EP1599593A2 - Verwendung eines trizyklischen antidepressivums zur förderung der endozytose - Google Patents

Verwendung eines trizyklischen antidepressivums zur förderung der endozytose

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Publication number
EP1599593A2
EP1599593A2 EP04711570A EP04711570A EP1599593A2 EP 1599593 A2 EP1599593 A2 EP 1599593A2 EP 04711570 A EP04711570 A EP 04711570A EP 04711570 A EP04711570 A EP 04711570A EP 1599593 A2 EP1599593 A2 EP 1599593A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
endocytosis
atom
substance
cell
substances
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04711570A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Birgit Neukamm
Christine Lang
Reinhard Gessner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RiNA Netzwerk RNA-Technologien GmbH
Original Assignee
RiNA Netzwerk RNA-Technologien GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RiNA Netzwerk RNA-Technologien GmbH filed Critical RiNA Netzwerk RNA-Technologien GmbH
Publication of EP1599593A2 publication Critical patent/EP1599593A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones

Definitions

  • the invention relates to the use of a substance for producing a pharmaceutical composition for promoting the endocytosis of an active compound, in particular a construct containing a nucleic acid or consisting thereof, for example in the context of gene therapy or the transfection of mammalian cells.
  • the invention further relates to methods for promoting endocytosis and cells which are transformed with such a method.
  • Gene therapy is a promising method for curing a large number of diseases that are caused by a germline or somatic gene defect, such as hereditary diseases and cancer (Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1999; 16 (2): 147-207).
  • nucleic acids are introduced into the target cell, which are supposed to fix the defect there directly.
  • Several methods for introducing nucleic acids into the cell have been developed in recent decades. This includes the introduction of nucleic acids into the cell using viral vectors, lipofection and directed Uptake by means of receptor-mediated endocytosis, such as. B. transfer infection.
  • the disadvantages of viral systems compared to the other systems have become increasingly clear in recent years, so that the future of gene therapy probably lies in the use of other systems.
  • Transfer infection is based on the natural transferrin-transferrin receptor endocytosis system, which ensures the iron supply in proliferating, differentiating and hemoglobin-synthesizing human cells (Theil, EC, Aisen, P. (1987) The storage and transport of iron in animal cells. Iron transport in Microbes, Plants, Ani- als, pp. 491-520, Winkelmann, G., van der Helm, D. and Neilands, JB (editor), VCH, Weinheim).
  • the naturally occurring transferrin-transferrin receptor endocytosis system was modified by coupling the DNA to the transferrin ligand (E. Wagner et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2: 226-231).
  • the ligand binds specifically to the cell surface receptor of the target cell and is taken up by endocytosis. Polycations such as polyethyleneimine or polylysine are used to neutralize the negative charge of the DNA, to condense the DNA and thus make it accessible for uptake. It.
  • a first approach consists in introducing directly translatable RNA into a target cell, in which case an active substance encoded by the RNA is expressed by the cell's own mechanisms.
  • Antisense RNA, RNA aptamers, siRNA and ribozymes can be used to modulate naturally occurring processes at the RNA level in a cell due to malfunctions, mutations, etc.
  • the use and modulation or promotion of natural endocytosis processes is required so that the nucleic acid is introduced into the cell in a sufficiently large amount.
  • Cells transfected in vitro can also be used for therapeutic purposes.
  • tumor cells can be removed from a patient, cultivated in vitro and genetically modified in a targeted manner, for example with an expression cassette for a gene which stimulates an immune response against the tumor cells. These changed cells can then be presented to the patient again and can then trigger immune reactions in the patient which are directed against the unmodified tumor cells of the patient. In this way, a patient and tumor-specific tumor vaccine is obtained.
  • HSV Herpes Simplex Viruses
  • endocytosis generally denotes the uptake of extracellular, corpuscular or dissolved, mostly macromolecular material in a cell.
  • Macromolecular means compounds with a molecular weight above 300 da, preferably above 500 da, most preferably above 1000 da.
  • the naturally absorbable macromolecules include, for example, antibodies, enzymes, antigen-antibody complexes, lipoproteins, LDL, transferrin and nucleic acids.
  • Naturally ingestible corpuscular material includes, for example, viruses, bacteria and protozoa.
  • the macromolecular nucleic acids must at least be the first Step taken up in the cytosol, possibly also ' transported further into the nucleus.
  • auxiliaries are substances which act on one or more steps of endocytosis to increase or modulate the transport rate.
  • quinoline ring structures such as chloroquine
  • phenathiazines such as chlorpromazine
  • Tricyclic substances are known from other contexts, such as desipramine or amoxapine. These compounds are antidepressants.
  • the invention is based on the technical problem of specifying agents which improve the endocytosis of macromolecular active compounds.
  • the invention teaches the use of a substance according to formula I or II or several different such substances
  • Rl with a substituted C atom or several substituted C atoms
  • the 0, S or N atom counts as a C atom in the context of the term Cl-15-alkyl.
  • a radical Rl -CH2-CH2-CH2-NH-CH3 in this terminology would be C5-alkyl, where one carbon atom is substituted by one N-atom ⁇ .
  • a substance promotes endocytosis if, for example, in a transfection experiment, as indicated in the examples, the substance produces higher transfection rates or efficiencies compared to the same experiment, only with the use of the buffer (negative control).
  • the level of support can be determined and compared in the same way if the evaluation size is determined quantitatively, absolutely, relative to a negative control or relative to a defined reference substance that promotes endocytosis.
  • the invention is based on the surprising finding that so-called tricyclic antidepressants have an endocytosis-promoting effect.
  • Rl can be a secondary or tertiary amine.
  • Rl can in particular only be present and bound to D, and in the case of formula II D can be a C atom. ______ can be a single bond.
  • a and B can be a single bond.
  • C atoms and D be a C or N atom.
  • A can be a C atom, B an O atom and D a C atom.
  • R2 and R3 can in particular be -H.
  • A can be an N atom, B a C atom and D an O atom, where .... is a double bond.
  • Suitable substances are: desipramine, imipramin, trimipramine, amitriptyline, nortriptyline, doxepin, amoxapine, maprotyline and other tricyclic antidepressants.
  • a preferred embodiment of the invention of independent importance is characterized in that the pharmaceutical composition additionally comprises a quinoline ring compound and / or a phenathiazine compound, optionally selected from the group consisting of "Chloroquine, Chlorpromazin, Primazin, Quinin, Biquinolin, Phenathiazin and Chlorpromazin" contains.
