DE10057014B4

DE10057014B4 - Verfahren zur Herstellung von zielzellspezifischen Arzneimitteln

Info

Publication number: DE10057014B4
Application number: DE2000157014
Authority: DE
Inventors: Steven Dooley
Original assignee: Steven Dooley
Current assignee: DOOLEY, STEVEN, 66424 HOMBURG, DE
Priority date: 2000-11-17
Filing date: 2000-11-17
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2020-11-18
Also published as: DE10057014B8; DE10057014A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines zielzellspezifischen Arzneimittels, umfassend die Schritte:
(a) Identifizierung von mindestens zwei Genen, deren Expression in einer Zielzelle im Vergleich zur Expression in einer Kontrollzelle erhöht ist;
(b) Identifizierung und Isolierung der Expressionskontrollsequenzen der mindestens zwei in Schritt (a) identifizierten Gene;
(c) Klonierung der in Schritt (b) isolierten mindestens zwei Expressionskontrollsequenzen oder funktionell äquivalenter Derivate davon in mindestens einen Gentransfervektor, so dass die mindestens zwei Expressionskontrollsequenzen oder Derivate in dem mindestens einen Gentransfervektor jeweils die Regulation der Expression einer Sequenz erlauben, wobei die Sequenzen in Ribonukleinsäuren transkribierbar sind, die funktionell interagieren; und
(d) Formulierung des mindestens einen in Schritt (c) erzeugten Gentransfervektors in einem Arzneimittel,
wobei der Gentransfervektor ein Adenovirus-assoziiertes (AAV) Konstrukt ist, und
wobei die mindestens zwei Ribonukleinsäuren Sequenzen umfassen, die ein Trans-Splicing der mindestens zwei Ribonukleinsäuren erlauben, wobei mindestens eine der daraus resultierenden Ribonukleinsäuren ein funktionell aktives (Poly)peptid kodiert, und...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines zielzellspezifischen Arzneimittels, umfassend die Schritte: (a) Identifizierung von mindestens zwei Genen, deren Expression in einer Zielzelle im Vergleich zur Expression in einer Kontrollzelle erhöht ist; (b) Identifizierung und Isolierung der Expressionskontrollsequenzen der mindestens zwei in Schritt (a) identifizierten Gene; (c) Klonierung der in Schritt (b) isolierten mindestens zwei Expressionskontrollsequenzen oder funktionell äquivalenter Derivate davon in mindestens einen Gentransfervektor, so daß die mindestens zwei Expressionskontrollsequenzen oder Derivate in dem mindestens einen Gentransfervektor jeweils die Regulation der Expression einer Sequenz erlauben, wobei die Sequenzen in Ribonukleinsäuren transkribierbar sind, die funktionell interagieren, oder (Poly)peptide kodieren, die funktionell interagieren; und (d) Formulierung des mindestens einen in Schritt (c) erzeugten Gentransfervektors in einem Arzneimittel. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Arzneimittel, das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des mindestens einen Gentransfervektors, wie vorstehend definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Krebs, Atherosklerose, einer Fibrose, einer Autoimmunerkrankung, virusinfizierten Zellen oder Psoriasis. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung eine Bank von Gentransfervektoren wie vorstehend definiert. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit, umfassend mindestens einen Gentransfervektor wie vorstehend definiert und gegebenenfalls ein Mittel zur Therapieverlaufskontrolle.

Das Hauptproblem aller zur Zeit bekannten Therapieformen maligner Erkrankungen einschließlich gentherapeutischer Verfahren besteht in einer nicht ausreichenden Spezifität der eingesetzten Therapeutika für die jeweiligen Zielzellen. Aufgrund dessen werden gesunde Zellen des Organismus betroffen und geschädigt, möglicherweise sogar maligne verändert, was im Patientenbild unerwünschten Nebenwirkungen entspricht (A.E. Kulozik et al. Molekulare Medizin, de Gruyter Verlag Berlin, New York, 2000), und die meisten metastatischen und lokal fortgeschrittenen malignen Erkrankungen sind nicht gezielt heilbar. Durch klassische Chemotherapie, welche immer noch das am häufigsten eingesetzte Verfahren zur Behandlung von beispielsweise Tumoren darstellt, werden nicht nur Ziellzellen erfasst sondern auch grossflächig gesunde Zellen angegriffen. In letzter Zeit sind Anstrengungen unternommen worden auf der Basis des Gentransfers neue Therapieformen zu entwickeln. Auch bei diesen Strategien tritt die Problematik der Spezifität für den jeweiligen Wirkort auf.

Sowohl Leukämien und solide Tumoren als auch deren Metastasen bieten prinzipiell an mehreren Stellen Angriffspunkte für eine Gentherapie. Es gibt eine Reihe von Strategien, die für die Gentherapie maligner Tumoren klinisch getestet werden (Tabelle I). Drei dieser Ansätze sind in diesem Feld am weitesten entwickelt: (1) die Aktivierung des körpereigenen Immunsystems zur Eliminierung der Tumor- oder Leukämiezellen, (2) die Tumorspezifische Aktivierung einer sonst inaktiven Substanz (suicide-Strategie) und (3) der Ersatz ausgefallener Tumorsuppressorgene. Beim Ersatz defekter Tumorsuppressoren oder der Suicide-Strategie ist es erforderlich, daß möglichst viele, wenn nicht alle Zielzellen getroffen werden.

Tabelle I: Gentherapiestudien maligner Tumoren (aus A.E. Kulozik et al. Molekulare Medizin, de Gruyter Verlag Berlin New York, 2000)

Maligne Zellen unterscheiden sich in vielen Fällen von normalen Zellen durch die Expression charakteristischer Proteine, die grundsätzlich durch das Immunsystem erkannt werden können. Möglicherweise führt die immunologische Kontrolle auch zur Elimination vieler Tumore im status nascendi oder einer minimalen Restkrankheit nach erfolgreicher konventioneller Therapie. Bei klinisch manifesten Tumoren hat dieser natürliche Mechanismus aber offensichtlich nicht ausreichend funktioniert. Eine effiziente Immunantwort erfordert zum einen die Präsentation des fremden Antigens gegenüber den T- und B-Lymphozyten durch eine Antigenpräsentierende Zelle (APC). Zum anderen müssen die an der Immunantwort beteiligten Zellen miteinander kommunizieren. Dies wird durch die Synthese von Zytokinen erreicht. Bei einer häufig verfolgten Strategie werden Tumorzellen des Patienten entfernt und ex vivo mit einem Zytokin, etwa Interleukin, Interferon oder GM-CSF, transduziert. Nach Bestrahlung werden die so veränderten Tumorzellen dem Patienten subkutan oder intramuskulär injiziert. Die Zytokinexpression soll beim Patienten dann eine spezifische Immunantwort anregen, die sich auch gegen die nicht transduzierten Tumorzellen richten soll. Es gibt eine Reihe von bemerkenswerten Erfolgsberichten dieser Strategie, vor allem bei der Behandlung von Patienten mit kleinen Tumoren und einem intakten Immunsystem. Kontrollierte Vergleiche mit konventionellen Therapieansätzen fehlen jedoch meist noch. Ein verwandter Therapieansatz nutzt Gene tumorspezifischer Antigene, mit denen APCs des Patienten ex vivo transduziert werden. Diese modifizierten Zellen können dann eine T-Zell vermittelte, gegen den Tumor gerichtete Immunantwort stimulieren. Erfolgversprechende klinische Erfahrungen mit diesem System gibt es bei der Behandlung des malignen Melanoms, bei dem eine Reihe von tumorspezifischen Antigenen bekannt sind.

Bei der Suicide-Strategie metabolisiert das Transgen die unwirksame Vorstufe einer Substanz (prodrug) zum aktiven Wirkstoff. Weder die inaktive Substanz selbst noch das Produkt des Transgens sind allein therapeutisch wirksam. Der Prototyp dieser Strategie wird durch die Aktivierung von Ganciclovir (GCV) durch die Thymidin-kinase (Tk) des Herpes Simplex Virus (HSV) repräsentiert. Durch Phosphorylierung wird GCV zu einem Nukleosidanalogon metabolisiert und hemmt die DNA-Synthese. Im Kontext der Gentherapie beispielsweise eines Hirntumors wird das HSV-Tk Gen in einem retroviralen Vektor in den Tumor injiziert und der Patient dann mit GCV behandelt. Aufgrund der Unfähigkeit eines retroviralen Vektors mitotisch ruhende Zellen zu tranduzieren, wird das normale Gewebe geschont, die sich teilenden Tumorzellen jedoch GCV-vermittelt getötet. Tatsächlich führte dieses Verfahren in einer Reihe von präklinischen und klinischen Studien zu einer Grössenreduktion von Tumoren. Interessant war dabei, daß nicht nur die transduzierten Zellen sondern auch umliegende maligne Zellen durch den sogenannten bystander-Effekt getroffen wurden. Dieser Effekt kommt wahrscheinlich dadurch zustande, daß die aktivierte toxische Substanz via gap-junctions in die Nachbarzellen transportiert wird. Ähnlich wie bei der Tumorsupressor-Therapie wurden anhaltende, vollständige Regressionen allerdings auch bei diesem Verfahren nicht beobachtet. Besorgnis erregte ein Bericht über die Induktion einer chronischen aktiven Entzündung des Gehirns mit Demyelinisierungserscheinungen in einem Glioblastom Tiermodell.

Der Tumorsuppressor-Ersatz-Strategie liegt die Erkenntnis zugrunde, daß der maligne Phänotyp vieler Tumoren durch den Ausfall von Tumorsuppressorgenen bedingt ist. Besonders häufig finden sich Mutationen des p53-Gens, dessen Produkt ein wichtiges Regulatorprotein des Zellzyklus und der Apoptose darstellt. In Modellsystemen für Lungen- und Brustkrebs konnte durch die Transduktion von p53-negativen Tumoren klinisch eine Verlangsamung des Wachstums und Sensibilisierung der Tumoren gegenüber einer Strahlen- oder Chemotherapie erreicht werden. Vollständige Regression von Tumoren konnte jedoch weder in klinischen noch in präklinischen Studien erreicht werden.

Ein entscheidendes Kriterium für die Zielzellspezifität bei der Gentherapie ist die Auswahl der Steuerelemente (Promotoren), welche die Expression des Transgens veranlassen. Promotoren, die beispielsweise in einer grossen Anzahl verschiedener Zelltypen aktiv sind, finden aufgrunddessen nur sehr eingeschränkt Verwendung. Darum ist die Bereitstellung einer hohen Expressionsrate eines gewünschten Produkts in definierten Zielzellen durch spezifische zelluläre Promotoren oder regulatorische Elemente von grossem Interesse. Verschiedene Ansätze in diese Richtung sind bereits beschrieben. So sind zahlreiche gewebsspezifische Promotoren isoliert und charakterisiert worden und einige davon sind auch in experimentellen Modellen zur Gentherapie von Krebs eingesetzt worden. Ein Nachteil der bisher angewandten Strategien ist, daß diese sogenannten gewebsspezifischen Promotoren auch im normalen Gewebe aktiv sind, von welchem die Tumorzellen abstammen. Weitere Mechanismen zur Erhöhung der Spezifität sind auch hier erforderlich, um einen entsprechenden resultierenden Vektor für eine systemische Verabreichung zweckmässig zu machen.

