ES2075901T5 - Sistemas de expresion de virus recombinantes de arn con cadena negativa y vacunas. - Google Patents

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Abstract

SE DESCRIBEN MODELOS DE ARN DE VIRUS DE FRAGMENTOS NEGATIVOS RECOMBINANTES QUE PUEDEN SER UTILIZADOS PARA EXTRESAR PRODUCTOS DE GENES HETEROLOGOS Y/O PARA CONSTRUIR VIRUS QUIMERICOS. LA POLIMERASA VIRAL DE LA GRIPE, QUE SE PREPARO CON UNA CANTIDAD REDUCIDA DE ARN VIRAL, SE UTILIZO PARA COPIAR PEQUEÑOS MODELOS DE ARN PREPARADOS A PARTIR DE SECUENCIAS CODIFICADAS POR PLASMIDOS. LAS FORMACIONES DE MODELOS QUE SOLO CONTENIAN EL EXTREMO 3'' DEL ARN GEROMICO RESULTARON QUE SE PODIAN COPIAR DE MANERA EFICAZ, LO QUE INDICABA QUE EL PROMOTOR SOLO ESTABA DENTRO DEL TERMINO 3'' DEL NUCLEOTIDO 15. LAS SECUENCIAS NO ESPECIFICAS DE LOS TERMINOS VIRALES DE LA GRIPE NO SE COPIARON Y, SORPRENDENTEMENTE, LOS TERMINOS QUE CONTENIAN ARN SUB S IDENTICOS A LOS DEL CRNA DE SIGNO MAS (+) SE COPIARON A BAJOS NIVELES. LA ESPECIFICIDAD PARA EL RECONOCIMIENTO DEL PROMOTOR DEL SIGNO DEL VIRUS SE SIGUIO DEFINIENDO MEDIANTE UNA MUTAGENESIS ESPECIFICA DEL LUGAR . TAMBIEN SE DESCUBRIO QUE SE NECESITABAN NIVELES MAYORES DE PROTEINA VIRAL PARA CATALIZAR TANTO LA SINTESIS DEL ARN SIN CEBADO Y CEBADA DE ENDENUCLEASA REVESTIDA DESDE ESTOS PATRONES MODELO ASI COMO DESDE ARN SUB S DE LONGITUD GEROMICA. ESTO INDICO QUE ESTE SISTEMA RECONSTITUIDO TENIA PROPIEDADES CATALITICAS MUY PARECIDAS A LAS DE LOS PNR SUB S VIRALES NATIVOS. SE OBTUVIERON AL RAS NIVELES DE EXPRESION DE UN GEN HETEROLOGO UTILIZANDO LAS CONSTRUCCIONES Y METODOS DESCRITOS.

Description

Sistemas de expresión de virus recombinantes de ARN con cadena negativa y vacunas.
1. Introducción
La presente invención se refiere a moldes recombinantes de RNA de virus de la influenza de hebra negativa que pueden ser empleados para expresar productos génicos heterólogos en sistemas de células hospedantes apropiadas y/o para construir virus de la influenza recombinantes que expresan, empaquetan, y/o presentan el producto génico heterólogo. Los productos de expresión y los virus quiméricos pueden ser utilizados ventajosamente en formulaciones de vacunas.
La invención se demuestra mediante la construcción de moldes recombinantes de RNA de virus de la influenza que contienen una secuencia codificante de genes heterólogos en la polaridad negativa. Estos moldes recombinantes, cuando se combinaron con RNA-polimerasa RNA-dirigida, viral, purificada, eran infecciosos, se replicaban en células huésped apropiadas, y expresaban el producto génico heterólogo en niveles altos. Además, el gen heterólogo era expresado y empaquetado por los virus de la influenza recombinantes que resultan.
2. Fundamento de la invención
Un número de virus DNA ha sido construido por ingeniería genética para dirigir la expresión de proteínas heterólogas en sistemas celulares hospedantes (por ejemplo, virus vacunal, baculovirus, etc.). Recientemente, se han hecho avances similares con virus RNA de hebra positiva (por ejemplo, poliovirus). Se cree que los productos de expresión de estas construcciones, es decir, el producto génico heterólogo o el virus quimérico que expresa el producto génico heterólogo, han de ser potencialmente útiles en formulaciones de vacunas (vacunas virales, subunitarias o totales). Un inconveniente para el uso de virus tales como virus vacunales para construir virus recombinantes o quiméricos para usar en vacunas es la carencia de variación en sus epítopos principales. Esta carencia de variabilidad en las cepas virales impone limitaciones estrictas sobre el uso repetido de vacunas quiméricas, en las que las vacunaciones múltiples pueden generar resistencia del hospedante a la cepa por lo que el virus inoculado no puede infectar al huésped. La inoculación de un individuo resistente con vacunas quiméricas puede, por consiguiente, no inducir estimulación inmunitaria.
Por contraste, el virus de la influenza, un virus RNA de hebra negativa, demuestra una amplia variabilidad de sus epítopos principales. Sin duda, han sido identificadas miles de variantes de la influenza, cada una de cuyas cepa ha evolucionado por deriva antigénica. Los virus de hebra negativa, tales como el de la influenza, podrían ser candidatos interesantes a la construcción de virus quiméricos para usar en vacunas debido a que su variabilidad genética permite la construcción de un vasto repertorio de formulaciones de vacunas que pueden estimular inmunidad sin el riesgo de desarrollar tolerancias. No obstante, la consecución de este objetivo ha estado impedida por el hecho de que, hasta la fecha, no ha sido posible construir partículas de RNA de hebra negativa de influenza, recombinantes o quiméricas, que fueran infecciosas.
2.1. El virus de la influenza
Familias de virus que contienen RNA de una sola hebra, envuelto, del genoma de sentido negativo, están clasificadas en grupos que tienen genomas no segmentados (Paramixovirus, Rhabdovirus) o aquellos que tienen genomas segmentados (Ortomixovirus, Buniavirus y Arenavirus). La familia de los Ortomixovirus, que se describe en detalle más adelante y se utiliza en los ejemplos de esta memoria, contiene solo los virus de la influenza tipos A, B
y C.
Los viriones de la influenza están constituidos por un núcleo interna de ribonucleoproteína (una nucleocápsida helicoidal) que contiene el genoma de RNA de una sola hebra, y una envoltura externa de lipoproteína revestida en el interior por una proteína de matriz (M). El genoma segmentado de la influenza A consta de ocho moléculas (siete para la influenza C) de RNAs de una sola hebra, de polaridad negativa, lineal, que codifican diez polipéptidos, que incluyen las proteínas de RNA-polimerasa RNA-dirigida (PB2, PB1 y PA) y nucleoproteína (NP) que forman la nucleocápsida; las proteínas de matriz (M1, M2); dos glicoproteínas de la superficie que se proyectan desde la envoltura de lipoproteína: hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA); y proteínas no estructurales cuya función es desconocida (NS1 y NS2). La transcripción y la replicación del genoma tiene lugar en el núcleo y el montaje tiene lugar mediante gemación sobre la membrana plasmática. Los virus pueden reordenar genes durante infecciones
mixtas.
El virus de la influenza adsorbe mediante HA a sialil-oligosacáridos en glicoproteínas y glicolípidos de la membrana celular. Después de la endocitosis del virión, tiene lugar un cambio de conformación en la molécula de HA dentro del endosoma celular, lo que facilita la fusión de membranas, disparando de este modo la retirada de la capa. La nucleocápsida emigra hacia el núcleo donde es transcrito mRNA viral como el acontecimiento inicial en la infección. El mRNA viral es transcrito mediante un mecanismo único en el que la endonucleasa viral segmenta el término 5' con casquete desde los mRNAs heterólogos celulares que sirven luego como cebadores para la transcripción de moldes de RNA viral mediante la viral-transcriptasa. Los transcritos terminan en sitios de 15 a 22 bases desde los extremos de sus moldes, donde las secuencias óligo(U) actúan como señales para la adición de tractos poli(A) independiente del molde. De las ocho moléculas de mRNA viral producidas de este modo, seis son mensajes monocistrónicos que son traducidos directamente en las proteínas que representan HA, NA, NP y las proteínas de la polimerasa viral, PB2, PB1 y PA. Los otros dos transcritos sufren corte y empalme, proporcionando cada uno dos mRNAs que son traducidos en marcos de lectura diferentes produciendo M1, M2, NS1 y NS2. En otras palabras, los ocho mRNAs virales codifican diez proteínas: ocho estructurales y dos no estructurales. Un resumen de los genes del virus de la influenza y sus productos proteínicos, se muestra en la Tabla T que figura a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA I Segmentos de RNA genómico del virus de la influenza y asignaciones de codificación^{a}
1
2
3
Después de la transcripción, la replicación del genoma del virus es el segundo hecho esencial en la infección por virus RNA de hebra negativa. Como con otros virus RNA de hebra negativa, la replicación del genoma del virus en la influenza se realiza por intermedio de proteínas especificadas por virus. Se ha establecido la hipótesis de que la mayor parte o la totalidad de las proteínas virales que transcriben segmentos de mRNA de virus de la influenza también llevan a cabo su replicación. Todos los segmentos de RNA viral poseen términos comunes 3' y 5', que permiten, presumiblemente, que el aparato de sintetización de RNA reconozca cada uno de los segmentos con igual eficacia. El mecanismo que regula los usos alternativos (es decir, la transcripción o la replicación) del mismo complemento de proteínas (PB2, PB1, PA y NP) no ha sido identificado con claridad pero parece implicar la abundancia de formas libres de una o más de las proteínas de las nucleocápsidas, en particular, la NP. El núcleo aparece como el sitio de replicación del RNA del virus, justamente como lo es el sitio para la transcripción.
Los primeros productos de la síntesis de RNA replicativa son copias complementarias (es decir, polaridad más) de todos los segmentos de RNA genómico del virus de la influenza (cRNA). Estas copias con hebras más (anti-genomas) se diferencian de los transcritos de mRNA de hebra más en la estructura de sus términos. A diferencia de los transcritos de mRNA, los cRNAs anti-genómicos no tienen casquete ni están metilados en los términos 5', ni están truncados ni poliadenilados en los términos 3'. Los cRNAs son co-terminales con sus moldes de hebra negativa y contienen la totalidad de la información genética en cada uno de los segmentos de RNA genómico existente en la forma complementaria. Los cRNAs sirven como moldes para la síntesis de vRNAs genómicos de hebra negativa.
Los genomas (vRNAs) y antigenomas (cRNAS) de hebra negativa de virus de la influenza están siempre encapsidados mediante proteínas de nucleocápsidas; las únicas especies de RNA sin encapsidar son los mRNAs de virus. En contraste con los otros virus RNA con envoltura, el montaje con nucleocápsida parece tener lugar en el núcleo en vez de en el citoplasma. El virus madura por gemación desde la superficie apical de la célula que incorpora la proteína M sobre el lado citoplásmico o superficie interior de la envoltura de gemación. La HA y NA quedan glicosiladas e incorporadas en la envoltura lipídica. En células permisivas, la HA es finalmente segmentada, pero las dos cadenas que resultan permanecen unidas mediante enlaces disulfuro.
No se conoce mediante qué mecanismo es seleccionada una copia de cada uno de los ocho RNAs virales genómicos para su incorporación en cada nuevo virión. Con frecuencia son producidas partículas defectuosas que interfieren (DI), en especial después de infección a multiplicidad alta.
2.2 RNA-polimerasa RNA-dirigida
Las RNA-polimerasas RNA-dirigidas de virus animales han sido ampliamente estudiadas en lo que respecta a muchos aspectos de las estructuras proteínicas y de las condiciones de reacción. Sin embargo, los elementos del RNA del molde que favorecen la expresión óptima mediante la polimerasa, solamente podrían estudiarse por inferencia utilizando secuencias de RNA viral existentes. Este análisis de promotor es de interés ya que es desconocido cómo una polimerasa viral reconoce RNAs virales específicos de entre los muchos RNAs codificados en el huésped encontrados en una célula infectada.
Virus animales que contienen RNA genómico de sentido más pueden ser replicadas cuando RNA derivado de plásmidos es introducido en células mediante transfección (por ejemplo, Racaniello et al., 1981, Science 214:916-919; Levis et al., 1986, Cell 44:137-145). En el caso de poliovirus, la polimerasa purificada puede replicar un RNA genómico en reacciones in vitro y cuando esta preparación es transfectada en células es infecciosa (Kaplan et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8424-8428). Sin embargo, los elementos del molde que sirven como promotor de la transcripción para la polimerasa codificada por poliovirus, son desconocidos ya que pueden ser copiados incluso homopolímeros de RNA (Ward et al., 1988, J. Virol. 62:558-562). Transcritos de SP6 han sido empleados también para producir RNAs de interferencia defectuosos (DI), modélicos, para el genoma viral Sindbis. Cuando el RNA es introducido en células infectadas, se replica y empaqueta. Se puso de manifiesto que las secuencias de RNA que eran responsables tanto del reconocimiento por la polimerasa viral de Sindbis como del empaquetamiento del genoma en partículas de virus, estaban dentro de 162 nucleótidos (nt) del término 5' y 19 nt del término 3' del genoma (Levis et al., 1986, Cell 44:137-145). En el caso del virus del mosaico del bromo (BMV), un virus vegetal de RNA de hebra positiva, se han utilizado transcritos de SP6 para identificar el promotor como un término de 3' semejante a tRNA, de 134 nt. (Dreher y Hall, 1988, J. Mol. Biol. 201:31-40). Se puso de manifiesto que el reconocimiento de polimerasa y síntesis eran dependientes tanto de la secuencia como de características estructurales secundarias (Dreher et al., 1984, Nature 311:171-175).
Los virus RNA de sentido negativo han sido refractarios al estudio de los requisitos secuenciales de la replicasa. La polimerasa purificada del virus de la estomatitis vesicular solamente es activa en transcripción cuando complejos de ribonucleoproteína (RNPs) derivados de virus son incluidos como molde (De and Banerjee, 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun. 126:40-40; Emerson y Yu, 1975, J. Virol. 15:1348-1356; Naito e Ishihama, 1976, J. Biol. Chem. 251:4307-4313). Han sido reconstituidas RNPs desde RNA desnudo de partículas DI de VSV utilizando extractos de células infectadas como fuente de proteínas. Estas RNPs fueron replicadas luego cuando fueron vueltas a añadir a células infectadas (Mirakhur y Peluso, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7511-7515). Con respecto a los virus de la influenza, se ha informado recientemente que ha sido empleado RNA desnudo, purificado desde virus, para reconstituir RNPs. La nucleocápsida viral y las proteínas de polimerasa fueron purificadas en gel y renaturalizadas sobre el RNA viral utilizando tiorredoxina (Szewczyk et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:7907-7911). Sin embargo, estos autores no han indicado que la actividad de la preparación fuera específica del RNA viral de la influenza, ni analizado las señales que favorecen la transcripción.
Durante el curso de infección por virus de la influenza la polimerasa cataliza tres actividades de transcripción diferentes. Estas incluyen la síntesis de (a) mRNA subgenómico, que contiene un casquete en 5' y una cola de poli-A en 3'; (b) una hebra más o antigenoma de longitud total (cRNA) copiado desde el RNA genómico; y (c) vRNA genómico sintetizado a partir del cRNA de longitud total (revisado en el trabajo de Ishihama y Nagata, 1988, CRC Crit. Rev. Biochem. 23:27-76; y Krug, Transcription and replication of influenza viruses. (Transcripción y replicación de virus de la influenza). En: Genetics of influenza viruses (Características genéticas de virus de la influenza) Compiladores, Palese, P. y Kingsbury, D.W. Nueva York, Springer-Verlag, 1983, página 70-98). Se cree que las proteínas virales PB2, PB1 y PA catalizan la totalidad de la síntesis de RNA específico de virus de la influenza cuando están en presencia de exceso de proteína de la nucleocápsida (NP; véanse referencias bibliográficas anteriores). Estas funciones de polimerasas han sido estudiadas utilizando núcleos de RNP que derivan de virus rotos por detergente, y RNPs procedentes de los extractos nucleares de células infectadas. Ocurre transcripción desde las RNPs derivadas de virus rotos cuando se ceba o bien con dinucleótido adenilil-(3',5')-guanosina (ApG) o con mRNAs con casquete. Los productos de mRNA con sentido más han terminado la síntesis de 17-20 nucleótidos aguas arriba del término de 5' del molde de RNA y han sido procesados mediante la adición de colas de poli A. Estos productos no pueden servir de molde para el genoma de sentido viral dado que carecen de secuencias terminales (Hay et al., 1977, Virology 83:337-355). RNPs que derivan de extractos nucleares de células infectadas sintetizan también mRNA poliadenilado en presencia de cebadores de RNA con casquete. Sin embargo, si se emplea ApG bajo estas condiciones, pueden ser obtenidos RNAs y cRNA poliadenilado y de longitud total (Beaton y Krug, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:6282-6286; Takeuchi et al, 1987, J. Biochem. 101:837-845). Recientemente se ha indicado que podría ocurrir síntesis replicativa de cRNA en ausencia de cebador exógeno si el extracto nuclear era recogido al cabo de determinados tiempos después de la infección. En estas mismas preparaciones se observó también la síntesis de vRNA de sentido negativo a partir de un molde de cRNA (Shapiro y Krug, 1988, J. Virol. 62:2285-2290). Se ha indicado que la síntesis de cRNA de longitud total dependía de la presencia de proteína de la nucleocápsida (NP) que estaba libre en solución (Beaton y Krug, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6282-6286; Shapiro y Krug, 1988, J. Virol. 62:2285-2290). Estos descubrimientos condujeron a la sugerencia de que el control regulador entre la síntesis de mRNA y cRNA por el complejo de RNP se basa en el requisito de que haya exceso de NP soluble (Beaton y Krug, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6282-6286).
Otra línea de investigación se ha enfocado sobre la preparación de complejos de RNA-polimerasa que derivan de RNPs procedentes de virus rotos con detergente. Cuando el complejo de RNP es centrifugado mediante un gradiente de CsCl-glicerina, el RNA puede encontrarse asociado con las tres proteínas (P) de polimerasa en la parte baja del gradiente. Cerca de la parte alta del gradiente, puede encontrarse proteína NP libre (Honda et al., 1988, J. Biochem. 104:1021-1026; Kato et al., 1985, Virus Research 3, 115-127). El complejo de RNA-polimerasa purificado (parte baja del gradiente), es activo para iniciar la síntesis de RNA cebada con ApG, pero falla en el alargamiento a más de 12-19 nucleótidos. Cuando fracciones procedentes de la parte alta del gradiente que contienen la proteína NP se vuelven a añadir al complejo de RNA-polimerasa, puede sobrevenir alargamiento (Honda et al., 1987, J. Biochem. 102:41-49). Estos datos sugieren que la proteína NP es necesaria para el alargamiento, pero que puede ocurrir iniciación en ausencia de NP.
Se ha puesto de manifiesto que el RNA genómico de virus de la influenza se encuentra en una conformación circular mediante el apareamiento de bases de los términos para formar un enclave (panhandle) de 15 a 16 nt (Honda et al., 1988, J. Biochem. 104:1021-1026; Hsu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8140-8144). Ya que la polimerasa viral se encontró unida al enclave, esto llevó a la idea de que se requería una estructura de enclave para el reconocimiento por la polimerasa viral (Honda et al., 1988, J. Biochem. 104:1021-1026). Por consiguiente se elaboró la hipótesis en estos dos informes de que el promotor para la RNA-polimerasa viral era el RNA de doble hebra en la conformación del enclave.
3. Sumario de la invención
Se describen moldes recombinantes de RNA viral de la influenza según la reivindicación 1, que pueden ser empleados con complejos de RNA-polimerasa RNA-dirigida, purificados, para expresar productos génicos heterólogos en células huésped apropiadas y/o para rescatar el gen heterólogo en partículas de virus. Los moldes de RNA se preparan mediante transcripción de secuencias apropiadas de DNA con una RNA-polimerasa DNA-dirigida. Los moldes de RNA que resultan tienen la polaridad negativa y contienen secuencias terminales apropiadas que permiten al aparato de sintetización de RNA viral reconocer el molde.
Según se demuestra mediante los ejemplos aquí descritos, moldes de RNA de la influenza, de orientación negativa, recombinantes, pueden ser mezclados con proteínas de polimerasas virales purificadas y nucleoproteína (es decir, el complejo de polimerasa viral purificado) para formar RNPs recombinantes infecciosas. Estas pueden ser usadas para expresar productos génicos heterólogos en células huésped o para rescatar el gen heterólogo en partículas de virus mediante transfeccion conjunta de células huésped con RNPs recombinantes y virus. Alternativamente, los moldes recombinantes de RNA o RNPs recombinantes pueden emplearse para transfectar líneas celulares transformadas que expresan la RNA-polimerasa RNA-dependiente y permitir la complementación. Adicionalmente, se describe también un sistema de replicación para el virus de la influenza que no depende de virus. Vectores vacunales que expresan polipéptidos del virus de la influenza fueron empleados como el origen de proteínas que eran capaces de replicar y transcribir RNPs derivadas sintéticamente. Se encontró que el subconjunto mínimo de proteínas del virus de la influenza necesario para la replicación específica y expresión del RNP viral eran las tres proteínas de polimerasa (PB2, PB1 y PA) y la nucleoproteína (NP). Esto sugiere que las proteínas no estructurales, NS1 y NS2, no son absolutamente necesarias para la replicación y expresión de RNP viral.
Los productos de expresión y/o viriones quiméricos obtenidos pueden ser utilizados ventajosamente en formulaciones de vacunas. El uso de influenza recombinante para este fin es especialmente interesante ya que la influenza demuestra una tremenda variabilidad de cepas lo que permite la construcción de un extenso repertorio de formulaciones de vacunas. La posibilidad de selección entre miles de variantes de la influenza para construir virus quiméricos evita el problema de la resistencia del huésped con que se tropieza cuando se utilizan otros virus, tales como virus vacunales. Además, ya que la influenza estimula una respuesta vigorosa secretoria y de células T citotóxicas, la presentación de epítopos extraños en el fundamento del virus de la influenza puede proporcionar también la inducción de inmunidad secretoria e inmunidad por intermedio celular.
