KR20070110924A - 메타뉴모바이러스주 및 항원성 서열의 발현용 벡터 및 백신제제로서의 이의 용도 및 바이러스의 증식 방법 - Google Patents

메타뉴모바이러스주 및 항원성 서열의 발현용 벡터 및 백신제제로서의 이의 용도 및 바이러스의 증식 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 파라믹소비리데 패밀리의 뉴모바이러스 서브패밀리에 속하는, 포유류의 음성 가닥 RNA 바이러스인 메타뉴모바이러스(MPV)의 개량 균주에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 트립신 부재하에서 포유류 MPV의 증식 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법 및 조성물은 예컨대, MPV 감염에 대한 백신 제조에 사용할 수 있다.
메타뉴모바이러스, 조류, 백신, 항원성

Description

메타뉴모바이러스주 및 항원성 서열의 발현용 벡터 및 백신 제제로서의 이의 용도 및 바이러스의 증식 방법{METAPNEUMOVIRUS STRAINS AND THEIR USE IN VACCINE FORMULATIONS AND AS VECTORS FOR EXPRESSION OF ANTIGENIC SEQUENCES AND METHODS FOR PROPAGATING VIRUS}
-관련 출원-
본 출원은 2005년 3월 10일 가출원된 미국 가출원 제60/660,735호를 우선권으로 주장하며, 이의 전체 개시 내용을 전체로서 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다.
1. 개요
본 발명은 파라믹소비리데 패밀리의 뉴모바이러스 서브 패밀리에 속하는, 포유류의 음성 가닥 RNA 바이러스의 개량 균주에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 트립시 부재하에서 포유류 MPV를 증식시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법 및 조성물은 MPV 감염에 대한 백신을 제조하기 위해 사용할 수 있다.
2. 본 발명의 배경기술
인간 메타뉴모바이러스 (hMPV)는 최근 동정된 호흡기 바이러스인데, 미확인성 병인의 급성 호흡기성 질환을 경험한 네덜란드의 어린이 환자에게서 처음 분리 되었다. hMPV는 세기관지염 및 폐렴 등과 같은 경증 상기도 호흡기 증후군에서 중증 하기도 호흡기 질환 등에 걸친 범위의 호흡기 질환을 야기한다 (Boivin et al, 2002; van den Hoogen et al, 2001, 2003;). 표본 환자 집단에 따르면, 유아의 호흡기 감염의 5 내지 15%가 hMPV 감염에 의한 것으로 알려져 있다 (Boivin, 2003; Williams et al, 2004; van den Hoogen, 2004b). 또한, 어린이 중이염의 12 내지 50%가 hMPV와 관련되어 있다 (Boivin 2003; Peiris 2003; van den Hoogen, 2004b). 네덜란드에서, 2세 정도의 시험 개체의 55% 정도가 hMPV에 대해 혈청 양성 반응을 나타냈고 5세 이상의 경우에는 거의 대부분의 개체가 혈청 양성 반응을 나타내었다 (van den Hoogen, 2001). hMPV의 분포는 전세계적이며, 유럽, 북미, 오스트레일리아, 아프리카, 이스라엘, 일본 및 홍콩 등에서 보고되어 있다 (Bastien et al, 2003b; Howe, 2002; Hamelin et al 2004;IJpma eiral 2004; Maggretal, 2003; Nissen et al, 2002; Peiris 2003; Peret et al, 2002; Stockton et al, 2002; Wolf et al 2003). 보존 중인 혈청 샘플을 실험한 바에 의하면, hMPV는 50세 이상의 집단에서 분포되어 있다 (van de Hoogen et al, 2001). 근래에 이 바이러스가 동정된 이유 중 하나는 최소로 세포 변성 효과를 나타내면서 세포 배양에서 불충분하게 성장한다는 점때문이다 (Hamelin et al, 2004 ;van den Hoogen et al 2001).
hMPV는, 호흡기 신시티아 바이러스 (RSV), 조류 뉴모바이러스 (APV) 및 마우스의 뉴모바이러스 등도 포함되는, 파라믹소비리데 패밀리의 뉴모바이러스 서브패밀리에 속하는 엔벨로프(envelope) 단일 가닥 음성 센스 RNA 바이러스이다 (Van den Hoogen et al, 2001). 다른 뉴모바이러스와의 상동성을 기초로, 8개의 전사 유 닛이 다음의 순서로 확인되었다: 3' N-P-M-F-M2-SH-G-L 5' (Toquin et al, 2003; van den Hoogen 2002). 계통 발생학적 분석에 의하면 hMPV 바이러스주는 2종의 유전적 집단으로 분류할 수 있는데, 서브그룹 A 및 B로 표시되는 것으로서 APV 바이러스와는 구별된다 (Bastien et al 2003a and b; Biacchesi et al, 2003; Peret et al 2002 and 2004; van den Hoogen, 2002). 이들 서브그룹 내에서, hMPV는 Al, A2, Bl, 및 B2 서브타입으로 보다 세분할 수 있다 (van den Hoogen, 2003).
서브그룹 A 및 B 사이에서 매우 보존적인 융합 당단백질 (F)는 아마도 바이러스의 침투 및 합포체 (syncytia) 형성을 매개하는 듯하다. RSV 및 APV 등의 뉴모바이러스의 F 단백질은 전체 길이 전구체 (FO)로 합성되어 이후 다염기성 퓨린(furin) 유사 절단 부위에서 절단되어 F1 및 F2를 형성한다. FO의 절단으로 F1의 N-말단에서 융합 펩티드가 노출된다 (Collins 2001; Lamb 1993; Morrison 2003, Russell et al 2001; White 1990). RSV 및 APV와는 달리, hMPV는 퓨린 유사 모티프와는 일치하지 않는, 추정되는 절단 부위 RQS/PR를 포함한다 (Barr, 1991).
세포 배양한 임상 샘플로부터 hMPV의 분리가 트립신 의존적인 것으로 보고되었다 (Bastien et al 2003 a, Biacchesi et al, 2003; Boivin et al, 2002; Skiadopoulos et al, 2004; van den Hoogen et al 2001 and 2004a). 따라서, hMPV의 두 바이러스 분리주 hMPV/NL/1/00 및 hMPV/NL/1/99가 트립신없이 Vero 세포에서 성장했다는 것은 예상치 못한 것이다. 트립신 유무에 상관없이 동일하게 높은 역가(titer)를 얻었다.
야생형 (wt) hMPV/NL/1/00 및 wt hMPV/NL/1/99의 RT-PCR 산물을 서열 분석하였는데, 공개 서열 GL20150834 및 GI:50059145F와 비교시, F 단백질의 추정 절단 부위의 RQSR 모티프에 아미노산 치환 SlOlP을 암호화하는 돌연변이가 발견되었다. 여기서 보고된 결과에 따르면, 각각 hMPV의 A1 및 B1 서브타입을 대표하는 두 바이러스주 hMPV/NL/1/00 및 hMPV/NL/1/99에 있어서, F 당단백질의 추정 절단 부위의 RQSR 모티프에 101P를 보유하는 바이러스는 외래에서 첨가된 트립신없이 Vero 세포에서 복제할 수 있었다. 반대로, F 단백질에 101S를 보유하는 hMPV는 바이러스의 성장을 위하여 트립신 등과 같은 프로테아제를 첨가하는 것이 요구되었다. 이 보고서에서, 시험관내 성장 특성, hMPV F 당단백질 변이체의 절단 특성, 트립신의 존재 유무시 추정 절단 부위 근처에 아미노산 치환을 갖는 재조합 바이러스의 합포체 형성을 평가하였다. hMPV F 중의 S101P는 F의 절단 효율을 증가시키고 이의 융합 활성을 증가시키는 주요 유전적 결정 인자인 것으로 확인되었는데, 상기 두 특성이 트립신 부재에서 wt hMPV/NL/1/00 및 wt hMPV/NL/1/99의 효율적인 Vero 세포 성장에 기여하는 듯 하다. 인용된 문헌들의 목록은 본 명세서의 섹션 6의 뒷부분에 기재하였다.
3. 본 발명의 요약
본 발명은 트립신의 비활성도(specific activity)가 배지 1밀리리터 당 20 밀리유닛보다 낮은 배지에서 포유류 메타뉴모바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 포유류 메타뉴모바이러스의 증식 방법을 제공한다. 일 측면에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 인간 메타뉴모바이러스이다. 일 측면에 있어서, 상기 배지에 외래로부터 트립신을 첨가하지 않는다. 일 측면에 있어서, 상기 배지에 혈청을 첨가하지 않는다. 일 측면에 있어서, 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질의 절단 부위 내 RQSR 절단 모티프는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일 측면에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질은 서열 번호 314에 대하여 하나 이상의 추가 아미노산 치환을 포함한다. 일 측면에 있어서, RQPR 절단 모티프 내의 아미노산 치환은 세린이 프롤린으로 치환되어 RQPR 서열이 생성된다. 일 측면에 있어서, 상기 F 단백질의 추가 아미노산 치환은 다음의 치환 중 하나 이상이다: E93K, Q1OOK, E92K, E93V, I95S, E96K, Q94K, Q94H, I95S, N97K 또는 N97H. 일 측면에 있어서, 상기 F 단백질의 추가 아미노산 치환은 E93K이다. 일 측면에 있어서, 상기 추가 아미노산 치환은 RQSR 모티프 내 아미노산 치환을 안정화시킨다.
일 구체예에 있어서, 본 발명은 분리된 포유류 메타뉴모바이러스를 제공하는데, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 트립신 없이 성장할 수 있다. 일 측면에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 인간 메타뉴모바이러스이다. 일 측면에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질의 절단 부위 내 RQSR 절단 모티프는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일 측면에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질은 서열 번호 314에 대하여 하나 이상의 추가 아미노산 치환을 포함한다. 일 측면에 있어서, 상기 RQSR 절단 모티프 내 아미노산 치환은 세린이 프롤린으로 치환되어 RQPR 서열을 생성한다. 일 측면에 있어서, 상기 F 단백질 중의 추가 아미노산 치환은 다음의 치환 중 하나 이상이다: E93K, Q1OOK, E92K, E93V, I95S, E96K, Q94K, Q94H, I95S, N97K 또는 N97H. 일 측면에 있어서, 상기 추 가 아미노산 치환은 RQSR 모티프 내 아미노산 치환을 안정화시킨다. 일 측면에 있어서, 상기 F 단백질의 추가 아미노산 치환은 E93K이다. 일 측면에 있어서, 분리된 핵산은 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질을 암호화하며, 상기 F 단백질은 SlOlP 아미노산 치환 및 다음의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: E93K, Q1OOK, E92K, E93V, I95S, E96K, Q94K, Q94H, I95S, N97K 또는 N97H. 일 측면에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 인간 메타뉴모바이러스이다.
일 구체예에서, 본 발명은 트립시 부재하에서 포유류 메타뉴모바이러스의 안정한 성장을 지원하는 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질을 동정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 2 계대 이상 동안 트립신 부재하에서 포유류 메타뉴모바이러스를 성장시키는 단계로서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 F 단백질의 절단 부위에 RQPR 모티프를 포함하는 것인 단계; 및 (b) 합포체 형성을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서, 단계 (a) 전 포유류 메타뉴모바이러스에 의한 합포체 형성에 비하여 증가된 합포체 형성은 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질이, 트립신 부재하에서 포유류 메타뉴모바이러스의 안정한 성장을 지원하는 추가 아미노산 치환을 획득한 것을 의미한다. 일 측면에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 인간 메타뉴모바이러스이다. 일 측면에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 S101P 돌연변이를 보유한다.
일 구체예에 있어서, 본 발명은 트립신 부재하에서 포유류 메타뉴모바이러스의 안정한 성장을 지원하는 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질을 동정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 2 계대 이상 동안 트립신 부재하에서 포유류 메타뉴 모바이러스를 성장시키는 단계로서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 F 단백질의 절단 부위에 RQPR 모티프를 포함하는 것인 단계; 및 (b) F 단백질 절단을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 단계 (a) 전 포유류 메타뉴모바이러스에 의한 F 단백질 절단에 비하여 증가된 F 단백질 절단은, 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질이, 트립신 부재하에서 포유류 메타뉴모바이러스의 안정한 성장을 지원하는 추가의 아미노산 치환을 획득한 것을 의미한다. 일 측면에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 인간 메타뉴모바이러스이다. 일 측면에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 S101P 돌연변이를 보유한다.
일 구체예에 있어서, 본 발명은 F 단백질의 트립신 비의존적 절단을 증가시키는 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질 변이체를 동정하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 F 단백질은 절단 부위에 RQPR 모티프를 포함하고, 상기 방법은 (a) 2 계대 이상 동안 트립신 부재하에서 포유류 메타뉴모바이러스를 성장시키는 단계, 및 (b) F 단백질의 절단 효율을 측정하는 단계를 포함하며, 상기 F 단백질의 절단 효율의 증가는 F 단백질이, F 단백질의 트립신 비의존적 절단을 증가시키는 돌연변이를 획득하였음을 의미하는 것이다. 일 측면에 있어서, 포유류 메타뉴모바이러스는 인간 메타뉴모바이러스이다. 일 측면에 있어서, 포유류 메타뉴모바이러스는 S101P 돌연변이를 보유한다.
일 구체예에 있어서, 본 발명은 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질의 절단을 촉매하는 프로테아제를 동정하는 방법을 제공하며, 상기 F 단백질은 절단 부위에 RQPR 모티프를 포함하며, 상기 방법은 (a) F 단백질과 시험용 프로테아제를 접 촉시키는 단계, 및 (b) F 단백질의 절단 발생 여부를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 F 단백질의 절단 발생은 상기 프로테아제가 F 단백질의 절단을 촉매하였음을 의미하는 것이다.
3.1 협의된 약어들
cDNA : 상보 DNA
L : 큰(Large) 단백질
M : 메트릭스 단백질 (엔벨로프 내부에 있는 라인들)
F : 융합 당단백질
HN : 헤마글루티닌-뉴라미니다제 당단백질
N, NP 또는 NC : 핵단백질 (RNA와 연합되어 있고 폴리머라제 활성에 요구됨)
P : 인단백질
MOI : 감염 다중도
NA : 뉴라미니다제 (엔벨로프 당단백질)
PIV : 파라인플루엔자 바이러스
hPIV : 인간 파라인플루엔자 바이러스
hPIV3 : 인간 파라인플루엔자 바이러스 제3형
APV/hMPV : hMPV 서열을 보유한 재조합 APV
hMPV/APV : APV 서열을 보유한 재조합 hMPV
포유류 MPV : 포유류 메타뉴모바이러스
nt : 뉴클레오티드
RNP : 리보핵단백질
rRNP : 재조합 RNP
vRNA : 게놈 바이러스 RNA
cRNA : 안티게놈 바이러스 RNA
hMPV : 인간 메타뉴모바이러스
APV : 조류 뉴모바이러스
MVA : 변성 백시니아 바이러스 앙카라
FACS : 형광 활성화 세포 분류기
CPE : 세포 변성 효율 (cytopathic effects)
위치 1 : 전사되는 바이러스 게놈의 제1 유전자의 위치
위치 2 : 천연 바이러스 게놈의 제1 및 제2 오픈 리딩 프레임 사이의 위치이거나, 또는 다르게는 전사되는 바이러스 게놈의 제2 유전자의 위치
위치 3 : 천연 바이러스 게놈의 제2 및 제3 오픈 리딩 프레임 사이의 위치이거나, 또는 다르게는 전사되는 바이러스 게놈의 제3 유전자의 위치
위치 4 : 천연 바이러스 게놈의 제3 및 제4 오픈 리딩 프레임 사이의 위치이거나, 또는 다르게는 전사되는 바이러스 게놈의 제4 유전자의 위치
위치 5 : 천연 바이러스 게놈의 제4 및 제5 오픈 리딩 프레임 사이의 위치이거나, 또는 다르게는 전사되는 바이러스 게놈의 제5 유전자의 위치
위치 6 : 천연 바이러스 게놈의 제5 및 제6 오픈 리딩 프레임 사이의 위치이거나, 또는 다르게는 전사되는 바이러스 게놈의 제6 유전자의 위치
Ab : 항체
dpi : 감염 후 일수(days)
F : 융합 (fusion)
HAI : 혈구응집반응(hemagglutination)-억제
HN : 헤마글루티닌-뉴라미니다제
hpi : 감염 후 시간
MOI : 감염 다중도
POI : 감염 지점
bPIV-3 : 소과 파라인플루엔자 바이러스 제3형
hPIV-3 : 인간 파라인플루엔자 바이러스 제3형
RSV : 호흡기 신시티아 바이러스 (respiratory syncytial virus)
SFM : 무혈청 배지
TCID50 : 50% 의 조직 배양 감염 용량
4. 도면에 대한 구체적인 설명
도 1 : hMPV의 4 서브타입의 역가(titer) 및 플라크. 적당하게 성장한(Subconfluent) 단층의 Vero 세포에 MOI of 0.1 PFU/세포 및 +/- 0.2 ug/ml TPCK 트립신으로 각 표시한 생물학적으로 유래한 바이러스를 접종하였다. 상기 세포의 상등액을 감염 후 6일 후에 회수하고, -70℃에서 동결시켰으며 플라크 분석을 통해 서 Vero 세포에서의 역가를 측정하였다. 감염된 세포 단층을 1% 메틸셀룰로스하에서 성장시키고, 접종 후 6일에 메탄올에 고정시켰으며, 페렛 항-hMPV 폴리클로날 Ab로 면역 염색하였으며, 이후 홀스-래디쉬 퍼옥시다제-접합된 항-페렛 Ab로 염색하였다. 플라크는 3-아미노-9-에틸카바졸 (AEC)로 시각화하여서 니콘 이클립스 TE2000-U 현미경으로 사진을 찍었다. 역가는 log10 PFU/ml로 표시하였다.
도 2 : 대표적인 서프타입 A1인, rhMPV/NL/1/OO/lOlS 및 rhMPV/NL/1/OO/lOlP의 성장 특성 비교. (A) +/-0.2ug/ml 트립신의 Vero 세포에서 성장한 rhMPV/NL/1/OO/lOlP 및 rhMPV/NL/1/OO/lOlS에 의해 생성된 플라크를 접종 후 6일에페렛 항-hMPV 폴리클로날 Ab, 이어서 홀스 래디쉬 퍼옥시다제-접합된 항-페렛 Ab으로 면역 염색시키고 3-아미노-9-에틸카바졸 (AEC) 발색체 (Dako)로 색을 현상하였다. (B) rhMPV/NL/1/OO/lOlP (열린 사각) 또는 rhMPV/NL/1/OO/lOlS (닫힌 삼각)로 감염된 Vero 세포의 6일 성장 곡선. 좌측 그래프에서는, Vero 세포에서 바이러스 증식 및 플라크 분석 동안 0.2 ug/ml 트립신을 첨가하였다. 중간 그래프에서는, 트립신을 사용하지 않았다. 우측 그래프에서는, 바이러스 증식 동안에는 트립신을 사용하지 않았으나, 플라크 분석 과정중에는 0.2 ug/ml 트립신을 첨가하였다. 역가는 재료 및 방법에 기술한 바와 같은 플라크 형성법을 통해 측정하였다. (C) Vero 세포 단층에 +/-0.2ug/ml 트립신에서, rhMPV/NL/1/OO/lOlP 또는 rhMPV/NL/1/OO/lOlS 을 접종하였다. 감염된 세포 단층을 3% 파라포름알데히드에 고정시키고 hMPV F에 대한 햄스터 Mab 121-1017-133로 면역 염색하고, 이후에 FITC-접합된 항-햄스터 Ab 를 부착시키고, 니콘 TE2000-U 현미경을 사용하여 hMPV F의 표면 발현을 시각화하였다. (D) 재료 및 방법에 기술한 바와 같이 +/-0.2ug/ml 트립신에서, rhMPV/NL/1/OO/lOlP 또는 rhMPV/NL/1/OO/lOlS로 감염된 Vero 세포 단층의 웨스턴 블랏을 수행하였다. 바이러스 샘플을 12% SDS-PAGE 겔에서 분리하고, 이를 PVDF 멤브레인으로 이동시켰으며, hMPV F에 대한 햄스터 Mab 121-1017-133, 및 HRP-접합된 항-햄스터 Ab로 면역블랏하고, ECL(electrochemoluminescence) 용액을 처리하고 필름에 노출시켰다. 좌측 숫자는 마커의 분자량 (킬로달톤)이다. 우측 화살표는 전체 길이 hMPV F (F0) 및 절단 단편 hMPV F1에 대해 예측되는 크기에 해당하는 두 밴드의 위치를 나타낸다.
도 3 : 웨스턴 블랏으로 검출한 b/h PIV3에 벡터화된 hMPV F의 발현. 적당하게 자란 단층 Vero 세포에, 본 명세서에서 기술한 바와 같이, +/-트립신하에서 wt liMPV/NL/1/00, b/h PIV3/hMPV F/101P, 또는 b/h PIV3/hMPV F/101S를 접종하였다. hMPV F에 대한 Mab 121-1017-133를 사용하여, 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 좌측 숫자는 마커의 분자량 (킬로달톤)이다. 우측 화살표는 전체 길이 hMPV F (F0) 및 절단 단편 hMPV F1에 대해 에측되는 크기에 해당하는 두 밴드의 위치를 나타낸다.
도 4 : 재조합, 변이체 및 야생형 hMPV 바이러스에서 유래한 뉴클레오티드 서열의 크로마토그램. 재료 및 방법에 기술한 바와 같이 RT-PCR을 수행하였다. 이 크로마토그램에서는 뉴클레오티드 3348 내지 3373 사이를 확대하여 도시하고 있다. F 당단백질의 아미노산 93 (삼각형), 100 (타원) 및 101 (밑줄)로 예측되는 아미노산에 상응하는 코돈을 표시하였다. 별표는 돌연변이나 다형성을 나타낸다.
도 5 : 웨스턴 블랏으로 검출한 상대적인 hMPV F 단백질의 절단 효율성. MOI 0.1PFU/세포로, +/-0.2ug/ml 트립신에서, 표시한 hMPV를 Vero 세포에 접종하였다. 상기 바이러스들은 rhMPV/NL/1/OO/lOlS (레인 1, 6, 13 및 18), rhMPV/NL/1/OO/lOlP (레인 2 및 7, 11 및 16), vhMPV/93K/101P (레인 3 및 8), vhMPV/lOOK/lOlP (레인 4 및 9), wt hMPV/NL/1/00 (레인 5, 10,15 및 20), rhMPV/93K/101P (레인 12 및 17), 또는 rhMPV/93K/101S (레인 14 및 19)이다. 주목할 것은, 본 명세서에서 기술한 바와 같이, wt hMPV/NL/1/00은 E93K를 보유한 hMPV와 Q1OOK를 보유한 hMPV의 혼합물이다. 접종 후 6일, 세포 및 상등액을 회수하여, -7O℃에서 동결시키고, 해동한 후, 12% SDS-PAGE 겔에서 분리하였다. 단백질들을 PVDF 멤브레인으로 이동시키고 hMPV F에 대한 Mab 122-1017-133으로 탐지하였다. 좌측의 숫자는 마커의 분자량 (킬로달톤)이다. 우측 화살표는 전장 hMPV F (F0) 및 절단 단편 hMPV F1에 대하여 예측한 크기에 상응하는 두 밴드를 나타낸다. 각 바이러스의 위치 93, 100 및 101의 hMPV F 아미노산을 블랏 위의 각 레인에 표시하였다. 트립신의 존재 유무는 블랏 아래에 표시하였다.
도 6 : F 단백질에 101P를 함유하는 야생형 hMPV 바이러스, 변이체, 재조합 바이러스의 다수사이클 성장 곡선. 적당하게 자란 Vero 세포에 트립신 없이 MOI가 0.1 PFU/세포가 되도록 접종하였다. 세포 및 상등액을 24시간 간격으로 6일 동안 회수하였다. 회수한 바이러스의 역가는 플라크 분석법으로 측정하였다.
도 7: hMPV 바이러스로 감염된 Vero 세포의 상대적인 융합 효율. 충분하게 자란 단층의 Vero 세포에 +/-0.2 ug/ml TPCK 트립신으로, MOI가 3 PFU/세포가 되도록 각 표시한 hMPV 바이러스들을 접종하고 1% 메틸셀룰로스를 함유하는 배지 하에서 성장시켰다. 상기 단층을 48시에 메탄올에 고정시켰다. Heochst 염료와의 항온반응을 통해 핵을 가시화하고 니콘 이클립스 TE2000-U 형광 현미경의 DAPI 렌즈를 통해 형상화하였다. 도시한 사진은 3번의 독립적인 실험 중 하나에 의한 대표적인 시야계이다. 융합된 세포의 응집된 핵과 융합되지 않은 세포의 단일 핵을 10 시야계에서 계측하여서 융합된 세포의 비율을 그래프화하였다. 도시한 결과는 3번의 실험 중 하나이다.
도 8 : 대표적인 서브타입 B1인 wt hMPV/l/99/101P 및 rhMPV/l/99/101S의 성장 특성 비교. (A) 각각 +/- 0.2ug/ml 트립신에서, 접종 후 6일에 Vero 세포에 wt hMPV/NL/l/99/101P 또는 rhMPV/NL/99/101S에 의해 형성된 플라크를 면역 염색하였다. (B) wt hMPV/NL/l/99/lOlP (열린 사각형) 또는 rhMPV/NL/1 /99/101 S (닫힌 삼각형)에 감염된 Vero 세포의 6일 성장 그래프. 좌측 그래프는 바이러스 증식 및 플라크 형성 중에 0.2 ug/ml 트립신을 첨가하였다. 중간 그래프는 트립신을 사용하지 않았다. 우측 그래프는, 바이러스 증식 중에는 트립신을 사용하지 않았으나, 플라크 형성 중에는 0.2 ug/ml 트립신을 첨가하였다. 재료 및 방법에 기술한 바와 같이 플라크 분석을 통해서 역가를 측정하였다. (C) +/- 0.2 ug/ml에서, Vero 세포를 wt hMPV/NL/l/99/101P 또는 rhMPV/NL/l/99/lOlS으로 접종하였다. 감염된 세포 단층을 3% 파라포름알데히드로 고정시키고 hMPV F에 대한 햄스터 Mab 121-1017-133, 이어서 FITC-접합된 항-햄스터 Ab로 면역 염색시켜서 니콘 TE2000-U 현미경을 사용하여 hMPV F의 표면 발현을 가시화하였다. (D) 재료 및 방법에 기술한 바와 같이, +/- 0.2ug/ml 트립신에서, wt hMPV/NL/l/99/lOlP 또는 rhMPV/NL/l/99/lOlS로 감염시킨 Vero 세포 단층을 웨스턴 블랏 분석하였다. 바이러스 샘플을 12% SDS-PAGE 겔에서 분리하고, PVDF 멤브레인에 이동시키고, hMPV에 대한 햄스터 Mab 121-1017-133, 이어서 HRP-접합된 항-햄스터 Ab로 면역 염색하였으며, ELC 용액을 처리하고 필름에 노출시켰다. 좌측의 숫자는 마커의 분자량 (킬로달톤)이다. 우측의 화살표는 전체 길이 hMPV F (F0) 및 절단 단편 hMPV F1에 대해 예측한 크기에 상응하는 두 밴드의 위치를 나타낸다.
도 9 : hMPV 게놈 분석: hMPV 게놈 구성에 대한 hMPV 게놈 서열의 PCR 단편을 도시하고 있다. 돌연변이의 위치는 PCR 단편을 표시하는 수직선 아래 도시하였다.
도 10: hMPV 분리주 00-1 (Al) 및 hMPV 분리주 99-1 (Bl)의 제한 효소 지도. 각 분리주의 제한 효소 부위는 hMPV의 게놈 구성을 도시한 도표 아래에 표시하였다. 도표의 상층 눈금은 hMPV내 위치 (kb)를 나타낸다.
5. 본 발명의 상세한 설명
메타뉴모바이러스 주
본 발명은 트립신 부재하에서 증식할 수 있는 분리된 포유류 메타뉴모바이러스주를 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은, 트립신 부재하에서 증식할 수 있도록 유전자 조작한 재조합 포유류, 예컨대, 인간 메타뉴모바이러스를 제공한다. 이론에 제한되지 않으면서, 본 발명의 포유류 메타뉴모바이러스주는 트립신 부재하에서 증식할 수 있는데, F 단백질이 트립신 비의존적으로 절단되기 때문이다. 일 특정 구체예에서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 인간 메타뉴모바이러스이다. 일 측면에서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 재조합 메타뉴모바이러스이다. 일 특정 구체예에서, 포유류 메타뉴모바이러스는 재조합 인간 메타뉴모바이러스 (rhMPV)이다.
일 구체예에서, 본 발명은 외래에서 첨가된 트립신 없이 증식할 수 있는 포유류 메타뉴모바이러스주를 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은 배지 1밀리리터당 40밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 35밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터당 30밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 25밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 20밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 15밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 10밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 5밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 2밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 1밀리유닛 이하, 또는 배지 1밀리리터 당 0.5밀리유닛 이하의 트립신 비활성도를 생성하는 트립신 농도에서 증식할 수 있는 포유류 메타뉴모바이러스주를 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은, 배지 1밀리리터 당 트립신 0.1마이크로그램 이하, 배지 1밀리리터 당 트립신 0.05마이크로그램 이하, 배지 1밀리리터 당 트립신 0.01마이크로그램 이하, 배지 1밀리리터 당 트립신 0.005마이크로그램 이하, 배지 1밀리리터 당 트립신 0.001마이크로그램 이하, 또는 배지 1밀리리터 당 트립신 0.0005마이크로그램 이하의 배지 내 트립신 농도에서 증식할 수 있는 포유류 메타뉴모바이러스주를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, F 단백질의 절단 부위의 RQSR 모티프 내 하나 이상의 아미노산은 치환되거나 결실된다. 일 구체예에서, 본 발명의 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질의 절단 부위 내 RQSR 모티프의 세린은 상이한 아미노산으로 치환된다. 보다 특정 구체예에서, F 단백질의 절단 부위 내 RQSR 모티프의 세린은 프롤린으로 치환되어 RQSR 모티프를 생성한다. 야생형 유전형으로 복귀될 가능성을 줄이기 위하여, 상기 아미노산을 암호화하는 코돈에서 2개 이상의 뉴클레오티드 교환을 도입하여 아미노산 치환을 조작할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, F 단백질은 서열번호 314의 아미노산 서열(인간 메타뉴모바이러스주 NL/1/00의 F 단백질의 아미노산 서열)을 가지며 상기 아미노산 위치 101의 세린은 프롤린으로 치환되어, 트립신 비의존적으로 증식할 수 있는 포유류 메타뉴모바이러스를 얻게 된다. 당업자라면, 상이한 바이러스주의 F 단백질의 아미노산 서열을 예컨대 서열번호 314의 아미노산 서열과 정렬하여서 포유류 메타뉴모바이러스의 상이한 바이러스주의 F 단백질 내 상동성 아미노산 위치를 어떻게 확인하는 지 알고 있다. 예를 들어, 서열번호 314를, 다른 인간 메타뉴모바이러스주의 F 단백질의 아미노산 서열과 정렬시켜서, 서열번호 314의 RQSR 서열 (아미노산 위치 99 내지 102)이 위치하고, 포유류 메타뉴모바이러스의 상이한 바이러스주의 F 단백질 내에서 이에 상응하는 아미노산을 동정한다.
본 발명의 일 구체예에서, F 단백질은, 이 F 단백질 내 절단 부위의 RQSR 모티프의 세린 치환이외에도 서열번호 314에 대하여, 하나 이상의 추가 돌연변이("제2 부위 돌연변이'), 예컨대 아미노산 치환, 부가 또는 결실 등을 포함한다. 이론에 제한되지 않으면서, 이러한 제2 부위 돌연변이는 F 단백질 내 절단 부위의 RQSR 모티프의 세린 치환을 안정화시켜서, 트립신 부재하에서 성장시, 제2 부위 돌연변이가 없는 포유류 메타뉴모바이러스주에 비하여 포유류 메타뉴모바이러스주의 F 단백질 내 임의 추가 돌연변이 발생 빈도가 보다 감소된다. 또한, 이론에 제한되지 않고, 이러한 제2 부위 돌연변이는 F 단백질의 트립신 비의존적 절단을 강화시킨다. 일 구체예에서, 제2 부위 돌연변이를 보유하는 본 발명의 포유류 메타뉴모바이러스주는, F 단백질의 절단 부위의 RQSR 모티프 내 세린 치환이외에 F 단백질 내 임의 자발적인 돌연변이의 획득없이, 트립신 부재하에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 계대 이상, 또는 25 계대 이상을 견딜 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 제2 부위 돌연변이는 F 유전자와는 다른 유전자 내에 존재한다. 이론에 제한되지 않고, 상기 F 단백질의 절단은 F 단백질의 분자적 배경에 좌우되며 따라서, 예컨대 바이러스 입자 내 F 단백질의 배향성이나 F 단백질의 폴딩 등에 영향을 주는 단백질 내 변경도 또한, F 단백질의 절단에 영향을 줄 수 있다.
일 구체예에서, 제2 부위 돌연변이는 F 단백질의 절단 부위 내 RQSR 모티프에 근접하여 있다. 일 구체예에서, 제2 부위 돌연변이는 RQPR 모티프로부터 아미노 말단으로 20 아미노산 이내, 15 아미노산 이내, 10 아미노산 이내, 또는 5 아미노산 이내에 있다. 일 구체예에서, 상기 제2 부위 돌연변이는 RQPR 모티프로부터 카르복시-말단으로 20 아미노산 이내, 15 아미노산 이내, 10 아미노산 이내, 또는 5 아미노산 이내에 있다.
보다 특정의 일 구체예에서, 상기 제2 부위 돌연변이는 서열번호 314의 아미노산 위치 92, 93, 94, 95, 96, 97, 또는 100에 상응하는 F 단백질의 아미노산 위치에 있다. 보다 더욱 특정한 일 구체예에서, 상기 추가 돌연변이는 E93K, Q1OOK, E92K, E93V, 195S, E96K, Q94K, Q94H, I95S, N97K 또는 N97H일 수 있으며, 여기서 상기 첫 글자는 서열번호 314의 아미노산을 의미하며, 숫자는 아미노산 위치를 나타내고, 두번째 글자는 각 위치에서 서열번호 314의 아미노산을 치환한 아미노산을 의미한다.
일 구체예에서, 본 발명의 메타뉴모바이러스는 예컨대 S101P를 보유하는 RQPR 모티프, 및 제2 부위 돌연변이를 갖는다. 특정 일 구체예에서, 본 발명은 E93K 및 SlOlP 아미노산 치환을 포함하는 F 단백질을 함유하는 재조합 인간 메타뉴모바이러스를 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명의 바이러스의 F 단백질 내 돌연변이는 포유류 메타뉴모바이러스의 숙주 특이성에 변화를 야기하지 않는다. 일 구체예에서, 본 발명의 바이러스의 F 단백질 내 돌연변이는 포유류 메타뉴모바이러스의 숙주 세포 특이성에 변화를 야기하지 않는다.
본 발명의 포유류 메타뉴모바이러스주는 예컨대, 생약독화 바이러스 백신의 개발 등에 유용하다.
일 구체예에서, 2 또는 3개의 돌연변이를 하나의 코돈에 도입하여서 아미노산 치환을 실시한다. 이론에 제한되지 않고, 하나의 코돈에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 것은 야생형 유전형으로의 복귀율을 줄이게 된다.
본 발명의 메타뉴모바이러스주는 이종 서열을 암호화하도록 유전적으로 변형시킬 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 메타뉴모바이러스는 항원성 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하도록 변형시킬 수 있다. 이러한 변형 메타뉴모바이러스는 이하 더욱 기술하는 바와 같이 백신 등에 사용할 수 있다. 본 발명의 메타뉴모바이러스주는 특정 숙주에 대해 약독화되도록 유전적으로 더욱 변형시킬 수 있다 (이하 섹션 5.7 참조).
증식 방법
본 발명은 트립신 부재하에서 포유류 메타뉴모바이러스를 증식시키는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 포유류 메타뉴모바이러스는 재조합 포유류, 예컨대 인간, 메타뉴모바이러스로서, 트립신 부재하에서 증식할 수 있도록 조작된 것이다. 이론에 제한되지 않고, 포유류 메타뉴모바이러스주는 이의 F 단백질이 트립신 독립적으로 절단되면, 트립신 부재하에서 증식할 수 있다. 보다 특정의 일 구체예에서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 인간 메타뉴모바이러스이다. 일 측면에서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 재조합 메타뉴모바이러스이다. 일 특정 구체예에서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 재조합 인간 메타뉴모바이러스이다 (rhMPV).
일 구체예에서, 본 발명은 배지에 외부로부터 첨가된 트립신 없이 포유류 메타뉴모바이러스를 증식시키는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은 배지 1밀리리터 당 40밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 35밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 30밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 25밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 20밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 15밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 10밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 5밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 2밀리유닛 이하, 배지 1밀리리터 당 1밀리유닛 이하, 또는 배지 1밀리리터 당 0.5밀리유닛 이하의 트립신 비활성도가 생성되는 트립신 농도에서 증식할 수 있는 포유류 메타뉴모바이러스주의 증식 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은 배지 1밀리리터 당 트립신 0.1마이크로그램 이하, 배지 1밀리리터 당 트립신 0.05마이크로그램 이하, 배지 1밀리리터 당 트립신 0.01마이크로그램 이하, 배지 1밀리리터 당 트립신 0.005마이크로그램 이하, 배지 1밀리리터 당 트립신 0.001마이크로그램 이하, 배지 1밀리리터 당 트립신 0.0005마이크로그램 이하의 배지 내 트립신 농도에서 포유류 메타뉴모바이러스를 증식시키는 방법을 제공한다. 다른 일 구체예에서, 트립신은 트립신 활성 억제제로 불활성화된다.
본 발명의 일 구체예에서, F 단백질의 절단 부위의 RQSR 모티프 내의 하나 이상의 아미노산(들)은 치환되거나 결실된다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 증식하는 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질의 절단 부위 내 RQSR 모티프의 세린은 다른 아미노산으로 치환되어서 메타뉴모바이러스에 트립신 비의존적 성장을 부여한다. 보다 특정의 구체예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 증식하는 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질의 절단 부위 내 RQSR 모티프의 세린은 프롤린으로 치환된다.
일례에 있어서, 본 발명의 방법을 사용하여 증식시킨 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질은 서열번호 314의 아미노산 서열을 가지며 아미노산 위치 101의 세린은 프롤린으로 치환된다. 당업자라면, 다른 바이러스주의 F 단백질의 아미노산 서열을, 예컨대 서열번호 314의 아미노산 서열과 정렬하여 포유류 메타뉴모바이러스의 다른 바이러스주의 F 단백질 내 상동성을 갖는 아미노산 위치를 동정하는 방법을 알고 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 증식시킨 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질은, F 단백질의 RQSR 모티프의 세린 치환, 예컨대 RQPR 모티프이외에도, 하나 이상의 돌연변이("제2 부위 돌연변이"), 예컨대 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함한다. 이론에 제한되지 않고, 이러한 제2 부위 돌연변이는, F 단백질의 절단 부위의 RQSR 모티프의 세린 치환을 안정화시켜서, 트립신 부재하에서 바이러스를 성장시킬 경우 제2 부위 돌연변이가 없는 포유류 메타뉴모바이러스주에 비하여, 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질 내 임의 추가 돌연변이의 발생 빈도를 줄인다. 일 구체예에서, F 단백질의 절단 부위의 RQSR 모티프에 세린 치환 및 상기 제2 부위 돌연변이를 보유한 포유류 메타뉴모바이러스는 F 단백질에 임의의 자발적인 돌연변이의 획득없이 트립신 부재하에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 계대 이상, 또는 25 계대 이상을 견딜 수 있다.
일 구체예에서, 제2 부위 돌연변이는 F 단백질의 절단 부위 내 RQPR 모티프에 근접하여 존재한다. 일 구체예에서, 제2 부위 돌연변이는 RQPR 모티프로부터 아미노-말단으로 20 아미노산 이내, 15 아미노산 이내, 10 아미노산 이내, 또는 5 아미노산 이내에 존재한다. 일 구체예에서, RQPR 모티프로부터 카르복시 말단으로 20 아미노산 이내, 15 아미노산 이내, 10 아미노산 이내, 또는 5 아미노산 이내에 존재한다.
보다 특정한 일 구체예에서, 제2 부위 돌연변이는 서열번호 314의 아미노산 위치 92, 93, 94, 95, 96, 97, 또는 100에 상응하는 F 단백질의 아미노산 위치에 존재한다. 보다 더욱 특정한 일 구체예에서, 제2 부위 돌연변이는 E93K, Q1OOK, E92K, E93V, I95S, E96K, Q94K, Q94H, I95S, N97K 또는 N97H일 수 있고, 여기서 첫 글자는 서열번호 314의 아미노산을 나타내며, 숫자는 아미노산 위치를 나타내고, 두번째 글자는 각 위치에서 서열번호 314의 아미노산을 치환한 아미노산을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 제2 부위 돌연변이는 F 유전자와는 상이한 유전자이다. 이론에 제한되지 않고, F 단백질의 절단은 F 단백질의 분자적 구성에 의존적이며 따라서, 예컨대 바이러스 입자에서 F 단백질의 배향성, 또는 F 단백질의 폴딩 등에 영향을 주는 상기 단백질 내 변경은 또한 F 단백질의 절단에 영향을 주게 된다.
특정 일 구체예에서, 본 발명은 트립신 부재하에서, F 단백질을 포함하는 재조합 인간 메타뉴모바이러스를 증식시키는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 F 단백질은 E93K 및 SlOlP 아미노산 치환을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 배지에 혈청을 첨가하지 않고 포유류 메타뉴모바이러스를 증식시키는 방법을 제공한다. 혈청 부재하에서 감염 세포를 성장시키는 것에 대한 보다 구체적인 설명은, 이하 섹션 5.6을 참조한다.
본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 예시적인 세포주는 이에 한정되는 것은 아니나, 예컨대 Vero 세포 및 LLC-MK2 붉은털 원숭이 신장(Rhesus Monkey Kidney) 등을 포함한다. 본 발명의 방법에 재조합 바이러스를 사용할 경우, 포유류 메타뉴모바이러스의 복구(rescue)를 위하여 BHK 세포를 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 바이러스의 F 단백질 내 돌연변이는 포유류 메타뉴모바이러스의 숙주 특이성에 변화를 야기하지 않는다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 바이러스의 F 단백질 내 돌연변이는 포유류 메타뉴모바이러스의 숙주 세포 특이성에 변화를 야기하지 않는다.
스크리닝 분석법
본 발명은 또한, 절단 부위 내 RQPR 모티프를 보유하는 포유류 메타뉴모바이러스 F 단백질의 트립신 비의존적 절단의 제2 부위 돌연변이를 동정하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은 절단 부위 내에 RQPR 모티프를 보유하는 포유류 메타뉴모바이러스 F 단백질의 트립신 비의존적 절단의 인헨서를 동정하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다. 임의 특정 기작이나 이론에 제한되지 않고, RQPR 모티프를 보유한 포유류 메타뉴모바이러스 F 단백질의 트립신 비의존적 절단의 제2 부위 돌연변이, 예컨대 인헨서는 바이러스 게놈을 안정화시켜서 트립신 부재하에서 성장으로 인한 F 유전자 내 자발적인 추가 돌연변이의 축적을 야기시키지 않는다. 일 구체예에서, 이러한 제2 부위 변형 인자는 F 유전자 내에 존재한다. 다른 일 구체예에서, 이러한 제2 부위 변형 인자는 포유류 메타뉴모바이러스의 다른 유전자에 존재한다.
돌연변이는 당분야의 당업자에게 공지인 임의 방법을 통해서 포유류 메타뉴모바이러스의 F 유전자에 도입시킬 수 있다. 돌연변이는, 예컨대 DNA의 무작위 돌연변이 유발법 및 돌연변이를 갖는 바이러스 입자를 복구하기 위한 역유전학의 사용; DNA의 부위 특이적 돌연변이 유발법 및 돌연변이를 보유한 바이러스 입자를 복구하기 위한 역유전학의 이용; 또는 선별적인 압력, 예컨대 트립신 부재하에서의 바이러스 성장법 등을 통하여 도입시킬 수 있다.
적절한 제2 부위 돌연변이는 다른 수준으로 선택할 수 있다. 일 구체예에서, F 단백질을 암호화하는 DNA에 돌연변이를 유발시키고, 이 F 단백질을 발현시켜서 트립신 비의존적인 절단능에 대하여 시험한다(예시적인 분석법을 하기에 기술함). 트립신 비의존적 절단의 증가는 상기 제2 부위 돌연변이가 F 단백질의 트립신 비의존적 절단의 인헨서임을 의미한다. 다른 구체예에서, F 유전자를 암호화하는 DNA에 돌연변이를 유발시키고, 역유전학을 사용하여 바이러스를 복구하며, 이 바이러스에 대하여 트립신 비의존적 F 단백질 절단의 강화 또는 합포체 형성의 증가를 시험한다. 또 다른 구체예에서, 바이러스를 트립신 부재에서, 즉 선별적인 압력하에서 성장시키고, 이어서, 임의의 제2 부위 돌연변이, 예컨대 트립신 비의존적 F 단백질 절단의 강화 또는 합포체 형성 증가에 대한 효과를 시험한다.
F 유전자 내 제2 부위 변형 인자를 보유한 돌연변이체를 선별하면, 상기 F 유전자를 서열분석할 수 있다. 이후, 상기 돌연변이를 특징화가 잘된 바이러스주,이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대 rhMPV/NL/1/OO/lOlP 등에 도입시켜서 제2 부위 돌연변이의 효과를 검증할 수 있고 백신 생성에 적합한 바이러스주를 생성시킬 수 있다.
RQPR 모티프를 보유한 메타뉴모바이러스 F 단백질을 절단하는 프로테아제를 동정하기 위하여, 당업자에게 공지인 임의 방법을 사용하여 프로테아제의 활성을 검출 및 정량할 수 있다. 일 구체예에서, 절단 부위 내에 RQPR 모티프를 보유한, 검출가능하게 표지화된 F 단백질을 고상 지지체상에 고정화시켜서 F 단백질의 절단으로 상기 표지의 손실을 야기시킬 수 있다 (즉, 상기 표지는, 절단 부위에 대하여 고정 부위와는 멀리 존재함). 따라서, 프로테아제 활성은 검출가능한 표지의 감소를 통해서 검출 및 정량할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 검출가능하게 표지된 폴리펩티드의 아미노산 또는 펩티드의 반응 완충제로의 방출을 측정한다. 다른 일 구체예에서, FRET 또는 형광 편광법을 사용하여 프로테아제 반응을 검출 및 정량한다. 일례에 있어서, 상기 F 단백질은 고상 지지체에 부착되지 않은 말단이 형광 표지화된다. 시험용 프로테아제의 항온반응시, 상기 형광 표지는 단백질 가수분해시 손실되므로, 형광도의 감소는 FQPR 모티프를 갖는 F 단백질을 절단할 수 있는 프로테아제 활성이 존재함을 의미한다. 일 구체예에서, 상기 고상 지지체는 비드이다.
당업자에게 공지인 임의 방법을 통해서 상기 F 단백질을 검출가능하게 표지화할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 방사선 동위원소로 표지화한다. 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 한쪽 말단을 고상 지지체의 표면에 부착시키고 또 다른 한쪽 말단은 검출가능하게 표지화한다.고상 지지체상의 표면에서 검출가능 표지의 감소는 프로테아제 활성의 활성에 대한 측정 기준이다.
시험용 프로테아제로 사용할 수 있는 프로테아제의 종류로는, 이에 한정되는 것은 아니나, 예컨대 브로멜레인, 카텝신, 카이모트립신, 콜라게나제, 엘라스타제, 칼리크레인, 파파인, 펩신, 플라스민, 레닌, 스트렙토키나제, 서브틸리신, 써모라이신, 트롬빈, 트립신, 및 유로키나제 등이 포함된다. 특정 구체예에서, 프로테아제는 트립타제 클라라 또는 이의 상동체이다.
5.1 포유류 메타뉴모바이러스
포유류 메타뉴모바이러스의 구조적 특징
본 발명은 포유류 MPV를 제공한다. 포유류 MPV는 파라믹소비리데 패밀리의 뉴모바이러스 서브패밀리에 속하는 음성 센스 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 또한, 포유류 MPV는 계통 발생학적으로 메타뉴모바이러스 속에 상응하는 것으로 동정가능한데, 여기서 포유류 MPV는 조류 비기관염 (avian rhinotracheiti)의 병인인자인 칠면조의 비기관염 바이러스보다는 파리 소재의 CNCM에 1-2614로 기탁된 바이러스 분리주(서열번호 19)와 계통 발생학적으로 보다 근접하다. 예컨대, 바이러스의 핵산 서열 정보를 얻어서 이를 계통 발생학적으로 분석하여, 계통발생학적으로 메타뉴모바이러스 속에 해당되는 것으로 동정가능하다. 당업자에게 공지인 임의 방법을 사용하여 바이러스주간의 계통학적 관련성을 결정할 수 있다. 예컨대 섹션 5.9의 방법들을 참고할 수 있다. 기타 방법들은 예컨대 공개번호 WO 02/057302로 공개된, 국제 공개특허 제PCT/NL02/00040호에 개시되어 있으며, 이를 전체로 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다. 구체적으로 PCT/NL02/00040의 페이지 12, 27줄부터 페이지 19의 29줄에는 계통 분석에 적합한 핵산 서열이 개시되어 있으며, 이를 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다. 이하 보다 구체적으로 기술한 서열 유사성을 기초로 바이러스를 포유류 MPV로 더욱 동정가능하다.
본 발명에서 개시하는 포유류 MPV와 바이러스의 서열 유사성 및 계통학적 관련성이외에도, 본 발명에서 개시하는 포유류 MPV의 게놈 구성과 바이러스의 게놈 구성의 유사성을 또한 이용하여 상기 바이러스가 포유류 MPV인 것으로 확인할 수 있다. 포유류 MPV의 대표적인 게놈 구성은 도 9를 참조한다. 일 구체예에서, 포유류 MPV의 게놈 구성은 파라믹소비리데 패밀리의 뉴모비리네 서브 패밀리에 속하는 뉴모바이러스의 게놈 구성과는 다르다. 두 속, 즉 메타뉴모바이러스와 뉴모바이러스의 분류는 우선적으로 그들의 유전자 배치(constellation)에 기초하는데, 메타뉴모바이러스는 대체로 NS1 또는 NS2 등과 같은 비구조 단백질이 결핍되어 있으며(문헌 [Randhawa et al, 1997, J. Virol. 71:9849-9854] 참조) 유전자 순서가 뉴모바이러스와는 다르다 (RSV: '3-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5', APV: '3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5') (Lung, et al, 1992, J. Gen. Virol. 73:1709-17 15; Yu, et al, 1992, Virology 186:426-434; Randhawa, et al, 1997, J. Virol. 71:9849-9854).
또한, 본 발명의 포유류 MPV는 이의 면역학적 특성으로 동정할 수 있다. 일 구체예에서, 포유류 MPV를 중성화시킬 수 있는, 특정 항 혈청이 포유류 MPV에 대해 발생할 수 있다. 일 구체예에서, 또한 포유류 MPV를 중성화시킬 수 있는, 모노클로날 및 폴리클로날 항체가 MPV에 대해 발생할 수 있다 (PCT WO 02/057302의 페이지 _에서 _참조, 이를 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킴).
본 발명의 포유류 MPV는 포유류 숙주, 즉 포유류 배양 세포 또는 포유동물을 감염시키는 능력으로 더욱 특징된다. APV와 달리, 포유류 MPV는 닭 및 칠면조 등에서 매우 낮은 수준으로만 복제되거나 복제되지 않는다. 그러나, 포유류 숙주, 예컨대 시나몰거스 머카크(cynomolgous macaques) 등에서는 복제된다. 보다 특정한 일 구체예에서, 포유류 MPV는 이의 포유류 숙주에서의 복제능으로 더욱 특징된다. 더욱 특정의 일 구체예에서, 포유류 MPV는 포유류 숙주에서 상기 포유류 MPV의 게놈에 의해 암호화되는 단백질을 발현시킬 수 있는 능력으로 더욱 특징된다. 보다 더욱 특정의 일 구체예에서, 포유류 MPV에 의해 발현되는 바이러스 단백질은 포유류 숙주의 세포질막으로 삽입된다. 일 구체예에서, 본 발명의 포유류 MPV는 포유류 숙주를 감염시켜서 포유류 숙주가 상기 포유류 MPV의 새로운 감염 바이러스 입자를 생성하도록 야기한다. 본 발명의 기능적 특성에 대한 보다 구체적인 설명은 이하 5.1.2를 참조한다.
일 구체예에서, 전자 현미경에서의 바이러스의 외관이나 클로로포름에 대한 이의 감응성을 사용하여 바이러스가 포유류 MPV인지 동정할 수 있다. 본 발명의 포유류 MPV는 전자현미경에서 파라믹소바이러스와 유사한 입자로 관찰된다. 일관성있게, 포유류 MPV는 클로로포름 처리에 민감하며, 포유류 MPV는 tMK 세포 또는 기능적으로 이와 동등한 세포에서 최적으로 배양되며 대부분의 세포 배양에서 필수적으로 트립신 의존적이다. 또한, 포유류 MPV는 전형적인 세포 변형 효과(CPE)를 가지며 적혈구 세포 종에 대한 혈구응집 활성이 결핍되어 있다. MPV 분리주에 의해 유도되는 CPE는 hRSV에 의해 유도되는 CPE와 유사한데, 특징적인 합포체가 형성되고 이어서 빠르게 세포 내부가 파괴되고 이후 배양 플레이트에서 떨어져 나간다. 비록 대부분의 파라믹소바이러스가 혈구 응집 활성을 갖지만, 뉴모바이러스의 대부분은 그렇지 않다 (Pringle, CR. In: The Paramyxoviruses; (ed. D. W. Kingsbury) 1-39 (Plenum Press, New York, 1991)). 포유류 MPV는 M2 단백질을 암호화하는 핵산 단편에 제2의 중첩되는 ORF(M2-2)를 함유한다. 이러한 제2 중첩 ORF의 존재는 문헌 [Ahmadian et al, 1999, J. Gen. Vir. 80:2011-2016] 등에 개시된 바와 같이 다른 뉴모바이러스에서 발생한다.
일 구체예에 있어서, 본 발명은 포유류 MPV로서 바이러스 분리주를 동정하는 방법을 제공한다. 시험용 샘플을 예컨대 동물 또는 인간으로부터 얻을 수 있다. 이어서 상기 샘플에 대해서 뉴모비리네 서프패밀리의 바이러스 존재를 시험한다. 뉴모비리네 서프패밀리의 바이러스가 존재하면, 상기 바이러스에 대해서 본 발명에서 개시한 바와 같은, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, 포유류 MPV와의 계통학적 관련성, 포유류 MPV의 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성, 포유류 MPV의 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성/상동성, 및 게놈 구성 등과 같은, 포유류 MPV의 임의 특징에 대해 시험한다. 또한 상기 바이러스에 대해, MPV 분리주로부터의 핵산 서열을 사용한 교차 혼성화법, 포유류 MPV에 대해 특이적인 프라이머를 사용하는 RT-PCR, 또는 포유류 MPV 분리주에 대한 항체를 이용하는 고전적인 교차 혈청학적 실험 등을 통해서 포유류 MPV임을 동정할 수 있다. 다른 일 구체예에서, 포유류 MPV는, 동물 항혈청을 사용한 정량적 중성화법을 통해 측정하는 바와 같은, 면역학적 차이점을 기초로 동정할 수 있다. 항혈청은 예컨대, 포유류 MPV에 의해 감염된 페렛, 돼지, 마카크 등으로부터 얻을 수 있다 (실시예 8 참조).
일 구체예에서, 혈청형은 양 방향으로 상동성에서 이종성으로 역가비율 >16으로 나타난다. 중성화가 양 방향이나 한쪽 방향으로 두 바이러스 사이에서 어느 정도 교차 반응을 보이면(8이나 16의 상동성에서 이종성의 역가 비율), DNA 서열의 실질적인 생물리적/생화학적 차이가 존재하면 혈청형의 차이로 간주한다. 중성화가 양 방향이나 한쪽 방향에서 두 바이러스 사이에서 교차 반응이 다른 정도로 나타나면 (8보다 작은 상동성에서 이종성으로의 역가 비율), 실험 중인 분리주의 혈청형의 동일성으로 간주한다. MPV 분리주 00-1로도 공지된 본 명세서의 분리주 I-2614를 프로토타입으로 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 서열 또는 기탁을 통해서 본 발명에서 개시한 바이러스 분리주의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 비교하여 바이러스 단백질 또는 핵산의 서열 상동성/동일성을 수단으로 포유류 MPV로 동정할 수 있다. 구체적으로, L 단백질, M 단백질, N 단백질, P 단백질, 또는 F 단백질을 암호화하는 핵산에 대한, 바이러스 게놈과 파리 소재의 CNCM에 I-2614로 기탁된 바이러스 분리주의 핵산 동일성 비율이, 본 발명에서 확인한 비율보다 높고 APV-C와 비교한 것보다 낮은 핵산 서열을 포함하는 경우 포유류 MPV로 동정한다 (표 1 참조)(PCT WO 02/05302의 페이지 12 내지 19 참조, 이를 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킴). 이론에 제한되지 않고, 일반적으로 공지된 바에 의하면, 바이러스 종, 특히 RNA 바이러스 종은 대개, 바이러스 집단의 구성원들이 서열 이종성을 나타내는 유사 종들(quasi species)로 구성된다. 따라서, 각 개별 분리주는 APV-C와 비교시, 서열 동일성 비율이 어느 정도 차이가 있을 수 있다.
지금까지 알려진 동일 패밀리의 임의 기타 바이러스와 MPV 단백질 간의 가장 높은 아미노산 서열 동일성은 APV-C와 인간 MPV 사이의 동일성이다. 서열 목록에서 주어진 서열과 비교시 유추할 수 있는 바로서, 인간 MPV와 APV-C사이에서, 메트릭스 단백질에 대한 아미노산 서열 동일성은 87%, 핵단백질은 88%, 인단백질은 68%, 융합 단백질은 81%, 폴리머라제 단백질의 일부에 대해서는 56-64%이다. 하기 표 1을 참조한다. 이들 최대값을 비교하여 보다 높은 상동성을 갖는 단백질을 암호화하는 ORF를 함유하는 바이러스 분리주를 MPV로 간주한다. 주목할 것은, 다른 바이러스와 유사하게, 포유류 MPV의 다른 분리주 사이에서 어느 정도 편차가 발견된다는 점이다. 하기 표 1은 다른 파라믹소바이러스와 MPV ORF 사이의 아미노산 서열 동일성을 나타낸다.
N P M F M2-1 M2-2 L
APV A 69 55 78 67 72 26 64
APV B 69 51 76 67 71 27 -2
APV C 88 68 87 81 84 56 -2
hRSV A 42 24 38 34 36 18 42
hRSV B 41 23 37 33 35 19 44
bRSV 42 22 38 34 35 13 44
PVM 45 26 37 39 33 12 -2
기타 3 7-11 4-9 7-10 10-18 -4 -4 13-14
각주:
1.공지의 G 및 SH 단백질과의 서열 상동성이 없어 배제함.
2. 서열 입수불가능.
3. 기타 : 인간 파라인플루엔자 바이러스 제2형 및 제3형, 센다이 바이러스, 홍역 바이러스, 니파 바이러스, 바다표범 디스템퍼 바이러스, 및 뉴캐슬병 바이러스.
4. 바이러스 게놈에 ORF 없음.
일 구체예에서, 본 발명은 포유류 MPV를 제공하는데, 이때 상기 포유류 MPV의 SH 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 382(분리주 NL/1/00의 SH 단백질; 표 14 참조)의 아미노산 서열과, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상 동일하다. 서열번호 382(분리주 NL/1/00의 SH 단백질; 표 14 참조)와 30% 이상 동일한 SH 단백질을 포함하는 분리된 음성 센스 단일 가닥 RNA 메타뉴모바이러스는 포유류 숙주를 감염시킬 수 있다. 일 구체예에서, 서열번호 382(분리주 NL/1/00의 SH 단백질; 표 14 참조)와 30% 이상 동일한 SH 단백질을 포함하는 분리된 음성 센스 단일 가닥 RNA 메타뉴모바이러스는 포유류 숙주에서 복제가능하다. 일 구체예에서, 포유류 MPV는 서열번호 382(분리주 NL/1/00의 SH 단백질; 표 14 참조)과 30% 이상 동일한 SH 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 포유류 MPV를 제공하는데, 이때 포유류 MPV의 G 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 322 (분리주 NL/1/00의 G 단백질; 표 14 참조)의 아미노산 서열과 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상 동일하다. 서열번호 322 (분리주 NL/1/00의 G 단백질; 표 14 참조)와 20% 이상 동일한 G 단백질을 포함하는 분리된 음성 센스 단일 가닥 RNA 메타뉴모바이러스는 포유류 숙주를 감염시킬 수 있다. 서열번호 322 (분리주 NL/1/00의 G 단백질; 표 14 참조)와 20% 이상 동일한 G 단백질을 포함하는 분리된 음성 센스 단일 가닥 RNA 메타뉴모바이러스는 포유류 숙주에서 복제가능하다. 일 구체예에서, 포유류 MPV는 서열번호 322 (분리주 NL/1/00의 G 단백질; 표 14 참조)와 20% 이상 동일한 G 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 포유류 MPV를 제공하는데, 이때 상기 포유류 MPV의 L 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 330(분리주 NL/1/00의 L 단백질; 표 14 참조)의 아미노산 서열과 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상 동일하다. 서열번호 330(분리주 NL/1/00의 L 단백질; 표 14 참조)와 85% 이상 동일한 L 단백질을 포함하는 상기 분리된 음성 센스 단일 가닥 RNA 메타뉴모바이러스는 포유류 숙주를 감염시킬 수 있다. 일 구체예에서, 서열번호 330(분리주 NL/1/00의 L 단백질; 표 14 참조)와 85% 이상 동일한 L 단백질을 포함하는 분리된 음성 센스 단일 가닥 RNA 메타뉴모바이러스는 포유류 숙주에서 복제가능하다. 일 구체예에서, 포유류 MPV는 서열번호 330(분리주 NL/1/00의 L 단백질; 표 14 참조)와 85% 이상 동일한 L 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 포유류 MPV를 제공하며, 이때, 상기 포유류 MPV의 N 단백질의 아미노산 서열은, 서열번호 366의 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상 동일하다. 서열번호 366의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 N 단백질을 포함하는 분리된 음성 센스 단일 가닥 RNA 메타뉴모바이러스는 포유류 숙주를 감염시킬 수 있다. 일 구체예에서, 서열번호 366의 아미노산 서열과 90% 동일한 N 단백질을 포함하는 분리된 음성 센스 단일 가닥 RNA 메타뉴모바이러스는 포유류 숙주에서 복제가능하다. 상기 아미노산 동일성은 N 단백질의 전체 길이에 걸쳐서 산출한 것이다. 일 구체예에서, 포유류 MPV는 서열번호 366의 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 N 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한, 포유류 MPV를 제공하는데, 이때, 상기 포유류 MPV의 P 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 374의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 동일하다. 서열번호 374의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 P 단백질을 포함하는 상기 포유류 MPV는 포유류 숙주를 감염시킬 수 있다. 일 구체예에서, 서열번호 374의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 P 단백질을 포함하는 포유류 MPV는 포유류 숙주에서 복제가능하다. 상기 아미노산 동일성은 P 단백질의 전체 길이에 걸쳐서 산출한 것이다. 일 구체예에 있어서, 포유류 MPV는 서열번호 374의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 동일한 P 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한, 포유류 MPV를 제공하며, 여기서, 포유류 MPV의 M 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 358의 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 동일하다. 서열번호 358의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 M 단백질을 포함하는 포유류 MPV는 포유류 숙주를 감염시킬 수 있다. 일 구체예에서, 서열번호 358의 아미노산 서열과 90% 동일한 M 단백질을 포함하는 분리한 음성 센스 단일 가닥 RNA 메타뉴모바이러스는 포유류 숙주에서 복제가능하다. 상기 아미노산 동일성은 M 단백질의 전체 길이에 걸쳐 산출한 것이다. 일 구체예에서, 포유류 MPV는 서열번호 358의 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 동일한 M 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한, 포유류 MPV를 제공하는데, 이때, 상기 포유류 MPV의 F 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 314의 아미노산 서열과 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 동일하다. 서열번호 314의 아미노산 서열과 85% 이상 동일한 f 단백질을 포함하는 포유류 MPV는 포유류 숙주를 감염시킬 수 있다. 일 구체예에서, 서열번호 314의 아미노산 서열과 85% 동일한 F 단백질을 포함하는 분리된 음성 센스 단일 가닥 RNA 메타뉴모바이러스는 포유류 숙주에서 복제가능하다. 상기 아미노산 동일성은 F 단백질의 전체 길이에 걸쳐서 산출한 것이다. 일 구체예에서, 포유류 MPV는 서열번호 314의 아미노산 서열과 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 동일한 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한, 포유류 MPV를 제공하는데, 이때 상기 포유류 MPV의 M2-1 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 338의 아미노산 서열과 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 동일하다. 서열번호 338의 아미노산 서열과 85% 이상 동일한 M2-1 단백질을 포함하는 포유류 MPV는 포유류 숙주를 감염시킬 수 있다. 일 구체예에서, 서열번호 338의 아미노산 서열과 85% 동일한 M2-1 단백질을 포함하는 분리한 음성 센스 단일 가닥 RNA 메타뉴모바이러스는 포유류 숙주에서 복제가능하다. 상기 아미노산 동일성은 M2- 1 단백질의 전체 길이에 걸쳐서 산출한 것이다. 일 구체예에서, 포유류 MPV는 서열번호 338의 아미노산 서열과 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 동일한 M2-1 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한, 포유류 MPV를 제공하며, 이때 상기 포유류 MPV의 M2-2 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 346의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 동일하다. 서열번호 346의 아미노산 서열과 60% 이상 동일한 M2-2 단백질을 포함하는 분리된 포유류 MPV는 포유류 숙주를 감염시킬 수 있다. 일 구체예에서, 서열번호 346의 아미노산 서열과 60% 동일한 M2-2 단백질을 포함하는 분리된 음성 센스 단일 가닥 RNA 메타뉴모바이러스는 포유류 숙주에서 복제가능하다. 상기 아미노산 동일성은 M2-2 단백질의 전체 길이에 걸쳐서 산출한 것이다. 일 구체예에서, 포유류 MPV는 서열번호 346의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 동일한 M2-2 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명에서는 포유류 MPV를 제공하는데, 이때 상기 음성 센스 단일 가닥 RNA 메타뉴모바이러스는, (i) 서열번호 366에 대해 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 N 단백질; (ii) 서열번호 374의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 P 단백질; (iii) 서열번호 358에 대해 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 M 단백질; (iv) 서열번호 314에 대해 85% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 F 단백질; (v) 서열번호 338에 대해 85% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 M2-1 단백질; 및 (vi) 서열번호 346에 대해 60% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 M2-2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 단백질, 3 이상의 단백질, 4 이상의 단백질, 5 이상의 단백질, 또는 6 이상의 단백질을 암호화한다.
