DE69633725T2

DE69633725T2 - Kationische lipide/dns komplexe zum zielen von genen

Info

Publication number: DE69633725T2
Application number: DE69633725T
Authority: DE
Inventors: M. Cori GORMAN; Molly Mcclarrinon
Original assignee: Urigen Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Urigen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2005-03-17
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: EP0832270B1; CA2223923A1; US5830878A; AU698318B2; EP0832270A1; WO1996040962A1; DE69633725D1; ATE280833T1; US6344446B1; AU6160996A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Bereich der Erfindung
Ein ständiges Ziel in der pharmakologischen Technik war die Entwicklung von Verfahren und Zusammensetzungen zum Vereinfachen der spezifischen Zuführung von therapeutischen und anderen Mitteln zu den geeigneten Zellen und Geweben, die von einer solchen Behandlung einen Vorteil hätten, und die Vermeidung der allgemeinen physiologischen Wirkungen der ungeeigneten Zuführung derartiger Mittel an andere Zellen oder Gewebe des Körpers. In jüngerer Zeit lieferte das Aufkommen rekombinanter DNA-Technologie und der Gentechnik für die pharmakologische Technik ein weites neues Spektrum von Mitteln, die funktionale Gene sind, getragen in rekombinanten Expressionskonstrukten, die in der Lage sind zum Vermitteln einer Expression dieser Gene in Wirtszellen. Diese Entwicklungen stützten die Erwartungen der "molekularen Medizin", insbesondere Gentherapie, wobei ein defektes Gen ersetzt werden könnte durch eine exogene Kopie seines entsprechenden funktionalen Gens, wobei eine Vielzahl von genetischen Erkrankungen gelindert wird.
Jedoch war der größte Nachteil zum Erreichen einer wirkungsvollen Gentherapie die begrenzte Fähigkeit in der Technik rekombinante Expressionskonstrukte, die für funktionale Gene codieren, in Zellen und Gewebe in vivo einzubringen.
Während es in der Technik erkannt worden ist, dass es wünschenswert ist die Effizienz und Spezifität der Verabreichung von Gentherapiemitteln an Zellen der relevanten Gewebe zu erhöhen, ist das Ziel der spezifischen Zuführung nach dem Stand der Technik nicht erreicht worden.
Liposomen sind verwendet worden, um dieses Zelltargeting zu erreichen. Rahman et al., 1982, Life Sci. 31: 2061-71 fanden, dass Liposomen, die Galactolipid als einen Teil des Lipids enthielten, eine höhere Affinität für parenchymale Zellen aufzuweisen schienen als Liposomen, welchen Galactolipid fehlte. Bis heute jedoch war eine effiziente oder spezifische Zuführung nicht vorhersehbar gewesen, die erreicht wird unter Verwendung von Liposomen mit eingekapselten Arzneimitteln. Es bleibt weiterhin ein Bedarf bestehen für die Entwicklung eines Zell- oder Gewebe-Targeting-Zuführungssystems.
Daher bleibt in der Technik ein Bedarf für Verfahren und Reagenzien zum Erreichen von Zell- und Gewebe-spezifischem Targeting von Gentherapiemitteln, insbesondere rekombinanten Expressionskonstrukten, die für funktionale Gene in vivo codieren.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf verbesserte Verfahren zur Zielgerichteten Zuführung von funktionalen Genen an Zellen und Gewebe in vivo. Dieses Zuführungssystem erreicht eine solche spezifische Zuführung durch die Bildung von DNA:Lipid-Komplexen zwischen Nukleinsäure, umfassend ein rekombinantes Expressionskonstrukt, das für ein funktionales Gen oder Fragment davon codiert, das komplexiert ist mit einem Gemisch aus einem kationischen Lipid und einem neutralen Lipid. Verfahren zur Anwendung werden ebenfalls bereitgestellt. Diese Erfindung hat den besonderen Vorteil der zielgerichteten Zuführung von funktionalen Genen in Zellen in vivo, das Erreichen effektiver intrazellulärer Zuführung von Konstrukten, die für funktionale Gene codieren, in wirkungsvollerer Art und mit höherer Spezifität als herkömmliche Zuführungssysteme.
In einer ersten Ausführungsform liefert die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Formulierung eines löslichen Komplexes eines rekombinanten Expressionskonstruktes und ein Gemisch aus einem neutralen Lipid und einem kationischen Lipid in einem pharmazeutisch verträglichen Träger das geeignet ist zur Verabreichung an ein Lebewesen durch Injektion. In dieser Ausführungsform der Erfindung umfasst das rekombinante Expressionskonstrukt eine Nukleinsäure, die für ein Transkriptionsprodukt codiert, wobei die Nukleinsäure operativ verbunden ist mit Genexpressionsregulationselementen und wobei die Nukleinsäure in der Lage ist zur in vivo-Transkription. Wie hier verwendet, ist der Ausdruck "Transkriptionsprodukt" so vorgesehen, dass er ein RNA-Produkt umfasst, das aus der Transkription einer Nukleinsäuresequenz resultiert, und umfasst explizit RNA-Sequenzen, die nicht in Protein transkribiert werden (wie etwa Anti-Sense-RNAs oder Ribozyme), als auch RNAs, die nachfolgend in Polypeptide oder Proteine translatiert werden.
In dieser ersten Ausführungsform ist das kationische Lipid ein Stickstoffenthaltendes, von Imidazolinium abgeleitetes kationisches Lipid mit der Formel
worin jedes aus R und R₁ unabhängig eine geradkettige aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit einschließlich 11 bis 29 Kohlenstoffatomen ist. Bevorzugt sind diejenigen Kationen, worin jedes aus R und R₁ unabhängig einschließlich von 13 bis 23 Kohlenstoffatome aufweist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das kationische Lipid 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid. In zusätzlichen bevorzugten Ausführungsformen ist das neutrale Lipid Cholesterol und das 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid und Cholesterol liegen in dem Komplex in einem molaren Verhältnis von 1:1 vor. Weitere bevorzugte Ausführungsformen umfassen ein rekombinantes Expressionskonstrukt, das für humanes CFTR codiert und ein Gemisch aus einem neutralen Lipid und einem kationischen Lipid mit einem Verhältnis von DNA zu Lipid von etwa 1:6 bis etwa 1:15 (μg DNA:nMol Lipid). Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, worin die DNA, die das rekombinante Expressionskonstrukt umfasst, in dem Komplex in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 1 mg/ml vorliegt. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist das kationische Lipid 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid und das neutrale Lipid ist Dioleoylphosphatidylethanolamin und das 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid und Dioleoylphosphatidylethanolamin liegen in dem Komplex in einem Verhältnis von 1:1 vor. Weitere bevorzugte Ausführungsformen umfassen ein rekombinantes Expressionskonstrukt und ein Gemisch eines neutralen Lipids und eines kationischen Lipids mit einem Verhältnis von DNA zu Lipid von etwa 1:1 (μg DNA:nMol Lipid). Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, worin die DNA, die das rekombinante Expressionskonstrukt umfasst, in der Formulierung in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 5 mg/ml vorliegt.
In einer zweiten Ausführungsform liefert die Erfindung Verfahren zum Einbringen eines rekombinanten Expressionskonstrukts in eine Zelle, die Lungengewebe umfasst, in einem Lebewesen, wobei das Verfahren den Schritt des Verabreichens der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung an das Lebewesen durch intravenöse Injektion umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das kationische Lipid 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid. In zusätzlichen bevorzugten Ausführungsformen ist das neutrale Lipid Cholesterol und das 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid und Cholesterol liegen in dem Komplex in einem molaren Verhältnis von 1:1 vor. Weitere bevorzugte Ausführungsformen umfassen ein rekombinantes Expressionskonstrukt und ein Gemisch eines neutralen Lipids und eines kationischen Lipids mit einem Verhältnis von DNA zu Lipid von etwa 1:6 bis etwa 1:15 (µg DNA:nMol Lipid). Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, worin die DNA, die das rekombinante Expressionskonstrukt umfasst, in der Formulierung in einer Konzentration von etwa 0,5-1 mg/ml vorliegt.
In einer anderen Hinsicht der zweiten Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren bereitgestellt zum Einbringen eines rekombinanten Expressionskonstrukts in eine Zelle in einem Lebewesen die Milzgewebe umfasst, wobei das Verfahren den Schritt des Verabreichens der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung an ein Lebewesen durch intravenöse Injektion umfasst. In bevorzugten Ausführungsformen ist das kationische Lipid 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid. In zusätzlichen bevorzugten Ausführungsformen ist das neutrale Lipid Dioleoylphosphatidylethanolamin und das kationische Lipid und das neutrale Lipid liegen in einem molaren Verhältnis von 1:1 vor. Weitere bevorzugte Ausführungsformen umfassen ein rekombinantes Expressionskonstrukt und ein Gemisch aus einem neutralen Lipid und einem kationischen Lipid mit einem Verhältnis von DNA zu Lipid von etwa 1:1 (µg DNA:nMol Lipid). Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, worin die DNA, die das rekombinante Expressionskonstrukt umfasst, in der Formulierung in einer Konzentration von etwa 1-2,5 mg/ml vorliegt.
In weiteren Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist der DNA:Lipid-Komplex zielgerichtet auf peritoneale Makrophagen durch Verabreichung durch intraperitoneale Injektion. In diesen Ausführungsformen ist das kationische Lipid 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid, das neutrale Lipid ist Cholesterol, das kationische Lipid und das neutrale Lipid liegen in einem molaren Verhältnis von etwa 1:1 vor, wobei der Komplex aus einem rekombinanten Expressionskonstrukt und einem Gemisch aus einem neutralen Lipid und einem kationischen Lipid ein Verhältnis von DNA zu Lipid von etwa 1:1 aufweist (µg DNA:nMol Lipid) und worin die DNA-Konzentration in der DNA:Lipid-Formulierung etwa 1-2,5 mg/ml ist. In zusätzlichen Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist der DNA:Lipid-Komplex zielgerichtet auf Milz-Makrophagen und wird verabreicht durch intraperitoneale Injektion. In diesen Ausführungsformen ist das kationische Lipid 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid, das neutrale Lipid ist Cholesterol, das kationische Lipid und das neutrale Lipid liegen in einem Verhältnis von etwa 1:1 vor, wobei der Komplex aus einem rekombinanten Expressionskonstrukt und einem Gemisch aus einem neutralen Lipid und einem kationischen Lipid ein Verhältnis von DNA zu Lipid von etwa 1:1 aufweist (µg DNA:nMol Lipid), wobei die DNA-Konzentration in der DNA:Lipid-Formulierung etwa 1 bis 2,5 mg/ml ist.
Unter diesem Aspekt liefert die Erfindung ebenfalls Verfahren zum Targeting bzw. Anvisieren von Gentransfer in Pankreasgewebe durch intraperitoneale Injektion. In bevorzugten Ausführungsformen ist das kationische Lipid 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid, wobei das neutrale Lipid Dioleoylphosphatidylethanolamin ist, das kationische Lipid und das neutrale Lipid in einem molaren Verhältnis von etwa 1:1 vorliegen, wobei der Komplex aus einem rekombinanten Expressionskonstrukt und einem Gemisch aus einem neutralen Lipid und einem kationischen Lipid ein Verhältnis von DNA zu Lipid von etwa 1:1 aufweist (µg DNA:nMol Lipid), und die DNA-Konzentration in der DNA:Lipid-Formulierung ist etwa 1,5 bis etwa 2,5 mg/ml.
Die Erfindung liefert ebenfalls ein Verfahren zum Einbringen eines rekombinanten Expressionskonstrukts in eine Zelle, umfassend ein Gewebe, wie etwa Gehirngewebe, in einem Lebewesen, wobei das Verfahren den Schritt des Verabreichens der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung an ein Lebewesen durch direkte Injektion, wie etwa direkte intracraniale Injektion, umfasst. In bevorzugten Ausführungsformen ist das kationische Lipid 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid und das neutrale Lipid ist Cholesterol. Ebenfalls bevorzugt sind Gemische des kationischen Lipids und des neutralen Lipids in einem molaren Verhältnis von etwa 1:1. Bevorzugte Komplexe umfassen einen Komplex aus einem rekombinanten Expressionskonstrukt und einem Gemisch aus einem neutralen Lipid und einem kationischen Lipid mit einem Verhältnis von DNA zu Lipid von etwa 1:1 (µg DNA:nMol Lipid). Die bevorzugte DNA-Konzentration in der DNA:Lipid-Formulierung ist etwa 1-2,5 mg/ml in dieser Ausführungsform der Erfindung.