3.1 Definiciones
Tal como se emplean en esta memoria, los siguientes términos y expresiones tienen los significados que se indican:
CRNA =
RNA anti-genómico
HA =
hemaglutinina (glicoproteína de la envoltura)
M =
proteína matriz (reviste el interior de la envoltura
MDCK =
células de riñón canino de Madin Darby
MDBK =
células de riñón bovino de Madin Darby
moi =
multiplicidad de infección
NA =
neuraminidasa (glicoproteína de la envoltura)
NP =
nucleoproteína (asociada con RNA y requerida para actividad de polimerasa)
NS =
proteína no estructural (función desconocida)
nt =
nucleótido
PA, PB1, PB2 =
componentes de RNA-polimerasa RNA-dirigida
RNP =
ribonucleoproteína (RNA, PB2, PB1, PA y NP)
rRNP =
RNP recombinante
vRNA =
RNA genómico de virus
complejo de polimerasa viral =
PA, PB1, PB2 y NP
WSN =
virus A/WSN/33 de la influenza
virus WSN-HK =
virus de redistribución que contiene siete genes procedentes del virus WSN y el gen de NA procedente del virus A/HK/8/68 de la influenza.
4. Descripción de las figuras
Figura 1. Purificación de la preparación de polimerasa.
Núcleos de RNP fueron purificados partiendo de virus totales y sometidos luego a centrifugación con gradiente de CsCl-glicerina. La polimerasa se purificó de las fracciones con CsCl 1,5 a 2,0 M. Se analizaron después muestras mediante electroforesis en gel de poliacrilamida sobre un gel de un gradiente lineal de 7-14% en presencia de dodecilsulfato sódico al 0,1% seguido por tinción con plata. Las muestras de proteína contenían 1,4 \mug de virus total (calle 1), 0,3 \mug de virus total (calle 2), 5 \mul de núcleos de RNP (calle 3) y 25 \mul de RNA polimerasa (calle 4). Las asignaciones conocidas de las proteínas se indican a la izquierda.
Figura 2. Construcciones de plásmidos utilizadas para preparar moldes de RNA. El plano del plásmido está dibujado con el recuadro negro, lleno, que representa secuencias de pUC-19, el recuadro moteado que representa el promotor truncado reconocido específicamente por RNA polimerasa del bacteriófago T7, la línea llena representa el DNA que es transcrito desde plásmidos que han sido digeridos con MboII. El recuadro blanco representa secuencias que codifican los sitios de reconocimiento para MboII, EcoRI y PstI, en este orden. Están indicados sitios de segmentación por endonucleasas de restricción. Por debajo del diagrama, se dan las secuencias enteras de RNAs que resultan de síntesis por RNA polimerasa de T7 partiendo del plásmido digerido con MboII. El RNA de V-wt posee los términos 5' y 3' idénticos a los que se encuentran en el segmento 8 de RNA de los virus de la influenza A, separados por 16 nucleótidos "espaciadores". El RNA de M-wt, representa la posición opuesta exacta, o "sentido de mensaje", de V-wt. Están indicados sitios de endonucleasas de restricción para DraI, EcoRI, PstI y SmaI. Transcritos de T7 de plásmidos segmentados por estas enzimas dan como resultado, respectivamente, RNAs de longitud 32, 58, 66 y 91 nucleótidos. Están indicadas las secuencias de RNA de V-d5'. El dibujo del plásmido es esencialmente el mismo que el usado para el RNA de V-wt excepto por cambios menores en la secuencia "espaciadora". Los mutantes puntuales de RNAs de
V-d5' que fueron estudiados están indicados en la Tabla I.
Figura 3. Análisis de productos de polimerasa viral de la influenza. Fig. 3A: Mezclas de reacción con polimerasas conteniendo ApG 0,4 mM (calle 2) o sin cebador (calle 3) fueron sometidas a electroforesis sobre geles de poliacrilamida al 8% que contenían urea 7,7 M. Fig. 3B: El RNA naciente es resistente a la nucleasa S1 específica de hebra única. Después de la reacción estándar con polimerasa, las soluciones fueron diluidas en tampón con nucleasa S1 (calle 1) y se añadió enzima (calle 2). Como testigo para condiciones de digestión con S1, se trató RNA de V-wt de una sola hebra, marcado radiactivamente, con nucleasa S1 (calle 3) o con tampón solamente (calle 4). Fig. 3C: Análisis con ribonucleasa T1 de productos de reacción purificados en gel. Los productos de reacción de la polimerasa viral utilizando el molde de RNA de V-wt fueron sometidos a electroforesis sobre un gel de poliacrilamida al 8%. La banda de 53 nt y el transcrito más pequeño fueron cortados y eluídos desde la matriz del gel. Estos RNAs fueron digeridos con RNAsa T1 y analizados por electroforesis sobre un gel de poliacrilamida al 20% que contenía urea 7,7 M. Para comparar, transcritos de T7 de RNAs de M-wt y V-wt que habían sido sintetizados en presencia de \alpha-^{32}P-UTP fueron analizados también con RNAsa T1. Se indican los oligonucleótidos radiomarcados predichos de los RNAs testigo. Calle 1, producto de 53 nucleótidos de longitud total (FL); calle 2, producto de RNA más pequeño (Sm) de 40-45 nucleótidos; calle 3, RNA de M-wt marcado por incorporación de ^{32}P-UMP; y calle 4, RNA de V-wt marcado como en la calle 3.
Figura 4. Condiciones óptimas de reacción para la polimerasa viral. Fig. 4A: Reacciones con molde de V-wt se montaron sobre hielo y se incubó luego a las temperaturas indicadas durante 90 minutos. Fig. 4B: Se prepararon reacciones con el molde de V-wt, en paralelo con las concentraciones de NaCl o KCl indicadas y se incubó a 30ºC durante 90 minutos. Fig. 4C: Una reacción única con el molde de V-wt se incubó a 30ºC, y a los tiempos indicados se retiraron muestras y se trataron inmediatamente mediante extracción con fenol-cloroformo. Todos los geles contenían poliacrilamida al 8% con urea 7,7 M.
Figura 5. Especificidad de molde de la polimerasa viral. Fig. 5A: La reacción con polimerasa viral requiere secuencias de promotor terminales en 3'. Se emplearon diferentes RNAs de molde en reacciones bajo condiciones estándar. Calle 1, el RNA de V-Pst, que es idéntico al de V-wt excepto que tiene una extensión de 13 nt en el extremo 3'; calle 2, RNA de V-Sma, que tiene una extensión de 38 nt en el extremo 3'; calle 3, RNA de V-wt; calle 4, un polinucleótido de DNA con secuencia idéntica a la del RNA de V-wt; calle 5, un RNA de 80 nt generado por transcripción con RNA polimerasa del bacteriófago T3 de un plásmido pIBI-31 digerido con HindIII. La autorradiografía fue sometida a sobre-exposición con objeto de resaltar la ausencia de productos de reacción específicos cuando se emplearon estos otros moldes. Fig. 5B: 10 ng de cada RNA de molde fueron incubados con la polimerasa viral y los productos fueron sometidos luego a electroforesis sobre geles de poliacrilamida al 8% que contenían urea 7,7 M. Se indican las calles siguientes: Calle 1, RNA de V-wt; calle 2, RNA de V-Dra; calle 3, RNA de V-Eco; calle 4, RNA de M-wt; y calle 5, un oligonucleótido marcador de 53 nt. Para las diferencias exactas de las secuencias hágase referencia a la Fig. 2 y la Sección 6.1 y siguientes.
Figura 6. El promotor de RNA no requiere un enclave terminal. Reacción con polimerasa utilizando dos RNAs de molde. Cada reacción contenía 5 ng de RNA de V-wt. Como segundo molde Las reacciones contenían 0 ng (calle 1), 0,6 ng (calle 2) y 3,0 ng (calle 3), de RNA de V-d5'. Las relaciones molares resultantes son la indicadas en la figura. Los productos de reacción fueron analizados sobre un gel de poliacrilamida al 8% en presencia de urea 7,7 M. Después de análisis densitométrico de las autorradiografías, se corrigió la intensidad relativa de cada uno de los picos teniendo en cuenta la cantidad de UMP radiactivo que se había incorporado en cada producto.
Figura 7. Especificidad de secuencia de promotor: RNAs que carecían del término de 5' y que contenían mutaciones puntuales (Tabla II), fueron comparados con RNA de V-d5' en reacciones estándar con polimerasa. El panel de la derecha procede de un conjunto de reacciones separadas. Comparaciones cuantitativas están establecidas en la
Tabla II.
Figura 8. Preparaciones de polimerasa de alta concentración son activas en reacciones de síntesis cebadas con endonucleasa-con casquete y en reacciones de síntesis de RNA sin cebador. Fig. 8A: Especificidad de cebador de la enzima de alta concentración. En la calle 1 está un molde de 30 nt sintetizado radiactivamente. Reacciones empleando 20 ng de RNA de V-d5' y 5 \mul de polimerasa viral contenida como cebador: sin cebador (calle 2); 100 ng de RNA de BMV (De y Banerjee, 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun. 6:40-49) que contenían una estructura de casquete 0 (calle 3); 100 ng de mRNA de globina de conejo, que contenía una estructura de casquete 1, (calle 4); y APG 0,4 mM (calle 5). Una exposición más ligera de la calle 5 se muestra como calle 6. Fig. 8B: Análisis con nucleasa S1 de RNAs purificados en gel. Productos de reacciones utilizando como cebador ApG (calle 1 y 2); sin cebador (calles 3 y 4); o mRNA de globina (calles 5 y 6) fueron sometidos a electroforesis en ausencia de urea, el fragmento de gel apropiado fue cortado y se eluyó el RNA. Este RNA se sometió a digestión luego con nucleasa S1 (calles 2, 4 y 6) y los productos fueron desnaturalizados y analizados sobre un gel de poliacrilamida al 8% que contenía urea 7,7 M.
Figura 9. Síntesis de RNA de longitud genómica procedente de RNPs reconstituidas. Se analizaron productos de reacción utilizando 10 \mul de polimerasa y como molde RNA de 890 nt idéntico a la secuencia del segmento 8 del virus A/WSN/33 y RNA extraído del virus A/PR/8/34, sobre un gel de poliacrilamida al 4% que contenía urea 7,7 M. En la calle 1 se muestra el molde de 890 nt sintetizado radiactivamente por RNA polimerasa de T7. El RNA derivado de plásmido de 890 nt se empleó como molde en las calles 2, 3, 8 y 9. Se empleó como molde en las calles 4, 5, 10 y 11 RNA extraído de virus. No se empleó molde en las calles 6 y 7. No se empleó cebador en las calles 2 a 5, y se empleó ApG como cebador en las calles 6 a 11. Los productos de reacción fueron tratados con nucleasa S1 en las calles 3, 5, 7, 9 y 11.
Figura 10. Representación esquemática de un método de mutagénesis dirigido por PCR que puede ser empleado para reemplazar secuencias de codificación virales dentro de segmentos génicos virales.
Figura 11.(A). Representación esquemática de porciones relevantes del pIVCAT1. Los diversos dominios están marcados y son, de izquierda a derecha; un promotor de T7 truncado; el extremo 5' sin traducir del segmento 8 del virus A/PR/8/34 de la influenza (22 nucleótidos); 8 nucleótidos de secuencia de engarce; la región de codificación entera del gen de CAT (660 nucleótidos); el extremo 3' sin traducir, entero, del segmento 8 del virus A/PR/8/34 de la influenza (26 nucleótidos); y la secuencia de engarce que contiene el sitio de la enzima de restricción HGaI. Están indicados los sitios de enzimas de restricción relevantes y los sitios de comienzo y terminación del gen de CAT están indicados. (B) el producto de RNA de 716 bases obtenido después de digestión con HgaI y transcripción del pIVACAT1 mediante RNA polimerasa de T7. Las secuencias virales de la influenza están indicadas mediante letras negrillas, las secuencias del gen CAT mediante letras ordinarias y las secuencias de engarce mediante letras itálicas. Los tripletes - - en orientación antisentido - - que representan los codones de iniciación y terminación del gen de CAT están indicados mediante flecha y subrayado, respectivamente.
Figura 12. Productos de RNA de transcripción por polimerasa de T7 y transcripción in vitro por polimerasa de virus de la influenza. Calle 1-4: Análisis en gel de poliacrilamida de transcritos por polimerasa de T7 radiomarcados procedentes de pIVACAT1, y pHgaNS. Calles 5 y 6: Análisis en gel de poliacrilamida de los productos radiomarcados de transcripción in vitro por proteína de polimerasa de la influenza A purificada utilizando moldes de RNA de
1VACAT1 y RNA de HgaNS, sin marcar. Calle 1: RNA de HgaNS de 80 nt. Calles 2-4: preparaciones diferentes de RNA de IVACAT1. Calle 5: Transcrito por polimerasa viral de RNA de IVACAT1. Calle 6: Transcrito por polimerasa viral de RNA de HgaNS.
Figura 13. Vista esquemática de la transfección por RNP y experimentos de pase.
Figura 14. Valoraciones de CAT de células transfectadas por RNP con RNA de IVACAT1. (A) Curso del tiempo de transfección por RNP en células 293. Fueron transfectadas células en -1 hora con la RNP recombinante e infectadas con virus en la hora 0. Se recogieron células en los puntos de tiempo indicados y se valoró para determinar la actividad de CAT. (B) Requisitos para transfección por RNP de células 293. Los parámetros de las mezclas de reacción son los indicados. (C) Transfección por RNP de células MDCK. Células MDCK fueron transfectadas con RNA polimerasa de IVACAT1 o bien a -1 hora o +2 horas con respecto a la infección por virus. Se recogieron células y se valoró la actividad de CAT en los tiempos indicados. Los componentes/condiciones de la reacción fueron los indicados. "Tiempo" indica el punto temporal de recogida de las células. T=0 marca el tiempo de adición del virus helper (cooperador). "RNA" representa el RNA de IVACAT1. "Pol" es el complejo de proteína de polimerasa de A/PR/8/34 de la influenza, purificado. "WSN" indica el virus helper de A/WSN/33 de la influenza. "Pre-Inc" indica preincubación de RNA y polimerasa en tampón de transcripción a 30ºC durante 30 min. "Transfección por RNP" indica el tiempo de transfección por RNP con respecto a la infección por virus. "+/-" indican la presencia o ausencia del componente/característica particular. "C" indica valoraciones testigo utilizando enzima CAT de que se dispone en el comercio (Boehringer-Mannheim).
Figura 15. Actividad de CAT en células MDCK infectadas con virus recombinantes. Se usó sobrenadante procedente de células NDCK transfectadas con RNP e infectadas con virus helper, para infectar células MDCK de nueva aportación. El inóculo se separó 1 hora después de infección, se recogieron células 11 horas más tarde y se valoró la actividad de CAT. Calle 1: extracto de células infectadas con virus helper solamente. Calle 2: extracto de células infectadas con 100 \mul de sobrenadante procedente de células MDCK transfectadas con RNP e infectadas con virus helper. Calle 3: Sobrenadante (80 \mul) de células procedentes de la calle 2. Calle 4: Igual que la calle 2, excepto que se añadió al inóculo virus helper (MOI 4). En contraste con los experimentos indicados en la Fig. 4, las valoraciones contenían 20 \mul de ^{14}C cloranfenicol.
Fig. 16. Diagrama de porciones relevantes del gen de neuraminidasa (NA) contenidas en plásmidos empleados para experimentos de transfección. El plásmido pT3Nav derivado del pUC19 contiene el gen de NA del virus A/WSN/33 de la influenza y un promotor truncado reconocido específicamente por RNA polimerasa del bacteriófago T3. El promotor de T3 usado está truncado de tal modo que el nucleótido transcrito inicial (una adenina) corresponde a la adenina en 5' del gen de NA de WSN. En el extremo 3' de la copia de cDNA del gen de NA, se insertó un sitio de la enzima de restricción Ksp632I de tal modo que el sitio de segmentación tiene lugar directamente después del extremo 3' de la secuencia génica de NA. Se obtuvo un transcrito de 1409 nucleótidos de longitud después de digestión con Ksp632I y transcripción por RNA polimerasa de T3 de PT3Nav (según se describe en la Sección 8.1, infra). Se muestran los 15 nucleótidos del extremo 5', los 52 nucleótidos que corresponden a la región entre los sitios NcoI y PstI de endonucleasas de restricción y los 12 nucleótidos del extremo 3'. El transcrito de pT3Nav mut 1 es idéntico al del pT3NAv excepto una única supresión, once nucleótidos aguas abajo desde el extremo 5' del RNA de tipo salvaje. El transcrito del pT3Nav mut 2 es idéntico al del pT3NAv excepto por 5 mutaciones situadas en la región central (indicada por subrayado). Estas cinco mutaciones no cambian la secuencia de aminoácidos en el marco de lectura abierto del gen. El codón de serina UCC en posición 887-889 (RNA de sentido más) fue reemplazado con el codón de serina AGU en el mismo marco. La numeración de nucleótidos sigue a Hiti et al., 1982, J. Virol. 41:730-734.
Fig. 17. Electroforesis en gel de poliacrilamida de RNAs purificados procedentes de virus de la influenza rescatados. Transcritos de RNA de pT3NAs (Fig. 16) de RNA extraído con fenol derivado de virus A/WSN/33 de la influenza, se mezclaron con preparaciones de polimerasa purificadas siguiendo el protocolo descrito en la Sección 6.1.1, que figura más adelante. Estas RNPs reconstituidas fueron transfectadas luego en células MDBK que habían sido infectadas una hora antes con virus helper WSN-HK. El medio, que contenía 28 \mug/ml de plasminógeno, se recogió después de 16 horas y el virus se amplificó y plaqueó sobre células MDBK en ausencia de proteasa. El virus obtenido de las placas fue amplificado adicionalmente después en células MDBK y se extrajo RNA con fenol partiendo de preparaciones de virus purificadas según se describe en las Secciones 6.1 y siguientes y 7.1 y siguientes. Se separaron RNAs sobre geles de poliacrilamida al 2,8%-bisacrilamida al 0,075%, que contenían urea 7,7 M en tampón de TBE y se visualizó mediante tinción con plata según se describe en la Sección 6.1 y siguientes. Calles 1 y 6: RNA de virus WSN-HK. Calle 2: RNA de virus que fue rescatado a partir de células MDBK después de transfección por RNP con RNA de NA derivada de pT3NAv e infección con virus helper WSN-HK. Calle 3: RNA de NA transcrito in vitro desde pT3NAv. Calle 4: RNA de virus WSN testigo. Calle 5: RNA de virus que fue rescatado de células MDBK después de transfección por RNP con RNA de virus WSN extraído con fenol con virus helper WSN-HK.
Fig. 18. Análisis secuencial de RNA obtenido de virus de la influenza rescatados que contienen cinco mutaciones específicas del sitio. Después de infección con el virus helper WSN-HK, células MDBK fueron transfectadas por RNP con RNA de T3NAv mut 2 que se había obtenido por transcripción desde pT3NAv mut 2. Después de incubar durante la noche en presencia de 28 \mug/ml de plasminógeno, se usó medio para propagación y plaqueo sobre células MDBK en ausencia de proteasa. El virus procedente de placas fue amplificado luego y se obtuvo RNA después de extracción con fenol del virus purificado. El rescate del gen de NA mutante en partículas de virus se verificó mediante secuenciación de RNA directa utilizando 5'-TACGAGGAAATGTTCCTGTTA-3' como cebador (correspondiente a las posiciones 800-819; Hiti et al., J. Virol. 41:730-734) y transcriptasa inversa (Yamashita et al., 1988, Virol. 163:112-122). Las secuencias mostradas corresponden a la posición 878-930 en el gen de NA (Hiti et al., J. Virol. 41:739-734). Las flechas y los nucleótidos subrayados indican los cambios en el RNA mutante en comparación con el RNA de tipo salvaje. Izquierda: RNA testigo obtenido de virus A/WSN/33 de la influenza. Derecha: RNA de virus mutante rescatado de células MDBK que fueron transfectadas por RNP con RNA de T3NAv mut 2 e infectadas con virus helper WSN-HK.
Fig. 19. Expresión de CAT en células transfectadas por RNP de IVACAT-1/infectadas con virus vacunales. Aproximadamente 10^{6} células C127 de ratón en placas de 35 mm fueron infectadas con mezclas de virus vacunales recombinantes (Smith et al, 1986) a una MOI de aproximadamente 10 para cada vector. Después de 1,5 horas se transfectó RNP de IVACAT-1 sintética en las células infectadas con virus según ha sido descrito (Lutjyes et al., 1989). Se incubaron las células durante la noche, se recogieron y se valoraron para determinar la actividad de CAT según procedimientos operatorios estándar (Gorman et al., 1982). Las valoraciones contenían 0,05 uCl de [^{14}C] cloranfenicol, 20 ul de acetil-CoA 40 mM (Boehringer y 50 ul de extractos celulares en tampón Tris 0,25 M (pH 7,5). Los tiempos de incubación fueron aproximadamente 4 horas. Las etiquetas bajo los números de las calles indican el tratamiento de las células. Calles 1-testigo; 2-transfección de RNA desnudo (sin polimerasa añadida), sin infección con virus helper; 3-transfección por RNP, sin virus helper; 4-transfección por RNP, virus de la influenza como helper (cooperador); calles 5-11-transfección por RNP, vectores de virus vacunales como virus helper expresan las proteínas del virus de la influenza indicadas.
Fig. 20. Ensayo de diversas líneas celulares. A) Se infectaron células con vectores vacunales que expresan las proteínas PB2, PB1 y PA (Calles 1,3,5,7) o las proteínas PB2, PB1, PA y NP (Calles 2,4,6,8), transfectadas con RNP de IVACAT-1 y examinadas para determinar la actividad de CAT según se ha descrito. Calles 1,2: Célula de riñón canino de Maden-Darby (MDCK); 3,4: células HeLa, 5,6: células 293 (Graham et al., 1977, J. gen. Virol. 36:59-72); 7,8 células L. B) Se utilizó como célula huésped la línea celular 3 PNP-4. Se muestran bajo cada calle las proteínas virales de la influenza expresadas en cada muestra. C) células 293 fueron infectadas con las cuatro vacunas requeridas y transfectadas con RNP sintética fabricada utilizando RNA de IVA-CAT-1 (calle 1) o de IVA-CAT-2 (calle 2). Después de incubar durante la noche, se recogieron las células y se llevaron a cabo valoraciones de CAT.