  • a variant of this embodiment generally comprises the use of a mixture of at least two different substances selected from the group consisting of "quinoline ring compounds promoting endocytosis and / or a phenathiazine compound, endocytosis promoting substance according to one of claims 1 to 9" for the production of a pharmaceutical Composition containing an active compound with a different from the substances
  • an alkylpolyamine can also be combined with one.
  • Alkyl polyamines with molecular weights between 100 and 50,000 are suitable.
  • the alkyl polyamines are preferably linear.
  • the polyamines also preferably have one or two primary ones A in groups.
  • branched alkyl polyamines possibly with more primary amine groups, can also be used in principle.
  • the pharmaceutical composition can contain any active compound whose introduction into a cell is desirable.
  • the dosage units can be given simultaneously or in succession, in both possible orders.
  • a defined sequence is a selected and specified known sequence.
  • the construct can contain several such sequences. In the latter case, the multiple sequences can also be different, in particular, for example, be variants of a sequence within which partial sequences are specifically randomized.
  • Such a randomization can relate to 1 to 10, preferably 1 to 4, connected or not connected nucleotides. Randomization means that a randomized nucleotide position can have any of the 4 different nucleotides.
  • the invention further teaches the use of a substance used according to the invention or several different such substances, optionally in a mixture with a quinoline ring compound and / or a phenathiazine compound, optionally selected from the group consisting of "chloroquine, primazine, quinine, biquinoline, Phenathiazine and chlorpromazine ", to promote the endocytosis of an active compound, in particular a construct containing a nucleic acid of a defined sequence or consisting thereof, the cell being incubated in vitro with the active compound and the substance.
  • a substance used according to the invention or several different such substances optionally in a mixture with a quinoline ring compound and / or a phenathiazine compound, optionally selected from the group consisting of "chloroquine, primazine, quinine, biquinoline, Phenathiazine and chlorpromazine ", to promote the endocytosis of an active compound, in particular a construct containing
  • the invention further teaches a method for the transient or stable transfection of a cell in vitro, the cell having a construct containing a nucleic acid of a defined sequence or consisting thereof, and a substance used according to the invention or several different such substances, optionally in a mixture with a quinoline ring compound and / or a phenathiazine compound, optionally selected from the group consisting of "chloroquine, primazine, quinine, biquinoline, phenathiazine and chlorpromazine", the substance causing the endocytotic uptake of the nucleic acid into the cell (endocytosis), and wherein the nucleic acid enters the cell and exerts its effect there (for example, the cell is transfected).
  • the construct can contain a marker gene, or the incubation can be carried out with a second construct containing a nucleic acid coding for a marker gene or consisting thereof.
  • This variant allows easy control of the transfection by detection of the expression product of the marker gene (e.g. GFP, luciferase measurement).
  • the invention teaches a stable or transiently transfected cell which can be obtained by a cell with a construct containing a nucleic acid of a defined sequence or consisting thereof, and a substance used according to the invention or several different such substances, optionally in a mixture with one Quinoline ring compound and / or a phenathiazine compound, optionally selected from the group consisting of "chloroquine, pri azine, quinine, biquinoline, phenathiazine and chlorpromazine", is incubated, the substance causing the endocytotic uptake of the construct, and wherein the nucleic acid is the cell transfected.
  • the pharmaceutical preparation of a pharmaceutical composition according to the invention can be carried out in a manner customary in the art.
  • counterions for ionic substances and / or active compounds for example Na + , K + , Li + or Cyclohexylam onium come into question.
  • Ar ⁇ ines in particular can be present as the hydrochloride.
  • Suitable solid or liquid pharmaceutical preparation forms are, for example, granules, powders, dragees, tablets, (micro) capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions (IV, IP, IM) and preparations with protracted release of active ingredient, in the production of which conventional auxiliaries such as carriers, explosives, binders, coatings, swelling agents, lubricants or lubricants, flavorings, sweeteners and solubilizers are used.
  • auxiliaries such as carriers, explosives, binders, coatings, swelling agents, lubricants or lubricants, flavorings, sweeteners and solubilizers are used.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be produced by at least one substance used according to the invention in a defined dose with a pharmaceutically suitable and physiologically compatible carrier and, if appropriate, further suitable ones Active ingredients, additives or auxiliaries are mixed and prepared to the desired dosage form.
  • Target cells in vitro or in vivo, can in principle be all primary cells of an organism, for example somatic pluripotent cells or T cells, and all cell lines for use in in vitro experiments.
  • T cells the substances used according to the invention are advantageous over chloroquine.
  • Particular applications are, for example, in gene therapy, the generation of organisms, such as laboratory animals, for certain experimental purposes, but also in transplantation medicine, storage damage to the cells of the organs to be transplanted can be prevented or repaired and / or the organs in their Immune behavior can be changed so that rejection reactions do not take place in the body of the recipient.
  • Example 1 Active substance containing a nucleic acid (test form)
  • the plasr ⁇ id described below was used as the model active substance.
  • the plasmid pFL1 was used as described in the reference D. Botstein et al., Gene 8: 17-24 (1979).
  • pFLl is a 2 ⁇ m circular plasmid for Saccharomyces cerevisiae (Sa) with a high number of copies. It contains the Sa gene URA3 and parts of the pBR322 E. coli plasmid for the replication and selection in E. coli as a selective marker for ura3 auxotrophic yeast strains.
  • the plasmid was kept in E. coli SF8 and purified with the Qiagen Plasmid Mega Kit (Qiagen, Hilden, Germany).
  • the luciferase gene was cloned with Notl (NEB) in pBluescript SK (+) (Stratagene, Heidelberg, Germany), under the control of a CMV promoter and an SV40 poly-A signal.
  • This plasmid was ar ⁇ plified in E. coli DH5.
  • the DNA was purified using the Qiagen Plasmid Maxi Kit.
  • a first cell system is a yeast system.
  • the transfection protocol corresponded to that of the literature reference B. Neukamm et al. , Biochimica et Biophysica Acta 1572: 67-76 (2002).
  • a laboratory robot Zeinsser, Frankfurt, Germany was used for the measurements and a pipetting protocol was created.
