KR20140066126A - 단백질 f - 라미닌 및 비트로넥틴 결합 특성을 갖는 신규한 헤모필러스 인플루엔자 부착분자 - Google Patents

Abstract

서열번호 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는, 헤모필러스 인플루엔자에서 검출될 수 있는 단백질을 포함하는 백신 조성물이 기재된다. 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 1의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다.

Description

단백질 F - 라미닌 및 비트로넥틴 결합 특성을 갖는 신규한 헤모필러스 인플루엔자 부착분자{PROTEIN F - A NOVEL HAEMOPHILUS INFLUENZAE ADHESIN WITH LAMININ AND VITRONECTIN BINDING PROPERTIES}

본 발명은 헤모필러스 인플루엔자에서 발견될 수 있는 병독성 인자인 부착 특성을 갖는 라미닌 및 비트로넥틴 결합 단백질(단백질 F; pF)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단백질 F를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

헤모필러스 인플루엔자 유형 b(Hib) 및 비정형 H. 인플루엔자(NTHi)는 모두 소아 및 성인에서 다양한 질환을 야기한다. Hib은 4세 이하의 소아에서 세균성 수막염 및 다른 침습성 감염을 일으키는 반면, NTHi는 중이염, 부비동염, 후두개염, 기관기관지염 및 폐렴 사례들에서 단리되었으며, 신생아 패혈증을 일으킬 수 있다. 현재 NTHi에 대한 시판 백신은 없으나, Hib에 대해서는 여러 백신들이 사용되고 있다. 이들 백신은 18개월 미만의 소아에서 협막 다당류에 대한 약한 면역 반응을 극복하기 위해 다양한 단백질 담체(수막구균 외막 복합체, 파상풍 변성독소, 무독성 돌연변이 디프테리아 독소, 또는 디프테리아 변성독소)에 결합된 Hib 협막 다당류, 폴리리보실 리비톨 포스페이트로 구성된다. H. 인플루엔자 외막 단백질(OMP)은 Hib 및 NTHi 감염에 뒤따르는 숙주 항체의 표적인 것으로 나타나므로, 폴리리보실 리비톨 포스페이트의 담체로도 간주된다. OMP P1, P2, P4, P5, 및 P6 그리고 98-kDa 단백질에 대한 항체가 H. 인플루엔자 감염에 대한 생체내(in vivo) 보호 및 시험관내(in vitro) 살균 분석에서 평가되었으며, P1, P4, 및 P6에 대한 항체는 동종성 및 이종성 H. 인플루엔자 균주 모두에 대해 생물학적 활성을 나타내었다. 다른 OMP에 대한 항체에서의 이종성 보호의 부재는 부분적으로 상이한 H. 인플루엔자 균주들 간 이들 단백질의 항원 다양성에 기인한다. 따라서, 이상적인 항원은 박테리아 표면 상에 노출되어야 하며 항원적으로 잘 보존되어야 한다. 예를 들어, Hib 및 NTHi 균주들 모두 사이에 널리 분포되고 항원적으로 보존된 42-kDa 막 단백질(단백질 D)이 단리되고 클로닝되고 서열 분석되어 병원성 인자이며 유효한 백신 후보인 것으로 나타났다(Janson 등, 1991, Prymula 등, 2006).

NTHi 발병기전에서의 초기 단계는 점막, 기저막 및 세포외 기질(ECM)로의 부착이다. 구조 및 부착 기능을 모두 갖는 섬유성 단백질(예컨대 라미닌, 콜라겐, 및 엘라스틴) 및 프로테오글리칸의 형태로 단백질에 결합되는 글리코스아미노글리칸의 2가지 주요 거대분자군이 포유류의 ECM을 구성한다[Heino 등, 2009]. ECM은 조직의 물리적 구조를 안정화하며, 진핵 세포 부착, 분화, 이동, 증식, 형태 및 구조의 조절에 관여한다. 박테리아와 ECM의 상호작용은 숙주 조직에서의 집락형성에 중요한 역할을 담당하며, ECM은 정상적 상황 하에서는 병원체에 노출되지 않는다. 그러나, 기계적 또는 화학적 손상 또는 독소 및 용해성 효소의 활성을 통한 박테리아/바이러스 감염에 의한 조직 손상 후, 병원체는 ECM에 대한 접근을 확보할 수 있다.

라미닌은 α, β, 및 γ 사슬로 구성된 대략 400-900kDa의 이종삼량체성, 대형 십자형 당단백질군이다[Nguyen 2006]. 상이한 α, β, 및 γ 사슬이 존재하며, 이들이 상이한 라미닌 이소형로 조합된다. 상피에 대한 라미닌의 주요 역할은 세포를 기저막으로 부착하는 것이다. 몇몇 병원체, 예를 들어 미코박테리움 투베르쿨로시스[Kinhikar 등, 2006] 및 모락셀라 카타랄리스[Tan 등, 2006]는 라미닌에 결합한다.

비트로넥틴은 ECM의 다른 중요 성분이며, 간에서 합성되고 혈장 내로 분비된다[리뷰로는 Singh 등, 2010b를 참고하라]. 대부분의 혈중 순환 비트로넥틴은 단량체(65 및 75kDa)지만, 혈관 밖 세포-결합 비트로넥틴은 다량체이다. 비트로넥틴은 혈장 중에서 고농도로 발견되며(200-700㎍/㎖), 또한 상이한 인간 조직에 존재한다. 특히 다량이 간, 편도선, 십이지장, 심장, 골격근, 및 폐 조직에서 관찰된다.

비트로넥틴은 세포 이동, 부착 및 혈관신생을 포함하는 여러 생물학적 절차에서 중요한 역할을 담당한다[Preissner 등, 1998]. 비트로넥틴과 유로키나아제 플라스미노겐 활성화제-유로키나아제 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPA-uPAR) 복합체 및 인테그린 수용체와의 상호작용은 오래된 조직 분해(세포주변 단백분해), 재구성 및 상처 치유에 관여되는 플라스미노겐 활성화 시스템의 일부이다. 따라서 uPAR-비트로넥틴 상호작용은 항상성 절차에서의 주요 결정자이다[Smith 등, 2010].

ECM의 한 성분인 것에 부가하여, 비트로넥틴은 선천성 면역 반응의 자가 반응성을 제한하는 보체 활성화의 말단 경로 조절에 관여된다. 막 공격 복합체(MAC)의 형성은 두 저해제인 막 단백질 CD59 및 비트로넥틴의 조절 하에 있다. 비트로넥틴은 그 막-결합 부위에서 C5b-7 복합체에 결합하여 세포막 내로의 복합체 삽입을 저해한다. 따라서, 세포용해성 MAC의 형성이 저해되고 세포의 용해가 방지된다[Preissner, 1991]. 비트로넥틴의 존재 하에, C5b-7 복합체는 여전히 C8 및 C9에 결합하여 C5b-8 및 C5b-9 복합체를 형성할 수 있지만 후자는 비-용해성이다. 또한, 비트로넥틴은 C5b-9에 결합하여 C9의 개구 형성 중합을 차단한다[Preissner 등, 1985]. 비트로넥틴을 상피 세포에 대한 부착을 위한 가교로서 이용하는 것에 부가하여, NTHi를 포함하는 몇몇 병원체는 인간 혈청에서의 생존을 증가시키기 위해 MAC의 저해를 위한 효율적 보체 조절제로서 비트로넥틴을 이용한다[Singh 등, 2010b]. 다른 것들 중에서 몇몇 박테리아 외막 단백질 M. 카타랄리스 편재 표면 단백질(UspA2)[Singh 등, 2010] 및 H. 인플루엔자 단백질 E[Hallstroem 등, 2009]는 최근에 비트로넥틴과 상호작용하는 것으로 나타났다.

WO2007/084053에는 헤모필러스 인플루엔자에서 검출될 수 있는 단백질인 단백질 E로 불리는 표면 노출 단백질이 기재된다. 단백질 E는 부착분자(adhesin)이며 또한 비트로넥틴에 결합한다[Ronander 2009, Hallstroem 2009].

H. 인플루엔자가 상기도 및 하기도에서 주요 감염 원인으로 확인되었다는 사실의 측면에서, 현재 H. 인플루엔자에 대해 이용할 수 있는 백신을 개발할 필요성이 존재한다.

따라서 본 발명의 목적은 H. 인플루엔자가 체내에서 세포와 상호작용하고 면역계와 상호작용하는 방식을 더 연구하고, H. 인플루엔자에 대해 새로운 유형의 효과적인 백신을 제공할 수 있는 데 있다.

한 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는, 헤모필러스 인플루엔자에서 검출될 수 있는 표면 노출 단백질을 제공하며, 상기 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접(contiguous) 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 1의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 청구항 1에 따른 표면 노출 단백질의 면역원성 단편을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 단편은 헤모필러스 인플루엔자에서 검출될 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 언급된 단백질에 기반한 면역원성 단백질을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 서열번호 1의 위치 1-11 또는 1-22에서의 하나 이상의 아미노산들은 결실되거나 하나 이상의 아미노산들으로 치환된다. 한 구현예에서, 서열번호 1의 위치 1-11 또는 1-22에서의 하나 이상의 아미노산들은 0-11개 또는 0-22개의 선택적 아미노산들의 서열로 치환된다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 2에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 2의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다.

추가 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 3의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다.

다른 추가 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 4에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 4의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 5에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 단편은 서열번호 5의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 5의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 6에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 단편은 서열번호 6의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 6의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다.

추가 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 7에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 단편은 서열번호 7의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 7의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 8에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 단편은 서열번호 8의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 8의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다.

다른 추가 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 9에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 9의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 10에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 10의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 11에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 단편은 서열번호 11의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 11의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다.

추가 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 12에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 단편은 서열번호 12의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 12의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 13에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 단편은 서열번호 13의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 13의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 14에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 백신 조성물을 제공하며, 상기 단편은 서열번호 14의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 14의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다.

한 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 단백질 또는 단편의 적어도 하나의 이량체, 삼량체 또는 다량체를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물에 있어서, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 보강제, 운반체, 부형제, 결합제, 담체, 보존제, 완충제, 에멀전화제, 습윤제, 또는 전달감염(transfection) 촉진 화합물을 추가로 포함하는 조성물을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물에 있어서, 적어도 하나의 추가 백신을 포함하는 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물에 있어서, 다른 분자의 면역원성 부분을 포함하는 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 기재된 백신 조성물에 있어서, 상기 다른 분자의 면역원성 부분이 H. 인플루엔자의 단백질 D, pilA 또는 단백질 E, 모락셀라 카타랄리스의 MID, 모락셀라 카타랄리스의 UspA1 또는 UspA2, 및 인간 또는 동물에서 발견되는 임의의 호흡기 병원체의 외막 단백질을 포함하는 군으로부터 선택되는 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 기재된 단백질 또는 단편을 코딩하는 핵산 서열뿐만 아니라 그의 동족체, 다형체, 축퇴체(degenerates) 및 스플라이스 변이체(splice variant)를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 백신 조성물에 있어서, 적어도 다른 유전자에 융합된 조성물을 제공한다.

다른 추가 측면에 따르면, 본 발명은 상술된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 플라스미드(plasmid) 또는 파지(phage)를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 적어도 하나의 플라스미드를 포함하고 상기 언급된 바와 같은 단백질 또는 단편을 생산할 수 있는 비인간 숙주를 포함하는 백신 조성물에 있어서, 상기 숙주가 박테리아, 효모 및 식물 가운데 선택되는 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상술된 바와 같은 숙주를 포함하는 백신 조성물에 있어서, 숙주가 대장균인 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물에 있어서, 상기에 따른 단백질 또는 단편이 상기 언급된 바와 같은 재조합 핵산 서열을 이용하여 적어도 다른 단백질에 조합된 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 융합 단백질을 포함하는 백신 조성물에 있어서, 상기 언급된 바와 같은 단백질 또는 단편의 이량체, 삼량체 또는 다량체인 조성물을 제공한다.

한 측면에 따르면, 본 발명은 융합 생성물을 포함하는 백신 조성물에 있어서, 상기에 따른 단백질 또는 단편 또는 펩티드가 공유적으로 또는 다른 수단에 의해 단백질, 탄수화물 또는 기질에 결합되는 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 청구항 31에 있어서, 그 아미노산 서열이 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 추가 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 상술된 바와 같은 백신 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 단리된 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상술된 바와 같은 백신 조성물에 있어서, 폴리펩티드에 서열번호 1의 신호 펩티드(아미노산 1-22)가 없는 조성물을 제공한다.

한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 상술된 바와 같은 폴리펩티드로부터 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 단편을 포함하는 백신 조성물에 있어서, 상기 단편은 (필요한 경우 담체에 결합되었을 때) 서열번호 1의 폴리펩티드(또는 각각 상술된 바와 같은 폴리펩티드)를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있거나, 비트로넥틴 및 라미닌에 결합할 수 있는 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상술된 바와 같은 폴리펩티드 또는 면역원성 단편을 포함하는 백신 조성물에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 상기 면역원성 단편이 더 큰 융합 단백질의 일부인 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상술된 바와 같은 폴리펩티드 또는 면역원성 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 전체 길이에 걸쳐서 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 단리된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 전체 코딩 영역에 걸쳐서 서열번호 1의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 단리된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 추가 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 15의 전체 길이에 걸쳐서 서열번호 15와 적어도 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 단리된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상술된 바와 같은 백신 조성물에 있어서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드의 동일성이 서열번호 15에 대해 적어도 95%인 조성물을 제공한다.

한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1의 폴리펩티드, 또는 상술된 바와 같은 면역원성 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 15의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 추가 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 15의 서열 또는 그의 단편을 갖는 표지 탐침을 이용한 엄격한 혼성화 조건 하에 적절한 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있는, 서열번호 1의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

추가 측면에서, 본 발명은 상기에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 살아 있는 재조합 미생물을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 추가 측면에서, 본 발명은 상기에 따른 발현 벡터를 포함하는 살아 있는 재조합 미생물을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상술된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 발현하는 상기에 따른 숙주 세포의 막을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 추가 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물의 제조 방법에 있어서, 상기 폴리펩티드 또는 상기 면역원성 단편을 제조하기 충분한 조건 하에 상술된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

한 구현예에서, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물의 제조 방법에 있어서, 적어도 하나의 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 발현하기 충분한 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

다른 구현예에서, 본 발명은 상기 폴리펩티드 또는 면역원성 단편 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 유효량으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

다른 구현예에서, 본 발명은 상술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 유효량으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

한 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물에 있어서, 상기 조성물이 적어도 하나의 다른 헤모필러스 인플루엔자 항원을 포함하는 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물에 있어서, 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 뉴모라이신(pneumolysin)과 함께 제형화된 조성물을 제공한다.

다른 추가 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물에 있어서, 모락셀라 카타랄리스 유래의 Omp106과 함께 제형화된 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물에 있어서, 모락셀라 카타랄리스 유래의 UspA1 및/또는 UspA2와 함께 제형화된 조성물을 제공한다.

