PT95124B - Processo de preparacao de sistemas de expressao de virus com arn de cadeia negativa recombinante e de vacinas - Google Patents

Processo de preparacao de sistemas de expressao de virus com arn de cadeia negativa recombinante e de vacinas Download PDF

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Description

MEMORIA DESCRITIVA
1. INTRODUÇÃO
O presente invento refere-se a moldes de ARN virai de cadeia negativa, recombinantes, que podem ser usados para expre£ sar produtos de genes heterôlogos em sistemas de células hospe deiras apropriados e/ou construir vírus recombinantes que expressam, empacotam, e/ou apresentam o produto de genes heterôlogos. Os produtos de expressão e os vírus quiméricos podem ser usados, vantajosamente, em formulações de vacinas.
O invento ê demonstrado por meio de exemplos, nos quais foram construídos moldes de ARN do vírus da gripe, recombinantes, contendo sequências que codificam um gene heterõlogo na polaridade negativa. Estes moldes recombinantes, quando combinados com ARN polimerase dirigida a ARN virai purificado, são infecciosos, replicam-se em células hospedeiras apropriadas, e expressam o produto do gene heterõlogo com níveis elevados. Adicionalmente, o gene heterõlogo foi expresso e empacotado pelos vírus recombinantes da gripe resultantes.
. ANTECEDENTES DO INVENTO
Têm sido construídos, por engenharia genética, vários vírus de ADN, para dirigir a expressão de proteínas heterõIogas em sistemas de células hospedeiras (e.g., vírus vacinia, baculovit rus, etc.). Recentemente foram feitos avanços similares com vírus de ARN de cadeia positiva (e.g., poliovírus) . Pensa-se que os produtos de expressão destas construções, i.e, o produto de gene heterõlogo ou o vírus quimérico que exprime o produ to de gene heterõlogo, são potencialmente úteis em formulações de vacinas (vacinas quer de sub-unidades, quer do vírus inteiro) . Uma desvantagem para o uso dos vírus, tais como o vacinia, na construção de vírus recombinantes ou quiméricos, para uso em vacinas, ê a falta de variação nos seus epitopos principais. Esta falta de variabilidade nas estirpes virais coloca limitações estritas ao uso repetido de vacina quimérica, jã que variações múltiplas vão gerar resistência do hospedeiro â estirpe, de modo que o vírus inoculado não conseque infectar o hos71 470
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pedeiro. A inoculação de um indivíduo resistente com vacinia quimérica não irá, por isso, induzir estimulação imunitária.
Em constraste, o vírus da gripe, um vírus de ARN de cadeia negativa, apresenta uma larga variabilidade dos seus epitopos principais. De facto, foram identificados milhares de vari. antes da gripe; evoluindo cada estirpe por deriva (drift) anti genica. Os vírus de cadeia negativa, tais como.os da gripe, seriam candidatos atraentes para a construção de vírus quimérg cos para uso em vacinas, porque a sua variabilidade genética permite a construção de um vasto reportõrio de formulações de vacinas que estimulam à imunidade sem o risco do desenvolvimen to de tolerância. No entanto, a realização deste objectivo tem sido impedida pelo facto de, até agora, não ter sido possível construir partículas de ARN de cadeia negativa recombinantes ou quiméricas que sejam infecciosas.
2.1. O VlRUS DA GRIPE
As famílias de vírus contendo ARN de cadeia simples do genoma de sentido negativo com envelope, são classificadas em grupos tendo genomas não segmentados (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae), ou aqueles que têm genomas segmentados (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae e Arenaviridae) . A família Orthomyxoviridae, descrita em detalhe abaixo, e aqui usada nos exemplos, somente contém os vírus da gripe tipos A, B e C.
Os viriões da gripe consistem num núcleo interno de ribonucleoproteína (uma nucleocãpside helicoidal) que contém o genoma de ARN de cadeia simples, e num invólucro lipoproteico reves tido interiormente por uma matriz proteica (M) . O genoma segmentado da gripe A consiste em oito moléculas (sete para a gri. pe C) de ARN de cadeia simples, linear, de polaridade negativa, que codificam dez polipéptidos, incluindo as proteínas da ARN polimerase dirigida a ARN (PB2, PBl e PA) e a nucleoproteína (NP) que forma a nucleocãpside; as proteínas da matriz (Ml, M2) ; duas glicoproteínas de superfície que se projectam do invólucro lipoproteico: hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA); e proteí^ nas não estruturais cuja função ê desconhecida (NS1 e NS2) . A
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-5transcrição e replicação do genoma ocorre no núcleo e a montagem ocorre via budding na membrana plasmãtica. Os vírus podem reassociar genes durante infecções mistas.
O virus da gripe adsorve-se, através da HA, a sialioligo^ sacarido^ glicolípidos e glicoproteínas da membrana celular. A seguir ã endocitose do virião, ocorre uma mudança conformado— nal na molécula da HA dentro do endossoma que facilita a fusão da membrana, desencadeando, assim, o desrevestimento, a nucleocápside migra para o núcleo onde o ARNm ê transcrito, como acontecimento inicial, essencial, na infecção. O ARNm virai é transcrito por um mecanismo único, no qual a endonuclease virai cliva o terminal 5' de topo (capped) a partir de ARN celulares heterõlogos que servem então, como iniciadores para a transcri ção de moldes de ARN virai pela transcriptase virai. Os transcritos terminam em sítios 15 a 22 bases antes dos extremos dos seus moldes, onde sequências oligo (U) actuam como sinais para a adição independente de molde de tractos poli(A). Das oito moléculas de ARNm assim produzidas, seis são mensagens monocis^ trõnicas que são traduzidas directamente nas proteínas que representam HA, NA, NP e as proteínas da polimerase virai PB2,
PBl e PA. Os outros dois transcritos sofrem união, originando, cada um, dois ARNm que são traduzidos em diferentes estruturas de leitura, para produzirem Ml, M2, NSl e NS2. Por outras palavras, os oito ARNm codificam dez proteínas: oito estruturais e duas não estruturais. Um sumário dos genes do vírus da gripe e das suas proteínas produto ê mostrado na tabela I, abai xo.
TABELA I
Segmentos de ARN do genoma do vírus da gripe e atribuição da codificação3
Comprimen Polipép Comprimen to^ (Núcleo tidoC co to^ (AmiSegmento tidos)dificado no-Ácidos)
Moléculas
Por Virião Comentários
2341
PB2
759
30-60 Ccrnponente da ARN transcriptase; ligação do topo do ARN da célula hospedeira
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Segmento Comprimen Polipéjo tob (Nucled tidoc co Comprimen toa (Amino- Ac idos) Moléculas Por Viri- ão Comentários
tidos) dificado
2 2341 PB1 757 30-60 componente da ARN tran£ criptase; iniciação da transcrição; actividade de endonuclease?
3 2233 PA 716 30-60 componente da ARN trans criptase; alongamento de cadeias de ARNm?
4 1778 HA 566 500 trímero de Hemaglutinina; glicoproteína do invólucro; medeia a ligação a células
5 1565 NP 498 1000 Nucleoproteína; associada com ARN; compo nenté éstrutu- ral da ARN transcriptase
6 1413 NA 454 100 Neuraminidase; tetrâmero; glicoproteína do invólucro
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Segmentos de ARN do genoma do vírus da gripe e atribuição da codificação3
Segmento Comprimen tob (Nucleótidos) Polipejo tidoc co dificado Comprimen to^ (Amino-Ácidos) Moléculas por Viri- ão 1 Comentários
7 1027 M1 252 3000 Proteína da matriz; reves te o interior do invólucro
M2 96 ?9 Proteína estrutural na membrana pias mãtica; ARNm unido Proteína não identificada
8 890 NS^ 230 Proteína não estru tural; função desconhecida
NS2 121 Proteína não estrutural; função desconhecida; ARNm unido
a Adaptado de R.A. Lamb and P. W. Choppin (1983), Reproduzido
do Annual Review of Biochemistry, Volume 52, 467-506. b Para a estirpe A/PR/8/34 c Determinado por aproximações bioquímicas e genéticas α Determinado por análise de sequência de nucleõtido e sequenciação de proteínas.
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A seguir à transcrição, a replicação do genoma do vírus é o segundo acontecimento essencial na infecção por vírus de ARN de cadeia negativa. Tal como com outros vírus de ARN de cadeia negativa, a replicação do genoma do vírus da gripe ê mediada por proteínasespecíficas do vírus. Ê considerado como hipótese que a maior parte ou todas as proteínas virais que transcrevem os segmentos de ARNm do vírus da gripe, também realizam a sua replicação. Todos os segmentos de ARN virai têm terminais 3’ e 5' comuns, presumivelmente para permitir que o aparelho de sín tese de ARN reconheça cada segmento com igual eficiência. O me canismo que regula os usos alternativos (i.e. transcrição ou replicação) do mesmo complemento de proteínas (PB2, PBl, PA e NP) não foi claramente identificado, mas parece envolver a abun dância de formas livres de uma ou mais pro,teínas de nucleocãpsi^ de, em particular a NP. O núcleo parece ser o sítio da replicação do ARN do vírus, tal como ê o sítio para a transcrição.
Os primeiros produtos da síntese do ARN replicativo são cópias complementares (i.e. polaridade mais) de todos os segmen tos de ARN do genoma do vírus da gripe (ARNc). Estas cópias de cadeia mais (anti-genomas), diferem dos transcritos de ARNm de cadeia mais na estrutura dos seus terminais. Ao contrário dos transcritos de ARNm, os ARNc anti-genõmicos não têm topos nem são metilados nos terminais 5*, e não estão truncados nem poliadenilados nos terminais 3'. Os ARNc são co-terminais com os seus moldes de cadeia negativa e contêm toda a informação genética de cada segmento genõmico de ARN na forma complementar. Os ARNc servem de moldes para a síntese de ARN genõmicos de cadeia negativa.
Os gencmas de cadeia negativa do vírus da gripe (ARNv) e anti-genómicos (ARNc) estão sempre envoltos por proteínas da núcleo cápside; as únicas espécies de ARN que não são envolvidas pela nucleocápside são os ARNm dos vírus. Em contraste com os outros vírus de ARN com envelope, a montagem da nucleocápside parece ocorrer no núcleo em vez de ocorrer no citoplasma. O núcleo amadurece por budding a partir da superfície apical da célula incorporando a proteína M no lado citoplasmãtico ou superfície interior do invólucro de budding. A HA e a NA ficam glicosiladas
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-9e são incorporadas no invólucro lipídico. Em células permissivas, a HA ê, eventualmente, clivada , mas as duas cadelas resultantes permanecem unidas por ligações dissulfureto.
Não é conhecido o mecanismo pelo qual cada um dos oito ARN genómicos virais ê seleccionado para incorporação em cada novo virião. Partículas de Interferência defectiva (DI) são produzidas frequentemente, especialmente a seguir a infecção ccxn multiplicidade elevada.
2.2. ARN POLIMERASE DIRIGIDA A ARN
As ARN polimerases dirigidas a ARN, de vírus de animais, têm sido extensivamente estudadas relativamente a muitos aspec tos da estrutura proteica e a condições de reacção. No entanto, os elementos do molde de ARN que promovem a expressão óptima pela polimerase só puderam ser estudados por inferência, usan do sequências de ARN virai jã existentes. Esta análise de promotores tem interesse, jã que não ê conhecido o modo como uma polimerase virai reconhece os ARN virais, específicos, de entre os muitos ARN codificados pelo hospedeiro, encontrados numa cê lula infectada.
Vírus de animais contendo ARN genómico de sentido mais podem ser replicados quando ê introduzido ARN derivado de plasmídeo nas células, por transfecção (por exemplo Racaniello et al., 1981, Science 214:916-919; Levis, et al., 1986, Cell 44:137-145). No caso de poliovírus, a polimerase purificada replica um ARN do genoma em reacções in vitro, e quando esta preparação ê tran£ fectada para células, ê infecciosa (Kaplan et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:8424-8428). No entanto, os elementos do molde que servem como promotores da transcrição para a poliraerase codificada pelos poliovírus são desconhecidos, jã que até mesmo os homopolímeros de ARN podem ser copiados (ward, et al., 1988, J. Virol. 62:558-562). Foram, também, usados trans; critos de SP6 para se produzirem ARN de interferência defectivos (DI), modelo, para genomas virais de Sindbis. Quando o ARN é introduzido em células infectadas, é replicado e empacotado. Mostrou-se que as sequências de ARN que são responsáveis quer pelo reconhecimento da polimerase virai de Sindbis, quer pelo
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empacotamento do genoma em partículas virais, estavam dentro dos 162 nucleõtidos (nt) do terminal 5' e dos 19 nt do terminal 3' do genoma (Levis, et al., 1986, Cell 44:137-145). No caso de vírus do mosaico da cevadinha (BMV), um vírus de plantas, de ARN de cadeia positiva, usaram-se transcritos de SP6 para identificar o promotor como um terminal 3' de 134 nt, idêntico a ARNt (Dreher e Hall, 1988, J. Mol. Biol. 201:31-40). Mostrou -se que o reconhecimento e síntese da polimerase são dependentes da sequência e das caracteristicas secundárias (Dreher, et al., 1984, Nature 311:171-175).
Os vírus de ARN de sentido negativo têm-se mostrado refrac tãriosao estudo das caracteristicas de sequência da replicase.
A polimerase purificada do vírus da estomatite vesicular, sõ ê activa em transcrição quando estão incluídos, como moldes, comple xos de ribonucleoproteína derivados de vírus (De e Banerjee, 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun. 126: 40-49; Emerson e Yu, 1975, J. ViroL, 15: 1348-1356; Naito, e Ishihama, 1976, J. Biol Chem. 251: 4307-4314) . Foram reconstituídas RNP a partir de ARN nu , de partículas VSV DI, usando extractos de células infectadas como fonte de proteínas. Estas RNP foram, então, replicadas quando adicionadas de novo a células infectadas (Mirakhur e Peluso, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 7511-7515). Relativamente aos vírus da gripe foi descrito, recentemente, que o ARN nu, purificado a partir de vírus, foi usado para reconstituir RNP. As proteínas da nucleocápside e da polimerase foram purificadas por gel e renaturadas no ARN virai, usando tioredo xina (Szewczyk, et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85: 7907-7911) . No entanto, estes autores não mostraram que a acti. vidade da preparação era específica para o ARN virai da gripe, nem analisaram os sinais que promovem a transcrição.
No decurso da infecção pelo vírus da gripe, a polimerase catalisa três actividades de transcrição distintas. Estas incluem a síntese de (a) ARNm sub-genómico, que contêm um topo em 5 ’ e uma cauda poli-A em 3*; (b) uma cadeia mais, de compri^ mento total ou anti-genoma (ARNc) copiada do genoma de ARN; e (c) ARNv sintetizado a partir de ARNc de comprimento total (re visto em Ishihama e Nagata, 1988, CRC Crit. Rev. Biochem. 23:
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27-76; e Krug, Transcription and Replication of influenza viruses Em; Genetics of influenza viruses Ed., Palese, P. e Kingsbury, D. W. New York, Springer-Verlag, 1983, p. 70-98) . Pensa-se que as proteínas virais catalisam a síntese de todos os ARN específicos do virus da gripe quando em presença de um excesso de proteína de nucleocápside (NP, ver revisões citadas acima). Estas funções da polimerase têm sido estudadas, usando núcleos de RNP derivados de vírus rompidos por detergentes e RNP de extractos nucleares de células infectadas. A transcrição a partir das RNP derivadas de vírus rompidos, ocorre quando ê iniciada quer com o dinucleõtido adenililo-(3'-5')-guanosina (ApG), ou com ARNmccm topo . Os produtos de ARNm de sentido mais, têm a sua síntese terminada 17-20 nucleótidos a montante do terminal 5’ do molde de ARN e têm sido processados por adição de caudas poli-A. Estes produtos não podem servir como moldes para o genoma de sentido virai, já que não têm as sequências terminais (Hay, et al., 1977, Virology 83: 337-355). As RNP derivadas de extractos nucleares de células infectadas também sintetizam ARNm poli-adenilado, na presença de iniciadores de ARN ccm topo. No entanto, se for usado ApG nestas condições, podem-se obter ambos os ARN, o poliadenilado e o ARNc de cadeia de comprimento total (Beaton e Krug, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 6282-6286; Takenchi, et al., 1987, J. Biochem. (101: 837-845).
Foi mostrado recentemente que a síntese replicativa do ARNc po dia ocorrer na ausência de um iniciador exógeno, se o extracto nuclear fosse colhido em certos momentos após a infecção. Foi, também, observada, nestas preparações, a síntese do ARNv de sentido negativo a partir de um molde de ADNc (Shapiro e Krug, 1988, J, Virol. 62: 2285-2290). Mostrou-se que a síntese de ARNc de comprimento total era dependente da presença de protei na da nucleocápside (NP) que se encontrava livre em solução (Beaton e Krug, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 6282-6286; Shapiro e Krug, 1988, J. Virol. 62: 2285-2290). Estas descober tas levaram à sugestão de que o controlo regulatório entre as sín teses de ARNm e de ARNc pelo complexo de RNP, ê baseado na necessidade da existência de um excesso de NP solúvel (Beaton e Krug, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 6282-6286).
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-12Uma outra linha de investigação focou-se na preparação de complexos de polimerase-ARN, derivados de RNP de vírus rompidos por detergente. Quando o complexo de RNP é centrifugado através de um gradiente de CsCl-glicerol, pode-se encontrar no fundo do gradiente o ARN associado com as três proteínas da polimerase (P). Próximo do topo do gradiente, pode-se encontrar a proteína NP (Honda, et al., 1988, J. Biochem, 104: 1021-1026; Kato, et al., 1985, Virus Research 3, 115-127). O complexo purificado de polimerase-ARN (fundo do gradiente), é activo no inicio da síntese de ARN iniciada por ApG, mas falha no alongamento por mais de 12-19 nucleõtidos. Quando as fracções do topo do gradi ente são adicionadas, de novo, ao complexo de polimerase-ARN pode ocorrer alongamento (Honda, et al., 1987, J. Biochem. 102: 41-49). Estes dados sugerem que a proteína NP é necessária para alongamento, mas que a iniciação pode ocorrer na ausência da NP.
Mostrou-se que o ARN genõmico dos vírus da gripe estã numa conformação circular por emparelhamento de bases dos terminais para formar um cabo (panhandle) de 15 a 16 nt (Honda, et al., 1988, J. Biochem. 104: 1021-1026; Hsu, et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 8140-8144) . Como a polimerase virai foi encontrada no cabo, isto levou â sugestão de que uma estrutura tipo cabo era necessária para o reconhecimento pela polímera se virai (Honda, et al., 1988, J. Biochem. 104: 1021-1026). Por isso, considerou-se como hipótese, nestes dois relatórios, que o promotor para a ARN polimerase virai era um ARN de cadeia dupla com conformação em cabo.
3. SUMÃRIO DO INVENTO
São descritos moldes de ARN virai de cadeia negativa, recombinantes, que podem ser usados com complexos de ARN polímera se dirigida a ARN, para expressar produtos de gene heterólogo em células hospedeiras apropriadas e/ou para recuperar o gene heterólogo em partículas de vírus. Os moldes de ARN são preparados por transcrição das sequências apropriadas de ADN, com uma ARN polimerase dirigida a ADN. Os moldes de ARN resultantes são de polaridade negativa e contêm as sequências terminais a71 470
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dequadas que permitem ao aparelho sintetizador de ARN virai reconhecer o molde.
Como ê demonstrado pelos exemplos aqui descritos, os moldes de ARN de sentido negativo, recombinantes, da gripe, podem ser misturados com proteínas da polimerase virai purificada e nucleoproteína (i.e., o complexo de polimerase virai purificado) , para formarem RNP recombinantes, infecciosas. Estas podem ser usadas para expressar produtos de gene heterólogo em células hospedeiras, ou para recuperar o gene heterólogo, por co-transfecção de células hospedeiras com RNP recombinantes e vírus. Altemativamente os moldes de ARN recombinantes, ou as RNP recombinantes podem ser usadas para transfectar linhas de células modificadas que expressam a ARN polimerase dependente de ARN, e permitira complementação. Adicionalmente, é, também, des^ crito um sistema de replicação não dependente de vírus, para o vírus da gripe. Foram usados vectores vacinia que expressam poli pêptidos do vírus da gripe, como fontes de proteínas que foram capazes de replicar e transcrever as RNP derivadas sinteticamen te. Verificou-se que o sub-conjunto mínimo de proteína do vírus da gripe, necessário para a replicação específica e expressão da RNP virai, eram as três proteínas da polimerase (PB2, PBl e PA)e a nucleoproteína (NP). Isto sugere que as proteínas não estruturais , NS1 e NS2, não são, em absoluto, necessárias para a replicação e expressão da RNP virai.
Os produtos de expressão e/ou os viriões quiméricos obtidos podem ser, vantajosamente, usados em formulações de vacinas. O uso de gripe recombinante para este fim, ê especialmente atractivo, já que a gripe demonstra uma enorme variabilidade de estir pes, permitindo a construção de um vasto reportório de formulações de vacinas. A capacidade de seleccionar de entre milhares de variantes da gripe, para a construção do vírus quimérico evita o problema da resistência do hospedeiro, encontrado quando se usam outros vírus, tais como vacinia. Além diáso, porque a gripe estimula vigorosas respostas citotõxicas e secretoras em células T, a apresentação de epitopos estranhos no background do vírus da gripe pode, também, proporcionar a indução de imunidade secretora e imunidade mediada por células.
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3.1. DEFINIÇÕES
Tal como aqui usados, os seguintes termos terão os significados indicados:
ARNc = ARN anti-genõmico
HA = hemaglutinina (proteína do invólucro)
M = proteína da matriz (reveste o interior do invólucro)
MDCK = células de rim de canino de Madin Darby
MDBK = células de rim de bovino de Madin Darby moi = multiplicidade da infecção
NA = neuraminidase (glicoproteína do invólucro)
NP = nucleoproteína (associada com o ARN e necessária para a actividade da polimerase)
NS = proteína não estrutural (função desconhecida) nt = nucleótido
PA, PB1, PB2 = componentes da ARN polimerase dirigida a ARN RNP = ribonucleoproteína (ARN, PB2, PB1, PA e NP)
RNPr = RNP recomblnante
ARNv = ARN genõmico do vírus complexo de polimerase virai = PA, PBl, PB2 e NP WSN = vírus A/WSN/33 da gripe
Virus WSN-HK: vírus reassociado contendo sete genes do vírus WSN e o gene da NA do vírus A/HK/8/68 da gripe.
4. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1. Purificação da preparação da polimerase. Os núcle os de RNP foram purificados a partir de vírus completos e, então, sujeitos a centrifugação em gradiente de CsCl-glicerol. A polimerase foi purificada a partir de fracçõcs com 1,5 a 2,0 M da CsCl. As amostras foram, então, analisadas por electroforese em gel de
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poliacrilamida, num gel com um gradiente linear 7-14%, na presença de 0,1% de dodecilsulfato de sódio, seguido por coloração com prata. As amostras de proteína continham 1,4 fq de vírus completo (faixa 1), 0,3 y«g de vírus completo (faixa 2), 5 y*l de núcleos de RNP (faixa 3) e 25 juí de ARN polimerase (faixa 4) . As atribuições conhecidas das proteínas estão indicadas à esquerda.