  • Yeast precultures were grown from cultures of a -70 ° C glycerol stock of the strain RPY10 (R.C. Piper et al., Eur J Cell Biol 65: 305-318 (1995) for 72 hours
  • the subsequent pipetting protocol was as follows. First, solutions of a substance according to the invention or a comparison substance with different concentrations were added. Exactly 5 minutes later, 10 ⁇ l of a solution or suspension of the pFLl plas id (0.15 ⁇ g / ⁇ l) from Example 1 were automatically added to the mixture of cells and substance. Some wells were used for the negative control, with only the solvents and plasmid used being added to the cell suspension, but not substance. After completion of the pipetting t michsprotokolls the plate was covered 'and the Desyre mixer placed (Zinsser Analytik). After vortexing at 1300 rpm for 1 minute, incubation was carried out at 28 ° C. for 18-20 hours. After the incubation, 110 ⁇ l of distilled water were added slowly. Then the cells of each well were placed on 6-well plates (PS-
  • Macroplate, Greiner transferred, filled with 4 ml of WMIXura (Neukamm et al, see above) medium.
  • the wells of the microtiter plate were each distilled with 50 ⁇ l Washed water and the wash solution was pipetted onto the solid surface of the WMIXura.
  • the macroplates were allowed to dry and incubated for 4 days at 28 ° C.
  • Colony forming units (cfu) were then counted in each well. The cfu values obtained were compared to the cfu values of the negative control. This quotient is a measure of the transfection effectiveness.
  • HepG2 cells were grown in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco BRL, Eggenstein, Germany) supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum, Gibco) and 1 ⁇ g / r ⁇ l insulin. On day 1, the cells were detached by trypsinization, washed and divided into the wells of a 24-well tissue culture dish, namely 1.5 * 10 5 cells per well.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the transfection experiments were carried out with the luciferase plasmid from Example 1 and with various substances at about 70 to 80% confluence. For this purpose, the supernatant was removed and then a mixture (250 ⁇ l) containing medium, 12.5 ⁇ l dextran (10 mg / ml), 0.5 ⁇ l of the plas id and the respective substance were added to each well. After 2.5 hours incubation at 37 ° C, the supernatant was removed and 500 ul complete medium was added to each well. On day 5, the luciferase activity was measured using the Dual-Luciferase® Reporter Assay System Kit (Promega, Mannheim, Germany).
  • the optimal concentration was determined using a series of concentrations. For this purpose, series of concentrations of the respective substances were used. Corresponding measurements have been carried out with chloroquine for comparison. The results are shown in Figures la (yeast system) and lb (mammalian cell system). The ordinate values are normalized to chloroquine. It can be seen that ' in the case of the substances amoxapine, desipramine, maprotiline and chlorpromazine, the optimal concentrations are lower than in the case of chloroquine. In principle, the lowest possible concentrations are desirable and advantageous with regard to side effects. Only in the case of doxepine is the optimal concentration similar to that of chloroquine.
  • typical usable doses of the tricyclic antidepressants used according to the invention are in the range from 1 to 200 mg per day (adults with a body weight of 75 kg), preferably 30 to 120 mg.
  • the amount of active substance in a composition according to the invention depends on the doses customary for the active substance.
  • the doses of the active substance are preferably equal to or less than the doses which are customary without administration of the substances used according to the invention.
  • the doses can be reduced by up to 90% and more.

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Abstract

Die Erfindung lehrt die Verwendung einer trizyklischen Verbindung zur Förderung der endocytotischen Aufnahme makromolekularer Wirkverbindungen.

Description

Verwendung eines trizyklischen Antidepressivums zur Förderung der Endozytose.
Gebiet der Erfindung.
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Substanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Förderung der Endozytose einer Wirkverbindung, insbesondere eines Konstrukts enthaltend eine Nukleinsäure oder bestehend hieraus, beispielsweise im Rahmen einer Gentherapie oder der Tranfektion von Säugerzellen. Die Erfindung betrifft desweiteren Verfahren zur Förderung der Endozytose und Zellen, welche mit einem solchen Verfahren transformiert sind.
Hintergrund der Erfindung.
Bei verschiedensten therapeutischen Ansätzen ist es not- wendig, Wirkverbindungen mit hohen Molekulargewichten einzusetzen. Einige Beispiel werden folgend kurz erläutert.
Die Gentherapie ist eine vielversprechende Methode zur Heilung von einer Vielzahl von Krankheiten, die durch einen keimbahngängigen oder somatischen Gendefekt hervorgerufen werden, wie Erbkrankheiten und Krebs (Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1999; 16(2): 147-207). Bei der Gentherapie werden Nukleinsäuren in die Zielzelle eingebracht, die dort den Defekt direkt beheben sollen. In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Verfahren zur Einbringung von Nukleinsäuren in die Zelle entwickelt. Dazu zählt das Einbringen von Nukleinsäuren in die Zelle mittels vi- raler Vektoren, die Lipofektion und die gerichtete Aufnahme mittels rezeptorvermittelter Endozytose, wie z. B. die Transferrinfektion. Die Nachteile viraler Systeme gegenüber den restlichen Systemen wurden in den letzten Jahren immer deutlicher, so daß die Zukunft der Genthera- pie wahrscheinlich in der Benutzung anderer Systeme liegt. Dieses ist ein Verfahren, das sich der natürlichen Endozy- tose echanismen der Zelle bedient. Die Transferrinfektion beruht auf dem natürlichen Transferrin-Transferrin- rezeptor-Endocytose-System, das die Eisenversorgung in proliferierenden, differenzierenden und Hämoglobinsynthetisierenden humanen Zellen gewährleistet (Theil, E.C., Aisen, P. (1987) The storage and transport of iron in animal cells. Iron transport in Microbes, Plants, Ani- als, pp. 491-520, Winkelmann, G., van der Helm, D. und Neilands, J.B. ( Herausgeber) , VCH, Weinheim) . Beim Transferrinfektionssysterα wurde das natürlich vorkommenden Transferrin-Transferrinrezeptor-Endozytosesyste modifiziert, indem die DNA an den Liganden Transferrin gekoppelt wurde (E. Wagner et al . , 1991, Bioconjugate Chem. 2:226-231). Der Ligand bindet spezifisch an den Zellober- flächenrezeptor der Zielzelle und wird durch Endozytose aufgenommen. Um die negative Ladung der DNA zu neutralisieren, die DNA zu kondensieren und sie somit einer Aufnahme zugänglich zu machen, werden Polykationen wie Polyethylenimin oder Polylysin eingesetzt. Es. konnte außerdem gezeigt werden, daß auch kondensierte DNA, die an keinen Liganden gekoppelt ist, endocytotisch aufgenommen wird (W.T. Godbey et al . , 1996, PNAS 96:5177-5181) und dieses System wird als Polyfektion beschrieben. Für eine gentherapeutische Nutzung der bisher entwickelten Systeme zum zielgerichteten Einbringen von Nukleinsäuren in eu- karyontische Zellen durch Endozytose ist jedoch die Aufnahmerate, Stabilisierung der DNA vor Degradation in den zelleigenen Kompartimenten und Transfereffizienz an den Wirkungsort (Cytosol oder Kern) unzureichend (Mahato RI (1999) Non-viral peptide-based approaches to gene deliv- ery. J Drug Target. 7 (4) : 249-68) .