한 구현예에서, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물에 있어서, 모락셀라 카타랄리스 유래의 Hly3과 함께 제형화된 조성물을 제공한다.

다른 구현예에서, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물에 있어서, 모락셀라 카타랄리스 유래의 OmpCD와 함께 제형화된 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물에 있어서, 모락셀라 카타랄리스 유래의 D15와 함께 제형화된 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물에 있어서, 헤모필러스 인플루엔자 유래의 Omp26과 함께 제형화된 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물에 있어서, 헤모필러스 인플루엔자 유래의 P6과 함께 제형화된 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물에 있어서, 헤모필러스 인플루엔자 유래의 단백질 D 또는 E와 함께 제형화된 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물에 있어서, 헤모필러스 인플루엔자 유래의 NlpC2와 함께 제형화된 조성물을 제공한다.

다른 추가 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물에 있어서, 헤모필러스 인플루엔자 유래의 Slp 또는 pilA와 함께 제형화된 조성물을 제공한다.

한 구현예에서, 본 발명은 감염의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에서의 상기에 따른 백신의 용도를 제공한다.

추가 구현예에서, 본 발명은 상기에 따른 용도에 있어서, 상기 감염이 헤모필러스 인플루엔자에 의해 야기되는 용도를 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 용도에 있어서, 상기 헤모필러스 인플루엔자가 캡슐화되거나 또는 비정형인 용도를 제공한다.

다른 추가 측면에 따르면, 본 발명은 소아 및 성인에서의 중이염, 부비동염 또는 하기도 감염, 예컨대 만성 폐색성 폐 질환(COPD)의 예방 또는 치료를 위한 상기 언급된 바와 같은 용도를 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 상기에 따른 단백질, 단편 또는 펩티드 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 보강제, 운반체, 부형제, 결합제, 담체, 보존제, 완충제, 에멀전화제, 습윤제, 또는 전달감염 촉진 화합물을 포함하는 약제를 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 단백질, 단편 또는 펩티드의 단리 방법에 있어서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공한다:

a) 상기 단백질, 단편 또는 펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 헤모필러스 인플루엔자 또는 대장균을 성장시키고, 상기 박테리아를 수확하고, 외막, 외막 운반체 또는 봉입체를 단리하는 단계;

b) 상기 봉입체를 강한 용매화제로 가용화하는 단계;

c) 복원제(renaturating agent)를 첨가하는 단계; 및

d) 결과물인 현탁액을 pH 8 내지 10의 완충액에 대해 투석하는 단계.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 방법에 있어서, 상기 용매화제가 구아니듐 히드로클로라이드인 방법을 제공한다.

다른 추가 측면에 따르면, 본 발명은 상기 언급된 바와 같은 방법에 있어서, 상기 복원제가 아르기닌인 방법을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 언급된 바와 같은 백신의 제조 방법에 있어서, 단백질, 단편 또는 펩티드가 부형제와 함께 제형화되는 방법을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기에 따른 백신 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 개인에서 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

한 구현예에서, 상기 감염은 캡슐화된 또는 비정형 헤모필러스 인플루엔자로 야기되며, 다른 구현예에서, 상기 감염은 중이염, 부비동염 또는 하기도 감염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 측면에서, 본 발명은 상술된 바와 같은 단백질, 단편 또는 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열뿐만 아니라 그의 동족체, 다형체, 축퇴체 및 스플라이스 변이체에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 핵산 서열은 적어도 다른 유전자에 융합된다.

다른 측면에서, 본 발명은 상술된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 또는 파지에 관한 것이다.

다른 구현예에서, 본 발명은 상술된 바와 같은 적어도 하나의 플라스미드를 포함하고 상술된 바와 같은 단백질, 단편 또는 펩티드뿐만 아니라 그의 동족체, 다형체, 축퇴체 및 스플라이스 변이체를 제조할 수 있는 비인간 숙주에 관한 것이며, 이 숙주는 박테리아, 효모 및 식물 중에서 선택된다. 한 구현예에서, 상기 숙주는 대장균이다.

다른 측면에서, 본 발명은 융합 단백질 또는 폴리펩티드에 있어서, 상술된 바와 같은 단백질, 단편 또는 펩티드가 상기 논의된 바와 같은 재조합 핵산 서열을 이용하여 적어도 다른 단백질과 조합된 단백질 또는 폴리펩티드를 제공한다. 한 구현예에서, 상기 융합 단백질은 상기 논의된 바와 같은 단백질, 단편 또는 펩티드의 이량체, 삼량체 또는 다량체이다.

한 측면에서, 본 발명은 융합 생성물에 관한 것이며, 상술된 바와 같은 단백질, 단편 또는 펩티드는 공유적으로 또는 임의의 다른 수단에 의해 단백질, 탄수화물 또는 기질에 결합된다.

본 발명은 단백질 F, 구체적으로 단백질 F 폴리펩티드 및 단백질 F 폴리뉴클레오티드, 그의 제조를 위한 재조합 재료 및 방법에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은 다른 것들 중에서 미생물 질환의 예방 및 치료를 포함하는, 상기 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 사용 방법에 관한 것이다. 추가 측면에서, 본 발명은 미생물 감염에 연관된 질환 및 이러한 감염에 연관된 상태를 검출하기 위한 진단 분석, 예컨대 단백질 F 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 검출하기 위한 분석에 관한 것이다.

하기 설명을 읽음으로부터 그리고 본 개시의 다른 부분들을 읽음으로부터 본 발명에서 개시되는 요지 및 범위 내에서 다양한 변경들 및 개질들이 당업자에게 쉽게 자명해질 것이다.

본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명이 이 출원에서 본원에 기재된 구현예들 및 단계들의 상세 내용으로 제한되지 않음을 이해하는 것이 중요하다. 언급되는 예들은 본 발명을 예시하는 것이지 어떠한 방식으로든 이를 제한하려는 것이 아니다. 본 발명은 다른 구현예들을 가질 수 있고, 다양한 방식들로 실시 또는 수행될 수 있다. 본원에서 채용되는 어구 및 용어는 설명만을 위한 목적이지 제한하기 위한 것이 아님이 이해되어야 한다.

본 출원에서는 단백질 F(pF)로 명명된 신규한 H. 인플루엔자 외막 단백질의 클로닝 및 발현을 설명한다. 단백질은 인간 비트로넥틴을 미끼로 사용하여 발견되었다.

재조합 pF의 수율을 최대화하기 위해, 아미노산 잔기 A12 내지 K293으로 구성된 절단된 pF 단편을 제조하였다. 따라서 아미노산 pF1-11을 포함하는 예측되는 신호 펩티드의 N-말단이 제거되었으며 벡터 pET26(+)에서 유래된 9개 잔기들이 부가된 리더 펩티드로 치환되었다. 절단된 pF는 pF12-293으로 명명되었다.

본 발명은 헤모필러스 외막 단백질 pF 및 pF-유래 펩티드 pF23-48(서열번호 2), pF44-68(서열번호 3), pF64-88(서열번호 4), pF84-108(서열번호 5), pF104-128(서열번호 6), pF124-148(서열번호 7), pF144-168(서열번호 8), pF164-188(서열번호 9), pF184-209(서열번호 10), pF204-230(서열번호 11), pF225-255(서열번호 12), pF250-275(서열번호 13), pF270-293(서열번호 14), 및 그의 이량체, 삼량체 또는 올리고머체를 포함한다. 구체적으로, 표면 노출된 pF 또는 유래 펩티드의 서열들에 더 높은 중요성이 부여된다.

따라서, 본 발명에 따른 백신 조성물은 면역원성 성분으로서 모든 헤모필러스 인플루엔자에서 검출될 수 있으며, 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 갖는 표면 노출 단백질, 및/또는 서열번호 2-14에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 또는 그의 단편, 동족체, 기능적 균등체, 유도체, 축퇴체 또는 히드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 다른 이차 가공 생성물을 포함한다. 백신 조성물은 또한 면역원성 성분으로서 본 발명에 따른 융합 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 융합 생성물을 포함할 수 있다. 면역원성 성분은 헤모필러스 인플루엔자에 대한 항체 또는 다른 면역 반응을 야기할 수 있으며, 야기된 항체는 대상체의 세포에 대한 헤모필러스 인플루엔자 박테리아의 발병기전을 저해한다. 본 발명에 따른 백신 조성물의 "면역원성 용량"은 투여 전의 표준 면역 반응에 비해 투여 후에 검출 가능한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 일으키는 것이다.

항원을 생성하기 위해 본 발명의 백신 조성물에서 사용되는 핵산 서열은 다양한 절차에 의해 임의의 광범위한 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이러한 절차는 당업자에게 공지된 것으로 여겨진다.

백신 조성물은 널리 공지된 방법 및 기법을 이용하여 쉽게 달성될 수 있으며, 다양한 방식으로, 바람직하게는 비경구로 또는 비강내로 투여될 수 있다. 비경구 또는 비강내 투여에 적합한 제형에는 항산화제, 완충액, 정균제 및 문제 대상체의 채액에 대한 제형을 등장성으로 만드는 용질이 포함될 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 또는 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 포함된다. 활성 면역원성 성분은 종종 약학적으로 허용가능한 부형제, 예컨대 물, 식염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등과 혼합된다. 또한, 백신 조성물은 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 에멀전화제, pH 완충제, 결합제, 담체 또는 보존제를 함유할 수 있다.

백신 조성물은 또한 조성물의 면역원성을 증강시키기 위한 보강제, 예컨대 프로인트 보강제 및 당분야에 공지된 다른 시스템을 포함할 수 있다.

백신 조성물의 면역원성 성분들, 즉 본 발명의 단백질, 단편, 펩티드, 융합 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 융합 생성물은 중성 또는 염 형태로 백신 내에 제형화될 수 있다.

백신 조성물의 투여량은 백신의 특이적 활성에 의존할 것이며, 일상적 실험에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 백신 조성물은 치료적으로 유효하고 면역원성일 양으로 투여되며, 그 양은 대상체에 의존한다.

본 발명은 아래에서 더 상세히 기재되는 바와 같은 단백질 F 폴리펩티드들 및 폴리뉴클레오티드들에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 H. 인플루엔자의 단백질 F의 폴리펩티드들 및 폴리뉴클레오티드들에 관한 것이다. 단백질 F 폴리펩티드들은 신호 서열을 가지며, 박테리아의 표면에 노출된다. 신호 펩티드는 단백질 F 폴리펩티드의 잔기 1 내지 잔기 22에 위치한다.

본원에서 나타내는 "단백질 F"는 본원에서 논의되는 본 발명의 임의의 펩티드들, 면역원성 단편들, 융합물들, 폴리펩티드들 또는 단백질들을 나타낸다(예컨대 신호 서열 또는 위치 1-11의 아미노산들(예측되는 신호 펩티드의 N-말단부)을 포함하거나 포함하지 않는, 또는 신호 펩티드의 1-22가 결실되거나 하나 이상의 아미노산들로 치환될 수 있는 서열번호 1).

"단백질 F를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 본원에서 논의된 본 발명의 임의의 펩티드, 면역원성 단편, 융합물, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

본원에서 "포함하는"이라는 용어는 대안적으로 "로 구성된"으로 치환될 수 있다.

당업자는 이러한 서열들이 일반적으로 리보폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 유용하게 채용될 수 있음을 인식할 것이므로, 하기 서열 목록에서 "DNA"로 언급되는 서열들은 본 발명의 한 구현예의 예시를 나타내는 것으로 이해된다.

단백질 F의 서열을 서열번호 1(NTHi 균주 3655 유래)에 나타낸다. pF의 상피 세포 결합 영역의 맵핑에 사용된 단백질 F 인코딩 펩티드의 서열을 서열번호 2-14(NTHi 균주 3655 유래)에 나타낸다. 단백질 F 폴리뉴클레오티드들의 서열을 서열번호 15에 나타낸다.

폴리펩티드

본 발명의 한 측면에서는 본원에서 "단백질 F" 및 "단백질 F 폴리펩티드"로 나타내는 H. 인플루엔자(구체적으로 비정형 H. 인플루엔자)의 폴리펩티드뿐만 아니라 그의 생물학적으로, 진단학적으로, 예방적으로, 임상적으로 또는 치료적으로 유용한 변이체 및 이를 포함하는 조성물이 제공된다.

본 발명은 추가로 다음을 제공한다:

(a) 서열번호 1-14의 임의의 서열에 대해 적어도 85% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 97-99% 또는 정확한 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드;

(b) 서열번호 15의 선택된 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 15의 임의의 서열에 대해 적어도 85% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 97-99% 또는 정확한 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드로 인코딩되는 폴리펩티드; 또는

(c) 서열번호 1-14의 임의의 서열의 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 97-99% 또는 정확한 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드로 인코딩되는 폴리펩티드.

서열번호 1-14에 제공되는 단백질 F 폴리펩티드는 비정형 H. 인플루엔자 균주 유래의 단백질 F 폴리펩티드이다. 추가 단백질 F 서열은 도 3에 열거된 H. 인플루엔자 균주에서 확인되었다.

본 발명은 또한 단백질 F 폴리펩티드의 면역원성 단편, 즉 서열번호 1-14에서 선택된 해당 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 면역원성 활성을 갖는 단백질 F 폴리펩티드의 인접부를 제공한다. 다시 말하면, 단편(필요한 경우 담체에 결합되었을 때)은 단백질 F 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있다. 이러한 면역원성 단편에는, 예를 들어 N-말단 리더 서열 또는 그의 일부 및/또는 막통과 도메인 및/또는 C-말단 부착 도메인이 없는 단백질 F 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 바람직한 측면에서, 본 발명에 따른 단백질 F의 면역원성 단편은 상기 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1-14에서 선택된 서열에 대해 적어도 85% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 97-99% 동일성을 갖는 폴리펩티드의 실질적으로 전체 세포외 도메인을 포함한다.

단편은 본 발명의 임의의 폴리펩티드의 임의의 아미노산 서열과 부분적으로는 완전히 동일하지만 전체적으로는 동일하지 않은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 단백질 F 폴리펩티드와 마찬가지로, 단편은 "자유 고정"될 수도 있고 또는 이들이 부분 또는 영역을 형성하는 더 큰 폴리펩티드 내에 포함될 수 있고, 가장 바람직하게는 하나의 더 큰 폴리펩티드에서 하나의 연속 영역을 형성할 수 있다. 따라서, 단편은 전장 천연 서열보다 짧을 수 있고, 또는 더 큰 폴리펩티드 내에 포함된 경우 전장 천연 서열 또는 더 긴 융합 단백질일 수 있다.

바람직한 단편에는, 예를 들어 서열번호 1-14에서 선택된 아미노산 서열의 일부를 갖는 절단 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 예컨대 아미노- 및/또는 카복실-말단 아미노산 서열을 포함하는 일련의 연속 잔기들이 포함된다. 숙주 세포에 의해 또는 숙주 세포에서 제조된 본 발명의 폴리펩티드의 분해 형태도 바람직하다. 알파-나선 및 알파-나선 형성 영역, 베타-시트 및 베타-시트 형성 영역, 회전 및 회전-형성 영역, 코일 및 코일-형성 영역, 친수성 영역, 소수성 영역, 알파 양쪽성 영역, 베타 양쪽성 영역, 가요성 영역, 표면 형성 영역, 기질 결합 영역 및 높은 항원 지수 영역을 포함하는 단편과 같이 구조적 또는 기능적 속성들을 특징으로 하는 단편도 바람직하다.