5. Descripción de la invención
Esta invención se refiere a la construcción y uso de moldes recombinantes de RNA viral de influenza según la reivindicación 1, que pueden ser empleados con RNA-polimerasa viral RNA-dirigida, para expresar productos génicos heterólogos en células huésped apropiadas y/o rescatar el gen heterólogo en partículas de virus de la influenza. Los moldes de RNA pueden ser preparados mediante transcripción de secuencias apropiadas de DNA utilizando una RNA-polimerasa DNA-dirigida tal como polimerasa del bacteriófago T/, T3 o la polimerasa Sp6. Utilizando influenza, el DNA es construido para codificar el sentido de mensaje de la secuencia del gen heterólogo flanqueada aguas arriba de la ATG mediante el complemento del sitio de unión de la polimerasa viral/promotor de influenza, es decir, el complemento del término 3' de un segmento genómico de la influenza. Para el rescate en partículas de virus, puede ser preferido flanquear la secuencia heteróloga de codificación con el complemento de ambos términos, el término 3' y el término 5' de un segmento genómico de la influenza. Después de transcripción con una RNA-polimerasa DNA-dirigida, el molde de RNA resultante codificará la polaridad negativa de la secuencia génica heteróloga y contendrá las secuencias terminales de vRNA que permiten que la RNA-polimerasa RNA-dirigida reconozca el molde.
Los moldes recombinantes de RNA de sentido negativo según la reivindicación 1, pueden mezclarse con complejo de polimerasa viral purificada que comprende proteínas de RNA-polimerasa RNA-dirigida (las proteínas P) y nucleoproteína (NP), virales, que pueden ser aisladas de núcleos de RNP preparados a partir de virus totales para formar "RNPs recombinantes" (rRNPs). Estas rRNPs son infecciosas y pueden ser empleadas para expresar el producto génico heterólogo en células huésped apropiadas o para rescatar el gen heterólogo en partículas de virus mediante cotransfección de células huésped con las rRNPs y virus. Alternativamente, los moldes de RNA recombinante según la reivindicación 1, pueden ser empleados para transfección de líneas celulares transformadas que expresan las proteínas de RNA-polimerasa RNA-dirigida permitiendo la complementación.
La invención se demuestra por medio de ejemplos de trabajo en los que transcritos de RNA de DNA clonado conteniendo la región de codificación - - en orientación de sentido negativo - - del gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), flanqueada por los 22 nucleótidos del término 5' y los 26 del término 3', del RNA de NS del virus A/PR/8/34 de la influenza, fueron mezclados con proteínas aisladas de polimerasa del virus A de la influenza. Este complejo de ribonucleoproteína (RNP) reconstituida se sometió a transfección en células MDCK (ó 293), que estaban infectadas con virus de la influenza. La actividad del CAT era despreciable antes y prontamente después de la infección con el virus, pero era demostrable al cabo de siete horas después de la infección con el virus. Cuando se utilizó sobrenadante de las células que contenía virus gemados procedentes de este exp erimento de "rescate" para infectar una nueva monocapa de células MDCK, se detectó asimismo actividad de CAT, lo que sugiere que el RNA que contiene el gen de CAT recombinante había sido empaquetado en partículas de virus. Estos resultados demuestran el uso con éxito de moldes de RNA viral recombinantes de influenza y RNA-polimerasa RNA-dependiente purificada para reconstituir RNP de virus de la influenza, recombinante. Además, los datos sugieren que las secuencias de 22 nucleótidos del término 5' y la de 26 del término 3' del RNA del virus de la influenza A son suficientes para proporcionar las señales para transcripción de RNA, replicación de RNA y para empaquetar RNA en partículas de virus de la influenza.
Utilizando esta metodología se demuestra también el rescate de RNAs sintéticos, derivados de DNAs plasmídicos recombinantes apropiados, en virus de la influenza estables e infecciosos. En particular, RNA correspondiente al gen de la neuraminidasa (NA) del virus A/WSN/33 (WSN) de la influenza, fue transcrito in vitro desde DNA plasmídico y, después de la adición de complejo de polimerasa de virus de la influenza purificado, fue transfectado en células MDBK. Superinfección con virus helper (cooperador) que carece del gen de NA de WSN, dio por resultado la liberación de virus que contenían el gen de NA de WSN. Los inventores introdujeron cinco mutaciones puntuales en el gen de NA de WSN mediante mutagénesis "casete" del DNA plasmídico. El análisis secuencial del virus rescatado reveló que el genoma contenía la totalidad de las cinco mutaciones presentes en el plásmido mutado. Esta tecnología puede ser utilizada para crear virus con mutaciones específicas en sitios, por lo que pueden ser construidos virus de la influenza con propiedades biológicas definidas.
La aptitud para reconstituir RNPs in vitro permite el diseño de nuevos virus de la influenza quiméricos que expresan genes extraños. Un modo de conseguir este objetivo implica la modificación de genes de virus de la influenza existentes. Por ejemplo, el gen de HA puede ser modificado para que contenga secuencias extrañas en sus dominios externos. Donde la secuencia heteróloga son epítopos o antígenos de patógenos, estos virus quiméricos pueden ser usados para inducir una respuesta inmunitaria protectora contra el agente patógeno desde el que son derivados estos determinantes. Además de modificar genes que codifican proteínas de la superficie, pueden ser alterados genes que codifican proteínas no superficiales. Se ha mostrado que los últimos genes están asociados con la mayor parte de las importantes respuestas inmunitarias celulares en el sistema de virus de la influenza (Townsend et al., 1985, Cell 42:475-482). Así, la inclusión de un determinante extraño en el gen de NP o el gen de NS de un virus de la influenza puede - después de infección - inducir una respuesta inmunitaria celular eficaz frente a este determinante. Un enfoque tal puede ser particularmente de ayuda en situaciones en las que la inmunidad protectora depende grandemente de la inducción de respuestas inmunitarias celulares (por ejemplo, malaria, etc.).
Otro enfoque que podría permitir la expresión de proteínas extrañas (o dominios de tales proteínas) por medio de virus quiméricos de la influenza, concierne la introducción en el virus de genes heterólogos completos. Preparaciones de virus de la influenza con más de ocho segmentos de RNA han sido descritos con anterioridad (Nayak, D. et al. en Genetics of Influenza Virus, P. Palese y D. W. Kingsbury, compiladores, Springer-Verlag, Viena, páginas 255-279). Por tanto, virus quiméricos de la influenza con nueve o más segmentos de RNA pueden ser viables, y puede ocurrir fácilmente el empaquetado correcto de tales virus quiméricos.
La invención puede ser divida en las siguientes etapas solamente con la finalidad de descripción: (a) construcción de moldes recombinantes de RNA; (b) expresión de productos génicos heterólogos utilizando los moldes recombinantes de RNA; y (c) rescate del gen heterólogo en partículas de virus recombinante. Para claridad de la discusión, la invención se describe en las subsecciones que figuran seguidamente utilizando influenza. Puede emplearse cualquier cepa de influenza (por ejemplo, A, B, C).
5.1 Construcción de los moldes recombinantes de RNA
Secuencias de codificación de genes heterólogos flanqueadas por el complemento del sitio de unión de la polimerasa viral de la influenza/promotor, por ejemplo, el complemento del término 3' del virus de la influenza, o los complementos de ambos términos 3' y 5' del virus de la influenza, pueden ser construidos utilizando procedimientos operatorios conocidas en la técnica. Moléculas de DNA recombinante que contienen estas secuencias híbridas pueden ser clonadas y transcritas mediante una RNA-polimerasa DNA-dirigida, tal como polimerasa del bacteriófago T7, T3 o la polimerasa Sp6, y semejantes, para producir los moldes recombinantes de RNA que poseen las secuencias virales apropiadas que permiten el reconocimiento y actividad de la polimerasa viral.
Un enfoque para la construcción de estas moléculas híbridas consiste en insertar la secuencia de codificación heteróloga en un complemento de DNA de un segmento genómico de virus de la influenza de modo que la secuencia heteróloga está flanqueada por las secuencias virales requeridas para la actividad de la polimerasa viral; es decir, el sitio de unión de la polimerasa viral/promotor, a lo que se denomina más adelante en esta memoria el sitio de unión de la polimerasa viral. En un enfoque alternativo, oligonucleótidos que codifican el sitio de unión de la polimerasa viral de la influenza, por ejemplo, el complemento del término 3' o ambos términos de los segmentos genómicos del virus, pueden ser ligados a la secuencia de codificación heteróloga para construir la molécula híbrida. La colocación de un gen extraño o segmento de un gen extraño dentro de una secuencia diana fue dictada anteriormente por la presencia de sitios apropiados de enzimas de restricción dentro de la secuencia diana. Sin embargo, avances recientes en biología molecular han aminorado en gran manera este problema. Pueden colocarse fácilmente sitios de enzimas de restricción en cualquier lugar dentro de una secuencia diana mediante el empleo de mutagénesis dirigida al sitio (por ejemplo, véanse por ejemplo, las técnicas descritas por Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488). Variaciones en la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), descrita más adelante, permiten también la inserción específica de secuencias (es decir, sitios de enzimas de restricción) y permite asimismo la construcción fácil de moléculas híbridas. Alternativamente, reacciones PCR podrían ser empleados para preparar moldes recombinantes sin necesidad de clonación. Por ejemplo, podrían emplearse reacciones PCR para preparar moléculas de DNA de doble hebra que contienen un promotor de RNA-polimerasa DNA-dirigida (por ejemplo, las bacteriofases T3, T7 ó Sp6) y la secuencia híbrida que contiene el gen heterólogo y el sitio de unión de la polimerasa viral de la influenza. Los moldes de RNA podrían ser transcritos directamente a partir de este DNA recombinante. Todavía en otra realización, los moldes recombinantes de RNA pueden ser preparados ligando RNAs que especifican la polaridad negativa del gen heterólogo y el sitio de unión de la polimerasa viral de la influenza utilizando una RNA-ligasa. Requisitos de secuencia para la actividad de polimerasa viral y las construcciones que pueden ser empleadas según la invención, se describen en las subsecciones que figuran seguidamente.
5.1.1 El termino 3' viral es requerido para la actividad de la polimerasa
Los experimentos que se describen en la Sección 6 y siguientes, más adelante, son los primeros que definen secuencias de promotor para una polimerasa de un virus de RNA de sentido negativa, y se ha encontrado que la especificidad reside en los 15 nucleótidos del término 3'. Estas secuencias de sitios de unión de polimerasa viral de la influenza, así como también secuencias de la influenza funcionalmente equivalentes, pueden ser empleadas de conformidad con la invención. Por ejemplo, pueden ser utilizadas secuencias de la influenza funcionalmente equivalentes que contengan sustituciones, inserciones, supresiones, adiciones o inversiones, que muestran actividad similar. La síntesis de RNA mediante la polimerasa viral descrita más adelante es un modelo de reconocimiento específico y alargamiento mediante la polimerasa viral de la influenza por las razones siguientes: (a) la polimerasa posee alta actividad cuando está cebada con ApG, una característica única de la polimerasa viral de la influenza; (b) tiene una actividad óptima en condiciones de temperatura e iónicas que previamente han sido puestas de manifiesto como eficaces para las RNPs virales; (c) la polimerasa es específica de secuencias virales de la influenza sobre los moldes de RNA modélicos; (d) la polimerasa es activa en la síntesis de RNA cebado con endonucleasa con casquete, que es el contraste de la polimerasa viral de la influenza; (e) el reconocimiento de RNA donante de casquete es específico de estructuras de casquete 1; y (f) segmentos de RNA genómicos son copiados específicamente.
5.1.2. Un enclave terminal no se requiere para el reconocimiento y síntesis óptimos por la polimerasa viral
Los inventores han mostrado previamente que los RNAs de segmentos virales de la influenza realizan apareamiento de bases en sus términos formando estructuras enclavadas. Esto se consiguió por dos métodos. Un reactivo de reticulación derivado de psoralén, se unió covalentemente a los términos de cada segmento en virus intactos o en RNPs procedentes de células infectadas (Hsu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8140-8144). Se apreció, mediante microscopía electrónica, que el RNA tratado era circular, en virtud de los términos reticulados. De modo semejante, se encontró que los términos de RNA en RNPs eran sensibles a la ribonucleasa V1, que reconoce y segmenta RNA de doble hebra, y se encontró que la polimerasa viral estaba unida a ambos términos en la conformación de enclave (Honda et al., 1988, J. Biochem. 104:1021-1026). En estos estudios se puso de manifiesto que existía la estructura de enclave del RNA genómico, y se dedujo que jugaba un papel en el reconocimiento por la polimerasa. Aun cuando los RNAs de moldes empleados en los ejemplos descritos estaban originalmente preparados para revelar unión de proteínas específica de enclaves, se encontró que el enclave terminal no tenía un papel obvio en las reacciones con polimerasas estudiadas en esta memoria.
5.1.3. La preparación de RNA polimerasa copia específicamente moldes de sentido negativo
Se puso de manifiesto que la polimerasa viral sintetizaba RNA con eficacia óptima si el molde tenía el término 3' de sentido negativo del "tipo salvaje". Se mostró que RNAs de secuencias no afines no eran copiados, y que aquellos con secuencias extra de poliengarce sobre el extremo 3' eran copiados mucho menos eficazmente. Un DNA de la secuencia correcta era, de modo semejante, inadecuado como molde. La reacción era muy específica dado que el molde de M-wt se replicaba solamente a niveles muy bajos. Aun cuando la fuente de polimerasa de los inventores era virus intacto, este descubrimiento era muy sorprendente dado que nunca se había sugerido que la polimerasa que reconoce el RNA del sentido viral no pudiera copiar eficazmente la hebra de sentido más. Están en marcha estudios para examinar la especificidad de la polimerasa purificada procedente de células infectadas a tiempos posteriores a la infección cuando el RNA complementario es copiado en moldes genómicos. Los datos actuales soportan un modelo mediante el que la polimerasa viral que copia RNAs es funcionalmente diferente de la que sintetiza vRNA partiendo de cRNA en virtud de su reconocimiento de promotor. Es posible que por modificación regulada de la polimerasa en células infectadas se haga posible después reconocer el término 3' de RNA del sentido más. Por análisis de mutantes de promotor los presentes inventores han investigado la especificidad fina de la reacción y han descubierto que la sola mutación única que generaba un nivel significativamente inferior de síntesis era la de RNA V-A_{3}. Además, combinaciones de dos o más cambios puntuales en las posiciones 3, 5, 8 y 10 rebajaron en gran medida los niveles de síntesis.
5.1.4. Inserción de la secuencia génica heteróloga en los segmentos génicos de PB2, PB1, PA o NP
Los segmentos génicos que codifican las proteínas PB2, PB1, PA y NP contienen un único marco de lectura abierto con 24-45 nucleótidos sin traducir en su extremo 5', y 22-57 nucleótidos sin traducir en su extremo 3'. La inserción de una secuencia génica extraña en cualquiera de estos segmentos podría conseguirse o por un reemplazo completo de la región de codificación viral con el gen extraño o mediante reemplazo parcial. El reemplazo completo podría conseguirse del mejor modo, probablemente, mediante el uso de mutagénesis PCR-dirigida. El principio de este método de mutagénesis está ilustrado en la Fig. 10. En breve, el cebador A de PCR podría contener, desde 5' a 3', un sitio únicos de enzimas de restricción, tal como un sitio de enzimas de restricción de clase IIS (es decir, una enzima "desviadora", que reconoce una secuencia específica pero que segmenta el DNA o bien aguas arriba o bien aguas abajo de tal secuencia); la región sin traducir de 3' entera del segmento del gen de la influenza; y una extensión de nucleótidos complementaria a la porción de codificación del extremo carboxilo terminal del producto génico extraño. El cebador B de PCR podría contener desde el extremo 5' a 3': un sitio únicos de enzimas de restricción; una secuencia de polimerasa de fago, truncada pero activa; el complemento de la región sin traducir de 5' entera del segmento del gen de la influenza (con respecto al vRNA de sentido negativo); y una extensión de nucleótidos que corresponde a la porción de codificación de 5' del gen extraño. Después de una reacción de PCR utilizando estos cebadores con una copia clonada del gen extraño, el producto puede ser cortado y clonado utilizando los sitios de restricción únicos. Digestión con la enzima de la clase IIS y transcripción con la polimerasa de fago purificada podría generar una molécula de RNA que contiene los extremos sin traducir exactos del segmento génico viral de la influenza con una inserción de un gen extraño. Tal construcción está descrita para el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) usado en los ejemplos descritos en la Sección 7 que figura más adelante. En una realización alternativa, reacciones primadas de PCR podrían utilizarse para preparar DNA de doble hebra que contiene la secuencia de promotor de bacteriofago, y la secuencia génica híbrida, por lo que los moldes de RNA pueden ser transcritos directamente sin clonación.
Dependiendo de la integridad del producto génico extraño y de la finalidad de la construcción, puede ser deseable construir secuencias híbridas que dirijan la expresión de proteínas de fusión. Por ejemplo, las cuatro proteínas del virus de la influenza, PB2, PB1, PA y NP, son proteínas de polimerasas que son dirigidas al núcleo de la célula infectada por medio de secuencias específicas presente en la proteína. Para la NP se ha encontrado que esta secuencia de aminoácidos era (código de una sola letra) QLVWMACNSAAFEDLRVLS (Davey et al., 1985, Cell 40:667-675). Por consiguiente, si se desea dirigir el producto génico extraño hacia el núcleo (si por sí mismo no pudiera hacerlo ordinariamente) la proteína híbrida debe ser construida de modo que contenga un dominio que la dirija allí. Este dominio podría ser de origen viral de la influenza, pero no necesariamente así. Pueden fabricarse también proteínas híbridas a partir de fuentes no virales, en tanto contengan las secuencias necesarias para la replicación por el virus de la influenza (región sin traducir de 3', etc.).
Como otro ejemplo, ciertas regiones antigénicas de los productos génicos virales pueden ser sustituidos con secuencias extrañas. Townsend et al., (1985, Cell 42:475-482),identificaron un epítopo dentro de la molécula de NP que es capaz de atraer una respuesta de CTL (célula T citotóxica) vigorosa. Este epítopo une los residuos 147-161 de la proteína de NP y consta de los aminoácidos TYQRTRQLVRLTGMDP. La sustitución de un epítopo extraño corto en lugar de esta secuencia de ND puede atraer una fuerte respuesta inmunitaria celular contra el antígeno extraño intacto. Al contrario, la expresión de un producto génico extraño que contenga esta región de 15 aminoácidos puede ayudar asimismo a inducir una respuesta inmunitaria celular fuerte frente a la proteína extraña.
5.1.5. Inserción de la secuencia génica heteróloga en los segmentos génicos de HA o NA
Las proteínas de HA y NA, codificadas por segmentos génicos separados, son las glicoproteínas superficiales principales del virus. Por consiguiente, estas proteínas son los objetivos principales para la respuesta inmunitaria humoral después de la inyección. Estas han sido las proteínas más ampliamente estudiadas de todas las proteínas virales de la influenza, ya que las estructuras tridimensionales de ambas de estas proteínas han sido desentrañadas.
La estructura tridimensional de la hemaglutinina H3 junto con información de secuencia sobre gran número de variantes ha permitido la aclaración de los lugares antigénicos sobre la molécula de HA (Webster et al., 1983, en Genetics of Influenza Virus, P. Palese y D. W. Kingsbury, compiladores, Springer-Verlag, Viena, páginas 127-160). Estos sitios caen en cuatro regiones discretas sin solapamiento sobre la superficie de la HA. Estas regiones son muy variables y también se ha puesto de manifiesto que son capaces de aceptar inserciones y supresiones. Por consiguiente, la sustitución de estos sitios dentro de la HA (por ejemplo, sitio A; aminoácidos 122-147 de la HA de A/HK/68) con una porción de una proteína extraña puede proporcionar una respuesta humoral vigorosa frente a esta proteína extraña. En un enfoque diferente, la secuencia peptídica extraña puede ser insertada en el interior del sitio antigénico sin supresión de secuencias virales. Los productos de expresión de tales construcciones pueden ser útiles en vacunas frente al antígeno extraño, y sin duda, pueden embaír un problema discutido con anterioridad, el de la propagación del virus recombinante en el huésped vacunado. Una molécula de HA intacta con una sustitución solamente en sitios antigénicos puede consentir la función de HA permitiendo así la construcción de un virus viable. Por consiguiente, este virus puede ser cultivado sin necesidad de funciones cooperadoras adicionales. Como es lógico, el virus debe ser atenuado de otros modos para evitar peligro alguno de escape accidental.
Pueden prepararse otras construcciones híbridas de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas para expresar proteínas de la superficie celular o permitirlas ser liberadas desde la célula. Como una glicoproteína superficial, la HA posee una secuencia de señal segmentable, en el extremo amino terminal, necesaria para el transporte a la superficie celular, y una secuencia del extremo amino terminal necesaria para el anclaje de la membrana. Con objeto de expresar una proteína extraña intacta sobre la superficie celular puede ser necesario utilizar estas señales de HA para crear una proteína híbrida. Alternativamente, si sólo se encuentran presentes las señales de transporte y está ausente el dominio de anclaje de la membrana, la proteína puede ser excretada de la célula.
En el caso de la proteína de NA, la estructura tridimensional es conocida pero los sitios antigénicos están esparcidos sobre la superficie de la molécula y se solapan. Esto indica que si una secuencia es insertada en el interior de la molécula de NA y es expresada sobre la superficie externa de la NA, será inmunógena. Adicionalmente, como una glicoproteína superficial, la NA exhibe dos diferencias llamativas con respecto a la proteína HA. En primer lugar, la NA no contiene una secuencia de señal segmentable; en efecto, la secuencia de señal del extremo amino terminal actúa como un dominio de anclaje de la membrana. La consecuencia de ello, y la segunda diferencia entre la NA y la HA, es que la NA está orientada con el extremo amino terminal en la membrana mientras que la HA está orientada con el extremo carboxilo terminal en la membrana. Por consiguiente, puede ser ventajoso en algunos casos construir una proteína de NA híbrida, ya que la proteína de fusión estará orientada en dirección opuesta a la de un híbrido de fusión de HA.