Figura 2. Construção de plasmídeos usados para preparar moldes de ARN. Ê representada a constituição do plasmideo, representando a caixa a cheio sequências de pUC-19, a caixa a sombreado representa o promotor truncado reorganizado especificamente por ARN polimerase de bacteriõfago T7, a linha a cheio representa o ADN que ê transcrito dos plasmídeos que foram digeridos com Mbo II. A caixa a branco representa sequências que codificam os sítios de reconhecimento para Mbo II, EcoRl e PstI, por esta ordem. São indicados os sítios de clivagem por endonucleases de restrição. Por baixo do diagrama são dadas as sequências completas de ARN que resultam da síntese por ARN polimerase de T7 a partir de plasmídeos digeridos por Mbo II. O ARN de V-wt tem os terminais 5' e 3’ idênticos, tal como foi verificado para o segmento 8 do ARN dos vírus A da gripe, separados por 16 nucleótidos espaçadores. O ARN, M-wt, representa a cadeia exactamente oposta, ou sentido da mensagem, do V-wt. são indicados os sítios de endonuclease de restrição para Drat, EcoRl e Smal. Os transcritos de T7 de plasmídeos clivados por estas enzimas resultam, respec ti vamente, em ARN de 32, 58, 66 e 91 nucleótidos de comprimento. As sequências do ARN de V-d5' são indicadas. O esquema do plasmídeo ê, essencialmente o mesmo do que o usado para o ARN de V-wt, à excepção de mudanças mínimas na sequência espaçadora .
Os mutantes pontuais de ARN de V-d5* que foram estudados são indicados na Tabela I.
Figura 3. Análise de produtos da polimerase virai da gripe, Fig. 3A: Misturas reaccionais de polimerase contendo 0,4 mM de ApG (faixa 2) ou nenhum iniciador (faixa 3), sofreram electroforese em geles de poliacrilamida a 8%, contendo ureia 7,7 M. Fig. 3B: 0 ARN nascente e resistente a nuclease de Sl-específicá, de cadeia simples. A seguir à reacção padrão da polimerase, as solu71 470
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ções foram diluídas em tampão de nuclease de SI (faixa 1) e adicionaram-se enzimas (faixa 2). Como controlo para as condições de digestão da Sl, tratou-se ARN de V-wt, de cadeia simples com nuclease de Sl (faixa 3) ou só com tampão (faixa 4) . Fig. 3C: Análise por ribonuclease de Tl de produtos de reacção purificados em gel. Os produtos de reacção da polimerase virai usando o molde de ARN de V-wt, foram sujeitos a electroforese num gel de poliacrilamida a 8%. A banda de 53 nt e o transcritó mais peque no foram excisados e eluídos da matriz de gel. Estes ARN foram digeridos com RNase de Tl e analisados por electroforese num gel de poliacrilamida a 20%, contendo ureia 7,7 M. Para comparação, analisaram-se, também com RNase de Tl, transcritos de T7 de ARN de M-wt e de V-wt, que tinham sido sintetizados na presença de 32 um <X- P-UTP. Os oligonucleotidos dos ARN de controlo, radiomarcados, previstos, são indicados. Faixa 1, 53 nucleótidos do produto de comprimento total (FL), faixa 2, produto de ARN 40-45 nucleótidos mais pequeno (Sm); faixa 3, ARN de M-wt marcado por 32 incorporação de P-UMP; faixa 4, V-wt de ARN marcado como na fa£ xa 3.
Figura 4. Condições reaccionais óptimas para a polimerase virai. Fig. 4A: Reacções com o molde de V-wt foram montadas em gelo e, então, incubadas às temperaturas indicadas durante 90 minutos. Fig. 4B: Reacções com o molde de V-wt foram preparadas em paralelo com as concentrações de NaCl ou KCl indicadas e foram incubadas a 30 °C durante 90 minutos. Fig. 4C: Incubou-se a 30° C uma reacção única com o molde de V-wt e, nos tempos indica dos, foram removidas amostras e processadas imediatamente, por extracção com fenol-clorofórmio. Todos os geles continham poliacri lamina a 8% com ureia 7,7 M.
Figura 5. Especificidade da polimerase virai para o molde, Fig. 5A: A reacção da polimerase virai necessita de sequências promotoras no terminal 3'. Foram usados nas reacções moldes de diferentes ARN, sob condições padrão. Faixa 1,ARN de V-Pst, que ê igual ao de V-wt com a excepção de ter uma extensão de 13 nt na extremidade 3'; faixa 2, ARN de V-Sma, que tem uma extensão de 38 nt na extremidade 3'; faixa 3, akn de v-wt; faixa 4, um polinucleõtido de ADN com sequência idêntica à do ARN de V-wt; faixa
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5, um ARN de 80 nt gerado por transcrição de um plasmideo pIBI-31 digerido com Hind II, pela ARN polimerase do bacteriófago T3. A autoradiografia foi sobre-exposta de modo a dar ênfase ã ausência de produtos específicos de reacção quando estes outros moldes forem usados. Fig. 5B: foram incubados 10 ng de cada molde de ARN com a polimerase virai, e os produtos foram, então, su jeitos a electroforese em geles de poliacrilamida a 8%, contendo ureia 7.7 M. Sao mostradosz faixa 1, ARN de V-wt; faixa 2, ARN de V-Dra; faixa 3, ARN de V-Eco; faixa 4, ARN de M-wt, e faixa 5, um oligonucleõtido marcador de 53 nt. Para as diferenças exactas entre sequências ver Fig. 2 e Secção 6.1 et seq.
Figura 6. O promotor de ARN não necessita de um cabo terminal. Reacção da polimerase usando dois moldes de ARN. Cada reac ção continha 5ng de ARN de V-wt. Como um segundo molde, as reacções continham 0 ng (faixa 1), 0,6 ng (faixa 2) e 3,0 ng (faixa 3) de ARN de V-d5’. As razões molares resultantes estão indicadas na figura. Os produtos da reacção foram analisados num gel de poliacrilamida a 8%, na presença de ureia 7.7 M. Na analise por den sitometria das autoradiografias que se seguiu, a intensidade relativa de cada pico foi corrigida para a quantidade de UMP radio activo que estã incorporado em cada produto.
Figura 7. Especificidade das sequências promotoras. ARN que não tinham o terminal 5’ e continham mutações pontuais (Tabela II) foram comparados com o ARN de V-d5’, em reacções padrão de polimerase. O painel da direita ê de outro conjunto reaccional.
São mostradas comparações quantitativas na Tabela II.
Figura 8. Preparações de polimerase de concentração elevada são activas em reacções de síntese de ARN iniciada por topoendonuclease e nas reacções sem iniciador.Fig. 8A: Especificidade para o iniciador do enzima de concentração elevada. O molde de 30 nt sintetizado radioactivamente estã na faixa 1. Reacções usando 20 ng de ARN V-d5' e 5 /4 de polimerase virai, continham ccmo ini ciador: sem iniciador (faixa 2); 100 ng de ARN de BMV (De e Barier jee, 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun. 6: 40-49) contendo uma estrutura ccm tono 0; 100 ng de ARNm de globulina de coelho, contendo uma estrutura ccm topo 1 (faixa 4); e 0,4 mM ApG (faixa 5) . Mostrou -se uma exposição mais clara da faixa 5, na faixa 6. Fig. 8B:
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-18Análise por nuclease de Sl dos ARN purificados em gel. Produtos de reacções usando ApG como iniciador (faixas 1 e 2); sem inicia dor (faixas 3 e 4); ou ARNm de globulina (faixas 5 e 6) sofreram electroforese na ausência de ureia e o pedaço adequado de gel foi excisado e o ARN eluído. Este ARN foi, então, digerido com nuclea se de Sl (faixas 2, 4 e 6) e os produtos foram desnaturados e analisados num gel de poliacrilamida a 8%, contendo ureia 7.7 M.
Figura 9. Síntese de ARN de comprimento genómico a partir de RNP reconstituídas. Produtos de reacção usando 10 de polime rase e, como molde, ARN de 890 nt, idêntico à sequência do segmento 8 do vírus A/WSN/33, e ARN extraído de um vírus A/PR/8/34, foram analisados num gel de poliacrilamida a 4% contendo ureia
7.7 M. Na faixa 1, é mostrado o molde de 890 nt, sintetizado radioactivamente pela ARN polimerase de T7. O ARN de 890 nt deriva do de plasmideo foi usado como molde nas faixas 2, 3, 8 e 9. O ARN extraído do vírus foi usado como molde nas faixas 4, 5, 10 e 11. Não se usou molde nas faixas 6 e 7. Não se usou iniciador nas faixas 2 a 5, e usou-se ApG como iniciador nas faixas 6 a 11. Os produtos da reacção foram tratados com nuclease de Sl nas faL xas 3, 5, 7, 9 e 11.
Figura 10. Representação diagramãtica de um método de mutagénese dirigido por PCR que pode ser usado para substituir sequên cias virais de codificação em segmento de gene virai.
Figura 11. (A). Representação diagramãtica de porções relevantes do pIVCATl. Os vários domínios estão identificados e são, da esquerda para a direita; um promotor truncado de T7; ou extremidade 5’ , não traduzida, do segmento 8 do vírus A/PR/8/34 da gripe (22 nucleõtidos); 8 nucleõtidos da sequência de ligação; a região codificadora do gene de CAT, inteira (660 nucleõtidos); a extremidade 3', total, não traduzida do segmento 8 do vírus A/PR/8/ /34 da gripe (26 nucleõtidos); e a sequência de ligação contendo o sítio do enzima de restrição Hgal. Estão indicados os sítios relevantes de enzimas de restrição e os sítios de início e de pa ragem, para o gene de CAT. (Β) O produto de ARN de 716 bases, obtido a seguir à digestão com Hgal e ã transcrição do pIVACATl por ARN polimerase de T7. As sequências virais da gripe são indicadas por letras a negrito, as sequências do gene de CAT por letras nor
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mais, e as sequências de ligação em itálico. Os tripletos — em
anti-sentido — representando os codões de inicia ção e terminação do gene de CAT estão indicados por seta e sublinhado, respectivamente.
Figura 12. Produtos da transcrição de ARN por polimerase de T7 e da transcrição in vitro por polimerase do vírus da gripe. Faixas 1-4: análise em gel de poliacrilamida dos transcritos radiomarcados da polimerase de T7, do pIVACATl, e do pHgaNS. Faixas 5 e 6: Análise em gel de poliacrilamida dos produtos radiomarcados da transcrição in vitro por proteína de polimerase da gripe.A, purificada, usando moldes de ARN de IVACAT1 e de ARN de HgaNS. Faixa 1:ARN de HgaNS de 80 nt. Faixas 2-4: Várias preparações de ARN de IVACATl. Faixa 5: transcrito de ARN de IVACATl por polime rase virai. Faixa 6: transcrito de ARN de HgaNS por polimerase virai.
Figura 13. Esquema da transfecção com RNP e experiências de subcultura (passaging).
Figura 14. Ensaios de CAT de células transfectadas com RNP, com ARN de IVACATl. (A) Decurso no tempo da transfecção com RNP em células 293. As células foram na hora-1 transf ectadas com a RNP recombinante e infectadas com o vírus na hora 0. As células foram recolhidas nos tempos indicados, e ensaiadas relativamente à actividade de CAT. (B) Requisitos para a transfecção com RNP de células 293. Os parâmetros das misturas reaccionais eram como indicado. (C) Transfecção ccm RNP de células MDCK. As células MDCK foram transfectadas com ARN polimerase de IVACATl, quer na hora -1 quer na hora +2, relativamente à infecção com o vírus. As células foram colhidas e a actividade de CAT testada nos tempos indicados. Tempo indica o ponto no tempo da colheita das células. T = 0 marca o tempo da adição do vírus auxiliar. ARN representa o ARN de IVACATl. Pol é o complexo de proteína da polimerase da gripe A/PR/8/34, purificado. WSN indica o vírus A/WSN/33 da gripe, auxiliar. Pré-Inc indica pré-incubação do ARN e da polimerase em tampão de transcrição a 30°C durante 30 min. Transfecção com RNP indica o tempo da transfecção com RNP relativo à infecção do vírus. +/- indica a presença ou ausência de um com ponente/caracteristica particular. C indica ensaios de contro71 470
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-20lo usando enzima CAT disponível comercialmente (Boehringer-Mannheim).
Figura 15. Actividade de CAT em células MDCK infectadas com vírus recombinante. O sobrenadante de células MDCK transfectadas com RNP e infectadas com o vírus auxiliar foi usado para infectar células MDCK frescas. O inoculo foi removido uma hora apôs infecção, as células foram colhidas 11 horas mais tarde e ensaiou-se a actividade de CAT. Faixa 1: extracto de células infectadas só com o vírus auxiliar. Faixa 2: extracto de células infec tadas com 100 μΐ de sobrenadante de células MDCK transfectadas com RNP e infectadas com vírus auxiliar. Faixa 3: sobrenadante ( 80 ^ul) de células da faixa 2. Faixa 4: Como na faixa 2, com a excepção de o vírus auxiliar (MOI4) ter sido adicionado ao inõcu lo. Em contraste com as experiências mostradas na Fig.4, estes 14 ensaios continham 20 μβ de C cloramfenicol.
Figura 16. Diagrama das porções relevantes do gene da neura minidase (NA) contido em plasmídeos usados para as experiências de transfecção. O plasmídeo pT3NAv, derivado de pUC19, contém o gene da NA do vírus A/WSN/33 da gripe e um percursor truncado, reconhecido especificamente pela polimerase de T3. O promotor de T3 usado, está truncado de modo que o nucleótido inicialmente transcrito (uma adenina) corresponde à adenina 5' do gene de NA de WSN. Na extremidade 3’ da cópia ADNc do gene de NA foi inseri^ do um sítio do enzima de restrição Ksp63 2I, de modo que o sítio de clivagem ocorre directamente depois da extremidade 3’ de sequência do gene de NA. Obteve-se um transcrito de 1409 nucleóti. dos de comprimento a seguir à digestão com Ksp 6321 e transcrição pela ARN polimerase de T3 de pT3NAv (como descrito na secção 8.1. infra) . São mostrados os 15 nucleõtidos do terminal 5', os 52 nucleõtidos correspondentes à região entre os sítios de restrição Ncol e PstI e os 12 nucleõtidos do terminal 3' . O trans crito do pT3NAv mut 1 ê idêntico ao do pT3NAv, com a excepção de uma única delecção, onze nucleõtidos a jusante do terminal 5' do ARN de tipo selvagem. O transcrito do pT3NAv mut 2 ê idêntico ao do pT3NAv com a excepção das 5 mutações localizadas na região central (indicadas pelo sublinhado) . Estas cinco mutações não mudam a sequência de aminoácidos na estrutura de leitura,aberta, do
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gene. O codão UCC da serina na posição 887-889 (ARN de sentido mais) foi substituido pelo codão AGU da serina na mesma estrutura. A numeração dos nucleótidos segue Hiti et al., 1982, J. Virol. 41: 730-734.
Figura 17. Electroforese, em gel de poliacrilamida, de ARN purificados a partir de virus da gripe recuperados. Os ARN transcritos do pT3NAs (FIG. 16), de ARN, extraído com fenol, derivado do vírus A/WSN/33 da gripe, foram misturados com preparações de polimerase seguindo o protocolo descrito na secção 6.1.1. infra. Estas RNP reconstituídas forem, então, transfectadas em células MDBK que tinham sido· infectadas, uma hora antes, com o vírus auxiliar WSN-HK. O meio, contendo 28yLvg/ml de plasminogênio, foi colhido após 16 horas e o vírus foi amplificado e colocado em placa em células MDBK, na ausência de protease. O vírus obtido das placas foi, então, ainda mais amplificado em células MDBK e o ARN extraído com fenol das preparações de virus purificadas como descrito nas secções 6.1. et seq. e 7.1. et seq. Os ARN foram se parados em geles de poliacrilamida a 2.8% - bisacrilamida a 0,075%, contendo ureia 7,7 M, em tampão TBE e visualizados corando com prata, como descrito na secção 6.1 et seq. Faixa 1 e 6: ARN do virus WSN-HK. Faixa 2: ARN de vírus que foi recuperado de células MDBK a seguir ã transfecção com RNP, com ARN de NA derivado de pT3NAv e infecçâo com o vírus auxiliar WSN-HK. Faixa 3: ARN de NA transcrito in vitro a partir de pT3NAv. Faixa 4: ARN de virus WSN de controlo. Faixa 5: ARN de vírus que foi recuperado de células MDBK a seguir a transfecção com RNP, com ARN do vírus WSN, extraí^ do^com fenol e infecçâo com o vírus auxiliar WSN.
Figura 18. Análise da sequência de ARN do vírus da gripe recuperado , contendo cinco mutações específicas de sítio. A seguir à infecçâo com o vírus auxiliar WSN-HK, células MDBK foram transfectadas com RNP, com ARN de T3NAv mut 2 que foi obtido por tran£ crição a partir do pT3NAv mut 2. A seguir a incubação durante a noite na presença de 28 ^g/ml de plasminogênio, foi usado meio para propagação e plaquing em células MDBK, na ausência de protease. O vírus das placas foram, então, amplificados e obteve-se ARN, a seguir à extracção, com fenol de vírus purificados. A recuperação do gene de NA mutante, nas partículas de vírus, foi ve
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rifiçada através de sequênciação directa do ARN usando 5*-TACGAG GAAATGTTCCTGTTA-31 como iniciador (correspondendo à posição 800-819; Hiti et al., J. Virol. 41: 730-734), e transcriptase inversa (Jamashita et al., 1988, Virol. 163: 112-122). As sequências mostradas correspondem à posição 878-930 no gene da NA (Hiti et al., J. Virol. 41: 730-734). As setas e os nucleõtidos sublinhados indicam as mudanças no ARN mutante, comparadas com o ARN tipo selvagem. Esquerda: ARN de controlo obtido a partir do vírus A/ /WSN/83 da gripe. Direita: ARN de vírus mutante recuperado de cê lulas MDBK que foram transfectadas com RNP, com ARN de T3NAv mut 2 e infectadas com o vírus auxiliar WSN-HK.
Figura 19. Expressão de CAT em células infectadas por vírus vacinia/transfectadas com RNP de IVACAT-1. Foram infectadas apro ximadamente 10θ células C127 de ratinho em placas de 35 mm com misturas de vírus vacinia recombinantes (Smith et al., 1986) a uma M.O.I. de, aproximadamente, 10 por cada vector. Após 1,5 horas, foi transfectada RNP de IVACAT-1, sintética, nas células infectadas pelo vírus como descrito (Lutjyes et al., 1989).
As células foram incubadas durante a noite, colhidas e testadas para actividade de CAT, de acordo com procedimentos padrão (Gorman et al., 1982). Os testes continham 0,05 /<C1/ C_/ de cloramfenicol, 20 de acetil-CoA 40 mM (Boehringer) e 50 yul de extractos de células em tampão Tris 0,25 M (pH 7,5) . Os tempos de incubação foram, aproximadamente, de 4 horas. As etiquetas debaixo dos numeros da faixa indicam o tratamento das células. Faixa 1-controlo; 2-transfecção de ARN nu (sem adição de polimerase) , sem infecção com vírus auxiliar; 3-transfecção com RNP, sem vírus auxiliar; 4-transfecção com RNP, vírus da gripe como auxili ar; Faixas 5-11-transfecção com RNP, vectores de vírus vacinia como vírus auxiliares expressa as proteínas do vírus da gripe in dicadas.
Figura 20. Teste de várias linhas. A) As células foram infec tadas com vectores vacinia expressando as proteínas PB2, PBl e PA (Faixas 1, 3, 5, 7) ou as proteínas PB2, PBl, PA e NP (faixas 2, 4, 6, 8), transfectadas com RNP de IVACAT-1 e examinadas para actividade de CAT como descrito. Faixas 1, 2: Células de rim de canino de Maden-Darby (MDCK) ; 3,4: células HeLa; 5,6 células 293 humanas (Graham et al., 1977, J. Gen.Virol. 36: 59-72); 7,8
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células C. B) Usou-se a linha de células 3 PNP-4 como célula hospedeira. Em cada faixa estão mostradas as proteínas virais da grji pe expressas em cada amostra. C) Foram infectadas células 293 com os quatro vacinia necessários e transfectadas com RNP sintética feita usando ARN de IVA-CAT-1 (faixa 1) ou de IVA-CAT-2 (faixa 2) Apôs incubação durante a noite, as células foram colhidas e executaram-se ensaios de CAT.
5. DESCRIÇÃO DO INVENTO
Este invento refere-se à construção e uso de moldes de ARN virai de cadeia negativa, recombinantes, que podem ser usados com ARN polimerase dirigida a ARN virai, para expressar produtos de gene heterólogo em células hospedeiras apropriadas e/ou recuperar o gene heterólogo em partículas de vírus. Os moldes de ARN podem ser preparados por transcrição de sequências adequadas de ADN, usando uma ARN polimerase dirigida a ADN tal como polimerase de bacteriófago T7, T3 ou Sp6. Usando o vírus da gripe, por exemplo, o ADN é construído para codificar o sentido de mensagem da sequência do gene heterólogo flanqueada a montante do ATG pelo complemento do sítio de ligação da polimerase viral/promotor da gripe, i.e. o complemento do terminal 3 ’ de um segmento do ge noma da gripe. Para recuperação em partículas de vírus, pode ser preferido flanquear a sequência codificadora heterôloga com o complemento de ambos os terminais 3' e 5’, de um segmento do genoma da gripe. Após transcrição com a ARN polimerase dirigida a ADN, o molde de ARN, resultante, codificará a polaridade negativa da sequência de gene heterólogo e conterá as sequências termi nais do ARNv que possibilitam â ARN polimerase dirigida a ARN re conhecer o molde.
Os moldes de ARN de sentido negativo, recombinantes, podem ser misturados com complexo de polimerase virai purificado, compreendendo proteínas da ARN polimerase dirigida a ARN virai (as proteínas P) e a nucleoproteína (NP) , que pode ser isolada a par tir de núcleos de RNP preparados a partir do vírus total para formar RNP recombinantes (RNPr). Estas RNPr são infecciosas e podem ser usadas para expressar o produto de gene heterólogo em células hospedeiras adequadas ou para recuperar o gene heterólo71 470
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-24go em partículas de vírus por co-transfecção de células hospedei^ ras com a RNPr e vírus. Em alternativa, os moldes de ARN recombi nantes podem ser usados para transfectarem linhas de células trans formadas que expressam as proteínas da ARN polimerase dirigida a ARN, permitindo complementação.
invento é demonstrado por meio de exemplos de trabalho nas quais os transcritos de ARN de ADN clonado, contendo a região codificadora- na orientação do sentido negativo - do gene da cloramfenicol acetil transferase (CAT), flanqueado pelos 22 nucleõtidos do terminal 5’e pelos 26 nucleõtidos do terminal 3' do ARN de NS do vírus A/PR/8/34 da gripe, foram misturados com proteínas da polimerase do vírus da gripe A; isoladas. Este complexo de ribonucleoproteína (RNP), reconstruído, foi transfectado em células MDCK ( ou 293), que foram infectadas com o vírus da gripe. A actividade de CAT era negligenciávelantes e depois da infecção pelo vírus, mas era demonstrável sete horas após infecção pelo vírus. Quando se usava o sobrenadante de células contendo vírus budded desta experiência de recuperação, para infectar uma nova monocamada de células MDCK, a actividade de CAT também se detectava, sugerindo que o ARN contendo o gene de CAT, recombinante, tinha sido empacotado nas partículas do vírus. Estes re sultados demonstram o uso, com sucesso, de moldes de ARN virai de cadeia negativa recombinante e de ARN polimerase dependente de ARN, para reconstituir a RNP recombinante do vírus da gripe. Os dados sugerem, ainda, que as sequências de 22 nt do terminal 5' e de 26 nt do terminal 3' do ARN do vírus A da gripe, são suficientes para proporcionarem os sinais para a transcrição do ARN, replicação do ARN e para o empacotamento do ARN nas partículas do vírus da gripe.