Weiterhin sind eine ganze Reihe von Genen identifiziert worden (z.B. Onkogene), deren Expression in einem mehr oder weniger grossen Anteil untersuchter Proben aus verschiedenen Patienten, die histologisch als gleicher Typ eingeordnet sind, unter pathologischen Bedingungen hochreguliert wird. Es wird versucht, unter Verwendung von derart definierten spezifischen Promotoren eine tumorzellspezifische Gentherapie zu konzipieren. Häufig tritt jedoch die Überexpression nur in 10-30% und sehr selten in mehr als 50% der Fälle auf. Aufgrund dessen ist eine allgemeingültige Verwendung einer derartigen Therapie nicht sinnvoll. Desweiteren ist bekannt, daß ein Grossteil dieser Gene in anderen Organen bzw. in bestimmten physiologisch wichtigen Stadien ebenfalls verstärkt exprimiert sind. Dies bedeutet, daß auch in diesem Falle eine ausreichende Spezifität für die Zielzelle nicht gewährleistet ist.

Zudem werden bei der im Stand der Technik am weitesten entwickelten Methodik, wie vorstehend beschrieben, die Zielzellen dem Körper zunächst entnommen, dann ex vivo in einer Zellkultur genetisch modifiziert und erst in einem dritten Schritt dem Patienten zurückgegeben. Diese Strategie wurde für die Modifikation von hämatopoietischen Stammzellen (schwerer kombinierter Immundefekt durch Adenosin-Deaminase Mangel), Hepatozyten (Familiäre Hypercholesterinämie durch LDL-Rezeptordefekt), Myoblasten (Muskeldystrophie vom Typ Duchenne) und Fibroblasten (Hämophilie B) eingesetzt. Bei schwerer zugänglichen oder nicht kultivierbaren Zellen kann dieses Verfahren nicht angewandt werden. In diesen Fällen muß das therapeutische Gen dem Patienten, in vivo, appliziert werden. Durch Verwendung passender Tropismen bzw. Rezeptor-vermittelter Aufnahme des Vektors wird auf anderer Ebene versucht, eine höhere Spezifität zu erreichen. Beispiele dafür sind der Einsatz adenoviraler Vektoren für die Mukoviszidose oder herpesvirale Vektoren für Erkrankungen des ZNS.

Sehr viele Tumoren weisen eine hohe Proliferationsrate auf. Darauf beruht eine Strategie, welche zellzyklusregulierte Promotoren verwendet, um auf diese Art und Weise eine gewisse Spezifität für die Zielzelle zu erhalten. So ist zum Beispiel der E2F regulierte Promotor des E2F-1-Gens in einem adenoviralen Vektor verwendet worden, um Gliome zu therapieren (Parr et al., 1997). Man geht davon aus, daß die Promotoren weiterer Zellzyklusgene, wie Cyclin A oder cdc25C, ebenfalls interessante Werkzeuge für Gentherapie zur Behandlung von Krebserkrankungen darstellen (Parr et al., 1997; Zwicker et al., 1995). Dem kann entgegen gehalten werden, daß nicht alle Tumoren kontinuierlich ausreichend proliferieren, nicht gesichert ist, daß das Gen, welches dem jeweils verwendeten Promotor entspricht im jeweils untersuchten Fall an der Proliferation beteiligt ist, und es andererseits verschiedene gesunde Gewebe mit Proliferationsaktivität gibt. Daraus folgt, daß auch hier eine Verbesserung der Spezifität möglich und wünschenswert ist.

Die vorstehend dargestellten Anstrengungen aus der jüngeren Vergangenheit haben zwar bemerkenswerte Fortschritte bezüglich einer zukünftigen Anwendung der Gentherapie zur Behandlung maligner Erkrankungen erbracht, es ist jedoch offensichtlich, daß zusätzliche Grade an Erhöhung der Spezifität erforderlich sind, um Therapien von hoher Spezifität und damit Effizienz zu erreichen.

Derzeit werden weltweit mehr als 200 Phase I/II Studien durchgeführt, um die Verträglichkeit und die Effektivität der Gentherapie beim Menschen zu erproben. Die Verträglichkeit ist in den meisten Fällen gut. Ein klarer, reproduzierbarer klinischer Nutzen konnte mit den bisher verwendeten Methoden jedoch noch nicht belegt werden (A. E. Kulozik et al. Molekulare Medizin, de Gruyter Verlag Berlin, New York, 2000).

Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem war somit, Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln bereitzustellen, die eine zielzellspezifische Therapie unter Berücksichtigung individual-spezifischer pathologischer Veränderungen ermöglichen.

Dieses technische Problem wird von den in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines zielzellspezifischen Arzneimittels, umfassend die Schritte: (a) Identifizierung von mindestens zwei Genen, deren Expression in einer Zielzelle im Vergleich zur Expression in einer Kontrollzelle erhöht ist; (b) Identifizierung und Isolierung der Expressionskontrollsequenzen der mindestens zwei in Schritt (a) identifizierten Gene; (c) Klonierung der in Schritt (b) isolierten mindestens zwei Expressionskontrollsequenzen oder funktionell äquivalenter Derivate davon in mindestens einen Gentransfervektor, so daß die mindestens zwei Expressionskontrollsequenzen oder Derivate in dem mindestens einen Gentransfervektor jeweils die Regulation der Expression einer Sequenz erlauben, wobei die Sequenzen in Ribonukleinsäuren transkribierbar sind, die funktionell interagieren, oder (Poly)peptide kodieren, die funktionell interagieren; und (d) Formulierung des mindestens einen in Schritt (c) erzeugten Gentransfervektors in einem Arzneimittel.

Der Begriff "zielzellspezifisch" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, daß das mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte Arzneimittel im wesentlichen nur bei einer bestimmten Art von Zelle(n) (Zielzelle) wirksam ist und einen vernachlässigbaren Einfluß auf andere Zellen (Kontrollzelle) besitzt. Vorzugsweise ist das Arzneimittel bei mindestens 70% der Zielzellen wirksam, stärker bevorzugt bei mindestens 80% und am meisten bevorzugt bei 100% der Zielzellen. Es ist außerdem bevorzugt, daß das Arzneimittel bei höchstens 20% der Kontrollzellen wirksam ist, stärker bevorzugt bei höchstens 10% und am meisten bevorzugt bei 0% der Kontrollzellen.

Der Begriff "Expressionskontrollsequenz" umfaßt im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl Elemente, die die Expression auf Transkriptionsebene regulieren wie beispielsweise Enhancer oder Silencer, als auch Elemente, die die Expression auf post-transkriptioneller Ebene regulieren (z.B. splicing, nuclear export oder mRNA-Stabilität). Der Begriff umfaßt auch mehrere Elemente, die die Expression auf transkriptioneller bzw. post-transkriptioneller Ebene regulieren, bzw. Kombinationen von transkriptionellen und post-transkriptionellen Regulationselementen. Ebenso ist es vorstellbar, unterschiedliche Elemente für die mindestens zwei Gene zu verwenden. Techniken und Hilfsmittel zur Identifizierung von Expressionskontrollsequenzen, die zu einer erhöhten Expression führen, und zur Isolierung derselben sind dem Fachmann wohlbekannte Routinetechniken. Zu diesen zählen z.B. Genomdatenbank-Suchmachinen wie GenBank, National Center for Biotechnology Information (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PCR, Genklonierungstechniken und DNA-Sequenzierung, welche z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Sping Harbor Laboratory (1989), New York, und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience (1989), New York beschrieben sind.

Der Begriff "Identifizierung und Isolierung der Expressionskontrollsequenzen" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, daß vor und/oder nach der Isolierung der Expressionskontrollsequenzen mittels herkömmlicher, bekannter molekularbiologischer Verfahren (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Sping Harbor Laboratory (1989), New York, und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience (1989), New York) diese dahingehend überprüft werden, ob sie für die erhöhte Expression in der Zielzelle tatsächlich verantwortlich sind. Entsprechende Verfahren sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise die transiente Transfektion von Reporterkonstrukten unter der Kontrolle der isolierten Expressionskontrollsequenzen in die Zielzellen und die Bestimmung, ob das Reportergenprodukt in den Zielzellen verstärkt exprimiert wird.

Der Begriff "funktionell äquivalente Derivate" umfaßt im Sinne der vorliegenden Erfindung Expressionskontrollsequenzen, deren Sequenz an einer oder mehreren Positionen) von der Sequenz der isolierten Expressionskontrollsequenz abweicht, ohne jedoch einen Einfluß auf die Qualität der Funktion zu haben. Besonders geeignet sind Derivate mit einer verbesserten Funktion. Eine verbesserte Funktion beispielsweise eines Enhancers kann sich z.B. durch eine Steigerung der Transkriptionsrate auszeichnen, die größer ist als die Steigerung, die von dem isolierten nativen Enhancer bewirkt wird, wobei die Zielzellspezifität des isolierten nativen Enhancers (im wesentlichen) erhalten bleibt. Eine verbesserte Funktion kann auch bzw. zusätzlich in einer Erhöhung der Zielzellspezifität bestehen. Derivate, die im Vergleich zu z.B. einem isolierten nativen Enhancer eine erhöhte Zielzellspezifität aufweisen, jedoch zu einer geringeren Steigerung der Transkriptionsrate führen, sind auch erfindungsgemäß verwendbar. Handelt es sich bei der Expressionskontrollsequenz z.B. um eine Promotorsequenz, so umfassen Derivate z.B. auch Promotorsequenzen, in die ein oder mehrere z.B. Enhancer zur Steigerung der Transkriptionsrate eingefügt wurden. Solche Derivate sind vor allem bei Promotoren geeignet, die aufgrund ihrer hohen Zielzellspezifität isoliert wurden, jedoch nur eine geringe transkriptionelle Aktivität aufweisen. Verfahren zur Veränderung einer Nucleotidsequenz bzw. zur Bestimmung, ob ein Derivat von dieser Ausführungsform umfaßt ist, sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise ortsspezifische Mutagenese, Oligonukleotid-Synthese, Insertion bzw. Deletion bestimmter Bereiche durch Verwendung von Restriktionsendonukleasen, DNA-modifizierenden Enzymen oder PCR, Klonierung homologer Sequenzen von anderen Organismen und Reportergentests (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Sping Harbor Laboratory (1989), New York, und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience (1989), New York).

