DE69838584T2

DE69838584T2 - Enhancer des menschlichen glandulären kallikreingens, vektoren die ihn enthalten und methoden für seine verwendung

Info

Publication number: DE69838584T2
Application number: DE69838584T
Authority: DE
Inventors: De-Chao Foster City YU; Daniel R. Palo Alto HENDERSON; Eric R. Palo Alto SCHUUR
Original assignee: Cell Genesys Inc
Current assignee: Cell Genesys Inc
Priority date: 1997-08-04
Filing date: 1998-08-04
Publication date: 2008-06-26
Anticipated expiration: 2018-08-05
Also published as: AU8692598A; EP1002103A1; DE69838584D1; ATE376062T1; WO1999006576A1; US6916918B2; EP1002103B1; US20020136707A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft neue transkriptionale Regulationselemente (Enhancer), welche vorzugsweise die Transkription von cis-verknüpften Transkriptionseinheiten in Prostatazellen erhöhen. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zum Verwenden von DNA-Konstrukten, die die Enhancer umfassen, um Transkription heterologer Polynucleotide zu kontrollieren. Die Erfindung betrifft ferner Zelltransfektion unter Verwendung adenoviraler Vektoren. Spezifischer betrifft sie Zell-spezifische Replikation von Adenvirus-Vektoren in Zellen, die einen Androgen-Rezeptor exprimieren, insbesondere Prostatakarzinom-Zellen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Prostatakrebs ist das am schnellsten wachsende Neoplasma bei Männern mit geschätzten 244.000 neuen Fällen in den Vereinigten Staaten, die 1995 diagnostiziert werden, und von welchen ungefähr 44.000 Todesfälle resultieren werden. Prostatakrebs ist nun der am häufigsten diagnostizierte Krebs bei Männern. Prostatakrebs ist latent; viele Männer tragen Prostatakrebs-Zellen ohne offene Zeichen der Krankheit. Er ist mit einer hohen Morbidität assoziiert. Krebs-Metastase zum Knochen (späte Stufe) ist häufig und ist nahezu immer fatal.
Gegenwärtige Behandlungen schließen radikale Prostatektomie, Strahlungstherapie, hormonale Abtragung und Chemotherapie ein. Unglücklicherweise wird in ungefäbr 80% der Fälle die Diagnose von Prostatakrebs erstellt, wenn die Krankheit schon zu Metastasenbildungen im Knochen geführt hat, wodurch die Effektivität chirurgischer Behandlungen limitiert wird. Eine Vielzahl von Mitteln sind verfügbar, welche bei der Androgen-Blockierungstherapie verwendet werden, und sie beinhalten luteinisierendes Hormon-Freisetzungshormon-Analoga, steroidale Anti-Androgene, wie z. B. Cyproteronacetat, nicht-steroidale Anti-Androgene, wie z. B. Flutamid, und andere Mittel, wie z. B. Aminoglutethimid und Ketoconazol. Jedoch versagt hormonelle Therapie oft mit der Zeit mit der Entwicklung Hormon-resistenter Tumorzellen. Obwohl chemotherapeutische Mittel bei der Behandlung von Prostatakrebs verwendet worden sind, hat kein einzelnes Mittel gegenüber seinen Gegenspielern Überlegenheit gezeigt, und keine Arzneimittelkombination scheint besonders effektiv zu sein. Die allgemein Arzneimittel-resistente, langsam wachsende Art der meisten Prostatakrebsarten macht sie gegenüber Standardchemotherapie besonders unempfänglich.
Ein Haupthindernis und in der Tat das überwältigende Hindernis für Krebstherapie ist das Problem der Selektivität; d. h., die Fähigkeit, die Vermehrung von Tumorzellen zu inhibieren, während die Funktion normaler Zellen unbeeinflusst gelassen wird. Das therapeutische Verhältnis oder Verhältnis von Tumorzell-Töten gegenüber dem Töten normaler Zellen traditioneller Chemotherapie ist nur 1,5:1. Folglich sind effektivere Behandlungsverfahren und pharmazeutische Zusammensetzungen zur Therapie und Prophylaxe von Prostatahyperplasie und Neoplasie erforderlich.
Von besonderem Interesse ist die Entwicklung spezifischerer, zielgerichteter Therapieformen für Prostatakrankheiten. Im Gegensatz zu konventionellen Krebstherapien, welche in relativ nicht-spezifischer und oft ernsthafter Toxizität oder Impotenz resultieren, versuchen spezifischere Behandlungsmodalitäten, maligne Zellen selektiv zu inhibieren oder zu töten, während sie gesunde Zellen intakt lassen.
Eine mögliche Vorgehensweise zur Behandlung von Prostataerkrankungen ist Gentherapie, wobei ein interessierendes Gen in die maligne Zelle eingeführt wird. Boulikas (1997) Anticancer Res. 17:1471–1505. Das Gen von Interesse kann ein Protein codieren, welches sich bei Behandlung mit einer anderen Verbindung in eine toxische Substanz umwandelt, oder ein Enzym, das ein Prodrug zu einem aktiven Arzneimittel umwandelt. Beispielsweise macht die Einführung des Herpes simplex-Gens, das Thymidinkinase (HSV-tk) codiert, Zellen konditional bzw. bedingt sensitiv gegenüber Ganciclovir (GCV). Zjilstra et al. (1989) Nature 342:435; Mansour et al. (1988) Nature 336:348; Johnson et al. (1989) Science 245:1234; Adair et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4574; Capecchi (1989) Science 244:1288. Alternativ kann das Gen von Interesse eine Verbindung codieren, die direkt toxisch ist, wie z. B. Diphtherietoxin (DT). Damit diese Behandlungen spezifisch für Prostatazellen gemacht werden, kann das Gen von Interesse unter Kontrolle eines transkriptionalen Regulationselements sein, das spezifisch (d. h. vorrangig) Transkription eines funktionell verknüpften Polynucleotids in den Prostatazellen erhöht. Zell- oder Gewebe-spezifische Expression kann erzielt werden durch Verwendung Zell-spezifischer Enhancer und/oder Promotoren. Siehe im Allgemeinen Huber et al. (1995) Adv. Drug Delivery Rev. 17:279–292.
Eine Vielzahl viraler und nicht-viraler (z. B. Liposomen) Vehikel oder Vektoren sind entwickelt worden, um diese Gene zu transferieren. Von den Viren sind Retroviren, Herpesvirus, Adeno-assoziiertes Virus, Sindbisvirus, Pockenvirus und Adenoviren zur Verwendung beim Gentransfer vorgeschlagen worden, wobei Retrovirus-Vektoren oder Adenovirus-Vektoren der Fokus vieler jüngerer Forschungen waren. Verma und Somia (1997) Nature 389:239–242.
Adenoviren sind unter den am leichtesten Herzustellenden und zu Reinigenden und integrieren ferner nicht in das Wirtsgenom, was die Möglichkeit gefährlicher Mutationen reduziert. Darüber hinaus hat Adenovirus den Vorteil, dass es eine hohe Effizienz an Transduktion bewirkt und zur effizienten Transduktion einer Zelle keine Zellproliferation erfordert. Für allgemeine Grundlagen-Referenzen, die Adenovirus und die adenoviralen Vektorensysteme betreffen, siehe Graham et al. (1973) Virology 52:456–467; Takiff et al. (1981) Lancet 11:832–834; Berkner et al. (1983) Nucleic Acid Research 11: 6003–6020; Graham (1984) EMBO J 3:2917–2922; Bett et al. (1993) J. Virology 67:5911–5921; und Bett et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8802–8806.
Wenn sie als Gentransfervehikel verwendet werden, werden Adenovirus-Vektoren oft so entworfen, dass sie Replikations-defekt sind, und werden folglich absichtlich dahingehend konstruiert, dass sie in den Zielzellen von Interesse nicht replizieren können. In diesen Vehikeln sind die frühen Adenvirus-Genprodukte E1A und/oder E1B deletiert und in trans durch die Verpackungs-Zelllinie 293 bereitgestellt. Graham et al. (1987) 1 Gen. Virol. 36:59–72; Graham (1977) J. Genetic Virology 68:937–940. Das zu transduzierende Gen wird im Allgemeinen in der Region von deletiertem E1A und E1B des Virusgenoms in Adenovirus insertiert. Bett et al. (1994). Replikations-defekte Adenovirus-Vektoren als Vehikel zur effizienten Transduktion von Genen sind unter anderem beschrieben worden von Stratford-Perricaudet (1990) Human Gene Therapy 1:241–256; Rosenfeld (1991) Science 252:431–434; Wang et al. (1991) Adv. Exp. Med. Biol. 309:61–66; Jaffe et al. (1992) Nat. Genet. 1:372–378; Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581–2584; Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143–155; Stratford-Perricaudet et al. (1992) J. Clin. Invest. 90:626–630; Le Gal Le Salle et al. (1993) Science 259:988–990 Mastrangeli et al. (1993) J. Clin. Invest. 91:225–234; Ragot et al. (1993) Nature 361:647–650; Hayaski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:23872–23875; und Bett et al. (1994).
Der nahezu ausschließliche Fokus bei der Entwicklung adenoviraler Vektoren für die Gentherapie ist die Verwendung von Adenovirus nur als ein Vehikel zum Einführen des Gens von Interesse und nicht an sich als einen Effektor. Replikation von Adenovirus ist als ein nicht wünschenswertes Ergebnis angesehen worden, größtenteils bedingt durch die Immunreaktion des Wirts. Bei der Behandlung von Krebs durch Replikations-defekte Adenviren limitiert die Immunreaktion des Wirts die Dauer von Wiederholungsdosen auf zwei Ebenen. Zuerst sind die Capsidproteine des Adenovirus-Ablieferungsvehikels selbst immunogen. Zweitens werden späte virale Gene häufig in transduzierten Zellen exprimiert, was zelluläre Immunität auslöst. Folglich ist das Vermögen, wiederholt Cytokine, Tumorsuppressorgene, Ribozyme, Suizidgene oder Gene, welche ein Prodrug in ein aktives Arzneimittel umwandeln, zu verabreichen, durch die Immunogenität von sowohl dem Gentransfervehikel als auch den viralen Genprodukten des Transfervehikels sowie die kurzlebige Art der Genexpression limitiert gewesen. Es besteht ein Bedürfnis nach Vektorkonstrukten, die fähig sind, kanzeröse Zellen in einer minimalen Anzahl von Anwendungen zu eliminieren, bevor eine spezifische immunologische Reaktion gegen den Vektor weitere Behandlung verhindert.
Humanes glanduläres Kallikrein
Prostata-spezifisches Antigen (PSA oder hKLK3) und humanes Bauchspeicheldrüsen-/Nieren-Kallikrein sind zwei Mitglieder einer Untergruppe von Serinproteasen, die potentiell an der Aktivierung von spezifischen Polypeptiden durch posttranslationales Prozessieren beteiligt sind. Clements (1989) Endocr. Rev. 10:393–419. PSA wird ausschließlich von normalem hyperplastischen und malignen Prostataepithel synthetisiert; folglich hat es seine Gewebe-spezifische Expression zu einem ausgezeichneten Biomarker für gutartige Prostatahyperplasie (BPH, "benign prostatic hyperplasia") und Prostatakarzinom (CaP) gemacht. Normale Serumspiegel von PSA sind typischerweise unterhalb von 5 ng/ml, wobei erhöhte Spiegel indikativ für BPH oder CaP sind. Ein drittes Mitglied der Kallikrein-Genfamilie, humanes glanduläres Kallikrein-1 (hGK-1 oder hKLK2, codierend das hK2-Protein) hat eine Anzahl von Charakteristika mit PSA gemeinsam. Erstens werden beide ausschließlich in der Prostata exprimiert und durch Androgene in erster Linie durch transkriptionale Aktivierung hochreguliert. Wolf et al. (1992) Molec. Endocrinol. 6:753–762. Morris (1989) Clin. Exp. Pharm. Physiol. 16:345–351; Qui et al. (1990) J. Urol. 144:1550–1556; Young et al. (1992) Biochem. 31:818–824. Zweitens werden hKLK2 und PSA-mRNAs nur in Prostataepithel synthetisiert und co-lokalisieren nur dort. Drittens weisen hK2 und PSA einen höheren Grad an Aminosäuresequenzidentität auf. Schedlich et al. (1987) DNA 6:429–437. Viertens haben sie ähnliche regulatorische Elemente. Es besteht ungefähr 80% Nucleotidsequenzidentität zwischen PSA und hKLK2 in der 5'-flankierenden Region von –300 bis –1 relativ zur Transkriptionsstartstelle. Young et al. (1992) Biochem. 31:818–824. Jeder Promotor enthält ein auf Androgen reagierendes Element (ARE, "androgen responsive element"); ihre jeweiligen AREs unterscheiden sich voneinander nur durch 1 Nucleotid. Schedlich et al. (1987) DNA 6:429–437; Murtha et al. (1993) Biochem. 32:6459–6464.
Die Level an hK2, die man in verschiedenen Tumoren und in dem Serum von Patienten mit Prostatakrebs findet, unterscheiden sich wesentlich von jenen von PSA. Zirkulierendes hK2 in unterschiedlichen relativen Anteilen gegenüber PSA ist im Serum von Patienten mit Prostatakrebs detektiert worden. Charlesworth et al. (1997) Urology 49:487–493. Expression von hK2 ist in jeder von 257 radikale Prostatektomie-Proben, die analysiert wurden, detektiert worden. Darson et al. (1997) Urology 49:857–862. Die Intensität und das Ausmaß von hK2-Expression, detektiert unter Verwendung spezifischer Antikörper, nahm von benignem Epithel zu hochgradiger intraepithelialer Prostataneoplasie (PIN, "prostatic intraepithelial neoplasia") und Adenokarzinom zu, wohingegen PAS und saure Phosphatase der Prostata (PAP, "prostate acid phosphatase") ein umgekehrtes Muster an Immunreaktivität zeigten. Darson et al. (1997) Urology 49:857–862. Tatsächlich ist beschrieben worden, dass ein gewisser Prozentsatz von PSA-negativen Tumoren nachweisbares hK2 aufweisen. Tremblay et al. (1997) Am. J. Pathol. 150:455–459.
Der hKLK2-Promotor ist durch Androgen induzierbar, was mit dem Vorhandensein eines ARE in dem Promotor konsistent ist. Murtha et al. (1993). Jedoch reagierte die Promotorregion von ungefähr 627 Basenpaaren der 5'-flankierenden Region des hKLK2-Gens, welche in einem Plasmidkonstrukt mit einem Reportergen verknüpft war und in Zellen eingeführt wurde, mit einer nur ungefähr 10-fachen Zunahme an Reportergen-Aktivität, wenn dem Kulturmedium Androgen zugesetzt wurde. Murtha et al. (1993).
Androgen-Induktion von Genexpression erfordert die Gegenwart eines Androgen-Rezeptors (AR). Typischerweise diffundiert ein Androgen passiv in die Zelle, wo es AR bindet. Der Andogen-aktivierte AR bindet an spezifische DNA-Sequenzen, die auf Androgen reagierende Elemente ("androgen-responsive elements") genannt werden (AREs oder ARE-Stellen). Sobald er an einem ARE verankert ist, ist der AR in der Lage, Transkriptionsaktivität auf entweder eine positive oder negative Art und Weise zu regulieren. Lindzey et al. (1994) Vitamins and Hormones 49:383–432.
Der AR gehört zu einer Superfamilie von Kernrezeptoren, von deren Mitgliedern man glaubt, dass sie in erster Linie als Transkriptionsfaktoren wirken, die Genaktivität durch Binden an spezifische DNA-Sequenzen, auf Hormon reagierende Elemente ("hormone-responsive elements"), regulieren. Carson-Jurica et al. (1990) Endocr. Rev. 11: 201–220. Diese Familie schließt die anderen Steroidhormon-Rezeptoren sowie die Schilddrüsenhormon-Retinolsäure- und die Vitamin D₃-Rezeptoren ein. Der Progesteron- und Glucocorticoid-Rezeptor stehen mit dem AR strukturell in der engsten Beziehung. Tilley et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 327–331; Zhou et al. (1994) Recent Prog. Horm. Res. 49:249–274; und Lindzey et al. (1994) Vitamins and Hormones 49:383–432.
Das AR-Gen selbst ist ein Ziel von Androgenregulation. In den Prostatakrebs-Zelllinien PC3 und DU 145, welche keinen endogenen AR exprimieren, trat Androgen-Hochregulation von AR-cDNA-Expression in den transfizierten Zellen auf. Dai et al. (1996) Steroids 61:531–539. Androgen-Hochregulation von AR-mRNA und -Protein wurde in PC3-Zellen beobachtet, die mit der AR-cDNA stabil transfiziert waren, was nahe legt, dass AR-mRNA-Regulation auch auftritt, wenn die cDNA in Chromatin organisiert ist. Dai et al. (1996).
Identifikation von Prostata-spezifischen Genen und der Transkriptionsregulationselemente, die ihre Expression kontrollieren, würde die Entwicklung von Strategien erleichtern, Prostatakrebs durch Bereitstellen von Zielen bzw. Targets für die Therapie zu bekämpfen. Die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze zur Behandlung von Prostatakrebs ist kritisch, weil diese Krankheiten gegenüber konventionellen Therapien widerspenstig sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt einen Prostata-spezifischen Gen-Enhancer bereit, welcher Expression des Gens für humanes glanduläres Kallikrein (hKLK2) reguliert. Ein hKLK2-Enhancer kann einen Teil eines transkriptionalen hKLK2-Regulationselements (hKLK2-TRE) bilden. Ein hKLK2-TRE kann wiederum funktionell verknüpft sein mit einem heterologen Polynucleotid, um Transkriptionskontrolle des verknüpften Gens zu bewirken.
Demgemäß stellt die Erfindung ein isoliertes Polynucleotid bereit, das umfasst:

(i) Nucleotide 8021 bis 8371, 7200 bis 8371, 6859 bis 8627, 5976 bis 9620 oder 1 bis 9765 von SEQ ID NO:1; oder
(ii) eine Sequenz mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu den Nucleotiden 8021 bis 8371, 7200 bis 8371, 6859 bis 8627, 5976 bis 9620 oder 1 bis 9765 von SEQ ID NO:1;