본 발명은 포유류 MPV의 2 서브그룹, 즉 서브그룹 A 및 서브그룹 B를 제공한다. 본 발명은 또한 4종의 변이체 Al, A2, Bl 및 B2를 제공한다. 분리주 99-1(서열번호 18)보다 분리주 00-1(서열번호 19)에 대해 계통분류학적으로 보다 가까우면 포유류 MPV는, 서브그룹 A의 구성원이라고 할 수 있다. 계통 분류학적으로 분리주 00-1(서열번호 19)보다 분리주 99-1(서열번호 18)에 보다 가까우면, 포유류 MPV는 서브그룹 B의 구성원이라고 할 수 있다. 다른 구체예에서, 개별 ORF의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 상동성을 사용하여 포유류 MPV를 서브그룹 A 또는 B에 속하는 지 분류할 수 있다.
포유류 MPV의 상이한 분리주들은 4 종의 상이한 변이체로 분류할 수 있는데, 즉 변이체 Al, 변이체 A2, 변이체 Bl 및 변이체 B2이다. 상기 분리주 00-1 (서열번호 19)은 포유류 MPV의 변이체 Al의 예이다. 상기 분리주 99-1 (서열번호 18)는 포유류 MPV의 변이체 Bl의 예이다. 포유류 MPV는 계통학적 분석법을 사용하여 상기 4 변이체 중 하나로 분류할 수 있다. 따라서, 포유류 MPV의 다른 변이체의 구성원에 대하여 계통학적으로 관련된 것보다, 특정 변이체의 알려진 구성원에 대하여 계통학적으로 보다 가까우면, 포유류 MPV는 상기 특정 변이체에 속한다. N, P, L, M, SH, G, M2 또는 F 폴리펩티드를 포함하여, 특정 서브그룹 또는 변이체에 속하는지에 대해 MPV 분리주의 유형을 확인하는데 임의 ORF 및 암호화된 폴리펩티드의 서열을 사용할 수도 있다. 특정 구체예에서, 포유류 MPV를 변이체에 대해 분류하는 것은 G 단백질의 서열을 기초로 한다. 이론에 제한되지 않고, 포유류 MPV의 상이한 변이체의 F 단백질 간의 변이도가 높기 때문에 상기 G 단백질의 서열은 계통 분류학적 분석에 매우 적합하다.
본 발명의 일 구체예에서, 서열 상동성은 이하 기술하는 바와 같은, 특정 조건하에서 혼성화되는 두 서열의 능력을 통해서 측정할 수 있다. 포유류 MPV의 핵산, 또는 이의 역 상보성, 또는 상보적인 핵산과 혼성화하는 핵산을 본 발명의 방법에 사용하여 서로에 대한 이들 서열의 상동성 및 동일성을 측정할 수 있다. 일 구체예에서, 핵산을 고엄격 조건하에서 혼성화시킨다.
당업자에 잘 알려진 바에 따르면, 혼성화 조건은, 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대 온도, 염 농도, pH, 포름아미드 농도 등이 포함된다(예컨대, 문헌 [Sambrook et al., 1989, Chapters 9 to 115 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York] 참조, 본 발명에서 전체로 참조 문헌으로 포함시킴). 일 구체예에서, 혼성화는 수용액에서 수행하며 상기 용액의 이온 강도는 일정하게 유지하는 한편, 혼성화시키는 서열간의 서열 상동성 정도에 따라서 혼성화 온도는 다양하게 된다. 서로에 대하여 100% 동일하고 200 bp 보다 긴 DNA 서열에 대한 혼성화는 완벽한 하이브리드의 용융점(Tm)보다 대략 15-25℃ 낮은 온도에서 수행한다. 용융점(Tm)은 다음의 식을 사용하여 산출할 수 있다 (Bolton and McCarthy, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1390):
Tm = 81.5℃ - 16.6(loglO[Na+]) + (%G+C) - 0.63(포름아미드%) - (600/l)
상기 식에서, (Tm)은 용융점, [Na+]는 나트륨 농도, G+C는 구아닌과 시토신의 함량이며, l은 하이브리드의 길이 (bp)이다. 서열간 미스매치의 결과는 Bonner 등에 의한 식을 사용하여 산출할 수 있다: 하이브리드 내 베이스 미스매치의 매 1% 마다, 용융점을 1-1.5℃ 만큼 떨어뜨린다.
따라서, 두 서열이 혼성화하는 온도를 결정하여서, 당분야의 당업자는 알려진 서열에 대해서 서열이 얼마나 유사한지 평가할 수 있다. 이는 예컨대, 완전하게 매치하여 하이브리드하는 알려진 서열에 대해서 산출한 혼성화 온도와 경험에 의해 측정된 혼성화 온도를 비교하여서 수행할 수 있다. Bonner 등의 수식을 이용하여서, 혼성화 온도와 미스매치 비율간의 관련성을 이용하여 서열 유사성에 대한 정보를 제공할 수 있다.
예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 고엄격 조건을 사용하는 과정은 다음과 같을 수 있다. 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 및 500 ug/ml의 변성 연어 정자 DNA로 구성된 완충액 중에서 65℃에서 8시간 내지 밤새, DNA를 포함하는 필터의 예비혼성화를 수행한다. 100 ug/ml 변성 연어 정자 DNA 및 5-20 X 106 cpm의 32P-표지화된 프로브를 함유하는 예비혼성화 혼합물에서 65℃에서 48시간 동안 필터를 혼성화시킨다. 필터의 세척은 37℃에서 1시간 동안, 2X SSC, 0.01% PVP, 0.01% Ficoll, 및 0.01% BSA를 함유하는 용액에서 수행한다. 이후 50℃에서 45분 동안 0.1X SSC에서 세척하고 방사선 자동 사진법을 수행한다. 이용할 수 있는 기타 고엄격 조건은 당분야에서 공지이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 혼성화는 저엄격 조건의 온화한 조건하에서 수행하는데, 이러한 조건은 당분야의 당업자들에게 공지이다 (예컨대, 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Ausubel et al., eds., in the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1997 Current Protocols,(c) 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.]참조함, 이들을 전체로 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킴). 예시적인 저엄격 조건은 다음의 완충계로 제공된다: 35% 포름아미드, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.2% BSA, 100 ug/ml 변성 연어 정자 DNA, 및 10% (wt/vol) 덱스트란 설페이트를 포함하는 완충제 내에서, 40℃에서 18-20시간 동안 혼성화를 수행하고, 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, 및 0.1% SDS를 포함하는 완충제에서 55℃에서, 1.5시간 동안 세척하며, 이후 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, 및 0.1% SDS를 포함하는 완충제에서 60℃에서 1.5시간 동안 세척해 준다.
일 구체예에서, 포유류 MPV의 특정 변이체에 특이적인 프로브를 사용하여 변이체 중 하나로 포유류 MPV를 분류할 수 있다. 이러한 프로브들로는 RT-PCR용 프라이머 및 항체 등을 포함한다. 특정 변이체의 구성원으로서 포유류 MPV를 동정하기 위한 예시적인 방법은 이하의 섹션 5.9에 기술하였다.
본 발명의 일 구체예에서, 포유류 MPV의 상이한 변이체들은, 상이한 바이러스 단백질의 아미노산 서열을 통해서 이들 서로를 구별할 수 있다. 다른 구체예에서, 포유류 MPV의 상이한 변이체들은 바이러스 게놈을 통해서 암호화되는 상이한 ORF의 뉴클레오티드 서열을 통해서 이들 서로에 대해 구별할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 포유류 MPV의 변이체는 Al, A2, Bl 또는 B2이다. 그러나, 본 발명은 또한, 아직 동정되지 않은 다른 변이체의 구성원인 포유류 MPV의 분리주도 고려한다. 본 발명은 또한, 바이러스가, 하나의 변이체와 밀접하게 관련있는 하나 이상의 ORF 및 다른 변이체와 계통 분류학적으로 밀접하게 관련된 하나 이상의 ORF를 가질 수 있다는 것을 고려한다. 이러한 바이러스는 이의 ORF의 다수가 밀접하게 계통 분류학적으로 관련되어 있는 변이체인 것으로 분류한다. 비코딩 서열을 또한 계통 분류적 관련성을 결정하기 위해 사용할 수 있다.
포유류 MPV의 분리주가 다음의 기타 바이러스 분리주, NL/1/00 (서열번호 19), NL/17/00 (서열번호 20) 및 NL/1/94 (서열번호 21) 중 임의의 분리주와의 관련성보다는 바이러스 분리주 NL/1/99 (서열번호 18)와 계통 분류학적으로 보다 밀접하게 관련되어 있으면, 상기 포유류 MPV 분리주는 변이체 B1으로 분류한다. 포유류 MPV를 변이체로 분류하는데 포유류 MPV의 하나 이상의 ORF를 사용할 수 있다. 포유류 MPV의 G 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/1/99로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B1의 G 단백질 (서열번호 324)과 66% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 이의 N 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/1/99로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B1의 N 단백질 (서열번호 368)과 98.5% 이상, 또는 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 이의 P 단백질의 아미노산 서열이 프로토타입 NL/1/99로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B1의 P 단백질 (서열번호 376)과 96% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 이의 M 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/1/99로 표시되는 포유류 MPV 변이체 Bl의 M 단백질 (서열번호 360)과 동일하면; 이의 F 단백질의 아미노산 서열이 프로토타입 NL/1/99로 표시되는 포유류 MPV 변이체 Bl의 F 단백질 (서열번호 316)과 99% 이상 동일하면; 이의 M2-1 단백질의 아미노산 서열이 프로토타입 NL/1/99로 표시되는 포유류 MPV 변이체 Bl의 M2-1 단백질 (서열번호 340)과 98% 이상 또는 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 이의 M2-2 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/1/99로 표시되는 포유류 MPV 변이체 Bl의 M2-2 단백질의 아미노산 서열 (서열번호 348)과 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 이의 SH 단백질의 아미노산 서열이 프로토타입 NL/1/99로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B1의 SH 단백질 (서열번호 384)과 83% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 및/또는 이의 L 단백질이 프로토타입 NL/1/99로 표시되는 포유류 MPV 변이체 Bl의 L 단백질 (서열번호 332)과 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면, 상기 포유류 MPV는 MPV 변이체 B1으로 분류할 수 있다.
포유류 MPV의 분리주가 다음의 기타 바이러스 분리주 NL/1/99 (서열번호 18), NL/17/00 (서열번호 20) 및 NL/1/94 (서열번호 21) 중 임의이ㅡ 분리주와 계통 분류학적으로 관련된 것보다 바이러스 분리주 NL/1/00 (서열번호 19)과 계통 분류학적으로 보다 밀접하게 관련되어 있으면, 상기 포유류 MPV의 분리주를 변이체 A1으로 분류한다. 포유류 MPV의 하나 이상의 ORF를 상기 포유류 MPV를 변이체로 분류하는데 사용할 수 있다. 포유류 MPV의 G 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/1/00로 표시되는 MPV 변이체 Al의 G 단백질 (서열번호 322)과 66% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 이의 N 단백질의 아미노산 서열이 프로토타입 NL/1/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 Al의 N 단백질 (서열번호 366)과 99.5% 이상 동일하면; 이의 P 단백질의 아미노산 서열이 프로토타입 NL/1/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 Al의 P 단백질 (서열번호 374)과 96% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 이의 M 단백질의 아미노산 서열이 프로토타입 NL/1/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 Al의 M 단백질 (서열번호 358)과 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 이의 F 단백질의 아미노산 서열이 프로토타입 NL/1/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 Al의 F 단백질 (서열번호 314)과 98% 이상 또는 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 이의 M2-1 단백질의 아미노산 서열이 프로토타입 NL/1/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 Al의 M2-1 단백질 (서열번호 338)과 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 이의 M2-2 단백질의 아미노산 서열이 프로토타입 NL/1/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 Al의 M2-2 단백질 (서열번호 346)과 96% 이상 또는 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 이의 SH 단백질의 아미노산 서열이 프로토타입 NL/1/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 Al의 SH 단백질 (서열번호 382)과 84% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 및/또는 이의 L 단백질의 아미노산 서열이 프로토타입 NL/1/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 Al의 L 단백질 (서열번호 330)과 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면, 상기 포유류 MPV는 MPV 변이체 A1으로 분류한다.
포유류 MPV의 분리주가 다음의 바이러스 분리주 NL/1/99 (서열번호 18), NL/1/00 (서열번호 19) 및 NL/1/94 (서열번호 21) 중의 임의의 분리주와의 관련성보다 바이러스 분리주 NL/17/00 (서열번호 20)과 계통 분류학적으로 보다 밀접하게 관련되면 상기 포유류 MPV 분리주는 변이체 A2로 분류한다. 포유류 MPV의 하나 이상의 ORF를 포유류 MPV를 변이체로 분류하는데 사용할 수 있다. 포유류 MPV의 G 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/17/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 G 단백질 (서열번호 323)과 66% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 이의 N 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/17/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 N 단백질 (서열번호 367)과 99.5% 이상 동일하면; 포유류 MPV의 P 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/17/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 P 단백질 (서열번호 375)과 96% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 포유류 MPV의 M 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/17/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 M 단백질 (서열번호 359)과 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 포유류 MPV의 F 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/17/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 F 단백질 (서열번호 315)과 98% 이상, 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 포유류 MPV의 M2-1 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/17/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-1 단백질 (서열번호 339)과 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 포유류 MPV의 M2-2 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/17/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-2 단백질 (서열번호 347)과 96% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 포유류 MPV의 SH 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/17/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 SH 단백질 (서열번호 383)과 84% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 포유류 MPV의 L 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/17/00으로 표시되는 포유류 MPV 변이체 A2의 L 단백질 (서열번호 331)과 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면, 포유류 MPV는 MPV 변이체 A2로 분류할 수 있다.
포유류 MPV의 분리주가 다음의 바이러스 분리주 NL/1/99 (서열번호 18), NL/1/00 (서열번호 19) 및 NL/17/00 (서열번호 20) 중의 임의의 분리주와의 관련성보다 바이러스 분리주 NL/1/94 (서열번호 21)와 계통 분류학적으로 보다 밀접하게 관련되면 상기 포유류 MPV 분리주는 변이체 B2로 분류한다. 포유류 MPV의 ORF의 하나 이상을 포유류 MPV를 변이체로 분류하는데 사용할 수 있다. 포유류 MPV의 G 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/1/94로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 G 단백질 (서열번호 325)과 66% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 이의 N 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/1/94로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 N 단백질 (서열번호 369)과 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 포유류 MPV의 P 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/1/94로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 P 단백질 (서열번호 377)과 96% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 포유류 MPV의 M 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/1/94로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 M 단백질 (서열번호 361)과 동일하면; 포유류 MPV의 F 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/1/94로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 F 단백질 (서열번호 317)과 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 포유류 MPV의 M2-1 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/1/94로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-1 단백질 (서열번호 341)과 98% 이상, 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 포유류 MPV의 M2-2 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/1/94로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-2 단백질 (서열번호 349)과 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 포유류 MPV의 SH 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/1/94로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 SH 단백질 (서열번호 385)과 84% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면; 포유류 MPV의 L 단백질의 아미노산 서열이, 프로토타입 NL/1/94로 표시되는 포유류 MPV 변이체 B2의 L 단백질 (서열번호 333)과 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일하면, 포유류 MPV는 MPV 변이체 B2로 분류할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 서열 동일성의 비율은 전체 길이 단백질의 정렬을 기초로 한 것이다. 다른 구체예에서, 상기 서열 동일성의 비율은 단백질의 인접하는 아미노산 서열을 정렬시킨 것을 기초로 한 것인데, 여기서 상기 아미노산 서열은 길이가 25 아미노산, 50 아미노산, 75 아미노산, 100 아미노산, 125 아미노산, 150 아미노산, 175 아미노산, 200 아미노산, 225 아미노산, 250 아미노산, 275 아미노산, 300 아미노산, 325 아미노산, 350 아미노산, 375 아미노산, 400 아미노산, 425 아미노산, 450 아미노산, 475 아미노산, 500 아미노산, 750 아미노산, 1000 아미노산, 1250 아미노산, 1500 아미노산, 1750 아미노산, 2000 아미노산 또는 2250 아미노산일 수 있다.
5.2 포유류 MPV 의 기능적 특징
상기 포유류 MPV의 구조적 정의 이외에도, 포유류 MPV는 또한 이의 기능적 특징으로 정의할 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 포유류 MPV는 포유류 숙주를 감염시킬 수 있다. 상기 포유류 숙주는 포유류 세포, 조직, 장기 또는 포유 동물일 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 포유류 숙주는 인간 또는 인간 세포, 조직 또는 장기일 수 있다. 당분야의 당업자에게 공지인 임의 방법을 사용하여 상기 포유류 숙주가 포유류 MPV로 감염되었는지 여부를 시험할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 바이러스가 포유류 세포에 부착하는 능력을 시험한다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스에 대해서 이의 게놈을 포유류 세포로 전달할 수 있는 능력을 시험한다. 예시적인 구체예에서, 바이러스의 게놈을 검출가능한 표지, 예컨대 방사선 동위원소로 표지화한다. 이어서 상기 바이러스를 포유류 세포와 1 분 이상, 5 분 이상, 15 분 이상, 30 분 이상, 1 시간 이상, 2 시간 이상, 5 시간 이상, 12 시간 이상, 또는 1 일 이상 배양시킨다. 상기 세포를 이후 세척하여서 세포로부터 임의 바이러스 입자를 제거하고나서 검출가능한 표지를 통해서 바이러스 게놈의 존재를 시험한다. 다른 구체예에서, 포유류 MPV 특이적 프라이머를 이용하는 RT-PCR을 사용하여 상기 세포 내 바이러스 게놈의 존재를 검출한다 (PCT WO 02/057302의 pp. 37 내지 44를 참조하며, 이를 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다).
일 구체예에서, 상기 포유류 바이러스는 포유류 숙주를 감염시킬 수 있으며 이 포유류 MPV의 단백질이 포유류 숙주의 세포질막에 삽입되도록 할 수 있다. 상기 포유류 숙주는 배양한 포유류 세포, 장기, 조직 또는 포유동물일 수 있다. 예시적인 구체예에서, 포유류 세포를 포유류 바이러스와 함께 배양한다. 이후 세포 표면으로부터 바이러스가 제거되는 조건하에서 상기 세포를 세척한다. 당업자에게 공지인 임의 기술을 사용하여 상기 포유류 세포의 세포질막에 삽입된, 새롭게 발현된 바이러스 단백질을 검출할 수 있다. 예를 들어, 세포를 바이러스로 감염시킨 후, 상기 세포를 검출가능하게 표지된 아미노산을 포함하는 배지에서 유지시킨다. 이후, 상기 세포를 회수하고, 용출시켜서 세포질 분획을 막 분획과 분리한다. 이후 막 분획의 단백질을 가용화시키고, 포유류 MPV의 단백질, 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니나, F 단백질 또는 G 단백질 등에 특이적인 항체를 사용하여 면역침강법을 실시한다. 이후, 면역침강된 단백질에 대해서 SDS PAGE를 실시한다. 다음으로, 바이러스 단백질의 존재 여부를 방사선 자동 사진법으로 검출할 수 있다. 다른 구체예에서, 숙주 세포의 세포질막 내 바이러스 단백질의 존재 여부는 상기 포유류 MPV의 단백질에 특이적인 하나 이상의 항체를 사용하여 면역세포화학법으로 검출할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 포유류 MPV는 포유류 숙주를 감염시킬 수 있고 이 포유류 숙주 내에서 복제될 수 있다. 상기 포유류 숙주는 배양된 포유류 세포, 장기, 조직 또는 포유동물일 수 있다. 당업자에게 공지인 임의 기술을 사용하여 바이러스가 포유류 세포를 감염시키고 그 포유류 숙주 내에서 복제할 수 있는지 확인할 수 있다. 특정 구체예에서, 포유류 숙주를 바이러스로 감염시킨다. 이후 상기 세포를 30 분 이상, 1 시간 이상, 2 시간 이상, 5 시간 이상, 12 시간 이상, 1일 이상, 또는 2일 이상 유지시킨다. 바이러스 게놈에 특이적인 프로브를 사용하여 발생부위(in situ) 혼성화, RT-PCR, 또는 노던 블랏을 사용하여 세포 내 바이러스 게놈 RNA의 수준을 모니터링할 수 있다. 바이러스 게놈 RNA의 증가를 통해서 상기 바이러스가 포유류 세포를 감염시킬 수 있고 포유류 세포 내에서 복제될 수 있음을 증명할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 포유류 MPV는 포유류 숙주를 감염시킬 수 있는데, 여기서 상기 감염으로 인하여 포유류 숙주는 새로운 감염성 포유류 MPV를 생산하게 된다. 상기 포유류 숙주는 배양한 포유류 세포 또는 포유동물일 수 있다. 당업자에게 공지인 임의 기술을 사용하여 바이러스가 포유류 숙주를 감염시킬 수 있고 상기 포유류 숙주가 새로운 감염성 바이러스 입자를 생산하게 되는지 확인할 수 있다. 일례에서, 포유류 세포를 포유류 바이러스로 감염시킨다. 이후 상기 세포를 세척하고 30 분 이상, 1 시간 이상, 2 시간 이상, 5 시간 이상, 12 시간 이상, 1일 이상, 2일 이상, 1주일 이상, 또는 12일 이상 배양한다. 바이러스의 역가는 당업자에게 공지인 임의 방법으로 모니터링할 수 있다. 예시적인 방법은 섹션 5.8을 참조한다.
특정 일 구체예에서, 상기 포유류 MPV은 인간 MPV이다. 본 섹션에서 기술하는 시험법은 또한 인간 MPV를 사용하여 수행할 수 있다. 일 구체예에서, 인간 MPV는 포유류 숙주, 예컨대 포유 동물 또는 포유류의 배양 세포를 감염시킬 수 있다.
일 구체예에서, 인간 MPV는 포유류 숙주를 감염시킬 수 있고 인간 MPV의 단백질이 포유류 숙주의 세포질막에 삽입되도록 할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 인간 MPV는 포유류 숙주를 감염시킬 수 있고 그 포유류 숙주 내에서 복제될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 인간 MPV는 포유류 숙주를 감염시킬 수 있으며 그 포유류 숙주 내에서 복제될 수 있는데, 여기서 감염 및 복제에 의하여 상기 포유류 숙주가 새로운 감염성 인간 MPV를 생산하고 패키징하게 된다.
일 구체예에서, 상기 포유류 MPV는 비록 포유류 숙주를 감염시킬 수 있지만, 조류 숙주, 예컨대 새, 또는 조류 세포의 배양물도 감염시킬 수 있다. 일 구체예에서, 포유류 MPV는 조류 숙주를 감염시킬 수 있고 이 조류 숙주의 세포질막에 상기 포유류 MPV의 단백질이 삽입되도록 할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 포유류 MPV는 조류 숙주를 감염시킬 수 있으며 이 조류 숙주 내에서 복제될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 포유류 MPV는 조류 숙주를 감염시킬 수 있고, 이 조류 숙주 내에서 복제될 수 있는데, 이러한 감염 및 복제에 의하여 조류 숙주는 새로운 감염성 포유류 MPV를 생산하고 패키징하게 된다.
5.3 재조합 및 키메라 메타뉴모바이러스
본 발명은 포유류 및 조류 변이체 모두를 포함하여, 메타뉴모바이러스의 게놈으로부터 유래하는 바이러스 벡터에 의해 암호화되는 재조합 또는 키메라 바이러스를 포함한다. 본 발명에 따르면, 재조합 바이러스는 내인성 또는 천연 게놈 서열 또는 비천연 게놈 서열에 의해 암호화되는 포유류 MPV 또는 APV로부터 유래한 것이다. 본 발명에 따르면, 비천연 서열은 이에 제한되는 것은 아니나, 점돌연변이, 재배열, 삽입, 결실 등을 포함하여, 표현형에 변화를 야기하거나 야기하지 않을 수 있는 게놈 서열에 대한, 하나 이상의 돌연변이로 인하여 천연 또는 내인성 게놈 서열과는 다른 서열이다. 본 발명의 재조합 바이러스는 포유류 및 조류의 변이체를 비롯하여, 메타뉴모바이러스의 게놈으로부터 유래하는 바이러스 벡터에 의해 암호화되는 바이러스들을 포함하며, 상기 바이러스 게놈에 비천연적인 핵산을 포함하거나, 포함하지 않을 수 있다. 본 발명에 따르면, 메타뉴모바이러스의 게놈으로부터 유래한 바이러스 벡터는 포유류 메타뉴모바이러스의 한 ORF 중 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는데, 상기 ORF로부터 암호화되는 폴리펩티드는 상기 섹션 5.1 및 표 1에서 기술한 바와 같은 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 재조합 바이러스는, 포유류 메타뉴모바이러스 (MPV), 구체적으로 인간 메타뉴모바이러스의 게놈으로부터 유래한 바이러스 벡터로부터 암호화되는 바이러스들을 포함한다. 본 발명의 구체적인 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 메타뉴모바이러스 Al, A2, Bl 또는 B2 변이체의 게놈으로부터 유래한 것이다. 본 발명에 따르면, 이들 바이러스 벡터들은 바이러스 게놈에 비천연적인 핵산을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 재조합 바이러스는, 칠면조의 비기관염 바이러스 (TRTV)로도 알려진, 조류 뉴모바이러스 (APV)의 게놈으로부터 유래한 바이러스 벡터로부터 암호화되는 바이러스들을 포함한다. 본 발명의 구체적인 구체예에서, 상기 바이스 벡터는 APV 서브그룹A, B, C 또는 D의 게놈으로부터 유래한 것이다. 바람직한 구체예에서, 바이러스 벡터는 APV 서브그룹 C의 게놈으로부터 유래한 것이다. 본 발명에 따르면, 이들 바이러스 벡터는 바이러스 게놈에 대해 비천연적인 핵산을 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 재조합 바이러스는 APV 서브그룹 C의 F-ORF를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 APV의 게놈으로부터 유래한 바이러스 벡터로부터 암호화된 바이러스를 포함한다. 일 구체예에서, APV의 게놈으로부터 유래한 바이러스 벡터는 적어도 APV의 N-ORF, P-ORF, M-ORF, F-ORF, M2-1-0RF, M2-2-ORF 또는 L-ORF를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것이다.
본 발명에 따르면, 키메라 바이러스는 이종 핵산 서열을 더욱 포함하는 재조합 MPV 또는 APV이다. 본 발명에 따르면, 키메라 바이러스는 게놈에 이종 뉴클레오티드 서열이 부가되거나, 또는 내인성 또는 천연 뉴클레오티드 서열이 이종 뉴클레오티드 서열로 치환된, 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명에 따르면, 키메라 바이러스는 이종 뉴클레오티드 서열을 더욱 포함하는 본 발명의 바이러스 벡터에 의해 암호화된다. 본 발명에 따르면, 키메라 바이러스는 바이러스 게놈에 대해 비천연적인 핵산을 포함하거나 포함하지 않는 바이러스 벡터로부터 암호화된다. 본 발명에 따르면, 키메라 바이러스는 이종 뉴클레오티드 서열을 부가, 삽입, 또는 천연 또는 비천연 서열이 이로 치환된 바이러스 벡터에 의해 암호화된다. 본 발명에 따르면, 키메라 바이러스는 포유류 MPV의 상이한 바이러스주로부터 유래한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 구체적으로, 키메라 바이러스는 MPV의 상이한 바이러스주로부터 유래한 항원성 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로부터 암호화될 수 있다.
본 발명에 따르면, 키메라 바이러스는 APV, 구체적으로 서브그룹 C의 게놈으로부터 유래하고, MPV의 하나 이상의 바이러스주로부터 유래한 항원성 폴리펩티드를 암호화하는 이종 서열을 부가적으로 암호화하는 바이러스 벡터에 의해 암호화될 수 있다.
키메라 바이러스는 2 이상의 바이러스에 대해 보호하는 재조합 백신을 생성하는데 특히 사용할 수 있다 (Tao et al., J. Virol. 72, 2955-2961; Durbin et al., 2000, J.Virol. 74, 6821-6831; Skiadopoulos et al., 1998, J. Virol. 72, 1762-1768; Teng et al., 2000, J.Virol. 74, 9317-9321). 예를 들어, MPV의 하나 이상의 단백질을 발현하는 RSV 또는 RSV 벡터 등과 같이, 다른 음성 가닥 RNA 바이러스의 단백질을 하나 이상 발현하는 MPV 또는 APV 바이러스 벡터는 이러한 벡터로 백신 접종한 개체를 두 바이러스 감염으로부터 보호할 수 있을 것으로 예측할 수 있다. 이와 유사한 접근법을 PIV 또는 다른 파라믹소바이러스에 대하여 예측할 수 있다. 기타 바이러스에 대하여 제안된 바와 같이, 약독화 및 복제-결함 바이러스를 생백신을 이용하는 백신 접종 목적으로 활용할 수 있다 (PCT WO 02/057302의 pp. 6 및 23 참조, 이를 본 발명의 참조문헌으로 포함시킴).
본 발명에 따르면, 본 발명의 재조합 또는 키메라 바이러스를 암호화하는, 바이러스 벡터내에 도입된 이종 서열은, 메타뉴모바이러스의 상이한 바이러스주, 조류 뉴모바이러스주, 및 기타 음성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나, RSV, PIV 및 인플루엔자 바이러스, 예컨대 모르빌리바이러스 등을 비롯한 기타 바이러스 등에서 유래하거나 이로부터 얻은 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 키메라 또는 재조합 바이러스는, 하나 이상의 서열, 유전자 간 영역, 말단 서열, 또는 일부나 전체 ORF가 이종 또는 비천연 서열로 치환된, 바이러스 게놈으로부터 유래한 바이러스 벡터에 의해 암호화된다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 키메라 바이러스는 하나 이상의 이종 서열이 벡터에 부가된, 바이러스 게놈으로부터 유래한 바이러스 벡터에 의해 암호화된다.
일 구체예에서, 본 발명의 바이러스는 이종 핵산을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 바이러스 게놈의 위치 1에 삽입되거나 부가된다. 다른 바람직한 구체예에서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 바이러스 게놈의 위치 2에 삽입되거나 부가된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 바이러스 게놈의 위치 3에 삽입 또는 부가된다. 바이러스 게놈의 낮은 번호 위치에서의 핵산의 삽입 또는 부가는, 바이러스의 게놈을 가로지르는 전사 구배로 인하여 보다 높은 번호 위치에서의 삽입과 비교하여 이종 뉴클레오티드 서열의 발현이 보다 강하고 높은 수준으로 일어나게 된다.
따라서, 이종 뉴클레오티드 서열의 발현이 고수준인 것이 바람직하다면, 낮은 번호 위치에 이종 뉴클레오티드 서열을 삽입하거나 부가하는 것이, 본 발명의 바람직한 구체예이다. 이론에 제한되지 않고, 이종 서열의 삽입 또는 부가 위치는 재조합 또는 키메라 바이러스의 복제율에 영향을 준다. 이종 서열이 바이러스 게놈의 위치 2 또는 위치 1에 삽입 또는 부가되면 보다 높은 복제율을 얻을 수 있다. 이종 서열이 위치 3, 위치 4, 위치 5, 또는 위치 6에 삽입 또는 부가되면 복제율이 감소한다.
이론에 제한되지 않고, 바이러스 유전자와 이종 서열간의 유전자간 영역의 크기는 또한 바이러스의 복제율 및 이종 원자의 발현 수준을 결정한다.
일 구체예에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 2 이상의 상이한 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 제1 이종 뉴클레오티드 서열은 위치 1에 존재하고 제2 이종 뉴클레오티드 서열은 바이러스 게놈의 제2 위치에 존재한다. 다른 바람직한 구체예에서, 제1 이종 뉴클레오티드 서열은 위치 1에 존재하고 제2 이종 뉴클레오티드 서열은 바이러스 게놈의 위치 3에 존재한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 제1 이종 뉴클레오티드 서열은 위치 2에 존재하고 제2 이종 뉴클레오티드 서열은 바이러스 게놈의 위치 3에 존재한다. 다른 일 구체예에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 바이러스 게놈의 다른, 보다 높은 번호의 위치에 삽입된다. 본 발명에 따르면, 이종 서열의 위치는 바이러스 게놈으로부터 전사되는 서열의 순서를 의미하는데, 예를 들어, 위치 1의 이종 서열은 게놈으로부터 전사되는 첫번째 유전자 서열이다.
바이러스 벡터의 선택은 처리하거나 바이러스 감염으로부터 보호할 대상의 종에 따라 좌우된다. 대상이 인간이면, 약독화 포유류 메타뉴모바이러스 또는 조류 뉴모바이러스를 사용하여 항원성 서열을 제공할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 바이러스 벡터는 메타뉴모바이러스에 의한 감염에 대한 보호능을 부여하는 항원성 서열을 제공하도록 조작할 수 있는데, 이러한 서열은 포유류 메타뉴모바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, MPV 변이체 Al, A2, Bl 또는 B2로부터 유래한 서열, APV 서브그룹 A, B, C, 또는 D, 이중 C가 바람직하지만, 이들을 포함하여 조류 뉴모바이러스로부터 유래한 서열을 포함한다. 상기 바이러스 벡터는 인플루엔자, RSV, 또는 PIV3을 비롯한 PIV 등을 포함하여, 음성 가닥 RNA 바이러스를 비롯한 기타 바이러스에 의한 질병 또는 감염에 대한 보호능을 부여하는 항원성 서열을 제공하도록 조작할 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 1, 2, 3, 또는 그 이상의 항원성 서열을 제공하도록 조작할 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 항원성 서열은 동일한 바이러스로부터 유래하거나, 상이한 바이러스주로부터 유래하거나, 동일 유형의 바이러스의 변이체, 또는 모르빌리바이러스를 비롯한 다른 바이러스로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 바이러스의 게놈에 삽입되는 이종 뉴클레오티드는 메타뉴모바이러스로부터 유래한 것이다. 특정 일 구체예에서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 인간 메타뉴모바이러스로부터 유래한 것이다. 다른 특정 구체예에서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 조류 뉴모바이러스로부터 유래한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 이종 뉴클레오티드 서열은 인간 메타뉴모바이러스의 F 유전자를 암호화한다. 보다 구체적으로, 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 인간 메타뉴모바이러스의 G 유전자를 암호화한다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 이종 뉴클레오티드 서열은 조류 뉴모바이러스의 F 유전자를 암호화한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 이종 뉴클레오티드 서열은 조류 뉴모바이러스의 G 유전자를 암호화한다. 특정 구체예예서, 이종 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 5, 서열번호 14, 및 서열번호 15 중 임의 서열일 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6 내지 서열번호 13, 서열번호 16, 및 서열번호 17 중 어느 하나의 단백질을 암호화한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 키메라 F 단백질을 암호화한다. 예시적인 구체예에서, 키메라 F-단백질의 엑토도메인 (ectodomain)은 인간 MPV의 엑토도메인이고 트랜스막 도메인과 루미날 도메인은 조류 메타뉴모바이러스의 F 단백질로부터 유래한 것이다. 이론에 제한되지 않고, 인간 엑토도메인 및 조류 루미놀/트랜스막 도메인으로 이루어진 키메라 F-단백질을 암호화하는 키메라 인간 MPV는, F-단백질의 조류 부분으로 인해 약독화되지만, 인간 엑토도메인때문에 hMPV에 대한 면역원성은 높다.
일 구체예에서, 2종의 상이한 이종 뉴클레오티드 서열을, 포유류 및 조류를 포함하는, 메타뉴모바이러스 게놈으로부터 유래한, 본 발명의 바이러스 벡터에 삽입하거나 부가한다. 예를 들어, 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 인간 메타뉴모바이러스, 조류 뉴모바이러스조류 뉴모바이러스, RSV, PIV, 또는 인플루엔자로부터 유래한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 이종 서열은 각각 인간 메타뉴모바이러스, 조류 뉴모바이러스, RSV 또는 PFV의 F-단백질을 암호화한다. 다른 구체예에서, 상기 이종 서열은 인플루엔자의 HA 단백질을 암호화한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 2종의 상이한 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 여기서 제1 이종 뉴클레오티드 서열은 메타뉴모바이러스, 예컨대 인간 메타뉴모바이러스 또는 조류 뉴모바이러스로부터 유래한 것이고, 제2 뉴클레오티드 서열은 호흡기 신시티아 바이러스로부터 유래한 것이다 (표 2 참조). 특정 구체예에서, 호흡기 신시티아 바이러스로부터 유래한 이종 뉴클레오티드 서열은 호흡기 신시티아 바이러스의 F 유전자이다. 다른 특정 구체예에서, 호흡기 신시티아 바이러스로부터 유래한 이종 뉴클레오티드 서열은 호흡기 신시티아 바이러스의 G 유전자이다. 특정 구체예에서, 메타뉴모바이러스로부터 유래한 이종 뉴클레오티드 서열은 호흡기 신시티아 바이러스로부터 유래한 이종 뉴클레오티드 서열보다 낮은 번호 위치에 삽입된다. 다른 특정 구체예에서, 메타뉴모바이러스로부터 유래한 이종 뉴클레오티드 서열은 호흡기 신시티아 바이러스로부터 유래한 이종 뉴클레오티드 서열보다 높은 번호 위치에 삽입된다.
일 구체예에서, 본 발명의 바이러스는 2종의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 제1 이종 뉴클레오티드 서열은 메타뉴모바이러스, 예컨대 인간 메타뉴모바이러스 또는 조류 뉴모바이러스로부터 유래하며, 제2 뉴클레오티드 서열은 파라인플루엔자 바이러스, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나 PIV3 등으로부터 유래한 것이다 (표 2 참조). 특정 구체예에서, PIV로부터 유래한 이종 뉴클레오티드 서열은 PIV의 F 유전자이다. 다른 특정 구체예에서, PIV로부터 유래한 이종 뉴클레오티드 서열은 PIV의 G 유전자이다. 특정 구체예에서, 메타뉴모바이러스로부터 유래한 이종 뉴클레오티드 서열은 PIV로부터 유래한 이종 뉴클레오티드 서열보다 낮은 번호 위치에 삽입된다. 다른 특정 구체예에서, 메타뉴모바이러스로부터 유래한 이종 뉴클레오티드 서열은 PIV로부터 유래한 이종 뉴클레오티드 서열보다 높은 번호 위치에 삽입된다.
본 발명에 따라 얻어진 발현 산물 및/또는 재조합 또는 키메라 비리온은 이롭게는 백신 제제에 사용할 수 있다. 본 발명의 발현 산물 및 키메라 비리온은 바이러스 및 박테리아 항원, 종양 항원, 알레르겐 항원 및 자가 면역 질병에 관련되는 자가 항원 등을 포함하여, 광범위한 병원체에 대한 백신을 생성하도록 조작될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 키메라 비리온은 대상을 PIV, RSV, 및/또는 메타뉴모바이러스의 감염으로부터 보호하기 위한 백신을 생성하도록 조작될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 키메라 비리온은 항 HIV 백신을 생성하도록 조작될 수 있는데, 여기서 gp160 및/또는 HIV의 내부 단백질 유래의 면역원성 폴리펩티드를 당단백질 HN 단백질내로 조작하여서 척추동물의 체액성 및 세포 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 백신을 구축할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 돌연변이성 항원을 암호화하도록 조작된 재조합 메타뉴모바이러스 벡터 및 바이러스에 관한 것이다. 돌연변이성 항원은 야생형 바이러스 단백질로부터 유래한 것에 대하여 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 또는 키메라 바이러스를 포함하는 3가의 백신에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 3가 백신의 골격으로 사용되는 바이러스는 RSV로부터 유래한 제1 이종 뉴클레오티드 서열 및 PIV로부터 유래한 제2 이종 뉴클레오티드 바이러스를 포함하는 키메라 조류-인간 메타뉴모바이러스 또는 키메라 인간-조류 메타뉴모바이러스이다. 예시적인 구체예에서, 이러한 3가 백신은 (a) 키메라 조류-인간 또는 키메라 인간-조류 메타뉴모바이러스를 사용하는가에 따라서, 각각 인간 메타뉴모바이러스 또는 조류 메타뉴모바이러스의 F 유전자 및/또는 G 유전자의 유전자 산물; (b) RSV로부터 유래한 이종 뉴클레오티드 서열로부터 암호화되는 단백질; 및 (c) PIV로부터 유래한 이종 뉴클레오티드 서열로부터 암호화되는 단백질에 특이적이다. 특정 구체예에서, 제1 이종 뉴클레오티드는 호흡기 신시아 바이러스의 F 유전자이고 위치 1에 삽입되며, 제2 이종 뉴클레오티드 서열은 PIV의 F 유전자이며 위치 3에 삽입된다. 보다 많은 조합들이 본 발명에 포함되며 그 중 일부를 일례로서 표 2에 나타내었다. 또한, 키메라 F 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 사용할 수 있다 (상기 참조). 일부 덜 바람직한 구체예에서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 바이러스 게놈의 보다 높은 번호 위치에 삽입될 수 있다. 하기 표 2는 3가 백신용으로 사용되는 이종 뉴클레오티드 서열의 예시적인 배열이다.
조합 위치 1 위치 2 위치 3
1 PIV의 F 유전자 RSV의 F 유전자
2 RSV의 F 유전자 PIV의 F 유전자
3 - PIV의 F 유전자 RSV의 F 유전자
4 - RSV의 F 유전자 PIV의 F 유전자
5 PIV의 F 유전자 - RSV의 F 유전자
6 RSV의 F 유전자 - PIV의 F 유전자
7 PIV의 HN 유전자 RSV의 G 유전자 -
8 RSV의 G 유전자 PIV의 HN 유전자 -
9 - PIV의 HN 유전자 RSV의 G 유전자
10 - RSV의 G 유전자 PIV의 HN 유전자
11 PIV의 HN 유전자 - RSV의 G 유전자
12 RSV의 G 유전자 - PIV의 HN 유전자
13 PIV의 F 유전자 RSV의 G 유전자 -
14 RSV의 G 유전자 PIV의 F 유전자 -
15 - PIV의 F 유전자 RSV의 G 유전자
16 - RSV의 G 유전자 PIV의 F 유전자
17 PIV의 F 유전자 - RSV의 G 유전자
18 RSV의 G 유전자 - PIV의 F 유전자
19 PIV의 HN 유전자 RSV의 F 유전자 -
20 RSV의 F 유전자 PIV의 HN 유전자 -
21 - PIV의 HN 유전자 RSV의 F 유전자
22 - RSV의 F 유전자 PIV의 HN 유전자
23 PIV의 HN 유전자 - RSV의 F 유전자
24 RSV의 F 유전자 - PIV의 HN 유전자
일 구체예에서, 본 발명의 발현 산물 및 재조합 또는 키메라 비리온은, 바이러스 항원, 종양 항원, 및 자가면역 질환에 관련되는 자가 항원 등을 포함하여, 광범위한 병원체에 대한 백신을 생성하도록 조작될 수 있다. 이러한 목표를 이루기 위한 방법으로는 메타뉴모바이러스의 유전자가 그들의 각 외부 도메인에 외래 서열을 포함하도록 현존 메타뉴모바이러스 유전자를 변형시키는 것을 포함한다. 여기서 이종 서열이 병원체의 항원이나 에피토프일 경우, 이들 키메라 바이러스를 이용하여 이들 결정 인자가 유래한 질병원에 대하여 보호 면역 반응을 유도하도록 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 광범위한 바이러스 및/또는 항원에 대한 백신을 제제화하기 위한 바이러스 벡터 및 재조합 또는 키메라 바이러스의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 바이러스 벡터 및 키메라 바이러스는 체액성 면역 반응, 세포성 면역 반응을 자극하거나, 항원에 대한 내성을 자극하여 대상의 면역계를 조정하는데 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 대상은 인간, 영장류, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 개, 고양이, 조류 종 및 설치류 등을 의미한다.
본 발명은 설명의 목적을 위해 다음의 단계들로 나뉠 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다: (a) 재조합 cDNA 및 RNA 주형의 구축; (b) 재조합 cDNA 및 RNA 주형을 이용한 이종 유전자 산물의 발현; (c) 재조합 바이러스 입자에서 이종 유전자의 복구; 및 (d) 본 발명의 재조합 바이러스 입자를 포함하는 백신의 생성 및 용도.
5.4 재조합 cDNA 및 RNA 의 구축
일 구체예에서, 바이러스 벡터는 본 발명의 인간 또는 포유류 메타뉴모바이러스의 게놈으로부터 유래한다. 다른 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 조류 뉴모바이러스의 게놈으로부터 유래한다. 일 구체예에서, 바이러스 벡터는 포유류 MPV 및 APV로부터 유래한 서열을 포함하여서, 키메라 인간 MPV/APV 바이러스는 바이러스 벡터에 의해 암호화된다. 예시적인 구체예에서, 인간 메타뉴모바이러스의 F-유전자 및/또는 G-유전자는 조류 뉴모바이러스의 F-유전자 및/또는 G-유전자로 치환되어서 키메라 hMPV/APV 바이러스를 구축할 수 있다. 다른 구체예에서, 바이러스 벡터는 APV 및 포유류 MPV로부터 유래한 서열을 포함하여서, 키메라 APV/hMPV 바이러스는 바이러스 벡터에 의해 암호화된다. 보다 예시적인 구체예에서, 조류의 F-유전자 및/또는 G- 유전자는 인간 메타뉴모바이러스의 F-유전자 및/또는 G-유전자로 치환되어서 키메라 APV/hMPV 바이러스를 구축하게 된다.
본 발명은 또한, 내인성 또는 바이러스 게놈에 천연적인 서열을 포함하며, 바이러스 게놈에 비천연적인 서열은 포함하거나 포함하지 않을 수 있는, 포유류 MPV 또는 APV로부터 유래하는 바이러스 벡터를 포함하는 재조합 바이러스를 포함한다. 비천연 서열은 표현형의 변화를 야기하거나 야기하지 않을 수 있는, 천연 또는 내인성 서열과는 상이한 서열을 포함한다. 본 발명의 재조합 바이러스는 백신 제제에 보다 적합한 표현형, 예컨대 약독화 표현형 또는 증가된 항원성 등을 보유하는 바이러스를 발생시키는 서열을 함유할 수 있다. 돌연변이 및 변형 등이 바이러스의 코딩 영역, 유전자간 영역 및 리더 및 트레일러 서열에 있을 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 hMPV, APV, hMPV/APV 또는 APV/hMPV로부터 유래한 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 이때 천연 뉴클레오티드 서열은 이종 서열로 치환되거나 또는 이종 서열이 천연 메타뉴모바이러스 서열에 부가된다.
보다 특정 구체예에서, 키메라 바이러스는 PIV로부터 유래한 이종 서열이 부가된 MPV, APV, APV/hMPV, 또는 hMPV/APV로부터 유래한 바이러스 벡터를 포함한다. 보다 특정의 구체예에서, 재조합 바이러스는 PIV로부터 유래한 이종 서열에 의해 서열이 치환된 MPV, APV, APV/hMPV, 또는 hMPV/APV로부터 유래한 바이러스 벡터를 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 키메라 바이러스는 RSV로부터 유래한 이종 서열이 부가된 MPV, APV, APV/hMPV, 또는 hMPV/APV로부터 유래한 바이러스 벡터를 포함한다. 보다 특정한 구체예에서, 키메라 바이러스는 RSV로부터 유래한 이종 서열에 의해 서열이 치환된 MPV, APV, APV/hMPV, 또는 hMPV/APV로부터 유래한 바이러스 벡터를 포함한다.
바이러스 폴리머라제 결합 부위/프로모터의 상보 서열, 예를 들어, 본 발명의 3'-hMPV 바이러스 말단에 상보적이거나, 3' 및 5'-hMPV 바이러스 말단에 모두 상보적인 서열이 측접한 이종 유전자 코딩 서열을 당분야의 당업자에게 공지인 기술을 사용하여 구축할 수 있다. 보다 특정의 구체예에서, 본 발명의 재조합 바이러스는 hMPV 또는 APV의 리더 및 트레일러 서열을 함유한다. 일 구체예에서, 유전자간 영역은 hMPV 또는 APV로부터 얻는다. 얻어진 최종 RNA 주형은 음성 극성이며 바이러스 RNA 합성 기구가 주형을 인지할 수 있는 적절한 종결 서열을 포함한다. 다르게는, 바이러스 RNA 합성 기구가 주형을 인지할 수 있는 적절한 말단 서열을 포함하는 양성 극성 RNA 주형을 사용할 수도 있다. 이러한 하이브리드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 클로닝하고, DNA를 주형으로 하는 RNA 폴리머라제, 예컨대 박테리오파지 T7, T3, SP6 폴리머라제 또는 진핵세포 폴리머라제 예컨대 폴리머라제 I 등을 통하여 전사시켜서 바이러스 폴리머라제 인식 및 활성이 가능한 적절한 바이러스 서열을 보유하는 재조합 RNA 주형을 시험관 내에서 또는 생체에서 생산한다. 보다 특정 구체예에서, 상기 RNA 폴리머라제는 계두 바이러스 T7 RNA 폴리머라제 또는 MVA T7 RNA 폴리머라제이다.
이러한 하이브리드 분자를 구축하기 위한 예시적인 접근법으로는 이종 뉴클레오티드 서열을 hMPV, APV, APV/hMPV 또는 hMPV/APV 게놈의 상보적 DNA에 삽입시켜서, 바이러스 폴리머라제 활성에 필요한 바이러스 서열, 즉, 바이러스 폴리머라제 결합 부위/프로모터, 이하 바이러스 폴리머라제 결합 부위, 및 폴리아데닐화 부위 등이 이종 서열에 측접하게 한다. 바람직한 구체예에서, 이종 코딩 서열은 5' 및 3' 말단의 복제 프로모터, 유전자 출발 및 유전자 종결 서열, 및 5' 및/또는 3' 말단에서 발견되는 패키징 신호 등을 포함하는 바이러스 서열이 이종 코딩 서열에 측접한다. 다른 접근법에서, 바이러스 폴리머라제 결합 부위를 코딩하는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 바이러스 게놈 절편의 3' 말단이나 양쪽 말단에 상보적인 것을 이종 코딩 서열과 결찰시켜서 하이브리드 분자를 구축할 수 있다. 표적 서열 내 외래 유전자 또는 외래 유전자의 배치는, 이전에는 상기 표적 서열 내 적절한 제한 효소 부위의 존재에 의해 지배되었다. 그러나, 최근 분자생물학의 진보에 의해서 이러한 문제가 상당히 감소하였다. 부위 특이적 돌연변이 유발법 등을 사용하여 표적 서열 내 임의 위치에 용이하게 제한 효소 부위를 위치시킬 수 있다 (예컨대, 문헌 [Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82;488] 등에 기술된 방법 참조). 상기에 기술된, 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 법에 변형을 가하여 서열의 특정 삽입(즉, 제한 효소 부위)이 가능하고 하이브리드 분자의 구축이 용이해졌다. 다르게는 PCR 반응을 사용하여 클로닝할 필요없이 재조합 주형을 제조할 수 있다. 예를 들어, PCR 반응을 사용하여 DNA를 주형으로 하는 RNA 폴리머라제 프로모터(예를 들어, 박테리오 파지 T3, T7, 또는 SP6)를 함유하고 이종 유전자와 PIV 폴리머라제 결합 부위를 함유하는 하이브리드 서열을 포함하는 이중가닥 DNA 분자를 제조할 수 있다. 이후, RNA 주형을 이 재조합 DNA로부터 직접 전사시킬 수 있다. 다른 구체예에서, RNA 리가제를 사용하여, 이종 유전자의 음성 극성을 지정하는 RNA 및 바이러스 폴리머라제 결합 부위를 결찰시켜서 재조합 RNA 주형을 제조할 수 있다.
또한, 바이러스 복구를 이루기 위하여 중요한 "Rule of Six"에 부착하도록 비번역 영역에 하나 이상의 뉴클레오티드를 부가할 수 있다. 상기 "Rule of Six"는 많은 파라믹소바이러스에서 사용하며 RNA 뉴클레오티드 게놈이 기능적으로 6으로 나뉘어야하는 것을 일컫는 것이다. 뉴클레오티드 부가는 예컨대 시판중인 돌연변이 유발 키트 예를 들어 QuickChange mutagenesis kit(Stratagene)을 사용하여 당분야의 공지의 기술로 수행할 수 있다. 적절한 수의 뉴클레오티드를 부가한 후, 적절한 제한 효소로 분해하고 겔 정제하여 정확한 DNA 단편을 분리할 수 있다.
이론에 제한되지 않고, 몇몇 변수가 재조합 바이러스의 복제율 및 이종 서열의 발현 수준에 영향을 줄 수 있다. 구체적으로, hMPV, APV, hMPV/APV 또는 APV/hMPV의 이종 서열 위치 및 이종서열에 측접하는 유전자간 영역의 길이가 복제율과 이종 서열의 발현 수준을 결정한다.
일 구체예에서, 바이러스의 리더 또는 트레일러 서열은 야생형 바이러스에 대해서 변형시킨다. 보다 특정의 일 구체예에서, 리더 및/또는 트레일러의 길이를 변경한다. 다른 구체예에서, 리더 및/또는 트레일러의 서열은 야생형 바이러스에 대해서 돌연변이시킨다. 보다 구체적인 것은 섹션 5.7을 참조한다.
본 발명의 재조합 바이러스의 생산은 음성 센스 바이러스 RNA(vRNA)의 부분 또는 전체길이 복제본 또는 이의 상보적 복제본(cRNA)의 복제에 의해 좌우된다. 이 vRNA 또는 cRNA는 감염성 바이러스로부터 분리하거나, 시험관 내 전사시 생산하거나, 핵산의 형질전환시 세포에서 생산할 수 있다. 다음으로 재조합 음성 가닥 바이러스의 생산은 기능성 폴리머라제 복합체에 의해 좌우된다. 통상, 뉴모바이러스의 폴리머라제 복합체는 N, P, L 및 아마도 M2 단백질로 이루어지나 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.
폴리머라제 복합체 또는 이의 성분들은 바이러스 입자로부터 분리할 수 있고, 상기 성분 중 하나 이상을 발현하는 세포로부터 분리하거나, 특정 발현 벡터를 형질전환시켜서 생산할 수 있다.
MPV의 감염성 복제물은 상기 언급한 폴리머라제 복합체 16에 의해서 이들 RNA를 발현하는 상기 언급한 벡터, vRNA, 또는 cRNA를 복제할 경우 얻을 수 있다 (Schnell et al., 1994, EMBO J 13: 4195-4203; Collins, et al., 1995, PNAS 92: 11563-11567; Hoffmann, et al., 2000, PNAS 97: 6108-6113; Bridgen, et al., 1996, PNAS 93: 15400-15404; Palese, et al., 1996, PNAS 93: 11354-11358; Peeters, et al., 1999, J.Virol. 73: 5001-5009; Durbin, et al., 1997, Virology 235: 323-332).
본 발명은 본 발명에 따른 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. MPV의 폴리머라제 성분들(예측컨대 N, P, L 및 M2이나 이들에 필수적으로 제한되는 것은 아니다)을 포함하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 적절한 세포 유형(박테리아, 곤충 세포, 진핵 세포 등)에서 상기 성분들을 발현시키기 위해서 원핵 세포에서 생성시킨다. 시험관 내에서 또는 생체 내에서 바이러스 핵산의 발현을 위하여, 원핵 세포에서 MPV 게놈의 전장 또는 부분 복제본을 함유하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 생성시킨다. 후자의 벡터는 키메라 바이러스 또는 키메라 바이러스 단백질의 생성을 위한 기타 바이러스 서열을 포함할 수 있고, 복제 결함 바이러스의 생성을 위한 바이러스 게놈의 일부가 결여될 수 있으며, 약독화 바이러스를 생성하기 위한 돌연변이, 결실, 또는 삽입을 포함할 수 있다.
MPV(야생형, 약독화, 복제 결함 또는 키메라임)의 감염성 복제본은 상기 기술한 현재의 최신 기술들에 따라서 폴리머라제 성분들과 함께 발현시켜서 생산할 수 있다.
또한, 하나 이상의 전체 길이 또는 부분 MPV 단백질을 일시적으로 또는 안정적으로 발현하는 진핵 세포를 사용할 수 있다. 이러한 세포는 형질전환(단백질 또는 핵산 벡터), 감염(바이러스 벡터) 또는 형질감염(바이러스 벡터) 등을 통해 제조할 수 있고 상기 언급한 야생형, 약독화, 복제 결합 또는 키메라 바이러스의 상보성(complementation)을 위해 유용하다.
5.4.1 삽입되는 이종 유전자 서열
본 발명에 따르면, 본 발명의 바이러스 벡터는 이종 서열을 발현하도록 더욱 조작할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 이종 서열은 바이러스 벡터 이외의 공급원으로부터 유래한다. 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니나, 이종 서열은, 바이러스 벡터가 유래한 종, 서브그룹, 또는 변이체와는 다른 메타뉴모바이러스의 종, 서브그룹 또는 변이체에 속하는 바이러스의 펩티드 또는 폴리펩티드, 항원성 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 이종 서열은 메타뉴모바이러스이외의 바이러스의 펩티드 또는 폴리펩티드, 항원성 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 이종 서열은 바이러스 기원이 아니다. 이 구체예에 따르면, 상기 이종 서열은 바람직한 생물학적 물성 또는 활성을 보유하는 부분, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화할 수 있다. 이러한 이종 서열은 태그 또는 마커를 암호화할 수 있다. 이종 서열은 생물학적 반응 변형 인자, 예컨대 림포카인, 인터루킨, 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니 자극 인자 및 그래뉼로사이트 콜로니 자극 인자 등을 포함하는 것들을 암호화할 수 있다.
일 구체예에서, 삽입되는 이종 뉴클레오티드 서열은 메타뉴모바이러스로부터 유래한다. 보다 구체적으로, 삽입되는 이종 뉴클레오티드 서열은 인간 메타뉴모바이러스 및/또는 조류 뉴모바이러스로부터 유래한다.
일 구체예에서, 이종 서열은 PIV 핵캡시드 인단백질, PIV L 단백질, PIV 메트릭스 단백질, PIV HN 당단백질, PIV RNA-의존적 RNA 폴리머라제, PIV Yl 단백질, PIV D 단백질, PIV C 단백질, PIV F 단백질 또는 PIV P 단백질을 암호화한다. 일 구체예에서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 PIV 핵캡시드 인단백질, PIV L 단백질, PIV 메트릭스 단백질, PIV HN 당단백질, PIV RNA-의존적-RNA 폴리머라제, TIV Yl 단백질, PIV D 단백질, PIV C 단백질, PIV F 단백질 또는 PIV P 단백질과, 90 % 이상, 95 % 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 상동성을 갖는 단백질을 암호화한다. 상기 이종 서열은 PIV 제1형, PIV 제2형, 또는 PIV 제3형으로부터 얻을 수 있다. 더욱 특정 구체예에서, 상기 이종 서열은 인간 PIV 제1형, PIV 제2형, 또는 PIV 제3형으로부터 얻을 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 이종서열은 RSV 핵단백질, RSV 인단백질, RSV 메트릭스 단백질, RSV 소수성 소(small) 단백질, RSV RNA-의존적 RNA 폴리머라제, RSV F 단백질, RSV G 단백질, 또는 RSV M2-1 또는 M2-2 단백질을 암호화한다. 일 구체예에서, 이종 서열은 RSV 핵단백질, RSV 인단백질, RSV 메트릭스 단백질, RSV 소수성 소 단백질, RSV RNA-의존적 RNA 폴리머라제, RSV F 단백질, 또는 RSV G 단백질과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99 % 이상 상동성을 갖는 단백질을 암호화한다. 상기 이종 서열은 RSV 서브타입 A 및 RSV 서브타입 B로부터 얻을 수 있다. 다른 구체예에서, 이종 서열은 APV 핵단백질, APV 인단백질, APV 메트릭스 단백질, APV 소수성 소 단백질, APV RNA-의존적 RNA 폴리머라제, APV F 단백질, APV G 단백질 또는 APV M2-1 또는 M2-2 단백질을 암호화한다. 일 구체예에서, 이종 서열은 APV 핵단백질, APV 인단백질, APV 메트릭스 단백질, APV 소수성 소 단백질, APV RNA-의존적 RNA 폴리머라제, APV F 단백질, 또는 APV G 단백질과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 상동성을 갖는 단백질을 암호화한다. 상기 조류 뉴모바이러스는 APV 서브그룹 A, APV 서브그룹 B, 또는 APV 서브그룹 C일 수 있다. 다른 구체예에서, 이종 서열은 hMPV 핵단백질, hMPV 인단백질, hMPV 메트릭스 단백질, hMPV 소수성 소 단백질, hMPV RNA-의존적 RNA 폴리머라제, hMPV F 단백질, hMPV G 단백질 또는 hMPV M2-1 또는 M2-2를 암호화한다. 일 구체예에서, 상기 이종 서열은 hMPV 핵단백질, hMPV 인단백질, hMPV 메트릭스 단백질, hMPV 소수성 소 단백질, hMPV RNA-의존적 RNA 폴리머라제, hMPV F 단백질, 또는 hMPV G 단백질과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 상동성을 갖는 단백질을 암호화한다. 상기 인간 메타뉴모바이러스는 hMPV 변이체 Al, hMPV 변이체 A2, hMPV 변이체 Bl, 또는 hMPV 변이체 B2일 수 있다.
일 구체예에서, 이종 서열은 PIV, RSV, 인간 메타뉴모바이러스, 또는 조류 뉴모바이러스 유래의 상이한 이종 서열의 임의 조합을 본 발명의 바이러스에 삽입할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 상기 삽입되는 이종 뉴클레오티드 서열은 RSV, PTV, APV, 또는 hMPV 유래의 F 유전자로부터 유래한다.
