JP2005532789A - 減少した酵素活性を有する型別不能なインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａ）のＰ４タンパク質の変異体 - Google Patents

Abstract

減少した酵素活性を有し、そして野生型Ｐ４タンパク質に対する抗体を誘導し、かつ／または型別不能なインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＮＴＨｉ）に対する良好な殺バクテリア活性を有するＰ４バリアントタンパク質は、ヒトへの免疫原組成物の活性成分として有用である。これらタンパク質の使用法、およびそれらをさらなる抗原と組み合わせて含む組成物も提供される。

Description

発明の分野
本発明は、一般に免疫原組成物、そしてより詳細には中耳炎に対する免疫原組成物の分野に関する。

発明の背景
型別不能（ｎｏｎ−ｔｙｐａｂｌｅ）なインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＮＴＨｉ）は、成人のヒトに肺炎、中耳炎、静脈洞炎および急性熱性気管気管支炎を含む疾患を引き起こす。またこのバクテリアは小児および乳児の中耳炎のよくある病原である。ＮＴＨｉによる感染は株に特異的な免疫を与えるだけなので、ヒトは繰り返し感染し得る。実際に、このバクテリアにより引き起こされる最も慢性的な疾患は小児が繰り返し罹る中耳炎であり、抗体に対する反復暴露、または耳内に排液管を挿入するための手術を含む処置が生じる。

型別可能なインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）株（これは既知の莢膜を特徴とする）を処置するために利用可能ないかなる免疫原組成物も、ＮＴＨｉの処置には有用ではない。すなわち、ＮＴＨｉにより生じる感染の防止に有用な成分を見いだすためにかなりの研究が行われた。ヒトの中耳炎の発症を防止するための候補化合物の調査において、ＮＴＨｉのタンパク質４（Ｐ４：以前は「外膜タンパク質ｅ」と呼ばれた）と呼ばれるバクテリアのリポタンパク質は、ヒトにおいてバクテリアに対する殺バクテリア抗体を誘導するその能力により望ましい成分であると同定された。Ｐ４はＮＴＨｉの他の外膜タンパク質に対する抗体と相乗的に作用する殺バクテリア抗体を誘導することが見いだされた。これにより、このタンパク質はより有力な殺バクテリア応答を誘導するために、他の外膜タンパク質と一緒に使用することができる。

Ｐ４をコードするｈｅｌ遺伝子は、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）株の中および間で抗原的に保存されている。例えば、とりわけ引用により本明細書に包含する特許文献１；２および３；ならびに４および５を参照にされたい。ｈｅｌ遺伝子の配列（配列番号１）およびコードされる２７４アミノ酸、プレータンパク質（配列番号２）は、ＮＣＢＩデータベースから寄託番号Ｍ６８５０２で利用することができ、そして非特許文献１に確認される。ＮＴＨｉの成熟Ｐ４は、２５４アミノ酸長（配列番号３）の脂質化タンパク質であり、配列番号１のヌクレオチド２０９−９７０にコードされている。２７４アミノ酸のプロセッシングされていないプレーＰ４タンパク質は、脂肪酸のアシル化に関する部位を特定する２０アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号２、アミノ酸１−２０）を有し、そして配列番号１のヌクレオチド１４９−９７０にコードされ、ヌクレオチド１４９−２０８がシグナルまたはリーダーペプチドをコードする。

ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＰ４タンパク質の機能は、元はヘミン輸送であると考えられていた（非特許文献２）。しかし後にＰ４タンパク質は外膜酵素、すなわちバクテリアの酸性ホスファターゼであることが見いだされた（非特許文献３）。さらにこの分野の最近の研究では、Ｐ４タンパク質の真の機能について研究室により異なる意見が示された（非特許文献４；５；６；３；および７）。

酵素的タンパク質としてのＰ４の同定は、ヒトの免疫原組成物の成分としてのその使用に潜在的な関心をもたらした。このタンパク質は酵素的に活性であり、そしてそのインビボの基質は完全には定められていない。野生型Ｐ４はヒトに投与された時に有害な効果は知られていないが、一般的にヒトに投与される免疫原組成物における使用には非酵素的に活性なタンパク質または減少した活性を持つものが酵素的に活性なタンパク質よりも好ましいと認められている。酵素的に活性なタンパク質は、その酵素的活性が抗体の誘導以外の予期せぬ望ましくない反応を免疫感作したヒトに引き起こすかもしれないので、免疫原成分としての使用には好ましくない。

上に挙げた文献および特許により一般的に記載されているＰ４タンパク質の断片またはバリアント「変異体」Ｐ４配列は、免疫原組成物に最も重要な特性、すなわち免疫原性といった意味では特性決定されていない。免疫原性に及ぼす突然変異の効果について、情報は提供されていない。さらに酵素活性に及ぼす変化が免疫原的効力に効果を有する兆候も提供されていない。このように従来技術は、免疫原組成物の成分を生成するために、Ｐ４タンパク質の変異体の選択についていかなる方向性も提供していない。

当該技術分野では、ヒトに免疫原組成物を安全に使用するために、減少した酵素活性を有し、そして野生型タンパク質に免疫学的に均等なＮＴＨｉ Ｐ４バリアントタンパク質を含んでなる治療用および予防用組成物に関する必要性が存続している。

米国特許第５，７８０，６０１号明細書 米国特許第５，９５５，５８０号明細書 米国特許第５，６０１，８３１号明細書 欧州特許第０ ６０６ ９２１号明細書 欧州特許第０ ４６２ ２１０号明細書 Ｇｒｅｅｎ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．１９９１ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９（９）：３１９１−３１９８ Ｒｅｉｄｌ，Ｊ．，ａｎｄ Ｊ．Ｊ．Ｍｅｋａｌａｎｏｓ．１９９６ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３：６２１−６２９．５ Ｒｅｉｌｌｙ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８１：６７９７−８０５ Ｋｅｍｍｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：３９７４−３９８１ Ｒｅｉｄｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５：１５７３−８１ Ｒｅｉｌｌｙ，Ｔ．，ａｎｄ Ａ．Ｓｍｉｔｈ，１９９９ Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．，１７：４０１−４０９ Ｒｅｉｌｌｙ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２００１ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，４９４：１９−２３

発明の要約
１つの観点では、本発明は野生型Ｐ４タンパク質に比べて減少した酵素活性を有し、そして野生型Ｐ４タンパク質に対する抗体を誘導し、かつ／またはＮＴＨｉに対する殺バクテリア活性を有するＰ４バリアント（変異体）タンパク質を提供する。このバリアントタンパク質は、免疫感作したヒトにＮＴＨｉに対する防御免疫応答を誘導するため有用である。

別の観点では、本発明は本明細書に記載するＮＴＨｉ Ｐ４バリアントタンパク質、製薬学的に許容され得る担体、および場合によりアジュバントを含んでなる免疫原組成物を提供する。この組成物はさらなる抗原性タンパク質またはペプチドを含んでもよく、そしてＮＴＨｉに対する防御免疫応答を誘導するのに有用である。

さらに別の観点では、本発明は本発明のＰ４バリアントをコードする核酸配列を含んでなる単離された、または組換えヌクレオチド分子を提供する。また本発明は、宿主細胞中でバリアント等の発現を支配する配列の調節制御下に、これらの分子を含むプラスミド、組換えウイルスのようなベクターも内包する。

本発明のさらに別の観点では、本明細書に記載するヌクレオチド分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。

さらに本発明の別の観点には、バリアントタンパク質またはそれを含有する組成物を投与することにより、ＮＴＨｉに対してヒトに免疫応答を誘導するための方法を含む。

本発明のさらに別の観点は、これらの分子を含むベクターで形質転換、トランスフェクトまたは形質導入された宿主細胞により、Ｐ４バリアントタンパク質の組換え発現法を含む。

本発明の別の観点には、別の抗原のキャリアーとしてＰ４バリアントタンパク質の使用を含み、ここで他の抗原はタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、サッカリド、リポポリサッカリド、リポオリゴサッカリドまたはリポサッカリドでよい。Ｐ４バリアントタンパク質は野生型Ｐ４タンパク質に比べて減少した酵素活性を有するが、Ｐ４バリアントキャリアータンパク質が配列番号３のアミノ酸１２２位にフェニルアラニンを持たない限り、必ずしも野生型Ｐ４タンパク質に対する抗体を誘導する必要はなく、またＮＴＨｉに対する殺バクテリア活性を有する必要もない。

本発明のこれら、または他の観点は、当業者には以下の本発明の詳細な説明を読むことにより明白となるだろう。
本発明の詳細な説明
本発明は、野生型Ｐ４タンパク質に対する抗体を誘導し、かつ／またはＮＴＨｉに対する殺バクテリア活性を有する非酵素的に活性なＰ４バリアントタンパク質を提供することにより、当該技術分野の必要性に見合う。そのようなＰ４バリアントタンパク質、それらをコードする核酸分子を含む組成物、およびそのようなタンパク質および核酸分子の使用法は、ヒトにＮＴＨｉに対する免疫を誘導する新規手段を提供する。
Ａ．本発明のバリアントＰ４タンパク質
バリアントＰ４タンパク質は大変低レベルのＰ４酵素活性を有するか、または検出可能なＰ４酵素活性を待たない、いずれかの変異体Ｐ４タンパク質と定義する。免疫原組成物の成分として使用する時、これらのバリアントＰ４タンパク質は野生型Ｐ４タンパク質の望ましい免疫学的特性を保持する。これらの特性には、野生型Ｐ４に対するＥＬＩＳＡ反応性抗体および／またはＮＴＨｉに対する殺バクテリア性抗体の誘導を含む。キャリアータンパク質として使用する時、バリアントＰ４タンパク質は野性型Ｐ４タンパク質の免疫学的特性を保持する必要はない。

ＮＴＨｉに対する防御の臨床的相関は知られていないので、免疫原組成物中の野性型Ｐ４を変異体Ｐ４に置換することは、変異体が野性型組換えリポタンパク質Ｐ４（ｒＬＰ４）により誘起される力価に均等なＥＬＩＳＡ力価および／または殺バクテリア力価を誘起するだけで成功である。そのようなバリアントＰ４タンパク質は、ＮＴＨｉ感染の予防に有用な免疫原組成物の望ましい成分である。本明細書で使用するように、「バリアントＰ４タンパク質」または「変異体Ｐ４タンパク質」という用語は、野性型Ｐ４酵素活性を実質的に除去し、それでもヒトにおいてＮＴＨｉに対する免疫応答を誘導するタンパク質の能力を保持することが可能なアミノ酸残基に、特異的突然変異を持つタンパク質またはリポタンパク質を指す。

本明細書で互換的に使用する用語として、「免疫応答」または「免疫」は、体液性（すなわちＢ細胞）および／または細胞性（すなわちＴ細胞）応答の誘導を意味する。適当には体液性免疫応答は、本発明のＰ４タンパク質バリアントの宿主への導入に応答して、免疫感作された動物の血清中に存在するＰ４抗原特異的抗体を測定することにより評価することができる。以下の１つの例示態様では、免疫応答は免疫感作した動物の血清の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により評価される。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイは免疫感作した動物の脾臓から単離したリンパ球からのＴ細胞応答を測定するために使用することができる。

好ましくは本発明のバリアントＰ４タンパク質は、リポタンパク質、すなわちこれは修飾されたシステインをそのアミノ末端に含み、これに脂肪アシル化グリセロールがチオエーテル結合し、そして脂肪酸がその末端アミノ基に結合する。本発明のＰ４バリアントタンパク質の１態様では、リーダーペプチドはインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の野性型Ｐ４リーダーペプチド、すなわち配列番号２のアミノ酸１−２０である。しかしバクテリア細胞中で脂肪のアシル化に関する部位を特定する他のペプチドを、野性型配列の代わりにＰ４バリアントタンパク質に融合して、リポタンパク質を提供してもよい。他のリーダーペプチドの例には、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のＰ６タンパク質、ボレリア ブルグドルフェリー（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）のＱｓｐＡタンパク質に由来するもの、およびグラム陽性バクテリアの脂質シグナルペプチドに由来するものを含む。

さらにＰ４バリアントタンパク質をキャリアータンパク質として使用する本発明の別の態様では、脂質化されていない、すなわちリーダーペプチド無しで発現されることが好ましいかもしれない。例えば、これは配列番号２のアミノ酸１−２０のリーダーペプチドを欠いているか、または脂肪のアシル化に関する部位を欠くリーダーペプチドに融合されている。

本明細書を通して、特異的な突然変異が位置するアミノ酸残基の同一性は、野性型Ｐ４のプロセッシングされた、成熟した脂質化アミノ酸配列、すなわち配列番号３に対応する残基番号である。

本発明は、野生型Ｐ４タンパク質に比べて減少した酵素活性を有し、そして野生型Ｐ４タンパク質に対する抗体を誘導し、かつ／またはＮＴＨｉに対する殺バクテリア活性を有するＮＴＨｉのＰ４バリアントタンパク質を対象とし、ここでＰ４バリアントタンパク質は：
（ａ）野生型Ｐ４タンパク質ではグルタミンである配列番号３のアミノ酸残基３９の突然変異；
（ｂ）野生型Ｐ４タンパク質ではフェニルアラニンである配列番号３のアミノ酸残基４８の突然変異；
（ｃ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギン酸である配列番号３のアミノ酸残基６４の突然変異；
（ｄ）野生型Ｐ４タンパク質ではリシンである配列番号３のアミノ酸残基１６１の突然変異；
（ｅ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギンである配列番号３のアミノ酸残基２１８の突然変異；
（ｆ）野生型Ｐ４タンパク質ではアラニンである配列番号３のアミノ酸残基３５および３７の突然変異、ここで突然変異はグルタミン酸、グルタミンまたはトレオニンではない；
（ｇ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギン酸である配列番号３のアミノ酸残基６４および６６の突然変異；および
（ｈ）１以上の（ａ）−（ｇ）の突然変異の組み合わせ、
からなる群から選択される突然変異を有する。

具体的には本発明の特異的なＰ４バリアントタンパク質の第１態様は、野生型Ｐ４タンパク質ではグルタミンである配列番号３のアミノ酸残基３９に突然変異を含むタンパク質である。１つの態様では、Ｐ４バリアントタンパク質は配列番号３のアミノ酸３９位にグルタミン酸を含む。あるいはＰ４バリアントタンパク質は配列番号３のアミノ酸３９位にアスパラギン酸またはアスパラギンを含む。

本発明のＰ４バリアントタンパク質の第２態様は、野生型Ｐ４タンパク質ではフェニルアラニンであるアミノ酸残基４８番に突然変異を含む。望ましくはＰ４バリアントタンパク質中のアミノ酸残基はシステインである。４８位のＰｈｅ残基からＣｙｓ残基への置換は、タンパク質構造が破壊されるかもしれないことが予想された非保存的変化である。しかしこのＰ４バリアントタンパク質は望ましい抗原的および免疫原的特性を有する。このＰ４バリアントタンパク質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でヘムＡ突然変異を相補する能力も欠いている。引用により全部、本明細書に編入するＲｅｉｌｌｙ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，２００１ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４９４：１９−２３を参照にされたい。あるいはＰ４バリアントタンパク質は、配列番号３のアミノ酸４８位にセリン、またはグリシン、トレオニン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンのような非電荷極性基を有する他のアミノ酸を含む。

本発明のＰ４バリアントタンパク質の第３態様は、野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギン酸である配列番号３のアミノ酸残基６４位に突然変異を含む。１つの態様ではＰ４バリアントタンパク質は残基６４にアスパラギンまたはグルタミン酸を含む。あるいはＰ４バリアントタンパク質は配列番号３のアミノ酸６４位にアラニンを含む。

本発明のＰ４バリアントタンパク質の第４態様は、野生型Ｐ４タンパク質ではリシンである配列番号３のアミノ酸残基１６１位に突然変異を含む。１つの態様では、Ｐ４バリアントタンパク質は残基１６１にアルギニンを含む。