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Polynucleotid bereit, das ein transkriptionales Regulationselement umfasst, welches einen hKLK2-Enhancer und einen Promotor umfasst.
Die Erfindung stellt außerdem Vektoren und/oder Abgabevehikel bereit, die dieses Enhancer-Polynucleotid/diese Enhancer-Polynucleotide enthalten. Solche Vektoren und/oder Abgabevehikel können in Zellen sowohl in vivo als auch in vitro eingeführt werden.
Ein hKLK2-TRE kann in einen adenoviralen Vektor inkorporiert werden, welcher so konstruiert sein kann, dass ein hKLK2-TRE die Expression wenigstens eines adenoviralen Gens und/oder wenigstens eines Transgens kontrolliert. Vorzugsweise ist das adenovirale Gen eines, das zu Cytotoxizität beiträgt, wie z. B. ein Gen, das erforderlich ist für adenovirale Replikation oder das ein adenovirales Todesprotein („death Protein") codiert. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ferner adenovirale Vektoren bereit, in welchen ein Adenvirus-Gen unter transkriptionaler Kontrolle eines humanes glanduläres Kallikrein (hKLK2)-Transkriptionsregulationselements ist, wobei das hKLK2-Transkriptionsregulationselement einen hKLK2-Enhancer und einen Promotor umfasst. Alternativ kann ein adenoviraler Vektor so konstruiert sein, dass ein hKLK2-TRE Expression von einem adenoviralen Gen oder von adenoviralen Genen kontrolliert und zusätzlich dazu ein heterologes Polynucleotid unter transkriptionaler Kontrolle eines hKLK2-TRE ist. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ferner adenovirale Vektoren bereit, die heterologe Polynucleotide enthalten, welche vorzugsweise in Zellen transkribiert werden, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlauben.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung einen Adenovirus-Vektor bereit, der ein erstes Gen, wie z. B. ein adenovirales Gen oder ein Transgen, unter transkriptionaler Kontrolle eines humanes glanduläres Kallikrein (hKLK2)-Transkriptionsregulationselements (hKLK2-TRE) umfasst, und wenigstens ein anderes Gen, wie z. B. ein adenovirales Gen oder ein Transgen, unter transkriptionaler Kontrolle eines Prostata-spezifisches Antigen (PSA)-Transkriptionsregulationselements (PSA-TRE) umfasst, wobei das hKLK2-TRE einen hKLK2-Enhancer und einen Promotor umfasst, und wobei das PSA-TRE einen Prostata-spezifischen Enhancer (PSE) und eine Promotor umfasst.
Die Erfindung stellt außerdem Verfahren für das Einführen eines Vektors und/oder eines Abgabevehikels, enthaltend einen hKLK2-Enhancer, in eine Zelle bereit. Die Erfindung stellt ferner Wirtszellen bereit, die ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid enthalten.
In weiteren Aspekten stellt die Erfindung Verfahren für das Erzeugen von Konstrukten bereit, die ein hKLK2-TRE, funktionell verknüpft mit einem heterologen Polynucleotid, umfassen, und stellt ferner Verfahren bereit für das Erhöhen der Transkription und/oder Expression des verknüpften heterologen Polynucleotids, die generell das Einführen der Konstrukte in geeignete Zellen einschließen.
Demgemäß stellt die Erfindung Verfahren für das Erhöhen der Transkription einer funktionell verknüpften Polynucleotidsequenz in einer Zelle bereit, umfassend Einführen eines Konstruktes, umfassend einen humanes glanduläres Kallikrein (hKLK2)-Enhancer und einen Promo tor, funktionell verknüpft mit dem Polynucleotid, in eine Zelle, in welcher der hKLK2-Enhancer und/oder ein hKLK2-TRE funktional ist.
Weiterhin sind Verfahren bereitgestellt für das Verwenden der adenoviralen Vektoren der Erfindung. In einem Aspekt sind Verfahren bereitgestellt für das Verwenden der hierin beschriebenen Adenovirus-Vektoren, welche das Einführen dieses Vektors/dieser Vektoren in eine Zelle mit sich bringen. In einem weiteren Aspekt sind Verfahren, einer Zelle, die einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlaubt, selektive Cytotoxizität zu übertragen, bereitgestellt, die in-Kontakt-Bringen der Zellen mit einem hierin beschriebenen Adenovirus-Vektor mit sich bringen, wobei der Adenovirus-Vektor in die Zelle eintritt. In einem weiteren Aspekt sind Verfahren für das Modifizieren des Genotyps einer Zielzelle bzw. Targetzelle bereitgestellt, die in-Kontakt-Bringen der Zelle mit einem hierin beschriebenen Adenovirus-Vektor umfassen, wobei der Adenvirus-Vektor in die Zelle eintritt. In einem noch weiteren Aspekt sind Verfahren bereitgestellt für das Vermehren bzw. Propagieren der Adenovirus-Vektoren der Erfindung, umfassend Kombinieren der Adenovirus-Vektoren mit Zellen, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlauben, so dass der Adenvirus-Vektor in die Zellen eintritt und vermehrt wird.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren für das Screenen bzw. Screening von Verbindungen für die Behandlung von Prostatakrebs bereit, das Zellen einsetzt, die ein Expressionskonstrukt umfassen, wobei das Expressionskonstrukt ein hKLK2-TRE und ein Reportergen umfasst, dessen Expressionsprodukt ein detektierbares Signal liefert, wobei das Reportergen unter der transkriptionalen Kontrolle des hKLK2-TRE ist, wobei das Verfahren die Schritte des Kombinierens der Zellen mit einer Kandidatenverbindung und einem geeigneten induzierenden Mittel für eine ausreichende Zeit zur detektierbaren Expression des Reportergens, und Detektieren des Expressionslevels des Reportergens im Vergleich zum Expressionslevel in Abwesenheit der Kandidatenverbindung, umfasst.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung der hKLK2-Promotor/Enhancer-Region, dargestellt in SEQ ID NO:1. Die Zahlen oberhalb der Balken entsprechen der Position relativ zur hKLK2-Transkriptionsstartstelle; die Zahlen unterhalb der Balken stimmen mit SEQ ID NO:1 überein. Der durch diagonale Linien abgebildete Anteil stellt die Promotorregion (Schedlich et al. (1987)) dar; der gepunktete Anteil (einschließlich des ausgefüllten ("solid") Anteils) stellt eine aktive Enhancer-Region dar; der ausgefüllte Anteil stellt eine kleinere Enhancer-Region dar; und die Transkriptionsstartstelle ist durch einen gebogenen Pfeil angezeigt.
2A bis 2D zeigen eine Nucleotidsequenzanordnung eines Anteils von 2227 Nucleotiden eines hKLK2-Enhancers (Nucleotide 7272 bis 9498 von SEQ ID NO:1) und eines Anteils von 2187 Nucleotiden eines PSE (Nucleotide 775 bis 2961 der Sequenz, die in GenBank Zugangs-Nr. U37672 angegeben ist). Die obere Reihe sind die Nucleotide 7272 bis 9498 von SEQ ID NO:1. Die untere Reihe sind Nucleotide 775 bis 2961 von GenBank Zugangs-Nr. U37672. Punkte zwischen den Reihen zeigen Identität an. Lücken, eingeführt, um Identität zu maximieren, sind durch Striche angezeigt. Parameter für die vergleichende Anordnung waren: "Mismatch"=2; "open gap"=0 und "extend gap"=2.
3A und 3B sind Balkendiagramme der Induktion von hKLK2-Promotor/Enhancer-gesteuerter Luciferase-Expression durch Testosteron-Analogon R1881 in LNCaP (humanes metastatisches Prostata-Adenokarzinom)-Zellen. LNCaP-Zellen wurden mit Reportergen-Konstrukten transfiziert, in Gegenwart oder Abwesenheit von Induzierer inkubiert, und 48 Stunden nach Transfektion wurde Luciferaseaktivität gemessen. 3A zeigt Induktion, ausgedrückt in relativen Lichteinheiten (RLU, "relative light units") pro μg Gesamtprotein, von Luciferase-Expression mittels des hKLK2-Promotor-enthaltenden Konstrukts CN299 (gerasterte Balken) oder durch das hKLK2-Promotor/Enhancer-enthaltende Konstrukt CN322 (ausgefüllter Balken) in Gegenwart von 0 nM oder 0,5 nM R1881. 3B zeigt die (x-)fache („fold") Induktion, berechnet durch Vergleichen von CN322-RLU/μg Protein mit CN299-RLU/μg Protein in Gegenwart von 0,5 nM R1881.
4A und 4B sind Balkendiagramme der Konzentrationsabhängigkeit von R1881-vermittelter Induktion von hKLK2-Promotor/Enhancer-gesteuerter Luciferase-Expression. LNCaP-Zellen wurden mit CN322 transfiziert, und Zellen wurden in verschiedenen Konzentrationen von R1881 inkubiert. Zellen wurden 48 Stunden nach Transfektion geerntet, und Luciferaseaktivität wurde gemessen. 4A zeigt Luciferaseaktivität, ausgedrückt als RLU/μg Protein, von Kulturen, inkubiert in Gegenwart von 0, 0,01, 0,1, 1 oder 10 nM R1881. 4B zeigt (x-)fache Induktion, berechnet durch Vergleichen von RLU/μg Protein bei einer gegebenen Konzentration mit RLU/μg Protein bei 0 nM R1881.
5 ist ein Balkendiagramm, das Induktion von Luciferaseaktivität als eine Funktion über die Zeit von der Inkubation mit R1881 zeigt. LNCaP-Zellen wurden mit CN322 transfiziert, und Zellen wurden über verschiedene Zeiträume in Medium, das 0,5 nM R1881 enthielt, inkubiert, wonach Luciferaseaktivität gemessen wurde.
6 ist ein Balkendiagramm, das die Zelltyp-Spezifität hKLK2-Promotor/Enhancer-gesteuerter Luciferase-Expression darstellt. LNCaP- oder 293 (humane embryonale Niere)-Zellen wurden transfiziert mit CN299- oder mit CN322-Plasmidkonstrukten und inkubiert in der Abwesenheit oder der Gegenwart von 1 nM R1881. Zellen wurden 48 Stunden nach Transfektion geerntet, und Luciferaseaktivität wurde gemessen. (x-)fache Induktion wurde berechnet durch Vergleichen von RLU/μg Protein mit und ohne 1 nM R1881.
7 ist ein Balkendiagramm, das die Aktivität des hKLK2-Enhancers/Promotors in verschiedenen Zelllinien darstellt. Verschiedene Zelllinien wurden transfiziert mit entweder CN322 oder CN355 und wurden, nach einer Über-Nacht-Inkubation in Vollmedium in der Gegenwart oder Abwesenheit von R1881 inkubiert. CN355 enthält ein 3,8 kb-Fragment von ungefähr –6200 bis ungefähr –2400 des hKLK2-Enhancers, fusioniert an den hKLK2-Minimalpromotor, um Luciferase-Expression zu kontrollieren. Die verwendeten Zelllinien wa ren: OVCAR, humanes Eierstock-Adenokarzinom ("human ovarian adenocarcinoma"); 293, transformierte humane primäre embryonale Niere; PC3, humanes Prostata-Adenokarzinom Grad IV; LNCaP, metastatisches humanes Prostata-Adenokarzinom.
8 ist eine schematische Darstellung von hKLK2-Enhancer/Promotor-Konstrukten. Expressionsplasmide wurden konstruiert, in welchen Luciferase-Genexpression gesteuert ist durch hKLK2-Enhancer-Fragmente verschiedener Länge, verknüpft mit dem hKLK2-Minimalpromotor (–324 bis +33, relativ zur Transkriptionsstartstelle). Die Zahlen oberhalb der Linien, die die Konstrukte darstellen, geben 5'- und 3'-Enden der Enhancer-Fragmente relativ zur Transkriptionsstartstelle an. In der Säule auf der rechten Seite sind Werte für die (x)-fache Induktion gegenüber Kontrollproben, zu welchen kein Induzierer gegeben wurde, angegeben.
9 ist eine schematische Darstellung der hKLK2-Promotor/Enhancer-Region, dargestellt in SEQ ID NO:1. Die Zahlen oberhalb der Balken entsprechen der Position relativ zur hKLK2-Transkriptionsstartstelle; die Zahlen unterhalb der Balken stimmen mit SEQ ID NO:1 überein. Der durch diagonale Linien dargestellte Anteil stellt die Promotorregion (Schedlich et al. (1987)) dar; der gepunktete Anteil (einschließlich des ausgefüllten Anteils) stellt eine aktive Enhancer-Region dar; der ausgefüllte Anteil stellt eine kleinere Enhancer-Region dar; und die Transkriptionsstartstelle ist durch einen gebogenen Pfeil angezeigt. Die Enhancer-Region, dargestellt durch den ausgefüllten Anteil, ist unten vergrößert und zeigt eine kleinere Enhancer-Region (7200 bis 8371 von SEQ ID NO:1). Innerhalb dieser Enhancer-Region enthalten ist der 350 bp lange "core regulator". Auch gezeigt ist das ARE (Nucleotide 8192 bis 8206 von SEQ ID NO:1), dargestellt durch einen ausgefüllten Balken unterhalb des "core regulator".
10A ist ein Balkendiagramm, das die Aktivität eines hKLK2-Enhancers darstellt, der funktionell verknüpft ist mit einem hKLK2-Promotor (CN379) oder mit einem SV40-Promotor (CN408), um Expression eines Luciferase-Gens zu steuern. Die Konstrukte sind schematisch in 10B gezeigt. LNCaP-Zellen wurden mit den Konstrukten transfiziert, und Enhancer-Aktivität wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, gemessen.
11 ist ein Balkendiagramm, das die Aktivität eines hKLK2-Enhancers darstellt, der ein mutmaßliches ARE mit Wildtyp-(CN390) oder mutierter (CN457, CN458) Sequenz aufweist (11B). Die Sequenzen des mutmaßlichen ARE und seiner mutierten Formen sind unterhalb der dazugehörigen Konstrukte angegeben (11A). LNCaP-Zellen wurden mit den Konstrukten transfiziert, und Enhancer-Aktivität wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, gemessen.
12 zeigt die Ergebnisse von Experimenten, die die Aktivität von: einem hKLK2-Enhancer von 1,8 kb (CN379; Nucleotide 6859 bis 8627 von SEQ ID NO:1); dem hKLK2-Enhancer von 1,8 kb in umgekehrter Orientierung wie in CN379 und 5' von dem Luciferasecodierenden Gen (CN418), dem hKLK2-Enhancer von 1,8 kb in der gleichen Orientierung wie in CN379, jedoch 3' von dem Luciferase-codierenden Gen (CN419), und dem hKLK2-Enhancer von 1,8 kb in der umgekehrten Orientierung wie CN379 und 3' von dem Luciferase-codierenden Gen (CN420) testen. Werte sind für die (x-)fache Induktion in LNCaP-Zellen in der Gegenwart von R1881 angegeben.
13 ist ein Balkendiagramm, das die Induktion des Luciferase-codierenden Gens durch verschiedene hKLK2-Enhancer/Promotor-Konstrukte in verschiedenen Zellen in der Gegenwart von R1881 darstellt. Die verwendeten Zelllinien repräsentieren verschiedene auf Hormon reagierende Gewebe, einschließlich von Prostatakarzinom (LNCaP und PC-3), humanem Brustkarzinom (MCF-7), Lungenkarzinom (A549), humanem Brustepithel (HBL-100), Leberkarzinom (HUH-7) und Colonkarzinom (LoVo). Die Zelllinie 293, welche abgeleitet ist von humanen embryonalen Nierenzellen, transformiert mit Adenovirus-DNA, wurde als ein nicht auf Hormon reagierender Zelltyp eingeschlossen.
14 ist ein Balkendiagramm, das die Induktion von Luciferase-codierendem Gen durch einen hKLK2-Minimalpromotor (CN325; linke Balken) und von einem 1,17 kb-hKLK2-Enhancer/hKLK2-Minimalpromotor (CN390, enthaltend Nucleotide 7200 bis 8371 von SEQ ID NO:1; rechte Balken) in der Gegenwart von verschiedenen Steroidhormonen zeigt. Die getesteten Hormone waren: DEX, ein synthetisches Glucocorticoid; DES, ein synthetisches Östrogen; Dihydrotestosteron (DHT); und das synthetische Androgen R1881.
15 ist ein Balkendiagramm, das die Induktion eines Luciferase-codierenden Gens durch einen hKLK2-Minimalpromotor (CN325; linke Balken) und einen 1,17 kb-hKLK2-Enhancer/hKLK2-Minimalpromotor (CN390, rechte Balken) in Zelllinien zeigt, denen der endogene Androgen-Rezeptor (AR) fehlt, welche co-transfiziert waren mit einem Expressionskonstrukt, welches Expression des AR steuert (OVCAR, 293 und PC3); und in LNCaP-Zellen, welche endogenen AR exprimieren.
16 ist eine schematische Darstellung der hKLK2-TREs, die verwendet wurden, um die in Beispiel 10 beschriebenen adenoviralen Konstrukte zu erzeugen.
17A und 17B sind schematische Darstellungen der in Beispiel 10 beschriebenen adenoviralen Konstrukte, bei welchen die adenoviralen Gene E1A und E1B unter der transkriptionalen Kontrolle verschiedener TREs sind. Die Ovale zeigen an, dass endogenes E1A vorhanden ist. Die Dreiecke zeigen an, dass der endogene E1B-Promotor entfernt war. Abkürzungen für TREs sind wie folgt: PSE: Prostata-spezifisches Antigen-TRE; hKLK2 P: hKLK2-Promotor; PB: Probasin-TRE; hKLK2 (1,8 E + P): 1,8 kb hKLK2-Enhancer und hKLK2-Minimalpromotor, wie in 16 dargestellt; hKLK2 (1,17 kb E + P): 1,17 kb hKLK2-Enhancer und hKLK2-Minimalpromotor, wie in 16 dargestellt; hKLK2 (350 bp E + P): 350 bp hKLK2-Enhancer und hKLK2-Minimalpromotor, wie in 16 dargestellt).
18 zeigt die cytopathischen ("cytopathic") Effekte von CN702 und CN764 bei verschiedenen Multiplizitäten einer Infektion auf humane mikrovaskuläre Endothelzellen.
19 ist ein Balkendiagramm, das die Anzahl an Plaque-bildenden Einheiten zeigt, die ausgedrückt sind als Prozentsatz an Plaques, erhalten mit Wildtyp-Adenovirus, erhalten, wenn entweder LNCaP-Zellen (schraffierte Balken) oder HMVEC-Zellen (Balken mit eckigem Muster) mit adenoviralen Vektoren CN739, CN764, CN765 oder CN770 infiziert wurden.
20 ist ein Graph, der Cytotoxizität eines adenoviralen Vektors zeigt, enthaltend die codierende Sequenz für adenovirales Todesprotein (ADP, "adenoviral death Protein"), CN751 (ausgefüllte Quadrate), verglichen mit Kontrolle CN702 (ausgefüllte Kreise), Rec 700 (ausgefüllte Dreiecke) und Mock-Infektion (Xe).
21 ist ein Graph, der extrazelluläre Virus-Ausbeute von CN751 (ausgefüllte Quadrate) und CN702 (ausgefüllte Kreise) vergleicht.
22 ist ein Graph, der Tumorvolumen in Mäusen, die LNCaP-Tumor-Heterotransplantate beherbergen, herausgefordert mit ("challenged with") CN751 ("H"), CN702 ("J") oder Puffer ("B"), vergleicht.
23A und 23B stellen zwei unterschiedliche Assayverfähren für das Identifizieren von Mitteln dar, die die Fähigkeit haben, Expression eines Polynucleotids, funktionell verknüpft mit einem hKLK2-TER, zu modulieren.
24A und 24B sind Balkendiagramme (rechts), die die Ergebnisse von vorübergehenden Transfektionen unter Verwendung von schematisch gezeigten Konstrukten (links) darstellen. A. Aufklären der 5'-Grenze des hKLK2-Regulationselements. B. Aufklären der 3'-Grenze des hKLK2-Regulationselements. Luciferaseaktivitätsdaten wurden auf μg Protein normalisiert. Ausgefüllte Balken stellen Luciferaseaktivität in der Gegenwart von R1881 (1 nM) dar; leerer Balken stellt Luciferaseaktivität in Abwesenheit von R1881 (0 nM) dar. Die dicken Linien in den schematischen Darstellungen der Konstrukte stellen die hKLK2-Stromaufwärtsregionen dar, die bei den Reporter-Konstrukten beibehalten wurden. Die Positionen sind relativ zur Transkriptionsstartstelle angegeben.
25A und 25B zeigen Autoradiographie-Abbildungen der Ergebnisse eines elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassays ("electrophoretic mobility shift assay"). Die Angaben zu den Spuren sind wie folgt. 25A: Spur 1, Sonde alleine; Spur 2, Sonde mit LNCaP-Extrakt; Spur 3, Sonde mit LNCaP-Extrakt und spezifischem DNA-Kompetitor; Spur 4, Sonde mit LNCaP-Extrakt und (Schein-Kompetitor bzw.) Mock-Kompetitor; Spur 5, Mock-Kompetitor-Sonde mit LNCaP-Extrakt; Spur 6, Mock-Kompetitor-Sonde alleine. 25B. Spur 1, Sonde alleine; Spur 2, Sonde mit LNCaP-Extrakt; Spur 3, Sonde mit LNCaP-Extrakt und spezifischem DNA-Kompetitor; Spur 4, Sonde mit HeLa-Extrakt; Spur 5, Sonde mit HeLa-Extrakt und spezifischem DNA-Kompetitor. Die Pfeile zeigen den DNA-Protein-Komplex, beobachtet mit LNCaP-Extrakten, jedoch nicht mit HeLa-Extrakten, an.
26 zeigt den Effekt von CN764 auf Tumorzellwachstum in athymischen Mäusen, folgend auf subkutane Injektion von LNCaP-Zellen. Gruppe 1 (Kreise) empfing PBS, enthaltend 10% Glycerol; Gruppe 2 (Quadrate) empfing 1 × 10¹¹ Viruspartikel; Gruppe 3 (Dreiecke) empfing 1 × 10⁸ Viruspartikel; Gruppe 4 (Rauten) empfing 1 × 10⁶ Viruspartikel; und Gruppe 5 (Kreuze) empfing 1 × 10⁴ Viruspartikel.
AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Wir haben einen transkriptionalen Enhancer isoliert und charakterisiert, welcher auf eine Gewebe-spezifische Art und Weise die Expression von humanem glandulärem Kallikrein (hKLK2) reguliert. Die Aktivität des hKLK2-5'-Promotors ist zuvor beschrieben worden, und eine Region bis zu –2256 relativ zur Transkriptionsstartstelle ist zuvor offenbart worden. Schedlich et al. (1987). Der hKLK2-Promotor reagiert auf Androgen, und die Expression des Reportergens wird in Plasmidkonstrukten, worin der Promotor die Expression eines Reportergens alleine kontrolliert, in Gegenwart von Androgen ungefähr 10-fach erhöht. Murtha et al. (1993). Ein hKLK2-Enhancer der vorliegenden Erfindung erhöht, wenn funktionell verknüpft mit einem hKLK2-Promotor und einem Reportergen, Transkription von cis-verknüpften Sequenzen in Prostatazellen in der Gegenwart von Androgen bei Leveln von ungefähr 30- bis ungeführ 100-fach gegenüber dem Transkriptionslevel in der Abwesenheit von Androgen. Diese Induktion ist im Allgemeinen orientierungsunabhängig und positionsunabhängig.
Wie in 10 und Tabelle 1 gezeigt, wird, wenn ein hKLK2-TRE, umfassend einen hKLK2-Enhancer, umfassend Nucleotide 6859 bis 8627 von SEQ ID NO:1, und einen SV40-Promotor, funktionell verknüpft mit einem Reportergen, in LNCaP-Zellen eingeführt wird, Reportergen-Expression bei Induktion mit R1881etwa 80-fach induziert.
Folglich kann ein hKLK2-Enhancer funktionell verknüpft werden mit einem hKLK2-Promotor oder einem heterologen Promotor, um ein hKLK2-Transkriptionsregulationselement bzw. transkriptionales hKLK2-Regulationselement (hKLK2-TRE) zu bilden. Ein hKLK2-TRE kann dann funktionell mit einem heterologen Polynucleotid verknüpft werden, um dem verknüpften Gen hKLK2-TRE-spezifische transkriptionale Regulation zu verleihen, wodurch dessen Expression erhöht wird. Solche Konstrukte können in Zellen eingeführt werden. Ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid, welches ein Teil eines hKLK2-TRE sein kann, kann in einen viralen Vektor oder einen nicht-viralen Vektor insertiert werden, und an eine Zelle durch eine Vielzahl von Abgabevehikeln, einschließlich nicht-viraler und viraler Abgabevehikel, abgeliefert werden. In jenen Zellen, welche einem hKLK2-TRE erlauben, beim Erhöhen von Expression zu funktionieren, wird das heterologe Polynucleotid bei einem höheren Level exprimiert werden als in jenen Zellen, welche einem hKLK2-TRE nicht zu funktionieren erlauben.
Ein hKLK2-TRE ist verwendbar für das Bewirken Zell-spezifischer Expression, beispielsweise in Zellen der Prostata, und ermöglicht folglich die gerichtete Expression eines erwünschten Gens in diesen Zellen. Beispielsweise können Vektorkonstrukte, umfassend ein heterologes Polynucleotid unter der transkriptionalen Kontrolle eines hKLK2-TRE, in Prostatakrebszellen eingeführt werden, wobei das heterologe Polynucleotid ein Produkt codiert, welches für Zellwachstum inhibitorisch ist, wodurch folglich das Wachstum der Krebszellen kontrolliert wird.
Wir haben außerdem Replikations-kompetente Adenovirus-Vektoren entdeckt und konstruiert, die ein hKLK2-TRE enthalten, welche vorzugsweise in Zellen, wie z. B. Prostatazellen, replizieren können, die die Funktion eines hKLK2-Enhancers und/oder eines hKLK2-TRE zulassen, und haben Verfahren entwickelt, diese Adenvirus-Vektoren zu verwenden. Die Adenovirus-Vektoren dieser Erfindung umfassen wenigstens ein Adenovirus-Gen, vorzugsweise wenigstens ein adenovirales Gen, welches zur Cytotoxizität beiträgt, unter der transkriptionalen Kontrolle eines hKLK2-TRE. Durch das Sorgen für Zell-spezifische Transkription wenigstens eines Adenovirus-Gens, erforderlich zur Replikation, stellt die Erfindung Adenovirus-Vektoren bereit, die aufgrund selektiver Replikation verwendet werden können für spezifische cytotoxische Effekte. Dies ist insbesondere nützlich im Zusammenhang mit Krebs, bei welchem targetiertes ("targeted") Zelltöten wünschenswert ist. Die Adenovirus-Vektoren sind verwendbar zur Behandlung von Krebsarten, wie z. B. Prostata(krebs). Die Vektoren können auch verwendbar sein für das Detektieren der Gegenwart von Androgen-Rezeptor-produzierenden Zellen in beispielsweise einer geeigneten biologischen (wie z. B. einer klinischen) Probe. Weiterhin kann/können der Adenovirus-Vektor/die Adenovirus-Vektoren optional selektiv ein oder mehrere Proteine von Interesse unter Verwendung eines hKLK2-TRE in einer Zielzelle produzieren.
Die Adenovirus-Vektoren der Erfindung replizieren vorzugsweise Zellen, in welchen ein hKLK2-Enhancer und/oder ein hKLK2-TRE funktional ist, beispielsweise in Prostatazellen. Diese Replikations-Präferenz wird angezeigt bei Vergleichen des Replikationslevels (d. h. Titers) in Zellen, in welchen ein hKLK2-Enhancer und/oder ein hKLK2-TRE funktional ist, mit dem Replikationslevel in Zellen, in welchen ein hKLK2-Enhancer und/oder ein hKLK2-TRE nicht funktional ist. Die Replikations-Präferenz ist noch signifikanter, weil die Adenovirus-Vektoren der Erfindung in Zellen, in welchen ein hKLK2-Enhancer und/oder ein hKLK2-TRE nicht funktional ist, sogar bei einer signifikant niedrigeren Rate replizieren als Wildtyp-Virus. Vergleich des Titers in Zellen, in welchen ein hKLK2-Enhancer und/oder ein hKLK2-TRE funktional ist, mit dem Titer in Zellen, in welchen ein hKLK2-Enhancer und/oder ein hKLK2-TRE nicht funktional ist, liefert einen Schlüsselhinweis (darauf), dass die Gesamt-Replikationspräferenz, bedingt durch herabgesetzte Replikation in Zellen, in welchen ein hKLK2-Enhancer und/oder ein hKLK2-TRE nicht funktional ist, sowie die Replikation in Zellen, in welchen ein hKLK2-Enhancer und/oder ein hKLK2-TRE funktional ist, wenn verglichen mit Wildtyp-Adenovirus, verstärkt ist. Folglich benutzt die Erfindung das, was als ein unerwünschter Aspekt von adenoviralen Vektoren erachtet wurde, nämlich ihre Replikation und möglicherweise begleitende Immunogenität, und zieht daraus einen Vorteil. Unkontrollierte Infektion ("Runaway infection") wird aufgrund der Zell-spezifischen Erfordernisse für virale Replikation verhindert. Ohne zu wünschen, dass sie durch irgendeine spezielle Theorie gebunden sind, bemerken die Erfinder, dass Produktion von Adenovirus-Proteinen dazu dienen kann, das Immunsystem entweder allgemein oder spezifisch gegenüber Zielzellen, die adenovirale Proteine produzieren, zu aktivieren und/oder zu stimulieren, was eine wichtige Erwägung im Zusammenhang mit Krebs sein kann, in welchem Patienten oft moderat bis ernst immunkompromittiert sind.
Zellen, in welchen ein hKLK2-Enhancer und/oder ein hKLK2-TRE (dabei) funktionieren, die Expression eines heterologen Polynucleotids zu erhöhen, können verwendet werden, um Verbindungen auf einen möglichen therapeutischen Effekt gegen Prostatakrebs hin zu screenen. Dementsprechend sind Verfahren für das Screenen von Verbindungen bereitgestellt, welche Zugeben der Verbindung zu Zellen umfassen, in welchen ein hKLK2-TRE bei der Erhöhung von Expression eines heterologen Polynucleotids funktioniert, was ein detektierbares quantifizierbares Signal liefert. Durch Messen des Effekts der Kandidatenverbindung auf den Level an beobachtetem Signal im Vergleich zu einem Basislevel (d. h., keine Kandidatenverbindung zugegeben), kann man das Potential der Verbindung als ein therapeutisches Mittel für die Behandlung von Prostatakrebs evaluieren. Geeignete Kandidatenverbindungen sind unten diskutiert. Insbesondere kann anti-androgene Aktivität als für therapeutische Effekte für Prostatakrebs indikativ evaluiert werden, obwohl jede Verbindung, welche die Expression eines Prostata-spezifischen Gens modifiziert, was auch immer ihre Wirkungsweise sein mag, als eine Kandidatenverbindung erachtet werden kann.
Allgemeine Techniken
Die Praxis der vorliegenden Erfindung wird, wenn nicht anders angezeigt, konventionelle Techniken der Molekularbiologie (einschließlich rekombinanter Techniken), Mikrobiologie, Zellbiologie, Biochemie und Immunologie einsetzen, welche innerhalb des Könnens auf dem Fachgebiet liegen. Solche Techniken sind vollständig beispielsweise in der folgenden Literatur erklärt: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", zweite Auflage (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, Hrsg., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, Hrsg., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D.M. Weir & C.C. Blackwell, Hrsg.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, Hrsg., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., Hrsg., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., Hrsg., 1994); und "Current Protocols in Immunology" (J.E. Coligan et al., Hrsg., 1991).
Für mit Adenovirus in Beziehung stehende Techniken siehe unter anderem Felgner und Ringold (1989) Nature 337: 387–388; Berkner und Sharp (1983) Nucl. Acids Res. 11: 6003–6020; Graham (1984) EMBO J. 3: 2917–2922; Bett et al. (1993) J. Virology 67: 5911–5921; Bett et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8802–8806.
Definitionen
Wie hierin verwendet, ist ein "hKLK2-Enhancer" eine Polynucleotidsequenz, abgeleitet von dem hKLK2-Gen, welche Enhancer-Aktivität aufweist. "Enhancer-Aktivität" Aufweisen ist ein Ausdruck, der im Fachgebiet gut verstanden wird und bedeutet, was dargestellt worden ist, d. h., er/sie/es erhöht Transkription eines Gens, welches funktionell verknüpft ist mit einem Promotor, in einem Ausmaß, welches größer ist als die Zunahme an Transkription, bewirkt durch den Promotor selbst, wenn funktionell verknüpft mit dem Gen, d. h., er/sie/es erhöht Transkription von dem Promotor. Ein Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet würde leicht erkennen, dass Änderungen an der Nucleotidsequenz des hKLK2-Enhancers vorgenommen werden können, ohne seine Funktion zu beeinträchtigen. Solche Änderungen sind von dem Ausdruck "hKLK2-Enhancer" umfasst. Vorzugsweise trägt eine hKLK2-Enhancer-Sequenz wenigstens etwa 70%, stärker bevorzugt wenigstens etwa 75%, stärker bevorzugt wenigstens etwa 80%, stärker bevorzugt wenigstens etwa 85%, stärker bevorzugt wenigstens etwa 90%, stärker bevorzugt wenigstens etwa 95%, stärker bevorzugt wenigstens etwa 98%, stärker bevorzugt wenigstens etwa 99%, und noch bevorzugter 100% Nucleotidsequenz-Identität mit einer Nucleotidsequenz innerhalb von Nucleotiden 1 bis 11.407 von SEQ ID NO:1, vorzugsweise der Nucleotide von etwa 1 bis etwa 9765 von SEQ ID NO:1, stärker bevorzugt der Nucleotide von etwa 5976 bis etwa 9620 von SEQ ID NO:1, stärker bevorzugt der Nucleotide von etwa 6859 bis etwa 8627 von SEQ ID NO:1, stärker bevorzugt der Nucleotide von etwa 7200 bis etwa 8371 von SEQ ID NO:1, noch stärker bevorzugt der Nucleotide von etwa 8021 bis etwa 8371 von SEQ ID NO:1. Änderungen der Nucleotidsequenz des hKLK2-Enhancers oder aktiver Fragmente davon sind annehmbar, solange die Enhancer-Funktion beibehalten wird. Wie hierin diskutiert, ist selbstverständlich, dass hierin beschriebene hKLK2-Sequenzen nicht gefunden werden in (d. h., dargestellt sind in) SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3.
Wie hierin verwendet, ist ein "humanes glanduläres Kallikrein-Gentranskriptionsreaktionselement oder transkriptionales Regulationselement" oder "hKLK2-TRE" eine Polynucleotidsequenz, vorzugsweise eine DNA-Sequenz, welche Transkription einer funktionell verknüpften Polynucleotidsequenz in einer Wirtszelle, die einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlaubt, erhöht. Ein hKLK2-TRE umfasst einen hKLK2-Enhancer und einen Promotor. Wie unterhalb diskutiert, kann der Promotor heterolog sein oder kann er nichtheterolog sein. Hierin sind Verfahren für das Messen der Aktivität eines hKLK2-TRE, und folglich zum Bestimmen, ob eine gegebene Zelle einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlaubt, beschrieben.
Eine "funktional konservierte" Variante ("functionally-preserved" variant) eines hKLK2-TRE ist ein hKLK2-TRE, welches sich von einem anderen hKLK2-TRE unterscheidet, welches jedoch nach wie vor die Fähigkeit, Transkription eines funktionell verknüpften Polynucleotids zu erhöhen, beibehält. Der Unterschied bei einem hKLK2-TRE kann bedingt sein durch Unterschiede in der linearen Sequenz, die zurückzuführen sind beispielsweise auf eine einzelne oder mehrfache Basenmutation(en), Addition(en), Deletion(en), Insertion(en) und/oder Modifikation(en) der Basen. Der Unterschied kann auch zurückzuführen sein auf Änderungen bei dem Zucker/den Zuckern und/oder der Verknüpfung/den Verknüpfungen zwischen den Basen eines hKLK2-TRE.
Ein "heterologer" Promotor oder Enhancer ist einer, welcher in einer Zelle normalerweise nicht mit einem hKLK2-Gen assoziiert ist oder von einem hKLK2-Gen abgeleitet ist. Beispiele eines heterologen Promotors oder Enhancers sind der Albumin-Promotor oder -Enhancer und weitere virale Promotoren und Enhancer, wie z. B. SV40.
Im Zusammenhang mit einem hKLK2-TRE ist ein "heterologes Polynucleotid" im Verhältnis zu einer Referenz-Gensequenz definiert. Beispielsweise ist ein heterologes Polynucleotid hinsichtlich eines hKLK2-Promotors oder eines hKLK2-Enhancers ein Gen, das von Natur aus nicht funktionell verknüpft ist mit einem hKLK2-Promotor oder einem hKLK2-Enhancer. Wie hierin verwendet, bezieht sich "heterologes Polynucleotid" auf eine heterologe codierende Sequenz. Eine heterologe codierende Sequenz kann ein Protein codieren. Alternativ kann ein "heterologes Polynucleotid" in eine RNA, beispielsweise eine Antisense-RNA oder ein Ribozym, transkribiert werden.
Der Ausdruck "funktionell verknüpft" bezieht sich auf die Orientierung von Polynucleotid-Elementen in einer funktionalen Beziehung. Ein TRE ist funktionell verknüpft mit einem codierenden Segment, wenn das TRE Transkription der codierenden Sequenz fördert. Funktionell verknüpft bedeutet, dass die DNA-Sequenzen, die verknüpft sind, im Allgemeinen fortlaufend sind und, wo es erforderlich ist, um zwei Protein-codierende Regionen zu verbinden, fortlaufend und in dem gleichen Leserahmen sind. Jedoch können manche Polynucleotid-Elemente funktionell verknüpft, jedoch nicht fortlaufend sein, weil Enhancer im Allgemeinen funktionieren, wenn sie von dem Promotor durch einige Kilobasen getrennt sind, und Intronsequenzen von unterschiedlicher Länge sein können.
Eine Sequenz, ob Polynucleotid oder Polypeptid, "dargestellt in" einem SEQ ID NO bedeutet, dass die Sequenz als eine identische zusammenhängende Sequenz in der Sequenz des SEQ ID NO vorhanden ist. Umgekehrt bedeutet eine zusammenhängende Sequenz die "nicht dargestellt in" einem SEQ ID NO ist, dass die zusammenhängende Sequenz nicht als eine identische zusammenhängende Sequenz in der Sequenz des SEQ ID NO vorhanden ist.
Die Ausdrücke "Polynucleotid" und "Nucleinsäure", die hierin austauschbar verwendet sind, beziehen sich auf eine polymere Form von Nucleotiden einer beliebigen Länge, entweder Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide. Diese Ausdrücke beinhalten ein(e) einzelsträngige(s), doppelsträngige(s) oder dreifachsträngige(s) DNA, genomische DNA, cDNA, RNA, DNA-RNA-Hybrid, oder ein Polymer, umfassend Purin- und Pyrimidin-Basen oder andere natürliche, chemisch modifizierte, biochemisch modifizierte, nicht-natürliche oder derivatisierte Nucleotid-Basen. Das Rückgrat des Polynucleotids kann Zucker(-) und Phosphatgruppen umfassen (wie sie typischerweise in RNA oder DNA gefunden werden), oder modifizierte oder substituierte Zucker(-) oder Phosphatgruppen umfassen. Alternativ kann das Rückgrat des Polynucleotids ein Polymer synthetischer Untereinheiten, wie z. B. von Phosphoramidaten, umfassen, und kann folglich ein Oligodesoxynucleotid-Phosphoramidat (P-NH2) oder ein gemischtes Phosphoramidat-Phosphodiester-Oligomer sein. Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 1841–8; Chaturvedi et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 2318–23; Schultz et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 2966–73. Eine Phosphorthioat („phosphorothiate")-Verknüpfung kann anstelle einer Phosphodiesterverknüpfung verwendet werden. Braun et al. (1988) J. Immunol. 141: 2084–9; Latimer et al. (1995) Mol. Immunol. 32: 1057–1064. Zusätzlich dazu kann ein doppelsträngiges Polynucleotid erhalten werden aus dem einzelsträngigen Polynucleotid-Produkt chemischer Synthese, entweder durch Synthetisieren des komplementären Stranges und Anlagern der Stränge unter geeigneten Bedingungen oder durch Synthetisieren des komplementären Stranges de novo unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit einem geeigneten Primer.
Die Folgenden sind nicht-limitierende Beispiele von Polynucleotiden: ein Gen oder Genfragment, Exons, Introns, mRNA, tRNA, rRNA, Ribozyme, cDNA, rekombinante Polynucleotide, verzweigte Polynucleotide, Plasmide, Vektoren, isolierte DNA einer beliebigen Sequenz, isolierte RNA einer beliebigen Sequenz, Nucleinsäure-Sonden und Primer. Ein Polynucleotid kann modifizierte Nucleotide, wie z. B. methylierte Nucleotide, und Nucleotid-Analoga, Uracyl, andere Zucker(-) und Verknüpfungsgruppen, wie z. B. Fluorribose und Thioat, und Nucleotidzweige umfassen. Die Sequenz der Nucleotide kann durch Nicht-Nucleotid-Komponenten unterbrochen sein. Ein Polynucleotid kann nach Polymerisierung weiter modifiziert werden, wie z. B. durch Konjugation mit einer Markierungs-Komponente. Andere Arten an Modifikationen, die in dieser Definition eingeschlossen sind, sind "Caps", Substitution eines oder mehrerer der natürlich vorkommenden Nucleotide mit einem Analogon, und Einführen von Mitteln für das Befestigen der Polynucleotide an Proteinen, Metallionen, Markierungs-Komponenten, anderen Polynucleotiden oder einem festen Träger. Vorzugsweise ist das Polynucleotid DNA. Wie hierin verwendet, schließt "DNA" nicht nur Basen A, T, C und G ein, sondern schließt beliebige ihrer Analoga oder von modifizierten Formen dieser Basen, wie z. B. methylierte Nucleotide, Internucleotid-Modifikationen, wie z. B. ungeladene Verknüpfungen und Thioate, Verwendung von Zucker-Analoga, und modifizierte und/oder alternative Rückgrat-Strukturen wie z. B. Polyamide, ein.
Ein Polynucleotid oder eine Polynucleotid-Region hat einen gewissen Prozentsatz (beispielsweise 80%, 85%, 90% oder 95%) an "Sequenzidentität" mit einer anderen Sequenz bedeutet, dass, wenn vergleichend angeordnet, dieser Prozentsatz an Basen beim Vergleichen der zwei Sequenzen die gleichen sind. Diese vergleichende Anordnung ("alignment") und die Prozent (an) Homologie oder Sequenzidentität können bestimmt werden unter Verwendung von Softwareprogrammen, die im Fachgebiet bekannt sind, z. B. jenen, die beschrieben sind in Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., Hrsg., 1987), Anlage 30, Abschnitt 7.7.18, Tabelle 7.7.1. Ein bevorzugtes Alignment-Programm ist ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pennsylvania).
Ein "isoliertes" oder "gereinigtes" Polynucleotid ist eines, das im Wesentlichen frei ist von den Materialien, mit welchen es in der Natur assoziiert ist. Durch im Wesentlichen frei ist wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 70%, stärker bevorzugt wenigstens 80%, noch stärker bevorzugt wenigstens 90%, frei von den Materialien, mit welchen es in der Natur assoziiert ist, gemeint. Wie hierin verwendet, bezieht sich ein "isoliertes" Polynucleotid auch auf rekombinante Polynucleotide oder Polypeptide, welche aufgrund von Ursprung oder Manipulation: (1) nicht mit allem oder einem Anteil von einem Polynucleotid oder Polypeptid assoziiert sind, mit welchen es in der Natur assoziiert ist, (2) mit einem anderen Polynucleotid oder Polypeptid verknüpft sind als mit welchem es in der Natur verknüpft ist, oder (3) nicht in der Natur vorkommt.
Wie hierin verwendet, ist "eine Zelle, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlaubt" oder eine Zelle, in welcher die Funktion eines hKLK2-Enhancers und/oder hKLK2-TRE "ausreichend konserviert" ist, oder "eine Zelle, in welcher ein hKLK2-Enhancer und/oder ein hKLK2-TRE funktional ist" eine Zelle, in welcher ein hKLK2-Enhancer und/oder ein hKLK2-TRE, wenn funktionell verknüpft mit einem Promotor und einem Reportergen, Expression des Reportergens wenigstens etwa 2-fach, vorzugsweise wenigstens etwa 5-fach, vorzugsweise wenigstens etwa 10-fach, stärker bevorzugt wenigstens etwa 20-fach, stärker bevorzugt wenigstens etwa 50-fach, stärker bevorzugt wenigstens etwa 100-fach, stärker bevorzugt wenigstens etwa 200-fach, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 400- bis etwa 500-fach, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 1000-fach, erhöht, wenn verglichen mit der Expression des gleichen Promotors und Reportergens, wenn nicht funktionell mit einem hKLK2-Enhancer verknüpft. Verfahren für das Messen von Expressionsleveln (ob relativ oder absolut) sind im Fachgebiet bekannt und sind hierin beschrieben.
Eine "Wirtszelle" schließt eine einzelne Zelle oder Zellkultur ein, welche ein Empfänger irgendeines Polynucleotids/von irgendwelchen Polynucleotiden und/oder Vektors/Vektoren dieser Erfindung sein kann oder gewesen ist. Wirtszellen schließen Nachkommen einer einzelnen Wirtszelle ein, und die Nachkommen müssen nicht notwendigerweise vollständig identisch (bei der Morphologie oder von Gesamt-DNA-Komplement) mit der ursprünglichen Elternzelle sein, bedingt durch natürliche, zufällige oder absichtliche Mutation und/oder Änderung. Eine Wirtszelle beinhaltet Zellen, transfiziert oder infiziert in vivo mit einem Polynucleotid und/oder einem Vektor dieser Erfindung.
Wie hierin verwendet, ist eine "Zielzelle" bzw. "Targetzelle" eine, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlaubt. Vorzugsweise ist eine Zielzelle eine Säugerzelle, vorzugsweise eine Säugerzelle, die Androgen-Rezeptor exprimiert, stärker bevorzugt eine Säugerzelle, die endogenen Androgen-Rezeptor exprimiert, stärker bevorzugt eine menschliche Zelle, und stärker bevorzugt eine menschliche Zelle, die einen Androgen-Rezeptor exprimiert.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Ausdrücke "neoplastische Zellen", "Neoplasie", "Tumor", "Tumorzellen", "Krebs" und "Krebszellen" (die austauschbar verwendet werden) auf Zellen, welche relativ autonomes Wachstum aufweisen, so dass sie einen abweichenden Wachstumsphänotyp aufweisen, der gekennzeichnet ist durch einen signifikanten Verlust der Kontrolle von Zellproliferation. Neoplastische Zellen können maligne oder benigne sein.
Die Ausdrücke "Vektor", "Polynucleotid-Vektor", "Konstrukt" und "Polynucleotid-Konstrukt" werden hierin austauschbar verwendet. Ein Polynucleotid-Vektor dieser Erfindung kann in einer von vielen Formen sein, die folgende einschließen, aber nicht darauf limitiert sind: RNA, DNA, DNA, eingekapselt in einem Adenvirus-Mantel, DNA, verpackt in einer weiteren viralen oder Virus-ähnlichen Form (wie z. B. Herpes simplex und AAV), DNA, eingekapselt in Liposomen, DNA, komplexiert mit Polylysin, komplexiert mit synthetischen Polykation-Molekülen, konjugiert mit Transferrin, komplexiert mit Verbindungen, wie z. B. PEG, um das Molekül immunologisch zu "maskieren" und/oder die Halbwertszeit zu erhöhen, oder konjugiert mit einem nicht-viralen Protein. Ein Polynucleotid-Vektor dieser Erfindung kann in der Form irgendeiner der hierin beschriebenen Abgabevehikel sein. Vorzugsweise ist das Polynucleotid DNA. Wie hierin verwendet, beinhaltet "DNA" nicht nur Basen A, T, C und G, sondern auch irgendwelche ihrer Analoga oder modifizierte Formen dieser Basen, wie z. B. methylierte Nucleotide, Internucleotid-Modifikationen, wie z. B. ungeladene Verknüpfungen und Thioate, Verwendung von Zucker-Analoga, und modifizierte und/oder alternativer Rückgrat-Strukturen, wie z. B. Polyamide.
Ein "Adenovirus-Vektor" oder "adenoviraler Vektor" (austauschbar verwendet) ist ein Ausdruck, der im Fachgebiet gut verstanden wird, und umfasst im Allgemeinen ein Polynucleotid (das hierin definiert ist), das das gesamte oder einen Anteil des Adenovirus-Genoms umfasst. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung enthält ein Adenovirus-Vektor ein hKLK2-TRE, funktionell verknüpft mit einem Polynucleotid. Das funktionell verknüpfte Polynucleotid kann adenoviral oder heterolog sein. Ein adenoviraler Vektor der vorliegenden Erfindung kann in irgendeiner von vielen Formen vorliegen, einschließlich von, jedoch nicht limitiert auf: nackte DNA; ein adenoviraler Vektor, eingekapselt in einem Adenovirus-Mantel; verpackt in einer weiteren viralen oder Virus-ähnlichen Form (wie z. B. Herpes simplex-Virus und AAV); eingekapselt in einem Liposom; komplexiert mit Polylysin oder einem weiteren biokompatiblen Polymer; komplexiert mit synthetischen polykationischen Molekülen; konjugiert mit Transferrin; komplexiert mit Verbindungen, wie z. B. PEG, um das Molekül immunologisch zu "maskieren" und/oder die Halbwertszeit zu erhöhen, oder konjugiert mit einem nicht-viralen Protein. Ein adenoviraler Vektor der Erfindung kann in der Form irgendeines der hierin beschriebenen Abgabevehikel sein. Solche Vektoren sind eine Ausführungsform der Erfindung. Vorzugsweise ist das Polynucleotid DNA. Wie hierin verwendet, beinhaltet "DNA" nicht nur Basen A, T, C und G, sondern beinhaltet auch irgendwelche ihrer Analoga oder modifizierte Formen dieser Basen, wie z. B. methylierte Nucleotide, Internucleotid-Modifikationen, wie z. B. ungeladene Verknüpfungen und Thioate, Verwendung von Zucker-Analoga und modifizierte und/oder alternative Rückgrat-Strukturen, wie z. B. Polyamide. Für die Zwecke dieser Erfindung sind Adenovirus-Vektoren in einer Zielzelle replikationskompetent.
Im Zusammenhang mit einem Adenovirus-Vektor/Adenovirus-Vektoren ist ein "heterologes Polynucleotid" oder "Transgen" irgendein Gen, das nicht in Wildtyp-Adenvirus vorhanden ist. Vorzugsweise wird das Transgen in der Zielzelle vor Einführen durch den Adenovirus-Vektor auch nicht exprimiert werden und darin auch nicht vorhanden sein. Beispiele bevorzugter Transgene sind unten angegeben.
Im Zusammenhang mit einem viralen Vektor, z. B. Adenovirus-Vektor(en), der Erfindung ist ein "heterologer" Promotor oder Enhancer einer, welcher im Wildtyp-Virus nicht vorhanden ist. Beispiele eines heterologen Promotors oder Enhancers sind der Albumin-Promotor oder -Enhancer, und weitere virale Promotoren und Enhancer, wie z. B. SV40.
Im Zusammenhang mit einem Adenovirus-Vektor/Adenovirus-Vektoren ist ein "endogener" Promotor, Enhancer oder ein endogenes TRE für Adenovirus nativ oder stammt von Adenovirus.
Wie hierin verwendet, werden die Ausdrücke "Mittel", "Testverbindung" und "Kandidatenverbindung" austauschbar verwendet und bedeuten eine biologische oder chemische Verbindung, wie z. B. ein einfaches oder ein komplexes organisches oder anorganisches Molekül, ein Peptid, ein Protein oder ein Oligonucleotid. Eine enorm große Aufstellung ("array") von Verbindungen kann synthetisiert werden, beispielsweise Oligomere, wie z. B. Oligopeptide und Oligonucleotide, und synthetische anorganische und organische Verbindungen, basierend auf verschiedenen Kernstrukturen, und diese sind in dem Ausdruck "Mittel" enthalten. Zusätzlich dazu können verschiedene natürliche Quellen, wie z. B. Pflanzen- oder Tier-Extrakte und dergleichen, Verbindungen für das Screenen bereitstellen.
„Unter transkriptionaler Kontrolle" ist ein Ausdruck, der im Fachgebiet gut verstanden wird, und er zeigt an, dass Transkription einer Polynucleotidsequenz, gewöhnlich einer DNA-Sequenz, davon abhängt, dass es funktionell (wirkend) verknüpft ist mit einem Element, welches zur Vereinheitlichung („unification") der Transkription beiträgt oder Transkription fördert.
"Androgen-Rezeptor", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Protein, dessen Funktion es ist, spezifisch an Androgen zu binden und als eine Konsequenz des spezifischen Bindens ein auf Androgen reagierendes Element (ARE, "androgen response element") zu erkennen und daran zu binden, worauf folgend der AR fähig ist, transkriptionale Aktivität zu regulieren. Der AR ist ein nucleärer Rezeptor, der, wenn er aktiviert ist, an ein zelluläres, auf Androgen reagierendes Element/an zelluläre, auf Androgen reagierende Elemente bindet. In normalen Zellen wird der AR durch Androgen aktiviert, jedoch kann der AR in nicht-normalen Zellen (einschließlich maligner Zellen) durch nicht-androgen Mittel, einschließlich anderer Hormone als Androgen, aktiviert werden. In dem Ausdruck "Androgen-Rezeptor" umfasst sind mutierte Formen eines Androgen-Rezeptors, solange die Funktion in ausreichender Weise konserviert ist. Mutanten schließen Androgen-Rezeptoren mit Aminosäureadditionen, Insertionen, Trunkierungen und Deletionen ein, solange die Funktion ausreichenderweise konserviert ist. In diesem Zusammenhang ist ein funktionaler Androgen-Rezeptor einer, der sowohl Androgen als auch, beim Androgenbinden, ein ARE bindet.
Wie hierin verwendet, ist "Cytotoxizität” ein Ausdruck, der im Fachgebiet gut verstanden wird, und bezieht sich auf einen Zustand, bei welchem eine oder mehrere der gewöhnlichen biochemischen oder biologischen Funktionen einer Zelle in aberrierender Weise kompromittiert (d. h., inhibiert oder erhöht) sind. Diese Aktivitäten schließen ein, sind aber nicht limitiert auf Metabolismus; Zellreplikation; DNA-Replikation; Transkription; Translation; Aufnahme von Molekülen. "Cytotoxizität" beinhaltet Zelltod und/oder Cytolyse. Im Fachgebiet sind Assays bekannt, welche Cytotoxizität anzeigen, wie z. B. Farbstoffausschluss ("dye exclusion"), ³H-Thymidin-Aufnahme und Plaque-Assays. Der Ausdruck "selektive Cytotoxizität", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Cytotoxizität, die einer Zelle, welche einem hKLK2-Enhancer zu funktionieren erlaubt, von einem Polynucleotid-Vektor der vorliegenden Erfindung verliehen wird, wenn verglichen mit der Cytotoxizität, die einer Zelle, welche einem hKLK2-Enhancer nicht zu funktionieren erlaubt, durch einen Polynucleotid-Vektor der vorliegenden Erfindung verliehen wird. Solche Cytotoxizität kann beispielsweise gemessen werden durch Plaque-Assays, durch die Reduktion oder Stabilisierung der Größe eines Tumors, umfassend Zielzellen, oder die Reduktion oder Stabilisierung von Serumspiegeln eines Markers, charakteristisch für die Tumorzellen, oder eines Gewebe-spezifischen Markers, z. B. eines Krebsmarkers, wie z. B. Prostata-spezifisches Antigen.
"Replikation" und "Vermehrung" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf die Fähigkeit eines Adenovirus-Vektors der Erfindung, sich zu reproduzieren oder zu proliferieren. Diese Ausdrücke werden im Fachgebiet gut verstanden. Für Zwecke dieser Erfindung beinhaltet Replikation Produktion von Adenovirus-Proteinen und ist im Allgemeinen gerichtet auf Reproduktion von Adenovirus. Replikation kann unter Verwendung von Assays gemessen werden, die im Fachgebiet Standard sind und hierin beschrieben sind, wie z. B. eines " oder eines Plaque-Assays. "Replikation" und "Vermehrung" schließen jede Aktivität ein, die direkt oder indirekt beteiligt ist an dem Prozess der Virusherstellung, einschließlich, aber nicht limitiert auf, virale(r)Genexpression; Produktion viraler Proteine, Nucleinsäuren oder andere(r) Komponenten; Verpacken viraler Komponenten in komplette Viren; und Zelllyse.
Eine "Wirtszelle" schließt eine einzelne Zelle oder Zellkultur ein, welche Empfänger irgendeines Vektors dieser Erfindung sein kann oder gewesen ist. Wirtszellen schließen die Nachkommenschaft einer einzelnen Wirtszelle ein, und die Nachkommenschaft muss, bedingt durch natürliche, zufällige oder absichtliche Mutation und/oder Änderung, nicht notwendigerweise vollständig identisch (bei Morphologie oder bei Gesamt-DNA-Komplement) zu der ursprünglichen Elternzelle sein. Eine Wirtszelle schließt Zellen, transfiziert oder infiziert in vivo mit einem Vektor dieser Erfindung, ein.
Eine "biologische Probe" umfasst eine Vielzahl von Probentypen, erhalten von einem Individuum, und kann in einem diagnostischen Assay oder Überwachungsassay verwendet werden. Die Definition umfasst Blut oder andere flüssige Proben biologischen Ursprungs, feste Gewebeproben, wie z. B. eine Biopsieprobe oder Gewebekulturen oder Zellen, abgeleitet davon, und die Nachkommen davon. Die Definition schließt auch Proben ein, die auf irgendeine Weise nach ihrer Beschaffung manipuliert worden sind, wie z. B. durch Behandlung mit Reagentien, Solubilisierung oder Anreicherung für gewisse Komponenten, wie z. B. Proteine oder Polynucleotide. Der Ausdruck "biologische Probe" umfasst eine klinische Probe und schließt auch Zellen in Kultur, Zellüberstände, Zelllysate, Serum, Plasma, biologische Flüssigkeit und Gewebeproben ein.
Ein "Individuum" ist ein Vertebrat, vorzugsweise ein Säuger, stärker bevorzugt ein Mensch. Säuger schließen ein, sind aber nicht limitiert auf: Nutztiere, Sporttiere und Haustiere.
Eine "effektive Menge" ist eine Menge, ausreichend zum Bewirken nützlicher oder erwünschter klinischer Ergebnisse. Eine wirksame Menge kann in einer oder mehreren Verabreichungen verabreicht werden. Für Zwecke dieser Erfindung ist eine effektive Menge eines Polynucleotid-Vektors eine Menge, die ausreichend ist, um den Fortschritt des Krankheitszustands zu lindern, zu mildern oder zu stabilisieren, umzukehren, zu verlangsamen oder zu verzögern.
Wie hierin verwendet, ist "Behandlung" eine Vorgehensweise zum Erhalten nützlicher oder erwünschter klinischer Ergebnisse. Für Zwecke dieser Erfindung schließen nützliche oder erwünschte klinische Ergebnisse ein, sind aber nicht limitiert auf, Verminderung von Symptomen, Verringerung des Ausmaßes der Krankheit, stabilisierter (d. h., sich nicht verschlechternder) Krankheitszustand der Krankheit, Verhindern des Ausbreitens (d. h. Metastase) der Krankheit, Verzögerung oder Verlangsamen des Krankheitsfortschreitens, Besserung oder Linderung des Krankheitszustands und Remission (ob teilweise oder insgesamt), ob detektierbar oder nicht detektierbar. "Behandlung" kann auch Verlängern des Überlebens, wenn verglichen mit dem erwarteten Überleben, wenn keine Behandlung empfangen wird, bedeuten.
"Lindern" einer Krankheit bedeutet, dass das Ausmaß und/oder unerwünschte klinische Manifestationen eines Krankheitszustandes abgeschwächt werden und/oder der Zeitverlauf des Fortschreitens verlangsamt oder hinausgedehnt wird, wenn verglichen mit dem Nicht-Verabreichen adenoviraler Vektoren der vorliegenden Erfindung.
Humanes glanduläres Kallikrein-Enhancer-Sequenzen
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Polynucleotidsequenzen, abgeleitet von dem hKLK2-Gen, bereit, die wirken, um die Transkription funktionell verknüpfter Polynucleotide in einer Zell-spezifischen Art und Weise zu erhöhen. Diese Sequenzen sind verwendbar beim Kontrollieren der Transkription von Polynucleotidsequenzen, mit welchen sie funktionell verknüpft sind, und folglich können sie außerdem der Expression heterologer Polynucleotide einen Kontrolllevel verleihen. Diese Sequenzen, oder ein transkriptionales Regulationselement, welches sie bilden, können zum Teil dadurch charakterisiert sein, dass sie mit einer Polynucleotidsequenz verknüpft sind, deren Expression sie regulieren.
Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung hKLK2-Enhancer-Polynucleotide, Vektoren, enthaltend diese Polynucleotide, Wirtszellen, enthaltend diese Polynucleotide, und Zusammensetzungen, umfassend diese Polynucleotide. Diese Polynucleotide werden mittels chemischer und/oder rekombinanter Verfahren oder mittels einer Kombination dieser Verfahren isoliert und/oder produziert. Wenn nicht spezifisch etwas anderes angegeben ist, sollen "Polynucleotide" alle Ausführungsformen des Polynucleotids dieser Erfindung einschließen. Diese Poly nucleotide sind als Sonden und Primer in Expressionssystemen und in Screeningverfahren, wie hierin beschrieben, verwendbar.
hKLK2-Enhancer-Aktivität wird innerhalb der Nucleotide 1 bis 9765 von SEQ ID NO:1 gefunden (was –12014 bis –2257 relativ zur Transkriptionsstartstelle entspricht). Wie hierin beschrieben, sind Teile dieser Region identifiziert worden, welche Enhancer-Funktion beibehalten. Enhancer-Aktivität ist in der Region von Nucleotiden 8021 bis 8371 von SEQ ID NO:1 gezeigt worden (was –3993 bis –3643 relativ zur Transkriptionsstartstelle entspricht), wie in Beispiel 7 gezeigt. Demgemäß schließt die Erfindung eine isolierte Polynucleotidsequenz ein, die Nucleotide von etwa 8021 bis etwa 8371 von SEQ ID NO:1 umfasst. Enhancer-Aktivität ist auch gezeigt worden in der Region von Nucleotiden 7200 bis 8371 von SEQ ID NO:1 (was –4814 bis –3643 relativ zur Transkriptionsstartstelle entspricht), wie in Beispiel 7 gezeigt. Demgemäß schließt die Erfindung eine isolierte Polynucleotidsequenz ein, die Nucleotide von etwa 7200 bis etwa 8371 von SEQ ID NO:1 umfasst. Enhancer-Aktivität ist ferner in der Region von 6859 bis 8627 von SEQ ID NO:1 (–5155 bis –3387, relativ zur Transkriptionsstartstelle) demonstriert worden, wie in Beispiel 6 gezeigt. Demgemäß schließt die Erfindung eine isolierte Polynucleotidsequenz ein, die Nucleotide von etwa 6859 bis etwa 8627 von SEQ ID NO:1 umfasst. Enhancer-Aktivität ist in der Region von 5976 bis 9620 von SEQ ID NO:1 (–6038 bis –2394, relativ zur Transkriptionsstartstelle) gezeigt worden. Demgemäß schließt die Erfindung eine isolierte Polynucleotidsequenz ein, die Nucleotide von etwa 5976 bis etwa 9620 von SEQ ID NO:1 umfasst. Ein aktiver Enhancer liegt innerhalb eines XhoI-ApaI-Fragments, das sich über eine Region von etwa 2 bis etwa 6 kb stromaufwärts des hKLK2-Strukturgens erstreckt. Demgemäß schließt die Erfindung weiterhin ein isoliertes Polynucleotid ein, das Nucleotide von etwa 1 bis etwa 9765 von SEQ ID NO:1 umfasst. Für jede dieser Ausführungsformen weist das Polynucleotid Enhancer-Aktivität auf.
Eine hKLK2-Enhancer-Sequenz, die sich von 5976 bis 9620 von SEQ ID NO:1 erstreckt, teilt sich ungefähr 75% Gesamt-Nucleotidsequenz-Identität mit einem Prostata-spezifisches Antigen-Enhancer (PSE). Wie in 2 gezeigt, teilt sich eine hKLK2-Enhancer-Sequenz, die sich über Nucleotide 7272 bis 9498 von SEQ ID NO:1 erstreckt, 79% Sequenzidentität mit einem Anteil von 2187 Nucleotiden eines PSE (Nucleotide 775 bis 2961 der in SEQ ID NO:2 angegebenen Sequenz; GenBank Eingangs-Nr. U37672). Weiterhin teilt sich ein hKLK2-Enhancer von 8021 bis 8458 von SEQ ID NO:1 84% Sequenzidentität mit Nucleotiden 1500 bis 1940 des PSA-TRE, angegeben als SEQ ID NO:2, wie in 2 gezeigt.
Wie oben angemerkt, ist der PSE und der PSA-Promotor, dargestellt in SEQ ID NO:2, das/der gleiche, wie der/das, angegeben in GenBank Eingangs-Nr. U37672, und veröffentlicht. Schuur et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 7043–7051. Eine abweichende ("variant") PSA-TRE-Nucleotid-Sequenz ist in SEQ ID NO:3 dargestellt. Dies ist das PSA-TRE, enthalten innerhalb von CN706-Klon 35.190.13. CN706 ist ein adenoviraler Vektor, in welchem das E1A-Gen in Ad5 unter transkriptionaler Kontrolle eines PSA-TRE ist. CN706 zeigt selektive Cytotoxizität gegenüber PSA-exprimierenden Zellen in vitro und in vivo. Rodriguez et al. (1997) Cancer Res. 57: 2559–2563. CN706 wurde durch 293- und LNCaP-Zellen passagiert. Ein Klon, bezeichnet als 35.190.13, wurde isoliert. Die Struktur dieses Klons wurde mittels PCR, Restriktionsendonuclease-Verdau und Southern-Blotting bestätigt. Beide DNA-Stränge des CN706-Klons 35.190.13 wurden zwischen den Positionen 1 und 3537 sequenziert. Sieben einzelne Basenpaar-Austausche wurden in dem PSE, verglichen mit der Sequenz, die von Schuur et al. (1996) angezeigt wurde, gefunden. Diese Punktmutationen liegen nicht in dem ARE, und es ist folglich nicht wahrscheinlich, dass sie die Funktion des Enhancers beeinträchtigen. Eine Mutation wurde in der PSA-Promotorregion gefunden, es ist jedoch nicht wahrscheinlich, dass sie die Genexpression von diesem Promotor beeinträchtigt. Zusätzlich zu diesen Mutationen wurde eine Fehlsinn-Mutation in dem ersten Exon von E1A gefunden. Dieser C-zu-G-Übergang an Position 3032 resultiert in einem Glu-zu-Arg-Austausch in der E1A-Proteinsequenz. Diese Mutation scheint E1A-Funktion nicht zu verringern.
Wie in Beispiel 7 gezeigt, ist ein hKLK2-Enhancer, der Nucleotide 6859 bis 8627 von SEQ ID NO:1 umfasst, Androgen-induzierbar. Das Konstrukt CN408 umfasst diesen Anteil eines hKLK2-Enhancers, funktionell verknüpft mit einem SV40-Promotor und einem Reportergen, das für Luciferaseaktivität codiert. Bei Androgen-Induktion wurde eine 80-fache Zunahme an Luciferaseaktivität beobachtet. Wie in 11 gezeigt, ist ein mutmaßliches ARE bei Nucleotiden 8192 bis 8206 von SEQ ID NO:1 lokalisiert.
Demgemäß kann ein hierin beschriebener hKLK2-Enhancer etwa 100 zusammenhängende Nucleotide, etwa 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 1700, 2000 zusammenhängende Nucleotide der in den Nucleotiden 1 bis 11.407 von SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz oder länger sein. Beispiele 6 und 7 stellen Verfahren bereit, die demonstrieren, dass verschiedene hKLK2-Enhancer-Sequenzen zusammen mit einem Promotor Transkription eines funktionell verknüpften heterologen Polynucleotids in Reaktion auf Androgen erhöhen. Ähnliche Verfahren können verwendet werden für das Identifizieren anderer hKLK2-Enhancer-Sequenzen. Andere Verfahren für das Identifizieren einer hKLK2-Enhancer-Sequenz sind Routine und im Fachgebiet gut bekannt. Beispielsweise können überlappende Sequenzen eines hKLK2-Enhancers synthetisiert werden und in den in Beispiel 2 beschriebenen Vektor kloniert werden, um hKLK2-Enhancer-Aktivität zu bestimmen. In ähnlicher Weise können Punktmutationen in die offenbarten hKLK2-Enhancer-Sequenzen unter Verwendung von beispielsweise ortsgerichteter Mutagenese oder durch Synthetisieren von Sequenzen, die an einer oder mehreren vorbestimmten Positionen Zufallsnucleotide aufweisen, eingeführt werden und hKLK2-Enhancer-Aktivität bestimmt werden.
Als ein Beispiel dafür, wie hKLK2-Enhancer-Aktivität bestimmt werden kann, kann eine Polynucleotidsequenz oder ein Satz an solchen Sequenzen unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren, wie z. B. chemischer Synthese, ortsgerichteter Mutagenese, PCR und/oder rekombinanter Verfahren, generiert werden. Die Sequenz(en), die getestet werden soll(en), kann/können in einen Vektor insertiert werden, der einen Promotor und ein geeignetes Reportergen, codierend ein Reporterprotein, einschließlich von, jedoch nicht limitiert auf, Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), β-Galactosidase (codiert von dem IacZ-Gen), Luciferase (codiert von dem luc-Gen), alkalische(r) Phosphatase, -fluoreszierendes/m Protein und Meerrettichperoxidase, enthält. Solche Vektoren und Assays sind beispielsweise von, unter anderem, kommerziellen Quellen leicht erhältlich. So konstruierte Plasmide werden in eine geeignete Wirtszelle transfiziert unter Verwendung im Fachgebiet bekannter Transfektionsverfahren, wie z. B. Calciumphosphat-Präzipitation, Elektroporation, Liposomen (Lipofektion) und DEAE-Dextran, um auf die Expression des Reportergens, wie kontrolliert durch den mutmaßlichen hKLK2-Enhancer, zu testen.