Spezifische bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen und den Ansprüchen ersichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Graph, der die Stabilität von DNA:Lipid-Komplexen der Erfindung darstellt, untersucht durch intravenöse Verabreichung und Lungen-CAT-Assays über eine Dauer von 11 Wochen.
2 ist ein Graph eines Vergleichs des Chloridaustritts in der Gegenwart und ohne Stimuli in Zellen, die transfiziert sind mit humanen CFTRcodierenden Plasmidvektoren, komplexiert mit EDMPC:Cholesterol.
3 ist eine schematische Darstellung des Plasmids p4119.
4 ist ein Histogramm das zeigt, dass Mäusen, welchen CATcodierende Plasmide, komplexiert mit DOTIM:Cholesterol-Liposomen, verabreicht wurde, CAT-Genexpression in der Lunge zeigten.
5 zeigt Autoradiogramme von Southern Blot-Hybridisierungsassays, die durchgeführt wurden an Mausgeweben, erhalten nach intravenöser Verabreichung von CAT-codierenden DNA:Lipid-Komplexen der Erfindung.
6 ist ein Histogramm das β-Galactosidaseexpression in Mauslunge in 9 Versuchsmäusen zeigt, welchen β-Galactosidase-codierende DNA:Lipid-Komplexe der Erfindung verabreicht wurden.
7 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pMB19.
8 ist ein Graph, der die Langzeit-, persistente Expression von CAT-Aktivität in Mauslunge zeigt, die erhalten wird nach intravenöser Verabreichung von CAT-codierenden DNA:Lipid-Komplexen der Erfindung.
9 ist ein Histogramm, das CAT-Genexpression in Gehirn zeigt, nachdem CAT-codierende DNA:Lipid-Komplexe der Erfindung intracranial verabreicht wurden.
10 ist ein Histogramm, das die Gewebespezifität von CAT-Genexpression in DNA:Lipid-Komplexen zeigt, die intravenös (Proben 1 und 2) oder intraperitoneal (Proben 4 und 5) verabreicht wurden.
11 ist ein Histogramm, das die Formulierungs-abhängige Variabilität des Ausmaßes der Milzexpression von CAT nach intravenöser Verabreichung von DNA:Lipid-Komplexen der Erfindung zeigt.
12 ist ein Histogramm, das Human-HLA-Antigen-Expression in Knochenmark, Milz und Lymphknoten zeigt, nachfolgend auf intravenöse Verabreichung verschiedener Formulierungen von DNA:Lipid-Komplexen der Erfindung.
13 ist eine Darstellung von gewebespezifischem Targeting von CAT-codierender DNA, komplexiert mit verschiedenen Liposomenkomplexen und intravenös verabreicht.
14 ist ein Histogramm, das CAT-Gen-Targeting auf peritoneale Makrophagen nach intraperitonealer Injektion zeigt.
15 ist ein Histogramm, das Makrophagen-spezifisches Targeting durch Verabreichung von CAT-codierender DNA unter Verwendung von DNA-Lipid-Komplexen der Erfindung zeigt.
16 ist ein Histogramm, das Pankreas-spezifisches Targeting durch Verabreichung von CAT-codierender DNA unter Verwendung von DNA:Lipid-Komplexen der Erfindung zeigt.
17 ist ein Histogramm, das Milz-spezifisches Targeting durch Verabreichung von CAT-codierender DNA unter Verwendung von DNA-Lipid-Komplexen der Erfindung zeigt.
18 ist eine Darstellung von Gewebe-spezifischem Targeting von CAT-codierender DNA, komplexiert mit verschiedenen Liposomenkomplexen und intraperitoneal verabreicht.
19 ist ein Histogramm, das CAT-Genexpression in humanem Prostatagewebe zeigt, worin CAT-codierende DNA unter Verwendung von DNA:Lipidkomplexen der Erfindung direkt ex corpora verabreicht wurde.
20 ist ein Histogramm, das ein Vergleich von Milz-spezifischem und Lungen-spezifischem Targeting von DNA:Lipid-Komplexen der Erfindung unter Verwendung intravenöser und intraperitonealer Verabreichungsrouten zeigt.
21 zeigt die Ergebnisse von RT-PCR transfizierten Lungengewebesektionen, wobei transgene Sequenzen gezeigt werden, die spezifisch gerichtet sind auf vaskuläre endotheliale Zellen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Die vorliegende Erfindung liefert Materialzusammensetzungen und Verfahren zum Erleichtern des Eintritts von Nukleinsäuren in Zellen, insbesondere von rekombinanten Expressionskonstrukten, die für funktionale Gene codieren. Für die Zwecke dieser Erfindung soll der Ausdruck "rekombinantes Expressionskonstrukt" ein replizierbares DNA-Konstrukt umfassen, umfassend eine Nukleinsäure, die für ein funktionales Gen oder Fragment davon codiert, operabel verbunden mit geeigneten Kontrollsequenzen, die in der Lage sind zum Bewirken der Expression des Gens in einer geeigneten Wirtszelle. Im Besonderen ist vorgesehen, dass in die Definition eines "Gens" Ausführungsformen fallen, umfassend cDNA- und Genom-DNA-Sequenzen funktionaler Gene, als auch chimäre Hybride davon. Ebenfalls sollen in den Bereich des rekombinanten Expressionskonstrukts der Erfindung Fragmente oder Mutanten solcher Gene fallen, welche bei Expression die Funktion eines endogenen Gens in einer Zelle inhibieren oder unterdrücken können, einschließlich, inter alia, trans-dominante Mutanten, Antisense-Genfragmente und Ribozyme.
In den rekombinanten Expressionskonstrukten, wie sie durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, werden die Notwendigkeit solcher Kontrollsequenzen variieren in Abhängigkeit von den Wirts- und Zelltypen, die ausgewählt werden und den gewählten Transformationsverfahren. Im Allgemeinen umfassen Kontrollsequenzen einen Transkriptionspromotor, optional oder daneben Transkriptionskontrollsequenzen, wie etwa Transkriptionsfaktorbindungsdomänen, Enhancersequenzen und andere eukaryotische "Operator"-Sequenzen, um Transkription zu steuern, eine Sequenz, die codiert für geeignete mRNA ribosomale Bindungsstellen, und Sequenzen, welche die Terminierung der Transkription und Translation steuern. Siehe Sambrook et al., 1990, Molecular Clonina: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: New York).
Vektoren, die geeignet sind zum Durchführen der vorliegenden Erfindung umfassen Plasmide, Viren (einschließlich Phage), Retroviren und integrierbare DNA-Fragmente (d.h. Fragmente, die in das Wirtsgenom durch homologe oder nichthomologe Rekombination integrierbar sind). Ebenfalls geeignet sind Vektoren, welche sich autonom in Wirtszellen replizieren. Geeignete Vektoren werden Replikations- und Kontrollsequenzen enthalten, welche von Spezies abgeleitet sind, die kompatibel sind mit der vorgesehenen Expressionswirtszelle.
Die rekombinanten Expressionskonstrukte der vorliegenden Erfindung sind geeignet zur Gentherapie und im Besonderen zum Zuführen exogener, funktionaler Kopien eines defekten Gens zu einem spezifischen Gewebeziel in vivo. Siehe allgemein Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503-512; Bertling, 1987, Bioscience Reports 7: 107-112; Smithies et al., 1985, Nature 317: 230-234.
Die Erfindung liefert Komplexe rekombinanter DNA-Konstrukte, die für funktionale Gene oder Fragmente davon codieren und ebenfalls ein Gemisch aus einem kationischen Lipid und einem neutralen Lipid umfassen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck "kationisches Lipid" Lipide umfassen, welche bei physiologischem pH-Wert positiv geladen sind, und im Spezielleren konstitutiv positiv geladene Lipide, umfassend z.B. einen quarternären Ammoniumsalzrest.
Im Besonderen liefert die Erfindung Stickstoff-enthaltende von Imidazolinium abgeleitete kationische Lipide mit der Formel:
worin jedes aus R und R₁ unabhängig eine geradkettige, aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit von einschließlich 11 bis 29 Kohlenstoffatomen ist. Bevorzugt sind diejenigen Kationen, worin jedes aus R und R₁ unabhängig einschließlich 13 bis 23 Kohlenstoffatome aufweist. Die R- und R₁-Gruppen sind gesättigt oder ungesättigt mit einer oder mehreren ethylenisch ungesättigten Bindungen, und sind geeigneterweise die gleichen oder sind verschieden voneinander. Beispielhafte R₁-Gruppen umfassen Lauroyl, Myristoyl, Palmitoyl, Stearoyl, Linoleoyl, Eicosanoyl, Tricosanoyl und Nonacosanoyl. In bevorzugten Ausführungsformen ist das kationische Lipid 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid (hier abgekürzt als DOTIM).
Die kationischen Lipide, die die Liposomenformulierungen der Erfindung umfassen, können synthetisiert werden durch eine Umlagerungsreaktion. Diese Reaktion umfasst Synthese von DOTIM aus N,N-bis(2-Hydroxyethyl)ethylendiamin über ein Amino-geschütztes diacyliertes Zwischenprodukt zu dem gewünschten Produkt. Das Verfahren umfasst im Allgemeinen Synthese eines Imidazoliumions durch Erhitzen einer Vorläuferverbindung der Formel:
in einem organischen Lösungsmittel auf eine Temperatur über dem Siedepunkt von Wasser, worin jedes aus R und R₁ unabhängig eine organische Gruppe darstellt, sodass die Vorläuferverbindung löslich ist in dem Lösungsmittel und R und R₁ stabil sind gegenüber Reaktion in dem Lösungsmittel bei der Temperatur. Im Besonderen werden Imidazolinium-umfassende kationische Lipide der Erfindung hergestellt gemäß dem folgenden Reaktionsschema:
In diesem Reaktionsschema ist X eine Aminoschutzgruppe, die vorzugsweise mit einer sekundären Aminogruppe reagiert und diese schützt in der Gegenwart einer Hydroxylgruppe, vorzugsweise eine, die entfernbar ist durch saure Hydrolyse (z.B. mit einer starken Säure, wie etwa HCl); X' ist der Vorläufer der X-Schutzgruppe (z.B. ist X' ein Anhydrid oder ein Säurechlorid, worin X eine Acylgruppe ist); RCOZ ist ein Säurechlorid (Z ist Cl) oder ein Anhydrid (Z ist RCOO), worin R definiert ist als entweder R oder R₁; und HY ist eine starke Säure (z.B. Schwefelsäure oder ein Derivat davon oder ein Halogenwasserstoff). Eine bevorzugte Aminoschutzgruppe ist t-Butyloxycarbonyl (von di-t-Butylpyrocarbonat). Bevorzugte Acylierungsgruppen sind Säurechloride von Fettsäuren (wie etwa Fettsäuresubstituenten des hier beschriebenen Imidazoliniums). Eine bevorzugte Säure für die Umlagerungs- und Entschutzschritte des präparativen Schemas, das oben offenbart ist (und welches in einem einzelnen Schritt kombiniert sein kann) ist HCl. Wärme für die Umlagerungsreaktion wird vorzugsweise bereitgestellt durch Rückfluss in einem Lösungsmittel mit einem Siedepunkt im Bereich von 100 °C bis 200 °C, bevorzugter im Bereich von 100 °C bis 150 °C. Das anfängliche Imidazoliniumion wird als ein Hydroxidsalz und/oder ein Chloridsalz (wenn HCl als die starke Säure verwendet wird) gebildet, jedoch kann das Anion durch eine Austauschreaktion ersetzt werden. Das spezifische Reaktionsschema ist unten gezeigt:
Das Schema ist nicht begrenzt auf die explizit offenbarten Imidazoliniumverbindungen, die die Formulierungen der Erfindung umfassen. Dieses Reaktionsschema liefert ein allgemeines Protokoll für die Herstellung von Imidazoliniumverbindungen der Formel:
worin X₁ den Rest einer Acylgruppe nach der Umlagerungsreaktion, wie gezeigt, darstellt (von H in eine komplexe organische Gruppe), während X₂ und X₃ unabhängig H oder eine organische Gruppe darstellen. X₂ würde anfänglich R-CO- darstellen, jedoch diese Gruppe könnte entfernt oder ersetzt werden durch eine andere organische Gruppe unter Verwendung von chemischen Standardreaktionen; da eine der beiden potenziellen Hydroxylgruppen in dem Anfangsprodukt bereits geschützt ist, kann die Synthese von Verbindungen, in welchen X₂ und X₃ verschiedene Gruppen darstellen, leicht verwirklicht werden. Ionen, worin sowohl X₂ als auch X₃ H darstellen, sind bevorzugt, da diese verwendet werden können bei der Synthese zahlreicher Imidazoliniumverbindungen. Wenngleich es keine besondere Begrenzung der Struktur der drei "X"-Gruppen bei der allgemeinen Synthese gibt, die verschieden sind von denjenigen, die durch Löslichkeit oder Reaktivität unter den Erhitzungsbedingungen, die für die Reaktion verwendet werden (welche leicht ersichtlich sein werden) benötigt werden, sind bevorzugte organische Gruppen Kohlenwasserstoffgruppen mit 30 oder weniger Kohlenstoffen und ihre oxygenierten Produkte (insbesondere Fettsäuren und ihre Reaktionsprodukte), wie früher beschrieben, als auch andere Kohlenwasserstoffgruppen und oxygenierte Produkte, die 15 oder weniger Kohlenstoffatome enthalten, vorzugsweise 10 oder weniger, bevorzugter Kohlenwasserstoffgruppen, die nicht mehr als einen Phenylring enthalten, wobei der Rest der Kohlenwasserstoffgruppe aus Alkylgruppen besteht, insbesondere Alkylgruppen mit 5 oder weniger Kohlenstoffen). Aus organischen Gruppen gebildete oxygenierte Kohlenwasserstoffgruppen sind vorzugsweise Carbonsäuren, Alkohole, Ester, Ether, Ketone und Aldehyde, die nicht mehr als eine solche funktionale Gruppe pro organischer Gruppe enthalten. Beispiele von Imidazoliniumionen, die durch die oben beschriebene Synthese beschrieben werden können (mit weiterer Modifikation der Hydroxylgruppen unter Verwendung einfacher organischer Reaktionen), umfassen 1,3-Dihydroxyethylimidazolinium, 1-Methoxyethyl-3-hydroxyethylimidazolinium, 1-Hydroxyethyl-2-phenyl-3-methylcarboxyethylimidazolinium, 1,3-Dimethoxyethoxyethylimidazolinium, 1,3-Hydroxyethyl-2-tridecylimidazolinium und 1-Hydroxyethyl-2-cis, cis-8,11-Heptadecyldienyl-3-oleoyloxyethylimidazolinium.
