝子に導入する。好ましい一実施形態では、M遺伝子を変異する。
更に他の実施形態では、ウイルスゲノムにおける遺伝子の順番を、野生型のウイルスの遺伝子の順番から変更して弱毒ウイルスを産生する。より特定の一実施形態では、F、SH、および/またはG遺伝子を、ウイルスゲノムの3'末端に移動する。別の実施形態では、N遺伝子をウイルスゲノムの5'末端に移動する。
他の実施形態では、1つまたは複数の遺伝子開始部位(遺伝子開始部位の位置については、例えば、表8を参照されたい)を変異させ、あるいは、別のウイルス(例えば、RSV、PIV3、APV、もしくはマウスのニューモウイルス)の類似の遺伝子開始部位、または、組換えウイルスのタンパク質コード部分がそれに由来する、ヒトメタニューモウイルスとは異なるサブグループもしくは変異株のヒトのメタニューモウイルスの類似の遺伝子開始部位で置換する。より詳しい実施形態では、N遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、および/またはL遺伝子の遺伝子開始部位を変異させ、あるいは、別のウイルス(例えば、RSV、PIV3、APV、もしくはマウスのニューモウイルス)の、それぞれN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、および/またはL遺伝子の開始部位で、または、組換えウイルスのタンパク質コード部分がそれに由来する、ヒトメタニューモウイルスとは異なるサブグループもしくは変異株のヒトのメタニューモウイルスの開始部位で置換する。
5.7.1 ウイルスの遺伝子の置換による弱毒化
本発明のある種の実施形態では、ウイルスの1つまたは複数の遺伝子を、異なるウイルス、異なる株、または異なるウイルス分離株の類似の遺伝子で置換することによって弱毒化を実現する。ある種の実施形態では、哺乳動物のメタニューモウイルス、例えばhMPV、またはAPVなどの、メタニューモウイルスの1つまたは複数の遺伝子を、別のパラミクソウイルスの類似の遺伝子で置換する。より詳しい一実施形態では、N遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1、ORF、M2-2 ORF、SH遺伝子、G遺伝子、もしくはL遺伝子、または哺乳動物のメタニューモウイルス、例えばhMPVのこれらの遺伝子の2つ以上の任意の組合せを、別のウイルスの種、株、または分離株の類似の遺伝子で置き換え、この場合、他のウイルス種は、それだけには限定されないが、別の哺乳動物のメタニューモウイルス、APV、またはRSVであることができる。
より詳しい実施形態では、ヒトのメタニューモウイルスの1つまたは複数の遺伝子を、ヒトのメタニューモウイルスの別の分離株の類似の遺伝子で置換する。例えば、N遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1 ORF、M2-2 ORF、SH遺伝子、G遺伝子、もしくはL遺伝子、または分離株NL/1/99(99-1)、NL/1/00(00-1)、NL/17/00、もしくはNL/1/94のこれらの遺伝子の2つもしくはそれを超える任意の組合せを、類似の遺伝子または遺伝子の組合せ、即ち、異なる分離株、例えば、NL/1/99(99-1)、NL/1/00(00-1)、NL/17/00、もしくはNL/1/94のN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1 ORF、M2-2 ORF、SH遺伝子、G遺伝子、もしくはL遺伝子で置換する。
ある種の実施形態では、ウイルスゲノムの1つまたは複数の領域は、異なるウイルスの種、株、または分離株のゲノムからの類似領域で置換される。ある種の実施形態では、領域は、ウイルスゲノムのコード領域における一領域である。他の実施形態では、領域は、ウイルスゲノムの非コード領域における一領域である。ある種の実施形態では、2つの領域が、2つのウイルスで同一または同様の機能を支持する場合は、2つのウイルスの2つの領域は互いに類似である。ある他の実施形態では、2つの領域が2つのウイルスで同様の構造上のエレメントの同じものを提供する場合は、2つのウイルスの2つの領域は類似である。より詳しい実施形態では、2つの領域が2つのウイルスで類似のタンパク質の領域をコードする場合は、2つの領域は類似であり、この場合、類似のタンパク質の領域は、同一または同様の機能および/または構造を有する領域である。
ある種の実施形態では、哺乳動物のメタニューモウイルス、例えばhMPV、またはAPVなどのメタニューモウイルスゲノムの1つまたは複数の領域を、別のパラミクソウイルスゲノムの類似の領域で置換する。ある種の実施形態では、パラミクソウイルスゲノムの1つまたは複数の領域を、哺乳動物のメタニューモウイルス、例えばhMPV、またはAPVのゲノムの類似の領域で置換する。より詳しい実施形態では、N遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1 ORF、M2-2 ORF、SH遺伝子、G遺伝子、もしくはL遺伝子の領域、または哺乳動物のメタニューモウイルス、例えばhMPVのこれらの遺伝子の2つ以上のあらゆる組合せを、別のウイルスの種、株、または分離株の類似の領域で置換する。別のウイルス種は、それだけには限定されないが、別の哺乳動物のメタニューモウイルス、APV、またはRSVであることができる。
より詳しい実施形態では、ヒトのメタニューモウイルスの1つまたは複数の領域を、ヒトのメタニューモウイルスの別の分離株の類似の領域で置換する。例えば、N遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1 ORF、M2-2 ORF、SH遺伝子、G遺伝子、もしくはL遺伝子の1つもしくは複数の領域、または分離株NL/1/99(99-1)、NL/1/00(00-1)、NL/17/00、もしくはNL/1/94の2つもしくはそれを超える任意の組合せを、hMPVの異なる分離株、例えばNL/1/99(99-1)、NL/1/00(00-1)、NL/17/00、もしくはNL/1/94の類似の領域で置換する。
ある種の実施形態では、領域は、長さが少なくとも5ヌクレオチド(nt)、少なくとも10nt、少なくとも25nt、少なくとも50nt、少なくとも75nt、少なくとも100nt、少なくとも250nt、少なくとも500nt、少なくとも750nt、少なくとも1kb、少なくとも1.5kb、少なくとも2kb、少なくとも2.5kb、少なくとも3kb、少なくとも4kb、または少なくとも長さ5kbである。ある種の実施形態では、領域は、長さが多くとも5ヌクレオチド(nt)、多くとも10nt、多くとも25nt、多くとも50nt、多くとも75nt、多くとも100nt、多くとも250nt、多くとも500nt、多くとも750nt、多くとも1kb、多くとも1.5kb、多くとも2kb、多くとも2.5kb、多くとも3kb、多くとも4kb、または多くとも長さ5kbである。
5.8 本発明で使用するアッセイ
細胞培養系、動物モデル系または対象における、キメラまたは組換えウイルスの増殖速度を決定するために、幾種ものアッセイを本発明に従って使用してもよい。また、ウイルス粒子の感染、複製およびパッケージングを達成するキメラおよび組換えウイルスの要件を決定するために、幾種もアッセイを本発明に従って使用してもよい。
本明細書中に記載されているアッセイを使用して、経時的にウイルス価をアッセイし、ウイルスの増殖特性を決定してもよい。特定の実施形態において、ウイルス価は、感染細胞または感染した対象から試料を得ること、試料の段階希釈を調製すること、および、シングルプラークの出現を可能にするウイルスの希釈でウイルスの感染に感受性のある単層の細胞をウイルスに感染させることによって、決定される。次いで、プラークを計数し、ウイルス価を試料1ml当りのプラーク形成単位として表すことができる。本発明の特定の実施形態において、対象における本発明のウイルスの増殖速度は、対象におけるウイルスに対する抗体の力価によって推定される。理論に拘束されることなく、対象における抗体力価は、対象におけるウイルス価のみでなく、抗原性も反映する。ウイルスの抗原性が一定であれば、対象における抗体力価の増大を使用して、対象におけるウイルスの増殖曲線を決定することができる。好ましい実施形態において、動物またはヒトにおけるウイルスの増殖速度は、感染後複数の時点で宿主の体液を試料採取すること、およびウイルス価を測定することによって、最もよく試験される。
細胞培養系における、または対象における、異種遺伝子配列の発現は、当業者に公知の任意の技術によって決定することができる。ある種の実施形態において、異種遺伝子の発現は、転写産物のレベルを定量することによって測定される。転写産物のレベルは、転写産物に特異的なプローブまたはプライマーをそれぞれ用いた、ノーザンブロット分析またはRT-PCRによって、測定することができる。ウイルスはアンチセンス方向であるが転写産物はセンス方向なので、転写産物は、ウイルスゲノムと区別することができる。ある種の実施形態において、異種遺伝子の発現は、異種遺伝子のタンパク質生成物のレベルを定量することによって測定される。タンパク質のレベルは、タンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロット分析によって測定することができる。
特定の実施形態において、異種遺伝子は、ペプチドタグでタグ付けされる。ペプチドタグは、ペプチドタグに対する抗体を用いて検出することができる。検出されたペプチドタグのレベルは、異種遺伝子から発現されたタンパク質のレベルを代表する。あるいは、異種遺伝子から発現されたタンパク質は、ペプチドタグによって単離することができる。精製されたタンパク質の量は、異種遺伝子の発現レベルと相関がある。かかるペプチドタグ、およびかかるペプチドタグに融合したタンパク質の単離のための方法は、当該分野で周知である。当該分野で公知の種々のペプチドタグを、免疫グロブリン定常領域、ポリヒスチジン配列(Current Protocols in Molecular Biology、第1〜3巻(1994〜1998年)、Ausubel, F.M.、Brent, R.、Kunston, R.E.、Moore, D.D.、Seidmen, J.G.、Smith, J.A.およびStruhl, K.編、John Wiley and sons, Inc.発行、USA、Greene Publish Assoc. & Wiley Interscience中のPetty、1996年、Metal-chelate affinity chromatography)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST; Smith、1993年、Methods Mil. Cell Bio. 4:220〜229頁)、大腸菌(E. coli)マルトース結合タンパク質(Guanら、1987年、Gene 67:21〜30頁)、種々のセルロース結合ドメイン(米国特許第5,496,934号;第5,202,247号、第5,137,819号; Tommeら、1994年、Protein Eng. 7: 117〜123頁)、およびFLAGエピトープ(Short Protocols in Molecular Biology、1999年、Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc.ユニット10.11)等（しかしこれらに限定されない）の異種遺伝子の修飾に使用してもよい。他のペプチドタグは、特異的結合パートナーによって認識され、それにより、好ましくは固体支持体上に固定されているおよび/またはそこにある結合パートナーへの親和性結合により単離を容易にする。当業者に認識されるように、DNAクローニング、DNA増幅、および合成方法を含むがこれらに限定されない、多くの方法を使用して、上述のペプチドタグのコード領域を得ることができる。ペプチドタグならびにそれらの検出および単離のための試薬の幾つかは、市販されている。
対象由来の試料は、当業者に公知の任意の方法によって得ることができる。ある種の実施形態において、試料は、吸引鼻汁、咽頭スワブ、痰または気管支肺胞洗浄液からなる。
5.8.1 ミニレプリコン(minireplicon)構築物
cDNAからの生ウイルスの生成によって、hMPVの特徴付けならびに弱毒化ワクチン株および免疫原性化合物の生成のための手段が提供される。この目的を達成するために、レポーター遺伝子を含むvRNAをコードするcDNAまたはミニレプリコン構築物を使用して、ウイルスをレスキューし、ヌクレオチド配列ならびに増幅、発現、およびウイルス粒子へのRNAの組み込みに関与するタンパク質を同定することもできる。当業者に公知の任意のレポーター遺伝子を、本発明と共に使用することができる(5.8.2参照)。例えば、使用できるレポーター遺伝子としては、GFP、HRP、LUCおよびAPをコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない(レポーターの例のもっと広範なリストについては、第5.8.2節も参照)。特定の一実施形態において、使用されるレポーター遺伝子はCATをコードする。本発明の別の特定の実施形態において、レポーター遺伝子は、リーダーおよびトレーラー配列に挟まれている。レポーター遺伝子を挟むのに使用できるリーダーおよびトレーラー配列は、MPV、RSV、およびAPVを含むがこれらに限定されない、任意のネガティブセンスウイルスのものである。例えば、レポーター遺伝子は、デルタ肝炎リボザイム(Hep-d Ribo)およびT7ポリメラーゼ終止(T-T7)シグナルに連結されたネガティブセンスhMPVまたはAPVリーダー、ならびにT7 RNAポリメラーゼプロモーターに先行されるhMPVまたはAPVトレーラー配列によって挟まれることができる。
ある種の実施形態において、ミニレプリコンをコードするプラスミドを、宿主細胞にトランスフェクトする。本発明のより特定な実施形態において、T7 RNAポリメラーゼ、N遺伝子、P遺伝子、L遺伝子、およびM2.1遺伝子を発現している宿主細胞中でhMPVがレスキューされる。ある種の実施形態において、宿主細胞を、T7 RNAポリメラーゼ、N遺伝子、P遺伝子、L遺伝子、およびM2.1遺伝子をコードするプラスミドにトランスフェクトする。他の実施形態において、ミニレプリコンをコードするプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトし、宿主細胞をヘルパーウイルスに感染させる。
hMPVミニレプリコンは、種間および種内ポリメラーゼを含むがこれらに限定されない幾つかのポリメラーゼを用いて、レスキューすることができる。ある種の実施形態において、hMPVミニレプリコンは、hMPV複製に必要な最小の複製単位を発現している宿主細胞においてレスキューされる。例えば、hMPVは、RSV、APV、MPV、またはPIVのポリメラーゼを含むがこれらに限定されない、幾つかのポリメラーゼを用いて、cDNAからレスキューすることができる。本発明の特定の実施形態において、hMPVは、RNAウイルスのポリメラーゼを用いてレスキューされる。本発明のより特定な実施形態において、hMPVは、ネガティブセンスRNAウイルスのポリメラーゼを用いてレスキューされる。更に本発明のより特定な実施形態において、hMPVは、RSVポリメラーゼを用いてレスキューされる。本発明の別の実施形態において、hMPVは、APVポリメラーゼを用いてレスキューされる。本発明の更に別の実施形態において、hMPVは、MPVポリメラーゼを用いてレスキューされる。本発明の別の実施形態において、hMPVは、PIVポリメラーゼを用いてレスキューされる。
本発明の別の実施形態において、hMPVは、hMPVポリメラーゼタンパク質の複合体を用いて、cDNAからレスキューされる。例えば、hMPVミニレプリコンは、L、P、N、およびM2-1タンパク質からなるポリメラーゼ複合体を用いてレスキューすることができる。本発明の別の実施形態において、ポリメラーゼ複合体は、L、P、およびNタンパク質からなる。本発明の更に別の実施形態において、hMPVミニレプリコンは、RSV、PIV、APV等であるが、それだけに限らない他のウイルス由来のポリメラーゼタンパク質からなるポリメラーゼ複合体を用いて、レスキューすることができる。具体的には、hMPVミニレプリコンは、RSV、PIV、またはAPVのL、P、N、およびM2-1タンパク質からなるポリメラーゼ複合体を用いてレスキューすることができる。本発明の更に別の実施形態において、hMPVミニレプリコンをレスキューするのに使用されるポリメラーゼ複合体は、RSV、PIV、またはAPVのL、P、およびNタンパク質からなる。本発明の更に別の実施形態において、種々のウイルス由来の異なるポリメラーゼタンパク質を使用して、ポリメラーゼ複合体を形成することができる。かかる実施形態において、hMPVミニレプリコンをレスキューするのに使用されるポリメラーゼは、RSV、PIV、またはAPVポリメラーゼの異なる成分によって形成することができる。複合体の形成において、例として、および可能性のある組合せを制限することを意図することなく、Nタンパク質は、RSV、APV、またはPIVのN遺伝子によってコードされることができるが、Lタンパク質は、RSV、APV、またはPIVのL遺伝子によってコードされ、Pタンパク質は、RSV、APV、またはPIVのP遺伝子によってコードされることができる。当業者は、hMPVミニレプリコンをレスキューするのに必要なポリメラーゼ複合体の形成に使用してもよい、可能性のある組合せを決定することができよう。ミニレプリコン系において、成功したウイルスのレスキューを確認し、ウイルスの特徴づけもするために、レポーター遺伝子の発現が測定される。レポーター遺伝子の発現レベルおよび/またはその活性は、5.8.2の項に記載される方法等の、しかしこれらに限定されない、当業者に公知の任意の方法によってアッセイすることができる。
ある種のより特定な実施形態において、ミニレプリコンは、列挙した順に以下の要素:T7 RNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼI、リーダー配列、遺伝子開始、GFP、トレーラー配列、デルタ肝炎リボザイム配列またはRNAポリメラーゼI終止配列を含む。T7がRNAポリメラーゼとして使用される場合、デルタ肝炎リボザイム配列が終止配列として使用されるべきである。RNAポリメラーゼIが使用される場合、RNAポリメラーゼI終止配列を終止シグナルとして使用してもよい。レスキューシステムに応じて、ミニレプリコンの配列は、センス方向、アンチセンス方向のいずれになり得る。ある種の実施形態において、リーダー配列を、hMPVの野生型リーダー配列に関して修飾することができる。リーダー配列は、場合によりACに先行されてもよい。T7プロモーター配列には、Gダブレットまたはトリプレットがあってもなくてもよいが、Gダブレットまたはトリプレットによって転写が増加する。
特定の実施形態において、細胞を、T0でhMPVに感染させる。24時間後、T24で、細胞をミニレプリコン構築物でトランスフェクトする。T0の48時間後およびT0の72時間後に、細胞を、レポーター遺伝子の発現について試験する。蛍光レポーター遺伝子産物(例えば、GFP)を使用すると、レポーター遺伝子の発現を、FACSを用いて試験することができる。
別の実施形態において、細胞を、T=0時間で6つのプラスミドでトランスフェクトする。次いで、細胞をT=40およびT=60時間で採取し、CATまたはGFP発現について分析する。
別の特定の実施形態において、細胞を、T0でMVA-T7に感染させる。1時間後、T1で、細胞をミニレプリコン構築物でトランスフェクトする。T0の24時間後、細胞をhMPVに感染させる。T0の72時間後、細胞を、レポーター遺伝子の発現について試験する。蛍光レポーター遺伝子産物(例えば、GFP)を使用すると、レポーター遺伝子の発現を、FACSを用いて試験することができる。
5.8.2 レポーター遺伝子
ある種の実施形態において、組織培養物または動物モデルにおけるレポーター遺伝子発現の測定のためのアッセイを、本発明の方法と共に使用することができる。レポーター遺伝子のヌクレオチド配列を、APV、hMPV、hMPV/APVまたはAPV/hMPV等のウイルスにクローニングし、ここで(i)レポーター遺伝子の位置は変化し、(ii)レポーター遺伝子を挟む遺伝子間領域の長さは変化する。異なる組合せを試験して、レポーター遺伝子の発現の最適速度、およびレポーター遺伝子を含むウイルスの最適複製速度を決定する。
ある種の実施形態において、レポーター遺伝子を含むよう、ミニレプリコン構築物を生じる。ミニレプリコン構築物の構築は、本明細書中に記載されている。
レポーター遺伝子産物の存在量は、当業者に公知の任意の技術によって決定することができる。かかる技術としては、レポーター遺伝子に特異的なプローブまたは抗体をそれぞれ用いた、ノーザンブロット分析またはウェスタンブロット分析が挙げられるが、これらに限定されない。
ある種の実施形態において、レポーター遺伝子は、FACSにおいて検出することができる蛍光シグナルを発する。FACSを使用して、レポーター遺伝子を発現している細胞を検出することができる。
本発明の特定の態様を実施する技法には、別途指示しない限り、当業者が常套的に実施している、分子生物学、微生物学および組換えDNAの操作、生成に関する、従来技法が採用されよう。例えば、Sambrookら、Molecular cloning, a laboratory manual、第2版、第1〜3巻(Cold Spring Harbor Laboratory、1989年)、A Laboratory Manual、第2版; DNA Cloning、第I巻および第II巻(Glover編、1985年); およびTranscription and Translation (HamesおよびHiggins編、1984年)を参照のこと。
レポーター遺伝子産物の生化学的活性は、レポーター遺伝子の発現レベルを表す。レポーター遺伝子活性の総合レベルは、本発明の組換えウイルスの複製速度にも依存する。したがって、組換えウイルスからのレポーター遺伝子の真の発現レベルを決定するためには、この総合レベルを、細胞培養物または動物モデル中の組換えウイルスの力価で除算すべきである。
本発明の方法と共に使用することができるレポーター遺伝子としては、下記の表4に列挙する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2008537482
レポーター遺伝子の存在量は、中でも、ウェスタンブロット分析もしくはノーザンブロット分析、またはヌクレオチド配列の転写、そのmRNAそのタンパク質の豊富さの定量のために使用される任意の他の技術によって、測定することができる(Short Protocols in Molecular Biology、Ausubelら(編)、John Wiley & Sons, Inc.、第4版、1999年参照)。ある種の実施形態において、レポーター遺伝子産物の活性は、組換えウイルスからのレポーター遺伝子発現の読出しとして測定される。レポーター遺伝子産物の活性の定量のために、レポーター遺伝子産物の生化学的特性を使用することができる(表4参照)。レポーター遺伝子産物の生化学的活性を測定するための方法は、当業者に周知である。本発明の方法と共に使用することができる例示的なレポーター遺伝子の、より詳細な説明を以下に示す。
5.8.3 感染発生率の測定
感染発生率は、当該分野で周知の任意の方法によって決定することができ、例えば、限定されないが、臨床試料(例えば、鼻腔スワブ)を、それぞれ抗APV抗原抗体、抗hMPV抗原抗体、抗APV抗原抗体、および/または異種ヌクレオチド配列の遺伝子産物に特異的である抗体を用いた、免疫蛍光アッセイ(IFA)によって、本発明のウイルスの存在について試験することができる。
ある種の実施形態において、インタクトな細胞を含む試料を直接処理することができるが、インタクトな細胞を含まない分離株は、まず、許容細胞系(例えば、HEp-2細胞)上で培養するべきである。例示的な実施形態において、培養された細胞懸濁液は、例えば300xgで5分間室温での遠心分離と、それに続く同じ条件下でのPBS、pH7.4 (Ca++およびMg ++フリー)洗浄によって、澄まされるべきである。細胞ペレットを、分析のために少量のPBS中に再懸濁する。インタクトな細胞を含む初代臨床分離株をPBSと混合し、300xgで5分間、室温で遠心分離する。界面から無菌ピペットチップで粘液を除去、同じ条件下で細胞ペレットをもう1回PBSで洗浄する。次いで、ペレットを、分析のために少量のPBSに再懸濁する。5〜10μlの各細胞懸濁液を、アセトン洗浄した12ウェルHTC超硬化スライドガラス上の5mmウェルごとに点在させ、空気乾燥させる。スライドを冷たい(-20℃)アセトン中で10分間固定する。PBS-1% BSAを各ウェルに加え、それに続いて室温で10分間インキュベーションすることによって、反応をブロックする。スライドをPBS-0.1%Tween20中で3回洗浄し、空気乾燥する。10μlの、ブロッキング緩衝液中250ng/mlまで希釈した各一次抗体試薬を、ウェルごとに点在させ、加湿した37℃環境中で30分間、反応をインキュベートする。次いで、PBS-0.1%Tween20を3回替えてスライドを徹底的に洗浄し、空気乾燥する。10μlの、ブロッキング緩衝液中250ng/mlまで希釈した適当な二次結合抗体試薬をそれぞれのウェルごとに点在させ、加湿した37℃環境中で更に30分間反応をインキュベートする。次いで、PBS-0.1%Tween20を3回替えてスライドを洗浄する。5μlのPBS-50%グリセロール-10mM Tris pH8.0-1mM EDTAを反応ウェルごとに点在させ、スライドにカバースリップを載せる。各反応ウェルを、その後蛍光顕微鏡によって、B-2Aフィルター(EX 450〜490nm)を用いた200×倍率で分析する。陽性反応を、未染色細胞または二次試薬のみで染色した細胞から得られる自己蛍光バックグラウンドに対して採点する。陽性反応は、感染細胞の細胞質中の小さい封入体で断続した明るい蛍光によって特徴付けられる。
5.8.4 血清力価の測定
抗体血清力価は、当該分野で周知の任意の方法によって決定することができ、例えば、限定されないが、血清試料中の抗体または抗体断片の量を、サンドイッチELISAによって定量することができる。簡潔に述べると、ELISAは、マイクロタイタープレートを、血清中の抗体または抗体断片を認識する抗体で、一晩4℃でコーティングすることからなる。次いで、プレートを、PBS-Tween-0.5% BSAで、およそ30分間、室温でブロックする。PBS-Tween-BSA中で希釈した、精製された抗体または抗体断片を使用して標準曲線を構築し、試料をPBS-BSA中で希釈する。試料および標準を、アッセイプレートの二連のウェルに加え、およそ1時間、室温でインキュベートする。次に、非結合抗体をPBS-Tweenで洗い落とし、結合抗体を標識二次抗体(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgG)で、およそ1時間、室温で処理する。標識された抗体の結合を、標識に特異的な色素形成基質を加えること、および、例えば分光光度計によって、基質代謝回転の速度を測定することによって、検出する。血清中の抗体または抗体断片レベルの濃度は、ある一定の希釈での試料の基質代謝回転の速度と標準曲線の基質代謝回転の速度との比較によって、決定される。
5.8.5 血清学的試験
本発明のある種の実施形態において、哺乳動物MPVの成分に結合する抗体の存在を検出する。具体的には、哺乳動物MPVのタンパク質に対する抗体の存在を対象において検出して、対象における哺乳動物MPVの存在を診断することができる。当業者に公知の任意の方法を用いて、哺乳動物MPVの成分に対する抗体の存在を検出することができる。
別の実施形態において、MPVに感染している疑いのある宿主由来の試料を、MPVに対する抗体またはその成分と接触させること、および複合体の形成を検出することによって、血清学的試験を行うことができる。かかる実施形態において、血清学的試験は、MPV曝露に対する宿主抗体応答の存在を検出することができる。本発明のアッセイにおいて使用して宿主抗体またはMPV成分を検出することができる抗体は、当該分野で公知の任意の方法を用いて産生することができる。かかる抗体をの操作、作製によって、核酸、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、タンパク質、炭化水素、またはそれらの組合せを含むが、これらに限定されない、種々のエピトープを検出することができる。本発明の別の実施形態において、血清学的試験は、MPVに感染している疑いのある宿主由来の試料をMPVの成分に接触させること、および複合体の形成を検出することによって、行うことができる。かかる方法の例は当該分野で周知であり、直接免疫蛍光法、ELISA、ウェスタンブロット、免疫クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない。
例示的な実施形態において、哺乳動物MPVの成分を、固体支持体に連結させる。特定の実施形態において、哺乳動物MPVの成分は、Fタンパク質またはGタンパク質であってもよいが、これらに限定されない。続いて、哺乳動物MPVに対する抗体の存在について試験される物質を、哺乳動物MPV成分に対する抗体の結合を促進する条件下で、固体支持体と共にインキュベートする。続いて、固体支持体を、任意の非特異的に結合した抗体を除去する条件下で、洗浄する。洗浄工程の後、結合抗体の存在を、当業者に公知の任意の技術を用いて検出することができる。特定の実施形態において、哺乳動物MPVタンパク質-抗体複合体を、対象の種によって生成された抗体を認識する、検出可能に標識された抗体（例えば、対象がコトンラットである場合、検出可能に標識された該抗体はラット抗体に対する）と共に、哺乳動物MPVの成分に結合している抗体に対する検出可能に標識された該抗体の結合を促進する条件下で、インキュベートする。特定の実施形態において、検出可能に標識された抗体を、酵素活性に結合させる。別の実施形態において、検出可能に標識された抗体を、放射性標識する。次いで、哺乳動物MPVタンパク質-抗体-検出可能に標識された抗体の複合体を洗浄し、その後、検出可能に標識された抗体の存在を、当業者に公知の任意の技術によって定量し、ここで、使用される技術は、検出可能に標識された抗体の標識の型による。
5.8.6 BIACOREアッセイ
抗体結合の速度パラメーターの決定は、例えば、抗原が固定されているセンサーチップ表面での、0.05%Tween20を含むHBS緩衝液中の種々の濃度の250μLのモノクローナル抗体(「mAb」)の注射によって、決定することができる。抗原は、哺乳動物MPVの任意の成分であってよい。特定の実施形態において、抗原は、哺乳動物MPVのFタンパク質またはGタンパク質であってもよいが、これらに限定されない。流速は、75μL/分で維持される。解離データを15分間、または必要に応じてそれより長時間収集する。各注射/解離サイクルの後、結合しているmAbを、希酸、典型的には10〜100mM HClの短い1分パルスを用いて、抗原表面から除去するが、状況が許せば他の再生剤が使用される。
より具体的には、会合の速度konおよび解離の速度koffの測定のために、標準的なアミンカップリング化学反応、即ちEDC/NHS法(EDC=N-ジエチルアミノプロピル)-カルボジイミド)の使用によって、抗原をセンサーチップ表面に直接固定する。簡潔に述べると、10mM NaOAc、pH4またはpH5中の、抗原の5〜100nM溶液を調製し、およそ30〜50 RU (BiacoreRESONANCE UNIT)の量の抗原を固定するまで、EDC/NHS活性化表面を通過させる。これに続いて、未反応の活性エステルに対して1MのEt-NH2の注射で「締めくくり」をする。抗原を含んでいない空白の表面を、参照目的のために、同一の固定条件下で調製する。一旦適した表面が調製されると、HBS/Tween-20中で抗体試薬のそれぞれ1つの適当な希釈系列を調製し、連続して連結された、抗原および参照細胞表面の両方を通過させる。調製される抗体濃度の範囲は、平衡結合定数KDがいくらに推定されるかによって変化する。上述のように、結合抗体を、適当な試薬を用いた各注射/解離サイクルの後に除去する。
一旦完全なデータセットを収集し、装置製造業者であるBiacore, Inc. (ニュージャージー州ピスカタウェイ)によって供給されるアルゴリズムを用いて、得られた結合曲線を全体的に適合させる。全てのデータを1:1ラングミュア結合モデルに適合させる。これらのアルゴリズムは、konおよびkoffの両方を計算し、これから2つの速度定数の比(即ち、koff/kon)として見かけの平衡結合定数KDが推定される。個々の速度定数をどのようにして導くかの、より詳細な処理は、BIAevaluationソフトウェアハンドブック(BIAcore, Inc.、ニュージャージー州ピスカタウェイ)に見ることができる。
5.8.7 微量中和アッセイ
抗体またはその抗体結合性断片がウイルス感染性を中和できるかどうかを、微量中和アッセイによって決定する。この微量中和アッセイは、Andersonら(1985年、J. Clin. Microbiol. 22:1050〜1052頁、その開示は、その全体が参照によって本明細書中に援用される)によって記載されている手順の改変である。この手順はまた、Johnsonら、1999年、J. Infectious Diseases 180:35〜40頁にも記載されており、その開示は、その全体が参照によって本明細書中に援用される。
96ウェルプレートを使用して、3点1組で抗体希釈液を作製する。106 TCID50の哺乳動物MPVを、抗体またはその抗原結合性断片の連続希釈と共にインキュベートし、96ウェルプレートのウェル中、37℃で2時間試験する。次いで、Vero細胞(2.5×104)等の、しかしこれに限定されない、哺乳動物MPVでの感染に感受性のある細胞を各ウェルに加え、5% CO2中、37℃で5日間培養する。5日後、培地を吸引し、細胞を洗浄し、80%メタノールおよび20% PBSでプレートに固定する。次いで、Fタンパク質発現等のウイルス抗原によって、ウイルス複製を決定する。固定した細胞を、洗浄したFタンパク質モノクローナル抗体等の(例えば、pan Fタンパク質、C部位特異的MAb 133-1H)ビオチン結合抗ウイルス抗原と共にインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンをウェルに加える。ウェルを再び洗浄し、基質TMB(チオニトロ安息香酸)の代謝回転を450nmで測定する。中和力価を、ウイルスのみの対照細胞からの、450nmでの吸光度(OD450)の少なくとも50%の減少を引き起こす抗体濃度として表す。
本明細書中に記載されている微量中和アッセイは、一例のみである。あるいは、標準的な中和アッセイを使用して、どれだけ有意にウイルスが抗体によって影響を及ぼされるかを決定することができる。
5.8.8 ウイルス融合阻害アッセイ
このアッセイは、細胞が抗体の添加の前に4時間、それぞれのウイルスに感染しており、読出しが細胞の融合の有無に関する点を除いて、原則として、微量中和アッセイと同一である(Taylorら、1992年、J. Gen. Virol. 73:2217〜2223頁)。
5.8.9 等温滴定熱量測定
熱力学的結合親和性およびエンタルピーを、抗体の、それらのそれぞれ抗原との相互作用に関する、等温滴定熱量測定(ITC)測定から決定する。
抗体を透析物中で希釈し、濃度を、280nmでのピーク最大での217,000M-1cm-1の吸光係数を用いて、Perkin-Elmer Lambda 4B分光光度計によるUV分光吸収測定によって決定する。その吸光係数はあまりに低く、多量の試料を使用し失うことなしには正確な濃度を決定できないので、希釈した哺乳動物MPV抗原濃度を、元々の試料の質量の、希釈した試料のものに対する比から計算する。
ITC測定
抗体の結合熱力学量を、Microcal, Inc. VP Titration Calorimeterを用いたITC測定から決定する。VP滴定熱量計は、断熱性密閉箱に囲まれた試料容器および参照容器(1.409ml)の一対組合せ、ならびに試料容器へリガンド溶液を滴定するための回転するスターラーシリンジからなる。ITC測定を、25℃および35℃で行う。試料容器はリン酸緩衝液中の抗体を含んでいたが、参照容器は、緩衝液のみを含む。リン酸緩衝液は、HyClone, Inc.の、pH7.4の生理食塩水67mM PO4である。0.05〜0.1mM RSV抗原、PIV抗原、および/またはhMPV抗原溶液の一定分量5または10μlを、熱交換シグナルの欠如によって明らかなように結合が飽和するまで、3〜4分隔てて抗体試料溶液に滴定する。
Micocal, Inc.の、非線形最小二乗最小化ソフトウエアプログラムであるOrigin 5.0を使用して、以下の等式(I)に従って、総熱量Qtのi番目の滴定の増分の熱量(ΔQ(i))を、総滴定剤濃度Xtに適合させる。
Qt=nCtΔHb°V{1+Xt/nCt + 1/nKbCt - [(1 + Xt/nCt + 1/nKbCt)2 - 4Xt/nCt]1/2}/2 (1a)
ΔQ(i)=Q(i) + dVi/2V {Q(i) + Q (i-1)} - Q(i-1) (1b)
式中、Ctは試料容器中の最初の抗体濃度であり、Vは試料容器の容積であり、nは、Kb、ΔHb°、およびnの値を生じる結合反応の化学量論である。Kbの決定のための試料濃度の最適範囲は、1μMで、決定できる最大Kbが2.5×108 M-1未満であるように、Kbの値により、以下の関係によって定義される。
Ct Kbn≦500 (2)
最初の滴定剤添加が結合等温線に適合しない場合、それはシリンジ開口部-溶液界面での気泡の放出を反映する場合があるので、それは最終的な分析において無視した。
5.8.10 免疫アッセイ
免疫沈降手順は、一般に、タンパク質ホスファターゼおよび/またはプロテアーゼ阻害剤(例えば、EDTA、PMSF、159アプロチニン、バナジウム酸ナトリウム)を補充したRIPA緩衝液(1% NP-40またはTriton X-100、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、0.15 M NaCl、pH7.2の0.01Mリン酸ナトリウム、1%トラジロール)等の溶解緩衝液中で細胞の集団を溶解させること、目的の抗体を細胞溶解物に加えること、4℃で、ある時間に亘って(例えば4時間まで)インキュベートすること、タンパク質Aおよび/またはタンパク質Gセファロースビーズを細胞溶解物に加えること、4℃で約1時間以上インキュベートすること、溶解緩衝液中でビーズを洗浄すること、ならびにビーズをSDS/試料緩衝液中に再懸濁することを含む。目的の抗体が特定の抗原を免疫沈降することができるかどうかは、例えば、ウェスタンブロット分析によって評価することができる。当業者は、改変して抗原に対する抗体の結合を増大させ、バックグラウンドを減少させることができるパラメーター(例えば、細胞溶解物をセファロースビーズで予め澄ませること)について、精通されていよう。免疫沈降手順に関するさらなる考察については、例えば、Ausubelら編、1994年、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons, Inc.、ニューヨーク、10、16、1頁を参照のこと。
ウェスタンブロット分析は、一般に、タンパク質試料を調製すること、ポリアクリルアミドゲル(例えば、抗原の分子量によって8%〜20%のSDS-PAGE)中でのタンパク質試料の電気泳動、ポリアクリルアミドゲルから、ニトロセルロース、PVDFまたはナイロン等の膜へタンパク質試料を移すこと、ブロッキング溶液(例えば、3%のBSAまたは脱脂乳を含むPBS)中で膜をブロックすること、洗浄緩衝液(例えば、PBSTween20)中で膜を洗浄すること、膜を、ブロッキング緩衝液中で希釈した一次抗体(目的の抗体)と共にインキュベートすること、膜を洗浄緩衝液中で洗浄すること、膜を、ブロッキング緩衝液中で希釈した、酵素基質(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)または放射性分子(例えば、12Pまたは121I)に結合した二次抗体(一次抗体を認識する、例えば、抗ヒト抗体)と共にインキュベートすること、膜を洗浄緩衝液中で洗浄すること、ならびに抗原の存在を検出することを含む。当業者は、改変して検出されるシグナルを増大させ、暗雑音を減少させることができるパラメーターについて、よく知っているであろう。ウェスタンブロット手順に関するさらなる考察については、例えば、Ausubelら編、1994年、GinTent Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons, Inc.、ニューヨークの10.8.1を参照のこと。