Die in Ribonukleinsäuren transkribierbaren bzw. (Poly)peptid-kodierenden Sequenzen, können sich auf einem oder mehreren Gentransfervektor(en) befinden, so daß die isolierten Expressionskontrollsequenzen der identifizierten Gene in einen oder mehrere Gentransfervektor(en) kloniert werden können.

Der Begriff "(Poly)peptid" umfaßt erfindungsgemäß sowohl Proteine einer Länge von ungefähr 40 bis mehreren hundert Aminosäuren als auch Peptide einer Länge von zwei bis 40 Aminosäuren.

Die mindestens zwei Sequenzen können in den Zielzellen vorübergehend exprimiert werden. Die Expression kann jedoch auch stabil und reguliert erfolgen. Im Falle einer transienten Expression muß gewährleistet sein, daß ausreichend Produkt entsteht, um den gewünschten Effekt, z.B. Zelltod, in der exprimierenden Zelle zu erzielen. Es ist weiterhin denkbar, die zielzellspezifische Kontrollsequenz zusätzlich regulierbar zu machen, z.B. durch die Verwendung eines heterologen Promotorelements, welches durch exogene Zugabe eines Wirkstoffs die zielzellspezifische Kontrollsequenz zusätzlich aktiviert und die daran gekoppelte in Ribonukleinsäure transkribierbare Sequenz exprimiert. Heterolog bedeutet dabei, nicht zu der Wildtyp-Promotorsequenz der jeweiligen zielzellspezifischen Promotorsequenz gehörend. Ein denkbares Verfahren wäre hier z.B. die Verwendung des Tet-On^TM/Tet-Off^TM-Expressionssystems wie beschrieben in z.B. CLONTECH-Katalog 2000, Seiten 110 folgende. Natürlich ist dem Fachmann bekannt, daß die gewählte Art der Expression unter anderem die Wahl des Gentransfervektors beeinflußt.

Geeignete Gentransfervektoren umfassen beispielsweise Vektoren, die unverpackt als sogenannte „nackte DNA" in die Zelle aufgenommen und exprimiert werden können.

Als Vektoren bevorzugt sind Viren, die über Mechanismen verfügen, ihr Genom in die Wirtszelle einzubringen und dort zu exprimieren. In den letzten Jahren wurden auch für die vorliegende Erfindung geeignete nicht-virale Vektorsysteme entwickelt.

Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Vektoren können beispielsweise retrovirale Vektoren sein. Bei einer Infektion mit einem natürlicherweise vorkommenden Retrovirus wird das virale RNA-Genom reverse in DNA transkribiert und als Provirus permanent in das Genom der Wirtszelle integriert. Bei jeder Zellteilung wird das retrovirale Provirus zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert und an die Tochterzellen weitergegeben. Retrovirale Vektoren sind deshalb geeignet, weil sie diese Eigenschaften erhalten, während die pathogenen Eigenschaften, welche für den jeweiligen Patienten schädlich sein können, eliminiert werden. Der Begriff der Transduktion grenzt die Vektor-vermittelte Übertragung therapeutischer Transgene von der Infektion durch ein natürliches Virus ab.

Das Minimalgenom eines Retrovirus enthält die drei Gene gag (kodiert Verpackungsproteine des viralen Genoms), pol (kodiert die reverse Transkriptase) und env (kodiert virale Hüllproteine). Diese Gene werden von sogenannten long terminal repeats (LTR) flankiert, die zum einen als Enhancer/Promotor Element und zum anderen als Signal für die Verpackung des viralen Genoms in die Hüllproteine dienen. In einem für die vorliegende Erfindung geeigneten retroviralen Vektor sind die kodierenden viralen Gene entfernt und durch das vorstehend beschriebene therapeutische Konstrukt ersetzt. Damit verliert der Vektor seine unerwünschten, vorstehend beschriebenen pathogenen Eigenschaften und die Fähigkeit zur Replikation. Zur Produktion des therapeutisch einsetzbaren Partikels wird der virale Vektor in eine sogenannte Verpackungszelllinie eingebracht, die die retroviralen Gene ohne LTR enthält und exprimiert. Retrovirale Vektorpartikel können dann aus dem Überstand der mit dem Transgen transfizierten Verpackungszelllinie gewonnen und für die Transduktion der Zielzellen verwendet werden (1). Durch Modifikation des env-Gens können dem retroviralen Vektorpartikel falls gewünscht neue Eigenschaften gegeben werden, die zu einer weiteren Erhöhung der targeting-Spezifität durch z.B. eine gezielte zelltypspezifische, rezeptorvermittelte Aufnahme, beitragen. Retrovirale Vektoren eignen sich wegen ihrer annährend 100% Transduktionseffizienz und der Stabilität der Integration des Transgens sehr gut zur Durchführung der vorliegenden Erfindung.

Auch adenovirale Vektoren eignen sich sehr gut für das erfindungsgemäße Verfahren. Adenoviren haben ein 36 kb grosses DNA-Genom, welches eine Reihe von sogenannten „early" (E) Genen für regulatorische Proteine und „late" (L) Genen für strukturelle Proteine enthält. Diese Viren zeigen einen charakteristischen Tropismus für Epithelzellen der Atemwege, des Verdauungstraktes und der Leber. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung wird diesen Vektoren, ähnlich wie bei den retroviralen Vektoren, zumindest das für die Replikation nötige E1a-Gen durch ein therapeutisches Konstrukt, wie vorstehend beschrieben, ersetzt. Im Gegensatz zu den retroviralen Vektoren können adenovirale Vektoren sowohl mitotisch aktive als auch ruhende Zellen transduzieren. Ausserdem integriert sich die Vektor-DNA meist nicht in das Genom der Zielzelle, sondern wird als extrachromosomales Episom im Kern repliziert. Besonders bevorzugt sind adenovirale Vektoren, die keinerlei virusspezifische Proteine mehr kodieren.

Auch sogenannte AAV-Vektoren können für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden. Das Adeno-asoziierte-Virus (AAV) ist ein kleines, nicht-pathogenes, einzelsträngiges DNA-Virus, das ausser den Verpackungssignalen lediglich zwei Gene für das Kapsid und für die Replikation enthält. Darüberhinaus benötigt dieses Virus für die Replikation Genprodukte anderer Viren, die meist von Adenoviren oder von Herpesviren bereitgestellt werden. Das Virus kann eine Vielzahl von ruhenden oder sich teilenden Zellen infizieren und integriert sich präferenziell an einer spezifischen Stelle des Chromosoms 19 des Wirtsgenoms.

Grundsätzlich eignen sich auch liposomale Vektoren für das erfindungsgemäße Verfahren. Aufgrund ihrer negativen elektrischen Ladung wird die DNA prinzipiell von der ebenso geladenen Zellmembran abgestossen und daher schlecht aufgenommen. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Liposomen sind kleine, runde Partikel, die aus einer membranähnlichen Lipiddoppelschicht bestehen und sowohl nach innen als auch nach außen hydrophile Reste tragen. So sind sie selbst wasserlöslich und können wasserlösliche Bestandteile, wie z.B. Vektoren im Sinne der vorliegenden Erfindung, aufnehmen. Die Lipide der Liposomen können mit der Zellmembran fusionieren und so die Aufnahme der vorstehend beschriebenen therapeutischen Konstrukte in die Zelle vermitteln. Noch besser geeignet ist eine als „Lipoplexe" bezeichnete Weiterentwicklung dieser Liposomen, in der die natürlicherweise vorkommenden anionischen durch kationische Lipide ersetzt sind. Dadurch kann die Kapazität dieser Partikel für DNA und zum anderen auch die Effizienz der Fusion mit der negativ geladenen Zellmembran und damit die Transfektionseffizienz gesteigert werden.

Der Begriff "funktionell interagierend" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, daß die Interaktion der mindestens zwei Ribonukleinsäuremoleküle bzw. (Poly)peptide zu einem aktiven Produkt führt, dessen Aktivität in der Zielzelle einen gewünschten therapeutischen Effekt erzielt. Der gewünschte therapeutische Effekt kann beispielsweise die Beeinflussung der Proliferation oder Differenzierung der Zielzelle sein, eine Zelltodinduktion, die Sekretion von verschiedenen Substanzen wie z.B. Hormonen oder Zytokinen, oder die Beeinflussung der Immunerkennung.

Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht erstmals die Herstellung von zielzellspezifischen Arzneimitteln. Die hohe Zelltyp- wie auch fallbezogene Spezifität des Verfahrens ergibt sich zum einen daraus, daß ein Vergleich der differentiellen Genexpression zwischen Zielgewebe und Referenzgewebe als Grundlage für die Konstruktion der Gentransfervektoren verwendet wird. Verschiedene signifikant differentiell aktive Expressionskontrollsequenzen werden für die Expression der Sequenzen verwendet.

Ein zusätzlicher Grad an Spezifität wird dadurch erreicht, daß mindestens zwei Expressionskontrollsequenzen gleichzeitig verwendet werden, die jeweils alle aktiv werden müssen, um den jeweils gewünschten Effekt zu erzielen.

Vorzugsweise werden drei Expressionskontrollsequenzen, stärker bevorzugt vier Expressionskontrollsequenzen verwendet, die alle die Expression jeweils einer Sequenz bewirken. Die Expression aller jeweils verwendeten Sequenzen ist dabei notwendig, um den jeweils gewünschten Effekt zu erzielen.

Durch Anwendung der vorliegenden Erfindung ist es deshalb möglich, ein Verfahren zu konzipieren, welches erstmals die individuellen Gegebenheiten des jeweiligen zu therapierenden Patienten in besonderem Masse berücksichtigt. In einem ersten Schritt wird dazu ein Expressionsprofil des Zielgewebes erstellt. Mit der in naher Zukunft zu erwartenden Optimierung der Genchip-Analysen wird dies vollautomatisiert sehr schnell und präzise möglich sein. Als Referenzgewebe dienen jeweils gesunde Zellen des Zielgewebes. Mit zunehmender Probandenzahl kann das Verfahren immer weiter verfeinert und präzisiert werden. Mit jeder neuen Probe wird ein Expressionsprofil des entsprechenden gesunden Gewebes erstellt. Es wird erwartet, daß in naher Zukunft Datenbanken von Expressionsprofilen aller Organe und Zelltypen erstellt werden können und dann zur Verfügung stehen. Auf dieser Grundlage wird es möglich sein die Auswahl der pathologisch hochregulierten Expressionskontrollsequenzen zu verfeinern und damit den Grad an Spezifität immer weiter zu erhöhen. Ziel ist hier die Errichtung eines Gentherapiezentrums, in welchem alle Informationen gespeichert sind und abgerufen werden können. Mit jedem Probanden wird die Datenbank vergrössert und damit das erfindungsgemässe Verfahren verfeinert.

