DE69925113T2

DE69925113T2 - Polynukleotidzusammensetzung, verfahren zu deren herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE69925113T2
Application number: DE69925113T
Authority: DE
Inventors: Shankar Musunuri; P. Patrick DELUCA
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1998-03-13
Filing date: 1999-03-12
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2019-03-13
Also published as: IL138306A0; US20080081366A1; DE69925113D1; PT1061955E; ES2239440T3; WO1999045966A1; EP1061955B1; ATE294594T1; AU3086899A; CA2322232A1; KR100625385B1; AU765177B2; JP2002506048A; KR20010074441A; CN100471522C; CN1294520A; BR9908754A; EP1061955A1

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Polynucleotid-Zusammensetzung, die verbesserte Stabilität hat. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Herstellen der Polynucleotid-Zusammensetzung durch Lyophilisieren.
Hintergrund der Erfindung
Polynucleotid-Zusammensetzungen haben eine Vielfalt an Verwendungsmöglichkeiten in den industriellen, pharmazeutischen, medizinischen, ernährungsmäßigen und/oder landwirtschaftlichen Gebieten. Als ein Beispiel sind Polynucleotide für die Herstellung von Proteinen brauchbar, welche in diesen Gebieten brauchbar sind. Ferner sind Polynucleotide selbst als in vivo Reagenzien, in diagnostischen/bildgebenden Protokollen, als Reagenzien bei Gentherapie, in Antisense Protokollen und in Impfstoffanwendungen brauchbar, oder ansonsten als Pharmazeutika, welche verwendet werden, um eine Vielfalt an Krankheiten zu behandeln oder zu verhindern, wie genetische Defekte, infektiöse Krankheiten, Krebs und Autoimmunerkrankungen. Polynucleotide sind ebenfalls als in vitro Reagenzien in Tests brauchbar wie biologischen Forschungstests, medizinischen, diagnostischen und Screening Tests und Verunreinigungsnachweistests. Für jeden oben erwähnten Nutzen müssen die Polynucleotide wie Plasmid-DNA für verlängerte Zeiträume, vorzugsweise bei ungekühlten oder nicht gefrorenen Temperaturen bewahrt werden. Ein Problem, welches die Entwicklung von Polynucleotiden für solche Verwendungsmöglichkeiten behindert hat, ist, dass die Polynucleotide dazu neigen, instabil zu sein, wenn sie nicht gefroren sind. Zum Beispiel ist von Polynucleotiden gefunden worden, dass sie in der Wirksamkeit nachlassen, wenn sie für länger als ein paar Stunden in Lösung gelassen werden.
Ein wünschenswertes Verfahren zum Messen der Stabilität von Polynucleotiden ist der Verlust von Supercoil (oder „SC") der Polynucleotide im Zeitablauf. Der Begriff „Supercoil" ist definiert als der physikalische Zustand eines Polynucleotids, in welchem ein Strang des Polynucleotids im Bezug auf die anderen Stränge des Polynucleotids unterdreht oder überdreht ist. Der Verlust an Supercoil im Zeitablauf hat die unerwünschte Wirkung, die Reinheit einer Polynucleotid-Zusammensetzung zu verringern. Daher sind viele Versuche gemacht worden, dieses Problem anzugehen und die Stabilität von Polynucleotiden zu verbessern. Ein solcher Versuch schließt ein Polynucleotid-Herstellungsverfahren ein, welches Ausfällung, gefolgt von Trocknen einbezieht. Jedoch haben solche Verfahren gewünschte Polynucleotid-Stabilitäten nicht erreicht. Andere Versuche nach Stand der Technik schließen Lagern von Polynucleotiden in Salzlösungen ein; jedoch führen diese Verfahren ebenfalls zu einem Verlust an Supercoil Struktur.
Ein anderes Verfahren zum Stabilisieren von Polynucleotiden bezieht Lyophilisieren der Polynucleotide ein. Lyophilisieren, auch als Gefriertrocknen bezeichnet, ist in der Vergangenheit verwendet worden, um solche Artikel wie Nahrungsmittel, Blutplasma, lebenswichtige Organe, Proteine, intakte Zellen wie bakterielle und einzellige eukaryotische Organismen und biologisch wirksame Substanzen wie Arzneien zu stabilisieren oder konservieren. Das Lyophilisierungsverfahren schließt Lösen des zu lyophilisierenden Materials in einem Lösungsmittel, üblicherweise Wasser, und Gefrieren der Lösung ein. Eine Menge an Kryoprotektivum wird häufig eingeschlossen, um das Polynucleotid zu stabilisieren. Nach Gefrieren der Lösung wird Vakuum angewendet und das gefrorene Material wird allmählich erhitzt, um das Lösungsmittel vom gefrorenen Zustand zu sublimieren. Das endgültige gefriergetrocknete Material wird typischerweise als Kuchen der gleichen Form und Größe wie das gefrorene Material gewonnen und ist von ausreichender Porosität, um Rekonstitution zu erlauben. In den frühen 1980ern verkaufte die American Type Culture Collection zum Beispiel lyophilisierte DNA, stabilisiert mit dem Kryoprotektivum Lactose.
WO 95/27721 offenbart gefriergetrocknete Partikel, die RNA umfassen, und ihr Herstellungsverfahren. Die Partikel, die hergestellt werden, sind trocken, und daher wird beansprucht, dass sie gegenüber verschiedenen Abbauprozessen fast unempfindlich sind.
PCT-Anmeldung Nr. WO 96/41873, veröffentlicht am 27. Dezember 1996, und ihr verwandtes United States Patent Nr. 5811406, erteilt am 22. September 1998, welche hierin durch Verweis eingeschlossen werden, offenbaren Stabilisieren eines Palynucleotid-Komplexes, der ein Kryoprotektivum enthält, durch Lyophilisieren des Komplexes auf eine nicht offenbarte Weise. Jedoch können die Verfahrensparameter der Lyophilisierung einen signifikanten Einfluss auf die Stabilität und die Löslichkeit einer Polynucleotid-Zusammensetzung haben. Das Lyophilisierungsverfahren kann Polynucleotide mit niedriger Löslichkeit ergeben, was erfordert, dass mehr Lösungsmittel verwendet werden muss, um Rekonstitution zu erlauben. Diese Dokumente versäumen es, diese Sachverhalte der Lyophilisierung anzusprechen, und versäumen es daher, irgend welche Verfahren zum Vorsehen von lyophilisierten Zusammensetzungen mit verbesserter Stabilität oder Löslichkeit zu lehren.
Es bleibt ein Bedarf nach Stand der Technik für Polynucleotid-Zusammensetzungen, gekennzeichnet durch verbesserte Stabilität, insbesondere für pharmazeutische Anwendungen, als auch für Verfahren zum Herstellen solch stabiler Polynucleotid-Zusammensetzungen.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt sieht die vorliegende Erfindung eine lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzung vor, welche mindestens ein Polynucleotid und mindestens ein Kryoprotektivum umfasst, wobei das Verhältnis des Polynucleotids zum Kryoprotektivum von etwa 0,001 bis etwa 1,0 Gewichtsanteil Polynucleotid pro 1,0 Gewichtsanteil Kryoprotektivum beträgt. Diese Zusammensetzung umfasst ebenfalls von etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 6 Gew.-% Wasser, basierend auf dem Gesamtgewicht der endgültigen lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzung. Die Polynucleotid-Zusammensetzung dieser Erfindung ist durch verbesserte Stabilität gekennzeichnet, indem sie mindestens 90% Supercoil über einen Zeitraum von mindestens 10 Tagen bei einer Temperatur von etwa 37°C bewahrt.
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzung vor, gekennzeichnet durch verbesserte Stabilität. Die Schritte dieses Verfahrens schließen Unterwerfen einer ein Kryoprotektivum enthaltenden Polynucleotid-Lösung ein, welche Zusammensetzung bis zum Gefrieren gekühlt worden ist und einem Vakuum unterworfen wurde, unter einen primären Trocknungszyklus, welcher umfasst: allmähliches Erhitzen der Polynucleotid-Lösung bei einer Temperatur von etwa –20°C bis etwa 20°C über einen Zeitraum von etwa 5 bis etwa 30 Stunden unter Vermeiden von Verflüssigung (auch als „Rückschmelzen" bezeichnet) der Zusammensetzung. Dieser primäre Trocknungszyklus verringert die Zeit, welche für das vollständige Lyophilisierungsverfahren notwendig ist, und sieht das sich ergebende lyophilisierte Polynucleotid in einer im Wesentlichen amorphen physikalischen Struktur vor, welche mindestens 90% Supercoil über einen Zeit raum von mindestens 10 Tagen bei einer Temperatur von etwa 37°C bewahrt. Dieses Produkt kann dann falls gewünscht in einer wässerigen Lösung rekonstituiert werden.
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Lyophilisierungsverfahren mit Parametern vor, welche so ausgelegt sind, dass sie eine lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzung vorsehen, welche durch verbesserte Stabilität und verbesserte Löslichkeit gekennzeichnet ist. Dieses Verfahren umfasst die Schritte:

(a) Bilden einer wässerigen Polynucleotid-Lösung mit einem pH von etwa 6,2 bis etwa 7,8 und umfassend von etwa 0,1 mg/ml bis etwa 5 mg/ml von mindestens einem Polynucleotid, basierend auf dem Gesamtvolumen der Polynucleotid-Lösung, und von etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-% von mindestens einem Kryoprotektivum, basierend auf dem Gesamtgewicht der Polynucleotid-Lösung;
(b) Kühlen der Polynucleotid-Lösung auf eine Temperatur von etwa –30°C bis etwa –70°C, bis gefroren;
(c) Anwenden von Vakuum, um den Druck auf etwa 25 mTorr (187,5 Pa) bis etwa 250 mTorr (1875 Pa) zu verringern;
(d) allmähliches Erhitzen der Polynucleotid-Lösung ein erstes Mal auf eine Temperatur von etwa –40°C bis etwa 20°C über einen Zeitraum von etwa 5 Stunden bis etwa 40 Stunden;
(e) Halten der Polynucleotid-Lösung nach Erhitzungsschritt
(d) bei einer Temperatur von etwa –35°C bis etwa 10°C und bei einem Druck von 25 mTorr (187,5 Pa) bis etwa 250 mTorr (1875 Pa) für einen Zeitraum von etwa 1 Stunde bis etwa 10 Stunden;
(f) allmähliches Erhitzen der Polynucleotid-Lösung nach dem Halteschritt (e) auf eine Temperatur von etwa 20°C bis etwa 35°C über einen Zeitraum von etwa 1 Stunde bis etwa 20 Stunden und bei einem Druck von etwa 25 mTorr (187,5 Pa) bis etwa 150 mTorr (1125 Pa) und
(g) Gewinnen einer lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzung mit einem Wassergehalt von etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 6 Gew.-%, basierend auf dem Gesamtgewicht der gewonnenen Zusammensetzung.

In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung eine lyophilisierte Zusammensetzung vor, hergestellt durch die obigen Verfahren.
In noch einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ebenfalls eine flüssige Polynucleotid-Zusammensetzung vor, welche die oben beschriebene lyophilisierte Zusammensetzung umfasst, rekonstituiert in Wasser und gekennzeichnet durch einen pH von zwischen etwa 6,2 bis etwa 7,8.
In noch einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung vor, welche einen Wirkstoff umfasst, welcher eine lyophilisierte Zusammensetzung wie oben beschrieben oder eine rekonstituierte flüssige Zusammensetzung wie oben beschrieben ist. Diese Inhaltsstoffe werden wünschenswerterweise mit einem pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger oder Träger kombiniert.