또한 바람직한 단편에는 서열번호 1-14에서 선택된 아미노산 서열에서 적어도 15, 20, 30, 40, 50 또는 100개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드, 또는 서열번호 1-14에서 선택된 아미노산 서열에서 적어도 15, 20, 30, 40, 50 또는 100개의 인접 아미노산들이 절단되거나 결실된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드가 포함된다.

B-세포 에피토프를 포함하는 것들, 예를 들어 도 11에 기재된 단편들/펩티드도 또한 바람직한 단편이다.

본 발명의 전장 단백질 F의 단편은 펩티드 합성에 의해 해당하는 전장 폴리펩티드를 제조하기 위해 채용될 수 있다; 따라서, 이들 단편은 본 발명의 단백질 F 서열에 근거하여 전장 단백질 F 또는 다른 폴리펩티드를 제조하기 위한 중간체로서 채용될 수 있다.

몇몇, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 또는 1개 아미노산이 임의의 조합으로 치환, 결실 또는 추가된 변이체가 특히 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드, 또는 면역원성 단편은 "성숙" 단백질의 형태일 수도 있고 또는 더 큰 단백질, 예컨대 전구체 또는 융합 단백질의 일부일 수도 있다. 종종 분비성 또는 리더 서열, 프로-서열, 다중 히스티딘 잔기와 같이 정제를 돕는 서열 또는 재조합 생산 동안 안정성을 위한 추가 서열을 포함하는 추가 아미노산 서열을 포함시키는 것이 유리하다. 또한 최종 분자의 면역원성 가능성을 증가시키기 위한 외인성 폴리펩티드 또는 지질 꼬리 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 추가도 고려된다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편, 및 다양한 서브클래스의 면역글로불린(IgG, IgM, IgA, IgE)의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 다양한 부분들을 포함하는 유전적으로 조작된 가용성 융합 단백질에 관한 것이다.

면역글로불린으로 바람직한 것은 융합이 힌지 영역에서 일어나는 경우 인간 IgG, 특히 IgG1의 중쇄의 불변부이다. 특정 구현예에서, Fc부는 혈액 응고 인자 Xa로 절단될 수 있는 절단 서열의 도입에 의해 간단히 제거될 수 있다.

또한, 본 발명은 유전자 조작에 의한 이들 융합 단백질의 제조 방법, 및 그의 약물 스크리닝, 진단 및 치료를 위한 용도에 관한 것이다. 추가 측면에서, 본 발명은 또한 이러한 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 융합 단백질 기술의 예들은 WO94/29458 및 WO94/22914에서 확인할 수 있다.

단백질은 화학적으로 공액되거나 또는 재조합 융합 단백질로 발현되어 비융합 단백질에 비해 발현 시스템에서 증가된 수준으로 제조될 수 있다. 융합 파트너는 T 헬퍼 에피토프(면역학적 융합 파트너)를 제공하는 것을, 바람직하게는 T 헬퍼 에피토프가 인간에 의해 인식되는 것을 도울 수 있거나, 또는 천연 재조합 단백질에 비해 더 높은 수율로 단백질 발현을 도울 수 있다(발현 증강제). 바람직하게는 융합 파트너는 면역학적 융합 파트너 및 발현 증강 파트너 모두가 될 것이다.

융합 파트너에는 헤모필러스 인플루엔자 유래의 단백질 D(EP 594610), 헤모필러스 인플루엔자 유래의 단백질 E(EP 1 973 933) 및/또는 인플루엔자 바이러스 유래의 비구조 단백질, NS1(헤마글루티닌)이 포함된다. 다른 융합 파트너는 Omp26으로 알려진 단백질이다(WO 97/01638). 다른 융합 파트너는 LytA로 알려진 단백질이다. 바람직하게는 분자의 C 말단부가 사용된다. LytA는 펩티도글리칸 골격에서 특정 결합을 특이적으로 분해하는 오토라이신인 N-아세틸-L-알라닌 아미다아제, 아미다아제 LytA(lytA 유전자에 의해 코딩됨{Gene, 43 (1986), p. 265-272})를 합성하는 스트렙토코커스 뉴모니애에서 유래된다. LytA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 DEAE와 같은 일부 콜린 유사체에 대한 친화도에 관여한다. 상기 특성은 융합 단백질의 발현을 위해 유용한 대장균 C-LytA 발현 플라스미드의 개발을 위해 활용되었다. 그 아미노 말단에 C-LytA 단편을 포함하는 하이브리드 단백질의 정제가 설명되어 있다{Biotechnology: 10 (1992) p. 795-798}. 잔기 178에서 시작하는 C 말단에서 발견된 LytA 분자의 반복부, 예를 들어 잔기 188-305를 이용할 수 있다.

본 발명에는 또한 보존적 아미노산 치환에 의해 기준물과 다른 펩티드인 상기 언급된 단백질 F 및 펩티드의 변이체가 포함되며, 여기서 잔기는 유사 특징을 갖는 다른 잔기로 치환된다. 이러한 전형적 치환은 Ala, Val, Leu 및 Ile간; Ser 및 Thr간; 산성 잔기 Asp 및 Glu간; Asn 및 Gln간; 및 염기성 잔기 Lys 및 Arg간; 또는 방향족 잔기 Phe 및 Tyr간에 일어난다.

본 발명의 폴리펩티드는 임의의 적합한 방식으로 제조될 수 있다. 이러한 폴리펩티드에는 단리된 천연 생성 폴리펩티드, 재조합적으로 제조된 폴리펩티드, 합성적으로 제조된 폴리펩티드, 또는 이들 방법의 조합으로 제조된 폴리펩티드가 포함된다. 이러한 폴리펩티드의 제조 수단들은 당분야에서 널리 이해되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드가 비정형 H. 인플루엔자에서 유래하는 것이 가장 바람직하지만, 바람직하게는 동일한 분류 속의 다른 개체에서 수득될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한, 예를 들어 동일한 분류 과 또는 목의 개체에서 수득될 수 있다.

폴리뉴클레오티드

본 발명의 목적은 단백질 F 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 특히 본원에서 단백질 F로 명명된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 전장 유전자 또는 그의 변이체를 포함하는 서열번호 15에 나타낸 서열을 포함하는 단백질 F 폴리펩티드를 인코딩하는 영역을 포함한다.

서열번호 15에서 제공되는 단백질 F 폴리뉴클레오티드는 비정형 H. 인플루엔자 균주 3655 유래의 단백질 F 폴리뉴클레오티드이다. 다른 서열은 도 3에 열거된 H. 인플루엔자 균주로부터 결정된 단백질 F를 인코딩하는 유전자이다.

본 발명의 추가 측면으로서, 예를 들어 미가공 RNA, 리보자임 RNA, mRNA, cDNA, 게놈 DNA, B- 및 Z-DNA를 포함하는 단백질 F 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드, 특히 비정형 H. 인플루엔자 단백질 F 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 인코딩하거나 및/또는 발현하는 단리된 핵산 분자가 제공된다. 본 발명의 추가 구현예에는 생물학적으로, 진단학적으로, 예방학적으로, 임상적으로 또는 치료적으로 유용한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드, 및 그의 변이체, 및 이를 함유하는 조성물이 포함된다.

본 발명의 다른 측면은 서열번호 1-14의 추정 아미노산 서열을 갖는 단백질 F 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 전장 유전자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 이에 매우 관련된 폴리뉴클레오티드 및 그의 변이체에 관한 것이다.

본 발명의 다른 특히 바람직한 구현예는 서열번호 1-14에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 구성된 비정형 H. 인플루엔자 유래의 단백질 F 폴리펩티드 또는 그의 변이체에 관한 것이다.

본원에서 제공되는 정보, 예컨대 서열번호 15에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하여, 단백질 F 폴리펩티드를 인코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 표준 클로닝 및 스크리닝 방법, 예컨대 원료로서 비정형 H. 인플루엔자 균주 3224A (또는 3655) 세포를 이용하여 박테리아로부터 염색체 DNA 단편을 클로닝하고 서열 분석한 뒤 전장 클론을 수득함으로써 수득될 수 있다.

또한, 서열번호 15에 나타낸 각각의 DNA 서열은 당업자에게 널리 공지된 아미노산 잔기 분자량 값들을 이용하여 계산될 수 있는 추정 분자량을 갖는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 잔기의 개수를 대략 갖는 단백질을 인코딩하는 개방 해독틀을 포함한다.

출발 코돈에서 정지 코돈 사이의 서열번호 15의 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 1의 폴리펩티드를 인코딩한다.

추가 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하거나 이들로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다:

(a) 서열번호 15의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 15의 임의의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 85% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 97-99% 또는 정확한 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열; 또는

(b) 서열번호 1-14의 아미노산 서열(또는 그의 단편)의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1-14에서 선택된 임의의 아미노산 서열(또는 그의 단편)에 대해 적어도 85% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 97-99% 또는 100% 정확한 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열.

비정형 H. 인플루엔자 이외의 종들에서 유래된 동족체 및 오르소로그(ortholog)를 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15 또는 그의 단편에서 선택된 임의의 서열로 구성되거나 이를 포함하는 표지되거나 검출 가능한 탐침으로 엄격한 혼성화 조건 하에(예를 들어, 45 - 65℃ 범위의 온도 및 0.1 - 1%의 SDS 농도를 이용하여) 적절한 라이브러리의 스크리닝 단계; 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 전장 유전자 및/또는 게놈 클론의 단리 단계를 포함하는 절차에 의해 수득될 수 있다.

본 발명은 서열번호 15에 나타낸 코딩 서열(개방 해독틀)에 대해 그 전체 길이에 걸쳐 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 성숙 폴리펩티드 또는 그의 단편에 대한 코딩 서열 자체뿐만 아니라 다른 코딩 서열, 예컨대 리더 또는 분비성 서열, 프리-, 프로- 또는 프리프로-단백질 서열을 인코딩하는 서열과 해독틀에 있는 성숙 폴리펩티드 또는 단편에 대한 코딩 서열을 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한, 예를 들어 적어도 하나의 비코딩 5' 및 3' 서열, 예컨대 전사되지만 번역되지 않은 서열, 종료 신호(예컨대 rho-의존적 및 rho-독립적 종료 신호), 리보솜 결합 부위, Kozak 서열, mRNA를 안정화하는 서열, 인트론, 및 폴리아데닐화 신호를 비제한적으로 포함하는 적어도 하나의 비코딩 서열도 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 추가 아미노산을 인코딩하는 추가 코딩 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 폴리펩티드의 정제를 촉진하는 마커 서열이 인코딩될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 마커 서열은 pQE 벡터(Qiagen, Inc.)에서 제공하고 [Gentz 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 821 - 824 (1989)]에 기재된 바와 같은 헥사-히스티딘 펩티드, 또는 HA 펩티드 태그(Wilson 등, Cell 37: 767 (1984))이며, 이 둘 다 이들에 융합된 폴리펩티드 서열을 정제하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에는 또한 구조 유전자 및 유전자 발현을 조절하는 그 천연 연관 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 비제한적으로 포함된다.

서열번호 1-14의 단백질 F 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 15의 서열(또는 서열번호 15 내에 포함된 서열)을 인코딩하는 대응 폴리뉴클레오티드와 동일할 수 있다. 대안적으로, 유전 코드의 중복(축퇴)의 결과에서와 같이 서열번호 1-14의 폴리펩티드를 인코딩하는 임의의 서열일 수 있다.

본원에서 사용되는 "폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 용어에는 본 발명의 폴리펩티드, 특히 박테리아 폴리펩티드, 보다 특히 서열번호 1-14의 임의의 서열에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 비정형 H. 인플루엔자 단백질 F의 폴리펩티드 또는 그의 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 이 용어에는 또한 코딩 및/또는 비코딩 서열을 또한 포함할 수 있고, 추가 영역과 함께 폴리펩티드를 인코딩하는 단일 연속 영역 또는 비연속 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 통합 파지, 통합 삽입 서열, 통합 벡터 서열, 통합 트랜스포존 서열에 의해 또는 RNA 편집 또는 게놈 DNA 재구성으로 인해 단속된 폴리뉴클레오티드)가 포함된다.

본 발명은 또한 서열번호 1-14의 임의의 서열들의 추정 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 변이체를 인코딩하는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드들의 변이체에 관한 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편은, 예를 들어 본 발명의 전장 폴리뉴클레오티드를 합성하는데 이용될 수 있다.

B-세포 에피토프, 예를 들어 도 11에 기재된 단편/펩티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 재조합, 키메라성 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 바람직한 단편이다.

추가로 특히 바람직한 구현예는 몇몇, 소수, 5 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2, 1 또는 0개의 아미노산 잔기가 임의의 조합으로 치환, 개질, 결실되거나 및/또는 첨가된 서열번호 1-14의 임의의 서열의 단백질 F 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖는 단백질 F 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 이들 중에서 특히 바람직한 것은 단백질 F 폴리펩티드의 특성 및 활성(예를 들어 본원의 실시예 섹션에 기재된 특성)을 변형시키지 않는 침묵 치환, 추가 및 결실이다.

본 발명의 추가로 바람직한 구현예는 서열번호 1-14의 임의의 서열에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질 E 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 그의 전체 길이에 걸쳐 적어도 85% 동일한 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드이다. 대안적으로, 가장 높이 바람직한 것은 단백질 F 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 그 전체 길이에 걸쳐 적어도 90% 동일한 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드이다. 이와 관련하여, 이들에 대해 그 전체 길이에 걸쳐 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드가 특히 바람직하다. 또한, 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오티드 중에서 적어도 97% 동일한 폴리뉴클레오티드가 크게 바람직하며, 이들 중에서 적어도 98% 및 적어도 99% 동일한 것이 특히 크게 바람직하고, 적어도 99% 동일한 것이 더 바람직하다.

바람직한 구현예는 서열번호 15에서 선택된 DNA 서열에 의해 인코딩되는 성숙 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명의 특정한 바람직한 구현예에 따라, 단백질 F 폴리뉴클레오티드 서열들, 예컨대 서열번호 15의 폴리뉴클레오티드에, 특히 엄격한 조건 하에, 혼성화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명은 추가로 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이와 관련하여, 본 발명은 특히 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 "엄격한 조건" 및 "엄격한 혼성화 조건"이라는 용어는 서열 간에 적어도 95% 및 바람직하게는 적어도 97% 동일성이 존재하는 경우에만 혼성화가 일어남을 의미한다. 엄격한 혼성화 조건의 구체예는 50% 포름알데히드, 5xSSC(150mM NaCl, 15mM 트리나트륨 시트레이트), 50mM 나트륨 포스페이트(pH 7.6), 5x덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20㎍/㎖의 변성 전단 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 42℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션 후, 약 65℃에서 0.1xSSC 중 혼성화 지지체를 세척하는 것이다. 혼성화 및 세척 조건은 널리 공지되어 있으며 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)], 특히 11장에 예시되어 있다. 용액 혼성화를 또한 본 발명으로 제공되는 폴리뉴클레오티드 서열과 함께 이용할 수 있다.