Hierin beschrieben ist ein isoliertes Polynucleotid, das 150 zusammenhängende Nucleotide der Nucleotide von etwa 1 bis etwa 11.407 von SEQ ID NO:1 umfasst, jedoch nicht in SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3 dargestellt ist, und Enhancer-Aktivität aufweist. Die 150 zusammenhängenden Nucleotide können Nucleotide umfassen, die innerhalb der Nucleotide von etwa 5976 bis etwa 9620 von SEQ ID NO:1 gefunden werden. Die 150 zusammenhängenden Nucleotide können Nucleotide umfassen, die innerhalb der Nucleotide von etwa 6859 bis etwa 8627 von SEQ ID NO:1 gefunden werden. Die 150 zusammenhängenden Nucleotide können Nucleotide umfassen, die innerhalb der Nucleotide von etwa 7200 bis etwa 8371 von SEQ ID NO:1 gefunden werden. Die 150 zusammenhängenden Nucleotide können Nucleotide umfassen, die innerhalb der Nucleotide von etwa 8021 bis etwa 8371 von SEQ ID NO:1 gefunden werden. Wie oben angemerkt, kann Enhancer-Aktivität in/bei unterschiedlichen Längen von SEQ ID NO:1 (sowie in verschiedenen Regionen von SEQ ID NO:1) gefunden werden, und kann folglich auch eine längere zusammenhängende Nucleotidsequenz aufweisen. Bei beliebigen und all diesen Polynucleotiden wird verstanden, dass die zusammenhängenden Nucleotide nicht in SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3 dargestellt sind.
Auch hierin beschrieben ist ein isoliertes Polynucleotid, umfassend 150 zusammenhängende Nucleotide, mit wenigstens etwa 70%, stärker bevorzugt wenigstens etwa 75%, stärker bevorzugt wenigstens etwa 80%, stärker bevorzugt wenigstens etwa 85%, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 90%, noch stärker bevorzugt mehr als 90% Sequenzidentität zu einer Sequenz innerhalb von SEQ ID NO:1, wobei das Polynucleotid Enhancer-Aktivität aufweist. Wie oben angemerkt, kann Enhancer-Aktivität in/bei verschiedenen Längen von SEQ ID NO:1 (sowie in verschiedenen Regionen von SEQ ID NO:1) gefunden werden und kann folglich auch eine längere zusammenhängende Nucleotidsequenz aufweisen. Für diese Polynucleotide können die zusammenhängenden Nucleotide wenigstens etwa 75%, wenigstens etwa 85%, wenigstens etwa 90% oder wenigstens etwa 95% Sequenzidentität mit einer Sequenz von (d. h., innerhalb von) SEQ ID NO:1 aufweisen. Bei beliebigen und allen dieser Polynucleotide wird verstanden, dass die zusammenhängenden Nucleotide nicht in SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3 dargestellt sind.
Im Hinblick auf Hybridisierungsbedingungen sind, je höher die erforderliche Sequenzidentität ist, die Hybridisierungsbedingungen um so strenger, wenn solche Sequenzen durch ihr Vermögen, an eine Sequenz von SEQ ID NO:1 zu hybridisieren, bestimmt werden. Dementsprechend beschreiben wir auch Polynucleotide, die in der Lage sind, an eine Sequenz zu hybridisieren, die wenigstens etwa 15 zusammenhängende Nucleotide (oder mehr, wie z. B. etwa 25, 35, 50, 75 oder 100 zusammenhängende Nucleotide) von SEQ ID NO:1 umfasst. Die Hybridisierungsbedingungen wären stringent, d. h., 80°C (oder eine höhere Temperatur) und 6M SSC (oder weniger konzentriertes SSC). Für eine Diskussion bezüglich Hybridisierungsbedingungen siehe unten.
Hybridisierungsreaktionen können unter Bedingungen unterschiedlicher "Stringenz" durchgeführt werden. Bedingungen, die die Stringenz einer Hybridisierungsreaktion erhöhen, sind ("of") im Fachgebiet weit bekannt und publiziert. Siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989). Beispiele relevanter Bedingungen schließen ein (in der Reihenfolge zunehmender Stringenz): Inkubationstemperaturen von 25°C, 37°C, 50°C und 68°C; Pufferkonzentrationen von 10 X SSC, 6 X SSC, 1 X SSC, 0,1 X SSC (wobei SSC 0,15 M NaCl und 15 mM Citratpuffer ist) und ihre Äquivalente unter Verwendung anderer Puffersysteme; Formamid-Konzentrationen von 0%, 25%, 50% und 75%; Inkubationszeiten von 5 Minuten bis 24 Stunden; 1, 2 oder mehr Waschschritte; Waschinkubationszeiten von 1, 2 oder 15 Minuten; und Waschlösungen von 6 X SSC, 1 X SSC, 0,1 X SSC oder entionisiertem Wasser.
"T_m" ist die Temperatur in Grad Celsius, bei welcher 50% eines Polynucleotid-Duplexes bzw. -Doppelstrangs, gebildet aus komplementären Strängen, die in anti-paralleler Richtung mittels Watson-Crick-Basenpaarung über Wasserstoffbrücken gebunden sind, in einzelne Stränge unter den Bedingungen des Experiments dissoziieren. T_m kann vorhergesagt werden gemäß einer Standardformel, wie z. B.: Tm = 81,5 + 16,6 log[X+] + 0,41(%G/C) – 0,61(%F) – 600/Lwobei [X⁺] die Kationenkonzentration (gewöhnlich Natriumion, Na⁺) in mol/l ist; (%G/C) die Anzahl von G- und C-Resten als ein Prozentsatz an Gesamtresten in dem Duplex ist; (%F) der Prozentsatz Formamid in Lösung (Gewicht/Volumen) ist; und L die Anzahl von Nucleotiden in jedem Strang des Duplex ist.
Hierin außerdem beschrieben ist ein isoliertes Polynucleotid von wenigstens etwa 15 Nucleotiden Länge (vorzugsweise etwa 30, stärker bevorzugt wenigstens 100, stärker bvorzugt wenigstens etwa 150, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 200, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 250, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 300, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 400, und am bevorzugtesten wenigstens 450), das einschließt (a) einen Strang, welcher unter stringenten Bedingungen an eine DNA hybridisiert, die die Sequenz von SEQ ID NO:1 aufweist, (b) das Komplement davon oder (c) eine doppelsträngige DNA, die sowohl (a) als auch (b) einschließt. Mehrfachkopien dieser isolierten DNA (verwendbar beispielsweise als eine Hybridisierungssonde oder ein PCR-Primer) können durch rekombinante Mittel, durch Transfi zieren einer Zelle mit einem Vektor, enthaltend diese DNA, produziert werden. Bei beliebigen und allen diesen Polynucleotiden versteht sich, dass die zusammenhängenden Nucleotide nicht in SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3 dargestellt sind.
Stringente Bedingungen für sowohl DNA/DNA- als auch DNA/RNA-Hybridisierung sind wie von Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, welches hierin mittels Referenz inkorporiert ist, beschrieben. Siehe beispielsweise Seite 7.52 von Sambrook et al.
Eine hKLK2-Enhancer-Sequenz umfasst ein ARE. Wie in 11 gezeigt, ist ein intaktes ARE für hKLK2-Enhancer-Aktivität erforderlich. Eine hKLK2-Enhancer-Sequenz trägt ausreichend Informationen, wenn funktionell verknüpft mit einem Promotor, um Transkription eines heterologen (nicht-hKLK2)-Polynucleotids in einem Ausmaß zu erhöhen, welches größer ist als der Transkriptionslevel, der von einem Promotor selbst bewirkt wird. Demgemäß kann eine hKLK2-Enhancer-Sequenz von unterschiedlichen Langen sein, solange die erforderliche Funktion in ausreichendem Maße erhalten („preserved") ist.
Vorzugsweise enthält ein hKLK2-Enhancer Nucleotide von etwa –3822 bis etwa –3808, relativ zur Transkriptionsstartstelle (Nucleotide von etwa 8192 bis etwa 8206 von SEQ ID NO:1). Diese Nucleotidsequenz teilt sich signifikante Nucleotidsequenzidentität mit einem Konsensus-ARE. Beato (1989) Cell 56: 335–344; und Cleutjens et al. (1997) Molec. Endocrinol. 11: 148–161. Wir haben gezeigt (11 und Beispiel 7), dass Mutationen in dieser Region Enhancer-Aktivität beseitigen.
Ein hKLK2-Enhancer kann einen Teil eines hKLK2-Transkriptionsregulationelements, oder hKLK2-TRE, bilden, bei welchem ein hKLK2-Enhancer funktionell verknüpft ist mit einem Promotor, welcher wiederum funktionell verknüpft sein kann mit einem heterologen Polynucleotid, d. h. einem Gen, das normalerweise nicht funktionell verknüpft ist mit einem hKLK2-Promotor oder einem hLKL2-Enhancer. Ein hKLK2-TRE würde die Expression eines funktionell verknüpften Gens vorzugsweise in jenen Zellen erhöhen, welche einem hKLK2-Enhancer zu funktionieren erlauben. Demgemäß stellt die Erfindung außerdem ein isoliertes Polynucleotid bereit, das ein transkriptionales Regulationselement bzw. Transkriptionsregulationselement umfasst, wobei das transkriptionale Regulationselement einen hKLK2-Enhancer und einen Promotor umfasst. Der Promotor kann heterolog sein oder kann ein hKLK2-Promotor sein (beispielsweise Nucleotide von etwa 11.290 bis etwa 12.047 von SEQ ID NO:1).
Beispiele heterologer Polynucleotide, welche funktionell verknüpft sein können mit einem hKLK2-Enhancer und einem Promotor schließen ein, sind aber nicht limitiert auf: Reportergene, Gene, codierend Verbindungen, die toxisch für Säugerzellen sind, Gene, codierend Modifikatoren biologischer Reaktion ("biological response modifiers"), Lymphokine, Cytokine, Zelloberflächen-Antigene, synthetische Gene, welche die Synthese von Ribozymen oder Antisense-Ribonucleotiden steuern, und Gene, codierend Transkriptionsfaktoren.
Markergene oder Reportergene, welche eingesetzt werden können, sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Luciferase; Aequorin ("aequorian")(d. h., grün-fluoreszierendes Protein von Aequorea Victoria); β-Galactosidase, Chloramphenicol-Acetyltransferase; immunologisch detektierbare Protein-"Tags", wie z. B. humanes Wachstumshormon; und dergleichen. Siehe beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., Hrsg., 1987) und periodische Aktualisierungen. Ein beliebiger Assay, welcher ein Produkt des Reportergens, entweder durch direktes Detektieren des von dem Reportergen codierten Proteins oder durch Detektieren eines enzymatischen Produkts eines Reportergen-codierten Enzyms, detektiert, ist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Assays schließen colorimetrische Assays, fluorimetrische Assays oder Lumineszenz-Assays, oder sogar, im Fall von Protein-Tags, Radioimmunoassays oder andere immunologische Assays ein.
Toxingene können das Diphtherietoxin-A-Kette-Gen, das Ricin-A-Kette-Gen, das Pseudomonas-Exotoxin-Gen etc., einschließen. Maxwell et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:1576; Frankel et al. (1989) Mol Cell. Biol. 9:415; Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 4574. Solche Toxine sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Andere Toxingene können mutierte oder trunkierte bzw. verkürzte Formen natürlich vorkommender Proteine einschließen, welche das korrekte Funktionieren der natürlich vorkommenden Formen kompetitiv oder nicht-kompetitiv inhibieren, und welche dadurch die Zelle töten können. Alternativ kann ein Toxingen ein Gen umfassen, das, wenn exprimiert, Apoptose verursacht.
Lymphokine und Cytokine sind im Fachgebiet bekannt und schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Interleukine, Interferone, Kolonie-stimulierende Faktoren, etc.
Zelloberflächen-Antigene schließen jene ein, welche normalerweise nicht auf der Oberfläche einer gegebenen Zelle exprimiert werden, und resultieren in erhöhter Immuncytotoxizität oder Immunreaktivität gegenüber der Zelle.
Synthetische Gene, welche die Synthese von Ribozymen oder Antisense-Ribonucleotiden steuern, können auch mit einem hKLK2-Enhancer und einem Promotor funktionell verknüpft sein. Antisense-RNA- und (-)DNA-Moleküle und Ribozyme können dergestalt funktionieren, dass sie Translation eines Proteins inhibieren. S.T. Crooke und B. Lebleu, Hrsg., Antisense Research and Applications (1993) CRC Press; und Antisense RNA and DNA (1988), D.A. Melton, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Antisense-RNA- und (-)DNA-Moleküle wirken, indem sie direkt die Translation von mRNA durch Binden an als Ziel gesetzte bzw. targetierte mRNA blockieren und Proteintranslation verhindern. Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die fähig sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Der Mechanismus der Ribozymwirkung beinhaltet Sequenz-spezifische Wechselwirkung des Ribozymmoleküls mit komplementärer, als Ziel gesetzter RNA, gefolgt von einer endonucleolytischen Spaltung. Innerhalb des Umfangs der Erfindung sind konstruierte Hammerkopf- Ribozymmoleküle oder Ribozymmoleküle mit einem anderen Motiv, die spezifisch und effizient endonucleolytische Spaltung von RNA-Sequenzen katalysieren.
Zusammensetzungen, die ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid umfassen, sowie Zusammensetzungen, die ein hKLK2-TRE umfassen, das funktionell verknüpft ist mit einem heterologen Polynucleotid, sind von dieser Erfindung umfasst. Wenn diese Zusammensetzungen pharmazeutisch verwendet werden sollen, werden sie mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipiens kombiniert. Demgemäß stellt die Erfindung auch Zusammensetzungen dieser Polynucleotide bereit, einschließlich von Zusammensetzungen, die diese Polynucleotide und ein pharmazeutisches Exzipiens umfassen, sowie pharmazeutische(n) Zusammensetzungen, die diese Vektoren umfassen. Pharmazeutische Exzipientien sind im Fachgebiet gut bekannt und brauchen hierin nicht im Detail beschrieben werden. Siehe beispielsweise Remington: The Science and Practise of Pharmacy (19. Auflage, 1995), Gennaro, Hrsg.
Herstellung von hKLK2-Enhancer-Polynucleotiden der Erfindung
Die hKLK2-Enhancer-Polynucleotide dieser Erfindung können unter Verwendung von chemischer Synthese, rekombinanten Verfahren oder PCR erhalten werden.
Verfahren zur chemischen Polynucleotidsynthese sind im Fachgebiet gut bekannt und brauchen hierin nicht im Detail beschrieben zu werden. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann die hierin bereitgestellten Sequenzen und einen kommerziellen DNA-Synthetisierer benutzen, um eine gewünschte DNA-Sequenz herzustellen.
Für das Herstellen von hKLK2-Enhancer-Polynucleotiden unter Verwendung rekombinanter Verfahren kann ein Polynucleotid, das eine erwünschte Sequenz umfasst, in einen geeigneten Vektor insertiert werden, und kann der Vektor wiederum in eine geeignete Wirtszelle zur Replikation und Amplifikation eingeführt werden. Polynucleotide können in Wirtszellen mittels irgendwelcher im Fachgebiet bekannter Verfahren insertiert werden. Zellen werden durch Einführen eines exogenen Polynucleotids mittels direkter Aufnahme, Endocytose, Transfektion, "f-mating" oder Elektroporation transformiert. Sobald es eingeführt ist, kann das exogene Polynucleotid innerhalb der Zelle als ein nicht-integrierter Vektor (wie z. B. ein Plasmid) oder integriert in das Wirtszellgenom aufrechterhalten werden. Das so amplifizierte Polynucleotid kann aus der Wirtszelle durch innerhalb des Fachgebiets gut bekannte Verfahren isoliert werden. Siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989).
Alternativ erlaubt PCR Reproduktion von DNA-Sequenzen. PCR-Technologie ist im Fachgebiet gut bekannt und beschrieben in US-Patenten Nm. 4 683 195 , 4 800 159 , 4 754 065 und 4 683 202 , sowie in PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., Hrsg., Birkauswer Press, Boston (1994).
RNA kann erhalten werden durch Verwenden der isolierten DNA in einem geeigneten Vektor und Insertieren derselben in eine geeignete Wirtszelle. Wenn die Wirtszelle repliziert und die DNA in RNA transkribiert wird, kann die RNA dann isoliert werden unter Verwendung von dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannten Verfahren, wie z. B. dargelegt in Sambrook et al. (1989). RNA kann auch durch in vitro-Reaktionen erhalten werden. Ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid kann in einen Vektor insertiert werden, der geeignete Transkriptionspromotor-Sequenzen enthält. Kommerziell erhältliche RNA-Polymerasen werden an ihren Promotorstellen spezifisch Transkription initiieren und den Transkriptionsprozess durch die angrenzenden DNA-Polynucleotide fortsetzen. Das Platzieren von hKLK2-Enhancer-Polynucleotiden zwischen zwei solche Promotoren erlaubt die Generierung von Sinn- oder Gegensinn-Strängen von hKLK2-Enhancer-RNA.
Klonierungs- und Expressionsvektoren, umfassend ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid
Die vorliegende Erfindung beinhaltet weiterhin eine Vielzahl von Vektoren (d. h., Klonierungs- und Expressionsvektoren), die darin kloniert hKLK2-Enhancer-Polynucleotid(e) aufweisen. Diese Vektoren können verwendet werden zur Expression rekombinanter Polypeptide sowie als eine Quelle für hKLK2-Enhancer-Polynucleotide. Klonierungsvektoren können verwendet werden, um replizierte Kopien („replicate copies") der hKLK2-Enhancer-Polynucleotide, die sie enthalten, zu erhalten, oder als ein Mittel für die Lagerung an einem Aufbewahrungsort für zukünftige Rückgewinnung. Expressionsvektoren (und Wirtszellen, die diese Expressionsvektoren enthalten) können verwendet werden, um Polypeptide zu erhalten, die aus den Polynucleotiden, die sie enthalten, hergestellt sind. Sie können auch verwendet werden, wo es wünschenswert ist in einem Individuum Polypeptide, codiert von einem funktionell verknüpften Polynucleotid, zu exprimieren, wie z. B. für das Auslösen einer Immunreaktion mittels des/der Polypeptid/Polypeptide, codiert in dem Expressionsvektor/den Expressionsvektoren. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren beinhalten jegliche im Fachgebiet bekannte, z. B. jene zur Verwendung in bakteriellen Expressionssystemen, Säuger-, Hefe- und Insektenexpressionssystemen. Spezifische Vektoren und geeignete Wirtszellen sind im Fachgebiet bekannt und brauchen hierin nicht im Detail beschrieben zu werden. Beispielsweise siehe Gacesa und Ramji, Vectors, John Wiley & Sons (1994).
Klonierungs- und Expressionsvektoren enthalten typischerweise einen selektierbaren Marker bzw. eine selektierbare Markierung (beispielsweise ein Gen, das ein Protein codiert, das notwendig ist für das Überleben oder das Wachstum einer Wirtszelle, die mit dem Vektor transformiert ist), obwohl ein solches Markergen auf einer weiteren Polynucleotidsequenz getragen werden kann, die in die Wirtszelle co-eingeführt wird. Nur jene Wirtszellen, in welche ein selektierbares Gen eingeführt worden ist, werden unter Selektionsbedingungen überleben und/oder wachsen. Typische Selektionsgene codieren ein Protein/Proteine, das/die (a) Resistenz verleiht/verleihen gegenüber Antibiotika oder anderen Toxin-Substanzen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat, etc.; (b) auxotrophe Mängel komplementiert/komplementieren; oder (c) kritische Nährstoffe liefert/liefern, die von komplexem Medium nicht verfügbar sind. Die Auswahl des geeigneten Markergens wird von der Wirtszelle abhängen, und geeignete Gene für unterschiedliche Wirte sind im Fachgebiet bekannt. Klonierungs- und Expressionsvektoren enthalten typischerweise außerdem ein Replikationssystem, das von dem Wirt erkannt wird.
Geeignete Klonierungsvektoren können gemäß Standardtechniken konstruiert werden oder können ausgewählt werden aus einer großen Anzahl von im Fachgebiet erhältlichen Klonierungsvektoren. Während der Klonierungsvektor, der ausgewählt ist, gemäß der Wirtszelle, deren Verwendung beabsichtigt ist, variieren kann, werden verwendbare Klonierungsvektoren im Allgemeinen die Fähigkeit zur Seibstreplikation aufweisen, können sie ein einzelnes Ziel bzw. Target für eine spezielle Restriktionsendonuklease besitzen und/oder können sie Gene für einen Marker tragen, der beim Selektieren von Klonen, die den Vektor enthalten, verwendet werden kann. Geeignete Beispiele schließen Plasmide und bakterielle Viren, z. B. pUC18, pUC19, Bluescript (z. B. pBS SK+) und seine Derivate, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, Phagen-DNAs und Shuttle-Vektoren, wie z. B. pSA3 und pAT28, ein. Diese und viele andere Klonierungsvektoren sind erhältlich von kommerziellen Verkäufern, wie z. B. von BioRad, Strategene und Invitrogen. Die hierin bereitgestellten Beispiele liefern auch Beispiele von Klonierungsvektoren.
Expressionsvektoren sind im Allgemeinen replizierbare Polynucleotidkonstrukte, die ein Polynucleotid enthalten, das ein Polypeptid von Interesse codiert. Das Polynucleotid, das das Polypeptid von Interesse codiert, ist funktionell verknüpft mit geeigneten transkriptionalen Kontrollelementen bzw. Transkriptionskontrollelementen, wie z. B. Promotoren, Enhancern und Terminatoren. Zur Expression (d. h. Translation) sind gewöhnlich auch ein oder mehrere translationale Kontrollelemente erforderlich, wie z. B. Ribosomenbindungsstellen, Translationsstartstellen und Stoppcodons. Diese Kontrollelemente (transkriptionale und translationale) können abgeleitet sein von hKLK2-Polynucleotiden (z. B. dem hKLK2-Gen) oder sie können heterolog sein (d. h., abgeleitet von anderen Genen und/oder anderen Organismen). Eine Polynucleotidsequenz, die ein Signalpeptid codiert, kann auch eingeschlossen werden, um einem Polypeptid, das von einem funktionell verknüpften Polynucleotid codiert wird, zu erlauben, Zellmembranen zu überqueren und/oder darin zu verbleiben („lodge"), oder aus der Zelle sezerniert zu werden. Eine Anzahl von Expressionsvektoren, geeignet zur Expression in eukaryotischen Zellen, einschließlich von Hefe-, Vogel- und Säugerzellen, sind im Fachgebiet bekannt. Beispiele von Säuger-Expressionsvektoren enthalten sowohl eine prokaryotische Sequenz, um die Vermehrung des Vektors in Bakterien zu erleichtern, als auch eine oder mehrere eukaryotische Transkriptionseinheiten, die in eukaryotischen Zellen exprimiert werden. Beispiele von Säuger-Expressionsvektoren, die geeignet sind zur Transfektion von eukaryotischen Zellen, schließen die Vektoren pcDNAI/amp, pcDNAUneo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pRSVneo und pHygabgeleitete Vektoren ein. Alternativ können Derivate von Viren, wie z. B. des Rinderpapillomavirus (BPV-1) oder Epstein-Barr-Virus (pHEB(-), pREP-abgeleitete Vektoren), zur Expression in Säugerzellen verwendet werden. Beispiele von Expressionsvektoren für Hefesysteme schließen YEP24, YIP5, YEP51, YEP52, YES2 und YRP17 ein, welche Klonierungs- und Expressionsvehikel sind, die verwendbar sind zur Einführung von Konstrukten in S. cerevisiae. Broach et al. (1983) Experimental Manipulation of Gene Expression, Hrsg. M. Inouye, Academic Press, S. 83. Andere übliche Vektoren, wie z. B. YEP13, und die Sikorski-Reihe pRS303–306, 313–316, 423–426 können auch verwendet werden. Vektoren pDBV52 und pDBV53 sind geeignet zur Expression in C. albicans. Baculovirus-Expressionsvektoren zur Expression in Insektenzellen schließen pVL-abgeleitete Vektoren (wie z. B. pVL1392, pVL1393 und pVL941), pAcUW-abgeleitete Vektoren und pBlueBac-abgeleitete Vektoren ein.
Ein Vektor, der ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid umfasst, kann in eine Wirtszelle und/oder eine Zielzelle bzw. Targetzelle eingeführt werden mittels irgendeines einer Anzahl geeigneter Mittel, einschließlich von Elektroporation, Transfektion unter Einsatz von Calciumchlorid, Rubidiumchlorid, Calciumphosphat, DEAE-Dextran oder anderen Substanzen; Mikroprojektil-Beschuss; Lipofektion; und Infektion (wobei der Vektor ein infektiöses Mittel, wie z. B. ein Vaccinia-Virus, ist). Die Wahl der Mittel zum Einführen von Vektoren oder hKLK2-Enhancer-Polynucleotiden wird oft von der Wirtszelle oder Zielzelle abhangen. Ein Vektor, der ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid umfasst, kann auch in der Form eines Abgabevehikels, das unten beschrieben ist, an eine Wirtszelle und/oder eine Zielzelle abgeliefert werden.
Abgabevehikel, enthaltend ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Abgabevehikel, geeignet zur Abgabe eines hKLK2-Enhancer-Polynucleotids in Zellen (ob in vivo, ex vivo oder in vitro) bereit. Im Allgemeinen wird ein hKLK2-Enhancer funktionell verknüpft sein mit einem Promotor und einem heterologen Polynucleotid. Ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid kann innerhalb eines Klonierungs- oder Expressionsvektors, wie oben beschrieben, oder innerhalb eines viralen Vektors enthalten sein. Diese Vektoren (insbesondere Expressionsvektoren) können wiederum manipuliert werden, um irgendeine Anzahl von Formen anzunehmen, welche beispielsweise Ablieferung an und/oder Eintritt in eine Zielzelle erleichtern. Abgabe der Polynucleotid-Konstrukte der Erfindung an eukaryotische Zellen, insbesondere an Säugerzellen, spezieller an Prostatazellen, kann mittels irgendeines geeigneten im Fachgebiet bekannten Verfahrens erzielt werden. Abgabe kann erzielt werden in vivo, ex vivo oder in vitro.
Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen für das Transferieren solcher Expressionskonstrukte in Zellen, insbesondere in vivo, zur Behandlung von Prostatakrebs bereit. Es ist außerdem eine Aufgabe der Erfindung, Zusammensetzungen zur Therapie von BPH und neoplastischen Prostataerkrankungen bereitzustellen.
Abgabevehikel, die geeignet sind zur Inkorporation eines hKLK2-Enhancers der vorliegenden Erfindung zur Einführung in eine Wirtszelle schließen nicht-virale Vehikel und virale Vektoren ein. Verma und Somia (1997), Nature 389:239–242.
Nicht-virale Vehikel
Eine große Vielzahl an nicht-viralen Vehikeln zur Abgabe von hKLK2-Enhancer-Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung sind im Fachgebiet bekannt und sind von der vorliegenden Erfindung umfasst. Ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid kann an eine Zelle als nackte DNA abgeliefert werden ( US-Patent Nr. 5 692 622 ; WO 97/40163 ). Alternativ kann ein hKLK2- Enhancer-Polynucleotid, assoziiert auf eine Vielzahl von Arten mit einer Vielzahl von Substanzen (Abgabeformen) an eine Zelle abgegeben werden, einschließlich von, aber nicht limitiert auf, kationische(n) Lipide(n); biokompatible(n) Polymere(n), einschließlich natürlicher Polymere und synthetischer Polymere; Lipoproteine(n); Polypeptide(n); Polysaccharide(n); Lipopolysaccharide(n); künstliche(n) virale(n) Hüllen ("envelopes"); Metallpartikel(n); und Bakterien. Ein Abgabevehikel kann die Form eines Mikropartikels annehmen. Gemische oder Konjugate dieser verschiedenen Substanzen können auch als Abgabevehikel verwendet werden. Ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid kann mit diesen verschiedenen Formen von Abgabe(vehikeln) nicht-kovalent oder kovalent assoziiert sein.
Ein nicht-virales Gentransfer-Vehikel, geeignet zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, ist physikalischer Transfer eines Polynucleotids in kationischen Lipiden, welche die Form von Liposomen annehmen können. Rezensiert in Mahato et al. (1997), Pharm. Res. 14:853–859. Liposomale Präparationen schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, Cytofektine, multilamellare Vesikel und unilamellare Vesikel. Mehrere kommerzielle liposomale Zubereitungen sind zur Abgabe von DNA und RNA an Zellen erhältlich, einschließlich von, aber nicht limitiert auf, Lipofectin^TM, Lipofectamin^TM und DOTAP^TM.
Derivatisierte Liposomen können als Träger von hKLK2-Enhancer-Polynucleotiden verwendet werden. Immunoliposomen sind derivatisierte Liposomen, welche auf ihrer Oberfläche spezifische Antikörper enthalten, welche an Oberflächen-Antigene auf spezifischen Zelltypen binden, wodurch diese Liposomen zu speziellen Zelltypen zielgeleitet bzw. targetiert werden. Wang und Huang (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:7851; und Trubetskoy et al. (1992), Biochem. Biophys. Acta 1131:311. Andere Typen an Derivatisierung schließen Modifikation der Liposomen, um Liganden zu beinhalten, welche an Rezeptoren auf speziellen Zelltypen binden, oder Rezeptoren, welche spezifisch an Zelloberflächenmoleküle binden, ein.
Lipopolyamin kann als ein Reagens verwendet werden, um Transfektion selbst, ohne die Notwendigkeit irgendeines zusätzlichen Phospholipids, um Liposomen zu bilden, zu vermitteln. Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:6982.
Andere Lipid-basierte Abgabevehikel sind bekannt und sind beschrieben worden und können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielsweise offenbart US-Patent Nr. 5 705 385 Lipid-Nucleinsäure-Partikel zur Genabgabe mittels Bildung von hydrophoben/s Lipid-Nucleinsäure-Komplexen. Die Komplexe sind Ladungs-neutralisiert. Bildung dieser Komplexe in entweder Detergens-basierten Systemen oder Systemen, die auf organischem Lösungsmittel basieren, gefolgt von Entfernen des Detergens oder organischen Lösungsmittels, führt zu Partikelbildung.
Polypeptid-Genabgabe-Vehikel schließen Polyaminosäuren, wie z. B. Polylysin, und verschiedene natürlich vorkommende Polypeptide, wie z. B. Gelatine, und Konjugate von diesen mit anderen Makromolekülen ein.
Niedermolekulargewichtiges Polylysin (PL) und andere Polykationen können als Träger verwendet werden, um DNA-vermittelte Transfektion in kultivierte Säugerzellen zu fordern. Zhou et al. (1991) Biochem. Biophys. Acta 1065:1068, berichten über die Synthese eines Polylysin-Phospholipid-Konjugats, eines Lipopolylysins, umfassend PL, verknüpft mit N-Glutarylphosphatidylethanolamin, welches, wie berichtet, die Transfektionseffizienz von DNA erhöht.
Polylysinmoleküle, konjugiert an Asialoorosomucoid ("ASOR"), oder Transferin können verwendet werden zur Target-spezifischen Abgabe assoziierter Polynucleotide an Zellen, welche den geeigneten Rezeptor exprimieren (d. h., Asialoglykoprotein-Rezeptor bzw. Transferrin-Rezeptor). Solche Konjugate sind beschrieben worden. Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963; WO92/06180 ; WO92/05250 ; WO91/17761 ; Wagner et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:3410 ; Zenke et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:3655; und WO92/13570 .
Polypeptid-Abgabevehikel schließen jene ein, welche Mikrokügelchen ("microspheres") bilden, wie beschrieben. WO 96/00295 . Polypeptid-Mikrokügelchen können Polypeptid alleine oder Gemische von Polypeptiden mit anderen Makromolekülen, beispielsweise Chondroitinsulfat, umfassen. Die Polypeptide können quervernetzt sein, wie beschrieben. WO 96/40829 . Zusätzlich dazu kann eine Targeting-Gruppierung in solche Polypeptid-Abgabevehikel eingebaut werden.
Mikropartikel zur Abgabe von Polynucleotiden in Zellen sind bekannt und können verwendet werden, um hKLK2-Enhancer-Polynucleotide an eine Zelle abzugeben. Mikropartikel umfassen im Allgemeinen ein Polynucleotid und eine Substanz, welche Eintritt in eine Zelle erleichtert. Diese schließen beispielsweise polymere Kationen, Komplexe aus hydrophobisiertem, positiv geladenem, biokompatiblem Polymer und einem Lipoprotein ( US-Patent Nr. 5 679 559 ); Komplexe aus einem Rezeptor-Liganden und einem Polykation ( US-Patent Nr. 5 635 383 ); Polykation, konjugiert mit Polyalkylenglykol oder einem Polysaccharid ( WO 96/21036 ); einen Komplex zwischen einem Fusionsprotein, umfassend eine Domäne, welche spezifisch ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid bindet, und eine Domäne, welche auf einen speziellen Zelltyp abzielt ( EP 753 069 ); Chylomicronen (Hara et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:14547 – 14552 ); Metallpartikel, wie z. B. Wolfram und Gold (Zelenin et al. (1997) FERS Letters 414:319–322; und Chitosan-basierte Verbindungen ( WO 97/42975 ) ein.
Andere Trägertypen schließen kovalent gebundene Konjugate, bestehend aus Oligonucleotiden in Disulfid-Verknüpfung an einem Targeting-Mittel, das Transport über Zellmembranen hinweg fordert ( WO 91/14696 ); künstliche virale Hüllen (Schreier et al. (1995) J. Molec. Recognition 8:59–62; und Chander und Schreier (1992) Life Sci. 50:481–489; und Bakterien, beispielsweise Salmonella (Pawelek et al. (1997) Cancer Res. 57:4537–4544); und Listeria monocytogenes (Dietrich et al. (1998) Nature Biotech. 16:181–185, ein.
Die Abgabevehikel der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere Targetingmoleküle, eingebaut in oder angeheftet an dem/das Vehikel, einschließen. Targeting-Moleküle schlie ßen beliebige Moleküle ein, die spezifisch an einen Target-Zelltyp binden. Dies kann eine beliebige Art von Molekül sein, für welches ein spezifischer Bindungspartner existiert. Der Ausdruck "spezifischer Bindungspartner", wie hierin verwendet, beabsichtigt ein Mitglied eines Paares von Molekülen, die mittels spezifischer nicht-kovalenter Wechselwirkungen, die von den dreidimensionalen Strukturen der beteiligten Moleküle abhangen, Wechselwirken. Vorzugsweise wird der spezifische Bindungspartner nur auf dem Target-Zelltyp exprimiert. Beispiele von Targeting-Molekülen, welche verwendet werden können, sind Hormone, Antikörper, Zelladhäsionsmoleküle, Saccharide, Arzneimittel und Neurotransmitter.
Zusammensetzungen, die ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid in einem Abgabevehikel umfassen, sind von dieser Erfindung eingeschlossen. Wenn diese Zusammensetzungen pharmazeutisch verwendet werden sollen, werden sie mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipiens kombiniert. Demgemäß stellt die Erfindung auch Zusammensetzungen dieser Vektoren, einschließlich von Zusammensetzungen, die diese Vektoren und ein pharmazeutisches Exzipiens umfassen, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Vektoren umfassen, bereit. Pharmazeutische Exzipientien sind im Fachgebiet gut bekannt und brauchen hierin nicht im Detail beschrieben zu werden. Siehe beispielsweise Remington: The Science and Practise of Pharmacy (19. Auflage, 1995), Gennaro, Hrsg.
Ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid kann in einen nicht-viralen Vektor zur Abgabe in eine Zelle insertiert werden, wie oben beschrieben. In der Kategorie nicht-viraler Vektor eingeschlossen sind prokaryotische Plasmide und eukaryotische Plasmide, wie oben beschrieben. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass eine breite Vielzahl solcher Vektoren bekannt sind und leicht verfügbar sind und in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Ein in einen nicht-viralen Vektor insertiertes hKLK2-Enhancer-Polynucleotid kann mit der Hilfe irgendeines der oben beschriebenen Vehikel sowie direkter Injektion des Polynucleotids oder anderer Typen an Abgabeverfahren an eine Zelle abgegeben werden. Die oben beschriebenen Abgabevehikel können auch verwendet werden, um ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid, das in einen viralen Vektor insertiert ist, abzuliefern.
Virale Vektoren
Ein hLKL2-Enhancer-Polynucleotid kann in einen viralen Vektor insertiert werden. Virale Vektoren schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, virale DNA-Vektoren, wie jene, basierend auf Adenoviren, Herpes simplex-Virus, Pockenviren sowie Vaccinia-Virus und Parvoviren, einschließlich Adeno-assoziiertem Virus; und virale RNA-Vektoren, einschließlich von, aber nicht limitiert auf, den/die retroviralen Vektoren. Retrovirale Vektoren schließen Mause-Leukämie-Virus und Lentiviren, wie z. B. humanes Immunodefizienzvirus, ein. Naldini et al. (1996) Science 272:263–267.
Replikations-defekte retrovirale Vektoren, die eine hKLK2-Polynucleotid-Sequenz als Teil des retroviralen Genoms tragen, können verwendet werden. Solche Vektoren sind im Detail beschrieben worden. (Miller et al. (1990) Mol. Cell Biol. 10:4239; Kolberg, R. (1992) J. NIH Res. 4:43; Cornetta et al. (1991) Hum. Gene Ther 2:215). Die Hauptvorteile retroviraler Vektoren zur Gentherapie sind: die hohe Effizienz an Gentransfer in replizierende Zellen, die präzise Integration der transferierten Gene in zelluläre DNA und das Fehlen einer weiteren Verbreitung der Sequenzen nach Gentransduktion.
Repräsentative Beispiele retroviraler Gen-Abgabevehikel, die innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen beispielsweise jene ein, die beschrieben sind in EP 415 731 ; WO 90/07936 ; WO 94/03622 ; WO 93/25698 ; WO 93/25234 ; US-Patent Nr. 5 219 740 ; WO 93/11230 ; WO 93/10218 ; Vile und Hart, Cancer Res. 53:83–88, 1993; Vile und Hart, Cancer Res. 53:962–967, 1993; Ram et al., Cancer Res. 53:83–88, 1993; Takamiya et al., J. Neurosci. Res. 33:493–503, 1992; Baba et al., J. Neurosurg 79:729–735, 1993 ( US-Patent Nr. 4 777 127 , GB 2 200 651 , EP 0 345 242 und WO 91/02805 ).
Beispiele geeigneter Retroviren beinhalten pLJ, pZIP, pWE und pEM, welche dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind. Beispiele geeigneter Verpackungsviruslinien zum Herstellen sowohl ekotroper als auch amphotroper retroviraler Systeme schließen psi Crip, psi cre, psi 2 und psi Am ein. Retroviren sind verwendet worden, um eine Vielzahl von Polynucleotiden in viele unterschiedliche Zelltypen abzuliefern. Siehe beispielsweise Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641–647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892–10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104–4115.
Adenovirale Vektoren können auch für die Ablieferung von hKLK2-Enhancer-Polynucleotiden verwendet werden. Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143. Adenoviraler Vektor-Ausführungsformen der Erfindung sind in einem separaten Abschnitt diskutiert. Hauptvorteile von Adenvirus-Vektoren sind ihr Potential, große Insert-Polynucleotidsequenzen zu tragen, sehr hohe Virentiter, Fähigkeit, nicht-replizierende Zellen zu infizieren, und Eignung zum Infizieren von Geweben in situ.
Für die Zwecke dieser Erfindung können die adenoviralen Vektoren abhängig von dem erwünschten Ergebnis der Infektion mit Virus replikationskompetent oder replikationsdefekt sein.
Im Allgemeinen basieren replikationsdefekte Adenovirus-Gentransfer-Systeme auf rekombinantem, manipuliertem ("engineered") Adenovirus, welches durch Deletion eines Anteils seines Genoms, wie z. B. von E1 oder E3, replikationsinkompetent gemacht ist und jedoch nach wie vor seine Kompetenz zur Infektion beibehält. Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431–434; Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143–155. Relativ große Fremdproteine können exprimiert werden, wenn zusätzliche Deletionen in dem Adenovirusgenom vorgenommen werden. Beispielsweise sind Adenoviren, deletiert in sowohl E1- als auch E3-Regionen, fähig, bis zu 10 kb Fremd-DNA zu tragen, und sie können in 293-Zellen zu hohen Titern kultiviert werden. Geeignete adenovirale Vektoren, abgeleitet von dem Adenovirus-Stamm Ad Typ 5 oder anderen Stämmen von Adenovirus (z. B. Ad2, Ad3, Ad7, etc.) sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt.
Ein Replikations-kompetenter adenoviraler Vektor, der ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid umfasst, ist eine Ausführungsform eines Abgabevehikels, das einen hKLK2-Enhancer umfasst. Replikations-kompetente adenovirale Vektoren, die einen hKLK2-Enhancer umfassen, werden in größerem Detail unten diskutiert werden.
Ein weiteres virales Vektorsystem, verwendbar zur Abgabe eines hKLK2-Enhancer-Polynucleotids, ist das Adeno-assoziierte Virus (AAV). Das Adeno-assoziierte Virus ist ein natürlich vorkommendes, fehlerhaftes Virus, das für effiziente Replikation und einen produktiven Lebenszyklus ein weiteres Virus, wie z. B. ein Adenovirus oder ein Herpesvirus, als ein Helfer-Virus erfordert. Muzyczka et al. (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97–129. AAV als ein Abgabevehikel für ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid kann konstruiert werden und in Zellen eingeführt werden mittels beliebiger, im Fachgebiet bekannter Mittel, einschließlich der in US-Patent Nr. 5 658 785 beschriebenen Verfahren.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen viralen Vektoren können auch zahlreiche andere virale Vektorsysteme als ein Gen-Abgabevehikel eingesetzt werden. Repräsentative Beispiele solcher Gen-Abgabevehikel schließen Viren, wie z. B. Pockenviren, wie z. B. Kanarienvogelvirus oder Vacciniavirus (Fisher-Hoch et al., PNAS 86:317–321, 1989; Flexner et al., Ann N.Y. Acad. Sci. 569:86–103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17–21, 1990; US-Patent Nrn. 4 603 112 , 4 769 330 , 5 017 487 und 5 656 465 ; WO 89/01973 ); SV40 (Mulligan et al., Nature 277:108–114, 1979; Influenzavirus (Luytjes et al., Cell 59:1107–1113, 1989; McMicheal et al., N. Eng. J Med. 309:13–17, 1983; und Yap et al., Nature 273:238–239, 1978; Herpes (Kit, Adv. Exp. Med. Biol. 215:219–236, 1989; US-Patent Nr. 5 288 641 ); HIV (Poznansky, J. Virol. 65:532–536, 1991); Maser ( EP 0 440 219 ); Semliki-Wald-Virus und Coronavirus, sowie andere virale Systeme (z. B. EP 0 440 219 ; WO 92/06693 ; US-Patent Nr. 5 166 057 ) ein. Zusätzlich dazu können virale Träger bzw. Carrier ein homologes, nicht-pathogenes (fehlerhaftes), Replikations-kompetentes Virus sein (z. B. Overbaugh et al., Science 239:906–910, 1988), und nichtsdestotrotz zelluläre Immunreaktionen, einschließlich CTL, induzieren.
Virale Vektoren, die ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid umfassen, können zu einem speziellen Zelltyp für effizientere Abgabe eines hKLK2-Enhancer-Polynucleotids, beispielsweise an eine neoplastische Prostatazelle, targetiert werden. Beispielsweise kann ein viraler Vektor zusätzlich zu einem hKLK2-Enhancer-Polynucleotid ein Polynucleotid umfassen, das ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares codiert, welches in die Virushülle oder das virale Capsid insertiert und welches das Viruspartikel zu einer Zelle targetiert, die das komplementäre Mitglied des spezifischen Bindungspaars auf seiner Oberfläche aufweist. WO 95/26412 . Alternativ kann die Oberfläche eines Viruspartikels kovalent modifiziert werden, um es zu einer speziellen Zelle zu targetieren. WO 92/06180 ; WO 92/05266 .
Virale Vektoren können so konstruiert werden, dass sie regulierbare Kontrollelemente enthalten, welche beispielsweise durch Tetrazyklin kontrolliert werden. WO 97/20463 .
Virus-basierte Vektoren können auch verwendet werden, um ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid abzuliefern. Diese beinhalten Retrotransposon-Vektoren ( US-Patent Nr. 5 354 674 ) und synthetische Vektoren ( WO 94/20608 ; WO 96/26745 ).
Herstellung nicht-viraler Vehikel, umfassend einen hKLK2-Enhancer
Herstellung von Liposomen zum Transfer von Polynucleotiden kann wie von verschiedenen Forschern beschrieben durchgeführt werden (Wang und Huang (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 147:980; Wang und Huang (1989) Biochemistry 28:9508; Litzinger und Huang (1992) Biochem. Biophys. Acta 1113 201; Gao und Huang (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 179:280; Felgner WO91/17424 ; WO91/16024 ).
Die Herstellung anderer Typen von nicht-viralen Vehikeln ist im Fachgebiet bekannt und ist beschrieben worden. Beispielsweise ist die Herstellung von Polylysin-Abgabevehikeln von Zhou et al. (1991) Biochem. Biophys. Acta 1065:1068, beschrieben worden. Verfahren für das Herstellen von Mikropartikeln verschiedener Zusammensetzungen sind auch beschrieben worden (siehe oben zitierte Publikationen) und sind im Fachgebiet bekannt.
Einführen von Targeting-Molekülen in die nicht-viralen Vehikel der vorliegenden Erfindung können durchgeführt werden durch beliebige bekannte Mittel, einschließlich Inkorporation in ein kationisches Lipid-Vehikel oder ein Mikrokügelchen oder einen Mikropartikel; durch direkte chemische Konjugation mit einem Makromolekül, aus welchem das Abgabevehikel zusammengesetzt ist, oder beliebige andere Verfahren.
Einführen nicht-viraler Vehikel, umfassend einen hKLK2-Enhancer, in Wirtszellen und/oder Targetzellen
Nicht-virale Vehikel, die ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid umfassen, können mittels eines beliebigen, im Fachgebiet bekannten Verfahrens in Wirtszellen und/oder Targetzellen eingeführt werden, wie z. B. Transfektion durch die Calciumphosphat-Copräzipitationstechnik; Elektroporation, Elektropermeabilisierung, Liposom-vermittelte Transfektion; ballistische Transfektion; biolistische Prozesse, einschließlich Mikropartikelbeschuss, Düseninjektion ("jet injection") und Nadel- und Spritzen-Injektion; oder durch Mikroinjektion. Zahrleiche Verfahren der Transfektion sind der geschulten Arbeitskraft auf dem Gebiet bekannt. Eine Anzahl dieser Verfahren kann sowohl ex vivo als auch in vivo durchgeführt werden. Biolistischer Gentransfer, einschließlich Düseninjektion, Mikropartikelbeschuss und Nadel- und Spritzeninjektion, kann durch im Fachgebiet bekannte Verfahren durchgeführt werden. Für einen Übersichtsartikel siehe Furth (1997) Mol. Biotechnol. 7:139–143. In vivo-Elektropermeabilisierung kann wie beschrieben durchgeführt werden. Rols et al. (1998) Nature Biotech. 16:168–1171. Erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen anerkannt, wenn irgendein Hinweis auf das Arbeiten bzw. Funktionieren dieses Vektors in der Wirtszelle auftritt. Transformation wird unter Verwendung von Standardtechniken, die für die speziellen verwendeten Wirtszellen geeignet sind, erzielt. Nackte DNA kann mittels direkter Injektion eingeführt werden. Polynucleotide können auch unter Ver wendung verschiedener implantierbarer Vorrichtungen, wie z. B. jener, beschrieben in US-Patent Nr. 5 501 662 ; und Koole et al. (1998) Nature Biotech. 16:172–176, eingeführt werden.
Herstellung von viralen Vektoren, umfassend einen hKLK2-Enhancer
Die grundlegende Technik des Insertierens von Genen in Viren sind dem Fachmann bekannt, und sie beinhalten beispielsweise Rekombination zwischen den viralen Polynucleotidsequenzen, die ein Polynucleotid in einem Geber-Plasmid flankieren, und homologen Sequenzen, die in dem parentalen Virus vorhanden sind. Mackett et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415–7419. Beispielsweise kann eine einzelne Restriktionsstelle, die auf natürliche Weise in dem parentalen viralen Vektor vorhanden ist oder auf künstliche Weise in den parentalen viralen Vektor insertiert ist, verwendet werden, um ein Polynucleotid, das von der gleichen Restriktionsstelle wie in dem viralen Vektor flankiert ist, zu insertieren.
Ein DNA-Virus kann wie folgt konstruiert werden. Als Erstes kann die in das Virus zu insertierende Polynucleotidsequenz in einem Plasmid platziert werden, z. B. einem E. coli-Plasmidkonstrukt, in welches ein Polynucleotid, homolog zu einem Abschnitt des Polynucleotids, wie z. B. des Virus, eingeführt worden ist. Separat wird die zu insertierende Polynucleotidsequenz an einen Promotor ligiert. Die Promotor-Gen-Verknüpfung wird so in dem Plasmid-Konstrukt positioniert, dass die Promotor-Gen-Verknüpfung an beiden Enden von Polynucleotidsequenzen flankiert ist, die homolog sind zu einer Polynucleotidsequenz, die eine Region von viraler DNA flankiert, welche die erwünschte Insertionsregion ist. Das resultierende Plasmid-Konstrukt wird dann durch Kultivierung innerhalb von E. coli-Bakterien amplifiziert und wird isoliert. Vorzugsweise enthält das Plasmid außerdem einen Replikationsursprung, wie z. B. den E. coli-Replikationsursprung und einen Marker, wie z. B. ein Antibiotikum-Resistenzgen zur Selektion und Vermehrung in E. coli.
Als Zweites wird das isolierte Plasmid, das die zu insertierende Polynucleotidsequenz enthält, in eine Zellkultur, z. B. Hühnerembryofibroblasten, zusammen mit dem Virus transfiziert. Rekombination zwischen homologer DNA in dem Plasmid bzw. dem viralen Genom resultiert in einem Virus, modifiziert durch die Gegenwart des Polynucleotid-Konstrukts in seinem Genom, an einer Stelle, welche die Lebensfähigkeit des Virus nicht beeinträchtigt.
Wie oben angemerkt, wird das Gen in eine Region (Insertionsregion) in das Virus insertiert, wobei dies die Lebensfähigkeit des resultierenden rekombinanten Virus nicht beeinträchtigt. Der Fachmann kann derartige Regionen in einem Virus durch beispielsweise zufälliges Testen von Segmenten von Virus-DNA auf Regionen, die Rekombinantenbildung erlauben, ohne die Virus-Lebensfähigkeit der Rekombinante ernsthaft zu beeinträchtigen, leicht identifizieren. Eine Region, die leicht verwendet werden kann und in vielen Viren vorhanden ist, ist das Thymidinkinase-Gen.
Techniken für das Herstellen von Replikations-defekten Adenviren sind im Fachgebiet gut bekannt, wie es exemplifiziert ist durch Ghosh-Choudhury und Graham (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm. 147:964–973; Ghosh-Choudhury et al. (1987) EMBO J. 6:1733–1739; McGrory et al. (1988) Virol. 163:614–617. Es ist auch gut bekannt, dass verschiedene Zelllinien verwendet werden können, um rekombinante Adenoviren zu vermehren, solange sie irgendeinem Replikationsdefekt, welcher vorhanden sein kann, komplementieren. Ein Beispiel ist die menschliche Zelllinie 293, jedoch jede andere Zelllinie, die permissiv für Replikation ist. Beispielsweise wird für virale Konstrukte, (in) welchen, im Hinblick auf Insertion eines hKLK2-Enhancer-Polynucleotids, E1A und E1B nicht exprimiert werden, eine Zelllinie eingesetzt, welche E1A und E1B exprimiert. Weiterhin können die Zellen entweder auf Plastikschalen oder in Suspensionskultur vermehrt werden, um Virusvorräte („virus stocks") zu erhalten.
Herstellung von Rplikations-kompetenten adenoviralen Vektoren wird in einem separaten Abschnitt diskutiert.
Rekombinante Retroviren, welche so konstruiert sind, dass sie ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid tragen oder exprimieren, können aus einer breiten Vielfalt von Retroviren, einschließlich beispielsweise Retroviren vom Typ B, C und D, sowie Spumaviren und Lentiviren leicht konstruiert werden (siehe RNA Tumor Viruses, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985). Solche Retroviren können angesichts der hierin bereitgestellten Offenbarung und angesichts rekombinanter Standardtechniken (z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Kurekle, PNAS 82:488, 1985) leicht eingesetzt werden, um retrovirale Gen-Abgabevehikel zu assemblieren oder zu konstruieren. Zusätzlich dazu können Teile der retroviralen Gen-Abgabevehikel von unterschiedlichen Retroviren abgeleitet sein. Beispielsweise können retrovirale LTRs von einem Sarkom-Virus der Maus, einer tRNA-Bindungsstelle von einem Rous-Sarkom-Virus, einem Verpackungssignal von einem Leukämievirus der Maus und einem Ursprung der Zweitstrangsynthese von einem Vogel-Leukose-Virus abgeleitet sein.
Eine Hauptvoraussetzung der Verwendung von Retroviren ist, die Sicherheit ihrer Verwendung zu gewährleisten, insbesondere was die Möglichkeit der Ausbreitung von Wildtyp-Virus in der Zellpopulation betrifft. Die Entwicklung spezialisierter Zelllinien ("Verpackungszellen"), welche nur Replikations-defekte Retroviren produzieren, hat die Verwendbarkeit von Retroviren zur Genablieferung erhöht, und defekte Retroviren sind für Gen-Abgabezwecke gut charakterisiert. Miller et al. (1990) Blood 76:271. Rekombinante Retroviren, bei welchen ein Teil der retroviralen codierenden Sequenz (gag, pol, env) ersetzt worden ist durch ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid, wobei dies die Retrovirus-Replikation defekt macht, können konstruiert werden. Das Replikations-defekte Virus wird dann in Virionen verpackt, welche verwendet werden können, um eine Zielzelle durch die Verwendung eines Helfer-Virus mittels Standardtechniken zu infizieren. Protokolle für das Herstellen rekombinanter Retroviren und für das Infizieren von Zellen in vitro oder in vivo können in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al. (Hrsg.), Greene Publishing Associates (1989), und periodischen Aktualisierungen sowie anderen Standard-Laborhandbüchern gefunden werden.
Verpackungszelllinien, geeignet zur Verwendung mit den oben beschriebenen Vektorkonstrukten, können leicht hergestellt werden (siehe WO 92/05266 ), und angesichts der hierin bereitgestellten Offenbarung verwendet werden, um produzierende Zelllinien ("producer cell ines")(auch Vektorzelllinien oder "VCLs" genannt) zur Herstellung rekombinanter Vektorpartikel zu erzeugen.
Einführen viraler Vehikel, umfassend einen hKLK2-Enhancer in Wirtszellen und/oder Targetzellen
Virale Abgabevehikel können in Zellen mittels Infektion eingeführt werden. Alternativ können virale Vehikel in ein beliebiges der nicht-viralen Abgabevehikel, die oben für die Abgabe in Zellen beschrieben worden sind, eingebaut werden. Beispielsweise können virale Vektoren mit kationischen Lipiden (Hodgson und Solaiman (1996) Nature Biotechnol. 14:339–342); oder lamellenförmigen Liposomen (Wilson et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:3471; Faller et al. (1984) J. Virol. 49:269) vermischt werden.
Zur in vivo-Abgabe kann/können das/die Abgabevehikel mittels irgendeines einer Anzahl von Verfahren in einen Patienten eingebracht werden, von welchen jedes im Fachgebiet bekannt ist. Beispielsweise kann eine pharmazeutische Zubereitung des Gen-Ablieferungssystems systemisch, z. B. durch intravenöse Injektion, eingeführt werden, und spezifische Transduktion der Zielzellen entsteht vorwiegend von der Spezifität der Transfektion, bereitgestellt durch das Gen-Ablieferungsvehikel, Zelltyp- oder Gewebetyp-Expression, bedingt durch die transkriptionalen Regulationssequenzen, die die Expression des Gens kontrollieren, oder eine Kombination davon. In weiteren Ausführungsformen ist das ursprüngliche Abliefern des rekombinanten Gens limitierter, wobei die Einführung in das Tier örtlich ziemlich begrenzt ist. Beispielsweise kann das Gen-Ablieferungsvehikel durch Katheter (siehe US-Patent Nr. 5 328 470 ) oder durch sterntaktische Injektion (z. B. Chef et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3054–3057) eingeführt werden. Darüber hinaus kann die pharmazeutische Zubereitung im Wesentlichen aus dem Gen-Ablieferungssystem in einem annehmbaren Verdünnungsmittel bestehen oder kann eine Matrix zur langsamen Freisetzung ("slow release matrix") umfassen, in welche das Gen-Abgabevehikel eingebettet ist. Alternativ kann die pharmazeutische Zubereitung, wo das komplette Gen-Abgabesystem intakt aus rekombinanten Zellen produziert werden kann, z. B. retrovirale Pakete, ein oder mehrere Zellen umfassen, welche das Gen-Abgabesystem produzieren. Im Fall des Letzteren können Verfahren für das Einführen der viralen Verpackungszellen beispielsweise bereitgestellt werden durch wiederbeladbare oder bioabbaubare Vorrichtungen. Verschiedene Polymervorrichtungen zur langsamen Freisetzung sind in den letzten Jahren entwickelt und in vivo getestet worden für die kontrollierte Abgabe von Arzneimitteln, einschließlich proteinöser Biopharmazeutika, und sie können zur Freisetzung viraler Partikel durch die Manipulation der Polymerzusammensetzung und Form angepasst werden. Eine Vielzahl an biokompatiblen Polymeren (einschließlich Hydrogelen), einschließlich von sowohl bioabbaubaren als auch nicht-abbaubaren Polymeren, kann verwendet werden, um ein Implantat zu bilden oder die ver zögerte Freisetzung von einem den viralen Partikeln durch Zellen, implantiert an einer speziellen Target-Stelle. Solche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden zur Abgabe eines exogenen gereinigten Virus, welches in die polymere Vorrichtung eingebaut worden ist oder zur Abgabe von Viruspartikeln, hergestellt durch eine Zelle, eingekapselt in der polymeren Vorrichtung.
Durch Auswahl von Monomerzusammensetzung oder Polymerisationstechnik kann/können die Menge von Wasser, die Porosität und folgende Permeabilitätscharakteristika kontrolliert werden. Die Auswahl der Form, Größe, des Polymers und des Verfahrens zur Implantation kann auf einer individuellen Basis gemäß der zu behandelnden Störung und der individuellen Reaktion des Patienten bestimmt werden. Die Erzeugung solcher Implantate ist im Allgemeinen gut im Fachgebiet bekannt. Siehe beispielsweise Concise Encyclopedia of Medical & Dental Materials, herausgegeben von David Williams (MIT Press: Cambridge, MA, 1990); und das Sabel et al.- US-Patent Nr. 4 883 666 . Bei einem anderen Typ Implantat ist eine Quelle von Zellen, die das rekombinante Virus produzieren, in implantierbaren Hohlfasern eingekapselt. Solche Fasern können vorgesponnen und nachfolgend mit der viralen Quelle beladen werden (Aebischer et al., US-Patent Nr. 4 892 538 ; Aebischer et al., US-Pat. Nr. 5 106 627 ; Hoffman et al. (1990) Expt. Neurobiol. 110:39–44; Jaeger et al. (1990) Prog. Brain Res. 82:41–46; und Aebischer eta. (1991) J. Biomech. Eng 113:178–183), oder kann mit einem Polymer coextrudiert werden, welches dazu dient, einen polymeren Mantel um die viralen Verpackungszellen zu bilden (Lim, US-Pat. Nr. 4 391 909 ; Sefton, US-Pat. Nr. 4 353 888 ; Sugarmori et al. (1989) Trans. Am. Artif. Intern. Organs 35:791–799; Sefton et al. (1987) Biotechnol. Bioeng. 29:1135–1143; und Aebischer eta. (1991) Biomaterals 12:50–55. Wiederum kann Manipulation des Polymers durchgeführt werden, um für optimale Freisetzung der viralen Partikel zu sorgen.
Wirtszellen und Targetzellen, umfassend ein hKLK2-Enhancer-Polynucleotid
Die Erfindung stellt ferner Wirtszellen und Targetzellen bereit, die transfiziert oder transformiert sind mit (d. h. umfassen) dem/den (die) oben beschriebenen hKLK2-Enhancer(n) und/oder hKLK2-TRE(s), den (die) oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren dieser Erfindung oder den (die) oben beschriebenen Abgabevehikel(n), umfassend hKLK2-Enhancer und/oder hKLK2-TRE(s). Diese Zellen werden in gewöhnlichen Nährstoffmedien kultiviert, die modifiziert sind, wie es geeignet ist für das Induzieren von Promotoren, Selektieren von Transformanten oder Amplifizieren der Gene, die die erwünschten Sequenzen codieren.
Die Zellen, welche zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung hinsichtlich Expression, Transkriptionskontrolle oder für Zwecke des Klonierens und Vermehrens eines hKLK2-Enhancer-Polynucleotids geeignet sind, können prokaryotisch oder eukaryotisch sein.
Wirtssysteme sind im Fachgebiet bekannt und müssen hierin nicht im Detail beschrieben werden. Prokaryotische Wirte schließen Bakterienzellen, z. B. E. coli, B. subtilis und Mycobakterien, ein. Unter eukaryotischen Wirten sind Hefe(zellen), Insektenzellen, Vogelzellen, Pflanzen zellen, C. elegans- (oder Nematoden-) Zellen und Säugerzellen. Beispiele für Pilz- (einschließlich Hefe-)Wirtszellen sind S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis (K lactis), Arten von Candida, einschließlich C. albicans und C. glabrata, Aspergillus nidulans, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), Pichia pastoris und Yarowia lipolytica. Beispiele von Säugerzellen sind COS-Zellen, Maus-L-Zellen, LNCaP-Zellen, chinesischer Hamster-Eierstock (CHO, "Chinese hamster ovary")-Zellen, humane embryonale Nieren-(HEK, "human embroyonic kidney") Zellen und "African green monkey"-Zellen. Xenopus laevis-Oozyten, oder andere Zellen amphibischen Ursprungs, können auch verwendet werden.
Für die Abgabevehikel, die oben beschrieben sind, können beliebige eukaryotische Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, verwendet werden. Noch stärker bevorzugt sind die Zellen Prostatazellen, stärker bevorzugt Androgen-Rezeptor-exprimierend, noch stärker bevorzugt Prostataepithelzellen, die endogenen Androgen-Rezeptor exprimieren. Die eingesetzten Zellen können jene sein, die von der Prostata stammen. Solche Zellen schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, die LNCaP-Zelllinie (erhältlich von der American Type Culture Collection unter ATCC CRL 1740). Alternativ müssen die Zellen nicht von der Prostata stammen, solange die hKLK2-TRE-Funktion ausreichend konserviert ist. Dies kann beispielsweise erzielt werden durch Co-Transfizieren der Zelle mit einem Gen, das ein Produkt codiert, das notwendig für die Funktion des TRE des Prostata-spezifischen Gens ist. Beispielsweise kann es, wenn ein hKLK2-TRE durch Androgen induzierbar ist, notwendig sein, in die Zellen ein Konstrukt zu cotransfizieren, welches ein Gen, codierend einen Androgen-Rezeptor, codiert und dessen Expression erlaubt.
Die Wirtszellen dieser Erfindung können unter anderem als Aufbewahrungsort bzw. Depots von hKLK2-Polynucleotiden und/oder Vehikeln zur Produktion von hKLK2-Polynucleotiden und/oder Polypeptiden, welche von einem funktionell verknüpften Polynucleotid codiert werden, verwendet werden.
Zusammensetzungen, die Zellen enthalten, in welche Vektoren eingeführt worden sind, die ein hKLK2-TRE funktionell verknüpft mit einem heterologen Polynucleotid umfassen, sind von dieser Erfindung umfasst. Wenn diese Zusammensetzungen pharmazeutisch verwendet werden sollen, werden sie mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipiens kombiniert. Demgemäß stellt die Erfindung auch Zusammensetzungen dieser Zellen bereit, einschließlich von Zusammensetzungen, umfassend diese Zellen und ein pharmazeutisches Exzipiens, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend diese Zellen. Pharmazeutische Exzipientien sind im Fachgebiet gut bekannt und müssen hierin nicht im Detail beschrieben werden. Siehe beispielsweise Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19. Auflage, 1995), Gennaro, Hrsg.
Verfahren zum Verwenden der hKLK2-Enhancer-Polynucleotide der Erfindung
Die oben beschriebenen hKLK2-Enhancer-Sequenzen können für eine breite Vielzahl von Zwecken verwendet werden, welche mit dem erwünschten oder beabsichtigten Ergebnis variieren werden. Demgemäß schließt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung der hKLK2-Enhancer-Sequenzen, die oben beschrieben sind, ein.
Wie oben beschrieben, kann ein hKLK2-Enhancer funktionell verknüpft sein mit einem Promotor, um ein hKLK2-TRE zu bilden, welches wiederum funktionell verknüpft sein kann mit einem heterologen Polynucleotid. Solch ein hKLK2-TRE ist verwendbar zum selektiven Erhöhen von Transkription und/oder Expression eines funktionell verknüpften heterologen Polynucleotids in Zellen, welche einem hKLK2-Enhancer zu funktionieren erlauben. Demgemäß beinhaltet die Erfindung Verfahren für das Erhöhen von Transkription einer Polynucleotidsequenz in einer Zelle, die im Allgemeinen Einführen eines Konstrukts, umfassend einen hKLK2-Enhancer, und einen Promotor, funktionell verknüpft mit dem Polynucleotid, in eine Zelle, in welcher der hKLK2-Enhander funktional ist, einschließen.