In noch einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Behandeln eines Säugers durch Verabreichen einer wirksamen Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung an den Säuger vor. Solche Verabreichung kann auf jedem herkömmlichen Verabreichungsweg stattfinden, z.B. oral, parenteral, intranasal oder intrapulmonal.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon weiter beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Graph, welcher den Zerfall in % Supercoil („SC"), also die Stabilität von lyophilisierten DNA-Zusammensetzungen gemäß der Erfindung (⧫) gegenüber der gleichen DNA in Lösung (⦁) im Zeitablauf unter Verwendung des Agarose-Gel Verfahrens plottet. Basierend auf Geschwindigkeitsgleichung 3 in Schema 1 unten, welche den Abbau von DNA beschreibt, wurden Plots von ln(%SC) gegenüber Zeit für die bevorzugte lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzung von Beispiel 1 und flüssige Zusammensetzung, welche Plasmid-DNA enthält, welche nicht lyophilisiert wurde (Kontrolle) erzeugt. Die Neigungen (–k_obs, beobachtete pseudo Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung) von Plots wurden unter Verwendung von linearer Kleinste-Quadrate Regressionsanalyse berechnet. Für die lyophilisierten Zusammensetzungen war die Neigungsformel y = 0,001x + 4,5369 und die Geschwindigkeitskonstante (R²) = 0,7988. Für die Kontrolle war die Neigungsformel y = 0,014x + 4,5611 und R² = 0,9297. Es kann von dieser Figur beobachtet werden, dass die Geschwindigkeitskonstante für bevorzugte lyophilisierte Zusammensetzungen mindestens 10-fach nied-riger ist, als die Geschwindigkeitskonstante für flüssige Zusammensetzungen.
2 ist ein Graph ähnlich dem von 1, aber für eine bevorzugte lyophilisierte Zusammensetzung gemäß der Erfindung (⧫), welche Plasmid-DNA und 2% Gew.-/Gew. Trehalose als Kryoprotektivum mit einem 4% Feuchtigkeitsgehalt enthält (Lyo2T2H), gegenüber der gleichen DNA in nicht lyophilisierter Lösung (⦁, Flüssigkeit) im Zeitablauf. Für die lyophilisierte Zusammensetzung war die Neigungsformel y = 0,0033x + 4,52223 und R² = 0,9998. Für die Kontrolle war die Neigungsformel y = 0,014x + 4,5611 und R² = 0,9297.
3 ist ein Balkengraph, welcher Antigen-spezifische zelluläre Immunantworten in Balb/C Mäusen auf lyophilisierte DNA-Zusammensetzungen (Plasmide, welche das Herpes Simplex Virus Gen enthalten, welches für das gD₂-Protein kodiert) dieser Erfindung und auf Kontrollen veranschaulicht. Eine Kontrolle war die vorlyophilisierte Polynucleotid-Lösung Nr. 6 von Tabelle 4 in Beispiel 3 unten, welche kein Kryoprotektivum enthielt (Phos Pre-Lyo). Eine weitere Kontrolle war die lyophilisierte Citratpuffer Zusammensetzung von Lösung Nr. 8 von Tabelle 4, welche kein Kryoprotektivum enthielt (Citrat Post-Lyo). Die „023 control" ist eine vor-lyophilisierte Lösung, worin die DNA das gleiche Plasmid-Grundgerüst ist, wie es in den anderen Zusammensetzungen verwendet wurde, aber ohne gD₂-Sequenz. Die lyophilisierten Zusammensetzungen der Erfindung, welche eingesetzt wurden, schlossen die lyophilisierte Polynucleotid-Lösung Nr. 1 von Tabelle 4 mit Trehalose als Kryoprotektivum in Phosphatpuffer (Trehalose/Phos); lyophilisierte Polynucleotid-Lösung Nr. 3 von Tabelle 4 mit Sucrose als Kryoprotektivum in Phosphatpuffer (Sucrose/Phos); und lyophilisierte Polynucleotid-Lösung Nr. 7 mit Sucrose als Kryoprotektivum in Citratpuffer (Sucrose/Cit) ein. Die Wirkungen jeder Polynucleotid-Zusammensetzung auf die zelluläre Immunantwort wurden durch einen in Beispiel 4 beschriebenen Lymphoproliferationstest gemessen und als Stimulations-Index (SI) dargestellt.
4 ist ein Balkengraph, welcher humorale (Antikörper) Antwort, gemessen in optischer Dichte (OD) bei 450 nm in Serum von einzelnen Balb-C Mäusen, auf die lyophilisierten DNA-Zusammensetzungen dieser Erfindung und in 3 identifizierte Kontrollen zeigt. Die negative Kontrolle (neg control) und die 023-Kontrolle (023 control) sind identisch. Die Wirkungen von jeder Polynucleotid-Zusammensetzung auf die humorale Immunantwort wur den durch Standard-ELISA wie unten in Beispiel 4 beschrieben gemessen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich an den Bedarf nach Stand der Technik durch Vorsehen, wie hierin beschrieben, einer Polynucleotid-Zusammensetzung, die verbesserte Stabilität hat, einer Polynucleotid-Zusammensetzung, die verbesserte Löslichkeit hat, und eines Verfahrens zur Lyophilisierung, das eine stabilisierte Polynucleotid-Zusammensetzung ergibt.
I. Die Polynucleotid-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung
Die „Polynucleotid-Zusammensetzung" der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf das Polynucleotid-Gemisch, das gegenüber Polynucleotid-Gemischen nach Stand der Technik erhöhte Stabilität und Löslichkeit hat. Vorzugsweise ist die Polynucleotid-Zusammensetzung dieser Erfindung typischerweise ein Pulver mit einer überwiegend amorphen Struktur mit nur geringeren Mengen einer kristallinen Struktur und wird durch Unterwerfen einer Polynucleotid-Lösung unter ein hierin beschriebenes, neuartiges Lyophilisierungsverfahren hergestellt.
A. Die Polynucleotid-Lösung
Der Begriff „Polynucleotid-Lösung" wie hierin verwendet betrifft ein wässeriges Polynucleotid-Gemisch vor Lyophilisierung. Die Polynucleotid-Lösung, die lyophilisiert wird, ist ein wässeriges Gemisch aus mindestens einem Polynucleotid und mindestens einem Kryoprotektivum. Vorzugsweise ist das Verhältnis von Polynucleotid zu Kryoprotektivum in der Polynucleotid-Lösung von etwa 0,001 bis etwa 1,0 Gewichtsanteil Polynucleotid pro 1,0 Gewichtsanteil Kryoprotektivum. Die Polynucleotid-Lösung kann ebenfalls gegebenenfalls nicht-wässeriges) Lösungsmittel und weitere Zusatzstoffe enthalten. Die Konzentration des Polynucleotids, Kryoprotektivums, Lösungsmittels (einschließlich Wasser) und optionaler Zusatzstoffe wird angepasst, so dass eine angemessene Masse an Polynucleotid lyophilisiert wird und so dass das Polynucleotid während der Lyophilisierung nicht signifikant abgebaut wird.
1. Das Polynucleotid
Jedes Polynucleotid, einschließlich jedem modifizierten Polynucleotid, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Geeignete Polynucleotide schließen zum Beispiel BDNA, ADNA, ZDNA, RNA, tRNA und mRNA ein. Das Polynucleotid kann auch jede Form haben. Zum Beispiel kann das Polynucleotid kreisförmig oder linear sein. Das Polynucleotid kann einen oder mehrere Stränge enthalten. Zum Beispiel kann eine einsträngige DNA oder RNA, eine doppelsträngige DNA, ein doppelsträngiges DNA-RNA Hybrid oder ein dreifach- oder vierfach-strängiges Polynucleotid verwendet werden. Beispiele für doppelsträngige DNA schließen unter anderem chromosomale DNA, R-Faktor, PCR-Produkte, Plasmid-DNA, Bakteriophage, virale RNA- und DNA-Vektoren ein, einschließlich unter anderem Alphavirus, Adenovirus, Kuhpocken, Retrovirus, Adeno-assoziiertes Virus, positiv- und negativ-strängige RNA-Viren, Herpesviren und Viroide, Deltavirus und Poliovirus. DNA schließt vorzugsweise Codierungssequenzen ein, die für Proteine codieren, vorzugsweise bedienbar gebunden an regulatorische Elemente, Gene einschließlich Operator-Kontroll- und Endregionen, und sich selbst replizierende Systeme wie Plasmid-DNA. Einsträngige Polynucleotide schließen Antisense-Polynucleotide, Ribozyme und Triplex-bildende Oligonucleotide ein. Die Polynucleotide können als Thioate, Phosphorthioate und Phosphonate usw. modifiziert sein. Für einsträngige Polynucleotide in Zusammensetzungen der Erfindung, welche zur pharmazeutischen Verwendung beabsichtigt sind, ist es vorteilhaft, einen komplementären oder „Linker-Strang" zum therapeutischen Strang als Teil der Polynucleo-tid-Zusammensetzung herzustellen. Der Linker-Strang kann ein separater Strang sein, oder er kann an den therapeutischen Strang kovalent gebunden oder eine Erweiterung davon sein, so dass der therapeutische Strang im Wesentlichen zu sich selbst zurück doppelt und hybridisiert. Alternativ kann der Linker-Strang eine Anzahl an Armen haben, die komplementär sind, so dass er zu einer Vielfalt an Polynucleotid-Strängen hybridisiert.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Polynucleotid supercoiled Plasmid-DNA, welche ein Expressionsvektor ist, der für ein Immunogen codiert, welches bedienbar an regulatorische Elemente gebunden ist, welche in humanen Zellen funktional sind. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist das Immunogen, welches durch die Codierungssequenz codiert wird, ein Protein von einem Pathogen wie Herpes Simplex Virus gD₂-Protein oder humane Immunschwächevirus-Proteine wie jene, welche durch HIV-I gag, pol oder env Gene codiert werden. Die Codierungssequenzen werden bedienbar an einen geeigneten Promotor wie einen Zytomegalovirus (CMV) intermediate-early Promotor und ein SV40 Polyadenylierungssignal gebunden. Zum Beispiel beschreibt US-Patent Nr. 5593972, welches hierin durch Verweis eingeschlossen ist, Plasmide, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind.
Das Polynucleotid kann nacktes Polynucleotid wie Plasmid-DNA, vielfache Kopien des Polynucleotids oder unterschiedliche Polynucleotide umfassen, oder kann ein Polynucleotid in Verbindung mit einem „Co-Wirkstoff" wie einem lokalen Anästhetikum, einem Peptid, einem Lipid einschließlich kationischer Lipide, einem Liposom oder lipidischen Partikel, einem Polykation wie Polylysin, einem verzweigten, dreidimensionalen Polykation wie einem Dendrimer, einem Kohlenhydrat, kationischen Amphiphilen, Detergenzien, Benzylammonium-Surfactant oder weitere Verbindungen umfassen, die Polynucleotid-Transfer zu Zellen erleichtern. Nicht-exklusive Beispiele für Co-Wirkstoffe, welche in dieser Erfindung brauchbar sind, werden in US-Patent Nr. 5593972, 5703055, 5739118, 5837533 und Internationaler Patentanmeldung Nr. WO 96/10038, veröffentlicht am 4. April 1996 und Internationaler Patentanmeldung Nr. WO 94/16737, veröffentlicht am 8. August 1994 beschrieben, welche hierin durch Verweis eingeschlossen werden. Wenn der verwendete Wirkstoff ein lokales Anästhetikum ist, vorzugsweise Bupivacain, wird eine Menge von etwa 0,1 Gew.-% bis etwa 1,0 Gew.-%, basierend auf dem Gesamtgewicht der Polynucleotid-Lösung bevorzugt. Siehe ebenfalls Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US98/22841, welche den Einschluss von Benzylammonium-Surfactanten als Co-Wirkstoffe lehrt, verabreicht in einer Menge von zwischen etwa 0,001–0,03 Gew.-%, deren Lehre hiermit durch Verweis eingeschlossen wird.