Neben der Gentherapie gibt es weitere Behandlungsansätze und Nutzung meist makromolekularer Nukleinsäuren. Ein erster Ansatz besteht in der Einschleusung von direkt translatierbarer RNA in eine Zielzelle, wobei dann ein durch die RNA codierter Wirkstoff durch die zelleigenen Mechanismen exprimiert wird. Mittels Antisense RNA, RNA-Aptameren, siRNA und Ribozymen können in einer Zelle aufgrund von Fehlfunktionen, Mutationen, etc. natürlicherweise ablaufenden Prozesse auf RNA-Ebene moduliert werden. Auch in diesen Zusammenhängen ist die Nutzung und Modulation bzw. Förderung natürlicher Endozytoseprozesse erforderlich, damit die Nukleinsäure in ausreichend großer Menge in die Zelle eingeschleust wird.
Entsprechendes gilt für andere nieder- und/oder makromolekulare Moleküle in therapeutischen Zusammenhängen, die nur schwer oder gar nicht die Membranbarriere überwinden können und im Komplex mit Proteinen, Nukleinsäuren oder synthetischen Makromolekülen mittels Endozytose in die Zelle aufgenommen werden können. Hierzu gehören insbesondere alle Medikamente, die im Plasma in ionisierter Form vorliegen und für die kein geeignetes zelluläres Trans- portsystem existiert. Weiterhin ist es wünschenswert, ein Verfahren zur Verfügung zu haben für die Aufnahme von lipophilen Pharmaka, die eine hohe Eiweissbindung aufweisen und nach in vitro Bindung an ein geeignetes Carrier-Protein oder ein anderes geeignetes Makromolekül über Endozytose in die Zielzelle aufgenommen werden können.
Auch können in vitro transfizierte Zellen ihrerseits zu therapeutischen Zwecken genutzt werden. Beispielsweise können einem Patienten Tumorzellen entnommen, in vitro kultiviert und gezielt gentechnisch verändert werden, beispielsweise mit einer Expressionskassette für ein Gen, das eine Immunreaktion gegen die Tumorzellen stimuliert. Diese veränderten Zellen können dann dem Patienten wieder dargereicht werden und können dann in dem Patienten Immunreaktionen auslösen, die sich gegen die nicht modifizierten Tumorzellen des Patienten richten. So wird ein patienten- und tumorspezifischer Tumorimpfstoff erhalten.
Bei dem Einsatz onkolytischer Viren werden spezielle Viren einem an Krebs erkrankten Organismus dargereicht. Diese Viren haben die Eigenschaft, zwar grundsätzlich alle Zellen zu infizieren, sich jedoch ausschließlich in Tumorzel- len zu vermehren und in diesen Tumorzellen Zelllyse auszulösen. In gesunden Zellen ruhen diese Viren dagegen. Bekannt ist beispielsweise der Einsatz modifizierter Her- pes Simplex Viren (HSV) zur Behandlung von Gehirntumoren.
Insbesondere in therapeutischen Anwendungen stellt sich also das grundsätzliche Problem, die Wirkverbindung aus dem extrazellulären Raum in die Zelle hinein und aus den endocytotischen Kompartimenten in das Cytosol zu' transportieren, i.e. Endozytose zu bewirken, oder eine natürli- cherweise stattfindende Endozytose zu verstärken, damit weniger Wirksubstanz benötigt wird bzw. Transfektionsraten ausreichend sind. Der Begriff der Endozytose bezeichnet im Rahmen dieser Beschreibung allgemein die Aufnahme von extracellulärem, korpuskularem oder gelöstem, meist makromolekularem Material in eine Zelle. Makromolekular meint Verbindungen mit einem Molekulargewicht oberhalb von 300 da, vorzugsweise von oberhalb 500 da, höchstvorzugsweise von oberhalb 1000 da. Zu den natürlicherweise aufnehmbaren Makromolekülen gehören beispiels- weise Antikörper, Enzyme, Antigen-Antikörper-Komplexe, Lipoproteine, LDL, Transferrin und Nukleinsäuren. Natürlicherweise aufnehmbare korpuskulares Material umfaßt beispielsweise Viren, Bakterien und Protozoen. Unter anderem im Rahmen gentherapeutischer Maßnahmen, aber auch bei der Nutzung von direkt translatierbaren RNA-Molekülen oder als Antisense-RNA, Ribozyme, siRNA oder RNA-Aptamere wirkenden Nukleinsäuren .(einschließlich nicht-natürliche Derivate wie PNA) müssen die makromolekularen Nukleinsäuren zumindest als ersten Schritt in das Cytosol aufgenommen, ggf.' auch weiter in den Kern transportiert werden. Methoden und Hilfsstoffe, wie bei den im Rahmen der pharmazeutischen Industrie bislang favorisierten niedermolekularen Wirkstoffe sind hierfür ungeeignet. Vielmehr müssen die natürlichen Endozytosemechanismen genutzt und die Transportrate von der Zellmembran bis zum Wirkort durch geeignete Hilfsstoffe auf ein brauchbares Niveau angehoben werden .
Solche Hilfsstoffe sind Substanzen, die auf einen oder mehrere Schritte der Endozytose die Transportrate erhöhend einwirken bzw. diese modulieren. Bekannt ist der Einsatz von Quinolinringstrukturen, wie Chloroquin, als die En- dozytose fördernde Substanz. Hierzu wird lediglich beispielsweise auf die Literaturstelle B. Neukamm et al . , Biochimica et Biophysica Acta, 1572:67-76 (2002), sowie die darin genannten Zitate verwiesen. Weiterhin ist bekannt der Einsatz von Phenathiazinen, wie Chlorpromazin, zur Förderung der Endozytose.