ELISAは、抗原を調製すること、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを、抗原でコーティングすること、ウェルに結合しなかった抗原を洗い落とすこと、酵素基質(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)等の検出可能な化合物に結合した目的の抗体をウェルに加えること、ならびにある時間に亘ってインキュベートすること、結合していない、または非特異的に結合している抗体を洗い落とすこと、ならびにウェルをコーティングしている抗原に特異的に結合している抗体の存在を検出することを含む。ELISAにおいて、目的の抗体は、検出可能な化合物に結合させる必要はないが、検出可能な化合物に結合した二次抗体(目的の抗体を認識する)を、ウェルに加えてもよい。更に、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングしてもよい。この場合、検出可能な分子は、酵素基質(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)等の検出可能な化合物に結合した抗原であってもよい。改変してシグナル検出および他のELISAの変化を増大させることができるパラメーターは、当業者に周知である。ELISAに関するさらなる考察については、例えば、Ausubelら編、1994年、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons, Inc.、ニューヨーク、11.2.1を参照のこと。
抗体の、抗原に対する結合親和性(抗体断片もしくはその変異体を含むか、または、あるいはそれらからなる、scFvまたは他の分子を含む)、および抗体-抗原相互作用の解離速度は、競合的結合アッセイによって決定することができる。競合的結合アッセイの一例は、増大する量の未標識抗原の存在下での、標識した抗原(例えば、3Hまたは121I)の、目的の抗体とのインキュベーション、および標識した抗原に結合している抗体の検出を含む、ラジオ免疫アッセイである。
5.8.11 ショ糖密度勾配アッセイ
異種タンパク質がウイルス粒子に組み込まれるかどうかの問題は、当業者に公知の任意の生化学的アッセイの使用によって、更に調査することができる。特定の実施形態において、ショ糖密度勾配アッセイを使用して、異種タンパク質がウイルス粒子に組み込まれるかどうかを決定する。
感染細胞溶解物を、20〜60%ショ糖密度勾配中で分画することができ、種々の画分を収集し、例えばウェスタンブロット分析によって、異種タンパク質およびベクタータンパク質の存在および分布について分析する。画分およびウイルスタンパク質はまた、プラークアッセイによって、ピークウイルス価についてもアッセイすることができる。異種タンパク質がウイルス粒子と共に移動する場合、異種タンパク質は、ウイルス粒子と結合している。
5.9 新たなMPVの分離株を同定する方法
本発明は、哺乳動物MPV、具体的にはhMPVに関する。本発明はMPVの2つの血清学的サブグループAおよびBの特徴付けならびにMPVの4種の変異体A1、A2、B1およびB2の特徴付けを提供するが、本発明は、これらのサブグループおよび変異体に限定されない。本発明は、本明細書中に記載されているサブグループおよび変異体に属する、または未だ特性不明のサブグループもしくは変異体に属するとみなされているものを含めて、未同定の任意のMPV分離株を包含する。
所定の試料中に存在するタンパク質成分を特徴付けするために、免疫アッセイを使用することができる。免疫アッセイは、同定のためにウイルスのペプチド成分を使用してウイルス分離株を比較する有効な方法である。例えば、本発明は、本明細書に示すようなさらなるMPV分離株を同定する方法をここに提供するが、この方法は、本質的にMPVに感染していない、または特定の病原体を含まないモルモットまたはフェレット(詳細な説明においては、動物は鼻腔内接種されているが、他の場合に接種は筋肉内または皮内接種等であった上、他の実験動物を使用することもまた、実行可能である)に原型分離株I-2614または関連する分離株を接種することを含む。0日目、接種後2週目および3週目に、動物から血清を収集する。それぞれの分離株I-2614に対するウイルス中和(VN)アッセイ(VNアッセイの例については、実施例16参照)および間接的IFA(IFAの例については、実施例11または14参照)で測定すると、動物は特異的に血清変換し、血清変換した動物由来の血清を、前記さらなる分離株の免疫学的検出において使用する。一例として、本発明は、ヒトにおいて深刻なRTIを引き起こす場合がある、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、ヒトメタニューモウイルスまたはメタニューモウイルス様ウイルス(その最終的な分類には、ウイルス分類法委員会の考察が待たれるため、本明細書中では、MPVは、例えば、分類学的にAPVに対応するものとして記載する)(MPV)のファミリーの、新しいメンバーの特徴付けを提供する。MPVによって引き起こされる疾患の臨床兆候は、本質的に、咳、筋痛、嘔吐、熱性細気管支炎もしくは肺炎、可能性のある結膜炎、またはそれらの亘って等の、hRSVによって引き起こされるものと同様である。hRSV感染した子供に見られるように、特に幼児は、入院を必要とする場合がある。一例として、2001年1月19日にI-2614としてCNCM、パストゥール研究所、パリに寄託されたMPVまたは系統学的にそれに対応するウイルス分離株を本明細書中に提供する。それに加えて、本発明は、配列番号19の核酸配列に系統学的に対応する、または構造的にそれに対応する、核酸または機能的断片を含む、ウイルスを提供する。具体的には、本発明は、100のブートストラップおよび3のジャンブルを用いて最尤樹を生じる系統樹分析で検定した後、トリ鼻気管炎の病原体であるシチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)としても知られている、トリニューモウイルス(APV)のウイルス分離株との関連性よりも、I-2614としてCNCM、パリに寄託されたウイルス分離株に系統学的に密接に対応することが判明していることを特徴とする、ウイルスを提供する。前記系統樹分析においてAVP-Cウイルス分離株を外集団として使用することが、特に有用であり、これは、本質的に非哺乳動物ウイルスではあるが、最も密接な近縁体である。
5.9.1バイオインフォマティクスおよび配列のアラインメント
BLAST (Altschul, S.F.ら、1990年、J. Mol. Biol. 215:403〜410頁)によって、2つ以上のアミノ酸配列を比較して、それらの互いの配列相同性および配列同一性を決定することができる。BLAST (Altschul, S.F.ら、1990年、J. Mol. Biol. 215:403〜410頁)によって2つ以上のヌクレオチド配列を比較して、それらの互いの配列相同性および配列同一性を決定することができる。BLAST比較は、Clustal W法(マックベクター(MacVector) (商標))を用いて行うことができる。ある種の特定の実施形態において、コンピュータプログラムによる2つ以上の配列のアラインメントの後に、手作業の再調整が続く場合がある。
2つの配列の間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。2つの配列の比較に利用される、好ましい、数学的アルゴリズムの非限定的な例は、KarlinおよびAltschul、1993年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873〜5877頁として改変された、KarlinおよびAltschul、1990年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264〜2268頁のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Altschulら、1990年、J. Mol. Biol. 215: 403〜410頁のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれる。BLASTヌクレオチド比較は、NBLASTプログラムで行うことができる。BLASTアミノ酸配列比較は、XBLASTプログラムで行うことができる。比較目的でギャップのあるアラインメントを得るために、Altschulら、1997年、Nucleic Acids Res. 25:3389〜3402頁に記載されているように、Gapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-Blastを使用して、分子の間の離れた関係を検出する、繰り返しの検索を行うことができる(Altschulら、1997年、前出)。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターを使用することができる(http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの、別の好ましい非限定的な例は、MyersおよびMiller、1988年、CABIOS 4:11〜17頁のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重み付け残基表(weight residue table)を使用することができる。ギャップ長ペナルティは、当業者によって設定することができる。2つの配列の間の同一性パーセントは、ギャップの許容ありまたはなしで、上述のものと同様の技術を用いて決定することができる。同一性パーセントの計算においては、通常は、完全な一致だけがカウントされる。
5.9.2 ハイブリダイゼーション条件
哺乳動物MPVの核酸に、もしくはその逆の相補鎖にハイブリダイズする核酸、またはその相補鎖を本発明の方法において使用して、それらの互いの配列相同性および同一性を決定することができる。ある種の実施形態において、核酸は、高ストリンジェンシー(stringency)の条件下でハイブリダイズする。限定ではなく例として、かかる高ストリンジェンシーの条件を使用する手順は、以下の通りである。DNAを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを、6×SSC、50 mM Tris-HCl (pH7.5)、1mM EDTA、0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.02% BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNAで構成される緩衝液中、65Cで8時間から一晩行う。フィルターを、100μg/mlの変性サケ精子DNAおよび5〜20×106cpmの32P標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中、65Cで48時間ハイブリダイズさせる。2×SSC、0.01% PVP、0.01% Ficoll、および0.01% BSAを含む溶液中、37Cで1時間フィルターの洗浄を行う。この後、0.1×SSC中、50Cで45分間洗浄し、その後オートラジオグラフィーを行う。使用してもよい、高ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。本発明の他の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、中度または低ストリンジェンシー条件で行われ、かかる条件は、当業者に周知である(例えば、Sambrookら、1989年、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー参照;また、Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987〜1997年中、Current Protocols、(著作権)1994〜1997年、John Wiley and Sons, Inc.参照)。
5.9.3 系統学的分析
本発明は、哺乳動物MPVの分離株の間の系統学的関係の推論に関する。系統学的関係を分析するために、多くの方法または手法が利用可能であり、これらは、距離、最尤、および最大節約法を含む(Swofford, DL.ら、Phylogenetic Inderence. Molecular Systematics、Hillis, DM、Mortiz, CおよびMable BK編、1996年、Sinauer Associates:米国マサチューセッツ、407〜514頁中、Felsemsteon, J.、1981年、J. Mol. Evol. 17:368〜376頁)。また、ブートストラップ技法は、得られた系統樹の信頼区間を調製および調査する、有効な手段である(Felsenstein, J.、1985年、Evolution. 29:783〜791頁)。哺乳動物MPV分離株を比較するためのヌクレオチドまたはペプチド配列情報を使用する任意の方法または手法を使用して、距離、最尤、および最大節約法または手法を含むがこれらに限定されない、系統学的関係を確立することができる。ブートストラッピングを含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法を使用して、系統学的データの質を分析することができる。系統学的手法における使用のためのヌクレオチドまたはペプチド配列データのアラインメントとしては、手作業のアラインメント、コンピュータペアワイズアラインメント、およびコンピュータマルチプルアラインメントが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、必要な情報および割り当てられる時間に基づいて使用される、好ましいアラインメント方法または系統学的手法を熟知しているであろう。
一実施形態において、DNA最尤法を使用して、hMPV分離株の間の関係が推論される。別の実施形態において、ブートストラップ技法を使用して、前記系統学的手法の1つを使用して作成された系統学的データの確実性が決定される。別の実施形態において、系統学分析に対する配列規則性入力の効果を最小限にするために、ジャンブリング技術を系統学的手法に適用した後で、データを入力する。特定の一実施形態において、DNA最尤法が、ブートストラッピングと共に使用される。別の特定の実施形態において、DNA最尤法が、ブートストラッピングおよびジャンブリングと共に使用される。別の、より具体的な実施形態において、DNA最尤法が、50のブートストラップと共に使用される。別の特定の実施形態において、DNA最尤法が、50のブートストラップおよび3のジャンブリングと共に使用される。別の特定の実施形態において、DNA最尤法が、100のブートストラップおよび3のジャンブリングと共に使用される。
一実施形態において、hMPVの分離株由来の核酸またはペプチド配列情報は、他のhMPV分離株の配列と、比較またはアラインメントされる。アミノ酸配列は、Lタンパク質、Mタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、またはFタンパク質のアミノ酸配列であってもよい。別の実施形態において、hMPV分離株または幾つかのhMPV分離株由来の核酸またはペプチド配列情報は、他のウイルスの配列と、比較またはアラインメントされる。別の実施形態において、系統学的手法は、系統学的関係が推論できるようにおよび/または系統樹が構築できるように、配列アラインメントデータに適用される。ヌクレオチドまたはペプチド配列情報を使用してhMPV分離株を比較する任意の方法または手法を使用して、距離、最尤、および最大節約法または手法を含むがこれらに限定されない、前記系統学的関係を推論することができる。
系統学的分析のための他の方法は、国際公開第02/057302号として公開されている国際特許出願第PCT/NL02/00040号に開示されており、これは、その全体が本明細書中に援用される。具体的には、PCT/NL02/00040は、系統学分析に適した核酸配列を、12頁27行目〜19頁27行目に開示しており、これは、参照によって本明細書中に援用される。
系統学的分析のために、ウイルスを比較する外集団として、非MPVの核酸配列を得ることが最も有用であり、トリニューモウイルス血清型C (APV-C)から、非常に有用な外集団分離株を得ることができる。
多くの方法およびプログラムが当該分野で公知であり、系統学的関係の推論に使用することができ、BioEdit、ClustalW、TreeView、およびNJPlotを含むがこれらに限定されない。配列をアラインメントし、系統樹または系統学的関係を生じるのに使用される方法は、比較される配列情報の入力を必要とする。多くの方法または形式が当該分野で公知であり、配列情報を入力するのに使用することができ、FASTA、NBRF、EMBL/SWISS、GDEタンパク質、GDEヌクレオチド、CLUSTAL、およびGCG/MSFを含むがこれらに限定されない。配列をアラインメントし、系統樹または系統学的関係を生じるのに使用される方法は、結果の出力を必要とする。情報または結果の出力において、多くの方法および形式を使用することができ、CLUSTAL、NBRF/PIR、MSF、PHYLIP、およびGDEを含むがこれらに限定されない。一実施形態において、系統学的関係を生じるために、ClustalWが、100のブートストラップおよび3のジャンブリングを有するDNA最尤法と関連して使用される。
5.10 抗体の生成
本発明はまた、哺乳動物MPVによってコードされるタンパク質に対する抗体の生成に関する。具体的には、本発明は、哺乳動物MPVのFタンパク質、Nタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、Gタンパク質、またはPタンパク質を含む、全てのMPV抗原に対する抗体の生成に関する。本発明によると、哺乳動物MPVによってコードされる任意のタンパク質、その誘導体、類似体または断片を、免疫原として使用して、かかる免疫原に免疫特異的に結合する抗体を生成してもよい。本発明の抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性のヒト、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')断片、Fab発現ライブラリーによって生成される断片、抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む)、およびエピトープ結合性断片が挙げられるが、これらに限定されない。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、即ち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスのものであってもよい。免疫グロブリン分子の、免疫学的に活性のある部分の例としては、ペプシンまたはパパイン等の酵素で抗体を処理することによって生じることができる、F(ab)およびF(ab')2断片が挙げられる。特定の実施形態において、ヒトMPVによってコードされるタンパク質に対する抗体が生成される。別の実施形態において、ヒトMPVによってコードされるタンパク質のドメインに対する抗体が生成される。
哺乳動物MPVによってコードされるタンパク質、その誘導体、類似体または断片に対するポリクローナル抗体の生成のために、当該分野で公知の種々の手順を使用してもよい。抗体の生成のために、天然のタンパク質、もしくは合成バージョン、またはその誘導体(例えば断片)の注射によって、ウサギ、マウス、ラット等を含むがこれらに限定されない、種々の宿主動物を免疫することができる。フロイント(完全および不完全)、水酸化アルミニウム等の無機ゲル、リゾレシチン等の界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG (カルミット-ゲラン桿菌(bacille Calmette-Guerin))およびコリネバクテリウム・パルバム(corynebacterium parvum)等の潜在的に有用なヒトアジュバントを含むがこれらに限定されない、種々のアジュバントを使用して、宿主種に応じて、免疫学的応答を増大させてもよい。
哺乳動物MPVによってコードされるタンパク質、その誘導体、類似体または断片に対するモノクローナル抗体の調製のために、培養物中の連続した細胞系によって抗体分子の生成を提供する、任意の技術を使用してもよい。例えば、元々KohlerおよびMilstein(1975年、Nature 256:495〜497頁)によって開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、1983年、Immunology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら、1985年、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss, Inc.、77〜96頁中)。本発明のさらなる実施形態において、モノクローナル抗体は、最近の技術を利用して、無菌動物において生成することができる(PCT/US90/02545)。本発明によると、ヒト抗体を、使用してもよく、ヒトハイブリドーマを使用することによって(Coleら、1983年、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026〜2030頁)、またはin vitroでヒトB細胞をEBVウイルスで形質転換することによって(Coleら、1985年、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss、77〜96頁)、得ることができる。実際、本発明によると、哺乳動物MPVによってコードされるタンパク質、その誘導体、類似体、または断片に特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を適当な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生成のために開発された技術(Morrisonら、1984年、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851〜6855頁、Neubergerら、1984年、Nature 312:604〜608頁、Takedaら、1985年、Nature 314:452〜454頁)を使用することができる。かかる抗体は、本発明の範囲内である。
本発明によると、一本鎖抗体の生成のために記載されている技術(米国特許第4,947,778号)を適合させて、特異的一本鎖抗体を生成することができる。本発明のさらなる実施形態は、Fab発現ライブラリーの構築のために記載されている技術(Huseら、1989年、Science 246:1275〜1281頁)を利用して、哺乳動物MPVによってコードされるタンパク質、その誘導体、類似体または断片に対する所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の、迅速かつ容易な同定を可能にする。
分子のイディオタイプを含む抗体断片は、公知の技術によって生じることができる。例えば、かかる断片としては、抗体分子のペプシン消化によって生じることができるF(ab')2断片、F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することによって生じることができるFab'断片、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生じることができるFab断片、ならびにFv断片が挙げられる。
抗体の生成において、所望の抗体についてのスクリーニングは、当該分野で公知の技術、例えばELISA(酵素免疫測定法)によって達成することができる。例えば、哺乳動物MPVによってコードされるタンパク質の特定のドメインを認識する抗体を選択するために、かかるドメインを含む、哺乳動物MPVによってコードされるタンパク質の断片に結合する生成物について、生じたハイブリドーマをアッセイしてもよい。
本発明によって提供される抗体は、MPVを検出し、またMPV感染症を治療する治療方法のために、使用することができる。
本発明の方法によって生じる抗体の特異性および結合親和性は、当業者に公知の任意の技術によって試験することができる。ある種の実施形態において、本発明の方法によって生じる抗体の特異性および結合親和性は、5.8.5、5.8.6、5.8.7、5.8.8または5.8.9の項に記載されているようにして試験することができる。
5.11 抗ウイルス剤を同定するためのスクリーニングアッセイ
本発明は、哺乳動物MPVが宿主または宿主細胞に感染する能力を阻害する化合物の同定のための方法を提供する。ある種の実施形態において、本発明は、哺乳動物MPVが宿主または宿主細胞中で複製する能力を減少させる化合物の同定のための方法を提供する。当業者に周知の任意の技術を使用して、哺乳動物MPVが宿主に感染するおよび/または宿主もしくは宿主細胞中で複製する能力を廃止または減少させる化合物をスクリーニングすることができる。特定の実施形態において、哺乳動物MPVはヒトMPVである。
ある種の実施形態において、本発明は、哺乳動物MPVが哺乳動物または哺乳動物細胞中で複製する能力を阻害する化合物の同定のための方法を提供する。より具体的には、本発明は、哺乳動物MPVが哺乳動物または哺乳動物細胞に感染する能力を阻害する化合物の同定のための方法を提供する。ある種の実施形態において、本発明は、哺乳動物MPVが哺乳動物細胞中で複製する能力を阻害する化合物の同定のための方法を提供する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。ウイルス価を決定するのに使用することができるアッセイの詳細な説明については、5.7の項を参照のこと。
ある種の実施形態において、細胞を、試験化合物と接触させ、哺乳動物MPVに感染させる。ある種の実施形態において、試験化合物の非存在下で対照培養物を哺乳動物ウイルスに感染させる。細胞を、哺乳動物MPVでの感染の前、同時、または後に、試験化合物と接触させることができる。特定の実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。更により具体的な実施形態において、細胞はヒト細胞である。ある種の実施形態において、細胞を、試験化合物と共に少なくとも1分間、少なくとも5分間少なくとも15分間、少なくとも30分間、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも5時間、少なくとも12時間、または少なくとも1日間インキュベートする。ウイルスの力価は、アッセイの間の任意の時点で測定することができる。ある種の実施形態において、培養物中のウイルス増殖の経時変化を決定する。試験化合物の存在下でウイルス増殖が阻害されるか、または減少する場合、試験化合物は、哺乳動物MPVの増殖または感染の阻害または減少に有効であると同定される。特定の実施形態において、哺乳動物MPVの増殖を阻害するか、または減少させる化合物を、哺乳動物MPVに対するその特異性を試験するために、その他のウイルスの増殖速度を阻害するか、または減少させる能力について、試験する。
ある種の実施形態において、試験化合物をモデル動物に投与し、モデル動物を哺乳動物MPVに感染させる。ある種の実施形態において、試験化合物の投与なしに、対照モデル動物を哺乳動物ウイルスに感染させる。試験化合物は、哺乳動物MPVでの感染の前、同時、または後に、投与することができる。特定の実施形態において、モデル動物は哺乳動物である。更により具体的な実施形態において、モデル動物は、コトンラット、マウス、またはサルであってもよいが、これらに限定されない。モデル動物におけるウイルスの力価は、アッセイの間の任意の時点で測定することができる。ある種の実施形態において、培養物中のウイルス増殖の経時変化を決定する。試験化合物の存在下でウイルス増殖が阻害されるか、または減少する場合、試験化合物は、哺乳動物MPVの増殖または感染の阻害または減少に有効であると同定される。特定の実施形態において、モデル動物において哺乳動物MPVの増殖を阻害するか、または減少させる化合物を、哺乳動物MPVに対するその特異性を試験するために、その他のウイルスの増殖速度を阻害するか、または減少させる能力について、試験する。
5.12 ワクチン、抗体および抗ウイルス物質の製剤
好ましい実施形態において、本発明は、本発明による核酸配列によってコードされるタンパク質性分子もしくはメタニューモウイルス特異的ウイルスタンパク質またはその機能性断片を提供する。有用なタンパク質性分子は、例えば、本発明によるウイルスから導くことができる遺伝子またはゲノム断片のいずれかに由来する。かかる分子、またはその抗原性断片は、本明細書中で提供される場合、例えば、診断方法、またはキットおよびサブユニットワクチン等の医薬組成物において有用である。抗原またはサブユニット免疫原としての含有物のための、F、SHおよび/もしくはGタンパク質またはその抗原性断片が、特に有用であるが、不活化されたウイルス全体もまた、使用することができる。系統学的分析のために同定された、系統学分析において有用なORFの好ましい境界内にあるのが当然好ましい組換え核酸断片によってコードされるタンパク質性物質もまた特に有用であり、具体的には、in vivo(例えば、防御目的のためまたは診断用抗体を提供するため)であれin vitro(例えば、ファージディスプレイ技術または合成抗体を発生させるのに有用な別の技術によって)であれ、MPV特異抗体またはT細胞応答を誘発するためのタンパク質性物質である。
本発明により提供される抗体は、本発明のタンパク質性分子またはそのMPV特異的機能的断片を含む抗原と特異的に反応する、天然のポリクローナルもしくはモノクローナル抗体または合成抗体(例えば、(ファージ)ライブラリー由来結合性分子)である。かかる抗体は、ウイルス分離株またはその成分を本発明で提供される抗体と反応させることを含む、前記ウイルス分離株をMPVと同定するための方法において有用である。これは、例えば、ELISA、RIA、FACSまたは異なる形式の抗原検出アッセイを用いて、精製された、または精製されていないMPVまたはその一部(タンパク質、ペプチド)を用いることによって、達成することができる(Current Protocols in Immunology)。あるいは、感染細胞または細胞培養物を使用して、典型的な免疫蛍光法または免疫組織化学的技術を用いて、ウイルス抗原を同定してもよい。
本発明による、ウイルス、核酸、タンパク質性分子もしくはその断片、抗原および/または抗体を含む医薬組成物は、例えば、個体に本発明による医薬組成物を提供することを含む、MPV感染および/または呼吸器系疾患の治療または予防のための方法に使用することができる。これは、前記個体がヒトを含む場合に、特に前記ヒトが5歳未満である場合、かかる乳児および小児は本明細書中に提供されるようなヒトMPVに感染する可能性が最も高いので、最も有用である。一般に、急性期において、患者は、他の呼吸および他の疾患の素因をつくる上気道症状を患う。より重篤な、および他の重篤な状態の素因をつくる、下気道疾患が起こる場合もある。本発明の組成物を、癌患者、被移植者および高齢者を含む、免疫不全の個体の治療のために使用することができる。
本発明はまた、本発明によるウイルスを含む細胞培養物または実験動物を樹立すること、前記培養物または動物を候補抗ウイルス剤で処理すること、および前記培養物または動物の前記ウイルスまたはその感染に対する前記作用物質の効果を決定することを含む、気道疾患の治療において有用な抗ウイルス剤を得る方法を提供する。かかる抗ウイルス剤の例は、本明細書中で提供される場合、MPV中和抗体、またはその機能的成分を含むが、他の性質の抗ウイルス剤もまた、得られる。本発明はまた、医薬組成物の調製のため、具体的には、特にMPV感染または関連する疾患によって引き起こされる場合、気道疾患の治療のための医薬組成物の調製のための、本発明による抗ウイルス剤の使用を提供し、MPV感染または呼吸器疾患の治療または予防のための方法において有用な、本発明による抗ウイルス剤を含む医薬組成物を提供し、前記方法は、個体にかかる医薬組成物を提供することを含む。
本発明のある種の実施形態において、本発明のワクチンは、本明細書中で定義されるような、哺乳動物メタニューモウイルスを含む。ある種のより特定な実施形態において、哺乳動物メタニューモウイルスは、ヒトメタニューモウイルスである。好ましい実施形態において、ワクチン製剤中で使用される哺乳動物メタニューモウイルスは、弱毒化表現型を有する。弱毒化表現型を得る方法については、5.6の項を参照のこと。
本発明は、PIV、RSV、APV、および/またはhMPVでの感染の予防および治療のためのワクチン製剤を提供する。ある種の実施形態において、本発明のワクチンは、本発明の組換えおよびキメラウイルスを含む。ある種の実施形態において、ウイルスは弱毒化されている。
特定の実施形態において、ワクチンはAPVを含み、該ワクチンは、ヒトにおけるhMPV感染の予防および治療のために使用される。理論に拘束されることなく、APVのFタンパク質とhMPVのFタンパク質との高度な相同性により、APVの感染は、宿主中で、hMPVと交差反応してhMPVおよび関連する疾患から宿主を保護する抗体の生成をもたらす。
別の特定の実施形態において、ワクチンはhMPVを含み、ワクチンは、シチメンチョウ等の、しかしこれらに限定されないトリにおける、APV感染の予防および治療のために使用される。理論に拘束されることなく、APVのFタンパク質とhMPVのFタンパク質との高度の相同性により、hMPVでの感染は、宿主において、APVと交差反応してAPVでの感染および関連する疾患から宿主を保護する抗体の生成をもたらす。
特定の実施形態において、本発明は、APVおよび/またはhMPVに対する防御を付与する、ワクチン製剤中での、改変されている組換えおよびキメラAPV/hMPVウイルスの使用を包含する。ある種の実施形態において、APV/hMPVは、トリに投与されてトリをAPVでの感染から保護するワクチン中で使用される。理論に拘束されることなく、APV遺伝子またはヌクレオチド配列の、hMPV遺伝子またはヌクレオチド配列での置換は、キメラウイルスのワクチンとしての使用を可能にする弱毒化表現型を生じる。他の実施形態において、APV/hMPVキメラウイルスは、ヒトに投与される。理論に拘束されることなく、APVウイルスベクターは、ヒトにおいて、弱毒化表現型を提供し、hMPV配列の発現によって、hMPV特異的免疫応答が誘発される。
特定の実施形態において、本発明は、APVおよび/またはhMPVに対する防御を付与する、ワクチン製剤中での、改変されている組換えおよびキメラhMPV/APVウイルスの使用を包含する。ある種の実施形態において、hMPV/APVは、ヒトに投与されるワクチン中で使用されて、ヒトをhMPVでの感染から保護する。理論に拘束されることなく、hMPV遺伝子またはヌクレオチド配列の、APV遺伝子またはヌクレオチド配列での置換は、キメラウイルスのワクチンとしての使用を可能にする、弱毒化表現型を生じる。他の実施形態において、hMPV/APVキメラウイルスは、トリに投与される。理論に拘束されることなく、hMPV主鎖は、トリにおいて、弱毒化表現型を提供し、APV配列の発現によって、APV特異的免疫応答が誘発される。
ある好ましい実施形態において、本発明のワクチン製剤を用いて、メタニューモウイルスによる感染および関連する疾患に対して防御する。より具体的には、本発明のワクチン製剤を用いて、ヒトメタニューモウイルスおよび/またはトリニューモウイルスによる感染および関連する疾患に対して防御する。ある種の実施形態において、本発明のワクチン製剤を用いて、(a)ヒトメタニューモウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルスならびに/または(b)トリニューモウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルスによる感染に対して防御する。
ある種の実施形態において、本発明のワクチン製剤を用いて、(a)ヒトニューモウイルスおよびヒトパラインフルエンザウイルスならびに/または(b)トリニューモウイルスおよびヒトパラインフルエンザウイルスによる感染、ならびに関連する疾患に対して防御する。
ある種の実施形態において、本発明のワクチン製剤を用いて、(a)ヒトメタニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、およびヒトパラインフルエンザウイルス、ならびに/または(b)トリニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、およびヒトパラインフルエンザウイルスによる感染、ならびに関連する疾患に対して防御する。
ある種の実施形態において、本発明のワクチン製剤を用いて、ヒトメタニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、およびヒトパラインフルエンザウイルスによる感染ならびに関連する疾患に対して防御する。ある他の実施形態において、本発明のワクチン製剤を用いて、トリニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、およびヒトパラインフルエンザウイルスによる感染、ならびに関連する疾患に対して防御する。
種々のウイルス種のFタンパク質の間の高度な相同性のために、本発明のワクチン製剤は、Fタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が導かれたものとは異なるウイルスからの防御のために、使用することができる。特定の例示的な実施形態において、ワクチン製剤は、トリニューモウイルスタイプAに由来する異種ヌクレオチド配列を含むウイルスを含み、ワクチン製剤を用いて、トリニューモウイルスタイプAおよびトリニューモウイルスタイプBによる感染から防御する。本発明は、APV-CおよびAPV-Dを含むAPV、hMPV、PIV、インフルエンザ、RSV、センダイウイルス、ムンプス、咽頭気管炎ウイルス、シミアンウイルス5、ヒトパピローマウイルス、はしか、ムンプス、ならびに他のウイルスおよび病原体ならびに関連する疾患に対する防御に有用な、ヒトおよび動物に投与するワクチン製剤を包含する。本発明は更に、ヒトメタニューモウイルス感染およびトリニューモウイルス感染ならびに関連する疾患に対する防御に有用な、ヒトおよび動物に投与するワクチン製剤を包含する。
一実施形態において、本発明は、狂犬病ウイルス、ネコ白血病ウイルス(FLV)およびイヌジステンパーウイルスを含む、家畜疾患を引き起こす作用物質に対して有用な、ワクチン製剤を包含する。更に別の実施形態において、本発明は、家畜の、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、牛疫ウイルス、豚痘ウイルスからの防御、および更には野生動物の、狂犬病ウイルスからの防御に有用な、ワクチン製剤を包含する。
逆遺伝学的手法によって生成する弱毒ウイルスを、本明細書中に記載されているワクチンおよび医薬製剤中で使用することができる。逆遺伝学的技法を使用して、さらなる変異をワクチン生産に重要な他のウイルス遺伝子に操作して加えることもできる。即ち、有用なワクチン株変異体のエピトープを、弱毒ウイルス中に操作して導入することができる。あるいは、他のウイルス性または非ウイルス性病原体由来の抗原を含む、完全な外来エピトープを、弱毒株中に操作して導入することができる。例えば、HIV (gp160、gp120、gp41)寄生虫抗原(例えば、マラリア)、細菌もしくは真菌抗原または腫瘍抗原等の非関連ウイルスの抗原を、弱毒株中に操作して導入することができる。あるいは、in vivoでウイルスのトロピズムを変化させるエピトープを、本発明のキメラ弱毒ウイルス中に操作して導入することができる。
実質的に任意の異種遺伝子配列を、ワクチンにおける使用のための本発明のキメラウイルスに構築することができる。好ましくは、生物学的応答修飾因子として作用する部分およびペプチド。好ましくは、種々の病原体のいずれかに対する防御免疫応答を誘導するエピトープ、または中和抗体に結合する抗原が、キメラウイルスによって、またはキメラウイルスの一部として、発現されてもよい。例えば、本発明のキメラウイルスに構築することができる異種遺伝子配列としては、インフルエンザおよびパラインフルエンザ血球凝集素ノイラミニダーゼ、ならびにヒトPIV3のHNおよびF遺伝子等の融合糖タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。更に別の実施形態において、キメラウイルス中に操作して導入することができる異種遺伝子配列としては、免疫調節活性を有するタンパク質をコードするものが挙げられる。免疫調節タンパク質の例としては、サイトカイン、1型インターフェロン、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン-1、-2、-4、-5、-6、-12、およびこれらの作用物質のアンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。