Zur Verwendung als Polynucleotid in den Lösungen dieser Erfindung kann die Polynucleotid-Base, Kohlenhydrat oder Verbindung gemäß den Techniken, welche den Fachleuten gut bekannt sind, auch modifiziert werden.
Vorzugsweise ist das Polynucleotid in der Polynucleotid-Lösung bei einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis etwa 5,0 mg/ml vorhanden. In einigen weiteren Ausführungsformen ist das Polynucleotid in der Lösung bei einer Konzentration von etwa 1,0 mg/ml bis etwa 3,0 mg/ml vorhanden. In noch weiteren Ausführungsformen ist das Polynucleotid in der Lösung bei einer Konzentration von etwa 1,0 mg/ml bis etwa 2,0 mg/ml vorhanden.
2. Kryoprotektivum (–a)
Der Begriff „Kryoprotektivum" kann austauschbar mit dem Begriff „Lyoprotektivum" verwendet werden und ist so beabsichtigt, dass er sich auf einzelne Kryoprotektiva und Lyoprotektiva bezieht, als auch auf Gemische aus zwei oder mehr Kryoprotektivum-Verbindungen. Ein Kryoprotektivum kann jede Verbindung sein, die das Polynucleotid während und nach Lyophilisierung stabilisiert. Eine Vielfalt an Kryoprotektiva wird in herkömmlichen Texten beschrieben, wie Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol. 2, 19. Auflage (1995).
In einer Ausführungsform ist das Kryoprotektivum, welches in der vorliegenden Erfindung brauchbar ist, ein Zuckeralkohol wie Alditol, Mannitol, Sorbitol, Inositol, Polyethylenglycol und Kombinationen daraus. Besonders wünschenswert ist Polyethylenglycol. In einer weiteren Ausführungsform ist das Kryoprotektivum eine Zuckersäure, einschließlich einer Aldonsäure, einer Uronsäure, einer Aldarsäure und Kombinationen daraus.
Das Kryoprotektivum dieser Erfindung kann auch ein Kohlenhydrat sein. Geeignete Kohlenhydrate sind Aldehyd- oder Ketonverbindungen, welche zwei oder mehr Hydroxylgruppen enthalten. Die Kohlenhydrate können kreisförmig oder linear sein und schließen zum Beispiel Aldosen, Ketosen, Aminozucker, Alditole, Inositole, Aldonsäuren, Uronsäuren oder Aldarsäuren oder Kombinationen daraus ein. Das Kohlenhydrat kann auch ein Mono-, ein Di- oder Polykohlenhydrat sein, wie zum Beispiel ein Disaccharid oder Polysaccharid. Geeignete Kohlenhydrate schließen zum Beispiel Glyceraldehyd, Arabinose, Lyxose, Pentose, Ribose, Xylose, Galactose, Glucose, Hexose, Idose, Mannose, Talose, Heptose, Glucose, Fructose, Gluconsäure, Sorbitol, Lactose, Mannitol, Methyl-α-glucopyranosid, Maltose, Isoascorbinsäure, Ascorbinsäure, Lacton, Sorbose, Glucarsäure, Erythrose, Threose, Arabinose, Allose, Altrose, Gulose, Idose, Talose, Erythrulose, Ribulose, Xylulose, Psicose, Tagatose, Glucuronsäure, Gluconsäure, Glucarsäure, Galacturonsäure, Mannuronsäure, Glucosamin, Galactosamin, Sucrose, Trehalose oder Neuraminsäure oder Derivate davon ein. Geeignete Polykohlenhydrate schließen zum Beispiel Arabinane, Fructane, Fucane, Galactane, Galacturonane, Glucane, Mannane, Xylane (wie zum Beispiel Inulin), Levan, Fucoidan, Carrageen, Galactocarolose, Pektine, Pektinsäuren, Amylose, Pullulan, Glycogen, Amylopektin, Cellulose, Dextran, Pustulan, Chitin, Agarose, Keratin, Chondroitin, Dermatan, Hyaluronsäure, Alginsäure, Xanthingummi oder Stärke ein. Unter besonders brauchbaren Kohlenhydraten sind Sucrose, Glucose, Lactose, Trehalose und Kombinationen daraus. Sucrose ist ein besonders brauchbares Kryoprotektivum.
Vorzugsweise ist das Kryoprotektivum der vorliegenden Erfindung ein Kohlenhydrat oder „Zucker"-Alkohol, welcher ein mehrwertiger Alkohol sein kann. Mehrwertige Verbindungen sind Verbindungen, die mehr als eine Hydroxylgruppe enthalten. Vorzugsweise sind die mehrwertigen Verbindungen linear. Geeignete mehrwertige Verbindungen schließen zum Beispiel Glycole wie Ethylenglycol, Polyethylenglycol und Polypropylenglycol, Glycerol oder Pentaerythritol oder Kombinationen daraus ein.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist der Kryoprotektivum-Wirkstoff Sucrose, Trehalose, Mannitol oder Sorbitol. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist der Kryoprotektivum-Wirkstoff Sucrose. Jedes dieser Kryoprotektiva kann in Vermischung mit mindestens einem der anderen wie gewünscht gebildet werden.
Das Kryoprotektivum oder Gemisch aus Kryoprotektiva ist vorzugsweise in der Polynucleotid-Lösung bei einer Konzentration von etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-% vorhanden. In einigen Ausführungsformen ist/sind das/die Kryoprotektivum(–a) in der Lösung bei einer Konzentration von etwa 1,0 Gew.-% bis etwa 8,0 Gew.-% vorhanden. In noch weiteren Ausführungsformen ist/sind das/die Kryoprotektivum(–a) in der Lösung bei einer Konzentration von etwa 1,0 Gew.-% bis etwa 5,0 Gew.-% vorhanden.
3. Optionale Zusatzstoffe in der Polynucleotid-Lösung
Die Polynucleotid-Lösung ist vorzugsweise wässerig basiert. Jedoch können falls gewünscht ein oder mehrere Lösungsmittel zur Lösung zugegeben werden, die mit dem Wasser, dem Polynucleotid und Kryoprotektivum kompatibel sind. Zum Beispiel können wasserlösliche Alkohole wie Ethylenglycol, Propylenglycol oder Glycerol zur Lösung zugegeben werden.
Die Polynucleotid-Lösung wird vorzugsweise mit einem Puffer hergestellt, so dass bei Rehydratation der lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzung Isotonie erreicht werden kann. Die Polynucleotid-Lösung hat vorzugsweise einen pH von etwa 6,2 bis etwa 7,8. In einer Ausführungsform hat die Polynucleotid-Lösung einen pH von etwa 6,2 bis etwa 7,4. In einer weiteren Ausführungsform hat die Polynucleotid-Lösung der vorliegenden Erfin dung einen pH vorzugsweise von etwa 6,2 bis 6,9. Diese pH-Bandbreite hilft dabei zu verhindern, dass sich das Polynucleotid während des Lyophilisierungsverfahrens der vorliegenden Erfindung abbaut. Daher schließen Puffer, welche verwendet werden können, jede Verbindung ein, welche in der Lage ist, den oben erwähnten pH während der Lyophilisierung beizubehalten. Bevorzugte Puffer schließen Phosphat und Citrat ein, im Allgemeinen bei einer Konzentration von 5–60 mM. Bevorzugt werden die Puffer bei einem Gehalt von etwa 0,1 Gew.-% bis etwa 1,2 Gew.-% basierend auf dem Gesamtgewicht der Polynucleotid-Lösung verwendet.
Weitere optionale Zusatzstoffe wie Facilitatoren (wie oben beschrieben), Surfactanten oder Salze oder Kombinationen daraus können zur Polynucleotid-Lösung zugegeben werden. Salze können zugegeben werden, um die Isotonie der Polynucleotid-Lösung anzupassen. Zum Beispiel können Salze wie Natriumchlorid verwendet werden. Vorzugsweise wird das Salz in einer Menge von etwa 0,1 Gew.-% bis etwa 1,0 Gew.-% basierend auf dem Gesamtgewicht der Polynucleotid-Lösung verwendet.
Insgesamt umfassen diese optionalen Zusatzstoffe vorzugsweise von etwa 0,1 Gew.-% bis etwa 3 Gew.-%, basierend auf dem Gesamtgewicht Prozentsatz der Polynucleotid-Lösung.
Die durch Kombinieren dieser Bestandteile gebildete Polynucleotid-Lösung wird dann dem Lyophilisierungsverfahren der vorliegenden Erfindung unterworfen, welche eine lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzung dieser Erfindung ergibt.
B. Die lyophilisierte Zusammensetzung
Die lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzung dieser Erfindung, hergestellt aus der oben beschriebenen Polynucleotid-Lösung, umfasst somit:

a) mindestens ein Polynucleotid
b) mindestens ein Kryoprotektivum, wobei das Verhältnis von Polynucleotid zu Kryoprotektivum von etwa 0,001 bis etwa 1,0 Gewichtsanteil Polynucleotid pro 1,0 Gewichtsanteil Kryoprotektivum beträgt, und
c) von etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 6 Gew.-% Wasser, basierend auf dem Gesamtgewicht der Polynucleotid-Zusammensetzung.

Diese lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzung enthält in einigen Ausführungsformen etwa 6% oder weniger Wasser. In einigen Ausführungsformen enthält das Polynucleotid-Zusammensetzungsprodukt etwa 5% oder weniger Wasser. In weiteren Ausfüh rungsformen enthält die lyophilisierte Zusammensetzung Wasser von etwa 2 Gew.-% bis etwa 3 Gew.-%.
Die Polynucleotid-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist durch erhöhte Stabilität im Vergleich zu Polynucleotid-Zusammensetzungen nach Stand der Technik gekennzeichnet. Prozentsatz an Supercoil definiert den Reinheitsgrad des Polynucleo-tids. Somit wird Stabilität eines Polypeptids durch den im Zeitablauf bewahrten Reinheitsgrad bestimmt. Mit „erhöhter oder verbesserter Stabilität" ist gemeint, dass das Polynucleotid min-destens 90% seines Supercoil über einen Zeitraum von mindestens 10 Tagen bei etwa 37°C bewahrt. In einigen Ausführungsformen bewahrt das Polynucleotid, vorzugsweise DNA, der vorliegenden Erfindung mindestens 90% seines Supercoil über mindestens 20 Tage bei 37°C. Bevorzugter bewahrt das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung in einigen Ausführungsformen mindestens 90% seines Supercoil über mindestens 30 Tage bei etwa 37°C.
Zusätzlich zur Stabilität hat die Polynucleotid-Zusammensetzung dieser Erfindung vorzugsweise eine erhöhte Löslichkeit im Vergleich zu anderen Polynucleotid-Zusammensetzungen nach Stand der Technik. Mit „erhöhter Löslichkeit" ist gemeint, dass die Polynucleotid-Zusammensetzung dieser Erfindung vorzugsweise eine Löslichkeit in Wasser bei etwa 25°C (also Raumtemperatur) von mindestens 1 Milligramm pro Milliliter („mg/ml") hat. Wünschenswerterweise hat die Polynucleotid-Zusammensetzung dieser Erfindung eine Löslichkeit in Wasser bei etwa 25°C von mindestens 2 mg/ml. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen hat die Polynucleotid-Zusammensetzung dieser Erfindung eine Löslichkeit in Wasser bei etwa 25°C von mindestens 10 mg/ml. Löslichkeiten so hoch wie etwa 20 mg/ml sind ebenfalls möglich. Die erhöhte Stabilität und Löslichkeit von Polynucleotid-Zusammensetzungen dieser Erfindung werden vorzugsweise durch Lyophilisierung einer Polynucleotid-Lösung gemäß den hierin offenbarten Verfahren erhalten.