Da die Reaktion eine einfache Selbstkondensationsreaktion mit der Eliminierung von Wasser ist, sind das Lösungsmittel und/oder andere Reaktionsbedingungen für die Gesamtreaktion nicht wichtig. Jedes Lösungsmittel, das die Vorläuferverbindung lösen wird und das einen Siedepunkt über demjenigen von Wasser (unter den Druckbedingungen der Reaktion, welche nicht begrenzend sind) aufweist, kann verwendet werden. Wenn ein Katalysator verwendet wird, um die Reaktion zu beschleunigen, ist ein protisches Lösungsmittel bevorzugt, um leichteren Protonenaustausch bereitzustellen. Ethylenglycol und andere Alkohole mit einem Siedepunkt über 100 °C sind bevorzugt.
Eines der explizit offenbarten kationischen Lipide der Erfindung (bezeichnet als DOTIM) ist ebenfalls kommerziell erhältlich (Avanti Polar Lipids, Alabama).
Kationische Lipide sind besonders geeignet als Träger für anionische Verbindungen, insbesondere polyanionische Makromoleküle, wie etwa Nukleinsäuren. Da kationische Lipide positiv geladen sind, kann ein starker Ladungskomplex gebildet werden zwischen einem kationischen Lipidträger und einer polyanionischen Nukleinsäure, was zu einem Lipidträgernukleinsäurekomplex führt, der direkt verwendet werden kann für systemische Zuführung in einen Säuger oder eine Säugerzelle.
Neutrale Lipide sind im Gegensatz zu den kationischen Lipiden der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass sie elektrochemisch neutral sind, wenngleich diese Definition eine Protonierung derartiger Lipide zum Herstellen eines positiv geladenen Salzes unter bestimmten Bedingungen nicht ausschließt. Ausdrücklich sind innerhalb von dieser Definition inter alia Steroide umfasst, wie etwa Cholesterol und Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE).
Komplexe aus DNA und Gemischen kationischer und neutraler Lipide der Erfindung sind gekennzeichnet durch eine Anzahl von Parametern, die spezifisch sind für die Bildung derartiger Komplexe. Diese umfassen die Identität des kationischen Lipids und des neutralen Lipids; das Verhältnis von kationischem Lipid zu neutralem Lipid; die Konzentration von DNA in dem Komplex; das Verhältnis von DNA zu Lipid; DNA-Reinheit; kationische Liposomengröße; Verfahren zum Herstellen von Liposomen; die Verfahren zum Herstellen der DNA:Lipid-Komplexe; und andere Variablen. Bevorzugte Kombinationen kationischer und neutraler Lipide umfassen 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid und Cholesterol und 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid und Dioleoylphosphatidylethanolamin. Ein bevorzugtes molares Verhältnis dieser Lipide ist 1:1. Die DNA-Konzentration in den Formulierungen der Erfindung ist von etwa 0,5 mg/ml bis etwa 5 mg/ml, bevorzugter von etwa 0,5 mg/ml bis etwa 2,5 mg/ml. DNA:Lipid-Verhältnisse sind vorzugsweise von 1:1 (µg DNA/nmol Lipid) für Formulierungen, die intraperitoneal oder durch direkte Injektion injiziert werden sollen, bis von etwa 1:6 bis 1:15 (µg DNA/nmol Lipid) für Präparationen, die intravenös injiziert werden sollen. Die DNA-Reinheit hat eine direkte Wirkung auf die Liposomenkomplexbildung, jedoch DNAs mit einer Reinheit von etwa 15 % bis etwa 100 % sind geeignet zur Komplexbildung. DNA mit einer Reinheit von 90 bis 100 % gemäß HPLC werden bevorzugt in DNA:Lipid-Komplexen in einem Bereich von 1:12 bis 1:15 µg DNA/nmol Lipid verwendet.
Die verschiedenen Lipidträger-Nukleinsäure-Komplexe, worin der Lipidträger ein Liposom ist, werden unter Verwendung von Verfahren hergestellt, die in der Technik allgemein bekannt sind. Die Mischbedingungen können optimiert werden durch visuelle Untersuchung des resultierenden Lipid-DNA-Gemischs, um festzustellen, dass keine Präzipitation oder Aggregation auftritt. Um die Lipid-DNA-Komplexe sichtbarer zu machen, können die Komplexe mit einem Farbstoff angefärbt sein, welcher an sich keine Aggregation bewirkt, jedoch welcher entweder die DNA oder das Lipid färben wird. Zum Beispiel kann Sudan-Schwarz (welches Lipid färbt) verwendet werden als eine Hilfe zum Untersuchen des Lipid-DNA-Gemischs, um zu bestimmen, ob Aggregation aufgetreten ist. Die Teilchengröße kann ebenfalls mit in der Technik bekannten Verfahren untersucht werden, einschließlich Elektronenmikroskopie, Laserlichtstreuung, Coulter^TM-Zählung/Größenbestimmung, und dgl. Kügelchen mit Standardgröße können verwendet werden, um Instrumente zur Bestimmung von Liposomen oder Komplexen, die sich bilden, zu kalibrieren.
"Lipidträger-Nukleinsäurekomplex" bedeutet eine Nukleinsäuresequenz, wie oben beschrieben, im Allgemeinen gebunden an eine Lipidträgerpräparation, wie unten diskutiert. Die Lipidträgerpräparation kann auch andere Substanzen oder Cofaktoren umfassen. Darüber hinaus kann der Lipidträger-Nukleinsäure-Komplex Targetingmittelumfassen, um den Komplex speziellen Zell- oder Gewebetypen zuzuführen. Im Allgemeinen wird das Nukleinsäurematerial zu einer Suspension vorgebildeter Liposomen zugegeben, welche multilamellare Vesikel (MLV) oder kleine unilamellare Vesikel (SUV) sein können, üblicherweise SUV, gebildet durch Beschallen oder durch Extravasation durch Polycarbonatmembranen mit geeigneten Größen. Die Liposomen an sich werden hergestellt aus einem getrockneten Lipidfilm, der resuspendiert wird in einer geeigneten Mischlösung, wie etwa sterilem Wasser oder einer isotonen Pufferlösung, wie etwa 10 mM Tris/NaCl oder 5 % Dextrose in sterilem Wasser, und Beschallen, um die Liposomen zu bilden. Dann werden die Lipidträger im Allgemeinen direkt mit der DNA gemischt.
Mischen und Herstellen des Lipid-DNA-Komplexes kann kritisch beeinflusst werden durch die Abfolge, mit welcher das Lipid und die DNA vereinigt werden. Im Allgemeinen ist es bevorzugt (um Aggregation zu minimieren) das Lipid zu der DNA in Verhältnissen von DNA:Lipid von bis zu 1:2, einschließlich (Mikrogramm DNA:Nanomol kationisches Lipid) zu geben. Wenn das Verhältnis von DNA:Lipid 1:4 oder höher ist, werden im Allgemeinen bessere Resultate erhalten durch Zugeben der DNA zu dem Lipid. In jedem Fall sollte das Mischen rasch erreicht werden durch Schütteln oder Vortexen für kleine Volumina und durch die Verwendung von Schnellmischsystemen für große Volumina. Der flüssige Träger und die DNA-Form sind ein sehr stabiler Komplex aufgrund der Bindung der negativ geladenen DNA an die kationischen Lipidträger. Die DNA:Lipid-Komplexe der Erfindung finden Anwendung mit kleinen Nukleinsäurefragmenten, als auch mit großen Regionen von DNA (≥ 30 kb).
Aggregation des Lipid-Nukleinsäure-Komplexes wird verhindert durch Steuern des Verhältnisses von DNA zu Lipidträger, Minimieren der Gesamtkonzentration von DNA:Lipidträger-Komplex in Lösung (üblicherweise weniger als 5 mg DNA/ml-Lösung) und Vermeidung der Verwendung von Chelatisierungsmitteln, wie etwa EDTA und/oder wesentlicher Mengen Salz, von welchen beide dazu neigen, die Makroaggregation zu fördern. Der bevorzugte Exzipient ist Wasser, Dextrose/Wasser und eine andere Lösung mit geringer oder keiner Ionenstärke. Darüber hinaus sollte das Volumen auf das Minimum eingestellt sein, das erforderlich ist zur Injektion in den Wirtssäuger, während gleichzeitig Sorge dafür getragen wird, die Lösung nicht zu konzentriert zu machen, sodass sich Aggregate bilden.
Die Größe der DNA:Lipid-Komplexe der Erfindung kkann gemäß herkömmlicher Techniken, in Abhängigkeit von der gewünschten Größe, eingestellt werden. Für intravenöse oder intraperitoneale Zuführung weisen die Komplexe der Erfindung vorzugsweise 150 bis 300 nm Durchmesser auf.
Die DNA:Lipid-Komplexe der Erfindung haben Anwendbarkeit beim Vermitteln der wirkungsvollen Zuführung der rekombinanten Expressionskonstrukte der Erfindung, Codieren funktionaler Gene oder Fragmente davon, in eukaryotischen, vorzugsweise Säuger-, am bevorzugtesten humanen Zellen. DNA:Lipid-Komplexe der Erfindung sind geeignet zum Erreichen von Gentransfer in vitro, unter Verwendung von etablierten Techniken. Insbesondere sind die DNA:Lipid-Komplexe, die durch diese Erfindung bereitgestellt werden, und die Verfahren zum Verabreichen der DNA:Lipid-Komplexe, die hier bereitgestellt werden, geeignet zum spezifischen Zuführen rekombinanter Expressionskonstrukte der Erfindung in spezielle Gewebe und Zellen, die diese Gewebe umfassen, in vivo, wobei ein Targeting dieser Gene auf spezielle Gewebe bereitgestellt wird. Diese Eigenschaften der pharmazeutischen Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung sorgen für die Realisierung praktischer Gentherapie, wobei z.B. ein besonders defizientes Gen erneuert wird durch die Einführung einer funktionalen Kopie des normalen entsprechenden Gens in die Zellen des betroffenen Gewebes, ohne die nicht-spezifische ungeeignete Einführung des Konstrukts in andere Zellen oder Gewebe des Körpers.
Daher liefert die Erfindung Verfahren und pharmazeutische Zusammensetzungen mit einer Anzahl von Vorteilen gegenüber dem Stand der Technik. Die Liposomen und Lipidkomplexe der Erfindung sind in Menschen ausgiebig untersucht worden und sie sind nicht immunogen, relativ untoxisch und nicht infektiös. Diese Komplexe sind stabil, wie durch die experimentellen Ergebnisse in 1 gezeigt. Ein besonderer DNA:Lipid-Komplex (DOTIM:Cholesterol (1:1), komplexiert mit einem CAT-codierenden Plasmid bei einem DNA:Lipid-Verhältnis von 1:6 und einer DNA-Konzentration von 0,625 mg/ml) wurde hergestellt und wöchentlich über 11 Wochen getestet durch Injektion in die Schwanzvene von ICR-Mäusen. CAT-Aktivität wurde dann in der Mauslunge bestimmt unter Verwendung von unten im einzelnen beschriebenen Protokollen. Die Figur zeigt Ergebnisse, die zeigen, dass diese Präparation über den Verlauf des Versuchs stabil war, wobei im Wesentlichen identische Gehalte CAT-Gen-Expression zu allen getesteten Zeitpunkten erhalten wurden.
Die DNA:Lipid-Komplexe der Erfindung haben zusätzliche Vorteile gegenüber dem Stand der Technik. Rekombinante Expressionskonstrukte jeder praktikablen Größe können verwendet werden, wobei keine Begrenzung auf große Plasmidgröße besteht, aufgrund des Fehlens des Verpackens der DNA in das Genom eines Vektororganismus, wie etwa einen Retrovirus oder einen Adenovirus. Gentransfer kann erreicht werden in sich nicht teilenden Zellen im Unterschied zu Systemen nach dem Stand der Technik, welche auf viralen Vektoren beruhen, deren Lebenszyklus erforderte, dass die infizierten Zellen sich teilen. Zusätzlich kann die spezifische Formulierung der DNA:Lipid-Komplexe der Erfindung geändert werden, um das Targeting und die Dauer der Genexpressionswirkung zu beeinflussen. Die DNA:Lipid-Komplexe der Erfindung sind ebenfalls für viele Zuführungsrouten zugänglich und neigen weniger dazu die Sicherheitsprobleme mit sich bringen, die mit Zuführungssystemen auf viraler Basis verbunden sind.
Die DNA:Lipid-Komplexe der Erfindung können einem Lebewesen verabreicht werden, um eine Zuführung funktionaler Gene in spezifische Gewebe durch eine geeignete therapeutische Routine zu bewirken, einschließlich intravenöser, intraperitonealer, subkutaner oder intramuskulärer Injektion, als auch direkte Injektion in Zielgewebe. Typischerweise werden die DNA:Lipid-Komplexe der Erfindung in Lösung injiziert, worin die Konzentration der DNA, die zuzuführen ist, die Menge des zu verabreichenden Komplexes diktiert. Diese Menge wird variieren mit dem anzuvisierenden Gewebe und der Effizienz der anvisierten DNA, der erforderlichen Konzentration für die gewünschte Wirkung, der Anzahl von Verabreichungen und dgl.