また、ワクチンにおける使用のための本発明のキメラウイルスに構築することができる異種遺伝子配列としては、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、好ましくは1型または2型に由来する配列が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、抗原の供給源であってもよい免疫原性HIV由来ペプチドを、次いで使用して脊椎動物免疫応答を誘発してもよい、キメラPIVに構築してもよい。かかるHIV由来ペプチドとしては、env遺伝子(即ち、gp160、gp120、および/またはgp41の全てまたは一部をコードする配列)、pol遺伝子(即ち、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、および/またはインテグラーゼの全てまたは一部をコードする配列)、gag遺伝子(即ち、p7、p6、p55、p17/18、p24/25の全てまたは一部をコードする配列)、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、および/またはvpxに由来する配列が挙げられるが、これらに限定されない。
他の異種配列は、幾つか挙げると、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)、A型またはC型肝炎ウイルス表面抗原、エプスタイン-バーウイルスの糖タンパク質、ヒトパピローマウイルスの表面抗原、呼吸器合胞体ウイルスの糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス5またはムンプスウイルス、インフルエンザウイルスの糖タンパク質、ヘルペスウイルスの糖タンパク質、ポリオウイルスのVP1、細菌および寄生生物等の非ウイルス性病原体の抗原決定基に由来してもよい。別の実施形態において、免疫グロブリン遺伝子の全てまたは一部が発現されてもよい。例えば、かかるエピトープを模倣する抗イディオタイプ免疫グロブリンの可変領域を、本発明のキメラウイルスに構築してもよい。
他の異種配列は、腫瘍抗原に由来してもよく、得られたキメラウイルスを使用して、in vivoの腫瘍退縮につながる腫瘍細胞に対する免疫応答を生じてもよい。これらのワクチンを、腫瘍の治療のための、化学療法、放射線療法、外科手術、骨髄移植等を含むがこれらに限定されない、他の治療計画と組み合わせて使用してもよい。本発明に従って、組換えウイルスを操作して、T細胞によって認識されるヒト腫瘍抗原(RobbinsおよびKawakami、1996年、Curr. Opin. Immunol. 8:628〜636頁、その全体が参照によって本明細書中に援用される)、gp100、MART-1/MelanA、TRP-1 (gp75)、チロシナーゼを含むメラニン細胞系タンパク質;腫瘍特異的な、広く共有された抗原、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-1、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-V、p15;腫瘍特異的変異抗原、β-カテニン、MUM-1、CDK4;乳癌、卵巣癌、子宮頸癌および膵臓癌の非黒色腫抗原、HER-2/neu、ヒトパピローマウイルス-E6、-E7、MUC-1を含むがこれらに限定されない、腫瘍関連抗原(TAA)を発現させてもよい。
更に他の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルスおよび/またはトリニューモウイルス等のメタニューモウイルスに由来する。更に他の実施形態において、本発明のウイルスは、2つの異なる異種ヌクレオチド配列を含み、一方はヒトメタニューモウイルスおよび/またはトリニューモウイルス等のメタニューモウイルスに由来し、他方は呼吸器合胞体ウイルスに由来する。異種ヌクレオチド配列は、それぞれのウイルスのFタンパク質またはGタンパク質をコードする。特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、キメラFタンパク質をコードし、キメラFタンパク質は、メタニューモウイルスのFタンパク質の外部ドメインおよび膜貫通ドメインならびにパラインフルエンザウイルスのFタンパク質の内腔ドメインを含む。
生組換えウイルスワクチンまたは不活化組換えウイルスワクチンのいずれかを製剤化することができる。宿主における複製が天然の感染で生じるのと同様の種類および大きさの長期の刺激につながり、したがって実質的な長期に亘る免疫性を付与するので、生ワクチンが好ましい場合がある。かかる生組換えウイルスワクチン製剤の生産は、細胞培養物中またはニワトリ胚のアラントイン中でのウイルスの増殖とその後の精製を伴う、従来の方法を用いて達成してもよい。
特定の実施形態において、組換えウイルスは、それが投与される対象にとって非病原性である。これに関して、ワクチン目的のための、遺伝子操作されたウイルスの使用は、これらの菌株における特性の弱毒化の存在を要求する場合がある。トランスフェクションに用いる鋳型への適当な変異(例えば、欠失)の導入によって、弱毒化特性を有する新規のウイルスを提供してもよい。例えば、温度感受性または冷温適応に関連する特定のミスセンス変異を欠失変異にしてもよい。これらの変異は、冷温または温度感受性変異体に関連する点変異よりも安定しているべきであり、復帰頻度は極めて低いべきである。
あるいは、「自殺」特性を有するキメラウイルスを構築してもよい。かかるウイルスは、宿主内の1回または数回の複製しか経由しない。ワクチンとして使用される場合、組換えウイルスは、限定された複製サイクル(複数可)を通過し、十分なレベルの免疫応答を誘導するが、ヒト宿主において更に進んで疾患を引き起こさない。それぞれ野生型APVおよびhMPVの1つまたは複数の遺伝子を欠いた、または野生型株と比較して変異遺伝子を有する組換えウイルスは、連続した回の複製を経ることができない。かかる遺伝子(複数可)を永続的に発現する細胞系において、欠損したウイルスを生成することができる。これらの細胞系において、必須の遺伝子(複数可)を欠いたウイルスが複製されるが、ヒトに投与されると、宿主は、1回の複製を完了することができない。かかる調製物は、この不完全サイクルにおいて、免疫応答を誘導するのに十分な数の遺伝子を転写および翻訳する場合がある。あるいは、これらの調製物が不活化(死滅)ウイルスワクチンとして機能するように、より多量の菌株を投与することができる。不活化ワクチンについては、遺伝子産物がウイルス粒子と関連するように、異種遺伝子産物がウイルス成分として発現されることが好ましい。かかる調製物の利点は、それらが天然のタンパク質を含み、死滅ウイルスワクチンの製造において使用されるホルマリンまたは他の作用物質での処理による不活化を経ない点である。あるいは、cDNAから作製される本発明の組換えウイルスは、数回しか複製しないように、高度に弱毒化されてもよい。
ある種の実施形態において、本発明のワクチンは、弱毒化哺乳動物MPVを含む。理論に拘束されることはないが、ウイルスタンパク質は宿主の細胞膜に挿入され、したがって免疫応答を刺激することから、弱毒ウイルスが細胞に新たな感染性ウイルス粒子を生成させることができないとしても、弱毒ウイルスは、ワクチンとして有効であることができる。
本発明のこの態様の別の実施形態において、不活化ワクチン製剤は、従来の技術を用いてキメラウイルスを「死滅させて」調製してもよい。不活化ワクチンは、それらの感染性が破壊されているという意味で、「死んで」いる。理想的には、ウイルスの感染性は、その免疫原性に影響を及ぼすことなく破壊される。不活化ワクチンを調製するために、キメラウイルスを、細胞培養物中、またはニワトリ胚のアラントイン中で、増殖させて、ゾーン超遠心分離法によって精製し、ホルムアルデヒドまたはβ-プロピオラクトンによって不活化し、貯蔵してもよい。得られたワクチンは、通常、筋肉内に接種される。
免疫学的応答を増強するために、不活化ウイルスを、適したアジュバントと共に製剤化してもよい。かかるアジュバントとしては、無機ゲル、例えば、水酸化アルミニウム;リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン等の界面活性物質;ペプチド;油性乳濁液;ならびにBCG、コリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)、ISCOMSおよびビロソーム等の潜在的に有用なヒトアジュバントを挙げることができるが、これらに限定されない。
多くの方法を使用して、上述のワクチン製剤を導入してもよく、これらのものとしては、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経皮、ならびに鼻腔内および吸入経路が挙げられるが、これらに限定されない。ワクチンが設計される病原体の天然の感染の経路によってキメラウイルスワクチン製剤を導入することが好ましい場合がある。
ある種の実施形態において、本発明は、免疫原性組成物に関する。免疫原性組成物は、哺乳動物MPVを含む。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、ヒトMPVを含む。ある種の実施形態において、免疫原性組成物は、弱毒化哺乳動物MPVまたは弱毒化ヒトMPVを含む。ある種の実施形態において、免疫原性組成物は、薬学的に許容され得る担体を更に含む。
5.13 投薬計画、投与および製剤
本発明は、弱毒化形態のウイルス、組換え形態のMPVおよびAPV、ならびに1つまたは複数の異種または非天然抗原配列を発現するキメラMPVおよびAPVを始めとするMPVおよびAPVを含む、ワクチンおよび免疫原性調製物を提供する。本発明のワクチンまたは免疫原性調製物は、二価および三価ワクチンを含む、単一または多価のワクチンを包含する。本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、ウイルス感染に対する防御の提供において有用である。特に、本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、宿主における気道感染症に対する防御を提供する。
本発明の、組換えウイルスおよび/またはワクチンまたは免疫原性調製物は、単独で、または他のワクチンと組み合わせて投与することができる。好ましくは、本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、呼吸器合胞体ウイルスワクチン、インフルエンザワクチン、はしかワクチン、ムンプスワクチン、風疹ワクチン、肺炎球菌ワクチン、リケッチア(richettsia)ワクチン、ブドウ球菌ワクチン、百日咳ワクチンまたは気道癌に対するワクチン等の、しかしこれらに限定されない、気道疾患に対する防御を提供する他のワクチンまたは免疫原性製剤と組み合わせて投与される。好ましい実施形態において、本発明のウイルスおよび/またはワクチンは、対応する年齢で推奨される小児用ワクチンと同時に投与される。例えば、2、4または6ヶ月で、本発明のウイルスおよび/またはワクチンを、DtaP (IM)、Hib (IM)、ポリオ(IPVまたはOPV)およびB型肝炎(IM)と同時に投与することができる。12または15ヶ月で、本発明のウイルスおよび/またはワクチンを、Hib (IM)、ポリオ(IPVまたはOPV)、MMRII (登録商標) (サブQ (SubQ))、バリバックス(登録商標) (サブQ (SubQ))およびB型肝炎(IM)と同時に投与することができる。本発明の方法と共に使用することができるワクチンは、種々の刊行物、例えば、The Jordan Report 2000、米国国立衛生研究所(NIH)、国立アレルギー感染症研究所(NIAID)、微生物学感染症部門で概説されており、その内容は、全体が参照によって本明細書中に援用される。
本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、それ自体で、または医薬組成物もしくは治療組成物の形態で、対象に投与してもよい。従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠形成(dragee-making)、すりつぶし、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥の各プロセスによって、アジュバントおよび本発明の免疫原性抗原(例えば、ウイルス、キメラウイルス、変異ウイルス)を含む医薬組成物を製造してもよい。医薬組成物は、本発明の免疫原性抗原の、薬学的に使用できる調製物への加工を容易にする、1つまたは複数の生理学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤または助剤を用いて、従来の様式で製剤化してもよい。適当な製剤は、とりわけ選択する投与経路による。
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物がアジュバントを含むか、または1つまたは複数のアジュバントと共に投与される場合、使用することができるアジュバントとしては、無機塩アジュバントまたは無機塩ゲルアジュバント、粒子状アジュバント、微粒子アジュバント、粘膜アジュバント、および免疫賦活アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。アジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムゲル、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、スクアレンまたはスクアレン水中油型アジュバント製剤、生分解性および生体適合性ポリエステル、重合したリポソーム、トリテルペノイドグリコシドまたはサポニン(例えば、スティミュロン(STIMULON)、イスコプレップ(ISCOPREP)という商標でも販売されている、キルA (QuilA)およびQS-21)、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン(商標ターマータイド(TERMURTIDE)名で販売されているスレオニル-MDP)、LPS、モノホスホリルLipid A (商標MPL名で販売されている3D-MLA)が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物を投与する対象は、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトであるが、霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽(例えば、ニワトリ、シチメンチョウ)、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびげっ歯動物を含むがこれらに限定されない、非ヒト動物であってもよい。
経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経皮、鼻腔内および吸入経路、ならびに乱切法(例えば分岐した針を使用して、皮膚の最上層にかき傷をつくる)を含むがこれらに限定されない多くの方法を用いて、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物を導入してもよい。
局所投与については、本発明のワクチンまたは免疫原性調製物を、当該分野で周知のように、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液等として製剤化してもよい。
鼻腔内または吸入による投与については、本発明による使用のための調製物は、適した噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適した気体等の使用によって、加圧パックまたは噴霧器からのエーロゾルスプレー提示の形態で、簡便に送達することができる。加圧エーロゾルの場合、投薬単位は、測定された量を送達するためのバルブを提供することによって、決定してもよい。吸入器または注入器での使用のための、例えばゼラチンの、カプセルおよびカートリッジは、化合物および乳糖またはショ糖等の適した粉末基材の混合粉体を含んで製剤化してもよい。
注射については、ワクチンまたは免疫原性調製物は、水溶液中、好ましくはハンクス液、リンガー液、または生理食塩水緩衝液等の生理学的に適合性のある緩衝液中で、製剤化してもよい。溶液は、懸濁剤、安定剤および/または分散剤等の製剤用添加剤を含んでもよい。あるいは、タンパク質は、使用の前の、適したビヒクル、例えば無菌パイロジェンフリー水での構成のための粉末形態であってもよい。
投与のためのワクチンまたは免疫原性製剤の有効量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
有効量は、最初に、in vitroアッセイから予測することができる。例えば、用量は、動物モデルにおいて製剤化して、当業者に周知の技術を用いて、免疫応答の誘導を達成することができる。当業者は、本明細書中に記載される結果に基づいて、全ての動物種に対する投与を容易に最適化することができる。投薬量および間隔は、個々に調節してもよい。例えば、免疫原性組成物として使用する場合、適した用量は、上述のように投与される場合に、抗体応答を誘発することができる量である。ワクチンとして使用される場合、本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、約1〜3用量で1〜36週間の間投与してもよい。好ましくは、約2週間〜約4ヶ月の間隔で1または2用量が投与され、その後周期的に追加免疫ワクチンを投与してもよい。代替的な手順は、個々の動物に適当であってもよい。適した用量は、上述のように投与される場合、動物を少なくとも4〜12ヶ月間感染から防御するのに十分に、免疫された動物において免疫応答を起こすことができる、ワクチン製剤の量である。一般に、用量中に存在する抗原の量は、宿主1kg当たり約1pg〜約100 mgの範囲であり、典型的には約10pg〜約1mg、好ましくは約100pg〜約1μgの範囲である。適した用量範囲は、注射の経路および患者の大きさによって変化するが、典型的には、約0.1mL〜約5mLの範囲である。
特定の実施形態において、本発明のウイルスおよび/またはワクチンは、少なくとも103 TCID50、少なくとも104 TCID50、少なくとも105 TCID50、少なくとも106 TCID50の、開始の単一用量で投与される。別の特定の実施形態において、本発明のウイルスおよび/またはワクチンは、複数の用量で投与される。好ましい実施形態において、2、4、および6ヶ月での最初の投与計画ならびに生後2年目の最初の追加免疫用量が使用される。より好ましくは、少なくとも105 TCID50、または少なくとも106 TCID50の各用量が、複数回投与計画で投与される。
5.13.1 チャレンジ試験
このアッセイを用いて、本発明の組換えウイルスおよび本発明のワクチンが、コトンラットまたはハムスター等の、しかしこれらに限定されない動物モデル系において、下気道ウイルス感染を予防することができるかどうかを決定する。組換えウイルスおよび/またはワクチンを、静脈内(IV)経路によって、筋肉内(IM)経路によって、または鼻腔内経路(IN)によって、投与することができる。組換えウイルスおよび/またはワクチンを、当業者に周知の任意の技術によって投与することができる。このアッセイを用いて、抗体が結合するウイルスの肺力価の減少によって、抗体の血清濃度を補正することもできる。
0日目に、コトンラット(シグモドン・ヒスピディス(Sigmodon hispidis)、平均体重100g)カニクイザル(cynomolgous macacque) (平均体重2.0kg)等の、しかしこれらに限定されない動物のグループに、筋肉内注射によって、静脈内注射によって、または鼻腔内経路によって、目的の組換えもしくはキメラウイルスもしくはワクチンまたはBSAを投与する。本発明の組換えウイルスまたはワクチンの投与の前、同時、または後に、動物を野生型ウイルスに感染させ、ここで野生型ウイルスは、それに対してワクチンが生じたウイルスである。ある種の実施形態において、動物を、本発明の組換えウイルスおよび/またはワクチンの投与の後、少なくとも1日間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、1週間または1ヶ月以上野生型ウイルスに感染させる。
感染後、コトンラットを屠殺し、それらの肺組織を回収し、プラーク法力価測定によって肺ウイルス価を決定する。ウシ血清アルブミン(BSA) 10mg/kgを陰性対照として使用する。チャレンジの時点での血清中の抗体濃度を、サンドイッチELISAを用いて決定する。同様に、マカク(macacque)において、鼻洗浄液および肺洗浄液中のウイルス価を測定することができる。
5.13.2 標的集団
本発明のある種の実施形態において、本発明の治療および診断方法のための標的集団は、年齢によって定義される。ある種の実施形態において、本発明の治療および/または診断方法のための標的集団は、気道感染症に加えて、疾患または障害によって特徴付けられる。
特定の実施形態において、標的集団は、2歳未満の小児を包含する。より具体的な実施形態において、2歳未満の小児は、気道感染症以外の疾患を患っていない。
他の実施形態において、標的集団は、5歳より上の患者を包含する。より具体的な実施形態において、5歳より上の患者は、嚢胞性線維症、白血病、および非ホジキンリンパ腫を含む追加の疾患または障害を患っているか、または骨髄もしくは腎臓移植を最近受けている。
本発明の特定の実施形態において、標的集団は、hMPV感染が宿主の免疫抑制と関連している、対象を包含する。特定の実施形態において、対象は、免疫無防備状態の個体である。
ある種の実施形態において、本発明の方法のための標的集団は、高齢者を包含する。
特定の実施形態において、本発明の方法によって治療または診断される対象は、冬期にhMPVに感染していた。
5.13.3 臨床試験
in vitroアッセイおよび動物モデルで試験された本発明のワクチンまたはその断片は、健常成人ボランティアのグループにおいて、安全性、耐性、および薬物動態について、更に評価してもよい。ボランティアは、筋肉内、静脈内または肺送達系によって、単一用量の、本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンを投与される。各ボランティアは、単回用量の本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンを投与される前に、少なくとも24時間モニタリングされ、各ボランティアは、臨床現場で用量を投与された後、少なくとも48時間モニタリングされる。次いで、ボランティアは、投与後3、7、14、21、28、35、42、49、および56日目に、外来患者としてモニタリングされる。
以下の間隔:(1)本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンの用量の投与の前;(2)本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンの用量の投与の間;(3)本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンの用量の投与の5分、10分、15分、20分、30分、1時間、2時間、4時間、8時間、12時間、24時間、および48時間後;ならびに(4)本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンの用量の投与の3日、7日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、および56日後に、10mlの赤い蓋のヴァキュテイナー(Vacutainer)チューブを使用して、留置カテーテルまたは直接の静脈穿刺によって血液試料を収集する。試料を室温で凝固させ、遠心分離後に血清を収集する。
患者由来の試料中で本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンに対して生じる抗体の量は、ELISAによって定量することができる。PBMCならびに肺洗浄液および鼻洗浄液中のT細胞免疫性(細胞傷害性およびヘルパー応答)もまた、モニタリングすることができる。
ボランティアの血清中の抗体レベルの濃度を、投与前血清レベル(バックグラウンドレベル)を本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンの用量の投与後の各収集間隔での血清レベルから引くことによって、補正する。各ボランティアについて、薬物動態学的パラメーターを、モデル非依存的手法(Gibaldiら編、1982年、Pharmacokinetics、第2版、Marcel Dekker、ニューヨーク州)に従って、補正された血清抗体または抗体断片濃度から計算する。
5.14 哺乳動物MPVの検出法および診断法
本発明は、MPVを診断および/または検出する手段および方法を提供し、前記手段および方法は、MPV、その成分、ならびにその転写、翻訳、発現、増殖および代謝過程の産物の検出に使用できる。より具体的には、本発明は、動物および人間におけるMPV感染症を診断する手段および方法を提供し、前記手段および方法は、それだけに限らないが、MPVの成分、MPVの生活環の産物、およびMPVへの曝露または感染に対する宿主反応の産物の検出を包含する。
MPVまたはその成分、ならびにその転写、翻訳、発現、増殖および代謝過程の産物の検出に使用できる該方法は、当分野で周知であり、それだけに限らないが、分子ベースの方法、抗体ベースの方法および細胞ベースの方法を包含する。分子ベースの方法の例には、それだけに限らないが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、リアルタイムRT-PCR、核酸配列ベースの増幅(NASBA)、オリゴヌクレオチドプローブ使用法、サザンブロットハイブリッド形成、ノーザンブロットハイブリッド形成、MPVと相補的またはMPVと類似もしくは同一の核酸と試料を接触させることを含む任意の方法、および以上の方法の相互の組み合わせまたは当技術分野の方法との任意の組み合わせが挙げられる。使用できる同一または類似の核酸は、本明細書に記載されており、MPVと他のウイルスおよび生物のゲノム物質または関連産物との識別ができるほどに、当分野で周知のものでもある。抗体ベースの方法の例には、それだけに限らないが、MPVを含むと予想される試料との抗体の接触、直接免疫蛍光(DIF)、酵素免疫吸着法(ELISA)、ウェスタンブロット、免疫クロマトグラフィーなどが挙げられる。細胞ベースの方法の例には、それだけに限らないが、MPV、その成分、またはそれらの産物に曝した際にシグナルを発することのできるレポーターアッセイなどが挙げられる。別の実施形態では、該レポーターアッセイは、MPV、その成分、またはそれらの産物に曝した際にレポーターが発現されるin vitroのアッセイである。前記方法の例は、当分野で周知であり、本明細書にも記載されている。より特定の実施形態では、NASBAを使用して全核酸のプールから特定のRNAまたはDNAを増幅する。
一実施形態では、本発明は、MPVを診断および検出する手段および方法を提供するが、前記手段および方法は、MPVに結合するかまたはそれに相補的であるゲノム物質および他の核酸の検出、プロセシング済みか未プロセシングのMPVの転写および翻訳産物の検出、ならびにMPV曝露または感染に対する宿主反応の成分の検出を包含するが、それだけに限らない。
一実施形態では、本発明は、MPVのゲノム内に存在する核酸配列および核酸配列転写産物に相補的である、オリゴヌクレオチドの調製および使用によるMPVの検出に関する。更に、本発明は、MPVゲノムおよびその転写物の特定領域をコピーまたは増幅するプライマーとして前記オリゴヌクレオチドを用いた、MPVのゲノムおよびその転写産物中に存在する核酸またはその配列の検出に関する。コピーまたは増幅できるMPVゲノムおよびその転写物の該領域には、それだけに限らないが、以下のもの、即ちN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、およびL遺伝子の1種または複数の完全長および不完全長が挙げられる。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、同定目的のために、MPVのN遺伝子またはその転写物をコピーまたは増幅する方法との共同で、プライマーとして使用される。前記方法には、それだけに限らないが、PCR法、RT-PCR法、リアルタイムRT-PCR法、プライマー伸長またはランオン法、NASBA、ならびに前記オリゴヌクレオチドからの核酸配列の伸長用鋳型としてMPVの遺伝物質または転写物およびそれらの相補体を使用する他の方法が挙げられる。別の実施形態では、方法を併用して試料中のMPVの存在を検出する。当業者であれば、各アッセイの要件および適用性に精通されていよう。例えば、PCRおよびRT-PCRは、核酸の増幅または検出に有用となろう。より特定の実施形態では、リアルタイムRT-PCRは、PCR産物の常套的で信頼できる定量化に使用される。
別の実施形態では、本発明は、MPVのゲノム内に存在する核酸配列および核酸配列転写産物に相補的である、オリゴヌクレオチドの調製および使用によるMPVの検出に関する。更に、本発明は、MPVゲノムおよびその転写物内にある、またはこれらに相補的な特定領域へのハイブリッド形成、および該特定領域の検出のためのプローブとして前記オリゴヌクレオチド配列を用いた、MPVのゲノムおよびその転写産物中に存在する、またはこれらに相補的である、核酸またはその配列の検出に関する。ハイブリッド形成用プローブを用いて検出できるMPVゲノムおよびその転写物の該領域には、それだけに限らないが、以下のもの、即ちN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、およびL遺伝子の1種または複数の完全長および不完全長が挙げられる。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、同定目的のために、MPVのN遺伝子またはその転写物を検出、アニーリング、またはこれらにハイブリッド形成する方法との共同で、プローブとして使用される。前記方法には、それだけに限らないが、ノーザンブロット、サザンブロット、ならびにMPVゲノム内にある、またはこれに相補的である配列またはある長さの配列のハイブリッド形成、アニーリング、または検出のための標的として、MPVの遺伝物質または転写物およびそれらの相補体を使用する他の方法が挙げられる。
哺乳動物MPVの核酸、またはその逆相補体、またはその相補体にハイブリッド形成可能な核酸は、本発明の方法に使用することにより、哺乳動物MPVの存在を検出することができる。ある種の実施形態では、該核酸は高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成される。制限するためではなく例示すれば、このような高ストリンジェンシー条件下を用いる手順は以下の通りである。DNAを含んだフィルターの予備ハイブリッド形成は、6×SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02%PVP、0.02% Ficoll、0.02%BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNAからなる緩衝液中、8hから終夜65℃で行う。フィルターは、100μg/ml変性サケ精子DNAおよび5〜20×106cpm 32P標識プローブを含んだ予備ハイブリッド形成混合物中、48h、65℃でハイブリッド形成する。フィルター洗浄は、2×SSC、0.01%PVP、0.01%Ficollおよび0.01%BSAを含んだ溶液中、37℃、1時間行う。その後、0.1×SSC中50℃、45分洗浄してからオートラジオグラフィーを行う。使用し得る高ストリンジェンシーの他の条件は当分野で周知である。本発明の他の実施形態では、ハイブリッド形成が中度の、低ストリンジェンシー条件下で行われるが、そのような条件は当業者にとって周知のことである(例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照されたい。Ausubel et al., eds., in the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1997 Current Protocols, C 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.も参照されたい)。
任意のサイズのオリゴヌクレオチドが、本発明の方法において使用できる。本明細書に記載するように、このようなオリゴヌクレオチドは、多様な方法において、例えば多様な検出または分析手順におけるプライマーまたはプローブとして有用である。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーは、少なくとも5個、少なくとも8個、少なくとも10個、少なくとも12個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、少なくとも55個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも100個、少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも400個、少なくとも500個、少なくとも1000個、少なくとも2000個、少なくとも3000個、少なくとも4000個、または少なくとも5000個の塩基である。別のより確定した実施形態では、オリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーは、少なくとも5個、少なくとも8個、少なくとも10個、少なくとも12個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、少なくとも55個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも100個、少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも400個、少なくとも500個、少なくとも1000個、少なくとも2000個、少なくとも3000個、少なくとも4000個、または少なくとも5000個の塩基を含み、該塩基は、MPVゲノム配列やその相補体などの標的配列と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、少なくとも99.5%相同である。別の特定の実施形態では、プライマーまたはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さであり、ストリンジェントな条件下で、最も3'末端側の塩基少なくとも8個を介して標的配列に特異的にハイブリッド形成する。別の特定の実施形態では、プライマーまたはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さであり、ストリンジェントな条件下で、最も3'末端側の塩基少なくとも10個を介して標的配列に特異的にハイブリッド形成する。別の特定の実施形態では、プライマーまたはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さであり、ストリンジェントな条件下で、最も3'末端側の塩基少なくとも12個を介して標的配列に特異的にハイブリッド形成する。別の特定の実施形態では、プライマーまたはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さであり、ストリンジェントな条件下で、最も3'末端側の塩基少なくとも15個を介して標的配列に特異的にハイブリッド形成する。別の特定の実施形態では、プライマーまたはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さであり、ストリンジェントな条件下で、最も3'末端側の塩基少なくとも20個を介して標的配列に特異的にハイブリッド形成する。別の特定の実施形態では、プライマーまたはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さであり、ストリンジェントな条件下で、最も3'末端側の塩基少なくとも25個を介して標的配列に特異的にハイブリッド形成する。別の実施形態では、特定の位置またはヌクレオチドが置換されるようなオリゴの1縮重セットが使用される。該縮重は、ストリンジェントな条件下で標的配列にハイブリッド形成する領域において、任意の位置または任意数の位置、最も好ましくは、少なくとも1つの位置に起こることができるが、少なくとも2つの位置、少なくとも3つの位置、少なくとも10個の位置に起こってもよい。
当業者であれば、当分野で公知のアッセイでオリゴヌクレオチドに必要な構造的要件に精通されていよう。より体系的な手法を用いてオリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブを設計することも可能である。例えば、当業者であれば、好ましいアッセイまたはアニーリング温度および該オリゴの構造、即ち配列に基づいて、オリゴヌクレオチドのプライマーまたはプローブの適当な長さおよび配列を決定できよう。その上、当業者であれば、標的配列に対するオリゴの特異性が、温度に応じて増減するようにアッセイの温度を調節することによって、オリゴヌクレオチドのプライマーまたはプローブを使用する該アッセイの特異性を決定できよう。好ましい実施形態では、プライマーまたはプローブのアニーリング温度は当分野で公知の方法を用いて決定され、そのアッセイは前記アニーリング温度で行われる。当業者であれば、特定の標的配列に対してオリゴヌクレオチドに関わるアニーリング温度を計算する方法に精通されていよう。例えば、標的配列にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド中のGまたはCの各ヌクレオチドに対して、アニーリング温度に4℃を割り当てることにより、アニーリング温度を概算することができる。別の実施形態では、標的配列にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド中のAまたはTの各ヌクレオチドに対して、アニーリング温度に2℃を割り当てることにより、アニーリング温度を概算することができる。オリゴヌクレオチドのアニーリング温度が、該オリゴヌクレオチドの長さおよび配列、ならびに標的配列に対する該オリゴの相補性に依存するのは必然的であるため、オリゴのプライマーまたはプローブ間の結合事象だけがアニーリング温度の要因として考慮される。アニーリング温度の計算のために本明細書に記載した例は、例題であることを意図しており、アニーリング温度の他の決定法を本発明から除外する意図はない。当業者であれば使用できる他の方法に精通されていようし、その上、オリゴヌクレオチドに対してアニーリングまたは融解温度を計算するもっと精巧な他の方法は、本明細書に記載した。より特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドのプローブおよびプライマーは、少なくとも30℃、少なくとも35℃、少なくとも40℃、少なくとも45℃、少なくとも50℃、少なくとも55℃、少なくとも60℃、少なくとも65℃、少なくとも70℃、少なくとも80℃、少なくとも90℃、または少なくとも99℃の温度でアニーリングされる。