Usando esta metodologia também demonstrámos a recuperação de ARN sintéticos, derivados de ADN de plasmídeos, recombinantes, adequados, em vírus da gripe, infecciosos, estáveis. Em particular, o ARN correspondente ao gene da neuraminidase (NA) do vírus A/WSN/ /33 da gripe (WSN) foi transcrito in vitro de ADN de plasmídeo e, seguindo a adição de complexo de polimerase do vírus da gripe, purificado, foi transfectado em células MDBK. Super-infecçao com o vírus auxiliar que não tinha o gene da NA do WSN, resulta na
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-25libertação de vírus contendo o gene da NA do WSN. Introduzimos, então, cinco mutações pontuais no gene da NA por mutagénese em cassete do ADN de plasmideo. A análise da sequência do vírus re cuperado revelou que o genoma continha todos as cinco mutações presentes no plasmideo mutado. Esta tecnologia pode ser usada para criar vírus com mutações especificas de local, de modo que podem ser construídos vírus da gripe com propriedades biológicas definidas.
A capacidade de reconstituir RNP in vitro permite a concepção de novos vírus quiméricos da gripe que expressam genes estranhos. Um modo de conseguir este objectivo envolve a modificação de genes de vírus da gripe existentes. Por exemplo, o gene da NA pode ser modificado para conter sequências estranhas nos seus domínios externos . Onde as sequências heterólogas são epitopos ou antigénios de patogénios, este vírus quiméricos podem ser usados para induzir uma resposta imunitária protectora contra os agentes da doença dos quais derivaram estes determinantes. Em adição ã modificação de genes que codificam proteínas de superfície, também se podem alterar genes que codificam proteínas que não são de superfície. Mostrou-se que estes últimos genes estão associados com as respostas imunitárias celulares mais importantes no sistema do vírus da gripe (Townsend et al., 1985, Cell, 42: 475-482) . A£ sim, a inclusão de um determinante estranho nos genes da NP ou da NS de um vírus da gripe pode - a seguir a infecção - induzir uma reposta imunitária celular, eficaz contra este determinante.
Tal abordagem pode ser particularmente útil em situações nas quais a imunidade protectora depende fortemente da indução de respostas imunitárias celulares (e.g., malária, etc.).
Uma outra abordagem que permitiria a expressão de proteínas estranhas (ou domínios de tais proteínas) , por via de vírus da gripe quiméricos, tem a ver com a introdução de genes heterôlogos completos no vírus. Preparações de vírus da gripe com mais do que oito segmentos de ARN foram jã descritos (Nayak, D. et al., em Genetics of Influenza virus, P. Palese e D.N. Kingsbury, eds, Springerverlag, Vienna, pp 255-279). Assim, vírus da gripe, quiméricos, com nove ou mais segmentos podem ser viáveis e o correcto empacotamento de tais vírus quiméricos pode ocorrer pronta
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mente.
O invento pode ser dividido nas seguintes fases, somente pa ra o propósito de descrição e não como forma de limitação: (a) construção de moldes de ARN, recombinantes; (b) expressão dos produtos de gene heterõlogo usando os moldes de ARN, recombinantes; e (c) recuperação do gene heterõlogo nas partículas de vírus recombinantes. Para a clareza da discussão, o invento ê descrito nas sub-secções abaixo, usando gripe. Pode ser utilizada qualquer estirpe da gripe (e.g. A, B, C). No entanto, os principios podem ser aplicados, de uma forma analôga, na construção de outros moldes de ARN de cadeia negativa de vírus e vírus quiméri cos incluindo, mas não lhes estando limitados, vírus dos sincícios respiratórios; buniavírus; vírus arena; etc. Um sistema de vírus particularmente interessante, que pode ser usado de acordo com o invento é o vírus de insecto idêntico a orthcmyxo, chamado Dhori (Fuller, 1987, Virology. 160: 81-87).
5.1. CONSTRUÇÃO DOS MOLDES DE ARN RECOMBINANTES
Sequências codificadoras de gene heterõlogo, flanqueadas pe lo complemento do sítio de ligação à polimerase viral/promotor, e.g. o complemento do terminal 3' do vírus da gripe, ou os complementos de ambos os terminais 3* e 5' podem ser construídos usando técnicas conhecidas na arte. Moléculas de ADN recombinante contendo estas sequências híbridas podem ser clonadas e tran£ critas por uma ADN polimerase dirigida a ARN, tal como polimerase de bacterio'fago T7, T3 ou Sp6 e semelhantes, para produzir os moldes de ARN recombinante que possuem as sequências virais adequadas, que permitem o reconhecimento e actividade de polimerase.
Uma abordagem para a construção destas moléculas híbridas ê a inserção de sequência codificadora heterôloga num complemento de ADN de um segmento genómico de um vírus da gripe r de modo que a sequência heterôloga é flanqueada pelas sequências virais necessárias para a actividade da polimerase, i.e: o sítio de ligação da polimerase viral/promotor, a partir daqui referido como sítio de ligação da polimerase virai. Numa abordagem alter nativa, oligonucleótidos codificando o .sítio de ligação da poli
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merase virai, e.g. o complemento do terminal 3' ou ambos os terminais dos segmentos genõmicos do vírus, podem ser ligados à εβ quência codificadora heteróloga para construir a molécula híbrida. A colocação de um gene estranho ou segmento de um gene estra nho era, anteriormente, ditada pela presença de sítios de enzima de restrição apropriados, na sequência alvo. No entanto avanços recentes em biologia molecular atenuaram este problema de uma grande forma. Sítios de enzima de ligação podem ser, facilmente, colocados em qualquer parte da sequência alvo através do uso de mutagénese dirigida ao sitio (e.g., ver, por exemplo, as técnicas descritas por Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82: 488). Variações na tecnologia da reacção em cadeia de polimerase (PCR), descritas infra, também permite a inserção especifica de sequências (i.e., sítios de enzima de restrição) e permite a construção fãcil de moléculas híbridas. Alternativamente, reacçoes PCR podiam ser usadas para preparar os moldes recombinantes sem necessidade de clonação . Por exemplo, podiam ser usadas reacçoes PCR para preparar moléculas de ADN de cadeia dupla contendo um promotor de ARN polimerase dirigida a ADN (e. g. bacteriófago T3, ' T7 ou Sp6) , e a sequência hibrida contendo o gene heterólogo e o sitio de ligação à polimerase virai da gripe. Os moldes de ARN podiam, assim, ser transcritos directamente a partir deste ADN recombinante. Ainda, noutra concretização, os moldes de ARN, recombinantes, podem ser preparados, ligando ARN especificando a polaridade negativa do gene heterólogo e o sitio de ligação à polimerase virai usando ARN ligase. Os requisitos de sequências para a actividade da polimerase virai e construções que podem ser usadas de acordo com o invento são descritas nas sub-secções abaixo.
5.1.1. O TERMINAL VIRAL 3' S NECESSÃRIQ PARA A
ACTIVIDADE DA POLIMERASE
As experiências descritas na secção 6 et seg., infra, sâo as primeiras a definir sequências de promotores pare a polimera se de um vírus de ARN de sentido negativo, e verificou-se que a especificidade reside nos 15 nucleôtidos do terminal 3'. Estas sequências dos sítios de ligação ã polimerase virai, bem como se
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quências funcionalmente equivalentes podem ser usadas de acordo com o invento. Por exemplo, podem ser utilizadas sequências fun cionalmente equivalentes, contendo substituições, inserções, de lecções, adições ou inversões, que exibem actividade semelhante. A síntese de ARN pela polimerase virai, descrita infra, é um modelo para o reconhecimento específico e alongamento pela polimera se virai da gripe, pelas seguintes razões: (a) a polimerase tem actividade elevada quando iniciada com ApG, um aspecto único para a polimerase virai da gripe; (b) tem actividade óptima em condições iónicas e de temperatura, demonstradas anteriormente como sendo eficazes para as RNP virais; (c) a polimerase ê espe cífica para as sequências virais da gripe nos moldes de ADN modelo; (d) a polimerase ê activa na síntese de ARN iniciada por endonuclease com topo, o que é característica da polimerase virai da gripe; (e) o reconhecimento de ARN com topo doador ê específico para estruturas topo 1, e (f) segmentos de ARN genómico são copiados especificamente.
5.1.2. UM CABO TERMINAL NÃO & NECESSÁRIO PARA 0 RECONHECIMENTO e síntese Óptimos pela polimerase viral
Mostrámos já que os ARN de segmentos da gripe viral sofrem emparelhamento entre bases nos seus terminais para formarem estruturas em cabo. Isto ê conseguido por dois métodos. Um reagente de reticulação derivado de psolaren liga covalentemente os terminais de cada segmento no vírus intacto ou nas RNP de células infectadas (Hse et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 8140-8144). Observou-se por microscopia electrónica que o ARN tratado ê circular em virtude dos terminais reticulados. Duma forma similar verificou-se que os terminais de ARN nas RNP são sensíveis à ribónuclease VI, que reconhece e cliva ARN de cadeia dupla, e verificou-se que a polimerase viral estava ligada a ambos os terminais na conformação de cabo (Honda et al. , 1988,
J. Biochem. 104: 1021-1026) . Nestes estudos mostrou-se que a estrutura de cabo do ARN genómico existe, e inferiu-se que desem penha um papel no reconhecimento pela polimerase. Embora os moldes de ARN usados nos exemplos descritos, tenham sido, originalmente, preparados para revelar a ligação da proteína específica
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do cabo, verificou-se que o cabo terminal não tinha qualquer papel óbvio nas reacções da polimerase aqui estudadas.
5.1.3. A PREPARAÇÃO DE ARN POLIMERASE COPIA ESPECIFICAMENTE MOLDES DE SENTIDO NEGATIVO
Verificou-se que a polimerase virai sintetiza ARN com efici ência óptima se o molde tiver o terminal 3’ de sentido negativo do tipo selvagem. Verificou-se que ARN de sequência não relacionada não eram copiados, e que aqueles com sequências do poli-ligador no terminal 3’ eram copiados muito menos eficazmente. Um ADN com a sequência correcta também não era adequado como mol. de. A reacção era muito específica, jã que o molde M-wt era repli^ cado somente em níveis muito baixos. Apesar de a nossa fonte de polimerase ser o vírus intacto, esta descoberta foi bastante sur preendente^ jã que nunca se tinha sugerido que a polimerase reconhe cendo o ARN de sentido virai não copiasse eficientemente a cadeia de sentido mais. Estão a fazer-se estudos para se examinar a especificidade da polimerase purificada a partir de células infectadas em momentos põs-infecção, quando o ARN complementar ê copiado nos moldes genõmicos. Os presentes dados apoiam um modelo pelo qual a polimerase virai que copia o ARNv ê funcionalmente diferente da que sintetiza o ARNv a partir do ARNc, em virtude do reconhecimento por promotores. Ê possível que por modificação regulada da polimerase em células infectadas ele se torne, então, capaz de reconhecer o terminal 3' doARN.de sentido mais. Analisando promotores mutantes, investigámos a estrutura fina da reacção, e verificámos que a única mutação simples que gerava um nível significativamente mais baixo de síntese, era a do ARN de V-A3. Além disso, combinações de duas ou mais mudanças pontuais nas posições 3, 5, 8 e 10. baixaram gradualmente os níveis de sín tese.
5.1.4. INSERÇÃO DA SEQUÊNCIA DE GENE HETEROLOGO NOS SEGMENTOS DE GENE DE PB2, DE PBl, DE PA OU DE NP
Os segmentos de gene que codificam as proteínas PB2, PBl,
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PA e NP contêm uma estrutura de leitura simples, aberta, com 24-45 nucleõtidos não traduzidos na sua extremidade 5', e 22-57 nucleõtidos não traduzidos na sua extremidade 3*. a inserção de uma sequência de gene estranha em qualquer um destes segmentos poderia ser conseguida quer por uma substituição total da região virai de codificação pelo gene estranho, quer por uma substituição parcial. A substituição total seria melhor conseguida através do uso de mutagénese dirigida por PCR. 0 princípio deste metõdo de mutagénese ê ilustrado na FIG. 10. Resumidamente, o iniciador A de PCR conteria, de 5’ para 3’, um sítio de enzima de restrição, único, tal como um sítio de enzima de restrição da classe IIS (i.e, um enzima de desvio (shifter); que reconhe ce uma sequência específica, mas cliva o ADN quer a montante quer a jusante dessa sequência); a região de 3’ não traduzida, total do segmento do gene da gripe; e um comprimento de nucleótidos complementares da porção codificadora do terminal carboxi do pro duto de gene estranho. O iniciador B de PCR conteria, da extrenii dade 5’ para a 3’: um sítio único de enzima de restrição; uma se quência truncada, mas activa , de polimerase de fago; o complemento da região não traduzida 5', total, do segmento de gene da gripe (relativamente ao ARNv de sentido negativo); e um comprimento de nucleõtidos correspondendo à porção codificadora de 5' do gene estranho. Após uma reacção de PCR, usando estes iniciadores, com uma cópia cionada do gene estranho, o produto pode ser excisado e clonado usando os sítios de restrição únicos. Digestão com o enzima de classe IIS e transcrição com a polimerase de fago pur£ ficada, geraria uma molécula de ADN contendo as extremidades nãq traduzidas do segmento do gene virai da gripe com uma inserção estranha. Uma tal construção ê descrita para o gene da cloramfenicol acetiltransferase (CAT), usado nos exemplos descritos na secção 7 infra. Numa concretização alternativa, reacções iniciadas por PCR podem ser usadas para preparar ADN de cadeia dupla contendo a sequência promotora de bacteriõfago, e a sequência de gene híbrido, de modo que os moldes de ARN podem ser transcritos directamente sem clonação.
Dependendo da integridade do produto de gene estranho e o do fim para construção, pode ser desejável construir sequências
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-31híbridas que dirijam a expressão de proteínas de fusão. Por exem pio, as quatro proteínas do vírus da gripe PB2 , PBl, PA OU NP são proteínas de polimerase que são dirigidas ao núcleo da célula infectada, através de sequências específicas presentes na pro teína. Verificou-se que para a NP esta sequência de aminoãcidos é (código de uma letra QLVWMACNSAAFEDLRVLS (Davey et al., 1985, Cell 40: 667-675). Assim, se se desejar dirigir o produto de gene estranho ao núcleo (se ele, por sí próprio, ordinariamente, o não fizesse) a proteína híbrida seria construída de modo a conter um domínio que aí a dirija. Este domínio pode ser de origem da gripe virai, mas não necessariamente. Proteínas híbridas podem, também, ser feitas a partir de fontes não virais, desde que contenham as sequências necessárias para a replicação pelo vírus da gripe (a região 3' não traduzida, etc.).
Como outro exemplo, podem ser substituídas por sequências estranhas certas regiões antigénicas dos produtos de gene virai. Townsend et al. , (1985, Cell 42: 475-482), identificaram um epitopo dentro da molécula de NP que ê capaz de produzir uma respos ta CTC (célula T citotóxica) vigorosa. Este epitopo abarca os resíduos 147-161 da proteína NP e consiste dos aminoãcidos TYQRTRQL VRLTGMDP. A substituição desta sequência de NP por um epitopo és tranho, curto, pode produzir uma forte resposta imunitária celular contra a região intacta do antigénio estranho. Reciprocamente, a expressão de um produto de gene estranho contendo esta região de 15 aminoãcidos pode, também, ajudar a induzir uma forte respo£3 ta imunitária celular contra a proteína estranha.
5.1.5, INSERÇÃO DA SEQUfiNCIA DE GENE HETERÓLOGO NOS
SEGMENTOS DE GENE DA HA OU DA NA
As proteínas HA e NA, codificadas por diferentes segmentos de gene, são as principais proteínas de superfície do vírus. Con sequentemente, estas proteínas são os alvos principais para a res posta imunitária humoral apôs infecção. Foram as mais extensivamente estudadas de todas as proteínas virais da gripe, jã que se resolveram as estruturas tridimensionais destas duas proteínas.
A estrutura tridimensional de hemaglutinina H3, em conjunto
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-32com a informação de sequências de um largo número de variantes permitiu a elucidação dos sítios antigênicos na molécula de HA (Webster et al., 1983, em Genetics of Influenza Virus, P. Palese e D. W. Kingsbury, eds., Springer-Verlag, Vienna, pp. 127-160). Estes sítios caiem em quatro regiões discretas, não sobre postas na superfície da HA. Estas regiões são muito variáveis e verificou-se, também que aceitam inserções ou delecções. Assim, a substituição destes sítios dentro da HA (e.g. sítio A; aminoáci^ dos 122-127 da HA de A/HK/68) por uma porção de uma proteína estranha pode proporcionar uma resposta humoral vigorosa contra este péptido estranho. Numa abordagem diferente, a sequência do pêptido estranho pode ser inserida dentro do sítio antigênico, sem delecção de quaisquer sequências virais. Os produtos de expressão de tais construções podem ser úteis em vacinas contra o antigénio estranho, e podem, de facto, tornear um problema discutido anteriormente, o da propagação do vírus recombinante no hospedeiro vacinado. Uma molécula intacta de HA com uma substituição sõ em sítios antigênicos pode permitir a função da HA e, assim, permitir a construção de um vírus viável. Por conseguinte, este vírus pode ser multiplicado sem a necessidade de funções auxiliares adicionais. Claro que o vírus deve ser atenuado de outras formas, para evitar qualquer perigo de fuga acidental.
Pode-se fazer com que outras construções híbridas expressem proteínas na superfície da célula, ou conferir-lhes a capacidade de se libertarem da célula. Como proteína de superfície, a HA tem uma sequência sinal amino-terminal, clivãvel, necessária para o transporte para a superfície da célula, e uma sequência carboxi-terminal, necessária para ancoragem à membrana. Para expressar uma proteína estranha intacta, na superfície da célula, pode ser necessário usar estes sinais da HA para criar uma proteína híbrida. Altemativamente se sõ estão presentes os sinais de transporte, e o domínio de ancoragem à membrana estã ausente, a proteína pode ser excretada para fora da célula.
No caso da proteína NA, a estrutura tridimensional ê conhecida, mas os sítios antigênicos estão espalhados sobre a superfície da molécula e sobrepõem-se. Tsto indica que se uma sequência ê inserida na molécula de NA, e ê expressa na superfície exteri71 470
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or de NA, será imunogénica. Adicionalmente, como glicoproteína de superfície, a NA exibe duas diferenças marcantes relativamen te à proteína HA. Em primeiro lugar, a NA não contém uma sequên cia sinal clivãvel; de facto, a sequência sinal amino-terminal, actua como um domínio de ancoragem ã membrana; A consequência disto,θ a segunda diferença entre a NA e a HA, é que a NA estã orientada com o terminal amino na membrana, ao passo que a ha está orientada com o terminal carboxi na membrana. Por conseguinte, pode ser vantajoso, em alguns casos, construir uma proteína NA híbri da, jã que a proteína de fusão estará orientada em oposição a um híbrido de fusão de HA.
5.1.6. INSERÇÃO DO GENE HETERÓLOGO NOS SEGMENTOS NS
E M DA GRIPE
A propriedade única dos segmentos NS e M, quando comparados com os outros seis segmentos do vírus da gripe, ê que estes segmentos codificam, pelo menos, dois produtos proteicos. Em cada caso, uma proteína é codificada por um ARNm que é colinear com o ARN genómico, ao passo que a outra proteína é codificada por uma mensagem unida . No entanto, como o sítio doador de união ocorre na região de codificação para o transcrito co-linear, as proteínas NS1 e NS2 têm uma terminação amino de 10 aminoãcidos, idêntica, ao passo que as proteínas Ml e M2 têm uma terminação amino, de 14 aminoãcidos, idêntica.
Como resultado desta estrutura única, podem construir-se vírus recombinantes de modo a se substituir um produto de gene dentro do segmento, deixando o segundo produto intacto. Por exem pio, a substituição da maior parte da região de codificação de NS2 ou de M2 por um produto de gene estranho (mantendo o sítio doador de união podia resultar na expressão de uma proteína NS1 ou Ml intacta, e de uma proteína de fusão, em vez de NS2 ou m2 . Alternativamente, pode ser inserido um gene estranho no segmento do gene de NS sem afectar a expressão quer de NSl, quer de NS2. Apesar de a maior parte dos genes de NS conterem uma sobreposição substancial das estruturas de leitura de NSl e NS2, certos genes de NS, naturais, não a têm. Analisámos o segmento do gene
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de NS do vírus A/Ty/0r/71 (Norton et al., 1987, Virology 156: 204-213) e verificámos que, neste gene particular, a proteína NS1 termina na posição do nucleótido 409 do segmento de gene de NS ao passo que o sítio aceitador de união para a NS2 está na posição de nucleótido 528. Assim, um gene estranho podia ser coloca do entre o codão de terminação da região de codificação de NS1 e o sítio aceitador de união da região de codificação de NS2, sem afectar qualquer proteína. Pode ser necessário incluir um sítio acei. tador de união na extremidade 5' da sequência de gene estranho, para assegurar a produção de proteína (isto codificaria uma pro teína híbrida contendo o terminal amino de NSl). Deste modo, o virus recombinante não seria defectivo e seria capaz de ser pro pagado sem necessidade de funções auxiliares.
Apesar de o genoma do vírus da gripe consistir em oito sej mentos de gene funcionais, é desconhecido quantos segmentos um vírus empacota, na realidade. Foi sugerido que a gripe pode empacotar mais de dois segmentos e, possivelmente, até 12 (Lamb e Choppin, 1983, Ann. Rev. Biochem. 52: 467-506). Isto permitiria a propagação mais fácil do vírus recombinante,jã que esse nono segmento de gene podia ser projectado para expressar o produto de gene estranho. Apesar deste nono segmento poder ser incorpo rado em alguns vírus, seria rapidamente perdido na multiplicação do vírus, a menos que se fornecesse alguma selecção. Isto pode ser conseguido por desacoplamento do segmento NS ou M de gene.
A porção codificadora de NS2 pode ser removida do segmento de NS do gene e colocada no segmento de gene que codifica a proteína estranha (em conjunto com os sinais de união apropriados). Altemativamente podia ser construído um ARNm bi-cistrõnico para permitir a iniciação interna para não unir estas sequências virais; por exemplo, usando as sequências descritas por Pelletier et al., 1988, Nature 334: 320-325. 0 vírus recombinante, resultante, com O gene de NS ou de M desacoplado seria capaz de se propagar por si próprio e teria, necessariamente, que empacotar o nono segmento de gene, assegurando, assim, a expressão do gene estranho.