本発明のＰ４バリアントタンパク質の第５態様は、野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギンである配列番号３のアミノ酸残基２１８位に突然変異を含む。１つの態様では、Ｐ４バリアントタンパク質は残基２１８にグルタミンを含む。あるいはＰ４バリアントタンパク質は配列番号３のアミノ酸２１８位にアスパラギン酸またはグルタミン酸を含む。

本発明のＰ４バリアントタンパク質の第６態様は、野生型Ｐ４タンパク質ではアラニンである配列番号３のアミノ酸残基３５および３７位に突然変異を含む。１つの態様では、Ｐ４バリアントタンパク質は残基３５および３７にアスパラギンを含む。Ｐ４バリアントタンパク質は配列番号３のアミノ酸３５および３７位にグルタミン酸、グルタミンまたはトレオニンを含まない。

本発明のＰ４バリアントタンパク質の第７態様は、野生型Ｐ４タンパ質ではアスパラギン酸である配列番号３のアミノ酸残基６４および６６位に突然変異を含む。１つの態様では、Ｐ４バリアントタンパク質は残基６４および６６にアラニンを含む。あるいはＰ４バリアントタンパク質は、配列番号３のアミノ酸６４および６６位にアスパラギンまたはグルタミン酸を含む。

本発明者は、Ｐ４バリアントタンパク質における酵素活性の排除または減少は、野生型Ｐ４に対する免疫原性が保存されるかどうかについて明白なパターンを伴わないことを決定した。Ｐ４配列中の幾つかの突然変異は酵素活性を排除または減少させるが、変異体タンパク質が高ＥＬＩＳＡ力価または高殺バクテリア力価のいずれかの誘起もできなくする。本発明者は、酵素活性と免疫原性との間、高ＥＬＩＳＡ力価と高殺バクテリア力価との間、および調査したものと、以下の実施例で確認した種々のＰ４バリアントタンパク質において、抗原構造に及ぼす保存的変化の効果の予測性の間に、相関が無いことを観察した。

例えば、Ｐ４タンパク質の酵素活性を排除するための最初の試みは、バクテリアの酸性ホスファターゼに共通する既知のＤＤモチーフ（２つの隣接または近いアスパラギン酸残基）（Ｔｈａｌｌｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．，７：１６４７−５２）、すなわち配列番号３のアミノ酸残基６４および６６ならびに配列番号３のアミノ酸１８４および１８５位でなされた。６４および６６位の２つのアスパラギン酸の代わりに２つのアラニンの二重変異体、あるいは１８４および１８５位の２つのアスパラギン酸の代わりに２つのアラニンの二重変異体のいずれかを含むＰ４バリアントタンパク質を酵素活性について評価した時、両方が酵素的に不活性であった。

しかしこれらのタンパク質がマウスを免疫感作するために使用された時、生成された抗血清は、野性型Ｐ４に対して低いＥＬＩＳＡ力価を示した。これは抗血清がホモロガスなタンパク質に対して高い力価を有するので、抗体により認識されるエピトープにおける変化によることが示された。対照的に、これら抗血清の殺バクテリア活性を評価した時、両変異体タンパク質に対する抗血清はＤ６４Ａ、Ｄ６６Ａ変異体について高レベルの殺バクテリア活性を示し、そしてＤ１８４Ａ、Ｄ１８５Ａ変異体について低レベルの殺バクテリア活性を示した。すなわちＤ６４Ａ、Ｄ６６Ａ変異体は免疫原組成物に包含するために有用な成分であるが、Ｄ１８４、Ｄ１８５Ａ変異体は有用ではない。別に提案された、６４位のＡｓｐ残基の高度に保存されたＧｌｕ残基への置換を含む変異体は、たとえ野性型Ｐ４に対して高いＥＬＩＳＡ力価を誘起するＰ４バリアント（Ｄ６４Ｅ）を生じても、ＮＴＨｉに対しては低い殺バクテリア力価を有した。さらに本発明の免疫原組成物の成分として有用なＰ４バリアントタンパク質に関する基準を満たさない、他の提案された変異体Ｐ４タンパク質を以下の実施例に示す。

本発明に有用な他の有用なＰ４バリアントタンパク質には、上に提供した１以上の特異的突然変異を持つ完全長の成熟２５４アミノ酸リポタンパク質、または上に記載した突然変異した残基を含むポリペプチドもしくはその断片を含み、そしてこのタンパク質、ポリペプチドもしくは断片は、それらが誘導された完全長Ｐ４バリアントの減少した酵素活性、ＥＬＩＳＡおよび／または殺バクテリア（ＢＣ）活性を保持する。

これらＰ４バリアントタンパク質の免疫学的に活性で、酵素的に不活性な断片は通常、上記の突然変異誘発部位を含むＰ４バリアントタンパク質の少なくとも約２５個の連続するアミノ酸を含む。より典型的にはＰ４バリアントタンパク質の断片は、少なくとも約１００個の連続するアミノ酸を含む。Ｐ４バリアントタンパク質の他の断片は、少なくとも約１５０個の連続するアミノ酸を含む。さらにＰ４バリアントタンパク質の別の態様は、少なくとも約２００個の連続するアミノ酸長を含む。

Ｐ４バリアントタンパク質の断片が個体にＮＴＨｉに対する防御免疫応答を誘導するならば、それは以下に記載する方法に有用である。断片はＰ４タンパク質のカルボキシ末端領域に先端の切断を含む。例えば約残基２００で短縮化されたＰ４バリアントタンパク質（すなわちこれは配列番号３のアミノ酸１−２００を含む）が望ましい断片である。同様に約残基２１０、２２１または２３２で末端が切断されたＰ４バリアントタンパク質は望ましい断片である。本発明の非酵素的に活性で、免疫学的に活性なＰ４バリアントの他の断片を選択することができる。前述の断片は上記の１以上の特異的突然変異も含むことができる。

他の適当なＰ４バリアントタンパク質は、１以上のアミノ酸残基が置換された基を含むものを含むことができる。さらに別の適当なＰ４バリアントタンパク質は、ポリペプチドがポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物に融合されたものである。別の適当なＰ４バリアントタンパク質は、さらなるアミノ酸がリーダーもしくは分泌配列、またはＰ４バリアントタンパク質の免疫原性を強化するために採用される配列のようなポリペプチドに融合されたものである。Ｐ４バリアントタンパク質のさらに別の修飾には、Ｐ４のＮ末端でシグナルまたはリーダー配列の上に挙げた欠失（すなわち配列番号１のヌクレオチド１４８−２０８によりコードされる）、および／または免疫原性に影響しない他の領域の欠失を含む。同様に本明細書に記載するＰ４バリアントタンパク質の修飾には、シグナルまたはリーダー配列の別のシグナルまたはリーダー配列への置き換えを含む。例えば、引用により本明細書に編入する米国特許第５，７８０，６０１号明細書を参照にされたい。

適当なＰ４バリアントタンパク質のさらに別の例は、任意のアミノ酸（例えば、−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−）または他のアミノ酸または化学的化合物のスペーサーを、タンパク質を一緒に、またはキャリアーに連結する目的でペプチドの末端に含むことができるものである。例えば有用なＰ４バリアントタンパク質は、キャリアータンパク質に結合された１以上の上記Ｐ４バリアントタンパク質を含むことができる。あるいは有用なＰ４バリアントタンパク質は、場合によりキャリアータンパク質に結合された多数のＰ４バリアントタンパク質を含む融合タンパク質で存在することができる。これらの態様では、キャリアータンパク質は望ましくは選択したＰ４バリアントタンパク質の免疫原性を強化することができるタンパク質または他の分子である。そのようなキャリアーは、アジュバント効果も有する、より大きな分子でよい。通例のタンパク質キャリアーの例には限定するわけではないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｎａＫタンパク質、ガラクトキナーゼ（バクテリアのガラクトース代謝の第一段階を触媒するｇａｌＫ）、ユビキチン、α−接合因子、β−ガラクトシダーゼおよびインフルエンザＮＳ−１タンパク質を含む。ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドのようなトキソイド（すなわち毒性活性を排除するための十分な修飾を含む、自然に存在するトキシンをコードする配列）、それらの各トキシン、およびＣＲＭ_１９７（ジフテリアトキシンの非毒性形態、米国特許第５，６１４，３８２号明細書を参照にされたい）のようなこれらタンパク質の変異体形もキャリアーとして使用することができる。他のキャリアーにはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のエキソトキシンＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱不安定トキシンおよびレトロウイルス粒子（レトロウイルスおよびＶＰ６粒子を含む）を含む。あるいはキャリアータンパク質または他の免疫原性タンパク質の断片またはエピトープを使用してもよい。例えば、ハプテンをバクテリアトキシンのＴ細胞エピトープに結合することができる。米国特許第５，７８５，９７３号明細書を参照にされたい。同様に種々のバクテリア熱ショックタンパク質、例えばマイコバクテリアｈｓｐ−７０を使用することができる。グルタチオンーＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は別の有用なキャリアーである。当業者はこの内容での使用に適するキャリアーを容易に選択することができる。融合タンパク質は、タンパク質様物質を結合するために標準的な技法により形成することができる。融合物は以下に記載する組換えＤＮＡ技法により調製された融合遺伝子構築物から発現させることができる。

本明細書に記載する他の適当なＰ４バリアントタンパク質は、酵素活性を再生せず、そして免疫原性を消失しない修飾により、またはそのような性質の組合わせにより具体的に例示したＰ４バリアントタンパク質またはペプチドとは異なることができる。例えば、Ｐ４バリアントタンパク質の１次配列は改変するが、その機能は通常は改変しない保存的アミノ酸の変化を作成することができる。

そのような変化を作成するにあたり、アミノ酸の疎水親水指数を考慮することができる。ポリペプチドに相互作用的生物機能を付与することにおいて、疎水親水アミノ酸指数の重要性は一般に当該技術分野で知られている（Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。特定のアミノ酸を類似の疎水親水指数またはスコアを有する別のアミノ酸に置換し、そしてそれでも類似の生物活性を有するポリペプチドを生じることができることは知られている。各アミノ酸はその疎水性および荷電特性に基づき１つの疎水親水指数が割り当てられた。それらの指数には：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（―０．４）；トレオニン（―０．７）；セリン（―０．８）；トリプトファン（―０．９）；チロシン（―１．３）；プロリン（―１．６）；ヒスチジン（―３．２）；グルタメート（―３．５）；グルタミン（―３．５）；アスパルテート（―３．５）；アスパラギン（―３．５）；リシン（―３．９）；およびアルギニン（―４．５）を含む。

アミノ酸残基の相対的疎水親水特性は、生じるポリペプチドの２次および３次構造を決定し、これは次いでポリペプチドと酵素、基質、レセプター、抗体、抗原等のような他の分子との相互作用を定めると考えられている。当該技術分野ではアミノ酸は、類似の疎水親水指数を有する別のアミノ酸に置換することができ、そしてそれでも機能的に均等なポリペプチドを得ることができると知られている。そのような変化においては、疎水親水指数が＋／−２内のアミノ酸の置換が好ましく、＋／−１内のものが特に好ましく、そして＋／−０．５内のものがさらに特に好ましい。

アミノ酸のような置換は疎水性に基づき作成することもでき、特にそれにより作られる生物的に機能が均等なポリペプチドまたはペプチドは、免疫学的態様に使用されることを意図している。引用により本明細書に編入する米国特許第４，５５４，１０１号明細書は、隣接するアミノ酸の疎水性により支配されるようなポリペプチドの最大の部分的平均疎水性が、その免疫原性および抗原性、すなわちポリペプチドの生物学的特性に相関すると述べている。

米国特許第４，５５４，１０１号明細書に詳細に記載されているように、以下の疎水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタンメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（―０．５±１）；トレオニン（―０．４）；アラニン（―０．５）；ヒスチジン（―０．５）；システイン（―１．０）；メチオニン（―１．３）；バリン（―１．５）；ロイシン（―１．８）；イソロイシン（―１．８）；チロシン（―２．３）；フェニルアラニン（―２．５）；トリプトファン（―３．４）。アミノ酸は類似の疎水性値を有する別のアミノ酸に置換することができ、そしてそれでも生物学的に均等、そして特に免疫学的に均等なポリペプチドが得られると理解されている。そのような変化においては、疎水性値が±２内のアミノ酸の置換が好ましく；±１内のものが特に好ましく；そして±０．５内のものがさらに特に好ましい。

上で概略したように、アミノ酸の置換は一般にアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、荷電、サイズ等に基づく。種々の前記の特性を考慮した例示的置換は当業者には周知であり、そして：アルギニンおよびリシン；グルタメートおよびアスパルテート；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む。

加えて、Ｐ４バリアントタンパク質の１次配列を通常は変えない修飾には、ポリペプチドのインビボまたはインビトロの化学的誘導化、例えばアセチル化、メチル化またはカルボキシル化を含む。また本発明のＰ４バリアントタンパク質として含まれるのは、例えばその合成およびプロセッシング中、またはさらなるプロセッシング段階でポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することにより；あるいはポリペプチドをグリコシル化に影響を及ぼす、哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素のような酵素に暴露することにより作られるもののような、グリコシル化により修飾されたこれらのタンパク質である。またＰ４バリアントタンパク質として包含されるのは、リン酸化されたアミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニンを有する上で同定された突然変異した配列である。

またＰ４バリアントタンパク質として包含されるのは、タンパク質溶解的分解に対するそれらの耐性を改善するために、または溶解特性を至適化するために、通常の分子生物学的技法を使用して修飾された上記配列である。中でもそのようなＰ４バリアントタンパク質に含まれるのは、自然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸、または自然には存在しない合成アミノ酸を含むものである。中でも本発明のＰ４バリアントタンパク質中に存在することができる別の既知の修飾は、限定する訳ではないが、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫黄化、アルギニレーションのようなトランスファーＲＮＡが媒介するタンパク質へのアミノ酸の付加、およびユビキチン化である。
Ｂ．Ｐ４バリアントタンパク質をコードする核酸分子
本発明の別の観点には、Ｐ４タンパク質の特定された位置指定突然変異または断片を有する上記Ｐ４バリアントタンパク質をコードする単離された、合成の、または組換え核酸分子および配列を含む（この断片はさらに１以上のそれら突然変異を含むことができる）。

Ｐ４バリアントタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる単離されたヌクレオチド分子は好ましくは、宿主細胞中でＰ４バリアントの発現を支配する調節配列の制御下にあることができる。本明細書に記載するように、そのような核酸分子はインビトロでＰ４バリアントタンパク質を発現させるために、またはヒトのインビボでＰ４バリアントタンパク質の発現が可能となるように使用することができる。

本明細書で使用するように、「単離されたヌクレオチド分子または配列」と言う用語は、自然な環境で分子または配列に付随する他の生物学的成分の混入が無い核酸セグメントまたは断片を指す。例えば本発明の単離されたヌクレオチド分子または配列の１態様は、自然に存在する状態でそれを挟む配列から分離された配列、例えば自然に存在するゲノム中の断片に隣接する配列のような通常は断片に隣接する配列が除去されたＤＮＡ断片である。さらに本発明のヌクレオチド配列または分子は、本発明のＰ４バリアントタンパク質をコードするようにすでに改変されている。このように「単離された核酸分子または配列」と言う用語は、非突然変異核酸、例えば細胞中のＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質を自然に伴う他の成分から実質的に精製された核酸配列または分子にも適用する。本発明の単離されたヌクレオチド分子または配列は、組換え法、合成法、例えば突然変異誘発法、またはそのような方法の組み合わせのような他の常法により調製された配列および分子も包含する。本発明のヌクレオチド配列または分子は、本明細書に提示する特別なヌクレオチド配列にのみ限定されると解釈すべきではなく、むしろ本明細書に提示するヌクレオチド配列と相同性を共有する（すなわち配列同一性を有する）ありとあらゆるヌクレオチド配列を含むと解釈すべきである。