本発明は、試料中のMPVを同定または検出するために、細胞ベースのアッセイおよび無細胞アッセイを提供する。それだけに限らないが、レポーターを用いるアッセイを含め、本発明の細胞ベースのアッセイおよび無細胞アッセイを行うために、多様な方法を使用できる。レポーターの例は、本明細書に記載されており、ハイスループットスクリーニングを用いるMPVの同定または検出、および当業者であれば精通していると思われる他の任意目的のために使用できる。本発明のレポーターアッセイに使用できる方法は幾種もある。例えば、細胞ベースのアッセイは、MPV遺伝子のプロモーターに連結される、またはMPV遺伝子産物に認識されるプロモーターに連結されるレポーター遺伝子を含む核酸配列を含有する細胞と、試料とを接触させること、およびMPVまたはMPVの成分に曝した際の該レポーター遺伝子の発現を測定することによって実施し得る。細胞系アッセイの更なる実施形態では、MPVに感染し得る宿主細胞に対し、1つまたは複数のレポーター遺伝子をコードする核酸構成体を移入することにより、該レポーター遺伝子からの発現が、MPVまたはMPV成分の存在下で起こる。このような実施形態では、レポーター遺伝子の発現は、MPVまたはその成分に認識される核酸配列に作動的に連結され、そのため該レポーター遺伝子の発現を引き起こす。試料中でのMPVの存在は、当分野で公知であり、本明細書にも記載されている(5.8.2節)任意の方法を用いて検出できるレポーター遺伝子の発現を誘発する。トランスフェクションを受け、細胞系検出アッセイで使用できる宿主細胞の例には、それだけに限らないが、Vero、tMK、COS7の各細胞などを挙げることができる。別の実施形態では、該宿主細胞はMPVに感染することのできる任意の細胞である。そのためレポーター遺伝子の発現は、MPVまたはその成分の存在を示している。無細胞アッセイでは、核酸配列に作動可能に連結しているレポーター遺伝子を含む核酸と、試料とを接触させることにより、MPVまたはその成分が存在すると、該レポーター遺伝子の発現がin vitroで誘発される。例えば、無細胞アッセイは、MPV遺伝子のプロモーターに連結される、またはMPV遺伝子産物に認識されるプロモーターに連結されるレポーター遺伝子を含む核酸配列と、MPVまたはその成分を含むと疑われる試料とを接触させること、およびMPVまたはMPVの成分に曝した際の該レポーター遺伝子の発現を測定することによって実施し得る。そのためレポーター遺伝子の発現は、MPVまたはその成分の存在を示している。多数のレポーター化合物が当分野で知られているが、多様な例が本明細書に示されている(例えば、5.8.2節を参照されたい)。
別の実施形態では、本発明はミニレプリコン系を用いたMPV感染の検出に関する。例えば、宿主細胞に1つまたは複数のレポーター遺伝子をコードするhMPVミニレプリコン構成体を移入することにより、該レポーター遺伝子からの発現が、hMPVまたはhMPVポリメラーゼの存在下で起こり得る。レポーター遺伝子の例は、本明細書の5.8.2節に記載されている。このような実施形態では、hMPVは、ミニレプリコン系がコードする1つまたは複数のレポーター遺伝子の発現を促進するヘルパーウイルスとして作用する。限定するわけではないが、hMPVは、ミニレプリコン系のレスキューを推進し、したがって1つまたは複数のレポーター遺伝子の発現を推進するポリメラーゼを提供する。ある種の実施形態では、レポーター遺伝子をコードするhMPVミニレプリコンの移入を受けた宿主細胞は、hMPVを含むと疑われる試料とを接触させる。試料中でのhMPVの存在は、当分野で公知であり、本明細書にも記載されている(5.8.2節)任意の方法を用いて検出できるレポーター遺伝子の発現を誘発する。宿主細胞の例には、それだけに限らないが、Vero、tMK、COS7の各細胞などが挙げられる。別の実施形態では、該宿主細胞はhMPVに感染し得る任意の細胞である。
別の実施形態では、本発明は、MPVまたはその遺伝子産物に特徴的なペプチドまたは核酸に対して特異的であり、それを認識できる抗体、例えばモノクローナル抗体(MAb)の調製および使用による、動物または人間宿主におけるMPV感染症の検出に関する。前記MAbに認識されるエピトープまたは抗原決定基は、MPV増殖に関わる生活環および代謝過程の間に合成されるタンパク性および核酸性産物を包含するが、それらに限らない。適切な抗体の生成のために抗原決定基として使用できるタンパク性または核酸性産物には、それだけに限らないが、以下のMPV成分、即ちN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、およびL遺伝子の1種または複数の完全および不完全な転写および発現産物が挙げられる。特定の一実施形態では、G遺伝子のタンパク性産物またはその一部に対するMAbは、生体試料、例えば体液中にあるMPV発現Gペプチドの存在を検出または確認するために、他の方法と併用される。前記方法には、それだけに限らないが、ELISA、放射免疫または競合アッセイ、免疫沈降、ならびに標的またはその一部および関連物質に対するMAbによる検出用前記標的として、MPVの転写または発現遺伝子産物を用いる他の方法などが挙げられる。本発明の別の実施形態では、hMPVの検出に使用できる該抗体は、全4つのサブタイプのF、G、N、L、M2-1、PおよびSHタンパク質を認識する。
別の実施形態では、本発明は、MPV曝露または感染に対する宿主免疫反応に関連する、およびそれに特徴的である因子の検出に関する。MPVで曝露または感染した際、宿主免疫系は、前記曝露または感染に対して、ウイルスの作用および/または増殖を除去または減殺しようとする抗体の宿主による生成を伴う反応を表わす。本発明は、宿主へのMPV曝露または感染の結果、産生し得る前記抗体の検出によるMPV関連疾患の診断を行う手段および方法を提供する。前記抗体が認識するエピトープには、宿主免疫反応に接近可能であり、ウイルスに対する宿主による免疫反応の生成における抗原決定基として機能できるペプチドおよびその露出表面が挙げられるが、それだけに限らない。抗体生成用エピトープとして宿主免疫反応により使用されるタンパク性核内物質の一部には、それだけに限らないが、以下のMPV成分、即ちN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、およびL遺伝子の1種または複数の産物が挙げられる。一実施形態では、MPVのN遺伝子コードペプチドの部分接近または完全接近可能な部分に対する抗体が、宿主試料において検出される。特定の実施形態では、G遺伝子のタンパク性産物またはその一部は、生体試料、例えば体液中にある宿主由来抗体の存在を検出するために、他の方法と併用される。前記方法には、それだけに限らないが、ELISA、放射免疫または競合アッセイ、ならびにMPVの転写または発現遺伝子産物を認識し、生体試料中に見出される宿主抗体による検出用標的として、前記産物を用いる他の方法などが挙げられる。
本発明は、それだけに限らないが、生体試料、例えば体液を含めた多様な供給源由来のMPV感染症の診断アッセイ用手段および方法または試験キット、ならびに該感染症の病原体を検出する方法も提供する。一実施形態では、本発明は、MPV核酸またはその相補体の同定に適したアッセイ、キット、手順および操作に関する。別の実施形態では、本発明は、MPV発現ペプチドまたはその一部の同定に適したアッセイ、キット、手順および操作に関する。別の実施形態では、本発明は、MPV曝露または感染に対する宿主免疫反応の成分の同定に適したアッセイ、キット、手順および操作に関する。
宿主のMPV感染の診断的確認以外に、本発明は、MPVの分離株を異なる系統学的グループまたはサブグループに分類する手段および方法も提供する。一実施形態では、この特徴は、MPVの異なる変異体、変異体A1、A2、B1およびB2の識別によって、より有効でサブグループ特異的な治療薬を設計するために、有利に使用できる。MPVの変異体は、以下のもの、即ちN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、およびL遺伝子の1種または複数のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に基づいて識別できる。特定の実施形態では、MPVは、G遺伝子または糖タンパク質のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と、G糖タンパク質も認識するモノクローナル抗体を用いた中和試験とを用いて特定のサブグループに識別できる。
一実施形態では、人間におけるMPV感染症の診断は、当業者に周知の任意の方法、例えば免疫アッセイを用いてなされる。免疫特異的結合および交差反応性の分析に使用できる免疫アッセイには、それだけに限らないが、ほんの幾つか指名すればウェスタン(westem)ブロット、放射免疫法、ELISA(酵素免疫吸着法)、サンドイッチ免疫アッセイ、免疫沈降法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集法、補体結合法、蛍光免疫アッセイなどの技法を用いた競争的および非競争的な試験系が挙げられる。このようなアッセイは常套的であり、当分野で周知のものであり(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれているAusubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照されたい)、免疫アッセイの非限定的な例は5.8節に記載されている。
一実施形態では、本発明は、それだけに限らないが、遺伝子または遺伝子の一部、例えばN、M、F、G、L、M、PおよびM2の各遺伝子を含めた、MPVゲノムの領域をコピーまたは増幅するために、PCR法またはプライマー伸長法と共にオリゴヌクレオチドを使用するMPV感染症の検出に関する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドはRT-PCR法と共に使用される。更なる実施形態では、増幅産物および/または遺伝物質は、多様なhMPV株の間で保存されている、または多様なhMPV株の間で異なっている特定の配列に相補的なオリゴヌクレオチドで探査できる。後者のオリゴヌクレオチド1組で、宿主の感染症の原因である特定のhMPV株を同定できよう。
本発明は、宿主に感染できるhMPVの異なるサブグループおよび変異体間で識別する方法を提供する。特定の一実施形態では、宿主感染症の原因であるhMPVは、特定のサブグループ、例えばサブグループAまたはサブグループBに分類される。別の実施形態では、宿主感染症の原因であるhMPVは、あるサブグループの特定の変異体、例えば変異体A1、A2、B1またはB2として分類される。別の実施形態では、本発明は、宿主感染症の原因であるhMPVを、新たなサブグループ、および/または新たなもしくは既存のサブグループの新たな変異体に分類する手段および方法を提供する。hMPV株をサブグループおよび/または変異体群に識別できる方法は、当業者には公知であろう。一実施形態では、ポリクローナル抗体は、感染症の病原体をhMPVの株として同定するために使用され、二次抗体は、前記株を、hMPVの新規または公知のサブグループおよび/または新規または公知の変異体の特徴を示すものとして識別するために使用される。一実施形態では、hMPVに選択的な抗体は、免疫反応アッセイ、例えばELISAまたはRIAと共に使用することにより、生体試料中のhMPV曝露または感染の存在を同定する。更なる実施形態では、hMPVタンパク質のペプチド配列にある特定のエピトープに選択的な二次抗体は、前記で同定されたhMPV感染症の病原体をサブグループまたは変異体に更に分類するために、使用される。特定の一実施形態では、hMPVの全サブグループ間で共有されるペプチドエピトープに対する抗体は、感染症の病原体をhMPVとして同定するために使用される。更なる特定の実施形態では、hMPVの異なるサブグループおよび/または変異体に特有のペプチドエピトープに対する抗体は、宿主感染症の原因であるhMPVを公知または新規のサブグループおよび/または変異体に分類するために、使用される。特定の一実施形態では、hMPVの異なるサブグループおよび/または変異体間の識別ができる抗体は、そのサブグループまたは変異体に特有のhMPVペプチド、その中には、それだけに限らないが、N、M、F、G、L、M、PおよびM2の各遺伝子にコードされるものが含まれる該hMPVペプチドのセグメントを認識する。異なるhMPVサブグループまたは変異体間の識別ができる抗体の生成に使用できるペプチドまたはペプチドのセグメントは、親水性プロットと共に多様なhMPVタンパク質の公知ペプチド配列の差異を用いて選択することにより、診断アッセイで溶媒曝露性または接触性と予想される適当なペプチドセグメントを同定することができる。一実施形態では、hMPVの異なるサブグループ間の識別ができる抗体は、hMPVの異なるサブグループに特有のFタンパク質の差異、例えば全長Fタンパク質の286、296、312、348および404位にあるアミノ酸を認識する。別の実施形態では、hMPVの異なるサブグループおよび/または変異体間の識別ができる抗体は、特定のサブグループまたは変異体に特有のhMPVのGタンパク質のセグメントを認識し、例えば、配列番号119のアミノ酸50〜60位に相当するGペプチド配列は、サブグループA、B間ならびに変異体A1、A2、B1、B2間の識別をするために使用できる。本発明の別の実施形態では、hMPV分離株のヌクレオチド配列は、hMPVの異なるサブグループおよび/または変異体間の識別をするために使用される。一実施形態では、hMPVゲノム中の配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列、プライマーおよび/またはプローブは、当業者に公知の方法、例えばRT-PCR、PCR、プライマーランオン法および多種のブロット法と共に、hMPV感染症の病原体を異なるサブグループおよび/または変異体に分類するために使用される。特定の一実施形態では、生体試料は、RT-PCRを用いてhMPVゲノムの特定のセグメントをコピーまたは増幅するために使用される。更なる実施形態では、前記セグメントの配列を入手し、hMPVの公知配列と比較し、前記比較を使用して、該hMPV株を個々のサブグループまたは変異体に分類する、あるいは該hMPV株を新規なサブグループまたは変異体に分類する。別の実施形態では、本発明は、hMPVの異なるサブグループおよび/または変異体間の識別をするために使用できる、診断キットに関する。
好ましい実施形態では、特定のウイルス感染症の診断および/または治療は、前記感染症を起こす前記特定のウイルスに対して最も特異的な試薬を用いて行われる。この場合、このことは、MPV感染症の前記診断および/または治療は、MPVに対して最も特異的な試薬を用いて行うことが好ましいことを意味している。しかし、このことは、特異性がもっと低く、交差反応性の十分な試薬を代用する可能性を決して排除するものではなく、その理由は、例えば、該試薬は、入手がより容易であり、当面の問題に十分対応するからである。本明細書では、例えば、APV由来の試薬、特にAPV-C由来の試薬を用いて哺乳動物におけるMPV感染症のウイルス学的および/または血清学的診断を行うことが示されており、本明細書の詳細なる説明では、例えば、哺乳動物におけるMPV感染症の信頼性の十分な血清学的診断が、鳥類におけるAPV抗体を検出するように特別設計されたELISAの使用によって実現できることが示されている。この目的のために特に有用な試験は、APV抗体(例えば、血清中または卵黄中)の検出用に設計されたELISA試験であり、その市販型は、SVANOVA Biotech AB, Uppsal Science Park Glunten SE-751 83 Uppsala Swedenにより製造されるAPV-Ab SVANOVIR(登録商標)として知られている。逆の状況にも当てはまり、本明細書では、例えば、MPV由来の試薬を用いて哺乳動物におけるAPV感染症のウイルス学的および/または血清学的診断を行うことが示されており、本明細書の詳細なる説明では、例えば、鳥類におけるAPV感染症の信頼性の十分な血清学的診断が、MPV抗体を検出するように設計されたELISAの使用によって実現できることが示されている。抗原および抗体が鍵と鍵穴との関係を有することを考慮すれば、多様な抗原の検出は、交差反応性の十分な適当な抗体の選択によって実現できる。当然ながら、このような交差反応性に依存するためには、多様なウイルスの多様な(糖)タンパク質間に存在するアミノ酸相同性を指針として、該試薬(抗原や抗体など)を選択することが最善であり、それにより、相同性の最も高いタンパク質に関係する試薬が、前記交差反応性に依存する試験で使用するのに最も有用となろう。
核酸検出に関しては、多様なウイルスの異種核酸配列に基づいてプライマーまたはプローブを設計する代わりに、状況はなお一層簡潔であり、したがって、本質的に哺乳動物または鳥類のメタニューモウイルスの差異を検出するには、相同性の高い長さのウイルス特異的核酸配列に基づいてプライマーまたはプローブを設計または選択するだけで十分である。一般に、核酸配列については、90%以上の相同性パーセンテージがあれば、ストリンジェントなハイブリッド形成条件を利用する診断試験において、頼りとすべき十分な交差反応性が保証される。
本発明は、例えば、動物、特に哺乳動物、より特別には人間のMPV感染症をウイルス学的に診断する方法であって、前記動物の試料を本発明によるMPV特異的核酸または抗体と反応させることにより、前記試料中におけるウイルス分離株またはその成分の存在を決定することを含む方法と、哺乳動物MPV感染症を血清学的に診断する方法であって、前記哺乳動物の試料を本発明によるMPV特異的タンパク性分子もしくはその断片または抗原と反応させることにより、前記試料中におけるMPVまたはその成分に対する特異抗体の存在を決定することを含む方法とを提供する。本発明は、本発明によるMPV、MPV特異的な核酸、タンパク性分子もしくはその断片、抗原および/または抗体を含む、MPV感染症を診断するための診断キット、ならびに、好ましくは前記のMPV、MPV特異的な核酸、タンパク性分子もしくはその断片、抗原および/または抗体を検出する手段であって、当分野で使用される、蛍光体などの励起性団または酵素検出系を含む手段も提供する(適切な診断キット構成の例は、IF、ELISA、中和アッセイ、RT-PCR法を含む)。核酸、タンパク性分子やその断片などのこれまで未同定のウイルス成分またはその合成類縁体が、MPV特異的と同定できるか否かを決定するには、前記成分の核酸またはアミノ酸配列を、例えば前記核酸またはアミノ酸のある長さ、ヌクレオチド数またはアミノ酸数(各々)で好ましくは少なくとも10個、より好ましくは少なくとも25個、より好ましくは少なくとも40個について、例えば本明細書に示すような系統学解析を用いた、公知MPV配列および公知非MPV配列(APV-Cを用いるのが好ましい)との配列相同性の比較によって分析すれば十分である。前記MPVまたは非MPV配列との関係度に応じて、該成分または合成類縁体を同定することができる。
本発明はまた、哺乳動物MPV感染症をウイルス学的に診断する方法であって、前記哺乳動物の試料をAPV由来の交差反応性核酸(好ましくは血清型C)、または前記APVと反応性の交差反応性抗体と反応させることにより、前記試料中におけるウイルス分離株またはその成分の存在を決定することを含む方法と、哺乳動物MPV感染症を血清学的に診断する方法であって、前記哺乳動物の試料をAPV由来のタンパク性分子もしくはその断片または抗原と反応させることにより、前記試料中における、APVまたはその成分にも対する交差反応性抗体の存在を決定することを含む方法とを提供する。更に、本発明は、MPV感染症を診断するために、特に人間における前記MPV感染症を検出するために、AVPまたはAVP抗体の検出用に当初設計された診断キットの使用も提供する。
本発明はまた、トリにおけるAPV感染症をウイルス学的に診断する方法であって、前記トリの試料をMPV由来の交差反応性核酸、または前記MPVと反応性の交差反応性抗体と反応させることにより、前記試料中におけるウイルス分離株またはその成分の存在を決定することを含む方法と、トリのAPV感染症を血清学的に診断する方法であって、前記トリの試料をMPV由来のタンパク性分子もしくはその断片または抗原と反応させることにより、前記試料中における、MPVまたはその成分にも対する交差反応性抗体の存在を決定することを含む方法とを提供する。更に、本発明は、APV感染症を診断するために、特にニワトリ、アヒル、シチメンチョウなどの家禽における前記APV感染症を検出するために、MVPまたはMVP抗体の検出用に当初設計された診断キットの使用も提供する。
治療の場合と同様に診断についても、特に、当面の状況のために相同性の高い手法の使用ほど不便になる場合、異なる哺乳動物MPV間、およびMPVと例えばAPVなどの他のウイルスとの間の高度な相同性が利用できる。MPV感染症に対する緊急のワクチン接種などの待ったなしのワクチン接種は、より相同性の高いMPVワクチンが入手できない場合、例えば、APV(好ましくはC型)由来のワクチン製剤を用いて実施でき、逆にAPV感染症に対するワクチン接種は、MPV由来のワクチン製剤を用いて企図することができる。また、逆遺伝学的技法により、ワクチンとして有用であり、所望のレベルまで弱毒化すべき個々の株各々の現場分離株とは十分に異なる、キメラAPV-MPVウイルス構成体を生成することが可能である。同様の逆遺伝学的技法により、ワクチン製剤に使用するために、RSV-MPVまたはP13-MPV構成体などのキメラ・パラミクソウイルス-メタニューモウイルス構成体を生成することも可能となろう。このような構成体は、呼吸器病に対処するための混合ワクチンとして特に有用である。
MPVのCPEは、tMKや他の細胞培養中でhRSVまたはhPIV-1が起こすCPEと実質的には識別できなかったので、MPVがこれまで見過ごされた恐れは十分にある。tMK(三次サル腎細胞、即ち、細胞培養中の第3継代のMK細胞)は、一次または二次培養と比較して低コストのために好ましく使用される。該CPEは、古典的なパラミクソウイルス科の場合と同様に、細胞の急速な内部破壊と、それに続く単層からの細胞脱着を起こした合胞体形成を特徴としている。その細胞は、始原物質からウイルス3継代後、接種後10〜14日に、hRSVやhPIV-1などの他のウイルスが起こすCPEよりやや遅れて、普通は(必ずではないが)CPEを示した。
例えば、本発明は、重度RTIに罹っている子供28人から採取した鼻咽頭吸引試料から得た、従来未同定のパラミクソウイルスを提供する。こうした子供の臨床症状はhRSVが原因の症状と大体類似していた。その患者中27人は5歳未満の子供であり、そのうちの半数は生後1〜12ヶ月であった。もう1人の患者は18歳であった。全員が上部RTIに罹っており、症状は咳、筋肉痛、吐き気および発熱から細気管支炎および重症肺炎に亘っていた。その患者の大半は1〜2週間入院していた。
こうした患者からのウイルス分離株は、ネガティブコントラスト電子顕微鏡観察でパラミクソウイルスの形態を示したが、ヒトおよび動物の既知パラミクソウイルスに特異的な抗血清とは反応しなかった。それらの分離株は、そのうちの2種に対する血清を用いた間接免疫蛍光法(IFA)で決定したところ、全て相互に密接に関係していた。これらの分離株中9株の配列分析の結果、該ウイルスはAPVとある程度関係があることが判明した。ウイルス学的データ、配列相同性ならびにゲノム編成に基づいて、我々はそのウイルスをメタニューモウイルス属の1種であると提案している。血清学的調査の示したところでは、オランダにおける血清罹患率が5歳児までの100%に近いので、このウイルスはかなり一般的な病原体である。その上、1958年に人々から収集した血清においても、血清罹患率が同等に高いことが判明したので、このウイルスは人間集団において40年余りの間広まっていたことになる。メタニューモウイルス属の提案されたこの新種の同定によって、ウイルス性呼吸器感染症に対する診断アッセイ用手段および方法または試験キットと、ワクチンまたは血清または抗体組成物との開発、ならびにMPV感染症の治療に有用な抗ウイルス剤の試験またはスクリーニング法も、今や実現される。
本明細書に示す方法および手段は、ウイルス学的または血清学的診断の区別を問わず、MPV感染症を診断するための診断キットにおいて特に有用である。このようなキットまたはアッセイは、例えば、本発明によるウイルス、核酸、タンパク性分子もしくはその断片、抗原および/または抗体を含んでもよい。本発明によるウイルス、核酸、タンパク性分子もしくはその断片、抗原および/または抗体は、例えば、MPV感染症の治療もしくは予防、および/または特に人間における呼吸器病の治療もしくは予防のための医薬組成物の製造にも使用される。該ウイルスの弱毒化は、以下のことに限定されるわけではないが、他種の関連ウイルスの使用、実験動物または/および組織/細胞培養物を介した連続的継代、分子クローンの部位特異的変異誘発、ならびに関連ウイルス間での遺伝子または遺伝子断片の交換を含めた、この目的のために開発された確固たる方法によって実現できる。
これまで、サブタイプA1、A2、B1およびB2と称する4種のhMPVサブタイプについて説明してきた。本発明は、サブタイプ全4種に感受性を示す単一のアッセイを用いる、宿主におけるhMPVの検出に関する。宿主におけるhMPVの存在を検出するために、当分野で公知の任意の方法を使用できる。本発明のより特定な実施形態では、宿主におけるhMPVの存在を検出するために、感受性のTaqmanアッセイが使用される。当業者であれば、このようなアッセイに使用するオリゴヌクレオチドおよびプローブの設計に対する要件に精通されていよう。このようなオリゴヌクレオチドおよびプローブは、hMPVゲノム、転写物、またはそのプロセシングした産物および未プロセシング産物の任意の領域を特異的に認識するように、設計することができる。本発明のより特定な実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドおよびプローブは、hMPV全サブタイプ、例えばA1、A2、B1およびB2、その転写物、またはそのプロセシングした産物および未プロセシング産物中の配列と相補的または同一または類似である。特に、該オリゴヌクレオチドおよびプローブは、hMPV全4サブタイプ中の該配列、その転写物またはそのプロセシングした産物および未プロセシング産物のネガティブまたはポジティブコピーと少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、または99.5%同一である。別の実施形態では、それは、hMPV全4サブタイプ中の該配列のネガティブまたはポジティブコピーと相補的である。任意の長さのオリゴヌクレオチドおよびプローブが、本発明のアッセイの検出で使用できる。使用し得る通常のハイブリッド形成および洗浄の条件は、当分野で公知である。好ましくは、該条件は、プローブが特異的に結合し、非特異結合の結合を防止することを可能にし、または該結合の簡易除去を可能にするような条件である。本発明のより特定的な更に別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドおよびプローブは、以下のものに限らないが、N遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M遺伝子、M2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子およびL遺伝子、またはそのプロセシングした産物および未プロセシング産物を含めた、hMPVゲノム内のオープンリーディングフレームのいずれかと相補的である。本発明のより一層特定な実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドおよびプローブは、N遺伝子、その転写物またはそのプロセシングした産物および未プロセシング産物を認識する。更に別の実施形態では、全4サブタイプからのhMPVは同等の特異性で認識される。
ウイルスは、宿主から得ることのできる任意の生体試料から分離できる。本発明のより特定な実施形態では、本発明の検出アッセイに使用するために、鼻咽頭試料が宿主から収集される。ウイルスは、以下のものに限らないが、VeroおよびtMK細胞を含めたhMPVを支持することのできる多様な細胞系で、検出目的のために増殖できる。ウイルスRNAの検出は、当業者に公知の幾つもの方法を用いて実施できる。特定の一実施形態では、ウイルスRNAの検出は、Taqman PCRベースの方法を用いて実施される。
5.15 本発明の組成物および哺乳動物メタニューモウイルスの成分
本発明は、哺乳動物MPVの核酸配列、哺乳動物MPVのタンパク質、および哺乳動物MPVのタンパク質に対する抗体に関する。更に、本発明は、哺乳動物MPVの核酸配列の相同体、および哺乳動物MPVのタンパク質の相同体に関する。更に、本発明は、哺乳動物MPVのタンパク質またはその断片、および哺乳動物MPVに由来しない1種または複数のペプチドまたはタンパク質を含有する、融合タンパク質をコードする核酸配列に関する。特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、哺乳動物MPVのタンパク質またはその断片、およびそれだけに限らないが、ポリヒスチジンタグなどのペプチドタグを含有する。更に、本発明は、哺乳動物MPVのタンパク質またはその断片、および哺乳動物MPVに由来しない1種または複数のペプチドまたはタンパク質を含有する、融合タンパク質に関する。本発明は、哺乳動物MPVのタンパク質をコードする核酸の誘導体にも関する。本発明は、哺乳動物MPVのタンパク質の誘導体にも関する。誘導体は、以下のものに限らないが、付加、欠失、切断、置換、逆位などの該タンパク質の変異体であってもよいが、それだけに限らない。更に、誘導体は、そのタンパク質の少なくとも1つのドメインが異なるタンパク質に由来するような哺乳動物MPVのタンパク質のキメラ形態であってもよい。誘導体はまた、例えば薬物などの別の分子に共役結合または非共役結合で連結している哺乳動物MPVのタンパク質の形態であってもよい。
NL/1/00(あるいは00-1とも)と称するウイルス分離株は、変異体A1の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列は配列番号19に示されている。NL/17/00と称するウイルス分離株は、変異体A2の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列は配列番号20に示されている。NL/1/99(あるいは99-1とも)と称するウイルス分離株は、変異体B1の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列は配列番号18に示されている。NL/1/94と称するウイルス分離株は、変異体B2の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列は配列番号21に示されている。本出願に開示した配列および相当する配列番号のリストは、表14に示してある。
哺乳動物MPVのタンパク質は、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質またはM2-2タンパク質、あるいはその断片でもよい。哺乳動物MPVのタンパク質の断片は、長さが少なくとも25アミノ酸、少なくとも50アミノ酸、少なくとも75アミノ酸、少なくとも100アミノ酸、少なくとも125アミノ酸、少なくとも150アミノ酸、少なくとも175アミノ酸、少なくとも200アミノ酸、少なくとも225アミノ酸、少なくとも250アミノ酸、少なくとも275アミノ酸、少なくとも300アミノ酸、少なくとも325アミノ酸、少なくとも350アミノ酸、少なくとも375アミノ酸、少なくとも400アミノ酸、少なくとも425アミノ酸、少なくとも450アミノ酸、少なくとも475アミノ酸、少なくとも500アミノ酸、少なくとも750アミノ酸、少なくとも1000アミノ酸、少なくとも1250アミノ酸、少なくとも1500アミノ酸、少なくとも1750アミノ酸、少なくとも2000アミノ酸、または少なくとも2250アミノ酸でもよい。哺乳動物MPVのタンパク質の断片は、長さが多くとも25アミノ酸、多くとも50アミノ酸、多くとも75アミノ酸、多くとも100アミノ酸、多くとも125アミノ酸、多くとも150アミノ酸、多くとも175アミノ酸、多くとも200アミノ酸、多くとも225アミノ酸、多くとも250アミノ酸、多くとも275アミノ酸、多くとも300アミノ酸、多くとも325アミノ酸、多くとも350アミノ酸、多くとも375アミノ酸、多くとも400アミノ酸、多くとも425アミノ酸、多くとも450アミノ酸、多くとも475アミノ酸、多くとも500アミノ酸、多くとも750アミノ酸、多くとも1000アミノ酸、多くとも1250アミノ酸、多くとも1500アミノ酸、多くとも1750アミノ酸、多くとも2000アミノ酸、または多くとも2250アミノ酸でもよい。
本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、Nタンパク質であり、該Nタンパク質は、APV C型のNタンパク質との関連性よりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21(各配列番号の説明については表14も参照されたい)のウイルスゲノムがコードするNタンパク質などの哺乳動物MPVのNタンパク質との関連性の方が系統学的により近縁である。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、Pタンパク質であり、該Pタンパク質は、APV C型のNタンパク質との関連性よりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするPタンパク質などの哺乳動物MPVのPタンパク質との関連性の方が系統学的により近縁である。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、Mタンパク質であり、該Mタンパク質は、APV C型のMタンパク質との関連性よりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするMタンパク質などの、哺乳動物MPVのMタンパク質との関連性の方が系統学的により近縁である。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、Fタンパク質であり、該Fタンパク質は、APV C型のFタンパク質との関連性よりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするFタンパク質などの哺乳動物MPVのFタンパク質との関連性の方が系統学的により近縁である。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、M2-1タンパク質であり、該M2-1タンパク質は、APV C型のM2-1タンパク質との関連性よりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするM2-1タンパク質などの、哺乳動物MPVのM2-1タンパク質との関連性の方が系統学的により近縁である。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、M2-2タンパク質であり、該M2-2タンパク質は、APV C型のM2-2タンパク質との関連性よりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするM2-2タンパク質などの、哺乳動物MPVのM2-2タンパク質との関連性の方が系統学的により近縁である。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、Gタンパク質であり、該Gタンパク質は、APV C型の任意のタンパク質との関連性よりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするGタンパク質などの、哺乳動物MPVのGタンパク質との関連性の方が系統学的により近縁である。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、SHタンパク質であり、該SHタンパク質は、APV C型の任意のタンパク質との関連性よりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするSHタンパク質などの、哺乳動物MPVのSHタンパク質との関連性の方が系統学的により近縁である。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、Lタンパク質であり、該Lタンパク質は、APV C型の任意のタンパク質との関連性よりも、例えば配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするSHタンパク質などの、哺乳動物MPVのLタンパク質との関連性の方が系統学的により近縁である。
本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、Nタンパク質であり、該Nタンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするNタンパク質のアミノ酸配列(各Nタンパク質のアミノ酸配列は配列番号366〜369に開示されており、表14も参照されたい)と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、Nタンパク質であり、該Pタンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするPタンパク質のアミノ酸配列(各Pタンパク質のアミノ酸配列は配列番号374〜377に開示されており、表14も参照されたい)と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、Mタンパク質であり、該Mタンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするMタンパク質のアミノ酸配列(各Mタンパク質のアミノ酸配列は配列番号358〜361に開示されており、表14も参照されたい)と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、Fタンパク質であり、該Fタンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするFタンパク質のアミノ酸配列(各Fタンパク質のアミノ酸配列は配列番号314〜317に開示されており、表14も参照されたい)と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、M2-1タンパク質であり、該M2-1タンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするM2-1タンパク質のアミノ酸配列(各M2-1タンパク質のアミノ酸配列は配列番号338〜341に開示されており、表14も参照されたい)と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、M2-2タンパク質であり、該M2-2タンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするM2-2タンパク質のアミノ酸配列(各M2-2タンパク質のアミノ酸配列は配列番号346〜349に開示されており、表14も参照されたい)と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、Gタンパク質であり、該Gタンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするGタンパク質のアミノ酸配列(各Gタンパク質のアミノ酸配列は配列番号322〜325に開示されており、表14も参照されたい)と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、SHタンパク質であり、該SHタンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするSHタンパク質のアミノ酸配列(各SHタンパク質のアミノ酸配列は配列番号382〜385に開示されており、表14も参照されたい)と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの該タンパク質は、Lタンパク質であり、該Lタンパク質は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスゲノムがコードするLタンパク質のアミノ酸配列(各Lタンパク質のアミノ酸配列は配列番号330〜333に開示されており、表14も参照されたい)と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。