본 발명은 또한 서열번호 15의 임의의 서열에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 전체 유전자를 포함하는 적절히 라이브러리를 엄격한 혼성화 조건 하에 서열번호 15에 대응하는 서열에 나타낸 상기 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편의 서열을 갖는 탐침으로 스크리닝하고; 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 단리하여 수득되는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되거나 이를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해 유용한 단편에는, 예를 들어 본원의 다른 곳에 자세히 기재된 탐침 및 프라이머가 포함된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 분석에 관해 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 예를 들어 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 단백질 F를 인코딩하는 전장 cDNA 및 게놈 클론들을 단리하고, 단백질 F 유전자에 대해 높은 동일성, 특히 높은 서열 동일성을 갖는 다른 유전자의 cDNA 및 게놈 클론을 단리하기 위해 RNA, cDNA 및 게놈 DNA에 대한 혼성화 탐침으로 이용될 수 있다. 이러한 탐침은 일반적으로 적어도 15개 뉴클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 포함할 것이다. 바람직하게는, 이러한 탐침은 적어도 30개 뉴클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 가질 것이며, 적어도 50개 뉴클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 가질 수 있다. 특히 바람직한 탐침은 적어도 20개 뉴클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 가질 것이며, 30개 미만의 뉴클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 가질 것이다.

단백질 F 유전자의 코딩 영역은 올리고뉴클레오티드 탐침을 합성하기 위해 서열번호 15에서 제공되는 DNA 서열을 이용한 스크리닝에 의해 단리될 수 있다. 이어서 본 발명의 유전자와 상보적인 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝하여 라이브러리의 어느 멤버에 탐침이 혼성화하는지를 결정한다.

전장 DNA들을 수득하거나, 또는 짧은 DNA를 연장하기 위한 여러 방법들, 예를 들어 cDNA 말단의 신속 증폭(RACE) 방법에 기반한 것(예를 들어, Frohman 등, PNAS USA 85: 8998-9002, 1988 참고)이 당업자에게 공지되어 있다. 기법의 최근 개질, 예를 들어 Marathon™ 기술(Clontech Laboratories Inc.)로 예시되는 것은 더 긴 cDNA에 대한 탐색을 크게 단순화하였다. Marathon™ 기술에서, cDNA는 선택된 조직에서 추출된 mRNA 및 각 말단 상에 결찰된 '어댑터' 서열로부터 제조된다. 이어서 유전자 특이적 및 어댑터 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조합을 이용하여 DNA의 "결손" 5' 말단을 증폭하기 위해 핵산 증폭(PCR)이 수행된다. 이어서 PCR 반응은 "네스트화" 프라이머, 즉 증폭된 생성물(전형적으로 어댑터 서열에서 3'에 추가 어닐링하는 어댑터 특이적 프라이머 및 선택된 유전자 서열에서 5'에 추가 어닐링하는 유전자 특이적 프라이머) 내에 어닐링하도록 설계된 프라이머를 이용하여 반복된다. 그 뒤, 본 반응의 생성물은 DNA 서열 분석에 의해 분석될 수 있고, 전장 DNA는 생성물을 직접 기존 DNA에 결합시켜 전체 서열을 얻거나 5' 프라이머의 설계를 위한 신규 서열 정보를 이용하여 별도의 전장 PCR을 수행하여 구축될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 분석에 관해 본원에서 추가 논의된 바와 같이 질환, 특히 인간 질환에 대한 치료 및 진단의 발견을 위한 연구 시약 및 재료로서 채용될 수 있다.

서열번호 15의 서열에서 유래된 올리고뉴클레오티드인 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 기재된 바와 같이 본원의 방법에서 이용될 수 있지만, 바람직하게는 PCR을 위해 사용되어 전체적으로 또는 부분적으로 본원에서 확인된 폴리뉴클레오티드가 감염 조직의 박테리아에서 전사되는지 여부를 결정한다. 이러한 서열은 또한 병원체가 획득된 감염 유형 및 감염 단계의 진단에서도 유용성을 가질 것이다.

본 발명은 또한 성숙 단백질 플러스 추가 아미노 또는 카복실-말단 아미노산 또는 성숙 폴리펩티드보다 적은 아미노산(예를 들어 성숙 형태가 둘 이상의 폴리펩티드 사슬을 갖는 경우)의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 서열은 다른 것들 중에서 전구체로부터 성숙 형태로의 단백질 가공에 역할을 할 수 있거나, 단백질 수송을 허용할 수 있거나, 단백질 반감기를 증가시키거나 단축시킬 수 있거나 또는 분석 또는 제조를 위한 단백질 조작을 촉진할 수 있다. 생체내에서 일반적인 경우와 같이, 추가 아미노산은 세포성 효소들에 의해 성숙 단백질로부터 가공되어 제거될 수 있다.

본 발명의 각각의 그리고 모든 폴리뉴클레오티드에 있어서, 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 이들 상보적인 폴리뉴클레오티드가 이들이 상보적인 각각의 폴리뉴클레오티드에 대해 완전히 상보적인 것이 바람직하다.

하나 이상의 프로서열에 융합된 폴리펩티드의 성숙 형태를 갖는 전구체 단백질은 폴리펩티드의 불활성 형태일 수 있다. 프로서열이 제거되면, 이러한 불활성 전구체는 일반적으로 활성화된다. 일부 또는 전체 프로서열이 활성화 전에 제거될 수 있다. 일반적으로, 이러한 전구체는 프로단백질로 불린다.

뉴클레오티드에 대한 표준 A, G, C, T/U 표시에 부가하여, "N"이라는 용어도 본 발명의 특정 폴리뉴클레오티드를 설명하는 데 이용될 수 있다. "N"은 임의의 네 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드가 DNA 또는 RNA 서열의 이러한 지정 위치에서 나타날 수 있음을 의미하지만, 정확한 해독틀에서 읽혔을 때 인접한 뉴클레오티드 위치와 함께 고려되는 경우 N이 이러한 해독틀에서 성숙 전 종료 코돈을 생성하는 효과를 가질 핵산이 아닌 것이 바람직하다.

종합적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 성숙 단백질, 성숙 단백질 플러스 리더 서열(프리단백질로 나타낼 수 있음), 프리단백질의 리더 서열이 아닌 하나 이상의 프로서열을 갖는 성숙 단백질의 전구체, 또는 가공 단계들 중에 일반적으로 제거되어 폴리펩티드의 활성 및 성숙 형태를 생성하는 리더 서열 및 하나 이상의 프로서열을 갖는 프로단백질의 전구체인 프리프로단백질을 인코딩할 수 있다.

본 발명의 측면에 따르면, 치료적 또는 예방적 목적, 구체적으로 유전적 면역접종을 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 용도가 제공된다.

유전적 면역접종에서의 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 용도는 바람직하게는 플라스미드 DNA의 근육 내로의 직접 주사(Wolff 등, Hum Mol Genet (1992) 1: 363, Manthorpe 등, Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), 특정 단백질 담체와 복합화된 DNA의 전달(Wu 등, J Biol Chem. (1989) 264: 16985), 칼슘 포스페이트를 이용한 DNA의 공침전(Benvenisty & Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551), 다양한 형태의 리포좀 중의 DNA 캡슐화(Kaneda 등, Science (1989) 243: 375), 입자 폭탄(Tang 등, Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun 등, DNA Cell Biol (1993) 12: 791) 및 클로닝된 레트로바이러스 벡터를 이용한 생체내 감염(Seeger 등, PNAS USA (1984) 81: 5849)과 같은 적합한 전달 방법을 채용할 것이다.

벡터, 숙주 세포, 발현 시스템

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터로 유전적으로 조작된 숙주 세포 및 재조합 기법에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 제조에 관한 것이다. 무세포 번역 시스템도 본 발명의 DNA 구축물로부터 유래한 RNA를 사용하여 이러한 단백질을 제조하는 데 채용될 수 있다.

본 발명의 재조합 폴리펩티드는 발현 시스템을 포함하는 유전적으로 조작된 숙주 세포로부터 당업자에게 널리 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 따라서 추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 시스템, 이러한 발현 시스템으로 유전적으로 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기법에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 제조에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩티드의 재조합적 제조를 위해, 숙주 세포는 본 발명의 발현 시스템 또는 그의 일부 또는 폴리뉴클레오티드를 도입하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 숙주 세포 내로의 도입은 여러 표준 실험실 매뉴얼, 예컨대 [Davis 등, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) 및 Sambrook 등, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 기재된 방법, 예컨대 칼슘 포스페이트 전달감염, DEAE-덱스트란 매개 전달감염, 트랜스벡션, 마이크로주사, 양이온성 지질-매개 전달감염, 전기천공, 공액, 형질도입, 스크레이프 로딩, 탄도 도입 및 감염으로 시행될 수 있다.

적절한 숙주의 대표예에는 박테리아 세포, 예컨대 연쇄상구균, 포도상구균, 장구균, 대장균, 방선균, 시아노박테리아, 바실러스 서브틸리스, 나이세리아 메닌지티디스, 헤모필러스 인플루엔자 및 모락셀라 카타랄리스의 세포; 진균 세포, 예컨대 효모, 클루베로마이세스, 사카로마이세스, 피치아, 바시디오마이세트, 칸디다 알비칸스 및 아스페르길러스의 세포; 곤충 세포, 예컨대 드로소필라 S2 및 스포돕테라 Sf9의 세포; 동물 세포, 예컨대 CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1의 세포 및 보웨스 흑색종 세포; 및 식물 세포, 예컨대 겉씨식물 또는 속씨식물의 세포가 포함된다.

다양한 발현 시스템을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 이러한 벡터에는 다른 것들 중에서, 염색체-, 에피솜- 및 바이러스-유래 벡터, 예를 들어 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포존, 효모 에피솜, 삽입 요소, 효모 염색체 요소, 바이러스, 예컨대 배큘로바이러스, 파포바 바이러스, 예컨대 SV40, 박시니아 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스, 피코나바이러스, 레트로바이러스, 및 알파바이러스에서 유래된 벡터 및 그의 조합으로부터 유래된 벡터, 예컨대 플라스미드 및 박테리오파지 유전자 요소에서 유래된 벡터, 예컨대 코스미드 및 파지미드가 포함된다. 발현 시스템 구축물은 발현을 조절할 뿐만 아니라 일으키는 조절 영역을 포함할 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드를 유지, 증식 또는 발현하거나 및/또는 폴리펩티드를 숙주에서 발현하는데 적합한 임의의 시스템 또는 벡터를 이와 관련하여 발현을 위해 이용할 수 있다. 적절한 DNA 서열은, 예를 들어 [Sambrook 등, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (상동)]에 나타낸 바와 같은 다양한 널리 공지되고 일상적인 기법에 의해 발현 시스템 내로 삽입될 수 있다.

진핵생물에서의 재조합 발현 시스템에서는 번역된 단백질이 소포체의 내강 내로, 원형질막 주위공간 내로 또는 세포외 환경 내로 분비되기 위해서 적절한 분비 신호가 발현 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다. 이러한 신호는 폴리펩티드에 내인성일 수도 있고 또는 이들이 이종성 신호일 수도 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 널리 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 가장 바람직하게는, 이온 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC)가 정제를 위해 채용된다. 폴리펩티드가 세포 내 합성, 단리 및/또는 정제 동안 변성되는 경우에는 단백질을 재폴딩하기 위해 널리 공지된 기법을 채용하여 활성 입체구조를 재생할 수 있다.

발현 시스템은 또한 살아 있는 재조합 미생물, 예컨대 바이러스 또는 박테리아일 수 있다. 관심 유전자를 살아 있는 재조합 바이러스 또는 박테리아의 게놈 내로 삽입할 수 있다. 이러한 살아 있는 벡터의 접종 및 생체내 감염은 항원의 생체내 발현 및 면역 반응의 유도를 야기할 것이다. 이러한 목적을 위해 사용되는 바이러스 및 박테리아에는, 예를 들어 폭스바이러스(예컨대, 박시니아, 계두, 카나리폭스), 알파바이러스(신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 베네주엘리안 말 뇌염 바이러스), 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 피코나바이러스(폴리오바이러스, 리노바이러스), 헤르페스바이러스(바리셀라 조스터 바이러스 등), 리스테리아, 살모넬라, 시겔라, BCG, 연쇄상구균이 있다. 이들 바이러스 및 박테리아는 병독성일 수 있고, 또는 생백신을 수득하기 위해 다양한 방식으로 약독화될 수 있다. 이러한 생백신도 본 발명의 일부를 형성한다.

진단, 예후 판정, 혈청형 분석 및 돌연변이 분석

본 발명은 또한 진단 시약으로 사용하기 위한 본 발명의 단백질 F 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 진핵생물, 특히 포유류, 특히 인간에서의 단백질 F 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 검출은 질환, 질환의 단계 확인, 약물에 대한 감염성 개체의 반응의 진단을 위한 진단 방법을 제공할 것이다. 진핵생물, 특히 포유류, 및 특히 인간, 특히 단백질 F 유전자 또는 단백질을 포함하는 개체로 감염되었거나 감염된 것으로 추정되는 인간은 본원에서 제공하는 방법뿐만 아니라 다양한 널리 공지된 기법에 의해 핵산 또는 아미노산 수준에서 검출될 수 있다.

예후 판정, 진단 또는 다른 분석을 위한 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 추정 감염되거나 및/또는 감염된 개인의 신체 재료로부터 수득될 수 있다. 임의의 이들 원천 유래의 폴리뉴클레오티드, 특히 DNA 또는 RNA는 검출을 위해 직접 이용될 수도 있고, 또는 분석 전에 PCR 또는 임의의 다른 증폭 기법을 이용하여 효소적으로 증폭될 수도 있다. RNA, 특히 mRNA, cDNA 및 게놈 DNA도 동일한 방식에서 이용될 수 있다. 증폭 시, 감염성 또는 개인에 존재하는 잔류 개체의 종들 및 균주의 특징 분석은 개체의 선택된 폴리뉴클레오티드의 유전형 분석으로 수행될 수 있다. 결실 및 삽입은 관련 개체, 바람직하게는 동일한 속의 상이한 종들 또는 동일한 종들의 상이한 균주로부터 선택된 기준 서열의 유전형에 대비한 증폭 생성물의 크기 변경으로 검출될 수 있다. 점 돌연변이는 증폭된 DNA를 표지된 단백질 F 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화하여 확인될 수 있다. 완벽하게 또는 상당히 일치하는 서열은 DNA 또는 RNA 각각에 대해 불완전하게 또는 더 상당히 불일치하는 두 가닥으로부터 DNase 또는 RNase 소화에 의해 또는 융점이나 탈변성 역학에서의 차이를 검출하여 구별될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열 차이는 또한 기준 서열에 비해 겔에서 폴리뉴클레오티드 단편의 전기영동 이동성 변형에 의해 검출될 수 있다. 이는 변성제와 함께 또는 이것이 없이 수행될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 차이도 직접적 DNA 또는 RNA 서열 분석으로 검출될 수 있다. 예를 들어 [Myers 등, Science, 230: 1242 (1985)]를 참고하라. 특정 위치에서의 서열 변경도 뉴클레아제 보호 분석, 예컨대 RNase, V1 및 S1 보호 분석 또는 화학적 절단 방법에 의해 드러날 수 있다. 예를 들어 [Cotton 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397-4401 (1985)]를 참고하라.

