DE10355559A1

DE10355559A1 - Transskin

Info

Publication number: DE10355559A1
Application number: DE10355559A
Authority: DE
Inventors: Hans Dr. Meijer; Peter Dr. Wehling; Barbara Dr. Sturm
Original assignee: Orthogen AG
Current assignee: Orthogen AG
Priority date: 2003-11-21
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2005-06-23
Also published as: US20070086981A1; JP2007535908A; WO2005054279A1; WO2005054279A8; EP1694696A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Lieferproteine, Protein-Fracht-Komplexe, Verfahren und Mittel für die verbesserte Beförderung oder Transport von Medikamenten, biologisch aktiven Mitteln oder anderen Verbindungen als Fracht oder Frachtmoleküle auf biologische Membranen oder eine biologische Barriere bildende Gewebe, in diese oder über diese hinweg.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, Verfahren und Mittel für ein verbessertes Liefern, Abliefern oder Transportieren von Medikamenten, biologisch aktiven Mitteln oder anderen Verbindungen als Fracht oder Frachtmoleküle auf, in oder über biologische Membranen oder Gewebe, welche eine biologische Barriere bilden, hinweg. Biologische Barrieren schließen zum Beispiel Zellmembranen, mitochondriale Membranen, dermale und empitheliale Membranen wie die Haut, das gastrointestinale Epithel und das Bronchial- oder Lungenepithel sowie endotheliale Membranen wie die Blut-Hirn-Schranke ein.

Die Fähigkeit, biologisch aktive Substanzen wie therapeutisch wirkende Mittel, Nucleinsäuren, Aminosäuren, kleine Moleküle, sogenannte „small molecules", Viren etc. über biologische Barrieren oder spezielle Zelltypen hinweg und/oder auf deren Oberfläche oder in diese hinein zu befördern, ist für verschiedene Anwendungen nützlich, insbesondere für die Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, vorzugsweise im Bereich der Onkologie, Gentherapie und in Verbindung mit der Prophylaxe und/oder Therapie von Erkrankungen des Magen- und Darmtrakts oder von Hauterkrankungen.

Beispielsweise erreichen die meisten Wirkstoffe auf Basis kleiner Moleküle ihre Zielgebiete dadurch, dass sie in der Lage sind, passiv durch die Zellmembran zu difundieren. Jedoch begrenzt die Abhängigkeit von passiver Diffusion die Zahl einsetzbarer Pharmazeutika auf diejenigen, die sowohl im polaren extrazellulären Milieu als auch in der unpolaren Zellmembran löslich sind. Daher besteht auch ein Bedarf für die Bereitstellung von Mitteln und Verfahren, um alle Arten biologisch aktiver Substanzen durch die Zellmembran zu befördern, ohne dabei auf passive Diffusion angewiesen sein zu müssen.

Der Proteintransport, die sogenannte „protein transduction", ist ein kürzlich entdeckter Vorgang, worin kleine Proteine, insbesondere Polypeptide mit kurzen spezifischen Sequenzen, die auch als „protein transduction domains" (PTDs) bezeichnet werden, eingesetzt werden, um nicht nur Proteine befördern, sondern auch eine große Zahl verschiedener Moleküle, die an solch ein Lieferpeptid („delivery"-peptide) kovalent gebunden sind. Es wurde gefunden, dass eine Reihe natürlich vorkommender Proteine leicht in Zellen eindringen können, und dass diese deshalb als Lieferproteine dienen können. Diese schließen das TAT-Protein des menschlichen Immunschwächevirus (HIV), das Antennapedia-Protein aus Drosophila sowie das VP22-Protein des Herpes simplex-Virus ein. Spezielle kurze Sequenzen mit amphiphiler Struktur innerhalb des größeren Moleküls sind für einen Großteil der Transportfähigkeit dieser Proteine verantwortlich.

Darüber hinaus gibt es Ansätze, künstliche Proteine zu entwerfen, welche als Lieferproteine wirken können. Beispielsweise wurden Peptidsequenzen, welche sowohl in die Zellplasmamembran eindringen als auch über das Stratum corneum hinweg die Haut durchdringen können, beschrieben (Nature Medicine (2000) 6: 1263). Obwohl sich die Plasmamembran einer Zelle von einer biologischen Barriere, welche durch das Stratum corneum der Haut gebildet wird, unterscheidet, werden beide Barrieren von solchen Transportproteinen überwunden.

Die WO 02/069930 A1 betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Verbesserung des Transports von Wirkstoffen über Gewebe hinweg oder in diese hinein. Diese Gewebe schließen die Haut, den Magen-Darm-Trakt, das Lungenepithel und die Blut-Hirn-Schranke ein. Sie beschreibt die Bereitstellung eines die Beförderung verbessernden Transporterproteins, welches weniger als 50 Untereinheiten und mindestens 5 Guanidino- oder Amidino-Gruppen enthält, beispielsweise Arginin (R). Dabei ist das Protein mit einer biologisch aktiven Verbindung, welche über die Barriere hinweg transportiert werden soll, kovalent verbunden.

Die WO 01/15511 A2 betrifft sogenannte „internalisierende" Peptide, welche die Aufnahme und den Transport eines Frachtmoleküls in das Cytoplasma und in die Zellkerne erleichtern. Diese Peptide wurden durch ein M13-Phagenbank-Screening mit HIG-82-Zellen, menschlichen primären T-Zellen, Zellen einer menschlichen Epithelzelllinie oder Gewebe der menschlichen Cervixschleimhaut erhalten. Eine große Zahl verschiedener Peptide (75 Peptide), welche möglicherweise als beförderungsverbessernde internalisierende Peptide dienen können, wurde gefunden.

Die WO 01/62297 A1 betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Verbesserung der Beförderung von Wirkstoffen und anderen Mitteln über biologische Barrieren wie die Haut, den Magen-Darm-Trakt, das Lungenepithel und die Blut-Hirn-Schranke hinweg. Sie stellt dazu die beförderungsverbessernde Polymere, einschließlich beispielsweise Poly-Arginin-Moleküle mit einer Länge zwischen etwa 6 und 50 Gruppen, bereit.

Da die Haut in ihrer Funktion den gesamten Körper zu schützen, eine natürliche Barriere für Stoffe ist, ist beispielsweise der transdermale Transport von Stoffen schwierig. Trotz vieler Jahre der Forschung sind nur wenige Wirkstoffe bekannt, die in der Lage sind, in tiefere Schichten der Haut einzudringen. Die meisten dieser Stoff wie DMSO wirken darüber hinaus als Lösungsmittel und bergen Gesundheitsrisiken. Daher ist für die Verabreichung von therapeutischen und kosmetischen Mitteln zum Zwecke der Hautpflege, des Hautschutzes und der Behandlung von Hauterkrankungen ein wirksamer Mechanismus eines transdermalen Transports höchst wünschenswert. Für die Hautpflege ist die lokale Behandlung der Haut gegen Altern ein gutes Beispiel. Gegenwärtig sind keine Cremes, insbesondere Hautcremes, verfügbar, die wirksam das Entstehen von Falten im Gesicht verhindern und einen jungen Zustand der Haut herstellen können. Es ist hinreichend bekannt, dass die Hautalterung nicht nur die Dermis sondern auch tiefere Schichten betrifft. Zur Verhinderung der Alterung müssen wirksame Produkte ein breites Anwendungsspektrum in allen Hautschichten aufweisen. Um die Veränderungen in der Zusammensetzung der Gerüstproteine, welche für die Festigkeit und Elastizität der Haut verantwortlich sind, zu stoppen, müssen kosmetische Wirkstoffe auch in die tiefsten Hautschichten befördert werden. Dass die Wirkstoffe gegen das Altern aber auch in tiefere Schichten befördert werden, konnte für gegenwärtige Hautcremes nicht gezeigt werden. Daher ist ein Transportmechanismus, der aktive Wirkstoffe gegen das Altern in tiefere Schichten bringen kann, höchst wünschenswert.

Viele Stoffe, beispielsweise Vitamine, Retinsäure, Hyaluronsäure und Collagen, können Veränderungen der Zusammensetzung von Gerüstproteinen hemmen und haben daher eine das Alter aufhaltende Wirkung. Der Einsatz von Proteinen ist höchst wünschenswert, da Proteine eine hohe spezifische biologische Wirksamkeit aufweisen. Superoxiddismutase (SOD), ein Fänger für freie Radikale, ist ein gutes Beispiel für ein Protein mit einer das Altern aufhaltenden Wirkung. Freie Radikale verstärken die Entzündungsreaktionen und führen zu einer großen Zahl verschiedener Vorgänge und Erkrankungen in allen Arten von Gewebe, wie auch dem Alterungsprozess in der Haut. In der menschlichen Haut hat die Entzündungsreaktion einen negativen Einfluss auf die Zusammensetzung der Gerüstproteine, führt sie zu einem Verlust an Festigkeit und Elastizität und schließlich zur Entstehung von Falten. Es wurde gezeigt, dass SOD spezifisch freie Radikale fängt und den Zelltod hemmt. Es wird daher eine Wirkung gegen das Altern aufweisen, falls es in alle Schichten der Haut befördert wird.

Zur wirksamen Pflege der Haut, zum Hautschutz und zur Behandlung von Hautkrankheiten und Erkrankungen der Epidermis im Allgemeinen wird ein effektives Verfahren für den Transport aktiver Stoffe, speziell von biologisch aktiven Proteinen wie SOD, in tiefere Schichten der Haut benötigt. Diese Stoffe unterscheiden sich bezüglich ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften stark. Idealerweise sollte für alle Stoffe ein gemeinsames Verfahren anwendbar sein. Wie erwähnt, kann der transdermale Transport durch die Ver wendung von Lieferpeptiden, welche mit einem Frachtmolekül konjugiert sind, verbessert werden. Noch sind diese speziellen Peptide nicht in der Lage, den transdermalen Transport generell für verschiedene Arten von Fracht zu verbessern. Eine Hemmung der biologischen Aktivität der zu transportierenden Fracht kann dabei nicht ausgeschlossen werden. Es wäre vorteilhaft, PTDs zur Verfügung zu haben, welche eine Vielzahl verschiedener Frachtmoleküle transportieren können und welche nicht erst wieder entfernt werden müssen, um die biologische Aktivität des transportierten Frachtmoleküls wieder herzustellen. Bei bekannten Lieferproteinen steht häufig ein überwiegender Anteil der topologischen Oberfläche eines Frachtmoleküls mit dem Protein in Verbindung. Um eine biologische Aktivität zu erhalten, ist es daher notwendig, den Frachtanteil des Protein-Fracht-Komplexes vom anhängenden Lieferprotein zu trennen, nachdem dieses die biologische Barriere überwunden hat oder in die Zielzelle eingedrungen ist, und den freien Wirkstoff nach Passieren einer biologischen Barriere freizusetzen.

Demgemäß besteht das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem im Wesentlichen darin, Verfahren und Mittel für eine verbesserte Beförderung einer Vielzahl verschiedener verwendbarer biologisch aktiver Stoffe als Fracht auf die Oberfläche einer biologischen Barriere, in eine oder über eine biologische Barriere hinweg bereitzustellen, ohne dass eine merkliche Verminderung oder Hemmung der biologischen Aktivität der mit dem Lieferprotein verbundenen Fracht auftritt. In besonders bevorzugter Weise ist dabei die biologische Aktivität der Fracht im Vergleich zur biologischen Aktivität der Fracht in Abwesenheit des Lieferpeptids im Wesentlichen unverändert.

Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem, wird gelöst durch die Bereitstellung eines Polypeptids, das als Lieferpeptid wirkt und einer Familie von Peptiden angehört, welche die folgende allgemeine Formel I besitzen: (K)_n A₁B₁C₁ (K)_m A₂B₂C₂ (K)_l A₃B₃C₃ (K)_o (I),wobei
K Lysin (K) ist,
n, m, o jeweils Ganzzahlen von 0 bis 5 sind,
B₁, B₂, B₃ Arginin (R), Glutamin (Q) oder Histidin (H) ist,
A₁, A₁, A₁, C₁, C₂, C₃ Arginin (R) oder Histidin (H) ist oder fehlt und
die Gesamtzahl der Aminosäuregruppen nicht mehr als 10 beträgt.

Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Peptid, welches mindestens eine Aminosäuresequenz gemäß Formel I enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Peptid aus der Aminosäuresequenz nach Formel I.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das Peptid eine Aminosäuresequenz, insbesondere besteht es daraus, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
KKRKKQKKRK (SEQ ID NO: 1), RRKKKQKKK (SEQ ID NO: 2),
KKQKKRRK (SEQ ID NO: 3), KKQKKRRKK (SEQ ID NO: 4),
KKKQKRKK (SEQ ID NO: 5), RQKKQKKKR (SEQ ID NO: 6),
RKQKKKRKKK (SEQ ID NO: 7), KRKQKQKKK (SEQ ID NO: 8),
KKRKQKKQK (SEQ ID NO: 9), KKKRKKQK (SEQ ID NO: 10),
RKKKKQKKK (SEQ ID NO: 11), KKRKKQKK (SEQ ID NO: 12),
QKKRRKKKQK (SEQ ID NO: 13), KKRKQKKRK (SEQ ID NO: 14),
KKRKQKKQKR (SEQ ID NO: 15), KRKQKQKKKK (SEQ ID NO: 16),
KKRKRKQKK (SEQ ID NO: 17), KQKRKKKQK (SEQ ID NO: 18),
KQKKRQKKKR (SEQ ID NO: 19), KKKRKQKQKK (SEQ ID NO: 20),
RKKKQKKQKK (SEQ ID NO: 21), KKKRQKKQK (SEQ ID NO: 22),
KKRKKKKKRK (SEQ ID NO: 23), RRKKKKKK (SEQ ID NO: 24),
KKKKRRK (SEQ ID NO: 25), KKKKRRKK (SEQ ID NO: 26),
KKKKRKK (SEQ ID NO: 27), KKRKKKKK (SEQ ID NO: 28),
KKRKKHKKRK (SEQ ID NO: 29), RRKKKHKKK (SEQ ID NO: 30),
KKHKKRRK (SEQ ID NO: 31), KKHKKRRKK (SEQ ID NO: 32),
KKKHKRKK (SEQ ID NO: 33), RHKKHKKKR (SEQ ID NO: 34),
RKHKKKRKKK (SEQ ID NO: 35), HHKRKKKRK (SEQ ID NO: 36),
KKRHHKRK (SEQ ID NO: 37), and KKHRKKH (SEQ ID NO: 38).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das Peptid lediglich aus Aminosäuren, die aus der Gruppe der Aminosäuren bestehend aus Histidin (H), Lysin (K), Glutamin (Q) und Arginin (R) ausgewählt sind.