哺乳動物MPVのタンパク質の断片は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスがコードする相同なタンパク質と、該断片に相同なそのタンパク質の部分に亘って、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。特定の例示的な実施形態では、本発明は、Fタンパク質の外部ドメインを含む、哺乳動物MPVのFタンパク質の断片、およびその相同体を提供する。Fタンパク質の外部ドメインを含む、哺乳動物MPVのFタンパク質の断片の該相同体は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のウイルスがコードするFタンパク質(各Fタンパク質のアミノ酸配列は配列番号314〜317に開示されており、表14も参照されたい)の外部ドメインを含む相当する断片と、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。
ある種の実施形態では、本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのタンパク質およびその断片を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのNタンパク質を提供し、該Nタンパク質は、配列番号18または配列番号21がコードするウイルスがコードするNタンパク質との関連性よりも、配列番号19または配列番号20のウイルスがコードするNタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのGタンパク質を提供し、該Gタンパク質は、配列番号18または配列番号21がコードするウイルスがコードするGタンパク質との関連性よりも、配列番号19または配列番号20のウイルスがコードするGタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのPタンパク質を提供し、該Pタンパク質は、配列番号18または配列番号21がコードするウイルスがコードするPタンパク質との関連性よりも、配列番号19または配列番号20のウイルスがコードするPタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのMタンパク質を提供し、該Mタンパク質は、配列番号18または配列番号21がコードするウイルスがコードするMタンパク質との関連性よりも、配列番号19または配列番号20のウイルスがコードするMタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのNタンパク質を提供し、該Fタンパク質は、配列番号18または配列番号21がコードするウイルスがコードするFタンパク質との関連性よりも、配列番号19または配列番号20のウイルスがコードするFタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのM2-1タンパク質を提供し、該M2-1タンパク質は、配列番号18または配列番号21がコードするウイルスがコードするM2-1タンパク質との関連性よりも、配列番号19または配列番号20のウイルスがコードするM2-1タンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのM2-2タンパク質を提供し、該M2-2タンパク質は、配列番号18または配列番号21がコードするウイルスがコードするM2-2タンパク質との関連性よりも、配列番号19または配列番号20のウイルスがコードするM2-2タンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのSHタンパク質を提供し、該SHタンパク質は、配列番号18または配列番号21がコードするウイルスがコードするSHタンパク質との関連性よりも、配列番号19または配列番号20のウイルスがコードするSHタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのLタンパク質を提供し、該Lタンパク質は、配列番号18または配列番号21がコードするウイルスがコードするLタンパク質との関連性よりも、配列番号19または配列番号20のウイルスがコードするLタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。
他の実施形態では、本発明は、サブグループBの哺乳動物MPVのタンパク質またはその断片を提供する。本発明は、サブグループBの哺乳動物MPVのNタンパク質を提供し、該Nタンパク質は、配列番号19または配列番号20がコードするウイルスがコードするNタンパク質との関連性よりも、配列番号18または配列番号21のウイルスがコードするNタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのGタンパク質を提供し、該Gタンパク質は、配列番号19または配列番号20がコードするウイルスがコードするGタンパク質との関連性よりも、配列番号18または配列番号21のウイルスがコードするGタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのPタンパク質を提供し、該Pタンパク質は、配列番号19または配列番号20がコードするウイルスがコードするPタンパク質との関連性よりも、配列番号18または配列番号21のウイルスがコードするPタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのMタンパク質を提供し、該Mタンパク質は、配列番号19または配列番号20がコードするウイルスがコードするMタンパク質との関連性よりも、配列番号18または配列番号21のウイルスがコードするMタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのNタンパク質を提供し、該Fタンパク質は、配列番号19または配列番号20がコードするウイルスがコードするFタンパク質との関連性よりも、配列番号18または配列番号21のウイルスがコードするFタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのM2-1タンパク質を提供し、該M2-1タンパク質は、配列番号19または配列番号20がコードするウイルスがコードするM2-1タンパク質との関連性よりも、配列番号18または配列番号21のウイルスがコードするM2-1タンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのM2-2タンパク質を提供し、該M2-2タンパク質は、配列番号19または配列番号20がコードするウイルスがコードするM2-2タンパク質との関連性よりも、配列番号18または配列番号21のウイルスがコードするM2-2タンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのSHタンパク質を提供し、該SHタンパク質は、配列番号19または配列番号20がコードするウイルスがコードするSHタンパク質との関連性より、配列番号18または配列番号21のウイルスがコードするSHタンパク質との関連性が、系統学的に近縁である。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのLタンパク質を提供し、該Lタンパク質は、配列番号19または配列番号20がコードするウイルスがコードするLタンパク質との関連性よりも、配列番号18または配列番号21のウイルスがコードするLタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。
更に、本発明は、哺乳動物MPVの変異体A1、A2、B1またはB2のタンパク質を提供する。本発明のある種の実施形態では、哺乳動物MPVの異なる変異体のタンパク質は、アミノ酸配列の同一性により相互に識別できる。哺乳動物MPVの変異体は、A1、A2、B1またはB2でもよいが、それだけに限らない。しかし、本発明は、別の変異体に属する哺乳動物MPVの分離株も想定している。
本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のGタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B1の該Gタンパク質は、変異体A1の原型(prototype)である分離株NL/1/00のGタンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のGタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のGタンパク質との関連性よりも、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のGタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のGタンパク質を提供し、該Gタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異体B1のGタンパク質(配列番号324)に対し、少なくとも66%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のNタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B1の該Nタンパク質は、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のNタンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のNタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のNタンパク質との関連性よりも、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のNタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のNタンパク質を提供し、該Nタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異体B1のNタンパク質(配列番号368)に対し、少なくとも98.5%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のPタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B1の該Pタンパク質は、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のPタンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のPタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のPタンパク質との関連性よりも、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のPタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のPタンパク質を提供し、該Pタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異体B1のPタンパク質(配列番号376)に対し、少なくとも96%、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳類MPV変異体B1のMタンパク質を提供し、哺乳類MPV変異体B1の該Mタンパク質は、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のMタンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のMタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のMタンパク質との関連性よりも、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のMタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のMタンパク質を提供し、該Mタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異体B1のMタンパク質(配列番号360)と同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のFタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B1の該Fタンパク質は、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のFタンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のFタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のFタンパク質との関連性よりも、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のFタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のFタンパク質を提供し、該Fタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異体B1のFタンパク質(配列番号316)に対し少なくとも99%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のM2-1タンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B1の該M2-1タンパク質は、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のM2-1タンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のM2-1タンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のM2-1タンパク質との関連性よりも、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のM2-1タンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のM2-1タンパク質を提供し、該M2-1タンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異体B1のM2-1タンパク質(配列番号340)に対し、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のM2-2タンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B1の該M2-2タンパク質は、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のM2-2タンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のM2-2タンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のM2-2タンパク質との関連性よりも、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のM2-2タンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のM2-2タンパク質を提供し、該M2-2タンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異体B1のM2-2タンパク質(配列番号348)に対し、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のSHタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B1の該SHタンパク質は、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のSHタンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のSHタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のSHタンパク質との関連性よりも、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のSHタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のSHタンパク質を提供し、該SHタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異体B1のSHタンパク質(配列番号384)に対し、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のLタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B1の該Lタンパク質は、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のLタンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のLタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のLタンパク質との関連性よりも、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のLタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B1のLタンパク質を提供し、該Lタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異体B1のLタンパク質(配列番号332)に対し、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である。
本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のGタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A1の該Gタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のGタンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のGタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のGタンパク質との関連性よりも、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のGタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のGタンパク質を提供し、該Gタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異体A1のGタンパク質(配列番号322)に対し、少なくとも66%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のNタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A1の該Nタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のNタンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のNタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のNタンパク質との関連性よりも、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のNタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のNタンパク質を提供し、該Nタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異体A1のNタンパク質(配列番号366)に対し少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のPタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A1の該Pタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のPタンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のPタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のPタンパク質との関連性よりも、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のPタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のPタンパク質を提供し、該Pタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異体A1のPタンパク質(配列番号374)に対し、少なくとも96%、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のMタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A1の該Mタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のMタンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のMタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のMタンパク質との関連性よりも、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のMタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のMタンパク質を提供し、該Mタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異体A1のMタンパク質(配列番号358)に対し、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のFタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A1の該Fタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のFタンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のFタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のFタンパク質との関連性よりも、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のFタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のFタンパク質を提供し、該Fタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異体A1のFタンパク質(配列番号314)に対し、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のM2-1タンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A1の該M2-1タンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のM2-1タンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のM2-1タンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のM2-1タンパク質との関連性よりも、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のM2-1タンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のM2-1タンパク質を提供し、該M2-1タンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異体A1のM2-1タンパク質(配列番号338)に対し、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のM2-2タンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A1の該M2-2タンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のM2-2タンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のM2-2タンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のM2-2タンパク質との関連性よりも、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のM2-2タンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のM2-2タンパク質を提供し、該M2-2タンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異体A1のM2-2タンパク質(配列番号346)に対し、少なくとも96%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のSHタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A1の該SHタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のSHタンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のSHタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のSHタンパク質との関連性よりも、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のSHタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のSHタンパク質を提供し、該SHタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異体A1のSHタンパク質(配列番号382)に対し、少なくとも84%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のLタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A1の該Lタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のLタンパク質、A2の原型である分離株NL/17/00のLタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のLタンパク質との関連性よりも、変異体A1の原型である分離株NL/1/00のLタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A1のLタンパク質を提供し、該Lタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異体A1のLタンパク質(配列番号330)に対し、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である。
本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のGタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A2の該Gタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のGタンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のGタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のGタンパク質との関連性よりも、変異体A2の原型である分離株NL/17/00のGタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のGタンパク質を提供し、該Gタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異体A2のGタンパク質(配列番号332)に対し、少なくとも66%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のNタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A2の該Nタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のNタンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のNタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のNタンパク質との関連性よりも、変異体A2の原型である分離株NL/17/00のNタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のNタンパク質を提供し、該Nタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異体A2のNタンパク質(配列番号367)に対し少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のPタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A2の該Pタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のPタンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のPタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のPタンパク質との関連性よりも、変異体A2の原型である分離株NL/17/00のPタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のPタンパク質を提供し、該Pタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異体A2のPタンパク質(配列番号375)に対し、少なくとも96%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のMタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A2の該Mタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のMタンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のMタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のMタンパク質との関連性よりも、変異体A2の原型である分離株NL/17/00のMタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のMタンパク質を提供し、該Mタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異体A2のMタンパク質(配列番号359)に対し、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のFタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A2の該Fタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のFタンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のFタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のFタンパク質との関連性よりも、変異体A2の原型である分離株NL/17/00のFタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のFタンパク質を提供し、該Fタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異体A2のFタンパク質(配列番号315)に対し、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のM2-1タンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A2の該M2-1タンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のM2-1タンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のM2-1タンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のM2-1タンパク質との関連性よりも、変異体A2の原型である分離株NL/17/00のM2-1タンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のM2-1タンパク質を提供し、該M2-1タンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異体A2のM2-1タンパク質(配列番号339)に対し、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のM2-2タンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A2の該M2-2タンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のM2-2タンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のM2-2タンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のM2-2タンパク質との関連性よりも、変異体A2の原型である分離株NL/17/00のM2-2タンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のM2-2タンパク質を提供し、該M2-2タンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異体A2のM2-2タンパク質(配列番号347)に対し、少なくとも96%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のSHタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A2の該SHタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のSHタンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のSHタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のSHタンパク質との関連性よりも、変異体A2の原型である分離株NL/17/00のSHタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のSHタンパク質を提供し、該SHタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異体A2のSHタンパク質(配列番号383)に対し、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のLタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体A2の該Lタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のLタンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のLタンパク質、またはB2の原型である分離株NL/1/94のLタンパク質との関連性よりも、変異体A2の原型である分離株NL/17/00のLタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体A2のLタンパク質を提供し、該Lタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異体A2のLタンパク質(配列番号331)に対し、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である。