일 구체예에서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 키메라 단백질을 암호화한다. 보다 특정 구체예에서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 RSV, PIV, APV 또는 hMPV의 키메라 F 단백질을 암호화한다. 키메라 F 단백질은 상이한 바이러스, 예컨대 인간 메타뉴모바이러스, 조류 뉴모바이러스, 호흡기 신시티아 바이러스, 및 파라인플루엔자 바이러스 유래의 F 단백질의 일부를 포함한다. 다른 일 구체예에서, 상기 이종 서열은 키메라 G 단백질을 암호화한다. 키메라 G 단백질은 상이한 바이러스, 예컨대 인간 메타뉴모바이러스, 조류 뉴모바이러스, 호흡기 신시티아 바이러스, 및 파라인플루엔자 바이러스 유래의 G 단백질의 일부를 포함한다. 다른 일 구체예에서, 상기 F 단백질은 메타뉴모바이러스의 F 단백질의 엑토도메인, 파라 인플루엔자 바이러스의 F 단백질의 트랜스막 도메인, 및 파라인프루엔자 바이러스의 F 단백질의 루미날 도메인을 포함한다.
특정 일 구체예에서, 본 발명의 이종 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 내지서열번호 5, 서열번호 14, 및 서열번호 15 중 어느 하나이다. 특정 일 구체예에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6 내지 서열번호 13, 서열번호 16, 및 서열번호 17 중 어느 하나의 단백질을 암호화한다.
호흡기 신시티아 바이러스로부터 유래한 이종 뉴클레오티드 서열은 예컨대 PC17US98/20230를 참조할 수 있으며, 이를 전체로 본 발명의 참조문헌으로 포함시킨다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 재조합 바이러스 내에서 발현될 수 있는 이종 유전자 서열은 이에 제한되는 것은 아니나, 호흡기 질환을 유발하는 바이러스의 항원성 에피토프 및 당단백질, 예컨대 인플루엔자 당단백질, 구체적으로, 헤마글루티닌 H5, H7, 호흡기 신시티아 바이러스 에피토프, 뉴캐슬 질병 바이러스 에피토프 센다이 바이러스 및 감염성 후두 기관염 바이러스 (ILV) 등을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 RSV 또는 PIV로부터 유래한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 키메라 바이러스 내로 조작할 수 있는 이종 유전자 서열은 이에 제한되는 것은 아니나, 바이러스 에피토프 및 바이러스의 당단백질, 예컨대 B형 감염 바이러스 표면 항원, A형 또는 C형 감염 바이러스의 표면 당단백질, 엡스테인 바 바이러스의 당단백질, 인간 파필로마 바이러스, 시미언 바이러스 5 또는 멈프스 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 뎅구 바이러스 등의 당단백질, 헤르페스 바이러스의 당 단백질, 폴리오바이러스의 VPI, 및 렌티바이러스, 바람직하게는 이에 제한되는 것은 아니나 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 제1형 또는 제2형 등으로부터 유래한 서열 등을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 키메라 바이러스 내로 조작할 수 있는 이종 유전자 서열은 이에 제한되는 것은 아니나, 마렉병 바이러스 (MDV) 에피토프, 감염성 낭병 바이러스(IBDV)의 에피토프, 닭 빈혈증 바이러스의 에피토프, 감염성 후두기관염 바이러스(ILV), 조류 인플루엔자 바이러스(AIV), 광견병, 고양이 백혈병 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 및 돈두 바이러스의 에피토프 등을 포함한다 (문헌 [Fields et al., (ed.), 1991, Fundamental Virology, Second Edition, Raven Press, New York] 참조하며, 이를 전체로 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다).
본 발명의 기타 이종 서열은 자가면역 질환의 특징이 되는 항원을 포함한다. 이들 항원은 통상 세포 표면, 세포질, 핵, 마이토콘드리아 및 포유류 조직 등에서 유래하는데, 진성 당뇨병 (diabetes mellitus), 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루프스, 류마티스성 관절염, 악성 빈혈, 애디슨병, 피부경화증, 자가면역 위축성 위염, 연소성 당뇨병 및 원판상 홍반성 루푸스 등의 특징적인 항원을 포함한다.
알레르겐인 항원은 대체로, 화분, 먼지, 곰팡이, 포자, 비듬, 곤충 및 음식물 등으로부터 유래하는 항원을 비롯한, 단백질 또는 당단백질을 포함한다. 또한, 종양 항원으로 특징되는 항원은 통상 세포 표면, 세포질, 핵, 세포기관 및 종양 조직의 세포 등으로부터 유래하게 된다. 이의 예로는 예컨대 돌연변이성 종양유전자에 의해 암호화되는 단백질을 비롯한, 종양 단백질로 특징되는 항원; 종양과 관련된 바이러스 단백질; 및 당단백질 등을 포함한다. 종양은 이에 제한되는 것은 아니나, 다음의 암 유형으로부터 유래하는 것으로서; 입, 비인두, 인두 및 구강, 식도, 위, 결장, 직장, 간, 쓸개, 췌장, 후두, 폐 및 기관지, 피부의 흑색종, 유방, 경부, 자궁, 난소, 방광, 신장, 자궁, 뇌 및 신경계의 다른 부분, 갑상성, 전립선, 고환, 호지킨병, 비호지킨 임파종, 다발성 골수종 및 백혈병 등을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 이종 서열은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 바람직하게는 인간 면역결핍 바이러스-1 또는 인간 면역결핍 바이러스-2의 게놈으로부터 유래한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 이종 코딩 서열은 바이러스 골격의 유전자 코딩 서열 내에 삽입되어서 메타뉴모바이러스 단백질 내에 이종 펩티드 서열을 함유하는 키메라 유전자 산물을 발현시킨다. 본 발명의 다른 구체예에서, 이종 서열은 또한, 인간 면역결핍 바이러스, 바람직하게는 인간 면역결핍 바이러스-1 또는 인간 면역결핍 바이러스-2의 게놈으로부터 유래할 수도 있다.
예를 들어, HIV-유래 이종 서열로는, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나, env 유전자 (즉, gpl60, gp120 및/또는 gp41의 전체 또는 일부를 암호화하는 서열), pol 유전자 (즉, 역전사효소, 엔도뉴클레아제, 프로테아제, 및/또는 인테그라제 의 전체 또는 일부를 암호화하는 서열), gag 유전자 (즉, p7, p6, p55, pl7/18, p24/25의 전체 또는 일부를 암호화하는 서열) tat, rev, nef, vif, vpu, vpr, 및/또는 vpx로부터 유래한 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 키메라 바이러스 내로 조작할 수 있는 이종 유전자 서열은 면역강화 활성을 보유하는 단백질을 암호화하는 것들을 포함한다. 면역강화 단백질의 예로는 이에 제한되는 것은 아니나, 사이토카인, 인터페론 1형, 감마 인터페론, 콜로니 자극 인자 및 인터루킨 -1, -2, -4, -5, -6, -12 등을 포함한다.
또한, 키메라 단백질내로 조작할 수 있는 다른 이종 유전자 서열은 박테리아로부터 유래한 항원, 예컨대 박테리아 표면 당단백질, 진균류 유래 항원, 및 기타 다양한 병원체 및 기생충으로부터 유래하는 항원 등을 포함한다. 박테리아 병원체로부터 유래하는 이종 유전자 서열의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 다음 속의 종으로부터 유래하는 항원을 포함한다: 살모넬라, 시겔라, 클라미디아, 헬리코박터, 여시니아, 보다텔라, 슈노모나스, 나이세리아, 비브리오, 헤모필러스, 마이코플라스마, 스트렙토마이세스, 트레포네마, 코시엘라, 에르리치아, 브루셀라, 스트렙토바실러스, 푸소스피로케아, 스피릴룸, 우레아플라스마, 스피로카에타, 마이코플라스마, 액티노마이세테스, 보렐리아, 박테리오이데스, 트리코모라스, 브라나멜라, 파스튜렐라, 클로스트리디움, 코리네박테리움, 리스테리아, 바실러스, 에리시펠로트릭스, 로도코커스, 에스케리치아, 클렙시엘라, 슈도모나스, 엔테로박터, 세라티아, 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 레지오넬라, 마이코박테리움, 프로테우스, 캠필로박터, 엔테로코커스, 아시네토박터, 모르가넬라, 모라셀라, 시트로박터, 리케치아, 로치리미아 등을 비롯하여, 박테리아종 예컨대: P. 애루지노사; E. 콜라이, P. 세파시아, S. 에피더미스, E. 패칼리스, S. 뉴모니아, S. 아우레우스, N. 메닌지티디스, S. 파이오젠, 파스튜렐라 물토시다, 트레포네마 팔리둠, 및 P. 미라빌리스 등.
병원성 진균류로부터 유래하는 이종 유전자 서열의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 진균류 예컨대 크립토코커스 네오포르만스; 블라스토마이세스 더마티티디스;아이엘로마이세스 더마티티디스; 히스토플라스마 캡슐라텀; 코시디오이데스 임미티스; C. 알비칸스, C. 트로피칼리스, C. 파랍실로시스, C. 구일리에르몬디 및 C. 크루세이 등을 비롯한, 칸디다 종, A. 푸미가터스, A. 플라버스 및 A. 나이거를 비롯한 아스퍼질러스 종, 리조푸스 종; 리조무코르 종; 쿤닌가멜라 종; A. 사크세니아, A. 무코르 및 A. 아브시디아를 비롯한 아포피소마이세스 종; 스포로트릭스 스켄키, 파라코시디오이데스 브라질리엔시스; 슈달레스케리아 보이디, 토룰롭시스 글라브라타; 트리코파이톤 종, 마이코스포럼 종 및 더마토파이레스 종을 비롯하여, 병원성으로 알려지거나 이후 동정된 기타 효모 또는 진균류로부터 유래한 항원을 포함한다.
마지막으로, 기생충으로부터 유래하는 이종 유전자 서열의 예로는 아피콤플렉사 문의 구성원, 예컨대 바베시아, 톡소플라스마, 플라스모디움, 아이메리아, 이소스포라, 아톡소플라스마, 시스토이소스포라, 함몬디아, 베스니오티아, 사르코시스티스, 프렌켈리아, 헤모프로테우스, 루코사이토준, 테일레리아, 퍼킨수스 및 그레가리나 종; 뉴모시스티스 카리니; 마이코스포라 문의 구성원, 예컨대 노세마, 엔테로사이토준, 엔세팔리토준, 셉타타, 므라제키아, 암블리오스포라, 아메손, 글루게아, 플레이스토포라 및 마이크로스포리디움 종; 및 아세토스포라 문의 구성원 예컨대, 하플로스포리디움 종을 비롯하여, 플라스모디움 팔시파럼, P. 비박스, P. 오발레, P. 말라리아; 톡소플라스마 곤디; 라이슈만니아 멕시카나, L. 트로피카, L. 마조르, L. 애티오피카, L. 도노바니, 트리파노소마 크루지, T. 브루세이, 쉬스토소마 만소니, S. 헤마토비움, S. 자포니움; 트리키넬라 스피랄리스; 우케레리아 반크로프티; 브루기아 말라이리; 엔타모에바 히스토라이티카; 엔테로비우스 베르미큘로아루스; 태니아 솔리움, T. 사기나타, 트리코모나스 바기나리스, T. 호미니스, T. 테낙스; 기아르디아 람블리아; 크립토스포리디움 파르븀; 뉴모사이티스 카리니, 바베시아 보비스, B. 디베르겐스, B. 미크로티, 이소스포라 벨리, L 호미니스; 디엔타모에바 프라길리스; 온코세르카 볼불러스; 아스카리스 룸브리코이데스; 네카토르 아메리카니스; 안실로스토마 듀오데날레; 스트론길로이데스 스테르코랄리스; 카필라리아 필리피넨시스; 안지오스트론길러스 칸토넨시스; 히메놀렙시스 나나; 디필로보트리움 라툼; 에키노코커스 그래뉼로서스, E. 멀티롤로쿠라리스; 파라고니머스 웨스테르마니, P. 칼리엔시스; 클로노르키스 시넨시스; 오피스토르키스 페리네아스, G. 비베리니, 파시올라 헤파티카, 사르콥테스 트카비에이, 페디큘러스 휴마너스; 프티르러스 푸비스; 및 더마토비아 호미니스를 비롯하여, 병원성인 것으로 알려지거나 이후 동정된 임의의 기타 기생충으로부터 유래하는 항원을 포함한다.
5.4.2 이종 유전자 서열의 삽입
본 발명의 바이러스 벡터로 외래 유전자 서열의 삽입은 바이러스 코딩 영역을 이종 서열로 완전하게 치환하거나 또는 부분 치환하거나 또는 바이러스 게놈에 이종 뉴클레오티드 서열을 부가하여서 수행할 수 있다. 완전 치환은 아마도 PCR-지정 돌연변이 유발법을 통해서 수행하는 것이 가장 우수할 것이다. 간략하게, PCR 프라이머 A는 5'에서 3' 말단: 고유한 제한 효소 부위, 예컨대 클래스 IIS 제한 효소 부위 (즉, "쉬프터(shifter)" 효소; 특정 서열을 인식하지만 그 서열의 상류나 하류에 있는 DNA를 절단함); 교체하려는 유전자 영역에 상보적인 뉴클레오티드의 스트레치; 및 이종 서열의 카르복시 말단 코딩 부분에 상보적인 뉴클레오티스 스트레치를 포함한다. PCR-프라이머 B는 5'에서 3' 말단: 고유한 제한 효소 부위; 치환하려는 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 스트레치; 및 이종 또는 비천연 유전자의 5' 코딩 부분에 상응하는 뉴클레오티드 스트레치를 포함한다. 이들 프라이머와 이종 또는 비천연 유전자의 클론 복제물로 PCR 반응한 후, 그 산물을 고유한 제한 효소 부위를 사용하여 절단하고 클로닝한다. 클래스 IIS 효소를 이용한 분해 및 정제한 파지 폴리머라제를 통한 전사를 통해 이제 이종 또는 비천연 유전자 삽입물을 보유하는 바이러스 유전자의 정확한 비번역 말단을 포함하는 RNA 분자가 생성된다. 다른 구체예에서, PCR 프라이머 반응을 사용하여 박테리오파지 프로모터 서열, 및 하이브리드 유전자 서열을 함유하는 이중 가닥 DNA를 제조하여서 RNA 주형을 클로닝없이 직접 전사시킬 수 있다.
이종 뉴클레오티드 서열을 본 발명의 바이러스의 다양한 위치에 부가 또는 삽입할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 위치 1에 부가 또는 삽입시킨다. 다른 구체예에서, 이종 뉴클레오티드 서열을 위치 2에 부가 또는 삽입시킨다. 다른 구체예에서, 이종 뉴클레오티드 서열을 위치 3에 부가 또는 삽입시킨다. 다른 구체예에서, 이종 뉴클레오티드 서열을 위치 4에 부가 또는 삽입시킨다. 다른 구체예에서, 이종 뉴클레오티드 서열을 위치 5에 부가 또는 삽입시킨다. 또 다른 구체예에서, 이종 뉴클레오티드 서열을 위치 6에 부가 또는 삽입시킨다. 본 발명에서 사용하는 용어 "위치 (position)"는 전사되는 바이러스 게놈상에서의 이종 뉴클레오티드 서열의 위치를 의미하는데, 예를 들어, 위치 1은 전사되는 제1 유전자라는 의미이며, 위치 2는 전사되는 제2 유전자라는 의미이다. 바이러스 유전자의 낮은 번호 위치에서의 이종 뉴클레오티드 서열의 삽입은, 바이러스 게놈을 가로질러서 발생하는 전사 구배로 인하여, 높은 번호 위치의 삽입에 비하여 상기 이종 뉴클레오티스 서열의 발현이 보다 강하게 된다. 그러나, 전사 구배로 또한 바이러스 mRNA를 특정 비율로 수득하게 된다. 외래 유전자의 삽입은 이러한 비율을 방해하여서 바이러스 복제에 영향을 주는 바이러스 단백질의 양이 상이하게 합성되도록 할 수 있다. 따라서, 삽입 부위를 선택할 때, 전사 구배 및 복제 역학이 고려되어야 한다. 이종 뉴클레오티드 서열의 강한 발현이 바람직한 경우에는, 낮은 번호 위치에서의 이종 뉴클레오티드 서열 삽입이 본 발명에서는 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 상기 이종 서열은 위치 1, 2 또는 3에 부가 또는 삽입된다.
본 발명의 바이러스에 이종 뉴클레오티드 서열을 삽입할 때, 이종 유전자의 코딩 서열의 말단과 하류 유전자의 코딩 서열의 출발 사이의 유전자간 영역을 변경하여 바람직한 효과를 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용하는 용어 "유전자간 영역(intergenic region)"은 한 유전자의 정지 신호와 그 다음 하류 오픈 리딩 프레임의 코딩 서열의 출발 코돈(e.g., AUG) 사이에 존재하는 뉴클레오티스 서열을 의미한다. 유전자간 영역은 유전자의 비코딩 영역, 즉 전사 출발 부위와 유전자의 코딩 서열의 출발(AUG) 사이의 영역을 포함할 수 있다. 이 비코딩 영역은 일부 바이러스 유전자에서 천연적으로 발생하다.
다양한 구체예에서, 이종 뉴클레오티드 서열과 하류 유전자 사이의 유전자간 영역은 서로에 대해 독립적으로 조작할 수 있는데, 10 nt 이상의 길이, 20 nt 이상의 길이, 30 nt 이상의 길이, 50 nt 이상의 길이, 75 nt 이상의 길이, 100 nt 이상의 길이, 125 nt 이상의 길이, 150 nt 이상의 길이, 175 nt 이상의 길이, 200 nt 이상의 길이가 되도록 할 수 있다. 일 구체예에서, 이종 뉴클레오티드 서열과 하류유전자 사이의 유전자간 영역은 서로 독립적으로 조작할 수 있는데, 10 nt 이하의 길이, 20 nt 이하의 길이, 30 nt 이하의 길이, 50 nt 이하의 길이, 75 nt 이하의 길이, 100 nt 이하의 길이, 125 nt 이하의 길이, 150 nt 이하의 길이, 175 nt 이하의 길이, 200 nt 이하의 길이가 되도록 할 수 있다. 다양한 구체예에서, 바이러스 게놈 내 바람직한 유전자의 비코딩 영역을 또한, 서로 독립적으로 조작할 수 있는데, 10 nt 이상의 길이, 20 nt 이상의 길이, 30 nt 이상의 길이, 50 nt 이상의 길이, 75 nt 이상의 길이, 100 nt 이상의 길이, 125 nt 이상의 길이, 150 nt 이상의 길이, 175 nt 이상의 길이, 200 nt 이상의 길이가 되도록 할 수 있다. 일 구체예에서, 바이러스 게놈 내 바람직한 유전자의 비코딩 영역을 또한, 서로 독립적으로, 조작할 수 있는데, 10 nt 이하의 길이, 20 nt 이하의 길이, 30 nt 이하의 길이, 50 nt 이하의 길이, 75 nt 이하의 길이, 100 nt 이하의 길이, 125 nt 이하의 길이, 150 nt 이하의 길이, 175 nt 이하의 길이, 200 nt 이하의 길이가 되도록 할 수 있다.
이종 뉴클레오티드 서열을 삽입할 때, 위치적 효과 및 유전자간 영역 조작을 병용하여 바람직한 효과를 이룰 수 있다. 예를 들어, 상기 이종 뉴클레오티드 서열을, 위치 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택한 위치에 부가 또는 삽입시키고, 상기 이종 뉴클레오티드 서열과 그 다음 하류 유전자 사이의 유전자간 영역을 변경시킬 수 있다 (표 3 참조). 본 발명에 포함되는 상기 조합 중 일부를 표 3에 예시하여 나타내었다. 하기 표 3은 이종 뉴클레오티드의 삽입 모드의 일례들이다.
위치 1 위치 2 위치 3 위치 4 위치 5 위치 6
IGRa 10-20 10-20 10-20 10-20 10-20 10-20
IGR 21-40 21-40 21-40 21-40 21-40 21-40
IGR 41-60 41-60 41-60 41-60 41-60 41-60
IGR 61-80 61-80 61-80 61-80 61-80 61-80
IGR 81-100 81-100 81-100 81-100 81-100 81-100
IGR 101-120 101-120 101-120 101-120 101-120 101-120
IGR 121-140 121-140 121-140 121-140 121-140 121-140
IGR 141-160 141-160 141-160 141-160 141-160 141-160
IGR 161-180 161-180 161-180 161-180 161-180 161-180
IGR 181-200 181-200 181-200 181-200 181-200 181-200
IGR 201-220 201-220 201-220 201-220 201-220 201-220
IGR 221-240 221-240 221-240 221-240 221-240 221-240
IGR 241-260 241-260 241-260 241-260 241-260 241-260
IGR 261-280 261-280 261-280 261-280 261-280 261-280
IGR 281-300 281-300 281-300 281-300 281-300 281-300
a 유전자간 영역, 뉴클레오티드로 측정.
삽입시키는 이종 뉴클레오티드의 목적에 따라서(예컨대, 강한 면역원성의 부여 등), 삽입 위치 및 삽입되는 이종 뉴클레오티드 서열의 유전자간 영역 길이를 다양한 지표들, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나, 복제 역학 및 단백질이나 mRNA 발현 수준 등, 다음의 비제한적인 분석법들의 예를 통해 측정한 지표들을 통해 결정할 수 있다: 플라크 분석법, 형광 촛점 분석법, 감염 중심 분석법, 형질전환 분석법, 종료점 희석 분석법, 플레이팅 효율, 전자 현미경, 혈구 응집, 바이러스 효소 활성 측정, 바이러스 중성화, 혈구 응집 억제, 보체 결합법, 면역 염색법, 면역 침강법 및 면역블랏팅법, 효소 연결 면역흡착 분석법, 핵산 검출법 (예컨대, 서던 블랏 분석법, 노던 블랏 분석법, 웨스턴 블랏 분석법), 성장 곡선, 리포터 유전자의 적용(예를 들어, 리포터 유전자, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 강화 녹색 형광 단백질 (eGFP) 등을 사용하여, 단백질 발현을 관찰하기 위하여 관심 이종 유전자에 대해 수행한 동일한 방식으로 바이러스 게놈에 삽입시킴), 또는 이의 조합 등. 이러한 분석법을 수행하는 과정은 당분야에서 공지이며(예컨대 문헌 [Flint et al., PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2000, ASM Press pp 25-56] 참조, 이의 전체 내용을 본 발명의 참조문헌으로 포함시킴), 이의 비제한적인 예들은 이하 실시예 섹션에 기재하였다.
예를 들어, 발현 수준은 배양 중인 세포를 본 발명의 바이러스로 감염시키고 이어서 예를 들어, 이종 서열의 유전자 산물에 특이적인 항체를 이용하여 ELISA 또는 웨스턴 블랏 등을 통해 단백질 발현 수준을 측정하거나, 또는 예컨대 이종 서열에 특이적인 프로브를 사용하는 노던 블랏 분석법을 통해 RNA 발현 수준을 측정하여, 확인할 수 있다. 유사하게, 이종 서열의 발현 수준은, 동물 모델을 감염시키고 동물 모델에서 본 발명의 재조합 바이러스의 이종 서열로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하여 확인할 수 있다. 상기 단백질 수준은 감염된 동물로부터 조직 샘플을 얻어서, 이 조직 샘플에 대해 이종 서열의 유전자 산물에 특이적인 항체를 이용하는 웨스턴 블랏 분석 등을 실시하여 측정할 수 있다. 또한, 동물 모델을 사용하면, 이종 서열의 유전자 산물에 대하여 동물에서 생성되는 항체의 역가를, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, ELISA 등을 포함하는 당업자에게 공지인 임의 방법을 통해 확인할 수 있다.
이종 서열이 바이러스 게놈 내 뉴클레오티드 서열과 상동성을 가질 수 있기 때문에, 프로브 및 항체가 실제로 이종 서열 또는 이의 유전자 산물에 특이적인 것인지 주의를 기울여야 한다.
특정 일 구체예에서, 키메라 조류-인간 메타뉴모바이러스 유래의 hMPV의 F-단백질의 발현 수준은 다업자에게 공지인 임의 방법을 통해 확인할 수 있다. F-단백질의 발현 수준은, 배양 중인 세포를 본 발명의 키메라 바이러스로 감염시키고, 예컨대 hMPV의 F 단백질 및/또는 G-단백질에 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블랏 분석 또는 ELISA를 통해 단백질 발현 수준을 측정하거나, 인간 메타뉴모바이러스의 F-유전자 및/또는 G-유전자에 특이적인 프로브를 사용하는 노던 블랏 분석을 통하여 RNA 발현 수준을 측정하여 확인할 수 있다. 유사하게, 이종 서열의 발현 수준을 동물 모델을 사용하여 확인할 수 있는데 동물을 감염시키고 상기 동물 모델의 F-단백질 및/또는 G-단백질 수준을 측정한다. 상기 단백질 수준은, 감염된 동물로부터 조직 샘플을 얻고 이어서 상기 조직 샘플에 대하여 이종 서열의 F-단백질 및/또는 G-단백질에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블랏이나 ELISA를 실시하여 측정할 수 있다. 또한, 동물 모델을 사용하면, F-단백질 및/또는 G-단백질에 대하여 동물이 생산한 항체의 역가를, 이에 제한되는 것은 아니나, ELISA 등을 포함하는 당분야에서 공지인 임의 방법을 통해 확인할 수 있다.
본 발명의 재조합 바이러스의 복제율은 당업자에게 공지인 임의 방법을 통해 확인할 수 있다.
일 구체예에서, 바이러스 게놈 내에서 이종 서열의 최적 위치 및 유전자간 영역의 최적 길이의 확인을 촉진하기 위해서, 이종 서열은 리포터 유전자를 암호화한다. 최적 변수가 결정되면, 상기 리포터 유전자를 선택 항원을 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열로 치환한다. 당업자에게 공지인 임의 리포터 유전자를 본 발명의 방법과 함께 사용할 수 있다. 보다 구체적인 것은 섹션 5.8을 참조한다.
재조합 바이러스의 복제율은 당업자에게 공지인 임의 표준 방법을 통해 확인할 수 있다. 복제율은 바이러스의 성장률을 나타내므로 감염 후 시간에 대한 바이러스 역가를 그래프화하여서 측정할 수 있다. 바이러스 역가는 당업자에게 공지인 임의 방법을 통해 측정할 수 있다. 일 구체예에서, 바이러스를 포함하는 현탁물을 상기 바이러스의 감염에 민감한 세포와 배양한다. 본 발명의 방법과 함께 사용할 수 있는 세포 유형은 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대 Vero 세포, LLC-MK-2 세포, He[rho]-2 세포, LF 1043 (HEL) 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, tMK 세포, 293 T 세포, QT 6 세포, QT 35 세포, 또는 닭 배아 섬유아세포 (CEF) 등을 포함한다. 세포와 바이러스를 배양한 후, 감염된 세포의 수를 확인한다. 특정 일 구체예에서, 상기 바이러스는 리포터 유전자를 포함한다. 따라서, 리포터 유전자를 발현하는 세포의 수는 감염된 세포의 수를 나타내는 것이다. 특정 구체예에서, 상기 바이러스는 eGFP를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하며, eGFP를 발현하는 세포의 수는 즉, 바이러스에 감염된 세포의 수이며, FACS를 사용하여 확인한다.
일 구체예에서, 본 발명의 재조합 바이러스의 복제율은, 동일한 조건하에서, 상기 재조합 바이러스가 유래된 야생형 바이러스의 복제율의 20% 이하이다. 상기 동일한 조건은 동일한 바이러스의 초기 역가, 동일한 세포주, 동일한 배양 온도, 성장 배지, 세포수 및 복제율에 영향을 줄 수 있는 기타 시험 조건이 동일함을 의미한다. 예를 들어, 위치 1에 PIV F 유전자를 갖는 APV/hMPV의 복제율은 APV 복제율의 20% 이하이다.
일 구체예에서, 본 발명의 재조합 바이러스의 복제율은, 동일 조건하에서, 상기 재조합 바이러스가 유래한 야생형 바이러스의 복제율의 5% 이하, 10% 이하, 20% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 50% 이하, 75% 이하, 80% 이하, 90% 이하이다. 일 구체예에서, 본 발명의 재조합 바이러스의 복제율은, 동일한 조건하에서, 상기 재조합 바이러스가 유래된 야생형 바이러스의 복제율의 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 재조합 바이러스의 복제율은 동일한 조건하에서, 상기 재조합 바이러스가 유래된 야생형 바이러스의 복제율의 5% 내지 20%, 10% 내지 40%, 25 % 내지 50%, 40% 내지 75%, 50% 내지 80%, 또는 75 % 내지 90%이다.
일 구체예에서, 본 발명의 재조합 바이러스 내 이종 서열의 발현 수준은 동일한 조건하에서, 상기 재조합 바이러스가 유래된 야생형 바이러스의 F 단백질 발현 수준의 20% 이하이다. 상기 동일 조건은 바이러스의 동일한 초기 역가, 동일한 세포주, 동일한 배양 온도, 성장 배지, 세포수 및 복제율에 영향을 줄 수 있는 기타 테스트 조건을 의미한다. 예를 들어, hMPV의 위치 1에 있는 F-단백질의 이종 서열의 발현 수준은 hMPV의 F 단백질 발현 수준의 20% 이하이다.
일 구체예에서, 본 발명의 재조합 바이러스 내 이종 서열의 발현 수준은 동일한 조건하에서, 상기 재조합 바이러스가 유래된 야생형 바이러스의 F 단백질 발현 수준의 5% 이하, 10% 이하, 20% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 50% 이하, 75% 이하, 80% 이하, 90% 이하이다. 일 구체예에서, 본 발명의 재조합 바이러스 내 이종 서열의 발현 수준은 동일한 조건하에서, 상기 재조합 바이러스가 유래된 야생형 바이러스의 F 단백질 발현 수준의 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상이다. 일 구체예에서, 본 발명의 재조합 바이러스 내 이종 서열의 발현 수준은 동일한 조건하에서, 상기 재조합 바이러스가 유래된 야생형 F 단백질 발현 수준의 5% 내지 20%, 10% 내지 40%, 25% 내지 50%, 40% 내지 75%, 50% 내지 80%, 또는 75% 내지 90%이다.
5.4.3 유전자 내로의 이종 서열 삽입
G 단백질은 메타뉴모바이러스의 트랜스막 단백질이다. 특정 구체예에서, 이종 서열을 엑토도메인을 암호화하는 G-ORF 영역으로 삽입시켜서, 바이러스 엔벨로프 표면에 발현시킨다. 한 접근법에서, 상기 이종 서열을 어떠한 바이러스 서열도 결실시키지 않고 항원성 부위내에 삽입시킬 수 있다. 다른 접근법에서는, 상기 이종 서열로 G-ORF의 서열을 치환시킨다. 이러한 구축물의 발현 산물은 외래 항원에 대한 백신으로 유용할 수 있으며, 백신 예방한 숙주에서 재조합 바이러스의 증식과 관련된 문제를 실제 회피할 수 있다. 항원성 부위에만 치환을 보유한 완전한 G 분자는 G 기능이 가능하며 따라서 생바이러스의 구축이 가능하다. 따라서, 이러한 바이러스는 추가적인 헬퍼의 기능을 필요로하지 않으면서 성장할 수 있다. 상기 바이러스는 또한 우연한 일탈에 대한 임의의 위험성을 피하기 위해서 다른 방식으로 약독화시킬 수 있다.
세포 표면상에 단백질을 발현하거나 세포로부터 이들이 방출될 수 있도록 다른 하이브리드 구축물을 제조할 수 있다.
5.4.4 바이시스트론( BICISTRONIC) RNA의 구축
바이시스트론 mRNA를 구축하여 바이러스 서열 번역의 내부 개시를 가능하게 하고 정상적인 말단 개시 부위로부터 외래 단백질 코딩 서열의 발현을 가능하게 할 수 있다. 다르게는 바이시스트론 mRNA 서열을 구축하는데, 이때 바이러스 서열은 정상적인 말단 오픈 리딩 프레임으로부터 번역되는 반면, 외래 서열은 내부 부위로부터 개시된다. 일정한 내부 라이보솜 도입 부위(IRES) 서열을 사용할 수 있다. IRES는 MPV의 패키징 제한을 방해하지 않도록 충분히 짧게 선택되어야 한다. 따라서, 이러한 바이시스트론 접근법을 위해 선택된 IRES는 길이가 500 뉴클레오티드 이하인 것이 바람직하다. 특정 구체예에서, 상기 IRES는 피코르나바이러스로부터 유래하며 어떠한 추가적인 피코르나바이러스 서열도 포함하지 않는다. 특정 IRES 요소는, 이에 제한되는 것은 아니나, 포유류 BiP IRES 및 C형 간염 바이러스의 IRES 등을 포함한다.
다르게는, 외래 단백질은 새로운 내부 전사 유니트로부터 발현되는데, 이 전사 유니트는 개시 부위 및 폴리아데닐화 부위를 갖는다. 다른 구체예에서, 외래 유전자를 MPV 유전자에 삽입시켜 최종 발현 단백질을 융합 단백질로 얻는다.
5.5 재조합 cDNA 및 RNA 주형을 이용한 이종 유전자 산물의 발현
상기에서 기술한 바와 같이 제조된 바이러스 벡터 및 재조합 주형을 다양한 방식으로 사용하여 적절한 숙주 세포에서 이종 유전자 산물을 발현시키거나 이종 유전자 산물을 발현하는 키메라 바이러스를 생성할 수 있다. 하나의 구체예에서, 재조합 cDNA를 사용하여 적절한 숙주 세포를 형질감염시키고, 최종 RNA는 고수준으로 이종 유전자 산물을 발현하게 된다. 고수준의 발현을 제공하는 숙주 세포계는, 예컨대 각각 APV 또는 MPV로 중복감염된 세포주, APV 또는 MPV 기능을 상보하도록 조작된 세포주 등과 같은, 바이러스 기능을 제공하는 연속 세포주를 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 이종 유전자 산물을 발현시키기 위하여, 재조합 주형을 사용하여 바이러스 폴리머라제 단백질을 발현하는 세포주를 형질감염시킬 수도 있다. 이러한 목적을 위해서, 폴리머라제 단백질 예컨대 L 단백질을 발현하는 형질전환 세포주를 적절한 숙주 세포로 사용할 수 있다. 숙주 세포는 예컨대 G 또는 N 등의 기타 바이러스 기능이나 추가 기능을 제공하도록 유사하게 조작할 수도 있다.
다른 구체예에서, 이종 유전자 산물을 발현시키기 위하여, 헬퍼 바이러스는 세포가 사용하는 RNA 폴리머라제 단백질을 제공할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 예컨대 N, P, L, 및 M2-1 단백질 등의 바이러스 단백질을 암호화하는 벡터로 세포를 형질감염시킨다.
5.6 재조합 바이러스 입자의 복구(RESCUE)
본 발명의 재조합 바이러스 및 키메라 바이러스를 제조하기 위하여, 플러스 또는 마이너스 센스에 본 발명의 재조합 또는 키메라 바이러스의 게놈을 암호화한 cDNA를 사용하여 복제 및 복구에 요구되는 바이러스 단백질 및 기능을 제공하는 세포를 형질감염시킬 수 있다. 다르게는, 본 발명의 재조합 바이러스를 위한 DNA 또는 RNA 분자로 형질감염시키기 전, 동안 또는 후에 헬퍼 바이러스로 세포를 형질감염시킨다. 본 발명의 합성 재조합 플라스미드 DNA 및 RNA를 복제시켜서 감염성 바이러스 입자내로 복구시킬 수 있는데, 이는 당분야에서 공지인 방법들, 예컨대 다음의 문헌들을 참조할 수 있으며, 이들을 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다: 1992년 11월 24일 발행된 U.S.특허 제5,166,057호; 1998년 12월 29일 발행된 U.S. 특허 제5,854,037호; 1996년 2월 20일 공개된 유럽공개특허 제EP 0702085A1호; U.S. 특허출원 제09/152,845호; 1997년 4월 3일 공개된 국제공개특허 제WO97/12032호; 1996년 11월 7일 공개된 국제공개특허 제WO96/34625호; 유럽공개특허 제EP-A780475호; 1999년 1월 21일 공개된 국제공개특허 제WO99/02657호; 1998년 11월 26일 공개된 국제공개특허 제WO98/53078호; 1998년 1월 22일 공개된 국제공개특허 제WO98/02530호; 1999년 4월 1일 공개된 국제공개특허 제WO99/15672호; 1998년 4월 2일 공개된 국제공개특허 제WO98/13501; 1997년 2월 20일 공개된 국제공개특허 제WO97/06270호; 및 1997년 6월 25일 공개된 EPO 780 47SA1.
일 구체예에서, 본 발명의, 합성 재조합 바이러스 RNA를 제조할 수 있는데, 성숙한 비리온을 생성하는데 요구되는 패키징 신호 및 바이러스 폴리머라제에 의해 인식에 필수적인 음성 가닥 바이러스 RNA의 비코딩 영역(리더 및 트레일러)을 포함한다. 음성 가닥 RNA 바이러스를 복구하는데 역유전학을 적용하기 위해 사용할 수 있는 여러 접근법이 존재한다. 우선, 재조합 DNA 주형으로부터 재조합 RNA를 합성하고 정제한 바이러스 폴리머라제 복합체를 사용하여 시험관내에서 재구성하여 세포를 형질감염시키는데 사용할 수 있는 재조합 리보핵단백질(RNPs)을 형성시킨다. 다른 접근법에서, 시험관내에서나 생체내에서나, 합성 RNA의 전사 동안 바이러스 폴리머라제 단백질이 존재하면 보다 효율적인 형질감염을 이룰 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 폴리머라제 단백질을 암호화하는 cDNA 플라스미드와 시험관내에서 함께 전사시키거나, 또는 폴리머라제 단백질이 존재하는 생체내 즉, 폴리머라제 단백질을 일시적으로 또는 구성적으로 발현시키는 세포에서 전사된 cDNA 플라즈미드로부터 합성 RNA를 전사시킬 수 있다.
또한, 본 명세서에서 기술하는 접근법은, 감염성 키메라 또는 재조합 바이러스를, 메타뉴모바이러스 폴리머라제 단백질을 발현하는 숙주 세포계(예를 들어, 바이러스/숙주 세포 발현계; 폴리머라제 단백질을 발현하도록 조작한 형질전환 세포주 등)에서 복제시켜서, 감염성 키메라 또는 재조합 바이러스를 복제 및 복구시킨다. 이 예에서, 헬퍼 바이러스를 사용할 필요가 없는데, 이러한 기능은 발현되는 바이러스 폴리머라제 단백질에 의해 제공되기 때문이다.
본 발명에 따르면, 당분야의 당업자에게 공지인 임의 방법을 사용하여 재조합 및 키메라 바이러스의 복제 및 복구를 달성할 수 있다. 한 접근법에서는 숙주 세포를 형질감염시키기 전에 시험관 내에서 복제에 필요한 기능 및 바이러스 단백질을 제공하는 것이 포함된다. 이러한 구체에에서, 바이러스 단백질은 야생형 바이러스, 헬퍼 바이러스, 정제 바이러스 단백질 또는 재조합으로 발현되는 바이러스 단백질의 형태로 제공될 수 있다. 바이러스 단백질은 키메라 바이러스를 암호화하는 합성 cDNA 또는 RNA의 전사 전, 동안 또는 후에 제공될 수 있다. 전체 혼합물을 사용하여 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있다. 다른 접근법에서, 복제에 요구되는 바이러스 단백질 및 기능들은 키메라 바이러스를 암호화하는 합성 cDNA 또는 RNA의 전사 전 또는 그 동안에 제공될 수 있다. 이러한 구체예에서, 복제에 요구되는 바이러스 단백질 및 기능은, 감염 또는 형질감염을 통해 숙주 세포에 도입되는 바이러스 단백질을 발현하는 합성 cDNA 또는 RNA, 바이러스 추출물, 헬퍼 바이러스, 야생형 바이러스의 형태로 제공된다.
특히 바람직한 접근법에서, 본 발명의 모든 바이러스 유전자, 키메라 또는 재조합 바이러스, 즉 APV, MPV, MPV/ APV 또는 APV/MPV를 발현하도록 조작된 세포에 의하여, 목적하는 유전형을 함유하는 감염성 바이러스가 생산되어서, 선별 시스템에 대한 필요성이 제거된다. 이론적으로, MPV의 구조 단백질을 암호화하는 ORF 중 임의 하나의 일부 또는 ORF 중 어떤 하나를 외래 서열로 치환할 수 있다. 그러나, 이러한 등식에 필요한 부분은 결함 바이러스(정상적인 바이러스 유전자 산물이 소실되거나 변경된 결함)을 증식시키는 증력이다. 이러한 문제를 피할 수 있는 다수의 가능한 접근법이 존재한다. 하나의 접근법에서는, 돌연변이 단백질을 보유한 바이러스는 동일한 단백질의 야생형을 구성적으로 발현하도록 구축된 세포주에서 성장시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 세포주는 바이러스에서 돌연변이를 보상한다. 유사한 방법을 사용하여 MPV 유전자 중 어떠한 것을 구성적으로 발현시키는 형질전환 세포주를 구축할 수 있다. 바이러스 단백질을 발현하도록 제조한 이런 세포주들을 사용하여 키메라 또는 재조합 바이러스의 결함을 보상하여서 증식시킬 수 있다. 다르게는, 키메라 또는 재조합 바이러스를 증식시키기 위하여 일정한 천연 숙주 범위 시스템을 이용가능하다.
또 다른 구체예에서, 복제에 요구되는 바이러스 단백질 및 기능은 합성 cDNA 또는 RNA 형태의 유전 물질로 제공되어서 키메라 바이러스를 암호화하는 합성 cDNA 또는 RNA와 함께 전사시킨다. 특히 바람직한 접근법에서, 키메라 바이러스 및 바이러스 폴리머라제 및/또는 다른 바이러스 기능을 발현하는 플라스미드들을 숙주 세포에 함께 형질감염시킨다. 예를 들어, 하나 이상의 이종 서열이 있거나 없는, 게놈성 또는 안티게놈성 APV, MPV, MPV/APV 또는 APV/MPV RNA와 뉴모바이러스 폴리머라제 단백질 N, P, L, 또는 M2-1을 암호화하는 플라스미드를 함께 사용하여 숙주 세포를 형질감염시킨다. 다르게는 본 발명의 재조합 바이러스의 복구는 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 변성 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA)를 사용하거나, 또는 MVA와, 폴리머라제 단백질(N, P, 및 L)을 암호화하는 플라즈미드의 조합을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, MVA-T7 또는 계두-T7으로 Vero 세포, LLC-MK-2 세포, HEp-2 세포, LF 1043 (HEL) 세포, tMK 세포, LLC- MK2, HUT 292, FRHL-2 (rhesus), FCL-I (green monkey), WI-38 (인간), MRC-5 (인간) 세포, 293 T 세포, QT 6 세포, QT 35 세포 및 CEF 세포를 형질 감염시킨다. MVA-T7 또는 계두-T7으로 감염시킨 후, 본 발명의 재조합 바이러스를 암호화하는 안티게놈성 또는 게놈성 cDNA와 N, P, L, 및 M2-1 암호화 발현 플라스미드를 함께 사용하여 세포를 형질감염시킬 수 있다. 다르게는, 플라스미드 형질감염을 통해서 폴리머라제를 제공할 수 있다. 세포와 세포 상등액을 이후에 회수하여서 단일 동결 해동 순환을 실시한다. 얻어진 세포 용출물을 사용하여, 이후 백시니아 바이러스의 복제 억제제인 1-베타-D-아라비노푸라노실시토신(ara C) 존재하의 신선한 Vero 세포 단층을 감염시키고, 사용하고, 바이러스 스톡을 생성시킨다. 이들 플레이트 유래의 상등액 및 세포를 이후 회수하고, 동결 냉동을 한번 수행한 후 본 발명의 재조합 바이러스 입자의 존재를, 특정 바이러스에 특이적인 항혈청을 사용하는 바이러스 플라크의 면역 염색법을 통해 분석하였다.
키메라 또는 재조합 바이러스를 증식시키는 다른 접근법으로는 야생형 바이러스와의 공동 배양을 포함할 수 있다. 이는 재조합 바이러스 및 이것과 다른 야생형 바이러스로 함께 감염된 세포를 통해 간단하게 수행할 수 있다. 야생형 바이러스는 결함 바이러스 유전자 산물을 보상해야 하며 야생형 및 재조합 바이러스 모두를 성장시켜야 하다. 다르게는 헬퍼 바이러스를 사용하여 재조합 바이러스의 증식을 지원할 수도 있다.
다른 접근법에서, 메타뉴모바이러스 폴리머라제 단백질을 발현하는 재조합 바이러스와 함께 감염시킨 세포에서 합성 주형을 복제시킬 수 있다. 사실, 이 방법을 사용하여 본 발명에 다른 재조합 감염성 바이러스를 복구시킬 수도 있다. 이러한 목적을 위해서, 메타뉴모바이러스 폴리머라제 단백질을, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 배큘로바이러스 등), 또는 폴리머라제 단백질을 발현하는 세포주(예를 들어, 문헌 [Krystal et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2709-2713] 참조)를 포함하는, 임의 발현 벡터/숙주 세포계에서 발현시킨다. 또한, 모든 메타뉴모바이러스 단백질을 발현하는 숙주 세포의 감염을통해서 감염성 키메라 바이러스 입자의 생산이 일어난다. 주목할 것은, 바이러스의 생존능을 변경하지 않으면서 재조합 바이러스를 구축하는 것이 가능할 수 있다. 이들 변경된 바이러스들은 이후 성장 능력이 있으며 복제를 위하여 헬퍼 기능을 요구하지 않는다.
본 발명의 방법에 따라서 재조합적으로 바이러스를 생성시키기 위하여, 바이러스 게놈을 암호화하는 유전 물질을 전사시켜야 한다(전사 단계). 이 단계는 시험관 내(숙주 세포 밖) 또는 생체 내(숙주 세포 안)에서 수행할 수 있다. 바이러스 게놈은 유전 물질로부터 전사되어서 바이러스 게놈의 양성 센스 복제본(안티게놈 복제본) 또는 바이러스 게놈의 음성 센스 복제본(게놈 복제본)을 생성할 수 있다. 다음 단계에서는 바이러스 게놈의 복제 및 이 복제된 게놈을 바이러스 입자내로 패키징하는 것이 필요하다(복제 및 패키징 단계). 이 단계는 바이러스 복제 및 패키징에 필요한 바이러스 폴리머라제 및 구조 단백질을 충분한 수준으로 제공하도록 조작된 숙주 세포 내에서 세포내적으로 발생한다.
전사 단계가 시험관 내에서 발생하면, 다음으로 세포내 복제 및 바이러스 게놈의 패키징이 후속된다. 전사 단계가 생체내에서 발생한 경우, 당분야의 당업자에게 알려진 다양한 방법을 사용하고 다양한 공급원으로부터 생성되거나 얻을 수 있는 바이러스 게놈을 암호화하는 바이러스 유전 물질의 발현 전, 이와 동시에 또는 이후에 바이러스 게놈의 전사가 발생할 수 있다. 상기 유전 물질은 바이러스 자체로부터 분리가능하다. 예를 들어, 바이러스 RNA 게놈 및 폴리머라제 단백질의 복합체인, 리보핵단백질 복합체(RNP)를 전체 바이러스로부터 분리가능하다. 상기 바이러스 RNA를 연합되어 있는 단백질, 예컨대 바이러스 RNA 폴리머라제 및 핵 단백질에서 분리시킨다.
바이러스 게놈을 암호하하는 유전 물질은 표준 재조합법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 유전 물질은 전체 길이의 바이러스 게놈 또는 이의 일부를 암호화할 수 있다. 다르게는, 유전 물질은 바이러스 게놈의 리더 및/또는 트레일러 서열에 측접한 이종 서열을 암호화할 수 있다. 당분야의 공지 방법을 사용하여 몇몇 작은 PCR 단편을 조합하여 전체 길이 바이러스 게놈을 얻을 수 있다. hMPV의 다양한 분리주의 제한 효소 지도를 도 10에 도시하였다. 제한 효소 부위는 전체 길이 구축물을 조합하는데 사용할 수 있다. 일 구체예에서, PCR 반응으로 생성된 단편이 이의 5' 말단에 인접한 제한 효소 부위 및 3' 말단에 인접한 제한 효소 부위를 갖도록 PCR 프라이머를 설계한다. 다음으로 이 PCR 산물을 각 제한 효소로 분해하고 이후 인접한 PCR 단편과 결찰시킨다.
바이러스 게놈의 복제 및 패키징을 수행하기 위하여, 중요한 것은 리더 및 트레일러 서열이 바이러스 폴리머라제 인식에 필수적인 신호를 보유하는 것이다. 바이러스 RNA에 대한 리더 및 트레일러 서열을 최적화하거나 다양화시켜서 바이러스 복제 및 복구를 향상 및 증가시킬 수 있다. 다르게는, 리더 및 트레일러 서열을 변형시켜서 바이러스 복제 및 패키징 효율을 저하시켜서, 약독화 표현형을 갖는 복구 바이러스를 발생시킨다. 다양한 리더 및 트레일러 서열의 예로는 이에 제한된 것은 아니나, 예컨대 파라믹소바이러스의 리더 및 트레일러 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 구체예예서, 리더 및 트레일러 서열은 야생형 또는 돌연변이된 hMPV의 것이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 리더 및 트레일러 서열은 PIV, APV, 또는 RSV의 것이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 리더 및 트레일러 서열은 상이한 바이러스 기원을 조합한 것이다. 예를 들어서 이러한 가능한 조합에 제한되는 것은 아니나, hMPV, PIV, APV, RSV5 또는 임의의 다른 파라믹소바이러스의 리더 및 트레일러 서열 중 어떠한 것이라도 조합할 수 있다. 리더 및 트레일러 서열을 변형하는 예로는 바이러스 프로모터에 대한 간격의 다양화, 서열의 다양화, 예컨대 G 잔기 수(통상 0 내지 3)의 다양화, 및 시험관 내에서 생산된 런오프 RNA에 대한 제한 효소 이용 및 헤파타이티스 델타 바이러스(HDV)의 라이보자임 서열, 해머헤드 라이보자임 서열, 라이보자임 촉매 활성을 보유하는 이의 단편 등을 포함하는 라이보자임 서열을 이용한 5' 또는 3'의 한정화 등을 포함한다.
다른 구체예에서, 바이러스 복제 및 복구 효율은 바이러스 게놈이 헥사머 길이이면 증가시킬 수 있다. 바이러스 게놈이 적절한 길이를 갖도록 이를 보장하기 위하여, 5' 및 3' 말단을, 예컨대 시험관 내에서 생산된 런오프 RNA에 대한 제한 효소 이용 및 헤파타이티스 델타 바이러스(HDV)의 라이보자임 서열, 해머헤드 라이보자임 서열, 라이보자임 촉매 활성을 보유하는 이의 단편 등을 포함하는 라이보자임 서열을 이용하여 한정할 수 있다.
전사되는 바이러스 게놈을 암호화하는 유전 물질을 위하여, 상기 유전물질을 조작하여 적절한 전사 조절 서열, 예를 들어 폴리머라제가 인지하는 프로모터 서열의 제어하에 위치시킨다. 바람직한 구체예에서, 상기 프로모터 서열은 T7, SP6 또는 T3 폴리머라제에 의해 인지된다. 또 다른 구체예에서, 프로모터 서열은 세포의 DNA 의존적 RNA 폴리머라제, 예컨대 RNA 폴리머라제 I (Pol I) 또는 RNA 폴리머라제 II (Pol II)에 의해 인지된다. 바이러스 게놈을 암호화하는 유전 물질은 전사 조절 서열의 제어하에 위치하여서, 바이러스 게놈의 양성 또는 음성 가닥 복제본이 전사될 수 있다. 바이러스 게놈을 암호화하는 유전 물질을 재조합적으로 조작하여, 발현 벡터, 예컨대 플라스미드계 벡터, 예컨대 pol II 프로모터 예를 들어 CMV의 가장 초기(immediate early) 프로모터를 보유한 플라스미드, T7 프로모터를 갖는 플라스미드, 또는 바이러스계 벡터, 예컨대 백시니아 벡터, MVA-T7, 및 계두 벡터를 비롯한 폭스 바이러스 벡터 내에서 전사 조절 서열과 작동적으로 연결되도록 할 수 있다.
바이러스 게놈을 암호화하는 유전 물질을 변형시켜서 선택적으로 폴리머라제에 의한 발현을 증가시킬 수 있는데, 예를 들어, 리더나 트레일러 서열의 상류 G 잔기의 수(통상 0 내지 3)를 다양화시켜서 T7 프로모터에 의한 발현을 최적화시킨다.
바이러스 게놈의 복제 및 패키징은 바이러스 복제 및 패키징이 허용되는 숙수 세포의 세포내에서 발생한다. 적절한 헬퍼 바이러스로 숙주 세포를 감염시키거나, 바이러스 폴리머라제 및 구조 단백질이 안정적으로 또는 구성적으로 발현되도록 숙주 세포를 조작하거나, 또는 바이러스 폴리머라제 및 구조 단백질이 일시적으로 또는 유도적으로 발현되도록 숙주 세포를 조작하거나 하는 등의 방법을 포함하여, 복제 및 패키징에 필요한 바이러스 폴리머라제 및 구조 단백질을 충분한 수준으로 제공하도록 숙주 세포를 조작할 수 있는 다양한 방법들이 존재한다.
MPV 바이러스 복제 및 패키징에 요구되는 단백질 기능은, 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리머라제 단백질 P, N, L, 및 M2-1을 포함한다.
하나의 구체예에서, 발현된 단백질은 천연 또는 야생형 MPV 단백질이다. 다른 구체예에서, 표준 재조합 방법을 사용하여, 발현 및/또는 폴리머라제 활성 수준이 증가되도록 발현 단백질을 변형시킬 수 있다. 다르게는, 폴리머라제 활성을 보유한 폴리머라제 단백질의 단편, 유도체, 유사체, 또는 절두형으로 발현시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 다른 뉴모바이러스, 예컨대 APV, 또는 임의의 기타 파라믹소바이러스 유래의 유사 폴리머라제 단백질을 발현시킬 수 있다. 또한, 다른 바이러스주의 게놈과 함께 MPV의 한 바이러스주의 단백질을 발현시켜서 약독화 바이러스를 생산할 수 있다. 예를 들어, MPV의 한 바이러스주의 폴리머라제 단백질을 다른 바이러스주의 게놈과 함께 발현시켜서 약독화 표현형을 생산시킨다.
바이러스 폴리머라제 단백질은 헬퍼 바이러스에 의해 제공될 수 있다. 본 발명에 따라 사용가능한 헬퍼 바이러스는 천연적으로 폴리머라제 바이러스 단백질을 발현하는 것들, 예컨대 MPV, 또는 APV 등을 포함한다. 다르게는, 폴리머라제 바이러스 단백질을 제공하도록 재조합적으로 조작된 헬퍼 바이러스를 사용할 수도 있다.
다르게는, 발현 벡터를 통해 바이러스 폴리머라제 단백질을 제공할 수 있다. 바이러스 폴리머라제 단백질을 암호화하는 서열을, 적절한 전사 조절 서열, 예컨대 폴리머라제가 인지하는 프로모터 서열의 제어하에 위치하도록 조작한다. 바람직한 구체예에서, 프로모터 서열은, T7, SP6 또는 T3 폴리머라제에 의해 인지된다. 다르게는, 프로모터 서열은, 바이러스 폴리머라제, 예컨대 CMV에 의해 인지된다. 바이러스 폴리머라제 단백질을 암호화하는 서열을 재조합적으로 조작하여서, 발현 벡터, 예컨대 플라스미드계 벡턱, 예를 들어 CMV 유래 플라스미드, T7 유래 플라스미드, 또는 바이러스계 벡터, 예컨대 백시니아 벡터, MVA-T7, 및 계두 벡터를 포함한 폭스 바이러스 벡터 등의 전사 조절 서열과 작동적으로 연결된다.
효율적인 바이러스 복제 및 패키징을 이루기 위하여, 폴리머라제 단백질의 발현 수준이 높은 것이 바람직하다. 이러한 수준은, 전체 길이 바이러스 cDNA를 암호화하는 플라스미드 2-4ug과 함께, 파라믹소바이러스 단백질을 암호화하는 100-200ng L/pCITE, 200-400ng N/pCITE, 200-400ng P/pCITE, 및 100-200ng M2-l/pCITE 플라스미드를 MVA-T7으로 감염된 세포에 형질감염시켜서 얻을 수 있다. 다른 구체예에서, N cDNA 삽입물을 갖는 pCITE 벡터 0.1-0.8ug, pRF542 (T7 폴리머라제를 발현함), pSH25 (CAT 발현) 0.1-2.0ug, 및 각각 P, L, 및 M2-1 cDNA 삽입물을 함유하는 3종의 pCITE 벡터 0.1-1.0 ug을 사용한다. 다르게는, 정제한 리보핵단백질로 세포를 형질감염시켜서, 하나 이상의 폴리머라제 및 구조 단백질을 유전 물질과 함께 결합시켜서 세포 내로 도입시킬 수 있다. MPV 바이러스의 복제 및 패키징이 허용되는 숙주 세포가 바람직하다. 바람직한 숙주 세포의 예로는 이에 제한되는 것은 아니나, 293T, Vero, tMK, 및 BHK 등이 포함된다. 숙주 세포의 다른 예로는 이에 제한되는 것은 아니나, LLC-MK-2 세포, Hep-2 세포, LF 1043 (HEL) 세포, LLC-MK2, HUT 292, FRHL-2 (붉은털 원숭이), FCL-I (녹색 원숭이), WI-38 (인간), MRC-5 (인간) 세포, QT 6 세포, QT 35 세포 및 CEF 세포 등을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 바이러스 복제 및 패키징을 최적화하기 위하여, 형질 감염 및/또는 감염 효율, 단백질 발현 수준이 증가하도록, 숙주 세포를 다수의 방법을 사용하여 처리할 수 있다. 이러한 처리 방법은 이에 제한되는 것은 아니나, 초음파법, 동결/해동법, 열충격 등을 포함한다. 또한, 당업자에게 공지인 표준 방법을 사용하여 형질감염 및/또는 감염 프로토콜을 최적화할 수 있는데, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 인산칼슘 침전법, 리포펙틴 처리법, 리포솜-매개 형질감염법 및 전기천공법 등을 포함한다. 당업자라면 형질감염/감염 프로토콜을 최적화하는데 이용가능한 표준 방법에 익숙하다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, 필요한 단백질을 제공하도록 바이러스를 사용할 때 형질감염에 대한 감염 시기의 조정, 상이한 플라스미드의 형질감염 시기 조정, 및 바이러스 및 형질감염 플라스미드의 상대량에 영향을 주는 방법 등을 포함하는 방법 등을 사용할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 복구된 바이러스이외의 바이러스 유래의 폴리머라제를 사용하여, cDNA로부터 생바이러스를 생산 또는 복구하는 것에 관한 것이다. 일 구체예에서, 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대 종간 (interspecies) 및 종내(intraspecies)의 폴리머라제를 포함하는 임의의 다수 폴리머라제를 사용하여 cDNA로부터 hMPV를 복구할 수 있다. 일 구체예에서, hMPV 복제에 필요한 최소의 복제 유닛을 발현하는 숙주 세포 내에서 hMPV를 복구할 수 있다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, RSV, APV, MPV, 또는 PIV의 폴리머라제를 포함하는, 다수의 폴리머라제를 사용하여 cDNA로부터 hMPV를 복구할 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, RNA 바이러스의 폴리머라제를 사용하여 hMPV를 복구할 수 있다. 본 발명의 보다 특정 구체예에서, 음성 가닥 RNA 바이러스의 폴리머라제를 사용하여 hMPV를 복구할 수 있다. 본 발명의 더욱 특정한 구체예에서, RSV 폴리머라제를 사용하여 hMPV를 복구할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, APV 폴리머라제를 사용하여 hMPV를 복구할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, MPV 폴리머라제를 사용하여 hMPV를 복구할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, hMPV는 PIV 폴리머라제를 사용하여 복구할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, hMPV는 hMPV 폴리머라제 단백질의 복합체를 사용하여 cDNA로부터 복구할 수 있다. 예를 들어, L, P, N, 및 M2-1 단백질로 이루어진 폴리머라제 복합체를 사용하여 hMPV 미니레플리콘을 복구할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 폴리머라제 복합체는 L, P, 및 N 단백질로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, hMPV는 다른 바이러스, 예컨대 이에 제한되지는 않으나, RSV, PIV, 및 APV 유래의 폴리머라제 단백질로 이루어진 폴리머라제 복합체를 사용하여 cDNA로부터 복구할 수 있다. 구체적으로, RSV, PIV, APV, MPV, 또는 이들의 임의 조합의 L, P, N, 및 M2-1 단백질로 이루어진 폴리머라제 복합체를 사용하여 cDNA로부터 hMPV를 복구할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, cDNA로부터 hMPV를 복구하는데 사용되는 상기 폴리머라제 복합체는 RSV, PIV, APV, MPV, 또는 이들의 임의 조합의 L, P, 및 N 단백질로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 다양한 바이러스 유래의 상이한 폴리머라제 단백질을 사용하여 폴리머라제 복합체를 형성시킬 수 있다. 이러한 구체예에서, hMPV를 복구하는데 사용하는 폴리머라제는 RSV, PIV, APV, 또는 MPV 폴리머라제의 상이한 성분들에 의해 형성될 수 있다. 이의 예로는, N 단백질은 RSV, APV, PIV 또는 MPV의 N 유전자로부터 암호화될 수 있으며 L 단백질은 RSV, APV, PIV 또는 MPV의 L 유전자에 의해 암호화되며 P 단백질은 RSV, APV, PIV 또는 MPV의 P 단백질에 의해 암호화될 수 있다. 당분야의 당업자는 cDNA로부터 hMPV를 복구하는데 필요한 폴리머라제 복합체를 형성하는데 사용할 수 있는 가능한 조합을 결정할 수 있다.
일 구체예에서, 건강하며 고수율의 세포 배양물(예컨대 본 발명의 바이러스 백신 후보물을 제조하는데 이로운)을 생산하기 위하여 바이러스의 증식을 위한 조건을 최적화한다. 결정적인 변수를 확인할 수 있으며, 생산 공정은 우선 소규모 실험에서 최적화하여서 확장성, 강건성, 및 재생성 등을 결정하고 이후 대규모 바이러스 생산에 적용한다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 증식시키는 바이러스는 hMPV이다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 증식시키는 바이러스는 재조합 또는 키메라 hMPV이다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 증식시키는 바이러스는 다음의 바이러스 패밀리 중 하나의 바이러스이다: 아데노비리데, 아레나비리데, 아스트로비리데, 배큘로비리데, 부니아비리데, 칼리시비리데, 카울리보비리데, 코로나비리데, 시스토비리데, 필로비리데, 플라비비리데, 헤파드나비리데, 헤르페스비리데, 하이포비리데, 이데오비리데, 이노비리데, 이리도비리데, 레비비리데, 리포트릭스비리데, 루테오비리데, 마클로모비리데, 마라피비리데, 마이크로비리데, 미오비리데, 뉴로비리데, 노다비리데, 오르쏘믹소비리데, 파포바비리데, 파라믹소비리데, 파르티티비리데, 파보비리데, 피코드나비리데, 피코르나비리데, 플라스마비리데, 포도비리데, 폴리드나비리데, 포티비리데, 폭스비리데, 레오비리데, 레트로비리데, 라브도비리데, 세쿠이비리데, 시포이비리데, 소베모비리데, 텍티비리데, 테뉴이비리데, 테트라비리데, 토바모비리데, 토브라비리데, 토가비리데, 톰버스비리데, 토티비리데, 트리코비리데, 모노네가비리데. 일 구체예에서, 본 발명의 방법으로 증식하는 바이러스는 RNA 바이러스이다. 일 구체예에서, 상기 바이러스는 헤르페스비리데 패밀리의 바이러스가 아니다. 일 구체예에서, 상기 바이러스는 HSV가 아니다.
일 구체예에서, 바이러스 또는 관심 바이러스 구축물로 감염된 세포 배양물은 배양중인 세포에 대한 표준 배양 온도와 비교하여 보다 낮은 감염후 배양 온도에서 배양한다. 특정 구체예에서, 관심 바이러스 구축물로 감염된 세포 배양물은 33℃ 또는 약 33℃ (e.g., 33±1℃)에서 배양한다. 일 구체예에서, 감염후 배양 온도는 약 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃ 또는 37℃이다.
일 구체예에서, 바이러스로 감염시키기 전 세포 성장에 최적인 온도에서 세포를 배양하고 이후 상기 세포를 바이러스로 감염시키고, 즉 감염후, 온도를 저온으로 이동하여서 바이러스를 증식시킨다. 일 구체예에서, 상기 온도 이동은 적어도 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃ 이상, 또는 12℃ 이상이다. 일 구체예에서, 상기 온도 이동은 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃ 이하, 또는 12℃ 이하이다. 특정 구체예에서, 상기 온도 이동은 4℃이다.