Die Verfahren und pharmazeutischen Zusammensetzungen sind besonders nützlich und geeignet zum Einbringen funktionaler humaner Gene, insbesondere humaner CFTR, in Lungengewebe. Diese Verfahren und pharmazeutischen Zusammensetzungen haben daher Anwendbarkeit bei der Behandlung von Erkrankungen von Menschen, einschließlich zystischer Fibrose und chronischer Bronchitis.
Die folgenden Beispiele zeigen bestimmte Aspekte der oben beschriebenen Verfahren und vorteilhafte Ergebnisse. Die folgenden Beispiele sind nur zur Veranschaulichung gezeigt und in keinerlei Hinsicht sollen sie begrenzend sein.
BEISPIEL 1
Herstellung von DOTIM: Cholesterol (1:1) kleine unilamellare Vesikel
In einen 1 I-Rundkolben wurden 500 µmol Cholesterol in einem Überschuss Chloroform gelöst und dann wurden ebenfalls 500 µmol DOTIM ebenfalls in einem Überschuss Chloroform gelöst. Die Menge DOTIM wurde durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) oder durch UV-Spektroskopie bei 237 nm bestimmt.
Nach kurzem, vorsichtigem Mischen wurde der Kolben auf einer Rotationsverdampfervorrichtung angebracht und Chloroform unter langsamer Geschwindigkeit und Wasservakuumbedingungen abgezogen bis nahezu das gesamte Lösungsmittel verdampft war. Das Verdampfen wurde bei maximaler Rotationsgeschwindigkeit unter Verwendung einer Vakuumpumpe abgeschlossen, um das Lipidgemisch vollständig zu einem dünnen Film an der Wand des Rundkolbens zu trocknen.
Als ein Zwischenschritt zur Bildung der Titelzusammensetzung wurden multilamellare Vesikel (MLV) aus diesem Film hergestellt durch Zugabe von 16 ml Endotoxin-freiem Wasser in den Kolben, welcher dann erwärmt wurde auf 37 °C in einem Wasserbad unter leichtem Drehen mit der Hand. Die so gebildeten MLV wurden aus dem Kolben entfernt unter Verwendung einer 9 Zoll-Pasteur-Pipette und in ein 20 mm-Schraubdeckelgläschen bei Raumtemperatur übergeführt. Der Kolben wurde von verbleibenden MLV durch Waschen mit einem zusätzlichen ml Endotoxin-freiem Wasser gereinigt, welches zu den zuvor aus dem Kolben übergeführten 16 ml gegeben wurde. Diese Lösungen wurden gemischt und gleiche Aliquote in 20 16 ml-Schraubdeckelgläschen unter Verwendung einer Pasteur-Pipette hergestellt.
MLV wurden in die SUV der Titelverbindung durch Beschallen übergeführt. Jedes der 16 ml-Schraubdeckelgläschen, welche MLV enthielten, wurde einzeln in einem Schallwasserbad angeordnet, welches bei 36 °C gehalten wurde, für 5 min. und die Temperatur des Bades wurde vor dem Einbringen von jedem Gläschen überprüft. Beschallte Tröpfchen innerhalb jedes Gläschens wurden durch kurzes Vortexmischen gesammelt und die einzelnen Lösungen von SUV wurden dann in einem einzelnen 20 mm-Schraubdeckelgläschen unter Verwendung einer 9 Zoll-Pasteur-Pipette vereinigt und dann unter Verwendung eines 0,2 Mikrometer Einwegfilters (Nalgene) filtriert. Schließlich wurde eine Menge einer Endotoxin-freien Lösung von 25 % Dextrose in Wasser, gleich einem Viertel des Endvolumens der SUV, in das Gläschen der SUV gegeben. Dies führte zu einer Suspension von SUV, umfassend 20 mM DOTIM und 20 mM Cholesterol (40 mM Gesamtlipid) in einer 5 %-igen Dextroselösung, welche bei 4 °C bis zur Anwendung gehalten wurde.
BEISPIEL 2
Plasmid-DNA-Herstellung im großen Maßstab
Plasmid-DNA wurde in großen Mengen (d.h. Milligramm) hergestellt unter Verwendung einer Modifikation des alkalischen Lyseverfahrens (Sambrook et al., 1990, ibid). Kurz gesprochen, wurde eine einzelne Bakterienkolonie für 12-18 Stunden oder über Nacht in 15 ml TB-Kulturlösung (47 g/l TB (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)/8 % Glycerol) ergänzt mit 100 µg/ml Carbenicillin bei 37 °C unter Schütteln (250 UpM) gezüchtet. 2-2,5 ml dieser Kultur wurden dann zu 400 ml TB (ergänzt mit 100 µg/ml Carbenicillin) in jedem von sechs 2 I-Kolben (für insgesamt 2,4 L Kultur) und bei 37 °C unter Schütteln über Nacht (16-18 h) gezüchtet.
Nach Wachstum über Nacht wurden die Bakterien durch Zentrifugation für 10 min. bei 4 °C in einer Beckman J2-MI-Zentrifuge gesammelt, die ausgestattet war mit einem JA-10-Rotor. Das Bakterienpellet in jeder Zentrifugenflasche wurde vorsichtig in 20 ml einer eiskalten Lösung von 50 mM Dextrose in 25 mM HCl-Puffer (pH-Wert 8)/10 mM EDTA, resuspendiert. Zu den resuspendierten Bakterienzellpellets wurden 40 ml einer frisch hergestellten Lösung von 0,2 N NaOH/1 % Natriumdodecylsulfat bei Raumtemperatur gegeben, was zu Zelllyse bei vorsichtiger Bewegung dieses Gemisches auf Eis für etwa 5 min führte. Nachdem die zugegebene Lyse-Lösung sorgfältig. in die Bakteriensuspension gemischt war und die Zellen lysiert waren, ließ man das Gemisch bei Raumtemperatur für 5 min stehen. Zu diesem Gemisch lysierter Bakterien wurden 20 ml einer eiskalten Lösung von 3M Kaliumacetat gegeben, welche in die lysierte Bakterienlösung vorsichtig von Hand gemischt wurde und dann auf Eis für 10 min aufbewahrt wurde. Es bildete sich ein flockiges weißes Präzipitat, umfassend bakterielle chromosomale DNA, RNA und SDS/Protein/Membran-Komplexe, welche aus der Lösung entfernt wurden durch Zentrifugieren bei 8000 Upm für 15 min bei 4 °C in dem JA-10-Rotor, wie oben.
Nach Zentrifugation wurde der Überstand unter Filtrieren durch ein Miracloth in 250 ml Zentrifugenflaschen übergeführt und 50 ml Isopropanol bei Raumtemperatur zugegeben, gemischt und inkubiert für 10 min. Das Plasmid-DNA-Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei 5000 Upm für 10 min bei Raumtemperatur in einem JA-14 Rotor (Beckman) gewonnen. Der Alkoholenthaltende Überstand wurde dekantiert und restlicher Überstand durch Vakuumabziehen entfernt.
Die Plasmid-DNA-Pellets wurden resuspendiert in 6 ml einer Lösung aus 6 mM Tris-HCl (pH-Wert 8) und in 50 ml-Zentrifugengläschen unter Lösen übergeführt. In jedes Gläschen wurde ein gleiches Volumen von kaltem (-20 °C) 5M LiCl gegeben, die Lösungen von Hand gemischt und dann bei 8000 Upm für 10 min bei Raumtemperatur in einem JA-20-Rotor (Beckman) zentrifugiert. Die Überstandslösung von jedem Gläschen wurde in ein frisches Gläschen übergeführt und dann die Plasmid-DNA repräzipitiert durch die Zugabe eines gleichen Volumens Isopropanol, gemischt und gesammelt durch Zentrifugation bei 5000 Upm für 10 min bei Raumtemperatur in einem JA-20-Rotor. Die Alkoholenthaltende Überstandslösung wurde dann dekantiert, restlicher Alkohol durch Abziehen entfernt und die Plasmid-DNA-Pellets wurden für 5 min an Luft trocknen gelassen.
Verunreinigende Bakterien-RNA wurde von der Plasmid-DNA entfernt durch Lösen der Pellets in 1 ml 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8), Zugeben von etwa 0,5 bis 0,75 µg Pankreas-RNAase pro ml, gefolgt durch Inkubieren des Gemischs bei 37 °C für 1 h. Das Verschwinden von RNA wurde durch Analyse mit Ethidiumbromidgefärbtem Agarosegel bestimmt (siehe Sambrook et al. ibid). Plasmid-DNA wurde gereinigt durch Phenol-Chloroform-Extraktion. Kurz gesprochen, wurde zu jedem Aliquot von Plasmid-DNA-Lösung ein gleiches Volumen Tris-gesättigtes Phenol:Chloroform (1:1) gegeben, die unmischbaren Lösungen durch Vortexen gemischt und in einer Labortischmikrofuge für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die wässrige (obere) Schicht wurde entfernt, in ein frisches Mikrofugengläschen übergeführt und Extraktion mit Phenol:Chloroform mindestens zweimal wiederholt. Diese Extraktionen wurden gefolgt von zwei Extraktionen der wässrigen Schicht mit Tris-gesättigtem Chloroform. Plasmid-DNA wurde durch Präzipitation konzentriert, unter der Zugabe von 5M Natriumacetat, bis zu einer Endkonzentration von 0,3 M, und die Zugabe von zwei Volumina kaltem (- 20 °C) absolutem Ethanol. Man ließ DNA in dieser Lösung bei -20 °C für 1 h oder über Nacht präzipitieren.
Nach Präzipitation wurde Plasmid-DNA durch Zentrifugation bei etwa 6000 Upm in einer klinischen Mikrozentrifuge gesammelt. Der Alkohol-enthaltende Überstand wurde durch Vakuum abgesaugt und das Pellet zweimal mit 70 Ethanol/Wasser (4 °C) gewaschen. Die gewaschenen Pellets wurden an Luft für mindestens 30 min. getrocknet. Plasmid-DNA-Pellets wurden in insgesamt 6 ml einer Lösung aus 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8) gelöst und die Konzentration bestimmt durch spektrophotometrische Analyse einer 1-zu-200-Verdünnung des gewonnenen Plasmids bei A₂₆₀.
BEISPIEL 3
Herstellung von DNA:LIPID-Komplexen
DOTIM:Cholesterol:Plasmid-DNA-Liposomen wurden wie folgt hergestellt. Ein DOTIM:Cholesterol-Gemisch (1:1, 20 µmol/µl jedes Lipids) wurde hergestellt wie in Beispiel 1 oben beschrieben. Komplexe mit Plasmid-DNA wurden in DNA:Lipid-Verhältnissen von 1:1 und 1:6 hergestellt. DNA und DOTIM:Cholesterol wurden jeweils zuerst von den Aufbewahrungsbedingungen (-20 °C für DNA, 4 °C für Liposomenformulierungen) über den Verlauf von etwa 1,5 h auf Raumtemperatur vor der Anwendung gebracht. Die DNA-Konzentration in den Komplexpräparationen waren optimalerweise 100-550 µg/200 µl Komplexlösung (für Verhältnisse von 1:1 DNA:Lipid) und 100-150 µg/µl Komplex (für Verhältnisse von 1:6 DNA:Lipid). Die DNA-Konzentrationen wurden typischerweise unmittelbar vor der DNA:Lipid-Komplexbildung durch Ultraviolettspektrometrie, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt. DOTIM:Cholesterol-Gemische wurden typischerweise bei einer Gesamtlipidkonzentration von 40 µmol/ml, entsprechend 20 µmol/ml DOTIM und 20 µmol/ml Cholesterol, verwendet.
DNA:Lipid-Komplexe wurden aus diesen Reagenzien wie folgt hergestellt. Jede Komponente wurde in einzelnen Mikrofugengläschen bei einem Gesamtvolumen pro Gläschen von 100 µl hergestellt. Eine geeignete Menge DNA (äquivalent zu einer End-DNA-Konzentration von 500 µg/DNA/ml-Komplex) wurde in ein Gläschen gegeben und auf das Volumen mit Wasser oder einer Lösung aus 5 % Dextrose in Wasser gebracht. Die geeignete Menge DOTIM:Cholesterol-Gemisch (100 nmol Lipid/100 µg DNA bei einem 1:1-Verhältnis; 600 nmol Lipid/100 µg DNA bei einem 1:6-Verhältnis) wurde in ein zweites Gläschen gegeben und Wasser oder eine Lösung von 5 % Dextrose in Wasser wurde zugegeben, um diese Lösung auf ein Gesamtvolumen von 100 µl zu bringen. Die Inhalte des Lipid-enthaltenden Gläschen s wurden durch Vortexen für etwa 2 sec gemischt, während die Inhalte des DNA-enthaltenden Gläschen vorsichtig unter Verwendung eines 1 ml-Pipettors gemischt wurden. Die Inhalte des Lipidgemischenthaltenden Gläschens wurden dann zu dem DNA-enthaltenden Gläschen unter Verwendung eines 1 ml – Pipettors gegeben. Es wurde gefunden, dass es wesentlich war, dass diese Zugabe langsam durchgeführt wurde, bei einem konstanten Strom, auf die Oberseite der DNA-Lösung in Gläschen A. Wenn sich die Lipidlösung mit der DNA mischte, wurde Bildung des DNA:Lipid-Komplexes dadurch nachgewiesen, dass die Lösung leicht trüb und opaleszierend wurde. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass auf dieser Stufe das Gemisch nicht heftig gemischt werden konnte (z.B. durch Vortexen) ohne ernsthaft die Integrität und Eignung der so gebildeten Komplexe zu beeinträchtigen; jedoch war es vorteilhaft vorsichtig die gesamten Inhalte der Gläschen für 3 bis 4 Minuten nach Abschluss der Zugabe des Lipidgemischs zu dem DNA-Gemisch zu mischen.
Nachdem die Komplexe gebildet waren, wurde die Endkonzentration von DNA durch Ultraviolettspektrometrie, wie oben beschrieben, bestimmt und die Größe der DNA:Lipid-Komplexe wurde durch Lichtstreuung bei 400 nm gemessen.
BEISPIEL 4
Herstellung von Gewebeproben für CAT-Assay und Proteinbestimmung
Gewebe wurden für einen Assay wie folgt hergestellt. Versuchstiere wurden schnell und human getötet. Mäuse wurden typischerweise in einer mit CO₂-gefüllten Tötungskammer für 2 bis 3 Minuten belassen. Gewebe wurden durch Herausschneiden gewonnen und gewogen und dann in 1 ml kaltem Homogenisierungspuffer (250 mM Tris/5 mM EDTA), ergänzt mit PMSF (35 µg/ml) und Leupeptin/Aprotinin (5 µg/ml), angeordnet. Die Gewebe wurden dann für 20-30 sec unter Verwendung eines Gewebedisruptors (wie etwa ein Polytron) homogenisiert bis ein einheitliches Homogenisat erhalten wurde. Das Homogenisat wurde dann in ein Zentrifugengläschen übergeführt und rasch auf Trockeneis (oder bei -70 °C) gefroren und dann bei 37 °C aufgetaut. Unlösliches wurde aus dem Homogenisat durch Zentrifugation bei 10.000 g für 5-10 min. entfernt bzw. gecleart. 50 µl der resultierenden überstehenden Lösung wurden in ein Mikrofugengläschen alquotiert und bei -70 °C aufbewahrt bis zur Verwendung für Proteinbestimmungen.