本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のGタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B2の該Gタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のGタンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のGタンパク質、またはA2の原型である分離株NL/17/00のGタンパク質との関連性よりも、変異体B2の原型である分離株NL/1/94のGタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のGタンパク質を提供し、該Gタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異体B2のGタンパク質(配列番号325)に対し、少なくとも66%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のNタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B2の該Nタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のNタンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のNタンパク質、またはA2の原型である分離株NL/17/00のNタンパク質との関連性よりも、変異体B2の原型である分離株NL/1/94のNタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のNタンパク質を提供し、該Nタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異体B2のNタンパク質(配列番号369)に対し、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のPタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B2の該Pタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のPタンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のPタンパク質、またはA2の原型である分離株NL/17/00のPタンパク質との関連性よりも、変異体B2の原型である分離株NL/1/94のPタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のPタンパク質を提供し、該Pタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異体B2のPタンパク質(配列番号377)に対し、少なくとも96%、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のMタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B2の該Mタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のMタンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のMタンパク質、またはA2の原型である分離株NL/17/00のMタンパク質との関連性よりも、変異体B2の原型である分離株NL/1/94のMタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のMタンパク質を提供し、該Mタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異体B2のMタンパク質(配列番号361)と同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のFタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B2の該Fタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のFタンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のFタンパク質、またはA2の原型である分離株NL/17/00のFタンパク質との関連性よりも、変異体B2の原型である分離株NL/1/94のFタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のFタンパク質を提供し、該Fタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異体B2のFタンパク質(配列番号317)に対し、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のM2-1タンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B2の該M2-1タンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のM2-1タンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のM2-1タンパク質、またはA2の原型である分離株NL/17/00のM2-1タンパク質との関連性よりも、変異体B2の原型である分離株NL/1/94のM2-1タンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のM2-1タンパク質を提供し、該M2-1タンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異体B2のM2-1タンパク質(配列番号341)に対し、少なくとも98%または少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のM2-2タンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B2の該M2-2タンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のM2-2タンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のM2-2タンパク質、またはA2の原型である分離株NL/17/00のM2-2タンパク質との関連性よりも、変異体B2の原型である分離株NL/1/94のM2-2タンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のM2-2タンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、原型NL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異体B2のM2-2タンパク質(配列番号349)に対し、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のSHタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B2の該SHタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のSHタンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のSHタンパク質、またはA2の原型である分離株NL/17/00のSHタンパク質との関連性よりも、変異体B2の原型である分離株NL/1/94のSHタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のSHタンパク質を提供し、該SHタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異体B2のSHタンパク質(配列番号385)に対し、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のLタンパク質を提供し、哺乳動物MPV変異体B2の該Lタンパク質は、変異体B1の原型である分離株NL/1/99のLタンパク質、A1の原型である分離株NL/1/00のLタンパク質、またはA2の原型である分離株NL/17/00のLタンパク質との関連性よりも、変異体B2の原型である分離株NL/1/94のLタンパク質との関連性の方が、系統学的により近縁である。本発明は、哺乳動物MPV変異体B2のLタンパク質を提供し、該Lタンパク質のアミノ酸配列は、原型NL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異体B2のLタンパク質(配列番号333)に対し、少なくとも99%または少なくとも99.5%同一である。
ある種の実施形態では、配列同一性のパーセンテージは全長タンパク質のアラインメントに基づいている。他の実施形態では、配列同一性のパーセンテージは、該タンパク質の連続アミノ酸配列のアラインメントに基づくものであり、該連続アミノ酸配列は、長さが25アミノ酸、50アミノ酸、75アミノ酸、100アミノ酸、125アミノ酸、150アミノ酸、175アミノ酸、200アミノ酸、225アミノ酸、250アミノ酸、275アミノ酸、300アミノ酸、325アミノ酸、350アミノ酸、375アミノ酸、400アミノ酸、425アミノ酸、450アミノ酸、475アミノ酸、500アミノ酸、750アミノ酸、1000アミノ酸、1250アミノ酸、1500アミノ酸、1750アミノ酸、2000アミノ酸、または2250アミノ酸でもよい。
ある種の特定な実施形態では、本発明は、哺乳動物MPVのGタンパク質を提供し、該Gタンパク質は、配列番号119〜153、配列番号322〜325に示されたアミノ酸配列の1つ、またはその断片を有する。ある種の特定な実施形態では、本発明は、哺乳動物MPVのFタンパク質を提供し、該Fタンパク質は、配列番号234〜317に示されたアミノ酸配列の1つを有する。ある種の特定な実施形態では、本発明は、哺乳動物MPVのLタンパク質を提供し、該Lタンパク質は、配列番号330〜333に示されたアミノ酸配列の1つ、またはその断片を有する。ある種の特定な実施形態では、本発明は、哺乳動物MPVのM2-1タンパク質を提供し、該M2-1タンパク質は、配列番号338〜341に示されたアミノ酸配列の1つ、またはその断片を有する。ある種の特定な実施形態では、本発明は、哺乳動物MPVのM2-2タンパク質を提供し、該M2-2タンパク質は、配列番号346〜349に示されたアミノ酸配列の1つ、またはその断片を有する。ある種の特定な実施形態では、本発明は、哺乳動物MPVのMタンパク質を提供し、該Mタンパク質は、配列番号358〜361に示されたアミノ酸配列の1つ、またはその断片を有する。ある種の特定な実施形態では、本発明は、哺乳動物MPVのNタンパク質を提供し、該Nタンパク質は、配列番号366〜369に示されたアミノ酸配列の1つ、またはその断片を有する。ある種の特定な実施形態では、本発明は、哺乳動物MPVのPタンパク質を提供し、該Pタンパク質は、配列番号374〜377に示されたアミノ酸配列の1つ、またはその断片を有する。ある種の特定な実施形態では、本発明は、哺乳動物MPVのSHタンパク質を提供し、該SHタンパク質は、配列番号382〜385に示されたアミノ酸配列の1つ、またはその断片を有する。
本発明のある種の実施形態では、断片は、長さが少なくとも25アミノ酸、50アミノ酸、75アミノ酸、100アミノ酸、125アミノ酸、150アミノ酸、175アミノ酸、200アミノ酸、225アミノ酸、250アミノ酸、275アミノ酸、300アミノ酸、325アミノ酸、350アミノ酸、375アミノ酸、400アミノ酸、425アミノ酸、450アミノ酸、475アミノ酸、500アミノ酸、750アミノ酸、1000アミノ酸、1250アミノ酸、1500アミノ酸、1750アミノ酸、2000アミノ酸、または2250アミノ酸である。本発明のある種の実施形態では、断片は、長さが多くとも25アミノ酸、50アミノ酸、75アミノ酸、100アミノ酸、125アミノ酸、150アミノ酸、175アミノ酸、200アミノ酸、225アミノ酸、250アミノ酸、275アミノ酸、300アミノ酸、325アミノ酸、350アミノ酸、375アミノ酸、400アミノ酸、425アミノ酸、450アミノ酸、475アミノ酸、500アミノ酸、750アミノ酸、1000アミノ酸、1250アミノ酸、1500アミノ酸、1750アミノ酸、2000アミノ酸、または2250アミノ酸である。
更に、本発明は哺乳動物MPVに由来する核酸配列を提供する。本発明は、哺乳動物MPVに由来する核酸配列の誘導体も提供する。ある種の特定な実施形態では、該核酸は修飾されている。
ある種の実施形態では、本発明の核酸は、上記に定義したような哺乳動物MPVのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある種の実施形態では、本発明の核酸は、上記に定義したような哺乳動物MPVのサブグループAのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある種の実施形態では、本発明の核酸は、上記に定義したような哺乳動物MPVのサブグループBのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある種の実施形態では、本発明の核酸は、上記に定義したような哺乳動物MPVの変異体A1のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある種の実施形態では、本発明の核酸は、上記に定義したような哺乳動物MPVの変異体A2のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある種の実施形態では、本発明の核酸は、上記に定義したような哺乳動物MPVの変異体B1のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある種の実施形態では、本発明の核酸は、上記に定義したような哺乳動物MPVの変異体B2のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。
ある種の実施形態では、本発明は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のヌクレオチド配列に対し、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一のヌクレオチド配列を提供する。ある種の実施形態では、本発明の核酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のヌクレオチド配列の断片に対し、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であり、該断片は、長さが少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも75ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも150ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも250ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも750ヌクレオチド、少なくとも1000ヌクレオチド、少なくとも1250ヌクレオチド、少なくとも1500ヌクレオチド、少なくとも1750ヌクレオチド、少なくとも2000ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも3000ヌクレオチド、少なくとも4000ヌクレオチド、少なくとも5000ヌクレオチド、少なくとも7500ヌクレオチド、少なくとも10000ヌクレオチド、少なくとも12500ヌクレオチド、または少なくとも15000ヌクレオチドである。特定の実施形態では、本発明の核酸配列は、配列番号84〜118、配列番号154〜233、配列番号318〜321、配列番号326〜329、配列番号334〜337、配列番号342〜345、配列番号350〜353、配列番号354〜357、配列番号362〜365、配列番号370〜373、配列番号378〜381、または配列番号386〜389のヌクレオチド配列のうち1つに対し少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくは少なくとも99.5%、または100%同一である。
本発明の特定の実施形態では、本発明の核酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21の核酸配列の1つと低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、または高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリッド形成をすることができる。本発明の特定の実施形態では、本発明の核酸配列は、配列番号84〜118、配列番号154〜233、配列番号318〜321、配列番号326〜329、配列番号334〜337、配列番号342〜345、配列番号350〜353、配列番号354〜357、配列番号362〜365、配列番号370〜373、配列番号378〜381、または配列番号386〜389の核酸配列の1つと低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、または高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリッド形成をすることができる。ある種の実施形態では、核酸は、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも75ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも150ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも250ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも750ヌクレオチド、少なくとも1000ヌクレオチド、少なくとも1250ヌクレオチド、少なくとも1500ヌクレオチド、少なくとも1750ヌクレオチド、少なくとも2000ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも3000ヌクレオチド、少なくとも4000ヌクレオチド、少なくとも5000ヌクレオチド、少なくとも7500ヌクレオチド、少なくとも10000ヌクレオチド、少なくとも12500ヌクレオチド、または少なくとも15000ヌクレオチドの長さに亘り、配列番号18、配列番号19、配列番号20、または配列番号21のヌクレオチド配列とハイブリッド形成をする。
更に、本発明は、哺乳動物MPVのタンパク質と特異的に結合する、抗体および抗原結合性断片を提供する。本発明の抗体は、哺乳動物MPVのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。特定の実施形態では、該抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。ある種の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループAウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。他のある種の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループBウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。ある種のより特定な実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVの変異体A1ウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。他の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループA2ウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。ある種の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループB1ウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。他のある種の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループB2ウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。
5.16 七連子(heptad)リピートを用いたウイルス細胞融合の阻害
ウイルス-宿主細胞の融合は、MPVを含めた多数のエンベロープ付きウイルスの感染性生活環において必要なステップである。したがって、ウイルス細胞融合の阻害は、このようなウイルスの抑止に対する新たな手法となる。この阻害法は、宿主中でのMPVの増殖およびMPVによる宿主の感染を防止する代替手段となる。ウイルス-細胞融合の阻害は、必要とされる付着タンパク質の種類に依存する。Wang et al., Biochem Biophys Res Comm 302 (2003) 469-475. したがって、本発明の一実施形態では、ウイルス細胞融合の様々な付着タンパク質に対する依存性を特定するアッセイが使用される。
ある種の実施形態では、本発明は、対象におけるhMPV感染症を予防、治療または管理する方法であって、七連子リピート(HR)ペプチドの医薬有効量を投与することを含む方法を提供する。ある種の実施形態では、医薬有効量は、ウイルス宿主細胞融合を少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも99.5%減少させる。特定の実施形態では、該HRは対象中で感染症を起こすウイルスのHRである。ある種の実施形態では、該HRはサブタイプA1のhMPVのHRである。より特定な実施形態では、該HR配列は、HRAまたはHRBと称する、hMPVのFタンパク質のHR配列の一方であって、HRAが該ペプチドのN末端近傍の七連子リピート配列であり、HRBがC末端近傍のそのような配列である。ある種の実施形態では、対象におけるhMPV感染症を治療、予防または管理するために投与するHRは、A1、B1、A2またはB2のhMPVサブタイプのHRである。
ある種の実施形態では、該HRは、対象中で感染症を起こすウイルスのHRと、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、または少なくとも99.5%同一である。ある種の実施形態では、HRの誘導体は、ウイルス融合を防止するために使用できる。このような誘導体には、以下のものに限らないが、非天然アミノ酸で置換された、切断されてある連続のアミノ酸が除かれた、または延長されて単一のアミノ酸もしくはある連続のそのアミノ酸が付加されたHRペプチドが含まれる。更に別の実施形態では、単一のHRペプチドが、hMPV感染症の治療、管理または予防に使用される。なお更なる実施形態では、HRペプチドの組合せが、hMPV感染症の治療、管理または予防のために投与される。
以下に示す試験を用いて、hMPVの細胞との融合を防止する際のHRの有効性を決定でき、したがって、それらを用いて、対象におけるhMPV感染症を治療、予防または管理するのに最適なHR、またはその類縁体もしくは誘導体がいずれであるかを決定できる。
本発明の別の実施形態では、可溶性合成HRペプチドのアッセイにより、該ペプチドがウイルス-細胞融合を防止できるか否かを決定する。それだけに限らないが、RSV、PIV、APVおよびhMPVに対するHR配列を含めた任意のHR配列が、hMPVウイルス-細胞融合を阻害するために使用できる。好ましい実施形態では、該HR配列はhMPVのHR配列である。より特定な実施形態では、該HR配列は、HRAまたはHRBと称する、hMPVのFタンパク質のHR配列の一方であって、HRAが該ペプチドのN末端近傍の七連子リピート配列であり、HRBがC末端近傍のそのような配列である。本発明の別の実施形態では、hMPVウイルス-細胞融合の阻害に使用されるHRAおよびHRB由来ペプチドには、それだけに限らないが、RSV、APVおよびPIVからのHRAおよびHRBペプチドが含まれる。本発明の更に別の実施形態では、HRAおよびHRBペプチドの誘導体が、hMPVウイルス-細胞融合の阻害に使用される。例えば、HRAまたはHRBペプチド中の少なくとも1個のアミノ酸残基の変異で作製される誘導体は、hMPVウイルス-細胞融合の阻害に使用される。本発明の別の実施形態では、誘導体は、HRAまたはHRBペプチドの特定領域の切断または切除により作製される。更になお別の実施形態では、使用されるHRAおよびHRBペプチドは、内因性HR配列に関して延長される。なお更なる実施形態では、HRAまたはHRBペプチドの異なる領域の配列からなる短鎖ペプチドの各群が、hMPVウイルス-細胞融合の阻害に使用される。本発明の別の実施形態では、hMPV HRAおよびHRB由来ペプチドが、hMPVの相同株またはhMPVの異種株に対して使用される。本発明の更に別の実施形態では、HRAおよびHRBペプチド、またはそれらの類縁体もしくは誘導体が、ウイルス-細胞融合の阻害に一緒に使用される。より好ましい実施形態では、HRAもしくはHRBペプチド、またはその類縁体もしくは誘導体が、単独で使用される。別の実施形態では、使用されるHRAまたはHRBペプチドの誘導体は、内因性HRペプチドと少なくとも90%、80%、70%、60%または50%同一である。
七連子リピート配列のウイルス融合阻害能を調べるために、七連子リピートペプチドを発現させ、精製することにより、そのウイルス融合阻害能を試験することができる。可溶性七連子リピートペプチドを発現させ、精製した後、内因性七連子リピートとの競合アッセイに使用することにより、ウイルス融合の阻止性を試験することができる。本発明の一実施形態では、それぞれHRAおよびHRBと称する、hMPVのFタンパク質の七連子リピート配列をコードする、合成組換えDNAを調製してもよい。別の実施形態では、精製の促進に有用な配列タグも含んだ七連子リピートペプチドをコードする、合成組換えDNAを調製してもよい。本発明の好ましい実施形態では、七連子リピートペプチドの精製を促進する該タグはその活性を妨害しない。本発明の更に別の実施形態では、該タグは、該ペプチドの末端の一方にある一連のヒスチジン残基、例えば6連ヒスチジンで構成され、ヒスチジンタグと呼ばれる。可溶性HRAおよびHRBを発現させ、精製するために使用できる手法は、幾種もある。第一に、HRAおよびHRBをコードするDNAベクターが、当業者に公知の方法を用いて調製される。その後、該プラスミドを例えば大腸菌(E. coli)BL21(DE3)株などの適当な発現宿主細胞中に移入、形質転換し、当分野で常套的な方法を用いて該タンパク質を発現させ、精製する。例えば、ヒスチジンタグ付きのHRペプチドをコードする遺伝子の発現は、IPTGを用いてpETベクターから誘発することができる。次いで、細胞を溶解することができ、発現ペプチドは、逆荷電種、例えばイミダゾールで溶離後、Niキレートセファロース親和性カラム上に固定化した後、単離できる。
ウイルス融合を阻害する際の発現七連子リピートペプチドの潜在的有効性を決定するために、HRペプチド同士間の複合体の構築を確認するアッセイが使用できる。この方法は、ウイルス融合阻害における効力を決定するために、ペプチドの無細胞スクリーニングが可能となるため、細胞ベースの方法より有利となろう。本発明の一実施形態では、複合体形成が可能になるのに十分な期間、該ペプチド同士の同時インキュベーションを行う。より特定の実施形態では、複合体形成ができる時間の長さは28℃で1時間である。複合体形成は、以下の方法に限らないが、クロマトグラフィー、紫外可視分光、NMR分光、X線結晶解析、遠心分離、または電気泳動を含めた、当分野で公知の任意の方法を用いて検出できる。本発明の別の特定の実施形態では、複合体の分子量を決定するために、電気泳動と連動させたゲルろ過法を用いて複合体形成が検出される。本発明の更に別の実施形態では、この複合体形成アッセイを用いてウイルス融合の阻害に有用な候補物質を同定する、例えば、ウイルス融合の阻害における変異HRペプチドの有効性が決定される。本発明の更になお別の実施形態では、ウイルス融合の阻害におけるHRペプチドの誘導体の有効性が、この複合体形成アッセイを用いて測定される。
ペプチドの七連子リピートセグメントは、本来ヘリックス状であることが知られている。このため、発現HRペプチドがαヘリックスを形成するか否かを決定することにより、ウイルス融合阻害に使用する適当な候補物質を同定するために、幾つもの方法が使用できる。このような方法には、分光、X線結晶解析、顕微鏡観察などが挙げられるが、これらに限らない。本発明の一実施形態では、CD(円二色性)分光を用いてHRペプチドの構造的特徴を決定する。
ウイルス融合の阻害におけるHRペプチドの有効性を決定するために、細胞ベースの方法が使用できる。それだけに限らないが、tMK、Hep2またはVero細胞を含めた、MPVに感染し得る任意の細胞が、このアッセイに使用できる。特定の実施形態では、使用される細胞種はHep2細胞である。宿主細胞をMPVで感染させたとき、該細胞をHRタンパク質調製物とインキュベーションし、適当な期間のインキュベーション後にその融合度を採点する。その後、細胞を染色して合胞体/多核体の形成を調べることにより、ウイルス-細胞融合が成功したか否かを決定する。
本発明については、本発明の例示として示されている以下の非限定的実施例を参照することにより、その理解を深め得る。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより十分に例示するために提示されている。しかし、そうした実施例は、本発明の広範な範囲を限定するものとは決してみなすべきではない。
6. 実施例: ヒトメタニューモウイルス融合(F)タンパク質の推定切断部位におけるS101P置換は、Vero細胞中でのトリプシン非依存性増殖に対する主要決定因子である
材料および方法
細胞およびウイルス: 10%ウシ胎児血清(FBS)(Hyclone)、2mM L-グルタミン(Gibco BRL)、非必須アミノ酸類(Gibco BRL)、および2%ペニシリン/ストレプトマイシン(Biowhittaker)を補充した最少必須培地(MEM)(JHR Biosciences)中で、Vero細胞を維持した。10% FBS、5%トリプトースリン酸ブロス(Sigma)、非必須アミノ酸類、および2%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したGlasgow MEM(Gibco BRL)中で、BSR/T7細胞(KK Conzelmann博士のご好意で頂いた)を維持した。tMK細胞は既述のように維持した(van den Hoogen等、2001年)。hMPVおよびキメラb/h PIV3のウイルスは、optiMEM(Gibco/BRL)および2%ペニシリン/ストレプトマイシンを用いてVero細胞中で増殖させた。一部のウイルスは0.2μg/mlのTPCKトリプシン(Sigma)を用いて増殖させた。ウイルスウイルスストックは、SPG(10×SPGは、2.18Mスクロース、0.038M KH2PO4、0.072M KH2PO4、0.054M L-グルタミン酸(pH7.1)である)と共に細胞および上清を1×SPGの最終濃度となるようにすくい取り、-70℃で凍結することにより、回収した。
ウイルス分離株のwt hMPV/NL/1/93、wt hMPV/NL/1/94、wt hMPV/NL/1/99およびwt hMPV/NL/1/00は、以前に記載した(Hersft等、2004年; van den Hoogen等、2001年)。以下の組換えウイルスは、完全長cDNAプラスミドから逆遺伝学的方法により生成した: rhMPV/NL/1/00/101P、rhMPV/NL/1/00/101S、rhMPV/NL/1/99/101S、rhMPV/93K/101S、rhMPV/93K/101P、b/h PIV3/hMPV F/101P、およびb/h PIV3/hMPV F/101S。変異体ウイルスのvhMPV/93K/101PおよびvhMPV/100K/101Pは、rhMPV/93K/101Pから誘導した。
hMPVプラークの免疫染色による力価: ウイルス力価(プラーク形成単位(PFU)/ml)は、Vero細胞中でのプラークアッセイで決定した。Vero細胞をTC6ウェルプレート中で集密近くまで増殖させた。optiMEM中に希釈したウイルスを35℃で1時間吸着させた後、該細胞上に2%ペニシリン/ストレプトマイシン含有optiMEMで1:1に希釈した2%メチルセルロースを重層し、35℃で6日間インキュベートした。免疫染色の準備として、その重層を除き、細胞をメタノール中15分間固定した。wt hMPV/NL/1/00で免疫したフェレットから得た抗hMPV抗血清(MedImmune Vaccines, Inc.)でプラークを免疫染色した。該抗血清は、5%粉乳(w/v)を含んだPBS(PBS-ミルク)中、約1:500に希釈した。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗フェレットAb(Dako)と、次に3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC) (Dako)と細胞をインキュベートすることにより、プラークを計数のために可視化した。
全長hMPV cDNAプラスミドの構築: hMPV/NL/1/00(101S含有)およびhMPV/NL/1/99(101S含有)のcDNAを既述のように構築し、これらを用いてrhMPV/NL/1/00/101SおよびrhMPV/NL/1/99/101Sと命名した組換えウイルスを回収した(Hersft等、2004年)。組換えウイルスrhMPV/NL/1/00/101Pを回収するのに使用するプラスミドを構築するため、hMPV F糖タンパク質の推定アミノ酸配列においてS101Pをコードするヌクレオチド置換T3367CをプライマーGCAAATTGAAAATCCCAGACAACCTAGATTCGTTCTAGGおよびそのアンチセンスプライマーを用いて導入した。hMPV F糖タンパク質において推定アミノ酸置換E93Kをコードするヌクレオチド置換G3343Aは、プライマーGCTGATCAACTGGCAAGAGAGAAGCAAATTGAAAATCCCおよびそのアンチセンスプライマーで同様に導入した。
逆遺伝学的方法による組換えhMPVウイルスの回収: 既述(Herfst等、2004年)のように逆遺伝学的方法によって組換えhMPVウイルスを回収した。手短に言えば、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を10μL含有するoptiMEM 500μL中、pCITE hMPV N 1.2μg、pCITE hMPV P 1.2μg、pCITE hMPV M2 0.9μg、pCITE hMPV L 0.6μg、および完全長cDNAプラスミド5μgを、BSR/T7細胞106個の単層に適用した。その培地をトランスフェクションから15時間後、optiMEMに取替え、35℃で2〜3日間インキュベートした。凍結解凍サイクルを1回行った後、細胞および上清を用いてVero細胞の90%集密単層に感染させ、それを6日間インキュベートすることによりレスキューウイルスを増幅させた。ウイルスの回収は、前記のようにhMPVに対するフェレットポリクローナルAbで陽性免疫染色することにより確認した。回収したウイルスは、0.1PFU/細胞の感染多重度(MOI)で接種し、optiMEMを供給し、35℃で6日間のインキュベーション後に収集することによって、Vero細胞中で増幅させた。一部のトランスフェクションおよび増殖は、前記のように0.2μg/mlのTPCKトリプシン(Sigma)の存在下で行った。
回収したウイルスのRT-PCR: 配列決定用のDNAは、0.1PFU/細胞のMOIでhMPVウイルスをVero細胞単層に接種することにより生成した。細胞および上清を接種から6日後に収集し、凍結解凍サイクルを1回行なった。RNAは、TRizol試薬を用い、製造業者の使用説明書に従って抽出した。RT-PCRは、一段階RT-PCRキット(Invitrogen)および重複したプライマーのセットを用いて行なった。RT-PCR断片のクロマトグラムは、ゲル抽出キット(Qiagenゲル抽出キット)を用いてアガロースゲルから単離したDNAから生成した。
Vero細胞中でのhMPVウイルスの多サイクル増殖: TC6ウェルプレート中のVero細胞の準集密単層に、0.2μg/mlのTPCKトリプシン(Sigma)の非存在下または存在下で、optiMEM中に希釈したhMPVウイルスを0.1PFU/細胞のMOIで接種した。ウイルス接種液を吸引除去し、細胞にoptiMEM+/-0.2μg/ml TPCKトリプシンを1ウェル当たり2ml供給した。細胞+上清を24h間隔で6日間収集し、-70℃で凍結した。収集試料の力価は、Vero細胞+/-0.2μg/ml TPCKトリプシン中で測定した。プラークは、前記のようにフェレット抗hMPVポリクローナルAb(MedImmune Vaccines, Inc.)で免疫染色することにより、可視化した。
hMPV F糖タンパク質の表面発現のための免疫染色: Vero細胞をカバーガラス上に播種した。Vero細胞の準集密単層に5PFU/細胞のMOIで接種した。ウイルス接種液を吸引除去し、細胞に2%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むoptiMEMを供給した。35℃で3日間のインキュベーション後、細胞を3%パラホルムアルデヒド中で10分固定した。次いで、単層をPBS中で洗浄し、PBS-ミルク中でブロックした。細胞は、PBS-ミルク中に1:250に希釈した抗hMPV Fモノクローナル抗体(Mab)121-1017-133(未発表)と共に室温で1時間インキュベートした後、PBS中で2回洗浄した。次いで、細胞を、PBS-ミルク中に1:1000に希釈したフルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合抗アルメニアハムスターAb(Jackson Laboratories)と共に室温で1時間インキュベートした後、PBS中で2回洗浄した。反転させたカバーガラスをスライドガラス上にVecta-shield封入剤(Vector Laboratories)10μLを用いてマウントし、Nikon エクリプス TE2000-U顕微鏡で観察した。
hMPV Fタンパク質のウェスタンブロット: hMPVウイルスを用いて、TC6ウェル組織培養皿中のVero細胞の準集密単層に0.1PFU/細胞のMOIで感染させ、35℃でインキュベートした。感染から4〜6日後、細胞および上清を収集し、-70℃で凍結した。試料を解凍し、5%β-メルカプトエタノール(Sigma)を含むLaemmli緩衝液(Bio-Rad)中で溶解させ、12%ポリアクリルアミドTris-HCl Ready Gel(Bio-Rad)中で分離し、湿式転写セル(Bio-Rad)を用いてHybond-P PVDF膜(Amersham Biosciences)に転写した。膜は、5%(w/v)粉乳を含むPBS (PBS-ミルク) でブロックし、PBS-ミルク中に1:2000に希釈した抗hMPV F Mab 121-1017-133と共にインキュベートした後、PBS-ミルク中に1:1000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ハムスターMabと共にインキュベートした。膜は、0.5%(v/v)Tween20(Sigma)を含むPBSで4回洗浄し、化学発光基質(Amersham Biosciences)で発色させ、Biomax MRフィルム(Kodak)に露光してhMPV Fタンパク質を可視化した。
b/h PIV3/hMPV F2完全長cDNA: b/h PIV3/hMPV F2(101Sを含んだhMPV Fを発現する)については、以前に記述した(Tang等、2003年)。手短に言えば、ウシ/ヒトキメラパラインフルエンザウイルス3型(b/h PIV3)cDNA(Haller等、2000年; Haller等、2001年)のNおよびP遺伝子間に、hMPV F遺伝子を挿入した。hMPV/NL/1/00ゲノムにおけるT3367Cに対応するヌクレオチド変化を、b/h PIV3/hMPV F2のhMPV F遺伝子中に、Quik change変異誘発キット(Stratagene)を用いて導入し、アミノ酸101番にプロリンを有するhMPV Fを発現するb/h PIV3/hMPV/F2/101Pを得た。
Vero細胞における融合核の定量: TC6ウェルプレート中の集密Vero細胞の単層に3PFU/細胞のMOIで接種したもの、または該単層を疑似感染させたものを、2重に作製した。35℃で1時間のインキュベーション後、接種液を吸引除去し、2%ペニシリン/ストレプトマイシン+/-0.2μg/ml TPCKトリプシン(Sigma)含有optiMEMと1:1で混合した2%メチルセルロースを細胞上に重層した。48時間後または72時間後に培地を吸引除去し、単層をメタノールで15分間固定した。固定化単層をPBSで洗浄し、Hoechst染色液(PBS中ビスベンズイミドH33258(Sigma)0.25μg/ml)と1時間インキュベートし、DAPIレンズを備えたNikon エクリプス TE2000-U顕微鏡で調べた。無作為に選択した10視野中の融合核および非融合核(合計2000個超の核)を計数し、融合核の比率(%)を計算した。
結果
Vero細胞中での増殖に対するトリプシン要求性は、wt hMPVの代表的な4つのサブタイプ間で異なる: A1、A2、B1およびB2の全4つのサブタイプを代表するhMPVウイルスの生体由来株をVero細胞中で増殖させた。サブタイプA1およびB1を各々代表するwt hMPV/NL/1/00およびwt hMPV/NL/1/99は、トリプシンの有無に関わらずピーク力価106〜107PFU/mlまで増殖した。免疫染色により可視化した場合のプラークの大きさは、1%メチルセルロース下でのVero細胞中での6日間の増殖後、直径が大まかに0.3〜0.5mmであった(図1)。
極めて対照的に、サブタイプA2およびB2を各々代表するwt hMPV/NL/1/93およびwt hMPV/NL/1/94は、培地中にトリプシンが存在するときのみ増殖した。wt hMPV/NL/1/93がピーク力価106〜107PFU/mlまで増殖したのに対して、wt hMPV/NL/1/94の力価は1ログ低かった。その上、トリプシンが重層培地中に存在しないときは、プラークが生成しなかった。トリプシンの存在下でwt hMPV/NL/1/93およびwt hMPV/NL/1/94が生成したプラークの直径は、トリプシンを含む条件または含まない条件でhMPV/NL/1/00またはwt hMPV/NL/1/99が生成したプラークより著しく小さかった(図1)。