5.2
EXPRESSÃO DE PRODUTOS DE
GENE HETERÕLOGO USANDO
MOLDE DE ADN RECOMBINANTE
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Os moldes recombinantes,preparados como descrito acima, podem ser usados de variados modos para expressar os produtos de gene heterólogo em células hospedeiras apropriadas, ou para criar virus quiméricos que expressem os produtos de gene heterólogo. Numa concretização, o molde recombinante pode ser combinado com complexo de polimerase virai, purificado como descrito na secção 6, infra, para produzir RNPr que sâo infecciosas. Alternativamen te, o molde recombinante pode ser misturado com complexo de poli merase virai preparado usando métodos de ADN recombinante (e.g. ver Kingsbury et al., 1987, Virology 156: 396-403). Tais RNPr, quando usadas para transfectar células hospedeiras adequadas, po dem dirigir & expressão do produto de gene heterólogo em níveis elevados. Sistemas de células hospedeiras que proporcionam níveis elevados de expressão, incluem linhas de células contínuas que fornecem funções virais, tais como linhas de células superinfectadas por gripe, linhas de células construídas para complementar funções da gripe virai, etc.
Numa concretização alternativa do invento, os moldes recombinantes, ou as RNPr, podem ser usadas para transfectar linhas de células que expressam as proteínas de polimerase virai, de modo a se conseguir expressão do produto de gene heterólogo. Para este fim, linhas de células, transformadas, que expressam as três proteínas da polimerase, tais como 3P-38 e 3P-133 (Krystal et al., 1986, Proc. rJatl. Acad, Sei. U.S.A. 83: 2709-2713) podem ser uti lizadas como células hospedeiras adequadas. As células hospedeiras podem sei, duma forma similar, construídas para proporcionar outras funções virais ou funções adicionais tais como NP.
5.2.1. PURIFICAÇÃO DA POLIMERASE VIRAL
As proteínas da polimerase virai, usadas para produzir as RNP, podem ser purificadas a partir de núcleos de RNP isolados do vírus completo. Em geral, os núcleos de RNP podem ser preparados usando mêtodns padrão (Plotch et al., 1981, Cell ,23: 847-858; Ro chavansky, 1976, Virology 73: 327-338). Os núcleos de RNP reunidos podem, então, ser centrifugados num segundo gradiente de CsCl (1,5-3,0 M) glicerol (30%-45%), como descrito por Honda et al.,
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1988, J. Biochem, 104: 1021-1026. As fracções activas da polimerase virai podem ser isoladas do topo do gradiente, i.e. na regi, ão do gradiente que se correlaciona com 1,5 a 2,0 M CsCl, e que corresponde à fracção que Honda et al. identificaram como NP. Surpreendentemente, esta fracção contém todas as proteínas da po limerase virai, necessárias para o complexo activo. Mais ainda, as proteínas P que podem ser recuperadas do fundo do gradiente não são necessárias, e> de facto, não proporcionam a transcrição de ARN virai de comprimento total. Assim, ê aparente que a chamada fracção NP contém, além da NP, as formas activas das proteínas PB2, PBl e PA.
5.2.2. SÃO NEÇESSÃRIAS CONCENTRAÇÕES ELEVADAS DE POLIMERASE PARA A SÍNTESE DE ARN INICIADA POR TOPO
Concentrações elevadas do complexo de polimerase virai são capazes de catalisar esta transcrição específica para virus iniciados por endonucleases de topo. Sob as condições especificadas na Secção 6, infra, verificou-se que cerca de 50 ng de NP, com 200 pg das três proteínas P reagem optimamente com 5 a 10 ng de reacção de ARN. A observação foi que, apesar da NP encapsidar' selectivamente o ARNv ou o ARNc da gripe in vivo, a NP ligar-se-ã não especificamente ao ARN in vitro (Kingsbury, et al., 1987, Virology 156: 396-403; Scholtissek and Becht, 1971, J. Gen. Virol. 10; 11-16). Presumivelmente, por forma a que a polimerase virai reconhe ça os ARN virais do molde, na nossa reacção in vitro, eles têm que estar encapsidados pela NP. Assim, a adição de um iniciador de ARNm con topo competiria, essencialmente, com o molde de ARN para ligar a NP. Como não se esperava que o dinucleótido ApG ligasse a NP, a baixa concentração de polimerase só foi capaz de usar os moldes curtos com ApG. Esta hipótese ê apoiada pela observação de que a preparação de polimerase, de concentração mais elevada, ê inibida através da adição de quantidades progressivamente maio res, quer de molde de ARN , quer de qualquer ARN não específico. Deve, também, ser notado que a especificidade pouco usual para a estrutura m7GpppXm topo 1, previamente mostrada com as RNP virais foi também encontrada com as RNP reconstituídas.
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-375.2.3. MOLDES DE ADN DE COMPRIMENTO GENÕMICO SÃO
EFICIENTEMENTE COPIADOS
ARN derivado de plasmideo, idêntico ao segmento 8 do vírus A/WSN/33, foi copiado especificamente pela polimerase (usando o método PCR descrito na FIG. 10) . Em reacçôes usando ARN extraído de vírus, todos os oito segmentos eram copiados apesar do gene de HA ser copiado a um nível mais baixo. O fundo nestas reacções estava reduzido em comparação com os de 30 a 53 nt, provavelmente porque os ARN que contaminaram a preparação de polimera se eram, predominantemente, ARN defectivos, de pequeno tamanho. Moldes recombinantes codificando genes estranhos, transcritos por este sistema, podem ser usados para recuperar o gene construído, numa partícula de vírus.
5.3. PREPARAÇÃO DE VIRUS QUIMÉRICOS DE ADN DE CADEIA
NEGATIVA
Para se prepararem virus quiméricos, podem ser usados RNP reconstituídas contendo ARN modificados de vírus da gripe ou ARN que codifica proteínas estranhas, para transfectarem células que estão, também, infectadas com um virus da gripe pai. Em alternativa, as preparações de RNP reconstituída podem ser misturadas com as RNP do virus pai de tipo selvagem, e usadas directamente para transfecção. A seguir à reassociação, os novos virus podem ser isolados e os seus genomas identificados através de análise por hibridação. Em abordagens adicionais, aqui descritas, para a produção de virus quiméricos infecciosos, as RNPr podem ser replicadas em sistemas de células hospedeiras que expressam as proteínas das polimerase virai da gripe Çe.g. em sistemas de expressão virus/cêlulas hospedeira; linhas de células transformadas, manipuladas por engenharia genética para expressar as pro teínas da polimerase, etc.), de modo que os vírus quiméricos infecciosos são recuperados; neste caso não ê necessária a utiliza ção de vírus auxiliar, já que esta fracção é fornecida pelas pro teínas expressas da polimerase virai. Numa abordagem particularmente desejável, células infectadas com RNPr, construídas para os oito segmentos do virus da gripe, podem resultar na produção
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4$?
de virus quiméricos infecciosos que contêm o genotipo desejado, eliminando, assim, a necessidade de um sistema de selecção.
Teoricamente, qualquer um dos oito segmentos pode ser substituído pela sequência estranha. No entanto, uma parte necessária desta equação é a capacidade de se propagar o virus defectivo (defectivo porque lhe falta, ou está alterado, um produto nor mal do gene virai). Existe um certo número de abordagens possíveis para contornar este problema. Mostramos que mutantes do virus da gripe, defectivos nas proteínas PB2 e NP, podem ser multi plicados até títulos mais elevados, em linhas de células que foram construídas para expressar constitutivamente a polimerase e as proteínas NP (Krystal et al., 1986 Proc. Natl. Acad. Sei.
U.S.A. 83: 2709-2813). Podem ser usadas técnicas idênticas para construir linhas de células transformadas que expressam constitu tivamente qualquer dos genes da gripe. Estas linhas de células, que são feitas para exprimirem a proteína virai, podem ser usadas para complementar o def eito do virus recombinante e, por isso, propagá-lo. Alternativamente certos sistemas naturais ccm uma gama de hospedeiros podem estar disponíveis para propagar o virus re combinante. Um exemplo desta abordagem tem a ver com o isolado natural da gripe CR43-3. Este virus multiplica-se normalmente quando subcultivado em células primárias de rim de pinto (PCK) mas não se multiplicam em células de rim de carneiro de Madin-Darby (MDCK), um hospedeiro natural para a gripe (Maassab & DeBorde,
1983, Virology 130: 342-350). Quando analisamos este virus, veri ficamos que codifica uma proteína NSl defectiva, causada pela delecção de 12 aminoácidos. As células PCK contêm alguma actividade que ou complementa a proteína NSl defectiva, ou que pode substituir completamente a proteína defectiva.
Uma terceira abordagem para a propagação do virus recombinante pode envolver co-cultura com vírus de tipo selvagem. Isto pode ser feito co-infectando células hospedeiras com o vírus re combinante e com outro vírus de tipo selvagem (de preferência uma estirpe de vacina). O vírus de tipo selvagem deve complemen tar o produto defectivo de gene do virus e permitir a multiplicação do vírus de tipo selvagem e do vírus recombinante. Esta seria uma situação análoga à propagação de partículas de inter71 470
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ferência defectiva do vírus da gripe (Nayak et al., 1983, em: Genetics of influenza Vlruses, P. Palese e D. W. Kingsbury, eds., Springer-Veflag, Vienna, pp. 255-279). No caso de vírus de interferência defectiva, as condições podem ser modificadas de mo do que a maior parte dos virus propagados são partículas defectivas e não virus de tipo selvagem. Por isso, esta abordagem pode ser útil na geração de lotes de título elevado de vi rus recombinantes. No entanto, estes lotes conteriam,necessária mente, alguns virus de tipo selvagem.
Alternativamente, podem ser replicadas RNP sintéticas em células co-infectadas com virus recombinantes que expressam as proteínas da polimerase do virus da gripe. De facto, este método pode ser usado por recuperar o virus recombinante, infeccidso, de acordo com este invento. Para este fim, as proteínas da poli merase do virus da gripe em qualquer vector de expressão/sistema de células hospedeiras, incluindo, mas não lhes estando lim£ tados, vectores virais de expressão (e.g. virus vacinia, adenovirais, baculovirus, etc) ou linhas de células que expressem as proteínas da polimerase (e.g. Ver Krystal et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 2709-2713). Mais ainda, a infecção de células hospedeiras com RNPr codificando as oito proteínas do virus da gripe pode resultar na produção de partícula de vírus quiméricos, infecciosos. Este sistema eliminaria a necessidade de um sistema de selecção, já que todos os virus recombinantes produzidos seriam do genõtipo desejado. Nos exemplos aqui conti dos, descrevemos um sistema de replicação completamente sintéti^ co em que, em vez de se infectarem células com o virus da gripe, são replicadas em células RNP sintéticas, através de acção de proteínas do virus da gripe, expressas por vectores vacinia recombinantes. Deste modo mostraremos que as únicas proteínas do virus da gripe essenciais à transcrição e â replicação da RNP são as três proteínas da polimerase e a nucleoproteína.
Deve ser notado que pode ser possível construir um virus recombinante sem alterar a viabilidade do virus. Estes virus a.1 terados seriam, então, competentes para multiplicação e não necessitariam de funções auxiliares para se replicarem. Por exemplo, alterações no segmento do gene da hemaglutinina e no segmen
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-40to de gene de NS, discutidas supra, podem ser usadas para construir tais virus quiméricos viáveis.
Nos exemplos infra, é descrita a construção de um plasmideo recombinante que, a seguir à transcrição por polimerase de T7, origina um molde de ARN que ê reconhecido e transcrito in vitro pela polimerase do virus da gripe. Este molde de ARN corresponde ao ARN de NS de um virus da gripe, com a excepção de que as sequências virais de codificação estão substituídas pelas de um gene de CAT. Este molde de ARN virai, recombinante, de cadeia ne gativa foi, então, misturado com a polimerase purificada do virus da gripe, para reconstituir um complexo de RNP. O complexo de RNP recombinante foi transfectado em células que foram, então, infectadas com virus da gripe, levando à expressão de actividade de CAT.
Um certo número de factores indica que este sistema representa um complexo de RNP recombinante, biologicamente activo que se encontra sob controlo apertado dos sinais de transcrição, replicação e empacotamento de ARN de virus da gripe. Primeiro, o gene de CAT ê de polaridade negativa no ARN virai recombinante usando para a transfecção com RNP. Assim, o ARN que chega não pode ser traduzido directamente na célula e deve, primeiro, ser transcrito pela polimerase do virus da gripe para permitir a tradução e a expressão do gene de CAT. Segundo, um ARN recombinante, nu transfectado sozinho em presença do virus auxiliar, nem o comple xo de RNP recombinante na ausência de virus infectante auxiliar, têm sucesso na indução da actividade de CAT. Isto sugere que as proteínas virais da gripe proporcionadas pela RNP que chega, bem como pelo virus infectante auxiliar, são necessárias para a ampli ficação do molde de ARN recombinante. Finalmente, após transfecção com RNP e infecção pelo virus auxiliar emergem partículas de vírus que, aparentemente, contêm o ARN recombinante, jã que estas partículas, também, induzem actividade de CAT em células recentemente infectadas. Estes resultados sugerem que os 26 nucleõ tidos do terminal 3' e os 22 nucleótidos do terminal 5’, correspondentes aos nucleótidos terminais no ARN de NS do virus A da gripe, sao suficientes para proporcionarem sinais para transcrição e replicação pela polimerase, bem como para o empacotamento
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do ARN em partículas.
Os resultados precedentes, que definiram as sequências que actuam de forma cis, necessárias para transcrição, replicação e empacotamento de ARN do vírus da gripe, foram ampliados por exem pios de trabalho adicionais, descritos infra, que demonstraram que se podem usar técnicas de ADN recombinante para induzir muta ções dirigidas a sítio em genomas de vírus da gripe infecciosos.
ARN sintéticos, derivados por transcrição in vitro de ARN de plasmídeo, forma usados em experiências de transfecção com RNP para recuperar vírus da gripe, infecciosos. Para permitir a selecção deste vírus, escolheu-se um sistema que necessitava da presença de um gene da neuraminidase idêntico a WSN no virus re cuperado. Virus contendo este gene podem multiplicar-se em célu las MDBK, na ausência de protease no meio (Schulman et al., 1977, J. Virol. 24: 170-176). O virus auxiliar WSN-HK não se multipli ca nestas circunstâncias. Claramente, existem sistemas de selecção alternativos. Por exemplo, écrans de anticorpos, ou mutantes condicionalmente letais podem ser usados para isolar virus recuperados contendo ARN derivados de ADN de plasmídeo. Nas experiências, os virus descritos infra, virus que eram idênticos a virus WSN, foram recuperados. O gene da NA do WSN foi derivado de ADN de plasmídeos ou de virião de ARN de WSN purificado (FIG. 17, faixas 2 e 5). No último caso, usando o ARN do virião, completo, para a transf ecção com RNP, não se sabe se, também se tranferiram outros genes para o vírus recuperado, jã que o vírus auxiliar partilha os sete genes restantes com o vírus WSN. Os vírus recuperados tinham os padrões de ARN esperados (FIG. 17) e multiplicaram-se em células MDBK e MDCK, até títulos que eram indis tintos dos do virus WSN de tipo selvagem. Deve notar-se que a recuperação de um ARN de NA, contendo uma delecção de um único nucleótido na região 5’ não traduzida, não foi possível. Isto, uma vez mais ilustra a importância de sequências reguladoras pre sentes nas regiões não traduzidas dos ARN do virus da gripe. Foram, também, recuperados virus usando ARN que foi construído para conter 5 mudanças de nucleõtidos numa região com o comprimento de 39 nucleõtidos (FIG. 16). Verificou-se a presença destas mutações no vírus mutante recuperado por sequenciação directa do
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ARN (FIG. 18). Estas mutações não resultaram em qualquer mudança de aminoácidos na proteína neuraminidase e, assim, nao se esperava que mudassem a propriedade biológica do vírus. Apesar deste vírus não ter sido estudado extensivamente, o seu comportamento na formação de placas e as suas características de crescimento não se distinguiam das do vírus WSN do tipo selvagem. Usando esta tecnologia, podem ser introduzidas mutações que mudem as características biológicas do vírus da gripe. Estes estudos ajudarão as distinguir as funções precisas de todas as proteínas virais, incluindo a das proteínas não estruturais. Adicionalmente, as regiões do genoma não traduzidas podem ser estudadas por mutagénese, o que deve levar a uma melhor compreensão dos sinais reguladores presentes em ARN virais Uma ãrea adicional de grande interesse relaciona-se com o desenvolvimento do sistema do vírus da gripe como um vector de vacina.
5.4. FORMULAÇÕES DE VACINA USANDO OS VIRUS QUIMÉRICOS
Qualquer sequência de gene heterõlogo pode, virtualmente, ser construída no vírus quimérico do invento para uso em vacinas. De preferência, epitopos que induzem uma resposta imunitária pro tectora para qualquer um duma variedade de patogénios, ou antigê nios que ligam anticorpos neutralizadores, podem ser expressos por, ou como parte dos vírus quiméricos. Por exemplo, sequências de gene heterõlogo que podem ser construídos nos virus quiméricos do invento para uso em vacinas, incluem,mas não lhes estão limitadas, epitopos do virus da imunodeficiência humana (HIV), tais como gpl20; antigénio de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg); as glicoproteínas do vírus do herpes (e.g. gD, gE); VPl do poliovirus; determinantes antigênios de patogénios não virais, tais como bactérias e parasitas, nomeando só alguns. Numa outra concretização, todos, ou porções dos genes da imunoglobulina podem ser expressos. Por exemplo, regiões variáveis de imunoglobulinas anti-idiotípicas que simulam tais epitopos podem ser construídas nos virus quiméricos do invento.
Pode ser formulada quer uma vacina virai recombinante viva, quer uma vacina virai recombinante inactivada. Uma vacina viva pode ser preferida porque a multiplicação no hospedeiro leva a um estímulo prolongado de tipo e magnitude idênticos aos que ocor-
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rem em infecções naturais, e, consequentemente, confere imunidade substancial, de longa duração. A produção de tais formulações de vacinas de virus recombinante, vivo, pode ser conseguida usan do métodos convencionais que envolvem a propagação do virus numa cultura de células ou precursor da bexiga urinária do embrião da galinha, seguido de purificação.
Sob este aspecto, o uso de vírus da gripe manipulados por engenharia genética (vectores) para fins de vacina, pode necessitar da presença de características de atenuação nestas estirpes. Os candidatos correntes para vacinas de vírus para uso em humanos são, ou adaptados ao frio, sensíveis à temperatura, ou subculti vados de modo a derivarem alguns (seis) genes de vírus de aves > o que resulta em atenuação. A introdução de mutações adequadas (e.g. delecções) nos moldes usados para transfecção, pode originar novos vírus com características de atenuação. Por exemplo muta ções sem sentido específicas que estão associadas à sensibilidade ã temperatura ou adaptação ao frio, podem ser transformadas em mutações por delecção. Estas mutações devem ser mais estáveis do que as mutações pontuais associadas com mutantes sensíveis ao frio ou à temperatura e as frequências de inversão devem ser extremamente baixas.
Alternativamente, podem ser construídos vírus quiméricos com características suicidas. Tais vírus sofreriam um ou poucos ci cios de replicação no hospedeiro. Por exemplo, a clivagem da HA é necessária para permitir a re-iniciação da replicação. Assim, mudanças no sítio de clivagem de HA podem produzir um virus que se replica num sistema de células adequado, mas não no hospedeiro humano. Quando usado como uma vacina, o vírus recombinante so freria um único ciclo de replicação e induziria um nível suficiente de resposta imunitária, mas não avançaria mais no hospedeiro humano, não causando doença. Vírus recombinantes a que lhes falta um ou mais dos genes essenciais do vírus da gripe, não serão capazes de sofrer vários ciclos de replicação. Podem-se produzir tais vírus defectivos co-transfectando RNP reconstituídas a que lhes falta um gene(s) especif ico (s)f em linhas de células que expressam este(s) gene(s) permanentemente. Vírus a que lhes falta(m) um(s) gene(s) essenciai(s) serão replicados nestas linhas de cê71 470
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lulas, mas quando administradas ao hospedeiro humano, nao serão capazes de completarem um ciclo de replicaçao. Tais preparações podem transcrever e traduzir — neste ciclo incompleto — um nú mero suficiente de genes para induzir a resposta imunitária. Em alternativa, podem ser administradas maiores quantidades das es tirpes, de modo que estas preparações servem como vacinas de ví rus inactivados (mortos) . Para vacinas inactivadas é preferido que o produto de gene heterõlogo seja expresso com um componente viral, de modo que o produto de gene seja associado com o virião. A vantagem de tais preparações reside no facto de elas conterem proteínas nativas e não sofrerem inactivação por tratamento com formalina ou outros agentes usados na manufactura de vacinas de vírus mortos.
Numa outra concretização deste aspecto do invento, podem ser preparadas formulações de vacinas activadas, usando técnicas convencionais para matar os virus quiméricos. Vacinas inactivadas estão mortas no sentido de a sua capacidade de in fecção ter sido destruída. Idealmente, a infecciosidade do vírus é destruída sem se afectar a sua imunogenicidade. De modo a se prepararem vacinas inactivadas de vírus quimérico pode ser feito crescer em cultura de células ou no percursor da bexiga urinária de embrião de pinto purificado por ultracentri fugação zonal, inactivado por formaldeído ou (5-propiolactona, e reunidos. A vacina é, usualmente, inoculada intramuscularmente.
Virus inactivados podem ser formulados com um auxiliar ade quado, de modo a aumentar a resposta imunitária. Tais auxiliares podem incluir, mas não lhes estão limitados, geles minerais, e.g, hidróxido de alumínio; substâncias surfactantes como lisoleciti na, polióis plurõnicos, polianiões, pêptidos; emulsões de óleo; e adjuvantes humanos potencialmente úteis, tais como BCG e Corynebacterium parvum.
Podem ser usados muitos métodos para introduzir as formulações de vacinas descritas acima, estes incluem, mas não lhes estão limitados, vias orais, intradêrmicas, intraperitoneais, intravenosas, subcutâneas e intranasais. Pode ser preferível introduzir a formulação da vacina de virus quimérico através da via natural de infecção pelo patogênio para o qual a vacina ê concebida. Quando ê usada uma preparação de vacina de vírus qui71 470
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mêrico vivo, pode ser preferível introduzir a formulação através da via natural da infecção pelo vírus da gripo. A capacidade do vírus da gripe induzir uma vigorosa resposta secretora e celular, imunitária pode ser usada com vantagem. Por exemplo, a infecção do tracto respiratório pelos vírus quiméricos da gripe pode indu zir uma forte resposta imunitária secretora, por exemplo, no sis^ tema uro-genital, com concomitante protecção contra um agente causador de doença particular.
6. EXEMPLO:ANÃLISE DE PROMOTOR DA ARN POLIMERASE
VIRAL DA GRIPE
Nos exemplos descritos abaixo, foi preparada polimerase que estã esgotada em ARN genõmico a partir das fracçoes superiores da centrifugação em gradiente de CsCl-glicerol. Esta polimerase ê capaz de transcrever moldes de modelo curto, que são derivados da transcrição de ARN de plasmídeo adequado, com ARN polimerase de bacteriófago T7, duma forma específica para a sequência. Os terminais deste ARN modelo são idênticos aos. 15 nucleótidos do terminal 3’ e aos 22 nucleótidos do terminal 5', conservados no segmento 8 de todos os ARN virais A da gripe. Manipulando o pla£ mídeo de modo a se prepararem ARN diferentes para servirem como moldes, demonstrou-se que o reconhecimento e síntese a partir des^ te ARN modelo ê específico para o promotor na sequência terminal 3' e não necessita do cabo (panhandle”). Em adição, a mutagénese especifica de sítio identifica as posiçoes dos nucleótidos responsáveis pelo favorecimento, pela polimerase virai, da síntese a partir de moldes de sentido genõmico, relativamente a ARN de sentido complementar. Encontraram-se também situações nas cruais a sínte se de ARN iniciada por endonuclease de topo usando ARN modelo, podia ser observada. Em adição, o sistema reconstituído permitir a síntese especifica do vírus, a partir de ARN de comprimento genõmico, de rivado quer de plasmídeos, quer de ARN purificado a partir de virus, por extracção com fenol.