일 구체예에서, 상기 세포는 바이러스 또는 관심 바이러스 구축물로 감염 전 혈청 함유 배지에서 배양시키고, 바이러스 또는 바이러스 구축물로 감염시킨 후에는 혈청없는 배지에서 배양한다. 혈청없이 감염 세포를 성장시키는 것은 구체적으로, 예컨대 "무혈청 배지에서 바이러스의 플라스미드만 회수"라는 제목의 섹션을 참조한다. 특정 구체예에서, 혈청은 태아소 혈청이고 배양 부피의 5% 농도, 배양 부피의 2% 농도, 또는 배양 부피의 0.5% 농도로 존재한다.
일 구체예에서, 바이러스는 바이러스로 감염된 세포를 혈청 부재하에서 배양시켜서 증식시킨다. 일 구체예에서, 혈청이 5% 이하, 2.5% 이하, 1% 이하, 0.1% 이하, 0.01% 이하, 또는 0.001% 이하로 함유된 배양 배지에서, 바이러스로 감염된 세포를 배양하여 상기 바이러스를 증식시킨다.
일 구체예에서, 바이러스로 감염전 세포를 혈청 함유 배지에서 배양한다. 일 구체예에서, 세포를 바이러스로 감염시킨 후, 상기 세포를 혈청 부재하에서 배양한다. 다른 구체예에서, 상기 세포를 우선 혈청 함유 배지에서 배양시키고, 이어서, 혈청이 없는 배지로 세포를 이동시키며, 이후, 상기 세포를 바이러스로 감염시키고, 바이러스 부재에서 더욱 배양시킨다.
일 구체예에서, 혈청 함유 배지를 세포로부터 제거하고 혈청 무함유 배지를 첨가하여서, 상기 세포를 혈청 함유 배지에서 혈청 부재 배지로 이동시킨다. 다른 구체에에서, 세포를 원심분리하고 혈청 함유 배지를 제거한 후 무혈청 배지를 첨가한다. 일 구체예에서, 상기 세포를 무혈청 배지로 세척하여, 혈청 부재하에서, 바이러스 감염 세포의 배양을 보장한다. 보다 특정한 일 구체예에서, 상기 세포를 무혈청 배지로, 1번 이상, 2번 이상, 3번 이상, 4번 이상, 5번 이상, 또는 10번 이상 세척한다.
또 다른 구체예에서, 세포를 혈청 함유 배지, 및 바이러스 또는 바이러스 구축물로 감염시키기 전 상기 세포 성장에 최적인 온도에서 배양하고, 관심 바이러스 구축물로 감염시킨 후 상기 세포 배양물을 저온(상응하는 바이러스 또는 바이러스 벡터에 대한 표준 배양 온도에 비하여)에서 배양한다. 특정 구체예에서, 상기 세포를, 관심 바이러스 구축물로 감염시키기 전 혈청 함유 배지에서 37℃에서 배양하고, 관심 바이러스 구축물로 감염시킨 후, 상기 배양물을 33℃ 또는 약 33℃((e.g., 33±-1℃)에서 배양한다.
또 다른 구체예에서, 상기 세포를, 바이러스 또는 바이러스 구축물로 감염시키기 전 상기 세포 성장에 최적인 온도 및 혈청 함유 배지에서 배양하고, 관심 바이러스 구축물로 감염시킨 후, 상기 세포 배양물을 저온(상응하는 바이러스 또는 바이러스 벡터에 대한 표준 배양 온도에 비하여)에서 혈청없이 배양한다. 특정 구체예에서, 세포를 관심 바이러스 구축물로 감염시키기 전에 37℃에서 혈청 함유 배지에서 배양하고, 관심 바이러스 구축물로 감염시킨 후, 상기 세포 배양물을 33℃ 또는 약 33℃ (e.g., 33±1℃)에서 혈청없이 배양한다.
본 발명의 바이러스 구축물 및 방법은 바이러스의 산업적 생산, 예를 들어 백신 생산에 사용할 수 있다. 백신의 산업적 생산을 위하여, 백신은 감염성 바이러스 또는 오염된 바이러스 핵산을 완벽하게 함유하지 않는 불활성 바이러스 또는 바이러스 단백질만을 함유하는 것이 바람직하며, 다르게는 병독성으로 전환되지 않는 생약독화 백신을 함유하는 것이 바람직하다. 생산 중에 유입되는 외래 인자에 의한 백신의 오염 역시 피해야만 한다. 바이러스 또는 바이러스 단백질을 대규모로 생산하기 위해 당분야에서 알려진 방법을 본 발명의 백신의 산업적 생산에 사용할 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 백신의 산업적 생산을 위해서, 세포를 생반응기나 발효기에서 배양한다. 생반응기는 1리터 아래에서 부터 100 리터를 초과하는 부피의 것, 예컨대 Cyto3 생반응기; NBS 생반응기 (New Brunswick Scientific, Edison, NJ.)를 이용가능하고; B. Braun Biotech International (B. Braun Biotech, Melsungen, Germany)에서 제조하는 실험실 및 산업적 규모의 생반응기를 이용가능하다. 다른 구체예에서, 소규모 공정 최적화 실험을 바이러스의 산업적 생산전에 수행하여, 바이러스의 산업적 생산에 최적인 조건을 선별하여 사용한다.
무혈청 배지에서 플라스미드 복구
본 발명의 일 구체예에서, 바이러스를 헬퍼 바이러스없이 회수할 수 있다. 보다 구체적으로, 복제 및 복구에 요구되는 바이러스 단백질을 암호화하는 플라스미드 및 바이러스 게놈을 암호화하는 플라스미드를 세포에 도입시켜서 바이러스를 회수할 수 있다. 일 구체에에서, 상기 세포를 무혈청 배지에서 성장 및 유지시킨다. 일 구체예예서, 상기 플라스미드를 전기천공을 통해 세포에 도입시키다. 특정 구체예에서, T7 프로모터의 제어하에서 바이러스의 안티게놈 cDNA를 암호화하는 플라스미드, T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 플라스미드, 및 각각 T7 프로모터의 제어하에서, N 단백질, P 단백질, 및 L 단백질을 암호화하는 플라스미드를 전기천공법을 통해 SF Vero 세포에 도입시킨다. Vero 세포는 ATCC로부터 얻었고 다음의 단계에 따라서 무혈청 배지에서 성장하도록 적응시켰다 (Mike Berry's laboratory에서 발전시킨 방법임).
1. T-2 플라스크 내 DMEM + 5% v/v FBS에서 ATCC CCL-81 바이알을 해동시킨다 P121;
2. DMEM + 5% v/v FBS에서 5 계대 증식시킨다 P126;
3. T-225 플라스크 내 OptiPRO (Invitrogen Corporation)로 FBS 성장 세포를 직접 이동시킨다;
4. OptiPRO에서 7 계대 증식시킨다;
5. 예비마스터 세포 은행 스톡을 계대 133-7에서 동결시킨다;
6. OptiPRO에서 4 계대 증식시킨다;
7. 마스터 세포 은행 스톡을 계대 137에서 동결시킨다;
8. OptiPRO에서 4 계대 증식시킨다;
9. 워킹 세포 은행 스톡을 계대 141에서 정착시킨다;
10. 전기천공 및 바이러스 증폭을 위해 해동 및 증식시킨다.
바이러스 입자의 복구 방법은 5.6 재조합 바이러스의 복구에서 기술하였다.
일 구체예에서, 바이러스 복구용으로 사용하는 세포는 동물이나 인간으로부터 유래한 성분을 첨가하지 않고 성장 및/또는 유지시킬 수 있는 세포이다. 일 구체예에서, 바이러스 복구용으로 사용하는 세포는 혈청없이 성장이 적응된 세포이다. 특정 구체예에서, SF Vero 세포를 바이러스 복구용으로 사용한다. 일 구체예에서, 상기 세포를 4mM L-글루타민이 보충된 OptiPRO SFM (Invitrogen Corporation)에서 성장 및/또는 유지시킨다. 일 구체예에서, 상기 세포를 혈청이 보충된 배지에서 성장시키지만 바이러스 입자의 복구를 위하여 상기 세포를 무혈청 배지로 이동시킨다. 특정 구체예에서, 상기 세포를 무혈청 배지로 세척하여, 바이러스 복구가 무혈청 환겅에서 발생할 수 있도록 보장한다.
예컨대 인산칼슘 형질감염법, DEAE-덱스트란 형질감염법, 전기 천공법 또는 리포솜 배개 형질감염법(예컨대 문헌 [Chapter 9 of Short Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (editors), John Wiley & Sons, Inc., 1999] 참조) 등을 통하여, 세포와 함께 사용할 수 있는 당업자에게 공지인 임의 방법에 의해서 플라스미드를 세포내로 도입시킨다. 특정 구체예에서, 전기천공법을 사용하여 플라스미드 DNA를 세포내로 도입시킨다. SF Vero 세포는 리포펙틴에 내성이 있다. 필수 플라스미드로 형질감염된 세포를 선별하기 위하여, 상기 플라스미드는 또한 일정 마커를 보유할 수 있다. 이러한 마커는, 이에 제한되는 것은 아니나, 일정 항생제 (e.g., 카나마이신, 블라스티시딘, 암피실린, 히그로마이신 B, 퓨로마이신 및Zeocin™ 등)에 대한 내성, 마커없이는 자가 영양 특성이 결핍된 세포에 자가 영양 특성을 부여하는 마커 등을 포함하거나, 또는 마커는, 세포 성장에는 필수적이나 플라스미드를 도입하는 세포에는 돌연변이된 유전자일 수 있다.
바이러스 게놈 및/또는 바이러스 유전자의 전사는 프로모터의 전사 제어하에 있다. 따라서, 바이러스 게놈 또는 바이러스 단백질을 암호화하는 서열을 프로모터 서열에 작동적으로 연결한다. 당업자에게 알려진 임의 프로모터/RNA 폴리머라제 시스템을 본 발명의 방법과 함께 사용할 수 있다. 일 구체에에서, 상기 프로모터는 세포에 내재하는 RNA 폴리머라제에 의한 전사를 가능하게 하는 프로모터일 수 있는데, 예를 들어, 프로모터 서열은 세포의 DNA 의존적 RNA 폴리머라제, 예컨대 RNA 폴리머라제 I (Pol I) 또는 RNA 폴리머라제 II (Pol II)에 의해 인지되는 것이다. 일 구체예에서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프로모터는 세포에 내재하지 않는 RNA 폴리머라제에 의한 전사가 가능한 프로모터일 수 있다. 보다 특정한 일 구체예에서, 상기 프로모터는 T3 프로모터, T7 프로모터, SP6 프로모터, 또는 CMV 프로모터이다. 사용되는 프로모터 유형에 따라서, 상기 프로모터를 인지하는 RNA 폴리머라제를 암호화하는 플라스미드를 또한 세포에 도입하여 적절한 RNA 폴리머라제를 제공한다. 특정 구체예에서, RNA 폴리머라제는 T3 RNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, 또는 CMV RNA 폴리머라제이다. 특정 구체예에서, 바이러스 유전자 및 바이러스 게놈은 T7 프로모터의 제어하에서 전사되고 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 플라스미드를 도입하여 T7 RNA 폴리머라제를 제공한다. 폴리머라제의 전사는 사용하는 세포 유형에서 기능하는 임의 프로모터 시스템의 제어하에 있을 수 있다. 특정 구체예에서, CMV 프로모터를 사용한다.
바이러스 게놈은 플러스 또는 마이너스 배향성일 수 있다. 따라서, 바이러스 게놈은 바이러스 게놈의 양성 센스 복제본(안티게놈 복제본) 또는 바이러스 게놈의 음성 센스 복제본(게놈 복제본)을 생성하도록 유전 물질로부터 전사할 수 있다. 일 구체예에서, 바이러스 게놈은 본 발명의 재조합, 키메라 및/또는 약독화 바이러스이다. 일 구체예에서, 바이러스 복제 및 복구 효율은 바이러스 게놈이 헥사머 길이이면 증가한다. 바이러스 게놈이 적절한 길이인 것을 보장하기 위해서, 5' 및 3' 말단을 헤파타이티스 델타 바이러스 (HDV) 리보자임 서열, 해머헤드 라이보자임 서열, 라이보자임 촉매 활성을 보유하는 이의 단편 등을 포함하는 라이보자임 서열을 이용하여 한정화한다.
일 구체예에서, 복제 및 복구에 필수적인 바이러스 단백질은 N, P,및 L 유전자를 포함한다. 보다 특정한 일 구체예에서, 복제 및 복구에 필수적인 바이러스 단백질은 N, P, M2-1 및 L 유전자이다.
5.7 재조합 바이러스의 약독화
본 발명의 재조합 바이러스는 약독화 표현형을 나타내도록 유전적으로 더욱 조작할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 바이러스는 백신으로 바이러스를 투여한 대상에서 약독화 표현형을 나타낸다. 약독화는 당업자에게 공지의 임의 방법으로 이룰 수 있다. 이론에 제한되지 않고, 재조합 바이러스의 약독화 표현형은, 예를 들어 목적하는 숙주에서 천연적으로 복제가 잘되지 않는 바이러스를 이용하거나(예컨대, 인간에서 APV 이용), 바이러스 게놈의 복제 저하를 통해서, 바이러스의 숙주 세포 감염능 저하를 통해서, 또는 야생형 바이러스주에 비하여 감염성 바이러스 입자를 조립하는 바이러스 단백질의 능력 저하를 통해서 발생시킬 수 있다. 바이러스의 일정 서열, 예컨대 리더 및 트레일러 서열의 생존력은 미니게놈 분석법을 사용하여 측저할 수 있다 (섹션 5.8 참조).
본 발명의 재조합 바이러스의 약독화 표현형은 당업자에게 공지의 방법으로 시험할 수 있다 (섹션 5.8 참조). 예컨대 후보 바이러스에 대해서 세포 배양 시스템에서의 숙주 감염능 또는 복제율에 대해 시험한다. 일 구체예에서, 미니 게놈 시스템을 사용하여 변경된 유전자가 N, P, L, M2, F, G, M2-1, M2-2 또는 이의 조합인 경우 약독화 바이러스를 시험한다. 일 구체예예서, 다양한 온도에서 성장 곡선을 사용하여 바이러스의 약독화 표현형을 시험한다. 예를 들어, 약독화 바이러스는 35℃에서는 성장할 수 있지만, 39℃ 또는 4O℃에서는 성장할 수 없다. 일 구체예예서, 상이한 세포주를 사용하여 바이러스의 약독화 표현형을 평가할 수 있다. 예를 들어, 약독화 바이러스가 원숭이 세포주에서만 성장할 수 있고 인간 세포주에서는 성장할 수 없거나, 상이한 세포주에서 얻을 수 있는 바이러스 역가가 약독화 바이러스에 대해 다를 수 있다. 일 구체예에서, 이에 제한되는 것은 아니나, 햄스터, 코튼 래트, 마우스, 및 귀니아 피그 등의 작은 동물 모델의 호흡기 내 바이러스 복제를 사용하여 바이러스의 약독화 표현형을 평가할 수 있다. 다른 구체예에서, 이에 제하되는 것은 아니나 항체 역가(예를 들어, 플라크 감소 중화 분석법 또는 ELISA)를 포함하는, 바이러스에 의해 유도된 변역 반응을 통해서 바이러스의 약독화 표현형을 평가한다. 특정 구체예에서, 플라크 감소 중화 분석법 또는 ELISA는 저 용량에서 수행한다. 일 구체예에서, 동물 모델에서 병증을 유발하는 재조합 바이러스의 능력을 시험할 수 있다. 동물 모델 시스템에서 병증을 유발하는 바이러스의 능력 저하는 이의 약독화 표현형의 지표가 된다. 특정 구체예에서, 원숭이 모델에서 점액질 생성을 지표로, 코 감염에 대해 후보 바이러스를 시험한다.
본 발명의 바이러스는 이 바이러스의 하나 이상의 기능적 특성을 손상시켜서 약독화시킬 수 있다. 일 구체예에서, 약독화는, 약독화 바이러스가 유래된 야생형 바이러스주와 비교하여 측정한다. 다른 구체예에서, 약독화는, 상이한 숙주 시스템에서 약독화 바이러스의 성장을 비교하여 측정한다. 따라서, 비제한적인 예로, APV가 인간 숙주에서 성장할 때 인간 숙주에서 APV의 성장이 조류 숙주에서 APV이 성장과 비교하여 감소하면 APV는 약독화되었다고 할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 약독화 바이러스는 숙주를 감염시킬 수 있고 감염성 바이러스 입자를 생성하도록 숙주에서 복제할 수 있다. 그러나, 야생형 바이러스주와 비교하여, 약독화 바이러스주는 보다 낮은 역가로 성장하거나 보다 느리게 성장한다. 당업자에게 공지인 임의 기술을 사용하여 약독화 바이러스의 성장 곡선을 확인할 수 있고 이것을 야생형 바이러스의 성장 곡선과 비교할 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예를 참조한다. 특정 구체예에서, 예컨대 실시예 22에 기술한 조건하에서, Vero 세포에서, 상기 약독화 바이러스는 105pfu/ml 이하, 104pfu/ml 이하, 103pfu/ml 이하, 또는 102pfu/ml 이하의 역가로 성장한다.
일 구체예에서, 본 발명의 약독화 바이러스(예를 들어, 키메라 포유류 MPV)는 인간 세포에서 복제할 수 없으며 이의 야생형 바이러스(예컨대, 야생형 포유류 MPV)도 마찬가지이다. 그러나, 상기 약독화 바이러스는 인터페론 기능이 결핍된 세포주, 예컨대 Vero 세포 등에서는 복제될 수 있다.
다른 구체예예서, 본 발명의 약독화 바이러스는 숙주를 감염시킬 수 있고, 숙주에서 복제될 수 있으며, 본 발명의 바이러스의 단백질을 세포질막에 삽입시킬 수 있으나, 약독화 바이러스는 숙주에서 새로운 감염성 바이러스 입자이 생성을 야기시키지 않는다. 일 구체예에서, 상기 약독화 바이러스는 야생형 포유류 바이러스와 동일한 효율로 숙주를 감염시키고, 숙주에서 복제되며, 바이러스 단백질을 세포질막으로 삽입시킬 수 있다. 다른 구체에에서,숙주 내에서 복제되는 약독화 포유류 바이러스의 능력은 야생형 바이러스에 비해 감소한다. 당업자에게 공지인 임의 방법을 사용하여 바이러스가 포유류 세포를 감염시킬 수 있는지, 숙주 내에서 복제될 수 있는지, 그리고 바이러스 단백질을 숙주의 세포질 막으로 삽입시킬 수 있는지 확인할 수 있다. 이의 예시적인 방법들은 섹션 5.8을 참조한다.
일 구체예예서, 본 발명의 약독화 바이러스는 숙주를 감염시킬 수 있다. 그러나, 야생형 포유류 MPV와 대조적으로, 상기 약독화 포유류 MPV는 숙주에서 복제될 수 없다. 특정 구체에예서, 상기 약독화 포유류 바이러스는 숙주를 감염시킬 수 있고 숙주가 자신의 세포질막에 바이러스 단백질을 삽입하도록 야기할 수 있으나, 상기 약독화 바이러스는 숙주 내에서 복제될 수는 없다. 당업자에게 공지인 임의 방법을 사용하여 약독화 포유류 MPV가 숙주를 감염시켰는지 그리고 숙주의 세포질막으로 바이러스 단백질을 삽입시켰는지 시험할 수 있다.
일 구체예에서, 숙주를 감염시키는 약독화 바이러스의 능력은 동일 숙주를 감염시키는 야생형 바이러스의 능력에 비해 감소한다. 당업자에게 공지인 임의 방법으로 바이러스가 숙주를 감염시킬 수 있는지 확인할 수 있다. 예시적인 방법은 섹션 5.8을 참조한다.
일 구체예에서, 돌연변이(예를 들어, 미스센스 돌연변이)를 바이러스 게놈에 도입하여 약독화 표현형을 갖는 바이러스를 생성시킨다. 돌연변이(예를 들어, 미스센스 돌연변이)는 재조합 바이러스의 N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, SH-유전자, G-유전자 또는 L-유전자에 도입시킬 수 있다. 돌연변이는 부가, 치환, 결실 또는 이들의 조합일 수 있다. 특정 구체예에서, N, P, L, F, G, M2-1, M2-2 또는 M2 단백질에 대해 단일 아미노산 결실 돌연변이를 도입하는데, 이는 미니 게놈 시스템에서 기능성에 대해 스크리닝할 수 있고 바이러스 내 예측 기능성에 대해 평가할 수 있다.보다 특정 구체예에서, 미스센스 돌연변이는 저온 감수성 돌연변이이다. 다른 구체예에서, 미스센스 돌연변이는 열 감수성 돌연변이이다. 하나의 구체예에서, 상기 바이러스의 P 단백질의 주요 인산화 부위를 제거한다. 다른 구체예예서, 돌연변이 또는 돌연변이들을 바이러스의 L 유전자에 도입하여 온도 감수성 바이러스주를 생성시킨다. 또 다른 구체예에서, F 유전자의 절단 부위를 돌연변이시켜서 절단이 일어나지 않거나 매우 낮은 효율로 일어나도록 한다. 보다 특정의 구체예에서, hMPV의 F 단백질의 아미노산 위치 99 내지 102의 아미노산 서열 RQSR의 모티프를 돌연변이시킨다. 이에 제한되는 것은 아니나, 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 결실, 하나 이상의 아미노산의 부가, 하나 이상의 아미노산의 치환(보존적 또는 비보존적), 또는 이의 조합일 수 있다. hMPV의 일부 바이러스주에서, 절단 부위는 RQPR이다 (실시예"P101S" 참조). 일 구체예에서, 아미노산 서열이 RQPR인 절단 부위를 돌연변이시킨다. 보다 특정 구체예에서, hMPV의 F 단백질의 절단 부위를 돌연변이시켜서 hMPV의 감염성을 저하시킨다. 일 구체예에서, hMPV의 감염성은 5, 10, 50, 100, 500, 103, 5xlO3, 104, 5xlO4, 105, 5xlO5 이상, 또는 106 이상의 계수 만큼 감소한다. 일 구체예에서, hMPV의 감염성은 5, 10, 50, 100, 500, 103, 5xlO3, 104, 5xlO4, 105, 5xlO5 이하, 또는 106 이하의 계수만큼 감소한다.
다른 구체예에서, 재조합 바이러스의 게놈에 결실을 도입한다. 보다 특정 구체예에서, 결실은 재조합 바이러스의 N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, SH-유전자, G-유전자 또는 L-유전자에 도입된다. 특정 구체예에서, 결실은 본 발명의 재조합 바이러스의 M2-유전자에 위치한다. 다른 특정 구체예에서, 결실은 본 발명의 재조합 바이러스의 SH-유전자에 도입한다. 또 다른 구체예에서는 M2- 유전자 및 SH-유전자가 모두 결실된다.
일 구체예에서, 재조합 바이러스의 유전자간 영역이 변경된다. 하나의 구체예에서, 유전자간 영역의 길이가 변경된다. 다른 구체예에서, 유전자간 영역은 바이러스 게놈의 5' 말단으로부터 3' 말단으로 셔플된다(shuffle).
다른 구체예에서, 재조합 바이러스의 유전자 또는 유전자들의 게놈 위치가 변경된다. 하나의 구체예에서, F 또는 G 유전자가 게놈의 3' 말단으로 이동한다. 다른 구체예에서, N 유전자가 게놈의 5' 말단으로 이동한다.
일 구체예에서, 약독화 바이러스는 야생형 바이러스의 유전자를 다른 종의 바이러스(e.g., RSV, APV, PIV3 또는 마우스 뉴모바이러스), 다른 서브그룹, 또는 다른 변이체의 유사 유전자로 치환시켜서 얻는다. 예시적인 구체예에서, 포유류 MPV의 N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, SH-유전자, G-유전자 또는 L-유전자를 각각 APV의 N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, SH-유전자, G-유전자 또는 L-유전자로 치환시킨다, 다른 예시적인 구체예예서, APV의 N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, SH-유전자, G-유전자 또는 L-유전자를 각각 포유류 MPV의 N-유전자, P-유전자, M- 유전자, F-유전자, M2-유전자, SH-유전자, G-유전자 또는 L-유전자로 치환시킨다. 바람직한 구체예에서, 바이러스의 약독화는 하나 이상의 폴리머라제 관련 유전자 (e.g., N, P, L 또는 M2)를 다른 종의 바이러스 유전자로 치환시켜서 얻는다.
일 구체예에서, 바이러스의 약독화는 야생형 바이러스의 단백질의 하나 이상의 특정 도메인을 상이한 종의 바이러스의 이에 상응하는 단백질로부터 유래한 도메인으로 치환시켜서 얻는다. 예시적인 구체예에서, APV의 F 단백질의 엑토도메인을 포유류 MPV의 F 단백질의 엑토도메인으로 치환시킨다. 바람직한 구체예에서, L, N, 또는 P 단백질의 하나 이상의 특정 도메일을 상이한 종의 바이러스의 상응하는 단백질로부터 유래하는 도메인으로 치환한다. 다른 일 구체예에서, 바이러스의 약독화는 야생형 바이러스의 단백질의 하나 이상의 특정 도메인을 결실시켜서 얻는다. 특정 구체예예서, F 단백질의 트랜스막 도메인을 결실시킨다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 재조합 바이러스의 리더 및/또는 트레일러 서열을 변형시켜서 약독화 표현형을 얻을 수 있다. 보다 특정 일 구체예에서, 리더 및/또는 트레일러 서열은 야생형 바이러스에 비하여 이의 길이를 1 뉴클레오티드 이상, 2 뉴클레오티드 이상, 3 뉴클레오티드 이상, 4 뉴클레오티드 이상, 5 뉴클레오티드 이상 또는 6 뉴클레오티드 이상 만큼 감소시킨다. 보다 특정한 일 구체예에서, 재조합 바이러스의 리더 및/또는 트레일러 서열을 돌연변이시킨다. 특정 구체예에서, 상기 리더 및 트레일러 서열은 서로 100% 상보적이다. 다른 구체예에서, 1 뉴클레오티드, 2 뉴클레오티드, 3 뉴클레오티드, 4 뉴클레오티드, 5 뉴클레오티드, 6 뉴클레오티드, 7 뉴클레오티드, 8 뉴클레오티드, 9 뉴클레오티드, 또는 10 뉴클레오티드가 서로 상보적이지 않고 여기서 리더 및 트레일러 서열의 나머지 뉴클레오티드는 서로 상보적이다. 일 구체예에서, 비상보적 뉴클레오티드는 서로 동일하다. 다른 일 구체에에서, 비상보적 뉴클레오티드는 서로 상이하다. 다른 구체예에서, 트레일러의 비상보적 뉴클레오티드가 퓨린이면, 리더 서열 내 상응하는 뉴클레오티드도 퓨린이다. 다른 구체예에서, 트레일러의 비상보적 뉴클레오티드가 피리미딘이면, 리더 서열 내 상응하는 뉴클레오티드도 피리미딘이다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 재조합 바이러스의 리더 및/또는 트레일러 서열을 다른 바이러스의 리더 및/또는 트레일러 서열, 예를 들어, RSV, APV, PIV3, 마우스 뉴모바이러스의 리더 및/또는 트레일러 서열, 재조합 바이러스의 단백질 암호화 부분이 유래된 인간 메타뉴모바이러스와는 상이한 변이체 또는 인간 뉴모바이러스의 서브그룹의 리더 및/또는 트레일러 서열로 치환될 수 있다.
생약독화 백신을 사용할 때, 이의 안전성을 또한 고려해야만 한다. 상기 백신은 질병을 야기하면 안된다. 백신을 안전하게 만들 수 있는 당분야에서 공지인 임의 방법을 본 발명에서 사용해도 된다. 약독화 방법이외에도, 다른 방법을 사용할 수 있다. 이의 비제한적 예로는 비리온 막으로 도입될 수 없는 가용성 이종 유전자를 이용하는 것이다. 예를 들어, 트랜스막 및 시토졸 도메인이 결핍된 RSV 유전자 형인, 가용성 RSV F 유전자의 단일 복제본을 사용할 수 있다. 이는 비리온 막으로 도입될 수 없기 때문에, 바이러스의 향성이 변화할 것으로 예측되지 않는다.
백신의 안전성을 시험하기 위하여 다양한 방법을 사용할 수 있다. 하기 섹션 5.8을 참조한다. 구체적으로, 수크로스 구배 및 중화 분석법을 사용하여 안전성을 시험할 수 있다. 수크로스 구배 분석법을 사용하여 이종 단백질이 비리온에 삽입되었는지 여부를 확인할 수 있다. 이종 단백질이 비리온에 삽입되면, 상기 비리온이 모바이러스주는 야기하지 않는 증상을 야기하는 능력이 있는지에 대해 시험해야 한다. 이론에 제한되지 않고, 이종 단백질이 비리온에 도입되면, 상기 바이러스는 새로운, 가능성있는 병리적 특성을 획득할 수도 있다.
일 구체예에서, 하나 이상의 유전자를 hMPV 게놈으로부터 결실시켜서 약독화 바이러스를 생성시킨다. 보다 특정 구체예에서, M2-2 ORF, M2-1 ORF, M2 유전자, SH 유전자 및/또는 G2 유전자를 결실시킨다.
다른 구체예에서, 바이러스 복제에 관여하는 유전자에 작은 단일 아미노산 결실을 도입하여 약독화 바이러스를 생성시킨다. 보다 특정 구체예에서, 작은 단일 아미노산 결실을 N, L, 또는 P 유전자에 도입시킨다. 일 특정 구체예에서, 다음의 아미노산 : 아미노산 위치 456의 Phe, 아미노산 위치 749의 GIu, 아미노산 위치 1246의 Tyr, 아미노산 위치 1094의 Met 및 아미노산 위치 746의 Lys 중 하나 이상을 재조합 hMPV의 L 유전자에서 돌연변이시켜서 약독화 바이러스를 생성한다. 돌연변이는 예컨대 아미노산의 결실 또는 치환일 수 있다. 아미노산 치환은 보존 아미노산 치환 또는 비보존 아미노산 치환일 수 있다. 보존 아미노산 교환의 일례로는 아미노산의 측쇄의 구조적 및/또는 기능적 특성을 유지하는 아미노산 치환인데, 예를 들어, 방향족 아미노산을 다른 방향족 아미노산으로 치환시키고, 산성 아미노산을 다른 산성 아미노산으로 치환시키며, 염기성 아미노산을 다른 염기성 아미노산으로 치환시키고, 지방족 아미노산을 다른 지방족 아미노산으로 치환시킨다. 반대로, 비보존적 아미노산 교환의 예로는 아미노산 측쇄의 구조적 및/또는 기능적 특성을 유지하지 않는 아미노산 치환으로서, 예를 들어, 방향족 아미노산을 염기성, 산성, 또는 지방족 아미노산으로 치환시키고, 산성 아미노산을 방향족, 연기성, 또는 지방족 아미노산으로 치환시키고, 염기성 아미노산을 산성, 방향족 또는 지방족 아미노산으로 치환시키고, 지방족 아미노산을 방향족, 산성 또는 염기성 아미노산으로 치환시킨다. 보다 특정 구체예에서, 아미노산 위치 456의 Phe를 Leu로 치환한다.
일 구체예에서, 하나의 핵산을 치환시켜서 하나의 아미노산 교환을 암호화한다. 다른 구체예에서, 2 또는 3 핵산을 치환시켜서 하나의 아미노산 교환을 암호화한다. 바람직하게는 2 또는 3 핵산을 치환시켜서 야생형 단백질 서열로의 복귀 위험을 줄인다.
다른 구체예에서, 작은 단일 아미노산 결실을 바이러스 조립에 관여하는 유전자에 도입시켜서 약독화 바이러스를 생성시킨다. 보다 특정 구체예에서, 작은 단일 아미노산 결실을 M 유전자 또는 M2 유전자에 도입시킨다. 바람직한 구체예에서, M 유전자를 돌연변이시킨다.
또 다른 구체예에서, 바이러스 게놈 내 유전자 순서를 야생형 바이러스의 유전자 순서로부터 변경시켜서 약독화 바이러스를 생성시킨다. 보다 특정 구체예에서, F, SH 및/또는 G 유전자를 바이러스 게놈의 3' 말단으로 이동시킨다. 다른 구체예에서, N 유전자를 바이러스 게놈의 5' 말단으로 이동시킨다.
다른 구체예에서, 하나 이상의 유전자 출발 부위(유전자 출발 부위의 위치, 예컨대 표 8 참조)를 돌연변이시키거나 다른 바이러스(예를 들어, RSV, PIV3, APV, 또는 마우스 뉴모바이러스), 재조합 바이러스의 단백질 암호화 부분이 유래된 인간 메타뉴모바이러스와는 다른 변이체 또는 인간 메타뉴모바이러스의 서브그룹의 유사한 유전자 출발 부위로 치환시킨다. 보다 특정 구체예에서, N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, SH-유전자, G-유전자 및/또는 L-유전자의 유전자 출발 부위를 돌연변이시키거나 다른 바이러스(예를 들어, RSV, PIV3, APV, 또는 마우스 뉴모바이러스), 재조합 바이러스의 단백질 암호화 부분이 유래된 인간 메타뉴모바이러스와는 다른 변이체 또는 인간 메타뉴모바이러스의 서브그룹다른 바이러스의 각각 N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, SH-유전자, G-유전자 및/또는 L-유전자의 유전자 출발 부위로 치환시킨다.
5.7.1 바이러스 유전자의 치환에 의한 약독화
본 발명의 특정 실시형태에서, 약독화는 바이러스의 유전자 중 하나 이상을 상이한 바이러스, 상이한 균주, 또는 상이한 바이러스 분리물의 유사한 유전자로 치환하여 수행한다. 특정 실시형태에서, 메타뉴모바이러스, 예컨대 포유동물 메타뉴모바이러스, 예를 들어 hMPV 또는 APV의 유전자 중 하나 이상을 또 다른 파라믹소바이러스의 유사한 유전자(들)로 치환한다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 포유동물 메타뉴모바이러스, 예를 들어 hMPV의 N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, M2-1 ORF, M2-2 ORF, SH-유전자, G-유전자 또는 L-유전자 또는 상기 유전자 중 2 이상의 임의의 조합을 또 다른 바이러스 종, 균주 또는 분리물의 유사한 유전자로 치환하며, 여기서 상기 다른 바이러스 종은 또 다른 포유동물 메타뉴모바이러스, APV 또는 RSV일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
더 구체적인 실시형태에서, 인간 메타뉴모바이러스의 유전자 중 하나 이상을 인간 메타뉴모바이러스의 다른 분리물의 유사한 유전자(들)로 치환한다. 예를 들어, 분리물 NL/1/99(99-1), NL/1/00(00-1), NL/17/00, 또는 NL/1/94의 N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, M2-1 ORF, M2-2 ORF, SH-유전자, G-유전자 또는 L-유전자 또는 상기 유전자 중 2 이상의 임의의 조합을, 상이한 분리물, 예를 들어 NL/1/99(99-1), NL/1/00(00-1), NL/17/00 또는 NL/1/94의 유사한 유전자 또는 유전자들의 조합, 즉, N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, M2-1 ORF, M2-2 ORF, SH-유전자, G-유전자 또는 L-유전자로 치환한다.
특정 실시형태에서, 바이러스 게놈의 하나 이상의 영역을 상이한 바이러스 종, 균주 또는 분리물의 게놈 유래의 유사한 영역(들)으로 치환한다. 특정 실시형태에서, 상기 영역은 바이러스 게놈의 코딩 영역 내의 영역이다. 다른 실시형태에서, 상기 영역은 바이러스 게놈의 비코딩 영역 내의 영역이다. 특정 실시형태에서, 2 바이러스의 2 영역은, 상기 2 영역이 상기 2 바이러스에서 동일하거나 유사한 기능을 지지한다면, 서로 유사한 것이다. 다른 특정 실시형태에서, 2 바이러스의 2 영역은, 상기 2 영역이 상기 2 바이러스에서 동일하거나 유사한 구조적 요소를 제공한다면, 유사한 것이다. 더 구체적인 실시형태에서, 2 영역은, 이들이 2 바이러스에서 유사한 단백질 도메인을 코딩한다면, 유사한 것이며, 여기서 유사한 단백질 도메인은 동일하거나 유사한 기능 및/또는 구조를 갖는 도메인이다.
특정 실시형태에서, 메타뉴모바이러스, 예컨대 포유동물 메타뉴모바이러스, 예를 들어 hMPV 또는 APV 게놈의 하나 이상의 영역을 또 다른 파라믹소바이러스 게놈의 유사한 영역(들)으로 치환한다. 특정 실시형태에서, 파라믹소바이러스 게놈의 하나 이상의 영역을 포유동물 메타뉴모바이러스, 예를 들어 hMPV 또는 APV 게놈의 유사한 영역(들)으로 치환한다. 더 구체적인 실시형태에서, 포유동물 메타뉴모바이러스, 예를 들어 hMPV의 N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, M2-1 ORF, M2-2 ORF, SH-유전자, G-유전자 또는 L-유전자의 영역 또는 상기 유전자 중 2 이상의 영역의 임의의 조합을 또 다른 바이러스 종, 균주 또는 분리물의 유사한 영역으로 치환한다. 또 다른 바이러스 종은 또 다른 포유동물 메타뉴모바이러스, APV 또는 RSV일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
더 구체적인 실시형태에서, 인간 메타뉴모바이러스의 하나 이상의 영역을 인간 메타뉴모바이러스의 또 다른 분리물의 유사한 영역(들)으로 치환한다. 예를 들어, 분리물 NL/1/99(99-1), NL/1/00(00-1), NL/17/00, 또는 NL/1/94의 N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, M2-1 ORF, M2-2 ORF, SH-유전자, G-유전자 또는 L-유전자의 하나 이상의 영역(들) 또는 2 이상의 영역의 임의의 조합을, hMPV의 상이한 분리물, 예를 들어, NL/1/99(99-1), NL/1/00(00-1), NL/17/00, 또는 NL/1/94의 유사한 영역(들)으로 치환한다.
특정 실시형태에서, 상기 영역은 길이가 5 뉴클레오티드(nt) 이상, 10 nt 이상, 25 nt 이상, 50 nt 이상, 75 nt 이상, 100 nt 이상, 250 nt 이상, 500 nt 이상, 750 nt 이상, 1 kb 이상, 1.5 kb 이상, 2 kb 이상, 2.5 kb 이상, 3 kb 이상, 4 kb 이상 또는 5 kb 이상이다. 특정 실시형태에서, 상기 영역은 길이가 최대 5 뉴클레오티드(nt), 최대 10 nt, 최대 25 nt, 최대 50 nt, 최대 75 nt, 최대 100 nt, 최대 250 nt, 최대 500 nt, 최대 750 nt, 최대 1 kb, 최대 1.5 kb, 최대 2 kb, 최대 2.5 kb, 최대 3 kb, 최대 4 kb, 또는 최대 5 kb이다.
5.8 본 발명에 이용하기 위한 분석
세포 배양 시스템, 동물 모델 시스템 또는 피험체에서 키메라 또는 재조합 바이러스의 생장률을 측정하기 위해 다수의 분석을 본 발명에 따라 이용할 수 있다. 또한, 비리온의 감염, 복제 및 패키징을 위한 키메라 및 재조합 바이러스의 요건을 결정하기 위해 다수의 분석을 본 발명에 따라 이용할 수 있다.
본원에 기재된 분석은 바이러스의 생장 특성을 측정하기 위해 경시적으로 바이러스 역가를 분석하는 데 이용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 바이러스 역가는 감염된 세포 또는 감염된 피험체로부터 시료를 얻는 단계, 상기 시료의 연속 희석액을 제조하는 단계 및 단일 플라크가 발생하도록 하는 바이러스 희석률의 바이러스로 감염에 감수성이 있는 세포 단층을 감염시키는 단계에 의해 측정한다. 그 후 상기 플라크의 수를 계측할 수 있으며, 상기 바이러스 역가는 시료 ml당 플라크 형성 단위로서 표현된다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 피험체에서의 본 발명 바이러스의 생장률은 피험체에서의 바이러스에 대한 항체의 역가로서 추정된다. 이론에 구속되지는 않지만, 피험체에서의 항체 역가는 피험체에서의 바이러스 역가뿐 아니라 항원성을 반영한다. 바이러스의 항원성이 일정하다면, 피험체에서의 항체 역가의 증가는 피험체에서의 바이러스의 생장 곡선을 결정하는 데 이용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 동물 또는 인간에서의 바이러스의 생장률은 감염후 여러 시점에 숙주의 체액 시료를 채취하여 바이러스 역가를 측정함으로써 테스트하는 것이 가장 바람직하다.
세포 배양 시스템 또는 피험체에서의 이종성 유전자 서열의 발현은 당업자에게 공지된 임의의 기법으로 측정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이종성 유전자의 발현은 전사체 수준을 정량하여 측정한다. 전사체 수준은, 각각 전사체에 특이적인 프로브 또는 프라이머를 이용하여 노던 블롯 분석 또는 RT-PCR로 측정할 수 있다. 상기 전사체는 바이러스의 게놈과는 구별할 수 있는데, 왜냐하면 바이러스는 안티센스 배향인 반면, 전사체는 센스 배향이기 때문이다. 특정 실시형태에서, 이종성 유전자의 발현은 이종성 유전자의 단백질 생성물 수준을 정량하여 측정한다. 단백질의 수준은 그 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석으로 측정할 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 이종성 유전자에 펩티드 태그를 부착한다. 상기 펩티드 태그는 펩티드 태그에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 검출된 펩티드 태그의 수준은 이종성 유전자로부터 발현된 단백질의 수준을 나타내는 것이다. 대안으로, 이종성 유전자로부터 발현된 단백질은 펩티드 태그를 이용하여 분리할 수 있다. 정제된 단백질의 양은 이종성 유전자의 발현 수준과 상관 관계가 있다. 상기 펩티드 태그 및 상기 펩티드 태그에 융합된 단백질의 분리 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 면역글로불린 불변 영역, 폴리히스티딘 서열(Petty, 1996, Metal-chelate affinity chromatography, in Current Protocols in Molecular Biology, volume 1-3 (1994-1998). Ed. by Ausubel, F.M., Brent, R., Kunston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and Struhl, K. Published by John Wiley and sons, Inc., USA, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience), 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST; Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229), 이. 콜라이 말토스 결합 단백질(Guan et al., 1987, Gene 67:21-30), 각종 셀룰로스 결합 도메인(미국 특허 제5,496,934호; 제5,202,247호; 제5,137,819호; Tomme et al., 1994, Protein Eng. 7:117-123) 및 FLAG 에피토프(Short Protocols in Molecular Biology, 1999, Ed. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., Unit 10.11) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 다양한 펩티드 태그가 이종성 유전자를 변형시키는 데 이용될 수 있다. 다른 펩티드 태그는 특이적 결합 파트너에 의해 인식되며, 따라서 결합 파트너에 대한 친화성 결합에 의해 분리를 촉진하며, 상기 결합 파트너는 고체 지지체 상에 고정화되는 것이 바람직하다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, DNA 클로닝, DNA 증폭 및 합성 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 방법을 전술한 펩티드 태그의 코딩 영역을 얻는 데 이용할 수 있다. 펩티드 태그 일부와 그 검출 및 분리용 시약은 시판되는 것을 구입할 수 있다.
피험체 유래의 시료는 당업자에게 공지되어 있는 임의의 방법으로 얻을 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 시료는 비강 흡입물, 인후 도말, 가래 또는 기관지 폐포 세척액으로 구성된다.
5.8.1 미니레플리콘 구성체
cDNA로부터 생 바이러스를 제조하는 것은 hMPV의 특징을 분석하고 또한 약독화 백신 균주 및 면역원성 화합물을 제조하기 위한 수단을 제공한다. 이 목적을 달성하기 위해, 리포터 유전자를 포함하는 vRNA를 코딩하는 cDNA 또는 미니레플리콘 구성체를 이용하여, 바이러스를 구제(rescue)하고, 또한 RNA의 증폭, 발현 및 비리온으로의 통합에 관여하는 뉴클레오티드 서열 및 단백질을 확인할 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 리포터 유전자를 본 발명에 이용할 수 있다(섹션 5.8.2 참조). 예를 들어, 이용될 수 있는 리포터 유전자는 GFP, HRP, LUC 및 AP를 코딩하는 유전자를 포함하나 이에 한정되지 않는다(또한, 더 광범위한 리포터의 예에 관해서는 섹션 5.8.2 참조). 구체적인 일 실시형태에서, 이용되는 리포터 유전자는 CAT를 코딩한다. 본 발명의 또 다른 구체적인 실시형태에서, 리포터 유전자는 리더 및 트레일러 서열에 측접한다. 리포터 유전자에 측접시키는 데 이용될 수 있는 리더 및 트레일러 서열은 MPV, RSV 및 APV를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 (-) 센스 바이러스의 서열이다. 예를 들어, 상기 리포터 유전자를 간염 델타 리보자임(Hep-d Ribo) 및 T7 폴리머라제 종결(T-T7) 신호에 연결된 (-) 센스 hMPV 또는 APV 리더에 측접시킬 수 있으며, hMPV 또는 APV 트레일러 서열보다 T7 RNA 폴리머라제 프로모터가 선행할 수 있다.
특정 실시형태에서, 미니레플리콘을 코딩하는 플라스미드를 숙주 세포에 형질감염시킨다. 본 발명의 더 구체적인 실시형태에서, hMPV는 T7 RNA 폴리머라제, N 유전자, P 유전자, L 유전자 및 M2.1 유전자를 발현하는 숙주 세포에서 구제된다. 특정 실시형태에서, 상기 숙주 세포를 T7 RNA 폴리머라제, N 유전자, P 유전자, L 유전자 및 M2.1 유전자를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시킨다. 다른 실시형태에서, 미니레플리콘을 코딩하는 플라스미드를 숙주 세포에 형질감염시키고, 상기 숙주 세포를 헬퍼 바이러스로 감염시킨다.
상기 hMPV 미니레플리콘은 종간 또는 종내 폴리머라제를 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 폴리머라제를 이용하여 구제할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 hMPV-미니레플리콘은 hMPV 복제에 필요한 최소 복제 단위를 발현하는 숙주 세포에서 구제된다. 예를 들어, hMPV는 RSV, APV, MPV 또는 PIV를 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 폴리머라제를 이용하여 cDNA로부터 구제할 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, hMPV는 RNA 바이러스의 폴리머라제를 이용하여 구제한다. 본 발명의 더 구체적인 실시형태에서, hMPV는 (-) 가닥 RNA 바이러스의 폴리머라제를 이용하여 구제한다. 본 발명의 더욱 더 구체적인 실시형태에서, hMPV는 RSV 폴리머라제를 이용하여 구제한다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, hMPV는 APV 폴리머라제를 이용하여 구제한다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, hMPV는 MPV 폴리머라제를 이용하여 구제한다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, hMPV는 PIV 폴리머라제를 이용하여 구제한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, hMPV는 hMPV 폴리머라제 단백질의 복합체를 이용하여 cDNA로부터 구제한다. 예를 들어, hMPV 미니레플리콘은 L, P, N 및 M2-1 단백질로 구성된 폴리머라제 복합체를 이용하여 구제할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 폴리머라제 복합체는 L, P 및 N 단백질로 구성된다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, hMPV 미니레플리콘은 RSV, PIV 및 APV를 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 바이러스 유래의 폴리머라제 단백질로 구성되는 폴리머라제 복합체를 이용하여 구제할 수 있다. 특히, 상기 hMPV 미니레플리콘은 RSV, PIV 또는 APV의 L, P, N 및 M2-1 단백질로 구성되는 폴리머라제 복합체를 이용하여 구제할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, hMPV 미니레플리콘을 구제하는 데 사용되는 폴리머라제 복합체는 RSV, PIV 또는 APV의 L, P 및 N 단백질로 구성된다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 각종 바이러스 유래의 상이한 폴리머라제 단백질을 폴리머라제 복합체를 형성하는 데 이용할 수 있다. 이러한 실시형태에서, hMPV 미니레플리콘을 구제하는 데 이용되는 폴리머라제는 RSV, PIV 또는 APV 폴리머라제의 상이한 성분들에 의해 형성될 수 있다. 예를 들어, 가능한 조합을 한정하고자 하는 의도는 아니나, 복합체를 형성함에 있어서, N 단백질은 RSV, APV 또는 PIV의 N 유전자에 의해 코딩될 수 있는 반면, L 단백질은 RSV, APV 또는 PIV의 L 유전자에 의해 코딩되며, P 단백질은 RSV, APV 또는 PIV의 P 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 당업자라면 hMPV 미니레플리콘을 구제하는 데 필요한 폴리머라제 복합체를 형성하는 데 이용될 수 있는 가능한 조합을 결정할 수 있다. 미니레플리콘 시스템에서, 리포터 유전자의 발현은 바이러스의 성공적 구제를 확인하고 또한 바이러스의 특징을 분석하기 위해 측정된다. 리포터 유전자의 발현 수준 및/또는 그 활성은 섹션 5.8.2에 기재된 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 분석할 수 있다.
보다 구체적인 특정 실시형태에서, 미니레플리콘은 하기 구성 요소들을 열거순으로 포함한다: T7 RNA 폴리머라제 또는 RNA 폴리머라제 I, 리더 서열, 유전자 개시 서열, GFP, 트레일러 서열, 간염 델타 리보자임 서열 또는 RNA 폴리머라제 I 종결 서열. T7이 RNA 폴리머라제로서 이용된다면, 간염 델타 리보자임 서열이 종결 서열로서 이용되어야 한다. RNA 폴리머라제 I이 이용된다면, RNA 폴리머라제 I 종결 서열이 종결 신호로서 이용될 수 있다. 구제 시스템에 따라서, 미니레플리콘의 서열은 센스 또는 안티센스 배향일 수 있다. 특정 실시형태에서, 리더 서열은 hMPV의 야생형 리더 서열에 비하여 변형시킬 수 있다. 경우에 따라 리더 서열보다 AC가 선행할 수 있다. T7 프로모터 서열에는 G-이중체 또는 삼중체가 존재할 수도 존재하지 않을 수도 있으며, 여기서 G-이중체 또는 삼중체는 전사를 증가시킨다.
특정 실시형태에서, 세포를 T0에서 hMPV로 감염시킨다. 24 시간 후, 즉 T24에, 세포를 미니레플리콘 구성체로 형질감염시킨다. TO 후 48 시간째와 TO 후 72 시간째, 세포를 리포터 유전자의 발현에 대해 테스트한다. 형광 리포터 유전자 생성물이 이용된다면(예를 들어, GFP), FACS를 이용하여 리포터 유전자의 발현을 테스트할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 세포를 T=O 시간에 6개의 플라스미드로 형질감염시킨다. 그 후 세포를 T=40 시간 및 T=60 시간에 회수하고 CAT 또는 GFP 발현에 대해 분석한다.
또 다른 구체적 실시형태에서, 세포를 T0에 MVA-T7으로 감염시킨다. 1 시간 후, 즉 T1에, 세포를 미니레플리콘 구성체로 형질감염시킨다. T0 후 24 시간째, 세포를 hMPV로 감염시킨다. T0 후 72 시간째, 세포를 리포터 유전자 발현에 대해 테스트한다. 형광 리포터 유전자 생성물이 이용된다면(예를 들어, GFP), FACS를 이용하여 리포터 유전자의 발현을 테스트할 수 있다.
5.8.2 리포터 유전자
특정 실시형태에서, 조직 배양 또는 동물 모델에서의 리포터 유전자 발현의 측정을 위한 분석을 본 발명의 방법에 이용할 수 있다. 리포터 유전자의 뉴클레오티드 서열은 APV, hMPV, hMPV/APV 또는 APV/hMPV 등의 바이러스로 클로닝하는데, 이때 (i) 리포터 유전자의 위치가 변경되며, (ii) 리포트 유전자에 측접한 유전자간 영역의 길이가 변화된다. 리포터 유전자의 최적 발현율과 리포터 유전자를 포함하는 바이러스의 최적 복제율을 측정하기 위해 상이한 조합을 테스트한다.
특정 실시형태에서, 리포터 유전자를 포함하는 미니레플리콘 구성체를 생성한다. 상기 미니레플리콘 구성체의 구성에 관해서는 본원에서 기술한다.
리포터 유전자 생성물의 존재도(abundance)는 당업자에게 공지된 임의의 기법으로 측정할 수 있다. 상기 기법으로는 각각 리포터 유전자에 특이적인 프로브 또는 항체를 이용한 노던 블롯 분석 또는 웨스턴 블롯 분석을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
특정 실시형태에서, 상기 리포터 유전자는 FACS로 검출이 가능한 형광 신호를 방출한다. FACS는 리포터 유전자가 발현된 세포를 검출하는 데 이용될 수 있다.
본 발명의 특정 양태를 실시하기 위한 기법은, 달리 명시되지 않는 한, 당업자가 통상적으로 실시하는 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 조작 및 제조의 통상적인 기법을 이용한다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular cloning, a laboratory manual, second ed., vol. 1-3. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), A Laboratory Manual, Second Edition; DNA Cloning, Volumes I and II (Glover, Ed. 1985); and Transcription and Translation (Hames & Higgins, Eds. 1984)]을 참조할 수 있다.
리포터 유전자 생성물의 생화학적 활성은 리포터 유전자의 발현 수준을 나타낸다. 리포터 유전자 활성의 전체 수준은 또한 본 발명의 재조합 바이러스의 복제율에 의존한다. 따라서, 재조합 바이러스로부터의 리포터 유전자의 진정한 발현 수준을 측정하기 위해서는, 전체 발현 수준을 세포 배양 또는 동물 모델에서의 재조합 바이러스의 역가로 나누어야 한다.
본 발명의 방법에 이용될 수 있는 리포터 유전자로는 하기 표 4에 열거된 유전자들을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
리포터 유전자 및 각각의 리포터 유전자 생성물의 생화학적 특성
리포터 유전자 단백질 활성 및 측정
CAT(클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제) 방사성 아세틸기의 클로람페니콜로의 전달 또는 박막 크로마토그래피 및 오토래디오그래피로 검출
GAL(β-갈락토시다제) 무색 갈락토시드를 가수분해하여 발색 생성물을 생성함
GUS(β-글루쿠로니다제) 무색 글루쿠로니드를 가수분해하여 발색 생성물을 생성함
LUC(루시퍼라제) 루시페린을 산화시켜 광자를 발광함
GFP(녹색 형광 단백질) 기질이 없는 형광 단백질
SEAP(분비형 알칼리 포스파타제) 적절한 기질 또는 발색단을 생성하는 기질과의 발광 반응
HRP(호스래디쉬 퍼옥시다제) 산화수소 존재 하에, 3,3'5,5'-테트라메틸벤지딘을 산화시켜 발색 복합체를 형성함
AP(알칼리 포스파타제) 적절한 기질 또는 발색단을 생성하는 기질과의 발광 반응
리포터 유전자의 존재도는 특히, 뉴클레오티드 서열의 전사, 그 mRNA의 존재도 및 그 단백질의 존재도를 정량하는 데 이용되는 웨스턴 블롯 분석 또는 노던 블롯 분석 또는 임의의 기타 기법으로 측정할 수 있다(참고 문헌: Short Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, (editors), John Wiley & Sons, Inc., 4th edition, 1999). 특정 실시형태에서, 리포터 유전자 생성물의 활성은 재조합 바이러스로부터의 리포터 유전자의 해독물로서 측정한다. 리포터 유전자 생성물의 활성을 정량하기 위해, 리포터 유전자 생성물의 생화학적 특성을 이용할 수 있다(표 4 참조). 리포터 유전자 생성물의 생화학적 활성을 측정하기 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 대표적인 리포터 유전자에 관한 보다 상세한 설명은 아래에 기술한다.
5.8.3 감염 발생률의 빈도 측정
감염 발생률은 당업계에 잘 알려져 있는 임의의 방법으로 측정할 수 있으며, 예를 들어, 이에 한정되지는 않지만, 각각 항-APV-항원 항체, 항-hMPV-항원 항체, 항-APV-항원 항체 및/또는 이종성 뉴클레오티드 서열의 유전자 생성물에 특이적인 항체를 이용하는 면역형광 분석(IFA)으로 임상 시료(예를 들어, 비강 도말)를 본 발명 바이러스의 존재에 대하여 테스트할 수 있다.
특정 실시형태에서, 온전한 세포를 함유하는 시료는 바로 가공할 수 있는 반면, 온전한 세포를 함유하지 않는 분리물은 먼저 허용(permissive) 세포주(예를 들어 HEp-2 세포)에서 배양하여야 한다. 대표적인 실시형태에서, 배양된 세포 현탁액을, 예를 들어, 실온에서 300xg로 5 분 동안 원심분리하여 맑게 만들고, 이어서 동일한 조건 하에 PBS(pH 7.4, Ca++ 및 Mg++ 무함유) 세척을 수행한다. 분석을 위해 세포 펠릿을 소량의 PBS에 재현탁시킨다. 온전한 세포를 함유하는 1차 임상 분리물을 PBS와 혼합하여 실온에서 300xg로 5 분 동안 원심분리한다. 멸균 피펫 팁을 사용하여 계면으로부터 점액을 제거하고, 동일한 조건 하에 세포 펠릿을 PBS로 1회 이상 세척한다. 그 후, 분석을 위해 펠릿을 소량의 PBS에 재현탁시킨다. 아세톤으로 세척한 12웰 HTC의 5 mm 웰당 각각의 세포 현탁액 5∼10 ㎕를 스포팅하여 공기 건조시킨다. 슬라이드를 냉각(-2O℃) 아세톤으로 10 분 동안 고정시킨다. 각 웰에 PBS - 1% BSA를 첨가하여 반응을 중단시키고, 이어서 실온에서 10 분 동안 항온처리한다. 슬라이드를 PBS - 0.1% Tween-20으로 3회 세척하고 공기 건조시킨다. 차단 완충액 중에 250 ng/ml로 희석시킨 각각의 1차 항체 시약 10 ㎕를 각각의 웰에 스포팅하고 37℃ 함습 환경에서 반응물을 30 분 동안 항온처리한다. 그 후, 슬라이드를, PBS - 0.1% Tween-20을 3회 교환하여 충분히 세척한다. 차단 완충액 중에 250 ng/ml로 희석시킨 적절한 2차 접합 항체 시약 10 ㎕를 각각의 웰에 스포팅하고 37℃ 함습 환경에서 반응물을 30 분 동안 더 항온처리한다. 그 후, 슬라이드를, PBS - 0.1% Tween-20을 3회 교환하여 세척한다. PBS-50% 글리세롤-10 mM Tris pH 8.0-1 mM EDTA 5 ㎕를 각각의 반응 웰에 스포팅하고, 슬라이드에 커버 슬립을 덮는다. 그 후 각 반응 웰을, B-2A 필터(EX 450-490 nm)를 이용하여 200배 배율의 형광 현미경으로 분석한다. 비염색 세포 또는 2차 시약만으로 염색된 세포로부터 얻어진 자체 형광 바탕값에 대하여 양성 반응의 점수를 매긴다. 양성 반응은 감염된 세포의 세포질 내 작은 봉입체에 의해 강조되는 밝은 형광을 특징으로 한다.
5.8.4 혈청 역가의 측정
항체 혈청 역가는 당업계에 잘 알려져 있는 임의의 방법으로 측정할 수 있으며, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 혈청 시료 중의 항체 또는 항체 단편의 양을 샌드위치 ELISA로 정량할 수 있다. 요약하면, ELISA는 혈청 중의 항체 또는 항체 단편을 인식하는 항체와 4℃에서 밤새 미량적정 플레이트를 코팅하는 것으로 이루어진다. 그 후, 상기 플레이트를 실온에서 PBS-Tween-0.5% BSA로 약 30 분 동안 차단한다. PBS-TWEEN-BSA에 희석시킨 정제된 항체 또는 항체 단편을 이용하여 표준 곡선을 작성하고, 시료를 PBS-BSA에 희석시킨다. 분석 플레이트의 웰(2개씩)에 시료 및 표준 물질을 첨가하여, 실온에서 약 1 시간 동안 항온처리한다. 그 후, 비결합 항체는 PBS-TWEEN으로 세척해 내고, 결합된 항체는 표지된 2차 항체(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합 염소-항-인간 IgG)로 실온에서 약 1 시간 동안 처리한다. 표지된 항체의 결합은, 표지에 특이적인 발색 기질을 첨가하고, 예를 들어 분광광도계로 기질의 전환율을 측정하여 검출한다. 혈청 중의 항체 또는 항체 단편의 농도는 그 시료에 대한 기질 전환율을 특정 희석률에서의 표준 곡선에 있어서의 기질 전환율에 비교하여 결정한다.
5.8.5 혈청학적 테스트
본 발명의 특정 실시형태에서, 포유동물 MPV의 성분에 결합하는 항체의 존재를 검출한다. 구체적으로, 피험체 내의 포유동물 MPV의 존재를 진단하기 위해, 피험체에서 포유동물 MPV의 단백질에 대한 항체의 존재를 검출할 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 방법을 포유동물 MPV의 성분에 대한 항체의 존재를 검출하는 데 이용할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 혈청학적 테스트는, MPV에 감염된 것으로 의심되는 숙주 유래의 시료를, MPV 또는 그 성분에 대한 항체와 접촉시키는 단계 및 복합체의 형성을 검출하는 단계로 수행할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 혈청학적 테스트는 MPV 노출에 대한 숙주 항체 반응의 존재를 검출할 수 있다. 숙주 항체 또는 MPV 성분을 검출하기 위해 본 발명의 분석에 이용될 수 있는 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 그러한 항체는 핵산, 아미노산, 당, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 탄수화물 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 에피토프를 검출할 수 있도록 조작될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 혈청학적 테스트는, MPV에 감염된 것으로 의심되는 숙주 유래의 시료를 MPV의 성분과 접촉시키는 단계 및 복합체의 형성을 검출하는 단계로 수행할 수 있다. 직접 면역형광법, ELISA, 웨스턴 블롯, 면역크로마토그래피를 비롯하여 상기 방법의 예는 당업계에 잘 알려져 있으며 이 방법은 전술한 것에 한정되지 않는다.
대표적 일 실시형태에서, 포유동물 MPV의 성분은 고체 지지체에 결합된다. 특정 실시형태에서, 상기 포유동물 MPV의 성분은 F 단백질 또는 G 단백질일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 이어서, 포유동물 MPV에 대한 항체의 존재에 대해 테스트하고자 하는 물질을 포유동물 MPV 성분에 대한 항체의 결합을 유도할 수 있는 조건 하에 고체 지지체와 함께 항온처리한다. 그 후, 상기 고체 지지체를 비특이적으로 결합된 임의의 항체를 제거하는 조건 하에 세척한다. 세척 단계 후, 결합된 항체의 존재를 당업자에게 공지된 임의의 기법을 이용하여 검출할 수 있다. 특정 실시형태에서, 포유동물 MPV의 성분에 결합되는 항체에 대한 검출 가능하게 표지된 항체의 결합을 유도하는 조건 하에, 포유동물-MPV 단백질-항체 복합체를, 피험체의 종에 의해 생성된 항체를 인식하는 검출 가능하게 표지된 항체와 함께 항온처리하는데, 예를 들어, 피험체가 코튼 래트(cotton rat)라면, 검출 가능하게 표지된 항체는 래트 항체에 대한 것이다. 특정 실시형태에서, 검출 가능하게 표지된 항체는 효소 활성에 접합된다. 또 다른 실시형태에서, 검출 가능하게 표지된 항체는 방사능으로 표지된다. 그 후, 포유동물 MPV 단백질-항체-검출 가능하게 표지된 항체의 복합체를 세척하고, 이어서 검출 가능하게 표지된 항체의 존재를 당업자에게 공지된 기법으로 정량하는데, 여기서 이용되는 기법은 검출 가능하게 표지된 항체의 표지 유형에 따라 달라진다.
5.8.6 바이아코어 ( BIACORE ) 분석
항체 결합의 운동역학적(kinetic) 파라미터는, 예를 들어 0.05% Tween-20을 함유하는 HBS 완충액 중 다양한 농도의 단일 클론 항체("mAb") 250 ㎕를, 항원을 고정화시켜 둔 센서 칩 표면 위에 주사하여 측정할 수 있다. 상기 항원은 포유동물 MPV의 임의의 성분일 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 항원은 포유동물 MPV의 F 단백질 또는 G 단백질일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 유량은 75 ㎕/분으로 일정하게 유지한다. 해리 데이터는 15 분 동안 또는 필요에 따라 그보다 긴 시간 동안 수집한다. 매회의 주사/해리 사이클 후에, 묽은 산, 일반적으로 10∼100 mM HCl(환경상의 이유로서 다른 재생제도 이용됨)을 이용한 1 분 간의 짧은 펄스를 이용하여 항원 표면으로부터 결합된 mAb를 제거한다.