全4つのhMPVサブタイプのF糖タンパク質の公開された配列から、推定上の切断部位においてRQSRモチーフが予測される。F遺伝子の配列決定により、wt hMPV/NL/1/93およびwt hMPV/NL/1/94(各々サブタイプA2およびB2)は、推定RQSR配列を予想通り有することが確認された。しかし、wt hMPV/NL/1/00およびwt hMPV/NL/1/99(各々サブタイプA1およびB1)の配列は、推定上の切断部位がRQPRとなるようなFタンパク質中の推定S101Pアミノ酸置換をもたらすT3367C変換を獲得していた。hMPVのトリプシン非依存性増殖に対するS101P置換の効果について、その特徴を更に決定した。
rhMPV/NL/1/00/101PはトリプシンなしでcDNAから再生できるが、rhMPV/NL/1/00/101Sは再生できない: hMPV FにおけるS101Pアミノ酸置換がhMPV/NL/1/00のトリプシン非依存性増殖に及ぼす効果を調べるために、ヌクレオチド3367位にTを導入してrhMPV/NL/1/00/101Sを生成し、またはヌクレオチド3367位にCを導入してrhMPV/NL/1/00/101Pを生成した。rhMPV/NL/1/00/101Pはトリプシンの非存在下で容易に再生され、wt hMPV/NL/1/00と同等のプラークを形成した。極めて対照的に、rhMPV/NL/1/00/101Sはトリプシンが存在するときのみ再生され、rhMPV/NL/1/00/101Pのプラークより有意に小さいプラークを形成した(図2A)。
Vero細胞におけるrhMPV/NL/1/00/101SおよびrhMPV/NL/1/00/101Pの複製の比較: Fタンパク質中に101Sまたは101Pを有する組換えhMPV/NL/1/00ウイルスのトリプシン非依存性増殖の特性解析をするために、トリプシンの存在下または非存在下で多サイクル増殖曲線を達成した。
各時点における感染性ウイルスの定量は、トリプシンの存在下または非存在下でのプラークアッセイにより実行した(図2B)。トリプシン存在下では、rhMPV/NL/1/00/101SおよびrhMPV/NL/1/00/101Pは共に、効率的な多サイクル増殖を示した。rhMPV/NL/1/00/101Pが3日目に7.8 log10 PFU/mlのピーク力価に達したのに対し、rhMPV/NL/1/00/101Sは5日目に7 log10 PFU/mlのピーク力価を実現した(図2B)。
トリプシン非存在下では、rhMPV/NL/1/00/101Pだけが多サイクル増殖を起こし、トリプシン存在下での増殖とよく似た、3日目に7.6 log10のピーク力価に達した。rhMPV/NL/1/00/101Sは、プラークアッセイでトリプシンを排除した場合には、検出されなかった(図2B)。
しかし、トリプシンを用いない増殖の際に収集したウイルスは、トリプシンを添加条件下でのプラークアッセイで感染性フォーカスを形成したので、rhMPV/NL/1/00/101Sの単周期増殖がトリプシン非存在下で起こったように見えた。このことから、rhMPV/NL/1/00/101Sのウイルス粒子は、トリプシンを用いない複製の際に生成されるが、培地中にトリプシンが無ければ感染性を示さないことが示唆された。トリプシンを用いずに増殖させたrhMPV/NL/1/00/101Sのピーク力価は、rhMPV/NL/1/00/101Pと比較して約2 log1低かった(図2B)。
rhMPV感染細胞におけるhMPV Fタンパク質の表面発現に対するS101Pの効果: パラミクソウイルス融合タンパク質は、細胞膜に輸送され、そこで膜融合を促進する。rhMPV/NL/1/00/101Sの増殖の弱さが、細胞表面でのhMPV Fの発現低下によるものか否かを決定するために、Vero細胞に5 PFU/細胞のMOIで接種し、接種から3日後に免疫染色のために固定した。hMPV Fは、トリプシンの有無に関わらず、rhMPV/NL/1/00/101Pで接種した細胞のほぼ100%で検出された。トリプシン存在下でrhMPV/NL/1/00/101Sで接種したVero細胞では、hMPV Fの同程度の発現が認められた(図2C)。
対照的に、トリプシンを用いずにrhMPV/NL/1/00/101Sに感染させた単層では、数個の個別の細胞だけに細胞膜上でFタンパク質の表面発現が検出された(図2C)。このことから、hMPV F/101Sは、トリプシンを用いずに細胞膜上に確かに発現されたが、隣接細胞に広がらない非効率的rhMPV/NL/1/00/101S感染が起こったことが示唆された。hMPV F/101Sがトリプシン非存在下でrhMPV/NL/1/00/101S感染の活発な拡散を促進できないのは、部分的には感染性ウイルス粒子を生成できないためでありうる。しかし、融合タンパク質前駆体の効率的切断も、細胞間融合およびウイルス感染の拡散には必要である。
rhMPV/NL/1/00/101Pと比較した場合のrhMPV/NL/1/00/101SのhMPV Fタンパク質の切断: 理論に拘るわけではないが、F0前駆体がF1断片とF2断片とに切断されることにより、F1断片のN末端で融合ペプチドが露出し、それは融合活性および多サイクルウイルス増殖にとって必要である。S101P置換のF切断効率に対する効果を示すために、Vero細胞に、トリプシンを用いるかまたは用いずに0.1 PFU/細胞のMOIで接種した。細胞および上清を感染から5日後に収集し、ウェスタンブロットにより分析してhMPV Fの相対切断を可視化した。
101Pを含んだFタンパク質については、全長hMPV Fタンパク質(F0)の約半量が切断され、推定上のF1断片の予測サイズに相当するF種を形成した。101Pを含んだFタンパク質に対するプロセシングの効率は、トリプシンの有無によらず同等である(図2D)。
対照的に、101Sを含んだhMPV Fは、そのタンパク質をトリプシンに曝したときにだけ切断された。切断の相対的効率は、hMPV F/101Pと比較して有意に低かった(図2D)。トリプシンを用いた場合また用いない場合の101Sを含んだFタンパク質の相対的切断量は、添加したトリプシンの比活性の違いのために実験間で様々であることが判明した。しかし、hMPV F/101Sの相対的切断量は、hMPV F/101Pの場合より少ないことが再現性よく示された。
b/h PIV3ウイルスベクターから発現させた場合の、hMPV/101Pと比較したhMPV/101SのF切断: hMPV F切断が、他のhMPVウイルスタンパク質がもたらす天然のウイルス背景に依存するか否かを決定するために、予測される101Sまたは101Pを有するhMPV Fタンパク質を、b/h PIV3、即ちFおよびHN遺伝子をヒトPIV3 FおよびHN遺伝子に入れ替えたウシPIV3ウイルス中に、クローニングした。以前の研究によれば、b/h PIV3は、多様なパラミクソウイルス融合糖タンパク質の挿入を受け容れることが示された(Skiadopoulos等、2002年; Tang等、2003年、2004年aおよび2004年b)。トリプシンを外部から添加しない場合、感染細胞溶解物のウェスタンブロットにより決定したところ、ベクター化hMPV/NL/1/00/101P Fタンパク質はVero細胞中で部分的に切断されたが、hMPV/NL/1/00/101S Fタンパク質は切断されなかった(図3)。しかし、ベクター化hMPV F/ 101Pタンパク質の切断の程度は、hMPV感染細胞におけるhMPV F/ 101PのFの切断と比べて減少した(図70Dと71を比較されたい)。この差異は、トリプシンを添加したときはもはや認められなかった。トリプシンの存在下では、hMPV/NL/1/00/101P、hMPV/NL/1/00/101S双方のベクター化Fタンパク質は、wt hMPV/NL/1/00から発現されたFタンパク質と同程度に部分的に切断された(図3)。
hMPV/NL/1/00の自然発生hMPV F変異体: rhMPV/NL/1/00/101Pは、融合タンパク質の推定切断部位にあるRQPRモチーフ中で、またはその上流で他のコドン変化を急速に起こした。rhMPV/NL/1/00/101Pの1つのストックは、Fにおける予測上のE93Kアミノ酸置換をコードする変異G3343Aを自発的に生じた(図4Cの枠囲みコドン)。第2のストックは、Fにおける予測上のQ100K置換をコードする変異C3364Aを生じた(図4Dの丸囲みコドン)。これらの変異は、Vero細胞中で更に10継代の間遺伝的に安定性を維持した。このような継代の間、Fタンパク質中に他の変異は検出されなかった。こうした変異ウイルスの1種、vhMPV/93K/101Pに対して、その全配列(ゲノムの3'および5'末端の最も端の30ヌクレオチドは除く)が決定され、G3343Aが検出された唯一の変異であった。その他のhMPV ORFや非コード領域には他に変異が見出されず、このことから、hMPVゲノムのポリメラーゼ複合体による複製は、本質的にエラーを起こし易いというわけではないことが示唆された。
rhMPV/NL/1/00/101Pの独立にレスキューしたストック間では、G3343Aにおいて多型が最も頻繁に認められた。rhMPV/NL/1/00/101Pの5つの異なるウイルスストックに、推定切断部位の上流のヌクレオチドにおける他の5種の多型も見出されたが、その頻度はG3343Aより低かった。こうした多型は、G3340A、A3344T、T3350G、G3352AおよびA3355Cであり、それらは、予測アミノ酸置換E92K、E93V、I95S、E96KおよびN97Hをコードする(表20aおよび20b)。これらの多型の1種を生じたrhMPV/NL/1/00/101Pの各ウイルスストックは、こうした追加変異のうち1つだけを示したが決して2つ以上は示さなかったし、それは細胞培養の6継代未満に起こった。したがって、こうした追加変異のいずれによっても、Vero細胞中での増殖上の利点が個別に得られる。
表20aおよび20b: rhMPV/NL/1/00/101P、wt hMPV/NL/1/00およびwt hMPV/NL/1/99のhMPV F遺伝子における変異および多型: 示したhMPVウイルスのストックは、6継代未満でVero細胞中のF遺伝子に多型を生じた。その変異、およびhMPV Fタンパク質中に結果として生じる予測アミノ酸置換は、各欄の上に示してある。
Figure 2008537482
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トリプシンを用いない増殖では、rhMPV/NL/1/00/101Pに自然発生突然変異が生じるように選択圧が掛かることを証明するために、同じ完全長cDNAクローンを用いたトランスフェクション10個をトリプシンを用いて独立に行い、10個はトリプシンを用いずに行った。ウイルスの再生は、トリプシンを用いる用いないに関わらず等しく効率的であった。しかし、トリプシンを用いずに行った第3継代後、ウイルスストック10個中7個がG3343AまたはC3364Aの変異を有する小集団を生じたのに対し、トリプシンを用いて増殖させたウイルスストック10個中1個しか変異を生じず、それはG3343Aであった。
同様に、rhMPV/NL/1/00/101Sについても、同じ完全長cDNAクローンを用いたトランスフェクション10個をトリプシンを用いて独立に行い、トリプシンを用いずに10回を行なった。トリプシン非存在下ではウイルスは再生されなかった。トリプシンを用いて再生させ、増幅させた10個の独立にレスキューしたrhMPV/NL/1/00/101Sのストック由来のRT-PCR断片の配列決定からは、10連続継代の後でもF遺伝子中に変異が全く見られなかった。
これらのデータは、rhMPV/NL/1/00/101PのG3343AまたはC3364A変異体がトリプシン非存在下で急速に生じ、トリプシン非存在下での融合タンパク質のより効率的な切断を促進したことを示している。トリプシン存在下では、hMPV F切断の機能が外来性プロテアーゼにより担われており、それが切断促進性突然変異の選択を防いでいる。
wt hMPV/NL/1/00およびwt hMPV/NL/1/99の融合遺伝子におけるヌクレオチド多型を調査した。wt hMPV/NL/1/00ウイルスストックは、三次サル腎細胞中での3回の継代に由来するものであり、それをVero細胞中で更に3代継代した(「P6」)。このP6ウイルスストックの全ゲノムは、以前に配列分析に掛けられており、101位にプロリン(図4Eの下線のコドン)を有することが示されていた。そのクロマトグラムを詳細に調べると、F遺伝子中のヌクレオチド3343番および3364番における多型が明らかとなった(図4Eの枠囲みおよび丸囲みコドン)。wt hMPV/NL/1/00のP6ストック由来のヌクレオチド3200〜3500位に及ぶRT-PCR断片を用いて、クローン分析を行なった。分析した20クローンのうち、9つはC3364A変異(Q100K)を有し、4つはG3343A変異(E93K)を有していた。これら2つの変異は、rhMPV/NL/1/00に見出された優性突然変異と同一であった。残りのクローンのうち、3つはA3344T、1つはA3348C、1つはT3357Aを有し、それらは各々E93V、Q94H、N97Kをコードしていた(表20)。これらの突然変異のうち2つ以上を含有するクローンはなかった。wt hMPV/NL/1/00のプラークを単離しようとしたが、hMPV感染の細胞変性作用が低いため成功しなかった。こうした結果から、P6まで増殖させたwt hMPV/NL/1/00は、2つのプレドミナントな亜種を含んだ混合集団であったことが示される。したがって、生体由来、組換え双方のhMPVが、組織培養での増殖を促進する、hMPV F遺伝子における突然変異を容易に獲得した。
E93KおよびQ100KのhMPV Fの切断に対する効果: E93KおよびQ100KのhMPV F切断効率に対する効果を決定するために、トリプシン用いてまたは用いずに、Vero細胞に野生型、組換え体および変異体のhMPV/NL/1/00ウイルスを接種した。感染から6日後に、細胞および上清を収集し、ウェスタンブロットによる分析でhMPV Fタンパク質の相対的切断を可視化した(図5A)。トリプシンを用いない場合、101Pを有するFタンパク質の切断は、E93KまたはQ100Kのアミノ酸置換を有する変異ウイルスでは、101P置換だけを有する融合タンパク質と比較して顕著に効率が高かった(図5Aのレーン3、4および5をレーン2と比較されたい)。トリプシンの存在下では、野生型および変異体hMPVタンパク質の相対的切断は同程度であった(図5Aのレーン6〜10)。トリプシンが、切断促進性のE93KまたはQ100Kアミノ酸置換を含んだhMPV Fの切断効率を更に増加させることはなかった。
E93K単独では、hMPV Fのトリプシン非依存的切断をもたらすには不十分である: E93Kは、組換えhMPV/NL/1/00/101Pにおいて最も頻繁に認められる変異であり、E93Kを含んだ変異体Fタンパク質は切断活性の増大を示した。
hMPV/NL/1/00/101SおよびhMPV/NL/1/00/101Pの完全長cDNAの各々に、ヌクレオチド変化G3343Aを導入した。逆遺伝学的方法を用いて組換えウイルスrhMPV/93K/101PおよびrhMPV/93K/101Sを再生させ、それらの遺伝子型が、Vero細胞中で10継代までの間安定であることを示した。ウェスタンブロットによる分析から、トリプシン非存在下では、101Pを有するウイルスのFタンパク質は部分的に切断されたが、101Sを有するFタンパク質は切断されなかった(図5B)。E93Kが存在すると、hMPV F/101Pの切断効率は大いに増加した(図5Bのレーン11および12)。しかし、E93KによりhMPV F/101Sの切断は増加しなかった(図5Bのレーン13および14)。したがって、E93K置換により、プロリンが101位に存在する場合だけhMPV Fの切断効率が増加したことから、hMPV Fタンパク質のプロセシングに対する101Pと93Kとの相乗効果が実証された。
Vero細胞中での増殖速度に対するE93KおよびQ100Kの効果: Fタンパク質のトリプシン非依存的切断の増強が、Vero細胞中でのhMPVの多サイクル増殖に及ぼす効果を決定するために、rhMPV/NL/1/00/101P、vhMPV/93K/101P、rhMPV/93K/101P、vhMPV/100K/101Pまたはwt hMPV/NL/1/00を用いて、トリプシンを用いずに0.1PFU/細胞のMOIで細胞に感染させた。ウイルス力価はトリプシン非存在下で得られた。S101Pを含んだトリプシン非依存性ウイルスのそれぞれの増殖曲線は同等であったことから、E93KまたはQ100Kの獲得で生じたhMPV Fの切断効率が増加しても、ウイルスのピーク力価または増殖速度の増大は起こらないことが示された(図6)。
hMPV Fの切断増強は、hMPVに感染したVero細胞における融合活性の増加と相関している: 他のパラミクソウイルスと同様に、全長hMPV Fタンパク質(F0)の2個の断片F1およびF2への切断によって、細胞間の融合を促進できる融合ペプチドをF1断片のN末端に露出させたことも考えられる(Morrison、2003年; White、1990年)。wt hMPV/NL/1/00に感染したVero細胞の単層を視覚検査した結果、2〜3日後までにその細胞の大部分は融合して多数の大きな合胞体を形成していたことが判明したが、rhMPV/NL/1/00/101Sに感染した細胞では合胞体がもっと少なく、小さかった。
細胞間融合活性の増加がFタンパク質の切断増強と相関することを示すために、Vero細胞の集密単層に、トリプシンを用いてまたは用いないで、野生型、組換え体および変異体のhMPV/NL/1/00ウイルスを接種した。野生型および変異体のウイルスの融合活性は、無作為に選択した10視野中の融合核および非融合核を計数することによって、定量化した。48時間後までに、vhMPV/93K/101P、rhMPV/93K/101P、vhMPV/100K/101Pまたはwt hMPV/NL/1/00に感染したVero細胞単層中に巨大な合胞体が認められた。進行させて80時間後までに、多核合胞体がこれらウイルスに感染した単層の100%を占めた。融合核および非融合核を計数するために、融合が100%未満の場合は細胞を48時間で固定した(図7)。1つの代表的な実験に関しては、トリプシンを用いない場合、vhMPV/93K/101P、rhMPV/93K/101P、vhMPV/100K/101Pまたはwt hMPV/NL/1/00に感染したVero細胞の65〜75%が融合核を示し、トリプシンを用いる場合、該細胞の80%および90%が融合した(図7)。hMPV F切断促進性変異を含有しないrhMPV/NL/1/00/101Pに関しては、合胞体形成が大幅に減少し、融合核の割合(%)は、トリプシンを用いない場合に13%、トリプシンを用いる場合に25%であった。rhMPV/NL/1/00/101Sに関しては、小さな合胞体の形成がトリプシンの存在下でのみ認められ、核の20%が融合していた(図7)。図7に示したデータは、独立に行なった3回の実験の1つを表している。hMPV F切断の増強はhMPVの複製効率を増加させなかったので、hMPV Fの切断効率と合胞体形成を起こした融合活性との間には直接的相関関係がある。
Fタンパク質のRQSR切断モチーフ中にS101P置換を有するサブタイプB1 hMPV/NL/1/99の特性解析: 前記実験で使用されたhMPV/NL/1/00はA1サブタイプである。代表的なB1サブタイプである生体由来wt hMPV/NL/1/99も、そのFタンパク質の予測RQSR切断部位にS101P置換を有することが判明した。hMPV/NL/1/00と比較したhMPV/NL/1/99の増殖は、以前に記載された(Herfst等、2003年)。
rhMPV/NL/1/99/101Sの増殖特性をwt hMPV/NL/1/99と比較した: rhMPV/NL/1/00/101Sと同様、rhMPV/NL/1/99/101SもVero細胞中でのプラーク形成、多サイクル増殖、細胞間伝播およびFタンパク質の切断のために、外部添加トリプシンを必要とした(図8A〜D)。それに対し、wt hMPV/NL/1/99(101Pを有する)はトリプシンなしで効率的に増殖した。トリプシン存在下の場合でさえ、rhMPV/NL/1/99/101Sのピーク力価は、wt hMPV/NL/1/99が示すピーク力価よりおよそ2 log10低かった(図76B)。サブタイプB1 hMPV Fのウェスタンブロットでも、S101P置換によって外部トリプシンを添加せずにより多い切断がもたらされることが示された。hMPV F/101Sは、トリプシンの非存在下で切断を示さなかったが、トリプシンの存在下ではF1断片が容易に検出された。その上、31 kDaマーカーより下方に移動した小バンド(恐らくトリプシン切断産物)も、hMPV Fに対するMabにより認識された(図8D)。wt hMPV/NL/1/99のF遺伝子に由来するRT-PCR断片の配列決定によれば、F中の予測アミノ酸置換Q94KおよびE96Kをそれぞれコードする2種のヌクレオチド多型、C3346AおよびG3352Aが示された。
したがって、サブタイプA1、B1双方の融合タンパク質の切断部位にあるRQSRモチーフ中のS101Pは、プロテアーゼ特異性を変化させ、その結果、トリプシンの非存在下で効率的hMPV増殖をもたらす。
考察
hMPVは増殖にトリプシンを必要とすると報告されてきた(Bastien等、2003年aおよび2003年b; Biacchesi等、2003年; Boivin等、2002年; Hamelin等、2004年; Peret等、2002年および2004年; Skiadolopous等、2004年; van den Hoogen等、2001年および2004年b)。しかし、三次サル細胞中で3代およびVero細胞中で3代継代(「P6」株)したhMPV/NL/1/00(サブタイプA1)およびhMPV/NL/1/99(サブタイプB1)は、トリプシンの有無に関わらず同等の増殖速度およびピーク力価を示すことが認められた。異なるパラミクソウイルスのセンダイ(Sendai)ウイルスについては、融合タンパク質前駆体(F0)のプロセシング部位を変更する変異が、ウイルス増殖に対するトリプシン要求性が有意な影響を与えたことが実証されている(IshidaおよびM. Homma、1978年; Kido等、1992年; TashiroおよびM. Homma、1983年: Tashiro, M.等、1988年および1992年)。
hMPV/NL/1/00およびhMPV/NL/1/99のトリプシン非依存性増殖に対する遺伝的根拠を示すために、アミノ酸変化を同定するための配列決定をhMPV融合遺伝子に対して行なった(van den Hoogen、2001年、2002年)。推定F1/F2切断部位にあるRQSRモチーフ近傍の数個のヌクレオチドおよび該モチーフ中の1個のヌクレオチドが、ヌクレオチド多型を示すことが判明した。こうしたヌクレオチド変化の1つは、RQSRモチーフ中の101位にてSからPへの置換をコードしていた。他のパラミクソウイルス融合タンパク質からの類推から、RQS/PRモチーフでの切断のために、F1断片のN末端に位置し、宿主細胞膜との融合、合胞体形成および効率的ウイルス増幅に必要な融合ドメインを、露出させたものと思われた(Morrison, T. 2003年; ScheidおよびChoppin、1974年および1977年)。
Vero細胞中でのトリプシン非依存性増殖におけるS101P置換の役割を調査するために、RQSRモチーフ中の101位にセリンまたはプロリンを含む組換えhMPV/NL/1/00を作製した。101Sを有する融合タンパク質を発現するhMPVは、rhMPV/NL/1/00/101Pとは著しく対照的に、トリプシン添加なしでは多サイクル増殖を開始できないことが判明した。rhMPV/NL/1/00/101Pは、外来トリプシンの有無に関わらず同等の増殖速度および平均ピーク力価を示し、このことは、トリプシン存在下および非存在下での同等のhMPV F/101P切断効率と相関していた。対照的に、rhMPV/NL/1/00/F101Sは、外来トリプシンの添加によりhMPV F/101Sが切断されたときにしか、多サイクル増殖を開始することができなかった。したがって、RQSRモチーフにおけるS101P置換は、トリプシン非依存性増殖表現型の主要な決定因子であり、hMPV F1/F2切断の促進において主要な役割を果たす。
hMPV F/101Pを発現するhMPVは、F1断片ではなく、推定F2断片中の他のアミノ酸位置で急速に突然変異を獲得した。これら変異の大部分はRQPRモチーフに隣接しているが、Q100K変異は該モチーフ中に位置している。RQPRモチーフ外で起こったF2変異のうち、E93Kは最も高頻度に確認され、hMPV F/93K/101Pを発現するように操作されたhMPVは、F0プロセシングおよび細胞融合活性の増強を示した。hMPV F切断を増強する変異が生じる迅速性は、該変異がVero細胞培養において増殖上の利点をもたらすことを示した。0.1のMOIでなされた多サイクル増殖の比較曲線からこの増殖上の利点がたとえ明らかでなかったとしても、hMPV Fの切断効率の増加は、rhMPV/NL/1/00/101Pの増殖をトリプシン存在下でのrhMPV/NL/1/00/101Sと比較したとき、より感染性の高いウイルスの生成を確かにもたらした(図2)。しかし、rhMPV/NL/1/00/101Pの増殖は、hMPV F切断効率の更なる増強がピーク力価を有意には増加させそうにないほど、十分に効率的であり得る(図6)。
この表現型は、サブタイプB1 hMPVであるhMPV/NL/1/99についても認められた。サブタイプA1とB1のFタンパク質は、94%のアミノ酸相同性を有しており、その非相同アミノ酸の大部分は、推定膜貫通ドメインを含むhMPV Fタンパク質のC末端にある(van den Hoogen等、2004年aおよびb)。融合タンパク質の101位でのSからPへの置換は、hMPV/NL/1/99のトリプシン非依存性増殖も生じたが、一方、P6ストックの配列決定からは、主要なF2多型は、サブタイプA1 hMPV Fの場合のアミノ酸93番およびアミノ酸100番とは異なり、アミノ酸94番および96番にあることが判明した。この2つのサブタイプのFタンパク質は、F1/F2切断部位周辺では高度に保存されているので、異なる切断促進性変異が見つかるとは驚くべきことである。理論に拘るわけではないが、hMPV/NL/1/99/F 101Pのより広範な継代をすれば、サブタイプA1 F2断片に見出されるものと同様のアミノ酸置換が得られる可能性がある。しかし、F2変異におけるこの差異は、hMPV F切断を触媒したプロテアーゼの結合における柔軟性、またはhMPV F A1およびB1糖タンパク質のこの領域における高次のコンホメーションの違いを反映している可能性もある。
S101P置換は、ウシ/ヒトキメラPIV3ウイルスベクターから発現させた後のhMPV Fの切断効率も増加させたが、このことは、hMPV融合タンパク質の切断が、他のhMPVタンパク質との相互作用がない状態で起こったことを示している。しかし、PIV3感染細胞由来のhMPV F1断片の量は、hMPV感染細胞で認められる量より相対的に少なかったことから、他のhMPVタンパク質との相互作用がより高い切断活性をもたらしたことが示される。その他の可能性としては、PIV3タンパク質の阻害作用、またはhMPV感染 対 PIV3感染により誘発される細胞状態の差が挙げられる。しかし、これらの観察は、hMPV FのRQSRモチーフにおけるS101P置換が、Vero細胞中での切断活性の重要な決定因子であることの更なる確証になる。
hMPV F/101Sの表面発現から、未切断hMPV F0前駆体は細胞表面に輸送されることが示唆された。Vero細胞中では、RSV融合タンパク質のプロセシングとは対照的に、相当量のhMPV F0前駆体が、トリプシンの存在下でも切断から保護されていた(Gonzalez-Reyes、2001年; Collins、1991年)。このことから、hMPV F前駆体のプロセシングは非効率的であるか、および/またはhMPV F0がin vitroでのhMPVの複製周期において機能的役割を有していることが示唆された。hMPV F/101Sは、外部添加トリプシンに曝された後、細胞外で切断されるようであった。しかし、hMPV F/101Pが細胞外、細胞内のいずれで切断されるかは不明である。切断部位に多重に塩基性残基を含んだ他のパラミクソウイルス融合タンパク質は、フューリンなどの細胞内プロテアーゼにより切断されると考えられている(Bosch、1981年; Kawaoka等、1984年; Klenk、1988年および1994年)。
パラミクソウイルス融合タンパク質については、F0前駆体の切断は感染性および病原性の前提条件である(Kido等、1996年; Klenk、1994年)。インフルエンザ、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、パラインフルエンザウイルス2型(PIV2)、センダイウイルス(SeV)などの一部の呼吸器ウイルスについては、組織特異的プロテアーゼによる認識をフューリンなどの非特異的遍在性プロテアーゼによる認識へ変更したFタンパク質における変化が、毒性の増加を起こしてきた(Bosch等、1981年; Collins等、1993年および2001年; Glickman等、1988年; Kawoaka等、1984年; Klenk等、1988年および1994年; Nagai等、1989年; Seal等、2000年; Toyoda等、1987年; Towatari等、2002年)。
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引用された文献について
当業者には明らかであろうが、本発明の多くの改変および変更が、その趣旨および範囲から逸脱することなくなし得る。本明細書に記載の特定の実施形態は例示のためだけに提示されており、本発明は、添付の特許請求の範囲の表現、ならびに該特許請求の範囲が権利主張できる完全な範囲の等価物だけにより制限されるべきである。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることを意図している。
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更に、2004年4月23日に出願され、2005年1月27日にUS2005/0019891 A1として公開された、"Metapneumovirus Strains And Their Use In Vaccine Formulations And As Vectors For Expression Of Antigenic Sequences And Methods For Propagating Virus"という発明の名称の米国特許出願第10/831,780号の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
表14: 配列表の説明
配列番号1 ヒトメタニューモウイルス分離株00-1 マトリックスタンパク質(M)および融合タンパク質(F)の遺伝子
配列番号2 トリニューモウイルス融合タンパク質遺伝子、部分CDS
配列番号3 トリニューモウイルス分離株1b融合タンパク質mRNA、完全CDS
配列番号4 シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス融合タンパク質(F1およびF2サブユニット)遺伝子、完全CDS
配列番号5 トリニューモウイルスマトリックスタンパク質(M)遺伝子、部分CDSおよびトリニューモウイルス融合糖タンパク質(F)遺伝子、完全CDS
配列番号6 パラミクソウイルスFタンパク質hRSV B
配列番号7 パラミクソウイルスFタンパク質hRSV A2
配列番号8 ヒトメタニューモウイルス01-71 (部分配列)
配列番号9 ヒトメタニューモウイルス分離株00-1 マトリックスタンパク質(M)および融合タンパク質(F)の遺伝子
配列番号10 トリニューモウイルス融合タンパク質遺伝子、部分CDS
配列番号11 トリニューモウイルス分離株1b融合タンパク質mRNA、完全CDS
配列番号12 シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス融合タンパク質(F1およびF2 サブユニット)遺伝子、完全CDS
配列番号13 トリニューモウイルス融合糖タンパク質(F)遺伝子、完全CDS
配列番号14 シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(CVL14/1株)付着タンパク質(G) mRNA、完全CDS
配列番号15 シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(6574株)付着タンパク質(G)、完全CDS
配列番号16 シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(CVL14/1株)付着タンパク質(G) mRNA、完全CDS
配列番号17 シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(6574株)付着タンパク質(G)、完全CDS
配列番号18 分離株NL/1/99 (99-1) HMPV (ヒトメタニューモウイルス)cDNA配列
配列番号19 分離株NL/1/00 (00-1) HMPV cDNA配列
配列番号20 分離株NL/17/00 HMPV cDNA配列
配列番号21 分離株NL/1/94 HMPV cDNA配列
配列番号22 RT-PCRプライマーTR1
配列番号23 RT-PCRプライマーN1
配列番号24 RT-PCRプライマーN2
配列番号25 RT-PCRプライマーM1
配列番号26 RT-PCRプライマーM2
配列番号27 RT-PCRプライマーF1
配列番号28 RT-PCRプライマーN3
配列番号29 RT-PCRプライマーN4
配列番号30 RT-PCRプライマーM3
配列番号31 RT-PCRプライマーM4
配列番号32 RT-PCRプライマーF7
配列番号33 RT-PCRプライマーF8
配列番号34 RT-PCRプライマーL6
配列番号35 RT-PCRプライマーL7
配列番号36 オリゴヌクレオチドプローブM
配列番号37 オリゴヌクレオチドプローブN
配列番号38 オリゴヌクレオチドプローブL
配列番号39 分離株NL/1/00、BI/1/01、FI/4/01、NL/8/01、FI/2/01に対するTaqManプライマーおよびプローブ配列
配列番号40 分離株NL/30/01に対するTaqManプライマーおよびプローブ配列
配列番号41 分離株NL/22/01およびNL/23/01に対するTaqManプライマーおよびプローブ配列
配列番号42 分離株NL/17/01に対するTaqManプライマーおよびプローブ配列
配列番号43 分離株NL/17/00に対するTaqManプライマーおよびプローブ配列
配列番号44 分離株NL/9/01、NL/21/01およびNL/5/01に対するTaqManプライマーおよびプローブ配列
配列番号45 分離株FI/1/01およびFI/10/01に対するTaqManプライマーおよびプローブ配列
配列番号46 プライマーZF1
配列番号47 プライマーZF4
配列番号48 プライマーZF7
配列番号49 プライマーZF10
配列番号50 プライマーZF13
配列番号51 プライマーZF16
配列番号52 プライマーCS1
配列番号53 プライマーCS4
配列番号54 プライマーCS7
配列番号55 プライマーCS10
配列番号56 プライマーCS13
配列番号57 プライマーCS16
配列番号58 HPIV-1増幅用フォワードプライマー
配列番号59 HPIV-1増幅用リバースプライマー
配列番号60 HPIV-2増幅用フォワードプライマー
配列番号61 HPIV-2増幅用リバースプライマー
配列番号62 HPIV-3増幅用フォワードプライマー
配列番号63 HPIV-3増幅用リバースプライマー
配列番号64 HPIV-4増幅用フォワードプライマー
配列番号65 HPIV-4増幅用リバースプライマー
配列番号66 ムンプス(Mumps)増幅用フォワードプライマー
配列番号67 ムンプス増幅用リバースプライマー
配列番号68 NDV増幅用フォワードプライマー
配列番号69 NDV増幅用リバースプライマー
配列番号70 トゥパイア(Tupaia)増幅用フォワードプライマー
配列番号71 トゥパイア増幅用リバースプライマー
配列番号72 マプエラ(Mapuera)増幅用フォワードプライマー
配列番号73 マプエラ増幅用リバースプライマー
配列番号74 ヘンドラ(Hendra)増幅用フォワードプライマー
配列番号75 ヘンドラ増幅用リバースプライマー
配列番号76 ニパ(Nipah)増幅用フォワードプライマー
配列番号77 ニパ増幅用リバースプライマー
配列番号78 HRSV増幅用フォワードプライマー
配列番号79 HRSV増幅用リバースプライマー
配列番号80 麻疹(Measles)増幅用フォワードプライマー
配列番号81 麻疹増幅用リバースプライマー
配列番号82 一般的パラミクソウイルス科ウイルス増幅用フォワードプライマー
配列番号83 一般的パラミクソウイルス科ウイルス増幅用リバースプライマー
配列番号84 分離株NL/1/00 (A1)に対するG遺伝子コード配列
配列番号85 分離株BR/2/01 (A1)に対するG遺伝子コード配列
配列番号86 分離株FL/4/01 (A1)に対するG遺伝子コード配列
配列番号87 分離株FL/3/01 (A1)に対するG遺伝子コード配列
配列番号88 分離株FL/8/01 (A1)に対するG遺伝子コード配列
配列番号89 分離株FL/10/01 (A1)に対するG遺伝子コード配列
配列番号90 分離株NL/10/01 (A1)に対するG遺伝子コード配列
配列番号91 分離株NL/2/02 (A1)に対するG遺伝子コード配列
配列番号92 分離株NL/17/00 (A2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号93 分離株NL/1/81(A2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号94 分離株NL/1/93(A2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号95 分離株NL/2/93(A2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号96 分離株NL/3/93(A2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号97 分離株NL/1/95(A2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号98 分離株NL/2/96(A2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号99 分離株NL/3/96(A2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号100 分離株NL/22/01(A2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号101 分離株NL/24/01(A2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号102 分離株NL/23/01(A2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号103 分離株NL/29/01(A2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号104 分離株NL/3/02(A2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号105 分離株NL/1/99(B1)に対するG遺伝子コード配列
配列番号106 分離株NL/11/00(B1)に対するG遺伝子コード配列
配列番号107 分離株NL/12/00(B1)に対するG遺伝子コード配列
配列番号108 分離株NL/5/01(B1)に対するG遺伝子コード配列
配列番号109 分離株NL/9/01(B1)に対するG遺伝子コード配列
配列番号110 分離株NL/21/01(B1)に対するG遺伝子コード配列