Die lyophilisierte Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung wird ebenfalls durch eine überwiegend amorphe physikalische Struktur gekennzeichnet. In einigen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung Polynucleotid, welches im Wesentlichen amorph ist, aber enthält auch eine geringere Menge oder kleinere Prozentsätze an kristalliner Struktur, z.B. Gitterstruktur.
C. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzung kann in eine Vielfalt an Formen zur Lagerung oder zur in vitro oder in vivo Verwendung formuliert werden. Beispiele für in vivo Verwendungen, für welche die Polynucleotid-Zusammensetzungen der Erfindung besonders brauchbar sind, schließen jene Verfahren der Impfung und Gentherapie ein, welche Plasmid-DNA verwenden, wie in US-Patenten Nr. 5593972, 5703055, 5676954, 5580859, 5589466, 5739118 und 5837533; Internationaler Patentanmeldung Nr. WO 96/41873, veröffentlicht am 27. Dezember 1996; und Internationaler Patentanmeldung Nr. WO 94/16737, veröffentlicht am 8. August 1994 beschrieben, welche hierin durch Verweis eingeschlossen werden.
Die lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzung dieser Erfindung kann in verschiedene trockene oder flüssige Formen formuliert werden. Falls gewünscht, können die trockenen lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzungen dieser Erfindung gemahlen, zerrieben oder gesiebt werden, um ein Pulver zu bilden, durch Techniken, welche den Fachleuten gut bekannt sind. Zum Beispiel können die lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzungen durch einen Granulator, eine Strahlmühle, Entklumper oder Schredder zu einem Pulver umgewandelt werden. Vorzugsweise hat die Polynucleotid-Zusammensetzung eine durchschnittliche Partikelgröße von weniger als etwa 100 μm. Falls die Zusammensetzung zur pharmazeutischen Verwendung durch pulmonale Verabreichung beabsichtigt ist, wird zum Beispiel eine Partikelgröße von ≤ 10 μm gewünscht. In einigen bevorzugten Ausführungsformen wird die Polynucleotid-Zusammensetzung der Erfindung für Verabreichung an Säuger in der Form von zum Beispiel Pulvern, Tabletten, Kapseln, enterisch überzogenen Tabletten oder Kapseln oder Zäpfchen hergestellt.
Als weiteres Beispiel kann eine flüssige Polynucleotid-Zusammensetzung durch Rekonstituieren der lyophilisierten Zusammensetzung in Wasser hergestellt, und/oder in flüssige Zusammensetzungen bereitet werden. Die rekonstituierte Zusammensetzung hat vorzugsweise einen pH von zwischen etwa 6,2 bis etwa 7,8, wie oben für die anfängliche Polynucleotid-Lösung beschrieben.
Solche trockenen Zusammensetzungen oder flüssigen Lösungen werden vorzugsweise als pharmazeutische Zusammensetzungen verwendet. So ist eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Er findung eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche als Wirkstoff eine lyophilisierte Zusammensetzung wie hierin beschrieben oder eine rekonstituierte flüssige Zusammensetzung wie hierin beschrieben in Kombination mit einem optionalen pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger oder Träger umfasst. Je nach Zweck, für welchen die pharmazeutische Zusammensetzung gewünscht wird, ist der Arzneimittelträger oder Träger für jeden Verabreichungsweg geeignet, wie oral, parenteral, intranasal und intrapulmonal. Diese lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzung kann als Ausgangsmaterial in Verbindung mit weiteren pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträgern zum Entwickeln von Pulver-, Flüssigkeit-, oder Suspensionsdosierungsformen verwendet werden, einschließlich jenen für intranasale oder pulmonale Anwendungen. Siehe z.B. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol. 2, 19. Auflage (1995), z.B. Kapitel 95 Aerosole, dessen Lehre hierin durch Verweis eingeschlossen wird.
Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung, welche diese Wirkstoffe einsetzt, ist eine enterisch überzogene Tablette. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Polynucleotid-Zusammensetzung als ein oraler Impfstoff in einer enterisch überzogenen Kapsel vorgesehen. Das Polynucleotid ist Plasmid-DNA. Vorzugsweise wird etwa 1 mg DNA in eine harte Gelatinekapsel geladen, wie jene, welche durch Capsugel, einem Geschäftsbereich von Warner Lambert ParkeDavis hergestellt werden. Fließgleitmittel wie Talk, Magnesiumstearat können zur Polynucleotid-Zusammensetzung zugegeben werden. Ähnlich können Ballaststoffe wie Zellulose ebenfalls zugegeben werden. Die Gelatinekapseln werden unter Verwendung von zum Beispiel EUDRAGIT enterischem Überzugspolymermaterial enterisch überzogen. Gemäß weiterer Ausführungsformen kann die Polynucleotid-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in Form eines Pulvers verwendet werden, welches als Aerosol zur Abgabe des Polynucleotids an die Lunge verabreichbar ist. Zum Beispiel kann die Polynucleotid-Zusammensetzung hergestellt werden, um Gene vorzusehen, die bei der Behandlung einer Lungenerkrankung brauchbar sind. Ebenfalls kann zum Beispiel eine Polynucleotid-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung mit DNA, welche für zystischen Fibrose Transmembranleitfähigkeitsregulator codiert, als Behandlung für zystische Fibrose verwendet werden.
D. Verfahren der Verwendung
So werden, als noch weitere Ausführungsformen dieser Erfindung, die oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verwendung in der Medizin und der Verwendung von solchen Zusammensetzungen bei der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung eines Polynucleotids an einen Säuger vorgesehen. Je nach Zweck, zu welchem die Zusammensetzung verabreicht wird, umfassen Behandlungsverfahren Verabreichen der Zusammensetzung durch einen gewünschten Verabreichungsweg, einschließlich unter anderem oral, parenteral, intranasal und intrapulmonal. Zum Beispiel kann die Polynucleotid-Zusammensetzung in eine Flüssigkeit mit annehmbarer Isotonie formuliert und intramuskulär, intravenös, intradermal oder subkutan angewendet werden. Die Polynucleotid-Zusammensetzung kann auch durch intranasale oder intrapulmonale Abgabe (Inhalation) eines Pulvers angewendet werden. Die Polynucleotid-Zusammensetzung kann auch als Zäpfchen an solchen Körperhöhlen wie Vagina, Rektum und Mund angewendet werden. Verfahren, welche diese Zusammensetzungen einsetzen, schließen unter anderem Gentherapie-Protokolle für Erkrankungen, z.B. zystischer Fibrose ein.
II. Das Lyophilisierungsverfahren dieser Erfindung
Um die lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzungen und pharmazeutischen Produkte dieser Erfindung herzustellen, wird eine wie oben beschrieben gebildete Polynucleotid-Lösung gemäß sorgfältig kontrollierten Schritten lyophilisiert, die eine Wirkung auf Erhöhen der Stabilität und Löslichkeit der sich ergebenden lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzung haben. Die Vorrichtung, welche verwendet wird, um die Lösung zu lyophilisieren, kann jede Vorrichtung sein, die allmähliches Kühlen und allmähliches Erhitzen der Polynucleotid-Lösung unter Vakuum erlaubt. Wie hierin verwendet bedeutet „halten" oder „Halten" Beibehalten einer gegebenen Temperatur und/oder Vakuum über einen Zeitraum. „Ramp" oder „Ramping" bedeutet Verändern der Temperatur- und/oder Vakuumbedingungen über einen Zeitraum. In Lyophilisierungsverfahren sind einige Schritte Halteschritte und andere sind Ramping-Schritte.
Das Lyophilisierungsverfahren der vorliegenden Erfindung wird detaillierter unten beschrieben.
Die wässerige Polynucleotid-Lösung mit einem pH von etwa 6,2 bis etwa 7,8 und umfassend von etwa 0,1 mg/ml bis etwa 5 mg/ml von mindestens einem Polynucleotid, basierend auf dem Gesamtvolumen der Polynucleotid-Lösung, und von etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-% von mindestens einem Kryoprotektivum, basierend auf dem Gesamtgewicht der Polynucleotid-Lösung, wird zuerst gekühlt, um die Lösung zu verfestigen oder zu gefrieren. In einer Ausführungsform wird die Lösung auf eine Temperatur von etwa –30°C bis etwa –70°C gekühlt. In einer weiteren Ausführungsformen wird die Lösung auf eine Temperatur von etwa –40°C bis etwa –60°C gekühlt. In weiteren Ausführungsformen wird die Lösung auf eine Temperatur von etwa –40°C bis etwa –50°C gekühlt. Dieser Kühlschritt ist vorzugsweise allmählich und „ramped" oder wird über einen Zeitraum von etwa 1 Stunde bis etwa 5 Stunden und bevorzugter von etwa 1 Stunde bis etwa 3 Stunden durchgeführt. In einigen Ausführungsformen wird die Lösung über einen Zeitraum von 1 Stunde bis 2 Stunden gekühlt. In einigen Ausführungsformen wird die Lösung über einen Zeitraum von 2 Stunden bis 3 Stunden gekühlt. Vorzugsweise wird die Lösung bei einer linearen Geschwindigkeit über den gewünschten Kühlzeitraum gekühlt. Obwohl allmähliches Kühlen bevorzugt wird, ist es ebenfalls möglich, die Lösung ohne signifikanten Abbau des Polynucleotids während der Lyophilisierung schnell zu gefrieren (z.B. weniger als 10 Minuten).
Wenn die gewünschte Gefriertemperatur erreicht ist, wird sofort ein Vakuum angewendet, was den Druck von etwa 25 mTorr (187,5 Pa) bis etwa 250 mTorr (1875 Pa) verringert. In einigen Ausführungsformen verringert das Vakuum den Druck von etwa 50 (375 Pa) bis etwa 100 mTorr (750 Pa). Die Zusammensetzung wird gegebenenfalls bei dieser Temperatur und diesem Druck für etwa 30 Minuten bis etwa 5 Stunden, vorzugsweise mindestens eine Stunde gehalten. In einer besonders wünschenswerten Ausführungsform wird das Vakuum durch schnelles Verringern des Drucks von etwa 300 mTorr (2250 Pa) bis etwa 200 mTorr (1500 Pa) und danach allmähliches Verringern des Drucks bis etwa 150 mTorr (1125 Pa) und dann bis etwa 40 mTorr (300 Pa) über einen Zeitraum von etwa 1 Stunde bis etwa 2 Stunden angewendet.