Die erfindungsgemäß hergestellten Vektoren können weiterhin in einer Bank angelegt werden. Die Vektoren enthalten die auf der Komplettierung der Genomkarte basierenden bekannten genregulatorischen Elemente, im Idealfall aller, einzelnen Gene. Gekoppelt an diese genregulatorischen Elemente liegen die zu exprimierenden DNA-Sequenzen vor, wobei jede der zu exprimierenden Sequenzen unter der Kontrolle aller vorstehend beschriebenen genregulatorischen vorliegt. Die Expression von mindestens zwei dieser zu exprimierenden Sequenzen ist für das Auftreten des jeweils gewünschten Effekts erforderlich. Liegt diese Genbank vor, wird es mit der Analyse der differentiellen Genexpression möglich sein, sehr schnell die Vektorkombination herauszufinden, die für die Zielzelltherapie geeignet ist. Es wird erwartet, daß derart erstmals dem Kliniker sehr schnell ein für den jeweiligen Patienten spezifisches Therapeutikum auf Genbasis zur Behandlung insbesondere komplexer Erkrankungen wie z.B. Krebs zur Verfügung gestellt werden kann. Eine Zentralisierung von Vektorbanken und Genchip-Analyseverfahren wird die Komplettierung des Verfahrens von der Zielzellanalyse anhand der Gewebsprobe bis hin zum Therapie-Kit und somit den Zugang für jeden Kliniker ermöglichen. Lediglich die Entnahme des Zielgewebes/der Zielzellen sowie der entsprechenden Kontrollen und dessen/deren Archivierung und die Injektion der vorstehend beschriebenen Konstrukte obliegen dem behandelnden Arzt. Somit wird erwartet, daß die hier vorgestellte Erfindung die Grundlage nahezu aller zukünftiger Gentherapie-Strategien sein wird.

Damit stellt das Zusammenführen von sich noch in Entwicklung befindlichen Technologien, wie die Genchipanalyse, die Entwicklung neuartiger Vektorsysteme mit höherer Penetranz, z.B. auf Ribozymtechnologien basierende Herstellung zusammengesetzter Effektormoleküle gemeinsam mit der jüngsten Komplettierung der Humangenomsequenz, mit Hilfe deren Information die jeweils benötigten Expressionskontrollsequenzen isoliert werden können, ein Höchstmass an Spezifität für einen bestimmten Zelltyp in einem bestimmten Individuum dar.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt Schritt (a) folgende Schritte: (i) Isolierung von mRNA oder Protein aus der Zielzelle und der Kontrollzelle; (ii) Identifizierung von mRNAs oder Proteinen, deren Häufigkeit in der Zielzelle größer ist als in der Kontrollzelle; und (iii) Bestimmung der Gene, deren mRNAs oder Proteine in Schritt (ii) identifiziert wurden.

Verfahren zur Isolierung von RNA und Proteinen, zur quantitativen Analyse von RNA und Proteinen, und zur Isolierung und Identifizierung der entsprechenden Gene sind z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Sping Harbor Laboratory (1989), New York und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience (1989), New York, beschrieben. Außerdem ist es möglich, kommerziell verfügbare Kits wie z.B. das RNeasy RNA System der Firma QIAGEN zur RNA Isolierung zu benutzen.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Expression in der Zielzelle im Vergleich zur Expression in einer Kontrollzelle um mindestens einen Faktor 1,5 erhöht.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Expression der Zielzelle im Vergleich zur Expression in einer Kontrollzelle um mindestens einen Faktor 5 erhöht, und in einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Expression nur in der Zielzelle, jedoch nicht in der Kontrollzelle nachweisbar.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird Schritt (ii) mittels Hybridisierung mit einem Genchip oder einem Microarray durchgeführt.

Es ist jedoch auch vorstellbar, Schritt (ii) mittels auf RT-PCR basierenden Subtraktionsverfahren, mittels Durchmusterungsverfahren wie z.B. Filter-Subtraktionshybridisierung, oder mittels Northern Blot oder Western Blot durchzuführen. Letztere Verfahren sind im Stand der Technik bekannt und von einem Fachmann ohne weiteres durchführbar (z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Sping Harbor Laboratory (1989), New York und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience (1989), New York).

Die Identifizierung von mRNAs, deren Häufigkeit in der Zielzelle gegenüber der Kontrollzelle erhöht ist, kann beispielsweise mit einem Genchip, z. B. mit einem kommerziellen GeneChip Set der Firma Affymetrix erfolgen. Ebenso können sogenannte Microarrays, z.B. in Form kommerziell verfügbarer Kits, wie die Atlas^TM Human Microarray Serie der Firma CLONTECH oder verschiedene Subtraktionsverfahren wie z.B. Filter-Subtraktionshybridisierungverfahren welche beschrieben sind z.B. in (Brown et al., 2000; Hampson et al., 1992; Konietzko & Kuhl, 1998) oder Subtraktionsverfahren auf RT-PCR Basis, wie z.B. beschrieben in (Fu et al., 2000; Grillari et al., 2000; Justen et al., 2000; Kirschmann et al., 1999; Luo et al., 1999; Rottiers et al., 1999; Xu et al., 2000; Zhang et al., 2000; Zhao et al., 1999; Zhu et al., 2000) erfolgen. Bei Verwendung eines Genchip der Firma Affymetrix kann die genaue Identifizierung der differentiell exprimierten Gene mit Hilfe eines Affymetrix Microarray Suite Software Programms erfolgen (siehe auch http://www.affymetrix.com/products/tech-probe.html). Im Fall von Microarrays kann die genaue Identifizierung mit Hilfe eines AtlasNavigator^TM 1.0 Programms erfolgen (siehe auch http://www.clontech.com/ atlas/atlasnavigator/index.html). Im Fall von Filter-Subtraktionshybridisierungverfahren kann nach der Isolierung und Charakterisierung der differentiell exprimierten Gene anhand herkömmlicher, dem Fachmann geläufiger Verfahren (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Sping Harbor Laboratory (1989), New York und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience (1989), New York), ein Sequenzabgleich in einer Datenbank wie z.B. GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) erfolgen.

Es ist auch möglich, Schritt (ii) auf Proteinexpressionsbasis durchzuführen. Ein dafür gut geeignetes Verfahren ist unter dem Begriff "Proteomics" bekannt und kann wie z.B. in (Anglade et al., 2000; Asher, 2000; Chevalier et al., 2000; Clewley, 2000; Conrads et al., 2000; Eng & Friedman, 2000; Fountoulakis et al., 2000; Kriegel et al., 2000; Locke & Figeys, 2000; McKerrow et al., 2000; Unlu, 1999; Vuong et al., 2000) beschrieben verwendet werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Expressionskontrollsequenz ein Promotor.

Die Identifizierung der Promotorsequenz des jeweiligen differentiell exprimierten Gens kann mittels einer Datenbanksuche von z.B. GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) erfolgen. Identifizierte Promotoren können mit Hilfe von verschiedenen, dem Fachmann bekannten Verfahren wie z.B. PCR oder Restriktionsanalyse und Subklonierung (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Sping Harbor Laboratory (1989), New York und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience (1989), New York) isoliert und kloniert werden.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Gentransfervektor ein adenovirales, retrovirales oder Adenovirus-asoziiertes (AAV) Konstrukt.

Diese sind wie vorstehend beschrieben und weiterhin z.B. in (He et al., 1998; Monahan & Samulski, 2000; O'Brien, 2000; Sandmair et al., 2000; Seth, 2000; Wang & Huang, 2000).

Andere Gentransfervektoren, beispielsweise auf Vaccinia-Virus, Herpes-Virus oder Papilloma-Virus basierend, können erfindungsgemäß auch verwendet und für die Einbringung der mindestens zwei in RNA trankribierbare bzw. (Poly)peptidkodierenden Sequenzen in Zielzellpopulationen eingesetzt werden. Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, können eingesetzt werden, um rekombinante virale Vektoren- herzustellen (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Sping Harbor Laboratory (1989), New York und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience (1989), New York). Alternativ ist es auch möglich, die Gentransfervektoren mittels Liposomen in die Zielzellen einzubringen. Die Gentransfervektoren können in eine Wirtszelle mittels bekannter Verfahren eingebracht werden. Zu diesen Verfahren zählen die Kalziumphosphat- oder DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion oder Elektroporation (siehe z.B. Sambrook et al., loc. cit.). Ebenso können auf Liposomenbasis aufgebaute Transfektionsmittel wie z.B. Fugene (Roche) oder Lipofectamine (GibcoBRL) verwendet werden.

Die Gentransfervektoren können auch weitere Gene umfassen wie z.B. Markergene, die z.B. eine Selektion auf die Vektoren in einer geeigneten Wirtszelle und unter geeigneten Bedingungen erlauben.

Die Sequenzen sind gegebenenfalls bereits unter der Kontrolle von Expressionskontrollsequenzen.

Geeignete Expressionsvektoren umfassen gewöhnlich (i) (eine) Klonierungskassette(n), die es erlaubt (erlauben), Expressionskontrollsequenzen in den Vektor einzubringen und derart mit den in RNA transkribierbaren oder (Poly)peptid-kodierenden Sequenzen zu verknüpfen, daß die Expression dieser Sequenzen durch die Expressionskontrollsequenzen reguliert wird; (ii) gegebenenfalls zusätzliche regulatorische Sequenzen, die die Initiation der Transkription sicherstellen; (iii) nach der zu exprimierenden Sequenz gegebenenfalls ein PolyA Signal, das die Termination der Transkription und eine Stabilisierung des Transkripts sicherstellt; und (iv) gegebenenfalls weitere Enhancer Sequenzen, sowohl in 5'- als auch 3'-Richtung davon liegend, welche die Aktivität der Expressionskontrollsequenzen verstärken (dabei kann es sich sowohl um eukaryontische, prokaryontische als auch virale Enhancer-Sequenzen handeln). Vorstufen der Konstrukte umfassen im allgemeinen auch Resistenzgene für Antibiotika wie z.B. Ampizillin oder Kanamyzin zur Selektion, und einen Replikationsursprung zur bakteriellen Amplifikation (ori). Die Vektoren können weiterhin auch (ein) Intron(s) umfassen, das/die die Expression der Sequenzen weiter verstärkt (verstärken). Solche expressionsverstärkenden Sequenzen sind z.B. beschrieben in (Atchison, 1988; Chambon et al., 1984; Das et al., 1985; Khoury & Gruss, 1983; Wasylyk, 1988; Wildeman, 1988). Abhängig von den kodierten (Poly)peptiden können die Vektoren auch Signalsequenzen enthalten, die in der Lage sind, mittels des kodierten Signalpeptids die (Poly)peptide aus der Zelle auszuschleusen. Geeignete Signalsequenzen, die entsprechende Signalpeptide kodieren, wie z.B die RGD Sequenz, sind dem Fachmann bekannt und z.B. in (Samuelsson & Zwieb, 1999; von Heijne, 1985; von Heijne & Abrahmsen, 1989; Zheng & Gierasch, 1996) beschrieben. Es ist dem Fachmann auch bekannt, daß Signalsequenzen im richtigen Leseraster mit Translations-Initiations- und -Terminationssequenzen kloniert sein müssen. Die Gentransfervektoren können weiterhin heterologe Sequenzen enthalten, so daß die Expression der (Poly)peptid-kodierenden Sequenzen zu einem Fusionsprotein führt, das z.B. C- oder N-terminal heterologe Aminosäuren enthält. Solche Sequenzen können zur Stabilisierung oder zur einfachen Identifizierung der synthetisierten (Poly)peptide dienen.