核酸またはその断片を指す時、「実質的な相同性」または 「実質的な類似性」と言う用語は、適当なヌクレオチド挿入または欠失を別の核酸（またはその相補鎖）と最適に並べた時、例えばＦａｓｔａ、ＧＣＧバージョン６．１プログラムのような配列同一性の周知アルゴリズムにより測定される、ヌクレオチド塩基の少なくとも約７０％にヌクレオチド配列の同一性があることを示す。本明細書で使用する「相同的」と言う用語は、２つのポリマー性分子間、例えば２つの核酸分子間、例えば２つのＤＮＡ分子間もしくは２つのＲＮＡ分子間、または２つのポリペプチド分子間の配列類似性を称する。２つの両分子中のヌクレオチドまたはアミノ酸位置が同じ単量体ヌクレオチドまたはアミノ酸に占められる時、例えば２つの各ＤＮＡ分子における１つの位置がアデニンにより占められる場合、それらはその位置で相同的である。２つの配列間の相同性は、対合または相同的位置の数の直接的関数であり、例えば２つの化合物配列中の半分（例えば、１０サブユニット長のポリマー中、５個の位置）が相同的ならば、２つの配列は５０％相同的である。位置の９０％、例えば１０のうちの９が対合または相同的ならば、２つの配列は９０％の相同性を共有する。例として、３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＣＧ５’のＤＮＡ配列は、５０％の相同性を共有する。本明細書で使用する用語「実質的に相同的」と言う用語は、望ましい核酸に約７０％相同的、より好ましくは約８０％相同的、そして最も好ましくは約９０％相同的であるＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。

また本発明は、野生型Ｐ４タンパク質に比べて減少した酵素活性を有し、そして野生型Ｐ４タンパク質に対する抗体を誘導し、かつ／またはＮＴＨｉに対する殺バクテリア活性を有するＮＴＨｉのＰ４バリアントタンパク質をコードする核酸配列に少なくとも７０％、８０％、または９０％相同的である核酸配列を含んでなる単離されたヌクレオチド分子を対象とし、ここでＰ４バリアントタンパク質は：
（ａ）野生型Ｐ４タンパク質ではグルタミンである配列番号３のアミノ酸残基３９の突然変異；
（ｂ）野生型Ｐ４タンパク質ではフェニルアラニンである配列番号３のアミノ酸残基４８の突然変異；
（ｃ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギン酸である配列番号３のアミノ酸残基６４の突然変異；
（ｄ）野生型Ｐ４タンパク質ではリシンである配列番号３のアミノ酸残基１６１の突然変異；
（ｅ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギンである配列番号３のアミノ酸残基２１８の突然変異；
（ｆ）野生型Ｐ４タンパク質ではアラニンである配列番号３のアミノ酸残基３５および３７の突然変異、突然変異はグルタミン酸、グルタミンまたはトレオニンではない；
（ｇ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギン酸である配列番号３のアミノ酸残基６４および６６の突然変異；
（ｈ）１以上の（ａ）−（ｇ）の突然変異の組み合わせ、
からなる群から選択される突然変異を有し、ここで核酸配列は（ａ）−（ｇ）の少なくとも１つの突然変異をコードする。

さらに遺伝子コードの縮重により、本明細書に記載するＰ４の突然変異したアミノ酸残基をコードする任意の３ヌクレオチドコドンは、本発明の範囲である。

本明細書で検討するように、Ｐ４バリアントタンパク質および／またはそれらをコードするＤＮＡ、あるいは本明細書に記載する核酸分子または組成物に有用な他の配列が、同定された配列に対するそれらの相同性または同一性の割合で定められる場合、相同性の割合または同一性の割合を算出するために使用するアルゴリズムには以下を含む：Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｊ．Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：６７−７２；Ｊ．Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，分子配列の比較およびアライメント（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）（Ｍ．Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ ｅｔ ａｌ．，編集）、実践アプローチシリーズ：核酸およびタンパク質配列分析（Ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ） ＸＶＩＩＩ、ＩＲＬ出版で：オックスフォード、英国、ＵＫ（１９８７）、ｐｐ４１７）およびＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＦＡＳＴＡプログラム（Ｅ．Ｇ．Ｓｈｐａｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３８：１７９−１９１）。これらの参考文献は、引用により本明細書に編入する。

本明細書で使用するように２つのＤＮＡが「操作可能に連結された」と記載することは、１本鎖または２本鎖ＤＮＡが２つの各ＤＮＡを含んでなり、そしてその２つのＤＮＡは、少なくとも１つのＤＮＡ配列がもう１つを特徴付ける生理学的効果を発揮できる様式でＤＮＡ内に配列されていることを意味する。

好ましくは本発明のＰ４バリアントタンパク質の生産またはそのインビボ生産のための細胞への投与における使用では、各Ｐ４バリアントタンパク質をコードする配列および必要な調節配列は、別のウイルスまたは非ウイルス組換えベクターに存在する（核酸分子の細胞への非ウイルス送達法を含む）。あるいは本発明のＰ４バリアントタンパク質の二重コピーをコードするか、または多数の異なるＰ４バリアントタンパク質をコードする２以上のこれら核酸配列は、ポリシストロン性転写産物、すなわち多数の遺伝子産物を発現するように計画された１つの分子に含まれることができる。

本明細書で使用する「ベクター」と言う用語は、外因性または異種の核酸配列をコードするように設計されたウイルスまたは非ウイルス、例えばバクテリアの種に由来するＤＮＡ分子を意味する。すなわちこの用語は通例のバクテリアプラスミドを含む。そのようなプラスミドまたはベクターは、ウイルスまたはファージに由来するプラスミド配列を含むことができる。そのようなベクターには染色体、エピソームおよびウイルスに由来するベクター、例えばバクテリアプラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、およびウイルスに由来するベクターを含む。ベクターはプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝子要素、コスミドおよびファジェミドに由来するもののようなそれらの組み合わせに由来してもよい。この用語は遺伝子を１つの細胞から別の細胞に移す非複製ウイルスも含む。この用語は例えばポリリシン化合物等のような核酸を細胞に移し易くする非プラスミドおよび非ウイルス化合物も含むとも解釈するべきである。

本発明の核酸分子は非ウイルスベクター、または本発明に従いＰ４バリアントタンパク質をコードする配列の宿主細胞への送達法を含む。種々の非ウイルスベクターが当該技術分野で知られており、そして限定するわけではないがプラスミド、バクテリアベクター、バクテリオファージベクター、「裸の」ＤＮＡおよびカチオン性脂質またはポリマーで濃縮（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ）したＤＮＡを含むことができる。

バクテリアベクターの例は、限定するわけではないがとりわけカルメットーゲラン桿菌（ＢＣＧ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲーラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）を含む。適当なプラスミドベクターには例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫ３７、ｐＫＣ１０１、ｐＡＣ１０５、ｐＶＡ５１、ｐＫＨ４７、ｐＵＢ１１０、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２５、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３１３、ｐＭＬ２１、ＲＳＦ２１２４、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ｐＢＡＤ１８およびｐＢＲ３２８を含む。

適当な誘導性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）発現ベクターの例にはｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｇｅｎｅ，６９：３０１−３１５）、アラビノース発現ベクター（例えばｐＢＡＤ１８、Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７：４１２１−４１３０）、およびｐＥＴＩＩｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：６０−８９）を含む。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴＩＩｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時に発現するウイルスＲＮＡポリメラーゼＴ７ｇｎＩにより媒介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下にＴ７ｇｎ１遺伝子を持つ在住プロファージに由来する宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳＩ７４（ＤＥ３）により供給される。ｐＢＡＤ系はａｒａＣ遺伝子により調節される誘導性アラビノースプロモーターに依存する。このプロモーターはアラビノースの存在により誘導される。

例示ベクターは１本または２本鎖のバクテリオファージベクターである。例えば適当なクローニングベクターには限定するわけではないが、中でもバクテリオファージλベクター系、λｇｔ１１、μｇｔμＷＥＳ．ｔＢ、Ｃｈａｒｏｎ４、λｇｔ−ＷＥＳ−λＢ、Ｃｈａｒｏｎ２８、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、λｇｔ−１−λＢＣ、λｇｔ−１−λＢ、Ｍ１３ｍｐ７、Ｍ１３ｍｐ８またはＭ１３ｍｐ１９を含む。

別の態様では、発現ベクターは酵母発現ベクターである。Ｓ．セルビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母での発現ベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃＩ（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７）およびｐＹＥＳ２（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を含む。

あるいはバキュロウイルス発現ベクターを使用する。培養した昆虫細胞（例えばＳｆ９またはＳｆ２１）でのタンパク質の発現に利用できるバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８３）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９）を含む。

さらに別の態様では、哺乳動物発現ベクターは哺乳動物細胞中での発現に使用される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）を含む。哺乳動物細胞中で使用する時、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルス調節要素により提供される。

組換えベクターの１種類は、組換え１本または２本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターである。当該技術分野では種々のウイルスベクター系が知られている。そのようなベクターの例には限定するわけではないが、目的の選択した核酸組成物を運び、そして発現するように構築された組換えアデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に基づくベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクター、組換えレトロウイルスまたはレンチウイルス、組換えポックスウイルスベクター、組換えワクシニアウイルスベクター、ＳＶ−４０ベクター、バキュロウイルスのような昆虫ウイルス等を含む。

使用することができるレトロウイルスベクターには、欧州特許第０４１５７３１号明細書：国際公開第９０／０７９３６号；同第９４／０３６２２号；同第９３／２５６９８号；および同第９３／２５２３４号パンフレット；米国特許第５，２１９，７４０号明細書；国際公開第９３／１１２３０号および同第９３／１０２１８号パンフレット；Ｖｉｌｅ ａｎｄ Ｈａｒｔ，１９９３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ ａｎｄ Ｈａｒｔ，１９９３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７；Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９−７３５；米国特許第４，７７７，１２７号明細書；独国特許第２，２００，６５１号明細書；および欧州特許第０３４５２４２号明細書に記載されているものを含む。適当な組換えレトロウイルスの例には国際公開第９１／０２８０５号パンフレットに記載されているものを含む。

アルファウイルスに基づくベクターも、Ｐ４バリアントタンパク質をコードする核酸分子として使用することができる。そのようなベクターは例えばシンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネズエラ ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ１２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）を含む広範な種類のアルファウイルスから構築することができる。そのようなベクター系の代表例は、米国特許第５，０９１，３０９号；同第５，２１７，８７９号；および同第５，１８５，４４０号明細書；および国際公開第９２／１０５７８号；同第９４／２１７９２号；同第９５／２７０６９号；同第９５／２７０４４号；および同第９５／０７９９４号パンフレットに記載されているものを含む。

アデノウイルスベクターの例には、Ｂｅｒｋｎｅｒ，１９８８ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２７；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４；国際公開第９３／１９１９１号パンフレット；Ｋｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４ ＰＮＡＳ ９１：２１５−２１９；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３ ＰＮＡＳ ９０：１１４９８−１１５０２；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：２８３８−２８４８；Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２−１２０７；Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：４０３−４０９；Ｃａｉｌａｕｄ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：１２８７−１２９１；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５：１３０−１３４；Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１：３７２−３７８；およびＬｅｖｒｅｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｇｅｎｅ １０１：１９５−２０２に記載されているものを含む。例示するアデノウイルスベクターには、国際公開第９４／１２６４９号；同第９３／０３７６９号；同第９３／１９１９１号；同第９４／２８９３８号／同第９５／１１９８４号および同第９５／００６５５号パンフレットに記載されているものを含む。他のアデノウイルスベクターには、米国特許第６，０８３，７１６号明細書に記載されているようなチンパンジーアデノウイルスに由来するものを含む。

別のウイルスベクターは、アデノ−随伴ウイルス（ＡＡＶ）のようなパルボウイルスに基づく。代表例には国際公開第９３／０９２３９号パンフレット、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｖｉｒｏｌ．１６６：１５４−１６５；およびＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３ ＰＮＡＳ ９０：１０６１３−１０６１７に記載されているＡＡＶベクターを含む。他の特に望ましいＡＡＶベクターには、ＡＡＶ１に基づくものを含む；２０００年５月１８日に公開された国際公開第００／２８０６１号パンフレットを参照にされたい。他の望ましいＡＡＶベクターは、シュードタイプされた、すなわちＡＡＶ ＩＴＲｓにヘテロロガスなＡＡＶ血清型のキャプシドにパッケージングされたＡＡＶ５’ＩＴＲＳ、導入遺伝子およびＡＡＶ３’ＩＴＲｓからなるミニ遺伝子を含むものを含む。そのようなシュードタイプ化ＡＡＶベクターの生産法は、国際公開第０１／８３６９２号パンフレットに詳細に記載されている。

本発明の核酸分子が「裸のＤＮＡ」である態様では、これは中でもシクロデキトリンを含有するポリマーおよび保護的な、相互作用性の非濃縮（ｎｏｎｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ）ポリマーのような典型的および非典型的ポリマーを含むポリマーと組み合わせることができる。「裸の」ＤＮＡおよびカチオン性脂質もしくはポリマーで濃縮したＤＮＡは、多くは化学的方法を使用して細胞に送達される。細胞送達には当該技術分野において多数の化学的方法が知られており、そしてＤＮＡと複合した脂質、ポリマーまたはタンパク質を使用し、場合によりそれを粒子に濃縮し、そして細胞に送達することを含む。別の非ウイルス的な化学法には、ＤＮＡを濃縮するカチオンを使用し、これをリポソームに入れ、そして本発明に従い使用することを含む。Ｃ．Ｈｅｎｒｙ，２００１ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ，７９（４８）：３５−４１を参照にされたい。

核酸分子は「裸の」ＤＮＡとして（米国特許第５，５８０，８５９号明細書）、またはブピバカインおよび他の局所麻酔薬のような免疫感作をし易くする作用物質を含む組成物に配合されて（米国特許第６，１２７，１７０号明細書）、細胞に直接導入される。

上記ウイルスおよび非ウイルスベクターのすべての成分は、当該技術分野で既知の材料の中から容易に選択することができ、そして製薬産業から入手することができる。ベクター成分および調節配列の選択は、本発明を限定するとは考えられない。本発明に従いＰ４バリアントタンパク質をコードする各核酸配列は、好ましくは哺乳動物細胞中で各核酸配列の産物の複製および生成を支配する調節配列の制御下にある。用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列に操作可能に連結された核酸の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。場合によりプロモーター／調節配列は組織特異的様式で機能することができる。例えばプロモーター／調節配列は特定の組織型の細胞中のみでの発現を駆動することができる。場合によりこの配列はコアプロモーター配列であることができ、そして他の場合ではこの配列は組織特異的様式の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節要素も含むことができる。

好ましくは本発明のＰ４バリアントタンパク質をコードする核酸分子および／または組換えベクターは、さらに調節配列を含んでなる。例えばそのような調節配列は、Ｐ４バリアントタンパク質の発現を駆動するプロモーターを含んでなる。好ましくはプロモーター／調節配列は、これが細胞中でのＰ４バリアントタンパク質の発現を駆動するようにコード配列の５’末端に配置される。

適当なプロモーターは構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターおよびその他から容易に選択することができる。活性が非特異的であり、そして本発明のＰ４バリアントタンパク質をコードする核酸分子に使用することができる構成的プロモーターの例には、限定するわけではないがレトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを含む）（例えばＢｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照にされたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター（インビトロジェン）を含む。

外から供給される化合物により調節される誘導性プロモーターには限定するわけではないが、アラビノースプロモーター、亜鉛−誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）−誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（国際公開第９８／１００８８号パンフレット）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：３３４６−３３５１）、テトラサイクリン−抑制系（Ｇｏｓｓｅｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１）、テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９、またＨａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２−５１８も参照にされたい）、ＲＵ４８６−誘導系（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，４：４３２−４４１）、およびラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２）を含む。