보다 구체적으로, 결합 속도, 즉 kon 및 해리 속도, 즉 koff의 측정을 위해, 표준 아민 결합 화학법, 즉 EDC/NHS 법(EDC=N-디에틸아미노프로필)-카보디이미드)을 이용하여, 항원을 센서 칩 표면 상에 직접 고정화한다. 요약하면, 10 mM NaOAc(pH 4 또는 pH 5) 중의 5∼100 nM 항원 용액을 제조하고, 항원의 약 30∼50 RU(바이아코어 공명 단위; Biacore Resonance Unit) 수준이 고정화될 때까지, EDC/NHS 활성화 표면 위로 통과시킨다. 그 후, 1 M Et-NH2를 주사하여 미반응 활성 에스테르를 "캡핑"한다. 참조를 위해 동일한 고정화 조건 하에 항원을 함유하지 않는 빈(blank) 표면을 준비한다. 적절한 표면이 준비되면, 각각의 항체 시약을 HBS/Tween-20에 희석시켜 일련의 적절한 희석액을 제조하고, 직렬로 연결된 항원과 참조용 세포 표면 위로 통과시킨다. 제조된 항체 농도의 범위는 평형 결합 상수, 즉 KD의 값이 얼마로 추정되는지에 따라 달라진다. 전술한 바와 같이, 매회의 주사/해리 사이클 후에 적절한 재생제를 사용하여 결합된 항체를 제거한다.
전체 데이터 세트가 수집되면, 생성된 결합 곡선을 장치 제조업자, 즉 바이아코어 인코포레이티드(BIAcore, Inc)(미국 뉴저지주 피스카타웨이)가 제공하는 알고리즘을 이용하여 전체적으로 피팅(fitting)을 행한다. 모든 데이터는 1:1 랭뮈어 결합 모델에 대하여 피팅을 행한다. 이러한 알고리즘은 겉보기 평형 결합 상수, 즉 KD를 추론할 수 있는 kon과 koff 둘 다를 상기 두 속도 상수의 비(즉, koff/kon)로서 계산한다. 개개의 속도 상수의 추론 방법에 관한 보다 상세한 취급 방법은 BIAevaluation 소프트웨어 핸드북(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 바이아코어 인코포레이티드)을 참고할 수 있다.
5.8.7 마이크로 중화( microneutralization ) 분석
항체 또는 이의 항원 결합성 단편이 바이러스 감염성을 중화시키는 능력은 마이크로 중화 분석으로 측정한다. 마이크로 중화 분석은 Anderson 등의 문헌[1985, J. Clin. Microbiol. 22:1050-1052, 이 문헌의 개시 내용은 본원에서 그 전체를 참고로 인용함]이 발표한 방법의 변형법이다. 이 방법에 관해서는 문헌[Johnson et al., 1999, J. Infectious Diseases 180:35-40, 이 문헌의 개시 내용은 본원에서 그 전체를 참고로 인용함]에도 기재되어 있다.
96웰 플레이트를 이용하여 항체 희석액을 삼중으로 제조한다. 96웰 플레이트의 웰에서 37℃로 2 시간 동안 106 TCID50의 포유동물 MPV를 테스트하고자 하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합성 단편의 연속 희석액과 항온처리한다. 그 후, Vero 세포(2.5 x 104) 등(이에 한정되지 않음)의 포유동물 MPV에 의한 감염에 감수성이 있는 세포를 각각의 웰에 첨가하여 5% CO2, 37℃에서 5 일 동안 배양한다. 5 일 후, 배지를 흡출하고, 세포를 세척하고, 80% 메탄올 및 20% PBS를 사용하여 플레이트에 고정시킨다. 그 후, F 단백질 발현 등의 바이러스 항원으로 바이러스 복제를 측정한다. 고정된 세포는 비오틴 접합 항-바이러스 항원, 예컨대 항-F 단백질 단일 클론 항체(예를 들어, pan F 단백질, C-부위 특이적 MAb 133-1H)와 항온처리한 후 세척하고, 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합 아비딘을 상기 웰에 첨가한다. 상기 웰을 다시 세척하고, 450 nm에서 기질 TMB(티오니트로벤조산)의 전환율을 측정한다. 중화 역가는, 바이러스 단독 대조군 세포로부터 450 nm에서의 흡광도(OD450)를 50% 이상 감소시키는 항체 농도로서 표현된다.
전술한 마이크로 중화 분석은 단지 일례로서 제시한 것이다. 대안으로, 표준 중화 분석을 이용하여, 바이러스가 항체에 의해 얼마나 유의적으로 영향을 받는지를 측정할 수 있다.
5.8.8 바이러스 융합 억제 분석
이 분석은, 항체를 첨가하기 4 시간 전에 세포를 각각의 바이러스로 감염시키고 해독물을 세포 융합의 존재 또는 부재로 나타낸 것을 제외하고는 마이크로 중화 분석과 기본적으로 동일하다(Taylor et al., 1992, J. Gen. Virol. 73:2217-2223).
5.8.9 등온 적정 열량측정법
열역학적 결합 친화력 및 엔탈피는 항체와 그 각각의 항원과의 상호작용에 대한 등온 적정 열량측정법(ITC)의 측정값으로부터 측정한다.
항체를 투석액에 희석시키고, 280 nm에서의 최대 피크에서, 217,000 M-1 cm-1의 흡광 계수를 이용하여, 퍼킨-엘머 람다 4B 분광광도계를 사용한 UV 분광학적 흡광도 측정으로 농도를 측정하였다. 희석된 포유동물 MPV-항원 농도는 최초 시료의 질량 대 희석된 시료의 질량의 비로부터 계산하는데, 그 이유는 다량의 시료를 사용하여 손실시키지 않고는 정확한 농도를 측정할 수 없을 정도로 그 흡광 계수가 너무 낮기 때문이다.
ITC 측정
항체의 결합에 대한 열역학적 성질은 마이크로컬 인코포레이티드(Microcal, Inc.)의 VP 적정 열량계를 이용한 ITC 측정으로부터 측정한다. 상기 VP 적정 열량계는 단열 포장재에 동봉된 짝을 이루는 한 쌍의 시료와 참조 용기(1.409 ml) 및 리간드 용액을 시료 용기로 적정하는 데 사용되는 회전식 교반기-시린지로 구성된다. 상기 ITC 측정은 25℃ 및 35℃에서 수행한다. 상기 시료 용기는 인산염 완충액 중의 항체를 함유하는 반면, 상기 참조 용기는 완충액만을 함유한다. 상기 인산염 완충액은 하이클론 인코포레이티드(HyClone, Inc.)로부터 입수한 염수인 67 mM PO4(pH 7.4)이다. 0.05∼0.1 mM의 RSV-항원, PIV-항원 및/또는 hMPV-항원 용액 5 또는 10 ㎕ 분액을, 결합이 포화되었음이 열 교환 신호의 부재로 확인될 때까지, 항체 시료 용액으로 3∼4 분 간격으로 적정한다.
마이크로칼 인코포레이티드로부터 입수한 비선형 최소 자승 최소화법 소프트웨어, 즉 Origin 5.0을 이용하여, 하기 식 (I)에 따라, 총 적정액 농도 Xt에 대한, 총 열량 Qt의 i차 적정의 열 증분(ΔQ(i))의 피팅을 행한다.
Figure 112007072739021-PCT00001
상기 식에서, Ct는 시료 용기 내의 최초 항체 농도이고, V는 시료 용기의 부피이며, n은 Kb,
Figure 112007072739021-PCT00002
및 n의 값을 산출하기 위한 결합 반응의 화학량이다. Kb의 측정을 위한 시료 농도의 최적 범위는 Kb의 값에 좌우되며 하기 관계식에 의해 정의된다.
CtKbn ≤ 500 (2)
따라서 1 μM에서 측정될 수 있는 최대 Kb는 2.5 × 1O8 M-1 미만이다. 최초 적정액 첨가가 결합 등온선에 피팅되지 않는다면, 이것은 최초 분석에서 무시하는데, 그 이유는 그것이 시린지 개구와 용액의 계면에서의 기포의 방출을 반영하는 것일 수 있기 때문이다.
5.8.10 면역분석
면역침전 프로토콜은 일반적으로, 단백질 포스파타제 및/또는 프로테아제 억제제(예를 들어, EDTA, PMSF, 159 아프로티닌, 소듐 바나데이트)가 보충된, RIPA 완충액[1% NP-40 또는 트리톤(Triton) X-100, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1 % SDS, 0.15 M NaCl, 0.01 M 인산나트륨, pH 7.2, 1% 트라실롤(Trasylol)] 등의 용해 완충액에 세포 집합체를 용해시키는 단계, 관심있는 항체를 세포 용해물에 첨가하는 단계, 4℃에서 일정 시간 동안(예를 들어, 4 시간까지) 항온처리하는 단계, 단백질 단백질 A 및/또는 단백질 G 세파로스 비드를 세포 용해물에 첨가하는 단계, 4℃에서 약 1 시간 이상 동안 항온처리하는 단계, 용해 완충액으로 비드를 세척하고 그 비드를 SDS/시료 완충액에 재현탁시키는 단계를 포함한다. 관심있는 항체가 특정 항원을 면역침전시키는 능력은, 예를 들어 웨스턴 블롯 분석으로 측정할 수 있다. 당업자라면 항원에 대한 항체의 결합을 증가시키고 바탕값을 감소시키도록 변경시킬 수 있는 파라미터(예를 들어, 세파로스 비드를 이용한 세포 용해물의 예비 투명화 처리)에 관해 알고 있을 것이다. 면역침전 프로토콜에 관한 추가 고찰에 대해서는, 예를 들어 문헌[Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, at pages 10, 16, 1]을 참조할 수 있다.
웨스턴 블롯 분석은 일반적으로, 단백질 시료를 준비하는 단계, 단백질 시료를 폴리아크릴아미드 겔(예를 들어, 항원의 분자량에 따라 8%-20% SDS-PAGE)에서 전기영동하는 단계, 단백질 시료를 폴리아크릴아미드 겔로부터 니트로셀룰로스, PVDF 또는 나일론 등의 막으로 이전하는 단계, 막을 차단 용액(예를 들어, 3% BSA 또는 탈지유 함유 PBS) 중에서 차단하는 단계, 막을 세척 완충액(예를 들어, PBSTween20)에서 세척하는 단계, 막을 차단 완충액에 희석시킨 1차 항체(관심있는 항체)와 항온처리하는 단계, 막을 세척 완충액에서 세척하는 단계, 차단 완충액 중에 희석시킨, 효소 기질(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리 포스파타제) 또는 방사성 분자(예를 들어, 12P 또는 121I)에 접합된 2차 항체(1차 항체를 인식하는 항체, 예를 들어 항-인간 항체)와 막을 항온처리하는 단계, 막을 세척 완충액에서 세척하는 단계 및 항원의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 당업자라면 검출 신호를 증가시키고 배경 노이즈를 감소시키도록 변경시킬 수 있는 파라미터에 대해 알 것이다. 웨스턴 블롯 프로토콜에 관한 추가 고찰에 대해서는, 예를 들어 문헌[Ausubel et al., eds, 1994, GinTent Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.8.1]을 참조할 수 있다.
ELISA는 항원을 준비하는 단계, 96웰 미량적정 플레이트를 항원으로 코팅하는 단계, 웰에 결합하지 않은 항원을 세척 제거하는 단계, 효소 기질(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리 포스파타제) 등의 검출 가능한 화합물에 접합된 관심있는 항체를 웰에 첨가하여 일정 시간 동안 항온처리하는 단계, 비결합 항체 또는 비특이적으로 결합된 항체를 세척 제거하는 단계 및 항원 코팅 웰에 특이적으로 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. ELISA에서, 관심있는 항체를 검출 가능한 화합물에 접합할 필요는 없으며, 그 대신, 검출 가능한 화합물에 접합된 2차 항체(관심있는 항체를 인식하는 항체)를 웰에 첨가해도 좋다. 또한, 항원으로 웰을 코팅하는 대신에, 항체를 웰에 코팅해도 좋다. 이 경우, 검출 가능한 분자는 효소 기질(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리 포스파타제) 등의 검출 가능한 화합물에 접합된 항원일 수 있다. 신호 검출량을 증가시키도록 변경시킬 수 있는 파라미터와 ELISA의 기타 변형법은 당업자에게 잘 알려져 있다. ELISA에 관한 추가 고찰을 위해서는, 예를 들어 문헌[Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1]을 참조할 수 있다.
항원에 대한 항체(scFv, 또는 항체 단편 또는 이의 변이체를 포함하거나 또는 이것으로 구성된 다른 분자를 포함함)의 결합 친화력 및 항체-항원 상호작용의 해리 속도(off-rate)는 경쟁 결합 분석으로 측정할 수 있다. 경쟁 결합 분석의 일례로는, 증가하는 양의 비표지 항원 존재 하에 표지된 항원(예를 들어, 3H 또는 121I)과 관심있는 항체를 항온처리하는 단계 및 표지된 항원에 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함하는 방사성 면역분석법이 있다.
5.8.11 수크로스 구배 분석
당업자에 공지된 임의의 생화학 분석법을 이용하여 이종 단백질을 비리온으로 도입할지 여부를 더 조사할 수 있다. 특정 구체예에서는, 수크로스 구배 분석법을 사용하여 이종 단백질을 비리온으로 도입할지 여부를 결정한다.
감염된 세포 용해물을 20∼60% 수크로스 구배로 분획할 수 있으며, 여러 분획을 수집하여 예컨대 웨스턴 블롯 분석에 의하여 이종 단백질 및 벡터 단백질의 존재 및 분포에 대하여 분석한다. 분획 및 바이러스 단백질은 플라크 분석법에 의하여 최고 바이러스 역가에 대하여 분석할 수도 있다. 이종 단백질이 비리온과 함께 동시 이동할 경우 이종 단백질은 비리온과 회합된다.
5.9 신규한 MPV 분리물의 동정 방법
본 발명은 포유동물 MPV, 특히 hMPV에 관한 것이다. 본 발명은 MPV의 두 혈청학적 서브 그룹, A 및 B의 특징 및 MPV의 4 변이체 A1, A2, B1 및 B2의 특징을 제공하지만, 본 발명은 이들 서브 그룹 및 변이체에 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 아직 동정되어야 하는 임의의 MPV의 분리물, 본원에 개시된 서브 그룹 및 변이체에 속하거나 아직 특성화하여야 하는 서브 그룹 또는 변이체에 속하는 것을 특징으로 하는 것을 포함한다.
소정 샘플 중에 존재하는 단백질 성분을 특성화하기 위하여 면역 분석을 사용할 수 있다. 면역 분석은 동정을 위한 바이러스의 펩티드 성분을 사용하여 바이러스 분리물을 비교하는 효과적인 방법이다. 예컨대, 본 발명은 본원에 제공된 바와 같은 MPV의 추가의 분리물을 동정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본질적으로 MPV에 감염되지 않거나 또는 특이적 병원이 없는 기니아 피그 또는 흰족제비에 표현형 분리물 1-2614 또는 관련 분리물을 접종하는 것을 포함한다 (상세한 설명에서 동물은 비강내로 접종되지만 근내 또는 피내 접종과 같은 다른 접종 및 다른 실험 동물의 사용도 가능함). 혈청은 접종 후 0일, 2주 및 3주에 동물로서 수집한다. 각 분석물 I-2614에 대한 바이러스 중화 (VN) 분석 (VN 분석의 예에 대해서는, 실시예 16 참조) 및 간접 IFA (IFA의 예에 대해서는, 실시예 11 또는 14 참조)에서 측정한 바와 같이 특이적으로 혈청 변환된 동물 및 혈청 변환된 동물로부터 취한 혈청을 상기 추가 분석물의 면역 검출에 사용한다. 예로서, 본 발명은 인간에서 심각한 RTI를 야기할 수 있는 파리믹소바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 또는 메타뉴모바이러스 유사 바이러스 (그 최종 분류는 바이러스 분류 위원회의 논의를 기다려야 하므로 MPV는 본원에서 예컨대 분류학적으로 APV에 상응하는 것으로서 개시됨) (MPV) 패밀리에서 신규한 멤버의 특성화를 제공한다. MPV에 의하여 야기되는 질환의 임상적인 신호는 기침, 근육통, 구토, 열, 세기관지염 또는 폐렴, 경우에 따라 결막염 또는 이들의 조합과 같이 본질적으로 hRSV에 의하여 야기되는 것과 유사하다. hRSV에 감염된 어린이들에서 관찰되는 바와 같이, 특히 매우 어린 아이들은 입원이 필요할 수 있다. 본원에서는 예컨대 2001년 1월 19일에 1-2614로서 파리 파스퇴르 연구소 CNCM에 기탁된 MPV 또는 계통발생학적으로 이에 해당하는 바이러스 분리물이 제공된다. 또한, 본 발명은 핵산 또는 서열 번호 19의 핵산 서열에 계통발생학적 또는 구조적으로 상응하는 기능적 단편을 포함하는 바이러스를 제공한다. 특히 본 발명은 100 부트스트랩 및 3 점블을 사용하여 최대 확률 트리를 생성시키는 계통발생학적 트리 분석에서 시험한 후에 조류 비기관염 바이러스의 원인 병원체인 칠면조 비기관염 바이러스 (TRTV)로서도 공지된 조류 뉴모바이러스 (APV)의 바이러스 분리물보다 파리 CNCM에 1-2614로 기탁된 바이러스 분리물과 계통발생학적으로 더 밀접하게 상응하는 것을 특징으로 하는 바이러스를 제공한다. 상기 계통발생학적 트리 분석에서 가장 가까운 친족인 특히 본질적으로 비포유동물 바이러스인 AVP-C 바이러스를 외집단으로서 사용하는 것이 특히 유용하다.
5.9.1 서열의 생명 정보학적 배열
2 이상의 아미노산 서열을 BLAST (Altschul, S. F. et al, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)에 의하여 비교하여 서로에 대한 서열 상동성 및 서열 동일성을 결정할 수 있다. 2 이상의 누클레오티드 서열을 BLAST (Altschul, S. F. et al, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)에 의하여 비교하여 서로에 대한 서열 상동성 및 서열 동일성을 결정할 수 있다. Clustal W 방법 (MacVector(tm))을 사용하여 BLAST 비교를 실시할 수 있다. 일부 특정 구체예에서는, 컴퓨터 프로그램에 의하여 2 이상의 서열을 배열한 다음 수작업으로 재조절할 수 있다.
수학적 알고리즘을 사용하여 두 서열 간의 동일성 백분율을 결정할 수 있다. 두 서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한 비제한적 예는 문헌[Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 변형된 Karlin and Altschul(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 Altschul 등의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(1990, J. MoI. Biol. 215:403-410)에 통합된다. BLAST 누클레오티드 비교는 NBLAST 프로그램으로 실시될 수 있다. BLAST 아미노산 서열 비교는 XBLAST 프로그램으로 실시될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 허용 배열을 얻기 위하여 문헌(Altschul et al, 1997, Nucleic Acids Res.25:3389-3402)에 개시된 바와 같은 갭 허용 BLAST를 이용할 수 있다. 이와는 다르게, PSI-Blast를 사용하여 분자간의 먼 관계를 검출하는 반복 검색을 실시할 수 있다(Altschul et ah, 1997, supra). BLAST, 갭 허용 BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램의 디폴트 매개변수 (예컨대, XBLAST 및 NBLAST)를 사용할 수 있다 (http://www.ncbi.nlm.mh.gov 참조). 서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 또다른 바람직한 비제한적 예는 Myers 및 Miller의 알고리즘(1988, CABIOS 4:11-17)이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0)에 통합된다. 아미노산 서열의 비교를 위한 ALIGN 프로그램을 사용할 때, PAM 120 잔기 중량표를 사용할 수 있다. 당업자라면 갭 길이 패널티를 설정할 수 있다. 갭을 허용하지 않거나 허용하여 상기 개시한 기술과 유사한 기술을 사용하여 두 서열간의 동일성 백분율을 결정할 수 있다. 동일성 백분율 계산시, 일반적으로 정확한 매치만을 헤아린다.
5.9.2 하이브리드화 조건
서로에 대한 서열 상동성 및 동일성을 결정하기 위한 본 발명의 방법에 포유동물 MPV의 핵산, 또는 이의 역 상보체, 또는 이의 상보체에 하이브리드화할 수 있는 핵산 사용할 수 있다. 일부 구체예에서는, 매우 엄격한 조건하에 핵산을 하이브리드화한다. 비제한적 예로서, 이렇게 매우 엄격한 조건을 사용하는 절차는 다음과 같다. DNA를 함유하는 필터의 예비 하이브리드화는 6X SSC, 50 mM 의 Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM의 EDTA, 0.02%의 PVP, 0.02%의 Ficoll, 0.02%의 BSA, 및 500 ㎛/ml의 변성된 연어 정액 DNA로 구성된 완충액 중에서 65℃에서 8시간 내지 밤새 실시한다. 100 ㎍/ml의 변성된 연어 정액 DNA 및 5-20 X 106 cpm의 32P-표지된 프로브를 함유하는 예비 하이브리드화 혼합물에서 48시간 동안 65℃에서 필터를 하이브리드화한다. 2X SSC, 0.01%의 PVP, 0.01%의 Ficoll, 및 0.01%의 BSA를 함유하는 용액 중에서 1시간 동안 37℃에서 필터를 세정한다. 이후 45분 동안 50℃에서 0.1X SSC에서 세정한 다음 방사능 사진 촬영한다. 사용할 수 있는 매우 엄격한 다른 조건은 업계에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 다른 구체예에서는, 엄격도가 낮은 온건한 조건하에 하이브리드화를 실시하며, 이러한 조건은 당업자에 널리 공지되어 있다 [예컨대 문헌(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; 및 Ausubel et al., eds., in the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1997 Current Protocols, (c) 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.) 참조].
5.9.3 계통발생학적 분석
본 발명은 포유동물 MPV 분리물 간의 계통발생학적 관계의 영향에 대한 것이다. 다수의 방법 또는 접근법을 계통발생학적 관계를 분석하는 데 사용할 수 있으며, 이들은 거리, 최대 확률 및 최대 파시모니 방법을 포함한다 (Swofford, DL., et. al., Phylogenetic Inference. In Molecular Systematics. Eds. Hillis, DM, Mortiz, C, and Mable, BK. 1996. Sinauer Associates: Massachusetts, USA. pp. 407 - 514; Felsenstein, J., 1981, J. MoI. Evol. 17:368-376). 또한, 부트스트랩 방식의 기술은 계통발생학적 트리의 신뢰 구간을 준비 및 검사하는 효과적인 수단이다 (Felsenstein, J., 1985, Evolution. 29:783-791). 포유동물 MPV 분리물을 비교하기 위하여 누클레오티드 또는 펩티드 서열 정보를 사용하는 임의의 방법 또는 접근법(거리, 최대 확률 및 최대 파시모니 방법 또는 접근 방식을 포함하나 이에 한정되지 않음)을 사용하여 계통발생학적 관계를 확립할 수 있다. 부트스트랩핑을 포함하나 이에 한정되지 않는 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 계통발생학적 데이터의 질을 분석할 수 있다. 계통발생학적 접근법에서 사용하기 위한 누클레오티드 또는 펩티드 서열의 정렬은 수작업 배열, 컴퓨터를 이용한 쌍배열 및 컴퓨터를 이용한 다중 배열을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 당업자라면 요구되는 정보 및 허용되는 시간에 기초하여 사용될 수 있는 바람직한 배열법 또는 계통발생학적 접근법을 잘 알 것이다.
한 구체예에서는, DNA 최대 확률 방법을 사용하여 hMPV 분리물 간의 관계를 추정한다. 또다른 구체예에서는, 상기 계통발생학적 접근법 중 하나를 사용하여 생성된 계통발생학적 데이터의 신뢰성을 측정하기 위하여 부트스트랩핑 기술을 사용한다. 또다른 구체예에서는, 계통발생학적 분석에 대한 서열 순서 입력의 효과를 최소화하기 위하여 데이터의 입력 전에 점블링 기술을 계통발생학적 접근법에 적용한다. 한 특정 구체예에서는, DNA 최대 확률 방법을 부트스트랩핑과 함께 사용한다. 또다른 특정 구체예에서는, DNA 최대 확률 방법을 부트스트랩핑 및 점블링과 함께 사용한다. 또다른 더 특별한 구체예에서는, DNA 최대 확률 방법을 50 부트스트랩과 함께 사용한다. 또다른 특정 구체예에서는, DNA 최대 확률 방법을 50 부트스트랩 및 3 점블과 함께 사용한다. 또다른 특정 구체예에서는, DNA 최대 확률 방법을 100 부트스트랩 및 3 점블과 함께 사용한다.
한 구체예에서는, hMPV 분리물의 핵산 또는 펩티드 서열 정보를 다른 hMPV 분리물의 서열과 비교하거나 또는 정렬한다. 아미노산 서열은 L 단백질, M 단백질, N 단백질, P 단백질, 또는 F 단백질의 아미노산 서열일 수 있다. 또다른 구체예에서는, hMPV 분리물 또는 다수의 hMPV 분리물들의 핵산 또는 펩티드 서열 정보를 다른 바이러스의 서열과 비교하거나 또는 정렬한다. 또다른 구체예에서는, 계통발생학적 접근법을 서열 정렬 데이터에 적용하여 계통발생학적 관계를 추론하고 및/또는 계통발생학적 트리를 작제할 수 있다. 거리, 최대 확률 및 최대 파시모니 방법 또는 접근법을 포함하나 이에 한정되지 않는, hMPV 분리물을 비교하기 위해 핵산 또는 펩티드 서열 정보를 사용하는 임의의 방법 또는 접근법을 사용하여 상기 계통발생학적 관계를 추론할 수 있다.
계통발생학적 분석을 위한 다른 방법은 본원에 그 전체 내용이 포함되어 있는 WO 02/057302호로 공개된 국제 특허 출원 PCT/NL02/00040호에 개시되어 있다. 특히, 본원에 참고문헌으로 인용되어 있는 PCT/NL02/00040호에는 12페이지 27줄 내지 19페이지 29줄에 계통발생학적 분석에 적당한 핵산 서열을 개시하고 있다.
계통발생학적 분석을 위하여 바이러스를 비교할 외집단으로서 비-MPV의 핵산 서열을 얻는 것이 가장 유용하며, 매우 유용한 외집단 분리물은 조류 뉴모바이러스 혈청 타입 C (APV-C)로부터 얻을 수 있다.
BioEdit, ClustalW, Tree View, 및 NJPlot을 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 방법 및 프로그램이 업계에 공지되어 있으며 계통발생학적 관계의 추론에 사용될 수 있다. 서열을 정렬하고 계통발생학적 트리 또는 관계를 생성하기 위해 사용되는 방법은 비교할 서열 정보의 입력을 필요로 한다. FASTA, NBRF, EMBL/SWISS, GDE 단백질, GDE 누클레오티드, CLUSTAL, 및 GCG/MSF를 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 방법 또는 포맷은 업계에 공지되어 있으며 서열 정보를 입력하는 데 사용될 수 있다. 서열을 정렬하고 계통발생학적 트리 또는 관계를 생성하기 위해 사용되는 방법은 결과의 출력을 필요로 한다. CLUSTAL, NBRF/PIR, MSF, PHYLIP, 및 GDE를 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 방법 또는 포맷을 정보 또는 결과의 출력에 사용할 수 있다. 한 구체예에서는, ClustalW를 100 부트스트랩 및 3 점블을 포함하는 DNA 최대 확률 방법과 조합 사용하여 계통발생학적 관계를 생성한다.
5.10 항체의 생성
본 발명은 또한 포유동물 MPV에 의하여 인코딩되는 펩티드에 대한 항체의 생성에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 포유동물 MPV의 F 단백질, N 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, G 단백질, 또는 P 단백질을 포함하는 모든 MPV 항원에 대한 항체의 생성에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 포유동물 MPV, 이의 유도체, 유사체 또는 단편에 의하여 인코딩되는 임의의 단백질을 면역특이적으로 면역원과 결합하는 항체의 생성을 위하여 면역원으로서 사용할 수 있다. 본 발명의 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 다특이성의 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체, 단일쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의하여 생성되는 단편, 항유전자형 (항-Id) 항체 (예컨대, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체 포함), 및 에피토프-결합 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로부린 분자 및 면역글로부린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 갖는 분자를 의미한다. 본 발명의 면역글로부린 분자는 임의의 유형 (예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위 부류의 면역글로부린 분자일 수 있다. 면역글로부린 분자의 면역학적으로 활성인 부분의 예에는 펩신 또는 파파인과 같은 효소로 항체를 처리함으로써 생성될 수 있는 F(ab) 및 F(ab')2 단편이 포함된다. 특정 구체예에서는, 인간 MPV에 의하여 인코딩한 단백질에 대한 항체를 생성시킨다. 또다른 구체예에서는, 인간 MPV에 의하여 인코딩한 단백질 도메인에 대한 항체를 생성시킨다.
업계에 공지된 각종 절차를 포유동물 MPV, 이의 유도체, 유사체 또는 단편에 의하여 인코딩한 단백질에 대한 폴리클로날 항체의 생성에 사용할 수 있다. 항체의 생성을 위해, 천연 단백질 또는 이의 합성 버전, 또는 유도체 (예컨대, 단편)을 주입하여, 래빗, 마우스, 래트 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 여러 숙주 동물을 면역화할 수 있다. 프로이드의 (완전 및 불완전) 무기물 젤, 예컨대 수산화알루미늄, 표면 활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(KLH), 디니트로페놀 및 BCG (bacille Calmette-Guerin)와 코리네박테리움 파르붐과 같은 잠재적으로 유용한 인간 보조제를 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 보조제를 사용하여 숙주 종에 따라 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
포유동물 MPV, 이의 유도체, 유사체 또는 단편에 의하여 인코딩된 단백질에 대한 모노클로날 항체의 제조를 위해, 배양액에서 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기술을 사용할 수 있다. 예컨대, 원래 Kohler 및 Milstein이 개발한 하이브리도마 기술 (1975, Nature 256:495-497), 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (Kozbor et ah, 1983, Immunology Today 4:72), 및 EBV-하이브리도마 기술을 인간 모노클로날 항체 생성에 사용할 수 있다 (Cole et ah, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). 본 발명의 추가의 구체예에서는, 최근의 기술을 사용하여 무균 동물에서 모노클로랄 항체를 생성시킬 수 있다 (PCT/US90/02545). 본 발명에 따르면, 인간 항체를 사용할 수 있으며, 인간 하이브리도마를 사용하거나 (Cote et al, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030) 또는 시험관내에서 인간 B 세포를 EBV 바이러스로 형질전환하여 (Cole et al, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96) 얻을 수 있다. 사실상, 본 발명에 따르면, 포유동물 MPV, 이의 유도체, 유사체 또는 단편에 의하여 인코딩된 단백질에 대하여 특이적인 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 적절한 생물학적 활성을 갖는 인간 항체 분자로부터의 유전자로 슬라이싱하는 것에 의한 "키메라 항체"의 생성을 위해 개발된 기술 (Morrison et al, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855; Neuberger et al, 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al, 1985, Nature 314:452-454)을 사용할 수 있으며, 이러한 항체는 본 발명의 범위이다.
본 발명에 따르면, 단일쇄 항체의 생성을 위해 개시된 기술 (미국 특허 4,946,778호)을 특이적 단일쇄 항체의 제조에 채택할 수 있다. 본 발명의 추가의 구체예서는 Fab 발현 라이브러리의 작제를 위해 개시된 기술 (Huse et al, 1989, Science 246:1275-1281)을 사용하여 포유동물 MPV, 이의 유도체, 유사체 또는 단편에 의하여 인코딩된 단백질에 대한 소정 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 용이하게 동정할 수 있다.
분자의 유전자형을 포함하는 항체 단편은 공지된 기술에 의하여 생성될 수 있다. 예컨대, 이러한 단편은 항체 분자의 펩신 이화에 의하여 생성될 수 있는 F(ab')2 단편; 상기 F(ab')2 단편의 이황화물 가교를 환원시킴으로서 생성시킬 수 있는 Fab' 단편, 파파인 및 환원제로 항체 분자를 처리하여 생성시킬 수 있는 Fab 단편, 및 Fv 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
항체의 제조에서, 소정 항체에 대한 스크리닝은 업계에 공지된 기술, 예컨대 ELISA (효소결합 면역흡수 분석법)에 의하여 실시할 수 있다. 예컨대, 포유동물 MPV에 의하여 인코딩된 단백질의 특이적 도메인을 인식하는 항체를 선택하기 위하여, 이러한 도메인을 함유하는 포유동물 MPV에 의하여 인코딩된 단백질의 단편에 결합하는 생성물에 대한 발생 하이브리도마를 분석할 수 있다.
본 발명에 의하여 제공되는 항체는 MPV 감염의 치료를 위한 치료 방법 및 MPV 검출에 사용할 수 있다.
본 발명 방법에 의하여 생성되는 항체의 특이성 및 결합 친화도는 당업자에 공지된 임의의 기술에 의하여 시험할 수 있다. 일부 구체예에서는, 본 발명 방법에 의하여 생성되는 항체의 특이성 및 결합 친화도를 섹션 5.8.5, 5.8.6, 5.8.7, 5.8.8 또는 5.8.9에 기술한 바와 같이 시험할 수 있다.
5.11 항바이러스제의 동정을 위한 스크리닝 분석
본 발명은 포유동물 MPV의 숙주 또는 숙주 세포 감염능을 억제하는 화합물의 동정을 위한 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 포유동물 MPV의 숙주 또는 숙주 세포에서의 복제능을 감소시키는 화합물의 동정을 위한 방법을 제공한다. 당업자에 널리 공지된 임의의 기술을 사용하여 포유동물 MPV의 숙주 감염능 및/또는 숙주 또는 숙주 세포에서의 복제능을 감소 또는 제거하는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 특정 구체예에서, 포유동물 MPV는 인간 MPV이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 포유동물 MPV의 포유동물 또는 포유동물 세포에서의 복제능을 억제하는 화합물의 동정 방법을 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명은 포유동물 MPV의 포유동물 또는 포유동물 세포 감염능을 억제하는 화합물의 동정 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 포유동물 MPV의 포유동물 세포에서의 복제능을 억제하는 화합물의 동정 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 바이러스 역가를 결정하는 데 사용될 수 있는 분석의 상세 기술에 대해서는 섹션 5.7을 참조하기 바란다.
특정 구체예에서는, 세포를 시험 화합물과 접촉시키고 포유동물 MPV로 감염시킨다. 특정 구체예에서는, 대조군 배양액을 시험 화합물 없이 포유동물 바이러스로 감염시킨다. 포유동물 MPV로 감염시키기 전, 포유동물 MPV로 감염시킴과 동시에 또는 포유동물 MPV로 감염시킨 후에 세포를 시험 화합물과 접촉시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 더 특별한 구체예에서, 세포는 인간 세포이다. 특정 구체예에서는, 세포를 1분 이상, 5분 이상, 15분 이상, 30분 이상, 1시간 이상, 2시간 이상, 5시간 이상, 12시간 이상 또는 1일 이상 동안 시험 화합물과 함께 항온처리한다. 분석 동안 임의의 시간에 바이러스의 역가를 측정할 수 있다. 특정 구체예에서, 배양액 중에서 바이러스 성장의 경시적 추이를 측정한다. 시험 화합물의 존재하에 바이러스 성장이 억제 또는 감소될 경우, 시험 화합물은 포유동물 MPV의 성장 또는 감염을 억제 또는 감소시키는 데 효과적인 것으로 확인된다. 특정 구체예에서는, 포유동물 MPV에 대한 특이성을 시험하기 위하여 다른 바이러스의 성장율을 억제 또는 감소시키는 능력에 대하여 포유동물 MPV의 성장을 억제 또는 감소시키는 화합물을 시험한다.
특정 구체예에서는, 시험 화합물을 모델 동물에 투여하여 모델 동물을 포유동물 MPV로 감염시킨다. 특정 구체예에서는, 시험 화합물의 투여 없이 대조군 모델 동물을 포유동물 바이러스로 감염시킨다. 시험 화합물은 포유동물 MPV로 감염시키기 전, 포유동물 MPV로 감염시킴과 동시에 또는 포유동물 MPV로 감염시킨 후에 투여할 수 있다. 특정 구체예에서, 모델 동물은 포유동물이다. 더 특별한 구체예에서, 모델 동물은 코튼 래트, 마우스 또는 원숭이일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 모델 동물에서 바이러스의 역가는 분석 동안 임의의 시점에 측정할 수 있다. 특정 구체예에서는, 배양액 중 바이러스의 성장의 경시적 추이를 측정한다. 시험 화합물의 존재하에 바이러스 성장이 억제 또는 감소된 경우, 시험 화합물은 포유동물 MPV의 성장 또는 감염을 억제 또는 감소시키는 데 효과적인 것으로 확인된다. 특정 구체예에서는, 모델 동물에서 포유동물 MPV의 성장을 억제 또는 감소시키는 화합물을 포유동물 MPV에 대한 특이성을 시험하기 위하여 다른 바이러스의 성장율을 억제 또는 감소시키는 능력에 대하여 시험한다.
5.12 백신, 항체 및 항바이러스제의 제조
바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산에 의하여 인코딩되는 단백질 분자 또는 메타뉴로바이러스 특이적 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 제공한다. 유용한 단백질 분자는 예컨대 본 발명에 따른 바이러스로부터 유도될 수 있는 임의의 유전자 또는 게놈 단편으로부터 유도된다. 본원에 제공된 바와 같은 이러한 분자 또는 이의 항원 단편은 예컨대 진단 방법 또는 키트 및 서브유닛 백신과 같은 약학 조성물에서 유용하다. 항원 또는 서브유닛 면역원으로서의 포함을 위해 F, SH 및/또는 G 단백질 또는 이의 항원 단편이 특히 유용하나, 활성화되지 않은 전체 바이러스도 사용할 수 있다. 특히, (예컨대, 진단 항체의 제공 또는 보호 목적을 위해) 생체에서 또는 (예컨대, 대식 세포 발현 기술 또는 합성 항체의 생성에 유용한 또다른 기술에 의하여) 시험관내에서 MPV 특이적 항체 또는 T 세포 반응을 유도하기 위하여, 계통발생학적 분석을 위해 동정된 재조합 핵산 단편에 의하여 인코딩되는 단백질 물질도 특히 유용하며, 계통발생학적 분석에서 유용한 ORF의 바람직한 경계 및 한계내에 포함되는 것도 물론 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 단백질 분자 또는 이의 MPV-특이적 기능 단편을 포함하는 항원과 특이적으로 반응하는 천연 폴리클로날 또는 모노클로날의 항체 또는 합성(예컨대, (대식 세포) 라이브러리에서 유도된 결합 분자) 항체가 본원에서 제공된다. 이러한 항체는, 바이러스 분리물 또는 이의 성분을 본원에 제공된 바와 같은 항체와 반응시키는 것을 포함하는, 바이러스 분리물을 MPV로서 동정하는 방법에서 유용하다. 이것은 예컨대 ELISA, RIA, FACS 또는 상이한 포맷의 항원 검출 분석 (면역학에서의 현재의 프로토콜)을 사용하여 정제 또는 비정제된 MPV 또는 이의 부분 (단백질, 펩티드)을 사용함으로써 얻어질 수 있다. 이와는 다르게, 전통적인 면역형광 또는 면역조직화학 기술을 사용하는 바이러스의 항원 동정에 감염된 세포 또는 세포 배양액을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스, 핵산, 단백질 분자 또는 이의 단편, 항원 및/또는 항체를 포함하는 약학 조성물을, 예컨대 개체에 본 발명에 따른 약학 조성물을 제공하는 것을 포함하는 MPV 감염 및/또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료 방법에 사용할 수 있다. 이것은 상기 개체가 인간을 포함할 때, 특히 상기 인간이 5세 이하일 때 가장 유용한데, 이러한 유아 및 어린이가 본원에 개시된 바와 같은 인간 MPV에 가장 감염되기 쉽기 때문이다. 일반적으로, 급성 상태에서 상부 호흡기 증상으로 고생하는 환자는 다른 호흡기 질환 및 다른 질환에 걸리기 쉽다. 또한 하부 호흡기 질환이 발생하여 다른 더 심각한 상태에 처하기 쉽다. 본 발명 조성물은 암 환자, 이식 수혜자 및 노인을 비롯한 면역약화된 개인의 치료에 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 바이러스를 포함하는 실험 동물 또는 세포 배양액을 준비하는 단계, 상기 배양액 또는 동물을 후보 항바이러스 제제로 치료하는 단계 및 상기 제제가 상기 바이러스 또는 이의 상기 배양액 또는 동물의 감염에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는 기도 질환의 치료에 유용한 항바이러스 제제의 수득 방법을 제공한다. 이러한 항바이러스 제제의 예에는 본원에 제공된 바와 같은 MPV-중화 항체 또는 이의 작용 성분이 포함되나 다른 성질의 항바이러스 제제도 얻어진다. 본 발명은 또한 약학 조성물의 제조, 특히 MPV 감염 또는 관련 질환에 의하여 야기되는 기도 질환의 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명 항바이러스 제제의 용도도 제공하며, 개체에 약학 조성물을 제공하는 것을 포함하는 MPV 감염 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료 방법에 유용한 본 발명 항바이러스 제제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명 백신은 본원에서 정의된 바와 같은 포유동물 메타뉴모바이러스를 포함한다. 어떤 더 특별한 구체예에서는, 포유동물 메타뉴모바이러스는 인간 메타뉴모바이러스이다. 바람직한 구체예에서, 백신 제제에 사용되는 포유동물 메타뉴모바이러스는 약독화된 표현형을 가진다. 약독화된 표현형을 얻는 방법에 대해서는 섹션 5.6을 참조하기 바란다.
본 발명은 PIV, RSV, APV5 및/또는 hMPV 감염의 예방 및 치료를 위한 백신 제제를 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 발명 백신은 본 발명의 재조합 바이러스 및 키메라 바이러스를 포함한다. 어떤 구체예에서, 바이러스는 약독화된다.
특정 구체예에서, 백신은 APV를 포함하며 백신은 인간의 hMPV 감염의 예방 및 치료에 사용된다. 이론에 의한 구속 없이, APV의 F 단백질과 hMPV의 F 단백질은 상동성의 정도가 높으므로, APV 감염은 hMPV와도 교차 반응하는 항체를 숙주에서 생성시켜 hMPV 감염 및 관련 질환으로부터 숙주를 보호할 것이다.
또다른 특정 구체예에서, 백신은 hMPV를 포함하며 백신은 칠면조를 포함하나 이에 한정되지 않는 조류의 APV 감염의 예방 및 치료에 사용된다. 이론에 의한 구속 없이, APV의 F 단백질과 hMPV의 F 단백질은 상동성의 정도가 높으므로, hMPV 감염은 APV와도 교차 반응하는 항체를 숙주에서 생성시켜 APV 감염 및 관련 질환으로부터 숙주를 보호할 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 APV 및/또는 hMPV에 대한 보호를 제공하는 백신 제제에서 개질된 재조합 바이러스 및 키메라 APV/hMPV 바이러스의 용도를 포함한다. 어떤 구체예에서, APV/hMPV는 조류에 투여하여 조류를 APV 감염으로부터 보호하는 백신에서 사용된다. 이론에 의한 구속 없이, APV 유전자 또는 누클레오티드 서열을 hMPV 유전자 또는 누클레오티드 서열로 교체하면 키메라 바이러스를 백신으로서 사용할 수 있는 약독화된 표현형이 얻어진다. 다른 구체예에서는 APV/hMPV 키메라 바이러스를 인간에게 투여한다. 이론에 의한 구속 없이 APV 바이러스 벡터는 인간에서 약독화된 표현형을 제공하며 hMPV 서열의 발현은 hMPV 특이적 면역 반응을 유도한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 APV 및/또는 hMPV에 대한 보호를 제공하는 백신 제제에서 개질된 재조합 바이러스 및 키메라 hMPV/APV 바이러스의 용도를 포함한다. 어떤 구체예에서, hMPV/APV는 조류에 투여하여 조류를 hMPV 감염으로부터 보호하는 백신에서 사용된다. 이론에 의한 구속 없이, hMPV 유전자 또는 누클레오티드 서열을 APV 유전자 또는 누클레오티드 서열로 교체하면 키메라 바이러스를 백신으로서 사용할 수 있는 약독화된 표현형이 얻어진다. 다른 구체예에서는 hMPV/APV 키메라 바이러스를 조류에게 투여한다. 이론에 의한 구속 없이 hMPV 주쇄는 조류에서 약독화된 표현형을 제공하며 APV 서열의 발현은 APV 특이적 면역 반응을 유도한다.
어떤 바람직한 구체예에서, 본 발명의 백신 제제는 메타뉴모바이러스에 의한 감염 및 관련 질병을 방지하기 위해 사용된다. 더 구체적으로, 본 발명의 백신 제제는 인간 메타뉴모바이러스 및/또는 조류 뉴모바이러스에 의한 감염 및 관련 질환을 방지하기 위해 사용된다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 백신 제제는 (a) 인간 메타뉴모바이러스 및 호흡기 세포융합 바이러스(RS 바이러스); 및/또는 (b) 조류 뉴모바이러스 및 호흡기 세포융합 바이러스(RS 바이러스)에 의한 감염을 방지하기 위해 사용된다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 백신 제제는 (a) 인간 메타뉴모바이러스 및 인간 파라인플루엔자 바이러스; 및/또는 (b) 조류 뉴모바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스에 의한 감염 및 관련 질환을 방지하기 위해 사용된다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 백신 제제는 (a) 인간 메타뉴모바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RS 바이러스) 및 인간 파라인플루엔자 바이러스; 및/또는 (b) 조류 뉴모바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RS 바이러스) 및 인간 파라인플루엔자 바이러스에 의한 감염 및 관련 질환을 방지하기 위해 사용된다.
어떤 구체예에서, 본 발명 백신 제제는 인간 메타뉴모바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RS 바이러스) 및 인간 파라인플루엔자 바이러스에 의한 감염 및 관련 질환을 방지하기 위해 사용된다. 어떤 다른 구체예에서, 본 발명 백신 제제는 조류 뉴모바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RS 바이러스) 및 인간 파라인플루엔자 바이러스에 의한 감염 및 관련 질환을 방지하기 위해 사용된다.
상이한 바이러스 종의 F 단백질 간 상동성의 정도가 높기 때문에, 본 발명 백신 제제는 F 단백질을 인코딩하는 이종 누클레오티드 서열을 유도하는 바이러스와 상이한 바이러스로부터 보호하기 위해 사용할 수 있다. 특정의 예시적 구체예에서, 백신 제제는 조류 뉴모바이러스 A형으로부터 유도되는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스를 함유하며, 백신 제제는 조류 뉴모바이러스 A형 및 조류 뉴모바이러스 B형에 의한 감염으로부터 보호하는 데 사용된다. 본 발명은 APV-C 및 APV-D를 비롯한 APV, hMPV, PIV, 인플루엔자, RSV, 센다이 바이러스, 유행성 이하선염, 라린고트라케이티스 바이러스, 시미언바이러스 5, 인간 파필로마바이러스, 홍역, 유행성 이하선염, 다른 바이러스 및 병원 및 관련 질환을 방지하는 데 유용한, 인간 및 동물에게 투여할 수 있는 백신 제제를 포함한다. 본 발명은 또한 인간 메타뉴모바이러스 감염 및 조류 뉴모바이러스 감염 및 관련 질환을 방지하는 데 유용한, 인간 및 동물에게 투여할 수 있는 백신 제제를 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명은 광견병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스(FLV) 및 개 디스템퍼 바이러스를 포함하는 가축의 질환을 야기하는 병원체에 대하여 유용한 백신 제제를 포함한다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스, 우역 바이러스, 돈두 바이러스에 대하여 가축을 보호하고 나아가 광견병 바이러스에 대하여 야생동물을 보호하는 데 유용한 백신 제제를 포함한다.
역유전학적 접근방식에 의하여 생성된 약독화된 바이러스를 본원에 개시된 백신 및 약학 제제에서 사용할 수 있다. 역유전학적 기술은 또한 백신 제조에 중요한 다른 바이러스 유전자에 추가의 돌연변이를 발생시키기 위하여 사용할 수도 있다. 즉, 유용한 백신 균주 변이체의 에피토프를 약독화된 바이러스로 조작할 수 있다. 이와는 다르게, 다른 바이러스성 병원균 또는 비바이러스성 병원균으로부터 유도된 항원을 비롯한 완전히 이질인 에피토프를 약독화된 균주내로 조작할 수 있다. 예컨대, HIV (gp160, gp120, gp41) 기생충 항원 (예컨대, 말라리아), 박테리아 또는 진균 항원 또는 종양 항원과 같은 비관련 바이러스의 항원을 약독화된 균주내로 조작할 수 있다. 이와는 다르게, 생체내에서 바이러스의 향성을 변경하는 에피토프를 본 발명의 약독화된 키메라 바이러스내로 조작할 수 있다.
실질적으로 임의의 이종 유전자 서열을 백신에서 사용하기 위한 본 발명의 키메라 바이러스내로 구축할 수 있다. 바람직하게는 성분 및 펩티드는 생물학적 면역 개질제로서 작용한다. 바람직하게는, 임의의 각종 병원균 또는 중화 항체에 결합하는 항원에 대한 보호 면역 반응을 포함하는 에피토프는 키메라 바이러스에 의하여 또는 키메라 바이러스의 일부로서 발현될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 키메라 바이러스내로 구축될 수 있는 이종 유전자 서열은 인플루엔자 및 파라인플루엔자 헤마글루티닌 뉴라미니다제 및 융합 글리코단백질, 예컨대 인간 PIV3의 HN 및 F 유전자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또다른 구체예에서, 키메라 바이러스내로 구축될 수 있는 이종 유전자 서열은 면역 조절 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 것을 포함한다. 면역 조절 단백질의 예에는 시토킨, 인터페론 1형, 감마 인터페론, 콜로니 자극 인자, 인터루킨 -1, -2, -4, -5, -6, -12, 및 이들 병원균의 길항제가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
또한, 백신에 사용하기 위한 본 발명의 키메라 바이러스내로 구축될 수 있는 이종 유전자 서열은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 바람직하게는 1형 또는 2형으로부터 유도된 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구체예에서, 항원의 공급원일 수 있는 면역원 HIV-유도된 펩티드를, 이후 척추동물 면역 응답을 유도하는 데 사용될 수 있는 키메라 PIV내로 구축할 수 있다. 이러한 HIV-유도된 펩티드는 env 유전자 (즉, gp160, gp120, 및/또는 gp41의 전부 또는 일부를 인코딩하는 서열), pol 유전자 (즉, 역전사효소, 엔도누클레아제, 프로테아제, 및/또는 인테그라제의 전부 또는 일부를 인코딩하는 서열), gag 유전자 (즉, p7, p6, p55, pi 7/18, p24/25의 전부 또는 일부를 인코딩하는 서열), tat, rev, nef, vif, vpu, vpr, 및/또는 vpx로부터 유도된 서열을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
다른 이종 서열은 B형 간염 바이러스 표면 항원 (HBsAg); A형 또는 C형 간염 바이러스 표면 항원, Epstein Barr 바이러스의 글리코단백질; 인간 파필로마바이러스의 글리코단백질; 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 센다이 바이러스, 시미안 바이러스 5 또는 유행성 이하선염 바이러스의 글리코단백질; 인플루엔자 바이러스의 글리코단백질; 헤르페스 바이러스의 글리코단백질; 폴리오바이러스의 VP1; 박테리아 및 기생충과 같은 비바이러스성 병원균의 항원 결정기 등으로부터 유도될 수 있다. 또다른 구체예에서, 면역글로부린 유전자의 전부 또는 일부를 발현시킬 수 있다. 예컨대, 이러한 에피토프를 모방한 항유전형 면역글로부린의 여러 영역을 본 발명의 키메라 바이러스내로 구축할 수 있다.
다른 이종 서열은 종양 항원으로부터 유도될 수 있으며 생성되는 키메라 바이러스는 생체내에서 종양 회귀를 유도하는 종양 세포에 대한 면역 응답을 생성하는 데 사용할 수 있다. 이들 백신은 종양의 치료를 위한 화학 요법, 방사선 요법, 수술, 골수 이식 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 치료법과 함께 사용할 수 있다. 본 발명에 따르면, 재조합 바이러스를 조작하여, T 세포에 의하여 인식되는 인간 종양 항원을 포함하나 이에 한정되지 않는 종양 관련 항원 (TAAs) (Robbins and Kawakami, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:628-636, 그 전체 내용이 본원에 참고 문헌으로 인용됨), gp1OO, MART-1/MelanA, TRP-I (gp75), 티로시나제를 비롯한 흑색소 세포 계통 단백질; 종양 특이적인 널리 공유되는 항원, MAGE-I, MAGE-3, BAGE, GAGE-I, GAGE-I, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제-V, p15; 종양 특이적 돌연변이 항원, β-카테닌, MUM-I, CDK4; 유방, 난소, 자궁경부 및 췌장 암종에 대한 비흑색종 항원, HER-2/neu, 인간 파필로마바이러스-E6; -E7, MUC-1을 발현시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 이종 누클레오티드 서열은 인간 메타뉴모바이러스와 같은 메타뉴모바이러스 및/또는 조류 뉴모바이러스로부터 유도된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 바이러스는 두 상이한 이종 누클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 하나는 인간 메타뉴모바이러스와 같은 메타뉴모바이러스 및/또는 조류 뉴모바이러스로부터 유도되고, 다른 하나는 호흡기 세포융합 바이러스로부터 유도된다. 이종 누클레오티드 서열은 각 바이러스의 F 단백질 또는 G 단백질을 인코딩한다. 특정 구체예에서, 이종 누클레오티드 서열은 키메라 F 단백질을 인코딩하며, 여기서 키메라 F 단백질은 메타뉴모바이러스의 F 단백질의 엑토 도메인 및 파라인플루엔자 바이러스의 F 단백질의 루미날 도메인 및 트랜스막 도메인을 포함한다.
생 재조합 바이러스 백신 또는 비활성화된 재조합 바이러스 백신을 제조할 수 있다. 숙주내에서의 증식으로 자연 감염에서 발생하는 것보다 큰 비슷한 유형의 연장된 자극을 유도하여 실질적으로 장기 지속 면역을 제공하므로 생 백신이 바람직할 수 있다. 이러한 생 재조합 바이러스 백신 제제의 제조는 닭의 태아의 요막에서 또는 세포 배양에서 바이러스를 번식시킨 다음 정제하는 종래의 방법을 사용하여 실시한다.
특정 구체예에서, 재조합 바이러스는 그것이 투여되는 개체에 대하여 비병원성이다. 이 점에서, 백신의 목적으로 유전자 조작된 바이러스를 사용하는 것은 이들 균주에 약독화 특성이 존재하는 것을 필요로 할 수 있다. 적절한 돌연변이(예컨대, 결실)를 트랜스펙션에 사용하기 위한 주형으로 도입하여 약독화 특성을 갖는 신규한 바이러스를 제공할 수 있다. 예컨대, 온도 감지성 또는 추위 적응과 관련이 있는 특이적 미스센스 돌연변이를 결실 돌연변이내로 만들 수 있다. 이들 돌연변이는 추위 또는 온도 감지 돌연변이와 관련이 있는 점 돌연변이보다 더 안정하여야 하며 복귀 빈도는 매우 낮아야 한다.
이와는 다르게, "자살" 특성을 갖는 키메라 바이러스를 구축할 수 있다. 이러한 바이러스는 숙주내에서 단 1회 또는 수회의 복제를 거친다. 백신으로서 사용될 때, 재조합 바이러스는 제한된 복제 사이클(들)을 거쳐 충분한 수준의 면역 응답을 유도하지만 인간 숙주에서는 더 진행하지 않아 질병을 야기한다. 각각 야생형 APV 및 hMPV의 유전자가 하나 이상 부족하거나 또는 야생형 균주와 비교하여 돌연변이 유전자를 갖는 재조합 바이러스는 성공적인 복제를 거칠 수 없다. 이러한 유전자(들)을 영원히 발현시키는 결함이 있는 바이러스가 세포주에서 생성될 수 있다. 본질적인 유전자(들)가 부족한 바이러스가 이들 세포주에서 복제되지만 인간 숙주에 투여될 경우 1회의 복제를 완성할 수 없을 것이다. 이러한 제제는 이러한 비진행성 사이클에서 충분한 수의 유전자를 전사 및 번역하여 면역 응답을 유도할 수 있다. 이와는 다르게, 이들 제제가 비활성(사멸된) 바이러스 백신으로 작용할 수 있도록 보다 다량의 균주를 투여할 수 있다. 비활성 백신의 경우, 유전자 생성물이 비리온과 회합하도록 이종 유전자 생성물을 바이러스 성분으로서 발현시키는 것이 바람직하다. 이러한 제제의 이점은 이들이 천연 단백질을 함유하며 사멸된 바이러스 백신의 제조에서 사용되는 포르말린 또는 다른 제제로 처리함으로써 비활성화를 거치지 않는다는 것이다. 이와는 다르게, cDNA로부터 제조된 본 발명의 재조합 바이러스는 고도로 약독화되어 단지 수회만 복제될 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 백신은 약독화된 포유동물 MPV를 포함한다. 이론에 의한 구속 없이, 바이러스 단백질은 숙주의 세포질막에 삽입되어 면역 응답을 자극하므로, 약독화된 바이러스는 세포가 새로운 감염성 바이러스 입자를 생성하도록 유도하지 못할 경우에도 백신으로서 효과적일 수 있다.
본 발명의 이러한 측면의 또다른 구체예에서, 비활성화 백신 제제는 키메라 바이러스를 "사멸"시키는 종래의 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 비활성화 백신은 감염성이 파괴되었다는 의미에서 "죽은" 것이다. 이상적으로는, 면역원성에 영향을 주지 않으면서 바이러스의 감염성을 파괴한다. 비활성화 백신을 제조하기 위하여, 키메라 바이러스를 닭의 태아의 요막에서 또는 세포 배양에서 키메라 바이러스를 성장시키고 구역 초원심분리법에 의하여 정제하고 포름알데히드 또는 β-프로피오락톤으로 비활성화시키고 풀링할 수 있다. 얻어지는 백신은 통상적으로 근육내로 접종된다.
비활성화 바이러스를 적당한 보조제와 함께 조제하여 면역 응답을 증대시킬 수 있다. 이러한 보조제는 예컨대 수산화알루미늄과 같은 무기질 젤; 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다가음이온과 같은 표면 활성 물질; 펩티드; 오일 에멀젼; 및 BCG, 코리네박테리움 파르붐, ISCOMS 및 비로좀과 같은 잠재적으로 유용한 인간 보조제를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 개시한 백신 제제의 도입을 위해 다수의 방법을 사용할 수 있는데, 이들 방법에는 경구, 피내, 근내, 복강내, 정맥내, 피하, 경피적, 비강내 및 흡인 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 키메라 바이러스 백신 제제는 그 백신이 설계된 병원균의 자연적인 감염 경로를 통하여 도입하는 것이 바람직할 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 면역원 조성물에 관한 것이다. 면역원 조성물은 포유동물 MPV를 포함한다. 특정 구체예에서, 면역원 조성물은 인간 MPV를 포함한다. 어떤 구체예에서, 면역원 조성물은 약독화된 포유동물 MPV 또는 약독화된 인간 MPV를 포함한다. 어떤 구체예에서, 면역원 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함한다.
5.13 투약 방식, 투여 및 조제
본 발명은 하나 이상의 이종 또는 비천연 항원 서열을 발현시키는 MPV 및 APV, 바이러스의 약독화된 형태, MPV 및 APV의 재조합 형태, 및 키메라 MPV 및 APV를 포함하는 백신 및 면역원성 제제를 제공한다. 본 발명의 백신 및 면역원성 제제는 1가 또는 다가 백신(2가 및 3가 백신 포함)을 포함한다. 본 발명의 백신 또는 면역원성 제제는 각종 바이러스 감염을 방지하는 데 유용하다. 특히, 본 발명의 백신 또는 면역원성 제제는 숙주에서 기도 감염을 방지한다.
본 발명의 재조합 바이러스 및/또는 백신 또는 면역원성 제제는 단독으로 또는 다른 백신과 조합하여 투여할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 백신 또는 면역원성 제제는, 호흡기 세포융합 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역 백신, 유행성 이하선염 백신, 풍진 백신, 폐렴쌍구균 백신, 리케차 백신, 스타필로코쿠스 백신, 백일해 백신 또는 기도암에 대한 백신과 같은 그러나 이에 한정되지 않는, 기도 질환을 방지하는 다른 백신 또는 면역원성 제제와 함께 투여한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 바이러스 및/또는 백신은 해당 연령에서 추천되는 소아학상의 백신과 동시에 투여한다. 예컨대, 2, 4 또는 6 월령에서, 본 발명의 바이러스 및/또는 백신은 DtaP (IM), Hib (IM), Polio (IPV 또는 OPV) 및 헤파티티스 B (IM)와 동시에 투여될 수 있다. 12 또는 15 월령에서, 본 발명의 바이러스 및/또는 백신은 Hib (IM), Polio (IPV 또는 OPV), MMRII(R) (SubQ); Varivax(R) (SubQ), 및 헤파티티스 B (IM)와 동시에 투여될 수 있다. 본 발명 방법과 사용될 수 있는 백신은 여러 문헌[예컨대, The Jordan Report 2000, Division of Microbiology and Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, United States, 이 내용은 그 전체가 본원에 참고 문헌으로 인용됨]에서 고찰된다.
본 발명의 백신 또는 면역원성 제제는 그 자체로 또는 약학 조성물이나 치료 조성물의 형태로 개체에 투여될 수 있다. 보조제 및 본 발명의 면역원성 항원(예컨대, 바이러스, 키메라 바이러스, 돌연변이 바이러스)을 포함하는 약학 조성물은 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 분말화, 유화, 캡슐화, 봉입 또는 동결건조 방법에 의하여 제조될 수 있다. 약학 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 본 발명의 면역원성 항원을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 촉진하는 보조제를 사용하여 종래의 방식으로 조제할 수 있다. 적절한 제제는 특히 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.
본 발명의 백신 또는 면역원성 제제는 보조제를 포함하거나 하나 이상의 보조제와 함께 투여되는데, 사용될 수 있는 보조제는 무기물염 보조제 또는 무기물염 젤 보조제, 입자 보조제, 미립 보조제, 점막 보조제, 및 면역자극 보조제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 보조제의 예에는 수산화알루미늄, 인산알루미늄 젤, 프로이드 완전 보조제, 프로이드의 불완전 보조제, 스쿠알렌 또는 스쿠알렌 수중유 보조제 제제, 생분해성 및 생체 친화성 폴리에스테르, 중합된 리포좀, 트리터페노이드 글리코시드 또는 사포닌 (예컨대, QuilA 및 QS-21, 또한 상표명 STIMULON, ISCOPREP로 시판됨), N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (Threonyl-MDP, 상표명 TERMURTIDE로 시판됨), LPS, 모노포스포릴 지질 A (3D-MLA, 상표명 MPL로 시판됨)가 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 개체는 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이지만, 영장류, 소, 말, 양, 돼지, 가금(예컨대, 닭, 칠면조), 염소, 고양이, 개, 햄스터, 마우스 및 설치류를 포함하나 이에 한정되지 않는 비인간 동물일 수도 있다.
경구, 피내, 근내, 복강내, 정맥내, 피하, 경피적, 비강내 및 흡인 경로, 난절법(예컨대, 두 갈래로 갈라진 바늘을 사용하여 피부의 상층으로부터 긁음)를 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 방법을 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물을 도입하는 데 사용할 수 있다.
국소 투여를 위하여, 본 발명의 백신 또는 면역원성 제제는 업계에 널리 공지된 바와 같이 용액, 젤, 연고, 크림, 현탁액 등으로 제형화될 수 있다.
비강내 또는 흡인에 의한 투여를 위하여, 본 발명에 따라 사용하기 위한 제제는 편리하게는 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적당한 기체와 같은 적당한 추진제의 사용과 더불어 가압 팩 또는 네뷸리저로부터의 에어로졸 분무 제제의 형태로 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 용량 단위를 결정할 수 있다. 흡인기 또는 취입기에서 사용하기 위해 (예컨대 젤라틴의) 캡슐 및 카트리지를 락토즈 또는 전분과 같은 적당한 분말 베이스 및 화합물의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
주입을 위해, 백신 또는 면역원성 제제는 수용액으로, 바람직하게는 행크스 용액, 링거 용액 또는 생리학적 염수 완충제과 같은 생리학적 상용성 완충제로 제형화될 수 있다. 용액은 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화 제제를 함유할 수 있다. 이와는 다르게, 단백질은 사용 전에 예컨대 무균의 발열원 무포함수와 같은 적당한 부형제와 함께 구성하기 위하여 분말 형태일 수 있다.