Aus anderen Zusammenhängen sind trizyklische Substanzen bekannt, wie beispielsweise Desipramin oder Amoxapin. Bei diesen Verbindungen handelt es sich um Antidepressiva .
Technisches Problem der Erfindung.
Der Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, Mittel anzugeben, welche die Endozytose makromolekularer Wirkverbindungen verbessern.
Grundzüge der Erfindung und Ausführungsformen.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung die Verwendung einer Substanz gemäß Formel I oder II oder mehrerer verschiedener solche Substanzen
wobei A, B und D gleich oder verschieden und jeweils ein C-, N-, S-, oder O-Atom sind, wobei eine Einfachoder Doppelbindung ist, wobei freie Valenzen mit -H gebun- den sind, wobei Rl einfach, zweifach oder dreifach vorhanden und -H, -Cl-15-Alkyl (verzweigt, linear oder zyklisch) , oder -Cl-15-Alkyl (verzweigt, linear oder zyklisch) mit einem oder mehreren C-Atomen substituiert durch 0, S oder N ist, wobei R2 und R3 gleich oder verschieden, jeweils und unabhängig voneinander einfach, zweifach, dreifach oder vierfach vorhanden und -H, oder -Hai sind, wobei -Hai = -F, -Cl, oder -Br, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Förderung der Endocy- tose von Wirkverbindungen. Im Falle von Rl mit substi- tuiertem C-Atom oder mehreren substituierten C-Atomen zählt das 0-, S- bzw. N- Atom im Rahmen des Begriffes Cl-15-Alkyl als C-Atom. Beispielsweise wäre ein Rest Rl -CH2-CH2-CH2-NH-CH3 in dieser Terminologie C5-Alkyl, wobei ein C-Atom durch ein N-Atorα substituiert ist.
Eine Substanz ist die Endozytose fördernd, wenn die Substanz beispielsweise in einem Transfektionsexperiment, wie in den Beispielen angegeben, höhere Transfektionsraten bzw. Effizienzen bewirkt im Vergleich zum gleichen Experi- ment, nur mit Einsatz des Puffers (Negativkontrolle) . Das Maß der Förderung ist in gleicher Weise bestimmbar und vergleichbar, wenn die Auswertegrösse quantitativ bestimmt wird, absolut, relativ zu einer Negativkontrolle oder relativ zu einer definierten die Endozytose fördernden Referenzsubstanz. Die Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, dass sogenannte trizyklische Antidepressiva eine die Endozytose fördernde Wirkung haben.
Im einzelnen kann die Substanz die folgenden bevorzugten Strukturmerkmale aufweisen. Rl kann ein sekundäres oder tertiäres Amin sein. Bevorzugte Beispiele für Rl sind: -CH2-CH2-CH2-NH-CH3 -CH2-CH2-CH2-N (CH3) 2 -CH,-CH(CH3)-CH2-N(CH3), =CH-CH2-CH2-NHCH3 =CH-CH2-CH2-N(CH3)2 1-Piperazinyl . Rl kann insbesondere nur einfach vorhanden und an D gebun- den sein, wobei im Falle der Formel II D ein C-Atom sein kann. ______ kann eine Einfachbindung sein. A und B können
C-Atome und D ein C- oder N-Atom sein. Alternativ können A ein C-Atom, B ein O-Atom und D ein C-Atom sein. R2 und R3 können insbesondere -H sein. A kann ein N-Atom, B ein C- Atom und D ein O-Atom sein, wobei .... eine Doppelbindung ist. R2 kann einfach vorhanden und -Hai sein, und wobei Rl = -H ist.
Beispiele für geeignete Substanzen sind: Desipramin, Imi- pramin, Trimipramin, Amitriptylin, Nortriptylin, Doxepin, Amoxapin, Maprotylin und andere trizyklische Antidepressiva .
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung von selbstständiger Bedeutung ist dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich eine Quino- linringverbindung und/oder eine Phenathiazinverbindung, optional ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Chloroquin, Chlorpromazin, Primazin, Quinin, Biquinolin, Phenathiazin und Chlorpromazin", enthält. Eine Variante dieser Ausführungsform umfasst generell die Verwendung einer Mischung aus zumindest zwei verschiedenen Substanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "die Endocytose fördernde Quinolinringverbindungen und/oder eine Phenathi- azinverbindungen, die Endozytose fördernde Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 9" zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltend eine von den Sub- stanzen verschiedene Wirkverbindung mit einem
Molekulargewicht grösser als 300. Diese Ausführungsformen der Erfindung beruhen auf der Erkenntnis, dass eine solche Kombination von bekannten die Endozytose fördernden Substanzen mit erfindungsgemäß neu eingesetzten Substanzen, aber auch ausschließlich von bereits bekannten die Endozytose fördernden Substanzen, zu synergistischen Effekten führt. Überraschenderweise werden Transfektionsraten erzielt, die erheblich über jenen liegen, die mit den jeweiligen Substanzen allein erreichbar sind. Diese Er- läuterungen gelten insbesondere auch hinsichtlich der zweitgenannten Variante auch für die folgend dargestellten Aspekte der Erfindung.
Es ist auch möglich, sogenannte Triple- oder Multikombina- tionen mit drei oder mehr verschiedenen der vorstehend diskutierten Substanzen einzusetzen.
Alternativ oder zusätzlich zur Kombination mit der im vorstehenden Absatz genannten Gruppe kann auch mit einem ein Alkylpolyamin kombiniert werden. In Frage kommen Alkyl- polya ine mit Molekulargewichten zwischen 100 und 50.000. Bevorzugterweise sind die Alkylpoyamine linear. Weiterhin bevorzugt haben die Polyamine eine oder zwei primäre A ingruppen. Aber auch verzweigte Alkylpolyamine ggf. mit mehr primären Amingruppen sind grundsätzlich einsetzbar.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann im Prinzip jede Wirkverbindung enthalten, deren Einschleusung in eine Zelle wünschenswert ist. In einem wesentlichen Einsatzgebiet enthält die Wirkverbindung ein Konstrukt enthaltend ' eine Nukleinsäure definierter Sequenz oder bestehend hieraus, in Mischung mit den erfindungsgemäß eingesetzten Substanzen oder in separater Darreichungseinheit hierzu und zur gemeinsamen Anwendung bestimmt. In letzterem Falle können die Darreichungseinheiten zugleich oder nacheinander, in beiden möglichen Reihenfolgen, dargereicht werden.