Das Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere die Lieferpeptide, transportieren, beliefern oder erleichtern oder verbessern den Transport oder die Lieferung und haben, besonders vorteilhaft, keinen Einfluss auf die biologische Aktivität des Frachtmoleküls oder behindern diese. Auf besonders vorteilhafte Weise ist die biologische Aktivität des Moleküls, welches mit dem Lieferpeptid verbunden ist und ein Peptid-Fracht-Konjugat oder -Komplex bildet, im Wesentlichen dieselbe wie die einer isolierten Fracht bei Abwesenheit des Lieferpeptids. Besonders vorteilhaft besteht kein Bedarf, damit die Fracht aktiv werden kann, das Lieferpeptid abzuspalten sobald das Peptid-Fracht-Konjugat oder der Peptid-Fracht-Komplex in das Zielgewebe oder die Zielzelle aufgenommen worden ist oder die biologische Barriere erreicht oder in Richtung seines Ziels hin überwunden hat.

Im Gegensatz zu bekannten Lieferpeptiden, beispielsweise aus WO 91/09958 oder WO 02/069930, hat das erfindungsgemäße Peptid keinen Einfluss auf die biologische Aktivität der Frachtmoleküle.

Darüber hinaus ist die Beförderung der Fracht in der Gestalt eines Peptid-Fracht-Konjugats oder -Komplexes im Vergleich zur Beförderung der Fracht bei Abwesenheit des Lieferpeptids verbessert oder gesteigert. Beispielsweise stei gert das erfindungsgemäße Peptid den Transport von Proteinen, beispielsweise von therapeutisch wirksamen Enzymen, in tiefere Schichten der Haut.

Ohne an die Theorie gebunden zu sein, besitzt das erfindungsgemäße Peptid eine gesteigerte Translokationsaktivität, die auf dem Vorhandensein von zumindest einer Aminosäure mit basischer Ladung gründet, besitzt es eine gesteigerte Translokationsaktivität hauptsächlich aufgrund des Umstands, dass Aminosäuren im Lieferpeptid eine reguläre stabile Hülle bilden, verursacht es keine Reduktion der biologischen Aktivität eines Frachtmoleküls aufgrund der Tatsache, dass das Peptid nicht oder nur zu einem geringen Grad mit dem Frachtmolekül in Wechselwirkung tritt. Die Wechselwirkung zwischen dem Frachtmolekül und der durch das erfindungsgemäße Peptid gebildeten Hülle, wie eine sterische Behinderung und eine zu starke basische Ladung, ist überwiegend reduziert.

Ohne an die Theorie gebunden zu sein, stabilisiert Glutamin (O), welches in einer bevorzugten Ausführungsform des Peptids vorhanden ist, die Hülle aufgrund polarer Wechselwirkungen. Lysin (K) trägt mehr als Arginin (R) zu einer stabilen Hülle bei. Histidin (H), welches in einer bevorzugten Ausführungsform des Peptids vorhanden ist, trägt zu einer basischen Ladung in Gegenwart eines niederen pH bei.

Lieferpeptide können mittels jeden im Stand der Technik bekannten Verfahrens konstruiert werden. Vorzugsweise werden die Lieferpeptidpolymere synthetisch hergestellt, vorzugsweise unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Peptidsynthesizers. Konventionelle Aminosäuren können bei der Festphasenpeptidsynthese durch N-Methyl- und Hydroxy-Aminosäuren ersetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden biotinylierte Peptide hergestellt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die freien Aminoenden mit einer blockierenden Gruppe, wie einer Acetyl- oder Benzylgruppe, abgeschlossen, insbesondere um eine Ubiquitinierung in vivo zu verhindern.

Die Erfindung betrifft auch einen Komplex, welcher mindestens ein Peptid gemäß der Erfindung und mindestens ein Frachtmolekül beinhaltet. Im Folgenden wird dieser als Peptid-Fracht-Komplex bezeichnet. Die erfindungsgemäßen Lieferpeptide sind für die Bedeckung der Oberfläche der Frachtmoleküle gut geeignet. In Gegenwart mindestens eines erfindungsgemäßen Peptids ist die Aufnahme des mindestens einen Frachtmoleküls im Vergleich zur Aufnahme des Frachtmoleküls ohne Peptid stark erhöht. Diese Liefertechnik hat zum Zwecke der Verbesserung der Durchdringung der Haut oder anderer biologischer Barrieren oder deren Überwindung mit einem großen Spektrum therapeutischer Wirkstoffe ein breites Anwendungsspektrum.

Besonders vorteilhaft werden in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Lieferpeptiden übliche Mengen an Solubilisatoren wie CREMOPHOR^® (von BASF, hauptsächlich polyoxyethyliertes Rhizinusöl), Polysorbat 80 (Polyoxyethylen-Sorbitanmonooleat, auch bekannt als TWEEN 80) PEG und Ethanol nicht benötigt. Dementsprechend können Nebenwirkungen, die typischerweise mit solchen Solubilisatoren im Zusammenhang stehen wie anaphylaktischer Schock, Dyspnöe, Blutunterdruck und ähnliches deutlich reduziert werden.

Dem gemäß wird das technische Problem weiter gelöst durch die Bereitstellung eines Peptid-Fracht-Komplexes, enthaltend das Lieferpeptid und mindestens ein Frachtmolekül. In einer bevorzugten Ausführungsform des Peptid-Fracht-Komplexes ist das Lieferpeptid selektiv an die äußere Oberfläche des mindestens einen Frachtmoleküls gebunden.

Die Lieferpeptide der vorliegenden Erfindung können mit Fracht oder mindestens einem Frachtmolekül zu einem Komplex verbunden werden. Der hier verwendete Begriff „Fracht" oder „Frachtmolekül" bezeichnet jedes kleine Molekül, Makromolekül oder jeden makromolekularen Komplex welcher nützlich ist, um auf eine biologische Barriere oder eine Zielzelle, in diese oder über diese hinweg transportiert zu werden.

Vorzugsweise schließt die Fracht ein, ist aber nicht darauf beschränkt: kleine organische Moleküle, sogenannte „small organic molecules", Makromoleküle, Polynucleotide, DNS, Oligonucleotidreste, RNS, Antisense-RNS und andere Antisense-Konstrukte, Polypeptide, Proteine, Viren, modifizierte Viren, virale und nichtvirale Vektoren, Metalle und Plasmide. Dementsprechend enthält in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Fracht mindestens eine Verbindung, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polynucleotiden, Polypeptiden, Proteinen, kleinen organischen Molekülen, Metallen, Viren, modifizierten Viren, viralen Vektoren und Plasmiden. Vorzugsweise ist die Fracht ein Virus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenoviren, adenoassoziierten Viren, Herpesviren, Simplexvirus und Retroviren.

Das Lieferpeptid der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise mit der Fracht mittels eines beliebigen aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren wie chemische Quervernetzungen, Avidin-Brücke, Glutathion-S-Transferase-Brücke, Verbindung enthaltend mindestens eine Disulfid-Brücke, Peptid-Fracht-Fusionsproteine etc. verbunden, ohne darauf beschränkt zu sein.

Vorzugsweise werden verschiedenerlei funktioneller Gruppen wie Hydroxyl, Amino, Halogen etc., welche auf der Oberfläche der Fracht vorkommen, als Angriffspunkt benutzt, um daran eine passende Komplexierungsgruppe anzuheften. Beispielsweise wird eine Hydroxylgruppe modifiziert, um eine acidische Phosphatgruppe einzubauen.

In einer weiteren bevorzugten Variante beinhaltet die Verbindung eine Disulfid-Brücke. In einer weiteren Variante beinhaltet die Verbindung eine Streptavidin-Biotin-Komplex. Vorzugsweise ist das Lieferpeptid biotinyliert und das Frachtmolekül mit Avidin markiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Lieferpeptide der vorliegenden Erfindung mit der Fracht über einen spaltbaren Linker verbunden.

Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen wird die Fracht modifiziert, um eine funktionelle Gruppe wie eine Carboxylsäuregruppe, ein Phosphat oder Phosphatester, eine Sulfonsäuregruppe und dergleichen zu beinhalten. Vorzugsweise wird die Fracht modifiziert, um eine geeignete Gruppe zu beinhalten, indem die Gruppe über einen Linker an die Fracht angebracht wird. Vorzugsweise ist dieser Linker ein spaltbarer Linker, der den biologischen Wirkstoff freisetzen kann. Besonders bevorzugt wird die Fracht unter Verwendung einer Reihe aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren modifiziert. Dies geschieht entweder direkt, zum Beispiel mittels Carbodiimid oder mittels zumindest einer Verbindungsgruppe. Insbesondere werden Carbamat-, Ester-, Thioether-, Disulfid- und Hydrazon-Verbindungen erzeugt. Ester- und Disulfid-Verbindungen werden bevorzugt, falls vorgesehen ist, dass die Verbindung im Cytosol unmittelbar nach dem Transport des Stoffs über die Zellmembran abgebaut wird.

Obwohl die vorliegende Erfindung weiterentwickelte Lieferproteine betrifft, welche ein Minimum an Wechselwirkung oder sogar gar keine Wechselwirkung mit der Fracht bedingen, ist in einigen wenigen Fällen ein erheblicher Anteil der topologischen Oberfläche eines Frachtmoleküls öfters in die Protein-Fracht-Verbindung mit einbezogen. In Bezug auf die biologische Aktivität ist es daher notwendig, dass der Frachtanteil des Protein-Fracht-Komplexes möglicherweise vom anhängenden Lieferprotein und der Verbindungsgruppe (sofern vorhanden) getrennt wird, damit die Fracht biologische Aktivität entfalten kann sobald sie die biologische Barriere überquert hat oder in eine Zielzelle eingedrungen ist. Für diese Situationen enthält der Protein-Fracht-Komplex beziehungsweise das Protein-Fracht-Konjugat vorzugsweise einen spaltbaren Linker um den freien Wirkstoff nach Passieren der biologischen Barriere oder der Zellmembran freizusetzen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Fracht im Wesentlichen jeder biologisch aktiver Wirkstoff oder Molekül für Diagnostik.

In einigen bevorzugten Ausführungsformen wird der biologisch aktive Wirkstoff in seiner unmodifizierten Form verwendet. In anderen bevorzugten Ausführungsformen hingegen wird, um den Peptid-Fracht-Komplex zu verbessern, der Wirkstoff modifiziert, damit eine geladene (typischerweise acidische) Gruppe enthalten ist. Der hier verwendete Begriff „biologisch aktiver Wirkstoff" schließt sowohl Wirkstoffe in ihrer unmodifizierten Form als auch Wirkstoffe ein, die modifiziert wurden, beispielsweise Wirkstoffvorläufer, und verminderte oder verstärkte Aktivität und/oder verminderte oder verstärkte Bindungskinetiken im Vergleich zum ursprünglichen Wirkstoff aufweisen.

Kleine organische Moleküle, sogenannte „small organic molecules", die auch als kleine Moleküle, sogenannte „small molecules" bezeichnet werden, sind therapeutisch nützlich und schließen vorzugsweise ein: Pharmazeutika oder andere biologisch oder therapeutisch aktive Wirkstoffe, welche derart wirken, dass sie das fehlerfreie Funktionieren einer Zelle gewährleisten, oder, in Fällen, in denen der Tod einer Zelle wie einer Krebszelle gewünscht wird, Moleküle, welche möglicherweise Apoptose oder Zelllyse auslösen können. Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist besonders vorteilhaft, um kleine organische Moleküle zu befördern, die geringe Löslichkeiten in wässrigen Medien wie Serum oder Saline aufweisen. Daher können Wirkstoffe, deren therapeutische Wirksamkeiten aufgrund ihrer geringen Löslichkeit begrenzt sind, gemäß der vorliegenden Erfindung in höheren Dosierungen verabreicht werden. Aufgrund der erhöhten Aufnahmerate in die Zellen, können sie, gerechnet auf ihren molaren Anteil, in der verbundenen Form wirksamer sein, als in der nicht verbundenen Form.

Beispielhaft für solche kleinen organischen Moleküle, welche bevorzugte Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Verfahren erzeugen, sind Taxane. Der Komplex weist im Vergleich zu nichtkomplexierten Formen gesteigerte transepitheliale Gewebetransportraten auf und ist besonders geeignet, das Wachstum von Krebszellen zu hemmen. Es wird davon ausgegangen, dass Taxane und Taxoide ihre krebshemmenden Eigenschaften darin begründen, dass sie die Polymerisation von Mikrotubili steigern (und die Depolymerisation hemmen), und zwar zu einem Grad, der für die Zellfunktion schädlich ist, was die Replikation der Zelle hemmt und schließlich zum Zelltod führt. Der hier verwendete Begriff „Taxan" bezieht sich auf Paclitaxel, F, R' = Acetyl, R'' = Benzyl, auch bekannt unter dem Handelsnamen „TAXOL", sowie seinen natürlich vorkommenden, synthetischen oder mittels „Bioengineering" hergestellten Analogen. Vorzugsweise ist das Lieferpeptid mit einem modifizierten Taxan oder Taxoid verbunden, das modifiziert wurde, um eine Säuregruppe, beispielsweise Phosphat, zu beinhalten.