Der Rest des Überstands wurde hitzeinaktiviert bei 65 °C für 15 min und erneut zentrifugiert bei 10.000 g für 10 min und bei -70 °C aufbewahrt zur Verwendung für CAT-Assay-Aestimmungen.
Um CAT-Assays durchzuführen, wurden Proben parallel analysiert mit einer Reihe von Standard-CAT-Aktivitätsproben. Aus den Standards wurde eine Standardkurve der CAT-Aktitivität gegenüber CAT-Protein entwickelt, welche verwendet wurde, um den Grad CAT-Proteinexpression in Gewebeproben zu bestimmen, basierend auf der beobachteten CAT-Aktivität in Gewebehomogenisaten. Zum Herstellen der Standardkurven wurden Reihenverdünnungen von CAT-Enzym im Bereich von 0,1 bis 0,000025 U vorbereitet. Diese Standards wurden in einem Reaktionsgemisch hergestellt, bestehend aus 50 µl BSA-Puffer (mit der Formel: 250 mM Tris/5 mM EDTA/2 mg/ml BSA, Fraktion V (U.S. Biochemical, Cleveland, OH), 5 µl Standard-CAT-Enzym (und geeignete Verdünnungen; erhalten von Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), 50 µl ¹⁴C-markiertes Chloramphenicol (New England Nuclear; verdünnt 1:10 in BSA-Puffer vor der Anwendung) und 25 µl n-Butyryl-CoA (Sigma). Gewebeproben wurden identisch hergestellt, mit der Ausnahme, dass 5 µl Standard-CAT-Enzymaktivität durch 30 µl Gewebehomogenisat ersetzt wurden. Proben wurden inkubiert bei 37 °C für 2 h. Nach dieser Inkubation wurden 300 µl gemischte Xylole (Aldrich Chemical Co.) zu jedem Gläschen gegeben, für 30 sec gevortext und für 3 min bei 10.000 Upm in einer IEC-Zentrifuge, ausgestattet mit einem 24-Platz-Rotor, zentrifugiert. Die Phase gemischter Xylole (oben) von jedem Probengläschen wurde in ein frisches Mikrofugengläschen übergeführt und 750 µl Homogenisierungspuffer zugegeben. Die Proben wurden dann, wie oben beschrieben, gevortext und zentrifugiert.
200 µl der oberen Phase von jedem Rohr wurden in Flüssigszintillationsgläschen übergeführt und 0,5 ml Szintillationscocktail (Ready-Safe, Beckman) zugegeben. Die Menge CAT-spezifischer Radioaktivität in jeder Probe wurde durch Flüssigszintillationszählungsassay bestimmt.
BEISPIEL 5
X-Gal-Färbung von Gewebeproben
Gewebeproben wurden mit X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-α-D-galactopyranosid) unter Verwendung des folgenden Protokolls gefärbt. Gewebe wird fixiert durch Eintauchen für 0,5-1 h in frisch hergestellte Fixierlösung auf Eis (2 % neutrales gepuffertes Formalin (0,02 % Glutaraldehyd/0,02 % Nonidet-P40). Nach Fixierung wurden die Gewebe zweimal bei 4 °C in einer Lösung aus 2 mM MgCl₂/0,1 % Desoxycholat/0,2 % NP-40 und 10 mM Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH-Wert 7,3) gespült. Die Gewebe wurden dann gefärbt unter Verwendung der Spüllösung, die ergänzt war mit 1 mg/ml X-Gal (U.S. Biochemical), 5 mM Ferricyanid bzw. Eisen-(III)-Cyanid und 5 mM Ferrocyanid bzw. Eisen-(II)-Cyanid. Die Gewebe wurden gefärbt für 12-48 h bei 37 °C oder bei Raumtemperatur. Nach dem Färben wurden die Gewebe in PBS gespült. Die Gewebe wurden dann gefroren und geschnitten oder fixiert in 70 % Ethanol, eingebettet in Paraffin und dann geschnitten.
Proteinbestimmungen wurden durchgeführt unter Verwendung eines Farbstoffbindungsassays (BSA-Protein Assay Reagent, Pierce Chemical Co.). Das Pierce-Reagenz wurde hergestellt durch Mischen von 50 Teilen von Reagenz A mit 1 Teil Reagenz B, wie vom Hersteller bereitgestellt. 100 µl Aliquot dieses präparierten Reagenz wurden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. 100 µl einer Lösung, die 20 µg BSA enthielt, wurden in die erste Vertiefung der ersten Reihe (d.h. Vertiefung A1) gegeben und 100 µl einer 1:2- bis 1:8-Verdünnung von jedem Gewebeextrakt wurden in die anderen Vertiefungen in der Reihe gegeben. Reihenverdünnungen mit Verhältnissen von 1:2 wurden in jeder der benachbarten Reihen nachfolgend unter Verwendung der Vertiefungen in der folgenden Reihe durchgeführt.
Typischerweise führten Platten mit 96 Vertiefungen mit 12 Vertiefungen/Reihe zu 6 Reihen-Verdünnungen (1 bis 1/64); die letzte Reihe war ein Blindwert, der beladen war mit PBS als eine Kontrolle. Die Platten wurden bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert und das Ausmaß der Farbstoffbindung spektrophotometrisch als Absorption bei 562 nm bestimmt. Proteinkonzentrationen in Probenvertiefungen wurden im Vergleich mit einer Standardkurve bestimmt, die erzeugt wurde unter Verwendung der OD-Auslesungen der Reihenverdünnungen des BSA-Standards.
BEISPIEL 6
Mikroplatten-Assay für β-Galactosidaseexnression in Geweben
Gewebe wurde homogenisiert in einem geeigneten Volumen Homogenisierungspuffer (250 mM Tris/5 mM EDTA) (z.B. wurden 300 µl verwendet, um eine Mauslunge zu homogenisieren). Das Homogenisat wurde dann auf Eis für 30 min inkubiert und in einer Mikrozentrifuge für 10 min bei 13.000 Upm zentrifugiert, um das Homogenisat von Unlöslichem zu clearen bzw. reinigen. Überstände dieser Homogenisate wurden gesammelt und wie folgt untersucht.
Mikroplatten wurden für diese Analysen wie folgt hergestellt. Für jede zu beschichtende Platte wurden 50 µl monoklonaler Anti-β-Galactosidase-Antikörper in 5 ml 50 mM Natriumbicarbonatpuffer (pH-Wert 9,4) verdünnt. 50 µl der verdünnten Antikörperlösung wurden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte gegeben (z.B. Immulon 3, Dynatech), die Platte verschlossen und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach Übernachtinkubation wurden 200 µl BLOTTO-Lösung (5 VN nichtfette Trockenmilch und 0,2 % Tween 20 in PBS) in jede Vertiefung gegeben und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die BLOTTO-Lösung wurde dann entfernt und die Platten wurden dreimal mit einer Lösung von PBS/0,2 % Tween 20 gewaschen, mit der Ausnahme, dass die erste Reihe mit dieser Lösung nicht gewaschen wurde. 100 µl einer Standardlösung von 10 mU/ml β-Galactosidase wurden in die erste Vertiefung der ersten Reihe (d.h. Vertiefung A1) gegeben und 100 µl von jedem Gewebeextrakt wurden in die anderen Vertiefungen in der Reihe gegeben. Reihenverdünnungen mit Verhältnissen von 1:2 wurden in jeder der benachbarten Reihen nachfolgend unter Verwendung der Vertiefungen in der vorhergehenden Reihe durchgeführt. Typischerweise führten Platten mit 96 Vertiefungen mit 12 Vertiefungen/Reihe zu 6 Reihenverdünnungen (1 bis 1/64); die letzte Reihe ist ein Blindwert, der mit PBS als eine Kontrolle beladen ist. Die Platten wurden bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert und dann dreimal mit einer Lösung aus PBS/0,2 % Tween-20, wie oben, gewaschen.
Um den Assay zu entwickeln wurden 100 µl CPRG-AssaypufFer (2,5 mg/ml Chlorphenol-rot-β-D-galactopyranosidmononatriumsalz (CPRG)/1,8 mg/ml MgCl₂/7,1 µl/ml 2-Mercaptoethanol in PBS) in jede gewaschene Vertiefung gegeben und die Platten wurden dann bei 37 °C für 2 h inkubiert. Das Ausmaß der β-Galactosidaseexpression wurde dann spektrophotometrisch als Absorption bei 562 nm bestimmt.
Gesamtgewebe und Gewebeschnitte wurden untersucht unter Verwendung einer Modifizierung dieses Protokolls. Gefrorenes Gewebe oder Gewebeschnitte wurden fixiert durch Eintauchen der gefrorenen Gewebe in Fixierlösung (2 neutrales gepuffertes Formalin/0,02 % Glutaraldehyd/0,02 % NP-40) ohne Tauen. Gewebe wurden inkubiert in Fixierlösung für 2 h bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Bewegen. Nach Inkubation wurden die Gewebe zweimal mit PBS gespült, dann inkubiert bei 37 °C über Nacht in X-Gal Färbelösung (5 mM Kaliumferricyanid/5 mM Kaliumferrocyanid/0,01 % Natriumdesoxycholat/0,02 NP-40/1 mg/ml X-Gal in PBS, ergänzt mit MgCl₂ auf 20 µM unmittelbar vor Anwendung). Nach Färben wurden Gewebe zweimal mit PBS gewaschen und dann in Paraffin eingebettet oder schnell gefroren, um sie zu zerteilen und zur histochemischen Analyse.
BEISPIEL 8
Nachweis funktionaler CFTR-Expression in transfizierten Zellen unter Verwendung eines Chloraustrittsassays
Ein Chloridionenaustrittssassay wurde verwendet, um funktionale Expression von CFTR in transfizierten Zellen nachzuweisen.
Etwa 24 h vor Einbringen von CFTR in Zellen wurden Zellen in Gewebekulturplatten mit 6 Vertiefungen eingebracht, wobei jede Vertiefung 1 ml von 10 ml der Zellen auf der Platte plus 3 ml Medium erhielt. Die Zellen wurden in den Inkubator zurückgeführt und man beließ sie über Nacht bei 37 °C/5 % CO₂ oder bis sie etwa 70-80 % konfluent waren, wachsen. Zur Untersuchung wurde Medium aus den Vertiefungen entfernt und jede Vertiefung wurde mit 2 ml Serum-freiem Medium gewaschen. 1 ml Serum-freies Medium wurde dann pro Vertiefung zugegeben und die Zellen bei 37 °C für 1 bis 2 h inkubiert. 200 µl eines DNA-Lipidkomplexes, umfassend ein rekombinantes Expressionskonstrukt, das für CFTR codiert, wurden dann in jede Vertiefung zugegeben und bei 37 °C für 6-8 h inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde Medium aus jeder Vertiefung entnommen, die Vertiefungen wurden zweimal mit 2 ml serumfreiem Medium gewaschen und in 4 ml Serum-enthaltendem Medium bei 37 °C für 48 h inkubiert.
Der Chloridionenaustrittsassay wurde wie folgt durchgeführt. Mediem wurden aus jeder der Vertiefungen abgezogen, welche Zellen enthielten, die mit DNA-Lipid-Komplexen behandelt waren, und zweimal mit Austrittslösung (135 mM NaCl/2,4 mM K₂HPO₄/0,6 mM KH₂PO₄/1,2 mM CaCl₂/1,2 mM MgCl₂/10 mM Glucose/10 mM HEPES (pH-Wert 7,4)) gewaschen. Die Zellen wurden dann mit 1 ml Austrittslösung, enthaltend Na³⁶Cl mit einer Endkonzentration von 2,5 µCi/ml ³⁶Cl^-, für 2 h bei 37 °C inkubiert. Nach Inkubation wurde die ³⁶Cl-enthaltende Austrittslösung dann abgesaugt von den Zellen und die Zellen wurden dann jeweils viermal mit 1 ml Austrittslösung gewaschen. Die Zellen wurden dann für 3 min bei Raumtemperatur inkubiert mit 1 ml Austrittslösung und die Austrittslösung dann von den Zellen entfernt und in ein Szintillationsgläschen, das 5 ml Szintillationscocktail enthielt, übergeführt. Ein frisches Aliquot der Austrittslösung wurde dann in jede Vertiefung gegeben und für zusätzliche 3 min. inkubiert. Nach jeder Inkubation wurde die Austrittslösung in ein Szintillationsgläschen übergeführt, das 5 ml Szintillationscocktail enthielt und ein ml frisches Aliquot des Austrittsmediums wurde zu den Zellen gegeben und für 3 min inkubiert. Diese Schritte des Assays wurden zehnmal für insgesamt 30 min wiederholt. In bestimmten Vertiefungen wurde ³⁶Cl^--Ionen-Austritt stimuliert durch Inkubieren dieser Zellen in der Gegenwart von 40 µm Forskolin (Sigma), 500 µm cpt-cAMP (Sigma) und 100 µm IBMX (Sigma) in der Austrittslösung, wobei der Austritt stimuliert wird bei den Wiederholungen 3 bis 7.
Das Ausmaß des ³⁶Cl^--Ionen-Austritts über diese Zeitdauer wurde bestimmt durch Szintillationszählen und die Grundrate des ³⁶Cl^--lonenaustritts verglichen mit der Austrittsrate in Zellen, die durch Forskolin/cpt-cAMP/IBMX stimuliert wurden. Das Ausmaß des Austritts wurde normalisiert relativ zur Menge ³⁶Cl^--Ionen, die innerhalb der Zellen nach 30 min Inkubation verbleiben. Diese Menge wurde bestimmt durch Lysieren der Zellen indem sie mit 1 ml Szintillationsfluid für 15 min inkubiert wurden. Das Lysat aus jeder Vertiefung wurde dann in ein Szintillationsgläschen übergeführt, die Vertiefung mit 1 ml Austrittslösung gewaschen, welche zu dem Zelllysat gegeben wurde, und die mit dem ³⁶Cl^- Ionen verbundene Radioaktivität gezählt.
Die Ergebnisse eines solchen Assays sind gezeigt in 2. Zwei Plasmide, die für CFTR codieren und in den Details des Konstrukts (siehe Tabelle 1) verschieden sind, wurden getestet mit (geschlossene Kreise und Kästchen) und ohne (offene Kreise und Kästchen) Stimulierung. Wie in der Figur gezeigt, führt die Stimulierung zu einer raschen Induktion von Chloridionenaustritt gegenüber der Grundrate des Austritts, wobei der Austritt sogar nachdem das Stimulus entfernt ist (Zeitpunkte 24-30) weiter besteht. Diese Ergebnisse zeigen die Anwendbarkeit dieses Assays zum Nachweis funktionaler Expression von CFTR in heterologen Zellen und bildet daher einen in vitro-Standard zur Bestimmung der Vitalität verschiedener Expressionskonstrukte beim Exprimieren humaner CFTR.
Tabelle 1 Vektoren mir der CFTR-cDNA
BEISPIEL 9
Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion-Analyse