다른 구현예에서, 단백질 F 뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편을 포함하는 올리고뉴클레오티드 탐침의 어레이가 구축되어, 예를 들어 유전적 돌연변이, 혈청형, 분류학적 범주 또는 동정의 효율적 스크리닝을 수행할 수 있다. 어레이 기술 방법은 널리 공지되어 있고 일반적 적용 가능성을 가지며, 분자 유전학에서 유전자 발현, 유전자 연관 및 유전적 가변성을 포함하는 다양한 문제를 해결하기 위해 이용될 수 있다(예를 들어, Chee 등, Science, 274: 610 (1996) 참고).

따라서, 다른 측면에서 본 발명은 하기를 포함하는 진단 키트에 관한 것이다:

(a) 바람직하게는 서열번호 15의 임의의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편인, 본 발명의 폴리뉴클레오티드;

(b) (a)에 상보적인 뉴클레오티드 서열;

(c) 바람직하게는 서열번호 1-14의 임의의 폴리펩티드 또는 그의 단편인, 본 발명의 폴리펩티드; 또는

(d) 바람직하게는 서열번호 1-14의 임의의 폴리펩티드에 대한, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체.

임의의 이러한 키트에서, (a), (b), (c) 또는 (d)는 실질적 성분을 이룰 수 있음이 이해될 것이다. 이러한 키트는 다른 것들 중에서 질환의 진단 또는 질환에 대한 감수성에서의 용도를 가질 것이다.

본 발명은 또한 진단 시약으로서의 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 질환 또는 병원성과 연관된 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 서열번호 15의 임의의 서열의 돌연변이된 형태의 검출은 폴리뉴클레오티드의 저발현, 과발현 또는 변형된 발현으로 일어나는 질환의 진단, 질환 경과의 예후 판정, 질환 단계의 결정 또는 질환에 대한 감수성을 부가하거나 정의할 수 있는 진단 도구를 제공할 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드에 돌연변이를 수반하는 개체, 특히 감염성 개체는 다양한 기법, 예컨대 본원의 다른 곳에 기재된 기법에 의해 폴리뉴클레오티드 수준에서 검출될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드에서 돌연변이 또는 다형체(대립유전자 가변성)을 수반하는 개체의 세포는 또한, 예를 들어 혈청형 분석을 허용하는 다양한 기법에 의해 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 수준에서 검출될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR을 이용하여 RNA에서 돌연변이를 검출할 수 있다. 자동화검출 시스템, 예컨대 GeneScan과 함께 RT-PCR을 이용하는 것이 특히 바람직하다. RNA, cDNA 또는 게놈 DNA도 또한 동일한 목적으로 PCR에 이용될 수 있다. 예로서, 단백질 F 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 PCR 프라이머를 이용하여 돌연변이를 확인하고 분석할 수 있다.

본 발명은 또한 5' 및/또는 3' 말단에서 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오티드가 제거된 프라이머를 제공한다. 이들 프라이머는 다른 것들 중에서 개인, 예컨대 신체 재료 유래 표본에서 단리된 단백질 F DNA 및/또는 RNA를 증폭하는데 이용될 수 있다. 프라이머는 감염된 개인에서 단리된 폴리뉴클레오티드를 증폭하는데 사용된 뒤 폴리뉴클레오티드 서열을 규명하기 위한 다양한 기법에 적용될 수 있다. 이러한 방식으로, 폴리뉴클레오티드 서열에서의 돌연변이가 검출되고 감염 또는 그 단계 또는 경과를 진단하거나 및/또는 예후 판정하는데 또는 혈청형을 분석하거나 및/또는 감염제를 분류하는데 이용될 수 있다.

본 발명은 또한 개인, 예컨대 신체 재료에서 유래된 표본에서 서열번호 15의 임의의 서열의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 발현 증가 수준을 결정하는 것을 포함하는, 질환, 바람직하게는 박테리아 감염, 보다 바람직하게는 비정형 H. 인플루엔자로 야기되는 감염의 진단 방법을 제공한다. 단백질 F 폴리뉴클레오티드의 증가되거나 감소된 발현은 폴리뉴클레오티드의 정량을 위해 당분야에 널리 공지된 임의의 방법들, 예컨대 증폭, PCR, RT-PCR, RNase 보호, 노던 블로팅, 분광측정 및 다른 혼성화 방법을 이용하여 측정될 수 있다.

또한, 정상 대조군 조직 표본에 비해 단백질 F 폴리펩티드의 과발현을 검출하기 위한 본 발명에 따른 진단 분석은, 예를 들어 감염의 존재를 검출하는데 이용될 수 있다.

숙주, 예컨대 신체 재료 유래의 표본에서 단백질 F 폴리펩티드의 수준을 결정하는데 이용될 수 있는 분석 기법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 분석 방법에는 방사면역분석, 경쟁적-결합 분석, 웨스턴 블롯 분석, 항체 샌드위치 분석, 항체 검출 및 ELISA 분석이 포함된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 어레이, 바람직하게는 고집적 어레이 또는 그리드의 성분으로 이용될 수 있다. 이러한 고집적 어레이는 진단 및 예후 판정 목적을 위해 특히 유용하다. 예를 들어, 각각 상이한 유전자를 포함하고 추가로 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 스팟들의 세트는, 예컨대 혼성화 또는 핵산 증폭을 이용하여, 신체 표본에서 수득되거나 유래된 탐침을 이용하여 탐침검사를 위해 이용되어 개인에서 특정 폴리뉴클레오티드 서열 또는 관련 서열의 존재를 결정할 수 있다. 이러한 존재는 병원체, 특히 비정형 H. 인플루엔자의 존재를 시사할 수 있고, 질환 또는 질환의 경과의 진단 및/또는 예후 판정에 유용할 수 있다. 서열번호 15의 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 여러 변이체를 포함하는 그리드가 바람직하다. 서열번호 1-14의 임의의 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 여러 변이체가 또한 바람직하다.

항체

본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 또는 그의 변이체, 또는 이를 발현하는 세포를 면역원으로 사용하여 이러한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 각각에 대해 면역특이적인 항체를 제조할 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드 서열 내의 에피토프의 미모토프(mimotope), 특히 펩티드 미모토프가 또한 면역원으로 이용되어 본 발명의 폴리펩티드에 면역특이적인 항체를 제조할 수 있다. "면역특이적"이라는 용어는 항체가 선행 기술의 다른 관련 폴리펩티드에 대한 그의 친화도에 비해 본 발명의 폴리펩티드에 대해 실질적으로 더 큰 친화도를 갖는다는 것을 의미한다.

본 발명의 특정한 바람직한 구현예에서, 단백질 F 폴리펩티드들 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 항체가 제공된다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대해 생성된 항체는 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들 중 하나 또는 모두에 대한 에피토프-포함 단편, 이들 중 하나 또는 모두에 대한 유사체 또는 이들 중 하나 또는 모두를 발현하는 세포를 동물, 바람직하게는 비인간에게 일상적 프로토콜을 이용하여 투여함으로써 수득될 수 있다. 모노클로날 항체를 제조하기 위해서는, 연속 세포주 배양으로 제조되는 항체를 제공하는 당분야에 공지된 임의의 기법을 이용할 수 있다. 예들에는 다양한 기법, 예컨대 [Kohler, G. and Milstein, C, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor 등, Immunology Today 4: 72 (1983); Cole 등, pg. 77-96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985)]에서의 기법이 포함된다.

단일쇄 항체의 제조를 위한 기법(U.S. 특허 번호 4,946,778)을 채용하여 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 단일쇄 항체를 제조할 수 있다. 또한, 유전자 도입 마우스, 또는 다른 개체 또는 동물, 예컨대 다른 포유류를 이용하여 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대해 면역특이적인 인간화 항체를 발현할 수 있다.

대안적으로, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 갖는 항체 유전자를 항-단백질 F 활성의 보유에 대해 스크리닝된 인간의 림프구에서 PCR 증폭된 v-유전자의 레퍼토리로부터 또는 나이브 라이브러리로부터 선택할 수 있다(McCafferty 등, (1990), Nature 348, 552-554; Marks 등, (1992) Biotechnology 10, 779-783). 이들 항체의 친화도는 또한, 예를 들어 사슬 셔플링(Clackson 등, (1991) Nature 352: 628)에 의해 개선될 수 있다.

상술된 항체를 채용하여 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 클론을 단리하거나 동정하여, 예를 들어 친화도 크로마토그래피에 의해 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 정제할 수 있다.

따라서, 다른 것들 중에서 단백질 F 폴리펩티드 또는 단백질 F 폴리뉴클레오티드에 대한 항체를 채용하여 감염, 특히 박테리아 감염을 치료할 수 있다.

폴리펩티드 변이체에는 본 발명의 특정 측면을 형성하는 항원적, 에피토프적 또는 면역학적 균등 변이체가 포함된다.

바람직하게는 항체 또는 그의 변이체는 개인에서 그 면역원성이 더 적도록 개질된다. 예를 들어, 개인이 인간인 경우, 항체는 가장 바람직하게는 하이브리도마-유래 항체의 상보성 결정 영역 또는 영역들이 예를 들어 [Jones 등, (1986), Nature 321 , 522-525 또는 Tempest 등, (1991) Biotechnology 9, 266-273]에 기재된 바와 같이 인간 모노클로날 항체 내로 이식되어 "인간화"될 수 있다.

길항제 및 작동제 - 분석 및 분자

또한, 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 이용하여, 예를 들어 세포, 무세포 제조물, 화학적 라이브러리, 및 천연 생성물 혼합물에서 소분자 기질 및 리간드의 결합을 평가할 수 있다. 이들 기질 및 리간드는 천연 기질 및 리간드이거나 구조 또는 기능적 모사체일 수 있다. 예컨대, [Coligan 등, Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)]을 참고하라.

스크리닝 방법은 단순히 후보 화합물의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 또는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리펩티드의 융합 단백질을 포함하는 세포 또는 막에 대한 결합을 후보 화합물에 간적접으로 또는 직접적으로 연관된 표지 수단에 의해 측정할 수 있다. 대안적으로, 스크리닝 방법에는 표지된 경쟁제와의 경쟁이 관여될 수 있다. 또한, 이들 스크리닝 방법은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포에 적절한 검출 시스템을 이용하여 후보 화합물이 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성화 또는 저해에 의해 생성되는 신호를 일으키는지를 평가할 수 있다. 활성화 저해제는 일반적으로 공지된 작동제의 존재 하에 분석되며, 후보 화합물의 존재에 의한 작동제에 의한 활성화 효과가 관찰된다. 항상적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 항상적으로 발현되는 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 경우에 따라 후보 화합물이 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성화를 저해하는지를 평가함으로써 작동제 또는 저해제의 부재 하에 역 작동제 또는 저해제에 대한 스크리닝 방법에 채용될 수 있다. 또한, 스크리닝 방법은 단순히 후보 화합물을 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 용액과 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계, 혼합물 중 단백질 F 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 활성을 측정하는 단계, 및 혼합물의 단백질 F 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 활성을 표준물과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 융합 단백질, 예컨대 전술된 바와 같이 Fc 부분 및 단백질 F 폴리펩티드로 제조된 것들도 고처리량 스크리닝 분석을 위해 이용되어 본 발명의 폴리펩티드뿐만 아니라 계통유전적으로 및/또는 기능적으로 관련된 폴리펩티드의 길항제를 동정할 수 있다(D. Bennett 등, J Mol Recognition, 8:52-58 (1995); 및 K. Johanson 등, J Biol Chem, 270(16):9459-9471 (1995) 참고).

본 발명의 폴리펩티드와 결합하거나 및/또는 상호작용하는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 항체는 또한 세포에서 mRNA 및/또는 폴리펩티드의 제조에 대한 첨가 화합물의 효과를 검출하기 위한 스크리닝 방법을 구성하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 당분야에 공지된 표준 방법에 의해 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 이용하여 분비되거나 세포 연관된 폴리펩티드 수준을 측정하기 위해 ELISA 분석이 구축될 수 있다. 이는 적합하게 조작된 세포 또는 조직으로부터 폴리펩티드의 제조를 저해 또는 증강시킬 수 있는 제제(각각 길항제 또는 작동제로도 불림)를 발견하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명은 또한 단백질 F 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 작용을 증강시키거나(작동제) 또는 차단하는(길항제) 것들, 특히 정균 및/또는 살균 활성이 있는 화합물을 동정하기 위한 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 스크리닝 방법에는 고처리량 기법이 관여될 수 있다. 예를 들어, 작동제 또는 길항제를 스크리닝하기 위해, 단백질 F 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드의 표지된 기질 또는 리간드를 포함하는 합성 반응 혼합물, 세포성 구획, 예컨대 막, 세포 외피 또는 세포 벽, 또는 그의 임의의 제조물이 단백질 F 작동제 또는 길항제일 수 있는 후보 분자의 부재 또는 존재 하에 인큐베이션된다. 단백질 F 폴리펩티드를 작동시키거나 길항하는 후보 분자의 능력은 표지된 리간드의 결합 감소 또는 이러한 기질로부터의 생성물 제조 감소에 반영된다. 영향 없이, 즉 단백질 F 폴리펩티드의 효과들을 유도하지 않고 결합하는 분자들이 우수한 길항제들이 될 가능성이 가장 높다. 잘 결합하고 경우에 따라 기질로부터의 생성물 제조 속도를 증가시키거나, 신호 전달을 증가시키거나 또는 화학적 채널 활성을 증가시키는 분자들이 작동제들이다. 경우에 따라 기질로부터의 생성물 제조, 신호 전달 또는 화학적 채널 활성의 속도 또는 수준의 검출은 리포터 시스템을 이용하여 증강될 수 있다. 이와 관련하여 유용할 수 있는 리포터 시스템에는 열량측정, 생성물로 전환된 표지 기질, 단백질 F 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 활성의 변경에 관여하는 리포터 유전자, 및 당분야에 공지된 결합 분석이 비제한적으로 포함된다.

단백질 F 작동제에 대한 분석의 다른 예는 경쟁적 저해 분석을 위한 적절한 조건 하에 단백질 F 및 잠재적 작동제와 단백질 F 결합 분자, 재조합 단백질 F 결합 분자, 천연 기질 또는 리간드, 또는 기질 또는 리간드 모사체를 조합하는 경쟁적 분석이다. 단백질 F는 잠재적 길항제의 유효성을 평가하기 위해 결합 분자에 결합되거나 생성물로 전환된 여러 단백질 F 분자가 정확히 결정될 수 있도록, 예컨대 방사활성 또는 열량측정 화합물에 의해 표지될 수 있다.