In einer Ausführungsform sind Verfahren für das Einführen eines Konstrukts, umfassend ein hKLK2-TRE, funktionell verknüpft mit einem Reportergen, in Zellen bereitgestellt, welche einem hKLK2-Enhancer erlauben zu funktionieren, d. h., eine Zelle, in welcher ein hKLK2-Enhancer, wenn funktionell verknüpft mit einem Promotor und einem Reportergen, Expression des Reportergens erhöht. Beispiele schließen LNCaP-Zellen, wie in Beispielen 6 und 7 gezeigt, ein. Solche Zellen sind verwendbar für das Screenen von Verbindungen auf einen therapeutischen Effekt gegen Prostatakrebs. Verfahren für das Screenen von Kandidatenverbindungen auf einen therapeutischen Effekt gegen Prostatakrebs sind in Beispiel 15 angegeben.
In einer anderen Ausführungsform sind Verfahren bereitgestellt für das Verleihen selektiver Cytotoxizität in Zellen, in welchen ein hKLK2-TRE funktional ist, umfassend in-Kontakt-Bringen der Zellen mit einem Abgabevehikel, das hierin beschrieben ist, wobei das Vehikel in die Zelle eintritt. Vorzugsweise ist das Vehikel ein viraler Vektor. Vorzugsweise ist der virale Vektor Adenovirus. Cytotoxizität kann gemessen werden unter Verwendung von Assays, die im Fachgebiet Standard sind, wie z. B. Farbstoffausschluss ("dye exclusion"), 3H-Thymidin-Einbau und/oder Lyse.
In einer weiteren Ausführungsform sind Verfahren für die selektive Transkription und/oder Expression eines heterologen Polynucleotids in Zellen bereitgestellt, (in) welchen die Funktion eines hKLK2-Enhancers ausreichend konserviert ist. Mit "ausreichend konserviert" ist beabsichtigt, dass Transkription, bedingt durch die Gegenwart des Enhancers, über Basisleveln (d. h., Promotor alleine; dem Enhancer fehlt) in der Zielzelle um wenigstens 2-fach, vorzugsweise wenigstens etwa 5-fach, vorzugsweise wenigstens etwa 10-fach, stärker bevorzugt wenigstens etwa 20-fach, stärker bevorzugt wenigstens etwa 50-fach, stärker bevorzugt wenigstens etwa 100-fach, stärker bevorzugt wenigstens etwa 200-fach, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 400- bis etwa 500-fach, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 1000-fach, erhöht ist.
Insbesondere sind Verfahren bereitgestellt für die selektive Transkription und/oder Expression eines heterologen Polynucleotids in Zellen, welche normalerweise das heterologe Polynucleotid nicht exprimieren, oder das heterologe Polynucleotid bei nicht-detektierbaren Leveln exprimieren. Expression des heterologen Polynucleotids durch solche Zellen kann auf eine Vielzahl von Wegen detektiert werden, die einschließen, aber nicht limitiert sind auf: Fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren (FACS, "fluorescence-activated cell sorting") unter Verwendung eines oder mehrerer Antikörper, spezifisch für ein auf einer Zelloberfläche exprimiertes Protein (in Situationen, in welchen das heterologe Polynucleotid ein Produkt exprimiert, welches auf der Zelloberfläche exprimiert wird), Enzym-verknüpften Immunassay (ELISA, "enzyme-linked immunoassay") von Zellüberständen (für ein sezerniertes Produkt eines heterologen Polynucleotids), unter Verwendung eines Antikörpers, spezifisch für das sezernierte Produkt.
Demgemäß stellt die Erfindung Verfahren zum Erhöhen von Transkription einer funktionell verknüpften Polynucleotidsequenz in einer Zelle bereit, umfassend Einführen eines Konstrukts, umfassend einen hKLK2-Enhancer und einen Promotor, funktionell verknüpft mit dem Polynucleotid, in eine Zelle, in welcher der hKLK2-Enhancer funktional ist. Solche Zellen sind oben beschrieben worden, wie es auch hKLK2-Enhancer sind (d. h., Polynucleotidsequenzen, die Enhancer-Aktivität aufweisen).
Adenovirale Vektoren, umfassend ein hKLK2-TRE
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem adenovirale Vektorkonstrukte bereit, die ein adenovirales Gen unter transkriptionaler Kontrolle eines hKLK2-TRE umfassen. Vorzugsweise ist das adenovirale Gen eines, das zu Cytotoxizität beiträgt (ob direkt und/oder indirekt), stärker bevorzugt eines, das Zelltod verstärkt, und noch stärker bevorzugt ist das adenovirale Gen unter transkriptionaler Kontrolle eines hKLK2-TRE ein Gen, essentiell für adenovirale Replikation. Beispiele eines adenoviralen Gens, das zu Cytotoxizität beisteuert, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf ein adenovirales Todesprotein ("death Protein"). Wenn der Adenovirus-Vektor/die Adenovirus-Vektoren selektiv (d. h. vorzugsweise) Replikations-kompetent zur Vermehrung in Targetzellen, welche die Funktion eines hKLK2-TRE zulassen, ist/sind, werden diese Zellen vorzugsweise bei adenoviraler Proliferation getötet. Vorzugsweise sind Targetzellen Prostatazellen. Durch Kombinieren des Adenovirus-Vektors/der Adenovirus-Vektoren mit dem Gemisch von Prostata- und Nicht-Prostatazellen, in vitro oder in vivo, repliziert/replizieren der Adenovirus-Vektor/die Adenovirus-Vektoren vorzugsweise in den Prostata-Targetzellen. Sobald die Targetzellen bedingt durch selektive Cytotoxizität und/oder cytolytische Replikation zerstört sind, wird die Replikation des Adenovirus-Vektors/der Adenovirus-Vektoren signifikant reduziert, was die Wahrscheinlichkeit unkontrollierter Infektion ("runaway infection") und unerwünschter Nebeneffekte ("bystander effects") verringert. In vitro-Kulturen können zurückbehalten werden, um das Gemisch (wie z. B. eine Biopsie- oder andere geeignete biologische Probe) kontinuierlich auf das Auftreten (d. h. Vorhandensein) und/oder Wiederauftreten der Targetzelle, z. B. einer Androgen-Rezeptor-produzierenden Krebszelle, zu überwachen. Um Cytotoxizität weiter zu gewährleisten, können ein oder mehrere Transgene, die einen cytotoxischen Effekt aufweisen, auch vorhanden sein und unter selektiver transkriptionaler Kontrolle sein. In dieser Ausführungsform wird man höheres Vertrauen liefern können, dass die Targetzellen zerstört werden.
Demgemäß stellt die Erfindung einen Adenovirus-Vektor bereit, der ein Adenvirus-Gen umfasst, vorzugsweise eines, das zu Cytotoxizität beiträgt (ob indirekt und/oder direkt), vorzugsweise eines, das zu Zelltod beiträgt und/oder Zelltod verursacht, vorzugsweise eines, das essentiell für adenovirale Replikation ist, unter transkriptionaler Kontrolle eines hKLK2-TRE.
Im Zusammenhang mit Adenvirus-Konstrukten umfasst ein hKLK2-TRE einen hKLK2-Promotor oder einen hKLK2-Enhancer und eine Promotor, welcher ein hKLK2-Promotor, ein heterologer Promotor, z. B. ein Promotor, gesteuert von dem Prostata-spezifisches Antigen-Gen, oder ein homologer Promotor, d. h., ein adenoviraler Promotor sein kann. EP 755 443 und US-Patent Nr. 5 648 478 offenbaren die Sequenz eines Prostata-spezifischen Enhancers und eines Promotors, abgeleitet von dem Prostata-spezifisches Antigen (PSA)-Gen. hKLK-TRE sind in einem vorherigen Abschnitt beschrieben worden. In einer Ausführungsform umfasst ein hKLK2-TRE eine Region von etwa –323 bis etwa +33, relativ zur Transkriptionsstartstelle des hKLK2-Gens (Nucleotide von etwa 11.290 bis etwa 12.047 von SEQ ID NO:1). In einer weiteren Ausführungsform ist ein hKLK2-TRE die Sequenz stromaufwärts der codierenden Region für hKLK2 und umfasst beispielsweise die Polynucleotidsequenz von etwa –607 bis etwa +33, relativ zur Transkriptionsstartstelle des hKLK2-Gens (Nucleotide von etwa 11.407 bis etwa 12.047 von SEQ ID NO:1). In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein hKLK2-TRE Nucleotide von etwa –2247 bis etwa +33, relativ zur Transkriptionsstartstelle (Nucleotide von etwa 9767 bis etwa 12.047 von SEQ ID NO:1). Ein hKLK2-Promotor ist zuvor beschrieben worden. Murtha et al. (1993); Schedlich et al. (1987). Der hKLK2-Promotor enthält ein auf Androgen reagierendes Element (ARE, "androgen response element"), das ungefähr –160 relativ zur Transkriptionsstartstelle lokalisiert ist. Entfernen dieses ARE resultiert im Verlust an Androgen-Induzierbarkeit. Es wurde gezeigt, dass die Promotorregion von ungeführ 600 bp auf Androgen reagiert, jedoch nicht induzierbar war durch Östrogen, Glucocorticoide oder Progestin. Murtha et al. (1993). Obwohl 2,2 kb der 5'-flankierenden Sequenz publiziert worden sind (Schedlich et al. (1987)), ist keine Enhancer- oder Promotorfunktion, assoziiert mit den Sequenzen von etwa –600 bis etwa –2256, beschrieben worden. Wie oben diskutiert und wie in Beispiel 7 und 11 gezeigt, wird eine Sequenz, die signifikante Sequenzidentität mit einem Konsensus-ARE aufweist, bei Nucleotiden –3822 bis –3808 (Nucleotide 8192 bis 8206 von SEQ ID NO:1) gefunden. Mutation dieser Sequenz resultierte in beseitigter Enhancer-Aktivität.
Ein hKLK2-TRE kann eine beliebige Anzahl von Konfigurationen umfassen, die einschließen, aber nicht limitiert sind auf, einen hKLK2-Promotor (umfassend eine ARE-Stelle) und einen hKLK2-Enhancer (vorzugsweise umfassend ein ARE, wie oben beschrieben); einen Nicht-hKLK2-Promotor und einen hKLK2-Enhancer, und Multimeren der Vorangehenden, solange die gewünschte Zell-spezifische transkriptionale hKLK2-Aktivität erhalten wird. Die Promotor- und Enhancer-Komponenten eines hKLK2-TRE können in einer beliebigen Orientierung und/oder Entfernung von der codierenden Sequenz von Interesse sein, und Multimere der Voranstehenden umfassen, solange die Zell-spezifische transkriptionale hKLK2-Aktivität erhalten wird. Transkriptionale Verstärkung kann auf eine Anzahl von im Fachgebiet bekannten Wegen (und wie es in größerem Detail unten beschrieben ist) gemessen werden, wird jedoch im Allgemeinen durch Detektion und/oder Quantifizierung von mRNA oder dem Proteinprodukt der codierenden Sequenz unter Kontrolle von (d. h., funktionell verknüpft mit) einem hKLK2-TRE gemessen. Wie hierin diskutiert, kann ein hKLK2-TRE von variierenden Längen und von variierender Sequenzzusammensetzung sein. Durch transkriptionale Verstärkung ist es beabsichtigt, dass Transkription bedingt durch die Gegenwart des Enhancers über Basalspiegel (d. h., Promotor alleine; dem Enhancer fehlt) in der Zielzelle (d. h., eine Zelle, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlaubt) wenigstens etwa 2-fach, bevorzugt wenigstens etwa 5-fach, bevorzugt wenigstens etwa 10-fach, stärker bevorzugt wenigstens etwa 20-fach, stärker bevorzugt wenigstens etwa 50-fach, stärker bevorzugt wenigstens etwa 100-fach, stärker bevorzugt wenigstens etwa 200-fach, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 400- bis etwa 500-fach, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 1000-fach, erhöht ist. Basislevel sind im Allgemeinen der Level an Aktivität, wenn vorhanden, in einer Zelle, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE nicht zu funktionieren erlaubt, oder der Level an Aktivität (sofern vorhanden) eines Reporter-Konstrukts, dem ein hKLK2-TRE fehlt, wie getestet in einer Zelle, welche einem hKLK2-Enhancer oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlaubt.
Maximale Enhancer-Aktivität muss nicht („may not") immer notwendig sein, um ein gewünschtes Ergebnis zu erzielen. Beispielsweise verstärkt, wie in Beispiel 7 gezeigt, das 350 bp große hKLK2-"Core-Regulator"-Fragment (8021 bis 8371 von SEQ ID NO:1; –3993 bis –3643 relativ zur Transkriptionsstartstelle), wenn verknüpft mit dem hKLK2-Minimalpromotor (–234 bis +33 relativ zur Transkriptionsstartstelle), Aktivität eines Luciferase-codierenden Gens in LNCaP-Zellen in der Gegenwart von R1881 etwa 37-fach. Der Level an Induktion, der von dem 350 bp "core regulator"-Fragment hervorgebracht wird, kann in gewissen Anwendungen ausreichend sein, um ein gewünschtes Ergebnis zu erzielen. Beispielsweise ist es, wenn ein adenoviraler Vektor der Erfindung verwendet wird, um Zellen auf Androgen-Rezeptor-produzierende Aktivität zu überwachen, möglich, dass weniger als der maximale Grad an Ansprechempfindlichkeit von einem hKLK2-TRE ausreichen wird, um das Vorhandensein solcher Zellen qualitativ anzuzeigen. In ähnlicher Weise kann, falls verwendet, zur Behandlung oder Linderung eines Krankheitszustandes, weniger als maximale Ansprechempfmdlichkeit für das erwünschte Ergebnis ausreichend sein, wenn beispielsweise die Androgen-Rezeptor-produzierenden Zellen nicht besonders virulent sind und/oder das Ausmaß der Krankheit relativ beschränkt ist.
Verschiedene Replikations-kompetente Adenvirus-Vektoren können gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, bei welchen ein einzelnes oder mehrere Adenovirus-Gen(e) unter Kontrolle eines oder mehrerer hKLK2-TRE sind. Verfahren für das Erzeugen solcher Vektoren sind in den Beispielen 8 bis 10 bereitgestellt.
Beispielsweise kann ein hKLK2-TRE in einen Adenovirus-Vektor unmittelbar stromaufwärts von und funktionell verknüpft mit (d. h., auf solch eine Weise orientiert, dass er fähig ist, die Expression anzutreiben von) einem fühen Gen, wie z. B. E1A oder E1B, eingeführt werden.
Verschiedene andere Replikations-kompetente Adenovirus-Vektoren können gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, bei welchen zusätzlich dazu, dass sie ein Adenovirus-Gen/Adenovirus-Gene unter Kontrolle eines hKLK2-TRE aufweisen, ein anderes Adenovirus-Gen/andere Adenovirus-Gene unter Kontrolle eines weiteren heterologen (Nicht-Adenovirus)-Transkriptionskontrollelements sind. Dieses TRE kann ein Gewebe-spezifischer Promotor und/oder Enhancer sein, beispielsweise der PSE (Prostata-spezifisches Antigen-Enhancer) des Prostata-spezifisches Antigen (PSA)-Gens, welches bevorzugt in Prostatazellen exprimiert wird. Lundwall et al. (1987) FERS Lett. 214:317; Lundwall (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 161:1151; und Riegmann et al. (1991) Molec. Endocrin. 5:1921. Ein PSE ist zwischen Nucleotid –5322 und Nucleotid –3739 relativ zur Transkriptionsstartstelle des Prostataspezifisches Antigen-Gens lokalisiert. Schuur et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 7043–7051. Ein PSA-Promotor umfasst die Sequenz von etwa Nucleotid –540 bis etwa Nucleotid +8 relativ zum Transkriptionsstart des PSA-Gens. Nebeneinanderstellung dieser zwei genetischen Elemente erzielt ein vollständig funktionales minimales PSA-TRE. Siehe europäische Patentanmeldung Nr. EP 755 443 für die PSA-Promotor/Enhancer-Region. Alternativ kann ein PSA-TRE einen PSE und einen heterologen Promotor umfassen.
Dementsprechend ist eine Ausführungsform, bereitgestellt durch die Erfindung, ein Adenovirus-Vektor, umfassend ein erstes Gen unter transkriptionaler Kontrolle eines humanes glanduläres Kallikrein (hKLK2)-Transkriptionsregulationselements (hKLK2-TRE) und ein zweites Gen unter transkriptionaler Kontrolle eines PSA-TRE, wobei das hKLK2-TRE einen hKLK2-Enhancer, einen Promotor oder einen hKLK2-Promotor umfasst, und wobei das PSA-TRE einen Prostata-spezifischen Enhancer (PSE) und einen Promotor umfasst. Das erste Gen könnte ein für virale Replikation essentielles Gen, ein adenovirales Gen, welches zu Cytotoxizität beiträgt, oder ein heterologes Polynucleotid sein. Das zweite Gen könnte ein heterologes Polynucleotid, ein Gen, essentiell für virale Replikation, oder ein adenovirales Gen, welches zu Cytotoxizität beiträgt, sein. Demgemäß sind verschiedene Permutationen möglich und selbstverständlich.
Beispielsweise kann ein hKLK2-TRE in einen Adenovirus-Vektor unmittelbar stromaufwärts von und funktionell verknüpft mit einem frühen Gen, wie z. B. E1A, eingeführt werden, und der PSE kann unmittelbar stromaufwärts von und funktionell verknüpft mit einem weiteren frühen Gen, wie z. B. E1B, eingefÜhrt werden. Alternativ kann ein hKLK2-TRE stromaufwärts von und funktionell verknüpft mit E1B eingeführt werden, während der PSE unmittelbar stromaufwärts von und funktionell verknüpft mit E1A eingeführt wird.
In manchen Ausführungsformen stellt die Erfindung adenovirale Vektoren bereit, welche ein zusätzliches Adenovirus-Gen unter transkriptionaler Kontrolle eines zweiten hKLK2-TRE umfassen. Beispiele eines zusätzlichen Adenovirus-Gens unter transkriptionaler Kontrolle ist ADP (hierin diskutiert) und Gene, notwendig zur Replikation, wie z. B. frühe Gene. Beispielsweise kann ein adenoviraler Vektor so konstruiert sein, dass ein erstes hKLK2-TRE Transkription von einem frühen Gen, wie z. B. E1A oder E1B, reguliert, und ein zweites hKLK2-TRE Transkription eines weiteren frühen Gens reguliert. Diese Mehrfach-Konstrukte können insofern wünschenswerter sein, dass sie mehr als eine Quelle von Zellspezifität hinsichtlich der Replikation bereitstellen.
In einer Ausführungsform sind E1A und E1B unter Kontrolle von einem oder mehreren hKLK2-TREs, in dem das folgende Konstrukt hergestellt wird. Ein Fragment, das die codierende Region von E1A bis zu dem E1B-Promotor enthält, wird aus dem Ad-Genom ausgeschnitten und in umgekehrter Orientierung wieder eingesetzt. In dieser Konfiguration sind der E1A- und E1B-Promotor nebeneinander, gefolgt von E1A in entgegengesetzter Orientierung (so dass weder der E1A- noch der E1B-Promotor funktionell mit E1A verknüpft sind), gefolgt von E1B in umgekehrter Orientierung hinsichtlich E1A. Ein hKLK2-TRE/hKLK2-TREs kann/können zwischen den codierenden Regionen von E1A und E1B insertiert werden (welche in entgegengesetzter Orientierung sind), so dass diese Regionen unter Kontrolle des/der TRE(s) sind. Geeignete Promotorsequenzen werden proximal zu der E1A- und E1B-Region insertiert. Folglich kann ein hKLK2-TRE sowohl E1A als auch E1B steuern. Solch eine Konfiguration kann beispielsweise mögliche "loop-out"-Ereignisse verhindern, die auftreten können, wenn zwei hKLK2-TREs in ein intaktes (natives) Ad-Genom insertiert worden sind, eines jeweils 5' von den codierenden Regionen von E1A und E1B. Durch Einführen einer Polyklonierungsstelle zwischen E1A und E1B können andere Typen von TREs insertiert werden, wie z. B. ein carcinogenembryonales Antigen-TRE (CEA-TRE, "carcinogen embryonic antigen TRE"; ein Mucin-TRE (MU-TRE); oder andere Zell-spezifische regulatorische Elemente, vorzugsweise jene, die assoziiert sind mit einem Krankheitszustand, wie z. B. Neoplasma. Folglich kann dieses Konstrukt allgemeine Verwendung für Zell-spezifische, zeitliche oder andere Mittel der Kontrolle von Adenovirus-Genen E1A und E1B finden, wodurch ein bequemer und leistungsstarker Weg bereitgestellt ist, adenovirale Replikation von einem ausgewählten transkriptionalen Parameter abhängig zu machen.
Verschiedene andere Replikations-kompetente Adenovirus-Vektoren können gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, bei welchen zusätzlich zum Aufweisen ein(es) einzelnen/s oder mehrere Adenovirus-Gens/e unter Kontrolle eines hKLK2-TRE sind, ein Reportergen/Reportergene unter Kontrolle eines hKLK2-TREs sind.
Beispielsweise kann ein hKLK2-TRE in einen Adenovirus-Vektor unmittelbar stromaufwärts von und funktionell verknüpft mit einem frühen Gen, wie z. B. E1A oder E1B, eingeführt werden, und dieses Konstrukt kann auch ein zweites hKLK2-TRE enthalten, das Expression eines Reportergens, codierend ein Reporterprotein, einschließlich von, aber nicht limitiert auf Chloramphenicol-Acetyltransferase (CRT), β-Galactosidase (codiert von dem lacZ-Gen), Luci ferase, alkalische(r) Phosphatase, grün-fluoreszierendes/m Protein und Meerrettichperoxidase, steuert.
Die Größe eines hKLK2-TRE wird zum Teil durch die Kapazität des adenoviralen Vektors bestimmt werden, welche wiederum von der beabsichtigten Form des Vektors (siehe unten) abhängt. Im Allgemeinen ist eine minimale Größe bevorzugt, weil dies potentiellen Raum zur Insertion anderer Sequenzen liefert, welche wünschenswert sein kann/können, wie z. B. Transgene (unten diskutiert) oder andere zusätzliche regulatorische Sequenzen. Jedoch kann, wenn keine zusätzlichen Sequenzen in Erwägung gezogen werden oder falls beispielsweise ein adenoviraler Vektor frei von irgendwelchen viralen Verpackungsbeschränkungen aufrechterhalten und abgeliefert werden wird, eine größere DNA-Sequenz verwendet werden, solange der resultierende adenovirale Vektor Replikations-kompetent gemacht wird.
Falls keine Adenovirus-Sequenzen deletiert worden sind, kann ein adenoviraler Vektor mit Extrasequenzen, die sich zu etwa 5% der Genomgröße oder ungefähr 1,8 kb aufaddieren, verpackt werden. Wenn nicht-essentielle Sequenzen von dem Adenovirus-Genom entfernt werden, können zusätzliche 4,6 kb Insert toleriert werden (d. h., ein Gesamtwert von etwa 1,8 kb plus 4,6 kb, was etwa 6,4 kb ist). Beispiele nicht-essentieller adenoviraler Sequenzen, die deletiert werden können, sind E3 und E4 (solange der E4-ORF6 beibehalten wird).
Um nicht-spezifische Replikation zu minimieren, sollten endogene (d. h., Adenovirus-) TREs vorzugsweise entfernt werden. Dies würde auch mehr Platz für Inserts in einem adenoviralen Vektor bereitstellen, was von speziellem Belang sein kann, wenn ein adenoviraler Vektor als ein Virus verpackt werden wird (siehe unten). Noch wichtiger würde Deletion von endogenen TREs eine Möglichkeit eines Rekombinationsereignisses verhindern, wobei ein hKLK2-TRE deletiert wird und das endogene TRE Transkriptionskontrolle seiner entsprechenden Adenovirus-Codierungssequenzen übernimmt (was folglich nicht-spezifische Replikation erlaubt). In einer Ausführungsform wird ein adenoviraler Vektor der Erfindung so konstruiert, dass die endogenen Transkriptionskontrollsequenzen eines Adenovirus-Gens/von Adenovirus-Genen deletiert sind und ersetzt sind durch ein hKLK2-TRE. Jedoch können endogene TREs in dem Adenovirus-Vektor/in den Adenovirus-Vektoren beibehalten werden, vorausgesetzt, dass ausreichende Zell-spezifische Replikationspräferenz erhalten bleibt. Diese Ausführungsformen können konstruiert werden, indem man ein hKLK2-TRE bereitstellt, das zwischen dem endogenen TRE und dem Replikationsgen-Codierungssegment interveniert. Erforderliche Zell-spezifische Replikationspräferenz wird angezeigt durch Durchführen von Assays, die Replikation von dem Adenovirus-Vektor in einer Zelle, welche einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlaubt, mit Replikation in einer Zelle, welche dies nicht tut, vergleichen. Im Allgemeinen ist es beabsichtigt, dass Replikation über Basisleveln in der Targetzelle (d. h., AR-produzierenden Zelle) um wenigstens etwa 2-fach, vorzugsweise wenigstens etwa 5-fach, vorzugsweise wenigstens etwa 10-fach, stärker bevorzugt wenigstens etwa 20-fach, stärker bevorzugt wenigstens etwa 50-fach, stärker bevorzugt wenigstens etwa 100-fach, stärker bevorzugt wenigstens etwa 200-fach, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 400- bis etwa 500-fach, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 1000-fach, erhöht ist. Der akzeptable Unterschied kann empirisch bestimmt werden (unter Verwendung von beispielsweise Northern-Assays oder anderen im Fachgebiet bekannten Assays) und wird von der voraussichtlichen Verwendung des adenoviralen Vektors und/oder dem erwünschten Ergebnis abhängen.
Beliebige der verschiedenen Serotypen von Adenovirus können verwendet werden, wie z. B. Ad2, Ad5, Ad12 und Ad40. Für Zwecke der Veranschaulichung ist hierin der Serotyp Adenovirus 5 (Ad5) beispielhaft gezeigt.
Wenn ein hKLK2-TRE mit einem Adenovirus-Gen verwendet wird, das für Vermehrung essentiell ist, ist Replikationskompetenz vorzugsweise in den Zielzellen erzielbar, welche die Funktion eines hKLK2-TRE zulassen. Vorzugsweise ist das Gen ein frühes Gen, wie z. B. E1A, E1B, E2 oder E4. (E3 ist für virale Replikation nicht-essentiell.) Stärker bevorzugt ist das frühe Gen unter hKLK2-TRE-Kontrolle E1A und/oder E1B. Mehr als ein frühes Gen können unter Kontrolle eines hKLK2-TRE platziert sein. Beispiele 8 bis 10 liefern eine detailliertere Beschreibung solcher Konstrukte.
Das E1A-Gen wird unmittelbar nach viraler Infektion (0–2 Stunden) und vor irgendwelchen anderen viralen Genen exprimiert. E1A-Protein wirkt als ein trans-wirkender, positiv wirkender Transkriptionsregulationsfaktor und ist erforderlich für die Expression der anderen frühen viralen Gene E1B, E2, E3, E4 und der Promotor-proximalen späten Hauptgene ("maj or late genes"). Trotz der Nomenklatur werden die von dem späten Hauptpromotor gesteuerten Promotor-proximalen Gene während früher Phasen nach Ad5-Infektion exprimiert. Flint (1982) Biochem. Biophys. Acta 651:175–208; Flint (1986) Advances Virus Research 31:169–228; Grand (1987) Biochem. J. 241:25–38. In Abwesenheit eines funktionalen E1A-Gens schreitet die virale Infektion nicht voran, weil die Genprodukte, die für virale DNA-Replikation erforderlich sind, nicht produziert werden. Nevins (1989) Adv. Virus Res. 31:35–81. Die Transkriptionsstartstelle von Ad5-E1A ist bei Nucleotid 498, und die ATG-Startstelle des E1A-Proteins ist bei Nucleotid 560 im Virusgenom.
Das E1B-Protein wirkt in trans und ist notwendig für den Transport später mRNA vom Zellkern zum Cytoplasma. Defekte bei der E1B-Expression resultieren in schlechter Expression später viraler Proteine und einem Unvermögen, die Proteinsynthese der Wirtszelle abzuschalten. Der Promotor von E1B ist als das definierende Element des Unterschieds beim Wirts-Bereich von Ad40 und Ad5 ins Spiel gebracht worden: klinisch ist Ad40 ein Enterovirus, wohingegen Ad5 akute Konjunktivitis verursacht. Bailey et al. (1993) Virology 193:631; Bailey et al. (1994) Virology 202:695–706. Der E1B-Promotor von Ad5 besteht aus einer einzelnen hochaffinen Erkennungsstelle für Sp1 und einer TATA-Box.
Die E2-Region von Adenovirus codiert für Proteine, die in Bezug stehen zur Replikation des adenoviralen Genoms, einschließlich des 72 kDa DNA-Bindungsproteins, des 80 kDa "Precursor terminal-Proteins" und der viralen DNA-Polymerase. Die E2-Region von Ad5 wird in einer rechtsgerichteten Orientierung von zwei Promotoren, genannt E2 früh und E2 spät, transkribiert, die bei 76,0 bzw. 72,0 Karteneinheiten auf der Karte liegen. Während der E2 spät-Promotor während später Stufen der Infektion vorübergehend aktiv ist und unabhängig von dem E1A-Transaktivatorprotein ist, ist der E2 früh-Promotor während der frühen Phasen viraler Replikation entscheidend.
Der E2 früh-Promotor, der auf der Karte in Ad5 von 27050–27150 liegt, besteht aus einer Transkriptions-Hauptstartstelle und einer Transkriptions-Nebenstartstelle, wobei Letztere für etwa 5% der E2-Transkripte, zwei nicht-kanonische TATA-Boxen, zwei E2F-Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen und eine ATF-Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle verantwortlich ist.
Für einen detaillierten Übersichtsartikel der E2-Promotor-Architektur siehe Swaminathan et al., Curr. Topfics in Micro. and Imm. (1995) 199, Teil 3:177–194.
Der E2 spät-Promotor überlappt mit den codierenden Sequenzen eines Gens, das von dem Gegenstrang codiert wird und ist deshalb nicht zur genetischen Manipulation veränderbar. Jedoch überlappt der E2 früh-Promotor nur für ein paar Basenpaare mit Sequenzen, die ein 33 kDa-Protein auf dem Gegenstrang codieren. Bemerkenswerterweise ist die SpeI-Restriktionsstelle (Ad5-Position 27082) Teil des Stoppcodons für das oben erwähnte 33 kDa-Protein und trennt in bequemer Weise die E2 Früh-Haupttranskriptions-Startstelle und TATA-Bindungsproteinstelle von den stromaufwärts liegenden Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen E2F und ATF. Deshalb würde Insertion eines hKLK2-TRE, das SpeI-Enden aufweist, in die SpeI-Stelle in dem Plusstrang den endogenen E2 früh-Promotor von Ad5 stören und sollte AR-beschränkte Expression von E2-Transkripten erlauben.
Das E4-Gen hat eine Anzahl von Transkriptionsprodukten. Die E4-Region codiert für zwei Polypeptide, welche verantwortlich sind für das Stimulieren der Replikation viraler genomischer DNA und für das Stimulieren später Genexpression. Die Proteinprodukte von offenen Leserahmen (ORFs) 3 und 6 können beide diese Funktionen dadurch durchführen, dass sie an das 55 kDa-Protein von E1B und Heterodimere von E2F-1 und DP-1 binden. Das ORF 6-Protein erfordert für Aktivität Wechselwirkung mit dem E1B55-55-kDa-Protein, während dies das ORF 3-Protein nicht tut. In der Abwesenheit von funktionalem Protein von ORF 3 und ORF 6 werden Plaques mit einer Effizienz von weniger als 10^-6 mal der des Wildtyp-Virus produziert. Um die virale Replikation weiter auf AR-produzierende Zellen einzuschränken, können E4-ORFs 1–3 deletiert werden, was die virale DNA-Replikation und Synthese später Gene von E4-ORF 6-Protein abhängig macht. Durch Kombinieren solch einer Mutante mit Sequenzen, in welchen die E1B-Region durch ein hKLK2-TRE reguliert wird, kann ein Virus erhalten werden, in welchem sowohl die E1B-Funktion als auch die E4-Funktion von einem hKLK2-TRE abhängig sind, das E1B steuert.
Die späten Hauptgene, die für die vorliegende Erfindung relevant sind, sind L1, L2 und L3, welche Proteine des Ad5-Virus-Virions codieren. All diese Gene (die typischerweise für Strukturproteine codieren) sind wahrscheinlich zur adenoviralen Replikation erforderlich. Die späten Gene sind alle unter der Kontrolle des späten Hauptpromotors (MLP, "major late Promoter"), welcher in Ad5 bei +5986 bis +6048 lokalisiert ist.
Zusätzlich zum Verleihen selektiver cytotoxischer und/oder cytolytischer Aktivität aufgrund von bevorzugter Replikationskompetenz in Zellen, welche Funktion eines hKLK2-TRE zulassen, können die Adenovirus-Vektoren dieser Erfindung weiterhin ein heterologes Polynucleotid (Transgen) unter der Kontrolle eines hKLK2-TRE einschließen. Auf diese Weise können verschiedene genetische Fähigkeiten in Targetzellen, insbesondere Prostatakarzinom-Zellen, eingeführt werden. Beispielsweise kann es unter gewissen Umständen wünschenswert sein, den Grad und/oder die Rate von cytotoxischer Aktivität, bedingt durch beispielsweise das relativ refraktäre Wesen oder die spezielle Aggressivität der Targetzelle, zu verstärken. Dies könnte erreicht werden durch Koppeln der Zell-spezifischen replikativen cytotoxischen Aktivität mit Zell-spezifischer Expression von beispielsweise HSV-tk und/oder Cytosin-Deaminase (cd), was Zellen dazu fähig macht, 5-Fluorcytosin (5-FC) zu dem chemotherapeutischen Mittel 5-Fluoruracil (5-FU) zu metabolisieren. Das Verwenden dieser Typen von Transgenen kann auch einen Bystander-Effekt verleihen.
Andere wünschenswerte Transgene, die mittels eines Adenvirus-Vektors/mittels Adenovirus-Vektoren eingeführt werden können, schließen Gene ein, die cytotoxische Proteine codieren, wie z. B. die A-Ketten von Diphterietoxin, Ricin oder Abrin [Palmiter et al. (1987) Cell 50: 435; Maxwell et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7: 1576; Gehringer et al. (1988) Genes Dev. 2: 453; Messing et al. (1992) Neuron 8: 507; Piatak et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 4937; Lamb et al. (1985) Eur. J. Biochem. 148: 265; Frankel et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 415], Gene, die für einen Faktor codieren, der fähig ist, Apoptose zu initiieren, Sequenzen, die Antisense-Transkripte oder Ribozyme codieren, welche unter anderen Fähigkeiten gegen mRNAs gerichtet sein können, codierend Proteine, essentiell für die Proliferation, wie z. B. Strukturproteine oder Transkriptionsfaktoren; virale oder andere pathogene Proteine, wobei das Pathogen intrazellulär proliferiert, Gene, die manipulierte cytoplasmatische Varianten einer Nuclease (z. B. RNase A) oder Protease (z. B. Awsin, Papain, Proteinase K, Carboxypeptidase etc.) codieren oder das Fas-Gen und dergleichen codieren. Andere Gene von Interesse schließen Cytokine, Antigene, Transmembranproteine und dergleichen ein, wie z. B. IL-1, -2, -6, -12, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IFN-α, -β, -γ, TNF-α, -β, TGF-α, -β, NGF, und dergleichen. Die positiven Effektorgene könnten in einer frühen Phase verwendet werden, gefolgt von cytotoxischer Aktivität, bedingt durch Replikation.
In manchen Ausführungsformen wird das Adenvirus-Todesprotein (ADP, "adenovirus death Protein"), das innerhalb der E3-Region codiert wird, auch in dem Adenovirus-Vektor aufrechterhalten (d. h., ist dort enthalten). Das ADP-Gen, unter Kontrolle des späten Hauptpromoters (MLP), scheint für ein Protein (ADP) zu codieren, das dabei wichtig ist, Wirtszelllyse zu beschleunigen. Tollefson et al. (1996) J. Virol. 70(4):2296; Tollefson et al. (1992) J. Virol. 66(6):3633. Folglich können adenovirale Vektoren, die das ADP-Gen enthalten, den adenovira len Vektor wirksamer machen, was eine effektivere Behandlung und/oder ein niedrigeres Dosierungserfordernis möglich macht.
Demgemäß stellt die Erfindung adenovirale Vektoren bereit, die eine Polynucleotidsequenz einschließen, die ein ADP codiert. Eine DNA-Sequenz, die ein ADP codiert, und die Aminosäuresequenz eines ADP sind in (SEQ ID NO:4 bzw. SEQ ID NO:5) dargestellt. Kurz gesagt, wird eine ADP-codierende Sequenz vorzugsweise von Ad2 erhalten (weil dies der Stamm ist, in welchem ADP vollständiger charakterisiert worden ist) unter Verwendung von im Fachgebiet bekannter Techniken, wie z. B. von PCR. Vorzugsweise wird auch der "V-Leader" (welches eine wichtige Sequenz für korrekte Expressionen später Gene ist) erhalten und an die ADP-codierende Sequenz ligiert. Die ADP-codierende Sequenz (mit oder ohne den "V-Leader") kann dann in das adenovirale Genom, beispielsweise in der E3-Region (wo die ADP-codierende Sequenz von dem MLP oder dem E3-Promotor gesteuert werden wird) eingeführt werden. Die ADP-codierende Sequenz könnte auch an anderen Stellen des Adenvirus-Genoms, wie z. B. der E4-Region, insertiert werden. Alternativ könnte die ADP-codierende Sequenz funktionell mit einem heterologen Promotor (mit oder ohne Enhancer) verknüpft werden, der einschließt, aber nicht limitiert ist auf, einen anderen viralen Promotor, einen Gewebe-spezifischen Promotor wie z. B. AFP, karzinoembryonales Antigen (CEA, "carcinoembryonic antigen"), hKLK2, Mucin und Rattenprobasin.
Die adenoviralen Vektoren können in einer Vielzahl von Formen verwendet werden, die einschließen, aber nicht limitiert sind auf: nackte Polynucleotid (gewöhnlich DNA)-Konstrukte; Polynucleotid-Konstrukte, komplexiert mit Mitteln, um Eintritt in Zellen zu erleichtern, wie z. B. kationischen Liposomen oder anderen Verbindungen, wie z. B. Polylysin; verpackt in infektiöse Adenovirus-Partikel (welche den adenoviralen Vektor/die adenoviralen Vektoren immunogener machen können); verpackt in andere partikuläre virale Formen, wie z. B. HSV oder AAV; komplexiert mit Mitteln, um eine Immunreaktion zu verstärken oder zu dämpfen; komplexiert mit Mitteln, die in vivo-Transfektion erleichtern, wie z. B. DOTMA^TM, DOTAP^TM, und Polyaminen; oder in der Form irgendeines der hierin beschriebenen Abgabevehikel.
Wenn ein adenoviraler Vektor in ein Adenovirus gepackt wird, kann das Adenvirus selbst ausgewählt werden, um Targeting weiter zu verbessern. Beispielsweise vermitteln Adenovirus-Fasern den Erstkontakt mit einem zellulären Rezeptor/mit zellulären Rezeptoren, die/was beim Tropismus helfen/hilft. Siehe Amberg et al. (1997) Virol. 227:239–244. Wenn ein spezielles Subgenus eines Adenovirus-Serotyps Tropismus für einen Zielzell-Typ und/oder reduzierte Affinität für Nicht-Zielzell-Typen zeigen würde, könnte(n) ein solches Subgenus (oder solche Subgenera) verwendet werden, um Zellspezifität von Cytotoxizität und/oder Cytolyse weiter zu erhöhen.
Die Erfindung stellt außerdem einen Adenvirus-Vektor bereit, der einen hKLK2-Enhancer umfasst, wobei der Adenovirus-Vektor fähig ist, vorzugsweise in einer Zelle zu replizieren, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlaubt.
"Bevorzugt in einer Zelle zu replizieren, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlaubt" bedeutet, dass sich das Adenovirus in einer Zelle, die all die Faktoren und Cofaktoren produziert, die gebraucht werden, um einem hKLK2-Enhancer und einem Promotor zu erlauben, Transkription eines funktionell verknüpften Polynucleotids zu erhöhen, mehr repliziert, als in einer Zelle, die solche Faktoren und Cofaktoren nicht produziert. Vorzugsweise repliziert sich das Adenovirus bei einem signifikant höheren Level in einer Zelle, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlaubt, als in einer Zelle, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE nicht zu funktionieren erlaubt; vorzugsweise wenigstens etwa 2-fach höher, vorzugsweise wenigstens etwa 5-fach höher, stärker bevorzugt mindestens etwa 10-fach höher, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 50-fach höher, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 100-fach höher, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 400- bis etwa 500-fach höher, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 1000-fach höher, und am stärksten bevorzugt wenigstens etwa 1 × 10⁶ höher. Am stärksten bevorzugt repliziert sich das Adenovirus nur in einer Zelle, welche einem hKLK2-Enhancer oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlaubt (d. h., es repliziert sich nicht oder repliziert sich nur bei sehr geringen Leveln in einer Zelle, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE nicht zu funktionieren erlaubt).
Wirtszellen und Targetzellen
Die vorliegende Erfindung stellt auch Wirtszellen bereit, die die hierin beschriebenen adenoviralen Vektoren umfassen (d. h., damit transformiert sind). Sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Wirtszellen können verwendet werden, solange die Sequenzanforderungen zur Aufrechterhaltung in diesem Wirt, wie z. B. ein geeigneter Replikationsursprung/geeignete Replikationsursprünge, vorhanden sind. Als eine Annehmlichkeit sind auch selektierbare Marker bereitgestellt. Ein prokaryotischer Wirt schließt Bakterienzellen, beispielsweise E. coli und Mycobakterien, ein. Unter eukaryotischen Wirtszellen sind Hefe(-), Insekten-, Vogel-, Amphibien-, Pflanzen- und Säuger-Wirtszellen. Wirtsysteme sind im Fachgebiet bekannt und müssen hierin nicht im Detail beschrieben werden.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Targetzellen bereit, die die hierin beschriebenen adenoviralen Vektoren umfassen (d. h., damit transformiert sind). Geeignete Targetzellen für das Adenovirus schließen einen beliebigen eukaryotischen Zelltyp ein, der einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlaubt, vorzugsweise Säuger-Zelltypen, welche Prostatazellen sein können oder nicht. Vorzugsweise sind die Zellen Prostatazellen oder Zellen, abgeleitet von der Prostata, z. B. LNCaP-Zellen. Vorzugsweise produzieren die verwendeten Zellen endogenen Androgen-Rezeptor. Geeignete Targetzellen schließen auch beliebige Zellen ein, die Proteine und andere Faktoren produzieren, die notwendig sind für die Expression des Polynucleotids unter Kontrolle des hKLK2-TRE, welche ein AR sein können, ob der AR und/oder andere Faktoren, natürlich oder rekombinant produziert sind. Geeignete Targetzellen sind jene, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionie ren erlauben. Solche Zellen können durch ihre Fähigkeit, einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren zu erlauben, identifiziert und/oder charakterisiert werden.
Vergleiche zwischen oder unter verschiedenen hKLK2-TREs können bewertet werden durch Messen und Vergleichen der Expressionslevel innerhalb einer einzelnen Zelllinie, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlaubt. Es wird verstanden, dass absolute transkriptionale Aktivität eines hKLK2-TRE von mehreren Faktoren abhängen wird, wie z. B. der Art der Targetzelle, Verabreichungsart und Form eines hKLK2-TRE, und der codierenden Sequenz, deren Transkription erhöht werden soll. Um auf unterschiedliche verwendete Plasmidgrößen hin zu kompensieren, können Aktivitäten als relative Aktivität pro Mol transfiziertes Plasmid ausgedrückt werden. Alternativ kann der Transkriptionslevel (d. h., mRNA) unter Verwendung von Standard-Northern-Analyse und Hybridisierungstechniken gemessen werden. Transfektionslevel (d. h., Transfektionseffizienzen) werden gemessen durch Co-Transfizieren eines Plasmids, das ein unterschiedliches Reportergen unter Kontrolle eines unterschiedlichen TRE codiert, wie z. B. den unmittelbar frühen CMV-Promotor. Diese Analyse kann auch negative regulatorische Regionen, d. h. Silencer, anzeigen.
Die adenoviralen Vektoren können an eine Targetzelle in einer Vielzahl von Formen abgegeben werden, die einschließen, aber nicht limitiert sind auf, beliebige der oben beschriebenen Abgabevehikel, und auf eine Vielzahl von Wegen, die einschließen, aber nicht limitiert sind auf, allgemeine Transfektionsverfahren, die im Fachgebiet gut bekannt sind (wie z. B. Calciumphosphat-Präzipitation und Elektroporation), direkte Injektion und intravenöse Infusion. Die Abgabemittel werden zu einem großen Teil von dem speziellen adenoviralen Vektor (einschließlich seiner Form) sowie der Art und Lage der Zielzellen (d. h., ob die Zellen in vitro oder in vivo sind) abhängen.
Wenn in einem verpackten Adenovirus verwendet, können Adenvirus-Vektoren in einem geeigneten physiologisch annehmbaren Träger bei einer Dosis von etwa 10⁴ bis etwa 10¹⁴ verabreicht werden. Die Multiplizität der Infektion wird im Allgemeinen in dem Bereich von etwa 0,001 bis 100 sein. Wenn verabreicht als ein Polynucleotid-Konstrukt (d. h., nicht als ein Virus verpackt), können etwa 0,01 μg bis 1000 μg eines adenoviralen Vektors verabreicht werden. Die adenoviralen Vektoren können ein oder mehrere Male verabreicht werden, abhängig von der beabsichtigten Verwendung und dem Immunreaktionspotential des Wirts, oder können als multiple simultane Injektionen verabreicht werden. Wenn eine Immunreaktion nicht wünschenswert ist, kann die Immunreaktion durch Einsetzen einer Vielzahl von Immunsuppressiva verringert werden, um wiederholte Verabreichung ohne eine starke Immunreaktion zu erlauben. Wenn als eine andere virale Form, wie z. B. als HSV, verpackt, basiert eine zu verabreichende Menge auf Standardwissen über das spezielle Virus (welches beispielsweise aus der publizierten Literatur leicht erhältlich ist) und kann empirisch bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung schließt außerdem Zusammensetzungen ein, einschließlich von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die hierin beschriebenen adenoviralen Vektoren enthalten. Solche Zusammensetzungen sind verwendbar für in vivo-Verabreichung, beispielsweise wenn man den Grad an Transduktion und/oder die Effektivität von Zelltöten in einem Individuum misst. Vorzugsweise umfassen diese Zusammensetzungen weiterhin ein pharmazeutisch annehmbares Exzipiens. Diese Zusammensetzungen, welche eine wirksame Menge eines adenoviralen Vektors dieser Erfindung in einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipiens umfassen können, sind geeignet zur systemischen Verabreichung an Individuen in Einheits-Dosierungsformen, sterilen parenteralen Lösungen oder Suspensionen, sterilen nicht-parenteralen Lösungen oder oralen Lösungen oder Suspensionen, Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsionen und dergleichen. Formulierungen für parenterale und nicht-parenterale Arzneimittelabgabe sind im Fachgebiet bekannt und sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, Mack Publishing (1990), dargelegt. Zusammensetzungen schließen auch lyophilisierte und/oder rekonstituierte Formen der adenoviralen Vektoren (einschließlich jener, die als ein Virus, wie z. B. Adenovirus, verpackt sind) der Erfindung ein.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Kits, die einen adenoviralen Vektor dieser Erfindung enthalten. Diese Kits können für diagnostische und/oder Überwachungszwecke, vorzugsweise für Überwachen, verwendet werden. Prozeduren unter Verwendung dieser Kits können durch klinische Laboratorien, experimentelle Laboratorien, Ärzte oder Privatpersonen durchgeführt werden. Kits, (als Ausführungsformen) enthalten in dieser Erfindung, erlauben jemandem, die Anwesenheit von Androgen-Rezeptor-produzierenden Zellen in einer geeigneten biologischen Probe, wie z. B. Biopsieproben, zu detektieren.
Die Kits der Erfindung umfassen einen hierin beschriebenen adenoviralen Vektor in geeigneter Verpackung. Das Kit kann optional zusätzliche Komponenten bereitstellen, die bei der Prozedur nützlich sind, einschließlich von, aber nicht limitiert auf, Puffer(n), Entwicklungsreagentien, Markierungen, reagierende(n) Oberflächen, Detektionsmittel(n), Kontrollproben, Instruktionen und Informationen zur Interpretation.
Herstellung der Adenovirus-Vektoren der Erfindung
Die Adenovirus-Vektoren in dieser Erfindung können unter Verwendung rekombinanter Techniken hergestellt werden, die im Fachgebiet Standard sind. Im Allgemeinen wird ein hKLK2-TRE 5' von dem adenoviralen Gen von Interesse, vorzugsweise einem adenoviralen Gen, welches zu Cytotoxzität beiträgt, welches ein oder mehrere frühe Gene sein kann/können (obwohl ein spätes Gen/späte Gene verwendet werden kann/können) insertiert. Ein hKLK2-TRE kann hergestellt werden unter Verwendung von Oligonucleotid-Synthese (wenn die Sequenz bekannt ist) oder rekombinanten Verfahren (wie z. B. PCR und/oder Restriktionsenzymen). Zweckdienliche Restriktionsstellen, entweder in der natürlichen Adeno-DNA-Sequenz, oder eingeführt durch Verfahren, wie z. B. PCR oder ortsgerichtete Mutagenese, stellen eine Insertionsstelle für ein hKLK2-TRE bereit. Demgemäß können zweckdienliche Restriktionsstellen für das Annealing (d. h. Insertieren) eines hKLK2-TRE an den 5'- und 3'-Enden eines hKLK2-TRE unter Verwendung von rekombinanten Standardverfahren, wie z. B. von PCR, konstruiert werden.
Polynucleotide, verwendet für das Herstellen adenoviraler Vektoren dieser Erfindung, können erhalten werden unter Verwendung von Standardverfahren im Fachgebiet, wie z. B. von chemischer Synthese, rekombinanten Verfahren und/oder aus biologischen Quellen erhalten werden.
Adenovirale Vektoren, die alle Replikations-essentiellen Elemente enthalten, wobei die erwünschten Elemente (z. B. E1A) unter Kontrolle eines hKLK2-TREs sind, werden in günstiger Weise hergestellt durch homologe Rekombination oder in vitro-Ligation von zwei Plasmiden, wobei eines den linksseitigen Anteil von Adenovirus liefert und das andere den rechtsseitigen Anteil liefert, von welchen eines oder beide wenigstens ein Adenovirus-Gen unter Kontrolle eines hKLK2-TRE enthält. Wenn homologe Rekombination verwendet wird, sollten die zwei Plasmide wenigstens etwa 500 bp Sequenzüberlappung teilen. Jedes Plasmid kann, wie gewünscht, unabhängig manipuliert werden, gefolgt von Co-Transfektion in einen kompetenten Wirt, der komplementierende Gene, wie geeignet, oder die geeigneten Transkriptionsfaktoren zur Initiierung der Transkription von einem hKLK2-TRE zur Vermehrung des Adenovirus bereitstellt. Plasmide werden im Allgemeinen in eine geeignete Wirtszelle, wie z. B. 293-Zellen oder LNCaP-Zellen etc., unter Verwendung geeigneter Mittel der Transduktion, wie z. B. kationischer Liposomen, eingeführt. Alternativ kann in vitro-Ligation der rechts- und linksseitigen Anteile des Adenovirus-Genoms verwendet werden, um ein rekombinantes Adenovirus-Derivat zu konstruieren, das alle Replikations-essentiellen Anteile des Adenovirus-Genoms enthält. Berkner et al. (1983) Nucleic Acid Research 11:6003–6020; Bridge et al. (1989) J. Virol. 63:631–638.
Als Annehmlichkeit sind Plasmide erhältlich, die die notwendigen Anteile von Adenovirus bereitstellen. Plasmid pXC.1 (McKinnon (1982) Gene 19:33–42) enthält das linksseitige Wildtyp-Ende von AdS, von Adenovirus 5-Nucleotid 22 bis 5790. pBHG10 (Bett et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8802–8806; Microbix Biosystems Inc., Toronto) liefert das rechtsseitige Ende von AdS, mit einer Deletion in E3. Die Deletion in E3 schafft Raum in dem Virus, um ein 3 kb hKLK2-TRE zu insertieren, ohne den endogenen Enhancer-Promotor zu deletieren. Das Gen für E3 ist auf dem Gegenstrang von E4 (r-Strang) lokalisiert. pBHG11 [Bett et al. (1994)] liefert eine noch größere E3-Deletion (zusätzliche 0,3 kb sind deletiert).
Zur Manipulation der frühen Gene ist die Transkriptionsstartstelle von Ad5-E1A bei Nucleotid 498, und die ATG-Startstelle des codierenden Segments dieses Gens ist bei Nucleotid 560 im Virusgenom. Diese Region kann verwendet werden zur Insertion eines hKLK2-TRE. Eine Restriktionsstelle kann durch Einsatz von PCR eingeführt werden, wobei der Primer, der eingesetzt wird, auf das Ad5-Genom limitiert sein kann oder einen Anteil des Plasmids involvieren kann, der die genomische Ad5-DNA trägt. Beispielsweise können die Primer, wo pBR322 verwendet wird, die EcoRI-Stelle in dem pBR322-Rückgrat und die XbaI-Stelle an Nucleotid 1339 von Ad5 verwenden. Durch Durchführen der PCR in zwei Stufen kann man, wo überlappende Primer im Zentrum der Region eine 30-Sequenz-Änderung einführen, die in einer einzigartigen Restriktionsstelle resultieren, für Insertion eines hKLK2-TRE an dieser Stelle sorgen.
Eine ähnliche Strategie kann verwendet werden für die Insertion eines hKLK2-TRE, um E1B zu regulieren. Der E1B-Promotor von Ad5 besteht aus einer einzelnen Erkennungsstelle hoher Affinität für SpI und einer TATA-Box. Diese Region erstreckt sich von Ad5-Nucleotid 1636 bis 1701. Durch Insertion eines hKLK2-TRE in dieser Region kann man für Zellspezifische Transkription des E1B-Gens sorgen. Durch Einsetzen der linksseitigen Region, modifiziert mit dem zellspezifischen Reaktionselement, das E1A reguliert, als die Matrize für das Einführen eines hKLK2-TRE, um R1B zu regulieren, wird der resultierende Adenovirus-Vektor von den Zell-spezifischen Transkriptionsfaktoren zur Expression von sowohl E1A als auch E1B abhängig sein. Beispiel 9 liefert eine detailliertere Beschreibung, wie solche Konstrukte hergestellt werden können.
Gleichermaßen kann ein hKLK2-TRE stromaufwärts des E2-Gens insertiert werden, um seine Expression Zell-spezifisch zu machen. Der E2 früh-Promotor, der in Ad5 von 27050-27150 auf der Karte liegt, besteht aus einer Haupt- und einer Nebentranskriptionsstartstelle, wobei die Letztere zu etwa 5% der E2-Transkripte, zwei nicht-kanonischen TATA-Boxen, zwei E2F-Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen und einer ATF-Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle beiträgt (für einen detaillierten Übersichtsartikel über die E2-Promotor-Architektur siehe Swaminathan et al., Curr. Topics in Microbiol. and Immunol. (1995) 199 Teil 3:177–194.
Der E2 spät-Promotor überlappt mit den codierenden Sequenzen eines Gens, codiert von dem Gegenstrang, und ist deshalb nicht für genetische Manipulation zugänglich. Jedoch überlappt der E2 früh-Promotor nur ein paar Basen lang mit Sequenzen, die für ein 33 kDa-Protein auf dem Gegenstrang codieren. Bemerkenswerterweise ist die SpeI-Restriktionsstelle (Ad5-Position 27082) Teil des Stoppcodons für das oben erwähnte 33 kDa-Protein und trennt auf praktische Weise die E2 früh-Haupttranskriptionsstartstelle und TATA-Bindungsprotein-Stelle von den stromaufwärts liegenden Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen E2F und ATF. Deshalb würde Insertion eines hKLK2-TRE, das SpeI-Enden aufweist, in die SpeI-Stelle in dem Plusstrang den endogenen E2 früh-Promotor von Ad5 stören und sollte AR-beschränkte Expression von E2-Transkripten erlauben.
Für E4 muss man den rechtsseitigen Anteil des Adenovirus-Genoms verwenden. Die E4-Transkriptionsstartstelle ist hauptsächlich bei Nucleotid 35609, die TATA-Box bei Nucleotid 35638 und das erste AUG/CUG von ORF1 ist bei Nucleotid 35532. Virtanen et al. (1984) J. Virol. 51:822–831. Unter Verwendung irgendeiner der obigen Strategien für die anderen Gene kann hKLK2-TRE stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle eingeführt werden. Für die Konstruktion von Mutanten in der E4-Region werden die Co-Transfektion und homologe Rekombination in W162-Zellen (Weinberg et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:5383–5386) durchgeführt, welche E4-Proteine in trans bereitstellen, um Defekte bei der Synthese dieser Pro teine zu komplementieren. Verfahren für das Verpacken von Adenovirus-Polynucleotiden in Adenovirus-Partikel sind im Fachgebiet bekannt und sind in den Beispielen beschrieben.
Verfahren unter Verwendung der Adenovirus-Vektoren der Erfindung
Die adenoviralen Vektoren des Gegenstands (der Erfindung) können für eine breite Vielzahl von Zwecken verwendet werden, welche mit dem erwünschten oder beabsichtigten Ergebnis variieren werden. Dementsprechend beinhaltet die vorliegende Erfindung Verfahren unter Verwendung der adenoviralen Vektoren, die oben beschrieben sind.
In einer Ausführungsform sind Verfahren bereitgestellt für das Verleihen selektiver Cytotoxizität in Zellen, welche Funktion eines hKLK2-Enhancers und/oder eines hKLK2-TRE zulassen, umfassend in-Kontakt-Bringen von Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, vorzugsweise Androgen-Rezeptor-produzierenden Zellen, mit einem hierin beschriebenen Adenovirus-Vektor, so dass der Adenovirus-Vektor/die Adenovirus-Vektoren in die Zelle(n) eintritt/eintreten, d. h. diese transduziert/transduzieren. Cytotoxizität kann unter Verwendung von Standardassays im Fachgebiet, wie z. B. Farbstoffausschluss, ³H-Thymidin-Einbau und/oder Lyse gemessen werden.
In einer anderen Ausführungsform sind Verfahren bereitgestellt für das Vermehren eines Adenovirus, spezifisch für Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, welche Funktion eines hKLK2-Enhancers und/oder eines hKLK2-TRE zulassen. Diese Verfahren bringen Kombinieren eines Adenovirus-Vektors mit Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, welche Funktion eines hKLK2-Enhancers und/oder eines hKLK2-TRE zulassen, mit sich, wobei das Adenovirus vermehrt wird.
Eine weitere Ausführungsform stellt Verfahren für das Töten von Zellen bereit, die einem PB-TRE zu funktionieren erlauben, wie z. B. Zellen, die den Androgen-Rezeptor in einem Gemisch von Zellen exprimieren, umfassend Kombinieren des Gemisches von Zellen mit einem Adenovirus-Vektor der vorliegenden Erfindung. Das Gemisch von Zellen ist im Allgemeinen ein Gemisch von normalen Zellen und Krebszellen, die Androgen-Rezeptor produzieren, und kann ein in vivo-Gemisch oder in vitro-Gemisch sein.
Die Erfindung beinhaltet außerdem Verfahren für das Detektieren, in einer biologischen Probe, von Zellen, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlauben. Diese Verfahren sind insbesondere verwendbar für das Überwachen des klinischen und/oder physiologischen Zustands eines Individuums (d. h., Säugers), sei es in einem experimentellen oder klinischen Setting. Für diese Verfahren werden Zellen einer biologischen Probe in Kontakt gebracht mit einem Adenvirus-Vektor der Erfindung, und Repliaktion des adenoviralen Vektors oder Expression eines Polynucleotids, enthalten innerhalb des adenoviralen Vektors, dessen Produkt ein detektierbares Signal produzieren kann, wird detektiert. Eine geeignete biologische Probe ist eine, in der Zellen, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlauben, vorhanden sein können oder von der man annimmt, dass solche Zellen vorhanden sind. Im Allgemeinen ist bei Säugern eine geeignete klinische Probe eine, bei welcher man annimmt, dass Krebszellen, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlauben, wie z. B. Prostatakrebszellen, vorhanden sind.
Solche Zellen können beispielsweise erhalten werden durch Nadelbiopsie oder eine andere chirurgische Vorgehensweise. Zellen, die in Kontakt gebracht werden sollen, können behandelt werden, um Assaybedingungen, wie z. B. selektive Anreicherung und/oder Solubilisierung, zu fördern. In diesen Verfahren können Zellen, welche einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlauben, unter Verwendung von in vitro-Assays, die Proliferation detektieren, welche im Fachgebiet Standard sind, detektiert werden. Beispiele solcher Standardessays schließen ein, sind aber limitiert auf, Burst-Assays (welche Virusausbeuten messen) und Plaque-Assays (welche infektiöse Partikel pro Zelle messen). Außerdem kann Vermehrung detektiert werden durch Messen spezifischer adenoviraler DNA-Replikation, wobei dies auch Standardessays sind. Alternativ können Zellen, die einem hKLK2-Enhancer und/oder einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlauben, detektiert werden, wenn der adenovirale Vektor ein Polynucleotid umfasst, dessen Expressionsprodukt ein detektierbares Signal produzieren kann. Beispiele beinhalten Reportergene, wie hierin beschrieben.
Die Erfindung stellt außerdem Verfahren für das Modifizieren des Genotyps einer Targetzelle bereit, umfassend in-Kontakt-Bringen der Targetzelle mit einem Adenovims-Vektor, der hierin beschrieben ist, wobei der adenovirale Vektor in die Zelle eintritt.
Die Erfindung stellt ferner Verfahren für das Supprimieren von Tumorzellwachstum bereit, umfassend in-Kontakt-Bringen einer Tumorzelle mit einem adenoviralen Vektor der Erfindung, so dass der adenovirale Vektor in die Tumorzelle eintritt und für die Tumorzelle selektive Cytotoxizität ausübt. Tumorzellwachstum kann durch beliebige Mittel, die im Fachgebiet bekannt sind, bewertet werden, die Mittel einschließen, aber nicht limitiert sind auf, Messen von Tumorgröße, Bestimmen, ob Tumorzellen proliferieren, unter Verwendung eines ³H-Thymidin-Einbau-Assays, oder Zählen von Tumorzellen. "Supprimieren" von Tumorwachstum bedeutet irgendeinen oder alle der folgenden Zustände: Verlangsamen, Verzögern und Stoppen von Tumorwachstum, sowie Tumorschrumpfung. "Supprimieren" von Tumorwachstum zeigt einen Wachstumszustand an, der, wenn verglichen mit Wachstum ohne Kontakt mit, d. h., Transfektion mit einem adenoviralen Vektor der Erfindung, eingeschränkt ist.
Die Erfindung stellt außerdem Verfahren für das Herabsetzen der Spiegel eines Tumorzellmarkers in einem Individuum bereit, umfassend Verabreichen eines adenoviralen Vektors der vorliegenden Erfindung an das Individuum, wobei der adenovirale Vektor selektiv cytotoxisch gegenüber Zellen ist, die den Tumorzellmarker produzieren. Tumorzellmarker schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, PSA, karzinoembryonales Antigen und hK2. Verfahren zum Messen der Spiegel eines Tumorzellmarkers sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, immunologische Assays, wie z. B. Enzymverknüpften Immunosorptions-Assay (ELISA), unter Verwendung von Antikörpern, spezifisch für den Tumorzellmarker. Im Allgemeinen wird eine biologische Probe aus dem zu testenden Individuum erhalten, und ein geeigneter Assay, wie z. B. ein ELISA, wird an der biologischen Probe durchgeführt.
Die Erfindung stellt außerdem Behandlungsverfahren bereit, in welchen eine effektive Menge eines adenoviralen Vektors/von adenoviralen Vektoren, der/die hierin beschrieben ist/sind, an ein Individuum verabreicht wird/werden. Behandlung unter Verwendung eines adenoviralen Vektors/von adenoviralen Vektoren ist in Individuen mit Tumoren, wie z. B. Prostatakarzinom, angezeigt. Außerdem indiziert sind Individuen, von welchen man annimmt, dass sie ein Risiko für das Entwickeln von Prostata-assoziierten Krankheiten haben, wie z. B. jene, welche eine Krankheit gehabt haben, welche resezerniert worden ist, und jene, welche eine Familiengeschichte Prostata-assoziierter Krankheiten gehabt haben. Bestimmung der Eignung der Verabreichung von (einem) adenovirale(n) Vektor(en) der Erfindung wird unter anderem von untersuchbaren klinischen Parametern, wie z. B. serologischen Indikationen und histologischer Untersuchung von Gewebebiopsien, abhangen. Im Allgemeinen wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend (einen) adenoviral(en) Vektor(en) verabreicht. Pharmazeutische Zusammensetzungen sind oben beschrieben.
Die Menge von zu verabreichendem/n adenoviralem/n Vektor(en) wird von verschiedenen Faktoren abhangen, wie z. B. Verabreichungsroute, dem Zustand des Individuums, dem Aggressivitätsgrad der Krankheit, dem speziellen eingesetzten hKLK2-TRE und dem speziellen Vektorkonstrukt (d. h., welches Adenvirus-Gen/welche Adenovirus-Gene unter hKLK2-TRE-Kontrolle ist/sind).
Wenn als ein verpacktes Adenovirus verabreicht, von etwa 10⁴ bis etwa 10¹⁴, vorzugsweise von etwa 10⁴ bis etwa 10¹², stärker bevorzugt von etwa 10⁴ bis etwa 10¹⁰. Wenn als ein Polynucleotidkonstrukt (d. h., nicht als ein Virus verpackt) verabreicht, können etwa 0,01 μg bis etwa 100 μg verabreicht werden, vorzugsweise 0,1 μg bis etwa 500 μg, stärker bevorzugt etwa 0,5 μg bis etwa 200 μg. Mehr als ein adenoviraler Vektor kann entweder simultan oder sequenziell verabreicht werden. Verabreichungen werden typischerweise periodisch gegeben, während jedwede Reaktion überwacht wird.
Die adenoviralen Vektoren der Erfindung können alleine verwendet werden oder im Zusammenhang mit anderen aktiven Mitteln, wie z. B. Chemotherapeutika, die das erwünschte Ziel fördern.
Screeningverfahren unter Verwendung eines hKLK2-TRE
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für das Screening von Verbindungen zur Behandlung von Prostatakrebs bereit, die Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, einsetzen, die ein Expressionskonstrukt umfassen. Das Expressionskonstrukt umfasst ein hKLK2-Transkriptionsregulationelement (hKLK2-TRE) und ein Reportergen, dessen Expressionsprodukt ein detektierbares Signal liefert. Das hKLK2-TRE umfasst einen hKLK2 und eine Promotor, und das Reportergen ist unter der transkriptionalen Kontrolle eines hKLK2-TRE. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