6.1. MATERIAIS E MÉTODOS
6.1.1. PURIFICAÇÃO DA ADN POLIMERASE VIRAL
Foram preparados núcleos de RNP a partir de virus completos
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usando métodos padrão (Plotch et al., 1981 Cell 23: 847-858, Rochavansky, 1976, Virology 73: 327-338). Romperam-se dois a três miligramas de virus por incubação em Triton N-101, 1,5% lisolecitina 10 mg/ml, tris-HCl 100 mM, pH 8,0, KCl 100 mM,
MgCl2 5 mM, glicerol 5% e ditiotreitol 1,5 Μ. A amostra foi fraccionada por centrifugação num gradiente em degrau de glice rol 30-70% (p/v), na presença de tris-HCl 50 mM, pH 7,8 e NaCl 150 mM. A preparação de núcleos foi centrifugada a 45 000 rpm num rotor SW50.1, durante 4 horas a4°C. Fracções enriquecidas em RNP foram identificadas por electroforese em SDS-gel de poliacrilamida de amostras de proteína de cada fracção, e coloração com prata. As fracções do núcleo foram, então sujeitas a uma segunda centrifugação em gradiente, como descrito em Honda et al., 1988 J. Biochem. 104: 1021-1026. Este segundo gradiente tinha degraus de 0,5 ml de CsCl 3,0 M e glicerol 45% (p/v), 1,75 ml de CsCl 2,5 M e glicerol 40%, 1,25 ml de CsCl 2,0 M e glicerol
35% e 10 ml de CsCl 1,5 M e glicerol 30%. Todos os degraus foram tamponados com tris-HCL 50 mM, pH 7,6, e NaCl 100 mM. Depositaram-se numa camada, no topo, 0,5 ml de núcleos de RNP e a amostra foi centrifugada a 45 000 rpm num rotor SW50.1 durante 25 horas, a 4°C. As fracções de polimerase foram, novamente, identificadas por electroforese em SDS-gel de poliacrilamida das amostras de proteína e coloração com prata. As fracções de poli merase activa foram, geralmente, encontradas na região do grad£ ente que se correlaciona com 1,5 a 2,5 M de CsCl, Estas fracções foram reunidas e, então, dializadas contra tris-HCl 50 mM, pH 7,6; NaCl 100 mM e MjC^ 10 mM, e concentradas em tubos centricon-10 (Amicon) , ou as fracções foram dializadas, em sacoq, contra tris-HCl 50 mM, pH 7,6, NaCl 100 mM, MgC^ 10 mM, ditiotreitol 2 mM e glicerol 50%.
6.1.2. PREPARAÇÃO DO PLASMIDEO
O esquema do plasmideo ê indicado na FIG. 2. Preparou-se a inserção de ADN para o plasmideo pV-wt, usando um sintetizador Applied Biosystems. A cadeia de cima era 5'-GAAGCTTAATACGACTCACTATAAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTCATATCATTTAAACTTCACCCTGCTTTTGCTGAATTCATTCTTCTGCAGG-3'. A cadeia do fundo foi sintetizada por extensão pór iniciador com 5'-CCTGCAGAAGAATGA-3' como iniciador. O
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ADN de 95 bp foi digerido com HindIII e PstI e purificado por extracção com fenol/clorofórmio, precipitação com etanol, e passagem sobre uma coluna de permuta iónica prê-empacotada com NACS (Bethesda Research Laboratories). Este ADN foi ligado no pUC-19 que tinha sido digerido com HindIII e PstI e, então, usado para transformar a estirpe DH5-ú( da E. Coli, que tinha sido tornada competente usando protocolos padrão. Espalharam-se as bactérias em placas de ágar contendo X-gal e IPTG, e verificou-se que colo nias azuis tinham o plasmídeo que continha a inserção prevista, já que a pequena inserção conservava a estrutura de leitura de lacZ e não possuia um codão de terminação. 0 plasmídeo pM-wt foi preparado por uma estratégia similar, com a excepçâo de ambas as cadeias serem sintetizadas quimicamente, tendo a cadeia de cima a sequência 5'-GAAGCTTAATACGACTCACTATAAGCAAAAGCAGGGTGAAGTTTAAATGATATGAAAAAACACCCTTGTTTCTACTGAATTCATTCTTCTGCAGG-3'. .
O plasmídeo pV-d5* (FIG. 2) foi preparado usando os oligonucleótidos 5 ' -AGCTTAATACGACTCACTATAAGATCTATTAAACTTCACCCTGCTTTTGCTGAATTCATTCTTCTGCA-3' e 5'-GAAGAATGAATTCAGCAAAAGCAGGGTGAAGTTTAATAGATCTTATAGTGAGTCGTATTA-3'. Os ADN foram temperados e ligados no pUC-19, digerido com Hind11Γ/Ps11, e verificou-se que colónias brancas continham o plasmídeo correcto porque esta inserção resulta em deslocamento da estrutura no gene lacZ.
Os mutantes pontuais foram isolados a seguir à digestão do pV-d5' com BglII e PstI e ligação do plasmídeo linearizado com um oligonucleótido de cadeia única, de composição mista. Como o BglII deixa uma extensão 5' e o PstI uma extensão 3', só foi necessário um único oligonucleótido para a ligação da inserção. A célula foi, então, capaz de reparar lacunas causadas pela falta de um oligonucleótido complementar. Os oligonucleótidos foram projectados para repararem o deslocamento de estrutura no gene lacZ de modo que as bactérias que continham os plasmídeos mutantes eram seleccionada pela sua cor azul.
O plasmídeo pHgaNS, que foi usado para preparar um ARN idên tico ao segmento 8 do A/WSN/33, foi preparado usando os iniciadores 5'-CCGAATTCTTAATACGACTCACTATAAGTAGAAACAAGGGTG-3' e 5’-CCTCTAGACGCTCGAGAGCAAAAGCAGGTG-3' numa reacção em cadeia de polimerase, total, dum clone de ADNc. 0 produto foi, então, clonado na janela Xbal/EcoRl do pUC19.
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6.1.3. PREPARAÇÃO DE MOLDES DE ARN
ADN de plasmídeos, foram digeridos com MboII ou com outras endonucleases apropriadas (Ver FIG. 2) , e o ADN linearizado foi transcrito usando a ARN polimerase do bacteriófago T7. Os trans critos impressos foram tratados com RNase- DNase 1 livre e, en tão, o ARN foi purificado das proteínas e dos nucleõtidos livres usando colunas de permuta iónica Qiagen tip-5 (Qiagen Inc.). A seguir à precipitação em etanol, os ARN purificados foram ressus pensos em ãgua e analisou-se uma amostra por electroforese, seguindo-se coloração, com prata, do gel de poliacrilamida, de modo a se quantificar o rendimento em ARN.
6.1,4. REACÇÕES DA POLIMERASE VIRAL DA GRIPE
Misturaram-se num volume total de 25 y<l, cerca de 30 de nucleoproteína e um total de 200 pg das três proteínas da polimerase, com 10 ng do molde de ARN e a solução foi completada de modo a se obter uma concentração final de: Hepes 50 mM, pH 7,9, NaCl 50 mM, MgCl2 5mMfditiotreitol 1 mM, NP-40 0,05%, dinucleótido adenilil- (3'-5') -guanosil (ApG) 0,4 mM, (Pharmacia) , ATP 0,5 mM,
GTP 0,5 mM, CTP 0,5 mM e, aproximadamente o( - P-UTP 0,6 y<M (40/(Ci a 3000 Ci/mmole, New England Nuclear). As misturas reac cionais foram construídas em gelo e, então, transferidas para um banho de água a 30°C, durante 90 minutos. Terminaram-se as reacções por adição de 0,18 ml de acetato de sódio 0,3 M/EDTA 10 mM, gelada, e as misturas reaccionais foram, então, extractadas com fenol/clorofõrmio (razão de volumes 1:1).. A seguir ã primeira extracçâo, adicionaram-se 15 ytg de ARN polil-poliC como porta dor, e a amostra foi extractada, novamente com fenol/clorofõrmio As amostras foram, então extractadas com éter e precipitadas em etanol. A seguir à centrifugação, a pelota de ARN foi lavada duas vezes com etanol 70% e, então, seca sob vácuo.
Em reacções usando a polimerase de concentração elevada, as condições foram idênticas às descritas acima, com a excepção de se terem juntado 20 ng do molde de ARN. Em reacções usando ARN de comprimento genómico, a quantidade de polimerase usada foi duplicada, usaram-se 50 ng do molde de ARN, e a concentração de UTP foi aumentada para 2,6 ^M.
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ARN foi ressuspenso numa mistura corante contendo formamida 78%, EDTA 10 mM, xllenocianol 0,1% e azul de bromofenol 0,05% Tipicamente, uma amostra deste ARN sofreu electroforese em gel de poliacrilamida a 8% na ausência de ureia, e o restante foi des naturado por aquecimento a 100°C durante 1,5 minutos e carregou-se uma àlíquota em gel de poliacrilamida, contendo ureia 7,7 M.
Os geles foram fixados por um procedimento em dois passos, primeiro ãcido acético 10% e, então, em metanol 25%/ãcido acético 8%. Os geles foram secos sobre papel de filtro e, então, exposto a filme de raios-X.
Quando os diferentes ARN estavam a ser testados quanto â sua utilidade como moldes, as diferentes preparações de ARN foram sempre analisadas em gel de poliacrilamida e coradas com prata, de modo que se usaram iguais quantidades de cada molde. Para quantificar a quantidade de produtos, os geles foram expostos a filme de raios-X na ausência de um écran intensificador de modo a se melhorar a linearidade das leituras densitomêtricas. As auto -radiografias foram analisadas usando um densitómetro de varrimen to FB910 (Fisher Biotech) e os picos foram analisados usando software de computador da Fisher Biotech.
6.1.5. ANÃLISE POR NUCLEASE DOS PRODUTOS DE REACÇÃO
Para a análise por ribonuclease de Tl dos dois promotores de ARN principais, os produtos de reacção foram analisados por electroforese em gel de poliacrilamida a 8% (sem meio) e o gel não foi tratado com fixador. O gel húmido foi exposto a um fil me de raios-X e as partes apropriadas do gel foram localizadas e excisadas. 0 pedaço do gel foi esmagado num volume de 0,3 ml contendo tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, dodecilsulfato de sódio 0,1% e 1 yi\g de ARNt como portador. O ARN difundiu-se nesta solução durante 3 horas e, então, o gel foi pelotizado e adicionou-se acetato de sõdio ao sobrenadante atê à concentração de 0,3 M. 0 sobrenadante foi, então, extractado duas vezes com fenol/clorofõrmio e uma vez com éter e, então, precipitado em eta noi. A pelota de ARN foi ressuspensa em 5 />1 de formamida, desnaturada em água em ebulição durante 1,5 minutos e, então, dilui da por adição de 0,1 ml de tris-HCl 10 mM, pH 7,5, e EDTA 1 mM. Foi adicionada ribonuclease de Tl (50 unidades, Boehinger Ma71 470
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nheim Biochemicals) e as amostras foram incubadas durante 60 minutos a 37°C. ARN V-wt e H-wt, sintetizados com ARN polimerase de T7 na presença de d- P-UTP, foram digeridos duma forma si milar com RNase de Tl. Os produtos da reacção foram extraídos com fenol/clorofórmio e precipitados em etanol e, então, analisa dos em geles de poliacrilamida a 20% contendo ureia 7,7 M.
A análise por nuclease de Sl dos produtos da reacção foi fei ta no ARN transcrito, terminando, primeiro, a reacção padrão da polimerase, através da adição de tampão Sl a vim volume de 0,2 ml com NaCl 0,26 M, acetato de sódio 0,05 M, pH 4,6, e sulfato de zinco 4,5 mM. A amostra foi dividida em dois volumes de 0,1 ml e adicionaram-se a um tubo 100 unidades de nuclease de Sl (Sigma Chemical Company). As amostras foram incubadas durante 60 minutos a 37°C. A seguir â incubação, adicionaram-se EDTA (concentração final 10 mM) e 15 /ug de ARN polil-poliC e a amostra foi extractada com fenol/clorofórmio e precipitada em etanol. As amostras foram, então, sujeitas a electroforese em gel de poliacrilamida.
6.2. RESULTADOS
6.2.1. PREPARAÇÃO DE ARN POLIMERASE VIRAL DA GRIPE
E DO MOLDE DE ARN
Prepararam-se núcleos de RNP do virus A/Puerto Rico/8/34 da gripe por rompimento do vírus em lisolecitina e Triton N-101, seguido de centrifugação em gradiente de glicerol (Rochavansky, 1976, Virology 73: 327-338). As fracçóes contendo núcleos foram, então, sujeitas a uma segunda centrifugação num gradiente em de grau de CsCl-glicerol (Honda et al., J. Biochem. 104: 1021-1026). As fracções contendo a polimerase foram identificadas por electroforese em gel, de amostras, seguida de coloração com prata. A FIG. 1 mostra a preparação de polimerase após centrifugação em CsCl. Durante a diálise adicionou-se albumina de soro bovino (BSA) para protecção contra a perda de proteína. A pesquisa den sitométrica da faixa 4, comparada com quantidades conhecidas do vírus completo nas faixas 1 e 2, permitiram-nos estimar que as proteínas na faixa 4 consistem de 150 ng de NP e de cerca de 1 ng do total das três proteínas da polimerase. Usou-se ura quinto da preparação usada para este gel, por reacção.
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Representa-se na figura 2 o esquema global dos plasmideos usados neste estudo para preparar os moldes de ARN. Toda a inser ção foi preparada usando oligonucleotidos de um sintetizador de ADN que foram, então, clonados no poliligador do pUCl9. A inserção continha uma sequência promotora truncada reconhecida pela ARN polimerase do bacteriófago T7 (Studier e Dunn, 1983, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, xlvii, 999-1007) de modo que os primeiros nucleótidos a serem sintetiza dos foram os 22 nucleótidos (nt) terminais da sequência da extre midade 5' do ARN do genoma. Quando o plasmideo foi cortado com a endonuclease de restrição Mboll (que corta sete bases a montante do seu sítio de identificação), o ARN que resultou da transcrição com ARN polimerase de T7 terminava com os nucleótidos terminais de 3' da sequência virai da gripe. Incluído na sequência estava o troço poli-U adjacente à extremidade 5’ do terminal conservado, o qual se pensa que compreende, pelo menos uma parte do sinal de terminação de poliadenilação (Robertson, et al., 1981, Virol. 38, 157-163) . O comprimento total deste ARN genómico modelo era 53 nt, jã que um separador de 16 nt separava as sequências conservadas dos terminais. 0 ARN modelo que continha ambos os termi nais idênticos aos do ARNv foi chamado V-wt. O ARN M-wt codifica va a cadeia complementar exacta do V-wt de modo que os terminais emparelham com os do ARN complementar (ARNc) . O V-wt e o M-wt fo ram construídos para servirem de moldes para os ARNv e ARNc, específicos para o virus da gripe, respectivamente.
6.2.2, A POLIMERASE VIRAL CATALISA A SÍNTESE DE
UMA CÕPIA DE COMPRIMENTO TOTAL DO MOLDE
Na reacção usando a polimerase virai da gripe, o molde V-wt e o iniciador ApG, obteve-se um produto que co-migrava com unj ARN de 53 nt em geles desnaturantes, Tambên) se observou ARN que migrava como um dupleto numa posição de cerca de 40 a 45 nucleõtidos (FIG. 3A faixa 2) . Mostra-se mais adiante que este pro duto mais curto ê o ARN que tinha terminado num troço de adenosinas presente entre os nucleótidos 43-48, no molde de sentido do virião. Em adição aos transcritos específicos dos moldes, podia ser observado um fundo geral de bandas claras que correspondiam a produtos de ARN, truncados, transcritos do ARN genómico virai,
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não removido durante o passo de centrifugação em gradiente de CsCl-glicerol. Quando não e usado qualquer Iniciador, não se observa o produto da transcrição específica (FIG. 3A, faixa 3) . Experiências adicionais mostraram que o ARNm de globina, contendo uma estrutura de topo 1 terminal, era inactivo como iniciador, usando as prepara ções iniciais de polimerase. Quando a reacção da polimerase foi terminada pela adição, em excesso, de tampão favorável à digestão por nuclease de Sl, e se adicionou nuclease, o produto marcado radioactivamente era resistente à digestão (FIG. 3B, faixa
2) . Em contraste, estas condições eram eficientes para digerirem muito eficientemente a digestão do ARN V-wt de cadeia simples sin tetizado radioactivamente com a ARN polimerase de T7 (FIG. 3B, faixa 3 e 4) . Estes dados de nuclease confirmaram que, efectivamente, a cadeia oposta estava a ser sintetizada nestas reacçôes.
O produto da reacção pode ser um ARN de cadeia dupla, mas não se pode excluir que o produto era, de facto, de cadeia simples e, depois, era temperado no molde dè ARN, na presença de conteúdo elevado de sal usado na reacção da nuclease.
Os produtos de ARN foram purificados por electroforese num gel da 8%, excisados, eluidos do gel, e, então, digeridos por r/ bonuclease de Tl. Os produtos foram analisados por electroforese e comparados com os padrões gerados por digestão com RNase de Tl de sondas de controlo de M-wt e V-wt, marcadas internamente. Como pode ser visto na FIG. 3C, o ARN de comprimento total (faixa 1) tem um padrão idêntico ao do ARN de sentido mais, M-wt (faixa 3), e não tem o padrão do ARN V-wt (faixa 4) . Os padrões observados eram, essencialmente, idênticos ao que é previsto a partir da se quência do ARN e, assim, mostrava que a polimerase copiava fielmente o molde V-wt. 0 ARN produto, mais pequeno, um dubleto para a maior parte dos moldes, foi, também, digerido com RNase Tl. 0 seu padrão era idêntico ao do ARN produto de comprimento total (FIG. 3C, faixa 2) com a excepção de que o oligonucleótido de 14 bases não estava presente. Em vez dele, observou-se um oligonucleõtido fraco de 13 bases, indicando, assim, a terminação de ARN curto atê à posição 44, um local em que seriam incorporadas duas uridinas. Como a quantidade de ARN produto, mais pequeno, diminuía a concentrações mais elevadas de UTP e desaparecia quando se usa va CTP como marcador, estas bandas pareceram ser um produto devi
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-53do a baixas concentrações de uTP na reacção da polimerase.
6.2.3. CONDIÇÕES PARA AS REACÇÕES DA POLIMERASE
USANDO MOLDES DE ARN MODELOS
Verificou-se que amostras de proteínas contendo cerca de 30 ng de proteína NP e cerca de 200 pg, totais, das três proteínas P, reagiram optimamente com 5 a 10 ng de ARN. Usando ARN competidor frio, polil-poliC, verificou-se que um excesso de ARN inibia não especificamente a transcrição, possivelmente através de ligação não específica da proteína NP (Kingsbury, et al., 1987, Virology 156: 396-403; Scholtissek e Becht, 1971, J. Gen. Virol. 10: 11-16). Na ausência do competidor não específico, variações na quantidade do molde entre 1 ng e 10 ng produziram pouca alteração na eficiência da síntese do ARN. A proteína NP e o ARN estavam presentes em concentrações molares aproximadamente iguais, e estas estavam, cada uma, num excesso de cerca de mil vezes relativamente ao numero de moles do complexo formado pelas três pro teínas P (assumindo-o como 1:1:1) , na reacção típica.
Como estas RNP reconstituídas eram capazes de usar ApG, mas não ARNm de glcbina como iniciador, testámos estas RNP modelo relativamente a outras variáveis da reacção de transcrição. Em todas as outras formas em que foram testadas, as RNP reconstituídas comportaram-se em solução duma forma similar às RNP purificadas a partir de vírus rompidos por detergente. A temperatura para a síntese do ARN era 30°C (FIG.4A, faixa 2) , como foi repetidâmente verificado para a polimerase virai (Bishop, et al.,
1971, J. Virol. 8: 66-73; Takeuchi, et al., 1987, J. Biochem.
101: 837-845; Ulmanen, et al., 1983, J. Virol, 45: 27-35). Também as condições mais activas de sal eram NaCl 60 mM (FIG. 4B, faixa 2) , novamente, consistentes com as condições usadas por vãrios grupos (Bishop, et al., 1971, J. Virol. 8: 66-73; Honda, et al., 1988, J. Biochem. 104: 1021-1026; Shapiro e Krug, 1988, J. Virol. 62: 2285-2290) . A Figura 4C mostra o decurso no tempo de uma experiência. A quantidade de síntese do ARN parece aumentar duma forma grosseiramente linear durante os primeiros 90 minutos, como foi verificado para RNP virais (Takeguchi, et al., 1987, J. Bio71 470
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-54chem. 101: 837-845).
6.2.4, ESPECIFICIDADE DA REACÇÃO DE ALONGAMENTO
Foram testados vários ARN para se verificar a sua aptidão como moldes para o ARN polimerase do virus da gripe. O clone do plasmideo pV—wt foi digerido quer com EcoRI, quer com PetI ou com Smal, e usou-se a polimerase de T7 para transcrever o ADN. Isto resultou em ARN idênticos a V-wt com a excepção da adição de 5, 13 e 38 nt na extremidade 3’. Na FIG. 5A mostra-se uma sobreexposição de uma autoradiografia para demonstrar que não se observaram quaisquer transcritos em fundo em reacções que continham como molde: dois dos ARN idênticos a V-wt com a excepção de eles conterem 13 e 38 nt de uma sequência extra no terminal 3' (faixas 1 e 2) ; um ADN de cadeia simplescom sequência idêntica à do V-wt (faixa 4) ; e um ARN não relacionado, de 80 nt, gerado por transcrição do poliligador do pIBI-81 com ARN polimerase de T3 (faixa 5). No entanto, o molde V-Eco contendo cinco nucleõtidos extra na extremidade 3' podia ser reconhecido e fielmente trans crito, apesar de o ser com uma eficiência de aproximadamente um terço da do ARN V-wt de tipo selvagem (FIG. 5B, faixa 3) . É interessante notar que a iniciação no ARN V-Eco pela polimerase virai da gripe parecia ocorrer na base correcta, já que o ARN trans; crito tinha o mesmo tamanho que o produto do molde V-wt.
6.2.5 ANALISE DA REGIÃO PROMOTORA PARA A ARN
POLIMERASE VIRAL
A construção original usada para estes estudos continha a sequência de ambos os terminais de ARN do ARN genõmico que podiam emparelhar bases e, assim, formar um cabo. Isto foi feito porque foi demonstrado que o ARNv em viriões e em RNP em células infectadas estava numa conformação circular através do cabo (panhandle) com 15 a 16 nt de comprimento (Honda, et àL., 1988, J. Biochem. 104: 1021-1026; Hsu, et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 8140-8144). Mostrou-se, ainda que a polimerase virai estava ligada â estrutura de cadeia dupla (Hon da, et al., 1988, J. Biochem. 104: 1021-1026),o que leva à suges-
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tão de que o promotor para a síntese do ARN era o cabo.