5.1.6. Inserciones del gen heterólogo en los segmentos génicos de NS y M
La propiedad única de los segmentos de NS y M en comparación con los otros seis fragmentos génicos del virus de la influenza, es que estos segmentos codifican al menos dos productos proteínicos. En todos los caso, una de las proteínas es codificada por un mRNA que es co-lineal con RNA genómico, mientras que la otra proteína es codificada por un mensaje de corte y empalme. Sin embargo, ya que el sitio del donante del corte y empalme tiene lugar dentro de la región de codificación para el transcrito co-lineal, las proteínas NS1 y NS2 tienen un extremo terminal amino de 10 aminoácidos idéntico mientras que las M1 y M2 tienen un extremo amino terminal de 14 aminoácidos idéntico.
Como resultado de esta estructura única, pueden ser construidos virus recombinantes de la influenza de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas para reemplazar así a un producto génico dentro del segmento al tiempo que dejar el segundo producto intacto. Por ejemplo, el reemplazo de la mayoría de la región de codificación de NS2 o M2 con un producto génico extraño (manteniendo el sitio del aceptor de corte y empalme) podría dar por resultado la expresión de una proteína NS1 ó M1 intacta y una proteína de fusión en lugar de NS2 ó M2. Alternativamente, un gen extraño puede ser insertado dentro del segmento génico de NS sin afectar ni a la expresión de NS1 ni de NS2. Aun cuando la mayor parte de los genes de NS contienen un solapamiento sustancial de los marcos de lectura de NS1 y NS2, ciertos genes de NS naturales no lo contienen. Los presentes inventores han analizado el segmento génico de NS procedente del virus A/Ty/Or/71 (Norton et al., 1987, virology 156:204-213) y encontrado que en este gen particular, la proteína NS1 termina en la posición del nucleótido 409 del segmento génico de NS, mientras que el sitio del aceptor de corte y empalme para NS2 está en la posición del nucleótido 528. Por tanto, un gen extraño podría ser colocado entre el codón de terminación de la región de codificación de NS1 y el sitio del aceptor de corte y empalme de la región de codificación de NS2 sin afectar a cualquiera de las dos proteínas. Puede ser necesario incluir un sitio del aceptor de corte y empalme en el extremo 5' de la secuencia del gen extraño para asegurar la producción de proteína (esta podría codificar una proteína híbrida que contiene el extremo amino terminal de NS1). De este modo, el virus recombinante no sería defectuoso y podría ser capaz de ser propagado sin necesidad de funciones cooperadoras.
Aun cuando el genoma del virus de la influenza consta de ocho segmentos génicos funcionales se desconoce cuantos segmentos reales empaqueta un virus. Se ha sugerido que la influenza puede empaquetar más de ocho segmentos, y posiblemente hasta 12 (Lamb y Choppin, 1983, Ann. Rev. Biochem. 52:467-506). Esto permitiría una propagación más fácil de virus recombinantes, porque el segmento génico "noveno" podría estar destinado a expresar el producto génico extraño. Aun cuando este "noveno" segmento puede ser incorporado en algunos virus, podría perderse pronto durante el desarrollo del virus a menos que se provea alguna selección. Esto puede realizarse "desacoplando" el segmento génico de NS o M. La porción de codificación de NS2 podría separarse desde el segmento génico de NS y colocarse sobre el segmento génico que codifica la proteína extraña (junto con señales de corte y empalme apropiadas). Alternativamente, podría ser construido un mRNA bicistrónico que permitiera la iniciación interna para "no cortar ni empalmar" estas secuencias virales; por ejemplo, utilizando las secuencias descritas por Pelletier et al., 1988, Nature 334:320-325.
El virus recombinante que resulta con el gen de NS o M "desacoplado" sería capaz de propagarse por sí mismo y podría también, necesariamente, tener que empaquetar el "noveno" segmento génico, asegurando de este modo la expresión del gen extraño.
5.2. Expresión de productos génicos heterólogos utilizando molde de RNA recombinante
Los moldes recombinantes preparados según se ha descrito pueden ser utilizados de diversos modos para expresar los productos génicos heterólogos en células huésped apropiadas o para crear virus quiméricos según las reivindicaciones adjuntas que expresan los productos génicos heterólogos. En una realización, el molde recombinante puede ser combinado con complejo de polimerasa viral purificado según se ha descrito en la Sección 6, que figura más adelante, para producir rRNPs que son infecciosas. Alternativamente, el molde recombinante según la reivindicación puede ser mezclado con complejo de polimerasa viral preparada empleando métodos de DNA recombinante (por ejemplo, véase Kingsbury et al., 1987, Virology, 156:396-403). Tales rRNPs, cuando se emplean para la transfección de células huésped, pueden dirigir la expresión del producto génico heterólogo en niveles altos. Los sistemas de células huésped que proporcionan altos niveles de expresión, incluyen líneas celulares continuas que suministran funciones virales tales como líneas celulares superinfectadas con influenza, líneas celulares construidas por ingeniería genética, para complementar funciones virales de la influenza, etc.
En una realización alternativa de la invención, los moldes recombinantes de las rRNPs según las reivindicaciones adjuntas pueden ser usados para transfectar líneas celulares que expresan las proteínas de polimerasas virales con objeto de conseguir la expresión del producto génico heterólogo.
A este fin, líneas celulares transformadas que expresan las tres proteínas de polimerasa tales como 3P-38 y 3P-133 (Krystal et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:2709-2713) pueden ser utilizadas como células huésped apropiadas. Similarmente pueden ser construidas por ingeniería genética células huésped para proporcionar otras funciones virales o funciones adicionales tales como NP.
5.2.1. Purificación de la polimerasa viral
Las proteínas de polimerasas virales empleadas para producir las rRNPs pueden ser purificadas partiendo de núcleos de RNP disociados, aislados de virus de la influenza total. En general, pueden prepararse núcleos de RNP utilizando métodos estándar (Plotch et al., 1981, Cell 23:847-858; Rochavansky, 1976, Virology, 73:327-328). Los núcleos de RNP reunidos pueden ser centrifugados después sobre un segundo gradiente de CsCl (1,5-3,0 M) y glicerina (30%-45%) según ha sido descrito por Honda et al., 1988, J. Biochem. 104:1021-1026. Las fracciones de polimerasas virales activas pueden ser aisladas desde la parte superior del gradiente, es decir, en la región del gradiente en correlación con CsCl 1,5 a 2,0 M y correspondiente a la fracción de Honda et al., identificada como "NP". Sorprendentemente, esta fracción contiene la totalidad de las proteínas de polimerasas virales requeridas para el complejo activo. Además, las proteínas P que pueden recuperarse desde la parte inferior del gradiente no son requeridas, y sin duda no proporcionan la transcripción de RNA viral de longitud total. De este modo, se pone de manifiesto que la denominada fracción "NP", contiene, además de NP, las formas activas de las proteínas PB2, PB1 y PA.
5.2.2 Se requieren altas concentraciones de polimerasa para la síntesis de RNA cebado con casquete
Altas concentraciones de complejo de polimerasa viral son capaces de catalizar esta transcripción cebada con endonucleasa con casquete, específica de virus. Bajo las condiciones especificadas en la Sección 6, indicada más adelante, se encontró que aproximadamente 50 ng de NP con 200 pg de las tres proteínas P reaccionaban óptimamente con 5 a 10 ng de reacción de RNA. Se ha hecho la observación de que aunque la NP encapsida selectivamente vRNA o cRNA de la influenza, in vivo, la NP puede unirse a RNA inespecíficamente in vitro (Kingsbury et al., 1987, Virology, 156:396-403; Scholtissek y Becht, 1971, J. Gen. Virol. 10:11-16). Presumiblemente, con objeto de que la polimerasa viral reconozca los RNAs de moldes virales en la reacción in vitro de los presentes inventores, ellos han de estar encapsidados por la NP. Por consiguiente, la adición de un cebador de mRNA con casquete podría competir esencialmente con el RNA del molde para la unión de la NP. Dado que no podría esperarse que el dinucleótido ApG se uniera a NP, la polimerasa de concentración baja sería capaz de emplear solamente los moldes cortos con ApG. En ayuda de esta hipótesis se encuentra la observación de que la preparación de polimerasa de concentración superior resulta inhibida mediante la adición de cantidades progresivamente mayores o bien de RNA del molde o bien de cualquier RNA inespecífico. Debe hacerse notar asimismo que la especificidad inusual para la estructura m7GpppXm cap 1, previamente mostrada con RNPs virales, fue encontrada también con las RNPs reconstituidas.
5.2.3. Moldes de RNA de longitud genómica son copiados eficazmente
RNA derivado de plásmido idéntico al segmento 8 del virus A/WSN/33, fue copiado específicamente mediante la polimerasa (utilizando el método de PCR descrito en la Fig. 10). En reacciones que utilizan RNA extraído de virus, los ocho segmentos fueron copiados, aun cuando el gen de HA fue copiado a un nivel más bajo. El fondo de estas reacciones resultó disminuido en comparación con los moldes de 30 a 53 nt, probablemente dado que los RNAs contaminantes existentes en la preparación de polimerasa eran RNAs predominantemente defectuosos de tamaño pequeño. Moldes recombinantes que codifican genes extraños transcritos en este sistema pueden ser utilizados para rescatar en una partícula de virus el gen construido.
5.3. Preparación de virus de la influenza quiméricos
Al objeto de preparar virus de la influenza quiméricos, pueden emplearse RNPs reconstituidas que contienen RNAs de virus de la influenza modificados o RNA que codifica proteínas extrañas, para transfectar células que son infectadas también con un virus de la influenza "parental". Alternativamente, las preparaciones de RNP reconstituidas pueden ser mezcladas con las RNPs de virus de la influenza parental de tipo salvaje y usadas para la transfección directa. Después de reclasificación, los nuevos virus de la influenza pueden ser aislados y sus genomas identificados mediante análisis de hibridación. En enfoques adicionales aquí descritos para la producción de virus quiméricos infecciosos según las reivindicaciones adjuntas, rRNPs pueden ser replicadas en sistemas de células huésped que expresen las proteínas de polimerasa viral de la influenza (por ejemplo, en sistemas de expresión virus/célula huésped; líneas celulares transformadas construidas para expresar las proteínas de polimerasas, etc.), por lo que son rescatados virus quiméricos infecciosos; en este caso, no es necesario utilizar virus helper (cooperadores) ya que esta función es provista por las proteínas de polimerasa viral expresadas. En un enfoque particularmente deseable, células infectadas con rRNPs construidas para los ocho segmentos del virus de la influenza pueden dar como resultado la producción de virus quiméricos infecciosos que contienen el genotipo deseado, eliminando así la necesidad de un sistema de selección.
Teóricamente, puede reemplazarse uno cualquiera de los ocho segmentos génicos o parte de uno cualquiera de los ocho segmentos, con la secuencia extraña. Sin embargo, una parte necesaria de esta ecuación es la aptitud para propagar el virus defectuoso (defectuoso debido a que un producto génico viral normal se ha perdido o está alterado). Existe un número de enfoques posibles para enredar este problema. Los presentes inventores han puesto de manifiesto que mutantes de virus de la influenza defectuosos en las proteínas PB2 y NP pueden ser cultivados hasta títulos sustancialmente superiores en líneas celulares que fueron construidas para expresar constitutivamente las proteínas de polimerasa y de NP (Krystal et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:2709-2813). Pueden ser empleadas técnicas similares para construir líneas celulares transformadas que expresen constitutivamente cualquiera de los genes de la influenza. Estas líneas celulares que se preparan para expresar la proteína viral pueden ser empleadas para complementar el defecto existente en el virus recombinante y con ello propagarle. Alternativamente, ciertos sistemas naturales de la gama de hospedantes pueden encontrarse disponibles para propagar virus recombinantes. Un ejemplo de este enfoque concierne al CR43-3 aislado de la influenza natural. Este virus crece normalmente cuando se somete a pases en células primarias de riñón de pollo (PCK) pero no crece en células de riñón canino de Madin-Darby (MDCK), un huésped natural para la influenza (Maassab y DeBorde, 1983, Virology 130:342-350). Cuando se analizó este virus se encontró que codifica una proteína NS1 causada por una supresión de 12 aminoácidos. Las células PCK contienen alguna actividad que o bien complementa la proteína NS1 defectuosa o pueden sustituir completamente a la proteína defectuosa.
Un tercer enfoque para propagar el virus de la influenza recombinante de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas, puede implicar el cultivo conjunto (co-cultivo) con virus de tipo salvaje. Esto podría hacerse tomando simplemente virus recombinantes y co-infectando células con éste y otros virus de tipo salvaje (preferiblemente una cepa de vacuna). El virus de tipo salvaje complementaría el producto génico del virus defectuoso y permitiría el crecimiento de ambos virus, el virus de tipo salvaje y el virus recombinante. Esta sería una situación análoga a la propagación de partículas del virus de la influenza que interfieren, defectuosas (Nayak et al., 1983, en Genetics of Influenza Viruses, P. Palese y D. W. Kingsbury, compiladores, Springer-Verlag, Viena, páginas 255-279). En el caso de virus que interfieren, defectuosos, pueden modificarse ciertas condiciones de tal modo que la mayoría del virus propagado sea la partícula defectuosa en vez del virus de tipo salvaje. Por tanto este enfoque puede ser útil para generar "stocks" de virus recombinante de alto título. Sin embargo, estos "stocks" contendrían necesariamente algunos virus de tipo salvaje.
Alternativamente, RNPs sintéticas pueden ser replicadas en células co-infectadas con virus recombinantes que expresan las proteínas de polimerasa del virus de la influenza. En efecto, este método puede ser utilizado para rescatar virus infecciosos recombinantes de conformidad con la invención. A este propósito, las proteínas de polimerasa de virus de la influenza pueden ser expresadas en cualquier sistema de expresión vector/célula huésped, que incluyen, pero no se limitan, a vectores de expresión virales (por ejemplo virus vacunales, adenovirus, baculovirus, etc.) o líneas celulares que expresan las proteínas de polimerasas (por ejemplo, véase Krystal et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:2709-2713). Además, la infección de células huésped con rRNPs que codifican las ocho proteínas del virus de la influenza puede dar por resultado la producción de partículas de virus quiméricos infecciosos. Este sistema podría eliminar la necesidad de un sistema de selección, puesto que todos los virus recombinantes producidos serían del genotipo deseado. En los ejemplos que figuran en esta memoria, se describe un sistema de replicación completamente sintético donde, en vez de infectar células con virus de la influenza, RNPs sintéticas son replicadas en células mediante la acción de proteínas de virus de la influenza expresadas por vectores vacunales recombinantes. De este modo los inventores presentes muestran que las únicas proteínas del virus de la influenza esenciales para la transcripción y replicación de RNP son las tres proteínas de polimerasa y la nucleoproteína.
Ha de hacerse notar que puede ser posible construir un virus de la influenza recombinante sin alterar la viabilidad del virus. Estos virus alterados podrían luego ser competentes en el crecimiento y no necesitarían funciones cooperadoras para replicarse. Por ejemplo, alteraciones en el segmento génico de la hemaglutinina y el segmento génico de NS que se han discutido antes, pueden ser empleadas para construir tales virus quiméricos viables según las reivindicaciones adjuntas.
En los ejemplos que siguen, se describe la construcción de un plásmido recombinante que, después de transcripción por polimerasa de T7, proporcionó un molde de RNA que fue reconocido y transcrito por la polimerasa del virus de la influenza in vitro. Este molde de RNA corresponde al RNA de NP de un virus de la influenza excepto que las secuencias de codificación virales son reemplazadas por las de un gen de CAT. Este molde de RNA viral recombinante de hebra negativa se mezcló luego con polimerasa de virus de la influenza purificada para reconstituir un complejo de RNP. El complejo de RNP recombinante fue transfectado en células que fueron infectadas luego con virus de la influenza, conduciendo a expresión de actividad de CAT.
Cierto número de factores indican que este sistema representa un complejo de RNP recombinante biológicamente activo que se encuentra bajo el control estricto de las señales para transcripción, replicación y empaquetamiento de RNAs de virus de la influenza. En primer lugar, el gen de CAT tiene polaridad negativa en el RNA viral recombinante utilizado para transfección de RNP. Así, el RNA que entra no puede ser traducido directamente en la célula y debe, en primer lugar, ser transcrito por la polimerasa de virus de la influenza para permitir la traducción y expresión del gen de CAT. En segundo lugar, ni RNA recombinante desnudo transfectado, solo, en la presencia de virus helper de infección, ni complejo de RNP recombinante en ausencia de virus helper de infección, tienen éxito en inducir actividad de CAT. Esto sugiere que proteínas virales de la influenza proporcionadas por la RNP entrante, así como también por el virus helper de infección, son necesarias para la amplificación del molde de RNA recombinante. Finalmente, después de transfección por RNP e infección por virus helper, emergen partículas de virus que aparentemente contienen el RNA recombinante, dado que estas partículas inducen de nuevo actividad de CAT en células recién infectadas. Estos resultados sugieren que los 26 nucleótidos del extremo 3' y los 22 nucleótidos del extremo 5', que corresponden a los nucleótidos terminales en el RNA de NS del virus de la influenza A proporcionan las señales para transcripción y replicación de polimerasa, así como para el empaquetamiento de las partículas en el RNA.
Los resultados anteriores, que definían las secuencias de actuación cis requeridas para la transcripción, replicación y empaquetamiento de RNAs de virus de la influenza, fueron ampliados mediante ejemplos de trabajo adicionales, descritos más adelante, que demuestran que pueden ser empleadas técnicas del DNA recombinante para introducir mutaciones específicas en el sitio, en los genomas de virus de la influenza infecciosos.
RNAs sintéticos, derivados por transcripción de RNA plasmídico in vitro, fueron empleados en experimentos de transfección por RNP para rescatar virus de la influenza infecciosos. Para permitir la selección de este virus, los inventores han escogido un sistema que requería la presencia en el virus rescatado de un gen de neuraminidasa parecido al WSN. Los virus que contienen este gen pueden crecer en células MDBK en ausencia de proteasa en el medio (Schulman et al., 1977, J. Virol., 24:170-176). El virus helper (cooperador) WSN-HK no crece en estas circunstancias. Claramente, existen sistemas alternativos de selección. Por ejemplo, rastreos de anticuerpos o mutantes condicionalmente letales podrían ser usados para aislar virus rescatados que contienen RNAs derivados de DNAs plasmídicos. En los experimentos con virus descritos seguidamente, fueron recuperados virus que eran semejantes a virus WSN. El gen de NA de WSN fue derivado desde DNAs plasmídico o desde RNA de viriones de WSN purificado (Fig. 17, calles 2 y 5). En el último caso, empleando RNA de viriones total para la transfección por RNP, no se sabe si otros genes eran transferidos también al virus rescatado, dado que el virus helper comparte los siete genes restantes con virus de WSN. Los virus rescatados tenían los esquemas de RNA esperados (Fig. 17) y crecían en células MDBK o MDCK hasta títulos que no podían diferenciarse de los del virus de WSN de tipo salvaje. Ha de apuntarse que no era posible el rescate de un RNA de NA conteniendo una supresión de nucleótido única en la región de 5' sin traducir. Esto ilustra de nuevo la importancia de secuencias reguladoras presentes en regiones sin traducir de RNAs de virus de la influenza. Asimismo los inventores rescataron virus utilizando RNA que fue construido para que contuviera 5 cambios de nucleótidos en una región de 39 nucleótidos de longitud (Fig. 16). Los inventores presentes verificaron la presencia de estas mutaciones en el virus mutante rescatado, por secuenciación directa del RNA (Fig. 18). Estas mutaciones no resultaron en cambio alguno de aminoácidos en la proteína de neuraminidasa y por tanto no era de esperar cambio en las propiedades biológicas del virus. Aun cuando este virus no fue estudiado extensamente, su comportamiento en las placas y sus características de crecimiento no pudieron diferenciarse de las del virus WSN de tipo salvaje. Utilizando tal tecnología, pueden introducirse mutaciones que han de cambiar las características biológicas de virus de la influenza. Estos estudios pueden ayudar a diferenciar las funciones precisas de la totalidad de las proteínas virales, incluyendo las de las proteínas no estructurales. Además, las regiones del genoma sin traducir, pueden ser estudiadas mediante mutagénesis, lo que conduciría a un mejor entendimiento de las señales reguladoras presentes en RNAs virales. Un campo adicional de gran interés concierne al desarrollo del sistema de virus de la influenza como un vector vacunal.
5.4. Formulaciones de vacunas utilizando los virus de la influenza quiméricos
Virtualmente cualquier secuencia génica heteróloga puede ser construida en los virus de la influenza quiméricos según las reivindicaciones adjuntas, para usar en vacunas. Preferiblemente, epítopos que inducen una respuesta inmunitaria protectora a cualquiera de una diversidad de patógenos o antígenos, que unen anticuerpos de neutralización, pueden ser expresados por los virus quiméricos o como parte de los mismos. Por ejemplo, secuencias génicas heterólogas que pueden construirse en los virus quiméricos según las reivindicaciones adjuntas, para usar en vacunas, incluyen, aunque no se limitan a ellos, epítopos de virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) tales como gp120; antígeno superficial del virus de la hepatitis B (HBsAg); las glicoproteínas de virus herpes (por ejemplo, gD, gE); VP1 de poliovirus; determinantes antigénicos de patógenos no virales tales como bacterias y parásitos, por citar algunos. En otra realización, pueden expresarse la totalidad o partes de genes de inmunoglobulinas. Por ejemplo, regiones variables de inmunoglobulinas anti-idiotípicas que imitan tales epítopos, pueden ser construidas en los virus quiméricos según las reivindicaciones adjuntas.
Puede formularse o bien una vacuna viral recombinante viva o una vacuna viral recombinante inactivada. Puede preferirse una vacuna viva debido a que la multiplicación en el huésped conduce a un estímulo prolongado de tipo y magnitud similares al que ocurre en infecciones naturales, y por consiguiente, confiere inmunidad sustancial, de larga duración. La producción de tales formulaciones de vacunas de virus recombinantes vivos, puede ser realizada utilizando métodos convencionales que implican propagación del virus en un cultivo celular o en el alantoides del embrión de pollo, seguida de purificación.