a) Kombinieren von Zellen mit einer Kandidatenverbindung in Gegenwart eines geeigneten induzierenden Mittels für eine ausreichende Zeit zur detektierbaren Expression des Reportergens; und
b) Detektieren des Expressionslevels des Reportergens, im Vergleich zu dem Exressionslevel in Abwesenheit der Kandidatenverbindun.

Die Screeningverfahren beinhalten Einführen eines Expressionskonstrukts, umfassend ein hKLK2-TRE, funktionell verknüpft mit einem Reportergen, in Zellen, welche einem hKLK2-Enhancer zu funktionieren erlauben. Ein hKLK2-TRE kann funktionell verknüpft sein mit einem Reportergen ("reported gene") und in eine Vielzahl von Vektoren insertiert sein. Wirtszellen werden dann transfiziert oder transformiert mit Vektoren, die ein hKLK2-TRE, verknüpft mit einem Reportergen, enthalten, und werden in konventionellen Nährstoffmedien kultiviert, die, wie beispielsweise für das Selektieren von Transformanten geeignet, modifiziert sind.
Zell-basierte Screening-Assays der vorliegenden Erfindung können entworfen werden, z. B. durch Konstruieren von Zelllinien, in welchen die Expression eines Reporterproteins, d. h., eines leicht zu untersuchenden Proteins, wie z. B. von β-Galactosidase, Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), grün-fluoreszierendem Protein (GFP) oder Luciferase, von der Funktion eines hKLK2-TRE abhängig ist. Beispielsweise kann ein DNA-Konstrukt, umfassend ein hKLK2-TRE, funktionell verknüpft sein mit einem Gen, codierend Luciferase, wie in Beispiel 2 beschrieben. Das resultierende DNA-Konstrukt, das die Luciferase-codierende DNA umfasst, wird stabil oder transient in eine Wirtszelle transfiziert (siehe Beispiel 3). Die Zelle wird einer Testverbindung und einem geeigneten induzierenden Mittel, wie z. B. einem Androgen, gegenüber ausgesetzt, und nach einer Zeit, die ausreichend ist, um Luciferase-Expression zu bewirken, werden die Zellen auf die Produktion von Luciferase hin mittels Standard-Enzymassays untersucht (siehe Beispiel 3).
Ein hKLK2-TRE umfasst einen hKLK2-Enhancer und einen Promotor. Für die hierin beschriebenen Screeningverfahren beinhaltet ein hKLK2-Enhancer eine isolierte Polynucleotidsequenz, umfassend Nucleotide von etwa 8021 bis etwa 8371 von SEQ ID NO:! (was etwa –3993 bis etwa –3643 relativ zu der hKLK2-Transkriptionssartstelle entspricht) und aktive Fragmente davon. Er beinhaltet außerdem eine isolierte Polynucleotidsequenz, umfassend Nucleotide von etwa 7200 bis etwa 8371 von SEQ ID NO:1 (was etwa –4814 bis etwa –3643 relativ zur hKLK2-Transkriptionsstartstelle entspricht) und aktive Fragmente davon. Der Promotoranteil des hKLK2-TRE kann heterolog sein oder kann ein hKLK2-Promotor sein.
Reportergene, welche eingesetzt werden können, sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und schließen ein, sind aber nicht limitiert auf Luciferase, "Aequorian" (d. h., grünfluoreszierendes Protein von Aequorea victoria); β-Galactosidase, Chloramphenicol-Acetyltransferase; immunologisch detektierbare Protein-"Tags", wie z. B. humanes Wachstumshormon; und dergleichen. Siehe beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., Hrsg., 1987) und periodische Aktualisierungen. Ein beliebiger Assay, welcher ein Produkt des Reportergens detektiert, entweder durch direktes Detektieren des Proteins, codiert von dem Reportergen, oder durch Detektieren eines enzymatischen Produkts eines Reportergencodierten Enzyms, ist für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Assays schließen colorimetrische, fluorimetrische Assays oder Lumineszenz-Assays ein oder sogar, im Fall von Protein-Tags, Radioimmunassays oder andere immunologische Assays.
Ein rekombinantes Polynucleotid, umfassend ein hKLK2-TRE oder aktives Fragment davon, sowie jene, welche andere hKLK2-Transkriptionsregulationselemente, die hierin beschrieben sind, umfassen können, können mittels einer beliebigen Technik, die dem Fachmann auf dem Gebiet (bekannt ist), unter Verwendung der hierin bereitgestellten Sequenzinformation hergestellt werden.
Ein Konstrukt kann in einen geeigneten Vektor für die Zwecke der Vermehrung oder der Expression inkorporiert sein. Solche Vektoren schließen prokaryotische Plasmide, eukaryotische Plasmide und viralen Vektoren ein, und die Auswahl des Vektors hängt von dem Design des Screeningassays, der beteiligten Zelltypen und anderen Faktoren ab. Expressionskonstrukte, umfassend ein hKLK2-TRE, schließen Plasmid(-) und virale Vektoren ein, insbesondere Adenovirus-Vektoren, wie hierin beschrieben, bei welchen das hKLK2-TRE etwa 8021 bis etwa 8371 von SEQ ID NO:1 (was etwa –3993 bis etwa –3643 relativ zu der hKLK2-Transkriptionsstartstelle entspricht) und aktive Fragmente davon, und von etwa 7200 bis etwa 8371 von SEQ ID NO:1 (was zu etwa –4814 bis etwa –3643 relativ zu der hKLK2-Transkriptionsstartstelle entspricht) und aktive Fragmente davon umfasst.
Für das Herstellen eines Expressionskonstrukts, umfassend ein hKLK2-TRE, funktionell verknüpft mit einem Reportergen, zur Verwendung in den Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung kann ein Polynucleotid, umfassend ein hKLK2-TRE, funktionell verknüpft mit einem Reportergen, in einen geeigneten Vektor insertiert werden, und der Vektor kann wiederum eingeführt werden in eine geeignete Wirtszelle zur Replikation und Amplifikation. Polynucleotide können in Wirtszellen mittels beliebiger im Fachgebiet bekannter Verfahren insertiert werden. Zellen werden durch Einführen eines exogenen Polynucleotids durch direkte Aufnahme, Endocytose, Transfektion, f-Mating oder Elektroporation transformiert. Sobald eingeführt, kann das exogene Polynucleotid innerhalb der Zelle als ein nicht-integrierter Vektor (wie z. B. ein Plasmid) oder integriert in das Wirtszellgenom aufrechterhalten werden. Das so amplifizierte Polynucleotid kann aus den Wirtszellen mittels innerhalb des Fachgebiets gut bekannter Verfahren isoliert werden. Siehe z. B. Sambrook et al. (1989).
Die Zellen, welche geeignet sind zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung hinsichtlich Screening von Verbindungen auf mögliche therapeutische Verwendung bei der Behandlung von Prostatakrebs, sind beliebige eukaryotische Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, welche einem hKLK2-TRE zu funktionieren erlauben. Vorzugsweise sind die Zellen Prostatazellen, stärker bevorzugt exprimierend Androgen-Rezeptor, noch stärker bevorzugt Prostataepithelzellen, die endogenen Androgen-Rezeptor exprimieren. Die eingesetzten Zellen können jene sein, die von der Prostata stammen. Solche Zellen schließen ein, sind aber nicht. limitiert auf, die LNCaP-Zelllinie (erhältlich von der American Type Culture Collection unter ATCC CRL 1740). Alternativ brauchen die Zellen nicht von der Prostata abgeleitet sein, solange die hKLK2-TRE-Funktion in ausreichender Weise aufrechterhalten ist.
Nach Selektieren von Kinnen, welche ausreichende Level an Reportergen-Aktivität zeigen, wenn sie mit Aasdrogen induziert sind, kann das Induktionsverhältnis durch Durchführen limitierter Verdünnung mit den Zellen und Screening der resultierenden Klone weiter verstärkt werden. Auf diese Weise kann die Induktion wenigstens 20-fach, wenn induziert, mit einem induzierenden Mittel, wie z. B. 0,1–1,0 nM R1881, vorzugsweise wenigstens etwa 50-fach, und stärker bevorzugt wenigstens etwa 100-fach sein. Für gewöhnlich wird die Induktion etwa 500-fach nicht übersteigen.
Ein induzierendes Mittel kann irgendeine Verbindung sein, welche der Wachstumsumgebung der Zelle zugesetzt wird und welche bei Kontakt mit und/oder Eintritt in die Zelle in der transkriptionalen Aktivierung eines hKLK2-TRE resultiert. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein "geeignetes induzierendes Mittel" eines, welches spezifisch die Expression eines hKLK2-TRE induziert, welches funktionell mit einem Reportergen verknüpft ist. Beispielsweise ist ein hKLK2-Enhancer mit Aasdrogen induzierbar. Ein Beispiel eines induzierenden Mittels, das verwendet wird, ist R1881.
Wenn das induzierende Mittel ein Aasdrogen ist, werden Zellen wünschenswerterweise in Hormon-freiem Medium kultiviert, z. B. RPMI-Medium, supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum, 100 Units/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, und in Hormon-gespiketem („spiked") Medium, z. B. 10% "Strip-Serum"-RPMI mit Hormon, untersucht. Wünschenswerterweise sollten die Zellen nicht mehr als 50 Mal, stärker bevorzugt nicht mehr als 25 Mal passagiert worden sein.
Sobald ein hKLK2-TRE-Reportergen-Konstrukt in die Wirtszelle eingeführt worden ist und stabile Zelllinien hergestellt sind, können die Zellen in einem geeigneten Wachstumsmedium kultiviert werden, dann, zusammen mit einem induzierenden Mittel, einem Mittel gegenüber exponiert werden, dessen Fähigkeit, die Aktivität von hKLK2-TRE zu modulieren, getestet werden soll.
Stabile Zelllinien, umfassend ein Expressionskonstrukt, welches ein hKLK2-TRE umfasst, das Expression eines Reportergens steuert, können erzeugt werden zur Verwendung in den Screeningverfahren, wie oben beschrieben. Alternativ können geeignete Zellen transient mit den Expressionskonstrukten transfiziert werden, die Zellen in einem geeigneten Wachstumsmedium kultiviert werden und dann zusammen mit einem induzierenden Mittel einem Mittel gegenüber ausgesetzt werden, dessen Fähigkeit, die Aktivität des hKLK2-TRE zu modulieren, getestet werden soll. Verfahren für die transiente Transfektion sind im Fachgebiet bekannt.
Das verwendete Reportergen kann Luciferase-Aktivität codieren, und ein Assaysystem kann so ausgewählt werden, dass das Produkt der Luciferase-Aktivität lumineszent ist. Lumi neszenz kann in Übereinstimmung mit konventionellen kommerziellen Kits, z. B. dem "enhanced luciferase assay kit" (Analytical Luminescence Laboratory, MI) bestimmt werden. Die Zellen können in Multiwell-Platten verteilt werden, welche von einem Luminometer aufgenommen werden können. Eine bekannte Anzahl von Zellen wird in jede einzelne der Vertiefungen in einem geeigneten Medium eingebracht, die Kandidatenverbindung wird zugegeben, und die Kultur wird wenigstens 12 Stunden lang, gewöhnlicher wenigstens etwa 24, und nicht mehr als etwa 60 Stunden lang, insbesondere etwa 48 Stunden lang, aufrechterhalten. Die Kultur wird dann in einem geeigneten Puffer unter Verwendung eines nicht-ionischen Detergens, z. B. 1% Triton X-100, lysiert. Die Zellen werden dann umgehend untersucht. Im Zusammenhang mit der Kandidatenverbindung wird auch eine induzierende Verbindung, z. B. Androgene, zugegeben werden, wie z. B. Methyltrienolen (R1881) oder Dihydrotestosteron (DHT). Die Konzentration dieser induzierenden Mittel wird abhängig von der Art des Mittels variieren, wird jedoch ausreichend sein, um Expression zu induzieren. Die Konzentration bei R1881 wird im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,1–10 nM, und vorzugsweise etwa 1 nM, sein.
In dieser Ausführungsform wird ein Androgen oder anderes induzierendes Mittel dem Kulturmedium zu etwa der gleichen Zeit wie die zu testende Verbindung zugesetzt, und nach einer geeigneten Zeit werden Zellen auf die Menge eines Reportergenprodukts hin getestet. Eine "geeignete Zeit" bedeutet bei diesem Assay eine Menge an Zeit, die ausreichend ist, damit das zu testende Mittel eine Änderung bei den Leveln des Reportergenprodukts bewirken kann, so dass ein Unterschied zu der Kontrolle gemessen werden kann. Diese Zeitspanne kann von der Stabilität der Reportergen-Messenger-RNA oder des (Reportergen-)Proteins abhängen, davon abhängen, wie leicht das Mittel in die Zelle eintritt, wie stabil das Mittel ist, sobald es in die Zelle eintritt und/oder von anderen Faktoren abhängen. Im Allgemeinen muss eine geeignete Zeit empirisch bestimmt werden, und dies liegt klar innerhalb des Könnens eines Durchschnittsfachmanns auf dem Gebiet. Eine Abnahme oder Zunahme in dem Level an Reportergenprodukt von etwa 25% bis etwa 40%, stärker bevorzugt von etwa 40% bis etwa 70%, und am stärksten bevorzugt von etwa 70% bis etwa 100%, ist ein Beispiel für ein Mittel, das die Aktivität eines hKLK2-TRE moduliert.
Assayverfahren erfordern im Allgemeinen Vergleich zu einer Kontrollprobe, zu welcher kein Mittel zugegeben wird. Man sagt, dass Modulation von hKLK2-Expression von einem Testmittel bewirkt wird, wenn solch ein Effekt in Abwesenheit des Testmittels nicht auftritt.
In einer anderen Ausführungsform können die oben beschriebenen hKLK2-TRE-Reportergen-Plasmidkonstrukte auch zur transienten Expression des Reportergens in die Wirtszellen eingeführt werden. In diesem Assaysystem können die zu testende Verbindung und ein Androgen vor dem oder gleichzeitig mit dem Einführen des Plasmids in die Zellen zugegeben werden. Um auf Unterschiede bei der Transfektionseffizienz hin zu korrigieren, können die Zellen mit einem Referenzplasmid co-transfiziert werden, das beispielsweise β-Galactosidase codiert. Die Zellen werden dann eine Zeit lang kultiviert, wonach der Level an Reportergenprodukt gemessen wird und, falls angemessen, auch das Produkt, codiert von dem Plasmid, das als eine Kontrolle für die Transfektionseffizienz dient, gemessen wird. Die Fähigkeit des Mittels, die Aktivität eines hKLK2-TRE zu modulieren, wird als ein Unterschied in der Menge an Reportergen-Produkt relativ zur Kontroll-Zellkultur, zu welcher keine Testverbindung zugegeben wurde, gemessen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein hKLK2-TRE, das funktionell mit einem Reportergen verknüpft ist, in einen viralen Vektor zum Verpacken in ein Viruspartikel eingebaut werden. Das Virus kann ein beliebiges im Fachgebiet bekanntes sein, welches eukaryotische Zellen infizieren kann. Vorzugsweise wird Adenovirus verwendet. Ein hKLK2-TRE-Reportergen kann an einer Vielfalt von Stellen in einen adenoviralen Vektor eingebaut werden. Vorzugsweise werden ein oder mehrere Gene, die essentiell für Adenovirus-Replikation sind, durch ein hKLK2-TRE-Reportergenkonstrukt ersetzt. Beispielsweise können die Regionen, die als E1A und E1B bekannt sind, mit einem DNA-Fragment ersetzt werden, das ein hKLK2-TRE, funktionell verknüpft mit einem Reportergen, enthält. Das resultierende Adenovius-Konstrukt kann durch im Fachgebiet bekannte Verfahren mittels Passage durch eine Zelllinie, die die E1A- und E1B-Genprodukte liefert, z. B. 293-Zellen, vermehrt werden. In diesem Assaysystem kann das Adenovirus-Konstrukt, das ein hKLK2-TRE funktionell verknüpft mit einem Reportergen enthält, verwendet werden, um eine geeignete Zelllinie zu infizieren, wie z. B. jene, die oben beschrieben sind. Ein Mittel, dessen Fähigkeit, die Aktivität eines hKLK2-TRE zu modulieren, kann entweder simultan mit dem adenoviralen Konstrukt zugegeben werden oder nach einer geeigneten Zeit zugegeben werden. Eine "geeignete Zeit" bedeutet in diesem Assaysystem eine Menge an Zeit, die ausreichend ist, um Eintritt des viralen Partikels in die Zelle, nachfolgendes "Uncoating" des viralen Partikels und Transport in den Zellkern erlaubt. Diese Zeitspanne kann von etwa einer bis etwa fünf Stunden sein. Nach Kultivieren der Zellen in einem geeigneten Wachstumsmedium werden die Level an Reportergenprodukt gemessen und mit Leveln in rekombinanten Wirtszellkulturen verglichen, welchen kein Mittel zugesetzt worden ist.
Verbindungen können einzeln oder in Kombination miteinander getestet werden. Folglich stellen Screening-Assays ein Verfahren für das Identifizieren eines "Mittels" bereit, welches verwendet werden kann, um hKLK2-Expression in einer Zelle in vitro oder in einem Patienten zu modulieren. Ein "effektives Mittel" bzw. "wirksames Mittel" ist eines, das hKLK2-Expression moduliert.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "modulieren", dass das wirksame Mittel den Expressionslevel eines Gens unter transkriptionaler Kontrolle eines hKLK2-TRE oder eines aktiven Fragments davon erhöhen oder verringern kann. Modulation kann auftreten als ein Ergebnis eines Effektes bei irgendeinem Punkt bei der Signaltransduktion von der Zellmembran zum Zellkern. Die Arten, auf die ein effektives Mittel wirken kann, um die Expression von hKLK2 zu modulieren, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, 1) Modifizieren des Bindens eines Transkriptionsfaktors an ein hKLK2-TRE; 2) Modifizieren der Wechselwirkung zwischen zwei Transkriptionsfaktoren, notwendig für hKLK2-Expression; 3) Verändern der Fähigkeit eines Transkriptionsfaktors, notwendig für hKLK2-Expression, in den Zellkern einzutreten; 4) Inhibieren der Aktivierung eines Transkriptionsfaktors, der bei hKLK2-Gentranskription beteiligt ist; 5) Modifizieren eines Zelloberflächen-Rezeptors, welcher normalerweise mit einem Liganden wechselwirkt und dessen Binden des Liganden in hKLK2-Expression resultiert; 6) Inhibieren der Inaktivierung einer Komponente der Signaltransduktionskaskade, die zu hKLK2-Expression führt; und 7) Verstärken der Aktivierung eines Transkriptionsfaktors der an hKLK2-Gentranskription beteiligt ist.
Die folgenden Beispiele sind bereitgestellt, um die Erfindung zu veranschaulichen, jedoch nicht, um sie zu begrenzen.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Klonieren und Sequenzieren der hKLK2-5'-flankierenden Region Die vom "chromosome walking" in Chromosom 19 resultierenden Ergebnisse zeigten an, dass hKLK2 ungeführ 12 kbps stromabwärts des PSA-Gens in einer Kopf-an-Schwanz-Weise („head-to-tail") lokalisiert ist. Riegman et al. (1992) Genomics 14:6–11. Basierend auf diesem Hinweis wurde ein DNA-Fragment von 12 kbp, das stromaufwärts des ersten Exons in hKLK2 liegt, mittels PCR unter Verwendung humaner genomischer DNA als Matrize und der folgenden synthetischen Oligonucleotide amplifiziert:

• 42.100.1: 5'-GAT CAC CGG TGT CCA CGG CCA GGT GGT GC-3' (SEQ ID NO:6) PinAI-Stelle unterstrichen, welches komplementär ist zu der 5'-nicht-translatierten Region (UTR, "untranslated region") des ersten Exons in hKLK2 und
• 42.100.4: 5'-GAT CAC CGG TAT ACC AAG GCA CTT GGG CCG AAT G-3' (SEQ ID NO:7), PinAI-Stelle unterstrichen, welches der 3'-UTR von PSA-mRNA entspricht.

Die Oligonucleotide erzeugten eine PinAI-Stelle an beiden Enden des PCR-Fragments. Das PCR-Fragment wurde gereinigt und in pGEM-T-Vektor (Promega) ligiert, um Plasmid CN312 zu erzeugen. Dieses Plasmid stellt die hKLK2-Transkriptionsreaktionselemente (TREs, "transcription response elements") für die Konstrukte, über die hier berichtet wird, bereit.
Die Sequenz dieses Fragments wurde mittels des Fluoreszenzfarbstoff-Terminator-Markierung-Verfahrens ("fluorescent dye terminator labeling method") unter Verwendung von Ampli Taq-DNA-Polymerase bestimmt. Die Sequenz erstreckt sich 12.047 bp lang zwischen der EcoRI- und PinAI-Stelle und ist schematisch in 1 gezeigt. Ein Teil der Promotorregion wurde zuvor publiziert. Schedlich et al. (1987). Die zuvor publizierte Sequenz erstreckt sich 9766 bis 12047. Nach Betrachtung sind erwähnenswerte Eigenschaften der Sequenz die Homonucleotid-Abschnitte, die man an mehreren Stellen findet. Der größte ist ein Polypyrimidin-Trakt von 135 Basen zwischen 3867 (–8144, relativ zur Transkriptionsstelle des hKLK2-Gens) und 4002 (–8012). Zusätzlich dazu findet man Poly(T)-Regionen nahe 10768 (–1246)(16 Basen) und 10753 (–1261)(23 Basen).
Es besteht ein hoher Grad an Nucleotidsequenzidentität (etwa 66%) zwischen der hKLK2-5'-flankierenden Region von 6019 (–5995, hinsichtlich der „cap"-Stelle) bis 12019 (+5) und der des Prostata-spezifisches Antigen-Enhancers (PSE). US-Patent Nr. 5,648,478 . Eine Computeranalyse der Sequenz fand ungefähr 75% Homologie zwischen PSE und hKLK2 in der weit stromaufwärts gelegenen Region von Nucleotid –4739 bis –2513, zusätzlich zu den hoch homologen Promotorregionen (81%). Schuur et al. (1996); Schedlich et al. (1987). Was noch interessanter ist, ist, dass die hKLK2-Sequenz zwischen Nucleotid –3819 bis –3805 auf dem Minus-Strang mit dem Konsensus-ARE an 14 von 15 Positionen übereinstimmt und mit dem in PSE gefundenen AREIII identisch ist. Pang et al. (1997) Cancer Res. 57:495–499.
BEISPIEL 2
Konstruktion von Reporter-Konstrukten, in welchen Expression von Reportergenen unter der Kontrolle der hKLK2-5'-flankierenden Region ist
Um die Funktion des DNA-Segments, das den mutmaßlichen Enhancer enthält, zu identifizieren, wurde eine Reihe von Konstrukten durch Insertieren der hKLK2-5'-flankierenden Region stromaufwärts des Luciferase-Reportergens erzeugt, und die Aktivität dieser Fragmente wurde mit der von CN299, einem Plasmid mit dem vollen hKLK2-Promotor (–607 bis +33), der die Expression von Glühwürmchen-Luciferase steuert, verglichen. Die Konstrukte waren wie folgt:

• Um den vollen hKLK2-Promotor zu klonieren, wurde ein Fragment von ungefähr 600 bp mit den Oligonucleotiden 41.100.1. und 42.100.2 (5'-GAT CAC CGG TGC TCA CGC CTG TAA TCT CAT CAC-3' (SEQ ID NO:8), PinAI-Stelle unterstrichen) amplifiziert. 42.100.2 entspricht der stromaufwärts gelegenen Region des hK2-Promotors. Das PCR-Produkt wurde dann in pGEM-T-Vektor (Promega) kloniert, um CN294 zu erzeugen.
• CN299 ist ein Plasmid, das das Luciferase-codierende Segment, gesteuert von dem vollen hKLK2-Promotor, enthält. Die volle Promotorregion wurde von CN294 mittels NcoI-SacI-Verdau herausgeschnitten („released") und in ein ähnlich geschnittenes pGL3-Basic (Promega) ligiert, um CN299 zu erzeugen.
• CN322 ist ein Plasmid, enthaltend das gesamten Strukturgen von Glühwürmchen-Luciferase, gesteuert von dem humanen hKLK2-Promotor, und aridere(n) regulatorische(n) Elemente(n), enthalten innerhalb des 12 kb-hKLK2-5'-flankierenden Fragments. Die gesamte 12 kb-hKLK2-5'-flankierende Region wurde aus CN312 mittels SacII/SpeI-Verdau ausgeschnitten und in SacII/SpeI-verdautes pGL3-Basic ligiert, um CN322 zu produzieren.
• CN324 ist ein Luciferase-Konstrukt, enthaltend den hKLK2-Minimalpromotor, der die Luciferase-codierende Region steuert. Der hKLK2-Minimalpromotor wurde aus CN317 mittels NcoI-SacI-Verdau herausgeschnitten und in ein ähnlich geschnittenes pGL3-Basic ligiert, um CN324 zu erzeugen.
• CN325 ist das gleiche wie CN324, außer dass am 5'-Ende des Minimalpromotors eine Xhol-Stelle (anstelle einer PinAl-Stelle) erzeugt wurde.
• CN355 wurde durch Verdauen von CN340 mit XhoI und KpnI erzeugt. Das herausgeschnittene bzw. freigesetzte Fragment (–3,8 kbps) wurde in CN325 stromaufwärts des Minimalpromotors ligiert.
• CN296 ist ein pGEM-T-Vektor-Derivat, enthaltend ein hKLK2-Fragment von Nucleotid –2247 bis +33, welches durch PCR amplifiziert wurde mittels der Oligonucleotid 42.100.1 und 42.100.3 (5'-GAT CAC CGG TGG TTT GGG ATG GCA TGG CTT TGG-3'; SEQ ID NO:9), PinAI-Stelle unterstrichen). 42.100.3 entspricht einer Region ungefähr 2300 bp stromaufwärts von hKLK2.
• CN317 ist ein pGEM-T-Derivat, das den hKLK2-Minimalpromotor enthält. Ein PCR-Fragment, das der hKLK2-5'-UTR von Nucleotiden –323 bis +33 entspricht, wurde mit zwei synthetischen Oligonucleotiden amplifiziert; 42.100.1 und 43.121.1
• (5'-GAT CAC CGG TAA AGA ATC AGT GAT CAT CCC AAC-3'; SEQ ID NO:10, PinAI-Stelle unterstrichen). Das resultierende PCR-Produkt wurde in pGEM-T-Vektor kloniert. • CN390 wurde wie folgt konstruiert. Ein Fragment mit KpnI- und XhoI-Stellen an den Enden wurde aus CN379 mit den synthetischen Oligonucleotiden 51.96.3 (5'-GAT CGG TAC CAA AAG CTT AGA GAT GAC CTC CC-3'; SEQ ID NO:11) und 51.96.4 (5'-GAT CCT CGA GGC AAT AAT ACC GTT TTC TTT TCT GG-3'; SEQ ID NO:12) amplifiziert. Das resultierende Fragment wurde mit XhoI und KpnI verdaut, dann in ähnlich geschnittenes CN325 kloniert, um CN390 zu erzeugen.
• CN396 wurde mit der Ausnahme, dass ein unterschiedlicher Satz an Oligonucleotiden für die Amplikation verwendet wurde, unter Verwendung der Vorgehensweise erzeugt, die verwendet wurde, um CN390 zu erzeugen. Die Oligonucleotide für das Amplifizieren des hKLK2-Enhancer-Fragments waren 51.96.1
• (5'-GATCGGTACCGGGATGATCAGAGCAGTTCAGG-3'; SEQ ID NO:13) und 51.96.4. Das amplifizierte Fragment wurde mit XhoI und KpnI verdaut, dann in ähnlich geschnittenes CN325 kloniert, um CN396 zu erzeugen.
• CN408 wurde wie folgt konstruiert. CN379 wurde mit KpnI und XhoI verdaut, das Enhancer-enthaltende Fragment wurde isoliert und an ähnlich geschnittenes pGL3 ligiert. pGL3 enthält einen SV40-Promotor. CN408 umfasst folglich einen hKLK2-Enhancer, funktionell verknüpft mit einem SV40-Promotor.
• CN300 wurde konstruiert durch Insertieren des hKLK2-Fragments von –2247 bis +33, das aus CN296 mittels NcoI-SacI-Verdau herausgeschnitten wurde und in ein ähnlich geschnittenes pGL3-Basic in Wildtyp-Orientierung ligiert wurde.
• CN339 wurde durch Verdauen von CN322 mit SacI, Gel-Reinigung des größeren Fragments und Ligieren des größeren Fragments an den Vektor erzeugt. Das Endkonstrukt ist ein Plasmid, das das Luciferase-Gen, gesteuert von einer 5,2 kb-hKLK2-5'-flankierenden Sequenz, enthält.
• CN340 enthält ein 6,0 kb-Fragment, das aus CN312 mit den Oligonucleotiden 42.156.3 (5' GCC AGG TGT GGT GGC AAG CACC 3'; SEQ ID NO:28) und 43.163.1 (5'GAT CGG TAC CAC TCA CTA TAG GGC GAA TTG GGC 3'; SEQ ID NO:29) amplifiziert wurde. Dieses PCR-Produkt wurde von der 5'-flankierenden Region des hKLK2-Gens amplifiziert und in pGEM-T ligiert, wodurch CN340 erzeugt wurde.
• CN354 weist eine 1,0 kb-Verlängerung der 5'-UTR in CN339 auf. Ein SacI-KpnI-Fragment wurde aus CN340 mittels Enzymverdau herausgeschnitten und in ein ähnlich geschnittenes CN339 ligiert, um CN354 herzustellen.
• CN377 ist ein Luciferase-Reporterkonstrukt, das eine hKLK2-5'-flankierende Region enthält, welche mittels PCR mit CN312 als eine Matrize und den folgenden zwei synthetischen Oligonucleotiden amplifiziert wurde:51.70.1 (5' GGA AAT CAA ACA CAA CCA CAT CCC 3'; SEQ ID NO:30) und 51.70.2 (5' GAT CGG TAC CTC ACT AAA GGA TCA GGG ACC 3'; SEQ ID NO:31). Das PCR-Produkt wurde mit KpnI und XhoI verdaut, in ähnlich geschnittenes CN325 ligiert, wodurch CN377 erzeugt wurde.
• CN378, CN380, CN381 wurden auf eine Art und Weise hergestellt, die ähnlich zu der für CN377 ist. Die folgenden Primerpaare wurden verwendet. CN378-51.70.1 und 51.70.3 (5' GGA TGG TAC CAG TTG CAT GGG GCA AAG ACA AGG 3'; SEQ ID NO:32); CN380: 51.70.2 und 51.70.6 (5' GAT CCT CGA GTT CCT CCA GAG TAG GTC TGC 3'; SEQ ID NO:33); und CN381: 51.70.1 und 51.70.5 (5' GAT CGG TAC CAT GAT TAG ACA TTG TCT GCA GAG 3'; SEQ ID NO:34).