Eine definierte Sequenz ist eine ausgewählte und vorgebene bekannte Sequenz. Das Konstrukt kann mehrere solcher Sequenzen enthalten. In letzterem Falle können die mehreren Sequenzen auch unterschiedlich sein, insbesondere beispielsweise Varianten einer Sequenz sein, innerhalb welcher gezielt Teilsequenzen randomisiert sind. Eine solche Randomisierung kann 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 4, miteinander verbundene oder nicht miteinander verbundene Nukleotide .betreffen. Randomisierung meint, dass eine ran- domisierte Nukleotidposition ein beliebiges der 4 verschiedenen Nukleotide aufweisen kann.
Die Erfindung lehrt desweiteren die Verwendung einer erfindungsgemäß eingesetzten Substanz oder mehrerer ver- schiedener solcher Substanzen, optional in Mischung mit einer Quinolinringverbindung und/oder eine Phenathiazin- verbindung, optional ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Chloroquin, Primazin, Quinin, Biquinolin, Phenathiazin und Chlorpromazin", zur Förderung der Endozytose einer Wirkverbindung, insbesondere eines Konstruktes enthaltend eine Nukleinsäure definierter Sequenz oder bestehend hieraus, wobei die Zelle in vitro mit der Wirkverbindung sowie der Substanz inkubiert wird.
Die Erfindung lehrt weiterhin ein Verfahren zur transien- ten oder stabilen Transfektion einer Zelle in vitro, wobei die Zelle mit einem Konstrukt enthaltend eine Nukleinsäure definierter Sequenz oder bestehend hieraus, sowie einer erfindungsgemäß eingesetzte Substanz oder mehrerer verschiedener solcher Substanzen, optional in Mischung mit einer Quinolinringverbindung und/oder einer Phenathiazin- verbindung, optional ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Chloroquin, Primazin, Quinin, Biquinolin, Phenathiazin und Chlorpromazin", inkubiert wird, wobei die Substanz die endocytotische Aufnahme der Nukleinsäure in die Zelle (Endozytose) bewirkt, und wobei die Nukleinsäure die Zelle gelangt und dort ihre Wirkung entfaltet (z.B. die Zelle transfiziert) . Dabei kann das Konstrukt ein Markergen enthalten, oder die Inkubation kann mit einem zweiten Konstrukt enthaltend eine Nukleinsäure codierend für ein Markergen oder bestehend hieraus durchgeführt werden. Diese Variante erlaubt leichte Kontrolle der Transfektion durch Detektion des Expressionsproduktes des Markergens (z.B. GFP, Luciferasemessung) .
Schliesslich lehrt die Erfindung eine stabil oder tran- sient transfizierte Zelle erhältlich indem eine Zelle mit einem Konstrukt enthaltend eine Nukleinsäure definierter Sequenz oder bestehend hieraus, sowie einer erfindungsgemäß eingesetzten Substanz oder mehrerer verschiedener solcher Substanzen, optional in Mischung mit einer Quinolinringverbindung und/oder einer Phenathiazinver- bindung, optional ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Chloroquin, Pri azin, Quinin, Biquinolin, Phenathiazin und Chlorpromazin", inkubiert wird, wobei die Substanz die endocytotische Aufnahme des Konstruktes bewirkt, und wobei die Nukleinsäure die Zelle transfiziert .
Die galenische Herrichtung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise erfolgen. Als Gegenionen für ionische Substanzen und/oder Wirkverbindungen kommen beispielsweise Na+, K+, Li+ oder Cyclohexylam onium infrage . Insbesondere Arαine können als Hydrochlorid vorliegen. Geeigenete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granu- late, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-) Kapseln, Sup- positorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder injizierbare Lösungen (i.V., i.p., i.m.) sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxyd, Lactose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyeth- ylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glyc- erin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens eine erfindungsgemäß verwendete Substanz in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet wird.
Die Erindung ist in den verschiedensten Bereichen anwend- bar. Zielzellen, in vitro oder in vivo, können grundsätzlich alle primären Zellen eines Organismus sein, beispielsweise somatische pluripotente Zellen oder T- Zellen, sowie alle Zelllinien zur Verwendung in in-vitro Experimenten. Beispielsweise im Falle der T-Zellen sind die erfindungsgemäß verwendeten Substanzen vorteilhaft gegenüber Chloroquin. Besondere Anwendungen liegen beispielsweise in der Gentherapie, der Generierung von Organismen, wie Labortiere, für bestimmte Versuchszwecke, aber auch in der Transplantationsmedizin, wobei Lagerungs- schaden der Zellen der zu transplantierenden Organe verhindert bzw. repariert werden können und/oder wobei die Organe in ihrem Immunverhalten so verändert werden können, dass Abstossungsreaktionen im Körper des Empfängers nicht stattfinden.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen sowie Vergleichsbeispielen näher erläutert .
Beispiel 1: Wirksubstanz enthaltend eine Nukleinsäure (Testform)
Zum Zwecke der Messung der die Endozytose fördernden Wirkung erfindungsgemäßer Substanzen wurde als Modell- Wirksubstanz das folgend beschriebene Plasrαid eingesetzt. Verwendet wurde das Plasmid pFLl, wie beschrieben in der Literaturstelle D. Botstein et al., Gene 8:17-24 (1979). pFLl ist ein 2 μm zirkuläres Plasmid für Saccharomyces cerevisiae (Sa) mit einer hohen Kopieanzahl. Es enthält als selektiven Marker für ura3 auxotrophe Hefestämme das Sa Gen URA3 sowie Teile des pBR322 E. coli Plasmids für die Replikation und Selektion in E. coli. Das Plasmid wurde in E. coli SF8 gehalten und mit dem Qiagen Plasmid Mega Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gereinigt.
Für Luciferase Zellkultur Assays wurde das Luciferasegen mit Notl (NEB) in pBlueskript SK (+) (Stratagene, Heidelberg, Deutschland) geklont, und zwar unter der Kontrolle eines CMV-Promotors und einem SV40 poly-A-Signal. Dieses Plasmid wurde in E. coli DH5 arαplifiziert . Die DNA wurde mit dem Qiagen Plasmid Maxi Kit gereinigt.
Beispiel 2: Modell-Zellsysteme
2a: Hefesystem
Ein erstes Zellsystem ist ein Hefesystem. Das Transfek- tionsprotokoll entsprach jenem der Literaturstelle B. Neukamm et al . , Biochimica et Biophysica Acta 1572:67-76 (2002) . Für die Messungen wurde ein Laborrobotor (Zinsser, Frankfurt, Deutschland) eingesetzt und ein Pipettierungs- protokoll wurde erstellt.