투여를 위한 백신 또는 면역원성 제제의 유효량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 기술에 비추어 당업자가 결정할 수 있는 범위에 속한다.
유효 용량은 먼저 시험관 분석으로부터 추산할 수 있다. 예컨대, 업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 면역 응답을 유도할 수 있도록 동물 모델에서 용량을 결정할 수 있다. 당업자는 본원에 개시된 결과를 기초로 모든 동물 종에 대한 투여를 용이하게 최적화할 수 있다. 용량 및 간격은 개별적으로 조절할 수 있다. 예컨대, 면역원성 조성물로서 사용할 경우, 적당한 용량은 상기 개시된 바와 같이 투여될 때 항체 응답을 유도할 수 있는 조성물의 양이다. 백신으로서 사용할 경우, 본 발명의 백신 또는 면역원성 제제는 약 1∼3회분 용량으로 1∼36주 동안 투여할 수 있다. 바람직하게는, 약 2주 내지 약 4달의 간격으로 1 또는 2회분 용량을 투여하고 이후 주기적으로 증강 접종을 실시할 수 있다. 개개의 동물에 대하여 교대 프로토콜이 적절할 수 있다. 적당한 용량은, 상기 개시한 바와 같이 투여할 때 4∼12달 동안 동물을 감염으로부터 보호하는 데 충분히 면역화된 동물에서 면역 응답을 증가시킬 수 있는 백신 제제의 양이다. 일반적으로, 숙주 1 kg당 약 1 pg 내지 약 100 mg의 용량 범위에 존재하는 항원의 양은 일반적으로 약 10 pg 내지 약 1 mg, 바람직하게는 약 100 pg 내지 약 1 ㎍이다. 적당한 용량 범위는 환자의 크기 및 주입 경로에 따라 달라질 것이나, 일반적으로 약 0.1 mL 내지 약 5 mL 범위일 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 바이러스 및/또는 백신은 개시시에 103 TCID50 이상, 104 TCID50 이상, 105 TCID50 이상, 106 TCID50 이상의 단일 용량으로 투여한다. 또다른 특정 구체예에서, 본 발명의 바이러스 및/또는 백신은 다회분 용량으로 투여한다. 바람직한 구체예에서, 2, 4, 및 6 월령에서의 1차 투약 방식 및 제2 생년의 개시시에 증강 투약을 사용한다. 더 바람직하게는, 105 TCID50 이상 또는 106 TCID50 이상의 각 용량이 다회분 투약 방식에 제공된다.
5.13.1 투여 연구
이 분석은 코튼 래트 또는 햄스터와 같은 그러나 이에 한정되지 않는 동물 모델 시스템에서 하부 기도 바이러스 감염을 방지하는 본 발명의 재조합 바이러스 및 본 발명의 백신의 능력을 결정하는 데 사용된다. 재조합 바이러스 및/또는 백신은 정맥내 (IV) 경로에 의하여, 근내 (IM) 경로에 의하여 또는 비강내 경로 (IN)에 의하여 투여할 수 있다. 재조합 바이러스 및/또는 백신은 당업자에게 널리 공지된 임의의 기술에 의하여 투여할 수 있다. 이 분석은 항체가 결합하는 바이러스의 폐 역가 감소와 항체의 혈청 농도를 관계짓는 데도 사용한다.
0일에, 코튼 래트 (시그모돈 히스피디스, 평균 체중 100 g), 짧은 꼬리 원숭이 (평균 체중 2.0 kg)와 같은 그러나 이에 한정되지 않는 동물군에 해당 재조합 바이러스 또는 키메라 바이러스 또는 백신 또는 BSA를 근내 주입, 정맥내 주입 또는 비강내 경로에 의하여 투여한다. 본 발명의 재조합 바이러스 또는 백신의 투여 전에, 본 발명의 재조합 바이러스 또는 백신의 투여와 동시에 또는 본 발명의 재조합 바이러스 또는 백신의 투여 후에, 동물을 야생형 바이러스로 감염시키는데, 여기서 야생형 바이러스는 백신이 생성된 바이러스이다. 어떤 구체예에서는, 본 발명의 재조합 바이러스 또는 백신의 투여 후 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 1주 또는 1달 이상에서 야생형 바이러스로 동물을 감염시킨다.
감염 후, 코튼 래트를 죽이고 그 폐 조직을 수득하여 플라크 적정에 의하여 폐 바이러스 역가를 측정한다. 소 혈청 알부민 (BSA) 10 mg/kg을 네거티브 대조군으로서 사용한다. 공격 동안 혈청 중 항체 농도는 샌드위치 ELISA를 사용하여 결정한다. 유사하게는, 짧은 꼬리 원숭이에서, 코 및 폐 세척에서의 바이러스 역가를 측정할 수 있다.
5.13.2 표적 집단
본 발명의 어떤 구체예에서, 본 발명의 치료 및 진단 방법을 위한 표적 집단은 연령에 의하여 정의된다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 치료 및/또는 진단 방법을 위한 표적 집단은 기도 감염 외의 질환 또는 질병을 특징으로 한다.
특정 구체예에서, 표적 집단은 2세 이하의 어린이를 포함한다. 더 특별한 구체예에서, 2세 이하의 어린이는 기도 감염 이외의 질병을 앓지 않는다.
다른 구체예에서, 표적 집단은 5세 이상의 환자를 포함한다. 더 특별한 구체예에서, 5세 이상의 환자는 낭포성 섬유증, 백혈병 및 비호지킨 림프종을 비롯한 추가의 질환 또는 질병을 앓고 있거나 또는 최근 골수 또는 신장을 이식 받았다.
본 발명의 특정 구체예에서, 표적 집단은 hMPV 감염이 숙주의 면역 억제와 관련이 있는 개체를 포함한다. 특정 구체예에서, 개체는 면역 약화된 개체이다.
어떤 구체예에서, 본 발명 방법을 위한 표적 집단은 노인을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명 방법으로 치료 또는 진단되는 개체는 겨울철에 hMPV로 감염되었다.
5.13.3 임상 시험
시험관 분석에서 시험되는 본 발명의 백신 또는 이의 단편 및 동물 모델은 정상의 건강한 성인 지원자 군에서 안전성, 내성 및 약력학에 대하여 더 평가될 수 있다. 지원자는 근내, 정맥내 또는 폐 전달 시스템에 의하여 본 발명의 재조합 바이러스 및/또는 본 발명의 백신의 단회분을 투여받는다. 각 지원자는 본 발명의 재조합 바이러스 및/또는 본 발명의 백신의 단회분을 받기 24시간 이상 전에 모니터링되며, 의료 기관에서 용량을 받은 후 48시간 이상 동안 모니터링될 것이다. 지원자는 투약 후 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 및 56일에 외래 환자로서 모니터링된다.
혈액 샘플을 유치 도관을 통하여 또는 10 ml의 적색 뚜껑 Vacutainer 튜브를 사용하는 직접 정맥 천자를 통하여 하기 간격으로 수집한다: (1) 본 발명의 재조합 바이러스 및/또는 본 발명의 백신의 용량 투여 전; (2) 본 발명의 재조합 바이러스 및/또는 본 발명의 백신의 용량 투여 동안; (3) 본 발명의 재조합 바이러스 및/또는 본 발명의 백신의 용량 투여 후 5분, 10분, 15분, 20분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간 및 48시간; 및 (4) 본 발명의 재조합 바이러스 및/또는 본 발명의 백신의 용량 투여 후 3일, 7일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일, 49일 및 56일. 샘플을 실온에서 응고되게 두고 혈청을 원심분리 후 수거한다.
환자로부터 채취한 샘플 중 본 발명의 재조합 바이러스 및/또는 본 발명의 백신에 대해 생성된 항체의 양은 ELISA로 정량할 수 있다. PBMC 및 폐와 코 세척에서 T-세포 면역 (세포독 및 헬퍼 응답)도 모니터링할 수 있다.
지원자의 혈청 중 항체 농도는 본 발명의 재조합 바이러스 및/또는 본 발명의 백신의 용량 투여 후 각 수집 간격에서의 혈청 수준으로부터 투약전 혈청 수준 (배경 수준)을 감하여 수정한다. 각 지원자에 대하여 약력학적 매개변수는 수정된 혈청 항체 또는 항체 단편 농도로부터 모델 독립 접근방식 (Gibaldi et al., eds., 1982, Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel Dekker, New York)에 따라 컴퓨터로 처리한다.
5.14 포유동물 MPV 의 검출 및 진단 방법
본 발명은 MPV의 진단 및/또는 검출 수단 및 방법, MPV의 검출에 사용되는 상기 수단 및 방법, 그 성분 및 그 전사, 번역, 발현, 증식 및 대사 과정의 생성물을 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명은 동물 및 인간에서 MPV 감염의 진단을 위한 수단 및 방법을 제공하며, 상기 수단 및 방법은 MPV 성분, MPV 라이프 사이클의 생성물, 및 MPV 발현 또는 감염에 대한 숙주의 응답 생성물의 검출을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
MPV 또는 그 성분, 및 전사, 번역, 발현, 증식 및 대사 과정 생성물의 검출에 사용할 수 있는 방법은 업계에 널리 공지되어 있으며 분자에 기초한 방법, 항체에 기초한 방법 및 세포에 기초한 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 분자에 기초한 방법의 예에는 중합효소 사슬 반응 (PCR), 역전사효소 PCR (RT-PCR), 실시간 RT-PCR, 핵산 서열에 기초한 증폭 (NASBA), 올리고누클레오티드 탐침, 서던 블롯 하이브리드화, 노던 블롯 하이브리드화, MPV에 상보적이거나 MPV와 유사 또는 동일한 핵산과 샘플의 접촉을 수반하는 임의의 방법, 및 이들 방법의 서로간 임의 조합 또는 이들 방법과 업계에 공지된 방법의 임의의 조합이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 동일하거나 또는 유사한 핵산은 본원에 개시되어 있으며, 또한 업계에 널리 공지되어 있어 MPV 및 게놈 물질 또는 다른 바이러스 및 유기체의 관련 생성물을 구별할 수 있게 한다. 항체를 기초한 방법의 예에는 MPV 함유하는 것으로 생각되는 샘플과 항체의 접촉, 직접 면역형광 (DIF), 효소결합 면역흡수 분석 (ELISA), 웨스턴 블롯, 면역크로마토그래피가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 세포에 기초한 방법의 예에는 MPV, 그 성분 또는 이의 생성물에 노출될 때 신호를 방출할 수 있는 수용체 분석이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 또다른 구체예에서, 수용체 분석은 MPV, 그 성분 또는 이의 생성물에 노출시 수용체가 발현되는 시험관 분석이다. 상기 방법의 예는 업계에 널리 공지되어 있으며 본원에도 개시되어 있다. 더 특별한 구체예에서, NASBA는 전체 핵산의 풀로부터 특정 RNA 또는 DNA를 증폭시키기 위해 사용된다.
한 구체예에서, 본 발명은 MPV의 진단 및 검출을 위한 수단 및 방법을 제공하며, 상기 방법 및 수단은 MPV와 회합하거나 MPV에 상보적인 다른 핵산 및 게놈 물질의 검출, 프로세싱된 및 프로세싱되지 않은 MPV의 전사 및 번역 생성물의 검출 및 MPV 노출 또는 감염에 대한 숙주 응답의 성분 검출을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
한 구체예에서, 본 발명은 MPV 게놈내에 존재하는 핵산 서열 및 핵산 서열의 전사 생성물에 대하여 상보적인 올리고누클레오티드의 제조 및 사용을 통한 MPV의 검출에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, MPV 게놈 및 이의 전사체의 특이 영역을 복사 또는 증폭시키기 위한 프라이머로서 상기 올리고누클레오티드를 사용하여, MPV 게놈 및 이의 전사 생성물에 존재하는 핵산 또는 이의 서열을 검출하는 것에 관한 것이다. 복사 또는 증폭될 수 있는 MPV 게놈 및 이의 전사체의 영역은 N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, SH-유전자, G-유전자, 및 L-유전자 중 하나 이상의 완전 및 불완전 스트레치를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예에서는, 동정 목적을 위해 MPV의 N-유전자 또는 이의 전사체를 복사 또는 증폭시키는 방법과 함께 프라이머로서 올리고누클레오티드를 사용한다. 상기 방법은 PCR 분석, RT-PCR 분석, 실시간 RT-PCR 분석, 프라이머 연장 또는 분석 실행, NASBA 및 상기 올리고누클레오티드로부터 핵산 서열을 연장하기 위한 주형으로서 MPV의 유전 물질 또는 이의 전사체 및 이의 보체를 사용하는 다른 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또다른 구체예에서는, 샘플 중의 MPV의 존재를 검출하기 위하여 방법들을 조합해서 사용한다. 당업자라면 각 분석의 요구 조건 및 적용 가능성을 잘 알 것이다. 예컨대, PCR 및 RT-PCR은 핵산의 증폭 또는 검출에 유용하다. 더 특별한 구체예에서는, 실시간 RT-PCR을 PCR 생성물의 일상적이고 신뢰할만한 정량에 사용한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 MPV의 게놈내 존재하는 핵산 서열 및 핵산 서열의 전사 생성물에 대하여 상보적인 올리고누클레오티드의 제조 및 사용을 통한 MPV의 검출에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 MPV 게놈 및 그 전사체에 대하여 상보적이거나 그 내부에 있는 특이 영역의 검출 및 이에 대한 하이브리드화를 위한 프로브로서 상기 올리고누클레오티드 서열을 사용하여, MPV 게놈 및 그 전사 생성물에 상보적이거나 이 내부에 존재하는 핵산 또는 이의 서열을 검출하는 것에 관한 것이다. 하이브리드화 프로브를 사용하여 검출할 수 있는 MPV 게놈 및 그 전사체의 영역은 N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, SH-유전자, G-유전자, 및 L-유전자 중 하나 이상의 완전 및 불완전 스트레치를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예에서는, 동정 목적을 위해 MPV의 N-유전자 또는 이의 전사체의 검출, 어닐링 또는 하이브리드화 방법과 더불어 올리고누클레오티드를 프로브로서 사용한다. 상기 방법은 노던 블롯, 서던 블롯 및 MPV 게놈에 대하여 상보적이거나 또는 이 내부에 존재하는 서열 또는 서열의 스트레치의 하이브리드화, 어닐링 또는 검출을 위한 타겟으로서 MPV의 유전 물질 또는 이의 전사체 및 보체를 사용하는 다른 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
포유동물 MPV, 또는 이의 역보체, 또는 이의 보체의 핵산에 하이브리드화할 수 있는 핵산을 포유동물 MPV의 존재를 검출하는 본 발명 방법에 사용할 수 있다. 어떤 구체예에서, 핵산은 매우 엄격한 조건하에 하이브리드화된다. 비제한적 예로서, 매우 엄격한 조건을 사용하는 절차는 다음과 같다. DNA를 함유하는 필터의 예비 하이브리드화는 8시간 내지 밤새도록 65℃에서 6X SSC, 50 mM의 Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM의 EDTA, 0.02%의 PVP, 0.02%의 Ficoll, 0.02%의 BSA, 및 500 ㎍/ml의 변성 연어 정액 DNA로 구성되는 완충액 중에서 실시한다. 필터는 48시간 동안 65℃에서 100 ㎍/ml의 변성 연어 정액 DNA 및 5-20 X 106 cpm의 32P-표지된 프로브를 함유하는 예비 하이브리드화 혼합물 중에서 하이브리드화한다. 필터 세정은 2X SSC, 0.01%의 PVP, 0.01%의 Ficoll, 및 0.01%의 BSA를 함유하는 용액 중에서 1시간 동안 37℃에서 실시한다. 이후 50℃에서 45분 동안 0.1X SSC 중에서 세정한 다음 방사능 사진 촬영을 한다. 사용될 수 있는 다른 매우 엄격한 조건은 업계에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 하이브리드화는 엄격도가 낮은 온건한 조건하에서 실시하며, 이러한 조건은 당업자에게 널리 공지되어 있다[예컨대, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; 및 Ausubel et al., eds., in the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1997 Current Protocolsⓒ 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc. 참조].
임의 크기의 올리고누클레오티드를 본 발명 방법에 사용할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 이러한 올리고누클레오티드는 여러 검출 또는 분석 절차에서 예컨대 프라이머 또는 프로브로서 다양한 방법에서 유용하다. 바람직한 구체예에서, 올리고누클레오티드 프로브 및 프라이머는 5 이상, 8 이상, 10 이상, 12 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상, 50 이상, 55 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 100 이상, 200 이상, 300 이상, 400 이상, 500 이상, 1000 이상, 2000 이상, 3000 이상, 4000 이상 또는 5000 이상의 염기이다. 또다른 특정 구체예에서, 올리고누클레오티드 프로브 및 프라이머는 MPV 게놈 서열 또는 이의 보체와 같은 타겟 서열에 대하여 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 상동성인 5 이상, 8 이상, 10 이상, 12 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상, 50 이상, 55 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 100 이상, 200 이상, 300 이상, 400 이상, 500 이상, 1000 이상, 2000 이상, 3000 이상, 4000 이상 또는 5000 이상의 염기를 포함한다. 또다른 특정 구체예에서, 프라이머 또는 프로브로서 사용되는 올리고누클레오티드는 임의의 길이이며, 엄격한 조건하에서 8 이상의 3' 말단 염기를 통해 표적 서열에 특이적으로 하이브리드화된다. 또다른 특정 구체예에서, 프라이머 또는 프로브로서 사용되는 올리고누클레오티드는 임의의 길이이며, 엄격한 조건하에서 10 이상의 3' 말단 염기를 통해 표적 서열에 특이적으로 하이브리드화된다. 또다른 측정 구체예에서, 프라이머 또는 프로브로서 사용되는 올리고누클레오티드는 임의의 길이이며, 엄격한 조건하에서 12 이상의 3' 말단 염기를 통해 표적 서열에 특이적으로 하이브리드화된다. 또다른 특정 구체예에서, 프라이머 또는 프로브로서 사용되는 올리고누클레오티드는 임의의 길이이며, 엄격한 조건하에서 15 이상의 3' 말단 염기를 통해 표적 서열에 특이적으로 하이브리드화된다. 또다른 특정 구체예에서, 프라이머 또는 프로브로서 사용되는 올리고누클레오티드는 임의의 길이이며, 엄격한 조건하에서 20 이상의 3' 말단 염기를 통해 표적 서열에 특이적으로 하이브리드화된다. 또다른 특정 구체예에서, 프라이머 또는 프로브로서 사용되는 올리고누클레오티드는 임의의 길이이며, 엄격한 조건하에서 25 이상의 3' 말단 염기를 통해 표적 서열에 특이적으로 하이브리드화된다. 또다른 구체예에서, 특정 위치 또는 누클레오티드가 치환되도록 퇴화 세트의 올리고를 사용한다. 퇴화는 엄격한 조건하에서 표적 서열에 하이브리드화되는 영역에서 임의 위치 또는 임의 수의 위치, 가장 바람직하게는 1 이상의 위치, 2 이상의 위치, 3 이상의 위치, 10 이상의 위치에서 일어날 수 있다.
당업자는 업계에 공지된 분석에 의하여 올리고누클레오티드에 대하여 부과되는 구조적 조건을 잘 알 것이다. 더 전체적인 접근 방식을 사용하여 올리고누클레오티드 프라이머 및 프로브를 설계할 수도 있다. 예컨대, 당업자는 바람직한 분석 또는 어닐링 온도 및 올리고, 즉 서열의 구조를 기초로 하여 올리고누클레오티드 프라이머 또는 프로브의 서열 및 적절한 길이를 결정할 수 있다. 또한, 당업자는 온도에 따라 표적 서열에 대한 올리고의 특이성이 증가 또는 감소되도록 분석 온도를 조절함으로써 올리고누클레오티드 프라이머 또는 프로브를 사용하는 분석의 특이성을 결정할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 프라이머 또는 프로브의 어닐링 온도는 업계에 공지된 방법을 사용하여 결정되며, 분석은 상기 어닐링 온도에서 실시한다. 당업자는 그 특이적 표적 서열에 대하여 올리고누클레오티드와 관련된 어닐링 온도를 계산하는 방법을 잘 알 것이다. 예컨대, 어닐링 온도는 표적 서열에 대하여 하이브리드화하는 올리고누클레오티드 중의 각 G 또는 C 누클레오티드에 대한 어닐링 온도를 4℃로 함으로써 대략적으로 계산할 수 있다. 또다른 실시예에서, 어닐링 온도는 표적 서열에 대하여 하이브리드화하는 올리고누클레오티드 중의 각 A 또는 T 누클레오티드에 대한 어닐링 온도를 2℃로 함으로써 대략적으로 계산할 수 있다. 올리고누클레오티드의 어닐링 온도는 올리고누클레오티드의 길이 및 서열 뿐만 아니라 표적 서열에 대한 올리고의 상보성에 따라 반드시 달리하여 올리고 프라이머 또는 프로브 간 결합이 이루어질 때만 어닐링 온도에 포함시킨다. 어닐링 온도의 계산을 위해 본원에 개시된 예는 실시예로 의도되며 다른 어닐링 온도 결정 방법으로부터 본 발명을 제한하는 의도는 아니다. 당업자는 사용될 수 있는 다른 방법을 잘 알 것이며, 또한, 올리고누클레오티드의 어닐링 온도 및 용융 온도를 계산하는 다른 더 정교한 방법은 본원에서 개시하였다. 더 특별한 구체예에서, 올리고누클레오티드 프로브 및 프라이머는 3O℃ 이상, 35℃ 이상, 4O℃ 이상, 45℃ 이상, 5O℃ 이상, 55℃ 이상, 6O℃ 이상, 65℃ 이상, 7O℃ 이상, 80℃ 이상, 9O℃ 이상 또는 99℃ 이상의 온도에서 어닐링된다.
본 발명은 샘플 중 MPV의 동정 또는 검출을 위한 세포에 기초한 분석 및 무세포 분석을 제공한다. 수용체를 사용하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 방법을 사용하여 본 발명의 세포에 기초한 분석 및 무세포 분석을 수행할 수 있다. 수용체의 예는 본원에 개시되며 고처리 스크리닝을 사용하는 MPV의 동정 또는 검출을 위하여 및 당업자에 익숙한 임의의 다른 목적을 위하여 사용할 수 있다. 본 발명의 수용체 분석에서 사용할 수 있는 다수의 방법이 있다. 예컨대, 세포에 기초한 분석은 MPV 유전자의 촉진유전자 또는 MPV 유전자 생성물에 의하여 인식되는 촉진유전자에 연결되는 수용체 유전자를 포함하는 핵산 서열을 함유한 세포와 샘플을 접촉시키고 MPV 또는 MPV 성분에 노출시 수용체 유전자의 발현을 측정함으로써 실시할 수 있다. 세포에 기초한 분석의 추가의 구체예에서, MPV에 의하여 감염될 수 있는 숙주 세포는 하나 이상의 수용체 유전자를 암호화하는 핵산 구축물로 감염되어, MPV 또는 MPV 성분의 존재시에 수용체 유전자로부터의 발현이 일어난다. 이러한 구체예에서는, 수용체 유전자의 발현을 MPV 또는 이의 성분에 의하여 인식되는 핵산 서열에 작동 연결시킴으로써 수용체 유전자를 발현시킨다. 샘플 중 MPV의 존재는 업계에 공지되고 본원에 개시(섹션 5.8.2)된 임의의 방법을 사용하여 검출될 수 있는 수용체 유전자의 발현을 유도한다. 세포에 기초한 검출 분석에서 감염 및 사용될 수 있는 숙주 세포의 예는 Vero, tMK, COS7 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또다른 구체예에서, 숙주 세포는 MPV로 감염될 수 있는 임의의 세포이다. 따라서, 수용체 유전자의 발현은 MPV 또는 이의 성분의 존재를 나타낸다. 무세포 분석에서는, MPV 또는 이의 성분의 존재로 시험관내에서 수용체 유전자의 발현이 유도되도록, 샘플을 핵산 서열에 작동 연결되는 수용체 유전자를 포함하는 핵산과 접촉시킨다. 예컨대, MPV 또는 이의 성분을 함유하는 것으로 생각되는 샘플을 MPV 유전자의 촉진유전자 또는 MPV 유전자 생성물에 의하여 인식되는 촉진유전자에 연결되는 수용체 유전자를 포함하는 핵산 서열과 접촉시키고 MPV 또는 MPV 성분에 노출시 수용체 유전자의 발현을 측정함으로써 실시할 수 있다. 이로써 수용체 유전자의 발현은 MPV 또는 이의 성분의 존재를 나타낸다. 다수의 수용체 화합물이 업계에 공지되어 있으나, 다수의 실시예가 본원에 제공된다 (예컨대, 섹션 5.8.2 참조).
또다른 구체예에서, 본 발명은 미니레플리콘 시스템을 사용하는 MPV 감염의 검출에 관한 것이다. 예컨대, hMPV 또는 hMPV 중합효소의 존재하에 수용체 유전자로부터 발현이 일어나도록 숙주 세포를 하나 이상의 수용체 유전자를 인코딩하는 hMPV 미니레플리콘 구축물로 감염시킨다. 수용체 유전자의 예는 본원 섹션 5.8.2에 개시되어 있다. 이러한 구체예에서, hMPV는 미니레플리콘 시스템에 의하여 인코딩되는 수용체 유전자 또는 유전자들의 발현을 촉진하는 헬퍼 바이러스의 역할을 한다. 제한에 의한 구속 없이, hMPV는 미니레플리콘 시스템의 구조를 유도하는 중합효소를 제공하므로 수용체 유전자 또는 유전자들의 발현을 유도한다. 어떤 구체예에서는, 수용체 유전자를 인코딩하는, hMPV 미니레플리콘으로 감염된 숙주 세포를 hMPV를 함유하는 것으로 생각되는 샘플과 접촉시킨다. 샘플 중 hMPV의 존재는 업계에 공지되고 본원에 개시(섹션 5.8.2)된 임의의 방법을 사용하여 검출할 수 있는 수용체 유전자의 발현을 유도한다. 숙주 세포의 예는 Vero, tMK, COS7 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또다른 구체예에서, 숙주 세포는 hMPV로 감염될 수 있는 임의의 세포이다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 MPV 또는 그 유전자 생성물을 특징으로 하는 펩티드 또는 핵산에 특이적이고 이를 인식할 수 있는 항체, 예컨대 모노클로날 항체 (MAbs)의 제조 및 사용을 통하여 동물 또는 인간 숙주에서 MPV 감염을 검출하는 것에 관한 것이다. 상기 MAbs에 의하여 인식되는 에피토프 또는 항원 결정기는 MPV 증식에 수반되는 대사 과정 및 라이프 사이클 동안 합성되는 단백질 및 핵산 생성물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적당한 항체의 생성을 위한 항원 결정기로서 사용될 수 있는 단백질 또는 핵산 생성물은 하기 MPV 성분, 즉 N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, SH-유전자, G-유전자 및 L-유전자 중 하나 이상의 완전 및 불완전 전사 및 발현 생성물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 특정 구체예에서, G-유전자의 단백질 생성물 또는 이의 일부에 대한 MAbs를 생물학적 샘플, 예컨대 체액 중의 MPV 발현된 G 펩티드의 존재를 검출하거나 확인하기 위한 다른 방법과 함께 사용한다. 상기 방법은 ELISA, 방사-면역 또는 경쟁 분석, 면역-침전, 및 표적 또는 이의 일부 및 이의 친족에 대하여 얻은 MAbs에 의한 검출 표적으로서 MPV의 전사 또는 발현 유전자 생성물을 사용하는 다른 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 또다른 구체예에서, hMPV를 검출하는 데 사용할 수 있는 항체는 모든 4 서브타입의 F, G, N, L, M, M2-1, P, 및 SH 단백질을 인식한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 MPV 노출 또는 감염에 대한 숙주의 면역 응답과 관련되고 이를 특징으로 하는 인자의 검출에 관한 것이다. MPV에 의한 감염 또는 노출시, 숙주 면역계는 바이러스의 효과 및/또는 증식을 제거 또는 약화시키기 위한 항체의 숙주에 의한 생성을 수반하는 상기 노출 또는 감염에 대한 응답을 유도한다. 본 발명은 MPV의 숙주 감염 또는 숙주에의 노출 결과 생성될 수 있는 상기 항체의 검출을 통하여 MPV 관련 질환을 진단하기 위한 수단 및 방법을 제공한다. 상기 항체에 의하여 인식되는 에피토프는 바이러스에 대한 숙주의 면역 응답의 생성에서 항원 결정기로서 작용할 수 있는 숙주 면역 반응에 접근 가능한 펩티드 및 그 노출 표면을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항체의 생성을 위한 에피토프로서 숙주 면역 반응에 의하여 사용되는 단백질 및 핵 물질의 일부는 하기 MPV 성분, 즉 N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, SH-유전자, G-유전자 및 L-유전자 중 하나 이상의 생성물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, MPV의 N-유전자로 인코딩된 펩티드의 부분 또는 완전 접근 가능한 부분에 대한 항체는 숙주 샘플에서 검출된다. 한 특정 구체예에서, G-유전자 또는 이의 일부의 단백질 생성물은 생물학적 샘플, 예컨대 체액 중의 숙주로 유도된 항체의 존재를 검출하는 다른 방법과 함께 사용된다. 상기 방법은 ELISA, 방사-면역 또는 경쟁 분석 및 생물학적 샘플에서 발견되고 MPV의 전사 또는 발현 유전자 생성물을 인식하는 숙주 항체에 의한 검출 표적으로서 상기 생성물을 사용하는 다른 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플, 예컨대 체액을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 MPV 감염의 병원체를 검출하는 방법 및 진단 분석 또는 시험 키트를 위한 수단 및 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명은 MPV 핵산 또는 이의 보체를 동정하기에 적당한 분석법, 키트, 프로토콜 및 절차에 관한 것이다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 MPV 발현 펩티드 또는 이의 일부를 동정하기에 적당한 분석법, 키트, 프로토콜 및 절차에 관한 것이다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 MPV 노출 또는 감염에 대한 숙주의 면역 응답의 성분을 동정하기에 적당한 분석법, 키트, 프로토콜 및 절차에 관한 것이다.
숙주의 MPV 감염의 진단 확인 외에, 본 발명은 또한 MPV의 분리물을 구분되는 계통발생학적 군 또는 서브 그룹으로 분류하는 수단 및 방법을 제공한다. 한 구체예에서는, 더 효과적이고 서브 그룹 특이적인 요법을 설계하기 위하여, 이러한 특징을 MPV의 상이한 변이체, 변이체 A1, A2, B1 및 B2를 구분하는 데 유리하게 사용할 수 있다. MPV 변이체는 N-유전자, P-유전자, M-유전자, F-유전자, M2-유전자, SH-유전자, G-유전자, 및 L-유전자 중 하나 이상의 누클레오티드 또는 아미노산 서열을 기초로 분화될 수 있다. 한 특정 구체예에서, MPV는 G 유전자 또는 글리코단백질의 누클레오티드 또는 아미노산 서열 및 역시 G 글리코단백질을 인식하는 모노클로날 항체를 사용하는 중화 시험을 사용하여 특정 서브 그룹으로 분화될 수 있다.
한 구체예에서, 인간에서 MPV 감염의 진단은 당업자에 널리 공지된 임의의 기술, 예컨대 면역 분석법을 사용하여 이루어진다. 면역특이적 결합 및 교차 반응성을 분석하는 데 사용될 수 있는 면역 분석법은 웨스턴 블롯, 방사면역 분석, ELISA (효소결합 면역흡수 분석), 샌드위치 면역 분석, 면역침전 분석, 프레시피틴 반응, 젤 확산 침전 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체-고정 분석, 및 형광 면역 분석 등과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 및 비경쟁적 분석 시스템을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 분석은 일상적이고 업계에 널리 공지되어 있으며[예컨대, 문헌(Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, 본원에 그 전체 내용이 참고문헌으로 포함됨) 참조], 면역 분석의 비제한적 예는 섹션 5.8에 개시되어 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 유전자 또는 유전자 일부, 예컨대, N, M, F, G, L, M, P, 및 M2 유전자를 포함하나 이에 한정되지 않는 MPV 게놈 영역을 복사 또는 증폭시키는 PCR 또는 프라이머 확장 방법과 더불어 올리고누클레오티드를 사용하는 MPV 감염의 검출에 관한 것이다. 한 특정 구체예에서, 올리고누클레오티드는 RT-PCR 방법과 함께 사용된다. 추가의 구체예에서, 증폭 생성물 및/또는 유전 물질을 여러 hMPV 균주 간에 보존되거나 여러 hMPV 균주 사이에서 구별되는 특정 서열에 상보적인 올리고누클레오티드로 탐침할 수 있다. 후자의 올리고누클레오티드 세트는 숙주 감염의 원인이 되는 hMPV의 특정 균주를 동정할 수 있다.
본 발명은 숙주를 감염시킬 수 있는 hMPV의 변이체 및 상이한 서브 그룹들을 구분하는 방법을 제공한다. 한 특정 구체예에서, 숙주 감염의 원인이 되는 hMPV는 특정 서브 그룹, 예컨대 서브 그룹 A 또는 서브 그룹 B로 분류된다. 또다른 특정 구체예에서, 숙주 감염의 원인이 되는 hMPV는 서브 그룹의 특정 변이체, 예컨대 변이체 A1, A2, B1, 또는 B2로 분류된다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 숙주 감염의 원인이 되는 hMPV를 신규한 서브 그룹 및/또는 신규하거나 현존하는 서브 그룹의 신규한 변이체로 분류하는 수단 및 방법을 제공한다. hMPV 균주를 서브 그룹 및/또는 변이체군으로 구분할 수 있는 방법은 당업자에 공지되어 있다. 한 구체예에서는, 폴리클로날 항체를 사용하여 감염의 병인성 병원체를 hMPV의 균주로서 확인하며, 2차 항체를 사용하여 상기 균주를 hMPV의 신규하거나 공지된 서브 그룹 및/또는 신규하거나 공지된 변이체의 특징으로 구분한다. 한 구체예에서는, hMPV에 대하여 선택적인 항체를 예컨대 ELISA 또는 RIA와 같은 면역반응 분석법과 함께 사용하여 생물학적 샘플에서의 hMPV 노출 또는 감염의 존재를 확인한다. 추가의 구체예에서는, hMPV 단백질의 펩티드 서열에서 특정 에피토프에 대하여 선택적인 2차 항체를 사용하여 상기 확인된 hMPV 감염의 병인성 병원체를 서브 그룹 또는 변이체로 더 분류한다. 한 특정 구체예에서는, 모든 hMPV 서브 그룹 간에 공유되는 펩티드 에피토프에 대한 항체를 사용하여 감염의 병인성 병원체를 hMPV로서 확인한다. 한 추가의 특정 구체예에서는, hMPV의 상이한 서브 그룹 및/또는 변이체에 독특한 펩티드 에피토프에 대한 항체를 사용하여 숙주 감염의 원인이 되는 hMPV를 공지되거나 신규한 서브 그룹 및/또는 변이체로 분류한다. 한 특정 구체예에서, hMPV의 상이한 서브 그룹 및/또는 변이체를 구별할 수 있는 항체는 상기 서브 그룹 또는 변이체에 독특한 hMPV 펩티드의 단편을 인식하며, 상기 펩티드는 N, M, F, G, L, M, P, 및 M2 유전자에 의하여 인코딩되는 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상이한 hMPV 서브 그룹 및/또는 변이체를 구별할 수 있는 항체를 생성시키는 데 사용될 수 있는 펩티드 또는 펩티드 단편은 진단 분석에서 접근 가능하거나 용매 노출될 것으로 예상되는 적당한 펩티드 단편을 동정하기 위한 친수성 플롯과 더불어 여러 hMPV 단백질의 공지된 펩티드 서열에서의 차이를 이용하여 선택할 수 있다. 한 구체예에서, hMPV의 상이한 서브 그룹을 구분할 수 있는 항체는 hMPV의 상이한 서브 그룹에 독특한 F 단백질에서의 차이, 예컨대 전체 길이 F 단백질의 286, 296, 312, 348, 및 404 위치의 아미노산을 인식한다. 또다른 특정 구체예에서, hMPV의 상이한 서브 그룹 및/또는 변이체를 구분할 수 있는 항체는 특정 서브 그룹 또는 변종에 독특한 hMPV의 G 단백질의 단편을 인식하며, 예컨대 서열 번호 119의 아미노산 50∼60에 해당하는 G 펩티드 서열을 사용하여 서브 그룹 A 및 B와 변이체 A1, A2, B1, 및 B2를 구별하는 데 사용할 수 있다. 본 발명의 또다른 구체예에서는, hMPV 분리물의 누클레오티드 서열을 사용하여 hMPV의 상이한 서브 그룹 및/또는 상이한 변이체를 구별한다. 한 구체예에서는, hMPV 게놈에서의 서열에 상보적인 올리고누클레오티드 서열, 프라이머, 및/또는 프로브를 당업자에 공지된 방법, 예컨대 RT-PCR, PCR, 프라이머 실행 분석, 및 각종 블롯팅 기술과 함께 사용하여 hMPV 감염의 병인성 병원체를 구분되는 서브 그룹 및/또는 변이체로 분류한다. 한 특정 구체예에서는, RT-PCR을 사용하여 hMPV 게놈의 특정 단편을 복사 또는 증폭시키기 위하여 생물학적 샘플을 사용한다. 추가의 구체예에서는, 상기 단편의 서열을 얻어 hMPV의 공지된 서열과 비교하며, 상기 비교를 이용하여 hMPV 균주를 구분되는 서브 그룹 또는 변이체로 분류하거나 또는 hMPV 균주를 신규한 서브 그룹 또는 변이체로 분류한다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 hMPV의 상이한 서브 그룹 및/또는 변이체를 구별하는 데 사용할 수 있는 진단 키트에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 특정 바이러스 감염의 진단 및/또는 치료는 상기 감염을 야기하는 상기 특정 바이러스에 가장 특이적인 시약을 사용하여 실시한다. 이 경우, 이것은 상기 MPV 감염의 진단 및/또는 치료는 MPV에 가장 특이적인 시약을 사용하여 실시하는 것이 바람직함을 의미한다. 그러나, 예컨대 더 용이하게 입수 가능하고 작업을 충분히 처리하므로 덜 특이적이지만 충분히 교차 반응적인 시약을 대신 사용할 수 있다는 가능성을 배제하는 것은 전혀 아니다. 본원에서는 예컨대 APV로부터 유도된 시약, 특히 APV-C로부터 유도된 시약을 사용하여 포유동물에서 MPV 감염의 바이러스학적 및/또는 혈청학적 진단의 실시를 제공하며, 본원의 상세한 설명에서는 예컨대 조류에서의 APV 항체의 검출을 위하여 설계된 ELISA를 사용함으로써 포유동물에서의 MPV 감염을 충분히 신뢰할 정도로 혈청학적으로 진단할 수 있음을 보여준다. 이러한 목적을 위해 특히 유용한 시험은, 스웨덴 웁살라 웁살라 사이언스 파크 글룬텐 SE-751 83에 소재하는 SVANOVA Biotech AB사에 의하여 제조되는 APV-Ab SVANOVIR®로 공지된 상업적으로 입수 가능한 버전인 (예컨대, 혈청 또는 난황 중의) APV 항체의 검출을 위해 설계된 ELISA 시험이다. 반대의 상황은 예컨대 MPV에서 유도된 시약으로 포유동물에서의 APV 감염을 바이러스학적으로 및/또는 혈청학적으로 진단하는 경우이며, 본원의 상세한 설명에서는 예컨대 MPV 항체의 검출을 위하여 설계된 ELISA를 사용함으로써 조류에서의 APV 감염을 충분히 신뢰할 정도로 혈청학적으로 진단할 수 있음을 보여준다. 항원 및 항체가 자물쇠 및 열쇠 관계인 것을 고려하여, 충분한 교차 반응성을 갖는 적절한 항체를 선택함으로써 각종 항원을 검출할 수 있다. 물론, 이러한 교차 반응성에 의존하기 위하여, 각종 바이러스의 각종 (글리코)단백질 간에 존재하는 아미노산 상동성에 따라 (항원 또는 항체와 같은) 시약을 선택하는 것이 최선이므로, 가장 상동성인 단백질과 관련된 시약을 상기 교차 반응성 의존 시험에서 사용하는 것이 가장 유용하다.
핵산 검출의 경우, 각종 바이러스의 이종 핵산 서열에 기초한 프라이머 또는 프로브를 설계하는 대신 실질적으로 포유동물 또는 조류 메타뉴모바이러스 사이의 차이를 검출하는 것이 더 직접적이므로, 높은 상동성을 보이는 바이러스 특이적 핵산 서열의 스트레치에 기초한 프라이머 또는 프로브를 선택 또는 설계하기에 충분하다. 일반적으로, 핵산 서열의 경우, 상동성이 90% 이상인 것이 하이브리드화의 엄격한 조건을 이용하는 진단 시험에서 신뢰할만한 충분한 교차 반응성을 보장한다.
본 발명은 예컨대 동물, 특히 포유동물, 더 특별하게는 인간의 샘플을 본 발명에 따른 MPV 특이적 핵산 또는 항체와 반응시킴으로써 바이러스 분리물 또는 이의 성분의 존재를 상기 샘플에서 측정하는 단계를 포함하는 상기 동물의 MPV 감염을 바이러스학적으로 진단하는 방법, 및 포유동물의 샘플을 본 발명에 따른 MPV 특이적 단백질 분자 또는 이의 단편 또는 항원과 반응시킴으로써 MPV 또는 이의 보체에 대하여 특이적인 항체의 존재를 상기 포유동물의 샘플에서 측정하는 단계를 포함하는 포유동물의 MPV 감염을 바이러스학적으로 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 MPV, MPV-특이적 핵산, 단백질 분자 또는 이의 단편, 항원 및/또는 항체를 포함하는 MPV 감염을 진단하기 위한 진단 키트를 제공하며, 상기 수단은 예컨대 업계에서 사용되는 효소 검출 시스템 또는 형광발색단과 같은 여기가능한 기를 포함한다(적당한 진단 키트 포맷의 예에는 IF, ELISA, 중화 분석, RT-PCR 분석이 포함됨). 아직 확인되지 않은 바이러스 성분 또는 이의 합성 유사체, 예컨대 핵산, 단백질 분자 또는 이의 단편이 MPV-특이적인 것으로 동정될 수 있는지 결정하기 위하여, 예컨대 본원에 개시된 바와 같은 계통발생학적 분석을 사용하여 공지된 MPV 서열 및 공지된 비-MPV 서열(APV-C를 사용하는 것이 바람직함)과의 서열 상동성을 비교함으로써, 예컨대 상기 핵산 또는 아미노산의 스트레치, 바람직하게는 10 이상, 더 바람직하게는 25 이상, 더욱 바람직하게는 40 이상의 누클레오티드 또는 아미노산 (각각)에 대하여 상기 성분의 핵산 또는 아미노산 서열을 분석하는 것으로 충분하다. 상기 MPV 또는 비-MPV 서열과의 관계 정도에 따라, 성분 또는 합성 유사체를 동정할 수 있다.
본 발명은 또한 포유동물의 샘플을 APV (바람직하게는 혈청형 C)로부터 유도된 교차 반응성 핵산 또는 상기 APV와 반응성인 교차 반응성 항체와 반응시킴으로써 상기 포유동물 샘플에서 바이러스 분리물 또는 이의 보체의 존재를 측정하는 것을 포함하는 포유동물의 MPV 감염을 바이러스학적으로 진단하기 위한 방법, 및 포유동물의 샘플을 APV로부터 유도된 단백질 분자 또는 이의 단편 또는 항원과 반응시킴으로써 APV 또는 이의 보체에 대한 교차 반응성 항체의 존재를 상기 포유동물의 샘플 중에서 측정하는 것을 포함하는 포유동물의 MPV 감염을 혈청학적으로 진단하기 위한 방법을 제공한다. 나아가, 본 발명은 처음에 MPV 감염의 진단, 특히 인간에서 상기 MPV 감염의 검출을 위한 AVP 또는 AVP-항체 검출을 위해 설계된 진단 키트의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 조류의 샘플을 MPV로부터 유도된 교차 반응성 핵산 또는 상기 MPV와 반응성인 교차 반응성 항체와 반응시킴으로써 상기 조류 샘플에서 바이러스 분리물 또는 이의 보체의 존재를 측정하는 것을 포함하는 조류의 APV 감염을 바이러스학적으로 진단하기 위한 방법, 및 조류의 샘플을 MPV로부터 유도된 단백질 분자 또는 이의 단편 또는 항원과 반응시킴으로써 MPV 또는 이의 보체에 대한 교차 반응성 항체의 존재를 상기 조류의 샘플 중에서 측정하는 것을 포함하는 조류의 APV 감염을 혈청학적으로 진단하기 위한 방법을 제공한다. 나아가, 본 발명은 처음에 APV 감염의 진단, 특히 닭, 오리 또는 칠면조와 같은 가금류에서 상기 APV 감염의 검출을 위한 MVP 또는 MVP-항체 검출을 위해 설계된 진단 키트의 용도를 제공한다.
치료와 마찬가지로 진단의 경우, 특히 더 상동성이고 덜 직접적인 접근 방식을 이용하는 상황에서 상이한 포유동물 MPV 간 및 MPV와 다른 바이러스(예컨대, APV5) 간의 고도의 상동성을 이용할 수 있다. MPV 감염에 대한 긴급 백신 접종과 같이 지체할 수 없는 백신 접종은, 더 상동성인 MPV 백신을 이용할 수 없는 경우, 예컨대 APV(바람직하게는 C형) 분리물로부터 유도된 백신 제제로 실시할 수 있으며, 그 반대의 경우 APV 감염에 대한 백신 접종은 MPV로부터 유도된 백신 제제를 이용할 수 있다. 또한, 역유전 기술에 의하면 각각의 균주의 분리물을 소정 수준으로 약독화시키는 것과 충분히 상이한 백신으로서 유용한 키메라 APV-MPV 바이러스 구축물을 생성시킬 수 있다. 유사한 역유전 기술에 의하면 백신 제제에서 RSV-MPV 또는 P13-MPV 구축물과 같은 키메라 파라믹소바이러스-메타뉴모바이러스 구축물을 생성시킬 수도 있다. 이러한 구축물은 특히 기도 질환을 치료하는 조합 백신으로서 유용하다.
MPV CPE는 tMK 또는 다른 세포 배양액 중에서 hRSV 또는 hPIV-1에 의하여 야기되는 것과 실질적으로 구별할 수 없으므로, MPV는 지금까지 잘 인식되지 않았을 수 있다. tMK (3차 원숭이 신장 세포, 즉 세포 배양 중 제3 계대 배양에서의 MK 세포)가 1차 및 2차 배양과 비교하여 비용이 낮으므로 바람직하게 사용된다. CPE 및 일부 전형적인 파라믹소바이러스는 다핵 거대 세포 형성 후 세포가 급속한 내부 붕괴를 보인 다음 단층으로부터 세포가 탈착되는 것을 특징으로 한다. 상기 세포는 (항상은 아니지만) 통상적으로 hRSV 또는 hPIV-1과 같은 다른 바이러스에 의하여 야기되는 CPE보다 다소 후인 접종 후 10∼14일에 원래의 재료로부터 바이러스를 3회 계대 배양한 후 CPE를 나타내었다.
예컨대, 중증 RTI를 앓고 있는 28명의 어린이로부터 취한 비인두 흡입물 샘플로부터 이전에 확인되지 않았던 파라믹소바이러스를 제공한다. 이들 어린이의 임상적 증상은 hRSV에 의하여 야기되는 것과 매우 유사하였다. 27명의 환자는 5세 이하의 어린이이고 이들 중 반수가 1 및 12 월령이었다. 다른 환자는 18세였다. 상부 RTI를 앓고 있는 모든 개인은 기침, 근육통, 구토 및 열에서부터 기관지염 및 중증 폐렴에 이르기까지의 증상을 보였다. 이들 환자의 대다수가 1주 내지 2주 입원하였다.
이들 환자로부터 취한 바이러스 분리물은 음성 대조 전자 현미경에서 파라믹소바이러스의 모폴로지를 보였으나 공지된 인간 및 동물 파라믹소바이러스에 대한 특이적 항혈청과 반응하지 않았다. 이들은 모두 두 분리물에 대하여 얻은 혈청과 간접 면역형광 분석법(IFA)으로 측정할 때 서로 매우 밀접한 관계였다. 이들 분리물 9종의 서열 분석은 바이러스가 APV와 약간 관련이 있음을 나타내었다. 바이러스학적 데이타, 서열 상동성 및 게놈 조직을 기초로, 이 바이러스는 메타뉴모바이러스 속의 일원인 것으로 생각된다. 혈청학적 조사에 의하면, 네덜란드에서 그러한 혈청의 전파가 5세 인간의 100%에 접근하므로, 이 바이러스가 비교적 통상적인 항원임을 보여주었다. 또한, 그러한 혈청의 전파가 1958년 인간으로부터 수집한 혈청에서 동등하게 높은 것으로 발견되어 이 바이러스가 40년 이상 동안 인간에서 퍼졌음을 암시하였다. 이러한 제안된 메타뉴모바이러스 속의 신규한 멤버의 동정은 또한 바이러스 기도 감염에 대한 진단 분석 또는 테스트 키트 및 백신 또는 혈청 또는 항체 조성물의 수단 및 방법의 개발을 제공하며, MPV 감염의 치료에서 유용한 항바이러스 제제에 대한 스크리닝 또는 시험 방법을 제공한다.
본원에 제공된 방법 및 수단은 바이러스학적 진단이든 혈청학적 진단이든지간에 MPV 감염의 진단을 위한 진단 키트에서 특히 유용하다. 이러한 키트 또는 분석은 예컨대 바이러스, 핵산, 단백질 분자 또는 이의 단편, 항원 및/또는 본 발명에 따른 항체를 포함한다. 예컨대 MPV 감염의 치료 또는 예방 및/또는 특히 인간에서 기도 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물의 제조를 위한, 예컨대 바이러스, 핵산, 단백질 분자 또는 이의 단편, 항원 및/또는 본 발명에 따른 항체의 용도도 제공된다. 다른 종의 관련 바이러스의 사용, 실험실 동물 및/또는 조직/세포 배양물을 통한 연속 계대 배양, 분자 클론의 특정부위 돌연변이 유발 및 관련 바이러스의 유전자 또는 유전자 단편의 교환을 포함하나 이에 한정되지 않는, 이러한 목적을 위해 개발된 확립된 방법에 의하여 바이러스를 약독화시킬 수 있다.
서브타입 A1, A2, B1 및 B2로서 언급되는 4개의 구분되는 hMPV 서브타입이 개시되었다. 본 발명은 4개의 모든 서브타입을 감지하는 하나의 분석법을 사용하여 숙주에서 hMPV를 검출하는 것에 관한 것이다. 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 숙주 중의 hMPV의 존재를 검출할 수 있다. 본 발명의 더 특별한 구체예에서는, 고감도 Taqman 분석법을 사용하여 숙주 중의 hMPV의 존재를 검출할 수 있다. 당업자는 이러한 분석에 사용하기 위한 프로브 및 올리고누클레오티브의 설계를 위한 조건을 잘 알 것이다. 이러한 프로브 및 올리고누클레오티드는 hMPV 게놈, 전사체 또는 이의 가공 및 미가공 생성물의 임의의 영역을 특이적으로 인식하기 위하여 설계될 수 있다. 본 발명의 더 특별한 구체예에서, 본 발명의 올리고누클레오티드 및 프로브는 hMPV의 모든 서브타입, 그 전사체, 또는 이의 가공 및 미가공 생성물, 예컨대, A1, B1, A2, 및 B2에서의 서열에 대하여 상보적이거나 또는 동일하거나 또는 유사하다. 특히, 올리고누클레오티드 및 프로브는 hMPV의 모든 4개의 서브타입, 그 전사체, 또는 이의 가공 및 미가공 생성물내 서열의 음성 또는 양성 카피에 대하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일하다. 또다른 구체예에서, 이것은 hMPV의 모든 4개의 서브타입내 서열의 음성 또는 양성 카피에 대하여 상보적이다. 임의의 길이의 올리고누클레오티드 및 프로브를 본 발명의 분석 검출에 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 일반적인 하이브리드화 및 세정 조건은 업계에 공지되어 있다. 바람직하게는, 예컨대 프로브가 특이적으로 결합하고 비특이적 결합의 용이한 제거 또는 결합을 방지할 수 있도록 하는 조건이다. 본 발명의 또다른 더 특별한 구체예에서, 본 발명의 올리고누클레오티드 및 프로브는 N-유전자, P-유전자, F-유전자, M-유전자, M2-유전자, SH-유전자, G-유전자, 및 L-유전자를 포함하나 이에 한정되지 않는 hMPV 게놈, 또는 이의 가공 및 미가공 생성물 내의 임의의 열린 해독 틀에 대하여 상보적이다. 본 발명의 더 특별한 구체예에서, 본 발명의 올리고누클레오티드 및 프로브는 N-유전자, 그 전사체, 또는 이의 가공 및 미가공 생성물을 인식한다. 또다른 구체예에서, 모든 4개의 서브타입으로부터의 hMPV는 동일한 특이성으로 인식된다.
바이러스는 숙주로부터 얻을 수 있는 임의의 생물학적 샘플로부터 분리될 수 있다. 본 발명의 더 특별한 구체예에서, 비인두 샘플을 본 발명의 검출 분석에서 사용하기 위하여 숙주로부터 수집한다. 바이러스는, Vero 및 tMK 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는, hMPV를 지지할 수 있는 각종 세포주에서 검출 목적으로 증식시킬 수 있다. 바이러스 RNA의 검출은 당업자에게 공지된 다수의 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 한 특정 구체예에서, 바이러스 RNA 검출은 Taqman PCR을 기초로 하는 방법을 사용하여 실시한다.
5.15 본 발명의 조성물 및 포유동물 메타뉴로바이러스의 성분
본 발명은 포유동물 MPV의 핵산 서열, 포유동물 MPV의 단백질, 및 포유동물 MPV의 단백질에 대한 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유동물 MPV의 핵산 서열의 동족체 및 포유동물 MPV의 단백질의 동족체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 관한 것이며, 상기 융합 단백질은 포유동물 MPV의 단백질 또는 이의 단편 및 포유동물 MPV로부터 유도되지 않은 하나 이상의 펩티드 또는 단백질을 함유한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질은 포유동물 MPV의 단백질 또는 이의 단편, 및 폴리히스티딘 태그와 같은 그러나 이에 한정되지 않는 펩티드 태그를 함유한다. 본 발명은 또한 융합 단백질에 관한 것이며, 여기서 상기 융합 단백질은 포유동물 MPV의 단백질 또는 이의 단편 및 포유동물 MPV로부터 유도되지 않은 하나 이상의 펩티드 또는 단백질을 함유한다. 본 발명은 또한 포유동물 MPV의 단백질을 인코딩하는 핵산의 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유동물 MPV의 단백질의 유도체에 관한 것이다. 유도체는 삽입, 결실, 절단, 치환 및 역위와 같은 그러나 이에 한정되지 않는 단백질의 돌연변이 형태일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 유도체는 또한 포유동물 MPV의 단백질의 키메라 형태일 수 있으며, 단백질의 하나 이상의 도메인은 상이한 단백질로부터 유도된다. 유도체는 또한 예컨대 약물과 같은 또다른 분자에 공유 또는 비공유 결합된 포유동물 MPV의 단백질의 형태일 수 있다.
NL/1/00 (또한 00-1)로 명명되는 바이러스 분리물은 변이체 A1의 포유동물 MPV이며 그 게놈 서열은 서열 번호 19에 나타내었다. NL/17/00로 명명되는 바이러스 분리물은 변이체 A2의 포유동물 MPV이며 그 게놈 서열은 서열 번호 20에 나타내었다. NL/1/99 (또한 99-1)로 명명되는 바이러스 분리물은 변이체 B1의 포유동물 MPV이며 그 게놈 서열은 서열 번호 18에 나타내었다. NL/ 1/94로 명명되는 바이러스 분리물은 변이체 B2의 포유동물 MPV이며 그 게놈 서열은 서열 번호 21에 나타내었다. 본 출원에 개시된 서열 목록 및 해당 서열 번호는 표 14에 나타내었다.
포유동물 MPV의 단백질은 N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질 또는 M2-2 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 포유동물 MPV의 단백질 단편은 25 이상의 아미노산, 50 이상의 아미노산, 75 이상의 아미노산, 100 이상의 아미노산, 125 이상의 아미노산, 150 이상의 아미노산, 175 이상의 아미노산, 200 이상의 아미노산, 225 이상의 아미노산, 250 이상의 아미노산, 275 이상의 아미노산, 300 이상의 아미노산, 325 이상의 아미노산, 350 이상의 아미노산, 375 이상의 아미노산, 400 이상의 아미노산, 425 이상의 아미노산, 450 이상의 아미노산, 475 이상의 아미노산, 500 이상의 아미노산, 750 이상의 아미노산, 1000 이상의 아미노산, 1250 이상의 아미노산, 1500 이상의 아미노산, 1750 이상의 아미노산, 2000 이상의 아미노산 또는 2250 이상의 아미노산 길이일 수 있다. 포유동물 MPV의 단백질의 단편은 25 이하의 아미노산, 50 이하의 아미노산, 75 이하의 아미노산, 100 이하의 아미노산, 125 이하의 아미노산, 150 이하의 아미노산, 175 이하의 아미노산, 200 이하의 아미노산, 225 이하의 아미노산, 250 이하의 아미노산, 275 이하의 아미노산, 300 이하의 아미노산, 325 이하의 아미노산, 350 이하의 아미노산, 375 이하의 아미노산, 400 이하의 아미노산, 425 이하의 아미노산, 450 이하의 아미노산, 475 이하의 아미노산, 500 이하의 아미노산, 750 이하의 아미노산, 1000 이하의 아미노산, 1250 이하의 아미노산, 1500 이하의 아미노산, 1750 이하의 아미노산, 2000 이하의 아미노산 또는 2250 이하의 아미노산 길이일 수 있다.
본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 N 단백질이며, 여기서 N 단백질은 APV C형의 N 단백질보다 포유동물 MPV의 N 단백질, 예컨대 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 N 단백질과 계통발생학적으로 더 밀접한 관계이다(역시 서열 번호의 기술에 대해서는 표 14 참조). 본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 P 단백질이며, 여기서 P 단백질은 APV C형의 P 단백질보다 포유동물 MPV의 P 단백질, 예컨대 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 P 단백질과 계통발생학적으로 더 밀접한 관계이다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 M 단백질이며, 여기서 M 단백질은 APV C형의 M 단백질보다 포유동물 MPV의 M 단백질, 예컨대 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 M 단백질과 계통발생학적으로 더 밀접한 관계이다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 F 단백질이며, 여기서 F 단백질은 APV C형의 F 단백질보다 포유동물 MPV의 F 단백질, 예컨대 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 F 단백질과 계통발생학적으로 더 밀접한 관계이다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 M2-1 단백질이며, 여기서 M2-1 단백질은 APV C형의 M2-1 단백질보다 포유동물 MPV의 M2-1 단백질, 예컨대 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 M2-1 단백질과 계통발생학적으로 더 밀접한 관계이다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 M2-2 단백질이며, 여기서 M2-2 단백질은 APV C형의 M2-2 단백질보다 포유동물 MPV의 M2-2 단백질, 예컨대 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 M2-2 단백질과 계통발생학적으로 더 밀접한 관계이다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 G 단백질이며, 여기서 G 단백질은 APV C형의 임의의 단백질보다 포유동물 MPV의 G 단백질, 예컨대 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 G 단백질과 계통발생학적으로 더 밀접한 관계이다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 SH 단백질이며, 여기서 SH 단백질은 APV C형의 임의의 단백질보다 포유동물 MPV의 SH 단백질, 예컨대 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 SH 단백질과 계통발생학적으로 더 밀접한 관계이다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 L 단백질이며, 여기서 L 단백질은 APV C형의 임의의 단백질보다 포유동물 MPV의 L 단백질, 예컨대 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 L 단백질과 계통발생학적으로 더 밀접한 관계이다.
본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 N 단백질이며, 여기서 N 단백질은 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21 (각 N 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 366-369에 개시됨; 역시 표 14 참조)의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 N 단백질의 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상 동일하다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 P 단백질이며, 여기서 P 단백질은 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21 (각 P 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 374-377에 개시됨; 역시 표 14 참조)의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 P 단백질의 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상 동일하다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 M 단백질이며, 여기서 M 단백질은 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21 (각 M 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 358-361에 개시됨; 역시 표 14 참조)의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 M 단백질의 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상 동일하다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 F 단백질이며, 여기서 F 단백질은 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21 (각 F 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 314-317에 개시됨; 역시 표 14 참조)의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 F 단백질의 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상 동일하다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 M2-1 단백질이며, 여기서 M2-1 단백질은 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21 (각 M2-1 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 338-341에 개시됨; 역시 표 14 참조)의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 M2-1 단백질의 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상 동일하다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 M2-2 단백질이며, 여기서 M2-2 단백질은 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21 (각 M2-2 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 346-349에 개시됨; 역시 표 14 참조)의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 M2-2 단백질의 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상 동일하다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 G 단백질이며, 여기서 G 단백질은 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21 (각 G 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 322-325에 개시됨; 역시 표 14 참조)의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 G 단백질의 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상 동일하다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 SH 단백질이며, 여기서 SH 단백질은 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21 (각 SH 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 382-385에 개시됨; 역시 표 14 참조)의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 SH 단백질의 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상 동일하다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 포유동물 MPV의 단백질은 L 단백질이며, 여기서 L 단백질은 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21 (각 L 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 330-333에 개시됨; 역시 표 14 참조)의 바이러스 게놈에 의하여 인코딩된 L 단백질의 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상 동일하다. 포유동물 MPV의 단백질의 단편은 상기 단편에 대하여 상동성인 단백질 부분에 있어서 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21의 바이러스에 의하여 인코딩된 동종성 단백질과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상 동일하다. 특정의 예시적 구체예에서, 본 발명은 F 단백질 및 이의 동족체의 엑토 도메인을 함유하는 포유동물 MPV의 F 단백질의 단편을 제공한다. 상기 엑토 도메인을 함유하는 F 단백질의 단편의 동족체는 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 21 (각 F 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 314-317에 개시됨; 역시 표 14 참조)의 바이러스에 의하여 인코딩된 F 단백질의 엑토 도메인을 함유하는 해당 단편과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상 동일하다.
포유류 MPV의 단백질의 단편이 이 단편에 상동성인 단백질의 일부에 걸쳐 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 또는 서열 번호: 21의 바이러스에 의해 암호화된 상동성 단백질과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하다. 구체적인 예시적 실시양태에서, 본 발명은 F 단백질 및 이것의 상동체의 엑토도메인을 함유하는 포유류 MPV의 F 단백질의 단편을 제공한다. 엑토도메인을 함유하는 F 단백질의 단편의 상동체는 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 또는 서열 번호: 21의 바이러스에 의해 암호화된 F 단백질의 엑토도메인을 함유하는 상응하는 단편과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하다(각 F 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호: 314-317로 개시되어 있다; 또한 표 14를 참조할 수 있다).