BEISPIEL 3
Erzeugen von vorübergehend und stabil transßzierten Zelllinien mit hKLK2-Enhancer-Konstrukten
Zellen und Kulturverfahren.
LNCaP-Zellen wurden bei Passage 9 von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten. LNCaP-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium (RPMI), supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS, "fetal bovine serum"; Intergen Corp.), 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 Einheiten/ml Streptomycin aufrechterhalten. LNCaP-Zellen, die auf Luciferase-Expression untersucht wurden, wurden in 10% Strip-Serum ((Aktiv-) Kohle/Dextranbehandeltes fötales Rinderserum, um T3, T4 und Steroide zu entfernen; Gemini Bioproduct, Inc., Calabasas, CA)-RPMI aufrechterhalten. Die Zellen wurden periodisch auf die Produktion von PSA getestet, welches konsistent oberhalb von 20 ng/ml pro Tag war.
Selektion auf eine stabil integrierte Plasmid-DNA wird in RPMI-Medium durchgeführt, das G418 enthält (GibcoBRL, NY). Der Level an G418 in RPMI ist nach Selektion der parenta len LNCaP-Klone zur Evalulation von 500 auf 100 μg/ml verringert; diese Klone werden die gesamte Zeit vor dem Untersuchen bei 100 μg/ml G418 aufrechterhalten. Subklone, die verstärkte Luciferaseaktivität aufweisen, werden von der parentalen Zelllinie durch das Verfahren der limitiertes Verdünnen-Klovierung ("limited dilution cloning") erhalten.
Transfektionen von LNCaP-Zellen
Für Transfektionen wurden LNCaP-Zellen bei einer Zelldichte von 5 × 10⁵ Zellen pro 6 cm Kulturschale (Falcon, NJ) in vollständigem RPMI ausplattiert. DNAs wurden in LNCaP-Zellen eingeführt, nachdem sie komplexiert worden waren mit einem 1:1-molaren Lipidgemisch von N-(1-(2,3-Dioleyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTAP^TM; Avanti Polar Lipids, AL) und Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE^TM; Avanti Polar Lipids, AL); DNA/Lipid-Komplexe wurden in Serum-freiem RPMI bei einem molaren Verhältnis von 2:1 hergestellt. Typischerweise wurden 8 μg (24,2 nmol) DNA in 200 μl unvollständigem RPMI verdünnt und tropfenweise zu 50 nmol transfizierender, Lipide in 200 μl RPMI bei sanftem Vortexen zugegeben, um homogenes Mischen der Komponenten zu gewährleisten. Den DNA/Lipid-Komplexen wurde vor ihrer Zugabe zu LNCaP-Zellen bei Raumtemperatur 15 Minuten lang Annealing ermöglicht. Das Medium wurde von LNCaP-Zellen entfernt und durch 1 ml Serumfreies RPMI ersetzt, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe von DNA/Lipid-Komplexen. Zellen wurden mit Komplexen 4–5 Stunden lang bei 37°C, 5% CO₂, inkubiert. Medium wurde entfernt, und Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann trypsinisiert und in 10% Strip-Serum-RPMI (Phenolrot-frei) resuspendiert. Zellen wurden in eine opake Gewebekulturplatte mit 96 Kavitäten (Falcon, NJ) bei einer Zelldichte von 40.000 Zellen/Kavität pro 100 μl Medium replattiert und untersucht. Verschiedene Mengen an Arzneimitteln (z. B. Androgene und Anti-Androgene) wurden 16 Stunden später zugegeben, und 32 Stunden danach (wurde) auf Luciferase-Aktivität untersucht.
Erzeugung einer stabil-transfizierten Zelllinie, die Luciferase exprimiert, wird erreicht durch Co-Transfizieren des Plasmids pcDNA3 mit hKLK2-TRE-Luc. Das Neomycin-Gen von pcDNA3 verleiht Resistenz gegenüber dem Antibiotikum G418, was Selektion stabil transfizierter LNCaP-Zellen erlaubt. LNCaP-Zellen werden mit hKLK2-TRE-Luc und pcDNA3, wie für vorübergehende („transient") Transfektionen beschrieben, co-transfiziert. Kurz erläutert, werden 1 μg pcDNA3 und 1–10 μg hKLK2-TRE-Luc in 200 μl RPMI verdünnt und mit zwei molaren Äquivalenten von DOTAP/DOPE (1:1) in 200 μl RPMI komplexiert. Zugabe von DNA zu Lipiden geschieht tropfenweise mit sanftem Vortexen, um die Proben homogen zu mischen. Nach 15-minütigem Annealing der Komplexe werden sie tropfenweise zu LNCaP-Zellen in 1 ml RPMI zugegeben und über Nacht (12 Stunden) bei 37°C inkubiert. Medien/DNA-Lipid-Komplexe werden von den Gewebekulturplatten entfernt und mit vollständigem RPMI supplementiert, das 500 μg/ml G418 enthält. Das Selektionsmedium wird bei 500/μg/ml G418 drei Wochen lang beibehalten, bevor es auf 250 μg/ml reduziert wird. G418-resistente Kolonien treten im Allgemeinen nach vier Wochen auf und werden wachsen gelassen, bis sie durch das Auge sichtbar sind, worauf Kolonien trypsinisiert (0,25 Trypsin) werden und auf eine Gewebekulturplatte mit 24 Kavitäten transferiert werden, gefolgt von weiterer Expansion. Klone werden, nachdem sie etwa 3–5 × 10⁶ Zellen erreichen, auf Luciferase-Expression untersucht.
Induktion und Untersuchen vorübergehender und stabiler hKLK2-TRE-Luc/LNCaP-Zellen
Für sowohl vorübergehend als auch stabil transfizierte LNCaP-Zellen werden eine Vielzahl von Androgenen und Anti-Androgenen – Methyltrienolon (R1881, DuPont NEN), Dihydrotestosteron (DHT, Sigma), Cyproteronacetat (CA) und Hydroxyflutamid (Ho-Flu)- verwendet, um Expression des Luciferase-Reportergens zu induzieren. Androgene oder Antiandrogene werden bei 3x-Konzentrationen in 10% Strip-Serum-RPMI hergestellt und als 50 μl Aliquots zu jeder Kavität der Platte mit 96 Kavitäten zugegeben. Zellen werden entweder mit Androgenen oder Anti-Androgenen vor dem Untersuchen 48 Stunden lang inkubiert. Assays werden in dreifacher Ausführung oder vierfacher Ausführung durchgeführt. Die Konzentration an Dihydrotestosteron (DHT) wird gemessen durch den Testosteron-ELISA-Kit (Neogen Corporation). Der Assay weist 100% Kreuzreaktivität mit DHT auf.
Im Fall von stabil transfizierten hKLK2-TRE-Luc/LNCaP-Klonen wird Medium entfernt und werden Zellen mit PBS (2 × 20 ml) gewaschen. Die klonalen Zellen werden dann, vor dem Trypsinisieren und Replattieren in eine opake Platte mit 96 Kavitäten bei 40.000 Zellen/Kavität pro 100 μl Medium, 24 Stunden lang in 10% Strip-Serum-RPMI (Phenolrot-frei) aufrechterhalten. Zellen wird vor der Zugabe von entweder Androgenen oder Anti-Androgenen ermöglicht, über Nacht adhärent zu werden. Inkubation klonaler Zellen im Strip-Serum-RPMI vor Induktion mit Arzneimittel(n) reduziert Hintergrund-Luciferase-Expression wesentlich.
Der Luciferase-Assay von sowohl transient als auch stabil transfizierten Zellen wird auf die gleiche Art und Weise durchgeführt. Nach Induktion von Zellen mit Androgenen oder Anti-Androgenen für 48 Stunden wird Medium entfernt und werden 50 μl Lyse-Reagens zu jeder Kavität zugegeben (0,1 M Kaliumphosphat-Puffer bei pH 7,8, 1% Triton X-100, 1 mM Dithiotreitol, 2 mM EDTA). Zellen werden innerhalb von 15 Minuten Lyse untersucht oder bis zur Analyse bei –80°C gelagert. Lagerung von Zellysaten bei –80°C für 5 Tage oder weniger resultiert in keinem signifikanten Verlust an Luciferase-Aktivität.
Der Enhanced Luciferase Assay Kit (Analytical Luminescence Laboratory, MI) wurde verwendet, um das Ausmaß an Luciferaseaktivität von hKLK2-Luc-transfizierten LNCaP-Zellen zu quantifizieren. Ein Dynatech 3000-Luminometer für Platten mit 96 Kavitäten ("Dynatech 3000 96-well plate luminometer")(Dynatech, VA) wurde verwendet, um die Menge an Licht, erzeugt von dem Assay, zu messen. Das Instrument wurde in dem "Enhanced Flash Mode" laufen gelassen, der ein duales Injektorsystem für die Substratzugabe einsetzt. Optimale Assaybedingungen und Luminometerparameter waren wie folgt: Zugabe von 60 μl Substrat A (Puffer), 1 Sekunde Verzögerung, Zugabe von 60 μl Substrat B (Luciferin-Reagens), 1 Sekunde Verzögerung, Signalintegration für 3 Sekunden. Die Ergebnisse sind als die Integralsumme in relativen Lichteinheiten (RLUs, "relative light units") dargestellt. Das Ausmaß an Induktion durch Androgene/Anti-Androgene, z. B. (x-)fache Induktion, wurde bestimmt durch: (x)fache Induktion = RLUs [x nMArzneimittel]/RLUs [0 nM Arzrieimittel].
BEISPIEL 4
Effekte der hKLK2-5'-flankierenden Region
Um den Effekt der 12 kbp-5'-flankierenden Sequenz auf Promotoraktivität zu bestimmen, wurden zwei Konstrukte erzeugt: CN299 und CN322, wie in Beispiel 2 beschrieben. Der hKLK2-Promotor wurde stromaufwärts des luc-Gens kloniert, um CN299 zu erzeugen. Die gesamte 12 kbp-Sequenz stromaufwärts des hKLK2-Gens (einschließlich des Promotors) wurde stromaufwärts des luc-Gens kloniert, um CN322 zu erzeugen. Jedes Konstrukt wurde dann verwendet, um LNCaP-Zellen zu transfizieren. Die Medien in der Hälfte der Schalen wurde mit 0,5 nM R1881 supplementiert. Die Zellen wurden 48 Stunden nach Transfektion geerntet, und die Luciferase-Aktivität wurde gemessen. 3A und 3B fassen die Daten zusammen und zeigen, dass CN322 höhere Aktivität als CN299 hat. Bei beiden getesteten R1881-Konzentrationen hatte CN322 höhere Aktivität als CN299. Bei 0 nM war CN322 12-fach aktiver als CN299. Bei 0,5 nM war CN322 ungefähr 36-fach aktiver als CN299. Diese Daten legen nahe, dass die 12 kb-5'-flankierende Sequenz einen Enhancer enthält, und dass dieser Enhancer auch auf Androgen reagiert.
BEISPIEL 5
Charakterisierung des hKLK2-Enhancers
Die Ergebnisse des vorherigen Experiments legen nahe, dass die Luciferase-Aktivität des mutmaßlichen Enhancers, gefunden in CN322, auf eine Androgen-abhängige Art und Weise reagierte. Um zu bestimmen, ob die hKLK2-5'-flankierende Sequenz tatsächlich ein auf Androgen reagierendes Element enthielt, wurden zwei Experimente durchgeführt. In dem ersten Experiment wurden LNCaP-Zellen mit CN322 transfiziert, die Transformanten wurden in Medium inkubiert, das verschiedene Konzentrationen an R1881 enthielt, und 48 Stunden nach Transfektion wurde Luciferase-Aktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in 4A und B zusammengefasst. Kurz beschrieben, reagierte CN322 auf das Testosteron-Analogon R1881 in einer Konzentrations-abhängigen Art und Weise. Peak-Induktion an Aktivität wurde bei 1 nM R1881, etwa 9-fach mehr als die 0 nM-Aktivität, abgeschätzt.
In dem zweiten Experiment wurde der Effekt der Inkubationszeit in der Gegenwart von R1881 auf die Aktivität der 12 kbps-5'-flankierenden Sequenz untersucht. LNCaP-Zellen wurden mit CN322 transfiziert und für verschiedene Zeitspannen in der Gegenwart von 0,5 nM R1881 vor dem Ernten inkubiert. Die Ergebnisse sind in 5 zusammengefasst. Die Peak-Luciferase-Aktivität wurde bei 60 Stunden nach Transfektion beobachtet, jedoch scheint der Gesamt-Aufwärtstrend bei etwa 48 Stunden nach Transfektion ein Plateau zu erreichen.
Um diese zwei Experimente zusammenzufassen, schien es, dass der hKLK2-Enhancer auf Androgen reagierend ist und Peak-Induktion von luc-Aktivität irgendwo zwischen 48 und 60 Stunden nach Transfektion stattfindet.
BEISPIEL 6
Gewebespezißtdt der hKLK2-5'-flankierenden Region
In dem Wissen, dass der PSA-Enhancer Gewebe-spezifisch ist, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um zu bestimmen, ob das Gleiche auf den mutmaßlichen hKLK2-Enhancer zutraf. In dem ersten Experiment wurden LNCaP-Zellen (eine Prostatakrebs-Zelllinie) und 293s (eine humane embryonale Nieren-Zelllinie) mit CN299 oder CN322 transfiziert. Die Hälfte der Schalen wurde mit 1 nM R1881 supplementiert, und die Zellen wurden 48 Stunden nach Transfektion geerntet. Die LNCaP-Zellen, transfiziert mit CN322, wiesen eine 17-fache Induktion von Aktivität in Gegenwart von 1 nM R1881 auf, wenn verglichen mit der Hintergrundaktivität bei 0 nM R1881. Die 293-Zellen, transfiziert mit CN322, zeigten keine Induktion von Luciferase-Aktivität in der Gegenwart von 1 nM R1881. CN299 wies eine 2- bis 3-fache Induktion in der Gegenwart von 1 nM R1881 auf, und wies in den 293-Zellen keine Aktivitätsinduktion auf. Die Ergebnisse dieses ersten Experiments sind in 6 zusammengefasst. Die Ergebnisse dieses Experiments unterstützen wiederum die Schlussfolgerung, dass der mutmaßliche hKLK2-Enhancer Androgen-induzierbar ist.
Ergebnisse früherer Experimente zeigten an, dass ein mutmaßlicher hKLK2-Enhancer zwischen der ApaI-Stelle bei ungeführ –6200 bp und der XhoI-Stelle bei ungefähr –2400 bp des hKLK2-Enhancers liegen könnte. Dieses 3,8 kbp-Fragment wurde stromaufwärts des hKLK2-Minimalpromotors fusioniert, und dann stromaufwärts des luc-Gens kloniert, was CN355 erzeugte. Eine Vielzahl von Zelllinien wurden mit CN322 oder CN355 transfiziert, indem sie mit den Komplexen über Nacht in Vollmedium inkubiert wurden. Die Komplexe wurden dann angesaugt („aspirated"), und das Medium wurde mit Stripped-Serum-Medium ersetzt. Das Medium in der Hälfte der Platten wurde mit 1 nM R1881 supplementiert. Die Zellen wurden dann 48 Stunden nach dem Entfernen der DNA-Lipid-Komplexe geerntet und auf Luciferase-Aktivität hin getestet. Die Ergebnisse sind in 7 zusammengefasst.
CN322 ergab eine fast 100-fache Induktion von Aktivität in der Gegenwart von 1 nM R1881 in den LNCaP-Zellen. CN355 wies unter den gleichen Bedingungen eine 35-fache Induktion an Aktivität auf. Alle der anderen Zelllinien zeigten wenig Androgen-Induzierbarkeit. Tatsächlich zeigten CN322 und CN355 nur eine etwa 1- bis 2-fache Induktion in allen anderen Zelllinien auf. Um die für Enhancer-Aktivität erforderlichen Sequenzen weiter abzugrenzen, wurde das Konstrukt CN379 hergestellt, welches zusätzlich zu dem hKLK2-Minimalpromotor die Regionen von –5155 bis –3387 (in US-Serien-Nr. 60/054,523 als –5155 bis –3412 bezeichnet), die Expression des Luciferase-Gens steuern, aufweist. Dieses Konstrukt ergab ungefähr 54-fache Induktion von Luciferase-Aktivität in der Gegenwart von induzierendem Mittel. Wenn diese Ergebnisse wiederholt wurden, ergab CN322 ungefähr 30-fache Induktion. Dieses Ergebnis kann bedingt sein durch die Gegenwart eines negativen Regulators in den Sequenzen zwischen Nucleotiden 5976 bis 6859 und/oder 8627 bis 9620. Diese Daten zeigen, dass die minimalen Enhancer-Konstrukte CN355 und CN379 einiges der Aktivität der vollen 12 kbps-5'-flankierenden Sequenz beibehielten, was anzeigt, dass ein Teil des mutmaßlichen hKLK2-Enhancers zwischen den zuvor oben beschriebenen ApaI- und XhoI-Stellen ist. Die Daten unterstützen außerdem die Schlussfolgerung, dass der hKLK2-Enhancer auf Androgen reagierend ist, und dass seine Aktivität auf Prostata-Zelllinien beschränkt ist, die Androgen-Rezeptor exprimieren.
BEISPIEL 7
Weitere Charakterisierung des hKLK2-Enhancers
Um die 5'- und 3'-Grenzen des hKLK2-Enhancers zu erforschen, wurde eine Reihe von Konstrukten hergestellt und getestet, wie beschrieben in Beispiel 2. Die Ergebnisse sowie schematische Darstellungen der Konstrukte sind in 24A und 24B gezeigt. Eine 5'-Verlängerung von 1,6 kb (CN300) resultierte in niedrigerer Luciferase-Gesamtaktivität und keiner Androgen-Empfindlichkeit (24A). Eine weitere 5'-Verlängerung auf –5130 (CN339) zeigte eine Zunahme an Aktivität, jedoch resultierten weitere 5'-Verlängerungen auf –9033 und –7020 (CN354 bzw. CN383) nicht in zusätzlichen Zunahmen der Aktivität (24A). Die 3'-Grenze des hKLK2-Enhancers wurde untersucht durch Konstruieren von Reporterplasmiden, die Deletionen von stromaufwärts gelegenen Sequenzen enthielten, die bei –2394 begannen. Die Konstrukte und Ergebnisse sind in 24B gezeigt. CN378 zeigt eine 40-fache Induktion, während CN325 eine 5-fache Induktion an Aktivität zeigt. Weiteres Entfernen der Sequenzen zwischen –2394 und –3387 (CN379) resultierte in einer 70-fachen Induktion. Wenn die Deletion erweitert wurde, um die Hälfte der mutmaßlichen ARE-Sequenz einzuschließen (CN380), war der Level an Induktion ungeführ der gleiche wie der, der mit CN325 beobachtet wurde. Das Gleiche trifft zu, wenn die Sequenz zwischen –3884 und -5155 deletiert war (CN412). Zusammenfassend legen diese Ergebnisse nahe, dass die mutmaßliche ARE-Sequenz sowie die Region stromaufwärts des mutmaßlichen ARE für einen hohen Level an hKLK2-Expression unentbehrlich ist und die 3-Grenze des stromaufwärts gelegenen Enhancer-Elements zwischen –3387 und –3817 liegt.
Um die Sequenzen, erforderlich für Enhancer-Aktivität, weiter zu charakterisieren, wurden verschiedene Konstrukte gemacht, und sie sind schematisch in 8 gezeigt. Abschnitte der stromaufwärts gelegenen hKLK2-Region wurden nebeneinander gestellt mit ("juxtaposed to") dem hKLK2-Minimalpromotor (–324 bis +33, relativ zur Transkriptionsstartstelle), und das resultierende TRE wurde funktionell verknüpft mit einem Luciferase-codierenden Gen, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die hKLK2-Enhancer-Promotor-Expressionsplasmide wurden in LNCaP-Zellen transfiziert, die Zellen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit des induzierten Mittels R1881 inkubiert, und 48 Stunden nach Transfektion wurde die Luciferase-Aktivität gemessen, wie in Beispiel 3 beschrieben. Das Konstrukt CN325, welches den hKLK2-Minimalpromotor, funktionell verknüpft mit einem Gen, das Luciferase codiert, enthält, wurde als eine Kontrolle verwendet, um die relativen Beiträge von Enhancer-Fragmenten zu Zunahmen an Transkription bei Konstrukten, enthaltend hKLK2-Enhancer-Fragmente, funktionell verknüpft mit dem hKLK2-Minimalpromotor, zu bewerten. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt.
CN379 weist zusätzlich zu dem hKLK2-Minimalpromotor die hKLK2-5'-flankierende Region von –5155 bis –3387 (Nucleotide 6859 bis 8627 von SEQ ID NO:1) auf, die Expression des Luciferase-Gens steuert. Der CN379-hKLK2-Promotor-Enhancer resultiert in einer ungefähr 81-fachen Induktion von Luciferase-Aktivität in der Gegenwart von induzierendem Mittel.
CN390 weist, funktionell verknüpft mit dem hKLK2-Minimalpromotor, die hKLK2-5'-flankierende Region von –4814 bis –3643 (Nucleotide 7200 bis 8371 von SEQ ID NO:1; auch in SEQ ID NO:14 angegeben) auf, die Expression des Luciferase-Gens steuert. Der CN390-hKLK2-Promotor-Enhancer resultiert in ungefähr 90-facher Induktion von Luciferaseaktivität in der Gegenwart von induzierendem Mittel. Das 1,17 kb-hKLK2-Enhancer-Fragment, enthalten auf CN390, behält daher, wenn verglichen mit CN379, volle Enhancer-Aktivität bei.
CN396 umfasst die hKLK2-5'-flankierende Region von –3993 bis –3643, relativ zur Transkriptionsstartstelle (8021 bis 8371 von SEQ ID NO:1), funktionell verknüpft mit dem hKLK2-Minimalpromotor. Der CN396-Promotor-Enhancer stimulierte eine 37-fache Induktion an Luciferaseaktivität. Das 350 bp-Enhancer-Fragment, enthalten auf CN396, kann als ein "Kernregulator" bzw. „Core regulator" erachtet werden. Ein 136 bp-Fragment von –3886 bis –3751 (Nucleotide 8128 bis 8263 von SEQ ID NO:1), d. h., ein Subfragment des hK1K2-Enhancers, enthalten auf CN396, zeigte in Assays mit vorübergehender Transfektion überhaupt keine Enhancer-Aktivität, wenn funktionell verknüpft mit einem hKLK2-Promotor, um Expression eines Luciferase-codierenden Gens zu steuern.
Die obigen Ergebnisse zeigen an, dass der hKLK2-Enhancer von –4814 bis –3643, enthalten in dem CN390-Konstrukt, wenn verglichen mit dem Volllängen-Enhancer (CN322-Konstrukt), volle Funktion beibehält, während der 350 bp-Core-Regulator einen niedrigeren Transkriptionslevel liefert. Diese zwei Regionen sind schematisch in 9 gezeigt.
Das Konstrukt CN408 enthält die gleiche hKLK2-Enhancer-Region wie sie CN379 enthält, d. h., von Nucleotiden –5155 bis –3387 (Nucleotide 6859 bis 8627 von SEQ ID NO:1). Jedoch hat dieses Konstrukt anstelle eines hKLK2-Minimalpromotors einen SV40-Promotor, funktionell verknüpft mit diesem Enhancer, der Luciferase-Genexpression steuert. Wie in 10A gezeigt, zeigt dieses Konstrukt etwa 80-fache Induktion von Luciferase-Expression. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Verwendung eines hKLK2-Promotors für die Zunahme an Expression nicht kritisch ist.

Die Ergebnisse der obigen Experimente sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Zahlen auf der oberen Ebene zeigen Positionen relativ zu der hKLK2-Startstelle an, während die Zahlen auf der unteren Ebene Position in SEQ ID NO:1 anzeigen. Die Werte bei der "Induktions"-Spalte stellen ungefähre (x-) fache Induktion dar. Der Pfeil nach oben zeigt Induktion der Gen expression eines verknüpften Reporters („linked reporter gene expression") in LNCaP-Zellen in der Gegenwart eines induzierenden Mittels an. Tabelle 1

Enhancer-Aktivität	5'-Ende	3'-Ende	Konstrukt	Induktion	Promotor
keine	–324 11290	+33 12047	CN325	< 10-fach ⇡	minimal hKLK2

keine	–607 11407	+33 12047	CN299	<10-fach ⇡	vollständig hKLK2

Enhancer-Aktivität (9,7 kb)	–12014 1	–2257 9765	CN322	30- bis 90-fach ⇡	vollständig hKLK2

Enhancer-Aktivität (3,7 kb)	–6038 5976	–2394 9620	CN355	35-fach ⇡	minimal hKLK2

Enhancer-Aktivität (1,8 kb)	–5155 6859	–3387 8627	CN379	81-fach ⇡	minimal hKLK2

Enhancer-Aktivität (1,17 kb)	–4814 7200	–3643 8371	CN390	90-fach ⇡	minimal hKLK2

„core-Regulator" (350 bp)	–3993 8021	–3643 8371	CN396	37-fach ⇡	minimal hKLK2

Enhancer-Aktivität (1,8 kb)	–5155 6859	–338 8627	CN408	80-fach ⇡	SV40

Mutationen in einem mutmaßlichen ARE beeinflussen Enhancer-Funktion
Ein mutmaßliches ARE, das die Sequenz 5' GGAACATATTGTATT 3' aufweist, ist bei Nucleotiden 993 bis 1007 von SEQ ID NO:14 lokalisiert (Nucleotide 8192 bis 8206 von SEQ ID NO:1; –3822 bis –3808 relativ zur hKLK2-Transkriptionsstartstelle). SEQ ID NO:14 gibt die Sequenz eines hKLK2-Enhancers, enthalten in dem Konstrukt CN390, an (Nucleotide 7200 bis 8371 von SEQ ID NO:1), an. Um den Effekt von Mutationen in diesem Element auf hKLK2-Enhancer-Aktivität zu bestimmen, wurden Konstrukte hergestellt, welche Änderungen in dieser Sequenz enthalten. CN390 weist, funktionell verknüpft mit dem hKLK2-Minimalpromotor, die hKLK2-5'-flankierende Region von –4814 bis –3643 (Nucleotide 7200 bis 8371 von SEQ ID NO:1; hier als SEQ ID NO:14 angegeben) auf, die Expression des Luciferase-Gens steuert. Dieses Konstrukt weist außerdem das mutmaßliche ARE auf. CN457 ist wie CN390, außer dass diese Sequenz zu 5 GTACTATATTACAGT 3' (Nucleotide 993 bis 1007 von SEQ ID NO:15) geändert wurde. Ein anderes Konstrukt, CN458, ist wie CN300, außer dass das mutmaßliche ARE zu 5' GCAGAATATTCGAAT 3' (Nucleotide 993 bis 1007 von SEQ ID NO:16) geändert wurde. hKLK2-Enhancer-Funktion dieser Konstrukte wurde wie oben beschrieben gemessen. Die Ergebnisse, die in 11 gezeigt sind, zeigen, dass Änderungen in diesem mutmaßlichen ARE hKLK2-Enhancer-Funktion auf Hintergrundlevel reduzieren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass dieses Element in der Tat als ein Androgen-reaktives Element wirken bzw. fungieren kann.
Der hKLK2-Regulator ist ein Enhancer
Eines der definierenden Merkmale eines Enhancer-Elements ist ihre Fähigkeit, Transkription trotz ihrer Lage oder Orientierung relativ zu dem Promotor, auf welchen sie wirken, zu stimulieren. Um zu bestimmen, ob der Regulator von hKLK2 diese Eigenschaften aufweist, wurden Konstrukte durch Insertieren des Segments von –5155 bis –3387 relativ zur hKLK2-Transkriptionsstartstelle (Nucleotide 6859 bis 8627 von SEQ ID NO:1) an verschiedenen Positionen und in verschiedenen Orientierungen relativ zu der hKLK2-Promotor/Luciferasegen-Transkriptionseinheit erzeugt. Wie in 12 gezeigt, ergab CN379 eine 81-fache Induktion in LNCaP-Zellen, behandelt mit R1881; das gleiche Segment in der entgegengesetzten Orientierung, CN148, resultierte in einer 68-fachen Induktion. Dieser Induktionslevel blieb unverändert, wenn das stromaufwärts gelegene Element mit der gleichen Orientierung wie in CN379 stromabwärts von dem Luciferase-Gen verschoben wurde, wie mit dem Konstrukt CN419 gezeigt. Das Umkehren dieser Orientierung stromabwärts des Luciferase-Gens in CN419 resultierte auch in einem hohen Level an Induktion, wie mit dem Konstrukt CN420 gezeigt. Das hKLK2-Enhancer-Fragment von –5155 bis –3387 ist ein echter Enhancer, weil seine Aktivität durch Position oder Orientierung relativ zu dem hKLK2-Minimalpromotor nicht signifikant beeinflusst wurde.
Gewebespezifität des hKLK2-Enhancers
Die Gewebespezifität der oben beschriebenen hKLK2-Enhancer-Konstrukte wurde getestet. Eine Vielzahl von Zelllinien wurde mit drei Reporter-Konstrukten transfiziert ("treasfected"): CN325 (hKLK2-Minimalpromotor), CN390 (1,17 kb-"volle Enhancer-Aktivität"-hKLK2-Enhancer/hKLK2-Minimalpromotor) und CN396 (350 bp-hKLK2-Minimal-Enhancer/hKLK2-Minimalpromotor). Die verwendeten Zelllinien stellen mehrere auf Hormon reagierende Gewebe dar, einschließlich von humanem Brustepithel (HBL-100), humanem Brustkarzinom (MCF-7), Colonkarzinom (LoVo), Leberkarzinom (HUH-7), Lungenkarzinom (A549) und Prostatakarzinom (LNCaP und PC-3). Die 293-Zelllinie war abgeleitet von humanen embryonalen Nierenzellen, transformiert mit Adenovirus-DNA. Die Zelllinien wurden mit Reporter-Konstrukten und einem internen Kontrollplasmid, pCMVβ-GaI, transfiziert, und Assays wurden wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt. In LNCaP-Zellen stimulieren CN390 und CN396 Luciferase-Synthese etwa 90- bzw. 30-fach in der Gegenwart von 1 nM R1881, während CN325 eine 6-fache Akkumulation von Luciferase, verglichen mit Kontrollkulturen, welchen kein R1881 zugesetzt wurde, stimulierte. In keiner anderen Zelllinie führten CM390 oder CM396 zu mehr als einer 6-fachen Induktion von Luciferase-Synthese. Alle drei Reporterkonstrukte waren in der PC-3-Prostatakarzinom-Zelllinie inaktiv. Das Fehlen von detektierbarem Androgen-Rezeptor ist ein Merkmal, welches diese Zelllinie von der LNCaP-Zelllinie unterscheidet. Diese Ergebnisse zeigen an, dass der hKLK2-Enhancer in Prostatazellen funktioniert, die einen Androgen-Rezeptor exprimieren.
Androgen-Spezifität eines 1,17 kb-hKLK2-Enhancers
Um die Androgen-Spezifität des hKLK2-Enhancers zu untersuchen, wurden LNCaP-Zellen, transfiziert mit CN390 (1,17 kb-"volle Enhancer-Aktivität"-hKLK2-Enhancer/hKLK2-Minimalpromotor), mit verschiedenen Steroidhormonen behandelt. Wie in 14 gezeigt, verursachten alle getesteten Androgene, einschließlich des natürlich vorkommenden Androgens, Dihydrotestosteron (DHT) und des synthetischen Androgens R1881, deutliche Zunahme an Luciferaseaktivität, wenn verglichen mit Zellen, die nicht mit Hormonen behandelt wurden. Nichtandrogene Verbindungen, einschließlich von DES, einem synthetischen Östrogen, und DEX, einem synthetischen Glucocorticoid, zeigten geringe oder keine Induzierbarkeit. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der hKLK2-Enhancer/Promotor Androgen-Rezeptor-vermittelte Gentranskriptionskontrolle verleiht.
Gewebe-spezifische Faktoren, beteiligt am Regulieren der Aktivität des hKLK2-Enhancers
Um zu bestimmen, ob das Fehlen von hKLK2-Enhancer/Promotor-Aktivität in den PC-3-Zellen und in den Nicht-Prostatazellen, die getestet wurden, in erster Linie bedingt war durch das Fehlen von funktionalen Androgen-Rezeptoren in diesen Zellen, wurden OVCAR-, 293- und PC-3-Zellen mit CN390 und mit einem Plasmid, welches die Expression von Androgen-Rezeptor regelt, co-transfiziert. Wie in 15 gezeigt, wurde, während CN390 zu einer 90-fachen Induktion von Luciferase-Expression in LNCaP-Zellen führte, in der Gegenwart von R1881 in OVCAR-, 293- oder PC-3-Zellen, welche mit dem AR-Expressionsplasmid cotransfiziert worden waren, keine Induktion beobachtet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass andere Faktoren als Androgen-Rezeptoren und vielleicht andere Faktoren zusätzlich zu Androgen-Rezeptoren für das Aktivieren der regulatorischen Sequenzen erforderlich sind.
BEISPIEL 8
Konstruktion von Adenovirus-Konstrukten, in welchen Expression eines Adenovirus-Gens von einem hKLK2-Promotor kontrolliert wird
Um hKLK2-Adenovirus-Konstrukte zu erzeugen, wurden drei mit hKLK2 in Beziehung stehende („hKLK2 related") Fragmente, welche den vollen hKLK2-Promotor enthalten, unter Verwendung der gleichen Strategie mit den folgenden synthetischen Oligonucleotiden ebenfalls amplifiziert:

1) 42.100.1 in Kombination mit 42.100.2;
2) 42.100.1. in Kombination mit 42.100.3;
3) 42.100.1 in Kombination mit 43.121.1 (5'-GAT CAC CGG TAA AGA ATC AGT GAT CAT CCC AAC-3'; SEQ ID NO:17; PinAI-Stelle unterstrichen); und
4) 42.174.1 (5'-GAT CCG GCC GTG GTG CTC ACG CCT GTA ATC-3'; SEQ ID NO:18; EagI-Stelle unterstrichen) in Kombination mit 42.174.2 (5'-GAT CCG GCC GTG TCC ACG GCC AGG TGG TGC AG-3'; SEQ ID NO:19; EagI-Stelle unterstrichen).

Konsequenterweise wurden vier Konstrukte, CN294, CN296, CN317 und CN310, erzeugt durch jeweiliges Ligieren dieser Fragmente in einen pGEM-T-Vektor. All diese Plasmide wurden in Beispiel 2 beschrieben, außer CN310, welches mit CN294 mit der Ausnahme identisch ist, dass die EagI-Stellen das Insert flankieren.
hKLK2-Promotor-gesteuertes E1A-Ad5-Plasmid CN303

• CN303 wurde durch Insertieren des hKLK2-Promotors, gerade stromaufwärts von dem E1A-codierenden Segment, in ein Derivat von pXC-1, ein Plasmid, das das linksseitige Ende des Ad5-Genoms enthält, hergestellt.
• CN124 ist ein Derivat von Konstrukt pXC-1, welches das linksseitige Ende von Wildtyp-Ad5 enthält, einschließlich von sowohl E1A als auch E1B (McKinnon (1982) Gene 19:33-42). CN124 weist außerdem unter anderen Änderungen eine künstliche PinAI-Stelle an Ad5-Nucleotid 547 auf (gerade stromaufwärts des E1A-Transkriptionsstarts bei Nucleotid 560 und dem E1A-codierenden Segment, das mit ATG bei 610 beginnt). CN124 wurde mit PinAI linearisiert und mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase ("calf intestinal alkaline phosphatase")(New English Biolab) dephosphoryliert.
• CN294 wurde mit PinAI verdaut, um den hKLK2-Promotor freizusetzen. Der hKLK2-Promotor wurde dann in das PinAI-linearisierte CN124 ligiert, was CN303 produzierte. CN304 ist mit der Ausnahme, dass das hKLK2-Promotor-Fragment in der umgekehrten Orientierung ist, ähnlich zu CN303.

Folglich enthält Konstrukt CN303 den hKLK2-Promtor, stromaufwärts insertiert von und funktionell verknüpft mit dem E1A-codierenden Segment in dem Adenovirus 5-Genom.
hKLK2-Promotor-gesteuertes E1B-Ad5-Plasmid CN316

• CN316 wurde durch Insertieren des hKLK2-Promotors, gerade stromaufwärts des E1B-codierenden Segments, in ein Derivat von pXC-1, einem Plasmid, das das linksseitige Ende von dem Ad5-Genom enthält, produziert.
• CN124, das oben beschrieben ist, enthält außerdem eine künstliche EagI-Stelle bei Ad5-Nucleotid 1682, gerade stromaufwärts des E1B-codierenden Segments. Der hKLK2-Promotor wurde mit EagI aus CN310 ausgeschnitten und in CN124, verdaut mit EagI, insertiert, um CN316 zu produzieren. CN316 enthält den hKLK2-Promotor unmittelbar stromaufwärts von und funktionell verknüpft mit dem E1B-codierenden Segment.

BEISPIEL 9
Konstruktion von Adenovirus-Konstrukten, bei welchen Expression eines Adenovirus-Replikationsgens von einem hKLK2-Promotor oder einem hKLK2-TRE kontrolliert wird, und Expression eines weiteren Adenovirus-Replikationsgens von einem unterschiedlichen exogenen TRE kontrolliert wird
Ad5-Konstrukt, umfassend hKLK2-Promotor-gesteuertes E1A und PSE (Prostataspezifisches Antigen-Promotor und (-)Enhancer)-gesteuertes E1B (CN301)

• CN301 wurde aus CN125 durch Insertieren eines hKLK2-Promotors stromaufwärts des E1A-Gens erzeugt.
• CN125 ist ein pXC-1-Derivat, in welchem die Expression des E1B-Gens von PSE gesteuert wird. Eine PinAI-Stelle liegt stromaufwärts des E1A-Gens, dessen Expression von seinem Wildtyp-Promotor gesteuert wird. CN125 wurde erzeugt durch Insertieren von PSE als ein EagI-Fragment von Konstrukt CN105 in die EagI-Stelle unmittelbar stromaufwärts des E1B-Gens in CN124. CN105 enthält die PSE-Region von –5322 bis –3875, relativ zur PSA-Transkriptionsstartstelle.

Das hKLK2-Promotorfragment wurde aus CN294 mittels PinAI-Verdau freigesetzt und in PinAI-verdautes CN125 ligiert, um CN301 zu erzeugen. Das Endkonstrukt ist ein Plasmid, bei dem der hKLK2-Promotor E1A steuert und PSE E1B steuert.
Ad5-Konstrukte, umfassend PSE-gesteuertes E1A und hKLK2-Promotor-gesteuertes E1B (CN323)

• CN323 wurde so konstruiert, dass die Expression von E1A vermittelt wird durch PSE und Expression von E1B vermittelt wird durch einen hKLK2-Promotor.
• CN314 ist ein Plasmid, das ein PSE-Fragment in einem pGEM-T-Vektor enthält. Dieses PSE-Fragment wurde von CN706, einem adenoviralen Konstrukt, in welchem ein PSE Expression der E1A-Transkriptionseinheit in Ad5 steuert, mit den folgenden zwei synthetischen Oligonucleotiden amplifiziert: 51.10.1 (5'-CTC ATT TTC AGT CAC CGG TAA GCT TGG-3'; SEQ ID NO:20) und 51.10.2 (5'-GAG CCG CTC CGA CAC CGG TAC CTC-3'; SEQ ID NO:21).
• Das PSE-Fragment wurde durch Verdau von CN314 mit PinAI isoliert und in PinAI-verdautes CN316 (oben beschrieben) ligiert. Das Endkonstrukt ist ein Plasmid, enthaltend PSE, der E1A steuert, und den hKLK2-Promotor, der E1B steuert.

Erzeugen des rekombinanten Adenovirus
Adenovirus, enthaltend hKLK2-TRE, wurden durch homologe Rekombination in 293-Zellen erzeugt. Kurz beschrieben, wurde CN303 mit BHG10 (welches das rechtsseitige Ende des Adenovirus-Genoms enthält) in 293-Zellen co-transfiziert. Die Zellen wurden mit Medium überschichtet, und infektiöses Virus, erzeugt durch in vivo-Rekombination, wurde mittels cytopathischem Effekt detektiert und isoliert. Plaque-gereinigte Vorräte ("stocks") einer Mutante, bezeichnet als CN749, wurden etabliert. Die Struktur des rekombinanten Virus wurde mittels PCR, Restriktionsendonuclease-Verdau und Southern-Blot charakterisiert. CN749 ist ein Volllängen-Ad5, wobei der hKLK2-Promotor die Expression von E1A steuert.
Viren CN747 und CN754 wurden mit der gleichen Vorgehensweise mit der Ausnahme erzeugt, dass das CN303-Plasmid durch CN301 bzw. CN323 ersetzt wurde. Diese abgeschwächten Viren wurden durch Konstruieren von einem oder zwei exogenen Transkriptionsregulationselementen stromaufwärts von einem oder zwei essentiellen frühen Adenovirus 5-Genen; E1A und E1B, konstruiert. Schematisch beschrieben ist CN749 ein abgeschwächtes Adenovirus Typ 5, welches eine hKLK2-Promotorkassette, stromaufwärts des E1A-Gens konstruiert, enthält. Ähnlich dazu ist CN747 ein Virus, dessen E1A und E1B unter der Kontrolle des hKLK2-Promotors bzw. von PSE sind, und CN754 ist das Reziproke von CN747.
BEISPIEL 10
Erzeugen von adenoviralen Konstrukten, umfassend ein erstes adenovirales Gen unter transkriptionaler Kontrolle eines hKLK2-TRE und ein zweites adenovirales Gen unter transkriptionaler Kontrolle eines unterschiedlichen heterologen Promotors

• CN421 wurde durch Insertieren eines hKLK2-TRE (umfassend einen hKLK2-Enhancer von Nucleotiden –5155 bis –3387 relativ zur hKLK2-Gen-Transkriptionsstartstelle (Nucleotide 6859 bis 8627 von SEQ ID NO:1) und einen hKLK2-Minimalpromotor, wie in CN379; siehe Tabelle 1 und 16) in CN306 konstruiert. Das hKLK2-TRE-Fragment wurde mittels PCR aus CN379 amplifiziert, mit PinAI verdaut und in ähnlich geschnittenes CN306 ligiert, um CN421 zu produzieren.
• CN438 wurde durch Insertieren eines hKLK2-TRE (umfassend einen hKLK2-Enhancer von Nucleotiden –4814 bis –3643, relativ zur hKLK2-Gen-Transkriptionsstartstelle (Nucleotide 7200 bis 8371 von SEQ ID NO:1) und einen hKLK2-Minimalpromotor, wie in CN390; siehe Tabelle 1 und 16) in CN306 konstruiert. Das Enhancer-Fragment wurde mittels PCR aus CN390 amplifiziert, mit PinAI verdaut und in ähnlich geschnittenes CN306 ligiert, um CN438 zu produzieren.
• CN306 wurde von CN124 durch Entfernen des endogenen E1A-Promotors von 64 Nucleotiden abgeleitet.
• CN321 wurde aus CN306 durch Insertieren eines großen PSE-Fragments, amplifiziert aus CN96, erzeugt.
• CN326 wurde aus CN321 durch Insertieren eines Ratten-Probasin-Transkriptionsregulationselements (PB-TRE) an der EagI-Stelle konstruiert.
• CN326 wurde durch Insertieren eines PB-TRE in die EagI-Stelle von CN321 konstruiert. CN321 enthält einen PSE von CN96 an der PinAI-Stelle von CN306.
• CN416 wurde durch Insertieren eines hKLK2-TRE (umfassend einen hKLK2-Enhancer von Nucleotiden –5155 bis –3387 relativ zur hKLK2-Gen-Transkriptionsstartstelle (Nucleotide 6859 bis 8627 von SEQ ID NO:1) und einen hKLK2-Minimalpromotor, wie in CN379; siehe Tabelle 1 und 16) in CN321 konstruiert. Das Enhancer-Fragment wurde mittels PCR aus CN379 amplifiziert, mit EagI verdaut und in ähnlich geschnittene CN321 ligiert, um CN416 zu erzeugen.
• CN422 wurde durch Insertieren eines hKLK2-TRE (umfassend einen hKLK2-Enhancer von Nucleotiden –5155 bis –3387 relativ zu der hKLK2-Gen-Transkriptionsstartstelle (Nucleotide 6859 bis 8627 von SEQ ID NO:1) und einen hKLK2-Minimalpromotor, wie in CN379; siehe Tabelle 1 und 16) in CN369 konstruiert. CN369 ist ein Derivat von CN306, bei welchem der endogene E1B-Promotor entfernt wurde. Das hKLK2-TRE wurde aus CN379 amplifiziert, mit EagI verdaut, und in ähnlich geschnittenes CN369 ligiert, um CN422 zu produzieren.
• CN444 wurde durch Ersetzen des hKLK2-TRE von CN442 mit einem hKLK2-TRE, umfassend einen hKLK2-Enhancer von Nucleotiden –4814 bis –3643, relativ zu der hKLK2-Transkriptionsstartstelle, und einem hKLK2-Minimalpromotor wie in CN300 (siehe Tabelle 1 und 16) konstruiert. Das hKLK2-TRE wurde aus CN390 amplifiziert, mit EagI verdaut und in ähnlich geschnittenes CN369 ligiert, um CN444 zu produzieren.
• CN446 ist mit der Ausnahme, dass der endogene E1B-Promotor nicht entfernt wurde, ähnlich zu CN444. Das hKLK2-TRE wurde aus CN390 amplifiziert, mit EagI verdaut, und in ähnlich geschnittenes CN321 ligiert, um CN446 zu produzieren.
• CN459 und CN460 sind mit der Ausnahme ähnlich zu CN444, dass jedes ein hKLK2-TRE, umfassend einen hKLK2-Enhancer von Nucleotiden –3993 bis –3643 relativ zu der hKLK2-Transkriptionsstartstelle, und einen hKLK2-Minimalpromotor, wie in CN396, (siehe Tabelle 1) umfasst.
• CN463 wurde durch Insertieren eines hKLK2-TRE (umfassend einen hKLK2-Enhancer von Nucleotiden –4814 bis –3643 relativ zu der hKLK2-Transkriptionsstartstelle, und einen hKLK2-Minimalpromotor, wie in CN390; siehe Tabelle 1 und 16) in CN251 konstruiert. Das hKLK2-TRE wurde aus CN446 mit EagI ausgeschnitten und in ähnlich geschnittenes CN251 ligiert, um CN463 zu produzieren.

Erzeugen rekombinanter Adenoviren
Viren CN753, CN755, CN759, CN761, CN763, CN764, CN765, CN767, CN768, CN769, CN770, CN772 und CN773 wurden unter Verwendung des Verfahrens, wie beschrieben in Beispiel 9, von den Elternplasmiden CN326, CN328, CN398, CN316, CN421, CN416, CN422, CN436, CN438, CN444, CN446, CN459, CN460 bzw. CN463 erzeugt. Diese viralen Konstrukte sind schematisch in den 17A und 17B gezeigt. Auf eine ähnliche Weise wurde CN774, bei welchem das adenovirale E1A-Gen unter transkriptionaler Kontrolle eines Probasin-TRE ist, und das adenovirale E1B-Gen unter transkriptionaler Kontrolle des innerhalb von CN463 enthaltenen hKLK2-TRE ist, konstruiert.
BEISPIEL 11
In vitro-Charakterisierung adenoviraler Konstrukte, umfassend ein adenovirales Gen unter transkriptionaler Kontrolle eines hKLK2-TRE
Plaque-Assays
Um zu bestimmen, ob die in Beispiel 10 beschriebenen adenoviralen Konstrukte vorzugsweise in Prostatazellen replizieren, wurden Plaque-Assays durchgeführt. Die Plaquebildungseffizienz wurde in den folgenden Zelltypen ausgewertet: Prostatatumor-Zelllinien (LNCaP), normale Brustzelllinie (HBL-100), Eierstocktumorzelllinie (OVCAR-3, SK-OV-3) und humane embryonale Nierenzellen (293). LNCaP-Zellen exprimieren sowohl Androgen-Rezeptor als auch PSA, während die anderen getesteten Zelllinien dies nicht tun. 293-Zellen dienen als eine positive Kontrolle für die Plaquebildungseffizienz, weil diese Zelllinie Ad5-EIA- und -EIB-Proteine exprimiert. Der Plaque-Assay wurde wie folgt durchgeführt: Konfluente Zellmonolayers wurden in Schalen mit 6 Kavitäten achtzehn Stunden vor Infektion angeimpft („seeded"). Die Monolagers wurden mit 10-fach Reihenverdünnungen jedes Virus infiziert.