本内容に有用となり得る他の種類の誘導性プロモーターは、特異的な生理学的状態により調節される、例えば温度または急性期もしくは複製している細胞に調節されるプロモーターである。有用な組織特異的プロモーターには、骨格筋β−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびに自然に存在するプロモーターよりも高い活性を持つ合成筋肉プロモーターを含む（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１−２４５を参照にされたい）。組織特異的プロモーターの例は、中でも肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４−３２；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９；アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４）、骨（オステオカルシン、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６；骨シアロプロテイン、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４−６４）、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３−８；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞レセプターα鎖）、神経性（ニューロン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５；ニューロフィラメント軽鎖遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５；ニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４）である。例えば本内容に有用な既知のプロモーターに関するさらなるリストについては、国際公開第００／５５３３５号パンフレットを参照にされたい。

本発明の核酸配列、分子またはベクターに含まれるさらなる調節配列には、限定するわけではないがエンハンサー配列、ポリアデニレーション配列、スプライス供与配列およびスプライス受容配列、翻訳されるポリペプチドのそれぞれ始めおよび終わりに配置された翻訳開始および終結に関する部位、転写された領域の翻訳のためのリボゾーム結合部位、エピトープタグ、核局在化配列、ＩＲＥＳエレメント、ゴールドバーグ−ホグネス“ＴＡＴＡ”エレメント、制限酵素開裂部位、選択可能マーカー等を含む。エンハンサー配列は例えば、ＳＶ４０ ＤＮＡの７２ｂｐ縦列反復配列またはレトロウイルスの長い末端反復配列またはＬＴＲｓ等を含む。プロモーターまたは他の共通のベクター要素の選択は通例であり、そしてそのような多くの配列が入手可能であり、それを用いて本発明に有用なヌクレオチド分子およびベクターを設計する。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，モレキュラークローニング．ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク（１９８９）およびそこに引用されている参考文献、例えば第３．１８〜３．２６頁、および１６．１７〜１６．２７、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、分子生物学の現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン ウィリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（１９８９）を参照にされたい。本発明の分子を調製するために、当業者はそのような既知の調節配列の中から容易に選択することができる。そのような調節配列の選択は、本発明を限定しない。
Ｃ．本発明のＰ４バリアントタンパク質およびヌクレオチド分子の作成法
本明細書に開示する本発明のヌクレオチド配列およびＰ４バリアントタンパク質、ならびにヌクレオチド分子またはＰ４バリアントタンパク質を含む組成物の調製または合成は、利用可能な材料を使用して、当該技術分野で通常の技術を有する人の能力の範囲内である。合成法は本発明を限定しない。以下の実施例は、Ｐ４バリアントタンパク質をコードする配列の合成の現在好適な態様を詳細に説明する。

本発明のＰ４バリアントタンパク質およびヌクレオチド分子および配列は、中でも化学合成法、組換え遺伝子工学法、位置指定突然変異誘発法により、およびそのような方法を組み合わせて生産することができる。

例えば本発明のヌクレオチド配列／Ｐ４バリアントタンパク質は、既知の化学的合成技術、例えば中でもＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４；Ｊ．Ｓｔｕａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｙｏｕｎｇ、固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、ピアスケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社、ロックフォード、イリノイ州（１９８４）；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，１９８１ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５；Ａｌｖａｒａｄｏ−Ｕｒｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９８０ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４：２７０；およびＳｉｎｈａ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．、１９８４ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４５３９に記載されているような固相化学合成により従来通り調製することができる。また、例えばタンパク質−構造および分子特性（ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ）、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）アンド カンパニー、ニューヨーク、１９９３；タンパク質の翻訳後の共有的修飾（ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ）」、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編集、アカデミック出版、ニューヨーク、１９８３の１−１２頁、Ｗｏｌｄ，Ｆ．，「翻訳後タンパク質修飾：展望および見込み（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）」；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８２：６２６−６４６、およびＲａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２も参照にされたい。

あるいは本発明の組成物は、本明細書に提供する情報（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，分子生物学における現在のプロトコール、ジョン ウィリー＆サンズ、ニューヨーク（１９９７））を利用して、宿主微生物等の中で任意の他の免疫原および任意のキャリアータンパク質を含むＰ４バリアントタンパク質をコードするヌクレオチド分子をクローニングし、そして発現させることによるような、通例の分子生物学的技法、位置指定突然変異誘発法、遺伝子工学またはポリメラーゼ連鎖反応を使用して組換え的に構築することができる。Ｐ４バリアントタンパク質および任意の免疫原に関するコード配列は、合成的に調製することができる（Ｗ．Ｄ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１６４：４９（１９９５））。あるいはＰ４野生型タンパク質をコードするＤＮＡは、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）から、引用により本明細書に編入する米国特許第５，７８０，６０１号明細書に記載されているように単離し、そして突然変異させることができる。

一般に、組換えＤＮＡ技法には上記のようにＰ４バリアントタンパク質をコードするＤＮＡ配列を合成または単離により得ること、そしてそれを適当なベクター／それが発現される宿主細胞発現系に導入することを含む。ＤＮＡを発現ベクターに挿入するために記載された任意の方法を使用して、プロモーターおよび他の調節制御要素を選択した組換えベクター内の特異的部位に連結することができる。本発明の組換えＰ４バリアントタンパク質は、それぞれＰ４リーダーコード配列を使用して、またはリーダー配列を使用しないことにより（または上で検討したような脂肪酸のアセチル化を特定しないリーダー配列）、脂質化または非脂質化タンパク質として生産されることができる。

種々の宿主−ベクター系が本発明のＰ４バリアントタンパク質を発現させるために使用され得る。合成核酸分子を使用した本発明のＰ４バリアントタンパク質および他の組成物のクローニングおよび発現のための系には、組換え技法において周知である種々の微生物および細胞の使用を含む。宿主細胞は原核（例えば、バクテリア）細胞および哺乳動物、昆虫細胞、酵母細胞を含む真核細胞を含む任意の生物から選択することができる。好ましくは本発明の種々の方法および組成物で使用する細胞は、バクテリア細胞である。

適当なバクテリア細胞には例えば、種々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含む。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）のような酵母細胞、およびＳｆ９およびＳｆ２１細胞のような昆虫細胞も生産目的に有用な宿主細胞である。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＥＲ Ｃ６、ＮＳＯ ＶＥＲＯまたはＣＯＳ細胞のような哺乳動物細胞も適当な宿主細胞である。

ベクターは上記のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターから選択することができるが、使用する宿主細胞と適合しなければならない。組換えＤＮＡベクターは適切な宿主細胞（バクテリア、ウイルス、酵母、哺乳動物細胞等）に形質転換、形質導入またはトランスフェクション（ベクター／宿主細胞系に依存する）により導入することができる。宿主−ベクター系には限定するわけではないが、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換したバクテリア；酵母ベクターを含む酵母のような微生物；ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス等）で感染させた哺乳動物細胞系；およびウイルス（例えばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系を含む。

他の適当な宿主細胞および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび生産物の生産および精製に関する方法の選択は、既知の技法を参考することにより当業者により行われることができる。例えば中でもＧｅｔｈｉｎｇ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８１ Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５を参照にされたい。

典型的には宿主細胞は発現に十分な期間、培養条件下で維持される。培養条件は当該技術分野では周知であり、そしてイオン組成および濃度、温度、ｐＨ等を含む。典型的にはトランスフェクトした細胞を培養基中で培養条件下に維持する。種々の細胞型に適当な培地が当該技術分野では周知である。好適な態様では、温度は約２０℃〜約５０℃、より好ましくは約３０℃〜約４０℃、さらに一層好ましくは約３７℃である。

ｐＨは好ましくは約６．０の値から約８．０の値、より好ましくは約６．８の値から約７．８の値、そして最も好ましくは約７．４である。浸透圧は好ましくは１リットルあたり約２００ミリオスモル（ｍｏｓｍ／Ｌ）から約４００ｍｏｓｍ／Ｌであり、そしてより好ましくは約２９０ｍｏｓｍ／Ｌから約３１０ｍｏｓｍ／Ｌである。コードされたタンパク質のトランスフェクションおよび発現に必要な他の生物学的条件は、当該技術分野において周知である。

組換えＰ４バリアントタンパク質は、宿主細胞もしくはその膜、またはそれら細胞が培養された培地のいずれかから回収または集める。回収は組換えＰ４バリアントタンパク質を単離し、そして精製することを含んでなる。ポリペプチドに関する単離および精製技法は当該技術分野において周知であり、そして沈殿、濾過、クロマトグラフィー、電気泳動等のような手法を含む。

通常の組換え手段により生産された時、本発明のＰ４バリアントタンパク質は細胞またはその培地から、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティーおよびサイジング（ｓｉｚｉｎｇ）カラムクロマトグラフィー）、遠心、分別溶解を含む通例の方法により、あるいは精製またはタンパク質に関する他の標準的技法により、単離し、そして精製することができる。原核細胞からヘテロロガスなタンパク質を精製するために幾つかの技術が存在する。米国特許第４，５１８，５２６号；同第４，５９９，１９７号；および同第４，７３４，３６２号明細書を参照にされたい。しかし生産された精製調製物は、ヒトに対して有害となる宿主毒素を実質的に含むべきではない。特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のようなグラム陰性バクテリア宿主細胞で発現された時、精製されたペプチドまたはタンパク質は実質的にエンドトキシンの混入があってはならない。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、モレキュラークローニング．ア ラボラトリーマニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク（１９８９）を参照にされたい。

本発明の方法および組成物に使用するＰ４バリアントタンパク質は、本明細書に列挙する具体的な例示方法の生成物に限定されない。実際にはタンパク質は直前に引用した教科書の方法により、あるいは本明細書のいたる所に引用した教科書の方法により調製することができる。そのような使用のために組換え的または合成的にタンパク質組成物を単離し、そして生産することは、当業者の技術範囲である。生成した組成物は任意の数の自由選択の免疫原を用いて免疫原組成物に配合され、そして以下の実施例に記載するＢＣアッセイのようなインビボアッセイにより効力をスクリーニングされる。あるいは上記のように調製されたタンパク質および／またはヌクレオチド分子は、診断アッセイに有用である。
Ｄ．本発明の免疫原組成物
本発明のＰ４バリアントタンパク質およびそれらをコードする核酸分子は、型別不能なインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対する防御免疫応答を誘導するために、種々の免疫原組成物に使用することができる。そのような免疫原組成物は、急性中耳炎およびＮＴＨｉにより引き起こされる他の疾患に対する感受性を防止または減少するために使用することができる。免疫原組成物は小児または成人を中耳炎に対して全身的に免疫感作するために有用であり、またはそれらは中耳炎にかかる危険がある小児（例えば耳感染の病歴のある小児）に有用となり得る。

これらＮＴＨｉのバリアントＰ４タンパク質は、Ｐ４タンパク質をコードするｈｅｌ遺伝子がインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の株内または間で抗原的に保存されているので、ｂ型インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のような種々の型別可能なインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対する免疫原組成物に含めることにも適する。

そのような免疫原組成物は、単価または多価ワクチンとして配合することができる。そのような組成物は、Ｐ４バリアントタンパク質またはタンパク質自体をコードする核酸分子に加えて、他の抗原または他の抗原を発現するヌクレオチド分子を含む。本発明の免疫原組成物に使用するためのそのようなさらなる抗原には、他の抗原のＢまたはＴ細胞エピトープを含む。本発明のＰ４バリアントタンパク質と同時投与するためのそのような「他の抗原」の中には、限定するわけではないがインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の他の外膜タンパク質（またはそのエピトープを有するペプチドもしくはタンパク質）のようなインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の他の抗原を含む。インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のそのような外膜タンパク質には、１５，０００ダルトンのペプチドグリカン−結合外膜リポタンパク質（ＰＡＬ）および１５，０００ダルトンのヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）リポタンパク質ＰＣＰ（Ｄｅｉｃｈ，Ｒ．Ａ，ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０（２）：４８９−４９８）を含む。「他の」抗原にはまた、ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）のようなインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のオリゴ−もしくはポリサッカリド莢膜成分、あるいはインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）または他の微生物のリポポリサッカリド、リポオリゴサッカリドもしくはリポサッカリド成分を含む。本発明の免疫原組成物に含むことができるさらなる「他の」抗原には、他の微生物（例えば莢膜を持つ、もしくは莢膜を持たない、バクテリア、ウイルス、真菌および寄生体）の抗原を含む。例えば肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（限定するわけではないが１以上の既知の肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のポリペプチド、リポポリサッカリド−タンパク質結合物およびポリサッカリド−タンパク質結合物を含み、限定するわけではないが現在入手可能な２３価の肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）莢膜ポリサッカリドワクチン、および７価の肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）−ポリサッカリド−タンパク質結合物ワクチンを含む）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ａ群、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、呼吸合胞体ウイルスおよびモラクセーラ カターリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）（限定するわけではないが、ＵｓｐＡ１、ＵｓｐＡ２、Ｂ１、Ｃ／Ｄ、Ｅおよび７４ｋＤａタンパク質を含む）のような中耳炎に関係する他の微生物の抗原を、本発明の免疫原組成物に含めることができる。
１．免疫原組成物中のＰ４バリアントタンパク質の使用
Ｐ４バリアントタンパク質は、防御免疫応答の誘導のために望ましくは免疫原組成物に配合される。すなわち１つの態様では本発明の免疫原組成物は上記の１以上のＰ４バリアントタンパク質を、製薬学的に許容され得る担体中に含む。そのような製剤は滅菌水または滅菌した等張塩溶液のような製薬学的に許容され得る担体と組み合わせたＰ４バリアントタンパク質を含んでなる。本明細書で使用する「製薬学的に許容され得る担体」という用語は、ヒトへの投与に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒質、コーティング、抗バクテリア性および抗菌・カビ剤、等張性および吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は当業者には明白であり、そしてその大部分が投与経路に依存する。

製剤には限定するわけではないが、懸濁液、溶液、油性もしくは水性賦形剤中の乳液、ペーストおよび移植可能な徐放性または生分解性製剤を含む。そのような製剤はさらに限定するわけではないが、沈殿防止剤、安定化剤または分散剤を含む１以上のさらなる成分を含んでなることができる。非経口投与用製剤の１態様では有効成分は、再構成された組成物の非経口投与に先立ち、適当な賦形剤（例えば滅菌した、発熱物質を含まない水）で再構成されるために、乾燥（例えば粉末もしくは顆粒状）状態で提供される。有用である他の非経口的に投与可能な製剤は、微晶質状で、リポソーム調製物中に、または生分解性ポリマー系の成分として有効成分を含んでなるものを含む。徐放性または移植用組成物は、乳剤、イオン交換樹脂、溶解し難いポリマーまたは溶解し難い塩のような製薬学的に許容されるポリマー性または疎水性材料を含んでなることができる。

さらに本発明のタンパク質免疫原組成物に存在することができるさらなる成分は、アジュバント、保存剤、化学安定剤、または他の抗原性タンパク質である。典型的には安定化剤、アジュバントおよび保存剤は、標的とするヒトまたは動物における効力について最高の製剤を決定するために至適化される。適切な保存剤の例にはクロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを含む。使用できる適切な安定化成分には、例えばカザミノ酸、シュクロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ−Ｚアミン、二リン酸一カリウム、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解物、および乾燥ミルクを含む。

免疫応答を強化するために通常のアジュバントを使用する。そのようなアジュバントには中でも、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ；コリキサ（Ｃｏｒｉｘａ）、ハミルトン、モンタナ州）を含み、これは引用により本明細書に編入する米国特許第４，９１２，０９４号明細書に記載されている。

またアジュバントとして適するのは、アミノアルキル グルコサミン ホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体または類似体であり、これはコリキサ（ハミルトン、モンタナ州）から入手可能であり、そして引用により本明細書に編入する米国特許第６，１１３，９１８号明細書に記載されている。１つのそのようなＡＧＰは、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−エチル ２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、これは５２９（正式にはＲＣ５２９として知られている）としても知られている。この５２９アジュバントは、水性状態または安定な乳剤として配合される。