De modo a testar se o cabo (panhandle) era um requisito absoluto para o reconhecimento, usaram-se os seguintes moldes: o plasmideo pV-wt foi digerido com Dral antes da transcrição por polimerase de T7 (FIG. 2). Isto deveria resultar numa molécula de ARN de 32 nt contendo só sequências específicas de vírus da extre midade 5' do ARN. Quando este ARN foi usado como molde, não se produziu qualquer produto aparente (FIG. 5B, faixa 2). Assim, o terminal 3’ do ARN de virião ê necessário para esta reacção. Esta conclusão ê consistente com o facto de o sítio de iniciação na extremidade 3’ do V-wt não estar presente em V-Dra. Produziu-se um segundo clone de plasmideo que fazia a delecçào das sequências 5’ terminais mas mantinha intacto o terminal 3*. Este clone, pV-d5’, quando digerido com MboII e usado para transcrição por polimerase de T7 produziu um transcrito principal de 30 nt e espécies secundárias de 29 e 31 nt. Surpreendentemente, este molde foi reconhecido e copiado pela polimerase virai da gripe, A FIG.
7, faixa 1, mostra que o produto da reacção da ARN polimerase v£ ral com V-d5' contém bandas múltiplas que reflectem o ARN de entrada. Quando os produtos mostrados na FIG. 7, faixa 1, foram eluídos dos geles e sujeitos a anãlise por RNase de Tl, foi observado o padrão esperado do produto de transcrição do V-d5'. Como o molde de ARN V-d5' foi copiado, o cabo (panhandle) não ê necessário para ligação da polimerase virai e para a síntese.
Apesar de o terminal 5' não ser necessário para a síntese pela polimerase, era uma possibilidade distinta que o ARN V-wt fosse um molde preferido quando comparado com o V-d5’. De modo a examinar isto, foram feitas reacções nas quais os moldes foram misturados. O ARN V-wt estava presente em 5 ng em cada reacção,
V-d5' ou estava ausente (FIG. 6, faixa 1) ou estava presente numa razão molar de 1/5 (FIG. 6, faixa 2) ou numa razão molar 1/1 (FIG. 6, faixa 3). As intensidades relativas das bandas de cada ARN foram determinadas por densitometria da auto-radiografia. Os valores foram corrigidos para a quantidade do nucleótido radioactivo, UTP, que podia ser incorporado em cada produto, e o valor foi normalizado de modo que o nível de síntese em cada faixa foi ajustado igual a um. 0 nível de cópia do V-wt diminuiu com Q au-
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-56mento do de V-d5'. Quando o V-d5' estava presente numa razão molar de um quinto, o seu nível de sintese corrigido era cerca de um quarto do do V-wt (FIG. 6, faixa 2). Quando os moldes se encontravam presentes em quantidades equimolares, o nível de síntese do V-wt era de cerca de 60% do total (FIG. 6, faixa 3) o que poderá estar dentro do limite esperado de erro experimental para níveis equivalentes de síntese. Obtiveram-se resultados idênticos quando ARN V-d5' foi mantido constante e o ARN V-wt foi variado. Concluiu-se, assim, que o ARN V-wt contendo o cabo não era muito favorecido relativamente ao molde de ARN que só continha o terminal 3’ adequado.
6.2.6. A POLIMERASE VIRAL NÃO COPIA MOLDES DE ARN
CONTENDO TERMINATS' DE SENTIDO POSITIVO
Tal como descrito anteriormente, a ARN polimerase da gripe realiza três actividades dintintas durante o decurso de uma infecção. Duas actividades envolvem a transcrição do ARN de sentido genõmico e a terceira envolve a cópia do ARN de sentido comple mentar no ARNv. Construímos, assim, um molde de ARN que continha os terminais 5 ’ e 3' do ARN de sentido complementar do segmento 8 (M-wt; FIG. 2).
Quando o ARN M-wt foi usado como molde, foi observada pouca síntese (FIG. 5B, faixa 4) . Em duas experiências usadas para determinação quantitativa, o nível médio de síntese a partir do ARN M-wt era 4% da do V-wt. Comparando os promotores de ARN V-wt e M-wt, o M-wt tem sõ três mudanças de transição e uma inserção pon tual dentro dos 15 nucleõtidos de 3'.Estas incluem uma mudança de G para A na posição 3, uma mudança de U para C na posição 5, uma mudança de C para U na posição 8 e uma inserção de u entre o nono e o décimo nucleõtidos (ver Tabela II, abaixo) . De modo a determinar quais das quatro diferenças pontuais nos terminais 3 ’ eram responsáveis pela especificidade, muitas destas combinações foram preparadas e testadas relativamente à eficiência como um molde, (FIG. 7) . Estes moldes eram derivados de V-d5’ jã que não continham o terminal 5' . Os resultados de explorações densitométricas de vá rias experiências estão indicados na Tabela II,
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TABELA II
COMPARAÇÃO QUANTITATIVA DO EFEITO DE MUTAÇÕES
PONTUAIS NA SEQUÊNCIA DO PROMOTOR*
MOLDE SEQUÊNCIA 3' NÍVEL DE SÍNTESE DE ARN
V-d5' CACCCUGCUUUUGCU-OH 1
V-A3 CACCCUGCUUUUACU-OH 0,4
V-C5 CACCCUGCUUCUGCU-OH 1,0
V-dU25U8 CACCCUGUUUUUGCU-OH 1,0
v-u8a3 CACCCUGUUUUUACU-OH 0,08
V-U8 C5 CACCCUGUUUCUGCU-OH 0,3
v-iuio CACCCUUGCUUUUGCU-OH 0,7
v-íUi0a3 CACCCUUGCUUUUACU-OH 0,06
V iU10U8A3 CACCCUUGUUUUUACU-OH 0,2
V-iU10U8C5A3 CACCCUUGUUUÇUACU-OH 0,2
* Sequências de V-wt, M-wt e V-d5' são mostradas na FIG. 2. Todas os outros ARN são idênticos ao V-d5’ com excepção das posições indicadas. O número em subscrito indica a distância da extremidade 3 ' de uma mudança, e d e i referem-se a nucleótidos que sofreram delecção ou inserção.
Como se mostrou na Tabela II, mudanças pontuais únicas em V-d5' eram igualmente bem copiadas quando comparadas com o próprio V-d5', com excepção do ARN V-A^ que foi copiado com uma eficiência de 40% (FIG. 7, faixa 10; Tabela II). Quando foram testados ARN com duas mudanças, a actividade baixou geralmente, para níveis muito baixos (FIG. 7, faixas 3, 4 e 5) . Por isto, estas experiências confirmaram que a especificidade das reacções para o V-wt sobre o M-wt era o resultado da combinação das mudanças de nucleótidos presentes no terminal 3' de M-wt.
6.2.7. SÍNTESE DE ARN INICIADA POR ENDCNUCT.FASE DE TOPO método de purificação da polimerase virai foi modificado
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-58de modo a diminuir a perda de proteína durante a diálise. Em vez de se usar o sistema de diálise Amicon centricon-10, o enzima foi dializado em membranas padrão resultando em concentrações mais elevadas de todas as quatro proteínas do núcleo. 0 padrão do gel de proteína desta preparação era idêntico ao mostrado na FIG. 1, faixa 4, com a excepção de não existir qualquer banda derivada de BSA. Verificou-se que 5 jul desta preparação, contendo 150 ng de NP e 5 ng total das três proteínas da polimerase, reagiam em condições óptimas com 10 a 40 ng de molde de ARN modelo. No entanto, o uso de níveis mais elevados de proteínas aumentava o fundo, possivelmente devido a níveis mais elevados de ARN conta minantes (ARN de viriões não removidas pela centrifugação em CsCl) resultando produtos com uma classe de tamanhos, de cerca de 50-75 nt, complicando a análise dos moldes de ARN com um comprimento de 50 nt.
Esta preparação de concentração elevada de polimerase era, agora, activa na síntese de ARN iniciada por endonuclease de topo (FIG. 8A, faixa 4) e, também, na replicação independente de iniciador do molde de ARN (FIG. 8A, faixa 2) . Quando se usou como iniciador ARNm de glóbina para a transcrição do molde V-d5' de 30 nt, aparecia como produto um tripleto de bandas de tamanho de cerca de 42 a 44 nt (FIG. 8A, faixa 41, o que é consistente com a clivagem da estrutura de topo a cerca de 12 nt da extremidade 5* do ARNm e com o uso deste oligonucleõtido para iniciar a síntese a partir do molde modelo de 30 nt. Uma vez que excesso de ARN inibe a síntese de ARN, possivelmente através da ligação não específica de NP in vitro como discutido acima verificou-se que a quantidade óptima de ARN doador de topo adicionada a cada reacção era 100 ng, o que ê muito mais baixa do que a usualmente usada com estruturas de RNP prê-formadas (e.g. Bouloy, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 3952-3956). O iniciador mais efi caz era ApG (FIG. 8A, faixa 5 e exposição menos intensa na faixa 6) . O produto migra mais devagar do que o do molde de entrada (FIG. 8A, faixa 1) ou do que o produto na ausência de inicia dor (FIG. 8A, faixa 2) provavelmente porque o produto do terminal 5’ do produto de ApG estã não fosforilado. A intensidade do produto iniciado por ApG era cerca de 10 vezes mais elevada do que a do produto iniciado por topo mas a 0,4 πΜ,ο ApG estava num ex-
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-59cesso molar de 60 000 relativamente à concentração de doadores de topoAssim, apesar da intensidade da banda do produto da iniciação de topo ser cerca de dez vezes mais baixa do que a da iniciação com ApG, a reacção iniciada por topo era cerca de 6000 vezes mais eficiente, numa base molar. Este valor é idêntico ao excesso de eficiência de, aproximadamente, 4000 vezes observado anteriormente para a polimerase virai (Bouloy, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei.
USA 77: 3952-3956) . Foi previamente mostrado que o APN doador de topo contendo uma estrutura de topo 0, cano no ARN BMV, são cerca de 10 vezes menos activos na iniciação da polimerase virai da gripe (Bouloy, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 3952-3956). Esta especificidade ao topo, pouco usual era partilhada pelas RNP es tudadas aqui como o produto específico do ARN modelo, estava muito diminuída em reacções contendo ARN BMV como doador de topo. Observou -se um produto de 30 nt nas faixas 2-4, provavelmente devido a replicação sem iniciador do molde modelo.
Mostrou-se que os ARN produto eram de sentido oposto ao mol^ de V-d5* de entrada, por analise por nuclease de Sl (FIG. 8B) .
Os produtos de ARN iniciados por ApG (FIG.8B, faixas 1 e 2) e sem iniciador (FIG. 8B, faixas 3 e 4) eram, essencialmente, resisten tes a nuclease. O produto da reacção iniciada por topo (FIG. 8B, faixas 5 e 6) era parcialmente sensível a nuclease jâ que cerca de 12 nt eram digeridos do produto. Estes resultados eram muito consis^ tentes com os 12 nt 5' não serem de origem ARNm como foi mostrado muitas vezes para a síntese de ARNm especifico do virus da gripe.
A especifidade do promotor desta preparação de polimerase em reacções iniciadas com ApG verificou-se ser essencialmente idêntica ã das de baixa concentração de enzima, como mostrado anteriormente. No entanto, tentativas de realização de análises semelhantes de especificidade do promotor com as reacções sem iniciador e iniciadas por topo têm, até agora, sido frustadas pelos níveis comparativamente elevadas de background , fazendo, assim, a determinação quantitativa díficil.
6.2.8. REPLICAÇÃO DE MOLDES DE ARN DE COMPRIMENTO GENÕMICO
Um ARN de comprimento total de 890 nt, idêntico à sequência
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do segmento 8 do A/WSN/33, foi preparado por transcrição com ARN polimerase de T7 de ADN de plasmídeo, pHgaV5, que tinha sido digerido com a endonuclease de restrição Hgal. Este ARN foi copiado em reacções iniciadas por ApG, contendo 10 pl da polime rase de concentração elevada (FIG. 9, faixa 8). Demonstrou-se que o ARN era, de facto, uma cópia do molde, pela sua resistência ã nuclease de Sl (FIG. 9, faixa 9). Observou-se um produto similar na ausência de iniciador (FIG. 9, faixas 2 e 3) . A confirmação de que estes ARN produto eram cópias de comprimento total dos moldes, foi feita por análise por RNase de Tl. ARN de vir ião, purificado a partir do vírus A/PR/8/34 extraído com fenol, foi copiado duma forma similar em reacção iniciada por ApG (FIG. 9, faixas 10 e 11) e na ausência de iniciador (FIG. 9, faixas 4 e 5) . Interessantemente, o produto da replicação do gene de HA encontrava-se em níveis grandemente reduzidos. A extremidade 3’ deste ARN difere da do segmento 8 somente nos nucleótidos 14 e 15, sugerindo a importância destes nucleótidos no promotor para a sintese de ARN. Adicionalmente, verificámos que, quando se usava ARN virai completo nas RNP reconstituídas, o nível de con tagens em ácido precipitãvel era de cerca de 70% do observado conj RNP nativas. A polimerase virai era também capaz de copiar estes ARN de comprimento total quando se usava ARN de glcbina em reac ções iniciadas por topo.
EXEMPLO; EXPRESSÃO E EMPACOTAMENTO DE UM GENE
ESTRANHO PELO VÍRUS RECOMBINANTE DA GRIPE
Ê descrita a expressão do gene da cloramfenicol transferase (CAT) usando RNPr. As RNPr foram preparadas usando pIVACAT (originalmente referido como pCATCNS), um plasmídeo recombinante con tendo o gene CAT. O plasmídeo pIVACAT ê um plasmídeo pUC19 contendo em sequência o promotor de T7; a sequência flanqueadora de 5' não codificante (sentido virai) do segmento 8 de ARN du gripe A/PR8/34 (codifica as proteínas N$); um sítio de clonação BglII, a sequência completa do gene da cloramfenicol transferase (CAT) na ordem inversa e complementar; a sequência de ARN de NS flanqueadora de 3', não codificante (sentido virai); e vários sítios de restrição que permitem a transcrição run off do mol de. O pIVACAT pode ser transcrito usando a polimerase de T7 para
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-61criar um ARN com sequências flanqueadoras de sentido gripe A â volta de um gene CAT em orientação inverti/^
As experiências in vivo descritas nas subsecções utilizaram a molécula de ARN recombinante descrita, sequências correspondentes às sequências não traduzi^ terminais do ARN de NS do virus A/PR/8/34, flanquean! tura de leitura aberta, orientada anti-sentido do ge! ARN foi misturado com o complexo de polimerase virall purificado, e transfectado em células MDCK (ou célu] seguir â infecção com o vírus A/WSN/33 mediu-se a a< nas células transfectadas por RNP e foi indicada a do gene. Em adição, o gene do vírus recombinante da pacotado em partículas de vírus, jã que a actividade monstrada em células, a seguir â infecção com a prej rus recombinante.
7.1. MATERIAIS E MÉTODOS irai da abaixo, ntendo s 3' e 5' ' a est.ru: CAT. Este .a gripe, , 293) . A vidade CAT ilif icação ipe foi em :AT foi de•ação do ví.
'lanqueadoa seguinte interna aane de CAT, lanqueiam o a 5' do ARN , (que gera tio Seal que :jem incluído) < icos, usando r dois fragaorrectas pata do codão nte' Xbal sea de NS (sen jência de CAT (sublinhado). r um sitio odificacões
Por forma a se conseguir a fusão das sequência ras do ARN de NS na sequência do gene de CAT, usouestratêgia. Seleccionaram-se dois sítios de restriç dequados, perto dos codões de inicio e paragem do g que permitissem a substituição das sequências que f gene de CAT no plasmídeo pCM7 com as sequências 3’ de NS. Na extremidade 5* escolheu-se um sitio SfaNI um corte a 57 nt do ATG) , e na extremidade 3’ um si gera um corte a 28 nt do fim do gene (codão de para A seguir, fizeram-se quatro oligonucleotidos sintet um sintetizador de ADN, Applied, Biosystems, para gera| mentos de ADN de cadeia dupla com pontas salientes ra clonagem. Estes oligonucleotidos formaram, ã vo de início, uma peça de ADN contendo uma ponta sali guida por um sitio Hgal e um sítio PstI, a sequênci tido virai) de 31, seguida, imediatamente, pela sei desde o codão de inicio atê à ponta saliente SfaNI Em adição, incorporou-se uma mutação muda para gera Accl mais perto do codão de inicio, para permitir π futuras.
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-62Xba I
Acc
Hga I Pst I 5·-Ctagacqccctqcaqcaaaaqcaggqtqacaaaqacataatggagaaâaaaatcac
3’tgcgggacgtcgttttcgtcccactgtttctgtattacctctttttttagtg
- SfaN I tqqgtataccaccgttqatatatcccaatcqcatcqtaaa- 3’ oligo2 acccatatggtggcaactatatagggttagcgtagcatttcttg- 5* oligol à volta do codão de paragem, os outros dois nucleótidos geraram uma peça de ADN como se segue: um sitio Sca I, rombo, a sequência de Cat desde este sítio atê, e incluindo, o codão de paragem (sublinhado) seguido por um sítio Bgl II e uma ponta saliente Xba I.
Sca I
Bgl II
5’-actqcqatqagtqqcaqqqcqqqqcqtaataqat- 3’ .
31-tgacqctactcaccgtcccqccccqcattatctagatc- 5 *
Xbal oligo3 oligo4
Usando um sítio único, interno, de EcoRI na sequência de CAT, os fragmentos SfaNI/EcoRI e EcoRl/Scal do pCM7 foram, independentemente, separados e purificados de geles de acrilamida. O fragmento SfaNI/EcoRI foi, subsequentemente ligado com o fragmento sintético de ADN obtido por tempera dos oligonucleõtidos 1 e 2 num plasmideo pUC19 que foi cortado com Xbal e EcoRI. O fragmento EcoRI/Seal foi clonado duma forma semelhante, num plasmideo pUC19 digerido com Xbal e EcoRI, usando os oligonucleótidos 3 e 4. 0 ADN ligado foi transformado em bactê rias DH5a compétentes, amplificado, isolado e analisado por meio de análise de restrição usando técnicas padrão.
Os recombinantes com a inserção que contêm SfaNI foram cortados com Xbal e EcoRI, e os plasmideos com a inserção Seal foram cortados com EcoRI e BglII. Os fragmentos foram purifi cados a partir de gel de acrilamida e clonados em conjunto no vector pPHV, que tinha sido cortado com Xbal e BglII. Após transformação, cultivaram-se colónias brancas, analisaram-se
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-63por digestão com endonuclease e os clones seleccionados foram sequenciados. 0 clone final, pCATcNS2, foi cultivado em grandes quantidades e sequenciado desde as sequências flanqueadoras pUC atê 300 nt no gene de CAT, não revelando discrepâncias com a sequência pretendida, com a excepção de uma transição de G para A no gene CAT, que aparecia muda.
7.1.1. VIRUS E CSLULAS
Os virus A/PR/8/3H e A/WSN/34 da gripe foram cultivados em ovos em estado embrionário e células MDCK, respectivamente (Ritchey et al., 1976, J. Virol. 18: 736-744: Sugiura et al., 1972, J. Virol. 10: 639-647). As transfecções por RNP foram realizadas em células 293 humanas (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36: 59-72) e em células de rim canino de Madin-Darby (MDCK) (Sugiura et al., 1972. supra).
7.1.2. CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEOS plasmideo pIVACATl, derivado de pUC19, contém a região de codificação do gene da cloramfenicol acetiltransferase (CAT) flanqueado pelas sequências não codificadoras do segmento 8 do ARN da gripe A/PR/8/34. Esta construção ê colocada sob o controlo do promotor da polimerase de T7 de um modo tal que o ARN transcrito IVACATl contêm, na ordem 5’ para 3': 22 nucleótidos derivados do terminal 5' do ARN de NS do virus da gripe, uma sequência ligadora de 8 nt incluindo um sítio de restrição BglII, o gene de CAT em polaridade negativa e 26 nt derivados da extremidade 3’ do ARN de NS do virus da gripe (FIG. 11).
O pIVACATl foi construído da seguinte maneira: de modo a se obter a extremidade 5’ correcta no pIVACATl, o fpagmento EcoRI-Scal do gene de CAT derivado do plasmideo pCMT (.Pharmacia) foi ligado a um fragmento de ADN formado por dois oligonucleõtidos sintéticos. As sequências destes oligonucleõtidos são:
5'-ACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATAGAT- 3' (cadeia decima ) , e
5'-CTAGATCTATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGT- 3’ (cadeia de baixo).
Para a extremidade 3' da inserção no pIVACATl o fragmento SfaNl-EcoRI do gene de CAT foi ligado a um fragmento de ADN feito pelos oligonucleõtidos sintéticos: 5'-CTAGACGCCCTGCAGCAAAAGCA71 470
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-64gggtgacaaagacataatggagaaaaaaaatcactgggtataccaccgttgatatatcccaaTCGCATCGTAAA- 3' (cadeia de cima), e 51-GTTCTTTACGATGCGATTGGGATATATCAACGGTGGTATACCCAGTGATTTTTTTCTCCATTATGTCTTTGTCACCCTGCTTTTGCTGCAGGGCGT- 3’ (cadeia de baixo). Os oligonucleõtidos foram sintetizados num sintetizador de ADN Applied Biosystems. Estas construções 3' e 5' foram ligadas em vectores vai-vem digeridos com Xbal e EcoRI, multiplicados, separados com ecori/ /BglII (região 5’) e Xbal/EcoRI (região 3') e ligados em pPHV cortado com BglII/Xbal. O último plasmideo é similar ao pV-wt descrito na secção 6, supra, com a excepção de conter um sitio de BglIIj que separa as sequências não codificadoras, terminais do segmento de ARN de NS do virus A da gripe. O clone final pIVACATl (FIG. 1) foi multiplicado e o ADN foi sequenciado par cialmente, começando nas sequências flanqueadoras pUC e chegando dentro do gene de CAT. Não se encontraram quaisquer mudanças quando se comparou com as sequências esperadas, com a excepçào de uma transição de G para A, muda, no gene de CAT, na posição 106 relativamente ao inicio do ARN de IVACAT1.
7.1.3. TRANSCRIÇÃO DE ARN DE T7
O plasmideo pIVACATl foi digerido com Hgal (FIG. II) , para permitir transcrição run off. A ponta saliente de 5 nt gerada por este enzima foi cheia com o enzima Klenow (BRC) e o ADN foi purificado numa coluna giratória (Boehringer). A reacção da polimerase T7 foi realizada usando métodos padrão na presença de Rnasin (Promega). 0 molde de ADN foi removido da DNase I isen ta de RNase (Promega). 0 ARN foi purificado em colunas Qiagen tip-5 (Qiagen-Inc.) e quantificado usando geles de poliacrilamida a 4% que foram corados com prata. 0 ARN de NS foi preparado a partir do plasmideo pHgaNS da mesma maneira,
7.1.4. PURIFICAÇÃO DA POLIMERASE DO VIRUS DA GRIPE A E TRANSCRIÇÃO IN VITRO
O complexo de ARN polimerase foi purificado a partir da gripe A/PR/8/34, tal como foi descrito na secção 6, supra.
Transcrições in vi tro de IVACAT1 frio ou do molde de ADN HgaNS foram realizadas usando as condições que foram descritas na secção 6, supra. Transcritos radiomarcados foram analisados em
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-65geles de acrilamida a 4%.