특정 실시양태에서, 본 발명은 부분군 A인 포유류 MPV의 단백질 및 이것의 단편을 제공한다. 본 발명은 부분군 A인 포유류 MPV의 N 단백질을 제공하며, 여기서 N 단백질은 이것이 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 N 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20의 바이러스에 의해 암호화된 N 단백질과 계통발생론적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 부분군 A인 포유류 MPV의 G 단백질을 제공하며, 여기서 G 단백질은 이것이 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 G 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20의 바이러스에 의해 암호화된 G 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 부분군 A인 포유류 MPV의 P 단백질을 제공하며, 여기서 P 단백질은 이것이 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 P 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20의 바이러스에 의해 암호화된 P 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 부분군 A인 포유류 MPV의 M 단백질을 제공하며, 여기서 M 단백질은 이것이 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 M 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20의 바이러스에 의해 암호화된 M 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 부분군 A인 포유류 MPV의 F 단백질을 제공하며, 여기서 F 단백질은 이것이 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 F 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20의 바이러스에 의해 암호화된 F 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 부분군 A인 포유류 MPV의 M2-1 단백질을 제공하며, 여기서 M2-1 단백질은 이것이 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 M2-1 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20의 바이러스에 의해 암호화된 M2-1 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 부분군 A인 포유류 MPV의 M2-2 단백질을 제공하며, 여기서 M2-2 단백질은 이것이 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 M2-2 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20의 바이러스에 의해 암호화된 M2-2 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 부분군 A인 포유류 MPV의 SH 단백질을 제공하며, 여기서 SH 단백질은 이것이 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 SH 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20의 바이러스에 의해 암호화된 SH 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 부분군 A인 포유류 MPV의 L 단백질을 제공하며, 여기서 L 단백질은 이것이 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 L 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20의 바이러스에 의해 암호화된 L 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 부분군 B인 포유류 MPV의 단백질 또는 이것의 단편을 제공한다. 본 발명은 부분군 B인 포유류 MPV의 N 단백질을 제공하며, 여기서 N 단백질은 이것이 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 N 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21의 바이러스에 의해 암호화된 N 단백질과 계통발생론적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 부분군 B인 포유류 MPV의 G 단백질을 제공하며, 여기서 G 단백질은 이것이 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 G 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21의 바이러스에 의해 암호화된 G 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 부분군 B인 포유류 MPV의 P 단백질을 제공하며, 여기서 P 단백질은 이것이 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 P 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21의 바이러스에 의해 암호화된 P 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 부분군 B인 포유류 MPV의 M 단백질을 제공하며, 여기서 M 단백질은 이것이 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 M 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21의 바이러스에 의해 암호화된 M 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 부분군 B인 포유류 MPV의 F 단백질을 제공하며, 여기서 F 단백질은 이것이 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 F 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21의 바이러스에 의해 암호화된 F 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 부분군 B인 포유류 MPV의 M2-1 단백질을 제공하며, 여기서 M2-1 단백질은 이것이 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 M2-1 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21의 바이러스에 의해 암호화된 M2-1 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 부분군 B인 포유류 MPV의 M2-2 단백질을 제공하며, 여기서 M2-2 단백질은 이것이 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 M2-2 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21의 바이러스에 의해 암호화된 M2-2 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 부분군 B인 포유류 MPV의 SH 단백질을 제공하며, 여기서 SH 단백질은 이것이 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 SH 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21의 바이러스에 의해 암호화된 SH 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 부분군 B인 포유류 MPV의 L 단백질을 제공하며, 여기서 L 단백질은 이것이 서열 번호: 19 또는 서열 번호: 20에 의해 암호화된 바이러스에 의해 암호화되는 L 단백질과 관련이 있는 것보다 서열 번호: 18 또는 서열 번호: 21의 바이러스에 의해 암호화된 L 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다.
본 발명은 추가로 변이체 A1, A2, B1 또는 B2인 포유류 MPV의 단백질들을 제공한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 포유류 MPV의 상이한 변이체의 단백질들은 이들의 아미노산 서열 동일성에 의해 서로 식별될 수 있다. 포유류 MPV의 변이체는 A1, A2, B1 또는 B2일 수 있지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 그러나, 또한 본 발명은 다른 변이체의 구성원인 포유류 MPV의 분리체(isolate)도 고려한 것이다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 G 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B1의 G 단백질은 이것이 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 G 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 G 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 G 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 G 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 G 단백질을 제공하며, 여기서 G 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/99에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B1의 G 단백질(서열 번호: 324)과 적어도 66%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 N 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B1의 N 단백질은 이것이 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 N 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 N 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 N 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 N 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 N 단백질을 제공하며, 여기서 N 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/99에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B1의 N 단백질(서열 번호: 368)과 적어도 98.5%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 P 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B1의 P 단백질은 이것이 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 P 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 P 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 P 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 P 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 P 단백질을 제공하며, 여기서 P 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/99에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B1의 P 단백질(서열 번호: 376)과 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 M 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B1의 M 단백질은 이것이 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 M 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 M 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 M 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 M 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 M 단백질을 제공하며, 여기서 M 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/99에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B1의 M 단백질(서열 번호: 360)과 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 F 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B1의 F 단백질은 이것이 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 F 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 F 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 F 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 F 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 F 단백질을 제공하며, 여기서 F 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/99에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B1의 F 단백질(서열 번호: 316)과 적어도 99% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-1 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-1 단백질은 이것이 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 M2-1 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 M2-1 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 M2-1 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 M2-1 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-1 단백질을 제공하며, 여기서 M2-1 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/99에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-1 단백질(서열 번호: 340)과 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-2 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-2 단백질은 이것이 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 M2-2 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 M2-2 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 M2-2 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 M2-2 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-2 단백질을 제공하며, 여기서 M2-2 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/99에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B1의 M2-2 단백질(서열 번호: 348)과 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 SH 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B1의 SH 단백질은 이것이 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 SH 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 SH 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 SH 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 SH 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 SH 단백질을 제공하며, 여기서 SH 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/99에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B1의 SH 단백질(서열 번호: 384)과 적어도 83%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 L 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B1의 L 단백질은 이것이 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 L 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 L 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 L 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 L 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B1의 L 단백질을 제공하며, 여기서 L 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/99에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B1의 L 단백질(서열 번호: 332)과 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 G 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A1의 G 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 G 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 G 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 G 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 G 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 G 단백질을 제공하며, 여기서 G 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/100에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A1의 G 단백질(서열 번호: 322)과 적어도 66%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 N 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A1의 N 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 N 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 N 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 N 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 N 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 N 단백질을 제공하며, 여기서 N 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/00에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A1의 N 단백질(서열 번호: 366)과 적어도 99% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 P 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A1의 P 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 P 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 P 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 P 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 P 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 P 단백질을 제공하며, 여기서 P 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/00에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A1의 P 단백질(서열 번호: 374)과 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 M 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A1의 M 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 M 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 M 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 M 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 M 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 M 단백질을 제공하며, 여기서 M 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/00에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A1의 M 단백질(서열 번호: 358)과 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 F 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A1의 F 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 F 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 F 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 F 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 F 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 F 단백질을 제공하며, 여기서 F 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/00에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A1의 F 단백질(서열 번호: 316)과 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-1 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-1 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 M2-1 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 M2-1 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 M2-1 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 M2-1 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-1 단백질을 제공하며, 여기서 M2-1 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/00에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-1 단백질(서열 번호: 328)과 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-2 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-2 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 M2-2 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 M2-2 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 M2-2 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 M2-2 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-2 단백질을 제공하며, 여기서 M2-2 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/00에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A1의 M2-2 단백질(서열 번호: 346)과 적어도 96%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 SH 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A1의 SH 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 SH 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 SH 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 SH 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 SH 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 SH 단백질을 제공하며, 여기서 SH 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/00에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A1의 SH 단백질(서열 번호: 382)과 적어도 84%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 L 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A1의 L 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 L 단백질, 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 L 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 L 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 L 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A1의 L 단백질을 제공하며, 여기서 L 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/00에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A1의 L 단백질(서열 번호: 330)과 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 G 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A2의 G 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 G 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 G 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 G 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 G 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 G 단백질을 제공하며, 여기서 G 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/17/100에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A2의 G 단백질(서열 번호: 332)과 적어도 66%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 N 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A2의 N 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 N 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 N 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 N 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 N 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 N 단백질을 제공하며, 여기서 N 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/17/00에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A2의 N 단백질(서열 번호: 367)과 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 P 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A2의 P 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 P 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 P 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 P 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 P 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 P 단백질을 제공하며, 여기서 P 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/17/00에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A2의 P 단백질(서열 번호: 375)과 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 M 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A2의 M 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 M 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 M 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 M 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 M 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 M 단백질을 제공하며, 여기서 M 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/17/00에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A2의 M 단백질(서열 번호: 359)과 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 F 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A2의 F 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 F 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 F 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 F 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 F 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 F 단백질을 제공하며, 여기서 F 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/17/00에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A2의 F 단백질(서열 번호: 315)과 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-1 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-1 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 M2-1 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 M2-1 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 M2-1 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 M2-1 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-1 단백질을 제공하며, 여기서 M2-1 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/17/00에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-1 단백질(서열 번호: 339)과 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-2 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-2 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 M2-2 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 M2-2 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 M2-2 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 M2-2 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-2 단백질을 제공하며, 여기서 M2-2 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/17/00에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A2의 M2-2 단백질(서열 번호: 347)과 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 SH 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A2의 SH 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 SH 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 SH 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 SH 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A2, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 SH 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 SH 단백질을 제공하며, 여기서 SH 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/17/00에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A2의 SH 단백질(서열 번호: 383)과 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 L 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 A2의 L 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 L 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 L 단백질, 또는 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 L 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 L 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 A2의 L 단백질을 제공하며, 여기서 L 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/17/00에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 A2의 L 단백질(서열 번호: 331)과 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다.
본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 G 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B2의 G 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 G 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 G 단백질, 또는 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 G 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 G 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 G 단백질을 제공하며, 여기서 G 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/94에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B2의 G 단백질(서열 번호: 325)과 적어도 66%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 N 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B2의 N 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 N 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 N 단백질, 또는 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 N 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 N 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 N 단백질을 제공하며, 여기서 N 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/94에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B2의 N 단백질(서열 번호: 369)과 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 P 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B2의 P 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 P 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 P 단백질, 또는 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 P 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 P 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 P 단백질을 제공하며, 여기서 P 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/94에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B2의 P 단백질(서열 번호: 377)과 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 M 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B2의 M 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 M 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 M 단백질, 또는 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 M 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 M 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 M 단백질을 제공하며, 여기서 M 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/94에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B2의 M 단백질(서열 번호: 361)과 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 F 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B2의 F 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 F 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 F 단백질, 또는 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 F 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 F 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 F 단백질을 제공하며, 여기서 F 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/94에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B2의 F 단백질(서열 번호: 317)과 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-1 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-1 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 M2-1 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 M2-1 단백질, 또는 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 M2-1 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 M2-1 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-1 단백질을 제공하며, 여기서 M2-1 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/94에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-1 단백질(서열 번호: 341)과 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-2 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-2 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 M2-2 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 M2-2 단백질, 또는 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 M2-2 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 M2-2 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-2 단백질을 제공하며, 여기서 M2-2 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/94에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B2의 M2-2 단백질(서열 번호: 349)과 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 SH 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B2의 SH 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 SH 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 SH 단백질, 또는 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 SH 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 SH 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 SH 단백질을 제공하며, 여기서 SH 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/94에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B2의 SH 단백질(서열 번호: 385)과 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 L 단백질을 제공하며, 여기서 포유류 MPV 변이체 B2의 L 단백질은 이것이 변이체 B1, 분리체 NL/1/99의 프로토타입의 L 단백질, 변이체 A1, 분리체 NL/1/00의 프로토타입의 L 단백질, 또는 변이체 A2, 분리체 NL/17/00의 프로토타입의 L 단백질과 관련이 있는 것보다 변이체 B2, 분리체 NL/1/94의 프로토타입의 L 단백질과 계통발생학적으로 보다 근접하게 관련이 있다. 본 발명은 포유류 MPV 변이체 B2의 L 단백질을 제공하며, 여기서 L 단백질의 아미노산 서열은 프로토타입 NL/1/94에 의해 표시된 바와 같은 포유류 MPV 변이체 B2의 L 단백질(서열 번호: 333)과 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 동일하다.
특정 실시양태에서, 서열 동일성의 백분율은 전장 단백질의 배열을 기준으로 한다. 다른 실시양태에서, 서열 동일성의 백분율은 단백질의 인접 아미노산 서열의 배열을 기준으로 하고, 여기서 아미노산 서열은 길이상 25개 아미노산, 50개 아미노산, 75개 아미노산, 100개 아미노산, 125개 아미노산, 150개 아미노산, 175개 아미노산, 200개 아미노산, 225개 아미노산, 250개 아미노산, 275개 아미노산, 300개 아미노산, 325개 아미노산, 350개 아미노산, 375개 아미노산, 400개 아미노산, 425개 아미노산, 450개 아미노산, 475개 아미노산, 500개 아미노산, 750개 아미노산, 1000개 아미노산, 1250개 아미노산, 1500개 아미노산, 1750개 아미노산, 2000개 아미노산 또는 2250개 아미노산일 수 있다.
구체적인 특정 실시양태에서, 본 발명은 포유류 MPV의 G 단백질을 제공하며, 여기서 G 단백질은 서열 번호: 119-153; 서열 번호: 322-325 또는 이들의 단편으로 열거된 아미노산 서열 중 하나를 갖는다. 구체적인 특정 실시양태에서, 본 발명은 포유류 MPV의 F 단백질을 제공하며, 여기서 F 단백질은 서열 번호: 234-317로 열거된 아미노산 서열 중 하나를 갖는다. 구체적인 특정 실시양태에서, 본 발명은 포유류 MPV의 L 단백질을 제공하며, 여기서 L 단백질은 서열 번호: 330-333 또는 이들의 단편으로 열거된 아미노산 서열 중 하나를 갖는다. 구체적인 특정 실시양태에서, 본 발명은 포유류 MPV의 M2-1 단백질을 제공하며, 여기서 M2-1 단백질은 서열 번호: 338-341 또는 이들의 단편으로 열거된 아미노산 서열 중 하나를 갖는다. 구체적인 특정 실시양태에서, 본 발명은 포유류 MPV의 M2-2 단백질을 제공하며, 여기서 M2-2 단백질은 서열 번호: 346-349 또는 이들의 단편으로 열거된 아미노산 서열 중 하나를 갖는다. 구체적인 특정 실시양태에서, 본 발명은 포유류 MPV의 M 단백질을 제공하며, 여기서 M 단백질은 서열 번호: 358-361 또는 이들의 단편으로 열거된 아미노산 서열 중 하나를 갖는다. 구체적인 특정 실시양태에서, 본 발명은 포유류 MPV의 N 단백질을 제공하며, 여기서 N 단백질은 서열 번호: 366-369 또는 이들의 단편으로 열거된 아미노산 서열 중 하나를 갖는다. 구체적인 특정 실시양태에서, 본 발명은 포유류 MPV의 P 단백질을 제공하며, 여기서 P 단백질은 서열 번호: 374-377 또는 이들의 단편으로 열거된 아미노산 서열 중 하나를 갖는다. 구체적인 특정 실시양태에서, 본 발명은 포유류 MPV의 SH 단백질을 제공하며, 여기서 SH 단백질은 서열 번호: 382-385 또는 이들의 단편으로 열거된 아미노산 서열 중 하나를 갖는다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 단편이 길이상 적어도 25개 아미노산, 50개 아미노산, 75개 아미노산, 100개 아미노산, 125개 아미노산, 150개 아미노산, 175개 아미노산, 200개 아미노산, 225개 아미노산, 250개 아미노산, 275개 아미노산, 300개 아미노산, 325개 아미노산, 350개 아미노산, 375개 아미노산, 400개 아미노산, 425개 아미노산, 450개 아미노산, 475개 아미노산, 500개 아미노산, 750개 아미노산, 1000개 아미노산, 1250개 아미노산, 1500개 아미노산, 1750개 아미노산, 2000개 아미노산 또는 2250개 아미노산이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 단편이 길이상 많아야 25개 아미노산, 50개 아미노산, 75개 아미노산, 100개 아미노산, 125개 아미노산, 150개 아미노산, 175개 아미노산, 200개 아미노산, 225개 아미노산, 250개 아미노산, 275개 아미노산, 300개 아미노산, 325개 아미노산, 350개 아미노산, 375개 아미노산, 400개 아미노산, 425개 아미노산, 450개 아미노산, 475개 아미노산, 500개 아미노산, 750개 아미노산, 1000개 아미노산, 1250개 아미노산, 1500개 아미노산, 1750개 아미노산, 2000개 아미노산 또는 2250개 아미노산이다.
본 발명은 추가로 포유류 MPV로부터 유도된 핵산 서열을 제공한다. 또한 본 발명은 포유류 MPV로부터 유도된 핵산 서열의 유도체도 제공한다. 구체적인 특정 실시양태에서, 핵산은 변형된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 상기 정의된 바와 같은 포유류 MPV의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질을 암호화한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 상기 정의된 바와 같은 포유류 MPV의 부분군 A의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질을 암호화한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 상기 정의된 바와 같은 포유류 MPV의 부분군 B의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2- 2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질을 암호화한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 상기 정의된 바와 같은 포유류 MPV의 변이체 A1의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질을 암호화한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 상기 정의된 바와 같은 포유류 MPV의 변이체 A2의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질을 암호화한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 상기 정의된 바와 같은 포유류 MPV의 변이체 B1의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질을 암호화한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 상기 정의된 바와 같은 포유류 MPV의 변이체 B2의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질을 암호화한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 또는 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 서열과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일한 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 또는 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 서열의 단편과 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하며, 여기서 단편은 길이상 적어도 25 뉴클레오티드, 적어도 50 뉴클레오티드, 적어도 75 뉴클레오티드, 적어도 100 뉴클레오티드, 적어도 150 뉴클레오티드, 적어도 200 뉴클레오티드, 적어도 250 뉴클레오티드, 적어도 300 뉴클레오티드, 적어도 400 뉴클레오티드, 적어도 500 뉴클레오티드, 적어도 750 뉴클레오티드, 적어도 1,000 뉴클레오티드, 적어도 1,250 뉴클레오티드, 적어도 1,500 뉴클레오티드, 적어도 1,750 뉴클레오티드, 적어도 2,000 뉴클레오티드, 적어도 2,00 뉴클레오티드, 적어도 3,000 뉴클레오티드, 적어도 4,000 뉴클레오티드, 적어도 5,000 뉴클레오티드, 적어도 7,500 뉴클레오티드, 적어도 10,000 뉴클레오티드, 적어도 12,500 뉴클레오티드, 또는 적어도 15,000 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 서열은 서열 번호: 84-118; 서열 번호: 154- 233; 서열 번호: 318-321; 서열 번호: 326-329; 서열 번호: 334-337; 서열 번호: 342-345; 서열 번호: 350-353; 서열 번호: 354-357; 서열 번호: 362-365; 서열 번호: 370-373; 서열 번호: 378-381; 또는 서열 번호: 386-389의 뉴클레오티드 서열 중 하나와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일하다.
본 발명의 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 핵산 서열은 낮은 엄격도(stringency), 중간 엄격도 또는 높은 엄격도 조건 하에 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20 또는 서열 번호: 21의 핵산 서열 중 하나로 혼성화될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 서열은 낮은 엄격도, 중간 엄격도 또는 높은 엄격도 조건 하에 서열 번호: 84-118; 서열 번호: 154-233; 서열 번호: 318-321; 서열 번호: 326-329; 서열 번호: 334-337; 서열 번호: 342-345; 서열 번호: 350-353; 서열 번호: 354-357; 서열 번호: 362-365; 서열 번호: 370-373; 서열 번호: 378-381; 또는 서열 번호: 386-389의 핵산 서열 중 하나로 혼성화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산이 적어도 25 뉴클레오티드, 적어도 50 뉴클레오티드, 적어도 75 뉴클레오티드, 적어도 100 뉴클레오티드, 적어도 150 뉴클레오티드, 적어도 200 뉴클레오티드, 적어도 250 뉴클레오티드, 적어도 300 뉴클레오티드, 적어도 400 뉴클레오티드, 적어도 500 뉴클레오티드, 적어도 750 뉴클레오티드, 적어도 1,000 뉴클레오티드, 적어도 1,250 뉴클레오티드, 적어도 1,500 뉴클레오티드, 적어도 1,750 뉴클레오티드, 적어도 2,000 뉴클레오티드, 적어도 2,00 뉴클레오티드, 적어도 3,000 뉴클레오티드, 적어도 4,000 뉴클레오티드, 적어도 5,000 뉴클레오티드, 적어도 7,500 뉴클레오티드, 적어도 10,000 뉴클레오티드, 적어도 12,500 뉴클레오티드, 또는 적어도 15,000 뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 또는 서열 번호: 21의 뉴클레오티드 서열에 의해 혼성화된다.
추가로, 본 발명은 포유류 MPV의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명의 항체는 포유류 MPV의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질에 특이적으로 결합한다. 구체적인 실시양태에서, 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 포유류 MPV의 부분군 A의 바이러스의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질에 특이적으로 결합한다. 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 포유류 MPV의 부분군 B의 바이러스의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질에 특이적으로 결합한다. 보다 구체적인 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 포유류 MPV의 변이체 A1의 바이러스의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질에 특이적으로 결합한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 포유류 MPV의 변이체 A2의 바이러스의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 포유류 MPV의 변이체 B1의 바이러스의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질에 특이적으로 결합한다. 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 포유류 MPV의 변이체 B2의 바이러스의 G 단백질, N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, M2-1 단백질, M2-2 단백질, SH 단백질, 또는 L 단백질에 특이적으로 결합한다.
5.16 HR 을 이용하는 바이러스 세포 융합의 억제
바이러스 숙주 세포 융합(virus-host cell fusion)은 MPV를 비롯한 수많은 인벨로프형 바이러스(enveloped virus)의 전염환(infectious life cylce)에서 필수적인 단계이다. 이로써, 바이러스 세포 융합의 억제는 이러한 바이러스의 조절에 대한 새로운 접근법을 나타낸다. 이러한 억제 방법은 숙주내 MPV의 증식 및 숙주의 MPV에 의한 감염을 예방하는 대체 수단을 나타낸다. 바이러스 세포 융합의 억제는 요구되는 부착 단백질의 유형에 따라 좌우된다. 문헌[Wang et al, Biochem Biophys Res Comm 302 (2003) 469-475]을 참조할 수 있다. 결과적으로, 본 발명의 한 실시양태에서 다양한 바이러스 부착 단백질 상에서 바이러스 세포 융합의 의존성을 확인하는 데 임의의 측정검사법(assay)이 이용된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 환자의 hMPV 감염을 예방, 치료 또는 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 HR(heptad repeat) 펩티드의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 특징 실시양태에서, 약학적 유효량은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 만큼 바이러스 숙주 세포 융합을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, HR은 환자에 있어서 감염을 야기하는 바이러스의 HR이다. 특정 실시양태에서, HR는 서브타입 A1의 MPV의 HR이다. 보다 구체적인 실시양태에서, HR 서열은 hMPV의 F 단백질의 HR 서열, 지정된(designated) HRA 또는 HRB 중 하나이고, 여기서 HRA는 펩티드의 N 말단 부근에 있는 HR 서열이고, HRB는 C 말단 부근에 존재한다. 특정 실시양태에서, 환자에 있어서 hMPV 감염을 처리, 또는 예방 또는 조절하도록 투여되는 HR은 A1, B1, A2, 또는 B2의 hMPV 서브타입의 HR이다.
특정 실시양태에서, HR은 환자에 있어서 감염을 야기하는 바이러스의 HR과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 적어도 99.5% 동일하다. 특정 실시양태에서, HR의 유도체는 바이러스 융합을 예방하는 데 사용할 수 있다. 그러한 유도체로는 비정상적(non-native) 아미노산에 의해 치환되거나, 아미노산의 스트레치(stretch)가 제거되도록 절두되거나, 또는 단일 아미노산 또는 이것의 스트레치가 추가되도록 연장되는 HR 펩티드가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또다른 실시양태에서, 단일 HR 펩티드는 hMPV 감염을 치료, 조절 또는 예방하는 데 이용된다. 또다른 추가적인 실시양태에서는, HR 펩티드의 조합물이 투여되어 hMPV 감염을 치료, 조절 또는 예방한다.
하기 설명된 테스트는 hMPV와 세포의 융합을 예방할 때 HR의 유효성을 결정하는 데 이용할 수 있으며, 따라서 어느 HR 또는 이것의 유사체 또는 유도체가 환자에 있어서 hMPV 감염을 치료, 예방 또는 조절하기에 가장 적합한지를 결정하는 데 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 가용성의 합성된 HR 펩티드는 그 펩티드가 바이러스 세포 융합을 예방할 수 있는지의 여부를 결정하는 데 측정검사된다. 임의의 HR 서열이 RSV, PIV, APV, 및 hMPV에 대한 HR 서열(이들에 국한되는 것은 아님)을 비롯한 hMPV 바이러스 세포 융합을 억제하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 그 HR 서열은 hMPV의 것이다. 보다 구체적인 실시양태에서, HR 서열은 hMPV의 F 단백질의 HR 서열, 지정된 HRA 또는 HRB 중 하나이고, 여기서 HRA는 펩티드의 N 말단 부근에 있는 HR 서열이고 HRB는 C 말단 부근에 있는 HR 서열이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, hMPV 바이러스 세포 융합을 억제하는 데 사용되는 HRA 및 HRB 유도된 펩티드로는 RSV, APV, 및 PIV로부터 유래하는 HRA 및 HRB 펩티드가 포함되지만, 이에 국한되는 것이 아니다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, HRA 및 HRB 펩티드의 유도체가 hMPV 바이러스 세포 융합을 억제하는 데 사용된다. 예를 들면, HRA 및 HRB 펩티드내 하나 이상의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 이루어지는 유도체가 hMPV 바이러스 세포 융합을 억제하는 데 사용된다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 유도체가 HRA 및 HRB 펩티드의 특이적 영역을 절단 또는 절제함으로써 이루어진다. 또다른 실시양태에서, 사용되는 HRA 및 HRB 펩티드가 내인성 HR 서열에 대하여 연장된다. 또다른 추가적인 실시양태에서, HRA 및 HRB 펩티드의 상이한 영역의 서열로 구성되는 짧은 펩티드의 군이 hMPV 바이러스 세포 융합을 억제하는 데 사용된다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, hMPV HRA 및 HRB 유도된 펩티드가 hMPV의 동종 균주에 대하여 또는 hMPV의 이종 균주에 대하여 사용된다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, HRA 및 HRB 펩티드, 또는 이들의 유사체 또는 유도체가 바이러스 세포 융합에 함께 사용된다. 보다 바람직한 실시양태에서, HRA 또는 HRB 펩티드 또는 이들의 유사체 또는 유도체가 단독으로 사용된다. 다른 실시양태에서, 사용되는 HRA 또는 HRB 펩티드의 유도체가 내인성 HR 펩티드와 적어도 90%, 80%, 70%, 60%, 또는 50% 동일하다.
HR 서열이 바이러스 감염을 억제할 수 있는 성능을 검토하기 위해서, HR 펩티드는, 이것이 바이러스 융합 억제 성능에 대하여 테스트될 수 있도록, 발현 및 정제될 수 있다. 가용성의 HR 펩티드가 발현 및 정제될 수 있으며, 결과적으로 바이러스 감염을 차단하는 테스트를 실시하기 위해서 내인성 HR로 종결하는 측정검사에 사용된다. 본 발명의 한 실시양태에서, hMPV의 F 단백질의 HR 서열, 지정된 HRA 및 HRB 각각을 암호화하는 합성 재조합 DNA가 제조될 수 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 정제를 용이하게 하는 데 유용한 서열 태크도 함유하는 HR 펩티드를 암호화하는 합성 재조합 DNA가 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, HR 펩티드의 정제를 용이하게 하는 태그는 그 HR 펩티드의 활성을 방해하지 않는다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 상기 태그는 일련의 히스티딘 잔기, 예를 들면 펩티드의 말단 중 하나에 있는 6 연속적 히스티딘로 구성되고, 히스티딘 태그라고 칭한다. 가용성 HRA 및 HRB를 발현 및 정제하는 데 이용할 수 있는 다수의 상이한 접근법이 존재한다. 우선, HRA 및 HRB를 암호화하는 DNA 벡터가 해당 기술 분야의 당업자에 공지된 방법을 이용하여 제조된다. 이어서, 그 플라스미드는 예를 들어 이.콜리 균주 BL21(DE3)과 같은 적당한 발현 숙주 세포 내로 형질전환되고, 단백질이 해당 기술 분야에 일상적인 방법을 이용하여 발현 및 정제된다. 예를 들면, 히스티딘 태그로 HR 펩티드를 암호화하는 유전자의 발현이 IPTG을 이용하는 pET 벡터로부터 유도될 수 있다. 이어서, 세포가 용해될 수 있고, 발현된 펩티드가 카운터 하전된 종, 예를 들면 이미다졸에 의한 용출을 수행하면서 Ni-킬레이트화된 세파로즈 친환성 컬럼 상에 부동화시킨 후 단리될 수 있다.
바이러스 융합의 억제시 발현된 HR 펩티드의 잠재적인 유효성을 결정하기 위해서, 임의의 측정검사법이 HR 펩티드들 간의 복합체의 어셈블리를 확인하는데 사용된다. 이러한 방법은 이것이 바이러스 융합 억제에서의 효율을 결정하기 위해서 펩티드의 비세포계 선별(cell-free screening)을 허용한다는 점에서 세포계 측정검사법에 비하여 이점을 갖는다. 본 발명의 한 실시양태에서, HR 펩티드가 복합체 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 동시에 항온 처리된다. 보다 구체적인 실시양태에서, 복합체 형성에 허용되는 시간의 양은 28℃에서 1 시간이다. 복합체 형성은 크로마토그래피, UV-VIS 분광법, NMR 분광법, X-선 결정학 방법, 원심분리법, 또는 전기영동법(이에 국한되는 것은 아님)을 비롯한 해당 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 본 발명의 다른 구체적인 실시양태에서, 복합체 형성은 복합체의 분자량을 결정하기 위해서 전기영동법과 함께 결부된 겔 여과 방법을 이용하여 검출된다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 이러한 복합체 형성 측정검사법이 바이러스 융합을 억제할 때 유용한 후보물질을 확인하는 데 이용된다. 예를 들면, 바이러스 융합의 억제에서 돌연변이된 HR 펩티드의 유효성이 결정된다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 바이러스 융합의 억제에서 HR 펩티드의 유도체의 유효성이 복합체 형성 측정검사법을 이용하여 측정된다.
펩티드의 HR 분절이 성질상 나선형인 것으로 공지되어 있다. 이러한 이유로, 다수의 방법이 발현된 HR 펩티드가 바이러스 융합 억제에서 사용하기 위한 적당한 후보물질을 확인하기 위해서 알파 나선형을 형성하는지의 여부를 결정하는 데 이용될 수 있다. 그러한 방법으로는 분광법, X-선 결정학 방법, 및 현미경 방법이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 한 실시양태에서, CD(원편광 이색성: circular dichroism) 분광법이 HR 펩티드의 구조적 특징을 결정하는 데 이용된다.
세포계 측정검사법이 바이러스 융합의 억제에서 HR 펩티드의 유효성을 결정하는 데 이용될 수 있다. 그 측정검사법에는 tMK, Hep2, 또는 Vero 세포(이에 국한되는 것은 아님)를 비롯한 MPV에 의해 감염될 수 있는 임의의 세포가 사용될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 사용되는 세포의 유형이 Hep2 세포이다. 숙주 세포를 MPV로 감염시키자마자, 세포는 HR 단백질 제제로 항온 처리되고, 적당한 시간 동안 항온 처리 후 융합에 대한 점수가 기록된다. 이어서, 세포는 바이러스 세포 융합이 성공되었는지의 여부를 결정하기 위해서 합포체/폴리캐리온(synctium/polykaryon) 형성에 대하여 염색 처리된다.
본 발명은 후술하는 실시예를 참조하여 보다 잘 이해할 수 있으며, 그 실시예는 본 발명의 예시적인 것으로 제공된 것이다. 후술하는 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 충분히 예시하기 위해서 나타낸 것이다. 그러나, 실시예는 본 발명의 넓은 영역을 한정하는 것으로 어떠한 방식으로도 해석되어서는 안된다.
6. 실시예 : 인간 메타뉴모 바이러스 융합 (F) 단백질의 추정 절단 부위내 S1O1P 치환부는 VERO 세포내 트립신- 비의존성 성장에 대한 주요 결정인자이다.
재료 및 방법
세포 및 바이러스. Vero 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS) (Hyclone), 2 mM L-글루타민(Gibco BRL), 비필수 아미노산(Gibco BRL) 및 2% 페니실린/스트렙토마이신(Biowhittaker)로 보충된 최소 필수 배지(MEM)(JHR Biosciences) 중에 유지하였다. BSR/T7 세포(Dr. KK Conzelmann 박사에 의해 호의로 제공됨)는 10% FBS, 5% 트 립신 포스페이트 브로쓰(Sigma), 비필수 아미노산, 및 2% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 Glasgow MEM(Gibco BRL) 중에 유지하였다. tMK 세포는 전술한 바와 같이(van den Hoogen et al, 2001) 유지하였다. hMPV 및 키메라성 b/h PIV3 바이러스는 optiMEM (Gibco/BRL) 및 2% 페니실린/스트렙토마이신(Sigma)으로 Vero 세포 중에서 증식시켰다. 일부 바이러스는 0.2 μg/ml TPCK 트립신(Sigma)으로 증식시켰다. 바이러스 스톡은 세포 및 상청액을 함께 SPG(1OX SPG는 pH 7.1에서의 2.18M 수크로스, 0.038M KH2PO4, 0.072M K2HPO4, 0.054M L-글루타메이트이다)에 의해 최종 농도 IX SPG로 스크래핑(scraping) 처리하고 -70℃에서 동결시킴으로써 수득하였다.
바이러스 분리체 wt hMPV/NL/1/93, wt hMPV/NL/1/94, wt hMPV/NL/1/99 및 wt hMPV/NL/1/00는 전술하였다(Hersft et al, 2004 ; van den Hoogen, 2001). 다음의 재조합 바이러스: rhMPV/NL/1/OO/101P, rhMPV/NL/1/OO/101S, rhMPV/NL/l/99/101S, rhMPV/93K/101S, rhMPV/93K/101P, b/h PIV3/hMPV F/101P 및 b/h PIV3/hMPV F/101S는 전장 cDNA 플라스미드로부터 역 유전학 방법에 의해 발생시켰다. 변이체 바이러스 vhMPV/93K/101P 및 vhMPV/100K/101P는 rhMPV/93K/101P로부터 유도하였다.
hMPV 플라크의 면역염색법에 의한 역가 . 바이러스 역가(플라크 형성 단위 (PFU)/ml)는 Vero 세포 중에서 플라크 측정검사법에 의해 결정하였다. Vero 세포는 TC6-웰 평판에서 유사 컨플루언시(near confluency)로 성장시켰다. optiMEM 중에 희석된 바이러스로 35℃에서 1 시간 흡착을 수행한 후, 그 세포는 optiMEM 및 2% 페니실린/스트렙토마이신과의 1:1 희석된 20% 메틸 셀룰로즈로 도포하고, 35℃에서 6일 동안 항온 처리하였다. 면역염색법에 대한 것을 준비하기 위해서, 그 도포층(overlay)을 제거하고, 세포를 15 분 동안 메탄올 중에 고정하였다. 플라크는 wt hMPV/NL/1/00(Medlmmune Vaccines, Inc.)로 면역화된 흰족제비(ferret)로부터 얻은 hMPV에 대한 항혈청으로 면역염색하였다. 이 항혈청은 5% 분말형 밀크(w/v)(PBS-milk)를 함유하는 PBS 중에 대략 1:500 희석하였다. 이어서, 세포는 양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다제-컨쥬케이트화된 항-흰족제비(anti-ferret) Ab(Dako)으로 항온 처리하고, 이어서 3-아미노-9-에틸카르바졸(AEC)(Dako)으로 처리하여 계수를 위해 플라크를 시각화하였다.
전장 hMPV cDNA 플라스미드의 구성( construction ). (101S를 함유하는) hMPV/NL/1/00의 cDNA 및 (101S를 함유하는) hMPV/NL/1/99의 cDNA는 전술한 바와 같이 구성하여, rhMPV/NL/1/OO/101S 및 rhMPV/NL/l/99/101S(Herfst et al 2004)라고 칭하는 재조합 바이러스를 회수하는 데 사용하였다. hMPV F 당단백질의 예측된 아미노산 서열내 S101P를 암호화하는 뉴클레오티드 치환부 T3367C는, 재조합 바이러스 rhMPV/NL/1/OO/101P를 회수하는 데 사용되는 플라스미드를 구성하기 위해서, 프라이머 GCAAATTGAAAATCCCAGACAACCTAGATTCGTTCTAGG 및 이것의 안티-센스 프라이머를 사용하여 도입하였다. hMPV F 당단백질내 예측된 아미노산 치환부 E93K를 암호화하는 뉴클레오티드 치환부 G3343A도 프라이머 GCTGATCAACTGGCAAGAGAGAAGCAAATTGAAAATCCC 및 이것의 안티-센스 프라이머를 사용하여 유사하게 도입하였다.
역 유전학 방법에 의한 재조합 hMPV 바이러스의 회수. 재조합 바이러스는 전술한 바와 같이(Herfst et al 2004) 역 유전학 방법에 의해 회수하였다. 요약하건대, 10 μL 리포펙타민 2000(Invitrogen)를 함유하는 500 μL optiMEM 중의 1.2 μg의 pCITE hMPV N, 1.2 μg의 pCITE hMPV P, 0.9 μg의 opCITE hMPV M2, 0.6 μg의 pCITE hMPV L, 및 5 μg의 전장 cDNA 플라스미드를 106 BSR/T7 세포의 단일층에 도포하였다. 배지는 15 시간 트랜스펙션 후 optiMEM로 교체하고, 35℃에서 2 내지 3일 동안 항온 처리하였다. 1회의 동결 해동 순환 후, 세포 및 상청액은 Vero 세포의 90% 컨플루언트 단일층을 감염시키고 6 일 동안 항온 처리하여 구제된 바이러스를 증폭시키는 데 사용하였다. 바이러스 회수는 기술된 바와 같이 hMPV로 유도된 흰족제비 다클론성 Ab를 사용하여 양성 면역염색법으로 확인하였다. 회수된 바이러스는 0.1 PFU/c세포의 감염 다중도(MOI: multiplicity of infection)로 접종하고, optiMEM을 공급하며, 그리고 35℃에서 6 일 동안 항온 처리 후에 수집함으로써 Vero 세포 중에서 증폭시켰다. 일부 트랜스펙션 및 성장은 기술된 바와 같이 0.2 ug/ml TPCK 트립신(Sigma)의 존재 하에 수행하였다.
회수된 바이러스의 RT - PCR . 서열화를 위한 DNA는 0.1 PFU/세포의 MOI로 hMPV 바이러스를 사용하여 Vero 세포 단일층을 접종함으로써 생성시켰다. 세포 및 상청액은 접종한지 6일 후에 수집하고, 1회의 동결 해동 순환으로 처리하였다. RNA는 제조업자 지침서에 따라 TRizol 시약을 사용하여 추출하였다. RT-PCR는 원 스텝 RT-PCR 키트(Invitrogen) 및 프라이머의 중복 세트(overlapping set)를 사용하 여 수행하였다. RT-PCR 단편의 크로마토그램은 겔 추출 키트(Qiagen gel extraction kit)을 사용하여 아가로즈 겔로부터 단리된 DNA로부터 발생시켰다.
Vero 세포내 hMPV 바이러스의 다순환 성장. TC6-웰 평판내 Vero 세포의 서브컨플루언트 단일층은 0.2 ug/ml TPCK 트립신(Sigma)의 부재 또는 존재 하에 optiMEM으로 희석된 hMPV 바이러스를 사용하여 0.1 PFU/세포의 MOI로 접종하였다. 그 바이러스 접종물에 공기를 흡입시키고 세포에 웰 당 2 ml optiMEM +/- 0.2 ug/ml TPCK 트립신을 공급하였다. 세포와 상청액은 6 일 동안 24 시간의 간격으로 수집하고, -70℃에서 동결시켰다. 수집된 샘플은 Vero 세포 +/- 0.2 ug/ml TPCK 트립신 중에서 역가 측정하였다. 플라크는 상기 설명한 바와 같이 흰족제비 항-hMPV 다클론성 Ab(Medlmmune Vaccines, Inc.)를 사용하여 면역염색법에 의해 시각화하였다.
hMPV F 당단백질의 표면 발현을 위한 면역염색법. Vero 세포는 유리 커버슬립 상에 시딩 처리하였다. Vero 세포의 서브컨플루언트 단일층은 5 PFU/세포의 MOI로 접종하였다. 바이러스 접종물에 공기를 흡입시키고, 세포에 2% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 optiMEM을 공급하였다. 35℃에서 3 일 동안 항온 처리를 수행한 후, 세포는 3% 파라포름알데히드 중에서 10 분 동안 고정하였다. 이어서, 그 단일층은 PBS 중에 세척하고, PBS-밀크 중에서 차단하였다. 세포는 PBS-밀크 중에 1:250 희석된 항-hMPV F 모노클론성 항체(Mab) 121-1017-133(미공개됨)으로 실온에서 1 시간 동안 항온 처리하고, 이어서 PBS 중에 2회 세척을 수행하였다. 이어서, 세포는 PBS-밀크 중에 1:1000 희석된 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-컨쥬 케이트화된 항-어메리칸 햄스터 Ab(Jackson Laboratories)로 실온에서 1 시간 동안 항온 처리하고, PBS 중에 2회 세척을 수행하였다. 역위된 커브슬립은 10 μL 벡타-보호 장입 배지(Vecta-shield mounting medium)(Vector Laboratories)을 사용하여 유리 슬라이드 상에 장입하였고, 니콘 이클립스(Nikon eclipse) TE2000-U 현미경으로 관찰하였다.
hMPV F 단백질의 웨스턴 블롯 . hMPV 바이러스는 TC6-웰 조직 배양 접시내 Vero 세포의 서브컨플루언트 단일층을 0.1 PFU/세포의 MOI로 감염시키고, 35℃에서 항온 처리하는 데 사용하였다. 감염 4일 내지 6일 후, 세포 및 상청액은 수집하고, -70℃에서 동결시켰다. 샘플을 해동시키고, 5% 베타-머캅토에탄올(Sigma)을 함유하는 Laemmli 버퍼(Bio-Rad) 중에 용해시키고, 12% 폴리아크릴아미드 Tris-HCl Ready Gel(Bio-Rad) 중에서 분리하며, 그리고 습식 이동 셀(wet transfer cell)(Bio-Rad)를 사용하여 Hybond-P PVDF 멤브레인(Amersham Biosciences)으로 이동시켰다. 멤브레인은 5% (w/v) 건조 밀크(PBS-milk)를 함유하는 PBS로 차단시키고, PBS-밀크 중에 1:2000 희석된 항-hMPV F Mab 121-1017-133으로 접종시키고, 이어서 PBS-밀크 중에 1:1000 희석된 양고추냉이 퍼옥시다제-컨쥬케이트화된 항-햄스터 Mab로 항온 처리하였다. 멤브레인은 0.5% (v/v) Tween 20(Sigma)을 함유하는 PBS를 사용하여 4회 세척하고, 화학발광성 기질(Amersham Biosciences)로 현상시키며, 그리고 hMPV F 단백질을 시각화하기 위해 Biomax MR 필름(Kodak)에 노출시켰다.
b/h PIV3 / hMPV F2 전장 cDNA . (101S를 함유하는 hMPV F를 발현시키는) b/h PIV3/hMPV F2는 전술하였다(Tang et al 2003). 요약하건대, hMPV F 유전자는 키메 라성 소/인간 파라인플루엔자 바이러스 타입 3(b/h PIV3) cDNA(Haller et al 2000; Haller et al 2001)의 N 유전자와 P 유전자 사이에 삽입하였다. hMPV/NL/1/00 게놈내 T3367C에 상응하는 뉴클레오티드 변경부는 퀵 변경 돌열변이 유발 키트(Quik change mutagenesis kit)(Stratagene)를 사용하여 b/h PIV3/hMPV F2의 hMPV F 유전자 내로 도입시켰는데, 이는 결과적으로 아미노산 101에서 프롤린을 지닌 hMPV F를 발현시키는 b/h PIV3/hMPV/ F2/101P를 생성하였다.
Vero 세포내 융합된 핵의 정량화. TC6-웰 평판내 컨플루언트 Vero 세포의 단일층은 3 PFU/세포의 MOI로 이중 접종시키거나, 유사 감염시켰다. 35℃에서 1 시간 접종을 수행한 후, 접종물에 공기를 흡입시키고, 세포는 2% 페니실린/스트렙토마이신 +/- 0.2 ug/ml TPCK 트립신(Sigma)을 함유하는 optiMEM과 1:1 혼합된 2% 메틸 셀룰로즈로 도포하였다. 48 시간 또는 72 시간에서, 배지에 공기를 흡입시키고, 단일층은 메탄올로 15 분 동안 고정하였다. 이 고정된 단일층은 PBS로 세척하고, Hoechst 염색 용액(PBS 중의 비스벤즈이미드 H 33258(Sigma) 0.25 ug/ml)으로 1 시간 동안 항온 처리하며, 그리고 DAPI 렌즈를 구비한 니콘 이클립스 TE2000-U 현미경으로 검사하였다. 10개의 무작위로 선택된 시역내 (총 2000개 초과의 핵에 이르는) 융합된 핵 및 비융합된 핵을 계수하고, 융합된 핵의 %를 계산하였다.
결과
Vero 세포내 성장을 위한 트립신 요건은 wt hMPV 의 4가지 대표적인 서브타입사이에서 달라진다. 모든 4가지 서브타입 A1, A2, B1 및 B2를 나타내는 hMPV 바이러스의 생물학적으로 유도된 균주는 Vero 세포 중에서 성장시켰다. 서브타입 A1 및 B1을 나타내는 wt hMPV/NL/1/00 및 wt hMPV/NL/1/99는 각각 트립신의 존재뿐만 아니라 트립신의 부재 하에 106 내지 107 PFU/ml의 피크 역가로 성장시켰다. 면역염색법에 의해 시각화된 바와 같이, 플라크 크기는 1% 메틸셀룰로즈 하에 Vero 세포 중에서 6일 성장시킨 후 직경이 대략 0.3 mm 내지 0.5 mm이었다(도 1).
표시된 대조군에서, 서브타입 A2 및 B2를 나타내는 wt hMPV/NL/1/93 및 wt hMPV/NL/1/94는 각각 트립신이 배지 내에 존재하는 경우에만 성장하였다. wt hMPV/NL/1/93은 106 내지 107 PFU/ml의 피크 역가로 성장하였고, 반면에 wt hMPV/NL/1/94의 역가는 보다 낮은 대수였다. 또한, 트립신이 배지 도포층 내에 존재하지 않는 경우에는 어떠한 플라크도 생성되지 않았다. 트립신의 존재 하에 wt hMPV/NL/1/93 및 wt hMPV/NL/1/94에 의해 생성된 플라크의 직경은 트립신의 존재 또는 부재 하에 wt hMPV/NL/1/00 또는 wt hMPV/NL/1/99에 의해 생성된 플라크보다 현저히 더 작았다(도 1).
모든 4가지 hPPV 서브타입의 F 당단백질의 공개된 서열은 추정 절단 부위에서 PQSR 모티프를 예측한다. F 유전자의 서열화는 wt hMPV/NL/1/93 및 wt hMPV/NL/1/94(각각 서브타입 A2 및 B2임)가 예상한 바와 같이 예측된 RQSR 서열을 갖는다는 것을 확인시켜 준다. 그러나, wt hMPV/NL/1/00 및 wt hMPV/NL/1/99 (각각 서브타입 A1 및 B1임)의 서열은 추정 절단 부위가 RQPR이 되도록 F 단백질내 예측된 S101P 아미노산 치환부를 결과적으로 형성하는 T3367C 변경부를 획득한다. hMPV의 트립신-비의존성 성장에 미치는 S101P 치환부의 효과가 추가 특성화되었다.
rhMPV / NL /1/ OO /101P는 트립신의 부재 하에 cDNA 로부터 회수될 수 있지만, rhMPV/NL/1/OO/101S는 그렇지 않다. hMPV/NL/1/00의 트립신-비의존성 성장에 미치는 hMPV F내 S101P 아미노산 치환부의 효과를 연구조사하기 위해서, 본 발명자들은 nt 3367에서 T를 도입시켜 rhMPV/NL/1/OO/101S를 발생시키거나 또는 nt 3367에서 C를 도입시켜 rhMPV/NL/1/OO/101P를 발생시켰다. rhMPV/NL/1/OO/101P는 트립신의 부재 하에 용이하게 회수되었고, wt hMPV/NL/1/00과 유사한 플라크를 형성하였다. 표시된 대조군에서, rhMPV/NL/1/00/101S는 트립신의 존재 하에서만 회수되었고, rhMPV/NL/1/OO/101P의 플라크보다 현저히 적은 플라크를 형성하였다(도 2a).
Vero 세포내 rhMPV / NL /1/ OO /101S 및 rhMPV / NL /1/00/101P 복제의 비교. F 단백질내에 101S 또는 101P를 하버링(harboring)하는 재조합 hMPV/NL/1/00 바이러스의 트립신-비의존성 성장을 특성화시키기 위해서, 다순환 성장 곡선(multi-cycle growth curve)은 트립신의 존재 또는 부재 하에 수행하였다.
각각의 시점에서 감염성 바이러스의 정량화는 트립신의 존재 또는 부재 하에 플라크 측정검사법으로 수행하였다(도 2b). 트립신의 존재 하에, rhMPV/NL/1/OO/1O1S 및 rhMPV/NL/1/00/101P는 둘다 효율적인 다순환 성장을 입증하여 보여주었다. rhMPV/NL/1/00/101P는 3 일째에 7.8 log10 PFU/ml의 피크 역가에 도달하였고, 반면에 rhMPV/NL/1/00/101S는 5일째에 7 log10 PFU/ml의 피크 역가에 도달하였다(도 2b).
트립신의 부재 하에서, 단지 rhMPV/NL/1/00/101P만이 다순환 성장을 수행하 였는데, 이는 트립신의 존재 하에서의 성장과 유사한, 3일째에 7.6 log10의 피크 역가에 도달하였다. rhMPV/NL/1/OO/101S는 트립신이 플라크 측정검사법에서 생략되었을 때 검출되었다(도 2b).
그러나, rhMPV/NL/1/OO/101S의 단일 순환 성장은, 트립신 부재하 성장 동안 수집된 바이러스가 플라크 측정검사법에서 트립신의 첨가시 감염성 병소를 형성하였기 때문에, 트립신의 부재 하에 발생한 것으로 나타났다. 이는 rhMPV/NL/1/OO/101S의 바이러스 입자가 트립신의 부재하 복제 동안 발생되었지만,트립신이 배지 내에 존재하지 않는 한 상기 바이러스 입자가 감염되지 않았다는 것을 제시하여 보여준다. 트립신의 부재 하에 증식된 rhMPV/NL/1/00/101S의 피크 역가는 rhMPV/NL/1/00/101P에 비하여 상대적으로 더 작은 약 2 log10이었다(도 2b).
rhMPV -감염된 세포내 hMPV F 단백질의 표면 발현에 미치는 S1O1P 의 효과. 파라믹소바이러스 융합 단백질은 이것이 멤브레인 융합을 촉진시키는 혈장 멤브레인으로 수송시켰다. rhMPV/NL/1/00/1O1S의 불량한 성장이 hMPV F의 손상된 세포 표면 발현에 의해 야기되었지의 여부를 결정하기 위해서, Vero 세포는 5 PFU/세포의 MOI로 접종하였고, 접종 3일 후 면역염색법을 위해 고정하였다. hMPV F는 트립신 존재 및 부재 둘 다 하에 rhMPV/NL/1/OO/lO1P로 접종된 세포의 거의 1O0%로 검출되었다. hMPV F의 발현의 유사한 수준이 트립신의 존재 하에 rhMPV/NL/1/00/101S로 접종된 Vero 세포에서 관찰되었다(도 2c).
이와 대조적으로, F 단백질의 표면 발현은 트립신의 부재 하에 rhMPV/NL/1/OO/1O1S로 감염된 단일층내 단지 몇개의 개별 세포만의 혈장 멤브레인 상에서 관찰되었다(도 2c). 이는 트립신 부재 하에 hMPV F/101S가 실제로 혈장 멤브레인 상에서 발현되었지만, 결과적으로 인접 세포까지 전연되지 않는 비효율적인 rhMPV/NL/1/OO/1O1S 감염을 생성하였다는 점을 제시하여 보여준다. 트립신의 부재 하에 rhMPV/NL/1/OO/1O1S 감염의 강력한 전연을 촉진시킬 수 없는 hMPV F/101S의 무능력은 부분적으로 감염성 바이러스 입자를 생성하지 못한 것에 기인한 것일 수 있다. 그러나, 융합 단백질 전구체의 효율적인 절단이 또한 세포 대 세포 융합 및 바이러스 감염의 전연에도 필요하다.
rhMPV / NL /1/ OO /1 O1P 에 비교되는 rhMPV / NL /1/ OO /1 O1S 의 hMPV F 단백질의 절단. 이론에 의해 한정되는 것은 아니지만, F1 및 F2 단편으로 F0 전구체를 절단하는 것은 융합 활성 및 다순환 바이러스 성장에 요구되는 F1 단편의 N 말단에 융합 단백질을 노출시킨다. F 절단의 효율에 미치는 S101P 치환부의 효과를 입증하기 위해서, Vero 세포는 트립신의 존재 또는 부재 하에 0.1 PFU/세포로 접종하였다. 세포 및 상청액은 감염 5일 후 수득하고, 웨스턴 블롯으로 분석하여 hMPV F의 상대적 절단을 시각화하였다.
101P를 함유하는 F 단백질의 경우, 전장 hMPV F 단백질(F0)의 양의 대략 절반이 절단되어 추정 F1 단편의 예측된 크기에 해당하는 F 종을 형성하였다. 101P를 함유하는 F 단백질의 경우 처리 효율은 트립신의 존재 또는 부재 하에 유사하다(도 2d).
이와 대조적으로, 101S를 함유하는 hMPV F는 단지 단백질이 트립신에 노출되었을 때에만 절단되었다. 절단의 상대적 효율은 hMPV F/101P에 비하여 현저하게 더 작았다(도 2d). 트립신의 존재 및 부재 하에 101S를 함유하는 F 단백질의 절단의 상대적인 양은 첨가된 트립신의 특이적 활성에서의 차이에 기인한 실험들 사이에서 가변적인 것으로 밝혀졌다. 그러나, hMPV F/101S의 상대적 절단은 hMPV F/101P의 경우보다 덜 생산적이었다.
b/h PIV3 바이러스 벡터로부터 발현되는 경우 hMPV /101P와 비교되는 hMPV/101S의 F의 절단. hMPV F 절단이 다른 hMPV 바이러스 단백질에 의해 제공된 정상적 바이러스 컨텍스트(native viral context)에 의존적인지의 여부를 결정하기 위해서, 예측된 101S 또는 101P를 하버링하는 hMPV F 단백질은 b/h PIV3, F 및 HN 유전자가 인간 PIV3 F 및 HN 유전자에 의해 치환되어 있는 소 PIV3 바이러스 내로 클로닝하였다. 종래의 연구들은 b/h PIV3이 다양한 파라믹소바이러스 융합 당단백질의 삽입을 수용하였다는 점을 제시하여 보여준다(Skiadopoulos et al 2002; Tang et al, 2003, 2004a and 2004b). 외인성 첨가된 트립신의 부재 하에, 벡터화된 hMPV/NL/1/OO/101P F 단백질은 부분적으로 Vero 세포내에서 절단되었고, 반면에 hMPV/NL/1/OO/101S F 단백질은 감염된 세포 용해물의 웨스턴 블롯에 의해 결정된 바와 같이 절단되지 않았다 (도 3). 그러나, 벡터화된 hMPVF/101P 단백질의 절단 정도는 hMPV-감염된 세포내 hMPV F/101P의 F의 절단과 비교하여 감소되었다(도 70d와 도 71을 비교할 수 있다). 이러한 차이는 트립신이 첨가된 경우 더 이상 명백하게 나타나지 않았다. 트립신의 존재 하에서, hMPV/NL/1/OO/101P 및 hMPV/NL/1/OO/101S 둘 다의 벡터화 F 단백질은 wt hMPV/NL/1/OO으로부터 발현된 F 단백질과 동일한 정도로 부분적으로 절단되었다(도 3).
hMPV / NL /1/00의 자발적인 hMPV F 변이체 . rhMPV/NL/1/OO/101P는 융합 단백질의 추정 절단 부위에서 RQPR 모티프 내에 또는 상류에 다른 코돈 변경부를 신속하게 발생시켰다. rhMPV/NL/1/OO/101P의 한가지 스톡은 F내 예측된 E93K 아미노산 치환부(도 4c의 박스형 코돈)를 암호화하는 돌연변이 G3343A 치환부를 자발적으로 발생시켰다. 제2 스톡은 F내 예측된 Q100K 치환부(도 4d의 프로토타입 코돈)를 암호화하는 돌연변이 C3364A를 발생시켰다. 이들 돌연변이는 Vero 세포에서 10회 추가적인 계대배양 동안 유전자학적으로 안정되게 유지되었다. 이들 계대배양 동안, F 단백질 내에는 다른 돌연변이가 전혀 검출되지 않았다. 이들 변이체 바이러스 중 하나, vhMPV/93K/101P는 (게놈의 극단 3' 및 5' 단부에서 30 뉴클레오티드를 초과하는) 전체 내에 서열화되었고, G3343A는 검출된 유일한 돌연변이었다. 다른 hMPV ORF 또는 비-암호화 영역내에서는 다른 돌연변이가 전혀 발견되지 않았는데, 이는 폴리머라제 복합체에 의한 hMPV 게놈의 복제가 고유하게 에러-프로운(error-prone)이 아니었다는 것을 제시하여 보여준다.
rhMPV/NL/1/OO/101P의 독립적으로 구제된 스톡 중에서도 특히 G3343A에서의 다형성이 가장 빈번하게 관찰되었다. 추정 절단 부위의 상류에 있는 뉴클레오티드에서의 5가지 다른 다형성이 또한 rhMPV/NL/1/OO/101P의 5가지 상이한 바이러스 스톡에서도 발견되었지만, 그럼에도 불구하고 G3343A보다 덜 빈번하였다. 이들은 예측된 아미노산 치환부 E92K, E93V, I95S, E96K 및 N97H를 암호화하는 G3340A, A3344T, T3350G, G3352A 및 A3355C이었다(표 20a 및 20b). 이들 다형성 중 하나를 발생시킨 rhMPV/NL/1/OO/101P의 각각 바이러스 스톡은 이들 추가의 돌연변이 중 단지 하나에 의해 제공되지만, 전혀 2 이상에 의해 제공되지 않았고, 그 스톡은 세포 배양에서 6회 이하의 계대배양으로 발생하였다. 따라서, 이들 추가적인 돌연변이 중 어느 것이든 개별적으로 Vero 세포내 성장 이점을 제공한다.
표 20a 및 표 20b: rhMPV / NL /1/ OO /101P, wt hMPV / NL /1/00 및 wt hMPV/NL/1/99의 hMPV F 유전자내 돌연변이 및 다형성( polymorphism ). 지시된 hMPV 바이러스의 스톡은 Vero 세포에서 6회 이하의 계대 배양으로 F 유전자내 다형성을 발생시켰다. 돌연변이 및 hMPV F 단백질 내에 결과로서 생기는 예측된 아미노산 치환부는 상기 각 문단에서 나타내었다.
바이러스 트립신 E92K G3340A E93K G3343A E93V A3344T Q94K C3346A G94H A3348C
rhMPV/NL/1/00/101P - × ×
＋ × ×
wt hMPV/NL/1/00 - × × ×
wt hMPV/NL/1/99 - ×
바이러스 I95S T3350G E96K G3352A N97H A3355C N97K T3357A Q100K C3364A S101P T3367C
rhMPV/NL/1/00/101P × × × × ×
×
wt hMPV/NL/1/00 × × ×
wt hMPV/NL/1/99 × ×
트립신의 부재 하에 성장은 자발적인 돌연변이가 rhMPV/NL/1/OO/101P에서 발생하는 선택적인 압력을 제공하였다는 점을 입증하기 위해서, 동일한 전장 cDNA 클론을 사용하는 10개 독립적인 트랜스펙션을 트립신의 존재 하에 수행하였고, 10개 독립적인 트랜스펙션을 트립신의 부재 하에 수행하였다. 바이러스의 회수는 트립신 존재 또는 부재에 동일하게 효율적이었다. 그러나, 트립신의 부재 하에 제3 계대배양 후, 10개 바이러스 스톡 중 7개가 G3343A 또는 C3364A 돌연변이를 지닌 하위집단을 발생시키고, 반면에 트립신 존재 하에 성장된 10개 바이러스 스톡 중 단지 1개만이 돌연변이를 발생시켰고, 그 돌연변이는 G3343A이었다.
유사하게, rhMPV/NL/1/OO/101S의 경우, 동일한 전장 cDNA 클론을 사용하여 10개 독립적인 트랜스펙션을 트립신의 존재 하에 수행하였고, 10개의 비독립적인 트랜스펙션을 트립신의 부재 하에 수행하였다. 트립신의 부재 하에서는 어떠한 바이러스도 회수되지 않았다. 재조합되어 트립신으로 증폭된 10개 독립적으로 구제된 rhMPV/NL/1/OO/101S 스톡으로부터 유래한 RT-PCR 단편의 서열화는 10회 연속적 계대배양 후일지라도 F 유전자 내에 돌연변이를 전혀 나타내지 않았다.
이들 데이터는 rhMPV/NL/1/OO/101P의 G3343A 또는 C3364A 변이체가 트립신의 부재 하에 신속하게 발생되어 트립신 부재 하에서의 융합 단백질의 보다 효율적인 절단을 용이하게 하였다는 점을 보여준다. 트립신의 존재 하에, hMPV F 절단의 작용은 절단-강화 돌연변이의 선택을 미연에 방지하는 외인성 프로테아제에 의해 나타났다.
wt hMPV/NL/1/00 및 wt hMPV/NL/1/99의 융합 유전자내 뉴클레오티드 다형성을 연구조사하였다. wt hMPV/NL/1/00 바이러스 스톡은 제3기 멍키 신장 세포에서 3회 계대배양하였고, Vero 세포에서 3회 추가 계대배양하였다("P6"). 이 P6 바이러스 스톡의 전체 게놈은 미리 서열 분석으로 처리하여, 101 위치에서 프롤린(도 4e에서 밑줄친 코돈)을 갖도록 나타내었다. 크로마토그램의 면밀한 검사시, F 유전자내 뉴클레오티드 3343 및 3364에서의 다형성이 나타났다(도 4e에서 박스형 및 프로토타입 코돈). 클론 합성은 wt hMPV/NL/1/00의 P6 스톡으로부터 유도된 nt 3200 내지 nt 3500에 걸친 길이의 RT-PCR 단편을 사용하여 수행하였다. 분석된 20개 클론 중 9개는 C3364A 돌연변이(Q1OOK)를 보유하였고, 4개는 G3343A 돌연변이(E93K)를 보유하였다. 2개 돌연변이는 rhMPV/NL/1/00 내에 발견된 우세 돌연변이와 동일하였다. 나머지 클론 중 3개 클론, 1개 클론 및 1개 클론은 E93V, Q94H 및 N97K를 각각 암호화하는 A3344T, A3348C 및 T3357A를 보유하였다(표 20). 어떠한 클론도 이들 돌연변이 중 하나 초과하여 함유하지 않았다. wt hMPV/NL/1/00의 플라크를 단리하는 시도는 hMPV 감염의 불량한 세포변성 효과에 기인하여 성공적이지 못하였다. 이러한 결과는 P6까지 확대된 wt hMPV/NL/1/00가 2가지 유사종(quasispecies)을 함유한 혼성 집단이었다는 것을 보여준다. 따라서, 생물학적으로 유도된 hMPV 및 재조합 hMPV는 둘다 조직 배양에서 그들의 성장을 용이하게 하는 hMPV F 유전자내 돌연변이를 용이하게 획득하였다.
hMPV F의 절단에 미치는 E93K 및 Q100K 의 효과. hMPV F 절단의 효율에 미치는 E93K 및 Q1OOK의 효과를 결정하기 위해서, Vero 세포는 트립신의 존재 또는 부재 하에 야생형 hMPV/NL/1/00 바이러스, 재조합 hMPV/NL/1/00 바이러스 및 변이체 hMPV/NL/1/00 바이러스로 접종하였다. 세포 및 상청액은 감염 6일 후 수득하고, 웨스턴 블롯으로 분석하여 hMPV F 단백질의 상대적 절단을 시각화하였다(도 5a). 트립신의 부재 하에, 101P를 지닌 F 단백질의 절단은 단지 101P 치환부만을 지닌 융합 단백질과 비교하여 E93K 또는 Q1OOK 아미노산 치환부를 지닌 변이체 바이러스에서 현저하게 보다 효율적이었다(도 5a에서 래인 3, 4 및 5를 래인 2와 비교할 수 있다). 트립신의 존재 하에, 야생형 hMPV F 단백질 및 변이체 hMPV F 단백질의 상대적 절단은 유사하였다(도 5a의 래인 6 내지 10의 참조). 트립신은 절단 강화 E93K 또는 Q100K 아미노산 치환부를 함유하는 hMPV F의 절단 효율을 추가적으로 증가시키지 않았다.
E93K 단독은 hMPV F의 트립신- 비의존성 절단을 제공하기에 충분하지 않다. E93K는 재조합 hMPV/NL/1/OO/101P 내에 가장 빈번하게 관찰되는 돌연변이이고, E93K를 함유하는 변이체 F 단백질은 결과적으로 강화된 절단 활성을 형성하였다.