他のアジュバントには鉱物油および水エマルジョン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム等のようなアルミニウム塩（ａｌｕｍ）、例えばＡｍｐｈｉｇｅｎ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ、Ｌ１２１／スクワレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グルコシド、プルロニックポリオール、ムラミルジペプチド、死んだボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、引用により本明細書に編入する米国特許第５，０５７，５４０号明細書に記載されたＱｕｉｌＡまたはＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１（アンチジェニックス（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ）、フラミンガム、マサチューセッツ州）のようなサポニン、およびＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激複合体）のようなそれらから生成された粒子、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、バクテリアのリポポリサッカリド、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドのような合成ポリヌクレオチド（引用により本明細書に編入する米国特許第６，２０７，６４６号明細書）、コレラ毒素（野生型または変異体形のいずれか、例えば引用により本明細書に編入する国際公開第００／１８４３４号パンフレットに従いアミノ酸２９位のグルタミン酸が別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンに置換されている）、百日咳菌毒素（ＰＴ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱−不安定性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９；例えば引用により本明細書に編入する国際公開第９３／１３３０２号および同第９２／１９２６５号パンフレットを参照にされたい）を含む。種々のサイトカインおよびリンホカインはアジュバントとしての使用に有用である。そのようなアジュバントの１つは顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり、これは引用により本明細書に編入する米国特許第５，０７８，９９６号明細書に記載されたヌクレオチド配列を有する。ＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡを含有するプラスミドが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換され、そして２０１１０−２２０９、バージニア州、マナッサス、１０８０１のブルヴァール大学のアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号３９９００で寄託された。サイトカインインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、引用により本明細書に編入する米国特許第５，７２３，１２７号明細書に記載された別のアジュバントである。他のサイトカインまたはリンホカインは免疫調節活性を有することが示され、それらには限定するわけではないが、インターロイキン−１−アルファ、１−ベータ、２、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８、インターフェロン−アルファ、ベータおよびガンマ、顆粒球コロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子アルファおよびベータを含み、そしてアジュバントとして使用するために適する。

他の適当なアジュバントには限定するわけではないが：表面活性物質（例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リソレシチン、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブロミド）、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール；ポリアミン、例えばピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、カルボポール；ペプチド、例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、ツフシン；油乳剤；および鉱物ゲル、例えばリン酸アルミニウム等、および免疫刺激複合体を含む。免疫原はワクチン製剤で使用するために、リポソームに包含されてもよく、またはポリサッカリド、リポポリサッカリドおよび／または他のポリマーに結合されてもよい。

上記のように、さらなる免疫原成分は上記のような１以上の自由選択のさらなる抗原を含むことができる。他の外膜タンパク質のエピトープと合わせて投与するために、Ｐ４バリアントタンパク質は１以上の抗原との混合物中で別個に存在するか、あるいは多くの外膜タンパク質決定基または多くの抗原決定基と、他のインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）または非インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）との結合物質として、または融合タンパク質として存在することができる。例えばインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＰＡＬおよびＰＣＰまたは任意のタンパク質、ペプチドまたはそれらに由来するエピトープは、本発明のＰ４バリアントタンパク質との混合物として、または結合物もしくは融合物として投与することができる。

本発明のＰ４バリアントタンパク質を単独で含むか、または記載した種々の組み合わせで含む免疫原組成物の配合において、免疫原は適当な濃度に調整され、そして任意の適当なアジュバントが配合される。幾つかの好適な態様では、本発明のタンパク質免疫原組成物は、例えば液体、粉末、エーロゾル、錠剤、カプセル、腸溶コート錠剤もしくはカプセル、または座薬の形態でヒト個体に投与するために調製される。
２．核酸分子を含む免疫原組成物
本発明の免疫原組成物の別の態様は、本発明のＰ４バリアントタンパク質をコードする核酸分子および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる。ＮＴＨｉに対する免疫原組成物に使用するためのＰ４バリアントタンパク質をコードする核酸配列は、等張塩水または等張塩溶液のような適切な製薬学的−または生理学的に許容され得る担体中に存在することができる。適切な担体は当業者には明らかであり、そして大部分が投与経路に依存する。

あるいはポリヌクレオチド分子からなる免疫原組成物は、望ましくは局所麻酔剤、ペプチド、カチオン性脂質を含む脂質、リポソームもしくは脂性粒子、ポリリシンのようなポリカチオン、デンドリマーのような分枝状の３次元的ポリカチオン、炭水化物、カチオン性両親媒化合物、界面活性剤、ベンジルアンモニウムサーファクタントのような自由選択のポリヌクレオチド促進剤もしくはいわゆる「共作用剤（ｃｏ−ａｇｅｎｔ）」、またはポリヌクレオチドを細胞に輸送し易くする別の化合物を含む。本発明に有用なそのような促進剤または共作用剤の非排他的例は、引用により本明細書に編入する米国特許第５，５９３，９７２号；同第５．７０３，０５５号；同第５，７３９，１１８号；同第５，８３７，５３３号明細書；１９９６年４月４日に公開された国際公開第９６／１００３８号パンフレット；および１９９４年８月８日に公開された国際公開第９４／１６７３７号パンフレットに記載されている。

最も好ましくは局所麻酔剤は核酸分子と１以上の複合体を形成する量で存在する。局所麻酔剤を本発明の核酸分子またはプラスミドと混合する時、これはＤＮＡを包む種々の小さい複合体または粒子を形成し、そして均一である。このように本発明の免疫原組成物の１態様では、局所麻酔剤および本発明の少なくとも１つのプラスミドを混合することにより複合体が形成される。この混合物から生じる任意の単一複合体は、異なるプラスミドの様々な組み合わせを含むことができる。

あるいは本発明の組成物の別の態様では、すべてのプラスミドが単回のボーラス投与で投与される場合、局所麻酔剤を各プラスミドと前以て別々に混合し、次いで別個の混合物を１つの組成物に合わせて、所望の比率のプラスミドが単一の免疫原組成物に存在することを確実にすることができる。あるいは局所麻酔剤および各プラスミドを別々に混合し、そして所望の比率を得るために別々に投与する。今後「複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）」または「１以上の複合体（複数）」または「複合体（複数）」という用語が免疫原組成物のこの態様を定義する場合、この用語は１以上の複合体（複数）を包含すると理解され、各複合体はＰ４バリアントタンパク質をコードするプラスミドの混合物、または別々に形成された複合体（複数）の混合物（ここで各複合体は唯一の型のプラスミドを含む）、または複合体（複数）の１つもしくは混合物（ここで各複合体はポリシストロン性ＤＮＡを含む）を含む。

好ましくは複合体（複数）は直径が約５０から約１５０ｎｍの間である。使用する促進剤が局所麻酔剤の時、好ましくはブピバカインである時、ポリヌクレオチド組成物の総重量に基づき約０．１重量パーセント〜約１．０重量パーセントの量が好適である。引用により本明細書に編入する国際公開第９９／２１５９１号パンフレットも参照にされたい、そしてこれは共作用剤としてベンジルアンモニウムサーファクタントの包含も教示し、好ましくは約０．００１から０．０３重量％の間の量で投与される。本発明に従い、該核酸分子に対する局所麻酔剤の量は、１〜１０μｇ／ｍｌの核酸に対して０．０１〜２．５重量／容量％の局所麻酔剤の比率で存在する。別のそのような範囲は１００μｇ／ｍｌ〜１ｍｌ／ｍｌの核酸に対して０．０５〜１．２５重量／容量％の局所麻酔剤である。

このポリヌクレオチド免疫感作手順では、本発明のバリアントＰ４タンパク質はインビボの一過性基準で発現される；宿主の染色体に挿入または組込まれる遺伝物質はない。この手順は、問題の遺伝物質を染色体に挿入または組込むことを目標とする遺伝子治療とは区別される。アッセイを使用して、免疫感作により投与されるポリヌクレオチドが宿主に形質転換した表現型を生じないことを確認する（米国特許第６，１６８，９１８号明細書）。

免疫原組成物は、組成物の選択した投与様式に適する他の添加剤を含むこともできる。本発明の組成物は、粉末、液体または懸濁液の剤形を開発するために、他の製薬学的に許容され得る補形剤と使用することができる凍結乾燥したポリヌクレオチドも含むことができる。例えばレミングトン：製薬学の科学および実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２巻、第１９版（１９９５）、例えば第９５章のエーロゾル：および国際公開第９９／４５９６６号パンフレットを参照にされたい、これらの教示は引用により本明細書に編入する。これら組成物の投与経路は、所望により組み合わせ、または適合させることができる。

場合により、上記のようにこれら核酸分子を含有する免疫原組成物は、１以上の上記の「さらなる」抗原をコードする核酸配列を含むことができる。例えば個々の抗原をコードする個々のヌクレオチド分子は、Ｐ４バリアントタンパク質をコードする配列を含むヌクレオチド分子と混合することができる。あるいはＰ４バリアントタンパク質をコードする配列は、他のインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の１以上の抗原、または他のバクテリア、ウイルス、寄生体または真菌の抗原をコードするＤＮＡ配列に融合させて、遺伝的に融合した（共通するペプチド骨格を共有する）多価抗原を作成することができる。

これらの核酸分子を含有する免疫原組成物は、任意の通例の投与経路を介して投与するために適する添加剤を含むことができる。幾つかの好適な態様では、本発明の免疫原組成物は、例えば液体、粉末、エーロゾル、錠剤、カプセル、腸溶性コート錠剤もしくはカプセルまたは座薬の形態でヒト個体に投与するために調製される。
３．組換えウイルスを含む免疫原組成物
本発明のさらなる観点では、免疫原組成物はＰ４バリアントタンパク質（および／または任意のさらなる免疫原）を発現することができる組換えウイルスを含むことができる。本発明の核酸分子を宿主細胞に運ぶために工作することができる適当な非病原性ウイルスには、ワクシニアのようなポックスウイルス、アデノウイルス、アデノ−随伴ウイルス、カナリポックスウイルス、レトロウイルス等を含む。好ましくは投与のために、ウイルスはＥ１−欠失アデノウイルスのような非複製ウイルスであり、それらは典型的には遺伝子治療で使用されている。例えば中でも米国特許第５，６９８，２０２号明細書に記載されている組換え複製欠損アデノウイルスを参照にされたい。そのような多数の非病原性ウイルスは通常、ヒトの遺伝子治療および他のワクチン剤のキャリアーとして使用され、そして当業者には知られており、そして選択されることができる。

好ましくは本発明のＰ４バリアントタンパク質をコードする核酸配列を持つ非複製ウイルスは、生物学的に適合性がある溶液または製薬学的に許容され得る送達賦形剤に懸濁される。適当な賦形剤は滅菌塩水である。製薬学的に許容され得るキャリアーであると知られ、そして当業者に周知な他の水性および非水性の等張滅菌注入溶液、および水性および非水性の滅菌懸濁液をこの目的に使用することができる。

場合により本発明のこの種の免疫原組成物は、上に挙げた例えばアジュバント、安定化剤、ｐＨ調整剤、保存剤を含む他の成分を含むように配合してもよい。そのような成分はワクチン分野の当業者には周知である。

さらに本発明による免疫原組成物に適する態様は、不活化された免疫原組成物の使用であり、例えば所望のＰ４バリアントタンパク質を発現する大量の組換えウイルスを培養で成長させて、必要量の関連抗原を提供し、そして通例の手段により不活化する。種々のエピトープを発現する不活化されたウイルスの混合物は、引用により本明細書に編入する米国特許第５，７８０，６０１号明細書に記載されているような「多価」免疫原組成物の製剤に使用することができる。この免疫原組成物は抗原に対する免疫学的応答を強化するために、上記のような適当なアジュバントも含むべきである。
４．共生バクテリアを含有する免疫原組成物
本発明のさらに別の観点では、Ｐ４バリアントタンパク質（任意の融合タンパク質および／またはさらなる抗原を含む）をコードする本発明の合成核酸分子は、非病原性微生物に包含することができる。生成した微生物は、ヒト宿主に投与した時、インビボで発現し、そして発現した本発明の組成物を増強して特異的な抗体の形成を誘導する。例えば本発明のＰ４バリアントタンパク質をコードする分子を運ぶために使用することができ、そして患者に投与するために有用な非病原性の共生バクテリアは、通常の方法論を使用して調製することができ、そして既知の非病原性微生物から選択することができる。本発明の核酸分子の患者のインビボへの外的送達に有用となり得る共生バクテリアの中には、限定するわけではないが連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の種々の株、例えばＳ．ゴルドニー（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）を含む。

上記のような本発明の免疫原組成物は、従来の生理学的に許容され得る担体、アジュバント、または上記の種類の製薬学的調製物に有用な他の材料の選択により限定されることはない。上記の成分から、適切なｐＨ等張性、安定性および他の通例の特性を有するこれらの製薬学的に許容される組成物の調製は、当該技術分野の範囲内である。
Ｅ．使用法
上記の免疫原組成物は、型別不能なインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対してヒトの免疫応答を誘導する方法に使用することができる。この方法の１つの態様では、有効量の上記Ｐ４バリアントタンパク質の免疫原組成物を患者に投与する。組成物中のＰ４タンパク質、Ｐ４バリアントを発現する核酸分子、またはＰ４バリアントを発現する組換えウイルスの量は、ＮＴＨｉに対する免疫応答を誘導するために効果的な量である。好ましくは免疫応答はＮＴＨｉ感染に対して防御的である。

本発明の免疫原組成物の投与経路には、限定するわけではないが非経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸投与、膣投与等を含む。すべてのそのような経路はこれら組成物の投与に適している。適切な経路は、使用する免疫原組成物の性質、および患者の年齢、体重、性別および一般的健康状態の評価、および免疫原組成物中に存在する抗原、および担当医師により同様な因子に依存して選択される。

一般に、本発明の免疫原組成物に関して適切な「有効量」または投薬用量の選択は、使用する特定の免疫原組成物、ならびに最も特別には免疫感作する個体の一般的な健康状態および体重を含む個体の身体状態に基づく。そのような選択および有効用量の上方または下方調整は、当該技術の範囲内である。免疫応答、好ましくは防御応答を誘導するために、あるいは有意な悪い副作用無しに患者に外的効果を生じるために必要な活性成分の量は、使用する製薬学的組成物および（タンパク質を含有する組成物用の）アジュバントの任意の存在により変動する。

１つの態様では、タンパク質成分、例えば上記Ｐ４バリアントタンパク質または融合タンパク質を含む組成物について、各用量は１ｍＬの滅菌溶液あたり約１μｇから約２０ｍｇの間のタンパク質免疫原を含んでなる。他の投薬用量範囲も当業者により企図され得る。初期用量に続いて、場合により望ましい場合には追加投与することができる。

別の態様では、ＤＮＡおよびベクター組成物中のヌクレオチド分子の量は当業者により選択され、そして調整され得る。１つの態様では各用量は、１ｍＬの滅菌溶液あたり約５０μｇから約１ｍｇの間の免疫原をコードする核酸、例えばＤＮＡプラスミドを含んでなる。

本発明のＰ４バリアントタンパク質をコードする核酸分子を含む組換え体、好ましくは複製欠損ウイルスについて、「有効量」は個体の所望する細胞をトランスフェクトするための投与経路において効果的で、そして有益、すなわち防御免疫を提供するために選択した遺伝子の十分な発現レベルを提供する組換えウイルスの量である。免疫のレベルは、もしあれば追加免疫についての必要性を決定するためにモニタリングすることができる。しかし当業者はそのような投薬用量を、組換えウイルスの同一性および免疫原の構成（すなわち、組換えウイルスが宿主に送達するさらなるＰ４バリアントタンパク質または「他の抗原」の存在）に依存して改変することができると考えられる。