Nach dem Kühlen wird die Polynucleotid-Lösung dem „primären Trocken- oder Erhitzungszyklus" unterworfen, welcher signifikant zur Leistung dieses Verfahrens beiträgt. In diesem primären Erhitzungsschritt wird die gefrorene Lösung allmählich ein erstes Mal zu einer Temperatur von etwa –40°C bis etwa 20°C über einen Zeitraum von etwa Stunden bis etwa 40 Stunden erhitzt. In einer gewünschten Ausführungsform wird die gefrorene Lösung ein erstes Mal auf eine Temperatur von etwa –10°C bis etwa 20°C über einen Zeitraum von etwa 5 Stunden bis etwa 20 Stunden erhitzt. In einer weiteren Ausführungsform wird die gefrorene Lösung allmählich auf eine Temperatur von etwa –40°C bis etwa 10°C erhitzt. In einer weiteren Ausführungsform wird die gefrorene Lösung allmählich ein erstes Mal auf eine Temperatur von etwa –5°C bis etwa 5°C über einen Zeitraum von etwa 8 Stunden bis etwa 20 Stunden erhitzt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die gefrorene Lösung ein erstes Mal auf eine Temperatur von 0°C erhitzt. Dieser primäre Erhitzungsschritt wird vorzugsweise über einen Zeitraum von etwa 5 Stunden bis 40 Stunden, wünschenswerterweise von etwa 5 Stunden bis 20 Stunden und bevorzugter über einen Zeitraum von etwa 6 Stunden bis 15 Stunden durchgeführt. In einigen Ausführungsformen wird dieser erste Erhitzungsschritt über einen Zeitraum von etwa 10 Stunden durchgeführt.
Zusätzlich zum Erhitzen der Polynucleotid-Lösung während des primären Trocknungszyklus wird ebenfalls ein Vakuum angewendet, um Trocknen der Lösung zu beginnen. Vorzugsweise wird das Vakuum angewendet, sobald der primäre Erhitzungsschritt gestartet wird. Der Vakuumdruck während dieses Erhitzungsschritts beträgt vorzugsweise weniger als etwa 250 mTorr (1875 Pa) und bevorzugter von etwa 25 (187,5 Pa) bis etwa 150 Torr (1125 Pa). In bestimmten Ausführungsformen beträgt der Vakuumdruck von etwa 40 (300 Pa) bis etwa 150 mTorr (1125 Pa). In noch einer weiteren Ausführungsform beträgt der Vakuumdruck während dieses Erhitzungsschritts von etwa 60 mTorr (450 Pa) bis etwa 150 mTorr (1125 Pa). In einer wünschenswerten Ausführungsform wird das Vakuum vorzugsweise so angewendet, dass der Druck in weniger als 5 Minuten auf 200 mTorr (1500 Pa) gesenkt und dann zum gewünschten Druck über einen Zeitraum von etwa 1 Stunde bis etwa 2 Stunden verringert wird.
Dem primären Erhitzungsschritt folgend, wird die Polynucleotid-Lösung bei konstanter Temperatur und Druck gehalten, um die Polynucleotid-Lösung zu äquilibrieren. Dieser Halteschritt beträgt vorzugsweise einen Zeitraum von etwa 1 Stunde bis etwa 10 Stunden und bevorzugter von etwa 2 Stunden bis etwa 6 Stunden. Vorzugsweise wird die Temperatur während dieses Halteschritts bei von etwa –35°C bis etwa 10°C gehalten. In einigen Ausfüh rungsformen wird die Temperatur bei von etwa –10°C bis etwa 10°C für einen Zeitraum von etwa 2 bis etwa 10 Stunden gehalten. In weiteren Ausführungsformen wird die Temperatur bei von etwa –5°C bis etwa 5°C für einen Zeitraum von etwa 5 Stunden bis etwa 7 Stunden gehalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Temperatur bei etwa 0°C gehalten. Vorzugsweise wird der Vakuumdruck während dieses Haltens bei weniger als etwa 200 mTorr (1500 Pa) und bevorzugter von etwa 25 mTorr (187,5 Pa) bis etwa 250 mTorr (1875 Pa) für einen Zeitraum von etwa 1 Stunde bis etwa 10 Stunden gehalten. In einigen Ausführungsformen wird der Vakuumdruck während dieses Haltens bei etwa 40 mTorr (300 Pa) bis etwa 150 mTorr (1125 Pa) gehalten. In einigen Ausführungsformen wird der Vakuumdruck während dieses Haltens bei etwa 60 mTorr (450 Pa) bis etwa 150 mTorr (1125 Pa) gehalten. Der gewählte Druck und die Temperatur sind vorzugsweise die Temperatur und der Druck, welche am Ende des primären Erhitzungsschritts erreicht wurden.
Das Vakuum wird vorzugsweise kontinuierlich von diesem Halteschritt bis zum nächsten Schritt angewendet.
Nach diesem Halten wird der sekundäre Trockenschritt durchgeführt. Die Polynucleotid-Lösung wird allmählich ein zweites Mal auf eine Temperatur von etwa 20°C bis etwa 35°C über einen Zeitraum von etwa 1 Stunde bis etwa 20 Stunden und bei einem Druck von etwa 25 mTorr (187,5 Pa) bis etwa 250 mTorr (1875 Pa) erhitzt. In einer gewünschten Ausführungsform erhitzt dieser sekundäre Erhitzungsschritt allmählich die Lösung auf eine Temperatur von etwa 20°C bis etwa 30°C und bei einem Druck von 25 mTorr (187,5 Pa) bis etwa 150 mTorr (1125 Pa) für einen Zeitraum von etwa 1 Stunde bis etwa 10 Stunden. In einer weiteren Ausführungsform erhöht das sekundäre Erhitzen die Temperatur von etwa 23°C auf etwa 27°C über einen Zeitraum von etwa 2 Stunden bis etwa 3 Stunden. In einem bevorzugten sekundären Erhitzungsschritt wird die Temperatur auf etwa 25°C erhöht. Der Vakuumdruck während des zweiten Erhitzungsschritts beträgt vorzugsweise weniger als etwa 250 mTorr (1875 Pa) und bevorzugter von etwa 25 (187,5 Pa) bis etwa 150 mTorr (1125 Pa) und in einigen Ausführungsformen von etwa 40 (300 Pa) bis etwa 110 mTorr (825 Pa). Dieser zweite Erhitzungsschritt wird vorzugsweise über einen Zeitraum von etwa 1 Stunde bis etwa 5 Stunden und bevorzugter über einen Zeitraum von etwa 2 bis 3 Stunden durchgeführt.
In einer besonders wünschenswerten Ausführungsform des Lyophilisierungsverfahrens dieser Erfindung findet der primäre Erhitzungsschritt wünschenswerterweise über einen Zeitraum von etwa 7 Stunden bis etwa 11 Stunden statt, der nachfolgende Halteschritt findet für einen Zeitraum von etwa 1 Stunde statt und der sekundäre Erhitzungsschritt findet über einen Zeitraum von etwa 2 Stunden statt.
Nach diesem zweiten Erhitzen kann die Polynucleotid-Lösung gegebenenfalls wieder bei konstanter Temperatur und Druck gehalten werden, um die Polynucleotid-Lösung wieder zu äquilibrieren. Vorzugsweise beträgt dieses zweite Halten einen Zeitraum von etwa 1 Stunde bis etwa 10 Stunden und bevorzugter von etwa 2 Stunden bis etwa 5 Stunden. In einigen Ausführungsformen beträgt das zweite Halten von etwa 2 bis 3 Stunden. Vorzugsweise wird die Temperatur während dieses Haltens bei etwa 20°C bis etwa 30°C, bevorzugter von etwa 23°C bis etwa 27°C und insbesondere bevorzugt bei 25°C gehalten. Vorzugsweise wird der Vakuumdruck während dieses Haltens bei weniger als etwa 150 mTorr (1125 Pa) und bevorzugter von etwa 20 mTorr (150 Pa) bis etwa 100 mTorr (750 Pa) gehalten. Der gewählte Druck und die Temperatur sind vorzugsweise die Temperatur und der Druck, welche am Ende des sekundären Erhitzungsschritts erreicht wurden.
In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht der primäre Erhitzungsschritt allmähliches Erhitzen der Lösung bei einer Temperatur von etwa –20°C bis etwa 20°C über einen Zeitraum von etwa 5 Stunden bis etwa 30 Stunden unter Vermeiden von Rückschmelzen (Verflüssigung) der Lösung ein. Ein bevorzugter Zeitraum für diesen Erhitzungsschritt ist von etwa 5 bis etwa 20 Stunden und bevorzugter von etwa 5 bis etwa 10 Stunden. Eine bevorzugte Temperatur für diesen Schritt ist von etwa –10°C bis etwa 20°C und bevorzugter beträgt die Temperatur etwa 0°C. Dieser bevorzugte primäre Trockenzyklus verringert die Zeit, welche für das vollständige Lyophilisierungsverfahren notwendig ist. Tatsächlich erlaubt es der bevorzugte primäre Trockenschritt dem sekundären Trockenschritt, bei welchem die Polynucleotid-Lösung auf eine Temperatur von etwa 23°C bis etwa 27°C erhitzt wird, über einen Zeitraum von etwa 2 Stunden bis etwa 3 Stunden stattzufinden und sieht das lyophilisierte Polynucleotid in einer im Wesentlichen amorphen physikalischen Struktur vor, welche mindestens 90% Supercoil über einen Zeitraum von mindestens 10 Tagen bei etwa 37°C bewahrt.
Insgesamt wird es bevorzugt, dass sobald Vakuum in den Schritten dieses Verfahrens angewendet wird, es kontinuierlich angewendet wird, bis der letzte Schritt vollständig ist (also entweder der zweite Erhitzungsschritt oder der optionale zweite Halt). Jedoch ist es möglich, den Vakuumdruck in jedem Erhitzungsschritt zu variieren, solange der zu jeder Zeit angewendete Vakuumdruck weniger als etwa 200 mTorr (1500 Pa) beträgt.
Nachdem der optionale Endhalt vollständig ist, wird die sich ergebende Polynucleotid-Zusammensetzung gewonnen, welche einen Wassergehalt von etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 6 Gew.-%, basierend auf dem Gesamtgewicht der gewonnenen Zusammensetzung hat. Die gewonnene Polynucleotid-Zusammensetzung hat von etwa 0,5 bis etwa 6 Gew.-%, vorzugsweise etwa 1 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% und bevorzugter von etwa 2 Gew.-% bis etwa 4 Gew.-% Wasser, basierend auf dem Gesamtgewicht der Polynucleotid-Zusammensetzung.
Die lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzung enthält vorzugsweise von etwa 0,001 Gew.-% Polynucleotid bis etwa einen Gewichtsanteil Polynucleotid pro einem Gewichtsanteil Kryoprotektivum. In einer Ausführungsform enthält die Polynucleotid-Zusammensetzung vorzugsweise von etwa 0,001 Gewichtsanteil Polynucleotid bis etwa 0,5 Gewichtsanteil Polynucleotid pro einem Gewichtsanteil Kryoprotektivum. Die Polynucleotid-Zusammensetzung hat vorzugsweise eine amorphe Struktur, um die Löslichkeit der Zusammensetzung zu verbessern. Erhöhte Löslichkeit ist erwünscht, um relativ schnelle Rekonstitution zu erlauben und um konzentriertere Zusammensetzungen herzustellen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen einige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung im Detail. Diese Beispiele sind lediglich illustrativ für die vorliegende Erfindung und sollten nicht als den Umfang der Erfindung in irgend einer Weise einschränkend angesehen werden.
Beispiel 1: Eine bevorzugte lyophilisierte Zusammensetzung der Erfindung
Eine bevorzugte lyophilisierte Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, welche Plasmid-DNA als Polynucleotid und Sucrose als Kryoprotektivum verwendet, wird durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt. Das in diesen Zusammensetzungen verwendete DNA-Plasmid enthält das Herpes Simplex Virus Gen, welches für das gD₂-Protein codiert, gebunden an einen Zytomegalovirus Promotor und SV40 Polyadenylierungsstelle. Dieses Plasmid, welches als Plasmid 24 bezeichnet wird, wird detailliert in Internationaler Patentanmeldung Nr. WO 97/41892, veröffentlicht am 13. November 1997, und in 8D von US-Patent Nr. 5593972 beschrieben.