Nach Infizieren der Monolagers für vier Stunden in Serum-freiem Medium (MEM) wurde das Medium entfernt und mit einer Lösung von 0,75% Agarose mit niedrigen Schmelzpunkt und Gewebekulturmedium ersetzt. Plaques wurden zwei Wochen nach Infektion ausgezählt. CN702 weist in seiner E1-Region keine Modifikationen auf und wird als eine Wildtyp-Kontrolle verwendet. CN706 zeigt selektive Cytotoxizität gegenüber PSA-exprimierenden Zellen in vitro und in vivo. Rodriguez et al. (1997) Cancer Res. 57:2559–2563. Tabelle 2:

	293	LNCaP	HBL-100	OVCAR-3
Viren
CN702	100	100	100	100
CN706	100	23	2,4	5,5
CN763	100	35	1,2	1,9
CN768	100	29	1,3	3,9

Tabelle 3:

	293	LNCaP	HBL-100	OVCAR-3	SK-OV 3
Viren
CN702	100	100	100	100	100
CN706	100	23	4,2	5,5	8,9
CN764	100	31	0,25	0,032	0,003
CN769	100	11	0,14	0,015	0,0008
CN770	100	24	0,27	0,036	0,084
CN772	100	29	0,27	0,096	0,21

Tabelle 4:

	293	LNCaP	HBL-100	OVCAR-3
Viren
CN702	100	100	100	100
CN706	100	33	2,5	3,4
CN739	100	35	0,12	0,0023
CN753	100	41	0,23	0,11

Tabellen 2, 3 und 4 zeigen die Ergebnisse von Plaque-Assays, durchgeführt mit den in Beispiel 10 beschriebenen adenoviralen Vektoren. Die Ergebnisse sind als Prozent von Wildtyp-Adenovirus-Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro ml ausgedrückt. Der durchschnittliche Titer von Zweifachproben für die getesteten Viren. Der Titer für ein spezielles Virus in allen Zelllinien wurde auf seinen Titer bei 293-Zellen normalisiert. Sobald die Titer bei einem Zelltyp auf 293-Zellen normalisiert waren, wurden die normalisierten Zahlen der rekombinanten Viren mit CN702 verglichen. Ein Verhältnis von weniger als 100 legt nahe, dass das getestete Virus Plaques weniger effizient als CN702 bildet. In umgekehrter Weise legt ein Verhältnis von größer als 100 nahe, dass das Virus Plaques effizienter als CN702 bildet.
Die folgenden Beobachtungen wurden aufgestellt. Erstens zeigen hKLK2-TRE manipulierte („engineered") Adenoviren bevorzugte Replikation in Prostatatumorzellen. Nachdem dieses Karzinom Androgen-Rezeptoren exprimiert, sollte das in den adenoviralen Vektoren enthaltene hKLK-TRE beim Fördern der Transkription der frühen Adenovirusgene aktiv sein. Die in den Tabellen 2, 3 und 4 präsentierten Daten legen nahe, dass die hKLK2-TRE-enthaltenden adenoviralen Vektoren cytopathische Effekte mit einer geringeren Effizienz als Wildtyp-Adenovirus in Prostatatumorzellen induzieren. Zweitens zeigen hKLK2-TRE-kontrollierte Adenoviren eine dramatisch geringere Plaquebildungseffizienz in Nicht-Prostata-Tumorzellen, wenn verglichen mit Wildtyp. Beispielsweise produzierten CN763 und CN768 in der Eierstockkarzinomzelllinie OVCAR-3 etwa 25- bis 50-fach weniger Plaques als Wildtyp-Ad5. Die Ergebnisse sind für diese zwei Viren in HBL-100-Zellen ähnlich, in welchen Virusreplikation auch stark kompromitiert ist. Drittens ergeben adenovirale PSA-TRE-Vektoren und adenovirale hKLK2-TRE-Vektoren in HBL-100 und OVCAR-3-Zellen ähnliche Plaques. Folglich waren adenovirale hKLK2-TRE-Vektoren, wie der adenovirale PSA-TRE-Vektor CN706, relativ zu Wildtyp-Adenovirus in Nicht-Prostatazellen signifikant abgeschwächt, diese Vektoren wuchsen jedoch in Prostatatumorzellen in vergleichbarer Weise.
Cytopathische Effekte
Um die differentielle virale Replikation und cytopathische Effekte (CPE, „cytopathic effects") zu charakterisieren, wurden CPE-Assays wie folgt durchgeführt. Zellen wurden mit Virus bei zunehmenden Multiplizitäten einer Infektion (MOI) infiziert und auf cytopathische Effekte hin überwacht. Assays wurden beendet, wenn bei einer MOI von 0,01 mit Wildtyp-Adenovirus vollständige Cytolyse der Monolagers beobachtet wurde. Eine primäre nichtimmortalisierte humane mikrovaskuläre Endothel-Zelllinie (hMVEC) wurde ausgewählt, um ihre Sensitivität gegenüber CN764- und Wildtyp-Adenovirus (CN702)-Infektion in vitro zu testen. Wie in 18 gezeigt, verursachte CN702 innerhalb von 10 Tagen vollständige Monolayer-Cytolyse von hMVECs bei MOIs von so niedrigen Werten wie 0,01. Im Gegensatz dazu zeigten CN764-infizierte hMVEC-Monolagers an den gleichen Zeitpunkten bei MOIs von 10, 1,0, 0,1 und 0,01 keine signifikanten cytopathischen Effekte. Cytolyse von hMVECs, äquivalent zu der, die man mit Wildtyp-Adenovirus sieht, war nur bei MOIs ersichtlich, die zwischen 100 und 1000mal so hoch (MOI > 10) waren.
Folglich ist CN764-vermittelte Cytolyse relativ zu Wildtyp-Adenovirus in primären normalen humanen Zellen abgeschwächt.
Differentielle virale Replikation
Um zu bestimmen, ob Level an Virusreplikation mit den cytopathischen Effekten von CN739 in Prostatatumorzellen oder normalen humanen Zellen korrelieren, wurde Virusreplikationstitration an PSA-produzierenden Prostatatumorzellen (LNCaP) und primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen (hMVECs) durchgeführt. Zellen wurden bis zu 70–90% Konfluenz kultiviert und entweder mit Wildtyp-Adenovirus (CN702) oder CN764, CN765, CN770 90 min lang bei einer MOI von 10 infiziert. Fünfundfünfzig Stunden nach Infektion wurde das Virus von den Zellen durch drei Gefrier-/Huftau-Zyklen freigesetzt und der resultierende Überstand wurde auf 293-Zellen getitert („titered"). Die Menge an CN739, produziert 56 Stunden nach Infektion, wurde gegen die Menge an Wildtyp-Virus, produziert in der gleichen Zelllinie während des gleichen Zeitraums normalisiert. Die Daten, gezeigt in 19, zeigen an, dass hKLK2-TRE-Adenovirus-Konstrukt-Titer 30% von CN702-litern in LNCaPs waren, jedoch auf weniger als 1/100 jener der Wildtyp-Viren in normalen Zellen reduziert waren. Diese Daten legen nahe, dass CN764-ähnliche Viren in primären normalen humanen Zellen schlecht replizieren und in Prostatakrebszellen etwas abgeschwächt sind.
BEISPIEL 12
Testen von cytotoxischer Fähigkeit von Adenovirus-Vektoren auf Prostatakarzinom-Tumor-Heterotransplantate
Ein besonders nützliches Ziel bei der Entwicklung Prostata-spezifischer adenoviraler Vektoren ist, Patienten mit Prostatakrebs zu behandeln. Ein anfänglicher Indikator der Machbarkeit ist, die Vektoren unter Verwendung einer im Fachgebiet bekannten Technik zu testen, wie z. B. die Vektoren auf Cytotoxizität gegen Prostatakarzinomzellen, wie z. B. Prostataheterotransplantate, subkutan kultiviert in Balb/c nu/nu-Mausen, zu testen. Mausen werden subkutane Injektionen mit 1 × 10⁷ Prostatakarzinomzellen, wie z. B. LNCaP, in PBS verabreicht. Tumorzellen können auf hK2-Aktivität durch Untersuchen auf hK2 im Serum unter Verwendung von Standardassays (beispielsweise ELISA) getestet werden.
Für dieses Experiment werden Test-Virusvektoren in die Mause, entweder durch direkte intratumorale, intravenöse oder intraperitoneale Injektion von ungefähr 10⁸ pfu Virus (falls als ein verpacktes Virus verabreicht) in 0,1 ml PBs + 10% Glycerin oder intravenös über die Schwanzvene, eingeführt. Wenn als ein Polynucleotidkonstrukt (d. h. nicht in Virus verpackt) verabreicht, können 0,1 μg bis 100 μg oder mehr verabreicht werden. Tumorgrößen werden gemessen und in manchen Experimenten werden wöchentlich Blutproben genommen. Der Effekt intratumoraler Injektion eines Adenovirus-Vektors der vorliegenden Erfindung auf Tumorgröße und Serum-Androgen-Rezeptor-Spiegel wird mit Schein- („sham")-Behandlung verglichen.
Während es wahrscheinlich ist, dass ein Therapeutikum, basierend auf den hier beschriebenen Viren, intraläsional (d. h. direkte Injektion) gegeben würde, wäre es auch wünschenswert, zu bestimmen, ob intravenöse (IV)Verabreichung des Virus Tumorwachstum beeinflussen kann. Wenn dem so ist, dann ist es vorstellbar, dass das Virus verwendet werden könnte, um metastatische Tumorablagerungen, die für direkte Injektion unzugänglich sind, zu behandeln. Für dieses Experiment wurden Gruppen von fünf Mausen, die Prostatakrebs-Tumoren trugen, mit 10⁸ pfu von einem adenoviralen Vektor der vorliegenden Erfindung mittels Schwanzveneninjektion oder 10⁸ pfu eines Replikations-defekten Adenovirus (CMV-LacZ), um auf nicht-spezifische toxische Effekte des Virus zu kontrollieren, oder mit Puffer, der verwendet wurde, um das Virus zu tragen, inokuliert. Der Effekt intravenöser Injektion des adenoviralen Vektors auf Tumorgröße wird mit der Schein-Behandlung verglichen.
BEISPIEL 13
Konstruktion eines adenoviralen Vektors, der die codierende Region für das Adenovirus-Todesprotein (ADP)(„adenovirus death Protein") enthält
In einem adenoviralen Vektor (wie z. B. jenen, die oben beschrieben sind) kann eine Deletion in der E3-Region erzeugt werden, um ein hKLK2-TRE in der E1-Region unterzubringen. Die ADP-codierende Sequenz von Ad2 kann wie folgt in die E3-Region von Ad5 wiedereingeführt werden.
Eine ADP-Kassette wird unter Verwendung von Überlappungs-PCR konstruiert. Der „Y-Leader", eine wichtige Sequenz für korrekte Expression mancher später Gene, wird unter Verwendung der folgenden Primer PCR-amplifiziert:
5' GCCTTAATTAAAAGCAAACCTCACCTCCG...Ad2 28287bp (37.124.1)(SEQ ID NO: 22); und
5' GTGGAACAAAAGGTGATTAAAAAATCCCAG...Ad2 28622bp (37.146.1)(SEQ ID NO: 23).
Die ADP-codierende Region wird unter Verwendung der folgenden Primer PCR-amplifiziert
5' CACCTTTTGTTCCACCGCTCTGCTTATTAC...Ad2 29195bp (37.124.3)(SEQ ID NO: 24) und
5' GGCTTAATTAACTGTGAAAGGTGGGAGC...Ad2 29872bp (37.124.4)(SEQ ID NO: 25).
Die zwei Fragmente wurden „annealed" und das Überlappungsprodukt wurde unter Verwendung der Primer 37.124.1 und 37.124.4 PCR-amplifiziert. Die Enden des Produkts wurden mit Klenow-Fragment poliert und an BamHI-geschnittenes pGEM-72(+)(CN241; Promega, Madison, WI) ligiert. Die ADP-Kassette wurde durch Verdau von CN241 mit PacI-Restriktionsendonuklease herausgeschnitten und mit zwei Vektoren, CN247 und CN248, ligiert, was Plasmide CN252 bzw. CN270 erzeugt. CN247 enthält eine einzelne PacI-Stelle in der E3-Region und wurde wie folgt konstruiert. Ein Plasmid, das das Volllängen-Ad5-Genom enthält, TG3602 (Transgene, Frankreich), wurde mit BamHI verdaut und religiert, um CN221 zu ergeben. Das Rückgrat dieses Plasmids (außerhalb der Ad5-Sequenz) enthielt eine PacI-Stelle, die entfernt werden musste, um weitere Manipulationen zu erlauben. Dies wurde bewirkt durch Verdau von CN221 mit PacI und Polieren der Enden mit T4-DNA-Polymesse, was in CN246 resultierte. CN246 wurde mit AscI und AvrII verdaut (um intakte E3-Region zu entfernen). Dieses Fragment wurde durch ein ähnlich geschnittenes Fragment, abgeleitet von BHG11, ersetzt. Das resultierende Plasmid, CN247, enthielt eine deletierte E3-Region und eine PacI-Stelle, geeignet zur Insertion des ADP-Kassette-Fragments (oben beschrieben). Ligation von CN247 mit der ADP-Kassette erzeugte CN252.
CN248 (ein Konstrukt, das Einführung einer ADP-Kassette in ein Ad erlauben würde, das außerdem eine Deletion/Substitution in der E4-Region enthält) wurde wie folgt hergestellt. Die E4-Region wurde deletiert durch Verdau von CN108, einem Konstrukt, das die Sequenz des rechtsseitigen Endes von Ad5 von der einzelnen EcoRI-Stelle in der E3-Region enthält, mit AvrII und AfIII. Der einzige E4-ORF, notwendig für virale Replikation, ORF 6, wurde mittels PCR-Amplifikation des ORF mit den folgenden Primer wiedereingeführt.
33.81.1 (Ad5 33096):
GCAGCTCACTTAAGTTCATGTCG (SEQ ID NO: 26)
33.81.2 (Ad5 34084):
TCAGCCTAGGAAATATGACTACGTCCG (SEQ ID NO: 27)
Das resultierende Plasmid ist CN203. CN203 wurde mit EcoRI verdaut und an CN209, ein Shuttle-Plasmid, ligiert, um CN208 zu erzeugen. In dem letzten Klonierungsschritt wurde CN208 mit AscI und AvrII verdaut und ligiert, an ähnlich geschnittene E4-Deletion/Substitution mit der ADP-Kassette.
Sowohl CN252 als auch CN270 enthalten eine E3-Deletion. Zusätzlich dazu fehlt CN270 etwas Sequenz in der E4-Region, wie zuvor beschrieben. Adenovirale Vektoren werden erhalten über in vitro-Ligation von (1) geeignet hergestellter „vial DNA", verdaut mit BamHI, und (2) CN252 oder CN257, auch verdaut mit BamHI. Das Ligationsprodukt wird verwendet, um 293-Zellen zu transfizieren. Plaque-Assays werden wie oben beschrieben durchgeführt.
BEISPIEL 14
Charakterisierung eines E3-deletierten Adenovirus, CN751, das das Adenovirus-Todesprotein-Gen enthält
Eine Adenovirus-Todesprotein-Mutante, CN751, wurde konstruiert, um zu testen, ob solch ein Konstrukt für die Cytotoxizität effektiver sein kann. Das Adenovirus-Todesprotein (ADP), ein 11,6kD-Asn-glycosyliertes integriertes Membranpeptid, das spät in der Infektion bei hohen Leveln exprimiert wird, wandert zu der Kernmembran infizierter Zellen und beeinflusst effiziente Lyse des Wirts. Die Adenovirus 5 (Ad5)-E3-Region exprimiert das adp-Gen.
Konstruktion von CN751
CN751 wurde in zwei Teilen konstruiert. Zuerst wurde ein E3-deletieres Plattform-Plasmid, das Ad5-Sequenz 3' von der BamHI-Stelle bei 21562bp enthält, erzeugt. Das Ad2-adp wurde in den Rest der E3-Region dieses Plasmids eingebaut, um CN252 zu ergeben (diese Klonierung ist zuvor beschrieben worden). Um den zweiten Teil zu konstruieren, wurde die 5'-Ad5-Sequenz, notwendig für CN751, durch Verdauen von gereinigter CN702-DNA mit EcoRI und Isolieren des linksseitigen Fragments mittels Gelextraktion erhalten. Nach Verdau von CN252 mit EcoRI wurden das linksseitige Fragment von CN702 und CN252 ligiert. 293-Zellen wurden mit diesem Ligationsgemisch durch Lipofektion-Transfektion transfiziert und bei 37°C inkubiert. Zehn Tage später wurden die Zellen geerntet, dreimal gefrier-getaut und der Überstand wurde auf 293-Monolagers „plaquiert" („plaqued"). Einzelne Plaques wurden ausgewählt („picked”) und verwendet, um Monolagers von 293-Zellen zu infizieren, um genügend Virus zum Testen zu kultivieren. Nach mehreren Tagen wurden Plattenlysate unter Verwendung eines Polymerase-Ketten-Reaktion(PCR)-basierten Assays durchmustert, um Kandidatenviren zu detektieren. Einer der Plaques, der positiv bewertet wurde, wurde als CN751 bezeichnet.
Strukturelle Charakterisierung von CN751
Die Struktur von CN751 wurde durch zwei Verfahren bestätigt. Abs erstes wurden Primer 37.124.1 (5' gccttaattaaaagcaaacctcacctccg Ad2 28287bp; SEQ ID NO: 22) und 37.124.4 (5' ggcttaattaactgtgaaaggtgggctgc Ad2 29872bp; SEQ ID NO: 25) verwendet, um Kandidatenviren mittels PCR zu durchmustern, um das Vorhandensein der adp-Kassette zu detektieren. CN751 produzierte ein Ergänzungsfragment („extension fragment"), konsistent mit dem erwarteten Produkt (1065bp). Als Zweites wurde CN751 mittels Southern-Blot analysiert. Virale DNA wurde gereinigt, mit PacI, SacI und AccI/XhoI verdaut und mit einer Sequenz, homolog zu der ADP-codierenden Region, als Sonde behandelt. Die Struktur von CN751 passte zu dem erwarteten Muster.
In vitro-Charakterisierung von CN751
Zwei Experimente wurden durchgeführt, um die Cytotoxizität und Virusausbeute von CN751 zu untersuchen. In der ersten Studie wurde die Cytotoxizität von CN751 in LNCaP-Zellen durch Messen der Akkumulierung eines cytosolischen Enzyms, Lactatdehydrogenase (LDH), in dem Überstand über mehrere Tage hinweg ausgewertet. Der Level an extracellulärer LDH korreliert mit dem Ausmaß an Zelllyse. Gesunde Zellen setzen, wenn überhaupt, sehr wenig Enzym frei, wohingegen tote Zellen große Mengen freisetzen. LDH wurde als ein Marker gewählt, weil sie ein stabiles Protein ist, das leicht mittels eines einfachen Protokolls detektiert werden kann. Die Fähigkeit von CN751, Zelltod zu verursachen, wurde mit der von CN702, einem Vektor, dem das ADP-Gen fehlt, und Rec700, einem Vektor, der das ADP-Gen enthält, verglichen.
Monolagers von LNCaP-Zellen wurden bei einer MOI von eins mit entweder CN702, Rec700 („adp+"-Kontrolle) oder CN751 infiziert und dann in Schalen mit 96 Kavitäten ausgesät. Proben wurden einmal am Tag von einem Tag nach Infektion bis fünf Tage nach Infektion geerntet und unter Verwendung des Cytotox 96-Kits von Promega ausgewertet. Dieser Assay verwendet eine gekoppelte enzymatische Reaktion, welche ein Tetrazoliumsalz in ein rotes Formazan-Produkt umwandelt, das in einem Plattenlesegerät bei 490 nm bestimmt werden kann.
Weil die Absorption einer Probe dem Level an LDH, freigesetzt aus infizierten Zellen, entspricht, beschreibt ein Plot, wie sich die Absorption einer Probe über die Zeit ändert, wie effizient die untersuchten Viren Zelllyse induzieren (20). Jeder Datenpunkt stellt den Durchschnitt von sechzehn getrennten Proben dar. Die Ergebnisse legen nahe, dass CN751 Zellen effizienter als die „adp-"-Kontrolle, CN702, und ähnlich zu der „adp+"-Kontrolle, Rec700, tötet. Die Konzentration von LDH in dem Überstand erhöht sich von zwei Tagen an rapide und erreicht bei vier Tagen in Kavitäten, infiziert mit CN751, ein Maximum. Im Gegensatz dazu beginnt LDH-Konzentration in dem Überstand von CN702-infizierten Zellen, sich bei zwei Tagen langsam zu erhöhen und setzt dies bis zum Abschluss des Experiments fort. Bezeichnenderweise ist die Menge an LDH, freigesetzt von CN751-infizierten Zellen, bei drei Tagen zweimal die, die von CN702-infizierten Zellen freigesetzt wird. In der Summe zeigen die Virusausbeute-Daten, dass Adenovektoren mit dem ADP-Gen mehr Virus freisetzen.
Für Ad-Vektoren ist es nicht nur wichtig, Zellen effizient zu töten, sie müssen auch fähig sein, Nachkommen zu verstreuen, die andere Krebszellen infizieren können. Virale Vektoren, die große Mengen an Virus verstreuen können, könnten bessere Therapeutika sein als jene, die nur geringe Mengen verstreuen. Ein Virusausbeute-Assay wurde durchgeführt, um zu beurteilen, ob CN751 die effiziente Freisetzung seiner Nachkommen von der infizierten Zelle induzieren kann. A549-Zellen wurden bei einer MOI von fünf infiziert. Überstand wurde zu verschiedenen Zeiten nach Infektion geerntet und auf 293-Zellen getitert, um die Virusausbeute zu bestimmen (21). Die Daten legen nahe, dass Zellen, infiziert mit CN751, Virus effizienter verstreuen als jene, die mit CN702 infiziert sind. Achtundvierzig Stunden nach Infektion setzten CN751-infizierte Zellen zehnmal mehr Virus als CN702-infizierte Zellen frei. Zweiundsiebzig Stunden nach Infektion setzten CN751-infizierte Zellen vierzigmal mehr Virus frei. Die Daten zeigen, dass Adenovektoren mit dem ADP-Gen Zellen effizienter töten als Adenovektoren, denen das ADP-Gen fehlt.
In vivo-Charakterisierung von CN751
LNCaP-Nacktmaus-Heterotransplantate wurden mit einer einzelnen intratumoralen Dosis (1 × 10⁴ Partikel/mm³ Tumor) von entweder CN751, einem Vektor, enthaltend das ADP-Gen, oder CN702, einem Vektor, dem das Gen fehlt, herausgefordert („challenged"). Eine dritte Gruppe an Tumoren wurde mit Puffer alleine behandelt. Die Tumoren wurden wöchentlich sechs Wochen lang beobachtet und ihr relatives Volumen wurde graphisch gegen die Zeit aufgetragen. Die Ergebnisse sind in 22 gezeigt. Fehlerbalken stellen den Standardfehler für jede Probengruppe dar. Das anfängliche Tumor-Durchschnittsvolumen für CN751-behandelte Tiere (n = 14) war 320 mm³ für CN702-behandelte (n = 14) und 343 mm³ für Puffer-behandelte (n = 8). Die Daten legen nahe, dass CN751 Tumorzellen effizienter töten als CN702. Im Durchschnitt blieben Tumoren, herausgefordert mit CN751, durch den Verlauf des Experiments hindurch bei der gleichen Größe, während sich neun von vierzehn Tumoren (64%) zurückentwickelten. Jene, die mit CN702 behandelt wurden, verdoppelten die Größe. Puffer-behandelte Tumoren wuchsen auf nahezu fünfmal ihr anfängliches Volumen. Der „Students T-Test" zeigt an, dass der Unterschied an Tumorgröße zwischen CN751- und CN702-behandelten Tumoren von Tag 7 an (p = 0,016) bis zum Ende des Experiments (p = 0,003) statistisch signifikant war.
BEISPIEL 15
Arzneimittel-Screening-Assays
23A und 23B zeigen Schemata für die Verwendung eines hKLK2-TRE in Screening-Assays für Mittel, die hKLK2-Genexpression modulieren. Diese Assays sind auch geeignet für das automatisierte Zufalls-Arzneimittel-Screening mit hohem Durchsatz („automated high through-put random drug screening").
Screening- Verfahren unter Verwendung von Plasmidvektoren
Eine DNA-Sequenz, enthaltend ein hKLK2-TRE, ist verknüpft mit einer DNA-Sequenz, codierend eine zweite Gruppierung, die als ein detektierbares „Tag" dienen kann, z. B. Luciferase, und ist stabil oder transient in eine geeignete Zelllinie, wie z. B. LNCaP-Zellen, transfiziert (23A). Zellen werden in eine Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten plattiert. Nach einer geeigneten Zeit, beispielsweise etwa 12 Stunden, wird das Mittel, dessen Fähigkeit getestet werden soll, hKLK2-Genexpression zu beeinflussen, zugegeben. Kontrollproben beinhalten kein Test mittel. Nach einem geeigneten Inkubationszeitraum werden die Test-Kavitäten gewaschen und Luciferaseaktivität wird gemessen. Es gibt Standardverfahren für das Untersuchen von Luciferase-Enzymaktivität. Ow et al. (1986) Science 234:856 und de Wet et al. (19987) Mol. Cell. Biol. 7:725. Test-Kavitäten, die eine signifikant höhere oder signifikant niedrigere Luciferaseaktivität verglichen mit der Kontrolle zeigen, werden dann weiter untersucht, um einen Effekt auf hKLK2-Genexpression zu besttigen.
Screening-Verfahren unter Verwendung von Replikations-defektem Adenovirus
Zellen, wie z. B. LNCaP-Zellen, werden in Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten plattiert (23B). Nach einer geeigneten Zeitspanne, beispielsweise etwa 12 Stunden, werden die Zellen mit einem rekombinanten Adenovirus infiziert, in welchem ein Gen oder Gene, essentiell zur Replikation, wie z. B. E1A und E1B, ersetzt sind durch ein hKLK2-TRE, funktionell verknüpft mit einem Reportergen, z. B. Luciferase. Nach einem geeigneten Inkubationszeitraum wird das Mittel, dessen Fähigkeit, hKLK2-Genexpression zu modulieren, getestet werden soll, zugegeben. Kontrollproben beinhalten kein Testmittel. Nach einem geeigneten Inkubationszeitraum werden die Test-Kavitäten gewaschen, und Luciferaseaktivität wird mittels bekannter Verfahren gemessen. Test-Kavitäten, die verglichen mit der Kontrolle eine signifikant höhere oder signifikant niedrigere Luciferaseaktivität zeigen, werden dann weiter untersucht, um einen Effekt auf hKLK2-Genexpression zu bestätigen.
BEISPIEL 16
Elektrophoretische Mobilitäts-Verschiebungs-Assays (EMSA, „Electrophoretic Mobility Shift Assays")
Kernextrakte, enthaltend DNA-bindende Proteine, wurden von LNCaP- und HeLa-Zellen wie beschrieben hergestellt. Schuur et al. (1993) Cell Growth and Differ. 4:761–768. Dieses Protokoll ist eine Modifikation von dem, das von Dignam et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:1475–1489 beschrieben wurde. Ungefähr 1 × 10⁸ LNCaP-Zellen oder HeLa-Zellen wurden geerntet, mit PBS gewaschen, und dann in zwei 50 ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation für 10 Minuten bei 3000 UpM bei 4°C pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 5X Volumina hypotonem Puffer (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 0,2 mM PMSF, 0,5 mM DTT) resuspendiert. Die Zellen wurden wie zuvor pelletiert, der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 3X Volumina hypotonem Puffer resuspendiert und dann 10 Minuten lang auf Eis aufbewahrt. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen dann in einem Dounce-Homogenisator unter Verwendung eines Pistills vom Typ B homogenisiert. Nachdem die Zellen zu etwa 90% lysiert waren (wie bestimmt durch einen „trypan blue dye exclusion test", der an einer Probe durchgeführt wurde), wurde das Gemisch mittels Zentrifugation für 15 Minuten bei 4000 UpM (ungefähr 3300 × g) bei 4°C pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in Niedrigsalzpuffer (20 mM HEPES, pH 7,9, 25% Glycerin, 1,5 mM MgCl₂, 0,02 M KCl, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF und 0,5 mM Dithiothreitol) resuspendiert. 0,5 X Volumina an Hochsalzpuffer (der glei che wie Niedrigsalzpuffer, jedoch weist er 1,2 M KCl auf) wurde tropfenweise zu dem Gemisch gegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang auf einem Schüttler inkubiert. Nach Inkubation wurde das Gemisch 30 Minuten lang bei 13200 UpM (ungefähr 25.000 × g) bei 4°C zentrifugiert. Der Rohextrakt wurde in Bindungspuffer (20 mM HEPES, pH 7,9, 20% Glycerin, 100 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,5 mM DTT) dialysiert und bei –80°C gelagert.
Eine DNA-Sonde wurde von einem PCR-Produkt erzeugt, das sich von –3899 bis –3699 (Primer 58.44.3 und 58.44.4) relativ zum Start von hKLK2-Gen-Transkription erstreckt. Die verwendeten Primer waren 58.44.3 (5' TAC TAG CAA ACT TGT CCA GTC 3'; SEQ ID NO: 35) und 58.44.4 (5' TAG CCT TGC AAG ATG GTA TCG 3'; SEQ ID NO: 36) und die Matrize war CN379. Diese Sonde innerhalb des Kerns („core") des Enhancers enthält das ARE, lokalisiert bei etwa –3822 bis etwa –3808 (von etwa Nucleotid 8192 bis etwa 8206 von SEQ ID NO: 1). Eine Sonde, stromabwärts dieses Kerns, entsprechend einer Sequenz von –2358 bis –2555 relativ zum Start der bKLK2-Gen-Transkription wurde auch synthetisiert. Die verwendeten Primer waren 51.70.1 (5' GGA AAT CAA ACA CAA CCA CAT CCC 3'; SEQ ID NO: 37) und 58.160.2 (5' TGT GCC AGC ATC AGC TTC ATC TGT ACC 3'; SEQ ID NO: 38), und CN312 wurde als die Matrize verwendet.
Die PCR-Reaktionsgemische, welche verwendet wurden, um die Sonden herzustellen, enthielten 2U Taq-Polymerase (Boehringer-Mannheim), 10 ng CN379 (CN312 für die Negativsonde), 10 μl PCR-Puffer plus Mg² ⁺, bereitgestellt von dem Hersteller, 200 μM dNTPs und 50 pmol jedes Primers. Die Reaktionen wurden anfänglich 2 Minuten lang bei 94°C denaturiert, was gefolgt war von 25 Zyklen an Amplifikation (94°C für 15 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden). Eine letzte Verlängerung von 5 Minuten bei 72°C folgte der Amplifikation.
Markierte DNA-Sonden wurden hergestellt durch Modifizieren des obigen PCR-Protokolls. 10 prol jedes Primers wurden mit ³²P unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase (Amersham) in einer 10 μl-Reaktion markiert. Die Reaktionen wurden 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert und zu 8 μl Primer-Gemisch, das oben beschrieben ist, zugegeben. Die Proben wurden wie oben beschrieben Zyklen unterworfen („cycled"). Auf die Amplifikation folgend wurden die Proben einer Elektrophorese durch ein 5% Acrylamid (19 Acrylamid:1 Bisacrylamid), 0,5X TBE-Gel bei 150 V unterzogen. Markiertes PCR-Produkt wurde mittels Autoradiographie detektiert. Ein Gel-Stückchen, enthaltend die markierte DNA, wurde herausgeschnitten, zerkleinert und über Nacht bei 37°C in TE resuspendiert, um die DNA zu eluieren. Markierte DNA im Überstand wurde entfernt und ein Aliquot wurde ausgezählt, bevor die Bindungsreaktionen vorbereitet wurden. Markierte Sonde wurde mit Wasser auf 20.000 cpm/μl verdünnt.
Bindungsreaktionen beinhalteten 4–8 μg (Gesamtproten) Kernextrakt, 3 μg Poly(dI-dC) (Pharmacia Biotech), 20.000 cpm Sonde, 3 μl unmarkiertes PCR-Produkt als ein Kompetitor und Bindungspuffer auf 20 μl. Bindungsreaktionen wurden auf Eis 20 Minuten lang inkubiert und einer Elektrophorese durch 4% Acrylamid (19 Acrylamid: 1 Bisacrylamid), 0,25X TBE-Gele bei 150 V für 3,5–4,0 Stunden bei 4°C unterzogen. Die Gele wurden getrocknet und gegenüber Hyperfilm ECL (Amersham) bei –80°C 15–96 Stunden lang auf einer „Molecular imaging screen" (Bio-Rad) ausgesetzt.
DNA-Protein-Komplexe auf dem hKLK2-Enhancer
Nach Identifizieren und Charakterisieren des hKLK2-Enhancers wurde ein Segment der Core-Region (von –3899 bis –3699), das/die das AREII enthält, auf seine Fähigkeit hin bewertet, DNA-Protein-Komplexe auszubilden. Eine stromabwärts gelegene Region (von –2358 bis –2555), von der herausgefunden wurde, dass sie bei der Aktivierung dieses Enhancers nicht notwendig ist, wurde auch auf ihr Vermögen hin bewertet, DNA-Protein-Komplexe auszubilden. Diese Regionen wurden mittels PCR durch End-markierte Primer amplifiziert, um Kernextrakte von LNCaP- und HeLa-Zellen in EMSA-Tests zu sondieren bzw. zu prüfen. Beide Regionen wurden außerdem mittels PCR amplifiziert, um spezifische und nicht-spezifische Kompetitoren herzustellen.
Das Enhancer-Core-Segment band Proteine, die nur in den LNCaP-Kernextrakten gefunden werden, während das stromabwärts gelegene Segment keine Proteine band, die in LNCaP-Exrakten gefunden werden (25A). Die radiomarkierte Enhancer-Core-Region verlor gegenüber der Konkurrenz („was outcompeted") durch die Zugabe eines 100-fachen molaren Überschusses der identischen nicht-radiomarkierten Sequenz. Das stromabwärts gelegene Segment wurde auch als eine Negativkontrolle und ein negativer Kompetitor verwendet, um zu bestimmen, ob die Proteine, die an die Enhancer-Region banden, dies auf eine Sequenzspezifische Art und Weise taten. Die Ergebnisse sind in 25A gezeigt und legen nahe, dass die Enhancer-Core-Region in der Tat Proteine in LNCaPs auf eine Sequenz-spezifische Art und Weise bindet und dass dieses Binden durch die Zugabe eines nicht-spezifische(n) DNA-Kompetitors nicht unterbrochen wird.
Um zu bestimmen, ob das Enhancer-Core an Proteine, spezifisch für LNCaPs, band, wurde die radiomarkierte Enhancer-Core-Region mit LNCaP-Kernproteinen und HeLa-Kernproteinen inkubiert. Das in 25B gezeigte Gel zeigt an, dass DNA-Protein-Komplexe nur bei der Reaktion mit LNCaP-Kernextrakten beobachtet wurden (25B, Spur 2). Dies legt nahe, dass die Enhancer-Core-Region, die untersucht wurde, Proteine auf eine zellspezifische Art und Weise bindet, und dieser Enhancer auch zelluläre spezifische Faktoren bindet, die in LNCaPs, nicht aber in HeLa-Zellen, gefunden werden.
BEISPIEL 17
In vivo-Charakterisierung von CN764
LNCaP-Heterotransplantate wurden durch subkutanes Injizieren von 1 × 10⁶ LNCaP-Zellen in Matrigel in 12–16 Wochen alte athymische Balb/c (nu/nu)-Mause initiiert. LNCaP-Nacktmaus-Heterotransplantate wurden bei Tag 1 und bei Tag 4 mit einer konstanten Anzahl von CN764-Viruspartikeln oder mit einem Vektor, dem das Gen fehlt, herausgefordert. Mäuse mit Tumoren wurden in 5 Gruppen eingeteilt und mit einer Gesamtdosis von CN764, wie in 26 angezeigt, behandelt. Mäuse in Gruppe 1 empfingen PBS, enthaltend 10% Glycerin (Placebo). Tumoren wurden an Tag 0 und wöchentlich danach gemessen. Die Tumoren wurden wöchentlich sechs Wochen lang überwacht und ihr Volumen wurde graphisch gegenüber der Zeit aufgetragen („plotted"). Die Ergebnisse sind in 26 gezeigt. Fehlerbalken stellen den Standardfehler für jede Probengruppe dar. An Tag 24 hatte sich das durchschnittliche Tumorvolumen in Gruppe 1 auf 1496% des anfänglichen Volumens erhöht, während das Durchschnitts-Tumorvolumen in Behandlungsgruppe 2 (1 × 10¹¹ Partikel pro Tier) und Gruppe 3 (1 × 10⁸ Partikel pro Tier) auf 179% bzw. 438% des anfänglichen Durchschnittsvolumens erhöht war. Beginnend an Tag 21 bestand ein statistisch signifikanter Unterschied an durchschnittlichem Tumorvolumen zwischen Gruppe 1 und Gruppe 2. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynucleotid, umfassend: (i) Nucleotide 8021 bis 8371, 7200 bis 8371, 6859 bis 8627, 5976 bis 9620 oder 1 bis 9765 von SEQ ID NO: 1 oder (ii) eine Sequenz mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu den Nucleotiden 8021 bis 8371, 7200 bis 8371, 6859 bis 8627, 5976 bis 9620 oder 1 bis 9765 von SEQ ID NO: 1; wobei das Polynucleotid Prostata-spezifische Enhancer-Aktivität hat.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid ein humaner glandulärer Kallikrein(hKLK2)-Enhancer ist.
Isoliertes Polynucleotid, das ein transkriptionales Regulationselement umfasst, wobei das transkriptionale Regulationselement einen humanen glandulären Kallikrein(hKLK2)-Enhancer nach Anspruch 2 und einen Promotor umfasst.
Polynucleotid nach Anspruch 3, wobei der Promotor ein hK1K2-Promotor ist.
Polynucleotidvektor, der einen humanen glandulären Kallikrein-Enhancer nach Anspruch 2 umfasst.
Vektor nach Anspruch 5, wobei der Vektor ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor ist.
Vektor nach Anspruch 5 oder 6, der das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
Vektor nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Vektor ein viraler Vektor ist.
Vektor nach Anspruch 8, wobei der Vektor ein Adenovirus-Vektor ist.
Vektor nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei der Vektor in der Form eines Liposoms, eines Mikropartikels, eines biokompatiblen Polymers, eines Bakteriums oder eines Virus ist.
Vektor nach Anspruch 9, der ein Adenovirus-Vektor ist, der ein erstes Adenovirus-Gen unter transkriptionaler Kontrolle eines humanen glandulären Kallikrein-Transkriptions-Regulationselements (hKLK2-TRE) umfasst, wobei das hKLK2-TRE einen hKLK2-Enhancer und einen Promotor umfasst.
Vektor nach Anspruch 11, wobei das Adenovirus-Gen ein Gen, das für eine adenovirale Replikation essentiell ist, vorzugsweise ein adenovirales frühes Gen, ist.
Vektor nach Anspruch 12, wobei das adenovirale frühe Gen E1A oder E1B ist.
Vektor nach einem der Ansprüche 11 bis 13, der außerdem wenigstens ein zweites Gen unter der transkriptionalen Kontrolle eines hKLK2-TRE oder eines Regulationselements für die Prostata-spezifische Antigen(PSA)-Transkription (PSA-TRE) umfasst, wobei das hKLK2-TRE einen hKLK2-Enhancer und einen Promotor umfasst und wobei das PSA-TRE einen Prostataspezifischen Enhancer (PSE) und einen Promotor umfasst.
Adenovirus-Vektor nach Anspruch 14, wobei: (i) das erste Gen für eine virale Replikation essentiell ist und das zweite Gen ein heterologes Polynucleotid ist; oder (ii) das erste und das zweite Gen für eine virale Replikation essentiell sind.
Zusammensetzung, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder den Vektor nach einem der Ansprüche 5 bis 15.
Wirtszelle, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder den Vektor nach einem der Ansprüche 5 bis 15.
Wirtszelle nach Anspruch 17, wobei die Wirtszelle eine Säugerzelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 18 wobei die Säugerzelle eine Prostatazelle ist.
Verfahren zur Erhöhung der Transkription einer Polynucleotidsequenz in einer Zelle, umfassend: Einführen eines Konstrukts, das ein transkriptionales Regulationselement, wie es in Anspruch 3 oder 4 definiert ist, funktionell mit dem Polynucleotid verknüpft, umfasst, in eine Zelle, die den hKLK2-Enhancer wirken lässt.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die funktionell verknüpfte Polynucleotidsequenz eine heterologe codierende Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die heterologe codierende Sequenz für ein Reportergen, ein Toxin oder ein Lymphokin codiert.
Verfahren zur Verwendung des Vektors nach einem der Ansprüche 5 bis 15, das Einführen des Vektors in eine Zelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Vektor zur Modifizierung des Genotyps einer Targetzelle verwendet wird, wobei das Verfahren In-Kontakt-Bringen der Targetzelle mit dem Vektor umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Vektor zur Vermehrung eines Adenovirus verwendet wird, das für Zellen spezifisch ist, die ein hKLK2-TRE wirken lassen, wobei das Verfahren umfasst: Kombinieren des Vektors mit Zellen, die die Funktion eines hKLK2-TRE zulassen, wodurch das Adenovirus vermehrt wird, und wobei das hKLK2-TRE einen hKLK2-Enhancer und einen Promotor umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Vektor zur Verleihung selektiver Cytotoxizität an eine Zelle verwendet wird, welche einen hKLK2-Enhancer wirken lässt, das ein In-Kontakt-Bringen der Zelle mit dem Vektor umfasst.
Verfahren zum Screening von Verbindungen für die Behandlung von Prostatakrebs, das Zellen verwendet, die ein Expressionskonstrukt umfassen, wobei das Expressionskonstrukt ein hKLK2-transkriptionales Regulationselement (hKLK2-TRE) und ein Reportergen umfasst, dessen Expressionsprodukt ein detektierbares Signal bereitstellt, wobei das hKLK2-TRE einen hKLK2-Enhancer nach Anspruch 2 und einen Promotor umfasst, und wobei das Reportergen unter der transkriptionalen Kontrolle des hKLK2-TRE ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Kombinieren der Zellen mit einer Kandidatenverbindung in Gegenwart eines geeigneten induzierenden Mittels für eine ausreichende Zeit zur detektierbaren Expression des Reportergens und b) Detektieren des Expressionslevels des Reportergens im Vergleich zum Expressionslevel in Abwesenheit der Kandidatenverbindung.
Verfahren nach Anspruch 27 oder ein Vektor nach Anspruch 11, wobei das hKLK2-TRE ein transkriptionales Regulationselement, wie es in Anspruch 3 oder 4 definiert ist, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 27, wobei das Reportergen für ein Enzym, vorzugsweise Luciferase, codiert.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Enzym Luciferase ist und das Detektieren umfasst: Lysieren der Zellen unter Erhalt eines Lysats und Analysieren des Lysats auf Lumineszenz.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 27, wobei die Zelle (die Zellen) Säugerzellen ist (sind).
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Säugerzellen Prostatazellen sind.