Als weiteres Beispiel werden hochgeladene Wirkstoffe wie Levodopa (L-3,4-Dihydroxylphenylalanin, L-DOPA) als Fracht mit dem erfindungsgemäßen Lieferprotein verbunden. Peptoide und peptidomimetische Wirkstoffe sind als Fracht ebenso vorgesehen.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Makromoleküle als Fracht über eine oder mehrere Schichten eines epithelialen oder endothelialen Gewebes transportiert. Ein Beispiel dafür sind Proteine und insbesondere Enzyme. Therapeutische Proteine, die als Fracht eingesetzt werden, schließen auch Austauschenzyme ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.

Beispielsweise schließen die therapeutischen Enzyme als Fracht ein, sind nicht aber beschränkt darauf: Alglucerase, zur Verwendung bei der Behandlung lysosomalen Glucocerebrosidasemangels (Morbus Gaucher), alpha-L-Iduronidase zur Verwendung bei der Behandlung der Mucopolysaccharidose I, alpha-N-Acetylglucosamidase zur Verwendung bei der Behandlung des Sanfilippo B-Syndroms, Lipase zur Verwendung bei der Behandlung von Pankreasinsuffizienz, Adenosindeaminase zur Verwendung bei der Behandlung von schwerem kombiniertem Immunmangelsyndrom und Triosephosphatisomerase zur Ver wendung bei der Behandlung von neuromuskulären Störungen, die mit einem Triosephosphatisomerasemangel in Zusammenhang stehen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Lieferpeptid mit einer großen Vielfalt an Fracht, die eine diagnostische Verwendung hat, verbunden. Vorzugsweise ist die Fracht ein Mittel zur bildgebenden Diagnostik oder ein Kontrastmittel, welches, besonders vorteilhaft, gemäß der Erfindung auf eine oder mehrere Schichten einer biologischen Barriere, in diese oder über diese hinweg transportiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Lieferpeptid markiert mit Radioaktivität wie "mTc-Glucoheptonat oder mit Stoffen, die in bildgebenden Verfahren der magnetischen Resonanzspektroskopie (MRI) eingesetzt werden, wie gadoliniumdotieren Chelatbildnern, zum Beispiel Gd-DTPA. Weitere Beispiele diagnostischer Wirkstoffe, die als Fracht verwendet werden, schließen Markergene ein, die Proteine codieren, welche prompt detektiert werden können, sobald sie in einer Zelle exprimiert werden, eingeschlossen, aber nicht darauf beschränkt: β-Galactosidase, grünes Fluoreszenzprotein („green fluorescent protein"), Luciferase und ähnliche. Insbesondere ist die Fracht ausgewählt aus Metallen, Halogenen, Radionucliden, Fluorverbindungen, Enzymen, Enzymsubstraten, Enzymkofaktoren, Enzymhemmern, Liganden (insbesondere Haptenen) und ähnlichen.

Die vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen und Verfahren für eine Vielzahl an klassentherapeutischer Wirkstoffe bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein Wirkstoff, welcher mit dem Lieferprotein gemäß der Erfindung verbunden werden kann, um die Gewebedurchdringung des Wirkstoffs und seine Wirksamkeit wesentlich zu verbessern. Dies sind Verbindungen wie antibakterielle Wirkstoffe, antifungale Wirkstoffe, antivirale Wirkstoffe, antiproliferative Wirkstoffe, immunsupprimierende Wirkstoffe, Vitamine, Analgetika, Hormone und ähnliche.

Dementsprechend ist die Fracht in einer bevorzugten Ausführungsform ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus therapeutischen Proteinen, Suizidproteinen, tumorsupprimierende Proteine, Transkriptionsfaktoren, Kinasehemmer, Kinasen, regulatorischen Proteinen, apoptotischen Proteinen, antiapoptotischen Proteinen, viralen Antigenen, zellulären Antigenen, Differenzierungsfaktoren, Immortalisierungsfaktoren, Toxinen, Enzymen, Nucleinsäuren, Antisense-Konstrukten, Mitteln für bildgebende Verfahren oder Kontrastmitteln, Farbstoffen, antibakteriellen Wirkstoffen, antifugalen Wirkstoffen, antiviralen Wirkstoffen, antiproliferativen Wirkstoffen, Zytostatika, immunsupprimierenden Wirkstoffen, Vitaminen, Schmerzmitteln, Hormonen, entzündungshemmenden Wirkstoffen und Wirkstoffen gegen Altern.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein antibakterieller Wirkstoff, der in den vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren verwendet wird. Ein derartiger Wirkstoff beinhaltet die β-Lactam-Antibiotika und Quinolon-Antibiotika. Vorzugsweise ist die Fracht ein antibakterieller Wirkstoff, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nafcillin, Oxacillin, Penicillin, Amoxacillin, Ampicillin, Cephalosporin, Cefotaxim, Cetrifaxon, Rifampin, Minocyclin, Ciprofloxacin, Norfloxacin, Erythromycin, Tetracyclin, Gentamicin, einem Makrolid, einem Quinolon, einem β-Lacton, einem P-Lactamasehemmer, Salicylamid und Vanomycin. Besonders bevorzugt ist die Fracht ausgewählt aus Nafcillin, Oxacillin, Penicillin, Amoxacillin, Ampicillin, Cefataxim, Ceftriaxon, Rifampin, Minocyclin, Ciprofloxacin, Norfloxacin, Erythromycin, Vancomycin und deren Analogen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein antimikrobiell wirkendes Mittel, welches in den vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren verwendet wird. Vorzugsweise ist die Fracht ausgewählt aus Sulfanilamid, Sulfamethaoxazol, Sulfacetamid, Sulfisoxazol, Sulfadiazin, Penicillinen wie Penicillin G und V, Methicillin, Oxacillin, Naficillin, Ampicillin, Amoxacillin, Carbenicillin, Ticarcillin, Mezlocillin und Piperacillin, Cephalosporinen wie Cepha lothin, Cefaxolin, Cephalexin, Cedroxil, Cefamandol, Cefoxitin, Cefaclor, Cefuroxin, Loracarbef, Cefonicid, Cefotetan, Ceforanid, Cefotaxim, Cefpodoxim, Proxetil, Ceftizoxim, Cefoperazon, Ceftazidim und Cefepim, Aminoglycosiden wie Gentamycin, Tobramycin, Amikacin, Netilmicin, Neomycin, Kanamycin, Streptomycin und ähnliche, Tetracyclinen wie Chlortetracyclin, Oxytetracyclin, Demeclocylin, Methacyclin, Doxycyclin und Minocyclin sowie Macroliden wie Erythromycin, Clarithromycin und Azitromycin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein antifugal wirkendes Mittel, welches in den vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren verwendet wird. Vorzugsweise ist die Fracht ausgewählt aus Amphotericin, Itraconazol, Ketoconazol, Miconazol, Nystatin, Clotrimazol, Fluconazol, Ciclopirox, Econazol, Naftifin, Terbinafin und Griseofulvin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein antiviral wirkendes Mittel, welches in den vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren verwendet wird. Vorzugsweise ist die Fracht ausgewählt aus Acyclovir, Famiciclovir, Ganciclovir, Foscarnet, Idoxuridin, Sorivudin, Trifluridin (Trifluoropyridin), Valacyclovir, Cidofovir, Didanosin, Stavudin, Zalcitabin, Zidovudin, Ribavirin und Rimantatin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein antiproliferativ oder immunsupprimierend wirkendes Mittel, welches in den vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren verwendet wird. Vorzugsweise ist die Fracht ausgewählt aus Methotrexat, Azathiprin, Fluoruracil, Hydroxy-Harnstoff, 6-Thioguanin, Cyclosphosphamid, Mechloroethamin-Hydrochlorid, Carmustin, Cyclosporin, Taxol, Tacrolimus, Vinblastin, Dapson, Nedocromil, Cromolyn (Cromoglycinsäure) und Sulfasalazin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein Histaminrezeptoragonist oder -antagonist. Vorzugsweise ist die Fracht ausgewählt aus 2- Methylhistamin, 2-Pyridylethylamin, 2-Thiazolylethylamin, (R)-a-Methylhistamin, Impromidin, Dimaprit, 4(5)-Methylhistamin, Diphenhydramin, Pyrilamin, Promethazin, Chlorpheniramin, Chlorcyclizin, Terfenadin und ähnlichen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein bei der Behandlung von Asthma nützliches Mittel. Vorzugsweise ist die Fracht ausgewählt aus Corticosteroiden einschließlich Beclomethason, Budesonid und Prednison, als auch Cromolyn, Nedocromil, Albuterol, Bitolterolmesylat, Pirbuterol, Salmeterol, Terbutylin und Theophyllin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein Vitamin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein schmerzstillend wirkendes Mittel, eingeschlossen Lidocain, Bupivacain, Novocain, Procain, Tetracain, Benzocain, Cocain, Mepivacain, Etidocain, Proparacain, Ropivacain, Prilocain und ähnliche.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein antineoplastisch wirkendes Mittel, das in den vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren verwendet wird. Vorzugsweise ist die Fracht ausgewählt aus Pentostatin, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, Methotrexat, Bleomycinen, Etoposid, Teniposid, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Mitoxantron, Hydroxy-Harnstoff, 5-Fluorouracil, Cytarabin, Fludarabin, Mitomycin, Cisplatin, Procarbazin, Dacarbazin, Paclitaxel, Colchicin, Vincaalkaloiden und ähnlichen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein Hormon ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gewebshormonen, insbesondere Prostaglandin, Serotonin, Histamin, Bradykinin, Kallikrein sowie gastrointestinalen Hormonen, Releasinghormonen, Hormonen der Hypophyse, Insulin, Vasopressin (ADH), Glucagon, Ekephalin, Calcitonin und Corticosteroiden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Lieferpeptid mit als Fracht dienenden Nucleinsäuren verbunden, welche ein Protein, RNS, Ribosomen oder Antisense-RNS codieren. Das Protein, RNS oder Ribosom, welches von dem Nucleinsäuremolekül codiert wird, kann unterrepräsentiert oder funktionslos sein oder es kann in der Zelle gar nicht vorkommen. Die durch das Nucleinsäuremolekül codierte Antisense-RNS kann vorgesehen sein, um das Auslöschen einer unerwünschten Funktion eines Moleküls zu ermöglichen.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Peptide der vorliegenden Erfindung als Fusionsmolekül mit einem Peptid synthetisiert, insbesondere mit einem Peptidnucleinsäuremolekül (PNA), welches ein DNS-Wirkanalog ist mit der Fähigkeit, Doppel- und Trippelhelices mit DNS zu bilden. Ein derartiges Peptid-PNA-Fusionsmolekül kann stabile DNS- oder RNS/PNS-Duplexmoleküle erzeugen, welche über die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung in die Zelle eindringen können und dabei die DNS oder RNS zur Zielzelle befördern.

Dementsprechend schließt die Fracht auch Nucleinsäuren, einschließlich aus DNS und RNS gebildete Oligonucleotide und Polynucleotide sowie deren Analoge, ein, die ausgewählte Sequenzen aufweisen. Diese Sequenzen wurden für die Hybridisierung mit komplementären Zielstrukturen wie Antisense-Sequenzen für einzel- oder doppelsträngige Ziele, oder zur Expression von durch diese Sequenzen codierten Nucleinsäuretranskripten oder Proteinen entworfen. Analoge dazu schließen Analoge mit geladenem oder bevorzugt ungeladenem Gerüstmolekül wie Phosphonate, Methylphosphonate, Phosphoramidate, insbesondere N-3' oder N5', Thiophosphate, ungeladene Morpholinbasierte Polymere und Proteinnucleinsäuren (PNAs) ein. Derartige Moleküle können in einer Vielzahl therapeutischer Anwendungen eingesetzt werden. Diese schließen beispielsweise Enzymaustauschtherapie, Gentherapie und Antisense-Therapie mit ein.

So stellen zum Beispiel Proteinnucleinsäuren (PNA) Analoge von DNS dar, worin das Gerüstmolekül in seiner Struktur mit einem Desoxyribose-Gerüstmolekül homomorph ist. Das Gerüstmolekül besteht aus N-(2-Aminomethyl)glycin-Einheiten, woran die Nucleobasen gebunden sind. PNAs, die alle vier natürlich vorkommenden Nucleobasen enthalten, hybridisieren mit komplementären Oligonucleotiden gemäß den Basenpaarungsregeln der nach Watson & Crick. In Bezug auf die Basenpaarerkennung sind sie echte DNS-Wirkanaloge (Egholm et al. (1993) Nature 365: 566–568). Das Gerüstmolekül eines PNA wird gebildet aus Peptidbindungen an Stelle der Phosphatester, wodurch es für Antisense-Anwendungen gut geeignet ist. Da das Gerüstmolekül ungeladen ist, weisen die gebildeten PNA/DNS- oder PNA/RNS-Duplexmoleküle eine thermische Stabilität auf, die über der normalen liegt. PNAs weisen zusätzlich den Vorteil auf, dass sie von Nucleasen oder Proteasen nicht erkannt werden. Darüber hinaus können PNAs unter Verwendung eines t-Boc-Standardchemismus in einem automatischen Peptidsynthesizer synthetisiert werden. Die PNA wird anschließend mit dem erfindungsgemäßen Transportpolymer verbunden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Lieferpeptid verbunden mit „Scheinoligonucleotiden", sogenannten „decoy-Oligonucleotiden", die vorzugsweise spezifische Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren enthalten und die Funktion der Transkriptionsfaktoren in vitro und in vivo blockieren können.

Ist die Fracht ein Polypeptid, ist das Polypeptid vorzugsweise ein Peptid oder Protein welches, insbesondere wenn es über die biologische Barriere hinweg oder zur Zielzelle hin geliefert wird, der Zelle eine gewünschte Funktion vermittelt oder eine besondere Änderung des Phänotyps auslöst. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Protein oder Peptid ein Antigen, welches in der Lage ist, eine Immunantwort in der Zelle auszulösen.

Die Lieferpeptide der vorliegenden Erfindung sind auch geeignet, um Fracht in Zellen in vivo zu liefern und um, in situ oder lokalisiert, die Lieferung von Fracht in vivo zu erleichtern. Die Lieferpeptide der vorliegenden Erfindung erleichtern auch den Transport einer Fracht in den Zellkern, die sogenannte „nuclear translocation". Insbesondere ermöglichen die Lieferpeptide den Eintritt der peptidgebundenen Fracht und den Transport der Fracht in die Zellkerne.