Die Bestandteile der vor-lyophilisierten Polynucleotid-Lösung und einer flüssigen Kontrollzusammensetzung werden in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Die vor-lyophilisierte Lösung von Tabelle 1 wurde einem Lyophilisierungsverfahren gemäß dieser Erfindung unterworfen, gekennzeichnet durch spezifische Parameter für die Schritte des Gefrierens, primären Trocknens und sekundären Trocknens. Diese Parameter werden in der in Tabelle 2 dargestellten Reihenfolge durchgeführt und schließen zwei aufeinander folgende primäre Trockenschritte und vier aufeinander folgende sekundäre Trockenschritte ein.
Tabelle 2
Die Stabilität dieser lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzung und der flüssigen Kontrolle bei 37°C wurde basierend auf Abbau in % Supercoil (%SC) überwacht. Die Proben wurden unter Verwendung des Agarose-Gel Verfahrens bezüglich %SC analysiert. Das Agarose-Gel Verfahren ist ein elektrophoretisches Verfahren, welches gewöhnlich in der Molekularbiologie zur Trennung von verschiedenen Formen von DNA durchgeführt wird. Nachweis durch das Agarose-Gel Verfahren beruht auf der Interkalation des Farbstoffs Ethidiumbromid in die DNA. Das Verfahren nutzt eine fluoreszierende Farbstoffbindung an doppelsträngige (ds)-DNA zum Nachweis und die Fluoreszenz wird indirekt gemessen. DNA wird an Agarose-Gels elektrophoretisiert, welche Ethidiumbromid (EtBr) enthalten. Nach Interkalation in die DNA ist Fluoreszenz von EtBr stark verstärkt. Das Fluoreszenzsignal wird unter Verwendung eines CCD (Charge-Coupled Device) gesammelt. Das Bild wird integriert (Software von Alpha Innotech TM), um die relativen Mengen an offen-kreisförmigem und supercoiled Plasmid zu berechnen, welche in der Probe vorhanden sind. Die Ergebnisse beruhen auf konsistenter und gleichförmiger Bindung von EtBr an die Plasmide. Die Beobachtungen zeigen jedoch an, dass wenn %SC unter 93% ist, das Gel-Verfahren künstlich niedrige Ergebnisse angibt. Aus diesem Grund ist ein alternatives HPLC-Verfahren, wie in Montgomery et al., Pharmsci., (Suppl. 1998) „HPLC Assay for Determining Purity of [% Supercoiled] Plasmid DNA in a Vaccine Product", Abstrakt 2503, entwickelt worden. Die Reinheit von Plasmid-DNA wird durch den Gehalt an supercoiled T-Form bewertet. Ein einzelnder hydrolytischer Schritt in der Phosphodiester-Bindung des Grundgerüsts ist genug, um supercoiled DNA (SC) in die offen-kreisförmige Form (OC) umzuwandeln. Diese topologische Veränderung wird in veränderter Mobilität an Agarose-Gels reflektiert. Gegenwärtig ist der am häufigsten verwendete Reinheitstest (%SC Test) für Plasmid-DNA das Agarose-Gel basierte Verfahren.
Die Geschwindigkeitsgleichungen, welche den Abbau von DNA beschreiben, werden unten in Tabelle 3 vorgesehen.
Tabelle 3
Gleichung 1: k_obs ist die beobachtete Geschwindigkeitskonstante und stellt Gesamtabbau von DNA dar (SC = Supercoil; OC = offenkreisförmig)
Gleichung 2: Unter (pseudo) Bedingungen erster Ordnung kann die Geschwindigkeitsgleichung für DNA-Abbau wie folgt geschrieben werden: wo [DNA] die Reinheit (%SC) oder Wirkkraft von DNA darstellt.
Gleichung 3: Integration der obigen Gleichung unter Verwendung der anfänglichen Bedingungen, bei Zeit t = 0 [DNA] = [DNA]₀ ergibt die folgende Gleichung: ln[DNA] = ln[DNA]0 – kobst
Unter Verwendung von Gleichung 3 mit %SC (Reinheit von DNA) Stabilitätsdaten, erzeugt bei einer spezifischen Temperatur, kann ein Plot von ln(%SC) gegenüber der Zeit erzeugt werden und k_obs kann aus der Neigung des Plots errechnet werden.
Gleichung 4: Bei jeder gegebenen Temperatur kann die Lagerstabilität (t₉₀, Zeit, um 90% SC zu erreichen) wie folgt berechnet werden
worin [%SC]₀ Reinheit von DNA bei Zeit t = 0 darstellt.
Gleichung 5: Durch Annahme von [%SC]₀ = 95 in Gleichung 4 kann die Lagerstabilität von Plasmid-DNA bei einer gegebenen Temperatur wie folgt berechnet werden:
Basierend auf Gleichung 3 in Tabelle 2 wurden Plots von ln(%SC) gegenüber der Zeit für die oben beschriebene lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzung und die Kontrolle von Tabelle 1 erzeugt. Die Ergebnisse werden im Graph von 1 dargestellt. Die Neigungen (–k_obs, beobachtete pseudo Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung) von Plots wurden unter Verwendung von linearer Kleinste-Quadrate Regressionsanalyse berechnet. 1 zeigt an, dass die Geschwindigkeitskonstante für bevorzugte lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzungen mindestens 10-fach niedriger ist, als die Geschwindigkeitskonstante für flüssige Kontrollzusammensetzung. Diese Ergebnisse zeigen auch an, dass die Lagerstabilität von lyophilisierten Zusammensetzungen mindestens 10-fach höher ist, als die flüssige Zusammensetzung bei 37°C (54 Tage gegenüber 4 Tage, berechnet unter Verwendung von Gleichung 5 in Schema 1).
Die lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzung von Tabelle 1 wurde dann durch Röntgendiffraktion mit einer DNA-Lösung verglichen, welche aus der gleichen gD₂-Gen enthaltenen Plasmid-DNA wie oben bezeichnet (0,2% Gew./Vol.) in Citratpuffer bei pH 6,4 besteht, welche Lösung unter Verwendung des Ethanol-Ausfällungsverfahrens [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. E10=E11 „Concentrating Nucleic Acid: Precipitation with Ethanol or Isopropanol"] ausgefällt wurde. Röntgendiffraktionsmuster wurden konventionell für beide Zusammen-setzungen erhalten und zeigten, dass die lyophilisierte Zusammensetzung ein Röntgendiffraktionsmuster hat, welches für eine amorphe Struktur charakteristisch ist, während die ausgefällte DNA ein Diffraktionsmuster erzeugt, welches für eine hochgradig kristalline Struktur charakteristisch ist. Weil die lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzungen dieser Erfindung die physikalischen Eigenschaften haben, in ihrer Struktur amorph und hochgradig porös zu sein, sind die Zusammensetzungen dieser Erfindung in Wasser hochgradig löslich (bis zu etwa 20 mg/ml). Löslichkeitstests wurden unter Verwendung eines herkömmlichen HPLC-Verfahrens durchgeführt.
Beispiel 2: Eine bevorzugte lyophilisierte Zusammensetzung der Erfindung
Eine weitere bevorzugte lyophilisierte Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, welche in Beispiel 1 beschriebene Plasmid-DNA als Polynucleotid und Trehalose als Kryoprotektivum und Stabilisator verwendet, wird durch das Verfahren dieser Erfindung hergestellt. Die flüssige Kontrolle war identisch mit der in Beispiel 1 verwendeten. Tabelle 4 zeigt die Zusammensetzung der vor-lyophilisierten Lösung, als auch die der flüssigen Plasmidkontrolle.
Tabelle 4
Die vor-lyophilisierte Lösung wurde dem oben in Beispiel 1 beschriebenen Lyophilisierungsverfahren unterworfen und die Stabilität dieser Zusammensetzung bei 37°C wurde überwacht, basierend auf Abbau in %Supercoil (SC), wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Die Proben wurden unter Verwendung des Agarose-Gel Verfahrens bezüglich %SC analysiert. 2 zeigt einen Plot von ln(%SC) gegenüber der Zeit für die lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzung und die flüssige Kontrollzusammensetzung von Tabelle 4. Die Neigungen (–k_obs, beobachtete Geschwindigkeitskonstante) von den Plots wurden unter Verwendung von linearer Kleinste-Quadrate Regressionsanalyse berechnet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse von 2 zeigen an, dass die Geschwindigkeitskonstante für die lyophilisierte Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung 4-fach niedriger ist, als die Geschwindigkeitskonstante für die flüssige Kontrolle. Diese Daten zeigen auch an, dass die Lagerstabilität der lyophilisierten Zusammensetzung dieser Erfindung vierfach höher ist, als die flüs sige Kontrolle bei 37°C.
Beispiel 3: Screening von Kryoprotektiva
Mehrere Polynucleotid-Lösungen, welche Plasmid-DNA mit unterschiedlichen Kryoprotektiva (Sucrose, Trehalose, PVP und Sorbitol) enthalten, wurden gemäß der vorliegenden Erfindung lyophilisiert. Die in diesen Experimenten verwendete Plasmid-DNA war das gleiche Plasmid, welches das gD₂-Antigen von Herpes Simplex Virus, Typ 2 exprimiert, wie in Beispiel 1 eingesetzt.
Tabelle 5 zeigt die Zusammensetzungen der acht bewerteten vor-lyophilisierten Polynucleotid-Lösungen. Die Lyophilisierungsparameter waren die gleichen, wie jene in Tabelle 2 für Beispiel 1 beschriebenen. Der %SC wurde unter Verwendung des Agarose-Gel Verfahrens wie oben in Beispiel 1 beschrieben sowohl vor, als auch nach Lyophilisierung dieser Lösungen gemäß dieser Erfindung gemessen. So sieht Tabelle 5 ebenfalls den %SC vor Lyophilisierung für jede Polynucleotid-Lösung und den %SC nach Lyophilisierung für jede Polynucleotid-Zusammensetzung, lyophili-siert gemäß dieser Erfindung vor.
Tabelle 5
Basierend auf diesen Ergebnissen sind Trehalose und Sucrose wirksamere Kryoprotektiva als PVP und Sorbitol. In Abwesenheit von Kryoprotektiva zeigte die lyophilisierte Phosphatpuffer Kontrolle, basierend auf der Lyophilisierung von Lösung 6 gemäß dieser Erfindung mehr als 30% Verlust in Prozent Supercoil und lyophilisierte Citratpuffer Kontrolle, basierend auf der Lyophi lisierung von Lösung 8 zeigte weniger als 5% Verlust. Dies könnte der möglichen pH-Verschiebung zu einem sauren pH in der Phosphatprobe aufgrund von Gefrieren von kristallinen, zweibasischen Arten vor den amorphen einbasischen Arten zugeschrieben werden. Jedoch wurde dieses Phänomen nicht in den lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzungen in Gegenwart des Kryoprotektivums Sucrose (siehe Lösungen 3 und 7) beobachtet. Daher zeigt die Pufferart in Gegenwart von Kryoprotektivum keine Wirkung auf die lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzung.
Die Feuchtigkeitsergebnisse für die lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzungen zeigen an, dass PVP keine guten Kryoprotektivum-Eigenschaften zeigte, weil die lyophilisierten Zusammensetzungen, welche PVP enthielten, fast getrocknet waren (<< 1%) im Vergleich mit lyophilisierten Zusammensetzungen, welche andere Kryoprotektiva enthielten (Feuchtigkeitsgehalt 1–2%). Die PVP-enthaltenden lyophilisierten Zusammensetzungen zeigten auch mehr als 15% Verlust in Prozent Supercoil. Gemäß dieser Daten sind Sucrose und Trehalose gute Kryoprotektiva für die lyophilisierten Plasmid-DNA Zusammensetzungen dieser Erfindung.