잠재적 길항제에는, 다른 것들 중에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드에 결합하여 그 활성 또는 발현을 저해하거나 소멸시키는 유기 소분자, 펩티드, 폴리펩티드 및 항체가 포함된다. 잠재적 길항제는 또한 결합 분자에서 동일한 부위에 결합하는 유기 소분자, 펩티드, 폴리펩티드, 예컨대 밀접하게 관련된 단백질 또는 항체, 예컨대 단백질 F 유도 활성을 유도하지 않고 단백질 F 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 결합에서 배제함으로써 단백질 F 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 작용 또는 발현을 방지할 수 있는 결합 분자일 수 있다.

잠재적 길항제에는 폴리펩티드의 결합 부위에 결합하고 이를 점유하여 정상적 생물학적 활성이 방지되도록 세포성 결합 분자에 대한 결합을 방지하는 소분자가 포함된다. 소분자의 예에는 유기 소분자, 펩티드 또는 펩티드-유사 분자가 비제한적으로 포함된다. 다른 잠재적 길항제에는 안티센스 분자가 포함된다(Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988), 이들 분자에 대한 설명 참고). 바람직한 잠재적 길항제에는 단백질 F에 관련된 화합물 및 변이체가 포함된다.

추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편, 및 다양한 서브클래스의 면역글로불린(IgG, IgM, IgA, IgE)의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 다양한 부분들을 포함하는 유전적으로 조작된 가용성 융합 단백질에 관한 것이다. 면역글로불린으로 바람직한 것은 융합이 힌지 영역에서 일어나는 인간 IgG, 특히 IgG1의 중쇄의 불변부이다. 특정 구현예에서, Fc부는 혈액 응고 인자 Xa로 절단될 수 있는 절단 서열의 도입으로 간단히 제거될 수 있다. 또한, 본 발명은 유전자 조작에 의한 이들 융합 단백질의 제조 방법 및 그의 약물 스크리닝, 진단 및 치료를 위한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 추가 측면은 또한 이러한 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 융합 단백질 기술의 예는 국제 특허 출원 번호 WO94/29458 및 WO94/22914에서 찾아볼 수 있다.

본원에서 제공되는 각각의 폴리뉴클레오티드 서열은 항균 화합물의 발견 및 개발에 이용될 수 있다. 발현 시 인코딩되는 단백질은 항균 약물의 스크리닝을 위한 표적으로 이용될 수 있다. 추가적으로, 인코딩된 단백질의 아미노 말단 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 해당 mRNA의 샤인-달가노 또는 다른 번역 촉진 서열은 관심 코딩 서열의 발현을 조절하는 안티센스 서열을 구축하는데 이용될 수 있다.

본 발명은 또한 감염 후유증에 관여하는 병원체 또는 병원체 및 진핵생물, 바람직하게는 포유류, 숙주 간 초기의 물리적 상호작용을 방해하는 본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 작동제 또는 길항제의 용도를 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 분자는 다음에서 이용될 수 있다: 진핵생물, 바람직하게는 포유류, 내재 장치 상의 세포외 기질 단백질 또는 상처 내 세포외 기질 단백질에 대한 박테리아, 그람 양성 및/또는 그람 음성 박테리아의 부착 방지; 조직 손상을 매개하는 진핵생물, 바람직하게는 포유류, 세포외 기질 단백질 및 박테리아 단백질 F 단백질 간의 박테리아 부착 차단 및/또는; 내재 장치들의 삽입에 의한 또는 다른 수술 기법에 의한 것 이외로 개시되는 감염에서 발병기전의 일반 진행을 차단.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 단백질 F 작동제 및 길항제, 바람직하게는 정균 또는 살균 작동제 및 길항제가 제공된다.

본 발명의 길항제 및 작동제는, 예를 들어 질환을 예방, 저해 및/또는 치료하는데 채용될 수 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 미모토프에 관한 것이다. 미모토프는 천연 펩티드를 인지하는 항체에 의해 인식될 수 있을 만큼; 또는 적합한 담체에 커플링되는 경우 천연 펩티드를 인식하는 항체를 생성할 수 있을 만큼 천연 펩티드와 충분히 (서열적으로 또는 구조적으로) 유사한 펩티드 서열이다.

펩티드 미모토프는 선택된 아미노산들의 추가, 결실 또는 치환에 의해 특정 목적을 위해 설계될 수 있다. 따라서, 펩티드는 단백질 담체에 대한 공액의 용이성 목적을 위해 개질될 수 있다. 예를 들어, 일부 화학적 공액 방법에 있어서 말단 시스테인을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 단백질 담체에 공액된 펩티드에 있어서 펩티드의 공액 말단에서 멀리 소수성 말단을 포함시켜서 펩티드의 자유 미공액 말단이 담체 단백질 표면과 여전히 연합될 수 있도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서 전체 천연 문자의 맥락에서 확인되는 펩티드와 가장 밀접하게 가까운 입체구조의 펩티드가 제공된다. 예를 들어, 펩티드는 N-말단 시스테인 및 C-말단 소수성 아미드화 꼬리를 갖도록 변형될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 아미노산의 D-입체이성질체(인버소 서열)의 추가 또는 치환을 수행하여, 예를 들어 펩티드의 안정성을 증강시키는 유익한 유도체를 생성할 수 있다. 미모토프는 또한 서열 배향이 역전되었다는 점에서 천연 펩티드 서열의 레트로 서열일 수 있다. 미모토프는 또한 성질 상 레트로-인버소일 수 있다. 레트로, 인버소 및 레트로-인버소 펩티드는 WO 95/24916 및 WO 94/05311에서 설명된다.

대안적으로, 펩티드 미모토프는 기법, 예컨대 파지 디스플레이 기술(EP 0 552 267 B1)을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드에 대해 스스로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 동정될 수 있다. 이 기법은 천연 펩티드의 구조를 모방하며, 이에 따라 항-천연 펩티드 항체에 결합할 수 있지만 이들 스스로가 반드시 천연 펩티드와 상당한 서열 상동성(homology)을 공유하지는 않을 수 있는 다수의 펩티드 서열을 생성한다.

백신

본 발명의 다른 측면은 개인에게 항체 및/또는 T 세포 면역 반응을 일으키기 적절한 단백질 F 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드, 또는 그의 단편 또는 변이체를 접종하여 상기 개인을 감염, 특히 박테리아 감염, 가장 특히 비정형 H. 인플루엔자 감염으로부터 보호하는 것을 포함하는, 개인, 특히 포유류, 바람직하게는 인간에서의 면역학적 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한 이러한 면역학적 반응으로 박테리아 복제를 둔화시키는 방법이 제공된다. 본 발명의 다른 측면은 면역학적 반응을 유도하기 위해, 예컨대 상기 개인, 바람직하게는 인간을 질환에서 (질환이 개인 내에서 이미 확립되었는지와는 무관하게) 보호하기 위해 사이토카인-생성 T 세포 또는 세포독성 T 세포를 포함하는 항체 및/또는 T 세포 면역 반응을 생성하기 위해, 생체내에서 단백질 F 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드, 또는 그의 단편 또는 변이체를 발현하도록 단백질 F 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드, 또는 그의 단편 또는 변이체의 발현을 지시하는 핵산 벡터, 서열 또는 리보자임을 개인에게 전달하는 것을 포함하는, 개인에서의 면역학적 반응의 유도 방법에 관한 것이다. 유전자 투여의 한 예는 이것을 입자 상의 코팅으로 또는 다른 방식으로 원하는 세포 내로 가속화하는 것이다. 이러한 핵산 벡터는 DNA, RNA, 리보자임, 개질 핵산, DNA/RNA 하이브리드, DNA-단백질 복합체 또는 RNA-단백질 복합체를 포함할 수 있다.

본 발명의 추가 측면은 개인, 바람직하게는 그 내부에서 면역학적 반응을 유도할 수 있는 인간 내로 도입되는 경우, 이러한 개인에서 이들로부터 인코딩되는 단백질 F 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드에 대한 면역학적 반응을 유도하는 면역학적 조성물에 관한 것이며, 여기서 조성물은 그로부터 인코딩되는 재조합 단백질 F 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 포함하거나 및/또는 상기 단백질 F 폴리뉴클레오티드, 이로부터 인코딩되는 폴리펩티드, 또는 본 발명의 다른 폴리펩티드의 항원을 인코딩하고 발현하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 면역학적 반응은 치료적으로 또는 예방학적으로 이용될 수 있으며, 항체 면역성 및/또는 세포성 면역성, 예컨대 CTL 또는 CD4+ T 세포로부터 야기되는 세포성 면역의 형태를 취할 수 있다.

단백질 F 폴리펩티드 또는 그의 단편은 스스로 항체를 생성할 수 있거나 없지만 제1 단백질을 안정화하고 항원성 및/또는 면역원성 특성, 및 바람직하게는 보호 특성을 가질 융합 또는 개질 단백질을 제조할 수 있는 공단백질 또는 화학적 부분과 융합될 수 있다. 따라서 융합 재조합 단백질은 바람직하게는 항원성 공단백질, 예컨대 지단백질 또는 헤모필러스 인플루엔자의 단백질 D(EP 594610), H. 인플루엔자의 단백질 E(EP 1 973 933), 글루타치온-S-트랜스퍼라아제(GST) 또는 베타-갈락토시다아제, 또는 단백질을 가용화하고 그의 제조 및 정제를 촉진하는 임의의 다른 상대적으로 큰 공단백질을 추가로 포함한다. 또한, 공단백질은 단백질을 투여받는 개체의 면역계의 전신 자극을 제공하는 관점에서 보강제로서 작용할 수 있다. 공단백질은 제1 단백질의 아미노- 또는 카복시-말단에 부착될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물에서, 단백질 F 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 단편, 또는 미모토프, 또는 변이체는 벡터, 예컨대 전술된 살아 있는 재조합 벡터, 예를 들어 살아 있는 박테리아 벡터에 존재할 수 있다.

단백질 F 폴리펩티드에 대한 살아있지 않은 벡터, 예를 들어 박테리아 외막 운반체 또는 "소포"도 적합하다. OM 소포는 그람-음성 박테리아의 이중막의 외막에서 유래되며, C. 트라코마티스 및 C. 프시타시를 포함하는 여러 그람-음성 박테리아에서 보고되었다(Zhou, L 등, 1998. FEMS Microbiol. Lett. 163:223-228). 소포를 제조하는 것으로 보고된 박테리아 병원체의 비배타적 목록에는 하기가 또한 포함된다: 보르데텔라 퍼투시스, 보렐리아 부르그도르페리, 브루셀라 멜리텐시스, 브루셀라 오비스, 대장균, 헤모필러스 인플루엔자, 레지오넬라 뉴모필라, 모락셀라 카타랄리스, 나이세리아 고노로애, 나이세리아 메닌지티디스, 슈도모나스 애루기노사 및 예르시니아 엔테로콜리티카.

소포는 그의 천연 입체구조에서 외막 단백질을 제공하는 이점을 가지므로, 백신을 위해 특히 유용하다. 소포는 또한 외막에서 하나 이상의 분자의 발현을 개질하도록 박테리아를 조작하여 백신 용도를 위해 개선될 수 있다. 따라서, 예를 들어 외막에서 원하는 면역원성 단백질, 예컨대 단백질 F 폴리펩티드의 발현이 도입되거나 상향 조절될 수 있다(예컨대 프로모터를 변경함으로써). 대신 또는 부가하여, 관련되지 않거나(예컨대 비보호성 항원 또는 면역우성이지만 가변성인 단백질) 또는 해로운(예컨대 독성 분자, 예컨대 LPS, 또는 자가 면역 반응의 잠재적 유도제) 외막 분자의 발현은 하향 조절될 수 있다. 이러한 접근은 아래에서 보다 상세히 논의된다.

단백질 F 유전자의 비코딩 인접 영역은 유전자의 발현에서 중요한 조절 요소를 포함한다. 상기 조절은 전사 및 번역 수준에서 모두 일어난다. 유전자의 개방 해독틀의 상류 또는 하류인 이들 영역의 서열은 DNA 서열 분석에 의해 수득될 수 있다. 상기 서열 정보는 잠재적 조절 모티프, 예컨대 상이한 프로모터 요소, 종료자 서열, 유도성 서열 요소, 억제인자, 상 가변성에 관여하는 요소, 샤인 달가노 서열, 조절에 관여하는 잠재적 이차 구조를 갖는 영역뿐만 아니라 다른 유형의 조절 모티프 또는 서열을 결정할 수 있도록 한다. 상기 서열은 본 발명의 추가 측면이다.

본 서열 정보는 단백질 F 유전자의 자연적 발현을 조정할 수 있게 한다. 유전자 발현의 상향 조절은 프로모터, 샤인 달가노 서열, 잠재적 억제인자 또는 작동인자 요소, 또는 관여되는 임의의 다른 요소에 의해 달성될 수 있다. 마찬가지로, 발현의 하향 조절은 유사한 유형의 개질에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 상 가변성 서열을 변경하여, 유전자의 발현을 상 가변성 조절 하에 넣을 수도 있고, 또는 이를 본 조절과 연결되지 않도록 할 수도 있다. 다른 접근에서, 유전자의 발현은 조절 발현을 허용하는 하나 이상의 유도성 요소의 조절 하에 놓일 수 있다. 이러한 조절의 예에는 온도 변화에 의한 유도, 선택된 탄수화물 또는 그의 유도체와 같은 유도제 기질의 추가, 미량 원소, 비타민, 보조-인자, 금속 이온 등이 비제한적으로 포함된다.

상술된 바와 같은 이러한 개질은 여러 상이한 수단에 의해 도입될 수 있다. 유전자 발현에 관여되는 서열의 개질은 무작위 돌연변이화에 의해 생체내에서 수행된 후 원하는 표현형에 대해 선택될 수 있다. 다른 접근은 관심 영역을 단리하고, 이를 무작위 돌연변이화, 또는 부위-지정 교체, 삽입 또는 결실 돌연변이화에 의해 개질하는 것으로 구성된다. 이어서 개질된 영역은 상동성 재조합에 의해 박테리아 게놈 내로 재도입될 수 있고, 유전자 발현에 대한 효과가 평가될 수 있다. 다른 접근에서, 관심 영역의 서열 지식은 자연적 조절 서열의 전체 또는 일부를 교체 또는 삭제하는데 이용될 수 있다. 이러한 경우, 표적 조절 영역은 다른 유전자 유래의 조절 요소, 상이한 유전자 유래의 조절 요소의 조합, 합성 조절 영역 또는 임의의 다른 조절 영역을 포함하거나 야생형 조절 서열의 선택된 부분을 삭제하도록 단리 및 개질된다. 이어서 이들 개질된 서열은 박테리아 내로 상동성 재조합을 통해 게놈 내로 재도입될 수 있다. 유전자 발현의 상향 조절을 위해 이용될 수 있는 바람직한 프로모터의 비배타적 목록에는 N. 메닌지티디스 또는 N. 고노로애 유래의 프로모터 porA, porB, IbpB, tbpB, p110, lst, hpuAB; ompCD, copB, lbpB, ompE, UspA1; UspA2; M. 카타랄리스 유래의 TbpB; H. 인플루엔자 유래의 p1, p2, p4, p5, p6, lpD, pE, tbpB, D15, Hia, Hmw1, Hmw2가 포함된다.