Die Lieferproteine der vorliegenden Erfindung erleichtern, besonders vorteilhaft, die Aufnahme und die Beförderung in eine Vielzahl verschiedener Zelltypen, eingeschlossen Zellen, welche gegenüber einer Virusinfektion widerstandsfähig sind, wie menschliche primäre Epithelzellen der Luftwege, des Bronchial- oder Lungenepithels sowie andere Typen primärer Zellen oder etablierter Zelllinien wie Zellen der Synovialis (menschlich oder tierisch), primäre menschliche Inselzellen, Myoblastzellen, Nierenepithelzellen, Fibroblastzellen, Tumorzellen, Zellen der verschiedenen Keimblätter oder der Schleimhaut wie der Cervixschleimhaut. Da die Peptide der vorliegenden Erfindung die Aufnahme einer Fracht in Zellen der Synovialis in vivo verbessern, sind diese Peptide insbesondere für die Linderung der Arthritis geeignet. Ein Ansatz, rheumatoide Arthritis in einem Patienten zu lindern, besteht darin, den Tod von Zellen der Synovialis hervorzurufen. Die Peptide der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, Apoptose insbesondere in Zellen der Synovialis hervorzurufen, wenn sie beispielsweise an einen Apoptosefaktor gebunden sind, zum Beispiel B-53, Caspase oder ein antimikrobielles Peptid.

Die Peptide gemäß der Erfindung sind weiter geeignet, den Apoptosefaktor oder eine DNS, welche einen Apoptosefaktor codiert, in Gewebe wie arthritische Gelenke zu befördern und darin Apoptose auszulösen. Die Peptide der vorliegenden Erfindung sind weiter nützlich, um Apoptosefaktoren in Tumorzellen zu befördern und darin Apoptose auszulösen, insbesondere in Tumorzellen, bei denen sich in bei einer Reihe bekannter Behandlungen herausgestellt hat, dass sie gegenüber der Apoptose resistent sind.

Proteinasen, insbesondere Serinproteinasen und neutrale Metalloproteinasen, sind am Abbau von Gelenkknorpel beteiligt. Mesenchymale Zellen der Gelenkverbindung und weiße Blutzellen, die das Gelenk während einer Entzündungsantwort, beispielsweise bei rheumatoider Arthritis, besiedeln, produzieren verschiedene Proteinasen, die den Gelenkknorpel abbauen. Daher stellt die Verminderung der Zahl weißer Blutzellen am Entzündungsort in arthritischen Gelenken einen Ansatz zur antierosiven Therapie bei Arthritis dar. Die Lieferproteine der vorliegenden Erfindung sind nützlich bei der Beförderung apoptotischer Faktoren zu Zellen in arthritischen Gelenken, einschließlich weißer Blutzellen, beispielsweise in Lavageflüssigkeit entzündeter arthritischer Gelenke. Sie verursachen eine starke Verminderung der Zahl weißer Blutzellen, beispielsweise in der Lavageflüssigkeit von IL-1-entzündeten Gelenken. Die Verminderung der Zahl weißer Blutzellen ist auch nützlich, um in arthritischen Gelenken Schwellungen, synoviales Wachstum und Knorpelabbau zu vermindern.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Lieferpeptide mit therapeutischen Proteinen, nämlich Wachstumsfaktoren und Cytokine, welche als Fracht dienen, verbunden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein therapeutisch wirksames Mittel um ein Leiden zu behandeln, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus entzündlichen und degenerativen Erkrankungen der Gelenke und des Rückenmarks, Arthritis, insbesondere Osteoarthritis, Kreuz- beziehungsweise Lendenschmerz sowie zur Knochenwiederherstellung, Heilung von Knochenbrüchen und Therapie von Verletzungen der Muskeln und der Ligamente. Insbesondere ist die Fracht ausgewählt aus IL-1Ra, STNF-R(p55), STNF-R(p75), SIL-1R Typ I, SIL-1R Typ II, BMP-2, BMP-6, BMP-7, LMP-1, LMP-3, IGF-1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, IL-4, IL-10, CTLA4, CD30, TIMP-1, IFN-β, Sox-9 und PDGF. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Wachstumsfaktoren und Cytokine allein mittels der Peptide der vorliegenden Erfindung an das Zielgewebe oder die Zielzelle verabreicht; eine Verabreichung zusammen mit jeder anderen bekannten Weise der Verabreichung ist aber ebenfalls vorgesehen.

Die Peptide der vorgesehenen Erfindung sind auch nützlich, um verbesserte Immunogene zu entwickeln. Beispielsweise erleichtern die Peptide der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise die Beförderung von Proteinen, Polypeptiden, DNS, RNS, Vektoren und Viren, welche als Immunogene nützlich sind, zu Zielzellen in einem tierischen oder menschlichen Körper. Die Peptid-Fracht-Komplexe der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, eine Immunantwort auszulösen, wenn sie an eine Zielzelle eines tierischen oder menschlichen Körpers verabreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind solche Immunogene Impfstoffe, insbesondere ein Impfstoff für HIV. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Frachtanteil des als Immunogen wirkenden Peptid-Fracht-Komplexes ein Antigen wie ein HIV-Hüllprotein, gag, pol, env, tat, nef, vpr, vpv und rev.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Gegenstand der Erfindung eingesetzt, um immunspezifische Antikörper oder Antikörperfragmente in das Cytosol zu befördern, um zerstörerische biologische Prozesse wie eine mikrobielle Infektion zu unterbinden. Kürzlich durchgeführte Experimente haben gezeigt, dass intrazelluläre Antikörper wirksame antiviral wirkende Mittel in Pflanzen und Säugetierzellen sein können.

Im Gegensatz zu den typischerweise verwendeten einkettigen Fragmenten der variablen Region (scFv), worin leichte und schwere Ketten des Antikörpers als ein einziges Polypeptid synthetisiert sind, wird das erfindungsgemäße Lieferpeptid mit solchen scFv-Fragmenten komplexiert. Besonders vorteilhaft wird so der Grad der zellulären Aufnahme erhöht, was ermöglicht, dass die immunospezifischen Fragmente binden können und wichtige mikrobielle Komponenten wie HIV-Ref, die reverse Transkriptase des HIV und Integraseproteine in ihrer Funktion ausschalten können.

Als Fracht eingesetzte Peptide schließen auch Effektorpolypeptide, Rezeptorfragmente und ähnliche ein. Die Fracht ist vorzugsweise aus Peptiden ausgewählt, die Phosphorylierungsstellen aufweisen, die von Proteinen verwendet werden, die intrazelluläre Signale vermitteln. Solche als Fracht dienende Proteine schließen ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Proteinkinase C, RAF-1, p21Ras, NF-KB, C-JUN und cytoplasmatische Enden von Membranrezeptoren wie dem IL4-Rezeptor, CD28, CTLA-4, V7 sowie MHC-Klasse I- und Klasse II-Antigene.

Vorzugsweise wird der Vorgang des Auslösens einer Immunantwort in einem tierischen oder menschlichen Körper verwirklicht durch ex vivo-Transduktion der Zielzellen mit anschließender Präsentation der transduzierten Zellen in einem Patienten, beispielsweise durch intramuskuläre oder intradermale Injektion.

In einer bevorzugten Ausführungsform, ist das Proteinantigen ein Tumorantigen, um eine Immunantwort gegen Tumorzellen auszulösen und zu unterstützen. Der Transport isolierter oder löslicher Proteine in das Cytosol von APC mit anschließender Aktivierung von CTL ist außergewöhnlich, da, mit wenigen Ausnahmen, die Injektion isolierter oder löslicher Proteine weder die Aktivierung von APC noch die Induktion von CTLs zur Folge hat. Daher können Antigene, die mit den transportverbessernden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung komplexiert sind, dazu dienen, eine zelluläre Immunantwort in vitro oder in vivo zu stimulieren.

Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung werden Proteinantigene, die als Cargo dienen, in das cytosolische Kompartiment antigenpräsentierender Zellen (APCs) befördert, wo sie zu Peptiden abgebaut werden. Die Peptide werden daraufhin in das endoplasmatische Retikulum transportiert, wo sie mit naszierenden HLA-Klasse I-Molekülen in Verbindung treten und auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Derartige „aktivierte" APCs können als Auslöser Klasse I-restrigierter antigenspezifischer cytotoxischer T-Lymphozyten (CTLs) dienen, welche daraufhin zur Erkennung und Zerstörung derdas ausgewählte Antigen präsentierender Zellen schreiten. APCs, welche in der Lage sind, dieses Verfahren durchzuführen, schließen bestimmte Makrophagen, B-Zellen und dentritische Zellen ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.

In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet das Verfahren zum Auslösen einer Immunantwort in einem tierischen oder menschlichen Körper das Verabreichen eines Peptid-Fracht-Komplexes der vorliegenden Erfindung auf eine Zielzelle in vitro, in vivo oder ex vivo, wobei die Fracht ein Antigen ist. Die Peptid-Fracht-Komplexe der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt auf eine Vielzahl verschiedener Zelltypen in vivo, in vitro und ex vivo mittels dem Fachmann bekannten Verfahren verabreicht. Diese Zelltypen schließen epitheliale Zellen, Tumorzellen, Hepatozyten, endotheliale Zellen, Neuronen, Muskelzellen, T-Zellen, dentritische Zellen, β-Zellen, primäre Zellen, ausdifferenzierte Zellen, Stammzellen, antigenpräsentierende Zellen, Zellen der Schleimhaut etc. ein.

Falls die Peptid-Fracht-Komplexe der vorliegenden Erfindung an Stammzellen wie hämatopoetischen Zellen, Muskel, Gehirn etc. verabreicht werden, können sie die Differenzierung der Stammzellen auslösen. Der Peptid-Fracht-Komplex enthält Faktoren, welche die Stammzelldifferenzierung auslösen können, wie den Transkriptionsfaktor MyoD. Es konnte gezeigt werden, dass Stammzellen, die aus Knochenmark isoliert wurden, in eine Vielzahl verschiedener Gewebe differenzieren können, eingeschlossen Knorpel und Knochen, und sind daher möglicherweise therapeutisch nützlich (Pittenger et al. Science (1999) 284: 143).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Peptid-Fracht-Komplex verwendet, um eine Stammzellpopulation zu expandieren. Die internalisierenden Peptide der vorliegenden Erfindung können Proteine zu CD34⁺ hä matopoetischen Vorläuferstammzellen befördern. Die Beförderung immortalisierender Proteine wie dem SV40 T-Antigen, HPV E6, HPV E7 und Telomerase können eine transiente Expansion von Stammzellpopulationen erleichtern.

Da die Beförderung der immortalisierenden Proteine unter Verwendung der Peptide der vorliegenden Erfindung transient und reversibel ist, zum Beispiel die Beförderung des immortalisierenden Proteins, welches anschließend in der Zelle abgebaut wird, bietet eine derartige Beförderung den dahingehenden Vorteil, dass der Stammzellstatus erhalten bleiben kann. Das heißt, die Zellen können transient immortalisiert werden, während gleichzeitig die erzielbare Zahl an Zellverdopplungen erhöht wird. Eine stabile Beförderung immortalisierender Faktoren kann auch durch die Beförderung einer den immortalisierenden Faktor codierenden Fracht erreicht werden, beispielsweise einem viralen Vektor, Plasmid oder DNS. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dieser Ansatz zur Expansion einer großen Vielzahl von Stammzellen in Kultur für Transplantationsanwendungen eingesetzt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Peptide der vorliegenden Erfindung verwendet, um differenzierte Zellen zu expandieren, beispielsweise Neuronen, Chondrocyten etc., welche in Kultur meist eine endliche Anzahl an Zellverdopplungen aufweisen. Die Proliferation differenzierter Zellen kann durch die Beförderung von immortalisierender Faktoren ausgelöst werden, vorzugsweise SV40 T-Antigen, HPV E6, HPV E7 oder Telomerase.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Konstrukts enthaltend das Peptid der vorliegenden Erfindung, welches an ein Antigen gebunden ist, wobei es von einer Reihe antigenpräsentierender Zellen wie dendritischen Zellen, sowohl in vivo als auch in vitro in effizienter Weise aufgenommen werden kann und eine Immunantwort auslöst. Die Peptide können mit viralen Antigenen verbunden sein oder damit einen Komplex bilden, wie dem adenoassoziierten Virus (AAV) Rep Protein, SIV Antigenen oder HIV Anti genen wie gag, pol, env, HPV-E6, HPV-E7, EBV-LMP1, EBV-LMP2, EBNA1, EBNA3A, EBNA3C etc., Ovalbumin, Differenzierungsantigenen wie MART-1/Melan A, gpIOO, Tyrosinase, TRP-1, TRP-2 etc., tumorspezifischen „multilineage"-Antigenen wie MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15 etc. sowie Antigenen, die einzig von einem Tumor eines bestimmten Individuums expremiert werden wie mutierte Genprodukte wie p53, CDK4, p16, p21 etc.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung, kann die Immunantwort gegen Tumore verstärkt werden, indem die Peptide der vorliegenden Erfindung welche an eine Fracht, beispielsweise ein Apoptosefaktor, gebunden sind in Form eines Protein-Fracht-Komplexes zusammen mit beispielsweise Cytokinen und/oder anderen aktivierenden Molekülen verabreicht wird. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Cytokine und andere aktivierenden Moleküle mittels der Peptide der vorliegenden Erfindung verabreicht werden, aber auch durch jede andere gängige Verabreichungsweise.

Weitere mögliche Anwendungsgebiete der Peptide der vorliegenden Erfindung schließen, wenn diese, insbesondere in Form des erfindungsgemäßen Peptid-Fracht-Komplexes, an eine Fracht gebunden sind, die Behandlung von zugänglichen Kopf- und Halstumoren, Papylomen und anderen festen Tumoren ein, wobei die Fracht einen Apoptosefaktor beinhaltet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Peptid-Fracht-Komplex der vorliegenden Erfindung verwendet, um als Zusatztherapie in Verbindung mit Strahlentherapie oder regulärer Chemotherapie zu fungieren, oder um im Zusammenhang mit der operativer Entfernung die Excisionsränder zu erweitern.