Human-CFTR-Genexpression wurde untersucht unter Verwendung eines reverse Transkriptasepolymerasekettenreaktionassays (RT-PCR) auf transfizierte Gewebekulturzellen und Gesamtgewebe. Diese Assays wurden durchgeführt unter Verwendung vektorspezifischer Primen und CFTR-spezifischer Primer. Die verwendeten Vektor-spezifischen Primen waren:

5' AGA TCG CCT GGA GAC GCC AT 3'	Vorwärtsprimer (3651-3671 bp in pMB19: Figur 7 und SEQ ID Nr.:1)
und
5' GCT CCT AAT GCC AAA GGA AT 3'	Reversprimer (1246-1266 bp in pMB19, oberstromig von der hCFTR ATG-Stelle; SEQ ID Nr.:2).

Die CFTR-spezifischen Primer wurden verwendet:

5' CCT GTC TCC TGG ACA GAA A 3' Vorwärtsprimer (3337-3355 pb in pMB19; SEQ ID Nr.: 3)

und

5' GTC TTT CGG TGA ATG TTC TGA C 3' Reversprimer (3651-3671 pb in pMB19; SEQ ID Nr: 4).
Die Gewebe wurden auf Trockeneis für RT-PCT gefroren und bei -70 °C aufbewahrt. Gewebeproben wurden homogenisiert und direkt in dieser Beurteilung verwendet.
Kurz gesprochen, wurde RT-PCR ausgeführt durch Herstellen von Erststrang-cDNA aus zellulärer RNA, isoliert aus gefrorenen Geweben, unter Verwendung von Standardtechniken (siehe Sambrook et al., ibid.), einschließlich spezifisch umfassend die Verwendung von statistischem Hexamer zum Primen und MMLVabgeleiteter reverser Transkriptase. cDNA wurde in PCR-Reaktionen verwendet, die wie folgt durchgeführt wurden. Die gesamten 25 µl der Erststrang-cDNA-Reaktion wurden gemischt mit den Komponenten der PCR-Reaktion (unter Standardbedingungen; siehe Innis et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, New York), einschließlich 25 µM pro Stück jedes der spezifischen Paare von PCR-Primern. PCR-Reaktionen wurden überschichtet mit leichtem Mineralöl, um Kondensation zu verhindern und wurden dann dem folgenden PCR-Cyclisierungsprotokoll unterzogen:

1 Zyklus 10 min 94 °C

30 Zyklen 1 min 94 °C

2 min 55 °C

3 min 72°C

1 Zyklus 10 min 72 °C

2 min 27 °C.
Nach Abschluss der Reaktion wurde die Vorrichtung programmiert, um die Reaktionsgemische aufzunehmen und bei 4 °C bis zur Analyse zu halten.
PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese in Agarose oder Acrylamidgelen analysiert. In diesen Assays wurde erwartet, dass die Vektor-spezifischen Primen eine Bande ergeben, die repräsentativ für Plasmid-DNA (485 bp) ist und eine hCFTR RNA-spezifische Bande (142 bp) zu ergeben. Es wurde erwartet, dass die CFTR-spezifischen Primer eine DNA-Fragment-Bande von 334 by ergeben.
BEISPIEL 10
Funktionale Zuführung von CAT-Genkonstrukten in Zellen, in vivo
Funktionale Zuführung einer Vielzahl von CAT-Reportergen-Konstrukten wurde erreicht unter Verwendung von verschiedenen Ausführungsformen der DNA:Lipid-Komplexe der Erfindung.
A. DOTIM: Cholesterol-Formulierung I
DOTIM:Cholesterol-Liposomen wurden wie oben beschrieben in einem Verhältnis von 1:1 hergestellt und verwendet, um DNA:Lipid-Komplexe herzustellen. DOTIM:Cholesterol (1:1)-Liposomen wurden verwendet, um DNA-Komplexe herzustellen, unter Verwendung des Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Expressionsvektors p4119 (3). DNA:Lipid-Komplexe wurden hergestellt mit einem DNA:Lipid-Verhältnis von 1:6 und unter Verwendung von 125 µg DNA pro 200 µl Komplex. Die Liposomengröße wurde bestimmt durch optische Dichte (OD) bei 400 nm. Insgesamt wurden 200 µl des Komplexes in die Schwanzvenen von 3 ICR-Mäusen injiziert. 24 h nach Injektion wurden Gewebe geerntet und vorbereitet für CAT-Assays, wie in Beispiel 4 oben beschrieben. Geerntete Gewebe umfassten Lunge, Leber, Niere, Milz, Ovar, Hirn, glatten Muskel, Herz und Ohr.
Ergebnisse dieser CAT-Assays sind in den Tabellen II und III unten gezeigt. Tabelle II zeigt CAT-Aktivität als gesamte ¹⁴C-markierte Chloramphenicolzählungen, die konvertiert sind in Acetyl- und Diacetylformen durch CAT-Expressionsvektor-codierte Enzymaktivität in Lunge für jedes der drei getesteten Versuchstiere.
TABELLE II
Tabelle III zeigt CAT-Assaydaten einer Vielzahl von Geweben von einem der Versuchstiere (Tier 20.1-2). Diese Ergebnisse zeigen, dass intravenöse Inokulation von Mäusen in die Schwanzvene mit DOTIM:CholesteroI:DNA-Komplexen in dieser Formulierung zum bevorzugten Targeting der DNA-Lipidkomplexe auf Lungen führt, wobei CAT-Aktivität in Lungengewebe über 80 % der CAT-Aktivität darstellt, die in allen getesteten Mausgeweben nachgewiesen wurde.
TABELLE III

Schlüssel: Lunge (Iu), Leber (Ii), Niere (ki), Milz (sp), Ovar (ov), Gehirn (br), glatter Muskel (sm), Herz (he).