患者に送達されるＰ４バリアントタンパク質を発現する核酸配列を持つ共生バクテリアの量は、一般に約１０^３から約１０^１２細胞／ｋｇの間の範囲である。これらの投薬用量は、使用するバクテリアおよび生きているバクテリアにより宿主に送達されるさらなるＰ４バリアントタンパク質または「他の抗原」に依存して、当業者により改変され得る。
Ｆ．キャリアータンパク質としてのＰ４バリアントの使用
Ｐ４バリアントタンパク質の１次免疫原としての用途に加えて、Ｐ４バリアントタンパク質は、他の抗原の免疫原性を付加、または強化するためにキャリアータンパク質として使用することができ、ここで他の抗原はタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、サッカリド、リポポリサッカリド、リポオリゴポリサッカリドまたはリポサッカリドであることができる。バリアントＰ４タンパク質は野生型Ｐ４タンパク質に比べて減少した酵素活性を有するが、Ｐ４バリアントキャリアータンパク質が配列番号３のアミノ酸１２２位にフェニルアラニンを持たない限り、必ずしも野生型Ｐ４タンパク質に対する抗体を誘導するか、またはＮＴＨｉに対する殺バクテリア活性を有する必要はない。例えばＰ４バリアントタンパク質は、通例の手段によりポリサッカリドまたはリポポリサッカリドに化学的に結合するか、または他のタンパク質との融合タンパク質として発現される。
Ｇ．診断アッセイ
場合により免疫複合体またはＤＮＡハイブリダイゼーションの形成を検出することができる、検出可能な標識または成分と結合した本発明のＰ４バリアントタンパク質および核酸分子は、種々の組織および体液、例えば血液、脊髄液、痰等の中の型別不能なインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）を検出するためのアッセイに抗原としても使用することもできる。これらのアッセイおよびアッセイ形式は通例であり、そして米国特許第５，７８０，６０１号明細書に記載された、野生型Ｐ４試薬の使用について記載された形式と同じである。

例えば本発明のＰ４バリアントタンパク質は、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、「サンドイッチ」アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集反応アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイおよび免疫電気泳動アッセイにおける試薬として使用することができる。本発明のＰ４バリアントタンパク質は、場合により検出可能な標識と結合している。

本発明のＰ４バリアントタンパク質をコードする核酸分子またはそれとハイブリダイズする任意のヌクレオチド配列も、患者の種々の組織または体液中の型別不能なインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）を検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイにプローブとして使用することができる。適当なハイブリダイゼーションアッセイには限定するわけではないが、とりわけサザンブロット、ノーザンブロットおよびコロニーブロットを含む。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、アッセイの要件に依存して変動し得る。

適当な検出可能な標識には、限定するわけではないが、単独または他の分子もしくはタンパク質と協調して作用して、直接的もしくは間接的のいずれかで検出可能なシグナルを提供することができるタンパク質または小化学分子を含む。例えば検出可能な標識は、蛍光標識、発光標識、放射性標識または化学発光標識であることができる。標識は基質と相互作用して検出可能なシグナルを生成する酵素であることもできる。例えば、蛍光プローブおよび研究用化学物質のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、第６版、Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、モレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）社、ユージーン、オレゴン州（１９９６）；米国特許第４，５４２，１０４号および同第５，２７２，２５７号明細書を参照にされたい。さらに別の標識には緑色蛍光タンパク質および青色蛍光タンパク質を含む。核酸分子に適当な標識には、ｌｕｘ−遺伝子、ベータ−ラクタマーゼ、ガラクトシダーゼ酵素、例えばベータ−−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ酵素またはグルコナーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列であることができる。

任意の数のさらなる、そして通常使用されているマーカー系を、本発明のＰ４バリアントタンパク質および／またはＰ４バリアントタンパク質をコードする核酸配列との結合に適合させることができる。

当業者は、標識系の選択および／または実施には日常的な実験を含むだけであると理解する。
［実施例］
以下の実施例は、本発明の代表的なＰ４バリアントタンパク質の生産および活性を具体的に説明するために提供する。ここに提示する実施例は、Ｐ４バリアントタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド分子の構築、宿主細胞中での組換え発現、およびそれらからの精製を示す。精製されたタンパク質は感度のある比色アッセイで酵素活性について分析された。タンパク質は野生型ｒＬＰ４と一緒にスイス−ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔａｒ）マウスを免疫感作するためにも使用し、そして生成した抗血清を野生型ｒＬＰ４に対する全ＩｇＧ抗体、およびＮＴＨｉに対する殺バクテリア活性について分析した。これらの実験は、どのＰ４の変異体が酵素活性を欠いているかを決定すると同時に、保持している野生型免疫原性および機能的抗体の誘導が自明（ｔｒｉｖｉａｌ）の問題ではないことを証明する。以下のように構築した３種の変異体Ｐ４タンパク質は、所望の免疫原特性を保有し、すなわち野生型Ｐ４に対する高いＥＬＩＳＡ力価およびＮＴＨｉに対する高レベルの殺バクテリア抗体を誘導する。当業者は以下の実施例で具体的な試薬および条件が概略されているが、これらの試薬および条件は本発明を限定しないと考えるだろう。

Ｐ４遺伝子の位置指定突然変異誘発法
バクテリアの酸性ホスファターゼは長年にわたり十分に研究され、そしてそれらの基質特異性、細胞の局在化等に基づき多数のクラスに分類された（Ｔｈａｌｌｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．，７：１６４７−５２．９）。多数のバクテリアの酸性ホスファターゼ間で高度に保存されたアミノ酸を含む領域が、酵素活性を排除または減少させるための位置指定突然変異誘発法の見込み領域として同定され、そして保存的変化を作成することにより３次構造を維持する。

位置指定突然変異誘発法は、合成プライマーを使用してＢｓｍＢ１部位を導入した後に野生型Ｐ４について行い、そして所望の突然変異は以下に記載する通りであった。 ＢｓｍＢ１による消化および再連結により、ＢｓｍＢ１部位を同時に失った所望の変異体Ｐ４配列を生じた。これらの脂質化された変異体タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＲ宿主細胞中で発現され、そして脂質化された野生型ｒＬＰ４を精製するために使用した標準法のわずかな変更により精製した。

具体的には二重アスパラギン酸部位指定変異体を、野生型Ｐ４タンパク質中の２つのアスパラギン酸残基がホスファターゼ活性に重要となる情報に基づき構築した。Ｐ４−３５１と命名した変異体を構築し、ここで配列番号３のＡｓｐ６４およびＡｓｐ６６位のアミノ酸残基をＡｌａ６４およびＡｌａ６６Ａに変えた。Ｐ４−Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８５Ａと命名した別の変異体を構築し、ここで配列番号３の野生型Ａｓｐ１８４およびＡｓｐ１８５を、Ａｌａ１８４およびＡｌａ１８５に突然変異させた。別の変異体では、配列番号３のアミノ酸残基３５および３７の位置指定突然変異誘発法により４種のタンパク質を生じ、アラニン酸残基をグルタミン酸（Ａ３５Ｇ、Ａ３７Ｑ）、トレオニン（Ａ３５Ｔ、Ａ３７Ｔ）、アスパラギン（Ａ３５Ｄ、Ａ３７Ｄ）またはグルタミン（Ａ３５Ｑ、Ａ３７Ｑ）に変えた。これらの変異体を構築して、ＡｓｐからＡｌａ以外の別の領域の変化がタンパク質分子の立体配座的破壊が無い、すなわち野生型Ｐ４に対してより良い免疫原性をもたらすかどうかを決定した。

さらに以下のＰ４タンパク質中の単一突然変異を作成し、Ｐ４バリアントタンパク質Ｎ２１８Ｑ、Ｋ１６１Ｒ、Ｄ６４Ｅ、Ｙ１２２Ｆ、Ｄ６４Ｎ、Ｄ６４ＥおよびＱ３９Ｅを生成した。加えて、４８位のＰｈｅ残基をＣｙｓ残基に変えた。この残基は推定上のヘミン結合ドメイン中のその位置に基づく突然変異誘発法のために選択した。

この種々の発現された変異体タンパク質は、表１に同定されるように生産された。

Ｆ４８ＣおよびＤ６４Ａ、Ｄ６６Ａを除くすべての位置指定変異体は、アラビノースプロモーターの制御下に型別不能なインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＮＴＨｉ）Ｐ４遺伝子（Ｇｒｅｅｎ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９：３１９１−３１９８）を含むプラスミドｐＬＰ３３９、ｐＢＡＤ１８Ｃａｍ発現ベクターから誘導された。変異体タンパク質Ｄ６４Ａ、Ｄ６６ＡおよびＦ４８ＣはプラスミドｐＨｅｌ３（Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９、上記）から誘導された。

ほとんどの位置指定変異体タンパク質はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して、製造元の指示に従い構築した。Ｐ４突然変異を構築するために使用したプライマーを以下の表２に列挙する。本明細書で使用したオリゴヌクレオチドプライマー（Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９、上記により使用されたものを除く）は、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓオリゴヌクレオチド合成器（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスターシティ、カリフォルニア州）で、β−シアノエチルホルホラアミダイト化学を使用して合成した。

ＢｓｍＢＩシームレス（ｓｅａｍｌｅｓｓ）クローニングを使用して、幾つかのＰ４変異体を生成した。Ｐ４遺伝子の区画をプラスミドｐＬＰ３３９からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＰＥ２４００熱循環器、アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）により増幅した。最初にＢｓｍＢＩ部位および所望の突然変異を含むプライマーを、適切なベクタープライマーと対合させ、そしてＰ４遺伝子の区画を増幅させるために使用した。さらにＢｓｍＢＩ部位を含む第２プライマーを、適切なベクタープライマーと対合させ、そしてＰ４遺伝子の残りの区画を増幅させるために使用した。Ｐ４遺伝子の各区画を連結し、そしてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にクローン化した。

形質転換体は挿入の存在についてＰＣＲでスクリーニングし、そして配列分析により確認した。正しいクローンをＢｓｍＢＩおよびＳａｃＩまたはＳｐｈＩ（制限酵素はニューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）から供給された）で制限消化し、そして挿入物は低融点アガロースゲルにより精製した。ゲル精製した断片をＢｓｍＢＩ部位で一緒にシームレス的に連結した。

ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化された突然変異したＰ４遺伝子は、Ｆ４８Ｃ遺伝子での発現を除き、ＳａｃＩ−ＳｐｈＩ部位を使用して変異体Ｐ４タンパク質を発現させるために、ｐＢＡＤ１８Ｃａｍ（インビトロジェン）にサブクローン化した。Ｆ４８Ｃ配列はＮｈｅＩ−ＳａｃＩ部位を使用してｐＢＡＤ１８Ｃａｍにサブクローン化した。

脂質化組換え変異体Ｐ４タンパク質の発現
これら変異体Ｐ４タンパク質を含むプラスミドを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＲ株で形質転換させ、そしてすべての変異体Ｐ４タンパク質をその中で組換え的に発現させた。クローンはＰ４遺伝子のシークエンシングにより確認した。適切なプラスミドを含むＢＬＲの一晩のカルチャーは、０．０５％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＮａＰＯ_４で緩衝化したＨｙ−Ｓｏｙ培地で、３７℃にて通気しながら成長させた。グルコースを含まない同じ培地を含むフラスコに、１：２０希釈の一晩のカルチャーを接種し、そして３７℃にて通気しながらＯＤ_６００が約２．０になるまでインキューベーションした。ついでバクテリアは０．５％アラビノースを用いて誘導し、そしてインキューベーションを３時間続行した。バクテリア細胞は１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心することにより回収し、そして細胞ペレットは１回、ＰＢＳで洗浄した。細胞を再度ペレットとし、そして−２０℃で凍結した。Ｐ４タンパク質の発現は１２％ゲルを使用した全細胞ライゼートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により検査した。

脂質化組換えＰ４および変異体の精製
次いでＰ４変異体タンパク質を以下のように精製した：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を低張性のバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡ）に懸濁し、そして細胞懸濁液をミクロ流動化装置に通すことにより高圧（約１８，０００ｐｓｉ）下で分解した。膜は、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）の４５Ｔｉローター中で１０℃で３００，０００×ｇにて１時間、超遠心した後に得た。内側または外側の膜タンパク質は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２中の １（重量／容量）％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、５ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡ中の１（重量／容量）％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２をそれぞれ用いた順次抽出により、差別的に可溶化した。Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２は可溶化されたｒＬＰ４または変異体タンパク質を抽出する。

問題のタンパク質は縦列のイオン交換カラム（ＤＥＡＥ＆ＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を用いた分画により精製した。ｒＬＰ４タンパク質はＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅから０〜０．２Ｍの塩勾配で、１形および２形と命名した２つのピークとして溶出する。２形は、１０ｍＭ リン酸Ｎａ、ｐＨ７．１、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２のバッファー中でのゆっくりとした凍結、続いてＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ−Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２バッファー、ｐＨ８に対する透析により、１形に転換する。転換された１形はさらにＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで精製する。ｒＬＰ４−変異体は、突然変異がタンパク質のｐＩの下げる場合を除き、野生型タンパク質と同じ方法により精製された。このような場合は、抽出後、縦列カラム工程の前にバッファーを１０ｍＭ ＨｅＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、１（重量／容量）％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２に変えた。このバッファーはＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの溶出にも使用された。ほとんどのｒＬＰ４変異体がタンパク質の単一ピークで溶出した。タンパク質はビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）アッセイを使用して、製造元（ピアス）の指示に従いアッセイした。

ホスファターゼ活性に関するアッセイ
次いで精製したＰ４変異体タンパク質は、感受性の流体相アッセイで酵素活性について調査した。ｒＬＰ４のホスホモノエステラーゼ活性を、本質的に上に引用したＲｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．１９９９により記載された比色アッセイにより、野生型ｒＬＰ４と比べて測定した。１（重量／容量）％ＴｒｉｔｏｎＸ１００をアッセイバッファーに加えて、ｒＬＰ４の活性を強化した。生産されたナノモル量のｐ−ニトロフェノールは４１０ｎｍの吸収を、ｐ−ニトロフェノールの標準曲線の吸収と比較することにより決定した。１単位の酵素活性は、３７℃で１分間あたり１マイクロモルの基質を生成物に転換するために必要な量と定めた。比活性は１ｍｇのタンパク質あたり酵素の単位数と定めた。結果はまた野生型活性の％としても表す。結果を表３に示す。

バクテリアの酸性ホスファターゼ間の保存について選択したＰ４の特異的残基に作成したすべての変化は、Ｙ１２２Ｆ突然変異を除いてほとんど完全にＰ４の酵素活性を除去した。試験した残りの変異体の中で、Ｑ３９Ｅ変異体のみが野生型活性の＞１％を保持するが（３．３％）、二重変異体は検出可能な活性をもたない。

これらの結果は、バクテリアの酸性ホスファターゼ間で保存されたＰ４の領域内の荷電および３次構造が、酵素機能に必須であることを示す。変化が保存的Ａｓｐ残基で作成された時、Ａｓｐ残基のＧｌｕ残基への変化のような保存的変化でも酵素活性はほぼ完全に排除された。

Ｙ１２２ＦおよびＱ３９Ｅ変異体を除いて、発明者は部分的に減少された酵素活性のみを持つ変異体を検出しなかった。ほとんどすべての突然変異が、ほぼ完全に活性を除去した。Ｆ４８をシステインまたはセリン残基に変える突然変異も、酵素活性を減少させた。

脂質化ＲＬＰ４変異体タンパク質に対する抗血清の生産
次いで変異体Ｐ４タンパク質を、モノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）との反応性、および野生型Ｐ４に対して高力価の生物学的に活性な抗血清を誘導する能力についてアッセイした。
Ａ．免疫感作手順
メスのスイス ウェブスターマウス（６〜８週齢）に、塩水もしくはＰＢＳ中で１００μｇのＭＰＬ（商標）アジュバントと混合した１５μｇの野生型または変異体Ｐ４タンパク質を皮下に免疫感作した。組成物は保存剤として０．０１％のチメロサールも含んだ。２種類の免疫感作を４週間離して行い、そして最後の採血は６週目に行った。０週および６週の血清は、ＥＬＩＳＡアッセイにより個別に、またはプールとして分析し、そして殺バクテリア活性についてはプールとして分析した。
Ｂ．酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
抗−Ｐ４（野生型および変異体）抗体は、以下のように測定した。プレートに、ＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍｌの野生型Ｐ４または１２μｇ／ｍｌの変異体Ｐ４をコートした。９０分／３７℃のインキューベーション後、プレートは翌日まで４℃に保存した。変異体Ｐ４をコートしたプレートは、スキムミルクでブロックした。洗浄後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１：５０から１：５，４６７，５００の最終濃度に順次希釈した血清の１００μｌのアリコートを各ウェルに加え、そして室温で２時間インキューベーションした。プレートを洗浄し、そして１００μｌの２次抗体（アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１：５，０００に希釈）を加え、そして室温で２時間インキューベーションした。