Die vorliegende Erfindung ist darüber hinaus auf die Förderung des Wachstums von Defektviren wie HSV in Kultur gerichtet. Das Erzeugen von Defektviren ist in Anwendungen der Gentherapie nützlich. Defektviren replizieren nicht ohne die Hilfe notwendiger Replikationsproteine wie ICPO, ICP4, ICP22 und ICP27, die von derartigen Defektviren nicht codiert werden. In einer Ausfüh rungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Virus mit Replikationsdefekt in Zellen gezüchtet, indem die Zellen mit dem Defektvirus infiziert werden und ein oder mehrere Komplexe enthaltend ein Peptid der vorliegenden Erfindung welches an ein Protein, das für die Replikation des Defektvirus notwendig ist, gebunden ist, verabreicht werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung werden Metalle als Fracht vorzugsweise in eine oder mehrere Schichten epithelialer und endothelialer Gewebe oder über diese hinweg transportiert, wobei Chelatbildner wie Texaphyrin oder Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und das Lieferprotein eingesetzt werden. Diese Verbindungen sind für die Beförderung von Metallionen für bildgebende Verfahren oder zum Zwecke der Therapie nützlich. Beispielsweise schließt eine solche Fracht Metallionen wie Eu, Lu, Pr, Gd, ^99mTc, ⁶⁷Ga, ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu und ⁵⁷Co ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Metall in das Lieferpeptid selbst eingeschlossen oder es ist als Fracht mit dem Protein verbunden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung sind als Fracht auf Bor basierende Reagenzien wie diejenigen, die in der Bor-Neutronenfänger-Therapie eingesetzt werden, eingeschlossen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Borspezies in das Lieferprotein selbst eingebaut oder sie ist als Fracht mit dem Protein verbunden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein Wirkstoff gegen Altern, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Retinsäure, Hyaluronsäure, Collagen und freien Radikalfängern, insbesondere SOD.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein Therapeutikum, welches zur Behandlung von Ulcus eingesetzt wird, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem H2-Histaminhemmer, einem Hemmer der Wasserstoff-Kalium ATPase und einem Antibiotikum gegen Helicobacter pylori.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein therapeutischer Wirkstoff, welcher zur Behandlung eines Bronchialleidens verwendet wird, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus zystischer Fibrose, Asthma, allergischem Schnupfen und chronischer Lungenobstruktion.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein therapeutischer Wirkstoff, der verwendet wird zur Behandlung von Ischämie, Parkinsonscher Krankheit (Morbus Parkinson), Schizophrenie, Krebs, erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS), Infektionen des zentralen Nervensystems, Epilepsie, multipler Sklerose, neurodegenerativer Erkrankungen, Trauma, Depression, Alzheimerscher Krankheit (Morbus Alzheimer), Migräne, Schmerz und Anfallsleiden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Fracht ein therapeutischer Wirkstoff, der verwendet wird zur Behandlung von Glucocerebrosidasemangel (Morbus Gaucher), Mucopolycaccharidose I, Sanfilippo B-Syndrom, Pankreasinsuffizienz, schwerem kombinierten Immunschwächesyndrom sowie neuromuskulärer Funktionsstörung, welche mit Triosephosphatisomerasemangel in Verbindung steht.

Das technische Problem wird weiter gelöst durch die Verwendung des Peptids zur Aufnahme, der sogenannten „Internalisierung", eines daran gebundenen Frachtmoleküls in eine Zelle („cellular internalisation") sowie durch die Verwendung des Peptids zur Herstellung eines Kits für die Aufnahme eines daran gebundenen Frachtmoleküls in Zellen in einem tierischen oder menschlichen Körper.

Das technische Problem wird weiter gelöst durch die Verwendung des Peptids zum Transport in den Zellkern einer Zielzelle („nuclear translocation") sowie durch die Verwendung des Peptids zur Herstellung eines Kits für den Transport in den Zellkern einer Zielzelle in einem tierischen oder menschlichen Körper.

Das technische Problem wird weiter gelöst durch die Verwendung des Peptids zum Transport („translocation") in die Mitochondrien einer Zielzelle sowie durch die Verwendung des Peptids zur Herstellung eines Kits zum Transport in die Mitochondrien einer Zielzelle in einem tierischen oder menschlichen Körper.

Das technische Problem wird weiter gelöst durch die Verwendung des Peptids zur Behandlung von Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Ulkus des Magen-Darm-Trakts, peptischem Ulkus, Krankheiten, die auf eine krankhafte Gewebewucherung zurückgehen, einer Infektion mit Helicobacter pylori, zystischer Fibrose, Asthma, allergischem Schnupfen, chronischer Lungenobstruktion, Ischämie, Morbus Parkinson, Schizophrenie, Krebs, erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS), Infektionen des zentralen Nervensystems, Epilepsie, multipler Sklerose, neurodegenerativer Erkrankungen, Trauma, Depression, Morbus Alzheimer, Migräne, Schmerz und Anfallsleiden, sowie durch die Verwendung einer Zusammensetzung, insbesondere einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder einem Medikament zur Behandlung dieser Krankheiten in einem tierischen oder menschlichen Körper.

Das technische Problem wird weiter gelöst durch die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltend

– einen Peptid-Fracht-Komplex, der eine wirksame Menge eines biologisch aktiven oder therapeutsichen Wirkstoffs enthält, und
– einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

Das technische Problem wird weiter gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Beförderung einer Fracht an die Oberfläche einer biologischen Barriere, in die biologischen Barriere oder über sie hinweg, enthaltend die Schritte der

a) Bereitstellung einer Fracht und mindestens eines Lieferpeptids gemäß der Erfindung,
b) Erzeugen eines Peptid-Fracht-Komplexes,
c) Inkontaktbringen des Peptid-Fracht-Komplexes mit der Barriere und
d) Befördern der Fracht an die Oberfläche der Barriere, in die Barriere oder über sie hinweg.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist diese Barriere eine intakte epitheliale oder endotheliale Gewebeschicht oder -schichten. Vorzugsweise ist die Barriere die Haut. Vorzugsweise wird die Fracht in eine oder mehrere der Schichten Stratum corneum, Stratum granulosum, Stratum lucidum und Stratum germinativum und/oder über diese hinweg befördert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Inkontaktbringen des Peptid-Fracht-Komplexes mit der Haut dadurch bewerkstelligt, dass eine Zusammensetzung enthaltend den Peptid-Cargo-Komplex topisch auf die Haut verabreicht wird, wobei insbesondere die Fracht von denjenigen Zellen aufgenommen wird, welche die follikuläre oder interfollikuläre Epidermis bilden. Vorzugsweise ist die Zusammensetzung eine Creme, ein Unguentum, eine Salbe, eine Lotion oder ein transdermales Pflaster.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Barriere der Magen-Darm-Trakt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Barriere das Lungenepithel. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Barriere die epitheliale Blut-Hirn-Schranke.

Das technische Problem wird weiter gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zum Auslösen des Zelltods der Zellen der Synovialis, d. h. synoviale Zellen, enthaltend den Schritt des Verabreichens des Peptid-Cargo-Komplexes auf die Zellen der Synovialis sowie durch die Verwendung des Peptid-Cargo-Komplexes zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Auslösen des Zelltods der Zellen der Synovialis in einem tierischen oder menschlichen Körper.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auslösen von Apoptose in einer Tumorzelle, enthaltend den Schritt des Verabreichens des Peptid-Fracht-Komplexes, welcher insbesondere ein apoptotisches Protein enthält, auf die Tumorzellen sowie durch die Verwendung des Peptid-Fracht-Komplexes, insbesondere enthaltend ein apoptotisches Protein, zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Auslösen von Apoptose in einer Tumorzelle in einem tierischen oder menschlichen Körper.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduktion der Zahl weißer Blutzellen in arthritischen Gelenken, enthaltend den Schritt des Verabreichens des Peptid-Fracht-Komplexes auf die weißen Blutzellen sowie durch die Verwendung des Peptid-Cargo-Komplexes zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verringerung der Zahl weißer Blutzellen in arthritischen Gelenken in einem tierischen oder menschlichen Körper.

Eine weitere Zusammensetzung der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verminderung der Auswirkungen des Alterns der Haut, enthaltend den Schritt des Verabreichens des Peptid-Fracht-Komplexes, insbesondere enthaltend einen Wirkstoff gegen Altern, auf die Haut sowie durch die Verwendung des Peptid-Cargo-Komplexes, insbesondere enthaltend einen Wirkstoff gegen Altern, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verringerung der Auswirkungen der Hautalterung in einem tierischen oder menschlichen Körper. Vorzugsweise bildet oder enthält die Zusammensetzung eine Creme, ein Unguentum, eine Salbe oder eine Lotion.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auslösen einer Immunantwort in einem tierischen oder menschlichen Körper, enthaltend den Schritt des Verabreichens eines Immunogens enthaltend den Peptid-Fracht-Komplex auf eine Zielzelle dieses Körpers sowie durch die Verwendung des Peptid-Fracht-Komplexes zur Herstellung eines Immunogens zum Auslösen einer Immunantwort in einem tierischen oder menschlichen Körper.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Fusionsproteine. Beispielsweise finden GST-Fusionsproteine aufgrund der Einfachheit der Expression und Aufreinigung solcher Fusionsproteine eine breite Anwendung in der Forschung, um verschiedene Proteine zu untersuchen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Peptide der vorliegenden Erfindung verwendet, um ein oder mehrere GST-Fusionsproteine zu Zellen zu befördern. Die Peptide der vorliegenden Erfindung, insbesondere wenn sie an Glutation gebunden sind, erleichtern die Lieferung von GST-Fusionsproteine in eine Zielzelle. Derartige bevorzugte Glutation-Peptid-Konstrukte binden an jedes GST-Fusionsprotein und erleichtern das Einbringen des GST-Fusionsproteins in eine Zelle.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine Expressionskassette, welche eine Nucleinsäure, die ein Fusionsprotein, enthaltend eine Leader-Sequenz, ein internalisierendes Peptid der vorliegenden Erfindung und ein interessierendes Protein, funktionell verbunden mit Expressionssteuersequenzen, enthält. Ein derartiges Fusionsprotein ist über die Leader-Sequenz oder das internalisierende Lieferpeptid der vorliegenden Erfindung zu posttranslationalem interzellulären Transport fähig. Vorzugsweise ist die Leader-Sequenz von sezernierten Genprodukten wie dem Interleukin-1-Rezeptorantagonist (IL-1ra), dem Parathyroidhormon (PTH) oder Cathelin (Huttner et al., Ped. Res. (1999) 45: 785) abgeleitet. Vorzugsweise wird die Leader-Sequenz während der Translokation abgespalten oder entfernt. Vorzugsweise sorgen die erfindungsgemäßen Peptide dafür, dass das Fusionsprotein, welches durch die erfindungsgemäße Expressionskassette codiert wird, in umgebende Zellen aufgenommen wird, selbst nach Entfernen der Leader-Sequenz. Dadurch wird die Effizienz des interzellulären Transports erhöht. Die Fracht, welche das interessierende Protein enthält, kann apoptotische Proteine, therapeutische Proteine etc. einschließen.

Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das VP22-Protein des Herpes simplex-Virus aus Zellen freigesetzt wird und von deren benachbarten Zellen wieder aufgenommen wird. Dementsprechend ist eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf ein Fusionskonstrukt gerichtet, welches die Leader-Sequenz von VP22, ein Peptid der vorliegenden Erfindung sowie eine Fracht, beispielsweise ein apoptotisches Protein, Suizidprotein, therapeutisches Protein etc., enthält.

Die erfindungsgemäße Expressionskassette enthält ein DNS-Transgen, welches ein Fusionsprotein enthaltend eine Leader-Sequenz, ein interessierendes Protein und das Liefer-Peptid enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Expressionskassette zusätzlich Expressionskontrollsequenzen, welche funktionell mit dieser DNS verbunden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Expressionskassette der vorliegenden Erfindung vorzugsweise in einem Transfervektor enthalten, welcher vorzugsweise entweder in vivo oder in vitro auf Zellen verabreicht wird und darin die Expression vermittelt. Die Expressionskassette, welche DNS-Sequenzen codierend ein Fusionsprotein enthaltend eine Leader-Sequenz, ein internalisierendes Peptid und ein interessierendes Protein enthält, ist nützlich, um die Lieferung des interessierenden Peptids an umgebende Zellen zu lenken. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das interessierende Protein ein apoptotisches Protein, ein antiapoptotisches Protein, ein den Zellzyklus regulierendes Protein, ein Transkriptionsfaktor, ein Suizidgenprodukt, virale oder Tumorantigene oder Zellproliferationsfaktoren, beispielsweise virale Onkoproteine, Telomerase etc.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen Transfervektor, der die Expressionskassette enthält. Zusätzlich dazu, dass sie ein oder mehrere Transgene codierende DNS-Sequenzen enthalten, enthalten bevorzugte chimäre virale Vektoren, insbesondere adenovirale Vektoren, vorzugsweise Expressionskontrollsequenzen wie einen Promotor oder einen Enhancer, ein Polyadenylierungselement sowie jedes andere regulatorische Element, welches verwendet wird, um die Expression zu beeinflussen oder zu steigern. Vorzugsweise sind alle Elemente funktionell verbunden, um die Expression des Transgens zu ermöglichen. Die Verwendung beliebiger Expressionskontrollsequenzen oder regulatorischer Elemente, welche die Expression des Transgens erleichtern, liegt innerhalb der Lehre der vorliegenden Erfindung. Solche Sequenzen oder Elemente sind vorzugsweise in der Lage, gewebsspezifische Expression zu erzeugen, oder sie sind induzierbar, vorzugsweise durch exogene Wirkstoffe oder Stimuli. Zum Beispiel schließen geeignete Promotoren den Promotor der Phosphorglyceratkinase (PGK) oder den Promotor des Cytomegalievirus (CMV) ein.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Vektor welcher die Expressionskassette enthaltend DNS-Sequenzen codierend ein Fusionsprotein enthaltend eine Leader-Sequenz, ein erfindungsgemäßes Peptid und eine Fracht, vorzugsweise ein interessierendes Protein, auf eine Zelle verabreicht. Bevorzugt wird in dieser Zelle die Expressionskassette transkribiert und translatiert. Vorzugsweise wird das erhaltene Fusionsprotein anschließend über die Leader-Sequenz ausgeschieden. Nach dem Ausscheiden aus der Zelle, worin es exprimiert wurde, wird das Fusionsprotein, enthaltend das erfindungsgemäße Lieferpeptid, ein therapeutisches Protein oder ein anderes interessierendes Protein und optional die Leader-Sequenz, vorzugsweise über das Lieferpeptid gemäß der vorliegenden Erfindung in die umgebenden Zellen in vivo oder in vitro aufgenommen.