Die Ergebnisse dieser Versuche sind auch graphisch in 4 gezeigt, welche die Ergebnisse zusammenfasst, die erhalten wurden mit über 700 Versuchs- und Kontrollmäusen. Wie in der Figur gesehen werden kann, zeigten behandelte Mäuse reproduzierbar mehr als 1000-fach höhere CAT-Aktivität in Lunge von Mäusen, die behandelt sind mit DNA:Lipid-Komplexen der Erfindung, die CATcodierende rekombinante Expressionskonstrukte (insgesamt 555 Mäuse) umfassten, verglichen mit Kontrollmäusen (unbehandelt) (insgesamt 163 Mäuse).
Die Zuführung und Aufnahme in Zellen verschiedener Mausgewebe der CAT-Plasmid-DNA, die als DNA:Lipid-Komplexe der Erfindung verabreicht wird, durch Injektion in die Schwanzvene von Mäusen wurde durch Southern Blot Analyse analysiert, unter Verwendung von Routineverfahren (siehe Sambrook et al. ibid).
DNA von Mausgeweben wurde extrahiert, gereinigt und verdaut mit BamHl-Restriktionsendonuklease. Die resultierenden DNA-Restriktionsfragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese getrennt und auf eine Membran durch Kapillarwirkung übergeführt. Solche Membranen wurden getrocknet, vorhybridisiert und dann hybridisiert mit einer radioaktiv markierten CAT-DNAspezifischen Sonde (etwa 10⁸-10⁹ dpm/µg) bei einer geeigneten Stringenz (2X-6X SSC bei 62 °C) über Nacht, gewaschen bis zu hoher Stringenz (0,1-0,5XSSC bei 65 °C) und einem autoradiographischen Film bei -70 °C unter Verwendung von Verstärkungsschirmen ausgesetzt.
Ergebnisse dieser Versuche sind in 5 gezeigt. Das untere Feld ist identisch zu dem oberen Feld, jedoch setzte man es dem Röntgenfilm für eine längere Zeitdauer aus. Die Ergebnisse zeigen, dass CAT-DNA spezifisch in Lunge eingeführt wird mit wesentlichen Mengen DNA-Aufnahme in Milz. Viel geringere Mengen CAT-DNA wurden in bestimmten anderen Geweben (Leber, Niere) beobachtet, jedoch viele Gewebe zeigten im Wesentlichen keine CAT-spezifische Hybridisierung, selbst bei der längeren Aussetzungszeit.
Lungengewebe von unbehandelten Tieren wurde analysiert, um die spezifischen transfizierten Zelltypen zu bestimmen. Histologische Schnitte wurden auf Vektorspezifische mRNA untersucht durch reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), durchgeführt wie in Beispiel 9 beschrieben. Die in 21 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass Expression des Transgens vorherrschend in vaskulären Endothelialzellen gefunden wurde.
Eine zweite Reihe von Versuchen wurde unter Verwendung dieser Lipidformulierungen durchgeführt. In diesen Versuchen war das verwendete DNA-Konstrukt der β-Galactosidase-Expressionsvektor MB10 (siehe Tabelle 1), der für eine Form von β-Galactosidase codiert, die in vitro-Studien in dem Kern transloziert wird. Komplexe wurden wie oben beschrieben, gebildet und Mäusen wurden 200 µl Komplexe in die Schwanzvene injiziert. Die resultierenden β-Galactosidasegehalte, die in Lungen vorlagen, sind in 6 gezeigt, welche die Ergebnisse von Versuchen mit 9 Versuchs- und einer Kontrollmaus (nur Liposom verabreicht) darstellen.
In einer dritten Reihe von Versuchen wurde die Expression des humanen CFTR-Gens gezeigt nachfolgend auf i.v.-Zuführung von DNA/DOTIM:Cholesterol-Komplexen. Ein rekombinantes Expressionsplasmid, das für das humane CFTR-Gen (MB19; siehe Tabelle 1 und 7) codiert, wurde verwendet, um DNA-Lipid-Komplexe wie oben beschrieben herzustellen (DNA/Lipid-Verhältnis von 1:6; 125 µg DNA/200 µl Komplex). Diese Komplexe wurden getestet durch Transfektion/Chloridionenaustrittsassay in humanen 293 Zellen in vitro, wie beschrieben in Beispiel 8, und 200 µl wurden in jede der ICR-3-Mäuse injiziert. Zellen und Lungen wurden nach 24 Stunden geerntet. RNA wurde hergestellt unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren, wie sie umfasst sind in Kits von entweder Stratagene (für Zellkulturergebnisse) oder 5'-3'-Prime (für Lungengewebe). Proben wurden analysiert durch RT-PCR, wie oben in Beispiel 9 beschrieben. In dieser Analyse ergab Amplifikation von Plasmidsequenzen ein 484 by PCR-Produkt, während Amplifikation von cDNA, entsprechend gesplicter CFTR-mRNA für CFTR, ein 142 by PCR-Produkt ergab. Ähnliche Ergebnisse wurden von Lungen erhalten nachfolgend i.v.-Verabreichung der CFTR/Lipid-Komplexe.
Der Zeitverlauf der Expression von exogen zugegebenem CAT-codierendem Plasmid in Mauslunge wurde bestimmt. Einer Anzahl von Mäusen wurden intravenös in die Schwanzvene DNA/Lipid-Komplexe injiziert, umfassend p4119 CAT-DNA, in einem 1:6-Verhältnis mit DOTIM:Cholesterol, bei einer Konzentration von 125 µg/200 µl. Jeweils zwei Mäuse wurden geopfert über eine Dauer von 55 Tagen und Lungengewebe analysiert durch CAT-Assay, wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt, welche zeigen, dass hochgradige persistente Expression des Reportergenkonstrukts erreicht worden ist.
Komplexe dieser DOTIM:DNA-Formulierung wurden auch verabreicht durch direkte intracraniale Zuführung. Komplexe wurden hergestellt unter Verwendung von CAT-Expressionsplasmid p4119 und komplexiert mit DOTIM:Cholesterol (1:1) bei einem Verhältnis von 1:1 DNA:Lipid bei einer DNA-Konzentration von 500 µg/200 µl. 200 µl dieser Komplexe wurden direkt intracranial implantiert und das Ausmaß der CAT-Aktivität in Gehirngewebe 24 h später analysiert. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in 9 gezeigt.
Die Ergebnisse dieser verschiedenen Assays zeigten, dass diese DOTIM:Cholesterol-Formulierung in der Lage war zum Zuführen einer Vielzahl rekombinanter Expressionskonstrukte in die Lunge nach intravenöser Verabreichung, als auch durch direkte Injektion in ein Gewebe von Interesse (Gehirn).
B. DOTIM:Cholesterol-Formulierung II
DOTIM:Cholesterol-Liposomen wurden hergestellt wie oben beschrieben, in einem 1:1-Verhältnis und verwendet, um DNA:Lipid-Komplexe herzustellen. DOTIM-Cholesterol (1:1)-Liposomen wurden verwendet, um DNA-Komplexe herzustellen, unter Verwendung des Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Expressionsvektors p4119. DNA:Lipid-Komplexe wurden hergestellt, mit einem DNA:Lipid-Verhältnis von 1:1, und unter Verwendung von 200-550 µg DNA pro 200 µl Komplex. Liposomen wurden in die Schwanzvene von ICR-Mäusen, wie oben beschrieben, injiziert.
CAT-Gen-Expression in Lungengewebe von Mäusen, die injiziert wurden mit DOTIM:CholesteroI:DNA-Komplexen, hergestellt in einem DNA/Lipid-Verhältnis von 1:1, wurde bestimmt. Plasmid p4119-DNA wurde komplexiert mit DOTIM:Cholesterol-Formulierung der Erfindung, wobei die Komplexe ein DNA-Lipid-Verhältnis von 1:1 aufweisen. Schwanzveneninjektionen wurden durchgeführt und Gewebe nach 24 h wie beschrieben geerntet.
Die Ergebnisse dieser Assays sind in Tabelle IV unten gezeigt. TABELLE IV
DNA/DOTIM-Komplexe wurden hergestellt unter Verwendung von Plasmid p4119 und DNA/DOTIM:Cholesterol-Liposomen in Verhältnissen von 1:6 und 1:8, wurden bei 40 °C für 11 Tage vor dem Testen gehalten und dann erneut bei 18 Tagen getestet. Die Ergebnisse der CAT-Expressionsassys unter Verwendung dieser Formulierungen sind in Tabelle V gezeigt.
TABELLE V
DOTIM:Cholesterol-Komplexe mit DNA wurden ebenfalls durch intraperitoneale Injektion verabreicht. DNA:Lipid-Komplexe, die intravenös und intraperitoneal verabreicht wurden, wurden verglichen unter Verwendung von CAT-Expressionsplasmid p4119-DNA, komplexiert mit DOTIM:Cholesterol (1:1)-Formulierungen der Erfindung. In diesen Assays hatten die Komplexe ein DNA/Lipid-Verhältnis von 1:1 und eine DNA-Konzentration von 300-500 µg/200 µl. Insgesamt wurde 1 ml dieser Komplexe intraperitoneal in zwei Mäuse (Maus 4 und 5) injiziert, 200 µl wurden intravenös verabreicht (Maus 1 und 2) und 1 Maus (Maus 3) erhielt eine Formulierung verabreicht, die nur Liposomen enthielt. Gewebe wurden bei 48 h nach der Injektion geerntet. CAT-Assays wurden wie oben im Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt und die Ergebnisse dieser Assays sind in 10 für Herz (he), Milz (sp), Pankreas (pa) und Lunge (Iu) gezeigt.
Die Wirkung auf die Effizienz der DNA-Zuführung zu Gewebe in vivo einer intravenösen Verabreichung verschiedener Formulierungen, die das gleiche Gemisch kationischer und neutraler Lipide umfassen, wurde bestimmt durch Vergleichen des Ausmaßes übertragener CAT-Aktivität, die beobachtet wird unter Verwendung der verschiedenen Formulierungen. CAT-Plasmid-DNA/DOTIM:DOPE (1:1)-Komplexe wurden in den folgenden Formulierungen hergestellt:
Jede Formulierung wurde wie in den Beispielen 1 und 3 oben beschrieben hergestellt und wurde durch intravenöse Injektion in die Schwanzvene von Gruppen von 3 ICR-Mäusen pro getesteter Formulierung Injiziert. Liposomen, die nicht mit DNA komplexiert waren, wurden in eine getrennte Gruppe von 3 Mäusen als eine Kontrolle injiziert.
Tiere wurden 1-2 Tage nach Injektion geopfert und durch CAT-Assay von Milz-, Herz- und Lungengewebe analysiert. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in 11 gezeigt. Diese Figur zeigt, dass Formulierung B einen konsistent höheren Grad der CAT-Aktivität in Milz, Herz und Lunge liefert als Formulierung A, wenngleich es erscheint, dass die relative Effizienz der Plasmidzuführung etwa die gleiche für beide Formulierungen ist.
C. Vergleich der HLA-Gen-Zuführung unter Verwendung verschiedener DNA:Lipid-Komplexe
Drei verschiedene Lipidformulierungen wurden verwendet, um ein humanes HLAcodierendes Konstrukt Knochenmark, Milz und Lymphknoten zuzuführen. Die drei verwendeten Formulierungen waren:

A. DOTIM:Cholesterol (1:1) DNA:Lipid-Verhältnis 1:6 DNA-Konzentration 0,625 mg/ml
B. DOTIM:Cholesterol (1:1) DNA:Lipid-Verhältnis 1:1 DNA-Konzentration 2 mg/ml
C. DOTIM:DOPE (1:1) DNA:Lipid-Verhältnis 1:1 DNA-Konzentration 2 mg/ml