Beispiel 4: Wirkung der lyophilisierten Zusammensetzungen der Erfindung auf die Immunantwort
Um den Nutzen von lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzungen dieser Erfindung als Pharmazeutikum oder Forschungsreagens zu bewerten, wurde die Wirkung von lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzungen und Kontrollen auf Immunantworten unter Verwendung der lyophilisierten Zusammensetzungen, hergestellt wie in Beispiel 3 oben, bewertet.
Eine Kontrolle für die lyophilisierten Zusammensetzungen war die vor-lyophilisierte Polynucleotid-Lösung Nr. 6 von Tabelle 5, welche kein Kryoprotektivum enthielt (Phos Pre-Lyo). Eine weitere in diesen Versuchen verwendete Kontrolle war die lyophilisierte Citratpuffer-Zusammensetzung von Lösung Nr. 8 von Tabelle 5, welche kein Kryoprotektivum enthielt (Citrat Post-Lyo). Die lyophilisierten Zusammensetzungen der Erfindung, welche in diesem Versuch bewertet wurden, waren die lyophilisierte Polynucleotid-Lösung Nr. 1 von Tabelle 5 mit Trehalose als Kryoprotektivum in Phosphatpuffer (Trehalose/Phos); lyophilisierte Polynucleotid-Lösung Nr. 3 von Tabelle 5 mit Sucrose als Kryoprotektivum in Phosphatpuffer (Sucrose/Phos); und lyophilisierte Poly nucleotid-Lösung Nr. 7 mit Sucrose als Kryoprotektivum in Citratpuffer (Sucrose/Cit). Die Kontrollen von 3 und 4 (023 Kontrolle und negative Kontrolle) sind identisch und enthalten das Plasmid-Grundgerüst ohne die gD₂-Sequenz und Puffer.
Jede lyophilisierte Zusammensetzung wurde in entweder Phosphat- oder Citratpufferlösung rekonstituiert, was auch immer in der ursprünglichen vor-lyophilisierten Lösung verwendet wurde. Balb/C-Mäuse (5 pro Gruppe) wurden auf intramuskulärem Weg mit 50 μg/Dosis DNA in einem 100 μl Volumen von jeder rekonstituierten lyophilisierten Zusammensetzung von Beispiel 3 immunisiert. Kein weiterer Bestandteil wurde zu diesen Zusammensetzungen zugegeben. Nach drei Wochen wurden die Tiere eingeschläfert.
A. Zelluläre Immunantwort Bewertung
Die Milzen wurden aus den oben beschriebenen Mäusen entfernt und verwendet, um Antigen-spezifische zelluläre Immunantworten unter Verwendung eines Lymphoproliferationstests zu bestimmen. Einzelne Zellsuspensionen wurden aus den geernteten Milzen hergestellt und diese Zellen wurden dann bei 2 × 10⁵ Zellen/Mulde in Abwesenheit oder Gegenwart von 20 ng/ml gereinigtem gD₂-Protein kultiviert. Die Kulturen wurden bei 37°C in 5% CO₂ für vier Tage inkubiert, bevor 20 μl komplettes RPMI-1640 Medium, enthaltend 1 μCi von ³[H] Thymidin (ICN Inc., Costa Mesa, Ca) zu jeder Mulde zugegeben wurde, und für zusätzliche 18 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden auf Glasfasermatten unter Verwendung eines multiplen Probenerntegeräts geerntet und der Einschluss an Radioaktivität wurde unter Verwendung herkömmlicher Flüssigkeitsszintillationsverfahren in einem Beta-Zähler (Wallac, Finnland) gemessen.
B. Bewertung humoraler Immunantwort
Serumproben wurden zur Analyse von Antikörper (humoraler) Antwort auf HSV gD₂ gesammelt. Die gD₂ spezifischen IgG Antikörper in Serum wurden durch einen ELISA bewertet. Kurz: 96 Mulden-Schalen mit flachem Boden (Co-star, Cambridge, MA) wurden über Nacht bei 4°C mit gereinigtem gD₂-Protein bei einer Konzentration von 0,4 μg/ml überzogen. Die Schalen wurden drei Mal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit 4% Rinderserum Albumin (BSA) für eine Stunde bei Raumtemperatur geblockt. Fünfzig μl der passenden Verdünnung von Serum wurden dann zu der Schale zugegeben und über Nacht bei 4°C belassen. Nach fünf Mal Waschen mit BPST wurde eine 1 : 2000 Verdünnung aus Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus IgG (Sigma, St. Louis, Mo) zu gegeben und die Schalen für eine Stunde inkubiert. Die Schalen wurden mit PBST vor Zugeben des Substrats 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)-H₂O₂ (Biotecx, Houston, Tx) gewaschen. Farbe durfte sich für 30 Minuten vor Ablesung bei 450 nm an einem E_max Mikroplattenleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) entwickeln.
C. Ergebnisse
3 und 4 stellen die zellulären, bzw. humoralen Antworten für die oben identifizierten Zusammensetzungen dar. Die Ergebnisse zeigen höhere zelluläre und humorale Antworten für die lyophilisierten Citrat/Sucrose-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung im Vergleich mit lyophilisierter Phosphat/Citrat-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung und der lyophi-lisierten Citrat/kein Kryoprotektivum Kontrolle an. Beim Vergleich der Ergebnisse für lyophilisierte Zusammensetzungen dieser Erfindung mit der vor-lyophilisierten Kontrolle in Phosphat-puffer ist klar, dass das Lyophilisierungsverfahren und der Einschluss von Kryoprotektiva (Sucrose und Trehalose) in die Polynucleotid-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung die zellulä-ren und humoralen Antworten nicht nachteilig beeinflusst. Die lyophilisierten Zusammensetzungen dieser Erfindung bewahren die Wirksamkeit von darin enthaltenem Plasmid oder Polynucleotid.
Beispiel 5: Bewertung von lyophilisierten Zusammensetzungen der Erfindung
Sechzehn unterschiedliche vor-lyophilisierte Lösungen wurden bewertet und werden in Tabelle 6 beschrieben. Die DNA in jeder verwendeten Lösung war das gleiche in Beispiel 1 beschriebene gD₂-enthaltende Plasmid. Diese Lösungen werden durch unterschiedliche Codes in der Tabelle identifiziert und unterscheiden sich in der DNA-Konzentration (dargestellt durch die erste Zahl im Zusammensetzungs-Code), der Identität des Kryoprotektivums (dargestellt durch den ersten Buchstaben im Code), der Kryoprotektivum-Konzentration (dargestellt durch die zweite Zahl im Code) und dem Feuchtigkeitsgehalt nach Lyophilisierung (dargestellt als niedrig, L, oder hoch, H, im Code). Die vor-lyophilisierten Lösungen wurden mit Wasser für Injektion von qs 100 ml hergestellt und wurden gemäß dieser Erfindung unter Verwendung von Lyophilisierungszyklusparametern wie in Tabelle 2 oben skizziert lyophilisiert.
Alle lyophilisierten Zusammensetzungen von Tabelle 6 wurden Kurzzeit-Stabilitätstests bei 37°C unterworfen, als auch die flüssige Kontrolle (Zusammensetzungscode Nr. 96F0254), welche die Formel der in Tabelle 1 von Beispiel 1 mit 1 mg/ml Plasmid-DNA dargestellten flüssigen Kontrolle hat. Die Stabilitätsstudie schloss auch eine lyophilisierte Plasmid-Zusammensetzung ohne Kryoprotektivum als weitere Kontrolle ein. Proben wurden bei unterschiedlichen Zeitintervallen von Tag 0 bis Tag 30 gesammelt und unter Verwendung des Agarose-Gel Verfahrens wie in Beispiel 1 beschrieben bezüglich %SC analysiert. Unter Verwendung der %SC Daten in Kleinste-Quadrate Regressionsanalyse (siehe Gleichung 3 in Tabelle 3) wurden pseudo Geschwindigkeitskonstanten erster Ordnung (k_obs) für den Abbau von DNA in den unterschiedlichen Zusammensetzungen berechnet. Die k_obs-Werte mit 95% Konfidenzintervallen (CI) und R² (Anpassung) Werte für unterschiedliche Zusammensetzungen werden ebenfalls in Tabelle 6 zusammengefasst.
Tabelle 6
Die %SC Ergebnisse zeigen an, dass alle Sucrose enthaltenden lyophilisierten Zusammensetzungen der Erfindung bei 37°C für mindestens 4 Wochen (also der Dauer des Versuchs) stabil sind. Es ist von den pseudo Geschwindigkeitskonstanten erster Ordnung (k_obs) mit 95% Konfidenzintervallen (CI) und R² (Anpassung) Werten, dargestellt in Tabelle 5 klar, dass der k_obs für die gegenwärtige klinische Zusammensetzung mindestens 10-mal höher ist, als der k_obs für die meisten der lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzungen dieser Erfindung, welche Sucrose als Kryopro tektivum enthalten. Ähnlich ist der k_obs für die gegenwärtige klinische Zusammensetzung mindestens 1,5-mal größer, als der k_obs für die lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzungen dieser Erfindung, welche Trehalose als Kryoprotektivum enthalten. Basierend auf diesen Daten ist Sucrose das beste Kryoprotektivum, als auch das beste Stabilisierungsmittel für lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzungen dieser Erfindung.
Die Lagerstabilität (% Supercoil von 95% bis 90%) der lyophilisierten Zusammensetzung, welche Sucrose enthält (Code 2S2L) beträgt 54 Tage bei 37°C verglichen mit 4 Tagen Lagerstabilität für die flüssige Zusammensetzung Code 96F0254. Bei 5°C ist diese gegenwärtige klinische Zusammensetzung jedoch für zwei Jahre stabil. Daher würde man durch Extrapolation von der lyophilisierten Zusammensetzung dieser Erfindung erwarten, dass sie eine sehr lange Lagerstabilität hat. Bei Umgebungstemperatur (25°C) wird eine Stabilität von mindestens sechs Monaten erwartet. Lyophilisierte Zusammensetzungen dieser Erfindung mit hoher Feuchtigkeit, welche Trehalose als Kryoprotektivum enthalten, zeigten bessere Stabilität im Vergleich zu ähnlichen Trehalose enthaltenden Zusammensetzungen mit niedriger Feuchtigkeit.
Die Geschwindigkeitskonstanten für lyophilisierte Zusammensetzungen dieser Erfindung mit niedriger Feuchtigkeit, welche Sucrose enthalten, sind relativ gering verglichen mit lyophilisierten Zusammensetzungen dieser Erfindung, welche Sucrose enthalten, mit hoher Feuchtigkeit. Basierend auf diesen Daten wurde die lyophilisierte Zusammensetzung von Beispiel 1 (welche 2% Sucrose enthält) als die bevorzugte Zusammensetzung für den nächsten Versuch ausgewählt.