洗浄後、結合した抗体を、ジエタノールアミン中で１ｍｇ／ｍｌに希釈した基質ｐＮＰＰ（ｐ−ニトロフェノールホスフェート）により検出した。１時間後、黄色を４０５ｎｍで読んで６０５ｎｍを参照とした。各反応は２連で行い、そして結果を平均した。血清の抗−Ｐ４力価は、４−パラメーター曲線上に０．１の吸収を与える血清の希釈として算出した。
Ｃ．全細胞ＥＬＩＳＡ
ＮＴＨｉのＰ８６０２９５株を、チョコレートアガー（ｃｈｏｃｏｌａｔｅ ａｇａｒ）プレート上で６時間成長させ、そしてＰＢＳ中に回収した。細胞懸濁液を６２０ｎｍで定めた０．２のＯ．Ｄ．に希釈し、そして７５μｌをＮＵＮＣポリソーブ（ｐｏｌｙｓｏｒｂ）プレートに分配した。プレートを３７℃で一晩乾燥させ、そして使用するまで室温に維持した。それらをＰＢＳ／５％スキムミルクでブロクックし、そして洗浄した後に１００μｌの希釈した血清（１：３６，４５０または１，０９３，５００の最終濃度のいずれかにＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／５％スキムミルク中で順次希釈した）を加えた。１時間／３７℃のインキューベーション後、プレートを洗浄し、そしてさらに１時間、３７℃で１００μｌの２次抗体（アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／５％スキムミルクで１：５，０００に希釈）とインキューベーションした。

プレートを再度洗浄し、そして結合した抗体をジエタノールアミン中で１ｍｇ／ｍｌに希釈した基質ｐＮＰＰ（ｐ−ニトロフェノールホスフェート）により検出した。１時間後、黄色を４０５ｎｍで読んで６０５ｎｍを参照とした。各反応は２連で行い、そして結果を平均した。血清の抗−全細胞力価は、４−パラメーター曲線上に０．１の吸収を与える血清の希釈として算出した。

表４は、非保存的突然変異を含んだ非酵素的に活性なＰ４変異体：Ｐ４−Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８５ＡおよびＰ４−Ｄ６４Ａ、Ｄ６６Ａに関するＥＬＩＳＡの結果を具体的に説明する。このＥＬＩＳＡデータは、これらの部位が酵素活性に関与し、そして免疫応答に重要であることを証明する。これら変異体タンパク質に対して作られた抗体は、変異体Ｐ４タンパク質が、自然なＰ４または野生型ｒＬＰ４よりも野生型ｒＬＰ４に対して有意に低い抗体力価を誘導することを示した。

表５は、Ｐ４変異体タンパク質：（Ａ３５Ｇ、Ａ３７Ｇ）、（Ａ３５Ｔ、Ａ３７Ｔ）、（Ａ３５Ｄ、Ａ３７Ｄ）または（Ａ３５Ｑ、Ａ３７Ｑ）に関するＥＬＩＳＡアッセイの結果を報告する。上記のように、これらタンパク質をコードする変異した遺伝子は、ｒＬＰ４（ｐＢＡＤ１８ｃａｍ）について使用するアラビノース発現ベクターに挿入し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＲで発現させ、精製し、そしてマウスを免疫感作するために使用した。マウスは５μｇの適切なＰ４タンパク質＋ＭＰＬで０および４週に免疫感作した。動物は６週目に採血した。表５のデータは６週に採血した５匹のマウスのプールからのものである。ホモロガスな各変異体Ｐ４タンパク質および野生型Ｐ４に対するＥＬＩＳＡ抗体力価を、各抗血清に対して決定した。表でＮＤはデータ無しを意味する。

各変異体タンパク質は、自身（ホモロガスなタンパク質）に対する良好なレベルの抗体を誘導した。野生型ｒＬＰ４に対して匹敵するレベルの抗体を誘導するタンパク質は無かった。これらの結果は変異体Ｐ４タンパク質が良好な免疫原である可能性を予測するものである。

ホモロガスなタンパク質に対するそれらの力価は、このモデルにおいて脂質化Ｐ４について予想された正常範囲内である。

Ｄ．殺バクテリアアッセイ
殺バクテリア抗体アッセイはＮＴＨｉに対する抗体に関する機能的測定であり、そして上記のＧｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１により以前に記載されたように行った。簡単に説明すると、ＮＴＨｉのＰ８６０２９５株を３７℃で一晩、ＢＨＩ−ＸＶブロス中で成長させた。一晩のカルチャーは、Ｋｌｅｔｔ−Ｓｕｍｅｒｓｏｎ光度計で６６０ｎｍで測定した時、ＢＨＩ−ＸＶブロス中で３０Ｋｌｅｔｔｓの光学密度に希釈した。カルチャーを３７℃で中期対数期までインキューベーションし、そしてＰＣＭ中で１：１５，０００に希釈した（約１〜２×１０^５ｃｆｕ／ｍＬ）。補体活性を除去するために、抗−Ｐ４マウス血清を５５℃で３０分間加熱した。次いでこれらの血清は０．１５ｍＭ ＣａＣｌ_２および０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２（ＰＣＭ）を含有するリン酸緩衝化生理食塩水で順次希釈した。

ロチェスター大学により提供されたヒト補体を、ＮＴＨｉ Ｐ８６０２９５に対して吸着させた（Ｇｒｅｅｎ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８：３２７２−３２７８）。９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、３０μｌのＰＣＭ、５μｌの希釈したマウス抗血清、１０μｌの希釈したＮＴＨｉ、および５μｌの吸着したヒト補体を合わせ、そして３７℃で３０分間インキューベーションした。反応は２００μｌのＰＣＭを加えることにより停止した。各ウェルから５０μｌをＢＨＩ−ＸＶアガー上に２連でまき、そして３７℃で一晩インキューベーションした。コロニーを計数して殺バクテリア力価を決定した（抗体を含まないアッセイ対照に比べて、少なくとも５０％のバクテリアを殺すことができる抗血清の最高希釈の逆数）。

表６は、Ｐ４−Ｄ１８４Ａ、Ｄ１８５ＡおよびＰ４−Ｄ６４Ａ、Ｄ６６Ａに対して作られた抗血清のＢＣ力価を示す。これらの力価を決定し、そしてｒＬＰ４により誘導される力価と均等であることを示した（アッセイの誤差内で）（以下の表６）。これらの変異体についてＢＣ力価とＥＬＩＳＡ力価との間に相関は無かった。

表７は、二重変異体タンパク質：（Ａ３５Ｇ、Ａ３７Ｇ）、（Ａ３５Ｔ、Ａ３７Ｔ）、（Ａ３５Ｄ、Ａ３７Ｄ）または（Ａ３５Ｑ、Ａ３７Ｑ）で免疫感作したマウスの血清に関するＢＣアッセイの結果を報告する。殺バクテリア抗体力価は、野生型Ｐ４に対するＥＬＩＳＡ力価とは相関しなかった。例えばｒＬＰ４ Ａ３５Ｎ、Ａ３７Ｎ変異体は、野生型ｒＬＰ４に対して高いＥＬＩＳＡ力価を誘導しなかったが、ＮＴＨｉに対して良好な殺バクテリア抗体活性を誘導した。すなわちこれら変異体のいずれも良好な免疫原性もしくはワクチン成分になるとは考えられなかった。興味深いことには、抗−ｒＬＰ４血清はほとんどの変異体に対してそれほど強力に反応しなかったが、これは酵素的に活性な部位が免疫優性でもあることを示しているようである。

表８は、１つの突然変異を持つ脂質化タンパク質：Ｎ２１８Ｑ、Ｋ１６１Ｒ、Ｄ６４Ｅ、Ｙ１２２Ｆ、Ｄ６４Ｎ、Ｄ６４Ｅ、Ｆ４８ＣおよびＱ３９Ｅに関するＢＣアッセイの結果を報告し、これらは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＲ細胞から精製され、そして酵素活性について調査された。タンパク質がマウスを免疫感作するために使用される時、３種の変異体は高ＥＬＩＳＡ力価および高ＢＣ力価を組み合わせて、検出できない酵素活性と一緒に有するように思われる。これらはＦ４８Ｃ、Ｎ２１８ＱおよびＱ３９Ｅ突然変異であった（表７および８）。これらの変異体Ｐ４タンパク質は、野生型Ｐ４に均等な野生型Ｐ４に対するＥＬＩＳＡ力価を有するが、ＮＴＨｉに対しても高い殺バクテリア力価を有した。

Ｐ４短縮化変異体
野生型配列のＣ−末端のさまざまな点で先端を切断（短縮化）された４種のＰ４バリアントタンパク質を構築した。短縮化変異体は、ｐＬＰ３３９のｈｅｌ遺伝子のＰＣＲにより生成した。簡単に説明すると、ｈｅｌ遺伝子の５’プライム末端に相同的なプライマーおよびリボゾーム結合部位を、その５’末端のＳｐｈＩ部位で合成した。名付けた短縮化点後の残基を終止コドンに変える３’プライマーを合成したが、プライマーの３’末端でｈｅｌ遺伝子に相同的であった。第２プライマーの５’末端もＳａｃＩ部位を含んだ。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にクローン化し、そしてＳｐｈＩ−ＳａｃＩで消化した。ｈｅｌ遺伝子断片を精製し、そして同じ酵素で消化したｐＢＡＤ１８Ｃａｍに連結した。陽性クローンを同定し、そして発現に関して試験した。すべての構築物が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＲ中で脂質化された短縮化Ｐ４タンパク質を発現した。

具体的には、残基２００（すなわち、これは配列番号３のアミノ酸１〜２００を含む）、２１０、２２１および２３２で短縮化されたＰ４バリアントタンパク質を生成した。各断片はホスファターゼ活性について、実施例４で説明したプロトコールを使用してアッセイした。すべての４種の断片が検出可能な酵素活性をもたなかった。

次いでスイス ウェブスター マウスは、２５μｇのＭＰＬ（商標）と混合した５μｇの短縮化Ｐ４タンパク質が投与されたことを除いて、実施例５Ａのプロトコールにしたがって免疫感作された。表９は、野生型ｒＬＰ４に比べて４種の短縮化Ｐ４断片に関するＥＬＩＳＡの結果を具体的に説明し、ここで実施例５のプロトコールに従った。符号「ｒＬＰ４−２３２」は、組換えＰ４が配列番号３のアミノ酸２３２で切断された等を示す。ＥＬＩＳＡデータは、すべての４種の短縮化変異体が有用な力価レベルを誘導することを示した。

次いで２つの殺バクテリアアッセイを、実施例５Ｄのプロトコールに従い行った。第１アッセイでは、アミノ酸２１０で短縮化されたＰ４タンパク質を、野生型ｒＬＰ４および上記の種々のＰ４バリアントと比較し、ここで各製剤は最後の群（これは陽性対照として、事前の実験からわずか５μｇのｒＬＰ４タンパク質を含んだ）を除いて、１００μｇのＭＰＬ（商標）と混合した１５μｇのＰ４タンパク質を含んだ。表１０の殺バクテリアアッセイデータは、アミノ酸２１０で短縮化されたＰ４タンパク質がバックグラウンドから統計的に有意な殺バクテリア抗体を誘導したことを示した。この実験では、８０以上のＢＣ_５０力価がバックグラウンドから有意に異なると考えられた（＜２０）。使用した補体は、ヒトＵＲ８−９６に吸着させた。

第２アッセイでは、アミノ酸２００、２１０、２２１および２３２で短縮化されたＰ４タンパク質を、野生型ｒＬＰ４および上記の種々のＰ４バリアントと比較し、ここで各製剤は最後の群（これは陽性対照として、事前の実験から５μｇのｒＬＰ４タンパク質に加えて１００μｇのＭＰＬ（商標）含んだ）を除いて、２５μｇのＭＰＬ（商標）（最適下）と混合した５μｇのＰ４タンパク質を含んだ。表１１の殺バクテリアアッセイデータは、アミノ酸２２１および２３２で短縮化されたＰ４タンパク質が、たとえ低用量のＭＰＬ（商標）でもバックグラウンドから統計的に有意な殺バクテリア抗体を誘導したことを示した。この実験では、０週で８０以上のＢＣ_５０力価がバックグラウンドから有意に異なると考えられた。使用した補体は、ヒトＵＲ８−９６に吸着させた。

まとめると、提案されたＰ４突然変異の結果は、殺バクテリア活性からＥＬＩＳＡ力価の分離は、殺バクテリア活性に必要な部位が酵素活性に必須な領域とは異なることを意味する、ことを示す。

本明細書に引用したすべての公報は、参照により編入する。本発明は特に好適な態様について記載してきたが、本発明の精神から逸脱することなく修飾を行うことができると考えられるだろう。そのような修飾は前記特許請求の範囲内にあるものとする。

【配列表】

Claims (61)