Hefe Vorkulturen wurden aus Kulturen eines -70°C Glycerol Vorrates des Stammes RPY10 (R.C. Piper et al . , Eur J Cell Biol 65:305-318 (1995) für 72 Stunden gezogen. In der
Hauptkultur wurden die Zellen über Nacht in YPD Medium bis zu einer Zelldichte von 5 bis 8 * 107 Zellen/ml gezogen. 12 * 109 Zellen wurden geerntet und zweimal mit dem gleichen Volumen destillierten Wassers gewaschen. Die Zellen wurden durch Einweichen in destilliertem Wasser für 30 Minuten bei 4°C kompetent für die Transfektion gemacht. Die kompetenten Zellen wurden geerntet und in 10 ml 34% Sucrose, eingestellt auf pH 4 mit HCl, resuspendiert. Die Suspension wurde umgehend in sterilisierte 40 ml Glassröhrchen (Zinsser Analytik, Frankfurt, Deutschland) übertragen, welche dann mit Aluminiumfolie verschlossen wurden. Die Röhrchen wurden dann auf einen Schüttler auf der Plattform des Laborroboters plaziert und für 40 Sekunden bei 300 UpM behandelt. Die Suspension wurde automatisch in die Vertiefungen einer 96-well Mikrotiterplatte verteilt (je 80 μl unter Verwendung von Edelstahlspitzen) .
Das anschliessende Pipettierungsprotokoll war wie folgt. Zunächst wurden Lösungen einer erfindungsgemäßen Substanz oder einer Vergleichssubstanz mit verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Exakt 5 Minuten später wurden 10 μl einer Lösung bzw. Suspension des pFLl Plas ids (0,15 μg/μl) aus Beispiel 1 automatisch zu der Mischung aus Zellen und Substanz gegeben. Einige Wells wurden zur Negativkontrolle verwendet, wobei lediglich die verwendeten Lösungsmittel und das Plasmid zur Zellsuspension zugegeben wurden, nicht jedoch Substanz. Nach Beendigung des Pipet- tierungsprotokolls wurde die Platte abgedeckt ' und auf den Desyre-Mixer plaziert (Zinsser Analytik) . Nach Vortexen für 1 Minute bei 1300 UpM erfolgte eine Inkubation bei 28°C für 18-20 Stunden. Nach der Inkubation wurden jeweils 110 μl destilliertes Wasser langsam zugegeben. Dann wurden die Zellen jeder Vertiefung auf 6-well Platten (PS-
Macroplate, Greiner) transferriert, mit 4 ml WMIXura (Neukamm et al, s.o.) Medium aufgefüllt. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte wurden jeweils mit 50 μl destilliertem Wasser gewaschen und die Waschlösung wurde auf die feste Oberfläche des WMIXura pipettiert. Die Macroplates wurden trocknen gelassen und 4 Tage bei 28°C inkubiert.
Kolonie-bildende Einheiten (cfu) wurden dann in jeder Vertiefung gezählt. Die erhaltenen cfu-Werte wurden in das Verhältnis zu den cfu-Werten der Negativkontrolle gesetzt. Dieser Quotient ist ein Maß für die Transfektionseffektivität .
2b: Säugerzellen System
HepG2 Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland) , supplementiert mit 10% FBS (fetal bovine serum, Gibco) und 1 μg/rαl Insulin, gezogen. Am Tag 1 wurden die Zellen mittels Trypsinierung abgelöst, gewaschen und auf die Vertiefungen einer 24-wells Gewebekulturschale aufgeteilt, und zwar 1,5 * 105 Zellen je Vertiefung.
Ca. 24 Stunden später wurden die Transfektionsversuche mit dem Luciferase Plasmid aus Beispiel 1 und mit verschiedenen Substanzen bei ca. 70 bis 80% Konfluenz durch- geführt. Dazu wurde der Überstand entfernt und dann eine Mischung (250 μl) enthaltend Medium, 12,5 μl Dextran (10 mg/ml), 0,5 μl des Plas ids und die jeweilige Substanz zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach 2, 5-stündiger Inkubation bei 37 °C wurde der Überstand entfernt und wurden 500 μl Komplettmedium zu jeder Vertiefung zugegeben. Am Tag 5 wurde die Luciferase-Aktivität unter Verwendung des Dual- Luciferase® Reporter Assay System Kit (Promega, Mannheim, Deutschland) gemessen. Hierzu wurden 48 Stunden nach der Transfektion die Zellkulturüberstände entfernt und die Zellen nach Zugabe von 100 μl lx Lysis Puffer je Vertiefung (Promega) für 20 Minuten bei 20°C auf einem langsamen Schüttler solubilisiert . 20 μl des zeilfreien Überstand wurden in eine 96-well Platte (Corning und Costar,' Wiesbaden, Deutschland) transferiert und mit 100 μl Luciferase Assay-Puffer versetzt. Die Luciferaseaktivität wurde mit einem Luminometer (EG&G Berthold MicrolumatPlus) gemessen.
Beispiel 3: Bestimmung der optimalen Konzentrationen
Für jede eingesetzte Substanz wurde mittels Konzentrationsreihen die optimale Konzentration bestimmt. Hierzu wurden Konzentrationsreihen der jeweiligen Substanzen eingesetzt. Zum Vergleich sind entsprechende Messungen mit Chloroquin durchgeführt worden. Die Ergebnisse sind in den Figuren la (Hefesystem) und lb (Säugerzellensystem) angegeben. Die Ordinatenwerte sind auf Chloroquin nor - iert. Man erkennt,' dass im Falle der Substanzen Amoxapine, Desipramine, Maprotiline und Chlorpromazine die optimalen Konzentrationen niedriger als im Falle von Chloroquin liegen. Grundsätzlich sind im Hinblick auf Nebenwirkungen möglichst geringe Konzentrationen wünschenswert und vorteilhaft. Lediglich im Falle von Doxepine ist die optimale Konzentration ähnlich hoch wie bei Chloroquin.