(DOPE ist Dioleoylphosphatidylethanolamin). Jede Formulierung wurde wie in den Beispielen 1 und 3 oben beschrieben, hergestellt, und wurde durch intravenöse Injektion in die Schwanzvene von Gruppen von 3 ICR-Mäusen pro getesteter Formulierung verabreicht. Liposomen, die nicht mit DNA komplexiert waren, wurden in eine getrennte Gruppe von 3 Mäusen als eine Kontrolle injiziert.
Tiere wurden 1-2 Tage nach Injektion geopfert und durch histochemisches Färben auf Expression von humanem HLA analysiert. Gewebe wurden auf Prozentanteile von Zellen in dem Gewebe, die positiv für humane HLA-Expression in dem histochemischen Färbeassay sind, analysiert. Ergebnisse dieser Versuche sind in 12 gezeigt, worin Formulierung A MB102 ist, Formulierung B MB107 ist und Formulierung C MB163 ist. Für jede getestete Formulierung wurden in jedem der Gewebe einige Zellen gefunden, die positiv für Expression von humanem HLA färben. Lymphknotenfärbung variiert am stärksten unter verschiedenen verabreichten Formulierungen, wobei DOTIM:Cholesterol bei der höheren (2 mg/ml) DNA-Konzentration die meisten humanen HLApositiven Zellen liefert und die DOTIM:DOPE-Formulierung die wenigsten humanen HLA-positiven Zellen liefert. Die Ergebnisse in der Milz waren weniger variabel, wobei die DOTIM:Cholesterol-Formulierung bei der niederen (0,625 mg/ml) DNA-Konzentration die meisten humanen HLA-positiven Zellen liefert. Knochenmarkszellen zeigten hohe Gehalte humaner HLA-positiver Zellen mit allen getesteten Formulierungen.
Im Hinblick auf diese Ergebnisse wurde eine Reihe von Versuchen durchgeführt, um Formulierungs-abhängiges Targeting von DNA:Lipid-Komplexen auf Milz und Lunge zu zeigen. Zwei Formulierungen wurden verwendet:
Jede Formulierung wurde wie in den Beispielen 1 und 3 oben beschrieben, hergestellt, unter Verwendung eines CAT-codierenden Konstrukts und wurde verabreicht durch intravenöse Injektion in die Schwanzvene von Gruppen aus drei ICR-Mäusen pro getesteter Formulierung. Liposomen, die nicht mit DNA komplexiert waren, wurden eine getrennte Gruppe von drei Mäusen als Kontrolle injiziert.
Tiere wurden 1-2 Tage nach Injektion geopfert und durch CAT-Assay von Lungen- und Milzgeweben analysiert, wie oben beschrieben. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in 13 gezeigt, worin MB102 Formulierung A ist und MB153 Formulierung B ist. CAT-Aktivität ist ausgedrückt als die Prozentanteile gesamter ¹⁴C-Chloramphenicolzählungen, übergeführt auf acetylierte und diacetylierte Formen, die mit jedem Gewebe verbunden sind. Wie aus der Figur ersichtlich ist, führte die DOTIM:Cholesterol-Formulierung, die intravenös verabreicht wurde, zu 96 % (aus über 1 Million Zählungen), die in Lungengewebe lokalisiert sind; 2 % der Zählungen, die aus dieser Formulierung resultieren, wurden in der Milz gefunden und der Rest wurde in anderen Geweben gefunden. Im Gegensatz hierzu führte die intravenös verabreichte DOTIM:DOPE-Formulierung dazu, dass 91 % (von 160.000 Zählungen) in Milzgewebe lokalisiert sind, wobei etwa 3 % der Zählungen in der Lunge gefunden werden und der Rest in anderen Geweben gefunden wird. Die Ergebnisse zeigen, dass diese DOTIM:Cholesterol-Formulierung im Besonderen in DNA:Lipid-Komplex auf die Lunge zielt, während die DOTIM:DOPE-Formulierungen im Besonderen DNA:Lipidkomplexe auf die Milz zielt. Zusätzlich zeigen diese Ergebnisse, dass CAT-Aktivität etwa um das 10-fache stabiler ist bei Zuführung in DOTIM:Cholesterol-Komplexen zu der Lunge als die CAT-Aktivität, die aus DOTIM:DOPE-Komplex-vermittelter Zuführung zu Milz resultiert.
D. Intraperitoneal-Zuführungsformulierungen
Liposomenformulierungen wurden entwickelt zur zielgerichteten Genzuführung durch intraperitoneale Verabreichung. DOTIM:Cholesterol-Formulierungen (1:1) wurden getestet unter Verwendung eins CAT-codierenden Konstrukts bei einem DNA:Lipid-Verhältnis von 1:1 und einer Gesamt-DNA-Konzentration in dem Komplex von 2,5 mg/ml. Eine Menge (1 ml) dieser DNA-Komplexe wurde in die Peritonealhöhle von jeder von vier Mäusen injiziert; ein gleiches Volumen der Liposomenformulierung, die nicht komplexiert ist mit CAT-codierender DNA, wurde in vier Mäuse in einer getrennten Gruppe als eine Kontrolle injiziert. Peritoneale Makrophagen wurden 24-48 h nach Injektion isoliert und auf CAT-Aktivität wie oben beschrieben, getestet.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in 14 gezeigt. Peritoneale Makrophagen von Kontrollmäusen (unbehandelt) zeigten im Wesentlichen keine CAT-Aktivität in diesem Assay. Makrophagen von Mäusen, die DNA:Lipid-Komplexe in dieser Formulierung intraperitoneal verabreicht bekamen, zeigten hohe Grade CAT-Aktivität, wodurch spezifische in vivo-Zuführung eines funktionalen CAT-Gens unter Verwendung dieser Formulierung gezeigt wird.
Milz aus diesen Tieren wurde ebenfalls getestet und CAT-Aktivität verglichen mit peritonealen Makrophagen. Diese Ergebnisse sind in 15 gezeigt, woraus gesehen werden kann, dass CAT-Aktivität in Makrophagen viel höher war als in Milz, wodurch Spezifität beim Targeting bzw. der Zielrichtung auf diese Zellen gezeigt wird.
Pankreasgewebe wurden für Genzuführung wie folgt anvisiert, unter Verwendung der DNA:Lipid-Formulierungen der Erfindung. Eine Formulierung, umfassend ein CAT-exprimierendes Plasmid und DOTIM:DOPE (1:1), bei einem DNA:Lipid-Verhältnis von 1:1 und einer DNA-Konzentration im Komplex von 1,5 mg/ml wurde intraperitoneal injiziert in eine Gruppe von drei Mäusen. Zwei Mäuse wurden als eine Kontrolle injiziert mit der Liposomformulierung, die nicht komplexiert ist mit DNA. Pankreas- und Lungengewebe wurden 24 bis 48 h nach Verabreichung auf CAT-Aktivität wie oben beschrieben, analysiert.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in 16 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Formulierung sich im Besonderen auf die Zuführung von CATcodierenden DNA-Konstrukten bei intraperitonealer Verabreichung richtete.
Ein CAT-codierendes rekombinantes Konstrukt wurde auf Milz gerichtet, unter Verwendung von einer noch anderen DNA:Lipid-Formulierung. Plasmid-DNA, die mit DOTIM:Cholesterol (1:1) komplexiert war, bei einem DNA:Lipid-Verhältnis von 1:1, und einer Gesamt-DNA-Konzentration im Komplex von 2,5 mg/ml, wurde intraperitoneal in eine Gruppe von 3 Mäusen injiziert. Eine getrennte Gruppe von Mäusen wurde als eine Kontrolle injiziert mit der Liposomformulierung, die nicht komplexiert war mit DNA. Milzgewebe von Mäusen wurde in jeder Gruppe 24-48 h nach Verabreichung auf CAT-Aktivität analysiert, wie oben beschrieben.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in 17 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Formulierung im Besonderen gerichtet ist auf Zuführung von CAT-codierenden DNA-Konstrukten in die Milz in vivo, bei intraperitonealer Verabreichung.
Die Gewebespezifität von intraperitonealer Zuführung wurde gezeigt durch den Vergleich von zwei verschiedenen Formulierungen, die intraperitoneal verabreicht wurden. Die folgenden Formulierungen wurden getestet:
Jede Formulierung wurde hergestellt wie in den Beispielen 1 und 3 oben beschrieben, unter Verwendung eines CAT-codierenden Konstrukts und wurde durch intraperitoneale Injektion von Gruppen von drei ICR-Mäusen pro getesteter Formulierung verabreicht. Liposomen, die nicht komplexiert waren mit DNA wurden in eine getrennte Gruppe von drei Mäusen als eine Kontrolle injiziert.
Tiere wurden 1-2 Tage nach Injektion geopfert und durch CAT-Assay von Pankreas- und Milzgewebe analysiert, wie oben beschrieben. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in 18 gezeigt, worin MB153 Formulierung A ist und MB152 Formulierung B ist. CAT-Aktivität ist ausgedrückt als der Prozentanteil von gesamten ¹⁴C-Chloramphenicolzählungen, übertragen auf acetylierte und diacetylierte Formen, die mit jedem Gewebe verbunden sind. Wie aus der Figur ersichtlich ist, führte die DOTIM:DOPE-Formulierung, die intraperitoneal verabreicht wurde, dazu, dass 96 % (von 18 Millionen Zählungen) intraperitoneal verabreichter Formulierung in Pankreasgewebe lokalisiert sind; es zeigte sich, dass 3 % der Zählungen, die aus dieser Formulierung resultieren, in der Milz gefunden wurden, und der Rest wurde in anderen Geweben gefunden. Im Gegensatz hierzu führte die DOTIM:Cholesterol-Formulierung, die intraperitoneal verabreicht wurde, dazu, dass 58 % (von 28 Millionen Zählungen) in dem Milzgewebe lokalisiert sind, wobei etwa 42 % der Zählungen in dem Pankreas gefunden werden; im Wesentlichen wurde keine CAT-Aktivität in anderen Geweben beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese DOTIM:DOPE-Formulierung im Speziellen den DNA:Lipid-Komplex auf den Pankreas richtet bei intraperitonealer Verabreichung, während die DOTIM:Cholesterol-Formulierung im Speziellen DNA:Lipid-Komplexe auf Pankreas und Milz richtet.
E. Formulierungen für direkte Zuführung
Liposomenformulierungen wurden entwickelt für gezielte Genzuführung durch direkte Injektion in Gewebe. DOTIM:Cholesterol-Formulierungen (1:1) wurden getestet unter Verwendung eines CAT-codierenden Konstrukts bei einem DNA:Lipid-Verhältnis von 1:1 und einer DNA-Konzentration im Komplex von 2,5 mg/ml. Diese Formulierung wurde direkt mit 1,5 ml in eine humane Prostata ex corpora injiziert, und dann durch CAT-Assay wie oben beschrieben, untersucht.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in 19 gezeigt. Diese Figur zeigt die Ergebnisse von vier verschiedenen getesteten Prostatageweben, nachgewiesen als die Menge CAT-Aktivität, die in jedem der transfizierten Prostatagewebe gefunden wird.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Genzuführung vermittelt werden kann durch direkte Injektion von DNA:Lipid-Komplexen der Erfindung in humane Gewebe.
F. Vergleich von intravenösen und intraperitonealen Verabreichungswegen
Die Wirkung des Verabreichungsweges auf zielgerichtete Zuführung von CATcodierender Plasmid-DNA unter Verwendung einer einzelnen DNA:Lipid-Komplexformulierung wurden bestimmt. DOTIM:Cholesterol-Formulierungen (1:1) wurden getestet unter Verwendung eines CAT-codierenden Konstrukts bei einem DNA:Lipid-Verhältnis von 1:1 und einer Gesamt-DNA-Konzentration im Komplex von 2,5 mg/ml. Gruppen von 3 Mäusen wurden entweder intravenös in die Schwanzvene oder intraperitoneal injiziert. Milz- und Lungengewebe wurden 24-48 h nach Verabreichung auf CAT-Aktivität analysiert, wie oben beschrieben. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in 20 gezeigt. Es ist aus der Figur ersichtlich, dass die höchsten CAT-Aktivitätsgrade erreicht wurden in Lungengewebe nachfolgend auf intravenöse Verabreichung der Formulierung. Jedoch CAT-Aktivität nach intraperitonealer Verabreichung war relativ höher in der Milz als in der Lunge. Diese Ergebnisse zeigen, dass gewebespezifisches Ausrichten bzw. Targeting von DNA-Zuführung erreicht werden kann mit den gleichen effizienten Formulierungen von DNA:Lipid-Komplexen, und dass die anvisierte Stelle beeinflusst werden kann durch den Verabreichungsweg.
Es versteht sich, dass die vorstehende Offenbarung bestimmte spezifische Ausführungsformen der Erfindung darstellt und dass alle Modifikationen oder Alternativen, die hierzu äquivalent sind innerhalb des Geists und des Bereichs der Erfindung sind, wie in den anhängigen Ansprüchen angegeben.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Formulierung eines löslichen Komplexes eines rekombinanten Expressionskonstrukts und ein Gemisch aus einem neutralen Lipid und einem kationischen Lipid in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, geeignet zur Verabreichung an ein Lebewesen durch intravenöse, intraperitoneale oder direkte Injektion in ein Gewebe in das Lebewesen, worin: (a) das rekombinante Expressionskonstrukt eine Nukleinsäure umfasst, die für ein Protein codiert, worin die Nukleinsäure operativ verbunden ist mit Genexpressionregulationselementen, wobei das Protein, das durch die Nukleinsäure codiert wird, in Zellen in einem Gewebe in einem Lebewesen exprimiert wird; und (b) das kationische Lipid 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid ist und das neutrale Lipid Cholesterol oder Dioleoylphospatidylethanolamin ist, worin das kationische Lipid und das neutrale Lipid in dem Komplex in einem molaren Verhältnis von etwa 1:1 vorliegen, die DNA und das Lipid in dem Komplex in einem Verhältnis von etwa 1:1 bis 1:15 µg DNA/nmol Lipid vorliegen und die Nukleinsäure, die das rekombinante Expressionskonstrukt umfasst, in dem Komplex in einer Konzentration von etwa 0,5 mg/ml bis etwa 5 mg/ml vorliegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Komplex aus dem rekombinanten Expressionskonstrukt und einem Lipid ein Verhältnis von DNA zu Lipid von etwa 1:6 bis etwa 1:15 µg DNA/nmol Lipid umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Komplex aus dem rekombinanten Expressionskonstrukt und einem Gemisch eines neutralen und eines kationischen Lipids ein Verhältnis von DNA zu kationischem Lipid von etwa 1:1 µg DNA/nmol kationisches Lipid umfasst.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikaments zur Einführung eines rekombinanten Expressionskonstrukts in eine Zelle, umfassend Lungengewebe in einem Lebewesen, worin die pharmazeutische Zusammensetzung dem Lebewesen verabreicht werden durch intravenöse Injektion, worin das kationische Lipid 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid ist, das neutrale Lipid Cholesterol ist, worin das kationische Lipid und das neutrale Lipid in einem molaren Verhältnis von etwa 1:1 vorliegen, wobei der Komplex aus dem rekombinanten Expressionskonstrukt und einem Gemisch von einem neutralen Lipid und einem kationischen Lipid ein Verhältnis von DNA zu kationischem Lipid von etwa 1:6 µg DNA/nmol kationisches Lipid umfasst und die DNA-Konzentration in den DNA:Lipid-Komplexen von etwa 0,5 mg/ml bis etwa 1 mg/ml ist.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikaments zur Einführung eines rekombinanten Expressionskonstrukts in eine Zelle innerhalb einer Milz in einem Lebewesen, worin die pharmazeutische Zusammensetzung dem Lebewesen verabreicht wird durch intravenöse Injektion, worin das kationische Lipid 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid ist, das neutrale Lipid Dioleoylphospatidylethanolamin ist, worin das kationische Lipid und das neutrale Lipid in einem molaren Verhältnis von etwa 1:1 vorliegen, wobei der Komplex aus dem rekombinanten Expressionskonstrukt und einem Gemisch von einem neutralen Lipid und einem kationischen Lipid ein Verhältnis von DNA zu kationischem Lipid von etwa 1:1 µg DNA/nmol kationisches Lipid umfasst und die DNA-Konzentration in den DNA:Lipid-Komplexen von etwa 1 mg/ml bis etwa 2,5 mg/ml ist.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikaments zur Einführung eines rekombinanten Expressionskonstrukts in eine Zelle, die ein peritonealer Makrophage in einem Lebewesen ist, worin die pharmazeutische Zusammensetzung dem Lebewesen verabreicht wird durch intraperitoneale Injektion, worin das kationische Lipid 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3(2-hydroxyethyl)imidazoliumchlorid ist, das neutrale Lipid Cholesterol ist, worin das kationische Lipid und das neutrale Lipid in einem molaren Verhältnis von etwa 1:1 vorliegen, wobei der Komplex aus dem rekombinanten Expressionskonstrukt und einem Gemisch von einem neutralen Lipid und einem kationischen Lipid ein Verhältnis von DNA zu kationischem Lipid von etwa 1:1 µg DNA/nmol kationisches Lipid umfasst und die DNA-Konzentration in den DNA:Lipid-Komplexen von etwa 1 mg/ml bis etwa 2,5 mg/ml ist.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikaments zur Einführung eines rekombinanten Expressionskonstrukts in eine Zelle innerhalb einer Milz eines Lebewesens, worin die pharmazeutische Zusammensetzung dem Lebewesen verabreicht wird durch intraperitoneale Injektion, worin das kationische Lipid 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid ist, das neutrale Lipid Cholesterol ist, worin das kationische Lipid und das neutrale Lipid in einem molaren Verhältnis von etwa 1:1 vorliegen, wobei der Komplex aus dem rekombinanten Expressionskonstrukt und einem Gemisch von einem neutralen Lipid und einem kationischen Lipid ein Verhältnis von DNA zu kationischem Lipid von etwa 1:1 µg DNA/nmol kationisches Lipid umfasst und die DNA-Konzentration in der DNA:Lipid-Formulierung von etwa 1 mg/ml bis etwa 2,5 mg/ml ist.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikaments zur Einführung eines rekombinanten Expressionskonstrukts in eine Zelle innerhalb des Pankreas eines Lebewesens, worin die pharmazeutische Zusammensetzung dem Lebewesen verabreicht wird durch intraperitoneale Injektion, worin das kationische Lipid 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid ist, das neutrale Lipid Dioleoylphospatidylethanolamin ist, worin das kationische Lipid und das neutrale Lipid in einem molaren Verhältnis von etwa 1:1 vorliegen, wobei der Komplex aus dem rekombinanten Expressionskonstrukt und einem Gemisch von einem neutralen Lipid und einem kationischen Lipid ein Verhältnis von DNA zu kationischem Lipid von etwa 1:1 µg DNA/nmol kationisches Lipid umfasst und die DNA-Konzentration in der DNA:Lipid-Formulierung von etwa 1,5 mg/ml bis etwa 2,5 mg/ml ist.
Vewendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikaments zur Einführung eines rekombinanten Expressionskonstrukts in eine Zelle in einem Lebewesen, worin die pharmazeutische Zusammensetzung dem Lebewesen verabreicht wird durch direkte Injektion in das Gewebe in dem Lebewesen, worin das kationische Lipid 1-(2-(Oleoyloxy)ethyl)-2-oleyl-3(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid ist, das neutrale Lipid Cholesterol ist, worin das kationische Lipid und das neutrale Lipid in einem molaren Verhältnis von etwa 1:1 vorliegen, wobei der Komplex aus dem rekombinanten Expressionskonstrukt und einem Gemisch von einem neutralen Lipid und einem kationischen Lipid ein Verhältnis von DNA zu kationischem Lipid von etwa 1:1 µg DNA/nmol kationisches Lipid umfasst und die DNA-Konzentration in den DNA:Lipid-Komplexen ewa 1 mg/ml bis etwa 2,5 mg/ml ist.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 zum Herstellen eines Medikaments zur Einführung eines rekombinanten Expressionskonstrukts in eine Zelle, umfassend Hirngewebe in einem Lebewesen, worin die pharmazeutische Zusammensetzung dem Lebewesen verabreicht wird durch direkte intracraniale Injektion.