A este respecto, el empleo de virus de la influenza construido por ingeniería genética (vectores) con fines de vacunas pueden requerir en estas cepas la presencia de características de atenuación. Los candidatos actuales a vacunas de virus vivos para uso en el hombre son o bien adaptadas al frío, sensibles a la temperatura o sometidas a pases, con lo que deriven varios genes (seis) procedentes de virus de aves, lo que da como resultado atenuación. La introducción de mutaciones apropiadas (por ejemplo, supresiones) en los moldes empleados para transfección pueden proporcionar los nuevos virus con características de atenuación. Por ejemplo, mutaciones específicas de sentido equivocado que están asociadas con sensibilidad a la temperatura o adaptación al frío pueden ser hechas en mutaciones de supresión. Estas mutaciones serían más estables que las mutaciones puntuales asociadas con mutantes sensibles al frío o a la temperatura y las frecuencias de reversión serían extremadamente bajas.
Alternativamente, pueden construirse virus de la influenza quiméricos con características "suicidas". Tales virus pasarían a través de solamente uno o unos pocos ciclos de replicación en el huésped. Por ejemplo, la segmentación de la HA es necesaria para permitir reiniciar la replicación. Por consiguiente, cambios en el sitio de segmentación de la HA pueden producir un virus que se replica en un sistema celular apropiado pero no en el hospedante humano. Cuando se emplea como vacuna, el virus recombinante podría atravesar un ciclo único de replicación e inducir un nivel suficiente de respuesta inmunitaria pero no adelantaría en el hospedante humano ni ocasionaría enfermedad. Los virus recombinantes que carecen de uno o más de los genes esenciales de virus de la influenza no serían capaces de sufrir ciclos sucesivos de replicación. Tales virus defectuosos pueden ser producidos por co-transfección de RNPs reconstituidas que carecen de un gen o genes específicos, en líneas celulares que expresan permanentemente este gen o genes. Los virus que carecen de un gen o genes esenciales pueden replicarse en estas líneas celulares pero cuando se administran al hospedante humano no son capaces de completar un ciclo de replicación. Tales preparaciones pueden transcribir y traducir - - en este ciclo abortivo - - un número de genes suficiente para inducir una respuesta inmunitaria. Alternativamente, podrían administrarse mayores cantidades de las cepas, por lo que estas preparaciones servirían como vacunas de virus inactivados (muertos). Para vacunas inactivadas, se prefiere que el producto génico heterólogo sea expresado como un componente viral, de modo que el producto génico está asociado con el virión. La ventaja de tales preparaciones es que contienen proteínas nativas y no sufren inactivación por tratamiento con formalina u otros agentes empleados en la fabricación de vacunas de virus muertos.
En otra realización de este aspecto de la invención, pueden prepararse formulaciones de vacunas inactivadas utilizando técnicas convencionales para "matar" los virus de la influenza quiméricos según las reivindicaciones adjuntas. Las vacunas inactivadas están "muertas" en el sentido de que su infectividad ha sido destruida. Idealmente, la infectividad del virus es destruida sin afectar a su inmunogenicidad. Con objeto de preparar vacunas inactivadas, el virus quimérico puede ser hecho crecer en cultivos celulares o el alantoides del embrión de pollo, purificado por ultracentrifugación zonal, inactivado por formaldehído o \beta-propilactona, y reunido. La vacuna resultante habitualmente se inocula por vía intramuscular.
Los virus inactivados pueden ser formulados con un coadyuvante adecuado con objeto de mejorar la respuesta inmunológica. Tales coadyuvantes pueden incluir, pero no se limitan a ellos, geles minerales, por ejemplo, hidróxido de aluminio; sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas; y coadyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como BCG y Corynebacterium parvum.
Muchos métodos pueden ser utilizados para introducir las formulaciones de vacunas antes descritas. Estos métodos incluyen, aunque no se limitan a ellos, las vías oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea e intranasal. Puede ser preferible introducir la formulación de vacuna de virus de la influenza quiméricos mediante la vía natural de infección del patógeno para el que se ha destinado la vacuna. Cuando se emplea una preparación de virus quiméricos vivos, puede ser preferible introducir la formulación mediante la vía natural de infección para el virus de la influenza. Puede emplearse ventajosamente la aptitud del virus de la influenza para inducir una respuesta inmunitaria celular y secretoria vigorosa. Por ejemplo, la infección del tracto respiratorio por virus quiméricos de la influenza puede inducir una fuerte respuesta inmunitaria secretoria, por ejemplo en el sistema urogenital, con protección simultánea contra un agente particular causante de enfermedad.
6. Ejemplo: Análisis del promotor de la polimerasa del RNA viral de la influenza
En los ejemplos que se describen seguidamente, se preparó polimerasa empobrecida en RNA genómico, a partir de las fracciones superiores de la centrifugación con gradiente de CsCl-glicerina. Esta polimerasa es capaz de copiar moldes modélicos cortos derivados de la transcripción de DNA plasmídico apropiado con RNA polimerasa del bacteriófago T7, de un modo específico de la secuencia. Los términos de este RNA modélico son idénticos a los 15 nucleótidos de 3' y los 22 nucleótidos de 5' conservados en el segmento 8 procedente de todos los RNAs virales de la influenza A. Por manipulación del plásmido con objeto de preparar RNAs diferentes que sirvan de molde, los inventores presentes demostraron que el reconocimiento y la síntesis desde este RNA modélico eran específicos para el promotor en la secuencia terminal en 3' y que no requería el enclave. Además, la mutagénesis específica en el sitio identificó posiciones de nucleótidos responsables de la polimerasa viral que favorece la síntesis desde moldes de sentido genómica sobre RNA sentido complementario. También se encontraron condiciones en las que pudo observarse síntesis de RNA cebado con endonucleasa con casquete, utilizando RNAs modélicos. Además, el sistema reconstituido permitió la síntesis específica de virus a partir de RNAs de longitud genómica, derivados o bien de plásmidos o bien de RNA purificado partiendo de virus mediante extracción con fenol.
6.1. Materiales y métodos 6.1.1 Purificación de la RNA polimerasa viral
Se prepararon núcleos de RNP a partir de virus de la influenza totales utilizando métodos estándar (Plotch et al., 1981, Cell 23:847-858; Rochavansky, 1976, Virology, 73:327-338). Dos a tres miligramos de virus fueron rotos por incubación en Triton N-101 al 1,5%, lisolecitina 10 mg/ml, tris-HCl 100 mM, pH 8,0, KCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM, glicerina 5% y ditiotreitol 1,5 mM. La muestra fue fraccionada por centrifugación sobre un gradiente escalonado de 30-70% (p/v) de glicerina en presencia de tris-HCl 50 mM, pH 7,8 y NaCl 150 mM. La preparación de núcleos fue centrifugada a 45.000 rpm en un rotor SW50.1 durante 4 horas a 4ºC. Las fracciones enriquecidas en RNP fueron identificadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS de muestras de proteína a partir de cada fracción y tinción con plata. Las fracciones de los núcleos fueron sometidas luego a una segunda centrifugación con gradiente según ha sido descrito por Honda et al., 1988, J. Biochem. 104:1021-1026. Este segundo gradiente tenía escalones de 0,5 ml de CsCl 3,0 M y glicerina, 45% (p/v), 1,75 ml de CsCl 2,5 M y glicerina 40%, 1,25 ml de CsCl 2,0 M y glicerina 35%, y 1,0 ml de CsCl 1,5 M y glicerina 30%. Todos los escalones fueron tamponados con tris-HCl 50 mM, pH 7,6 y NaCl 100 M. 0,5 ml de núcleos de RNP fueron estratificados sobre la parte superior y la muestra fue centrifugada a 45.000 rpm en un rotor SW50.1 durante 25 horas a 4ºC. Las fracciones de polimerasa fueron identificadas de nuevo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS de las muestras de proteína y tinción con plata. Las fracciones con actividad de polimerasa se encontraron, por lo general, en la región del gradiente en correlación con CsCl 1,5 a 2,0 M. Estas fracciones fueron reunidas y dializadas después frente a tris-HCl 50 mM, pH 7,6, NaCl 100 mM y MgCl_{2} 10 mM, y se concentraron en 10 tubos centricón (Amicon) o se dializaron fracciones en bolsas de diálisis frente a tris-HCl 50 mM, pH 7,6, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 2 mM, y glicerina 50%.
6.1.2. Preparación de plásmidos
El diseño de plásmidos está indicado en la Figura 2. Se preparó DNA de inserción para el plásmido pV-wt utilizando un sintetizador de DNA de Applied Biosystems. La hebra "superior" era
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La hebra "inferior" fue sintetizada por extensión con cebador con 5'-CCTGCAGAAGAATGA-3' como cebador. El DNA de 95 bp se sometió a digestión con HindIII y PstI, y se purificó por extracción con fenol/cloroformo, precipitación con etanol, y paso sobre una columna de intercambio iónico previamente rellena de NACS (Bethesda Research Laboratories). Este DNA estaba ligado en el pUC-19 que había sido digerido con HindIII y PstI y usado luego para transformar la cepa DH5-\alpha de E. coli que había sido hecho competente utilizando protocolos estándar. Se extendieron bacterias sobre placas de agar que contenían X-gal e IPTG, y se descubrieron colonias azules que tenían el plásmido que contenía la inserción predicha dado que la inserción pequeña conservaba el marco de lectura lacZ y no contenía un codón de terminación. El plásmido pM-wt se preparó mediante una estrategia similar excepto que ambas hebras fueron químicamente sintetizadas teniendo la hebra superior la secuencia
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El plásmido pV-d5' (Figura 2) se preparó utilizando los oligonucleótidos
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Los DNAs fueron reasociados y ligados en el pUC-19 digerido con HindIII/PstI y se encontraron colonias blancas que contenían el plásmido correcto debido a que este inserto resultó en un cambio en el marco de lectura del gen lacZ. Los mutantes puntuales fueron aislados después de digestión de pV-d5' con BglII y PstI y ligación del plásmido linealizado con un oligonucleótido de composición mixta de una única hebra. Dado que BglII lava una extensión de 5' y PstI una extensión de 3', un único oligonucleótido era todo lo necesario para la ligación del inserto. La célula huésped era entonces capaz de reparar huecos ocasionados por la carencia de un oligonucleótido complementario. Fueron destinados oligonucleótidos a reparar el cambio en el marco de lectura en el gen lacZ por lo que fueron seleccionados por su color azul bacterias con plásmidos mutantes contenidos.
El plásmido pHgaNS, que se empleó para preparar un RNA idéntico al segmento 8 de A/WSN/33, se preparó utilizando los cebadores
7
en una reacción en cadena de la polimerasa, distante de un clon de cDNA. El producto fue clonado luego en la ventana de XbaI/EcoRI del pUC19.
6.1.3. Preparación de moldes de RNA
DNAs plasmídicos fueron digeridos con MboII u otras endonucleasas apropiadas (véase Fig. 2), y el DNA linealizado fue transcrito utilizando la RNA polimerasa del bacteriófago T7. Transcritos de RNA "run-off" fueron tratados con DNAsa 1 libre de RNAsa y luego el RNA fue purificado desde las proteínas y nucleótidos libres utilizando columnas de intercambio iónico Qiagen tip-5 (Qiagen, Inc.). Después de precipitación en etanol, los RNAs purificados fueron resuspendidos en agua y se analizó una muestra por electroforesis, siguiendo por tinción con plata del gel de poliacrilamida con objeto de cuantificar el rendimiento de RNA.
6.1.4. Reacciones con polimerasa viral de la influenza
En un volumen total de 25 \mul, aproximadamente 30 \mug de nucleoproteína y 200 pg en total de las tres proteínas de polimerasa, se mezclaron con 10 ng de RNA de molde y la solución se llevó hasta una concentración final de: Hepes 50 mM pH 7,9, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 5 mM, ditiotreitol 1 mM, NP-40 0,05%, adenilil-(3'-5')-guanosil (ApG) dinucleótido (Pharmacia) 0,4 mM, ATP 0,5 mM, GTP 0,5 mM, CTP 0,5 mM y \alpha-^{32}P-UTP aproximadamente 0.6 \muM (40 \muCi a 3000 Ci/mmol, New England Nuclear). Se realizaron las reacciones sobre hielo y después se pasaron a un baño de agua a 30ºC durante 90 minutos. Las reacciones fueron terminadas mediante la adición de 0,18 ml de acetato de sodio 0,3 M/ EDTA 10 mM enfriados con hielo y después se extrajo con fenol/cloroformo (relación en volumen 1:1). Después de la primera extracción, se añadieron como soporte 15 \mug de polyI-polyC RNA y la muestra se extrajo de nuevo con fenol/cloroformo. Las muestras fueron extraídas después con éter y precipitadas en etanol. Después de centrifugar el glóbulo de RNA se lavó dos veces con etanol de 70% y después se secó en vacío.
En reacciones realizadas utilizando la polimerasa de alta concentración, las condiciones fueron idénticas a las anteriores, excepto que se añadieron 20 ng de RNA de molde. En reacciones realizadas utilizando RNAs de longitud genómica, se duplicó la cantidad de polimerasa empleada, se usaron 50 ng de RNA de molde, y se elevó la concentración de UTP a 2,6 \muM.
El RNA se resuspendió en una mezcla colorante que contenía 78% de formamida, EDTA 10 mM, xileno cianol 0,1% y azul de bromofenol 0,05%. Típicamente, una muestra de este RNA se sometió a electroforesis sobre un gel de poliacrilamida al 8% en ausencia de urea, y el resto se desnaturalizó por calentamiento a 100ºC durante 1,5 minutos, y una parte alícuota se cargó sobre un gel de poliacrilamida al 8% que contenía urea 7,7 M. Los geles fueron fijados mediante un procedimiento de dos fases, la primera en ácido acético al 10% y luego en metanol 25%/ácido acético 8%. Los geles fueron secados sobre papel de filtro y expuestos después a película de rayos X.
Cuando RNAs diferentes se ensayaron para emplear como molde, las diferentes preparaciones de RNA fueron analizadas siempre sobre geles de poliacrilamida y teñidas con plata al objeto de utilizar cantidades iguales de cada molde. Para cuantificar la cantidad de producto, los geles fueron expuestos a película de rayos X en ausencia de pantalla de intensificación con objeto de mejorar la linealidad de las lecturas densitométricas. Las autorradiografías fueron analizadas utilizando un densitómetro de barrido FB910 (Fisher Biotech) y los picos fueron evaluados utilizando software de ordenador procedente de Fisher Biotech.
6.1.5. Análisis con nucleasas de productos de reacción
Para el análisis con ribonucleasa T1 de los dos productos de RNA principales, los productos de reacción fueron analizados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% (sin urea) y el gel no se trató con fijativo. El gel húmedo se expuso a una película de rayos X y los fragmentos apropiados del gel fueron localizados y cortados. El fragmento de gel se trituró en 0,3 ml que contenían tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, dodecilsulfato sódico al 0,1% y 1 \mug de tRNA como soporte. El RNA difundió en esta solución durante 3 horas, luego el gel fue aglomerado y el sobrenadante se hizo 0,3M en acetato de sodio. El sobrenadante se extrajo después dos veces con fenol/cloroformo y una vez con éter, y luego se precipitó en etanol. El glóbulo de RNA se volvió a suspender en 5 \mul de formamida, se desnaturalizó en agua a ebullición durante 1,5 minutos y después se diluyó mediante la adición de 0,1 ml de tris-HCl 10 mM, pH 7,5, y EDTA 1 mM. Se añadió ribonucleasa T1 (50 unidades, Boehringer Mannheim Biochemicals) y las muestras fueron incubadas durante 60 minutos a 37ºC. RNAs de V-wt y M-wt sintetizados con RNA polimerasa de T7 en presencia de \alpha-^{32}P-UTP fueron sometidos a digestión de modo similar con RNAsa T1. Los productos de reacción fueron extraídos en fenol/cloroformo y precipitados en etanol, y después fueron analizados sobre geles de poliacrilamida al 20% que contenían urea 7,7 M.
El análisis de los producto de reacción con nucleasa S1 se realizó sobre RNA transcrito terminando primeramente la reacción con polimerasa estándar mediante la adición de tampón S1 a un volumen de 0,2 ml con NaCl 0,26 M, acetato de sodio 0,05 M, pH 4,6, y sulfato de zinc 4,5 mM. La muestra se dividió en dos volúmenes de 0,1 ml y se añadieron a un tubo 100 unidades de nucleasa S1 (Sigma Chemical Company). Las muestras fueron incubadas durante 60 minutos a 37ºC. Después de la incubación, se añadieron EDTA (concentración final 10 mM) y 15 \mug de RNA poliI-poliC y la muestra se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó en etanol. Las muestras fueron sometidas luego a electroforesis en gel de poliacrilamida.
6.2. Resultados 6.2.1. Preparación de RNA polimerasa viral de la influenza y de RNA de molde
Núcleos de RNP de virus de la influenza A/Puerto Rico/8/34 fueron preparados por rotura de virus en lisolecitina y Triton N-101, seguido de centrifugación con gradiente de glicerina (Rochavansky, 1976, Virology, 73:327-338). Las fracciones que contenían núcleos fueron sometidas luego a una segunda centrifugación en un gradiente escalonado de CsCl-glicerina (Honda et al., 1988, J. Biochem., 104:1021-1026). Las fracciones que contenían la polimerasa fueron identificadas mediante electroforesis en gel de muestras, seguido de tinción con plata. La Fig. 1 muestra la preparación de polimerasa después de la centrifugación con CsCl. Se añadió albúmina de suero bovino (BSA) durante diálisis para proteger contra pérdidas de proteína. El análisis densitométrico por rastreo de la calle 4 comparado con cantidades conocidas de virus total en las calles 1 y 2, permitió estimar que las proteínas en la calle 4 consistían en 150 ng de NP y aproximadamente 1 ng en total de las tres proteínas de polimerasa. Se empleó por reacción una quinta parte de la preparación empleada para este gel.
El diseño global de los plásmidos utilizados para preparar RNAs de molde en este estudio, está indicado en la Figura 2. Se preparó la inserción entera utilizando oligonucleótidos procedentes de un sintetizador de DNA que luego fueron clonados en el poliengarce de pUC19. La inserción contenía una secuencia de promotor truncada reconocida por la RNA polimerasa del bacteriófago T7 (Studier y Dunn, 1983, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, XLVII, 999-1007) de modo que los primeros nucleótidos sintetizados fueron los 22 nucleótidos (nt) terminales de la secuencia conservada desde el extremo 5' del RNA genómico. Cuando el plásmido se cortó con la endonucleasa de restricción MboII (que corta 7 bases aguas arriba de su sitio de reconocimiento), el RNA que resultó de la transcripción con RNA polimerasa de T7 finalizó con los nucleótidos del terminal 3' de la secuencia viral de la influenza. Estaba incluido en la secuencia la extensión poli-U adyacente al extremo 5' del término conservado que se cree comprende al menos parte de la señal de poliadenilación de terminación (Robertson et al., 1981, J. Virol. 38, 157-163). La longitud total de este RNA genómico modélico era de 53 nt ya que un espaciador de 16 nt separaba las secuencias terminales conservadas. El RNA modélico que contenía ambos términos idénticos a los de vRNA se denominó V-wt. El M-wt de RNA codificaba la hebra complementaria exacta de V-wt por lo que los términos se igualan con los de RNA complementario (cRNA). Fueron construidos V-wt y M-wt para que sirvieran como modelos para vRNA y cRNA específicos del virus de la influenza, respectivamente.
6.2.2. La polimerasa viral cataliza la síntesis de una copia del molde de longitud total
En la reacción que utiliza la polimerasa viral de la influenza, molde de V-wt y cebador ApG, se obtuvo un producto que emigró conjuntamente con un RNA de 53 nt sobre geles desnaturalizados. También se vio un RNA que emigraba como un doblete, en una posición de aproximadamente 40 a 45 nucleótidos (Figura 3A, calle 2). Se pone de manifiesto más adelante que este producto más corto es RNA que había terminado en una extensión de adenosinas presente entre los nucleótidos 43-48 en el molde de sentido del virión. Además de los transcritos específicos del molde, pueden apreciarse un fondo general de bandas ligeras que corresponde a productos de RNA truncados transcritos desde RNA genómico viral no separados durante la fase de centrifugación con CsCl-glicerina. Cuando no se empleó cebador, no se apreció producto de transcripción específico (Fig. 3A, calle 3). Experimentos adicionales mostraron que mRNA de globina, que contenía una estructura terminal con casquete 1 (cap 1), era inactiva como cebador que utiliza preparaciones iniciales de polimerasa.
Cuando se terminó la reacción con la polimerasa mediante la adición de tampón en exceso favorable para digestión con nucleasa S1 y se añadió nucleasa, el producto marcado radiactivamente era resistente a la digestión (Fig. 3B, calle 2). Por contraste con estas condiciones, fue digerido muy eficazmente el RNA de una sola hebra de V-wt, sintetizado radiactivamente, con RNA polimerasa de T7 (Fig. 3B, calles 3 y 4). Estos datos de nucleasa S1 confirmarón que la hebra opuesta, sin duda, había siendo sintetizada en estas reacciones. El producto de la reacción podría ser un RNA de doble hebra, pero no podía admitirse que el producto tuviera, en efecto, una única hebra y pudiera reasociarse más tarde al RNA de molde en presencia de la alta concentración salina utilizada en la reacción con nucleasa.
Los productos de RNA fueron purificados mediante electroforesis sobre un gel al 8%, cortados, eluídos desde el gel, y luego sometidos a digestión con ribonucleasa T1. Los productos fueron analizados mediante electroforesis y comparados con los modelos generados mediante digestión con RNasa T1 de sondas testigo de M-wt y V-wt marcadas internamente. Como puede apreciarse en la Figura 3C, el RNA de longitud total (calle 1) tiene un modelo idéntico al RNA de sentido más, M-wt (calle 3), y no tiene el modelo del RNA de V-wt (calle 4). Los modelos observados eran esencialmente idénticos a lo que se ha predicho de la secuencia del RNA y se puso de manifiesto así que la polimerasa había copiado fielmente el molde de V-wt. El producto de RNA más pequeño, un doblete con la mayor parte de los moldes, también había sido digerido con RNasa T1. Su modelo era similar al del producto de RNA de longitud total (Figura 3C, calle 2) excepto que no se encontraba presente el oligonucleótido de 14 bases. En su lugar, se apreció un débil oligonucleótido de 13 bases, mapeando de este modo la terminación del RNA corto a la posición 44, un sitio donde podrían incorporarse dos uridinas. Ya que la cantidad de producto de RNA más pequeño disminuyó a concentraciones superiores de UTP y desapareció cuando se usó como marcador CTP, estas bandas mostraron ser un artefacto de bajas concentraciones de UTP en la reacción de la polimerasa.