配列番号111 分離株NL/1/94(B2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号112 分離株NL/1/82(B2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号113 分離株NL/1/96(B2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号114 分離株NL/6/97(B2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号115 分離株NL/9/00(B2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号116 分離株NL/3/01(B2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号117 分離株NL/4/01(B2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号118 分離株UK/5/01(B2)に対するG遺伝子コード配列
配列番号119 分離株NL/1/00(A1)に対するGタンパク質配列
配列番号120 分離株BR/2/01(A1)に対するGタンパク質配列
配列番号121 分離株FL/4/01(A1)に対するGタンパク質配列
配列番号122 分離株FL/3/01(A1)に対するGタンパク質配列
配列番号123 分離株FL/8/01(A1)に対するGタンパク質配列
配列番号124 分離株FL/10/01(A1)に対するGタンパク質配列
配列番号125 分離株NL/10/01(A1)に対するGタンパク質配列
配列番号126 分離株NL/2/02(A1)に対するGタンパク質配列
配列番号127 分離株NL/17/00(A2)に対するGタンパク質配列
配列番号128 分離株NL/1/81(A2)に対するGタンパク質配列
配列番号129 分離株NL/1/93(A2)に対するGタンパク質配列
配列番号130 分離株NL/2/93(A2)に対するGタンパク質配列
配列番号131 分離株NL/3/93(A2)に対するGタンパク質配列
配列番号132 分離株NL/1/95(A2)に対するGタンパク質配列
配列番号133 分離株NL/2/96(A2)に対するGタンパク質配列
配列番号134 分離株NL/3/96(A2)に対するGタンパク質配列
配列番号135 分離株NL/22/01(A2)に対するGタンパク質配列
配列番号136 分離株NL/24/01(A2)に対するGタンパク質配列
配列番号137 分離株NL/23/01(A2)に対するGタンパク質配列
配列番号138 分離株NL/29/01(A2)に対するGタンパク質配列
配列番号139 分離株NL/3/02(A2)に対するGタンパク質配列
配列番号140 分離株NL/1/99(B1)に対するGタンパク質配列
配列番号141 分離株NL/11/00(B1)に対するGタンパク質配列
配列番号142 分離株NL/12/00(B1)に対するGタンパク質配列
配列番号143 分離株NL/5/01(B1)に対するGタンパク質配列
配列番号144 分離株NL/9/01(B1)に対するGタンパク質配列
配列番号145 分離株NL/21/01(B1)に対するGタンパク質配列
配列番号146 分離株NL/1/94(B2)に対するGタンパク質配列
配列番号147 分離株NL/1/82(B2)に対するGタンパク質配列
配列番号148 分離株NL/1/96(B2)に対するGタンパク質配列
配列番号149 分離株NL/6/97(B2)に対するGタンパク質配列
配列番号150 分離株NL/9/00(B2)に対するGタンパク質配列
配列番号151 分離株NL/3/01(B2)に対するGタンパク質配列
配列番号152 分離株NL/4/01(B2)に対するGタンパク質配列
配列番号153 分離株NL/5/01(B2)に対するGタンパク質配列
配列番号154 分離株NL/1/00に対するF遺伝子コード配列
配列番号155 分離株UK/1/00に対するF遺伝子コード配列
配列番号156 分離株NL/2/00に対するF遺伝子コード配列
配列番号157 分離株NL/13/00に対するF遺伝子コード配列
配列番号158 分離株NL/14/00に対するF遺伝子コード配列
配列番号159 分離株FL/3/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号160 分離株FL/4/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号161 分離株FL/8/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号162 分離株UK/1/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号163 分離株UK/7/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号164 分離株FL/10/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号165 分離株NL/6/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号166 分離株NL/8/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号167 分離株NL/10/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号168 分離株NL/14/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号169 分離株NL/20/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号170 分離株NL/25/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号171 分離株NL/26/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号172 分離株NL/28/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号173 分離株NL/30/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号174 分離株BR/2/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号175 分離株BR/3/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号176 分離株NL/2/02に対するF遺伝子コード配列
配列番号177 分離株NL/4/02に対するF遺伝子コード配列
配列番号178 分離株NL/5/02に対するF遺伝子コード配列
配列番号179 分離株NL/6/02に対するF遺伝子コード配列
配列番号180 分離株NL/7/02に対するF遺伝子コード配列
配列番号181 分離株NL/9/02に対するF遺伝子コード配列
配列番号182 分離株FL/1/02に対するF遺伝子コード配列
配列番号183 分離株NL/1/81に対するF遺伝子コード配列
配列番号184 分離株NL/1/93に対するF遺伝子コード配列
配列番号185 分離株NL/2/93に対するF遺伝子コード配列
配列番号186 分離株NL/4/93に対するF遺伝子コード配列
配列番号187 分離株NL/1/95に対するF遺伝子コード配列
配列番号188 分離株NL/2/96に対するF遺伝子コード配列
配列番号189 分離株NL/3/96に対するF遺伝子コード配列
配列番号190 分離株NL/1/98に対するF遺伝子コード配列
配列番号191 分離株NL/17/00に対するF遺伝子コード配列
配列番号192 分離株NL/22/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号193 分離株NL/29/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号194 分離株NL/23/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号195 分離株NL/17/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号196 分離株NL/24/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号197 分離株NL/3/02に対するF遺伝子コード配列
配列番号198 分離株NL/3/98に対するF遺伝子コード配列
配列番号199 分離株NL/1/99に対するF遺伝子コード配列
配列番号200 分離株NL/2/99に対するF遺伝子コード配列
配列番号201 分離株NL/3/99に対するF遺伝子コード配列
配列番号202 分離株NL/11/00に対するF遺伝子コード配列
配列番号203 分離株NL/12/00に対するF遺伝子コード配列
配列番号204 分離株NL/1/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号205 分離株NL/5/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号206 分離株NL/9/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号207 分離株NL/19/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号208 分離株NL/21/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号209 分離株UK/11/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号210 分離株FL/1/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号211 分離株FL/2/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号212 分離株FL/5/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号213 分離株FL/7/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号214 分離株FL/9/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号215 分離株UK/10/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号216 分離株NL/1/02に対するF遺伝子コード配列
配列番号217 分離株NL/1/94に対するF遺伝子コード配列
配列番号218 分離株NL/1/96に対するF遺伝子コード配列
配列番号219 分離株NL/6/97に対するF遺伝子コード配列
配列番号220 分離株NL/7/00に対するF遺伝子コード配列
配列番号221 分離株NL/9/00に対するF遺伝子コード配列
配列番号222 分離株NL/19/00に対するF遺伝子コード配列
配列番号223 分離株NL/28/00に対するF遺伝子コード配列
配列番号224 分離株NL/3/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号225 分離株NL/4/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号226 分離株NL/11/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号227 分離株NL/15/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号228 分離株NL/18/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号229 分離株FL/6/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号230 分離株UK/5/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号231 分離株UK/8/01に対するF遺伝子コード配列
配列番号232 分離株NL/12/02に対するF遺伝子コード配列
配列番号233 分離株HK/1/02に対するF遺伝子コード配列
配列番号234 分離株NL/1/00に対するFタンパク質配列
配列番号235 分離株UK/1/00に対するFタンパク質配列
配列番号236 分離株NL/2/00に対するFタンパク質配列
配列番号237 分離株NL/13/00に対するFタンパク質配列
配列番号238 分離株NL/14/00に対するFタンパク質配列
配列番号239 分離株FL/3/01に対するFタンパク質配列
配列番号240 分離株FL/4/01に対するFタンパク質配列
配列番号241 分離株FL/8/01に対するFタンパク質配列
配列番号242 分離株UK/1/01に対するFタンパク質配列
配列番号243 分離株UK/7/01に対するFタンパク質配列
配列番号244 分離株FL/10/01に対するFタンパク質配列
配列番号245 分離株NL/6/01に対するFタンパク質配列
配列番号246 分離株NL/8/01に対するFタンパク質配列
配列番号247 分離株NL/10/01に対するFタンパク質配列
配列番号248 分離株NL/14/01に対するFタンパク質配列
配列番号249 分離株NL/20/01に対するFタンパク質配列
配列番号250 分離株NL/25/01に対するFタンパク質配列
配列番号251 分離株NL/26/01に対するFタンパク質配列
配列番号252 分離株NL/28/01に対するFタンパク質配列
配列番号253 分離株NL/30/01に対するFタンパク質配列
配列番号254 分離株BR/2/01に対するFタンパク質配列
配列番号255 分離株BR/3/01に対するFタンパク質配列
配列番号256 分離株NL/2/02に対するFタンパク質配列
配列番号257 分離株NL/4/02に対するFタンパク質配列
配列番号258 分離株NL/5/02に対するFタンパク質配列
配列番号259 分離株NL/6/02に対するFタンパク質配列
配列番号260 分離株NL/7/02に対するFタンパク質配列
配列番号261 分離株NL/9/02に対するFタンパク質配列
配列番号262 分離株FL/1/02に対するFタンパク質配列
配列番号263 分離株NL/1/81に対するFタンパク質配列
配列番号264 分離株NL/1/93に対するFタンパク質配列
配列番号265 分離株NL/2/93に対するFタンパク質配列
配列番号266 分離株NL/4/93に対するFタンパク質配列
配列番号267 分離株NL/1/95に対するFタンパク質配列
配列番号268 分離株NL/2/96に対するFタンパク質配列
配列番号269 分離株NL/3/96に対するFタンパク質配列
配列番号270 分離株NL/1/98に対するFタンパク質配列
配列番号271 分離株NL/17/00に対するFタンパク質配列
配列番号272 分離株NL/22/01に対するFタンパク質配列
配列番号273 分離株NL/29/01に対するFタンパク質配列
配列番号274 分離株NL/23/01に対するFタンパク質配列
配列番号275 分離株NL/17/01に対するFタンパク質配列
配列番号276 分離株NL/24/01に対するFタンパク質配列
配列番号277 分離株NL/3/02に対するFタンパク質配列
配列番号278 分離株NL/3/98に対するFタンパク質配列
配列番号279 分離株NL/1/99に対するFタンパク質配列
配列番号280 分離株NL/2/99に対するFタンパク質配列
配列番号281 分離株NL/3/99に対するFタンパク質配列
配列番号282 分離株NL/11/00に対するFタンパク質配列
配列番号283 分離株NL/12/00に対するFタンパク質配列
配列番号284 分離株NL/1/01に対するFタンパク質配列
配列番号285 分離株NL/5/01に対するFタンパク質配列
配列番号286 分離株NL/9/01に対するFタンパク質配列
配列番号287 分離株NL/19/01に対するFタンパク質配列
配列番号288 分離株NL/21/01に対するFタンパク質配列
配列番号289 分離株UK/11/01に対するFタンパク質配列
配列番号290 分離株FL/1/01に対するFタンパク質配列
配列番号291 分離株FL/2/01に対するFタンパク質配列
配列番号292 分離株FL/5/01に対するFタンパク質配列
配列番号293 分離株FL/7/01に対するFタンパク質配列
配列番号294 分離株FL/9/01に対するFタンパク質配列
配列番号295 分離株UK/10/01に対するFタンパク質配列
配列番号296 分離株NL/1/02に対するFタンパク質配列
配列番号297 分離株NL/1/94に対するFタンパク質配列
配列番号298 分離株NL/1/96に対するFタンパク質配列
配列番号299 分離株NL/6/97に対するFタンパク質配列
配列番号300 分離株NL/7/00に対するFタンパク質配列
配列番号301 分離株NL/9/00に対するFタンパク質配列
配列番号302 分離株NL/19/00に対するFタンパク質配列
配列番号303 分離株NL/28/00に対するFタンパク質配列
配列番号304 分離株NL/3/01に対するFタンパク質配列
配列番号305 分離株NL/4/01に対するFタンパク質配列
配列番号306 分離株NL/11/01に対するFタンパク質配列
配列番号307 分離株NL/15/01に対するFタンパク質配列
配列番号308 分離株NL/18/01に対するFタンパク質配列
配列番号309 分離株FL/6/01に対するFタンパク質配列
配列番号310 分離株UK/5/01に対するFタンパク質配列
配列番号311 分離株UK/8/01に対するFタンパク質配列
配列番号312 分離株NL/12/02に対するFタンパク質配列
配列番号313 分離株HK/1/02に対するFタンパク質配列
配列番号314 HMPV分離株NL/1/00に対するFタンパク質配列
配列番号315 HMPV分離株NL/17/00に対するFタンパク質配列
配列番号316 HMPV分離株NL/1/99に対するFタンパク質配列
配列番号317 HMPV分離株NL/1/94に対するFタンパク質配列
配列番号318 HMPV分離株NL/1/00に対するF遺伝子配列
配列番号319 HMPV分離株NL/17/00に対するF遺伝子配列
配列番号320 HMPV分離株NL/1/99に対するF遺伝子配列
配列番号321 HMPV分離株NL/1/94に対するF遺伝子配列
配列番号322 HMPV分離株NL/1/00に対するGタンパク質配列
配列番号323 HMPV分離株NL/17/00に対するGタンパク質配列
配列番号324 HMPV分離株NL/1/99に対するGタンパク質配列
配列番号325 HMPV分離株NL/1/94に対するGタンパク質配列
配列番号326 HMPV分離株NL/1/00に対するG遺伝子配列
配列番号327 HMPV分離株NL/17/00に対するG遺伝子配列
配列番号328 HMPV分離株NL/1/99に対するG遺伝子配列
配列番号329 HMPV分離株NL/1/94に対するG遺伝子配列
配列番号330 HMPV分離株NL/1/00に対するLタンパク質配列
配列番号331 HMPV分離株NL/17/00に対するLタンパク質配列
配列番号332 HMPV分離株NL/1/99に対するLタンパク質配列
配列番号333 HMPV分離株NL/1/94に対するLタンパク質配列
配列番号334 HMPV分離株NL/1/00に対するL遺伝子配列
配列番号335 HMPV分離株NL/17/00に対するL遺伝子配列
配列番号336 HMPV分離株NL/1/99に対するL遺伝子配列
配列番号337 HMPV分離株NL/1/94に対するL遺伝子配列
配列番号338 HMPV分離株NL/1/00に対するM2-1タンパク質配列
配列番号339 HMPV分離株NL/17/00に対するM2-1タンパク質配列
配列番号340 HMPV分離株NL/1/99に対するM2-1タンパク質配列
配列番号341 HMPV分離株NL/1/94に対するM2-1タンパク質配列
配列番号342 HMPV分離株NL/1/00に対するM2-1遺伝子配列
配列番号343 HMPV分離株NL/17/00に対するM2-1遺伝子配列
配列番号344 HMPV分離株NL/1/99に対するM2-1遺伝子配列
配列番号345 HMPV分離株NL/1/94に対するM2-1遺伝子配列
配列番号346 HMPV分離株NL/1/00に対するM2-2タンパク質配列
配列番号347 HMPV分離株NL/17/00に対するM2-2タンパク質配列
配列番号348 HMPV分離株NL/1/99に対するM2-2タンパク質配列
配列番号349 HMPV分離株NL/1/94に対するM2-2タンパク質配列
配列番号350 HMPV分離株NL/1/00に対するM2-2遺伝子配列
配列番号351 HMPV分離株NL/17/00に対するM2-2遺伝子配列
配列番号352 HMPV分離株NL/1/99に対するM2-2遺伝子配列
配列番号353 HMPV分離株NL/1/94に対するM2-2遺伝子配列
配列番号354 HMPV分離株NL/1/00に対するM2遺伝子配列
配列番号355 HMPV分離株NL/17/00に対するM2遺伝子配列
配列番号356 HMPV分離株NL/1/99に対するM2遺伝子配列
配列番号357 HMPV分離株NL/1/94に対するM2遺伝子配列
配列番号358 HMPV分離株NL/1/00に対するMタンパク質配列
配列番号359 HMPV分離株NL/17/00に対するMタンパク質配列
配列番号360 HMPV分離株NL/1/99に対するMタンパク質配列
配列番号361 HMPV分離株NL/1/94に対するMタンパク質配列
配列番号362 HMPV分離株NL/1/00に対するM遺伝子配列
配列番号363 HMPV分離株NL/17/00に対するM遺伝子配列
配列番号364 HMPV分離株NL/1/99に対するM遺伝子配列
配列番号365 HMPV分離株NL/1/94に対するM遺伝子配列
配列番号366 HMPV分離株NL/1/00に対するNタンパク質配列
配列番号367 HMPV分離株NL/17/00に対するNタンパク質配列
配列番号368 HMPV分離株NL/1/99に対するNタンパク質配列
配列番号369 HMPV分離株NL/1/94に対するNタンパク質配列
配列番号370 HMPV分離株NL/1/00に対するN遺伝子配列
配列番号371 HMPV分離株NL/17/00に対するN遺伝子配列
配列番号372 HMPV分離株NL/1/99に対するN遺伝子配列
配列番号373 HMPV分離株NL/1/94に対するN遺伝子配列
配列番号374 HMPV分離株NL/1/00に対するPタンパク質配列
配列番号375 HMPV分離株NL/17/00に対するPタンパク質配列
配列番号376 HMPV分離株NL/1/99に対するPタンパク質配列
配列番号377 HMPV分離株NL/1/94に対するPタンパク質配列
配列番号378 HMPV分離株NL/1/00に対するP遺伝子配列
配列番号379 HMPV分離株NL/17/00に対するP遺伝子配列
配列番号380 HMPV分離株NL/1/99に対するP遺伝子配列
配列番号381 HMPV分離株NL/1/94に対するP遺伝子配列
配列番号382 HMPV分離株NL/1/00に対するSHタンパク質配列
配列番号383 HMPV分離株NL/17/00に対するSHタンパク質配列
配列番号384 HMPV分離株NL/1/99に対するSHタンパク質配列
配列番号385 HMPV分離株NL/1/94に対するSHタンパク質配列
配列番号386 HMPV分離株NL/1/00に対するSH遺伝子配列
配列番号387 HMPV分離株NL/17/00に対するSH遺伝子配列
配列番号388 HMPV分離株NL/1/99に対するSH遺伝子配列
配列番号389 HMPV分離株NL/1/94に対するSH遺伝子配列
hMPVのサブタイプ4種の力価およびプラークを示す図である。Vero細胞の準集密単層に、生物学的に誘導した記載のウイルス各々を0.1PFU/細胞のMOIおよび+/-0.2μg/mlのTPCKトリプシンで接種した。細胞および上清を接種6日後に収集し、-70℃で凍結し、プラークアッセイによりVero細胞中の力価を決定した。感染細胞単層は、1%メチルセルロース下で増殖させ、接種6日後にメタノール中で固定し、フェレット抗hMPVポリクローナルAb、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗フェレットAbで免疫染色した。プラークを3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)で可視化し、NikonエクリプスTE2000-U顕微鏡を用いて写真撮影をした。力価はlog10PFU/mlで表わしている。 サブタイプA1を代表するrhMPV/NL/1/00/101PおよびrhMPV/NL/1/00/101Sの増殖特性の比較を示す図である。(A)Vero細胞+/-0.2μg/mlトリプシン中で増殖したrhMPV/NL/1/00/101PおよびrhMPV/NL/1/00/101Sにより生成され、接種6日後にフェレット抗hMPVポリクローナルAb、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗フェレットAbで免疫染色したプラークであり、3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)発色剤(Dako)の添加で発色させた。(B)rhMPV/NL/1/00/101P(白四角)またはrhMPV/NL/1/00/101S(黒三角)に感染したVero細胞の6日間増殖曲線。左側のグラフでは、ウイルス増殖中およびVero細胞内でのプラークアッセイ中に0.2μg/mlトリプシンを添加した。中央のグラフでは、トリプシンを用いなかった。右側のグラフでは、ウイルス増殖中にはトリプシンを用いなかったが、プラークアッセイ操作中に0.2μg/mlトリプシンを添加した。力価は、材料および方法において記載したようなプラークアッセイで決定した。(C)Vero細胞単層にrhMPV/NL/1/00/101PまたはrhMPV/NL/1/00/101S+/-0.2μg/mlトリプシンを接種した。感染細胞単層を3%パラホルムアルデヒド中で固定し、hMPV Fに対するハムスターMab 121-1017-133、次いでFITC結合抗ハムスターAbで免疫染色することにより、hMPV Fの表面発現をNikon TE2000-U顕微鏡で可視化した。(D)材料および方法において記載したような、rhMPV/NL/1/00/101PまたはrhMPV/NL/1/00/101S、+/-0.2μg/mlトリプシンを感染したVero細胞単層のウェスタンブロット。ウイルス試料を12%SDS-PAGEゲル上で分離し、PVDF膜に転写し、hMPV Fに対するハムスターMab 121-1017-133、次いでHRP結合抗ハムスターAbで免疫染色し、電気化学発光溶液で処理し、フィルムに露光した。左側の数値は、キロダルトン単位のマーカー分子量である。右側の矢印は、全長hMPV F(F0)および切断断片hMPV F1の推定サイズに相当する2個のバンドの位置を示す。 ウェスタンブロットで検出した場合のb/h PIV3中にベクター組込みしたhMPV Fの発現を示す図である。本文中に記載したように、Vero細胞の準集密単層にwt hMPV/NL/1/00、b/h PIV3/hMPV F/101Pまたはb/h PIV3/hMPV F/101S、+/-トリプシンを接種した。hMPV Fに対するMab 121-1017-133を用いたウェスタンブロット分析を材料および方法において記載したように行なった。左側の数値は、キロダルトン単位のマーカー分子量である。右側の矢印は、全長hMPV F(F0)および切断断片hMPV F1の推定サイズに相当する2個のバンドの位置を示す。 組換え体、変異体および野生型のhMPVウイルスに由来するヌクレオチド配列のクロマトグラムを示す図である。RT-PCRを材料および方法において記載したように行なった。示した各クロマトグラムは3348番から3373番のヌクレオチドに及んでいる。F糖タンパク質の推定アミノ酸93番(長方形)、100番(卵形)および101番(下線)に対応するコドンが示されている。アスタリスクは変異または多型を示す。 ウェスタンブロットで検出した場合のhMPV Fタンパク質の相対的切断効率を示す図である。Vero細胞に、記載したhMPVウイルスを+/-0.2μg/mlトリプシンと0.1PFU/細胞のMOIで接種した。当該ウイルスは、rhMPV/NL/1/00/101S (1、6、13および18番レーン)、rhMPV/NL/1/00/101P (2および7番、11および16番レーン)、vhMPV/93K/101P (3および8番レーン)、vhMPV/100K/101P (4および9番レーン)、wt hMPV/NL/1/00 (5、10、15および20番レーン)、rhMPV/93K/101P (12および17番レーン)、またはrhMPV/93K/101S (14および19番レーン)であった。wt hMPV/NL/1/00は、本文に記載のように、E93Kを有するhMPVとQ100Kを有するhMPVとの混合物であることに注意されたい。接種6日後に細胞および上清を収集し、-70℃で凍結し、解凍し、12%SDS-PAGEゲル上で分離した。タンパク質をPVDF膜に転写し、hMPV Fに対するMab 122-1017-133でプロービングした。左側の数値は、キロダルトン単位のマーカー分子量である。右側の矢印は、全長hMPV F(F0)および切断断片hMPV F1の推定サイズに相当する2個のバンドを示す。各ウイルスの93、100および101位のhMPV Fアミノ酸は、ブロット上の各レーンに対して示されている。トリプシンの有無はブロット下に示されている。 Fタンパク質中に101Pを含む、組換え体、変異体および野生型のhMPVウイルスの多サイクル増殖曲線を示す図である。Vero細胞の準集密単層にトリプシンなしで0.1 PFU/細胞のMOIで接種した。細胞および上清は、24時間間隔で6日間にわたり収集した。収集ウイルスの力価はプラークアッセイで決定した。 hMPVウイルスに感染したVero細胞単層の相対的融合効率を示す図である。Vero細胞の集密単層に、記載のhMPVウイルスを3 PFU/細胞のMOI +/-0.2μg/ml TPCKトリプシンで接種し、1%メチルセルロースを含んだ培地で増殖させた。単層は48時間時点でメタノール中で固定した。その核をHeochst染色液とのインキュベーションにより可視化し、NikonエクリプスTE2000-U蛍光顕微鏡のDAPIレンズで画像化した。示した写真は、独立の3つの実験中の1つから得た1視野を表している。融合細胞の凝集核および非融合細胞の単一核を10個の視野で計数し、融合細胞の割合(%)をグラフにした。示したデータは3つの実験中の1つから得たものである。 サブタイプB1を代表するwt hMPV/1/99/101PおよびrhMPV/1/99/101Sの増殖特性の比較を示す図である。(A)接種後6日に免疫染色した、Vero細胞中、各+/-0.2μg/mlトリプシン、wt hMPV/NL/1/99/101PまたはrhMPV/NL/99/101Sにより生成されたプラーク。(B)wt hMPV/NL/1/99/101P(白四角)またはrhMPV/NL/1/99/101S(黒三角)に感染したVero細胞の6日間増殖曲線。左側のグラフでは、ウイルス増殖中およびプラーク形成中に0.2μg/mlトリプシンを添加した。中央のグラフでは、トリプシンを用いなかった。右側のグラフでは、ウイルス増殖中にはトリプシンを用いなかったが、プラーク形成操作中に0.2μg/mlトリプシンを添加した。力価は、材料および方法において記載したようなプラークアッセイで決定した。(C)Vero細胞単層にwt hMPV/NL/1/99/101PおよびrhMPV/NL/1/99/101S +/-0.2μg/mlトリプシンを接種した。感染細胞単層を3%パラホルムアルデヒド中で固定し、hMPV Fに対するハムスターMab 121-1017-133で、次いでFITC結合抗ハムスターAbで免疫染色することにより、hMPV Fの表面発現をNikon TE2000-U顕微鏡で可視化した。(D)材料および方法において記載したような、wt hMPV/NL/1/99/101PおよびrhMPV/NL/1/99/101S +/-0.2μg/mlトリプシンで感染したVero細胞単層のウェスタンブロット。ウイルス試料を12%SDS-PAGEゲル上で分離し、PVDF膜に転写し、hMPV Fに対するハムスターMab 121-1017-133で、次いでHRP結合抗ハムスターAbで免疫染色し、さらに電気化学発光溶液で処理し、フィルムに露光した。左側の数値は、キロダルトン単位のマーカー分子量である。右側の矢印は、全長hMPV F(F0)および切断断片hMPV F1の推定サイズに相当する2個のバンドの位置を示す。 hMPVゲノム解析として、hMPVゲノム構造と比較してhMPVゲノム配列のPCR断片を示す図である。変異の位置は、PCR断片を示す垂直棒の下方に示してある。 hMPV分離株00-1(A1)およびhMPV分離株99-1(B1)の制限酵素地図を示す図である。各分離株中の制限酵素部位は、hMPVのゲノム構造を示す図の下方に示してある。その図の上部の目盛は、kb単位でhMPVゲノム中の位置を示す。

Claims (26)

  1. 哺乳動物メタニューモウイルスを、培地1ミリリットル当たり20ミリ単位未満のトリプシン比活性を有する培地中で培養することを含む、哺乳動物メタニューモウイルスを増殖させる方法。
  2. 哺乳動物メタニューモウイルスがヒトメタニューモウイルスである、請求項1に記載の方法。
  3. 培地にトリプシンを外部から添加しない、請求項1または2に記載の方法。
  4. 培地に血清を添加しない、請求項1または2に記載の方法。
  5. 哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質の切断部位にあるRQSR切断モチーフが、少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1または2に記載の方法。
  6. 哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質が、配列番号314と比較して少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を含む、請求項5に記載の方法。
  7. RQSR切断モチーフ中のアミノ酸置換が、RQPR配列を生じるセリンからプロリンへの置換である、請求項5に記載の方法。
  8. Fタンパク質における追加のアミノ酸置換が、以下のE93K、Q100K、E92K、E93V、I95S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K、またはN97Hの少なくとも1つである、請求項6に記載の方法。
  9. Fタンパク質における追加のアミノ酸置換がE93Kである、請求項8に記載の方法。
  10. 追加のアミノ酸置換が、RQSRモチーフ中のアミノ酸置換を安定化させる、請求項6に記載の方法。
  11. トリプシンの非存在下で増殖することができる、分離した哺乳動物メタニューモウイルス。
  12. 哺乳動物メタニューモウイルスがヒトメタニューモウイルスである、請求項11に記載のウイルス。
  13. 哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質の切断部位にあるRQSR切断モチーフが、少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項11または12に記載のウイルス。
  14. 哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質が、配列番号314と比べて少なくとも1つの追加のアミノ酸置換を含む、請求項13に記載のウイルス。
  15. RQSR切断モチーフ中のアミノ酸置換が、RQPR配列を生じるセリンからプロリンへの置換である、請求項13に記載のウイルス。
  16. Fタンパク質における追加のアミノ酸置換が、以下のE93K、Q100K、E92K、E93V、I95S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K、またはN97Hの少なくとも1つである、請求項14に記載のウイルス。
  17. 追加のアミノ酸置換が、RQSRモチーフ中のアミノ酸置換を安定化させる、請求項14に記載のウイルス。
  18. Fタンパク質における追加のアミノ酸置換がE93Kである、請求項16に記載のウイルス。
  19. 哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質をコードする単離された核酸であって、前記Fタンパク質が、S101Pアミノ酸置換と、以下のE93K、Q100K、E92K、E93V、I95S、E96K、Q94K、Q94H、I95S、N97K、またはN97Hの少なくとも1つとを含む核酸。
  20. 哺乳動物メタニューモウイルスがヒトメタニューモウイルスである、請求項19に記載の核酸。
  21. トリプシン非存在下で哺乳動物メタニューモウイルスの安定増殖を支持する、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質を同定する方法であって、
    (a)Fタンパク質の切断部位にRQPRモチーフを含む哺乳動物メタニューモウイルスを、トリプシン非存在下で少なくとも2継代の間増殖させるステップと、
    (b)合胞体形成を測定するステップと
    を含み、ステップ(a)前の哺乳動物メタニューモウイルスによる合胞体形成に比した合胞体形成の増加は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質が、トリプシン非存在下で哺乳動物メタニューモウイルスの安定増殖を支持する追加のアミノ酸置換を獲得したことを示す方法。
  22. トリプシン非存在下で哺乳動物メタニューモウイルスの安定増殖を支持する、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質を同定する方法であって、
    (a)Fタンパク質の切断部位にRQPRモチーフを含む哺乳動物メタニューモウイルスを、トリプシン非存在下で少なくとも2継代の間増殖させるステップと、
    (b)Fタンパク質の切断を測定するステップと
    を含み、ステップ(a)前の哺乳動物メタニューモウイルスによるFタンパク質の切断に比したFタンパク質切断の増加は、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質が、トリプシン非存在下で哺乳動物メタニューモウイルスの安定増殖を支持する追加のアミノ酸置換を獲得したことを示す、方法。
  23. 切断部位にRQPRモチーフを含むFタンパク質のトリプシン非依存的切断を促進する、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質変異体を同定する方法であって、
    (a)哺乳動物メタニューモウイルスをトリプシン非存在下で少なくとも2継代の間増殖させるステップと、
    (b)Fタンパク質の切断効率を決定するステップと
    を含み、Fタンパク質の増加した切断効率は、Fタンパク質が、Fタンパク質のトリプシン非依存的切断を促進する変異を獲得したことを示す、方法。
  24. 切断部位にRQPRモチーフを含む、哺乳動物メタニューモウイルスのFタンパク質の切断を触媒するプロテアーゼを同定する方法であって、
    (a)Fタンパク質を試験プロテアーゼと接触させるステップと、
    (b)Fタンパク質の切断が起こったか否かを決定するステップと
    を含み、Fタンパク質の切断が起きたことは、プロテアーゼがFタンパク質の切断を触媒することを示す、方法。
  25. 哺乳動物メタニューモウイルスがヒトメタニューモウイルスである、請求項21、22、23または24に記載の方法。
  26. 哺乳動物メタニューモウイルスがS101P変異を保持している、請求項21、22、23または24に記載の方法。
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