7.1.5. TRANSFECÇÃO POR RNP DE CfiLULAS MDCK E 293
Foram tratadas placas de 35 mm contendo aproximadamente 10® células com 1 ml de uma solução de DEAE-dextrina 300 μ g/ /ml, DMSO 0,5% em PBS/gelatina (0,1 mg/ml de gelatina), durante 30 minutos, ã temperatura ambiente. Apôs a remoção desta so lução adicionou-se às células 200 jtg de β-Ί. PBS/gelatina conten do 1 y-tg de ARN IVACATl (1-2 yul) , 20 ^1 da preparação da polimerase purificada e 4 y,l de Rnasin, e incubadas durante 1 hora, a 37°C. Isto foi seguido pela adição de virus A/WSN/33 da gripe, purificado em gradiente (moi 2-10). Após incubação durante uma hora a 37°C, adicionou-se 2,5 ml de meio DMEM+10% FCS (células 293)ou de meio MEM (células MDCK). Em algumas experiências, as células MDCK foram, primeiro, infectadas e, subsequen temente, transfectadas por RNP. A colheita das células foi fedL ta em tampão NET ou em meio, usando um policia de borracha (cê lulas MDCK), ou por suspensão suave (células 293). As células foram rodadas e as pelotas foram resuspensas em 100 fã. de tampão tris 0,25M, pH 7,5. As amostras foram, subsequentemente,cange ladas-descongeladas três vezes e os destroços celulares foram peloti zados. O sobrenadante foi usado para ensaios de CAT.
7.1.6. SUBCULTURAS DE VIRUS DE CÉLULAS TRANSFECTADAS POR RNP
Células MDCK foram infectadas com virus auxiliares e foram transfectadas por RNP 2 horas mais tarde, como descrito acima. Apôs 1 hora, as células e o meio foram recolhidos e as células depositadas por rotação. Adicionou-se 100 y.1 do meio sobrenadante, contendo virus, ãs placas de 35 mm com as células MDCK. Após 12 horas, estas células e o meio foram recolhidos e testados relativamen te à actividade de CAT. O virus contido neste meio sobrenadante foi usado para ciclos de infecção, subsequentes, de células MDCK em placas de 35 mm.
7,1.7. TESTES DE CAT
Os testes de CAT foram feitos de acordo com procedimentos padrão adaptados de Gorman et al., 1982, Mol. Cell. Biol. 2:
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-6614
1044-1051. Os testes continham 10 yl de C cloramfenicol (0,5 y.Ci; 8,3 nM; NEN) , 20 yl de acetil CoA 40 mM (Boehinger) e 50 yt 1 de extractos de célula em tampão Tris 0,25 M (pH 7,5) . Os tempos de incubação foram 16-18 horas.
7.2. RESULTADOS
Os moldes de ARNr foram preparados a partir de pCATcNS linearizados, enchidos na extremidade, digeridos por Hgal, usando a ARN polimerase do bacteriófago T7, como foi descrito na secção 6. Os moldes de ARNr foram combinados com o complexo da ARN polimera se virai, preparado como descrito na secção 6.1.1., e as RNPr resultantes foram usadas para transfecta.r linhas de células MDCK e 293 que foram superinfectadas com a gripe A/WSN/33. Em cada linha de células transfectada com as RNPr, foram obtidos níveis elevados de expressão de CAT, 6 horas após a infecção. Adicionalmente, lotes de virus obtidos 24 horas após infecção sintetizaram níveis elevados de enzima CAT apôs subcultura subsequente em células MDCK. A RNP-CAT foi empacotada em partículas de vírus.
7.2.1. SÍNTESE DO MOLDE DE ARN IVACATl
De modo a se estudarem in vivo os sinais da transcrição e replicação dos ARN do virus A da gripe, construímos o plasmí deo plVACATl (FIG. II) que dirige a síntese de um transcrito idêntico a ARN de NS. Este ARN partilha os nucleótidos 22 do terminal 5’ e 26 do terminal 3’ com o ARN de NS do virus A/PR/ /8/34 da gripe e contém — em vez das sequências que codificam as proteínas NS1 e NS2 — as da proteína de CAT de comprimento total. Para fins de clonação também contêm oito nucleótidos adicionais, incluindo um sítio BglII entre o codão de paragem do gene de CAT e um troço de U na região não codificante de 5' .
promotor de T7 adjacente às sequências não codificadoras de 5' e o sítio de Hgal, a jusante da extremidade 3', permitem a modelação exacta das extremidades 5’ e 3*. Transcrição run off usando a polimerase de T7 gera um ARN de 716 nt de comprimento: Fig. 12, faixas 2-4 mostram que este ARN tem um comprimento discreto e mais curto que o ARN de NS marcador, de 890 nt de comprimento, que foi sintetizado por transcrição com T7 de pHgaNS
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-67(faixa 1).
7.2.2. Ο ARN DE IVACATlS TRANSCRITO IN VITRO PELA ARN POLIMERASE DO VIRUS A DA GRIPE
Nos exemplos descritos na secção 6, foi demonstrado que ARN sintéticos, contendo na extremidade 3’ OS 15 nucleótidos 3' terminais do segmento 8 do ARN do virus da gripe, pode ser transcrito in vitro usando ARN polimerase do virus A da gripe, purificada. Testámos se o ARN IVACATl,não marcado, podia ser transcrito duma forma idêntica. Fig. 12, faixa 5, mostra que a reacção de transcrição in vitro gerava um ARN de comprimento discreto e de tamanho similar ao do produto da reacção de tran£ crição com T7, sugerindo a síntese de um produto de comprimento total.
7,2.3. TRANSFECÇÃO POR RNF E ACTIVIDADE DE CAT
Uma vez que o ARN recombinante de CAT podia ser transcrito in vitro, concebeu-se um sistema para testar se este ARN pode ser reconhecido e replicado in vivo (FIG. 13) . O ARN recombinan te foi misturado com a polimerase purificada para permitir a formação de partículas virais idênticas a RNP, Para facilitar a associação, a mistura ARN/polimerase foi incubada em tampão de transcrição sem nucleótidos durante 30 minutos, a 30°C, antes da transfecção por RNP. Em algumas experiências, este passo de pré-incubação foi omitido. Transfecções por RNP foram ou prece didas ou seguidas por infecção com virus A/WSN/33 da gripe, jã que se esperava que a produção de proteína de polijnerase virai fosse necessária para a amplificação eficiente do gene. As cêlulas usadas foram ou células MDCK, que são prontamente suscep tíveis à infecção pelo virus A/WSN/33 da gripe, ou células 293, humanas que suportam a infecção a uma velocidade mais baixa.
De modo a se determinar se o ARN IVACATl, de sentido menos, podia ser amplificado e transcrito in vivo, realizou-se uma experiência em células 293. As células foram transfectadas com rnp, infectadas com virus uma horas mais tarde, e colhidas em vãrios tempos após infecção. A FIG. 14A mostra que a tempos iniciais, após infecção, só se detectaram níveis de fundo de
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actividade de CAT (faixa 5, 7 e 9). No entanto, apareceram níveis significativos de actividade de CAT, sete horas após infecção com o virus (faixa 11) . Um nível idêntico de actividade de CAT foi detectado duas horas mais tarde (faixa 13). Existiam níveis de fundo de actividade de CAT em células transfectadas falsamente em qualquer ponto no tempo (faixas 6, 8, 10, 12 e 14), e em células de controlo não infectadas còm o vírus A/ /WSN/33 (faixas 1-4).
A pré-incubação do ARN e do complexo de polimerase não foi necessária para a transfecção por RNP com sucesso. Como pode ser visto na FIG. 14B, faixas 2 e 3, a pré-incubação podia, efectivamente, causar uma diminuição na actividade de CAT, presumivelmente devido a degradação do ARN durante a prê-incubação. Numa outra experiência de controlo, foi omitida a infec ção pelo virus auxiliar, das células transfectadas por RNP (FIG. 14B, faixas 4 e 5) .; Como estas faixas não mostram qualquer actividade de CAT, concluímos que o ARN IVACAT1 ê amplifi^ cado especificamente pelo maquinismo proteico fornecido pelo vírus auxiliar. Numa experiência adicional de controlo, ARN nu foi transfectado em células que foram, subsequentemente, infec tadas com auxiliar ou infectadas falsamente. Uma vez mais, não foi detectada actividade de CAT nestas amostras (FIG. 14B, fa_i xas 6-9). Finalmente, células infectadas com vírus que não foram transfectadas com CAT-RNP recombinante, também não exibiam actividade de acetilação endógena (FIG. 14B, faixa 10) . Parece assim, que adição da polimerase purificada ao ARN recombi nante bem como infecção de células por vírus auxiliar ê importante para a expressão com sucesso do enzima CAT,
Realizaram-se, também, experiências usando células MDCK, a cultura de tecido de células hospedeiras usual para o virus da gripe (FIG. 14C). Quando o complexo recombinante, reconstituído, CAT-RNP foi transfectado 1 hora antes, da infecção com o vírus, observou-se pequena actividade de CAT 7 horas após infecção com o virus. (FIG. 14C, faixa 1). Quando a transfecção com RNP foi conseguida 2 horas apôs a infecção com ó vírus( a expressão de CAT foi muito aumentada 7 horas apôs a infecção com o vírus (FIG. 14C, faixa 3), Por conseguinte, as células
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MDCK são, também, células hospedeiras viáveis para estas sequên cias.
7.2.4. A CAT-RNP E EMPACOTADA EM PARTÍCULAS DE VIRUS
Como o ARN de CAT, recombinante, pode ser replicado in vitro através de funções de virus auxiliar, examinámos se os vírus produzidos em células transfectadas por RNP e infectadas com vírus auxiliar continham o gene de CAT. Foram usados na experiência células MDCK porque elas originam títulos mais elevados de vírus infeccioso, do que ae células 293. As células MDCK foram infectadas com o vírus A/WSN/33, transfectadas por RNP duas horas mais tarde e deixado incubar durante a noite,14 horas depois da infecção colheu-se o meio e as células foram pelotizadas. O sobrenadante do vírus foi, então usado para in fectar novas monocamadas de células MDCK. O inoculo foi removi do após 1 hora e as células foram colhidas 12 horas depois da infecção e testadas relativamente à actividade de CAT. A FIG. 15 revela que a preparação de virus induz um nível de actividade de CAT (faixas 2 e 3) que é, significantemente, superior ao do controlo (faixa 1). Neste caso, a adição do vírus auxiliar ao inoculo não aumentou a actividade de CAT (faixa 4) . Subcultura adicional do vírus sobrenadante em células MDCK frescas, não resultou em indução mensurável de actividade de CAT, Isto não ê surpreendente porque não existe pressão selectiva para a reten ção do gene de CAT nestas preparações virais. Excluimos a possibilidade de que estavamos a transferir o complexo ARN/polime rase original por pré-tratamento dos inõculos com RNase. Este tratamento destrói as RNP virais do vírus da gripe (Pons et al., 1969, Virology 39: 250-259; Scholtissek e Becht, 1971 J, Gen. Virol. 10: 11-16).
8. RECUPERAÇÃO DE VIRUS INFECCIOSOS DA GRIPE USANDO ARN DERIVADO DE- ADN ESPECÍFICOS RECOMBINANTES
As experiências descritas nas subsecções abaixo demonstram a recuperação de virus infecciosos da gripe, usando ARN que ê derivado de ADN específicos, recombinantes. Os ARN corresponden tes ao gene da neuraminidase (NA) do vírus A/WSN/33 da gripe (vírus WSN), foram transcritos in vitro a partir de plasmídeo
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-70de ADN e — a seguir à adição do complexo de polimerase do vírus da gripe, purificado, (como foi descrito na Secção 6.1.1. supra) — foram transfectados em células MDBK como descrito na secção 7 supra. A superinfecção com vírus auxiliar, ao qual fa_l ta o gene de NA do WSN resultou na libertação de vírus contendo o gene de NA do WSN. Assim, esta tecnologia permite a produção de vírus infecciosos da gripe usando clones de ADNc e mutagénese específica de sítio dos seus genomas. Além disso, esta tecnologia pode permitir a construção de vírus quiméricos, infecciosos, da gripe, que podem ser usados como vectores eficientes para expressão do gene, em culturas de tecido, em animais ou no homem.
As experiências descritas nas secções 6 e 7 supra, demonstram que os 15 nucleõtidos 3' terminais de ARN de cadeia negativa do vírus da gripe, são suficientes para permitir a transcrição in vi tro, usando proteínas da polimerase do vírus da gri pe, purificadas. Adicionalmente, os estudos usando o gene repor ter cloramfenicol acetiltransferase (CAT) mostram que os 22 nucleõtidos 5' terminais e os 26 3’ terminais dos ARN virais contêm todos os sinais necessários para transcrição, replicação e empacotamento de ARN de vírus da gripe. Como uraa extensão destes resultados, foi construído um plasmídeo, pT3NAv, que conti^ nha o gene de NA completo do vírus A/WSN/33 da gripe, a jusante de um promotor de T3 truncado (FIG. 16). Por isso, a transcrição run off deste plasmídeo, cortado no sítio Ksp632l, ori_ gina um ARN que ê idêntico ao verdadeiro gene de NA, genõmico, do vírus WSN (FIG.17, faixa 3). Este ARN foi, então, incubado com polimerase purificada (purificada como descrito na secção
6.1.1.) e usado numa experiência de transfecção por ribonucleo proteína (RNP), para permitir a recuperação do vírus infeccioso, usando vírus auxiliar que não continha a NA do vírus WSN. A escolha do vírus auxiliar WSN-HK foi baseada na necessidade da escolha de um sistema de selecção forte através do qual se iso lasse o vírus recuperado. Foi mostrado, previamente. que o vírus WSN-HK sõ pode formar placas em células MDCK quando se adi. cionar protease ao meio. Este está em marcado contraste com o vírus WSN (isogênico do vírus WSN-HK, â excepção do gene da neuraminidase) que, na ausência da protease, se replica em cê71 470
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-71lulas MDBK e forma placas largas, facilmente visíveis (Schulman et al., 1977, J. Virol. 24: 170-176).
8.1. MATERIAIS E MfiTODOS
8.1.1. VÍRUS E CÉLULAS
O vírus A/WSN/33 da gripe e o vírus A/WSN-HK foram cultivados em células de rim de canino Madin-Darby (MDCK) e em ovos em estado embrionário, respectivamente (Sugiura et al., 1972, J. Virol. 10: 639-647; Schulman et al., 1977, J. Virol. 24: 170-176. 0 vírus A/PR/8/34 da gripe também foi cultivado em ovos em estado embrionário. Foram usadas células de rim de bovino de Madin-Darby (MDBK) para experiências de transfecção e para a selecção do vírus recuperado (Sugiura et al., 1972, J. Virol. 10: 639-647).
8.1.2. CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEOS
Os plasmideos pT3NAv, pT3NAv mut 1 e pT3NAv mut 2 foram construídos por mutagênese dirigida por PCR usando uma cópia clonada do gene de NA de WSN, que foi obtido seguindo procedimentos padrão (Buonagurio et al., 1986, Science 232: 980-982). Para construir o pT3NAv, usaram-se os seguintes iniciadores 5'-CGGAATTCTCTTCGAGCGAAAGCAGGAGTT-3 ' e 5'-CCAAGCTTATTAACCCTCACTAAAAGTAGAAACAAGGAGTTT-3'.Após 35 ciclos num ciclizador térmi co (Coy Lab Products, ΜΙ), o produto de PCR foi digerido com EcoRI e HindIII e clonado no pVC19. O plasmideo pT3NAv, mut 1 foi construído duma forma similar com a excepção da sequência do iniciador ter sido alterada (FIG. 16). O plasmideo pT3NAv mut 2 foi construído por mutagênese de cassete, através da digestão do pT3NAv com PstI e Ncol e re-ligação na presença de oligonucleótidos sintéticos - 5'- CATGGGTGAGTTTCGACCAAAATCTAGATTATAAAATAGGATACATATGCA-3* e 5 '-AATGTATCCTATTTTATAATCTACATTTTGGTCGAAACTCACC-3 ' .
Os oligonucleótidos foram sintetizados num sintetizador de ADN Applied Biosystems. Os clones finais pT3NAv, mut 1 e pT3NAv mut 2 foram cultivados e os ADN foram sequenciados. parcialniente a partir das sequências flanqueadoras de pUC19 e atingindo a sequência codificadora do gene de NA. As mutações no pT3NAv mut 2 foram, também, confirmadas por sequênciação.
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-728.1.3. PURIFICAÇÃO DA POLIMERASE DO VÍRUS A DA
GRIPE E TRANSFECÇÃO POR RNP EM CÉLULAS MDBK
O complexo de ARN polimerase foi purificado a partir do vírus A/PR/8/34 da gripe, tal como descrito na secção 6.1.1., supra, e foi, então, usado para transfecção por RNP em células MDBK, usando o protocolo descrito na secção 7, supra, com a ax cepção de que foi usado o vírus WSN-HK como vírus auxiliar a um moi de 1. Os ARN usados para a transfecção foram obtidos por extracçao com fenol do vírus purificado ou por transcrição (usando a polimerase de T3) do pT3NAv, pT3NAV mut 1, pT3NAv mut 2. Todos os plasmídeos foram digeridos com Ksp632I, com en chimento da extremidade pelo enzima de Klenow (BRL) e, então, transcrito numa secção run off tal como descrito na secção 7, supra.
8.2. RESULTADOS
8.2.1. RECUPERAÇÃO DO VÍRUS INFECCIOSO DA GRIPE EM CÉLULAS MDBK USANDO ARN DERIVADO DE ADN RE COMBINANTE DE PLASMIDEO
Foi construído um plasmideo, pT3NAv, para conter o gene completo de NA do vírus WSN da gripe, a jusante de um promotor de T3 truncado (FIG. 16) . Transcrição run off do plasmideo, cortado no sítio de Ksp632l, origina um ARN que é idêntico em comprimento ao verdadeiro gene de NA, genómico, do vírus WSN (FIG. 17, faixa 3). Este ARN foi, então, incubado com polímera se purificada e usado numa experiência de transfecção por ribo nucleoproteína (RNP), para permitir a recuperação do vírus infeccioso usando vírus auxiliar. A escolha do vírus WSN-HK como vírus auxiliar, foi baseada na necessidade de um forte sistema de selecção através do qual se isolasse um virus recuperado. Foi mostrado anteriormente que o vírus WSN-HN sô pode formar placas em células MDBK quando se adiciona protease ao meio (Schulman et al., 1977, J. Virol. 24: 170-176). Este está em marcado contraste com o vírus WSN (isogênico do vírus auxiliar WSN-HK, com a excepção do gene da neuraminidase), o qual se replica, prontamente, na ausência de protease, em células MDBK e
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forma placas grandes, facilmente visíveis (Sugiura et al.,
1972, J. Virol. 10: 639-647). As células MDBK foram primeiro infectadas com o vírus auxiliar WSN-HK e transfectadas por RNP, uma hora após a infecção pelo vírus. A seguir a incubação durante a noite, na presença de 20 /-d/ml de plasminogénio, o so brenadante destas células foi, então amplificado e posto em placas em células MDBK na ausência de protease no meio. 0 aparecimen to de placas nas células MDBK (Schulman et al., 197, J. Virol. 10: 639-647) indicou a presença do vírus que continha o gene da NA do vírus WSN, jã que o sobrenadante de experiências de controlo de células infectadas somente com o virus WSN-HK, não produziram placas. Numa experiência típica envolvendo o uso de uma placa de 35 mm para uma transfecção por RNP, foram obser2 vadas 2,5 x 10 placas.
Numa outra experiência de controlo, foi usado ARN NA sin tético, que tinha sido derivado do plasmídeo pT3NAv mut 1 (FIG. 16) . Este ARN difere do ARN da NA de tipo selvagem deri vado do pT3NAv por uma única delecção de um nucleõtido na região não traduzida da extremidade 5' (FIG. 16). A transfecção por RNP de células MDBK com este ARN e superinfecção com o virus WSN-HK, não resultou na formação de vírus recuperados. Este resultado negativo ê facilmente explicado uma vez que demons trámos nas secções 6 e 7, supra, que as sequências essenciais para o reconhecimento do ARN virai pela polimerase virai, bem como os sinais de empacotamento, estão localizados dentro das sequências 3' e 5', terminais, dos ARN virais. No entanto, nao podemos excluir a possibilidade de que a recuperação do vírus usando este ARN mutado possa ocorrer, embora a uma frequência não detectada.
8,2.2, ANALISE DE ARN DO VIRUS RECUPERADO
Os virus obtidos nas experiências de recuperação foi purifica do das placas amplificado em células MDBK e o ARN foi extraído desta preparação. 0 ARN foi, então, analisado por electrofore se num gel de poliacrilamida. A FIG. 17 mostra o ARN do vírus auxiliar WSN-HK (faixa 1) e o ARN de NA sintético (faixa 3) , que foi transcrito por polimerase de T3 a partir do plasmídeo
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Ζξ;
-74pT3NAv. o padrão de migração dos ARN do vírus recuperado (faixa 2) é idêntico ao do vírus WSN de controlo (faixa 4) . Também, os ARNs da NA, nas faixas 2 e 4, migram na mesma posição como o ARN da NA derivado de ADNc (faixa 3) e mais rapidamente do que a banda da NA do vírus HK, no vírus auxiliar WSN-HK (faixa 1) . Estas experiências apoiam a conclusão de que, como resulta do da transfecção por RNP, formou-se o vírus infeccioso conten do o ARN de NA do vírus WSN derivado de ADNc.
8.2.3. RECUPERAÇÃO DO VIRUS INFECCIOSO DA GRIPE USANDO ARN VIRIÃO
Numa outra experiência de transf ecção, foi empregue o ARN extraído a partir do vírus WSN purificado. Quando este ARN nu é transfectado em conjunto com as proteínas da polimerase em células infectadascom o vírus auxiliar, ê observada recuperação do vírus WSN capaz de replicação em células MDBK. O ARN isolado de uma placa amplificada nesta experiência ê analisada na faixa 5 da FIG. 17 e mostra um padrão indistinto do do vírus WSN de controlo na faixa 4.
8.2.4. INTRODUÇÃO DE MUTAÇÕES ESPECIFICAS DE SÍTIO NO GENOMA VIRAL
As experiências descritas ate aqui envolveram a recuperação do vírus WSN da gripe. Jã que o ARN sintético usado nestas experiências ê idêntico ao gene de NA do WSN, autêntico, a hipótese pouco provável de contaminação pelo vírus WSN de tipo selvagem não pode ser rigorosamente posta de lado. Por isso, introduzimos cinco mutações pontuais, mudas, na região de codi. ficação do gene de NA do plasmídeo pT3NAv. Estas mutações foram introduzidas por mutagénese de cassete, por substituição do fragmento curto NcoX/PstI presente no gene de NA. As cinco mutações no ADNc incluíam uma mudança de C para T na posição 901 e uma mudança de C para A na posição 925, criando um novo sítio de Xbal e destruindo o sítio PstI original, respectivamen te. Em adição, todo o codão da serina nas posições 887^-889 do clone dé ADNc foi substituído com um tripleto da serina alternativo (FIG. 17). A transfecção por RNP deste ARN mutageni71 470
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-75zado (pT3NAv mut 2) e infecçâo com vírus auxiliar de células MDBK resultou, novamente, na recuperação de um vírus idêntico a WSN que se multiplicou em células MDBK na ausência de prote ase adicionada. Quando se examinou o ARN deste vírus, por anã lise de sequência, foram observadas no ARN virai todas as cin co mutações presentes no ADN plasmídico (FIG. 16). Uma vez que ê extraordinariamente improvável que estas mutações resultem no vírus WSN de tipo selvagem da gripe, concluiu-se que se tinha conseguido a recuperação, com sucesso, do vírus infeccioso da gripe, contendo cinco mutações específicas de sítio, por transfecção por RNP de ADN manipulado.