한 예에서, 유전자 발현은 그 프로모터를 더 강한 프로모터로 변경하여(유전자 상류 서열을 단리하고, 이 서열을 시험관내 개질하고 상동성 재조합에 의해 게놈 내로 재도입하여) 조정될 수 있다. 박테리아뿐만 아니라 박테리아에서 떨어진(또는 제조된) 외막 운반체 모두에서 조절되지 않는 발현을 얻을 수 있다.

다른 예에서, 기재된 접근을 이용하여 백신 용도를 위해 개선된 특징을 갖는 재조합 박테리아 균주를 생성할 수 있다. 이들은 비제한적으로 약독화 균주, 선택된 항원의 발현이 증가된 균주, 면역 반응을 방해하는 유전자가 녹아웃된(또는 발현이 감소된) 균주, 면역우성 단백질의 발현이 조정된 균주, 외막 운반체의 벗겨짐이 조정된 균주일 수 있다.

따라서, 외막에 위치한 단백질 F 단백질의 발현 수준을 변형시키는 이종성 조절 요소를 포함하는 단백질 F 유전자의 개질된 상류 영역이 본 발명에 의해 제공된다. 본 발명의 이러한 측면에 따른 상류 영역에는 단백질 F 유전자의 상류 서열이 포함된다. 상류 영역은 단백질 F 유전자의 바로 상류에서 시작하며 보통 ATG 시작 코돈에서부터 유전자의 약 1000bp 상류 이하의 위치까지 계속된다. 유전자가 다시스트론 서열(오페론)에 위치한 경우, 상류 영역은 관심 유전자에 바로 앞에서 또는 오페론의 첫 번째 유전자의 앞에서 시작될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 이러한 측면에 따른 개질된 상류 영역은 ATG의 상류 500 및 700bp 사이의 위치에 이종성 프로모터를 포함한다.

단백질 F 유전자의 발현을 상향 조절하기 위한 개시된 상류 영역의 용도, (예를 들어 본원에 참조로 도입된 WO 01/09350에 기재된 바와 같은) 상동성 재조합을 통한 이의 달성 방법, 상기 목적에 적합한 상류 서열을 포함하는 벡터, 및 이렇게 변형된 숙주 세포가 모두 본 발명의 추가 측면들이다.

따라서, 본 발명은 개질된 박테리아 소포 중의 단백질 F 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 추가로 살아있지 않은 막 기재 소포 벡터를 제조할 수 있는 개질된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 추가로 이종성 조절 요소를 포함하는 개질된 상류 영역을 갖는 단백질 F 유전자를 포함하는 핵산 벡터를 제공한다.

본 발명에서는 또한 본 발명에 따른 숙주 세포 및 박테리아 소포의 제조 방법을 제공한다.

또한 본 발명에서는 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 및 면역자극성 DNA 서열, 예컨대 [Sato, Y. 등, Science 273: 352 (1996)]에 기재된 것들을 포함하는 조성물, 특히 백신 조성물, 및 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 H. 인플루엔자 감염의 동물 모델에서 이러한 유전자 면역접종 실험에 이용되는 폴리뉴클레오티드 구축물 중에서 박테리아 세포 표면 단백질의 비가변 영역을 인코딩하는 것으로 나타난, 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 특정 단편의 사용 방법을 제공한다. 이러한 실험은 예방적 또는 치료적 면역 반응을 야기할 수 있는 단백질 에피토프를 동정하는 데 특히 유용할 것이다. 이러한 접근은 포유류, 특히 인간에서 박테리아 감염, 특히 H. 인플루엔자 감염의 예방제들 또는 치료적 처치의 개발을 위해, 동물이 감염에 성공적으로 저항하거나 이를 제거하는데 필요한 기관에서 유래된 특별한 가치의 모노클로날 항체의 후속 제조를 가능케 할 것으로 여겨진다.

본 발명에는 또한 적합한 담체, 예컨대 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 본 발명의 면역원성 재조합 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신 제형이 포함된다. 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 위에서 소화될 수 있으므로, 각각 바람직하게는, 예를 들어 피하, 근육내, 정맥내, 또는 피내 투여를 포함하는 비경구로 투여된다. 비경구 투여에 적합한 제형에는 항산화제, 완충액, 정균 화합물 및 제형을 개인의 체액, 바람직하게는 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 또는 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 포함된다. 제형은 단일 용량 또는 다중 용량 용기, 예를 들어 밀봉 앰플 및 바이알에 제공될 수 있으며, 사용 직전에 멸균 액체 담체의 추가만을 필요로 하는 동결 건조 상태로 보관될 수 있다.

본 발명의 백신 제형에는 또한 제형의 면역원성을 증강시키기 위한 보강제 시스템이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 보강제 시스템은 우선적으로 TH1 유형의 반응을 일으킨다.

면역 반응은 폭넓게는 체액성 또는 세포 매개 면역 반응(전통적으로 각각 항체 및 세포성 효과기 보호 기전을 특징으로 함)의 두 극단적 범주로 구별될 수 있다. 이들 반응 범주는 TH1-유형 반응(세포-매개 반응), 및 TH2-유형 면역 반응(체액성 반응)으로 명명된다.

극도의 TH1-유형 면역 반응은 항원 특이적, 일배체형에 제한된 세포독성 T 림프구, 및 천연 킬러 세포 반응의 생성을 특징으로 할 수 있다. 마우스에서, TH1-유형 반응은 종종 IgG2a 아형 항체의 생성을 특징으로 하는 반면, 인간에서 이들은 IgG1 유형 항체에 해당된다. TH2-유형 면역 반응은 마우스에서 IgG1, IgA, 및 IgM을 포함하는 광범위한 면역글로불린 이소형의 생성을 특징으로 한다.

이들 두 유형의 면역 반응의 발생 뒤에 있는 추진력은 사이토카인으로 간주될 수 있다. 고수준의 TH1-유형 사이토카인은 주어진 항원에 대한 세포 매개 면역 반응의 유도를 선호하는 반면, 고수준의 TH2-유형 사이토카인은 항원에 대한 체액성 면역 반응의 유도를 선호한다.

TH1 및 TH2-유형 면역 반응 간의 구별은 절대적인 것이 아니다. 사실, 개인은 주로 TH1 또는 주로 TH2로 나타내는 면역 반응을 지지할 것이다. 그러나, 종종 Mosmann 및 Coffman[Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173]에서의 쥐과 CD4 +ve T 세포 클론에 설명된 관점으로 사이토카인 패밀리들을 고려하는 것이 편리하다. 전통적으로 TH1-유형 반응은 T-림프구에 의한 INF-γ 및 IL-2 사이토카인의 제조와 연관된다. 다른 사이토카인들은 종종 T-세포에 의해 생성되지 않는 TH1-유형 면역 반응, 예컨대 IL-12의 유도와 직접 연관된다. 대조적으로, TH2-유형 반응은 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-13의 분비와 연관된다.

특정 백신 보강제는 TH1 또는 TH2-유형 사이토카인 반응의 자극에 특히 적합한 것으로 알려져 있다. 전통적으로 백신접종 또는 감염 후 면역 반응의 TH1:TH2 균형의 최고 표지자에는 항원으로의 재자극 후 시험관내 T 림프구에 의한 TH1 또는 TH2 사이토카인 제조의 직접적 측정 및/또는 항원 특이적 항체 반응의 IgG1:IgG2a 비의 측정이 포함된다.

따라서, TH1-유형 보강제는 시험관내에서 항원으로 재자극되는 경우 고수준의 TH1-유형 사이토카인을 생성하는 단리된 T-세포군을 자극하고 TH1-유형 이소형과 연관된 CD8+ 세포독성 T 림프구 및 항원 특이적 면역글로불린 반응 모두의 발생을 촉진하는 것이다.

TH1 세포 반응의 우선적 자극이 가능한 보강제는 국제 특허 출원 번호 WO 94/00153 및 WO 95/17209에 기재되어 있다.

3데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)은 이러한 보강제의 하나이다. 이것은 GB 2220211(Ribi)에 알려져 있다. 이것은 화학적으로 3데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6 아실화 사슬의 혼합물이며, Ribi Immunochem, Montana에서 제조된다. 3데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A의 바람직한 형태는 유럽 특허 0 689 454 B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)에 개시되어 있다.

바람직하게는, 3D-MPL의 입자는 0.22마이크론 막을 통해 멸균 여과되기 충분히 작다(유럽 특허 번호 0 689 454).

3D-MPL은 용량 당 10㎍ - 100㎍, 바람직하게는 25-50㎍ 범위로 존재할 것이며, 여기서 항원은 전형적으로 용량 당 2-50㎍ 범위로 존재할 것이다.

다른 바람직한 보강제에는 사포나리아 몰리나 피 껍질에서 유래된 HPLC 정제 무독성 분획인 QS21이 포함된다. 선택적으로, 이것은 3데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)와, 선택적으로는 담체와 함께 혼합될 수 있다.

QS21의 제조 방법은 US 특허 번호 5,057,540에 개시된다.

QS21을 포함하는 비면역반응성 보강제 제형이 앞서 설명되었다(WO 96/33739). QS21 및 콜레스테롤을 포함하는 이러한 제형은 항원과 함께 제형화되는 경우, 성공적인 TH1 자극 보강제인 것으로 나타났다.

TH1 세포 반응의 우선적 자극제인 추가 보강제에는 면역조정 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 WO 96/02555에 개시된 바와 같은 비메틸화 CpG 서열이 포함된다.

예컨대 상술된 바와 같은 상이한 TH1 자극 보강제의 조합도 TH1 세포 반응의 우선적 자극제인 보강제를 제공하는 것으로 포함된다. 예를 들어, QS21은 3D-MPL과 함께 제형화될 수 있다. QS21:3D-MPL의 비는 전형적으로 1:10 내지 10:1; 바람직하게는 1:5 내지 5:1, 종종 실질적으로 1:1의 범위일 것이다. 최적 상승효과를 위해 바람직한 범위는 2.5:1 내지 1:1의 3D-MPL:QS21이다.

바람직하게는 담체가 또한 본 발명에 따른 백신 조성물 중에 존재한다. 담체는 수중유 에멀전, 또는 알루미늄 염, 예컨대 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 히드록시드일 수 있다.

바람직한 수중유 에멀전은 대사 가능한 오일, 예컨대 스쿠알렌, 알파 토코페롤 및 Tween 80을 포함한다. 특히 바람직한 측면에서, 본 발명에 따른 백신 조성물 중 항원은 이러한 에멀전 중에서 QS21 및 3D-MPL과 조합된다. 추가로, 수중유 에멀전은 span 85 및/또는 레시틴 및/또는 트리카프릴린을 포함할 수 있다.

전형적으로 인간 투여를 위해, QS21 및 3D-MPL은 백신 중에 용량 당 1㎍-200㎍, 예컨대 10-100㎍, 바람직하게는 10㎍-50㎍의 범위로 존재할 것이다. 전형적으로 수중유는 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 알파 토코페롤 및 0.3 내지 3% tween 80을 포함할 것이다. 바람직하게는 스쿠알렌:알파 토코페롤의 비는 이것이 보다 안정한 에멀전을 제공하기 때문에 1 이하이다. Span 85는 또한 1% 수준으로 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 본 발명의 백신은 추가로 안정화제를 포함할 것이 유리할 수 있다.

무독성 수중유 에멀전은 수성 담체 중에 바람직하게는 무독성 오일, 예컨대 스쿠알란 또는 스쿠알렌, 에멀전화제, 예컨대 Tween 80을 포함한다. 수성 담체는, 예를 들어 포스페이트 완충 식염수일 수 있다.

수중유 에멀전 중 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤이 관여되는 특히 강력한 보강제 제형은 WO 95/17210에 기재되어 있다.

본 발명을 특정 단백질 F 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 참조하여 설명하였지만, 이것이 천연 생성 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 단편, 및 재조합 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 면역원성 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가, 결실 또는 치환을 갖는 유사한 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포괄함이 이해되어야 한다. 바람직한 단편/펩티드를 도 11에 나타낸다.

본 발명은 또한 다른 항원, 구체적으로 중이염 치료를 위해 유용한 항원과의 조합으로 본 발명의 백신 제형을 포함하는 다가 백신 조성물을 제공한다. 이러한 다가 백신 조성물에는 전술된 바와 같은 TH-1 유도 보강제가 포함될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드, 단편 및 면역원은 하나 이상의 하기 항원군과 함께 제형화된다: a) 하나 이상의 폐렴구균성 협막 다당류(단순한 것 또는 담체 단백질에 공액된 것); b) M. 카타랄리스 감염에 대해 숙주를 보호할 수 있는 하나 이상의 항원; c) 스트렙토코커스 뉴모니애 감염에 대해 숙주를 보호할 수 있는 하나 이상의 단백질 항원; d) 하나 이상의 추가 비정형 헤모필러스 인플루엔자 단백질 항원; e) RSV에 대해 숙주를 보호할 수 있는 하나 이상의 항원; 및 f) 인플루엔자 바이러스에 대해 숙주를 보호할 수 있는 하나 이상의 항원. 군들 a) 및 b); b) 및 c); b), d), 및 a) 및/또는 c); b), d), e), f), 및 a) 및/또는 c)의 조합이 바람직하다. 이러한 백신들은 유리하게는 전반적인 중이염 백신으로 사용될 수 있다.

폐렴구균성 협막 다당류 항원은 바람직하게는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F(가장 바람직하게는 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F)로부터 선택된다.

바람직한 폐렴구균성 단백질 항원은 폐렴구균의 외부 표면에 노출된 폐렴구균성 단백질(폐렴구군의 생활사 중 적어도 일부 동안 숙주의 면역계에 의해 인식될 수 있음), 또는 폐렴구균에 의해 분비되거나 방출되는 단백질이다. 가장 바람직하게는, 단백질은 스트렙토코커스 뉴모니애의 독소, 부착분자, 2-성분 신호 변환기, 또는 지단백질, 또는 그의 단편이다. 특히 바람직한 단백질에는 비제한적으로 뉴모라이신(바람직하게는 화학적 처치 또는 돌연변이에 의해 탈독화된 것) [Mitchell 등, Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell 등, Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties.", WO 96/05859(A. Cyanamid), WO 90/06951(Paton 등), WO 99/03884(NAVA)]; PspA 및 그의 막통과 결실 변이체(WO 92/14488; WO 99/53940; US 5804193 - Briles 등); PspC 및 그의 막통과 결실 변이체(WO 99/53940; WO 97/09994 - Briles 등); PsaA 및 그의 막통과 결실 변이체(Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); 폐렴구균성 콜린 결합 단백질 및 그의 막통과 결실 변이체; CbpA 및 그의 막통과 결실 변이체(WO 97/41151; WO 99/51266); 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나아제(Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70(WO 96/40928); PcpA(Sanchez-Beato 등, FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); M 유사 단백질, SB 특허 출원 번호 EP 0837130; 및 부착분자 18627(SB 특허 출원 번호 EP 0834568)이 포함된다. 추가로 바람직한 폐렴구균성 단백질 항원은 WO 98/18931에 개시된 것들, 특히 WO 98/18930 및 PCT/US99/30390에서 선택된 것들이다.