뉴클레오티드 변경부 G3343A는 전장 cDNAs hMPV/NL/1/OO/101S 및 hMPV/NL/1/OO/101P 각각에 도입하였다. 재조합 바이러스 rhMPV/93K/101P 및 rhMPV/93K/101S는 역 유전학 방법을 이용하여 회수하였고, 이들의 유전자형은 Vero 세포에서 10회 계대배양까지 안정한 것으로 나타났다. 웨스턴 블롯 분석은 트립신의 부재 하에, 101P를 지닌 바이러스의 F 단백질이 부분적으로 절단되었고, 반면에 101S를 지닌 F 단백질이 절단되지 않았다는 점을 보여준다(도 5b). E93K의 존재는 hMPV F/101P 절단의 효율을 크게 강화시켰다(래인 11 및 12, 도 5b). 그러나, E93K는 hMPV F/101S의 절단을 증가시키지 않았다(래인 13 및 14, 도 5b). 그러므로, E93K 치환부는 단지 프롤린이 101 위치에서 존재하는 경우에만 hMPV F 절단의 효율을 증가시켰는데, 이는 hMPV F 단백질 처리시 101P과 93K 간의 상승작용적 효과를 입증하여 보여준 것이다.
Vero 세포내 성장 속도론에 미치는 E93K 및 Q1OOK 의 효과. Vero 세포에서 hMPV의 다순환 성장에 미치는 F 단백질의 강화된 트립신-비의존성 절단의 효과를 결정하기 위해서, rhMPV/NL/1/OO/101P, vhMPV/93K/101P, rhMPV/93K/101P, vhMPV/100K/101P 또는 wt hMPV/NL/1/00는 트립신의 부재 하에 0.1 PFU/세포의 MOI로 세포를 감염시키는 데 사용하였다. 바이러스 역가는 트립신의 부재 하에 얻었다. S101P를 함유하는 트립신-비의존성 바이러스 각각에 대한 성장 곡선은 유사하였는데, 이는 결과적으로 E93K 또는 Q100K의 획득으로부터 형성되는 hMPV F의 증가된 절단에 의해서는 바이러스 피크 역가 또는 성장 속도론에서의 강화가 전혀 존재하지 않는다는 것을 나타낸다(도 6).
강화된 hMPV F 절단은 hMPV -감염된 Vero 세포내 증가된 융합 활성과 상관 관계가 있다. 다른 파라믹소바이러스와 유사하게, 전장 hMPV F 단백질(F0)을 2개의 단편, F1과 F2로 절단하는 것은, 세포들 간의 융합을 촉진할 수 있는 F1 단편의 N-말단에서 융합 단백질을 노출시킬 수 있다(Morrison 2003; White, 1990). wt hMPV/NL/1/OO-감염된 Vero 세포 단일층의 시각적 검사는 2일 내지 3일까지 대부분의 세포가 융합되어 수 많은 합포체(syncytia)를 형성하였고, 반면에 rhMPV/NL/1/OO/101S-감염된 세포가 보다 적은 수와 보다 작은 크기의 합포체를 나타내었다는 것을 보여준다.
세포 대 세포 융합 활성에서의 증가가 F 단백질의 강화된 절단과 상관 관계가 있다는 점을 입증하기 위해서, Vero 세포의 컨플루언트 단일층(confluent mnolayer)은 트립신의 존재 또는 부재 하에 야생형 hMPV/NL/1/00 바이러스, 재조합 hMPV/NL/1/00 바이러스 및 변이체 hMPV/NL/1/00 바이러스로 접종하였다. 야생형 바이러스 및 변이체 바이러스의 융합 활성은 10개 무작위로 선택된 시역내 융합된 핵 및 비융합된 핵을 계수함으로써 정량화하였다. 48 시간까지, vhMPV/93K/101P, rhMPV/93K/101P, vhMPV/lOOK/101P 또는 wt hMPV/NL/1/00으로 감염된 Vero 세포 단일층에는 거대한 합포체가 시각화 가능하였다. 진행을 허용한 경우, 80 시간까지, 복수-핵화된 합포체가 이들 바이러스로 감염된 그 단일층을 100%로 덮었다. 융합된 핵 및 비융합된 핵을 계수하기 위해서, 세포는 융합이 100% 미만일 경우 48 시간에서 고정하였다(도 7). 하나의 대표적인 실험의 경우, 트립신의 부재 하에, vhMPV/93K/101P, rhMPV/93K/101P, vhMPV/100K/101P 또는 wt hMPV/NL/1/00으로 감염된 Vero 세포의 65-75%는 융합된 핵을 나타내었고, 트립신의 존재 하에, 세포의 80% 및 90%는 융합되었다(도 7). hMPV F 절단-강화 돌연변이를 함유하지 않는 rhMPV/NL/1/OO/101P의 경우, 합포체 형성은 상당히 감소되었고; 융합된 핵의 %는 트립신의 부재 하에 13%이었으며, 트립신의 존재 하에 25%이었다. rhMPV/NL/1/OO/101S의 경우, 작은 합포체의 형성이 오직 트립신의 존재 하에서만 관찰되었고, 핵의 20%가 융합되었다(도 7). 도 7에 도시된 데이타는 3가지 독립적으로 수행된 실험 중 하나를 나타낸 것이다. hMPV F 절단의 강화가 hMPV의 복제 효율을 증가시키지 않았기 때문에, hMPV F 절단의 효율과 합포체 형성을 발생시키는 융합 활성과의 직접적인 상관 관계가 존재한다.
F 단백질의 RQSR 절단 모티프 내에 S101P 치환부를 지닌 서브타입 B1 hMPV/NL/1/99의 특성화. 상기 실험에 사용된 hMPV/NL/1/00은 A1 서브타입을 갖는다. 생물학적으로 유도된 wt hMPV/NL/1/99, 대표적인 B1 서브타입은 또한 그 F 단백질의 예측된 RQSR 절단 부위 내에 S101P 치환부도 보유하는 것으로 밝혀졌다. hMPV/NL/1/00에 비교되는 hMPV/NL/1/99의 성장은 전술하였다(Herfst et al, 2003).
rhMPV / NL /l/99/101S의 성장 특성화는 wt hMPV / NL /1/99와 유사하였다. rhMPV/NL/1/OO/101S와 같이, rhMPV/NL/l/99/101S는 또한 Vero 세포에서 플라크 형성을 위한 외인성 첨가된 트립신, 다순환 성장, 세포 대 세포 전연 및 F 단백질의 절단을 획득하였다(도 8a 내지 8d). 이와 대조적으로, (101P를 보유하는) wt hMPV/NL/1/99는 트립신의 부재 하에 효율적으로 성장하였다. 심지어는 트립신의 존재 하에서도, rhMPV/NL/l/99/101S의 피크 역가는 wt hMPV/NL/1/99에 의해 나타난 피크 역가보다 더 낮은 약 2 log10이었다(도 76b). 서브타입 B1 hMPV F의 웨스턴 블롯은 또한 S101P 치환부가 결과적으로 외인성 트립신의 첨가 없이 보다 큰 절단을 생성하였다는 것을 보여준다. hMPV F/101S는 트립신의 부재 하에 절단을 전혀 나타내지 않았지만, 트립신의 존재 하에 Fl 단편이 용이하게 검출되었다. 또한, 31 kDa 마커(유사하게 트립신 절단의 생성물) 이하로 이동된 작은 밴드가 hMPV F로 유도된 Mab에 의해 인식되었다(도 8d). wt hMPV/NL/1/99의 F 유전자로부터 유도된 RT-PCR 단편의 서열화는 각각 F 내의 예측된 Q94K 및 E96K 아미노산 치환부를 각각 암호화하는 2가지 뉴클레오티드 다형성, C3346A 및 G3352A를 나타내었다.
그러므로, 서브타입 A1 및 B1 융합 단백질의 절단 부위에서 RQSR 모티프내 S101P는 트립신의 존재 하에 결과적으로 효율적인 hMPV 성장을 생성하는 프로테아제 특이성을 변경시킨다.
논의
hMPV는 성장을 위한 트립신을 필요로 하는 것으로 보고되어 있다(Bastien et al 2003a and 2003b, Biacchesi et al, 2003; Boivin et al, 2002; Hamelin et al, 2004; Peret et al, 2002 and 2004; Skiadolopous et al 2004; van den Hoogen et al 2001 and 2004b). 그러나, 제3기 멍키 세포에서 3회 계대배양되고 Vero 세포에서 3회 계대배양된 hMPV/NL/1/00 (서브타입 A1) 및 hMPV/NL/1/99(서브타입 B1) (균주 "P6")은 트립신의 존재 또는 부재 하에 유사한 성장 속도론 및 피크 역가를 나타내는 것으로 관찰되었다. 상이한 파라믹소바이러스, 센다이 바이러스(Sendai virus)의 경우, 융합 단백질 전구체(F0)의 처리 부위를 변경시킨 돌연변이는 바이러스 성장을 위한 트립신 요건에 현저하게 영향을 미치는 것으로 입증되었다(Ishida and M. Homma 1978.; Kido et al, 1992; Tashiro and M. Homnia, 1983: Tashiro, M. et al 1988 and 1992).
hMPV/NL/1/00 및 hMPV /NL/1/99의 트립신-비의존성 성장을 위한 유전학적 기초를 입증하기 위해서, 서열화는 hMPV 융합 유전자 상에서 수행하여 아미노산 변경부를 확인하였다(van den Hoogen, 2001, 2002). 추정 F1/F2 절단 부위에 있는 RQSR 모티프내 하나의 뉴클레오티드 및 몇가지 인접 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 다형성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이들 뉴클레오티드 변경부 중 하나는 101 위치에 있는 RQSR 모티프 내의 S 또는 P 치환부를 암호화하였다. 다른 파라믹소바이러스 융합 단백질과 유사하게, RQSR 모티프에서의 절단은 숙주 세포 멤브레인에 의한 융합, 합포체 형성 및 효율적인 바이러스 증폭에 필요로 하는 F1 단편의 N-말단에 위치한 융합 도메인을 유사하게 노출시켰다.
Vero 세포내 트립신-비의존성 성장에 미치는 S101P 치환부의 역할을 연구조사하기 위해서, RQSR 모티프내 101 위치에서 세린 또는 프롤린을 함유한 재조합 hMPV/NL/1/00 바이러스를 발생시켰다. 101S를 지닌 융합 단백질을 발현시킨 hMPV는 표시된 대조군에서 hMPV/NL/1/00/101P에 트립신을 첨가하는 일 없이 다순환 성장을 개시하는 것이 불가능한 것으로 밝혀졌다. hMPV/NL/1/00/101P는 외인성 트립신의 존재 또는 부재 하에 유사한 성장 속도론 및 평균 피크 역가를 나타내었는데, 이는 트립신의 존재 및 부재 하에 유사한 hMPV F/101P 절단 효율과 상관 관계를 나타내었다. 이와 대조적으로, rhMPV/NL/1/OO/F101S는 단지 hMPV FV101S가 외인성 트립신의 첨가에 의해 절단된 후에만 다순환 성장을 개시할 수 있었다. 따라서, RQSR 모티프에서 S101P 치환부는 트립신 비의존성 성장 표현형의 주요 결정인자이고, hMPV F1/F2 절단을 촉진하는 데 주요 역할을 한다.
hMPV F/101P를 발현하는 hMPV는 추정 F2 단편내 다른 아미노산 위치에서 돌연변이를 신속하게 획득하였지만, 추정 F1 단편 내에서는 그렇지 못하였다. 이러한 돌연변이 중 대부분은 Q100K 돌연변이가 모티프 내에 위치하긴 하지만 RQSR 모티프에 인접하게 존재한다. RQPR 모티프 외부에 발생한 F2 돌연변이 중, E93K는 가장 빈번하게 확인되었고, hMPV F/93K/101P를 발현하도록 조작된 hMPV는 강화된 F0 처리 및 세포 융합 활성을 나타내었다. hMPV F 절단을 발생시킨 돌연변이에 의해 생성된 신속성은 그 돌연변이가 Vero 세포 배양에서 성장 이점을 제공한다는 점을 보여 주었다. 비록 이러한 성장 이점이 0.1의 MOI로 실시된 유사한 다순환 성장 곡선으로부터 명백하지 않았지만, hMPV F 절단의 증가된 효율은 트립신의 존재 하에 rhMPV/NL/1/OO/101P의 성장을 rhMPV/NL/1/OO/101S와 비교할 경우 보다 감염성인 바이러스의 생성을 결과적으로 형성시켰다(도 2). 그러나, rhMPV/NL/1/OO/101P의 성장은 hMPV F 절단 효율에서의 보다 큰 강화가 피크 역가를 유의적으로 쉽게 증가시키지 않을 정도로 충분하게 효율적일 수 있다(도 6).
이 표현형은 또한 hMPV/NL/1/99, 서브타입 B1 hMPV의 경우에도 관찰되었다. 서브타입 A1 및 B1의 F 단백질은 94%의 아미노산 상동성을 공유하고, 비상동성 아미노산의 대부분은 추정 트랜스멤브레인 도메인을 포함하는 hMPV F 단백질의 C 말단에 위치한다(van den Hoogen et al, 2004a and b). 융합 단백질의 101 위치에 있는 S 내지 P 치환부가 또한 결과적으로 hMPV/NL/1/99의 트립신 비의존성 성장도 생성하긴 하지만, P6 스톡의 서열화는 주요 F2 다형성이 서브타입 A1 hMPV F의 경우의 아미노산 93 및 100과 대조적으로 아미노산 94 및 96에 존재한다는 것을 보여준다. 2가지 서브타입의 F 단백질이 F1/F2 절단 부위 주위에 고도로 보존되기 때문에, 상이한 절단-강화 돌연변이를 발견하는 것은 놀라운 일이다. 이론에 의해 제한하고자 하는 것은 아니지만, hMPV/NL/l/99/F 101P의 보다 확대적인 계대배양 처리는 결과적으로 서브타입 A1 F2 단편에서 발견된 것들과 유사한 아미노산 치환부를 생성할 수 있다. 그러나, F2 돌연변이에서의 차이는 hMPV F 절단을 촉매화하는 프로테아제의 결합에서의 유연성 또는 hMPV F A1 및 B1 당단백질의 그러한 영역내 보다 높은 순서 배열형태 차이를 반영할 수 있다.
S101P 치환부는 또한 키메라성 소/인간 PIV 바이러스 벡터로부터 발현을 수행하면서 hMPV F의 절단 효율도 증가시켰는데, 이는 hMPV 융합 단백질의 절단이 다른 hMPV 단백질과의 상호작용의 부재 하에 발생되었다는 점을 보여준다. 그러나, PIV3-감염된 세포로부터 유도된 hMPV F1 단편의 양은 hMPV 감염된 세포에서 관찰된 것보다 상대적으로 보다 적었는데, 이는 다른 hMPV 단백질과의 상호반응이 결과적으로 보다 큰 절단 활성을 생성하였다는 것을 보여준다. 다른 가능성은 PIV3 단백질의 억제 효과 또는 hMPV 감염 대 PIV3 감염에 의해 의도된 세포 상태에서의 차이를 포함한다. 그럼에도 불구하고 이들 관찰은 hMPV F의 RQSR 모티프내 S101P 치환부가 Vero 세포에서 절단 활성의 주요 결정인자이다는 추가의 확인사항으로서 작용을 한다.
hMPV F/101S의 표면 발현은 비절단된 hMPV F0 전구체가 세포 표면으로 소통되었다는 것을 보여준다. Vero 세포에서, hMPV F0 전구체의 상당한 양이 RSV 융합 단백질의 처리(Gonzalez-Reyes 2001; Collins, 1991)와 대조적으로 심지어는 트립신의 존재 하에서도 절단으로부터 보호되었다. 이는 hMPV F 전구체의 처리가 비효율적이고/이거나, 또는 hMPV F0가 시험관내 hMPV의 복제 순환에서 기능적인 역할을 갖는다는 것을 보여 주었다. hMPV F/101S는 외인성 첨가된 트립신에 대한 노출 후 세포외 절단되는 것으로 나타났다. 그러나, hMPV F/101P가 세포내 절단되는 것인지 아니면 세포외 절단되는 것인지의 여부가 불분명하다. 절단 부위에서 복수의 염기성 잔기를 함유하는 다른 파라믹소바이러스 융합 단백질은 퓨린과 같은 세포내 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 것으로 고려되고 있다(Bosch, 1981; Kawaoka et al 1984; Klenk 1988 and l994).
파라믹소바이러스 융합 단백질의 경우, F0 전구체의 절단은 감염성 및 병원성에 대한 필요조건이다(Kido et al 1996 ; Klenk 1994). 인플루엔자, 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 파라인플루엔자 바이러스 타입 2(PIV2) 및 센다이 바이러스(SeV) 와 같은 일부 호흡성 바이러스의 경우, 조직 특이성 프로테아제(예를 들면,기관지 상피에 의해 분비된 클라라 트립타제(Clara tryptase)) 내지 퓨린과 같은 비특이적 산재성 프로테아제에 의해 인지를 변경시킨 F 단백질내 변경부는 병독성(virulence)의 변화를 야기하였다(Bosch et al, 1981; Collins et al, 1993 and 2001; Glickman et al 1988; Kawoaka et al, 1984; Klenk et al, 1988 and 1994; Nagai et al, 1989, Seal et al 2000 ; Toyoda et al, 1987; Towatari et al 2002).
참조 문헌 목록
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인용 문헌
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또한, 2005년 1월 27일 US 2005/0019891 Al로 공개된, 2004년 4월 23일 "메타뉴모바이러스주 및 백신 제제 및 항원성 서열의 발현용 벡터로서의 용도 및 바이러스 증식 방법"의 제목으로 출원한 미국 특허 출원 제10/831,780호를 이의 전체로서 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다.
[표 14]
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SEQUENCE LISTING <110> MedImmune Vaccines, Inc. <120> METAPNEUMOVIRUS STRAINS AND THEIR USE IN VACCINE FORMULATIONS AND AS VECTORS FOR EXPRESSION OF ANTIGENIC SEQUENCES AND METHODS FOR PROPAGATING VIRUS <130> 7682-121-228 <140> <141> <150> 60/660,735 <151> 2005-03-10 <160> 389 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2507 <212> DNA <213> metapneumovirus <220> <221> CDS <222> (1)...(2507) <223> Human metapneumovirus isolate 00-1 matrix protein (M) and fusion protein (F) genes <400> 1 atggagtcct acctagtaga cacctatcaa ggcattcctt acacagcagc tgttcaagtt 60 gatctaatag aaaaggacct gttacctgca agcctaacaa tatggttccc tttgtttcag 120 gccaacacac caccagcagt gctgctcgat cagctaaaaa ccctgacaat aaccactctg 180 tatgctgcat cacaaaatgg tccaatactc aaagtgaatg catcagccca aggtgcagca 240 atgtctgtac ttcccaaaaa atttgaagtc aatgcgactg tagcactcga tgaatatagc 300 aaactggaat ttgacaaact cacagtctgt gaagtaaaaa cagtttactt aacaaccatg 360 aaaccatacg ggatggtatc aaaatttgtg agctcagcca aatcagttgg caaaaaaaca 420 catgatctaa tcgcactatg tgattttatg gatctagaaa agaacacacc tgttacaata 480 ccagcattca tcaaatcagt ttcaatcaaa gagagtgagt cagctactgt tgaagctgct 540 ataagcagtg aagcagacca agctctaaca caggccaaaa ttgcacctta tgcgggatta 600 attatgatca tgactatgaa caatcccaaa ggcatattca aaaagcttgg agctgggact 660 caagtcatag tagaactagg agcatatgtc caggctgaaa gcataagcaa aatatgcaag 720 acttggagcc atcaagggac aagatatgtc ttgaagtcca gataacaacc aagcaccttg 780 gccaagagct actaacccta tctcatagat cataaagtca ccattctagt tatataaaaa 840 tcaagttaga acaagaatta aatcaatcaa gaacgggaca aataaaaatg tcttggaaag 900 tggtgatcat tttttcattg ttaataacac ctcaacacgg tcttaaagag agctacttag 960 aagagtcatg tagcactata actgaaggat atctcagtgt tctgaggaca ggttggtaca 1020 ccaatgtttt tacactggag gtaggcgatg tagagaacct tacatgtgcc gatggaccca 1080 gcttaataaa aacagaatta gacctgacca aaagtgcact aagagagctc agaacagttt 1140 ctgctgatca actggcaaga gaggagcaaa ttgaaaatcc cagacaatct agattcgttc 1200 taggagcaat agcactcggt gttgcaactg cagctgcagt tacagcaggt gttgcaattg 1260 ccaaaaccat ccggcttgaa agtgaagtaa cagcaattaa gaatgccctc aaaaagacca 1320 atgaagcagt atctacattg gggaatggag ttcgtgtgtt ggcaactgca gtgagagagc 1380 tgaaagattt tgtgagcaag aatctaacac gtgcaatcaa caaaaacaag tgcgacattg 1440 ctgacctgaa aatggccgtt agcttcagtc aattcaacag aaggttccta aatgttgtgc 1500 ggcaattttc agacaacgct ggaataacac cagcaatatc tttggactta atgacagatg 1560 ctgaactagc cagagctgtt tccaacatgc caacatctgc aggacaaata aaactgatgt 1620 tggagaaccg tgcaatggta agaagaaaag ggttcggatt cctgatagga gtttacggaa 1680 gctccgtaat ttacatggtg caactgccaa tctttggggt tatagacacg ccttgctgga 1740 tagtaaaagc agccccttct tgttcaggaa aaaagggaaa ctatgcttgc ctcttaagag 1800 aagaccaagg atggtattgt caaaatgcag ggtcaactgt ttactaccca aatgaaaaag 1860 actgtgaaac aagaggagac catgtctttt gcgacacagc agcaggaatc aatgttgctg 1920 agcagtcaaa ggagtgcaac ataaacatat ctactactaa ttacccatgc aaagttagca 1980 caggaagaca tcctatcagt atggttgcac tatctcctct tggggctttg gttgcttgct 2040 acaagggagt gagctgttcc attggcagca acagagtagg gatcatcaag caactgaaca 2100 aaggctgctc ttatataacc aaccaagacg cagacacagt gacaatagac aacactgtat 2160 accagctaag caaagttgaa ggcgaacagc atgttataaa aggaaggcca gtgtcaagca 2220 gctttgaccc agtcaagttt cctgaagatc aattcaatgt tgcacttgac caagttttcg 2280 agagcattga gaacagtcag gccttggtgg atcaatcaaa cagaatccta agcagtgcag 2340 agaaaggaaa cactggcttc atcattgtaa taattctaat tgctgtcctt ggctctacca 2400 tgatcctagt gagtgttttt atcataataa agaaaacaaa gagacccaca ggagcacctc 2460 cagagctgag tggtgtcaca aacaatggct tcataccaca taattag 2507 <210> 2 <211> 1596 <212> DNA <213> pneumvirus <220> <221> CDS <222> (1)...(1596) <223> Avian pneumovirus fusion protein gene, partial cds <400> 2 atgtcttgga aagtggtact gctattggta ttgctagcta ccccaacggg ggggctagaa 60 gaaagttatc tagaggagtc atgcagtact gttactagag gatacctgag tgttttgagg 120 acaggatggt atacaaatgt gttcacactt ggggttggag atgtgaaaaa tctcacatgt 180 accgacgggc ccagcttaat aagaacagaa cttgaactga caaaaaatgc acttgaggaa 240 ctcaagacag tatcagcaga tcaattggca aaggaagcta ggataatgtc accaagaaaa 300 gcccggtttg ttctgggtgc catagcatta ggtgtggcaa ctgctgctgc tgtgacggct 360 ggtgtagcga tagccaagac aattaggcta gaaggagaag tggctgcaat caaaggtgcg 420 ctcaggaaaa caaatgaggc tgtatctaca ttaggaaatg gcgtgagggt acttgcaaca 480 gctgtgaatg atctcaagga ctttataagt aaaaaattga cacctgcaat aaacaggaac 540 aagtgtgaca tctcagacct taagatggca gtgagctttg gacaatacaa tcggaggttc 600 ctcaatgtgg taagacagtt ttctgacaat gcaggtatta cgcctgcaat atctctagat 660 ttaatgactg acgctgagct tgtaagagct gtaagcaaca tgcccacatc ttcaggacag 720 atcaatctga tgcttgagaa tcgggcaatg gtcagaagga aaggatttgg gattttgatt 780 ggagtttatg gtagctctgt ggtctatata gtgcagcttc ctattttcgg tgtgatagat 840 acaccgtgtt ggagggtgaa ggctgctcca ttatgttcag ggaaagacgg gaattatgca 900 tgtctcttgc gagaggacca aggttggtat tgtcaaaatg ctggatccac agtttattat 960 ccaaatgagg aggactgtga agtaagaagt gatcatgtgt tttgtgacac agcagctggg 1020 ataaatgtag caaaggagtc agaagagtgc aacaggaata tctcaacaac aaagtaccct 1080 tgcaaggtaa gtacagggcg tcacccaata agcatggtgg ccttatcacc actgggtgct 1140 ttggtagcct gttatgacgg tatgagttgt tccattggaa gcaacaaggt tggaataatc 1200 agacctttgg ggaaagggtg ttcatacatc agcaatcaag atgctgacac tgttacaatt 1260 gacaacacag tgtaccaatt gagcaaagtt gaaggagaac aacacacaat taaagggaag 1320 ccagtatcta gcaattttga ccctatagag ttccctgaag atcagttcaa cgtagccctg 1380 gatcaggtgt ttgaaagtgt tgagaagagt cagaatctga tagaccagtc aaacaagata 1440 ttggatagca ttgaaaaggg gaatgcagga tttgtcatag tgatagtcct cattgtcctg 1500 ctcatgctgg cagcagttgg tgtgggtgtc ttctttgtgg ttaagaagag aaaagctgct 1560 cccaaattcc caatggaaat gaatggtgtg aacaac 1596 <210> 3 <211> 1666 <212> DNA <213> pneumovirus <220> <221> CDS <222> (14)...(1627) <223> Avian pneumovirus isolate 1b fusion protein mRNA, complete cds <400> 3 gggacaagtg aaaatgtctt ggaaagtggt actgctattg gtattgctag ctaccccaac 60 gggggggcta gaagaaagtt atctagagga gtcatgcagt actgttacta gaggatacct 120 gagtgttttg aggacaggat ggtatacaaa tgtgttcaca cttgaggttg gagatgtgga 180 aaatctcaca tgtaccgacg ggcccagctt aataagaaca gaacttgaac tgacaaaaaa 240 tgcacttgag gaactcaaga cagtatcagc agatcaattg gcaaaggaag ctaggataat 300 gtcaccaaga aaagcccggt ttgttctggg tgccatagca ttaggtgtgg caactgctgc 360 tgctgtgacg gctggtgtag cgatagccaa gacaattagg ctagaaggag aagtggctgc 420 aatcaagggt gcgctcagga aaacaaatga ggctgtatct acattaggaa atggcgtgag 480 ggtacttgca acagctgtga atgatctcaa ggactttata agtaaaaaat tgacacctgc 540 aataaacagg aacaagtgtg acatctcaga ccttaagatg gcagtgagct ttggacaata 600 caatcggagg ttcctcaatg tggtaagaca gttttctgac aatgcaggta ttacgcctgc 660 aatatctcta gatttaatga ctgacgctga gcttgtaaga gctgtaagca acatgcccac 720 atcttcagga cagatcaatc tgatgcttga gaatcgggca atggtcagaa ggaaaggatt 780 tgggattttg attggagttt atggtagctc tgtggtctat atagtgcagc ttcctatttt 840 cggtgtgata gatacaccgt gttggaaggt gaaggctgct ccattatgtt cagggaaaga 900 cgggaattat gcatgtctct tgcgagagga ccaaggttgg tattgtcaaa atgctggatc 960 cacagtttat tatccaaatg aggaggactg tgaagtaaga agtgatcatg tgttttgtga 1020 cacagcagct gggataaatg tagcaaagga gtcagaagag tgcaacagga atatctcaac 1080 aacaaagtac ccttgcaagg taagtacagg gcgtcaccca ataagcatgg tggccttatc 1140 accactgggt gctttggtag cctgttatga cggtatgagt tgttccattg gaagcaacaa 1200 ggttggaata atcagacctt tggggaaagg gtgttcatac atcagcaatc aagatgctga 1260 cactgttaca attgacaaca cagtgtacca attgagcaaa gttgaaggag aacaacacac 1320 aattaaaggg aagccagtat ctagcaattt tgaccctata gagttccctg aagatcagtt 1380 caacgtagcc ctggatcagg tgtttgaaag tgttgagaag agtcagaatc tgatagacca 1440 gtcaaacaag atattggata gcattgaaaa ggggaatgca ggatttgtca tagtgatagt 1500 cctcattgtc ctgctcatgc tggcagcagt tggtgtgggt gtcttctttg tggttaagaa 1560 gagaaaagct gctcccaaat tcccaatgga aatgaatggt gtgaacaaca aaggatttat 1620 cccttaattt tagttattaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1666 <210> 4 <211> 1636 <212> DNA <213> rhinotracheitis virus <220> <221> CDS <222> (13)...(1629) <223> Turkey rhinotracheitis virus gene for fusion protein (F1 and F2 subunits), complete cds <400> 4 gggacaagta ggatggatgt aagaatctgt ctcctattgt tccttatatc taatcctagt 60 agctgcatac aagaaacata caatgaagaa tcctgcagta ctgtaactag aggttataag 120 agtgtgttaa ggacagggtg gtatacgaat gtatttaacc tcgaaatagg gaatgttgag 180 aacatcactt gcaatgatgg acccagccta attgacactg agttagtact cacaaagaat 240 gctttgaggg agctcaaaac agtgtcagct gatcaagtgg ctaaggaaag cagactatcc 300 tcacccagga gacgtagatt tgtactgggt gcaatagcac ttggtgttgc gacagctgct 360 gccgtaacag ctggtgtagc acttgcaaag acaattagat tagagggaga ggtgaaggca 420 attaagaatg ccctccggaa cacaaatgag gcagtatcca cattagggaa tggtgtgagg 480 gtactagcaa ctgcagtcaa tgacctcaaa gaatttataa gtaaaaaatt gactcctgct 540 attaaccaga acaaatgcaa tatagcagat ataaagatgg caattagttt tggccaaaat 600 aacagaaggt tcctgaatgt ggtgaggcaa ttctctgata gtgcaggtat cacatcagct 660 gtgtctcttg atttaatgac agatgatgaa cttgttagag caattaacag aatgccaact 720 tcatcaggac agattagttt gatgttgaac aatcgtgcca tggttagaag gaaggggttt 780 ggtatattga ttggtgttta tgatggaacg gtcgtttata tggtacaact gcccatattc 840 ggcgtgattg agacaccttg ttggagggtg gtggcagcac cactctgtag gaaagagaaa 900 ggcaattatg cttgtatact gagagaagat caagggtggt actgtacaaa tgctggctct 960 acagcttatt atcctaataa agatgattgt gaggtaaggg atgattatgt attttgtgac 1020 acagcagctg gcattaatgt ggccctagaa gttgaacagt gcaactataa catatcgact 1080 tctaaatacc catgcaaagt cagcacaggt agacaccctg tcagtatggt agccttaacc 1140 cccctagggg gtctagtgtc ttgttatgag agtgtaagtt gctccatagg tagcaataaa 1200 gtagggataa taaaacagct aggcaaaggg tgcacccaca ttcccaacaa cgaagctgac 1260 acgataacca ttgataacac tgtgtaccaa ttgagcaagg ttgtaggcga acagaggacc 1320 ataaaaggag ctccagttgt gaacaatttt aacccaatat tattccctga ggatcagttc 1380 aatgttgcac ttgaccaagt atttgagagt atagatagat ctcaggactt aatagataag 1440 tctaacgact tgctaggtgc agatgccaag agcaaggctg gaattgctat agcaatagta 1500 gtgctagtca ttctaggaat cttcttttta cttgcagtga tatattactg ttccagagtc 1560 cggaagacca aaccaaagca tgattacccg gccacgacag gtcatagcag catggcttat 1620 gtcagttaag ttattt 1636 <210> 5 <211> 1860 <212> DNA <213> pneumovirus <220> <221> CDS <222> (1)...(110) <223> Avian pneumovirus matrix protein (M) gene, partial cds <220> <221> CDS <222> (216)...(1829) <223> Avian pneumovirus fusion glycoprotein (F) gene, complete cds <400> 5 gagttcaggt aatagtggag ttaggggcat acgttcaagc agaaagcata agcagaatct 60 gcaggaactg gagccaccag ggtacgagat atgtcctgaa gtcaagataa acacagagag 120 tacacttacc aaatcacagt aacaatttcg tttttaaccc tctcatagtt attacctagc 180 ttgatattat ttagaaaaaa ttgggacaag tgaaaatgtc ttggaaagtg gtactgctat 240 tggtattgct agctacccca acgggggggc tagaagaaag ttatctagag gagtcatgca 300 gtactgttac tagaggatac ctgagtgttt tgaggacagg atggtataca aatgtgttca 360 cacttgaggt tggagatgtg gaaaatctca catgtaccga cgggcccagc ttaataagaa 420 cagaacttga actgacaaaa aatgcacttg aggaactcaa gacagtatca gcagatcaat 480 tggcaaagga agctaggata atgtcaccaa gaaaagcccg gtttgttctg ggtgccatag 540 cattaggtgt ggcaactgct gctgctgtga cggctggtgt agcgatagcc aagacaatta 600 ggctagaagg agaagtggct gcaatcaagg gtgcgctcag gaaaacaaat gaggctgtat 660 ctacattagg aaatggcgtg agggtacttg caacagctgt gaatgatctc aaggacttta 720 taagtaaaaa attgacacct gcaataaaca ggaacaagtg tgacatctca gaccttaaga 780 tggcagtgag ctttggacaa tacaatcgga ggttcctcaa tgtggtaaga cagttttctg 840 acaatgcagg tattacgcct gcaatatctc tagatttaat gactgacgct gagcttgtaa 900 gagctgtaag caacatgccc acatcttcag gacagatcaa tctgatgctt gagaatcggg 960 caatggtcag aaggaaagga tttgggattt tgattggagt ttatggtagc tctgtggtct 1020 atatagtgca gcttcctatt ttcggtgtga tagatacacc gtgttggaag gtgaaggctg 1080 ctccattatg ttcagggaaa gacgggaatt atgcatgtct cttgcgagag gaccaaggtt 1140 ggtattgtca aaatgctgga tccacagttt attatccaaa tgaggaggac tgtgaagtaa 1200 gaagtgatca tgtgttttgt gacacagcag ctgggataaa tgtagcaaag gagtcagaag 1260 agtgcaacag gaatatctca acaacaaagt acccttgcaa ggtaagtaca gggcgtcacc 1320 caataagcat ggtggcctta tcaccactgg gtgctttggt agcctgttat gacggtatga 1380 gttgttccat tggaagcaac aaggttggaa taatcagacc tttggggaaa gggtgttcat 1440 acatcagcaa tcaagatgct gacactgtta caattgacaa cacagtgtac caattgagca 1500 aagttgaagg agaacaacac acaattaaag ggaagccagt atctagcaat tttgacccta 1560 tagagttccc tgaagatcag ttcaacatag ccctggatca ggtgtttgaa agtgttgaga 1620 agagtcagaa tctgatagac cagtcaaaca agatattgga tagcattgaa aaggggaatg 1680 caggatttgt catagtgata gtcctcattg tcctgctcat gctggcagca gttggtgtgg 1740 gtgtcttctt tgtggttaag aagagaaaag ctgctcccaa attcccaatg gaaatgaatg 1800 gtgtgaacaa caaaggattt atcccttaat tttagttact aaaaaattgg gacaagtgaa 1860 <210> 6 <211> 574 <212> PRT <213> paramyxovirus <220> <223> paramyxovirus F protein hRSV B <400> 6 Met Glu Leu Leu Ile His Arg Leu Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala 1 5 10 15 Ile Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Phe Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro 100 105 110 Gln Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Lys Asn Leu Asn Val Ser 115 120 125 Ile Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asn Asn Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Gln Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Ser Arg Leu Leu Glu Ile Asn Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Ile Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Ile Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Asp Thr Cys Lys 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pneumovirus isolate 1b fusion protein mRNA, complete cds <400> 11 Met Ser Trp Lys Val Val Leu Leu Leu Val Leu Leu Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Gly Gly Leu Glu Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Val Thr 20 25 30 Arg Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe 35 40 45 Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Thr Asp Gly Pro 50 55 60 Ser Leu Ile Arg Thr Glu Leu Glu Leu Thr Lys Asn Ala Leu Glu Glu 65 70 75 80 Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Lys Glu Ala Arg Ile Met 85 90 95 Ser Pro Arg Lys Ala Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile 115 120 125 Arg Leu Glu Gly Glu Val Ala Ala Ile Lys Gly Ala Leu Arg Lys Thr 130 135 140 Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr 145 150 155 160 Ala Val Asn Asp Leu Lys Asp Phe Ile Ser Lys Lys Leu Thr Pro Ala 165 170 175 Ile Asn Arg Asn Lys Cys Asp Ile Ser Asp Leu Lys Met Ala Val Ser 180 185 190 Phe Gly Gln Tyr Asn Arg Arg Phe 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tatgaattgt ttgagcgtat atactaatga aatagcatct gtttgtgcat 840 caataatacc atcattattt aagaattaag aagaagctaa aattcaa 887 <210> 118 <211> 886 <212> DNA <213> human metapneumo virus <400> 118 atggaagtaa gagtggagaa cattcgggca atagacatgt tcaaagcaaa gatgaaaaac 60 cgtataagaa gtagcaagtg ctatagaaat gctacactga tccttattgg attaacagca 120 ctaagtatgg cacttaatat ttttttaatc attgattatg caacattaaa aaacatgacc 180 aaagtggaac actgtgttaa tatgccgccg gtagaaccaa gcaagaagac cccaatgacc 240 tctgcagtag acttaaacac caaacccaat ccacagcagg caacacagtt gaccacagag 300 gactctacat ctttagcagc aaccctagag gaccatccac acacagggac aactccaaca 360 ccagatgcaa cagtctctca gcaaaccaca gacgagcaca caacactgct gagatcaacc 420 aacagacaga ccacccaaac aactgcagag aaaaagccaa ccagagcaac aaccaaaaaa 480 gaaaccacaa ctcgaaccac aagcacagct gcaacccaaa cactcaacac caccaaccaa 540 actagcaatg gaagagaggc aaccacaaca tctgccagat ccagaaacaa tgccacaact 600 caaagcagcg atcaaacaac ccaagcagca gaaccaaact cccaatcaca acatacacag 660 aaaagcacaa caacaacata caacacagac acatcttctc taagtagtta acaaaaaaac 720 tataaaataa ccatgaaaac caaaaaacta gaaaagttaa tttgaactca gaaaggaaca 780 caaacactat atgaattatt tgagcgtata tactaatgaa atagcatctg tttgtgcatc 840 aataatacca tcattattta agaaataaga agaagctaaa attcaa 886 <210> 119 <211> 236 <212> PRT <213> human metapneumo virus <400> 119 Met Glu Val Lys Val Glu Asn Ile Arg Thr Ile Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu Val Leu Ile Gly Ile Thr Thr Leu Ser Ile Ala Leu Asn Ile Tyr 35 40 45 Leu Ile Ile Asn Tyr Lys Met Gln Lys Asn Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Ser Pro Met Glu Ser Ser Arg Glu Thr Pro Thr Val 65 70 75 80 Pro Thr Asp Asn Ser Asp Thr Asn Ser Ser Pro Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Gly Ser Thr Leu Tyr Phe Ala Ala Ser Ala Ser Ser 100 105 110 Pro Glu Thr Glu Pro Thr Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asn Arg Pro Pro 115 120 125 Phe Val Asp Thr His Thr Thr Pro Pro Ser Ala Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Ser Pro Ala Val His Thr Lys Asn Asn Pro 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metapneumo virus <400> 123 Met Glu Val Lys Val Glu Asn Ile Arg Thr Ile Asp Met Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser 20 25 30 Leu Val Leu Ile Gly Ile Thr Thr Leu Ser Ile Ala Leu Asn Ile Tyr 35 40 45 Leu Ile Ile Asn Tyr Lys Met Gln Lys Asn Thr Ser Glu Ser Glu His 50 55 60 His Thr Ser Ser Ser Pro Met Glu Ser Ser Arg Glu Thr Pro Thr Val 65 70 75 80 Pro Thr Asp Asn Ser Asp Thr Asn Ser Ser Pro Gln His Pro Thr Gln 85 90 95 Gln Ser Thr Glu Gly Ser Thr Leu Tyr Phe Ala Ala Ser Ala Ser Ser 100 105 110 Pro Glu Thr Glu Pro Thr Ser Thr Pro Asp Thr Thr Asp Arg Pro Pro 115 120 125 Phe Val Asp Thr His Thr Thr Pro Pro Ser Ala Ser Arg Thr Lys Thr 130 135 140 Ser Pro Ala Val His Thr Lys Asn Asn Pro Arg Ile Ser Ser Arg Thr 145 150 155 160 His Ser Pro Pro Trp Ala Thr Thr Arg Thr Ala Arg Arg Thr Thr Thr 165 170 175 Leu Arg Thr Ser Ser Thr Arg Lys Arg Pro Ser Thr Ala Ser Val Gln 180 185 190 Pro Asp Ile Ser Ala Thr Thr His Lys Asn Glu Glu Ala Ser Pro Ala 195 200 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Leu Leu Asp Val Val Ser Val Lys Thr Arg Cys 725 730 735 Gln Met Thr Ser Leu Leu Asn Gly Asp Asn Gln Ser Ile Asp Val Ser 740 745 750 Lys Pro Val Lys Leu Ser Glu Gly Ile Asp Glu Val Lys Ala Asp Tyr 755 760 765 Ser Leu Ala Ile Lys Met Leu Lys Glu Ile Arg Asp Ala Tyr Lys Asn 770 775 780 Ile Gly His Lys Leu Lys Glu Gly Glu Thr Tyr Ile Ser Arg Asp Leu 785 790 795 800 Gln Phe Ile Ser Lys Val Ile Gln Ser Glu Gly Val Met His Pro Thr 805 810 815 Pro Ile Lys Lys Ile Leu Arg Val Gly Pro Trp Ile Asn Thr Ile Leu 820 825 830 Asp Asp Ile Lys Thr Ser Ala Glu Ser Ile Gly Ser Leu Cys Gln Glu 835 840 845 Leu Glu Phe Arg Gly Glu Ser Met Leu Val Ser Leu Ile Leu Arg Asn 850 855 860 Phe Trp Leu Tyr Asn Leu Tyr Met His Glu Ser Lys Gln His Pro Leu 865 870 875 880 Ala Gly Lys Gln Leu Phe Lys Gln Leu Asn Lys Thr Leu Thr Ser Val 885 890 895 Gln Arg Phe Phe Glu Leu Lys Lys Glu Asn Asp Val Val Asp Leu Trp 900 905 910 Met Asn Ile Pro Met Gln Phe Gly Gly Gly Asp Pro Val Val Phe Tyr 915 920 925 Arg Ser Phe Tyr Arg Arg 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aagtaataag aactggttca atcttgtgta ggtcattggg taaattagtt 540 tttgttgtat catcatatgg atgtatagtc aagagcaaca aaagcaaaag agtgagcttc 600 ttcacataca atcaactgtt aacatggaaa gatgtgatgt taagtagatt caatgcaaat 660 ttttgtatat gggtaagcaa cagtctgaat gaaaatcaag aagggctagg gttgagaagt 720 aatctgcaag gcatattaac taataagcta tatgaaactg tagattatat gcttagttta 780 tgttgcaatg aaggtttctc acttgtgaaa gagttcgaag gctttattat gagtgaaatt 840 cttaggatta ctgaacatgc tcaattcagt actagattta gaaatacttt attaaatgga 900 ttaactgatc aattaacaaa attaaaaaat aaaaacagac tcagagttca tggtaccgtg 960 ttagaaaata atgattatcc aatgtacgaa gttgtactta agttattagg agatactttg 1020 agatgtatta aattattaat caataaaaac ttagagaatg ctgctgaatt atactatata 1080 tttagaatat tcggtcaccc aatggtagat gaaagagatg caatggatgc tgtcaaatta 1140 aacaatgaaa tcacaaaaat ccttaggtgg gagagcttga cagaactaag aggggcattc 1200 atattaagga ttatcaaagg atttgtagac aacaacaaaa gatggcccaa aattaaaaac 1260 ttaaaagtgc ttagtaagag atggactatg tacttcaaag caaaaagtta ccccagtcaa 1320 cttgaattaa gcgaacaaga ttttttagag cttgctgcaa tacagtttga acaagagttt 1380 tctgtccctg aaaaaaccaa ccttgagatg gtattaaatg ataaagctat atcacctcct 1440 aaaagattaa tatggtctgt gtatccaaaa aattacttac ctgagaaaat aaaaaatcga 1500 tatctagaag agactttcaa tgcaagtgat agtctcaaaa caagaagagt actagagtac 1560 tatttgaaag ataataaatt cgaccaaaaa gaacttaaaa gttatgttgt taaacaagaa 1620 tatttaaatg ataaggatca tattgtctcg ctaactggaa aagaaagaga attaagtgta 1680 ggtagaatgt ttgctatgca accaggaaaa cagcgacaaa tacaaatatt ggctgaaaaa 1740 ttgttagctg ataatattgt accttttttc ccagaaacct taacaaagta tggtgatcta 1800 gatcttcaga gaataatgga aatcaaatcg gaactttctt ctattaaaac tagaagaaat 1860 gatagttata ataattacat tgcaagagca tccatagtaa cagatttaag taagttcaac 1920 caagccttta ggtatgaaac tacagcgatc tgtgcggatg tagcagatga actacatgga 1980 acacaaagcc tattctgttg gttacatctt atcgtcccta tgacaacaat gatatgtgcc 2040 tatagacatg caccaccaga aacaaaaggt gaatatgata tagataagat agaagagcaa 2100 agtggtttat atagatatca tatgggtggt attgaaggat ggtgtcaaaa actctggaca 2160 atggaagcta tatctctatt agatgttgta tctgtaaaaa cacgatgtca aatgacatct 2220 ttattaaacg gtgacaacca atcaatagat gtaagtaaac cagttaagtt atctgagggt 2280 ttagatgaag tgaaagcaga ttatagcttg gctgtaaaaa tgttaaaaga aataagagat 2340 gcatacagaa atataggcca taaacttaaa gaaggggaaa catatatatc aagagatctt 2400 cagtttataa gtaaggtgat tcaatctgaa ggagtaatgc atcctacccc tataaaaaag 2460 atcttaagag tgggaccatg gataaacaca atattagatg acattaaaac cagtgcagag 2520 tcaataggga gtctatgtca ggaattagaa tttagggggg aaagcataat agttagtctg 2580 atattaagga atttttggct gtataattta tacatgcatg aatcaaagca acacccccta 2640 gcagggaagc agttattcaa acaactaaat aaaacattaa catcagtgca gagatttttt 2700 gaaataaaaa aggaaaatga agtagtagat ctatggatga acataccaat gcagtttgga 2760 ggaggagatc cagtagtctt ctatagatct ttctatagaa ggacccctga ttttttaact 2820 gaagcaatca gtcatgtgga tattctgtta agaatatcag ccaacataag aaatgaagcg 2880 aaaataagtt tcttcaaagc cttactgtca atagaaaaaa atgaacgtgc tacactgaca 2940 acactaatga gagatcctca agctgttggc tcagagcgac aagcaaaagt aacaagtgat 3000 atcaatagaa cagcagttac cagcatctta agtctttctc caaatcaact tttcagcgat 3060 agtgctatac actacagtag aaatgaagaa gaggtcggaa tcattgctga caacataaca 3120 cctgtttatc ctcatggact gagagttttg tatgaatcat taccttttca taaagctgaa 3180 aaagttgtga atatgatatc aggaacgaaa tccataacca acttattaca gagaacatct 3240 gctattaatg gtgaagatat tgacagagct gtatccatga tgctggagaa cctaggatta 3300 ttatctagaa tattgtcagt agttgttgat agtatagaaa ttccaaccaa atctaatggt 3360 aggctgatat gttgtcagat atctagaacc ctaagggaga catcatggaa taatatggaa 3420 atagttggag taacatcccc tagcatcact acatgcatgg atgtcatata tgcaactagc 3480 tctcatttga aagggataat cattgaaaag ttcagcactg acagaactac aagaggtcaa 3540 agaggtccaa agagcccttg ggtagggtcg agcactcaag agaaaaaatt agttcctgtt 3600 tataacagac aaattctttc aaaacaacaa agagaacagc tagaagcaat tggaaaaatg 3660 agatgggtat ataaagggac accaggttta agacgattac tcaataagat ttgtcttgga 3720 agtttaggca ttagttacaa atgtgtaaaa cctttattac ctaggtttat gagtgtaaat 3780 ttcctacaca ggttatctgt cagtagtaga cctatggaat tcccagcatc agttccagct 3840 tatagaacaa caaattacca 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agaatgctac atactcttaa cactaggcca ccacaacaat 5580 ttaccctgcc atggagaaat acaaaattct aagatgaaaa tagcagtgtg taatgatttt 5640 tatgctgcaa aaaaacttga caataaatct attgaagcca actgtaaatc acttttatca 5700 gggctaagaa taccgataaa taagaaagaa ttaaatagac agagaaggtt attaacacta 5760 caaagcaacc attcttctgt agcaacagtt ggaggtagca aggtcataga gtctaaatgg 5820 ttaacaaaca aggcaaacac aataattgat tggttagaac atattttaaa ttctccaaaa 5880 ggtgaattaa attatgattt ttttgaagca ttagaaaata cttaccctaa tatgattaaa 5940 ctaatagata atctagggaa tgcagagata aaaaaactga tcaaagtaac tggatatatg 6000 cttgtaagta aaaaatga 6018 <210> 335 <211> 6018 <212> DNA <213> human metapneumo virus <400> 335 atggatcctc ttaatgaatc cactgttaat gtctatctcc ctgattcgta ccttaaagga 60 gtaatttctt ttagtgaaac taatgcaatt ggttcatgtc tcttaaaaag accttactta 120 aaaaatgaca acactgcaaa agttgccata gagaatcctg ttattgagca tgtgagactc 180 aaaaatgcag tcaattctaa aatgaaaata tcagattaca aggtagtaga gccagtaaac 240 atgcaacatg aaataatgaa gaatgtacac agttgtgagc tcacactatt gaaacagttt 300 ttaacaagga 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ctagggaaga tgcttatgcc tactataaaa ggtcaaaaaa ctgatcagtt cttaaataag 4200 agagaaaact atttccatgg aaataattta attgaatctt tatctgcagc acttgcatgc 4260 cactggtgtg gaatattaac agaacagtgt gtagaaaaca atatctttag gaaagactgg 4320 ggtgatgggt tcatatcaga tcatgccttc atggatttca agatatttct atgtgtattt 4380 aaaaccaaac ttttatgtag ttggggatcc caagggaaaa atgtaaaaga tgaagatata 4440 atagatgaat ccattgacaa attattaaga attgacaaca ctttttggag aatgttcagc 4500 aaagtcatgt ttgaatcaaa ggtcaaaaaa agaataatgt tatatgatgt aaaattccta 4560 tcattagtag gttatatagg atttaaaaac tggtttatag agcagttaag agtagtagaa 4620 ttgcatgaag tgccctggat tgtcaatgct gaaggggagc tagttgaaat taaaccaatc 4680 aaaatttatt tgcagttaat agaacaaagt ctatctttaa gaataactgt tttgaattat 4740 acagacatgg cacatgctct tacacgatta attaggaaga aattgatgtg tgataatgca 4800 ctcttcaatc caagttcatc accaatgttt agtctaactc aagttatcga tcctacaaca 4860 cagctagact attttcctaa ggtgatattt gaaaggttaa aaagttatga taccagttca 4920 gactacaaca aagggaagtt aacaagaaat tacatgacat tattaccatg gcagcacgta 4980 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caacttgata ttatcctata tggagatgag caaaactcct 420 gcatctctaa tcaacaacct aaagaaacta ccaagggaaa aactgaagaa attagcaaga 480 ttaataattg atttatcagc aggaactgac aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtaa 564 <210> 345 <211> 564 <212> DNA <213> human metapneumo virus <400> 345 atgtctcgca aagctccatg caaatatgaa gtacggggca agtgcaacag gggaagtgag 60 tgcaaattca accacaatta ctggagctgg cctgataggt atttattgtt aagatcaaat 120 tatctcttga atcagctttt aagaaacact gataaggctg atggtttgtc aataatatca 180 ggagcaggta gagaagatag gactcaagac tttgttcttg gttctactaa tgtggttcaa 240 gggtacattg ataacaatca aggaataaca aaggctgcag cttgctatag tctacataac 300 ataataaaac agctacaaga aatagaagta agacaggcta gagataataa gctttctgac 360 agcaaacatg tggcacttca caacttgata ttatcctata tggagatgag caaaactcct 420 gcatccctga ttaataacct aaagaaacta ccaagagaaa aactgaagaa attagcgaaa 480 ttaataattg atttatcagc aggaactgat aatgactctt catatgcctt gcaagacagt 540 gaaagcacta atcaagtgca gtaa 564 <210> 346 <211> 71 <212> PRT <213> human metapneumo 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cttcaacagg aagcaaagca 720 gaaagtttgt ttgtaaatat atttatgcaa gcttatggag ctggccaaac actgctaagg 780 tggggtgtca ttgccagatc atccaacaac ataatgctag ggcatgtatc tgtgcaatct 840 gaattgaagc aagttacaga ggtttatgac ttggtgagag aaatgggtcc tgaatctggg 900 cttttacatc taagacaaag tccaaaggca gggctgttat cattggccaa ttgccccaat 960 tttgctagtg ttgttcttgg caatgcttca ggtctaggca taatcggaat gtacagaggg 1020 agagtaccaa acacagagct attttctgca gcagaaagtt atgccagaag cttaaaagaa 1080 agcaataaaa tcaacttctc ttcgttaggg cttacagatg aagaaaaaga agctgcagaa 1140 cacttcttaa acatgagtgg tgacaatcaa aatgattatg agtaa 1185 <210> 373 <211> 1185 <212> DNA <213> human metapneumo virus <400> 373 atgtctcttc aagggattca cctaagtgat ctgtcatata aacatgctat attaaaagag 60 tctcaataca caataaaaag agatgtaggc accacaactg cagtgacacc ttcatcattg 120 cagcaagaga taacactttt gtgtggagag attctttaca ctaaacatac tgattacaaa 180 tatgctgcag agatagggat acaatatatt tgcacagctc taggatcaga aagagtacaa 240 cagattttaa gaaattcagg tagtgaggtt caggtggttc taaccaagac atactcttta 300 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Trp Gly Cys Leu His 165 170 175 Pro <210> 385 <211> 177 <212> PRT <213> human metapneumo virus <400> 385 Met Lys Thr Leu Asp Val Ile Lys Ser Asp Gly Ser Ser Glu Thr Cys 1 5 10 15 Asn Gln Leu Lys Lys Ile Ile Lys Lys His Ser Gly Lys Leu Leu Ile 20 25 30 Ala Leu Lys Leu Ile Leu Ala Leu Leu Thr Phe Phe Thr Val Thr Ile 35 40 45 Thr Val Asn Tyr Ile Lys Val Glu Asn Asn Leu Gln Ala Cys Gln Leu 50 55 60 Lys Asn Glu Ser Asp Lys Lys Asp Thr Lys Leu Asn Thr Thr Ser Thr 65 70 75 80 Thr Ile Arg Pro Ile Pro Asp Leu Asn Ala Val Gln Tyr Leu Lys Arg 85 90 95 Leu Ile Gln Lys His Thr Asn Phe Val Ile Lys Asp Arg Asp Thr Cys 100 105 110 Trp Arg Ile His Thr Asn Gln Cys Thr Asn Ile Lys Ile Tyr Lys Phe 115 120 125 Leu Cys Phe Gly Phe Met Asn Ser Thr Asn Thr Asp Cys Glu Glu Leu 130 135 140 Thr Val Leu Cys Asp Lys Lys Ser Lys Thr Met Thr Glu Lys His Arg 145 150 155 160 Lys Ala Glu Cys His Cys Leu His Thr Thr Glu Trp Trp Cys Tyr Tyr 165 170 175 Leu <210> 386 <211> 552 <212> DNA <213> human metapneumo virus <400> 386 atgataacat tagatgtcat taaaagtgat gggtcttcaa aaacatgtac tcacctcaaa 60 aaaataatta aagaccactc tggtaaagtg cttattgtac ttaagttaat attagcttta 120 ctaacatttc tcacagtaac aatcaccatc aattatataa aagtggaaaa caatctgcaa 180 atatgccagt caaaaactga atcagacaaa aaggactcat catcaaatac cacatcagtc 240 acaaccaaga ctactctaaa tcatgatatc acacagtatt ttaaaagttt gattcaaagg 300 tatacaaact ctgcaataaa cagtgacaca tgctggaaaa taaacagaaa tcaatgcaca 360 aatataacaa catacaaatt tttatgtttt aaatctgaag acacaaaaac caacaattgt 420 gataaactga cagatttatg cagaaacaaa ccaaaaccag cagttggagt gtatcacata 480 gtagaatgcc attgtatata cacagttaaa tggaagtgct atcattaccc aaccgatgaa 540 acccaatcct aa 552 <210> 387 <211> 540 <212> DNA <213> human metapneumo virus <400> 387 atgataacat tagatgtcat taaaagtgat gggtcttcaa aaacatgtac tcacctcaaa 60 aaaataatca aagaccattc tggtaaagtg cttattgcac ttaagttaat attagcttta 120 ctaacatttt tcacaataac aatcactata aattacataa aagtagaaaa caatctacaa 180 atatgccagt caaaaactga atcagacaaa gaagactcac catcaaatac cacatccgtc 240 acaaccaaga ctactctaga ccatgatata acacagtatt ttaaaagatt aattcaaagg 300 tatacagatt ctgtgataaa caaggacaca tgctggaaaa taagcagaaa tcaatgcaca 360 aatataacaa catataaatt tttatgcttt aaacctgagg actcaaaaat caacagttgt 420 gatagactga cagatctatg cagaaacaaa tcaaaatcag cagctgaagc atatcataca 480 gtagaatgcc attgcatata cacaattgag tggaagtgct atcaccaccc aatagattaa 540 <210> 388 <211> 534 <212> DNA <213> human metapneumo virus <400> 388 atgaaaacat tagatgtcat aaaaagtgat ggatcctcag aaacgtgtaa tcaactcaaa 60 aaaataataa aaaaacactc aggtaaagtg cttattgcac taaaactgat attggcctta 120 ctgacatttt tcacagcaac aatcactgtc aactatataa aagtagaaaa caatttgcag 180 gcatgtcaac caaaaaatga atcagacaaa aaggtcacaa agccaaatac cacatcaaca 240 acaatcagac ccacacccga tccaactgta gtacatcatt tgaaaaggct gattcagaga 300 cacaccaact ctgtcacaaa agacagcgat acttgttgga gaatacacaa gaatcaacgt 360 acaaatataa aaatatacaa gttcttatgc tctgggttca caaattcaaa aggtacagat 420 tgtgaggaac caacagccct atgcgacaaa aagttaaaaa ccatagtaga aaaacataga 480 aaagcagaat gtcactgtct 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Claims (26)

  1. 배지 1밀리리터당 20밀리유닛보다 낮은 트립신 비활성도(specific activity)를 보유한 배지 중에서 포유류 메타뉴모바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 포유류 메타뉴모바이러스의 증식 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 인간 메타뉴모바이러스인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지는 외부로부터 트립신을 첨가하지 않은 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지는 혈청을 첨가하지 않은 것인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질의 절단 부위 내 RQSR 절단 모티프는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질은 서열번호 314에 대하여 하나 이상의 추가 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 RQSR 절단 모티프 중의 아미노산 치환은 세린이 프롤린으로 치환되어 RQPR 서열이 생성되는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 F 단백질 중의 추가 아미노산 치환은 E93K, Q1OOK, E92K, E93V, I95S, E96K, Q94K, Q94H, I95S, N97K 또는 N97H 중 하나 이상인 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 F 단백질 중의 추가 아미노산 치환은 E93K인 것인 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 추가 아미노산 치환은 RQSR 모티프 중의 아미노산 치환을 안정화시키는 것인 방법.
  11. 트립신 부재하에서 성장할 수 있는, 분리된 포유류 메타뉴모바이러스.
  12. 제11항에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 인간 메타뉴모바이러스인 것인 바이러스.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질의 절단 부위 중의 RQSR 절단 모티프는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것인 바이러 스.
  14. 제13항에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질은 서열번호 314에 대하여 하나 이상의 추가 아미노산 치환을 포함하는 것인 바이러스.
  15. 제13항에 있어서, 상기 RQSR 절단 모티프 중의 아미노산 치환은 세린이 프롤린으로 치환되어 RQPR 서열이 생성되는 것인 바이러스.
  16. 제14항에 있어서, 상기 F 단백질 중의 추가 아미노산 치환은 E93K, Q1OOK, E92K, E93V, 195S, E96K, Q94K, Q94H, I95S, N97K 또는 N97H 중 하나 이상인 것인 바이러스.
  17. 제14항에 있어서, 상기 추가 아미노산 치환은 RQSR 모티프 중의 아미노산 치환을 안정화시키는 것인 바이러스.
  18. 제16항에 있어서, 상기 F 단백질 중의 추가 아미노산 치환은 E93K인 것인 바이러스.
  19. 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질을 암호화하는 분리 핵산으로서, 상기 F 단백질은 S101P 아미노산 치환, 및 E93K, Q1OOK, E92K, E93V, I95S, E96K, Q94K, Q94H, I95S, N97K 또는 N97H의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 핵산.
  20. 제19항에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 인간 메타뉴모바이러스인 핵산.
  21. 트립신 부재하에서 포유류 메타뉴모바이러스의 안정한 성장을 지원하는 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질을 동정하는 방법으로서,
    (a) 2계대 이상 동안 트립신 부재하에서 포유류 메타뉴모바이러스를 성장시키는 단계로서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 F 단백질의 절단 부위 중에 RQPR 모티프를 포함하는 것인 단계; 및
    (b) 합포체 형성을 측정하는 단계를 포함하며,
    여기서, 단계 (a) 전에 포유류 메타뉴모바이러스에 의한 합포체 형성에 비해 증가된 합포체 형성은, 상기 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질이 트립신 부재하에서 포유류 메타뉴모바이러스의 안정한 성장을 지원하는 추가 아미노산 치환을 획득하였음을 의미하는 방법.
  22. 트립신 부재하에서 포유류 메타뉴모바이러스의 안정한 성장을 지원하는 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질을 동정하는 방법으로서,
    (a) 2계대 이상 동안 트립신 부재하에서 포유류 메타뉴모바이러스를 성장시키는 단계로서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 F 단백질의 절단 부위 중에 RQPR 모티프를 포함하는 것인 단계; 및
    (b) F 단백질의 절단을 측정하는 단계를 포함하며,
    여기서, 단계 (a) 전에 포유류 메타뉴모바이러스에 의한 F 단백질 절단에 비해 증가된 F 단백질 절단은, 상기 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질이 트립신 부재하에서 포유류 메타뉴모바이러스의 안정한 성장을 지원하는 추가 아미노산 치환을 획득하였음을 의미하는 방법.
  23. F 단백질의 트립신 비의존적 절단을 증가시키는 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질 변이체를 동정하는 방법으로서,
    (a) 2계대 이상 동안 트립신 부재하에서 포유류 메타뉴모바이러스를 성장시키는 단계; 및
    (b) F 단백질의 절단 효율을 측정하는 단계를 포함하며,
    여기서, 상기 F 단백질은 절단 부위에 RQPR 모티프를 포함하며, 상기 F 단백질의 절단 효율의 증가는 상기 F 단백질이, F 단백질의 트립신 비의존적 절단을 증가시키는 돌연변이를 획득하였음을 의미하는 방법.
  24. 포유류 메타뉴모바이러스의 F 단백질의 절단을 촉매하는 프로테아제를 동정하는 방법으로서,
    (a) F 단백질과 시험용 프로테아제를 접촉시키는 단계; 및
    (b) F 단백질의 절단 발생 여부를 측정하는 단계를 포함하며,
    여기서, 상기 F 단백질은 절단 부위에 RQPR 모티프를 포함하고, 상기 F 단백질의 절단 발생은 상기 프로테아제가 F 단백질의 절단을 촉매한 것임을 의미하는 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 인간 메타뉴모바이러스인 것인 방법.
  26. 제21항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 포유류 메타뉴모바이러스는 S1O1P 돌연변이를 보유하는 것인 방법.
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