Gentherapie, die auf das Einbringen therapeutischer Gene in Zellen durch ex vivo- oder in vivo-Techniken beruht, ist eine der wichtigsten Gentransferanwendungen. Geeignete Vektoren und Verfahren zur in vitro- oder in vivo-Gentherapie sind vorstehend bereits diskutiert worden und im Stand der Technik beschrieben und dem Fachmann bekannt (siehe z.B. Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957 oder Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640 und darin zitierte Publikationen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält der Gentransfervektor adenovirale Gene, welche für die Generation von replikationsdefizienten Adenoviren sorgen, die schliesslich den effizienten Gentransfer und die Expression der erfindungsgemässen Sequenz in der Zielzelle ermöglichen. Die Herstellung und Benutzung solcher Vektoren ist z.B. in (He et al., 1998; O'Brien, 2000; Sandmair et al., 2000) ausführlich beschrieben.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die mindestens zwei Ribonukleinsäuren Sequenzen, sogenannte Ribozyme, die ein Trans-Splicing der mindestens zwei Ribonukleinsäuren erlauben, wobei mindestens eine der daraus resultierenden Ribonukleinsäuren ein funktionell aktives (Poly)peptid kodiert. Ribozyme zeichnen sich durch hohe Substrat- und Produktspezifität aus und stellen hinsichtlich dieser Kriterien echte Äquivalente zu Proteinen dar. Physiologisch vorkommende Ribozyme verwenden RNAs als Substrate für Spaltungsreaktionen von Phosphodiesterbindungen. Die Interaktion eines Ribozyms mit einem Substrat findet zuerst durch Basenpaarung statt, was seine Spezifität erklärt. Physiologisch vermitteln Ribozyme z.B. die Reifung von t-RNA-Vorstufen (durch sog. RNase P) oder können, ähnlich dem Spleissosom, auch das Ausschneiden von speziellen Introns katalysieren. Im Sinne der vorliegenden Erfindung therapeutisch relevant sind die in niedrigen Eukaryonten und in einigen Bakterien vorkommenden Gruppe I Introns und die in einigen Viren vorkommenden selbst-spaltenden RNAs mit hammerhead oder hairpin Struktur. Die natürlich vorkommenden Ribozyme wirken intramolekular, d.h. sie entfalten ihre katalytische Aktivität an sich selbst. Das therapeutische Potential ergibt sich aus der Möglichkeit, diese Ribozyme strukturell zu verändern, auf andere RNAs zu richten und so eine Rekombination oder die Destruktion des Zielmoleküls zu bewirken.

Gruppe I Intron-Ribozyme katalysieren einen Spleissvorgang ohne daß dafür ein Spleissosom erforderlich ist. Die katalytische Aktivität zur RNA-Spaltung und zur Religierung der beiden Exons erfordert (1) die Präsenz eines Uridins an der letzten Position des 5'-Exons, (2) ein Guanosin an der letzten Positon des Introns, (3) die Hybridisierung der 3'- und der 5'-Spleissstellen durch Vermittlung einer internen Führungssequenz und (4) die Interaktion des Uridins mit einem Guanosin. Solche modifizierte Gruppe I Introns können zum Transspleissen und damit zur Rekombination der Ziel-RNA eingesetzt werden. Erfindungsgemäss soll durch den Einsatz eines solchen Ribozyms die Struktur einer therapeutisch relevanten RNA repariert werden. Dafür sind folgende Strukturmerkmale erforderlich: (1) ein Guanosin am 5'-Ende des Ribozyms, (2) eine spezifische homologe Sequenz zur Ziel-RNA, (3) die katalytischen Nukleotide innerhalb des Introns und (4) das neue Exon am 3'-Ende des Moleküls (2). Die Reparatur der Ziel-RNA erfolgt dann in drei Schritten. Zunächst bindet sich die homologe Sequenz des Ribozyms an die Ziel-RNA und erlaubt dadurch die Interaktion des 5'-Guanosins mit dem Uridin der Ziel-RNA. Dann vermittelt die katalytische Aktivität des Ribozyms die Spaltung der Ziel-RNA direkt hinter dem Uridin. Letztlich bewirkt die katalytische Aktivität des Ribozyms die Ligierung des neuen 3'-Exons an das 5'-Exon der Ziel-RNA (2).

In einer Ausführungsform umfaßt die erste RNA ein trans-spleissendes Ribozym, eine 3'-Teilsequenz eines (Poly)peptids, z.B. eines zelltodverursachenden Proteins, und zusätzlich eine Erkennungssequenz für das zweite Ribonukleinsäuremolekül. Das zweite Ribonukleinsäuremolekül beinhaltet die zur Komplettierung des (Poly)peptids, z.B. des zelltodverursachenden Proteins, erforderliche 5'-Teilsequenz.

In dieser Ausführungsform kann das Ribozym-gespleisste Ribonukleinsäuremolekül beispielsweise auch für ein enzymatisch aktives (Poly)peptid kodieren, dessen Enzymaktivität zur Aktivierung einer weiteren z.B. zelltodverursachenden Substanz, die vorab, gleichzeitig mit dem mindestens einen Gentransfervektor oder im nachhinein verabreicht wurde, führt.

Die 3'-Teilsequenz eines z.B. zelltodverursachenden Proteins können z.B. die Basen 912-1714 des humanen herpesvirus 1 TK Gens (GenBank Registriernummer: J02224) oder die Basen 212-428 des Triticum aestivum β-Purothionin Gens (GenBank Registriernummer: AF004018) oder die Basen 602-874 des Zea mays ribosome-inactivating protein Gens (GenBank Registriernummer: AF233881) sein. Die 5'-Teilsequenz könnte dann entsprechend die Basen 407-911 des humanen Herpesvirus 1 TK Gens, die Basen 18-211 des Triticum aestivum β-Purothionin Gens bzw. die Basen 47-601 des Zea mays ribosome-inactivating protein Gens umfassen. Dabei bedeutet „jeweils gekoppelt an die mindestens zwei kodierenden Sequenzen", daß beide Sequenzen unter der Regulation verschiedener Expressionskontrollsequenzen auf einem oder mehreren erfindungsgemässen Konstrukten vorliegen können.

Es ist auch vorstellbar, daß sogenannte Hammerhead Ribozyme zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Dabei handelt es sich um eine Reihe meist viraler RNAs, die sich ohne die Beteiligung von Enzymen selbst spalten und spleissen können. Die kleinste RNA dieses Typs Ribozym besitzt wegen seiner Fähigkeit zur Spaltung anderer RNAs ebenfalls großes therapeutisches Potential und wird in Anlehnung an ihre Sekundärstruktur als hammerhead Ribozym bezeichnet. Dieses Ribozym kann erfindungsgemäß so modifiziert werden, daß die katalytische Aktivität sequenzspezifisch zur Spaltung der Ziel-RNA an einem Uridin mit einem 3'-benachbarten Cytosin, Uridin oder Adenosin führt. Dazu benötigt dieses nur 30 Nukleotide grosse Molekül sein katalytisches Zentrum und flankierende Sequenzen, die komplementär zur Ziel-RNA sind (3).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das zelltodverursachende Protein Ricin oder Exotonin A.

Ricin und Exotonin A sowie deren Verwendung als zelltodverursachende Proteine sind dem Fachman bekannt (Evans, 1989).

In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die mindestens zwei (Poly)peptide funktionell inaktive Untereinheiten, deren Interaktion zu einem funktionell aktiven (Poly)peptid führt Beispielsweise ist es vorstellbar, daß die mindestens zwei (Poly)peptide Untereinheiten eines Transkriptionskomplexes sind, deren Interaktion, gegebenenfalls mit weiteren endogenen Untereinheiten, zu einem aktiven Transkriptionskomplex führt, durch den die Transkription eines gewünschten endogenen Gens initiiert wird. Kodiert dieses Gen beispielsweise ein zelltodverursachendes (Poly)peptid wie vorstehend beschrieben, kann durch zielzellspezifische Expression der mindestens zwei (Poly)peptide zielzellspezifisch Zelltod induziert werden. Es ist auch vorstellbar, daß der aktive Transkriptionskomplex die Transkription eines co-transfizierten Gens, das sich auf dem mindestens einen Gentransfervektor oder einem anderen co-transfizierten Konstrukt befindet, induziert. Kodiert das co-transfizierte Gen beispielsweise ein zelltodverursachendes (Poly)peptid kann auf diese Art und Weise ebenfalls der gewünschte Effekt erzielt werden.

Diese Ausführungsform umfaßt auch die Möglichkeit, daß die Interaktion der mindestens zwei (Poly)peptide zu einem enzymatisch aktiven (Poly)peptid führt, dessen Enzymaktivität zur Aktivierung einer weiteren Substanz, die vorab, gleichzeitig mit dem mindestens einen Gentransfervektor oder im nachhinein verabreicht wurde, führt. Natürlich ist es auch vorstellbar, daß die Interaktion der mindestens zwei (Poly)peptide direkt beispielsweise zu einem zelltodverursachenden (Poly)peptid führt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die mindestens zwei (Poly)peptide Untereinheiten eines Transkirptionsfaktors.

Ein Transkriptionsfaktor kann beispielsweise ein zusammengesetzter Transkriptionskomplex sein wie in dem Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid System der Firma CLONTECH (siehe www.clontech.com). Im Sinne der vorliegenden Erfindung würde die Expression der beiden Two-Hybrid-Untereinheiten, DNA-Bindungsdomäne und Aktivierungsdomäne durch die erfindungsgemässen zielzellspezifischen Expressionskontrollsequenzen reguliert und z.B. ein zelltodverursachendes Protein würde unter der Kontrolle der Zielsequenz des zusammengesetzten Transkriptionskomplexes (Gal4 UAS) zielzellspezifisch exprimiert.