Die erfindungsgemäße Expressionskassette ist für eine anhaltende Lieferung eines Peptid-Fracht-Komplexes in Zellen nützlich. Jede Leader-Sequenz, die in der Lage ist, die Freisetzung eines daran gebundenen Polypeptids zu erzielen, kann im Sinne der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, eingeschlossen, aber nicht darauf beschränkt, IL-1ra, PTH sowie verwandte Sequenzen.

Die vorliegende Erfindung steht auch im Zusammenhang mit Verfahren zur Identifikation von erfindungsgemäßen Lieferpeptiden. Peptide mit der Eigenschaft, in Zellen aufgenommen werden zu können, können mittels Zufallspeptidbanken, welche mit einem Affinitätsanreicherungsverfahren gekoppelt sind, identifiziert werden. Vorzugsweise wird ein Kit für eine Phagendisplay-Peptidbank eingesetzt, um Lieferpeptide zu identifizieren, die die Fähigkeit besitzen, in Zellen aufgenommen zu werden, und außerdem die Fähigkeit besitzen, die Aufnahme von Fracht in Zellen zu erleichtern. Vorzugsweise wird eine Zufallspeptidbank auf einem Plasmid dargeboten, insbesondere als Teil eines Fusionsproteins oder eines Proteins als Peptid-Protein-Komplex mittels aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren. Verfahren zur Identifikation von Lieferpeptiden erleichtern die Isolation von Peptiden mit betreffend deren Aufnahme überlegenen Eigenschaften. Sie stellen eine Vielzahl von Peptiden bereit, die dann nach verminderter Wahrscheinlichkeit, eine Immunantwort auszulösen, wenn sie einem Patienten verabreicht werden, und nach erhöhter in vivo- und/oder in vitro-Halbwertszeit selektiert werden. Dieses Verfahren enthält vorzugsweise die Schritte: Inkubieren einer Zielzelle mit einer Peptiddisplay-Bank, Isolieren der aufgenommenen Peptide, welche durch diese Peptiddisplay-Bank präsentiert wurden, aus dem Cytoplasma und den Zellkernen der Zelle und das Identifizieren dieser Peptide.

Das Sequenzprotokoll enthält:
SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 28: Aminosäuresequenzen künstlicher Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere fungierend als Lieferpeptide.

Obwohl vorstehend und in den nachfolgenden Experimenten nur bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung spezifisch beschrieben werden, versteht es sich, dass die Ausführungsformen und Beispiele bereitgestellt wurden, um die Aspekte der Erfindung klarer darzustellen, dass sie aber nicht dazu geeignet sind, den Umfang der vorliegenden Erfindung zu begrenzen. Weitere Abwandlungen und Variationen sind innerhalb des Anwendungsbereichs der Erfindung möglich.

Die Figuren zeigen:

In 1 ist eine Ähnlichkeitsanalyse der erfindungsgemäßen Peptidfamilie dargestellt. Die neu entworfenen Peptidsequenzen (für die vernunftmäßige Erklärung der Entwürfe siehe Beispiel 1) wurden unter Verwendung von DNASTAR Megalign^® (Betriebsart: langsam/genau mit allgemeinen Blosum-Tabellen) analysiert. Innerhalb der Familie sind die Sequenzen strukturell hochdivergent.

In 2 ist eine Ähnlichkeitsanalyse der erfindungsgemäßen Peptidfamilie und bekannten PTD-Peptidfamilien dargestellt. Veröffentlichte PTD(s) (WO 91/09958, WO 02/069930) und neu entworfene Peptidsequenzen (siehe Beispiel 1) wurden unter Verwendung von DNASTAR Megalign^® (Betriebsart: langsam/genau mit allgemeinen Blosum-Tabellen) analysiert. Beim Vergleich mit bekannten Peptiden bildet die neue Peptidfamilie eine eigene Gruppe, von denen einige Mitglieder eine leichte Ähnlichkeit mit bekannten Peptiden aufweisen.

3 zeigt ein Balkendiagramm der Beurteilung des kosmetischen Effekts des Konjugats aus huSOD-Peptid und OA 05 in einer Cremegrundlage. Gezeigt sind die prozentualen Anteile der Parameter verbesserter Hautpflege als Funktion der verschiedenen Behandlungsgruppen. Die Verbesserung verstärkt sich mit dem Anstieg der Konzentration von huSOD und OA 05.

Beispiel 1: In vitro Transport biotinylierter Peptide in Fibroblasten

Biotinylierte Peptide wurden durch einen gewerblichen Lieferanten (Jerini AG, Berlin) synthetisiert. Die Menge an Biotin betrug 5 mg, die Reinheit war höher als 95% (HPLC, 220 nm, C18 und C4, linearer Gradient, Analysen: HPLC & MS, mit Chlorid als Gegenion).

Die folgenden Peptide wurden synthetisiert: I. Bekannte Peptide Gruppe 1 (Vergleichsbeispiele aus WO 02/069930)

CE 49	AKKRRQRRR
CE 50	RAKRRQRRR
CE 51	RKARRQRRR
CE 52	RKKARQRRR

Gruppe 2 Vergleichsbeispiele aus WO 01/15511)

PI 01	KRIIQRILSRNS
PI 02	KRIHPRLTRSIR
PI 03	PPRLRKRRQLNM
PI 04	PIRRRKKLRRLK
PI 05	RRQRRTSKLMKR

II. Peptide gemäß der Erfindung

Es wurden Peptide gemäß der allgemeinen Formel I (K)_n A₁B₁C₁ (K)_m A₂B₂C₂ (K)_l A₃B₃C₃ (K)_o (I),wobei
K Lysin (K) ist,
B₁, B₂, B₃ Arginin (R), Glutamin (Q) oder Histidin (H) ist,
A₁, A₂, A₃, C₁, C₂, C₃ Arginin (R) oder Histidin (H) ist oder fehlt,
n, m, o eine Ganzzahl von 0 bis 5 ist, und
die Gesamtzahl der Aminosäuren nicht mehr als 10 beträgt,
synthetisiert:
KKRKKQKKRK (SEQ ID NO: 1), RRKKKQKKK (SEQ ID NO: 2),
KKQKKRRK (SEQ ID NO: 3), KKQKKRRKK (SEQ ID NO: 4),
KKKQKRKK (SEQ ID NO: 5), RQKKQKKKR (SEQ ID NO: 6),
RKQKKKRKKK (SEQ ID NO: 7), KRKQKQKKK (SEQ ID NO: 8),
KKRKQKKQK (SEQ ID NO: 9), KKKRKKQK (SEQ ID NO: 10),
RKKKKQKKK (SEQ ID NO: 11), KKRKKQKK (SEQ ID NO: 12),
QKKRRKKKQK (SEQ ID NO: 13), KKRKQKKRK (SEQ ID NO: 14),
KKRKQKKQKR (SEQ ID NO: 15), KRKQKQKKKK (SEQ ID NO: 16),
KKRKRKQKK (SEQ ID NO: 17), KQKRKKKQK (SEQ ID NO: 18),
KQKKRQKKKR (SEQ ID NO: 19), KKKRKQKQKK (SEQ ID NO: 20),
RKKKQKKQKK (SEQ ID NO: 21), KKKRQKKQK (SEQ ID NO: 22),
KKRKKKKKRK (SEQ ID NO: 23), RRKKKKKK (SEQ ID NO: 24),
KKKKRRK (SEQ ID NO: 25), KKKKRRKK (SEQ ID NO: 26),
KKKKRKK (SEQ ID NO: 27), KKRKKKKK (SEQ ID NO: 28),
KKRKKHKKRK (SEQ ID NO: 29), RRKKKHKKK (SEQ ID NO: 30),
KKHKKRRK (SEQ ID NO: 31), KKHKKRRKK (SEQ ID NO: 32),
KKKHKRKK (SEQ ID NO: 33), RHKKHKKKR (SEQ ID NO: 34),
RKHKKKRKKK (SEQ ID NO: 35), HHKRKKKRK (SEQ ID NO: 36),
KKRHHKRK (SEQ ID NO: 37), and KKHRKKH (SEQ ID NO: 38).

Dementsprechend können die synthetisierten Peptide gemäß der Erfindung in drei Untergruppen aufgeteilt wanden: (a) SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 22: Peptide bestehend aus Lysin (K), Arginin (R) und Glutamin (Q); (b) SEQ ID Nr. 23 bis SEQ ID Nr. 28: Peptide bestehend aus Lysin (K) und Arginin (R); (c) SEQ ID Nr. 29 bis SEQ ID Nr. 38: Peptide bestehend aus Lysin (K), Arginin (R) und Histidin (H).

Für den Entwurf der Untergruppe (a) der Peptide gemäß der Erfindung wurde die relative Anzahl an Lysingruppen (K) im Vergleich zu bekannten Proteinen erhöht. Durch Einbau einer oder maximal zwei Arginingruppen (R) wurde eine basische Ladung erzielt.

Für den Entwurf der Untergruppe (b) der Peptide gemäß der Erfindung wurde eine oder maximal zwei Histidin-Gruppen (H) eingebaut. Die erhaltenen Peptide besitzen eine hohe basische Ladung bei geringen pH-Werten.

Für die weiteren Beispiele wurden aus den vorstehenden erfindungsgemäßen Peptiden Peptide ausgewählt und in Gruppe 3, welche Unterguppe (a) repräsentiert, und Gruppe 4, welche Untergruppe (b) der erfindungsgemäßen Peptide repräsentiert, gruppiert.

Gruppe 3 (erfindungsgemäß)

Gruppe 4 (erfindungsgemäß)

Verschiedene Konzentrationen (0,1 mmol/l bis 1 mol/l Endkonzentration) eines jeden Peptids, woran Biotin an das Aminoende kovalent gebunden war, wurden in phosphatgepufferter Saline (PBS) gelöst und auf konfluent adhärierende Kulturen von NIH/3T3-Fibroblasten in Kulturobjektträgern (von Nunc) verabreicht. Die Zellkulturen wurden mit dem Peptid für 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden mit Formaldehyd (2% Formaldehyd, 0,2% Glutaaldehyd in 1 × PBS) fixiert und mit 0,05% Trypsin in 0,5 mmol/l EDTA lysiert. Die Objektträger wurden durch Inkubation mit fluoreszenzmarkiertem Streptavidin gefärbt und mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert.

Ergebnisse:

Die Zellen nahmen jedes getestete Peptid auf. Ein Anstieg der Peptidkonzentration verursacht einen Anstieg der Fluoreszenzmarkierung (gemessen durch den prozentualen Anteil markierter Zellen). Es konnte kein signifikanter Unterschied in der Aufnahme der unterschiedlichen Peptide festgestellt werden (gemessen durch den prozentualen Anteil markierter Zellen). Dies zeigt, dass die Peptide konjugiertes Biotin in murine Fibroblasten in vitro transportieren können.

Beispiel 2: Der in vitro Transport biotinylierter Peptide in Fibroblasten hängt vom pH-Wert ab.

Verschiedene Konzentrationen (0,1 mmol/l bis 1 mol/l in Konzentration) eines jeden Peptids aus Gruppe 3 und Gruppe 4 (siehe Beispiel 1), die am Aminoende mit Biotin kovalent verknüpft waren, wurden in TRIS-gepufferter Saline (bei entweder pH 6,0, 7,0 oder 8,0) und auf konfluent adhärierende Kulturen von NIH/3T3-Fibroblasten in Kulturobjektträgern (von Nunc) verabreicht. Die Zellkulturen wurden für 30 Minuten mit dem Peptid inkubiert. Die Zellen wurden mit Formaldehyd (2% Formaldehyd, 0,2% Glutaraldehyd in 1 × PBS fixiert und mit 0,05% Trypsin in 0,5 mmol/l EDTA lysiert. Die Objektträger wurden durch Inkubation mit fluoreszenzmarkiertem Streptavidin gefärbt und mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert.

Ergebnisse

Bei pH 6,0 nahmen die Zellen jedes der getesteten Peptide auf. Bei pH 7,0 und 8,0 war die Aufnahme von Peptiden der Gruppe 4 (gemessen über dem prozentualen Anteil markierter Zellen) im Vergleich zur Aufnahme der Peptide aus Gruppe 3 vermindert. Dies zeigt, dass in vitro der Transport von konjugiertem Biotin mittels Peptiden in murine Fibroblasten vom pH-Wert abhängt und dass allein Histidin zum Transport bei geringem pH-Wert beiträgt.

Beispiel 3: Spezifische Aktivität von Peptid-Enzym-Komplexen

Alle Peptide aus Beispiel 1 wurden über Disulfid-Brücken an verschiedene Epitope von Lac Z und an Epitope von GFP gekoppelt. Nach Kopplung und Aufreinigung wurde die spezifische biologische Aktivität des Peptid-Enzym-Komplexes untersucht. Die Lac Z-Aktivität wurde mittels Beta-Gal-Assays oder mittels Färbekits (von (Invitrogen) untersucht. Die spezifische Aktivität wurde entweder bestimmt auf Grundlage des Gesamtproteingehalts (Bradford, Biorad) oder auf Grundlage der Zellzahlen. Indem die Zahl der nachgewiesenen Epitope (GFP-Antiserum, Invitrogen) mit der Gesamtzahl an GFP in Beziehung gesetzt wurde, wurde die sterische Behinderung abgeschätzt.