6.2.3. Condiciones para las reacciones con polimerasa usando moldes de RNA modélicos
Se encontró que muestras de proteínas que contenían aproximadamente 30 ng de proteína de NP y aproximadamente 200 pg en total de las tres proteínas P, podían reaccionar óptimamente con 5 a 10 ng de RNA. Utilizando RNA de competidor frío, poliI-poliC, se encontró que RNA en exceso inhibía inespecíficamente la transcripción, posiblemente por medio de unión inespecífica de la proteína NP (Kingsbury et al., 1987, Virology, 156:396-403; Scholtissek y Becht, 1971, J. Gen. Virol. 10:11-16). En ausencia de competidor inespecífico, variaciones en la cantidad de molde entre 1 y 10 ng produjeron un cambio pequeño en la eficacia de la sintesis de RNA. La proteína NP y RNA estaban presentes en concentraciones molares aproximadamente iguales y éstas estaban, cada una, en aproximadamente mil veces en exceso de los moles del complejo (suponiendo que sea 1:1:1) formado por las tres proteínas P en la reacción típica.
Ya que estas RNPs reconstituidas eran capaces de usar ApG pero no mRNA de globina como cebador, los presentes inventores ensayaron estas RNPs modélicas para otras variables de la reacción de transcripción. En todas las otras vías ensayadas, las RNPs reconstituidas se comportaron en solución de modo similar a las RNPs purificadas procedentes de virus rotos con detergente. La temperatura óptima para la síntesis de RNA era 30ºC (Figura 4A, calle 2) como se ha encontrado repetidamente para la polimerasa viral (Bishop et al., 1971, J. Virol. 8:66-73; Takeuchi et al., 1987, J. Biochem. 101:837-845; Ulmanen et al., 1983, J. Virol. 45:27-35). Asimismo, las condiciones salinas más activas eran NaCl 60 mM (Figura 4B, calle 2), de nuevo consistente con las condiciones empleadas por diversos grupos (Bishop et al., 1971, J. Virol. 8:66-73; Honda et al., 1988, J. Biochem. 104:1021-1026; Shapiro y Krug, 1988, J. Virol. 62:2285-2290). La Figura 4C muestra un experimento de transcurso del tiempo. La cantidad de síntesis de RNA apareció aumentando de modo aproximadamente lineal durante los primeros 90 minutos, como se encontró para RNPs viral (Takeguchi et al., 1987, J. Biochem. 101:837-845).
6.2.4. Especificidad de la reacción de alargamiento
Diversos RNAs fueron ensayados para su adecuación como moldes para la RNA polimerasa de virus de la influenza. El clon del plásmido pV-wt se sometió a digestión con EcoRI, PstI o SmaI, y se utilizó polimerasa de T7 para transcribir RNA. Esto dio por resultado RNAs idénticos al V-wt, excepto por la adición de 5, 13 y 38 nt en el extremo 3'. En la Figura 5A se muestra una sobreexposición de una autorradiografía con objeto de demostrar que no se observaron transcritos sobre el fondo en reacciones que contenían como molde: dos de los RNAs idénticos a V-wt excepto que contenían 13 y 38 nt de secuencia extra sobre el extremo 3' (calles 1 y 2); un DNA de una sola hebra de secuencia idéntica a la de V-wt (calle 4); y un RNA de 80 nt sin relacionar generado por transcripción del poliengarce de pIBI-31 con RNA polimerasa de T3 (calle 5). Sin embargo, el molde de V-Eco, que contenía cinco nucleótidos extra sobre el extremo 3', pudo ser reconocido y fielmente transcrito, aun cuando en aproximadamente una tercera parte de la eficacia del RNA de V-wt de tipo salvaje (Figura 5B, calle 3). Es interesante notar que la iniciación sobre el RNA de V-Eco mediante la polimerasa viral de la influenza apareció teniendo lugar en la base correcta, ya que el RNA transcrito tenía el mismo tamaño que el producto procedente del molde de V-wt.
6.2.5. Análisis de la región del promotor para la RNA polimerasa viral.
La construcción original utilizada para estos estudios contenía las secuencias de ambos términos de RNA de RNAs genómicos que podían aparear bases formando de este modo un enclave. Esto se hizo ya que se había puesto de manifiesto que el vRNA en viriones y en RNPs en células infectadas tenía una configuración circular por medio del enclave de 15 a 16 nt de longitud (Honda et al., 1988, J. Biochem. 104:1021-1026; Hsu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8140-8144). Se puso de manifiesto además que la polimerasa viral se había unido a la estructura de doble hebra (Honda et al., 1988, J. Biochem. 104:1021-1026), llevando de este modo a la sugerencia de que el promotor para la síntesis de RNA era el enclave. Con objeto de ensayar si el enclave era un requisito absoluto para el reconocimiento, se utilizaron los moldes siguientes: el plásmido pV-wt se sometió a digestión con DraI antes de transcripción mediante la polimerasa de T7 (Figura 2). Esto debe dar como resultado una molécula de RNA de 32 nt que contienen solamente secuencias específicas de virus desde el extremo 5' del RNA. Cuando este RNA se usó como molde, no se obtuvo producto evidente (Figura 5B, calle 2). Por consiguiente, el término 3' de RNA de viriones era requerido para esta reacción. Este descubrimiento estaba de acuerdo con el hecho de que el sitio de iniciación en el extremo 3' de V-wt no estaba presente en V-Dra. Se produjo un segundo clon plasmídico que había suprimido las secuencias terminales de 5' pero que había mantenido intacto el término 3'. Este clon, pV-d5', cuando se sometió a digestión con MboII y se uso para transcripción por polimerasa de T7, produjo un transcrito principal de 30 nt y especies menores de 29 y 31 nt. Sorprendentemente, este molde fue reconocido y copiado mediante la polimerasa viral de la influenza. La Figura 7, calle 1, muestra que el producto de la reacción de RNA polimerasa viral con V-d5' contiene varias bandas que reflejan el RNA de entrada. Cuando los productos que se indican en la Figura 7, calle 1, fueron eluídos desde geles y sometidos a análisis con RNasa T1, se observó el modelo esperado del producto de transcripción de V-d5'. Puesto que el molde de RNA de V-d5' había sido copiado, no era necesario el enclave para la unión de la polimerasa viral ni para la síntesis.
Aunque no era necesario el término 5' para la síntesis por la polimerasa, una posibilidad diferente era que el RNA de V-wt pudiera ser un molde preferido en comparación con V-d5'. Con objeto de examinar esto, se efectuaron reacciones en la que los moldes fueron mezclados. El RNA de V-wt estaba presente en 5 ng en cada reacción. El V-d5' estaba ausente (Figura 6, calle 1) o estaba presente en una relación molar de 1/5 (Figura 6, calle 2) o una relación molar de 1/1 (Figura 6, calle 3). Las intensidades relativas de las bandas de cada RNA fueron determinadas mediante densitometría de la autorradiografía. Los valores fueron corregidos tomando en cuenta la cantidad de nucleótido radiactivo, UTP, que podía estar incorporado en cada producto, y el valor fue normalizado de modo que el nivel de síntesis en cada calle se fijó igual a uno. El nivel de copia de V-wt disminuyó a medida que aumentó V-d5'. Cuando V-d5' estaba presente en una relación quinto molar, su nivel de síntesis corregido era aproximadamente una cuarta parte de la del V-wt (Figura 6, calle 2). Cuando los dos moldes estaban presentes en cantidades equimolares, el nivel de síntesis desde V-wt era aproximadamente el 60% del total (Figura 6, calle 3) que pudiera estar dentro del intervalo esperado del error experimental para niveles de síntesis equivalentes. Se obtuvieron resultados similares cuando RNA de V-d5' se mantuvo constante y el RNA de V-wt fue variado. Por tanto se llegó a la conclusión de que el RNA de V-wt que contenía enclave no estaba favorecido grandemente sobre el RNA del molde que solamente contenía el término 3'apropiado.
6.2.6. La polimerasa viral no copia moldes de RNA que contienen términos de sentido mas
Según se ha descrito anteriormente, la RNA polimerasa de la influenza realiza tres actividades diferentes durante el transcurso de una infección. Dos de las actividades implican la transcripción de RNA del sentido genómico, y la tercera implica la copia del RNA del sentido complementario, en vRNA. Los presentes inventores construyeron un molde de RNA que contenía los términos 5' y 3' del RNA del sentido complementario, del segmento 8 (M-wt; Figura 2).
Cuando se utilizó como molde el RNA de M-wt, se observó poca síntesis (Figura 5B, calle 4). En dos experimentos empleados para cuantificación, el nivel medio de síntesis desde RNA de M-wt fue el 4% del de V-wt. Comparando los promotores de RNA de V-wt y M-wt, el M-wt tiene solamente tres cambios de transición y una inserción puntual dentro de los 15 nucleótidos de 3'. Estos incluyen un cambio de G a A en la posición 3, un cambio de U a C en la posición 5, un cambio de C a U en la posición 8 y un U insertado entre los nucleótidos noveno y décimo (véase Tabla II, a continuación). Con objeto de determinar cual de las cuatro diferencias puntuales en los términos 3' era responsable de la especificidad, se prepararon muchas combinaciones de estos y se valoraron para determinar su eficacia como molde (Figura 7). Estos moldes habían sido derivados de V-d5' dado que no contenían el término 5'. El resultado de rastreos densitométricos de varios experimentos está indicado en la Tabla II.
TABLA II
8 
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Como muestra la Tabla II, cambios puntuales únicos en V-d5' fueron igualmente bien copiados en comparación con el propio V-d5', excepto por el RNA de V-A_{3} que fue copiado con un 40% de eficacia (Figura 7, calle 10; Tabla II). Cuando fueron ensayados RNAs con dos cambios, la actividad generalmente descendió a niveles muy bajos (Figura 7, calles 3, 4, y 5). Por consiguiente, estos experimentos corfimaron que la especificidad de las reacciones para V-wt sobre M-wt era el resultado de la combinación de los cambios de nucleótidos presentes en el término 3' de M-wt.
6.2.7. Síntesis de RNA cebado con endonucleasa con casquete
El método de purificación de la polimerasa viral fue modificado con objeto de hacer disminuir la pérdida de proteína durante las diálisis. En vez de emplear el sistema de diálisis centricon-10 de Amicon, la enzima fue dializada en membranas estándar dando por resultado concentraciones superiores de las cuatro proteínas de los núcleos virales. El modelo del gel de proteína de esta preparación era idéntico al que se muestra en la figura 1, calle 4, excepto que no hay banda derivada de BSA. Se ha encontrado que 5 \mul de esta preparación, que contenían 150 ng de NP y 5 ng en total de las tres proteínas de polimerasa, reaccionaban de modo óptimo con 10 a 40 ng de molde de RNA de modelo. No obstante, el empleo de niveles superiores de proteína hizo aumentar el fondo, posiblemente debido a niveles superiores de RNAs contaminantes (RNAs viriónicos no separados mediante la centrifugación en CsCl) dando lugar a productos de la clase de tamaño en torno a 50-75 nt, lo que complica los análisis de moldes de RNA que contenían una longitud de 50 nt.
Esta preparación de polimerasa de alta concentración era ahora activa en la síntesis de RNA cebado con endonucleasa con casquete (Figura 8A, calle 4) y también en replicación independiente de cebador del RNA del molde (Figura 8A, calle 2). Cuando se usó mRNA de globina como cebador para transcripción desde el molde de V-d5' de 30 nt, resultó evidente, como producto, un triplete de bandas de tamaño aproximadamente 42 a 44 nt (figura 8A, calle 4), consistente con la segmentación de la estructura con casquete en aproximadamente 12 nt desde el extremo 5' del mRNA y el uso de este oligonucleótido para iniciar la síntesis desde el molde modélico de 30 nt. Dado que un exceso de RNA inhibe la síntesis de RNa, probablemente mediante la unión inespecífica de NP in vitro según se ha discutido antes, se encontró que la cantidad óptima de RNA donante de casquete añadido a cada reacción era 100 ng, que es muy inferior a la que habitualmente se usó con estructuras de RNP previamente configurada (por ejemplo, Bouloy et al, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:2952-3956). El cebador más activo fue el ApG (Figura 8A, calle 5 y exposición más ligera en la calle 6). El producto emigra más lentamente que el molde de entrada (Figura 8A, calle 1) o el producto en ausencia de cebador (Figura 8A, calle 2) probablemente dado que el término 5' del producto de ApG está sin fosforilar. La intensidad del producto cebado con ApG era aproximadamente diez veces mayor que la del producto cebado con casquete, pero a 0,4 mM, el ApG estaba en un exceso molar 60.000 veces mayor de la concentración de los donantes de casquete. Así, aun cuando la intensidad de la banda de producto procedente del cebado con casquete fue aproximadamente diez veces inferior a la del cebado con ApG, la reacción cebada con casquete fue aproximadamente 6000 veces más eficaz, sobre base molar. Este valor es similar al de la eficacia de aproximadamente 4000 veces en exceso observada con anterioridad para la polimerasa viral (Bouloy et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:3952-3956). Se ha indicado previamente que RNAs de donante de casquete que contienen una estructura cap 0, como en el RNA de BMV, son aproximadamente diez veces menos activos en actuación como cebador de la polimerasa viral de la influenza (Bouloy et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3952-3956). Esta inusual especificidad de casquete fue alcanzada por las RNPs reconstituidas aquí estudiadas porque el producto específico procedente desde el RNA modélico disminuyó grandemente en reacciones que contienen RNA de BMV como donante del casquete. Se observó un producto de 30 nt en las calles 2-4 debido probablemente a la replicación sin cebador del molde de modelo.
Que los RNAs producidos eran del sentido opuesto de el del V-d5' de molde de entrada, se puso de manifiesto mediante análisis con nucleasa S1 (Figura 8B). Los productos de RNA con cebador ApG (Figura 8B, calles 1 y 2) y sin cebador (Figura 8B, calles 3 y 4), eran esencialmente resistentes a la nucleasa. El producto de la reacción cebada con casquete (Figura 8B, calles 5 y 6) era parcialmente sensible a la nucleasa ya que aproximadamente 12 nt fueron digeridos desde el producto. Estos resultados eran más consistentes con el hecho de ser los 12 nt de 5' de origen del mRNA como ha sido puesto de manifiesto muchas veces para la síntesis de mRNA específico de virus de la influenza.
Se encontró que la especificidad del promotor de esta preparación de polimerasas en reacciones con ApG como cebador era esencialmente idéntica a la encontrada para la enzima de concentración inferior, como se ha indicado anteriormente. Sin embargo, los intentos realizados hasta ahora para efectuar análisis similares de especificidad del promotor con las reacciones sin cebador y con cebador con casquete, han sido frustrados por los niveles de fondo, relativamente altos, lo que hace difícil la cuantificación.
6.2.8. Replicación de moldes de RNA de longitud genómica
Un RNA de 890 nt de longitud total, idéntico a la secuencia del segmento 8 de A/WSN/33 fue preparado mediante transcripción por RNA polimerasa de T7 de DNA plasmídico, pHgaNS, que había sido sometido a digestión con la endonucleasa de restricción HgaI. Este RNA fue copiado en reacciones con cebador de ApG que contenían 10 \mul de la polimerasa de alta concentración (Figura 9, calle 8). Se demostró que el RNA era, en efecto, una copia del molde, por su resistencia a la nucleasa S1 (Figura 9, calle 9). Se observó un producto similar en ausencia de cebador (Figura 9, calles 2 y 3). La confirmación de que estos RNAs producidos eran copias de longitud total del molde se llevó a cabo mediante análisis con RNasa T1. RNA viriónico purificado partiendo de virus A/PR/8/34 extraídos con fenol, se copió similarmente en una reacción cebada con ApG (Figura 9, calles 10 y 11) y en ausencia de cebador (Figura 9, calles 4 y 5). Interesantemente, el producto procedente de la replicación del gen de HA estaba en niveles sumamente reducidos. El extremo 3' de este RNA se diferencia del segmento 8 solamente en los nucleótidos 14 y 15, lo que sugiere la importancia de estos nucleótidos en el promotor para la síntesis del RNA. Además los inventores encontraron que cuando se empleó RNA viral total en las RNPs reconstituidas, el nivel de cuentas precipitables de ácido era aproximadamente el 70% del observado con RNPs nativas. La polimerasa viral fue también capaz de copiar estos RNAs de longitud total cuando se empleó mRNA de globina en la reacción con cebador con casquete.
7. Ejemplo: Expresión y empaquetamiento de un gen extraño mediante virus de la influenza recombinante
Se describe la expresión del gen de cloranfenicol- transferasa (CAT) utilizando rRNPs. Las rRNPs fueron preparadas utilizando pIVACAT (al que primitivamente se ha hecho referencia como pCATcNS), un plásmido recombinante que contiene el gen de CAT. El plásmido pIVACAT es un plásmido pUC19 que contiene en secuencia: el promotor de T7; la secuencia de flanqueo no codificante (sentido viral) de 5' del segmento 8 de RNA del A/PR8/34 de la influenza (codifica las proteínas de NS); un sitio de clonación de BglII; la secuencia de codificación completa del gen de cloranfenicol-transferasa (CAT) en el orden invertido y complementado; la secuencia de RNA de NS no codificante (sentido viral) de 3'; y varios sitios de restricción que permiten la transcripción "run-off" del molde. El pIVACAT puede ser transcrito utilizando polimerasa de T7 para crear un RNA con secuencias de flanqueo de sentido viral de la influenza A en torno a un gen de CAT en orientación invertida.
Los experimentos in vivo descritos en las subsecciones que figuran seguidamente utilizaron la molécula de RNA recombinante descrita que contiene secuencias que corresponden a las secuencias terminales de 3' y 5' del RNA de NS del virus de la influenza A/PR/8/34 que flanquean el marco de lectura abierto orientado en dirección "antisentido" del gen de CAT. Este RNA se mezcló con complejo de polimerasa de virus de la influenza purificado y se transfectó en células MDCK (o 293). Después de infección con virus A/WSN/33 de la influenza, se midió la actividad de CAT en las células transfectadas con RNP y se indicó la amplificación del gen. Además, el gen de virus de la influenza recombinante se empaquetó en partículas de virus, dado que se demostró actividad de CAT en células después de infección con la preparación de virus recombinante.
7.1. Materiales y métodos
Con objeto de obtener las secuencias de flanqueo del RNA de NS fusionadas a la secuencia de codificación del gen de CAT, se empleó la estrategia siguiente. Se seleccionaron dos sitios de restricción interna adecuados, próximos al codón de iniciación y terminación del gen de CAT, que podrían permitir el reemplazo de las secuencias que flanquean el gen de CAT en el plásmido pCM7 con las secuencias de RNA de NS de 3' y 5'. En el extremo 5' se escogió un sitio SfaNI, (que genera un corte de 57 nt desde el ATG), y en el extremo 3', un sitio ScaI que genera un corte de 28 nt desde el extremo del gen (incluido el codón de terminación). A continuación, se prepararon cuatro oligonucleótidos sintéticos utilizando un sintetizador de DNA de Applied Biosystems, para generar dos fragmentos de DNA de doble hebra con salientes correctos para la clonación. En torno al codón de iniciación estos oligonucleótidos formaron un fragmento de DNA que contenía un saliente XbaI seguido por un sitio HgaI y un sitio PstI, la secuencia de NS (sentido-viral)-3' seguida inmediatamente por la secuencia de CAT desde el codón de iniciación hasta el saliente SfaNI (subrayado). Además se incorporó una mutación silenciosa para generar un sitio AccI más próximo al codón de iniciación para permitir futuras modificaciones.
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En torno al codón de iniciación los otros dos oligonucleótidos generaron un fragmento de DNA como sigue: un sitio ScaI de extremos romos, la secuencia de CAT desde este sitio hasta el codón de terminación, e incluyéndolo (subrayado) seguido por un sitio BglIII y un saliente Xba I.
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Empleando un único sitio EcoRI interno en la secuencia de CAT, el fragmento SfaNI/EcoRI y el EcoRI/ScaI que proceden de pCM7 fueron cortados independientemente y purificados en geles de acrilamida. El fragmento
SfaNI/EcoRI fue ligado seguidamente con el fragmento de DNA sintético obtenido por reasociación de los oligonucleótidos 1 y 2 en un plásmido pUC19 que fue cortado con XbaI y EcoRI. El fragmento EcoRI/ScaI fue clonado de modo semejante en un plásmido pUC19 digerido con XbaI y EcoRI utilizando los oligonucleótidos 3 y 4. El DNA ligado fue transformado en bacterias DH5a competentes, amplificado, aislado y rastreado mediante análisis de restricción utilizando técnicas estándar. Los recombinantes con la inserción que contenía SfaNI, fueron cortados con XbaI y EcoRI y los plásmidos con la inserción ScaI fueron cortados con EcoRI y BglII. Los fragmentos fueron purificados en gen de acrilamida y clonados juntos en el vector pPHV que había sido cortado con XbaI y BglII. Después de transformación, crecieron colonias blancas, se analizaron mediante digestión con endonucleasas y se secuenciaron los clones seleccionados. El clon final, pCATcNS2, se cultivó en grandes cantidades y se secuenció a partir de las secuencias de pUC de flanqueo hasta 300 nt en el gen de CAT, revelando la ausencia de discrepancias con la secuencia pretendida, con la excepción de una transición de G a A en el gen de CAT, que apareció silencioso.
7.1.1. Virus y células
Se cultivaron virus de la influenza A/PR/8/34 y A/WSN/33 en huevos embrionados y células MDCK, respectivamente (Ritchey et al., 1976, J. Virol. 18:736-744; Sugiura et al., 1972, J. Virol. 10:639-647). Se llevaron a cabo transfecciones de RNP en células 293 humanas (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36:59-72) y en células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) (Sugiura et al., 1972, supra).
7.1.2. Construcción de plásmidos
El plásmido pIVACAT1, derivado del pUC19, contiene la región de codificación del gen de cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT) flanqueado por las secuencias no codificantes del segmento 8 de RNA del A/PR/8/34. Esta construcción se coloca bajo el control del promotor de polimerasa de T7 de tal modo que el IVACAT1 transcrito de RNA contiene en el orden 5' a 3': 22 nucleótidos derivados del término 5' del RNA de NS de virus de la influenza, una secuencia de engarce de 8 nt que incluye un sitio de restricción BglII, el gen de CAT en polaridad negativa, y 26 nt derivados del extremo 3' del RNA de NS de virus de la influenza (Fig. 11).