Beispiel 6: Hochgradig konzentriertes DNA-Produkt
Eine bevorzugte lyophilisierte Zusammensetzung der Erfindung wird vorgesehen, um Masse-DNA zu lyophilisieren, für die Herstellung eines Arzneimittelprodukts mit einer hohen Endkonzentration, welches ebenfalls einen Facilitator enthält. Diese Zusammensetzung enthält die gleiche Plasmid-DNA, wie in Beispiel 1 beschrieben, bei einer Konzentration von 0,2% Gew./Vol. in der vor-lyophilisierten Lösung, Sucrose als Kryoprotektivum bei einer Konzentration von 2,0% Gew./Vol., Citratpuffer (5 mM, pH 6,7) und 100 ml Wasser für Injektion qs. Die Zusammensetzung wurde unter Verwendung des in Beispiel 1, Tabelle 2 oben skiz zierten Zyklus lyophilisiert. Unterschiedliche Konzentrationen von Bupivacain, einem Facilitator (0,25, 0,6 und 1,0% Gew./Vol.) wurden in Citratpuffer (5 mM, pH 6,7) hergestellt und verwendet, um das oben beschriebene, lyophilisierte Produkt zu rekonstituieren. Um gewünschte DNA-Konzentrationen zu erhalten, wurden unterschiedliche Mengen der gepufferten Bupivacain-Lösungen zum lyophilisierten Pulver zugegeben. Die sich ergebenden „Arzneimittel" Formulierungen werden in Tabelle 7 beschrieben, welche auch die Stabilität des hochgradig konzentrierten DNA-Produkts als Zeit in Tagen nach Rekonstitution wie in %SC gemessen, wie oben beschrieben darstellt.
Tabelle 7
Es kann von diesen Ergebnissen beobachtet werden, dass mindestens bis zu 20 mg/ml der rekonstituierten, lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzungen dieser Erfindung für 18 Tage stabil sind, basierend auf Reinheit. Es sollte ebenfalls vermerkt werden, dass die rekonstituierten Lösungen basierend auf physikalischer Erscheinung einheitlich waren.
Zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind in der oben identifizierten Beschreibung eingeschlossen und es wird von ihnen erwartet, dass sie für einen Fachmann offensichtlich sind. Es wird angenommen, dass solche Modifikationen und Veränderungen der Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung im Umfang der hieran angehängten Ansprüche eingeschlossen sind.

Claims

Lyophilisierte Polynucleotid-Zusammensetzung, welche umfasst: (a) mindestens ein Polynucleotid, (b) mindestens ein Kryoprotektivum, wobei das Verhältnis von Polynucleotid zu Kryoprotektivum von 0,001 bis 1,0 Gewichtsanteil Polynucleotid pro 1,0 Gewichtsanteil Kryoprotektivum beträgt, und (c) von 0,5 Gew.-% bis 6 Gew.-% Wasser, basierend auf dem Gesamtgewicht der Polynucleotid-Zusammensetzung; wobei besagte Polynucleotid-Zusammensetzung mindestens 90% Supercoil über einen Zeitraum von mindestens 10 Tagen bei 37°C bewahrt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin besagtes Wasser bei von 1 Gew.-% bis 5 Gew.-% vorhanden ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin besagtes Wasser bei von 2 Gew.-% bis 3 Gew.-% vorhanden ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das Polynucleotid ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus ADNA, BDNA, ZDNA, RNA, tRNA, mRNA und Kombinationen daraus.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, worin das Polynucleotid doppelsträngige DNA ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, worin das Polynucleotid Plasmid-DNA ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, worin das Polynucleotid ein Virus-Vektor ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, welche ferner eine Kombination aus zwei oder mehr Kryoprotektiva umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 7, worin besagtes Kryoprotektivum ein Zuckeralkohol ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, worin besagter Alkohol ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Alditol, Mannitol, Sorbitol, Inositol, Polyethylenglycol und Kombinationen daraus.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 10, worin das Kryoprotektivum Polyethylenglycol ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 7, worin besagtes Kryoprotektivum eine Zuckersäure ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, worin besagte Säure aus gewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Aldonsäure, einer Uronsäure, einer Aldarsäure und Kombinationen daraus.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 7, worin besagtes Kryoprotektivum ein Kohlenhydrat ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, worin besagtes Kohlenhydrat ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Aldose, einer Ketose, einem Aminozucker, einem Disaccharid, einem Polysaccharid und Kombinationen daraus.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, worin besagter Zucker ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Sucrose, Glucose, Lactose, Trehalose und Kombinationen daraus.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 16, worin das Kryoprotektivum Sucrose ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 mit einer überwiegend amorphen physikalischen Struktur.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, worin besagte Plasmid-DNA mindestens 90% Supercoil über einen Zeitraum von mindestens 20 Tagen bei 37°C bewahrt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche einen Wirkstoff umfasst, bestehend aus einer lyophilisierten Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–19 und einem optionalen pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger oder Träger.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 20, worin besagter Arzneimittelträger oder Träger für einen Verabreichungsweg geeignet ist, welcher ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus oral, parenteral, intranasal und intrapulmonal.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 zur Verwendung in Medizin.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung eines Polynucleotids an einen Säuger.
Verwendung gemäß Anspruch 23, wobei Verabreichung durch einen Weg stattfindet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus oral, parenteral, intranasal und intrapulmonal.
Verfahren zum Herstellen einer lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzung, welches die Schritt umfasst: (a) Bilden einer wässerigen Polynucleotid-Lösung mit einem pH von 6,2 bis 7,8 und umfassend von 0,1 mg/ml bis 5 mg/ml von mindestens einem Polynucleotid, basierend auf dem Gesamtvolumen besagter Polynucleotid-Lösung, und von 0,5 Gew.-% bis 10 Gew.-% von mindestens einem Kryoprotektivum, basierend auf dem Ge samtgewicht von besagter Polynucleotid-Lösung; (b) Kühlen von besagter Polynucleotid-Lösung auf eine Temperatur von –30°C bis –70°C, bis gefroren; (c) Anwenden von Vakuum, um den Druck auf 25 mTorr (187,5 Pa) bis 250 mTorr (1875 Pa) zu verringern; (d) allmähliches Erhitzen von besagter Polynucleotid-Lösung ein erstes Mal auf eine Temperatur von –40°C bis 20°C über einen Zeitraum von 5 Stunden bis 40 Stunden; (e) Halten von besagter Polynucleotid-Lösung nach Erhitzungsschritt (d) bei einer Temperatur von –35°C bis 10°C bei einem Druck von 25 mTorr (187,5 Pa) bis 250 mTorr (1875 Pa) für einen Zeitraum von 1 Stunde bis 10 Stunden; (f) allmähliches Erhitzen von besagter Polynucleotid-Lösung nach dem Halteschritt (e) auf eine Temperatur von 20°C bis 35°C über einen Zeitraum von 1 Stunde bis 20 Stunden und bei einem Druck von 25 mTorr (187,5 Pa) bis 150 mTorr (1125 Pa) und (g) Gewinnen einer lyophilisierten Polynucleotid-Zusammensetzung mit einem Wassergehalt von 0,5 Gew.-% bis 6 Gew.-%, basierend auf dem Gesamtgewicht von besagter gewonnener Zusammensetzung.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei besagte Polynucleotid-Lösung von Schritt (a) ferner einen Puffer umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 25, welches ferner nach Schritt (f) den Schritt das Haltens der Polynucleotid-Lösung bei einer Temperatur von 20°C bis 30°C und bei einem Druck von 25 mTorr (187,5 Pa) bis 150 mTorr (1125 Pa) für einen Zeitraum von 1 Stunde bis 10 Stunden umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei Schritt (d) allmähliches Erhitzen von besagter Polynucleotid-Lösung ein erstes Mal auf eine Temperatur von –10°C bis 20°C über einen Zeitraum von 5 Stunden bis 20 Stunden umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei während Halteschritt (e) besagte Polynucleotid-Lösung bei einer Temperatur von –10°C bis 10°C für einen Zeitraum von 2 bis 10 Stunden gehalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei während Halteschritt (e) besagte Polynucleotid-Lösung bei einer Temperatur von –5°C bis 5°C und für einen Zeitraum von 5 Stunden bis 7 Stunden gehalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei während Halteschritt (e) besagte Polynucleotid-Lösung bei einem Druck von 40 mTorr (300 Pa) bis 150 mTorr (1125 Pa) gehalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei während Kühlschritt (b) besagte Polynucleotid-Lösung allmählich auf eine Temperatur von –30°C bis –70°C über einen Zeitraum von 1 Stunde bis 5 Stunden gekühlt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei in Schritt (c) der Druck auf 50 bis 100 mTorr (375 bis 750 Pa) verringert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei zwischen Schritten (c) und (d) besagte Polynucleotid-Zusammensetzung bei einer Temperatur von Schritt (b) und Druck von Schritt (c) für 0,5 bis 5 Stunden gehalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei während Erhitzungsschritt (d) besagte Polynucleotid-Lösung allmählich auf eine Temperatur von –5°C bis 5°C über einen Zeitraum von 8 Stunden bis 20 Stunden erhitzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei während Erhitzungsschritt (d) der Druck von 40 mTorr (300 Pa) bis 150 mTorr (1125 Pa) beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei in Schritt (c) das Vakuum durch schnelles Verringern des Drucks auf 300 mTorr (2250 Pa) bis 200 mTorr (1500 Pa) und danach allmähliches Verringern des Drucks auf 150 mTorr (1125 Pa) bis 40 mTorr (300 Pa) über einen Zeitraum von 1 Stunde bis 2 Stunden angewendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei während des Erhitzungsschritts (f) die Polynucleotid-Lösung auf eine Temperatur von 23°C bis 27°C über einen Zeitraum von 2 Stunden bis 3 Stunden erhitzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 38, wobei während Erhitzungsschritt (f) der Druck von 40 mTorr (300 Pa) bis 110 mTorr (825 Pa) beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei Erhitzungsschritt (d) über einen Zeitraum von 7 Stunden bis 11 Stunden beträgt; Erhitzungsschritt (e) für einen Zeitraum von 1 Stunde beträgt und Erhitzungsschritt (f) über einen Zeitraum von 2 Stunden beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei das Kryoprotektivum ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Sucrose, Trehalose, Mannitol, Sorbitol, Polyethylenglycol und Kombinationen daraus.
Verfahren gemäß Anspruch 41, wobei besagtes Kryoprotektivum Sucrose und Polyethylenglycol ist.
Verfahren zum Lyophilisieren einer Polynucleotid-Zusammensetzung, wobei besagtes Verfahren Gefrieren besagter Zu sammensetzung, Unterwerfen besagter gefrorenen Zusammensetzung unter ein Vakuum, Durchführen eines primären Trocknungsschritts, Erhöhen des Drucks auf besagtes Produkt von besagtem Trocknungsschritt, Durchführen eines sekundären Trocknungsschritts und Gewinnen eines lyophilisierten Produkts umfasst, wobei die Verbesserung den Schritt umfasst: Unterwerfen einer Polynucleotid-Lösung, welche ein Kryoprotektivum enthält, welche Lösung bis zum Gefrieren gekühlt und einem Vakuum unterworfen worden ist, unter einen primären Trocknungszyklus, umfassend allmähliches Erhitzen der besagten Lösung bei einer Temperatur von –20°C bis 20°C über einen Zeitraum von 5 Stunden bis 30 Stunden und Vermeiden von Rückschmelzen besagter Lösung, wobei besagter primärer Trocknungszyklus die Zeit verringert, welche für den vollständigen Lyophilisierungsprozess notwendig ist, und das lyophilisierte Polynucleotid in einer im Wesentlichen amorphen physikalischen Struktur vorsieht, welche mindestens 90% Supercoil über einen Zeitraum von mindestens 10 Tagen bei 37°C bewahrt.
Verfahren gemäß Anspruch 43, wobei besagter Zeitraum von 5 bis 20 Stunden beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 43, wobei besagter Zeitraum von 5 bis 10 Stunden beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 43, wobei besagte Temperatur von –10°C bis 20°C beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 43, wobei besagte Temperatur 0°C ist.
Verfahren gemäß Anspruch 43, welches ferner einen sekundären Trocknungsschritt umfasst, in welchem die Polynucleotid-Lösung auf eine Temperatur von 23°C bis 27°C über einen Zeitraum von 2 Stunden bis 3 Stunden erhitzt wird.