Beispiel 4: Mischungen von Substanzen
In der Figur 2 sind Experimente mit Mischungen von er-' findungsgemäß eingesetzten Substanzen dargestellt. Hierbei wurde jeweils mit optimalen Konzentrationen, wie in Beispiel 3 bestimmt, gearbeitet. CQ steht für Chloroquin. Man erkennt im Falle der Mischungen von Chloroquin mit erfindungsgemäßen Substanzen durchgehend drastisch erhöhte Luciferaseaktivität, verglichen mit dem Einsatz von Chloroquin allein. Eine vergleichende Betrachtung mit der Figur lb zeigt, dass auch gegenüber dem Einsatz der erfindungsgemäßen Substanzen allein drastisch erhöhte Werte erhalten werden. Insgesamt führt also der Einsatz von solchen Mischungen zu einer erheblichen Verbesserung der Transfektionseffizienz, woraus sich allgemein eine erhebliche Verbesserung der Förderung der Endozytose ergibt.
Beispiel 5: Dosierungen
Unabhängig von den vorstehenden Ausführungsbeispielen sind typische einsetzbare Dosen der erfindungsgemäß verwendeten trizyklischen Antidepressiva im Bereich von 1 bis 200 mg je Tag (Erwachsener mit 75 kg Körpergewicht), vorzugsweise 30 bis 120 mg. Die Menge der Wirksubstanz in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung richtet sich nach den für die Wirksubstanz üblichen Dosen. Vorzugsweise sind die Dosen der Wirksubstanz gleich oder kleiner den Dosen, die ohne Gabe der erfindungsgemäß verwendeten üblich sind. Die Dosen können um bis zu 90% und mehr reduziert werden.

Claims

Patentansprüche :
1. Verwendung einer Substanz gemäß Formel I oder II oder mehrerer verschiedener solche Substanzen
wobei A, B und D gleich oder verschieden und jeweils ein C-, N-, S-, oder O-Atom sind,
wobei eine Einfach- oder Doppelbindung ist,
wobei freie Valenzen mit -H gebunden sind,
wobei Rl einfach, zweifach oder dreifach, im Falle der Formel II auch bis zu vierfach, vorhanden und -H, -Cl-15-Alkyl (verzweigt, linear oder zyklisch, gesättigt oder ungesättigt) , oder -Cl-15-Alkyl (verzweigt, linear oder zyklisch, gesättigt oder ungesättigt) mit einem oder mehreren C-Atomen substituiert durch O oder N ist, wobei Rl im Falle, dass A, B und/oder D in Formel I ein C-Atom ist, mit einer Einfach- oder einer Doppelbindung an ein solches C-Atom gebunden sein kann,
wobei R2 und R3 gleich oder verschieden, jeweils und unabhängig voneinander einfach, zweifach, dreifach oder vierfach vorhanden und -H, oder -Hai sind, wobei -Hai = -F, -Cl, oder -Br,
zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltend eine von der Substanz bzw. den Substanzen verschiedene Wirkverbindung mit einem Molekulargewicht grösser als 300.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei Rl ein sekundäres oder tertiäres Amin ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei Rl einfach vorhanden und an D gebunden ist, wobei im Falle der Formel II D ein C-Atom ist.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine Einfachbindung ist.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei A und B C-Atome sind und D ein C- oder N-Atom ist.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei A ein C-Atom, B ein O-Atom und D ein C-Atom ist.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei R2 und R3 -H sind.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei A ein N-Atom, B ein C-Atom und D ein O-Atom ist, und wobei .... eine Doppelbindung ist.
9. Verwendung nach Anspruch 9, wobei R2 einfach vorhanden und -Hai ist, und wobei Rl = -H ist.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich eine die Endocytose fördernde Quinolinringverbindung und/oder eine Phenathiazinverbindung oder mehrere verschiedene solcher Verbindungen, optional ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Chloroquin, Primazin, Quinin, Biquinolin, Phenathiazin und Chlorpromazin", enthält.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung die Wirkverbindung, insbesondere ein Konstrukt enthaltend eine Nukleinsäure definierter Sequenz oder bestehend hieraus, in Mischung oder in separater Verpackungseinheit enthält.
12. Verwendung einer Substanz gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9 oder mehrerer verschiedener solcher Substanzen, optional in Mischung mit einer die Endocytose fördernden Quinolinringverbindung und/oder eine
Phenathiazinverbindung, optional ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Chloroquin, Primazin, Quinin, Biquinolin, Phenathiazin und Chlorpromazin", zur Förderung der Endozytose einer Wirkverbindung, insbe- sondere eines Konstruktes enthaltend eine Nukleinsäure definierter Sequenz oder bestehend hieraus, wobei die Zelle in vitro mit der Wirkverbindung sowie der Substanz inkubiert wird.
13. Verfahren zur transienten oder stabilen Transfektion einer Zelle in vitro, wobei die Zelle mit einem Kos- trukt enthaltend eine Nukleinsäure definierter Sequenz oder bestehend hieraus, sowie einer Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder mehrerer verschiedener solcher Substanzen, optional in Mischung mit einer die Endozytose fördernde Quinolinringverbindung und/oder einer Phenathiazinverbindung, optional ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Chloroquin, Primazin, Quinin, Biquinolin, Phenathiazin und Chlorpromazin", inkubiert wird, wobei die Substanz die Endozytose der Nukleinsäure bewirkt, und wobei die Nukleinsäure die Zelle transfiziert .
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Konstrμkt ein Markergen enthält, oder wobei die Inkubation mit einem zweiten Konstrukt enthaltend eine Nukleinsäure codierend für ein Markergen oder bestehend hieraus durchgeführt wird.
15. Stabil oder transient transformierte Zelle erhältlich indem eine Zelle mit einem Konstrukt enthaltend eine Nukleinsäure definierter Sequenz oder bestehend hieraus, sowie einer Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder mehrerer verschiedener solcher Substanzen, optional in Mischung mit einer die Endozytose fördernden Quinolinringverbindung und/oder einer Phenathiazinverbindung, optional ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Chloroquin, Primazin, Quinin, Biquinolin, Phenathiazin und Chlorpromazin", inkubiert wird, wobei die Substanz die Endozytose des Konstruktes bewirkt, und wobei die Nukleinsäure die Zelle transformiert .
16. Verwendung einer Mischung aus zumindest zwei verschiedenen Substanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "die Endocytose fördernde Quinolin- ringverbindungen und/oder Phenathiazinverbindungen, Alkylpolyamine, und die Endozytose fördernden Substanz naςh einem der Ansprüche 1 bis 9" zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltend eine von den Substanzen verschiedene Wirkverbindung mit einem Molekulargewicht grösser als 300.
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