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El pIVACAT1 se construyó del siguiente modo: Con objeto de obtener el extremo 5' correcto en pIVACAT1, el fragmento EcoRI-ScaI del gen de CAT derivado del plásmido pCM7 (Pharmacia) fue ligado a un fragmento de DNA formado por dos oligonucleótidos sintéticos. La secuencia de estos oligonucleótidos son:
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Para el extremo 3' de la inserción en pIVACAT1 el fragmento SfaN 1-EcoRI del gen de CAT fue ligado a un fragmento de DNA que constaba de los oligonucleótidos sintéticos:
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Fueron sintetizados oligonucleótidos en un sintetizador de DNA Applied Biosystems. Estas construcciones de 5' y 3' fueron ligadas en vectores lanzadera pUC19 digeridos con XBaI y EcoRI, cultivados, cortados con EcoRI/BG1II (Región de 5') y XbaI/EcoRI (región de 3') y ligadas en pPHV cortado con BglII/XbaI. El último plásmido es similar al pV-WT descrito en la Sección 6, supra, excepto que contiene un sitio BglII que separa las secuencias terminales no codificantes del segmento de RNA de NS de virus de la influenza A. Se cultivó el clon pIVACAT1 final (Fig. 1) se cultivo y el DNA fue secuenciado parcialmente partiendo de las secuencias de pUC de flanqueo y alcanzado al gen de CAT. No se encontraron cambios en comparación con las secuencias esperadas con la excepción de una transición silenciosa de G a A en el gen de CAT en la posición 106 con respecto a la iniciación de RNA del IVACAT1.
7.1.3. Transcripción de RNA de T7
El plásmido pIVACAT1 fue digerido con HgaI (Figura II), para permitir la transcripción "run-off". El saliente de 5 nt generado por esta enzima fue rellenado con enzima de Klenow (BRL) y el DNA fue purificado sobre una columna de espín (Boehringer). La reacción con polimerasa de T7 se llevó a cabo utilizando procedimientos estándar en presencia de Rnasin (Promega). Se separó DNA de molde desde Dnasa I libre de Rnasa (Promega). El RNA fue purificado sobre columnas tip-5 de Qiagen (Qiagen, Inc.) y cuantificado utilizando geles de poliacrilamida al 4% que fueron teñidos con plata. Se preparó RNA de NS partiendo del plásmido pHgaNS del mismo modo.
7.1.4. Purificación de polimerasa de virus de la influenza A y transcripción in vitro
El complejo de RNA polimerasa fue purificado a partir del virus de la influenza A/PR/8/34 según se ha descrito en la Sección 6, supra. Transcripciones in vitro de IVACAT1 frío o molde de RNA de HgaNS fueron llevadas a cabo utilizando las condiciones que han sido discretas en la Sección 6, supra. Los transcritos radiomarcados fueron analizados sobre geles de acrilamida al 4%.
7.1.5. Transfección con RNP de células MDCK y 293
Placas de 35 mm que contenían aproximadamente 10^{6} células fueron tratadas con 1 ml de una solución de 300 \mug/ml de DEAE-dextrina, DMSO al 0,5% en PBS/gelatina (0,1 mg/ml de gelatina) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de separar esta solución se añadieron a las células 200 \mug de \mul de PBS/gelatina que contenía 1 \mug de RNA de IVACAT1 (1-2 \mul), 20 \mul de la preparación de polimerasa purificada y 4 \mul de Rnasin y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Se siguió mediante la adición de virus de la influenza A/WSN/33 (moi 2-10) purificado por gradiente. Después de incubar durante una hora a 37ºC, se añadieron 2,5 ml de o bien medio DMEM + FCS al 10% (células 293) o medio MEM (células MDCK). En algunos experimentos células MDCK fueron infectadas primeramente y seguidamente transfectadas con RNP. Se efectuó la recogida de células en tampón NET o en medios, utilizando una varilla con extremo de caucho (células MDCK) o mediante suspensión suave (células 293). Las células fueron sometidas a centrifugación y los glóbulos fueron resuspendidos en 100 \mul de tampón Tris 0,25 M, pH 7,5. Las muestras fueron seguidamente congeladas-descongeladas tres veces y el desecho celular fue aglomerado. El sobrenadante se empleó para las valoraciones de CAT.
7.1.6. Pase de virus desde células transfectadas con RNP
Células MDCK fueron infectadas con virus helper y transfectados con RNP 2 horas después según se ha descrito antes. Después de 1 hora fueron recogidos las células y los medios y las células fueron sometidas centrifugación. 100 \mul de los medios sobrenadantes, que contenían virus, se añadieron a placas de 35 mm con células MDCK. Después de 12 horas estas células y estos medios fueron recogidos y valorados para determinar la actividad de CAT. Se empleó el virus contenido en este medio sobrenadante para ciclos de infección subsiguientes de células MDCK en placas de 35 mm.
7.1.7. Valoraciones de CAT
Se llevaron a cabo valoraciones de CAT según procedimientos operatorios estándar adaptados de Gorman et al., 1982, Mol. Cell. Biol. 2:1044-1051. Las valoraciones contenían 10 \mul de ^{14}C cloranfenicol (0,5 \muCi; 8,3 nM; NEN), 20 \mul de acetil CoA 40 mM (Boehringer) y 50 \mul de extractos de células en tampón Tris 0,25 M (pH 7,5). Los tiempos de incubación fueron 16-18 horas.
7.2. Resultados
Se prepararon moldes de rRNA partiendo de pCATcNS linealizado rellenado en los extremos y digerido con HgaI, empleando la RNA polimerasa del bacteriófago T7 según se ha descrito en la Sección 6. Los moldes de rRNA fueron combinados con el complejo de RNA polimerasa viral preparado según se ha descrito en la Sección 6.1.1, y las rRNPs resultantes se usaron para transfectar líneas celulares MDCK y 293 que fueron superinfectados con A/WSN/33 de la influenza. En cada una de las líneas celulares transfectadas con las rRNPs, se obtuvieron altos niveles de expresión de CAT 6 horas después de la infección. Además, stocks de virus obtenidos 24 horas después de la infección sintetizaron altos niveles de enzima de CAT después de pase subsiguiente en células MDCK. La RNP de CAT fue empaquetada en partículas de virus.
7.2.1. Síntesis de RNA de molde de IVACAT1
Con objeto de estudiar las señales de transcripción y replicación de RNAs de virus de la influenza A in vivo, los presentes inventores construyeron el plásmido pIVACAT1 (Figura II) que dirige la síntesis de un transcrito semejante a RNA de NS. Este RNA participa de los 22 nucleótidos del extremo 5' y los 26 nucleótidos del extremo 3' con el RNA de NS del virus A/PR/8/34 de la influenza y contienen - - en lugar de las secuencias de codificación para las proteínas de NS1 y NS2 - - las de una proteína de CAT de longitud total. Con fines de clonación contiene también ocho nucleótidos adicionales que incluyen un sitio BglII entre el codón de terminación del gen CAT y la extensión de U's en la región no codificante de 5'. El promotor de T7 adyacente a las secuencias no codificantes de 5' y el sitio HgaI aguas abajo del extremo 3' permite el dimensionamiento exacto de los extremos 5' y 3'. La transcripción "run-off" utilizando polimerasa de T7 genera un RNA de 716 nt de longitud: la Fig. 12, calles 2-4 muestran que este RNA tiene una longitud discreta y es más corto que el RNA de NS marcador de 890 nt de longitud, que se sintetizó mediante transcripción con T7 de pHgaNS (calle 1).
7.2.2. El RNA de IVACAT1 es transcrito in vitro por la RNA polimerasa del virus de la influenza A
En los ejemplos descritos en la Sección 6, se demostró que RNAs sintéticos que contenían en el extremo 3' los 15 nucleótidos terminales de 3' del segmento 8 de RNA del virus de la influenza, pueden ser transcritos in vitro utilizando RNA polimerasa del virus de la influenza A purificada. Los inventores presentes ensayaron si el RNA de IVACAT1 sin marcar podía ser transcrito de un modo similar. La Figura 12 calle 5 indica que la reacción de transcripción in vitro generaba un RNA de longitud discreta y tamaño similar al producto de la reacción de transcripción con T7, lo que sugiere la síntesis de un producto de longitud total.
7.2.3. Transfección con RNP y actividad de CAT
Ya que el RNA de CAT recombinante pudo ser transcrito in vitro, se ideó un sistema para ensayar si este RNA puede ser reconocido y replicado in vivo (Figura 13). Se mezcló RNA recombinante con la polimerasa purificada para permitir la formación de partículas semejantes a RNP virales. Para facilitar la asociación, la mezcla de RNA/polimerasa se incubó en tampón de transcripción sin nucleótidos durante 30 minutos a 30ºC antes de transfección con RNP. En algunos experimentos, esta etapa de preincubación fue omitida. Las transfecciones con RNP fueron o precedidas o seguidas de infección con virus A/WSN/33 de la influenza, ya que era de esperar que la producción de proteína de polimerasa viral fuera necesaria para la amplificación eficaz del gen. Las células empleadas fueron o bien células MDCK, que son fácilmente susceptibles a infección por el virus A/WSN/33 de la influenza, o bien células 293 humanas, que soportan la infección en un grado más lenta.
Con objeto de determinar si el RNA de IVACAT1 de sentido menos podía ser amplificado y transcrito in vivo, se efectuó un experimento en células 293. Se transfectaron células con RNP, se infectaron virus una hora más tarde y se recogieron a tiempos diversos después de la infección. La Figura 14A muestra que en los primeros tiempos después de la infección solo fueron detectados niveles de fondo de actividad de CAT (calles 5,7 y 9). No obstante, se apreciaron niveles importantes de actividad de CAT siete horas después de la infección con virus (calle 11). Un nivel similar de actividad de CAT se detectó dos horas más tarde (calle 13). Había niveles de fondo de actividad de CAT en las células transfectadas falsamente en cualquier punto de tiempo (calles 6, 8, 10, 12 y 14), y en células testigo sin infectar con virus A/WSN/33 (calles 1-4).
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No fue necesaria preincubación de complejo de RNA y polimerasa para la transfección con éxito por RNP. Como puede apreciarse en la Figura 14B, calles 2 y 3, la preincubación pudiera en realidad ocasionar una disminución de actividad de CAT, debida presumiblemente a degradación de RNA durante la preincubación. En otro experimento testigo, se omitió la infección por virus helper de células transfectadas por RNP (Figura 14B, calles 4 y 5). Ya que estas calles no muestran actividad de CAT los inventores llegaron a la conclusión de que el RNA de IVACAT1 es amplificado específicamente por el aparato proteínico suministrado por el virus helper. En un experimento testigo adicional, se transfectó RNA desnudo en células que seguidamente fueron infectadas con helper o infectadas falsamente. De nuevo, no se detectó actividad de CAT en estas muestras (Figura 14B, calle 6-9). Finalmente, células infectadas con virus que no habían sido transfectadas con RNP - CAT recombinante tampoco exhibían actividad de acetilación endógena (Figura 14B, calle 10). Aparece así que la adición de la polimerasa purificada al RNA recombinante así como también la infección de células por virus helper es importante para la expresión con éxito de la enzima CAT.
Se llevaron a cabo también experimentos utilizando células MDCK, la célula huésped de los cultivos de tejidos habituales para el virus de la influenza (Figura 14C). Cuando el complejo de RNP-CAT recombinante reconstituido fue transfectado 1 hora antes de la infección por virus, se observó pequeña actividad de CAT al cabo de 7 horas después de la infección por virus (Figura 14C, calle 1). Cuando se realizó transfección con RNP 2 horas después de la infección con virus, la expresión de CAT resultó grandemente mejorada al cabo de 7 horas después de la infección por virus (Figura 14C, calle 3). Por consiguiente, las células MDCK son también células huésped viables para estos experimentos.
7.2.4. El RNP - CAT es empaquetado en partículas de virus
Dado que el RNA de CAT recombinante puede ser replicado in vivo por medio de funciones de virus helper, los presentes inventores examinaron si los virus producidos en las células transfectadas con RNP e infectadas con virus helper contenían el gen de CAT. Se emplearon en el experimento células MDCK debido a que proporcionan títulos más elevados de virus infeccioso que las células 293. Se infectaron células MDCK con virus A/WSN/33, se transfectó RNP 2 horas después y se dejó incubar durante la noche. Al cabo de 14 horas después de la infección, se recogieron y reunieron los medios y se aglomeraron las células. El sobrenadante de virus se utilizó después para infectar nuevas monocapas de células MDCK. Se separó el inóculo al cabo de 1 hora y las células fueron recogidas al cabo de 12 horas después de la infección y valoradas para determinar la actividad de CAT. La Figura 15 revela que la preparación de virus induce un nivel de actividad de CAT (calles 2 y 3) que está significativamente por encima del testigo (calle 1). En este caso, la adición de virus helper al inóculo no incrementó la actividad de CAT (calle 4). El pase posterior de virus sobrenadante en células MDCK de nueva aportación no dio como resultado inducción medible de actividad de CAT. Esto no es sorprendente puesto que no hay presión selectiva para retener el gen de CAT en estas preparaciones virales. Los inventores excluyeron la posibilidad de que estuvieran transfiriendo el complejo original de RNA/polimerasa por pretratamiento de los inóculos con RNasa. Este tratamiento destruye las RNPs virales de virus de la influenza (Pons et al., 1969, Virology 39:250-259; Scholtissek y Becht, 1971, J. Gen. Virol., 10:11-16).
8. Rescate de virus de la influenza infecciosos utilizando RNA derivado de DNAs recombinantes específicos
Los experimentos descritos en la subsecciones que figuran seguidamente demuestran el rescate de virus de la influenza infecciosos utilizando RNA que es derivado de DNAs recombinantes específicos. RNAs correspondientes al gen de neuraminidasa (NA) de virus A/WSN/33 de la influenza (virus WSN) fueron transcritos in vitro partiendo de DNAs plasmídicos apropiados y -después de la adición de complejo de polimerasa de virus de la influenza purificada (según se ha descrito en la Sección 6.1.1 supra)- transfectados en células MDBK según se ha descrito en la Sección 7, supra). Superinfección con virus helper, que carecen del gen de NA de WSN, dio por resultado la liberación de virus que contienen el gen de NA de WSN. Así, esta tecnología permite la construcción de virus de la influenza infecciosos utilizando clones de cDNA y mutagénesis de sus genomas específica en el sitio de sus genomas. Además, esta tecnología puede permitir la construcción de virus de la influenza quiméricos que pueden ser empleados como vectores eficientes para la expresión génica en cultivos de tejidos, animales o el hombre.
Los experimentos descritos en las Secciones 6 y 7 supra, demuestran que los 15 nucleótidos del terminal 3' de RNAs de virus de la influenza de hebra negativa son suficientes para permitir transcripción in vitro utilizando proteínas de polimerasa de virus de la influenza purificadas. Además, los estudios llevados a cabo utilizando la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) génica informadora, muestran que los 22 nucleótidos del terminal 5' y los 26 nucleótidos del terminal 3' de los RNAs virales contienen todas las señales necesarias para la transcripción, replicación y empaquetamiento de RNAs de virus de la influenza. Como extensión de estos resultados se construyó un plásmido, pT3NAv, que contenía el gen de NA completo del virus A/WSN/33 de la influenza aguas abajo de un promotor de T3 truncado (Figura 16). Por tanto, la transcripción "run-off" de este plásmido, cortado en el sitio Ksp632I, proporciona un RNA que es idéntico al gen de NA genómico verdadero del virus WSN (Figura 17, calle 3). Este RNA fue incubado luego con polimerasa purificada (purificada según se ha descrito en la Sección 6.1.1) y empleado en un experimento de transfección con ribonucleoproteína (RNP) permitiendo el rescate de virus infecciosos utilizando virus helper que no contenían la NA de virus WSN. La elección de virus helper WSN-HK estuvo basada en la necesidad de un sistema de selección fuerte mediante el cual aislar el virus rescatado. Previamente, se indicó que el virus WSN-HK puede solamente formar placas en células MDBK cuando se añade proteasa al medio. Esto se encuentra en marcado contraste con el virus WSN (isogénico con el virus WSN-HK excepto el gen de neuraminidasa), que en ausencia de proteasa se replica fácilmente en células MDBK y forma placas grandes, fácilmente visibles (Schulman et al., 1977, J. Virol. 24:170-176).
8.1. Materiales y métodos 8.1.1 Virus y células
Se cultivaron virus A/WSN/33 de la influenza y virus A/WSN-HK en células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) y huevos embrionados, respectivamente (Sugiura et al., 1972, J. Virol. 10:639-647; Schulman et al., 1977, J. Virol. 24:170-176). También se cultivó en huevos embrionados virus A/PR/8/34 de la influenza. Células de riñón bovino de Madin-Darby (MDBK) fueron usadas para los experimentos de transfección y para la selección de virus rescatados (Sugiura et al., 1972, J. Virol. 10:639-647).
8.1.2. Construcción de plásmidos
Los plásmidos pT3NAv, pT3NAv mut 1 y pT3NAv mut 2, fueron construidos mediante mutagénesis dirigida por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando una copia clonada del gen de NA de WSN, que se obtuvo siguiendo procedimientos operatorios estándar (Buonagurio et al., 1986, Science 232:980-982). Para construir el pT3NAv se utilizaron los siguientes cebadores:
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Al cabo de 35 ciclos en un ciclador térmico (Coy Lab products, MI), el producto de la PCR fue digerido con EcoRI y HindIII y clonado en pUC19. El plásmido pT3NAv mut 1 fue construido de un modo similar excepto que la secuencia del cebador fue alterada (Figura 16). El plásmido pT3Nav mut 2 fue construido por mutagénesis de casete mediante la digestión de pT3NAv con PstI y NcoI y religación en presencia de los oligonucleótidos sintéticos
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Se sintetizaron oligonucleótidos en un sintetizador de DNA de Applied Biosystems. Los clones finales pT3NAv, pT3NAv mut 1 y pT3NAv mut 2, fueron cultivados y los DNAs fueron parcialmente secuenciados partiendo de las secuencias de flanqueo de pUC19 y llegando a las secuencias de codificación del gen de NA. Las mutaciones en pT3NAv mut 2 fueron confirmadas también mediante secuenciación.
8.1.3. Purificación de polimerasa del virus de la influenza A y transfección con RNP en células MDBK
El complejo de RNA polimerasa fue purificado desde el virus A/PR/8/34 de la influenza según se ha descrito en la Sección 6.1.1, supra, y se utilizó luego para transfección con RNP en células MDBK utilizando el protocolo descrito en la Sección 7, supra, excepto que se usó virus WSN-HK como virus helper en una moi de 1. Se obtuvieron RNAs usados para transfección con RNP mediante extracción con fenol de virus purificados o por transcripción (empleando polimerasa de T3) de pT3NAv, pT3NAv mut 1 y pT3NAv mut 2. Todos los plásmidos fueron sometidos a digestión con Ksp632I, rellenados en el extremo por enzima de Klenow (BRL) y luego transcritos en una reacción "runoff" según se ha descrito en la Sección 7, supra.
8.2. Resultados 8.2.1. Rescate de virus de la influenza infeccioso en células MDBK utilizando RNA derivado de DNA plasmídico recombinante
Se construyó un plásmido, pT3NAv, que contenía el gen de NA completo del virus WSN de la influenza agua abajo de un promotor de T3 truncado (Figura 16). La transcripción runoff del plásmido, cortado en el sitio Ksp632I, proporciona un RNA que posee una longitud idéntica a la del gen de NA genómico verdadero del virus WSN (Figura 17, calle 3). Este RNA se incubó después con polimerasa purificada y se empleó en un experimento de transfección de ribonucleoproteína (RNP), permitiendo el rescate de virus infeccioso utilizando virus helper. La elección del virus WSN-HK como virus helper se basó en la necesidad de un sistema de selección fuerte mediante el cual poder aislar un virus rescatado. Previamente, se había indicado que el virus WSN-HN solamente puede formar placas en células MDBK cuando se añade proteasa al medio (Schulman et al., 1977, J. Virol., 24:170-176). Esto se encuentra en marcado contraste con respecto al virus WSN (isogénico con el virus helper WSN-HK excepto por el gen de neuraminidasa), que en ausencia de proteasa se replica fácilmente en células MDBK y forma placas grandes, fácilmente visibles (Sugiura et al., 1972, J. Virol. 10:639-647). En primer lugar fueron infectadas células MDBK con el virus helper WSN-HK y transfectadas con RNP una hora después de la infección con el virus. Después de incubar durante la noche en presencia de plasminógeno, 20 \mug/ml, el sobrenadante procedente de estas células fue amplificado y plaqueado en células MDBK en ausencia de proteasa en el medio. La aparición de calvas (plaques) en células MDBK (Schulman et al., 1972, J. Virol., 10:639-647) indicó la presencia de virus que contenían el gen de NA del virus WSN, ya que el sobrenadante procedente de experimentos testigo de células infectadas solamente con el virus WSN-HK no produjo calvas (plaques). En un experimento típico que implica el uso de una placa de 35 mm para la transfección con RNP se observaron 2,5 x 10^{2} calvas (plaques).
En otro experimento testigo, se usó RNA de NA sintético que fue derivado del plásmido pT3NAv mut 1 (Figura 16). Este RNA se diferencia del RNA de NA de tipo salvaje derivado del pT3NAv mediante una supresión única de un nucleótido en la región sin traducir del extremo 5' (Figura 16). La transfección con RNP de células MDBK con este RNA y la superinfección con virus WSN-HK no dio como resultado la formación de virus rescatado. Este resultado negativo se explica con facilidad puesto que los inventores presentes han mostrado en las Secciones 6 y 7, supra, que las secuencias esenciales para el reconocimiento de RNA viral por polimerasas virales así como también las señales de empaquetamiento están situadas dentro de las secuencias de los terminales 3' y 5' de los RNAs virales. Sin embargo, no se puede excluir la posibilidad de que ocurra rescate de virus utilizando este RNA mutado, aunque a una frecuencia no detectada.