9. EXEMPLO; SISTEMA SINTÉTICO DE RECUPERAÇÃO
Nas experiências descritas abaixo, usou-se um clone de ADNc que pode produzir uma molécula de ARNv, idêntica ao vírus da gripe, codificando o gene repórter. Este ARN resultante é um ARNv idêntico a NS que contêm o anti-sentido da região de codificação do gene da cloramfenicol acetiltransferase (CAT) em vez das regiões de codificação anti-sentido para as protei_ nas não estruturais, NSl e NS2 (Lutjyes et al., 1989 Cell, 59; 1107-1113). Este ARN recombinante (IVACAT-1) foi incubado com proteínas RNP do vírus da gripe, purificadas, e usando numa ten tativa para se desenvolver um sistema de replicação, não dependente do vírus da gripe. Foram infectadas células C127 de fibro blasto do ratinho, com misturas de vírus vacinia recombinantes (Smith et al., 1987, Virology, 160; 336-345) e foram transfectadas uma horas mais tarde com o RNP de IVACAT-1. Misturas de vectores expressando as três polimerases (PB2, PBl e PA) e a nucleoproteína foram usadas. A replicação e transcrição da RNP sintética foi testada analisando as células relativamente â actividade CAT, após incubação durante a noite. A Figura 19 examina a actividade de CAT presente nas células inicialmente infectadas com muitas das misturas possíveis dos 4 vírus vaci nia recombinantes. Figura 19, a faixa 4 é um controlo positivo no qual o vírus A/WSN/33 da gripe foi usado em lugar dos vírus vacinia recombinantes. A actividade de CAT está presente nesta amostra bem como em células infectadas com todos os quatro vectores vacinia (Figura 19, faixa 8 e 10). Células expressan-
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-76do qualquer um dos sub-conjuntos destas quatro proteínas não produziram proteína de CAT, detectável (Figura 19, faixas 5-7,
9, 11, não publicada). Em adição, ARN transfectado, não incubado com a polimerase purificada, apresentava-se, também, negativo relativamente à expressão de CAT (Lutjyes, et al., 1989). Assim, tendo o que ê necessário e suficiente para a replicação e expressão da RNP neste sistema, ê a presença das proteínas PB2, PB1, PA e NP. Os níveis de actividade de CAT obtidos em células infectadas com o vector vacinia são reprodutivelmente mais elevados do que em células infectadas com gripe como virusiauxiliar. A explicação mais provável para isto ê que, em células infectadas com o vírus da gripe, a CAT-RNP compete com as RNP virais pela polimerase activa, ao passo que no sistema controlado por vacinia, a CAT-RNP ê a única molécula tipo virai presente.
Várias outras linhas de células foram, então, testadas como hospedeiros para este sistema controlado por vírus vacinia. A Figura 20A mostra os resultados usando células MDBK,
Hela, 293, e L. Em cada caso, não se observou actividade de CAT quando as células eram infectadas com vectores que expres sam só 3 das proteínas de polimerase, mas obteve-se actividade de CAT significativa, se o vector vacinia, adicional, indu zindo a expressão da NP, fosse também adicionado.
Previamente, foi construída uma linha de células (designa da por 3PNP-4), que expressava constitutivamente níveis baixos das proteínas PB2, PBl e PA e níveis elevados da proteína NP. Estas células podem complementar o crescimento do seu mapeamento, para os segmentos do gene da PB2 ou da NP (Kristal et al., 1986; Li et al., 1989). Uma vez que a replica ção através de vectores de virus vacinia sõ depende destas pro teínas, era concebível que esta linha de células fosse capaz de amplificar e expressar a CAT-RNP sintética na ausência de qualquer infecção com vírus. Nó entanto, quando se tentou esta experiência, não se obteve qualquer actividade de CAT (dados não mostrados). De modo a se investigarem as razões pelas quais esta linha de células não suportava a replicação, usaram—se mis turas de vírus vacinia recombinantes para se infectar células
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AA as”’
3PNP-4. Como se esperava, a adição das quatro proteínas da polimerase suportava a expressão de CAT (FIG. 20B, faixa 2). A Figura 20B, faixa 3, mostra que a mistura mínima de vectores necessária para induzir a actividade de CAT em células 3PNP-4, ê aquela que expressa somente as proteínas PB1 e PA. Por isso, os níveis em estado estacionário das proteínas PB2 e NP são suficientes, mas os níveis de PBl e PA estão abaixo do patamar para a expressão de CAT na ausência de vírus auxiliares. Isto correlaciona-se com o fenótipo de complemento exibido por estas células jã que, a temperatura não permissiva, sõ se consegue recuperar o crescimento de mutantes PB2 e NP e não dos mutantes PBl e PA (Desseberger el al., 1980).
Uma vez que o ARN IVACAT-1 é de polaridade negativa, a CAT sõ pode ser sintetizada através da transcrição da molécula de RNP. Teoricamente, podem ser produzidos níveis de CAT detectãveis quer através de transcrição do RNP de entrada, transfec tada (equivalente à transcrição primária) ou, primeiro, através da amplificação da RNP e transcrição subsequente (necessitando replicação da RNP) ou uma combinação das duas. No entanto, tra balho anterior usando infecção por vírus da gripe como força motora da expressão da proteína da CAT, mostrou que a expressão detectável sõ ocorria se o CAT-RNP de entrada fosse replicado (Lutjyes et al., 1989). Isto foi mostrado pelo uso de um segundo CAT-RNA, IVACAT-2, que contém 3 mutações nas 12 bases no terminal 5' do ARN virai (Lutjyes et al., 1989). Esta região de 12 bases ê conservada em todos os oito segmentos de todos os virus A da gripe (Desselberger, et al., 1989). Esta RNP de IVACAT-2- ê competente para a transcrição pela polimerase do vírus da gripe mas não é replicada e, quando é transfectada em células infectadas com o vírus da gripe, a actividade de CAT continuava não detectada (Lutjyes et al., 1989). Assim, transcrição primária do ARN de entrada não produz níveis detectáveis de proteína infectada com o vírus da gripe. Em acordo com isto, usámos este ARN mutante para examinar se as proteínas da gripe, expressadas por vector, induzem actividade de CAT somente através da transcrição primária do ARN de entrada ou se permite amplificação através replicação e subsequente transcri ção. Foram infectadas células C127 com vírus vacinia recombinan
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-78tes e, então, transfectadas com RNP geradas quer por IVACAT-1 quer por IVACAT-2. A Figura 20C mostra que se podem detectar baixos níveis de actividade de CAT em células transfectadas com RNP de IVACAT-2 (faixa 2) . Quando determinado quantitativamente, 0,5-1% de cloramfenicol ê convertido numa forma acetilada, comparado com 0,2-0,4% em faixas de células transfectadas falsamente (não mostradas). No entanto, níveis muito mais elevados de actividade estão presentes em células transfectadas com RNP de CAT-1 (faixa 1; rotineiramente 15-50% de conversão de cloram fenicol), indicando que estã a ocorrer amplificação nestas células. Por isso este sistema movido pelo vírus vacinia é específico de sequência e as RNP estão a sofrer replicação.
Nas experiências descritas, nenhuma das proteínas NS1 ou NS2 foram necessárias para a replicação RNP. Apesar da sua fun ção não ser conhecida, tem-se especulado que estas proteínas podem desempenhar um papel importante na replicação porque ambas as proteínas são sintetizadas em grandes quantidades e estão presentes no núcleo (Krug et al., 1989; Young et al., 1983, Greenspan et al., 1985; Lamb et al., 1984). Com base nos dados apresentados, estas proteínas não são absolutamente necessárias para replicação do genoma. Pode-se especular que estas proteínas possam, efectivamente, ter pãpeis auxiliares relativamente â replicação da RNP, tais como interacção com factores dos hoss pedeiros, regulação da expressão de genes virais ou algumas funções envolvidas com o empacotamento da RNP em viriões infec ciosos. No entanto, não se pode excluir que uma função destas proteínas NS pode ser complementada por uma proteína do vírus vacinia, apesar de por inspecção, não se terem encontrado seme lhanças óbvias entre qualquer uma das proteínas NS1 ou NS2 e proteínas conhecidas do vírus vacinia. 0 contraste das proprie dades entre estes dois virus é um argumento contra a existência de uma proteína do vírus vacinia complementar, jã que como o vacinia ê um vírus grande, de ADN de cadeia dupla, que se replica exclusivamente no citoplasma, ao passo que o vírus da gripe ê um vírus de ARN de sentido negativo que se replica exclusivamen te no núcleo. Adicionalmente, a replicação de RNP sintéticas ocorria mesmo na presença de eitosina arabinose (ara-C, dados
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não mostrados) , um inibidor de expressão tardia de gene em vírus vacinia (Oda et al., 1967; Kaverin et al., 1975; Cooper et al., 1979).
Este esquema dependente do vectór vacinia recombinante possui um certo número de vantagens sobre o uso de infecção do vírus da gripe, para se conseguir a replicação de arn sintéti co. Uma delas é que, já que a expressão das proteínas virais é completamente artificial, permite uma dissecação precisa dos processos envolvidos na replicação. A replicação envolve, de início, a síntese de um molde de sentido positivo a partir do ARN genõmico de sentido negativo. Este ARNc de sentido posit£ vo ê, então, copiado de modo a amplificar a RNP de sentido ge nómico, que ê, então, usada para expressão de proteína e empacotamento (Krug et al., 1989). 0 sistema aqui descrito demons tra que só são necessárias as proteínas virais da gripe PB2, PBl, PA e NP, para a detecção de proteína expressa e para replicação da RNP. Uma outra vantagem deste esquema de replicação movido pelo vector vacinia é que como as proteínas da poli merase da gripe são expressas a partir do ADNc integrado no vírus vacinia, a mutagênese das proteínas de polimerase torna-se um método poderoso e realizável para avançar a análise das relações estrutura-função das proteínas da polimerase virai. Estamos, também a tentar, correntemente, a recuperação de vírus infecciosos da gripe através da transfecção de misturas de RNP virais reconstituídas. Esta tênica, se tiver sucesso, deve per mitir a fácil construção de vírus recombinantes definidos, através da adição de RNP definidas, quer natural quer sinteticamente derivadas. Esta tecnologia poderá ser aplicável para a análise e dissecação do aparelho de replicação de outros vírus de cadeia negativa.
10. DEPÕSITO DE MICRO-ORGANISMOS
Uma linha de células de E. coli contendo o plasmideo pIVACAT estã a ser depositada no Agricultural Research Culture Collection (NRRL) , Peoria, IL, e tem o seguinte número de acesso
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-80Estirpe
Plasmídeo
Número de Acesso
E. coli (DH5a) pIVACAT
NRRL
O presente invento não deve ser limitado no seu âmbito pelas concretizações específicas descritas, que se pretende sejam simples ilustrações de aspectos individuais do invento.
e quaisquer construções, vírus e enzimas que sao funcionalmen
te equivalentes, estão dentro do âmbito deste invento. De fac to, várias modificações do invento, adicionais àquelas que foram aqui mostradas e descritas, serão aparentes para os peri. tos na arte a partir da descrição anterior e dos desenhos que a acompanham. Pretende-se que tais modificações estejam dentro do âmbito das reivindicações em anexo.

Claims (49)

  1. REIVINDICACÕES
    1 - Processo de preparação de uma molécula de ARN recombinante compreendendo um sitio de ligação específico de uma ARN-polimerase dirigida a ARN de um vírus de ARN de cadeia negativa, ligada operativamente a uma sequência heteróloga de ARN compreendendo o complemento inverso de uma sequência de codificação de ARNm, caracterizado por compreender a realização de uma transcrição das sequências de ADN apropriadas com uma ARN-polimerase dirigida a ADN.
  2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o sítio de ligação da polimerase compreender o sítio de ligação da polimerase contido na sequência flanqueadora de 3' não codificante do segmento de ARNv do genoma da gripe.
  3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o sítio de ligação da polimerase compreender os 15 nucleõtidos terminais do terminal 3* de um segmento genõmico da gripe.
  4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a sequência flanqueadora de sentido virai 3' não codificante da gripe compreender a seguinte sequência:
  5. 5·—CACCCUGCUUUUGCU—3·
    5 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a sequência flanqueadora de sentido virai 3' não codificante da gripe compreender a seguinte sequência:
    5·-CACCCUGCUUCUGCU-3'
  6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a sequência flanqueadora de sentido virai 3' não codificante da gripe compreender a seguinte sequência:
    5·—CACCCUGUUUUUGCU—3·
  7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a sequência flanqueadora de sentido virai 3' não codificante
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    -82da gripe compreender a seguinte sequência: jfe»
    5 · —CACCCUUGCUUUUGCU— 3 · *
  8. 8 - Processo de preparação de uma molécula de ARN recombinante compreendendo uma sequência de ARN heterólogo compreendendo o complemento inverso de uma sequência de codificação de ARNm operativamente ligada a uma sequência flanqueadora de 3' não codificante de um ARNv da gripe contendo o sítio de ligação da polimerase virai e a uma sequência flanqueadora de 5' não codificante de um ARNv da gripe caracterizado por compreender a realização de uma transcrição das sequências de ADN apropriadas com uma ARN-polimerase dirigida a ADN.
  9. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a sequência flanqueadora de 5' não codificante de um ARNv da gripe compreender os primeiros 22 nucleótidos do terminal 5' de um segmento genómico da gripe.
  10. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a sequência flanqueadora de 5' não codificante de um ARNv da gripe compreender a seguinte sequência:
    5·-AGUAGAAACAAGGGUGUUUUUU-3'
  11. 11 - Processo de preparação de uma RNP recombinante, caracterizado por compreender a mistura de uma molécula de ARN recombinante preparada de acordo com o processo da reivindicação
    1 com uma ARN-polimerase dirigida a ARN purificada.
  12. 12 - Processo de preparação de uma RNP recombinante, caracterizado por compreender a mistura de uma molécula de ARN recombinante preparada de acordo com o processo da reivindicação
    2 com uma polimerase virai da gripe purificada.
  13. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a polimerase virai da gripe ser obtida a partir de RPN fraccionadas por centrifugação num gradiente de CsCl em que a polimerase virai da gripe purificada é isolada na
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    -83região do gradiente relativa de 1,5 a 2,0 M de CsCl.
  14. 14 - Processo de preparação de uma RNP recombinante, caracterizado por compreender a mistura de uma molécula de ARN recombinante preparada de acordo com o processo da reivindicação 8 com uma polimerase virai da gripe purificada.
  15. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a polimerase virai da gripe ser obtida a partir de RPN fraccionadas por centrifugação num gradiente de CsCl em que a polimerase virai da gripe purificada é isolada na região do gradiente relativa de 1,5 a 2,0 M de CsCl.
  16. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 8, caracterizado por a sequência de ARN heterõlogo compreender o complemento inverso de um ARNm bicistrónico contendo uma sequência interna que medeia a iniciação interna.
  17. 17 - Processo de acordo com a reivindicação 11, 12 ou 14, caracterizado por a sequência de ARN heterõlogo compreender o complemento inverso de um ARNm bicistrónico contendo uma sequência interna que medeia a iniciação interna.
  18. 18 - Processo de preparação de uma molécula de ADN recombinante codificando a molécula de ARN recombinante da reivindicação 1 operativamente ligada a um elemento de controlo da transcrição que se liga a uma ARN-polimerase dirigida a ADN caracterizado por se usarem técnicas de recombinação de ADN.
  19. 19 - Processo de preparação de uma molécula de ADN recombinante codificando a molécula de ARN recombinante da reivindicação 2 operativamente ligada a um elemento de controlo da transcrição que se liga a uma ARN-polimerase dirigida a ADN caracterizado por se usarem técnicas de recombinação de ADN.
  20. 20 - Processo de preparação de uma molécula de ADN recombinante codificando a molécula de ARN recombinante da reivindicação 8 operativamente ligada a um elemento de controlo
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    6923-004-118
    -84da transcrição que se liga a uma ARN-polimerase dirigida a ADN caracterizado por se usarem técnicas de recombinação de ADN.
  21. 21 - Processo de preparação de uma molécula de ADN recombinante codificando a molécula de ARN recombinante da reivindicação 16 operativamente ligada a um elemento de controlo da transcrição que se liga a uma ARN-polimerase dirigida a ADN caracterizado por se usarem técnicas de recombinação de ADN.
  22. 22 - Processo para expressão de gene, caracterizado por compreender cultivar uma célula hospedeira transfectada com a RNP de acordo com a reivindicação 11, de modo que o gene heterólogo seja expresso na cultura.
  23. 23 - Processo para expressão de gene, caracterizado por compreender cultivar uma célula hospedeira transfectada com a RNP de acordo com a reivindicação 12, de modo que o gene heterólogo seja expresso na cultura.
  24. 24 - Processo para expressão de gene, caracterizado por compreender cultivar uma célula hospedeira transfectada com a RNP de acordo com a reivindicação 14, de modo que o gene heterólogo seja expresso na cultura.
  25. 25 - Processo para expressão de gene, caracterizado por compreender cultivar uma célula hospedeira transfectada com a RNP recombinante de acordo com a reivindicação 17, de modo que o gene heterólogo seja expresso na cultura.
  26. 26 - Processo de produção de um vírus de ARN de cadeia negativa quimérico, caracterizado por compreender a cultura de uma célula hospedeira transfectada com a RPN recombinante da reivindicação ll e infectada com uma estirpe progenitora do vírus de ARN de cadeia negativa e a recuperação do vírus da gripe quimérico da cultura.
  27. 27 - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por o vírus quimérico compreender um vírus de ARN
    71 470
    6923-004-118
    -85de cadeia negativa contendo uma sequência de ARN heterólogo compreendendo o complemento inverso de uma sequência de codificação de ARNm, operativamente ligada a um sítio de ligação de polimerase do vírus de ARN de cadeia negativa.
  28. 28 - Processo de produção de um vírus da gripe quimérico, caracterizado por compreender a cultura de uma célula hospedeira transfectada com a RPN recombinante da reivindicação 12 e infectada com uma estirpe de gripe progenitora e a recuperação do vírus da gripe quimérico da cultura.
  29. 29 - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o vírus quimérico compreender vírus da gripe gue contém, em adição aos seus oito segmentos genómicos, um segmento de ARN adicional contendo uma sequência de ARN heterólogo compreendendo o complemento inverso de uma sequência de codificação de ARNm, operativamente ligada a um sítio de ligação de polimerase virai da gripe.
  30. 30 - Processo de produção de um vírus da gripe quimérico, caracterizado por compreender a cultura de uma célula hospedeira transfectada com a RPN recombinante da reivindicação 14 e infectada com uma estirpe de gripe progenitora e a recuperação do vírus da gripe quimérico da cultura.
  31. 31 - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por o vírus quimérico compreender vírus da gripe contendo a sequência de ARN heterólogo compreendendo o complemento inverso de uma sequência de codificação de ARNm operativamente ligada a um sítio de ligação da polimerase virai da gripe.
  32. 32 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a sequência de ARN heterólogo estar contida no segmento 1 da gripe.
  33. 33 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a sequência de ARN heterólogo estar contida no ll 470
    6923-004-118 segmento 2 da gripe.
  34. 34 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a sequência de ARN heterólogo estar contida no segmento 3 da gripe.
  35. 35 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a sequência de ARN heterólogo estar contida no segmento 4 da gripe.
  36. 36 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a sequência de ARN heterólogo estar contida no segmento 5 da gripe.
  37. 37 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a sequência de ARN heterólogo estar contida no segmento 6 da gripe.
  38. 38 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a sequência de ARN heterólogo estar contida no segmento 7 da gripe.
  39. 39 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a sequência de ARN heterólogo estar contida no segmento 8 da gripe.
  40. 40 - Processo de produção de um vírus da gripe quimérico, caracterizado por compreender a cultura de uma célula hospedeira transfectada com a RPN recombinante da reivindicação 17 e infectada com uma estirpe de gripe progenitora e a recuperação do vírus da gripe quimérico da cultura.
  41. 41 - Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por a sequência de ARN heterólogo compreender o complemento inverso de um ARNm bicistrónico contendo uma sequência interna que medeia a iniciação interna.
    71 470
    6923-004-118
    -8742 - Processo de preparação de uma molécula de ADN recombinante ligada operativamente a um elemento de controlo de transcrição que se liga a uma ARN polimerase dirigida a ADN, codificando uma molécula de RNA compreendendo um local de ligação para uma ARN polimerase dirigida a ARN de um vírus de ARN de cadeia negativa, ligado operativamente a uma sequência de ARN compreendendo o complemento inverso de um ARNm de um gene modificado do vírus de ARN de cadeia negativa caracterizado por se usarem técnicas de recombinação de ADN.
  42. 43 - Processo de produção de um vírus recombinante de ARN de cadeia negativa caracterizado por compreender:
    (a) cultivar uma célula hospedeira com uma RNP recombinante compreendendo a molécula de ARN recombinante codificada pela molécula de ADN recombinante da reivindicação 42, misturada com ARN polimerase dirigida a ARN e infectada com uma estirpe progenitora de um vírus de ARN de cadeia negativa; e (b) recuperar o vírus de ARN de cadeia negativa, recombinante, da cultura.
  43. 44 - Processo de acordo com a reivindicação 43 caracterizado por o vírus recombinante de cadeia negativa produzido ser um vírus recombinante de ARN de cadeia negativa, atenuado.
  44. 45 - Processo de produção de um vírus de ARN de cadeia negativa, quimérico, contendo uma sequência de ARN heteróloga compreendendo o complemento inverso de uma sequência de codificação de ARNm ligada operativamente a um local de ligação de polimerase de vírus de ARN de cadeia negativa caracterizado por se transfectarem, com uma RNP recombinante, células hospedeiras modificadas para expressarem ARN-polimerase dependente de ARN e se recuperar o vírus.
  45. 46 - Processo de acordo com a reivindicação 45 caracterizado por no vírue de ARN de cadeia negativa, quimérico.
    71 470
    6923-004-118
    -88a sequência de codificação de ARNm ser uma sequência de codificação do epitopo da inunodeficiência humana (HIV).
  46. 47 - Processo de acordo com a reivindicação 46 caracterizado por no vírus de ARN de cadeia negativa, quimérico, a sequência de codificação do epitopo da imunodeficiência humana (HIV) ser uma sequência de codificação do epitopo gpl20.
  47. 48 - Processo de acordo com a reivindicação 45 caracterizado por no vírus de ARN de cadeia negativa, quimérico, a sequência de codificação de ARNm ser uma sequência de codificação do epitopo de antigénio de superfície do vírus de hepatite B (HBsAg), uma sequência de codificação do epitopo de glicoproteína de herpes, uma sequência de codificação do epitopo de poliovirus VP1, uma sequência de codificação do epitopo de determinante antigénica bacteriana ou uma sequência de codificação do epitopo de uma determinante antigénica parasita.
  48. 49 - Processo de acordo com a reivindicação 48 caracterizado por no vírus de ARN de cadeia negativa, quimérico, a sequência de codificação do epitopo de glicoproteína de herpes ser uma sequência de codificação do epitopo de glicoproteína gD ou gE de herpes.
  49. 50 - Processo de acordo com a reivindicação 46, 47, 48 ou 49 caracterizado por o vírus de ARN de cadeia negativa, quimérico, compreender o vírus da gripe.
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