Wie unter www.clontech.com beschrieben, kann eine GAL4-Aktvierungsdomäne verwendet werden, die mit DNA Sequenzen gekoppelt (verknüpft) wird, die für p53 kodieren, und eine GAL4-DNA-Bindungsdomäne, die mit Sequenzen verknüpft ist, die für SV40-T-Antigen kodieren (Positivkontrolle im Kit). Alternativ kann auch das Two-Hybrid System der Firma Stratagene verwendet werden (siehe auch www.stratagene.com).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das eine der mindestens zwei (Poly)peptide eine funktionell inaktive Vorstufe eines (Poly)peptids und das zweite (Poly)peptid ein Aktivator, der die Aktivierung des ersten (Poly)peptids erlaubt. Ein Beispiel für ein solches Protein ist das pflanzliche Canatoxin (funktionell inaktive Vorstufe), welches nach proteolytischer Spaltung durch Cathepsin-ähnliche Enzyme aus Insekten (Aktivatorproteine) seine toxische Wirkung entfaltet (siehe Ferreira-DaSilva et al., 2000). Somit kann eine für die Vorstufe und für eines der Aktivatorproteine kodierende Sequenz unter der Kontrolle der zielzellspezifischen Expressionskontrollsequenzen exprimiert werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt Schritt (d) die Zugabe eines pharmazeutisch verträglichen Trägers und/oder Verdünnungsmittels. Beispiele für geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder Verdünnungsmittel sind dem Fachmann bekannt und umfassen z.B. Phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie z.B. Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Netzmitteln oder Detergenzien, sterile Lösungen, etc. Arzneimittel, die solche Träger umfassen, können mittels bekannter konventioneller Methoden formuliert werden. Diese Arzneimittel können einem Individuum in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung kann oral oder parenteral erfolgen, z.B. intravenös, intraperitoneal, subcutan, intramuskulär, lokal, intranasal, intrabronchial oder intradermal, oder über einen Katheter an einer Stelle in einer Arterie. Die Art der Dosierung wird vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Faktoren bestimmt. Es ist dem Fachmann bekannt, daß die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren abhängig ist, wie z.B. der Körpergröße bzw. dem Gewicht, der Körperoberfläche, dem Alter, dem Geschlecht oder der allgemeinen Gesundheit des Patienten, aber auch von dem speziell zu verabreichenden Mittel, der Dauer und Art der Verabreichung, und von anderen Medikamenten, die möglicherweise parallel verabreicht werden. Eine typische Dosis kann z.B. in einem Bereich zwischen 0,001 und 1000 μg liegen, wobei Dosen unterhalb oder oberhalb dieses beispielhaften Bereiches, vor allem unter Berücksichtigung der oben erwähnten Faktoren, vorstellbar sind. Im allgemeinen sollte sich bei regelmäßiger Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung die Dosis in einem Bereich zwischen 1 μg- und 10 mg-Einheiten pro Tag befinden. Wird die Zusammensetzung intravenös verabreicht, was nicht bevorzugt empfohlen wird, um die Gefahr einer anaphylaktischen Reaktionen zu minimieren, sollte sich die Dosis in einem Bereich zwischen 1 μg- und 10 mg-Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht pro Minute befinden.

Die Zusammensetzung der Erfindung kann lokal oder systemisch verabreicht werden. Präparate für eine parenterale Verabreichung umfassen sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht-wäßrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie z.B. Olivenöl, und organische Esterverbindungen wie z.B. Ethyloleat, die für Injektionen geeignet sind. Wäßrige Träger umfassen Wasser, alkoholisch-wäßrige Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Salzlösungen und gepufferte Medien. Parenterale Träger umfassen Natriumchlorid-Lösungen, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktat und gebundene Öle. Intravenöse Träger umfassen z.B. Flüssigkeits-, Nährstoff- und Elektrolyt-Ergänzungsmittel (wie z.B. solche, die auf Ringer-Dextrose basieren). Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann außerdem Konservierungsmittel und andere Zusätze umfassen, wie z.B. antimikrobielle Verbindungen, Antioxidantien, Komplexbildner und inerte Gase. Desweiteren können, abhängig von der beabsichtigten Verwendung, Verbindungen wie z.B. Interleukine, Wachstumsfaktoren, Differenzierungsfaktoren, Interferone, chemotaktische Proteine oder ein unspezifisches immunmodulatorisches Agens enthalten sein.

Die Verabreichung des erfindungsgemäß hergestellten Arzneimittels erfolgt bevorzugt systemisch.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stammen die Zielzelle und die Kontrollzelle aus unterschiedlichen Geweben und/oder Organismen.

In dieser Ausführungsform können zur weiteren Erhöhung der Spezifität für die jeweilige Zielzelle Informationen aus einer Datenbank verwendet werden, die von anderen Organen des Menschen stammen als die betreffende Zielzelle.

Dies kann zum Beispiel mit Hilfe von Microarray- oder Genchip-Expressionsmuster-Datenbanken erfolgen, welche z.B. unter Verwendung der jeweiligen operierten gesunden Organteile erstellt wurden. In diesem Zusammenhang ist es auch denkbar, daß Datenbanken von Expressionsprofilen benutzt werden, die anhand der Organe dem Menschen verwandter Säugetiere erstellt wurden, wie z.B. Affen, Mäuse, Ratten usw. Es ist denkbar, daß zur statistischen Auswertung dieser Expressionsprofile und Identifikation der am besten geeigneten erfindungsgemässen Expressionskontrollsequenzen eine spezielle Software eingesetzt wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammen die Zielzelle und die Kontrollzelle aus demselben Gewebe und/oder Organismus und ist die Zielzelle eine nicht gesunde Zelle und die Kontrollzelle eine gesunde Zelle.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die nicht gesunde Zelle eine tumorigene, metastasierende, atherosklerotische, fibrogene, virusinfizierte oder psoriatische Zelle.

So kann die Zielzelle beispielsweise eine Tumorzelle eines bestimmten Gewebes sein, wie z.B. eine hepatozelluläre Karzinomzelle. Das Karzinom des Patienten wird z.B. durch Operation entfernt und karzinomatöse Anteile des entnommenen Gewebes dienen für die Erstellung des Zielzell-Expressionsprofils. Zugleich werden gesunde Anteile des betroffenen Gewebes, z.B. der Leber mit entfernt und diese nicht betroffenen Gewebsanteile dienen zur Erstellung des Referenz-Expressionsprofils.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform stammen die Zellen aus einem Organ, Blut, Knochen- oder Knorpelgewebe oder einer Zellkultur.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Arzneimittel, das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des mindestens einen Gentransfervektors, wie vorstehend definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Krebs, Atherosklerose, einer Fibrose, einer Autoimmunerkrankung, von virusinfizierten Zellen oder Psoriasis.

Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung eine Bank von Gentransfervektoren wie vorstehend definiert.

Die Bank umfaßt eine Vielzahl von Vektoren, die verschiedene Expressionskontrollsequenzen enthalten, die jeweils an unterschiedliche in RNA transkribierbare bzw. (Poly)peptid-kodierende Sequenzen gekoppelt sind.

Die erfindungsgemäße Bank von Gentransvektoren erlaubt es vorteilhafterweise, nach Diagnose und Analyse schnell ein individual-spezifisches Arzneimittel für einen Patienten herzustellen. Soll beispielsweise ein Tumor in einem Patienten behandelt werden, ist es nur noch notwendig, mindestens zwei Gene zu identifizieren, deren Expression in diesem Tumor hochreguliert ist. Anschließend kann eine gegebenenfalls computerunterstützte Auswahl mindestens eines Gentransfervektors aus der erfindungsgemäßen Bank erfolgen, der die Expressionskontrollsequenzen, die den identifizierten Genen entsprechen, enthält. Da die Expressionskontrollsequenzen bereits an Sequenzen gekoppelt sind, deren Expressionsprodukte funktionell interagieren, kann sofort ein zielzellspezifisches Arzneimittel bereitgestellt werden.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit, umfassend mindestens einen Gentransfervektor wie vorstehend definiert und gegebenenfalls ein Mittel zur Therapieverlaufskontrolle.

Die vorstehend zitierten Publikationen sind hiermit per Referenz Teil der Beschreibung.

Die Figuren zeigen:

1: Schematische Darstellung einer Transduktion mit einem retroviralen Vektor. Das therapeutische Transgen ersetzt im Vektor die retroviralen pol-, gag- und env-Gene. Das komplette Vektorpartikel wird in einer Verpackungszelllinie zusamengesetzt, die die retroviralen Proteine beisteuert. Nach Aufnahme in die Zielzelle wird das Transgen revers transkribiert, in die genomische DNA integriert und von dort exprimiert.

2: Schematische Darstellung eines Ribozyms vom Typ des Gruppe I-Introns. Das Ribozym bindet durch homologe Basenpaarung des 5'-Bereiches an die Ziel-mRNA, so daß das Guanosin am 5'-Ende mit einem Uridin der Ziel-mRNA interagiert. 3'-seitig vom Uridin wird die Ziel-mRNA gespalten (Pfeil) und korrigiert, indem der 3'-Anteil durch Sequenzen des Ribozyms ersetzt wird.

3: Schematische Darstellung eines Hammerhead-Ribozyms. Die Ziel-mRNA wird an einer UY-Stelle gespalten (Y = A, C oder U), nachdem das Ribozym via homologe Basenpaarung 5'- und 3'-seitig davon spezifisch gebunden hat.

4: Darstellung eines beispielhaften Ribozymentwurfes, wie es in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Grosse Buchstaben zeigen Sequenzanteile des Gens der HSV-tk, welches in den Beispielen als zelltodverursachendes Protein dient.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Behandlung eines durch Noxen induzierten Lebertumors im Mausmodell