8.2.2. Análisis de RNA de virus rescatados
El virus obtenido en el experimento de rescate fue purificado en placa, amplificado en células MDBK y el RNA fue extraído de esta preparación. El RNA se analizó luego mediante electroforesis sobre un gel de poliacrilamida. La Figura 17 muestra el DNA del virus helper WSN-HK (calle 1) y el RNA de NA sintético (calle 3), que fue transcrito por polimerasa de T3 desde el plásmido pT3NAv. El esquema de emigración de los RNAs del virus rescatado (calle 2) es idéntico al del virus WSN testigo (calle 4). Asimismo, los RNAs de NA en las calles 2 y 4 emigran en la misma posición que el RNA de NA derivado de cDNA (calle 3) y más rápidamente que la banda de NA del virus HK en el virus helper WSN-HK (calle 1). Estos experimentos apoyan la conclusión de que, como resultado de la transfección con RNP, se formó virus infeccioso que contenía RNA de NA del virus WSN derivado de cDNA.
8.2.3. Rescate de virus de la influenza infeccioso usando RNA viriónico
En otro experimento de transfección, se empleó RNA extraído de virus WSN purificado. Cuando este RNA desnudo es transfectado junto con las proteínas de polimerasa en células infectadas con virus helper, se observa rescate de virus WSN capaces de replicación en células MDBK. RNA aislado de una calva (plaque) amplificada en este experimento es analizado en la calle 5 de la Figura 17 y muestra un esquema que no puede diferenciarse del testigo de virus WSN en la calle 4.
8.2.4. Introducción de mutaciones específicas en el sitio en el genoma viral
Los experimentos descritos hasta ahora implicaban el rescate de virus WSN de la influenza. Puesto que el RNA sintético empleado en estos experimentos es idéntico al gen de NA de WSN auténtico, la posibilidad improbable de contaminación mediante virus WSN de tipo salvaje no podría, con rigor, ser desechada. Por consiguiente, los presentes inventores introdujeron cinco mutaciones puntuales silenciosas en la región de codificación del gen de NA en el plásmido pT3NAv. Estas mutaciones fueron introducidas mediante mutagénesis de casete mediante reemplazo del fragmento corto de NcoI/PstI presente en el gen de NA. Las cinco mutaciones en el cDNA incluían un cambio de C a T en la posición 901 y un cambio de C a A en la posición 925, creando un nuevo sitio XbaI y destruyendo el sitio PstI original, respectivamente. Además, el codón de serina entero en la posición 887-889 del clon de cDNA fue reemplazado con un triplete de serina alternativo (Figura 17). La transfección con RMP de este RNA mutagenizado (pT3NAv mut 2) e infección con virus helper de células MDBK dio por resultado de nuevo el rescate de un virus semejante al WSN que creció en células MDBK en ausencia de proteasa añadida. Cuando el RNA de este virus fue examinado mediante análisis de la secuencia, las cinco mutaciones puntuales presentes en el DNA plasmídico (Figura 16) fueron observados en el RNA viral (Figura 18). Dado que es sumamente improbable que estas mutaciones se desarrollaran en el virus WSN de la influenza de tipo salvaje, los inventores llegaron a la conclusión de que se había conseguido el rescate con éxito de virus de la influenza infeccioso que contenía cinco mutaciones específicas en el sitio mediante transfección con RNP de RNA construido.
9. Ejemplo: Sistema de replicación sintético
En los experimentos que se describen a continuación, se empleó un clon de cDNA que puede producir una molécula de vRNA similar al de virus de la influenza que codifica un gen informador. Este RNA resultante es un vRNA similar a NS que contiene el antisentido de la región de codificación del gen de cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT) en lugar de las regiones de codificación antisentido para las proteínas estructurales, NS1 y NS2 (Lutjyes et al., 1989, Cell, 59:1107-1113). Este RNA recombinante (IVACAT-1) se incubó con proteínas de RNP de virus de la influenza purificadas y se usó en un intento de desarrollar un sistema de replicación dependiente de virus no de la influenza. Células C127 de fibroblastos de ratón fueron infectadas con mezclas de virus vacunales recombinantes (Smith et al., 1987, Virology, 160:336-345) y transfectadas una hora más tarde con la RNP de IVACAT-1. Se utilizaron mezclas de vectores que expresan las tres polimerasas (PB2, PB1 y PA) y la nucleoproteína. La replicación y transcripción de la RNP sintética se valoró analizando células para determinar actividad de CAT después de incubación durante la noche. La Figura 19 examina la actividad de CAT presente en células infectadas inicialmente con muchas de las mezclas posibles de los 4 virus vacunales recombinantes. La Figura 19, calle 4 es un testigo positivo en el que el virus A/WSN/33 de la influenza se utilizó en lugar de los virus vacunales recombinantes. Se encuentra presente actividad de CAT en esta muestra así como también en células infectadas con los cuatro vectores de vacuna (Figura 19, calles 8 y 10). Células que expresan cualquiera de los subconjuntos de estas cuatro proteínas no produjeron proteína de CAT detectable (Figura 19, calles 5-7, 9, 11, sin publicar). Además, el RNA transfectado, sin incubar con la polimerasa purificada, fue también negativo para expresión de CAT (Lutjyes et al., 1989). Así pues, la presencia de las proteínas PB2, PB1, PA y NP son todo lo que es necesario y suficiente para la expresión de RNP y replicación en este sistema. Los niveles de actividad de CAT obtenidos en células infectadas con vectores de vacuna son reproduciblemente mayores que en células infectadas con virus de la influenza como virus helper. La explicación más probable de esto es que en células infectadas con virus de la influenza, la RNP-CAT compite con las RNP virales endógenas por la polimerasa activa mientras que en el sistema estimulado por la vacuna la RNP-CAT es la única molécula similar a viral presente.
Cierto número de otras líneas celulares fueron ensayadas después como huéspedes para este sistema estimulado por virus de la vacuna. La Figura 20A muestra los resultados al emplear células MDBK, Hela, 293 y L. En todos los casos no se observó actividad de CAT cuando se infectaron células con vectores que expresan solamente las 3 proteínas de polimerasa, pero se obtuvo actividad de CAT importante si se había añadido también el vector de vacuna adicional que induce la expresión de NP.
Con anterioridad, se construyó una línea celular (designada 3PNP-4) que expresa constitutivamente niveles bajos de las proteínas PB2, PB1 y PA y altos niveles de la proteína NP. Estas células pueden complementar el crecimiento de sus mutantes que mapean a los segmentos génicos de PB2 o NP (Krystal et al., 1986; Li et al., 1989). Puesto que la replicación por medio de vectores de virus vacunales recombinantes depende solamente de estas proteínas, era concebible que esta línea celular pudiera ser capaz de amplificar y expresar la RNP-CAT sintética en ausencia de cualquier infección por virus. No obstante, cuando se intentó este experimento, no se obtuvo actividad de CAT detectable (no se indican los datos). Con objeto de investigar las razones de porqué esta línea celular no soportó replicación, mezclas de virus vacunales recombinantes fueron empleadas para infectar células 3PNP-4. Como era de esperar, la adición de las cuatro proteínas de polimerasa sostuvieron la expresión de CAT (F1gura 20 B, calle 2). La Figura 20B, calle 3, muestra que la mezcla mínima de vectores necesaria para inducir actividad de CAT en células 3PNP-4 es aquella que expresa solamente las proteínas PB1 y PA. Por tanto, los niveles de estado estacionario de las proteínas PB2 y NP en células 3PNP-4 son suficientes, pero los niveles de PB1 y PA están por debajo del umbral para la expresión de CAT en ausencia de virus cooperadores (helper). Esto se correlaciona con el fenotipo de complementación manifestado por estas células, ya que solamente puede ser recuperado a temperatura no permisiva el crecimiento de mutantes de PB2 y NP y no de mutantes de PB1 y PA (Desselberger et al., 1980).
Puesto que el RNA de IVACAT-1 sintético tiene polaridad negativa, la CAT solamente puede ser sintetizada mediante la transcripción de la molécula de RNP. Teóricamente, pueden producirse niveles detectables de CAT o bien mediante transcripción de la RNP de entrada transfectada (equivalente a transcripción primaria), o bien, en primer lugar, mediante la amplificación de RNP y transcripción subsiguiente (que necesita replicación de RNP) o una combinación de ambas. Sin embargo, el trabajo preliminar utilizando infección por virus de la influenza para estimular la expresión de la proteína de CAT mostró que una expresión detectable tenía lugar solamente si la RNP-CAT de entrada se había replicado (Lutjyes et al., 1989). Esto se puso de manifiesto mediante el uso de un segundo RNA-CAT,
IVACAT-2, que contiene 3 mutaciones dentro de las 12 bases en el extremo 5' del RNA viral (Lutjyes et al.,1989). Esta región de 12 bases se conserva entre los ocho segmentos génicos en todos los virus de la influenza A (Desselberger et al., 1980). Esta RNP de IVACAT-2 sintética es competente para la transcripción por la polimerasa del virus de la influenza pero no se replica y cuando es transfectada en células infectadas por virus de la influenza permaneciera sin detectar actividad de CAT (Lutyjes et al., 1989). Por tanto, la transcripción primaria del RNA de entrada no produce niveles detectables de proteína en células infectadas con virus de la influenza. Por consiguiente, los presentes inventores usaron este RNA mutante para examinar si las proteínas de la influenza expresadas por vectores de vacuna inducen actividad de CAT solamente a través de transcripción primaria de RNP de entrada o puede permitir amplificación mediante replicación y transcripción subsiguiente. Se infectaron células C127 con los virus vacunales recombinantes y luego fueron transfectadas con RNPs generadas o bien con IVACAT-1 o IVACAT-2. La Figura 20C muestra que pueden ser detectados niveles bajos de actividad de CAT, en células transfectadas con RNP de IVACAT-2 (calle 2). Cuando se cuantificó, 0,5-1% del cloranfenicol se había convertido en una forma acetilada, en comparación con 0,2-0,4% en las calles correspondientes a transfecciones simuladas (no indicado). Sin embargo, niveles de actividad mucho mayores están presentes en células transfectadas con RNP de CAT-1 (calle 1; rutinariamente, 15-50% de conversión de cloranfenicol), lo que indica que ocurre amplificación en estas células. Por consiguiente, este sistema de estimulación por virus vacunales recombinantes es específico de la secuencia y las RNP están sufriendo replicación.
En los experimentos descritos, ni la proteína NS1 ni la proteína NS2 fueron requeridas para la replicación de RNP. Aun cuando su función no es conocida se ha considerado que estas proteínas pueden jugar un papel principal en la replicación, debido a que ambas proteínas son sintetizadas en cantidades grandes y se encuentran presentes en el núcleo (Krug et al., 1989; Young et al., 1983, Greenspan et al., 1985; Lamb et al., 1984). Basado en los datos presentados, estas proteínas no se requieren en absoluto para la replicación genómica. Puede considerarse que estas proteínas pueden realmente tener papeles auxiliares con respecto a la replicación de RNP, tal como interacción con factores del hospedante, regulación de la expresión de genes virales o alguna función implicada con el empaquetamiento de la RNP en viriones infecciosos. No obstante, no puede establecerse que una función de estas proteínas de NS pueda estar complementada por una proteína de un virus vacunal aunque, por inspección, no se encontraron semejanzas evidentes entre las proteínas de NS1 ó NS2 y proteínas conocidas de virus vacunales. Las propiedades en contraste de estos dos virus argumentan también contra una proteína de virus vacunal de cumplimentación, ya que la vacuna es un virus de DNA de doble hebra largo que se replica exclusivamente en el citoplasma mientras que el virus de la influenza es un virus de RNA sentido, negativo, que se replica exclusivamente en el núcleo. Además, la replicación de las RNPs sintéticas ocurrió incluso en la presencia de citosina-arabinósido (ara-C, datos no indicados), un inhibidor de expresión génica remota en virus vacunales (Oda et al., 1967; Kaverin et al., 1975; Cooper et al., 1979).
Este esquema dependiente de vectores vacunales recombinantes posee cierto número de ventajas sobre el uso de infección con virus de la influenza para estimular la replicación de RNA sintético. Por ello, ya que la expresión de las proteínas virales es completamente artificial permitirá una disección precisa de los procesos implicados en la replicación. La replicación lleva consigo primeramente la síntesis de molde sentido, positivo, a partir del RNA genómico sentido, negativo. Este cRNA sentido, positivo, es copiado luego con objeto de amplificar la RNP genómica sentido, que después se usa para expresión de proteínas y empaquetamiento (Krug et al., 1989). El sistema aquí descrito demuestra que solamente las proteínas PB2, PB1, PA y NP virales de la influenza son necesarias para la detección de proteínas expresadas y para la replicación de RNP. Otra ventaja de este esquema de replicación estimulado por vectores vacunales es que ya que las proteínas de polimerasa de la influenza son expresadas desde cDNA integrado en los virus vacunales, la mutagénesis de las proteínas de polimerasa llega a ser un método factible y potente para analizar adicionalmente las relaciones estructura-función de las proteínas de polimerasas virales. Asimismo, los inventores presentes están intentando actualmente rescatar virus de la influenza infecciosos mediante la transfección de mezclas de RNPs virales reconstituidas. Esta técnica, si tuviera éxito, permitiría la construcción fácil de virus recombinantes definidos mediante la adición de RNPs definidas, tanto naturales como derivadas por síntesis.
10. Depósito de microorganismos
Una línea celular de E. coli que contiene el plásmido pIVACAT se ha depositado en la Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, IL; y tiene el número de catálogo siguiente:
Cepa Plásmido Número de catálogo
E. coli (DH5a) pIVACAT NRRL B-18540

Claims (40)

1. Una molécula de RNA recombinante que comprende un sitio de unión contenido en la secuencia de flanqueo no codificante de 3' de un segmento de vRNA del genoma de la influenza, específico para una RNA-polimerasa RNA-dirigida de un virus de la influenza, ligado operativamente a una secuencia de RNA heteróloga que comprende el complemento inverso de una secuencia codificante de mRNA.
2. La molécula de RNA recombinante según la reivindicación 1, en la que el sitio de unión de la polimerasa comprende los 15 nucleótidos terminales del término 3' de un segmento genómico de la influenza.
3. La molécula de RNA recombinante según la reivindicación 1, en la que la secuencia de flanqueo del sentido viral no codificante, de 3', de la influenza, comprende la secuencia siguiente:
5'-CACCCUGCUUUUGCU-3'
4. La molécula de RNA recombinante según la reivindicación 1, en la que la secuencia de flanqueo del sentido viral no codificante, de 3', de la influenza, comprende la secuencia siguiente:
5'-CACCCUGCUUCUGCU-3'
5. La molécula de RNA recombinante según la reivindicación 1, en la que la secuencia de flanqueo del sentido viral no codificante, de 3', de la influenza, comprende la secuencia siguiente:
5'-CACCCUGUUUUUGCU-3'
6. La molécula de RNA recombinante según la reivindicación 1, en la que la secuencia de flanqueo del sentido viral no codificante, de 3', de la influenza, comprende la secuencia siguiente:
5'-CACCCUUGCUUUUGCU-3'
7. Una molécula de RNA recombinante que comprende una secuencia de RNA heteróloga que comprende el complemento inverso de una secuencia codificante de mRNA, ligada operativamente a una secuencia de flanqueo no codificante, de 3' de un vRNA de la influenza que contiene el sitio de unión de la polimerasa viral, y a una secuencia de flanqueo no codificante, de 5', de un vRNA de la influenza.
8. La molécula de RNA recombinante según la reivindicación 7, en la que la secuencia de flanqueo no codificante de 5' de un vRNA de la influenza comprende los primeros 22 nucleótidos del término 5' de un segmento genómico de la influenza.
9. La molécula de RNA recombinante según la reivindicación 7, en la que la secuencia de flanqueo no codificante de 5', de un vRNA de la influenza comprende la secuencia siguiente:
5'-AGUAGAAACAAGGGUGUUUUUU-3'
10. Una RNP recombinante que comprende la molécula de RNA recombinante según la reivindicación 1, mezclada con polimerasa viral de la influenza purificada.
11. La RNP recombinante según la reivindicación 10, en la que la polimerasa viral de la influenza se obtiene a partir de RNPs fraccionadas mediante centrifugación en un gradiente de CsCl, en el que la polimerasa viral de la influenza purificada es aislada desde la región del gradiente que se correlaciona con CsCl 1,5 a 2,0 M.
12. Un virus quimérico que comprende virus de la influenza que contiene una secuencia de RNA heteróloga que comprende el complemento inverso de una secuencia codificante de mRNA, ligada operativamente a un sitio de unión de la polimerasa viral de la influenza.
13. El virus quimérico según la reivindicación 12, en el que la secuencia de RNA heteróloga está contenida dentro del segmento 1 de la influenza.
14. El virus quimérico según la reivindicación 12, en el que la secuencia de RNA heteróloga está contenida dentro del segmento 2 de la influenza.
15. El virus quimérico según la reivindicación 12, en el que la secuencia de RNA heteróloga está contenida dentro del segmento 3 de la influenza.
16. El virus quimérico según la reivindicación 12, en el que la secuencia de RNA heteróloga está contenida dentro del segmento 4 de la influenza.
\newpage
17. El virus quimérico según la reivindicación 12, en el que la secuencia de RNA heteróloga está contenida dentro del segmento 5 de la influenza.
18. El virus quimérico según la reivindicación 12, en el que la secuencia de RNA heteróloga está contenida dentro del segmento 6 de la influenza.
19. El virus quimérico según la reivindicación 12, en el que la secuencia de RNA heteróloga está contenida dentro del segmento 7 de la influenza.
20. El virus quimérico según la reivindicación 12, en el que la secuencia de RNA heteróloga está contenida dentro del segmento 8 de la influenza.
21. Un virus quimérico que comprende virus de la influenza que contiene, además de sus ocho segmentos genómicos, un segmento de RNA adicional que contiene una secuencia de RNA heteróloga que comprende el complemento inverso de una secuencia codificante de mRNA, ligada operativamente a un sitio de unión de la polimerasa viral de la influenza.
22. La molécula de RNA recombinante según las reivindicaciones 1 o 7, en la que la secuencia de RNA heteróloga comprende el complemento inverso de un mRNA bicistrónico que contiene una secuencia interna que interviene en la iniciación interna.
23. La RNP recombinante según la reivindicación 10, en la que la secuencia de RNA heteróloga comprende el complemento inverso de un mRNA bicistrónico que contiene una secuencia interna que interviene en la iniciación interna.
24. El virus quimérico según las reivindicaciones 12 ó 21, en el que la secuencia de RNA heteróloga comprende el complemento inverso de un mRNA bicistrónico que contiene una secuencia interna que interviene en la iniciación interna.
25. Una molécula de DNA recombinante que codifica la molécula de RNA recombinante según la reivindicación 1, ligada operativamente a un elemento de control de la transcripción que une una RNA-polimerasa DNA-dirigida.
26. Una molécula de DNA recombinante que codifica la molécula de RNA recombinante según la reivindicación 7, ligada operativamente a un elemento de control de la transcripción que une una RNA-polimerasa DNA-dirigida.
27. Una molécula de DNA recombinante que codifica la molécula de RNA recombinante según la reivindicación 22, ligada operativamente a un elemento de control de la transcripción que une una RNA-polimerasa DNA-dirigida.
28. Un método de expresión génica, que comprende cultivar una célula huésped transfectada con la RNP recombinante según la reivindicación 10, de modo que el gen heterólogo es expresado en el cultivo.
29. Un método de expresión génica, que comprende cultivar una célula huésped transfectada con la RNP recombinante según la reivindicación 11, de modo que el gen heterólogo es expresado en el cultivo.
30. Un método de expresión génica, que comprende cultivar una célula huésped transfectada con la RNP recombinante según la reivindicación 23, de modo que el gen heterólogo es expresado en el cultivo.
31. Un método para producir un virus de la influenza, que comprende cultivar una célula huésped transfectada con la RNP recombinante según la reivindicación 10 e infectada con una cepa parental del virus de la influenza y recuperar el virus de la influenza quimérico desde el cultivo.
32. Un método para producir un virus de la influenza quimérico, que comprende cultivar una célula huésped transfectada con la RNP recombinante según la reivindicación 23 e infectada con una cepa parental de la influenza, y recuperar desde el cultivo el virus de la influenza quimérico.
33. Una molécula de DNA recombinante, ligada operativamente a un elemento de control de la transcripción que une una RNA-polimerasa DNA-dirigida, que codifica una molécula de RNA recombinante que comprende un sitio de unión para una RNA-polimerasa RNA-dirigido de un virus de la influenza, ligado operativamente a una secuencia de RNA que comprende el complemento inverso de un mRNA de un gen modificado del virus de la influenza.
34. Un método para producir un virus de la influenza recombinante, que comprende:
(a) cultivar una célula huésped transfectada con una RNP recombinante que comprende la molécula de RNA recombinante codificada por la molécula de DNA recombinante según la reivindicación 33, mezclada con RNA-polimerasa RNA-dirigida de virus de la influenza, purificada, e infectada con una cepa parental de un virus de la influenza; y
(b) recuperar desde el cultivo el virus de la influenza recombinante.
35. El método de la reivindicación 34, en el que el virus de la influenza recombinante producido es un virus de la influenza atenuado.
36. Un virus de la influenza quimérico, que contiene una secuencia de RNA heteróloga que comprende el complemento inverso de una secuencia codificante de mRNA unida operativamente a un sitio de unión de la polimerasa del virus de la influenza.
37. El virus de la influenza quimérico, según la reivindicación 36, en el que la secuencia codificante de mRNA es una secuencia codificante del epítopo de la inmunodeficiencia humana (HIV).
38. El virus de la influenza quimérico, según la reivindicación 37, en el que la secuencia codificante del epítopo de la inmunodeficiencia humana (HIV) es una secuencia codificante del epítopo gp120.
39. El virus de la influenza quimérico, según la reivindicación 36, en el que la secuencia codificante de mRNA es una secuencia codificante del epítopo del antígeno superficial del virus de la hepatitis B (HBsAg), una secuencia codificante del epítopo de glicoproteína del herpes, una secuencia codificante del epítopo del poliovirus VP1, una secuencia codificante de epítopos de determinantes antigénicos bacterianos, o una secuencia codificante de epítopos de determinantes antigénicos de parásitos.
40. El virus de la influenza quimérico, según la reivindicación 39, en el que la secuencia codificante del epítopo de glicoproteína del herpes es una secuencia codificante del epítopo de la glicoproteína gD ó gE del herpes.
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