Ergebnisse:

Die Maskierung der Epitope war innerhalb der Peptidgruppen nicht signifikant unterschiedlich. Die spezifische Aktivität von Enzymen, die an Peptide der Gruppe 1 oder der Gruppe 2 gekoppelt waren, war signifikant reduziert. Jedoch war die spezifische Aktivität von Enzymen, die an Peptide der Gruppe 3 oder der Gruppe 4 gekoppelt waren, nicht signifikant reduziert. Dies zeigt, dass die Auswirkung von an Proteinen gekoppelten Peptiden auf die biologische spezifische Aktivität dieser Proteine von der Sequenz der gekoppelten Peptide abhängt.

Beispiel 4: Spezifische Aktivität von Peptid-huSOD-Komplexen

Alle Peptide gemäß Beispiel 1 wurden an verschiedene Epitope von huSOD (von Jena Biosciences) mittels Disulfid-Brücken gekoppelt. Nach der Kopplung und Aufreinigung wurde die spezifische biologische Aktivität des Peptid-Enzym-Komplexes durch Verwendung des Superoxiddismutase-Assay-Kit (von Calbiochem) und durch Messung des Gesamtproteingehaltes (von Bradford, Biorad) bestimmt. Indem die Zahl der nachgewiesenen Epitope (Anti-SOD von abcam) zur Gesamtzahl an SOD in Beziehung gesetzt wurde, wurde die sterische Behinderung abgeschätzt.

Ergebnisse:

Die Maskierung der Peptide unterschied sich nicht signifikant innerhalb der Peptidgruppen. Die spezifische Aktivität von huSOD, welches an Proteine der Gruppe 1 oder der Gruppe 2 gekoppelt war, war signifikant reduziert. Jedoch war die spezifische Aktivität von Enzymen, die an Peptide der Gruppe 3 oder Gruppe 4 gekoppelt waren, nicht signifikant reduziert. Dies zeigt, dass die Auswirkung von an Proteinen gekoppelten Peptiden auf die biologische Aktivität dieser Proteine von der Sequenz der gekoppelten Peptide abhängt.

Beispiel 5: Eindringen der Peptide in die Haut von Nacktmäusen

Verschiedene Konzentrationen, 0,1 mmol/l bis 1 mmol/l der Peptide CE 49, PI 05, OA 01, OA 05 und OA 34, woran Biotin an das Aminoende kovalent gebunden war, wurden in phosphatgepufferter Saline (PBS) gelöst und auf den Rücken betäubter Nacktmäuse appliziert. Die Proben konnten 30 Minuten lang eindringen. Anschließend wurde das Tier getötet und die entsprechenden Teile der Haut wurden herausgeschnitten und in ein Einbettungsmedium eingebettet und aufgefroren. Die gefrorenen Abschnitte (5 μ) wurden mittels fluoreszenzmarkiertem Streptavidin angefärbt. Die Objektträger wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert.

Ergebnisse:

Mittels jedes Peptids wurde das konjugierte Biotin in die Epidermis und darüber hinweg und in die Dermis transportiert. Es konnte kein signifikanter Unterschied im Transport beobachtet werden. Dies zeigt, dass die Peptide konjugiertes Biotin in die Haut liefern können.

Beispiel 6: Eindringen von huSOD in die Haut von Nacktmäusen

Dieses Beispiel zeigt, dass Peptide in der Lage sind, konjugiertes huSOD in die Haut zu liefern, und dass die Aktivität des huSOD von der Sequenz des Peptids abhängt. So war die spezifische Aktivität von huSOD, welches an Peptide der Gruppe 1 oder der Gruppe 2 gekoppelt war, wie mittels der Zahl der gefärbten Zellen bestimmt, signifikant verschieden im Vergleich zur Aktivität des huSOD, welches an Proteine der Gruppe 3 oder der Gruppe 4 gekoppelt war.

Verschiedene Konzentrationen, von 1 mmol/l bis 1 mmol/l der Peptide CE 49, PI 05, OA 01, OA 05 und OA 34, woran huSOD an das Aminoende kovalent gebunden war, wurden in phosphatgepufferter Saline (PBS) gelöst und auf den Rücken betäubter Nacktmäuse appliziert. Die Proben konnten 30 Minuten lang eindringen. Anschließend wurde das Tier getötet und die entsprechenden Abschnitte der Haut herausgeschnitten und in Einbettungsmedium eingebettet und aufgefroren. Fixierte Schnitte (5 μ) wurden entweder mit fluoreszenzmarkiertem Anti-huSOD-Antikörper (abcam) gefärbt oder es wurde ein in situ-SOD-Assay (von Calbiochem) durchgeführt. Die Objektträger wurden mittels Mikroskopie untersucht.

Ergebnisse:

Jedes Peptid transportiere das konjugierte huSOD in die Epidermis und darüber hinweg und in die Dermis. Bei huSOD, welches an Proteine der Gruppe 1 oder der Gruppe 2 konjugiert war, konnte nach Färben mit dem Anti-huSOD-Antikörper kein signifikanter Unterschied beim Transport beobachtet werden. Im Gegensatz dazu wurde huSOD, welches an Proteine der Gruppe 3 und der Gruppe 4 konjugiert war, in die Epidermis und über diese hinweg und in die Dermis in einer beachtlich höheren Rate transportiert, wie durch eine signifikant erhöhte Färbung mit dem Anti-huSOD-Antikörper beobachtet wurde.

Beispiel 7: Ähnlichkeitsanalyse der Peptidmotive

Veröffentlichte PTDs (siehe WO 91/09958 oder WO 02/069930) und Lieferpeptide mit neu entworfenen Sequenzen (siehe Beispiel 1) wurden unter Verwendung von DNASTRAR Megalign^® (Betriebsart: langsam/genau mit allgemeinen Blosum-Tabellen) analysiert.

Ergebnisse:

Die Analysen (1 und 2) zeigen, dass das erfindungsgemäße Peptid der Vertreter einer neuen strukturellen Familie von PTDs ist.

Beispiel 8: Klinische Studie mit einer Hautpflegecreme gegen Hautalterung

Eine Cremegrundlage wurde eingesetzt, die die folgenden Inhaltsstoffe aufwies:

Stoff:	Menge [g]
Tocopherolacetat	10,0
Calendulaessenz	10,0
Lecithin	5,0
DMS (Emulgator)	2,0
Glycerin	10,0
Sheabutter	30,0
Cordes-Cremegrundlage	10,0
Aqua dest.	ad 100,0

Das huSOD Peptid-OA 05-Konjugat wurde wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.

Die folgenden Hautcremezusammensetzungen für die Verwendung in der klinischen Studie hergestellt:

Gruppe L (Kontrolle):	Cremegrundlage ohne SOD (n = 20)
Gruppe II (Kontrolle):	Cremegrundlage mit 2 μg SOD pro 1 g Hautcreme (n = 20)
Gruppe III (erfindungsgemäß):	Cremegrundlage mit 2 μg SOD + Peptid OA 05 pro 1 g Hautcreme (n = 22)
Gruppe IV (erfindungsgemäß):	Cremegrundlage + 20 μg SOD + Peptid OA 05 pro 1 g Hautcreme (n = 15)
Gruppe V (erfindungsgemäß):	Cremegrundlage + 50 μg SOD + Peptid OA 05 pro 1 g Hautcreme (n = 10)

Die Eigenschaften bei der kosmetischen Beurteilung wurden bewertet mittels einer prospektiven Selbstbeurteilung auf einem standardisierten Beurteilungsbogen mit Bewertungen von „bin vollständig einverstanden", „einverstanden" bis „bin nicht einverstanden" sowie der weiteren Kategorie „keine Meinung". Die Eigenschaften wurden anhand der folgenden Kriterien beurteilt: „Festigkeit der Haut", „Verminderung oberflächlicher Falten", „Verminderung tieferer Falten", „Regeneration der Haut" sowie „Auftreten junger Haut". Der Fragebogen wurde mindestens 4 Wochen nach Beginn der Benutzung der Hautcreme ausgefüllt.

In allen Gruppen (I bis V) wurde die Hautcreme über 6 Wochen zweimal am Tag aufgetragen. Dabei wurden das Gesicht und der Hals am Morgen und am Abend eingecremt, ohne dabei irgendwelche anderen Hautpflegeprodukte zu verwenden. In keiner Gruppe kam es zu einem Absetzen der Anwendung. Der Beobachtungszeitraum (gezählt ab der ersten Anwendung) betrug mindestens 4 Wochen und maximal 10 Wochen.

Darüber hinaus wurde eine Gesamtbeurteilung der verschiedenen verwendeten Hautcremes auf einer Bewertungsskala von 1 („hervorragend") bis 6 („sehr schlecht") bewertet.

Ergebnisse:

Alle 87 Teilnehmer beantworteten die Fragen anhand einer bezüglich Nebeneffekte, kosmetischer Eigenschaften, Verringerung der Falten etc. standardisierten Bewertungsskala.

Tabelle 1 führt die verschiedenen Eigenschaften bei der kosmetischen Beurteilung als Funktion der Behandlungsweise auf.

Tabelle 2 führt die Ergebnisse der Gesamtbeurteilung der verschiedenen verwendeten Hautcremes an. Die Noten 5 und 6 wurden in keiner der Gruppen ausgewertet. Der große Unterschied zwischen den experimentellen Gruppen (huSOD + OA 05) und den Kontrollgruppen in der Beurteilung ist bemerkenswert.

Es wurden keine Nebenwirkungen beobachtet. In einem Fall (Gruppe IV) wurde eine Allergie vermutet, jedoch wurden nach Fortführung der Anwendung des Produkts keine weiteren allergischen Reaktionen beobachtet. Eine Wiederholung der Anwendung über drei Monate zeigte kein Wiederauftreten.

Der Vergleich zwischen SOD-Creme und Cremegrundlage, ohne Zusatz von Peptid-Konjugaten zeigt, dass SOD selbst eine verbessernde Wirkung auf verschiedene Altersparameter der menschlichen Haut hat. Jedoch steigert die Konjugation mit Peptid OA 05 die verbessernde Wirkung von SOD signifikant. In dem Peptid-Fracht Molekül-Komplex aus SOD und OA 05 wird die spezifische biologische Aktivität des Frachtmoleküls SOD durch das damit verbundene Lieferpeptid OA 05 nicht gehemmt.