1. Induktion eines Lebertumors in einer Maus. Ein Lebertumor kann z.B. durch eine Injektion von Diethylnitrosamin (DEN, 200 mg/kg i.p.) und anschliessende Tumorpromotion mit Phenobarbital (PB, 0.05%) in der Diät (Nutr Cancer 2000;37(1):89-98 Bishayee A, Sarkar A, Chatterjee M) induziert werden. Es ist auch möglich andere Toxine zu benutzen wie z.B. Aflatoxin B1, Myleran oder Bi(chloromethyl)ether.
2. Entnahme von Gewebsproben des induzierten Tumors, benachbartem gesundem Leberparenchym und gegebenenfalls von gesunden Organen wie Niere, Lunge, Muskel, Blut, Gehirn. Die Entnahme kann mittels einer Feinnadelbiopsie oder durch eine Operation durchgeführt werden.
3. Differentielle Expressionsanalyse der pathologischen Probe und des gesunden Referenzgewebes durch ein Hybridisierungsverfahren mit Hilfe eines sogenannten Human Cancer Array (Clontech).
(a) Isolierung von RNA aus den pathologischen Gewebsproben und den jeweiligen Referenzgewebsproben mit z.B einem RNeasy RNA System der Firma QIAGEN.
(b) mRNA-Gewinnung aus der isolierten Gesamt-RNA, Umschreiben der mRNA in die entsprechende cDNA und Markierung der gewonnen cDNA mit einem radioaktiven Marker wie 32P. Alle diese Schritte können z.B. mit einem Atlas^tm Pure Total RNA Labeling System (Clontech) durchgeführt werden.
(c) Hybridisierung der markierten Proben aus den pathologischen Gewebeproben und aus den Referenzgewebeproben auf einen Human Cancer Array (datailliert in dem Herstellerprotokoll dargestellt).
(d) Autoradiographische oder Phosphoimager-unterstützte Darstellung der Hybridisierungssignale.
(e) Auswertung der Daten, Beurteilung der Expression der einzelnen Gene mit der AtlasNavigator 1.0 (Clontech) Software. Schritte (a)-(e) können alternativ z.B. mit einem Custom Hybridization and Analysis Dienst bei der Firma Clontech gemacht werden.
4. Auswahl von zwei Genen, deren Expression auf RNA-Ebene im pathologischen Gewebe erhöht ist. Im am meisten bevorzugten Fall, Auswahl der Gene deren Expression auf der RNA-Ebene nur in dem Zielgewebe jedoch nicht in dem Kontrollgewebe nachweisbar ist. Eine zusätzliche Kontrolle von ausgewählten Genen durch RT-PCR, Light Cycler oder Northern Blot Expressionsanalyse.
5. Identifizierung und Isolierung der Promotersequenzen der ausgewählten Gene durch PCR-Amplifikation und Aufreiningung der Produkte.
(a) durch eine GenBank-Durchmusterung (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) können Promotersequenzen der ausgewählten Gene identifiziert werden.
(b) Anhand der bekannten Sequenz erfolgt die Auswahl der Primer. Amplifikation von Promotoren mittels PCR-Technik und genomischer Maus-DNA als Matrize. Das amplifizierte Stück soll den funktionellen Teil des Promotors erhalten, der für die Transkriptionaktivität im untersuchten Gewebe verantwortlich ist. Benutzte Primer enthalten idealerweise Erkennungsmotive für Restriktionsenzyme, die weitere Clonierungsschritte erleichtern. Die Auswahl der Restriktionsenzyme ist von den amplifizerten Promotersequenzen und den jeweils benutzten Vektoren abhängig.
6. Konstruktion eines trans-Spleiss-Ribozyms und eines Zielmoleküls, wovon beide Teilsequenzen eines zelltodverursachenden Proteins enthalten. Die gleichzeitige Expression dieser Sequenzen führt zu Ribozym-bedingtem Spleissing, wodurch es zur Expression des vollständigen zelltodverursachenden Proteins kommt (4).
(a) Konstruktion eines trans-Spleiss-Ribozyms nach dem US Patent 6071730, welches eine 3'-Teilsequenz des humanen Herpesvirus 1 TK Gens (Basen 912-1714; GenBank J02224) enthält.
(i) PCR Amplifikation der Tetrahymena Thermophila Ribozymsequenz unter Verwendung von T. Thermophila ribosomaler DNA als Matrize oder aus einem Vektor mit einer einklonierten T. Termophila Ribozymsequenz mit folgenden Primern: ribfor: TGACGCAATT CAACCAAGCG (Basen 1-20; GenBank V01416) ribrev TAATCCATTC ATGCGCGTCA (Basen 517-497; GenBank V01416) Das erwartete PCR-Produkt hat eine Länge von 517 bp.
(ii) PCR Amplifikation des 3'-Teils des HSV-tk Gens (Basen 912-1750 GenBank J02224) unter Verwendung von HSV1 viraler DNA als Matrize oder aus einem Vektor mit einkloniertem HSV-tk Gen mit Hilfe der Primer 3tkfor, wobei der Primer 3tkfor zusätzlich 20 Basen aus der Ribozym-core-Sequenz enthält (kursiv) und dem Primer 3tkrev. 3tkfor: RRRGATTAGTTTTGGAGTACTCG GCCGTGACC GACGCCGTTCT (kursiv: Basen 445-465 aus der Ribozym-core-Sequenz; GenBank V01416, nicht kursiv: Basen 912-932 des HSV-tk Gens; GenBank J02224, RRR Restriktionsenzym-Erkennungssequenz) primer 3tkrev AACCCCGCGTTTATGAACAAACGACCCAAC (Basen 1750-1720 des HSV-tk-Gens; GenBank J02224)
(iii) PCR-Reaktion, wobei das aus 6(a)(i) amplifizierte Produkt als Matrize dient. Als PCR-Primer dienen das amplizierte Produkt aus 6(a)(ii) und der Primer ribtkfor. ribtkfor: RRRGAAGACCTTTTACTTTGACAAATTCAGTGTCACGGATAAGGAAAA GTTATCAGGCATGCACC Die kursiv dargestellten Basen im Primer ribtkfor entsprechen den Basen 1920-1886 des Renilla Luciferase Gens aus dem Plasmid pRL-CMV (Promega; GenBank AF025843) und erkennen die entsprechende Sequenz im Zielmolekül (s.6.b), RRR Restriktionsenzym-Erkennungssequenz.
(b) Konstruktion eines Zielmoleküls, welches eine 5'-Teilsequenz des humanen Herpesvirus 1 TK Gens (Basen 407-911; GenBank J02224) enthält, gekoppelt an eine 3'-Teilsequenz mit einem polyA-Signal des Renilla Luciferase Gens (Basen 1886-2270; GenBank AF025843).
(i) PCR-Amplifikation der Teilsequenz des Renilla Luciferase Gens (Basen 1886-2270; GenBank AF025843) unter Verwendung des Renilla Luciferase Gens aus dem Plasmid pRL-CMV als Matrize und den Primern rlfor und rlrev, wobei der Primer rlfor zusätzlich 20 Basen aus der 5'-Teilsequenz des HSV-tk Gens enthält. rlfo: AAGCGCCCAGATAACAATGGGCATGCCTTATTCCTAATACTGAATTTGTCAAAGT A (kursiv: Basen 911-881 des HSV-tk-Gens; GenBank J02224; nicht kursiv: Basen 1886-1910 von pRL-CMV; GenBank AF025843) rlrev: RRRTGCCACCTGGATCCTTATCGATTT (Basen 2270-2247 von pRL-CMV; GenBank AF025843, RRR Restriktionsenzym-Erkennungssequenz)
(ii) PCR-Amplifikation des 5'-Teils des HSV-tk-Gens (Basen 381-911; GenBank J02224) unter Verwendung HSV1 viraler DNA als Matrize oder mit Hilfe eines Vektors mit einkloniertem HSV-tk-Gens, einem Primer 5tkfor und dem Produkt der PCR-Reaktion aus 6(b)(i). So entsteht ein Zielmolekül, das eine 5'-Teilsequenz des HSV-tk-Gens besitzt und eine 3'-Teilsequenz der Renilla Luciferase mit einem polyA-signal aus einem pRL-CMV plasmid. 5tkfor: RRRTATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGA (Basen 381-406; GenBank J02224, RRR Restriktionsenzym-Erkennungssequenz)
7. Herstellung von adenoviralen Vektoren
(a) Einklonieren der im Schritt 5 isolierten Promotoren und der im Schritt 6 hergestellten Ribozyme und Zielmoleküle in einen adenoviralen shuttle Vector. Der Promotor 1 wird zusammen mit dem Ribozym und der Promotor 2 zusammmen mit dem Zielmolekül in jeweils einen adenoviralen pShuttle-Vektor des AdEasy Systems einkloniert.
(i) Restriktionshydrolyse der PCR Produkte aus Schritt 5 und anschliessendes asymmetrisches Einklonieren der Promotorsequenzen in die MCS-Stelle jeweils eines pShuttle Vektors
(ii) Restriktionshydrolyse der PCR Produkte aus Schritt 6 und anschliessendes asymmetrisches Einklonieren des Ribozyms und des Zielmoleküls in die MCS-Stelle jeweils eines im Schritt 7(a) modifizierten pShuttle Vektors in 3'-Richtung relativ zu den einklonierten Promotoren.
(b) In vivo homologe Rekombination der in Schritt 7(a) modifizierten pShuttle Vektoren mit jeweils einem pAdEasy-1 Vektor in den BJ5183 E.coli Bakterien (für einen detailliertes Protokoll siehe AdEasy Vector System Manual, Quantum).
(c) Herstellung von replikationsdefizienten Adenoviren in HEK293 Zellen (für ein detailliertes Protokol siehe AdEasy Vector System Manual, Quantum).
8. Behandlung des induzierten Maustumors.
(a) Infektion der Maus durch Injektion mit zwei im Schritt 7 hergestellten adenoviralen Konstrukten.
(b) Zufuhr von Gancyclovir
9. Zur Kontrolle erfolgt eine Transduktion mit Hilfe adenoviraler Konstrukte, die keine in Ribonukleinsäuren transkribierbare Sequenzen enthalten, z.B. mit einem adenoviralen green fluorescent protein (GFP)-Konstrukt.