1. 野生型Ｐ４タンパク質に比べて減少した酵素活性を有し、そして野生型Ｐ４タンパク質に対する抗体を誘導し、かつ／または型別不能なインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＮＴＨｉ）に対する殺バクテリア活性を有するＮＴＨｉのＰ４バリアントタンパク質であって：
   （ａ）野生型Ｐ４タンパク質ではグルタミンである配列番号３のアミノ酸残基３９の突然変異；
   （ｂ）野生型Ｐ４タンパク質ではフェニルアラニンである配列番号３のアミノ酸残基４８の突然変異；
   （ｃ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギン酸である配列番号３のアミノ酸残基６４の突然変異；
   （ｄ）野生型Ｐ４タンパク質ではリシンである配列番号３のアミノ酸残基１６１の突然変異；
   （ｅ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギンである配列番号３のアミノ酸残基２１８の突然変異；
   （ｆ）野生型Ｐ４タンパク質ではアラニンである配列番号３のアミノ酸残基３５および３７の突然変異、ここで突然変異はグルタミン酸、グルタミンまたはトレオニンではない；
   （ｇ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギン酸である配列番号３のアミノ酸残基６４および６６の突然変異；および
   （ｈ）１以上の（ａ）−（ｇ）の突然変異の組み合わせ、
   からなる群から選択される突然変異を有する、上記Ｐ４バリアントタンパク質。
2. Ｐ４バリアントタンパク質が：
   （ａ）配列番号３のアミノ酸残基３９のグルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギン；
   （ｂ）配列番号３のアミノ酸残基４８のシステイン、セリンまたは非電荷極性基を有する他のアミノ酸；
   （ｃ）配列番号３のアミノ酸残基６４のアスパラギン、グルタミン酸またはアラニン；
   （ｄ）配列番号３のアミノ酸残基１６１のアルギニン；
   （ｅ）配列番号３のアミノ酸残基２１８のグルタミン、アスパラギン酸またはグルタミン酸；
   （ｆ）配列番号３のアミノ酸残基３５および３７のアスパラギン；
   （ｇ）配列番号３のアミノ酸残基６４および６６のアラニン、アスパラギンまたはグルタミン酸；
   （ｈ）１以上の（ａ）−（ｇ）の突然変異の組み合わせ、
   からなる群から選択される突然変異を有する、請求項１に記載のＰ４バリアントタンパク質。
3. 上記バリアントタンパク質が脂質化されている、請求項２に記載のＰ４バリアントタンパク質。
4. さらに上記Ｐ４バリアントタンパク質のＮ−末端に融合されたシグナルペプチドを含んでなる、請求項３に記載のＰ４バリアントタンパク質。
5. 上記シグナルペプチドが配列番号２のアミノ酸１−２０である、請求項４に記載のＰ４バリアントタンパク質。
6. 上記バリアントタンパク質が脂質化されていない、請求項２に記載のＰ４バリアントタンパク質。
7. 上記バリアントタンパク質がキャリアータンパク質とインフレームで融合している、請求項２に記載のＰ４バリアントタンパク質。
8. 上記キャリアータンパク質が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｄｎａｋタンパク質、ＧＳＴタンパク質、マイコバクテリア熱ショックタンパク質７０、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ガラクトキナーゼ、ユビキチン、α−接合因子、β−ガラクトシダーゼおよびインフルエンザＮＳ−１タンパク質からなる群から選択される、請求項７に記載のＰ４バリアントタンパク質。
9. 請求項１に記載のＰ４バリアントタンパク質および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる免疫原組成物。
10. さらにアジュバントを含んでなる請求項９に記載の免疫原組成物。
11. インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）またはインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）以外の微生物に由来するさらなる抗原をさらに含んでなる請求項９に記載の免疫原組成物。
12. 請求項２に記載のＰ４バリアントタンパク質および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる免疫原組成物。
13. さらにアジュバントを含んでなる請求項１２に記載の免疫原組成物。
14. インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）またはインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）以外の微生物に由来するさらなる抗原をさらに含んでなる請求項１２に記載の免疫原組成物。
15. 野生型Ｐ４タンパク質に比べて減少した酵素活性を有し、そして野生型Ｐ４タンパク質に対する抗体を誘導し、かつ／または型別不能なインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＮＴＨｉ）に対する殺バクテリア活性を有するＮＴＨｉのＰ４バリアントタンパク質であって、Ｐ４バリアントタンパク質が野生型Ｐ４タンパク質のカルボキシ末端領域が切り詰められた断片である、上記Ｐ４バリアントタンパク質。
16. Ｐ４バリアントタンパク質が、配列番号３のアミノ酸１−２００、１−２１０、１−２２１または１−２３２を含むように末端が切断されている、請求項１５に記載のＰ４バリアントタンパク質。
17. さらに：
    （ａ）野生型Ｐ４タンパク質ではグルタミンである配列番号３のアミノ酸残基３９の突然変異；
    （ｂ）野生型Ｐ４タンパク質ではフェニルアラニンである配列番号３のアミノ酸残基４８の突然変異；
    （ｃ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギン酸である配列番号３のアミノ酸残基６４の突然変異；
    （ｄ）野生型Ｐ４タンパク質ではリシンである配列番号３のアミノ酸残基１６１の突然変異；
    （ｅ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギンである配列番号３のアミノ酸残基２１８の突然変異；
    （ｆ）野生型Ｐ４タンパク質ではアラニンである配列番号３のアミノ酸残基３５および３７の突然変異、ここで突然変異はグルタミン酸、グルタミンまたはトレオニンではない；
    （ｇ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギン酸である配列番号３のアミノ酸残基６４および６６の突然変異；
    （ｈ）１以上の（ａ）−（ｇ）の突然変異の組み合わせ、
    からなる群から選択される１以上の突然変異を含んでなる、請求項１６に記載のＰ４バリアントタンパク質。
18. さらに：
    （ａ）配列番号３のアミノ酸残基３９のグルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギン；
    （ｂ）配列番号３のアミノ酸残基４８のシステイン、セリンまたは非電荷極性基を有する他のアミノ酸；
    （ｃ）配列番号３のアミノ酸残基６４のアスパラギン、グルタミン酸またはアラニン；
    （ｄ）配列番号３のアミノ酸残基１６１のアルギニン；
    （ｅ）配列番号３のアミノ酸残基２１８のグルタミン、アスパラギン酸またはグルタミン酸；
    （ｆ）配列番号３のアミノ酸残基３５および３７のアスパラギン；
    （ｇ）配列番号３のアミノ酸残基６４および６６のアラニン、アスパラギンまたはグルタミン酸；
    （ｈ）１以上の（ａ）−（ｇ）の突然変異の組み合わせ、
    からなる群から選択される１以上の突然変異を含んでなる、請求項１６に記載のＰ４バリアントタンパク質。
19. 請求項１５に記載のＰ４バリアントタンパク質および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる免疫原組成物。
20. さらにアジュバントを含んでなる請求項１９に記載の免疫原組成物。
21. インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）またはインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）以外の微生物に由来するさらなる抗原をさらに含んでなる請求項１９に記載の免疫原組成物。
22. 請求項１６に記載のＰ４バリアントタンパク質および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる免疫原組成物。
23. さらにアジュバントを含んでなる請求項２２に記載の免疫原組成物。
24. インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）またはインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）以外の微生物に由来するさらなる抗原をさらに含んでなる請求項２２に記載の免疫原組成物。
25. 野生型Ｐ４タンパク質に比べて減少した酵素活性を有し、そして野生型Ｐ４タンパク質に対する抗体を誘導し、かつ／またはＮＴＨｉに対する殺バクテリア活性を有するＮＴＨｉのＰ４バリアントタンパク質をコードする核酸配列に少なくとも７０％相同的な核酸配列を含んでなる単離されたヌクレオチド分子であって、Ｐ４バリアントタンパク質が：
    （ａ）野生型Ｐ４タンパク質ではグルタミンである配列番号３のアミノ酸残基３９の突然変異；
    （ｂ）野生型Ｐ４タンパク質ではフェニルアラニンである配列番号３のアミノ酸残基４８の突然変異；
    （ｃ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギン酸である配列番号３のアミノ酸残基６４の突然変異；
    （ｄ）野生型Ｐ４タンパク質ではリシンである配列番号３のアミノ酸残基１６１の突然変異；
    （ｅ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギンである配列番号３のアミノ酸残基２１８の突然変異；
    （ｆ）野生型Ｐ４タンパク質ではアラニンである配列番号３のアミノ酸残基３５および３７の突然変異、ここで突然変異はグルタミン酸、グルタミンまたはトレオニンではない；
    （ｇ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギン酸である配列番号３のアミノ酸残基６４および６６の突然変異；および
    （ｈ）１以上の（ａ）−（ｇ）の突然変異の組み合わせ、
    からなる群から選択される突然変異を有し、核酸配列が（ａ）−（ｇ）の少なくとも１つの突然変異をコードする、
    上記単離されたヌクレオチド分子。
26. 核酸配列が、ＮＴＨｉのＰ４バリアントタンパク質をコードする核酸配列に少なくとも８０％相同的である、請求項２５に記載の単離されたヌクレオチド分子。
27. 核酸配列が、ＮＴＨｉのＰ４バリアントタンパク質をコードする核酸配列に少なくとも９０％相同的である、請求項２６に記載の単離されたヌクレオチド分子。
28. 上記核酸配列が、宿主細胞中でＰ４バリアントの発現を支配する調節配列の制御下にある、請求項２５に記載の単離されたヌクレオチド分子。
29. 野生型Ｐ４タンパク質に比べて減少した酵素活性を有し、そして野生型Ｐ４タンパク質に対する抗体を誘導し、かつ／またはＮＴＨｉに対する殺バクテリア活性を有するＮＴＨｉのＰ４バリアントタンパク質をコードする核酸配列に少なくとも７０％相同的な核酸配列を含んでなる単離されたヌクレオチド分子であって、Ｐ４バリアントタンパク質が：
    （ａ）配列番号３のアミノ酸残基３９のグルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギン；
    （ｂ）配列番号３のアミノ酸残基４８のシステイン、セリンまたは非電荷極性基を有する他のアミノ酸；
    （ｃ）配列番号３のアミノ酸残基６４のアスパラギン、グルタミン酸またはアラニン；
    （ｄ）配列番号３のアミノ酸残基１６１のアルギニン；
    （ｅ）配列番号３のアミノ酸残基２１８のグルタミン、アスパラギン酸またはグルタミン酸；
    （ｆ）配列番号３のアミノ酸残基３５および３７のアスパラギン；
    （ｇ）配列番号３のアミノ酸残基６４および６６のアラニン、アスパラギンまたはグルタミン酸；
    （ｈ）１以上の（ａ）−（ｇ）の突然変異の組み合わせ、
    からなる群から選択される突然変異を有し、核酸配列が（ａ）−（ｇ）の少なくとも１つの突然変異をコードする、
    上記単離されたヌクレオチド分子。
30. 核酸配列が、ＮＴＨｉのＰ４バリアントタンパク質をコードする核酸配列に少なくとも８０％相同的である、請求項２９に記載の単離されたヌクレオチド分子。
31. 核酸配列が、ＮＴＨｉのＰ４バリアントタンパク質をコードする核酸配列に少なくとも９０％相同的である、請求項３０に記載の単離されたヌクレオチド分子。
32. 上記核酸配列が、宿主細胞中でＰ４バリアントの発現を支配する調節配列の制御下にある、請求項２９に記載の単離されたヌクレオチド分子。
33. 野生型Ｐ４タンパク質に比べて減少した酵素活性を有し、そして野生型Ｐ４タンパク質に対する抗体を誘導し、かつ／またはＮＴＨｉに対する殺バクテリア活性を有するＮＴＨｉのＰ４バリアントタンパク質をコードする核酸配列に少なくとも７０％相同的な核酸配列を含んでなる単離されたヌクレオチド分子であって、Ｐ４バリアントタンパク質が野生型Ｐ４タンパク質のカルボキシ末端領域が切り詰められた断片である、上記単離されたヌクレオチド分子。
34. 核酸配列が、ＮＴＨｉの短縮化Ｐ４タンパク質断片をコードする核酸配列に少なくとも７０％相同的である、請求項３３に記載の単離されたヌクレオチド分子。
35. 核酸配列が、ＮＴＨｉの短縮化Ｐ４タンパク質断片をコードする核酸配列に少なくとも８０％相同的である、請求項３４に記載の単離されたヌクレオチド分子。
36. 核酸配列が、ＮＴＨｉの短縮化Ｐ４タンパク質断片をコードする核酸配列に少なくとも９０％相同的である、請求項３５に記載の単離されたヌクレオチド分子。
37. 核酸分子が：
    （ａ）野生型Ｐ４タンパク質ではグルタミンである配列番号３のアミノ酸残基３９の突然変異；
    （ｂ）野生型Ｐ４タンパク質ではフェニルアラニンである配列番号３のアミノ酸残基４８の突然変異；
    （ｃ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギン酸である配列番号３のアミノ酸残基６４の突然変異；
    （ｄ）野生型Ｐ４タンパク質ではリシンである配列番号３のアミノ酸残基１６１の突然変異；
    （ｅ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギンである配列番号３のアミノ酸残基２１８の突然変異；
    （ｆ）野生型Ｐ４タンパク質ではアラニンである配列番号３のアミノ酸残基３５および３７の突然変異、ここで突然変異はグルタミン酸、グルタミンまたはトレオニンではない；
    （ｇ）野生型Ｐ４タンパク質ではアスパラギン酸である配列番号３のアミノ酸残基６４および６６の突然変異；および
    （ｈ）１以上の（ａ）−（ｇ）の突然変異の組み合わせ、
    からなる群から選択される突然変異を有する短縮化Ｐ４タンパク質断片をさらにコードし、ここで核酸配列が（ａ）−（ｇ）の少なくとも１つの突然変異をコードする、
    請求項３６に記載の単離されたヌクレオチド分子。
38. 核酸分子が：
    （ａ）配列番号３のアミノ酸残基３９のグルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギン；
    （ｂ）配列番号３のアミノ酸残基４８のシステイン、セリンまたは非電荷極性基を有する他のアミノ酸；
    （ｃ）配列番号３のアミノ酸残基６４のアスパラギン、グルタミン酸またはアラニン；
    （ｄ）配列番号３のアミノ酸残基１６１のアルギニン；
    （ｅ）配列番号３のアミノ酸残基２１８のグルタミン、アスパラギン酸またはグルタミン酸；
    （ｆ）配列番号３のアミノ酸残基３５および３７のアスパラギン；
    （ｇ）配列番号３のアミノ酸残基６４および６６のアラニン、アスパラギンまたはグルタミン酸；
    （ｈ）１以上の（ａ）−（ｇ）の突然変異の組み合わせ、
    からなる群から選択される突然変異を有する短縮化Ｐ４タンパク質断片をさらにコードし、ここで核酸配列が（ａ）−（ｇ）の少なくとも１つの突然変異をコードする、
    請求項３７に記載の単離されたヌクレオチド分子。
39. 上記分子がプラスミドベクターである、請求項２５に記載の単離されたヌクレオチド分子。
40. 請求項３９に記載のプラスミドベクターにより形質転換、トランスフェクトまたは形質導入された宿主細胞。
41. 上記分子がプラスミドベクターである請求項２９に記載の単離されたヌクレオチド分子。
42. 請求項４１に記載のプラスミドベクターにより形質転換、トランスフェクトまたは形質導入された宿主細胞。
43. 上記分子がプラスミドベクターである請求項３３に記載の単離されたヌクレオチド分子。
44. 請求項４３に記載のプラスミドベクターにより形質転換、トランスフェクトまたは形質導入された宿主細胞。
45. 請求項２５に記載のヌクレオチド分子および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる免疫原組成物。
46. 請求項２９に記載のヌクレオチド分子および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる免疫原組成物。
47. 請求項３３に記載のヌクレオチド分子および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる免疫原組成物。
48. 請求項９に記載の有効量の免疫原組成物をヒトに投与する工程を含んでなる、型別不能なインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対してヒトに免疫応答を誘導する方法。
49. 請求項１９に記載の有効量の免疫原組成物をヒトに投与する工程を含んでなる、型別不能なインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対してヒトに免疫応答を誘導する方法。
50. 請求項４５に記載の有効量の免疫原組成物をヒトに投与する工程を含んでなる、型別不能なインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対してヒトに免疫応答を誘導する方法。
51. 請求項４６に記載の有効量の免疫原組成物をヒトに投与する工程を含んでなる、型別不能なインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対してヒトに免疫応答を誘導する方法。
52. 請求項４７に記載の有効量の免疫原組成物をヒトに投与する工程を含んでなる、型別不能なインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対してヒトに免疫応答を誘導する方法。
53. 請求項４０に記載の宿主細胞を、Ｐ４バリアントタンパク質を生産するために適する条件下で培養し、そしてＰ４バリアントタンパク質をカルチャーから回収することを含んでなる、Ｐ４バリアントタンパク質の生産法。
54. 請求項４２に記載の宿主細胞を、Ｐ４バリアントタンパク質を生産するために適する条件下で培養し、そしてＰ４バリアントタンパク質をカルチャーから回収することを含んでなる、Ｐ４バリアントタンパク質の生産法。
55. 請求項４４に記載の宿主細胞を、Ｐ４バリアントタンパク質を生産するために適する条件下で培養し、そしてＰ４バリアントタンパク質をカルチャーから回収することを含んでなる、Ｐ４バリアントタンパク質の生産法。
56. 別の抗原のキャリアータンパク質として役立つ、請求項１に記載のＰ４バリアントタンパク質。
57. ポリサッカリド、オリゴサッカリド、サッカリド、リポポリサッカリド、リポオリゴサッカリドまたはリポサッカリドに化学的に結合した請求項５６に記載のＰ４バリアントタンパク質。
58. タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに融合した請求項５６に記載のＰ４バリアントタンパク質。
59. 別の抗原のキャリアータンパク質として役立つ、請求項１５に記載のＰ４バリアントタンパク質。
60. ポリサッカリド、オリゴサッカリド、サッカリド、リポポリサッカリド、リポオリゴサッカリドまたはリポサッカリドに化学的に結合した請求項５９に記載のＰ４バリアントタンパク質。
61. タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに融合した請求項５９に記載のＰ４バリアントタンパク質。