Dieses Beispiel zeigt, dass die Verwendung von huSOD, einer therapeutischen Wirksubstanz, zusammen mit OA 05, einem Peptid der Gruppe 3, als Wirkstoff gegen das Alter und als Hautpflegemittel für Menschen wirkungsvoll ist.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Lieferpeptid, enthaltend eine Aminosäuresequenz der Formel I: (K)_n A₁B₁C₁ (K)_m A₂B₂C₂ (K)_l A₃B₃C₃ (K)_o (I),wobei K Lysin (K) ist, B₁, B₂, B₃ Arginin (R), Glutamin (Q) oder Histidin (H) ist, A₁, A₂, A₃, C₁, C₂, C₃ Arginin (R) oder Histidin (H) ist oder fehlt, n, m, o eine Ganzzahl von 0 bis 5 ist, und die Gesamtzahl der Aminosäuren nicht mehr als 10 beträgt.
Peptid nach Anspruch 1 enthaltend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: KKRKKQKKRK (SEQ ID NO: 1), RRKKKQKKK (SEQ ID NO: 2), KKQKKRRK (SEQ ID NO: 3), KKQKKRRKK (SEQ ID NO: 4), KKKQKRKK (SEQ ID NO: 5), RQKKQKKKR (SEQ ID NO: 6), RKQKKKRKKK (SEQ ID NO: 7), KRKQKQKKK (SEQ ID NO: 8), KKRKQKKQK (SEQ ID NO: 9), KKKRKKQK (SEQ ID NO: 10), RKKKKQKKK (SEQ ID NO: 11), KKRKKQKK (SEQ ID NO: 12), QKKRRKKKQK (SEQ ID NO: 13), KKRKQKKRK (SEQ ID NO: 14), KKRKQKKQKR (SEQ ID NO: 15), KRKQKQKKKK (SEQ ID NO: 16), KKRKRKQKK (SEQ ID NO: 17), KQKRKKKQK (SEQ ID NO: 18), KQKKRQKKKR (SEQ ID NO: 19), KKKRKQKQKK (SEQ ID NO: 20), RKKKQKKQKK (SEQ ID NO: 21), KKKRQKKQK (SEQ ID NO: 22), KKRKKKKKRK (SEQ ID NO: 23), RRKKKKKK (SEQ ID NO: 24), KKKKRRK (SEQ ID NO: 25), KKKKRRKK (SEQ ID NO: 26), KKKKRKK (SEQ ID NO: 27), KKRKKKKK (SEQ ID NO: 28), KKRKKHKKRK (SEQ ID NO: 29), RRKKKHKKK (SEQ ID NO: 30), KKHKKRRK (SEQ ID NO: 31), KKHKKRRKK (SEQ ID NO: 32), KKKHKRKK (SEQ ID NO: 33), RHKKHKKKR (SEQ ID NO: 34), RKHKKKRKKK (SEQ ID NO: 35), HHKRKKKRK (SEQ ID NO: 36), KKRHHKRK (SEQ ID NO: 37), and KKHRKKH (SEQ ID NO: 38).
Peptid nach Anspruch 1 bestehend aus Aminosäuren, ausgewählt aus Histidin (H), Lysin (K), Glutamin (Q) und Arginin (R).
Expressionskassette enthaltend ein DNS-Transgen, welches ein Fusionsprotein codiert, das eine Leader-Sequenz, ein interessierendes Protein und das Lieferprotein nach Anspruch 1 enthält.
Expressionskassette nach Anspruch 4 weiter enthaltend Sequenzen zur Expressionssteuerung, welche mit der DNS funktionell verbunden sind.
Übertragungsvektor enthaltend die Expressionskassette nach Anspruch 4.
Peptid-Fracht-Komplex enthaltend das Lieferprotein nach Anspruch 1 und mindestens ein Frachtmolekül.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei das Lieferprotein spezifisch mit der äußeren Oberfläche des mindestens einen Frachtmoleküls verbunden ist.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 8, wobei die Verbindung mit einem spaltbaren Linker erzeugt wird.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 8, wobei die Verbindung eine Disulfid-Brücke enthält.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 8, wobei die Verbindung einen Streptavidin-Biotin-Komplex enthält.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei das Lieferpeptid biotinyliert und das Frachtmolekül mit Avidin markiert ist.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polynucleotiden, Polypeptiden, Proteinen, kleinen organischen Molekülen, Metallen, Viren, modifizierten Viren, viralen Vektoren und Plasmiden, enthält.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht ein Virus ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenoviren, Adeno-assoziierten Viren, Herpesviren, Simplexvirus und Retroviren.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus therapeutischen Proteinen, Suizidproteinen, tumorsupprimierenden Proteinen, Transkriptionsfaktoren, Kinase-Inhibitoren, Kinasen, regulatorischen Proteinen, apoptotischen Proteinen, antiapoptotischen Proteinen, viralen Antigenen, zellulären Antigenen, Differenzierungsfaktoren, immortalisierenden Faktoren, Toxinen, Enzymen, Nucleinsäuren, Antisense-Konstrukten, Mitteln für die bildgebende Diagnostik oder Kontrastmitteln, Farbstoffen, antibakteriellen Wirkstoffen, antifungalen Wirkstoffen, antiviralen Wirkstoffen, antiproliferativen Wirkstoffen, Cytostatika, immunsupprimierenden Wirkstoffen, Vitaminen, analgetischen Wirkstoffen, Hormonen, entzündungshemmenden Wirkstoffen und Mitteln gegen Altern.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht ein antiviraler Wirkstoff ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acyclovir, Famiciclovir, Ganciclovir, Foscarnet, Isoxuridin, Sorivudin, Trifluridin (Trifluoropyridin), Valacyclovir, Cidofovir, Didanosin, Stavudin, Zalcitabin, Zidovudin, Ribavirin und Rimantatin.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht ein antibakterieller Wirkstoff ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nafcillin, Oxacillin, Penicillin, Amoxacillin, Ampicillin, Cephalosporin, Cefotaxim, Ceftriaxon, Rifampin, Minocyclin, Ciprofloxacin, Norfloxacin, Erythromycin, Tetracyclin, Gentamicin, einem Macrolid, einem Quinolon, einem β-Lacton, einem P-Lactamase-Hemmer, Salicylamid und Vancomycin.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht ein antifungaler Wirkstoff ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amphotericin, Itraconazol, Ketoconazol, Miconazol, Nystatin, Clotrimazol, Fluconazol, Ciclopirox, Econazol, Naftifin, Terbinafin und Griseofulvin.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht ein antineoplastischer Wirkstoff ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pentostatin, Pentamidin, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, Methotrexat, Bleomycinen, Etoposid, Teniposid, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Mitoxantron, Hydroxy-Harnstoff, 5-Fluorouracil, Cytarabin, Fludarabin, Mitomycin, Cisplatin, Procarbazin, Dacarbazin, Paclitaxel, Colchicin und Vincaalkaloiden.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht ein immunsupprimierender Wirkstoff ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methotrexat, Azathioprin, Fluorouracil, Hydroxy-Harnstoff, 6-Thioguanin, Cyclophosphamid, Mechloroethamin-Hydrochlorid, Carmustin, Cyclosporin, Taxol, Tacrolimus, Vinblastin, Dapson, Nedocromil, Cromolyn (Cromoglycinsäure) und Sulfasalazin.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht an analgetischer Wirkstoff ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lidocain, Bupivacain, Novocain, Procain, Tetracain, Benzocain, Cocain, Mepivacain, Etidocain, Proparacain, Ropivacain und Prilocain.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht ein Hormon ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gewebehormonen, insbesondere Prostglandinen, Serotonin, Histamin, Bradykinin, Kallikrein und gastrointestinalen Hormonen, Releasing Hormonen, Hormonen der Hypophyse, Insulin, Vasopressin (ADH), Glucagon, Enkephalin, Calcitonin und Corticosteroiden.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht ein Histaminrezeptoragonist oder -antagonist ist, ausgewählt aus 2-Methylhistamin, 2-Pyridylethylamin, 2-Thiazolylethylamin, (R)-a-Methylhistamin, Impromidin, Dimaprit, 4(5)-Methylhistamin, Diphenhydramin, Pyrilamin, Promethazin, Chlorpheniramin, Chlorcyclizin und Terfenadin.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht ein Cytokin oder Wachstumsfaktor ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IL-1Ra, STNF-R (p55), STNF-R (p75), SIL-1R Typ I, SIL-1R Typ II, BMP-2, BMP-6, BMP-7, LMP-1, LMP-3, IGF-1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, IL-4, IL-10, CTLA4, CD30, TIMP-1, IFN-β, Sox-9 und PDGF.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht ein Mittel zur Verhinderung der Alterung ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Retinsäure, Hyaluronsäure, Collagen und Fängern freier Radikale, insbesondere SOD.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht ein therapeutischer Wirkstoff für ein Leiden ist, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Ulkus des Magen-Darm-Trakts, peptischer Ulkus und Krankheiten, die mit einer krankhaften Gewebswucherung einhergehen.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht ein Therapeutikum für Ulkus ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem H2-Histamininhibitor, einen Inhibitor der Wasserstoff-Kalium-ATPase und einem gegen Helicobacter pylori gerichteten Antibiotikum. 28 Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht ein therapeutischer Wirkstoff für die Behandlung eines Bronchialleidens ausgewählt aus zystischer Fibrose, Asthma, allergischem Schnupfen und obstruktiver Lungenerkrankung, ist.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht ein therapeutischer Wirkstoff ist zur Behandlung von Ischämie, Morbus Parkinson, Schizophrenie, Krebs, erworbenem Immunschwächesyndrom (AIDS), Infektionen des zentralen Nervensystems, Epilepsie, multipler Sklerose, neurodegenerativen Erkrankungen, Trauma, Depression, Morbus Alzheimer, Migräne, Schmerz und Anfallsleiden.
Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, wobei die Fracht ein therapeutischer Wirkstoff ist für einen Zustand, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus entzündlichen und degenerativen Erkrankungen der Gelenke und der Wirbelsäule, Arthritis, insbesondere Osteoarthritis, Kreuz- und Lendenschmerz, Knochenreparatur, Heilung von Knochenbrüchen, Therapie von Verletzungen der Muskeln und der Ligamente.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 zum Einbringen eines daran gebundenen Frachtmoleküls in eine Zelle.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Kits für das Einbringen eines an das Peptid gebundenen Frachtmoleküls in eine Zelle in einem tierischen oder menschlichen Körper.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 zum Transport in den Zellkern einer Zielzelle.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Kits für den Transport in den Zellkern einer Zielzelle in einem tierischen oder menschlichen Körper.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 zum Transport in die Mitochondrien einer Zielzelle.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Kits für den Transport in die Mitochondrien einer Zielzelle in einem tierischen oder menschlichen Körper.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 zur Behandlung von Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Ulkus des Magen-Darm-Trakts, peptischem Ulkus, Erkrankungen die mit einer krankhaften Gewebswucherung einhergehen, einer Infektion mit Helicobacter pylori, zystischer Fibrose, Asthma, allergischem Schnupfen, chronischer obstruktiver Lungenerkrankung, Ischämie, Morbus Parkinson, Schizophrenie, Krebs, erworbenem Immunschwächesyndrom (AIDS), Infektionen des Zentralnervensystems, Epilepsie, multipler Sklerose, neurodegenerativen Erkrankungen, Trauma, Depression, Morbus Alzheimer, Migräne, Schmerz und Anfallsleiden.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Ulkus des Magen-Darm-Trakts, peptischem Ulkus, Erkrankungen die mit einer krankhaften Gewebswucherung einhergehen, einer Infektion mit Helicobacter pylori, zystischer Fibrose, Asthma, allergischem Schnupfen, chronischer obstruktiver Lungenerkrankung, Ischämie, Morbus Parkinson, Schizophrenie, Krebs, erworbenem Immunschwächesyndrom (AIDS), Infektionen des Zentralnervensystems, Epilepsie, multipler Sklerose, neurodegenerativen Erkrankungen, Trauma, Depression, Morbus Alzheimer, Migräne, Schmerz und Anfallsleiden des tierischen oder menschlichen Körpers.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 zur Behandlung von Glucocerebrosidase-Mangel (Morbus Gaucher), Mucopolysaccharidose I, Sanfilippo B-Syndrom, Pankreasinsuffizienz, schwerem kombiniertem Immunschwächesyndrom und neuromuskulärer Funktionsstörungen, die mit einem Triosephosphatisomerase-Mangel einhergehen.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Glucocerebrosidase-Mangel (Morbus Gaucher), Mucopolysaccharidose I, Sanfilippo B-Syndrom, Pankreasinsuffizienz, schwerem kombiniertem Immunschwächesyndrom und neuromuskulärer Funktionsstörungen, die mit einem Triosephosphatisomerase-Mangel einhergehen, des tierischen oder menschlichen Körpers.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 zur Behandlung von entzündlichen und degenerativen Erkrankungen der Gelenke und der Wirbelsäule, Arthritis, insbesondere Osteoarthritis, Kreuz- und Lendenschmerz, zur Knochenheilung, zur Heilung von Knochenbrüchen und zur Therapie von Verletzungen der Muskeln und der Ligamente.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von entzündlichen und degenerativen Erkrankungen der Gelenke und der Wirbelsäule, Arthritis, insbesondere Osteoarthritis, Kreuz- und Lendenschmerz, zur Knochenheilung, zur Heilung von Knochenbrüchen und zur Therapie von Verletzungen der Muskeln und der Ligamente, des tierischen oder menschlichen Körpers.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend: – einen Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7, enthaltend eine wirksame Menge eines biologisch aktiven oder therapeutischen Wirkstoffs und – einen pharmazeutisch verträglicher Trägerstoff.
Verfahren zum Befördern einer Fracht an die Oberfläche einer biologischen Barriere, in diese oder über diese hinweg, enthaltend: a) Bereitstellen einer Fracht und mindestens eines Lieferpeptids gemäß Anspruch 1, b) Erzeugen eines Peptid-Fracht-Komplexes, c) Inkontaktbringen der Barriere mit dem Peptid-Fracht-Komple und d) Befördern der Fracht auf die Oberfläche der Barriere, in die Barriere oder über die Barriere hinweg.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Barriere eine intakte epitheliale oder endotheliale Gewebeschicht ist oder -schichten sind.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Barriere die Haut ist.
Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Fracht in und/oder über eine oder mehrere der Schichten Stratum corneum, Stratum granulosum, Stratum lucidum und Stratum germinativum hinweg befördert wird.
Verfahren nach Anspruch 46, wobei das Inkontaktbringen der Haut mit dem Peptid-Fracht-Komplex durch topikales Verabreichen einer Zusammensetzung enthaltend den Peptid-Fracht-Komplex auf die Haut bewerkstelligt wird, wobei insbesondere die Fracht von Zellen aufgenommen wird, die die follikuläre oder interfollikuläre Epidermis bilden.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei die Zusammensetzung eine Creme, ein Unguentum, eine Salbe, eine Lotion oder ein transdermales Pflaster ist.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Barriere der Magen-Darm-Trakt ist.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Barriere das Lungenepithel ist.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Barriere die endotheliale Blut-Hirn-Schranke ist.
Verfahren zum Auslösen des Zelltods von Zellen der Synovialis enthaltend das Verabreichen des Peptid-Fracht-Komplexes nach Anspruch 7 auf die synovialen Zellen.
Verwendung des Peptid-Fracht-Komplexes nach Anspruch 7 zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Auslösen des Zelltods von Zellen der Synovialis in einem tierischen oder menschlichen Körper.
Verfahren zum Auslösen von Apoptose in einer Tumorzelle, enthaltend das Verabreichen des Peptid-Fracht-Komplexes nach Anspruch 7, insbesondere enthaltend ein apoptotisches Protein, auf die Tumorzelle.
Verwendung des Peptid-Fracht-Komplexes nach Anspruch 7, insbesondere enthaltend ein apoptotisches Protein, zur Herstellung einer Zusammensetzung für das Auslösen von Apoptose in einer Tumorzelle in einem tierischen oder menschlichen Körper.
Verfahren zur Reduktion weißer Blutzellen in arthritischen Gelenken, enthaltend das Verabreichen des Peptid-Fracht-Komplexes nach Anspruch 7 auf die weißen Blutzellen.
Verwendung des Peptid-Fracht-Komplexes nach Anspruch 7 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Reduktion weißer Blutzellen in arthritischen Gelenken in einem tierischen oder menschlichen Körper.
Verfahren zur Verminderung der Auswirkungen der Hautalterung enthaltend das Verabreichen des Peptid-Fracht-Komplexes nach Anspruch 7, insbesondere enthaltend ein die Alterung verhinderndes Mittel, auf die Haut.
Verwendung des Peptid-Fracht-Komplexes nach Anspruch 7, insbesondere enthaltend ein die Alterung verhinderndes Mittel, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verminderung der Auswirkungen der Hautalterung in einem tierischen oder menschlichen Körper.
Verfahren gemäß Anspruch 60, wobei die Zusammensetzung in Form einer Creme, eines Unguentums, einer Salbe oder einer Lotion vorliegt.
Verfahren zum Auslösen einer Immunantwort in einem tierischen oder menschlichen Körper enthaltend das Verabreichen eines Immunogens, welches den Peptid-Fracht-Komplex nach Anspruch 7 enthält, auf eine Zielzelle des Körpers.
Verwendung des Peptid-Fracht-Komplexes nach Anspruch 7 zur Herstellung eines Immunogens zum Auslösen einer Immunantwort in einem tierischen oder menschlichen Körper.