Beispiel 2

Selektives Abtöten einer Zellinie in einer gemischten Zellkultur

1. Vorbereitung einer gemischten Zellkultur aus z.B. HepG2-Zellen und HeLa-Zellen.
2. Differentielle Expressionsanalyse von HepG2- und HeLa-Zellen durch ein Hybridisierungsverfahren mit Hilfe eines sogenannten humanen Cancer Array (Clontech).
(a) Isolierung von RNA aus HepG2- und HeLa-Zellen mit z.B einem RNeasy RNA System der Firma QIAGEN.
(b) mRNA-Gewinnung aus der isolierten Gesamt-RNA, Umschreiben der mRNA in die entsprechende cDNA und Markierung der gewonnen cDNA mit einem radioaktiven Marker wie ³²P. Alle diese Schritte können z.B. mit einem Atlas^tm Pure Total RNA Labeling System (Clontech) durchgeführt werden.
(c) Hybridisierung der markierten Proben aus HepG2- und HeLa-Zellen auf einen Human Cancer Array (detailliert in dem Herstellerprotokoll dargestellt).
(d) Autoradiographische oder Phosphoimager-unterstützte Darstellung der Hybridisierungssignale.
(e) Auswertung der Daten, Beurteilung der Expression der einzelnen Gene mit der AtlasNavigator 1.0 (Clontech) Software. Schritte (a)-(e) können alternativ z.B. mit einem Custom Hybridization and Analysis Dienst bei der Firma Clontech gemacht werden.
3. Auswahl von zwei Genen, deren Expression auf RNA-Ebene nur in einer der beiden Zelllinien erhöht ist. Im am meisten bevorzugten Fall, Auswahl der Gene deren Expression auf der RNA-Ebene nur in einer Zelllinie jedoch nicht in der anderen Zelllinie nachweisbar ist. Eine zusätzliche Expressionskontrolle von ausgewählten Genen durch RT-PCR, Light Cycler oder Northern Blot Expressionsanalyse.
4. Identifizierung und Isolierung der Promotersequenzen der ausgewählten Gene durch PCR-Amplifikation und Aufreiningung der Produkte.
(a) durch eine GenBank-Durchmusterung (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ können Promotersequenzen der ausgewählten Gene identifiziert werden.
(b) Anhand der bekannten Sequenz erfolgt die Auswahl der Primer. Amplifikation von Promotoren mittels PCR-Technik und genomischer Maus-DNA als Matrize. Das amplifizierte Stück soll den funktionellen Teil des Promotors erhalten, der für die Transkriptionaktivität im untersuchten Gewebe verantwortlich ist. Benutzte Primer enthalten idealerweise Erkennungsmotive für Restriktionsenzyme, die weitere Klonierungsschritte erleichtern. Die Auswahl der Restriktionsenzyme ist von den amplifizerten Promotersequenzen und den jeweils benutzten Vektoren abhängig.
5. Konstruktion eines trans-Spleiss-Ribozyms und eines Zielmoleküls, wovon beide Teilsequenzen eines zelltodverursachenden Proteins enthalten. Die gleichzeitige Expression dieser Sequenzen führt zu Ribozym-bedingtem Spleissing, wodurch es zur Expression des vollständigen zelltodverursachenden Proteins kommt (4).
(a) Konstruktion eines trans-Spleiss-Ribozyms (nach dem US Patent 6071730), welches eine 3'-Teilsequenz des humanen Herpesvirus 1 TK Gens (Basen 912-1714; GenBank J02224) enthält.
(i) PCR Amplifikation der Tetrahymena Thermophila Ribozymsequenz unter Verwendung von T. Thermophila ribosomaler DNA als Matrize oder aus einem Vektor mit einer einklonierten T. Termophila Ribozymsequenz mit folgenden Primern: ribfor: TGACGCAATT CAACCAAGCG (Basen 1-20; GenBank V01416) ribrev TAATCCATTC ATGCGCGTCA (Basen 517-497; GenBank V01416) Das erwartete PCR-Produkt hat eine Länge von 517 bp.
(ii) PCR Amplifikation des 3'-Teils des HSV-tk Gens (Basen 912-1750 GenBank J02224) unter Verwendung von HSV1 viraler DNA als Matrize oder aus einem Vektor mit einkloniertem HSV-tk Gen mit Hilfe der Primer 3tkfor, wobei der Primer 3tkfor zusätzlich 20 Basen aus der Ribozym-core-Sequenz enthält (kursiv) und dem Primer 3tkrev. 3tkfor: RRRGATTAGTTTTGGAGTACTCG GCCGTGACC GACGCCGTTCT (kursiv: Basen 445-465 aus der Ribozym-core-Sequenz; GenBank V01416, nicht kursiv: Basen 912-932 des HSV-tk Gens; GenBank J02224, RRR Restriktionsenzym-Erkennungssequenz) primer 3tkrev AACCCCGCGTTTATGAACAAACGACCCAAC (Basen 1750-1720 des HSV-tk-Gens; GenBank J02224)
(iii) PCR-Reaktion, wobei das aus 6(a)(i) amplifizierte Produkt als Matrize dient. Als PCR-Primer dienen das amplizierte Produkt aus 6(a)(ii) und der Primer ribtkfor. ribtkfor: RRRGAAGACCTTTTACTTTGACAAATTCAGTGTCACGGATAAGGAAAA GTTATCAGGCATGCACC Die kursiv dargestellten Basen im Primer ribtkfor entsprechen den Basen 1920-1886 des Renilla Luciferase Gens aus dem Plasmid pRL-CMV (Promega; GenBank AF025843) und erkennen die entsprechende Sequenz im Zielmolekül (s.6.b), RRR Restriktionsenzym-Erkennungssequenz.
(b) Konstruktion eines Zielmoleküls, welches eine 5'-Teilsequenz des humanen Herpesvirus 1 TK Gens (Basen 407-911; GenBank J02224) enthält, gekoppelt an eine 3'-Teilsequenz mit einem polyA-Signal des Renilla Luciferase Gens (Basen 1886-2270; GenBank AF025843).
(i) PCR-Amplifikation der Teilsequenz des Renilla Luciferase Gens (Basen 1886-2270; GenBank AF025843) unter Verwendung des Renilla Luciferase Gens aus dem Plasmid pRL-CMV als Matrize und den Primern rlfor und rlrev, wobei der Primer rlfor zusätzlich 20 Basen aus der 5'-Teilsequenz des HSV-tk Gens enthält. rlfor: AAGCGCCCAGATAACAATGGGCATGCCTTATTCCTAATACTGAATTTGTCAAAGT A (kursiv: Basen 911-881 des HSV-tk-Gens; GenBank J02224; nicht kursiv: Basen 1886-1910 von pRL-CMV; GenBank AF025843) rlrev: RRRTGCCACCTGGATCCTTATCGATTT (Basen 2270-2247 von pRL-CMV; GenBank AF025843, RRR Restriktionsenzym-Erkennungssequenz)
(ii) PCR-Amplifikation des 5'-Teils des HSV-tk-Gens (Basen 381-911; GenBank J02224) unter Verwendung HSV1 viraler DNA als Matrize oder mit Hilfe eines Vektors mit einkloniertem HSV-tk-Gens, einem Primer 5tkfor und dem Produkt der PCR-Reaktion aus 6(b)(i). So entsteht ein Zielmolekül was eine 5'-Teilsequenz des HSV-tk-Gens besitzt und eine 3'-Teilsequenz der Renilla Luciferase mit einem polyA-signal aus einem pRL-CMV plasmid. 5tkfor: RRRTATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGA (Basen 381-406; GenBank J02224, RRR Restriktionsenzym-Erkennungssequenz).
6. Herstellung von adenoviralen Vektoren für den Gentransfer.
(a) Einklonieren der im Schritt 5 isolierten Promotoren und der im Schritt 6 hergestellten Ribozyme und Zielmoleküle in einen adenoviralen shuttle Vector. Der Promotor 1 wird zusammen mit dem Ribozym und der Promotor 2 zusammmen mit dem Zielmolekül in jeweils einen adenoviralen pShuttle-Vektor des AdEasy Systems einkloniert.
(i) Restriktionshydrolyse der PCR Produkte aus Schritt 5 und anschliessendes asymmetrisches Einklonieren der Promotorsequenzen in die MCS-Stelle jeweils eines pShuttle Vektors
(ii) Restriktionshydrolyse der PCR Produkte aus Schritt 6 und anschliessendes asymmetrisches Einklonieren des Ribozyms und des Zielmoleküls in die MCS-Stelle jeweils eines im Schritt 7(a) modifizierten pShuttle Vektors in 3'-Richtung relativ zu den einklonierten Promotoren.
(b) In vivo homologe Rekombination der in Schritt 7(a) modifizierten pShuttle Vektoren mit jeweils einem pAdEasy-1 Vektor in den BJ5183 E.coli Bakterien (für einen detailliertes Protokoll siehe AdEasy Vector System Manual, Quantum).
(c) Herstellung von replikationsdefizienten Adenoviren in HEK293 Zellen (für ein detailliertes Protokol siehe AdEasy Vector System Manual, Quantum).
7. Selektives Abtöten einer Zellinie in einer Gemischten Zellkultur
(a) Ko-infektion der gemischten Zellkultur mit zwei in Schritt 6 hergestellten adenoviralen Vektoren.
(b) Zugabe von Ganciclovir
8. Zur Kontrolle erfolgt eine Infektion mit Hilfe adenoviraler Konstrukte, die keine in Ribonukleinsäuren transkribierbare Sequenzen erhalten, z.B. mit einem adenoviralen green fluorescent protein (GFP)-Konstrukt.

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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines zielzellspezifischen Arzneimittels, umfassend die Schritte: (a) Identifizierung von mindestens zwei Genen, deren Expression in einer Zielzelle im Vergleich zur Expression in einer Kontrollzelle erhöht ist; (b) Identifizierung und Isolierung der Expressionskontrollsequenzen der mindestens zwei in Schritt (a) identifizierten Gene; (c) Klonierung der in Schritt (b) isolierten mindestens zwei Expressionskontrollsequenzen oder funktionell äquivalenter Derivate davon in mindestens einen Gentransfervektor, so dass die mindestens zwei Expressionskontrollsequenzen oder Derivate in dem mindestens einen Gentransfervektor jeweils die Regulation der Expression einer Sequenz erlauben, wobei die Sequenzen in Ribonukleinsäuren transkribierbar sind, die funktionell interagieren; und (d) Formulierung des mindestens einen in Schritt (c) erzeugten Gentransfervektors in einem Arzneimittel, wobei der Gentransfervektor ein Adenovirus-assoziiertes (AAV) Konstrukt ist, und wobei die mindestens zwei Ribonukleinsäuren Sequenzen umfassen, die ein Trans-Splicing der mindestens zwei Ribonukleinsäuren erlauben, wobei mindestens eine der daraus resultierenden Ribonukleinsäuren ein funktionell aktives (Poly)peptid kodiert, und wobei die isolierten mindestens zwei Expressionskontrollsequenzen oder funktionell äquivalenten Derivate davon in adenovirale Shuttlevektoren kloniert werden, welche die 5'- und 3'-Teilsequenzen eines zelltodverursachenden Proteins enthalten und durch das Trans-Splicing vermittelte Zusammenführen der Teilsequenzen ein funktionell aktives zelltodverursachendens Protein entsteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (a) folgende Schritte umfasst: (i) Isolierung von mRNA oder Protein aus der Zielzelle und der Kontrollzelle; (ii) Identifizierung von mRNAs oder Proteinen, deren Häufigkeit in der Zielzelle größer ist als in der Kontrollzelle; und (iii) Bestimmung der Gene, deren mRNAs oder Proteine in Schritt (ii) identifiziert wurden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei Schritt (ii) mittels Hybridisierung mit einem Genchip oder einem Microarray oder mittels eines Filter-Subtraktionshybridisierungsverfahrens durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Expressionskontrollsequenz ein Promotor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Schritt (d) die Zugabe eines pharmazeutisch verträglichen Trägers und/oder Verdünnungsmittels umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zielzelle und die Kontrollzelle aus unterschiedlichen Geweben und/oder Organismen stammen, jedoch menschliche Stammzellen ausgeschlossen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Zielzelle und die Kontrollzelle aus demselben Gewebe und/oder Organismus stammen und die Zielzelle eine nicht gesunde Zelle und die Kontrollzelle eine gesunde Zelle ist, jedoch menschliche Stammzellen ausgeschlossen sind.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die nicht gesunde Zelle eine tumorigene, metastasierende, atherosklerotische, virusinfizierte, fibrogene oder psoriatische Zelle ist, jedoch menschliche Stammzellen ausgeschlossen sind.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Zellen aus einem Organ, Blut, Knochen- oder Knorpelgewebe oder einer Zellkultur stammen, jedoch menschliche Stammzellen ausgeschlossen sind.
Arzneimittel, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
Verwendung des mindestens einen Gentransfervektors, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Krebs, Atherosklerose, einer Fibrose, einer Autoimmunerkrankung, virusinfizierten Zellen oder Psoriasis.
Bank von Gentransfervektoren wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, zur Herstellung der erfindungsgemäßen zielzellspezifischen Arzneimittel.
Kit, umfassend mindestens einen Gentransfervektor wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert und gegebenenfalls ein Mittel zur Therapieverlaufskontrolle, zur Herstellung der erfindungsgemäßen zielzellspezifischen Arzneimittel.