조합 백신에 포함될 수 있는(특히 중이염 예방을 위한) 바람직한 모락셀라 카타랄리스 단백질 항원은 다음과 같다: OMP106[WO 97/41731(Antex) & WO 96/34960(PMC)]; OMP21; LbpA 및/또는 LbpB[WO 98/55606(PMC)]; TbpA 및/또는 TbpB[WO 97/13785 & WO 97/32980(PMC)]; CopB[Helminen ME 등(1993) Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspA1 및/또는 UspA2[WO 2007/018463(Arne Forsgren AB), WO 93/03761(University of Texas)]; OmpCD; HasR(PCT/EP99/03824); PilQ(PCT/EP99/03823); OMP85(PCT/EP00/01468); lipo06(GB 9917977.2); lipo10(GB 9918208.1); lipo11(GB 9918302.2); lipo18(GB 9918038.2); P6(PCT/EP99/03038); D15(PCT/EP99/03822); OmplA1(PCT/EP99/06781); Hly3(PCT/EP99/03257); 및 OmpE.

조합 백신에 포함될 수 있는(특히 중이염 예방을 위한) 바람직한 추가 비정형 헤모필러스 인플루엔자 단백질 항원에는 하기가 포함된다: 핌브린 단백질[(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] 및 이들 유레의 펩티드를 포함하는 융합물[예, LB1(f) 펩티드 융합물; US 5843464(OSU) 또는 WO 99/64067]; OMP26[WO 97/01638(Cortecs)]; P6[EP 281673(State University of New York)]; 단백질 D(EP 594610); 단백질 E(EP 1 973 933); TbpA 및/또는 TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); P2; P5(WO 94/26304); NlpC2(BASB205)[WO 02/30971]; Slp(BASB203)[WO 02/30960]; 및 iOMP1681(BASB210)[WO 02/34772].

바람직한 인플루엔자 바이러스 항원에는 계란 또는 MDCK 세포, 또는 Vero 세포에서 배양된 전체 생 바이러스 또는 비활성화 바이러스, 분리된 인플루엔자 바이러스, 전체 플루 바이로솜([R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920]에 기재된 것들) 또는 그의 정제 또는 재조합 단백질, 예컨대 HA, NP, NA, 또는 M 단백질, 또는 그의 조합이 포함된다.

바람직한 RSV(호흡기 세포융합 바이러스) 항원에는 F 당단백질, G 당단백질, HN 단백질, 또는 그의 유도체가 포함된다.

조성물, 키트 및 투여

본 발명의 추가 측면에서는 세포 또는 다세포성 개체로 투여하기 위한 단백질 F 폴리뉴클레오티드 및/또는 단백질 F 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 제공된다.

본 발명은 또한 본원에서 논의된 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드 또는 그의 작동제 또는 길항제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 개인에게 투여하기 적합한 세포, 조직 또는 개체, 예컨대 약학적 담체와 사용하기 위한 비멸균 또는 멸균 담체 또는 담체들과 조합으로 채용될 수 있다. 이러한 조성물은, 예를 들어 배지 첨가제 또는 본 발명의 치료적 유효량의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체에는 비제한적으로 식염수, 완충 식염수, 덱스트로오스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 그의 조합이 포함될 수 있다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다. 본 발명은 또한 본 발명의 상술된 조성물의 하나 이상의 성분로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 진단 및 약학 팩들 및 키트에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 다른 화합물은 단독으로, 또는 다른 화합물, 예컨대 치료적 화합물과의 조합으로 채용될 수 있다.

약학적 조성물은 다른 것들 중에서, 예를 들어 국소, 경구, 항문, 질, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비강내 또는 피내 경로에 의한 투여를 포함하는 임의의 효과적이고 편리한 방식으로 투여될 수 있다.

치료에서 또는 예방으로서, 활성제는 개인에게 주사 가능한 조성물로, 예를 들어 바람직하게는 등장성인 멸균 수성 분산액으로 투여될 수 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 치료적 유효량의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 가용성 형태, 작동제 또는 길항제 펩티드 또는 소분자 화합물을 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와의 조합으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 담체에는 비제한적으로 식염수, 완충 식염수, 덱스트로오스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 그의 조합이 포함된다. 본 발명은 추가로 본 발명의 상술한 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학 팩들 및 키트에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 다른 화합물은 단독으로, 또는 다른 화합물, 예컨대 치료적 화합물과 함께 채용될 수 있다.

조성물은 투여 경로, 예를 들어 전신 또는 경구 경로에 채택될 것이다. 전신 투여의 바람직한 형태에는 주사, 전형적적으로 정맥내 주사가 포함된다. 다른 주사 경로, 예컨대 피하, 근육내, 또는 복강내도 이용될 수 있다. 전신 투여에 대한 대안적 수단에는 침투제, 예컨대 담즙산염 또는 푸시딘산 또는 다른 세제를 이용하는 경점막 및 경피 투여가 포함된다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 또는 다른 화합물은 장내 또는 캡슐화된 제형으로 제형화될 수 있으며, 경구 투여도 가능할 수 있다. 이들 화합물의 투여는 또한 연고, 페이스트, 겔, 용액, 파우더 등의 형태로 국소화되거나 및/또는 편재화될 수 있다.

포유류, 및 특히 인간에 대한 투여에 있어서, 활성제의 1일 투여량 수준은 0.01㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏, 전형적으로 약 1㎎/㎏일 것으로 예측된다. 어느 경우에도 의사가 개인을 위해 가장 적합할 실제 투여량을 결정할 것이며, 이는 특정 개인의 연령, 체중 및 반응에 따라 변할 것이다. 상기 투여량은 평균 경우의 예시이다. 물론 더 높거나 더 낮은 투여량 범위가 이익이 되는 개인 사례가 있을 수 있으며, 이들도 본 발명의 범위 내에 속한다.

필요한 투여량 범위는 펩티드 선택, 투여 경로, 제형의 성질, 대상체 상태의 성질, 및 주치의의 판단에 근거한다. 그러나 적합한 투여량은 0.1-100㎍/대상체㎏ 범위이다.

백신 조성물은 편리하게는 주사 가능한 형태이다. 편리한 보강제가 면역 반응을 증강시키기 위해 채용될 수 있다. 백신접종을 위해 적합한 단위 용량은 0.5-5㎍/항원㎏이며, 이러한 용량은 바람직하게는 1-3주 간격으로 1-3회 투여된다. 나타낸 용량 범위에서는 개인에게 적합한 투여를 배제할 본 발명의 화합물에 대한 해로운 독성학적 효과가 관찰되지 않을 것이다.

그러나 이용 가능한 다양한 화합물 및 다양한 투여 경로의 상이한 유효성의 측면에서 필요한 투여량의 넓은 가변성이 예측된다. 예를 들어, 경구 투여는 정맥내 주사에 의한 투여보다 더 높은 투여량을 필요로 할 것으로 예측될 것이다. 이들 투여량 수준에서의 가변성은 당분야에 널리 이해되는 바와 같은 최적화를 위한 표준 실험 방식을 이용하여 조정될 수 있다.

서열 데이터베이스, 유형 매체에서의 서열, 및 알고리즘

폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 유사 상동성을 갖는 추가 서열의 동정뿐만 아니라 그의 2- 및 3-차원 구조의 결정에 대해 귀중한 정보 자원이 된다. 이러한 접근은 컴퓨터로 읽을 수 있는 매체에 서열을 저장한 뒤 저장된 데이터를 공지된 거대분자 구조 프로그램에서 이용하거나 또는 널리 공지된 검색 도구, 예컨대 GCG 프로그램 패키지를 이용하여 서열 데이터베이스를 검색함으로써 가장 쉽게 촉진된다.

또한, 특징 서열 또는 스트링, 특히 유전자 서열 또는 인코딩된 단백질 서열의 분석 방법이 본 발명에서 제공된다. 서열 분석의 바람직한 방법에는, 예를 들어 서열 상동성 분석, 예컨대 동일성 및 유사성 분석, DNA, RNA 및 단백질 구조 분석, 서열 어셈블리, 분기학 분석, 서열 모티프 분석, 개방 해독틀 결정, 핵산 염기 콜링, 코돈 사용 분석, 핵산 염기 정돈, 및 서열 분석 크로마토그램 피크 분석이 포함된다.

상동성 확인을 수행하기 위한 컴퓨터 기반 방법이 제공된다. 이 방법은 하기 단계를 포함한다: 컴퓨터로 읽을 수 있는 매체에 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계; 및 상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 적어도 하나의 제2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 비교하여 상동성을 확인하는 단계.

또한 하기 단계를 포함하는, 상동성 확인을 수행하기 위한 컴퓨터 기반 방법이 제공된다: 컴퓨터로 읽을 수 있는 매체에 본 발명의 폴리펩티드 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 서열의 제공하는 단계; 및 상기 제1 폴리펩티드 서열을 적어도 하나의 제2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 비교하여 상동성을 확인하는 단계.

본 명세서에서 언급되는 특허 및 특허 출원을 비제한적으로 포함하는 모든 공보들 및 참고문헌들은 본원에서 각각의 개별 공보 또는 참고문헌이 본원에 완전히 나타내는 것으로 참고문헌으로 도입되도록 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 마찬가지로 그의 전문이 참고문헌으로서 본원에 도입된다. 이 출원에 대해 우선권을 주장하는 임의의 특허 출원도 공보 및 참고문헌에 대해 상술된 방식으로 그 전문이 본원에 참고문헌으로 도입된다.

정의

"동일성"은 당분야에 공지된 바와 같이 경우에 따라 서열을 비교하여 결정되는, 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 상관관계이다. 당분야에서 "동일성"은 또한, 경우에 따라 이러한 서열의 스트링 간 매치에 의해 결정되는, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 간의 서열 관련도 정도를 의미한다. "동일성"은 [Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)]에 기재된 것들을 비제한적으로 포함하는 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 동일성을 결정하기 위한 방법은 평가하는 서열 간에 최다 일치를 제공하도록 설계된다. 또한, 동일성을 결정하기 위한 방법은 공개로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에서 코드화된다. 두 서열 간에 동일성을 결정하기 위한 컴퓨터 프로그램 방법에는 GCG 프로그램 패키지의 GAP 프로그램(Devereux, J. 등, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN(Altschul, S.F. 등, J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990), 및 FASTA(Pearson 및 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988))이 비제한적으로 포함된다. BLAST 패밀리의 프로그램은 NCBI 및 다른 소스에서 공개적으로 이용 가능하다(BLAST Manual, Altschul, S. 등, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S. 등, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). 널리 공지된 스미스 워터만 알고리즘도 동일성 결정에 이용될 수 있다.

폴리펩티드 서열 비교를 위한 파라미터에는 하기가 포함된다:

알고리즘: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

비교 매트릭스: [Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915-10919 (1992)]의 BLOSSUM62

갭 페널티: 8 갭 길이 패널티: 2

이들 파라미터에 유용한 프로그램은 Genetics Computer Group, Madison WI의 "갭" 프로그램으로서 공개 이용 가능하다. 상술된 파라미터는 펩티드 비교를 위한 기본 파라미터이다(말단 갭들을 위한 페널티 없음).

폴리뉴클레오티드 비교를 위한 파라미터에는 하기가 포함된다:

알고리즘: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

비교 매트릭스: 매치들 = +10, 미스매치 = 0

갭 페널티: 50

갭 길이 패널티: 3

이용: Genetics Computer Group, Madison WI의 "갭" 프로그램. 이들은 핵산 비교를 위한 기본 파라미터이다.

경우에 따라, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 "동일성"의 바람직한 의미가 하기 (1) 및 (2)에 제공된다. (1) 폴리뉴클레오티드 구현예에는 추가로 서열번호 15의 기준 서열에 대해 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 포함되며, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 15의 기준 서열에 대해 동일할 수 있거나 또는 기준 서열에 비해 특정 갯수 이하의 뉴클레오티드 변형이 포함될 수 있으며, 상기 변형은 적어도 하나의 뉴클레오티드 결실, 전이 및 전위를 포함하는 치환, 또는 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 변형은 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 기준 서열의 뉴클레오티드 가운데 개별적으로 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 인접 군들로 분산된 이들 말단 위치들 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있고, 상기 뉴클레오티드 변형의 갯수는 서열번호 15에서의 뉴클레오티드의 총 수를 동일성 백분율을 정의하는 정수로 곱하여 100으로 나눈 뒤 서열번호 15에서의 상기 뉴클레오티드의 총 수에서 그 값을 빼서, 또는

n_n≤x_n - (x_nㆍy)로 결정된다(식 중, n_n은 뉴클레오티드 변형의 갯수이고, x_n은 서열번호 15에서의 뉴클레오티드의 총 수이고, y는 50%에 대해 0.50, 60%에 대해 0.60, 70%에 대해 0.70, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85, 90%에 대해 0.90, 95%에 대해 0.95, 97%에 대해 0.97 또는 100%에 대해 1.00이고, ㆍ는 곱셈 연산자에 대한 기호이고, x_n과 y의 임의의 비정수 곱은 이를 x_n에서 빼기 전에 가까운 정수로 내림된다. 서열번호 1-14의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 이 코딩 서열에서 무의미, 과오 또는 틀이동 돌연변이를 만들어서 이러한 변형에 따르는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 변형시킬 수 있다.

예로써, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 15의 기준 서열에 대해 동일할 수 있고, 즉 100% 동일할 수 있고, 또는 기준 서열에 비해 동일성 백분율이 100% 동일성 미만이 되도록 특정 갯수 이하의 핵산 변형을 포함할 수 있다. 상기 변형은 적어도 하나의 핵산 결실, 전이 및 전위를 포함하는 치환, 또는 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 변형은 기준 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 또는 기준 서열의 핵산 가운데 개별적으로 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 인접 군들로 분산된 이들 말단 위치들 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 주어진 동일성 백분율에 대한 핵산 변형의 갯수는 서열번호 15에서의 핵산의 총 수를 동일성 백분율을 정의하는 정수로 곱하여 100으로 나눈 뒤 서열번호 15에서의 상기 핵산의 총 수에서 그 값을 빼서, 또는

n_n≤x_n - (x_nㆍy)로 결정된다(식 중, n_n은 핵산 변형의 갯수이고, x_n은 서열번호 15에서의 핵산의 총 수이고, y는, 예를 들어 70%에 대해 0.70, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85 등이고, ㆍ는 곱셈 연산자에 대한 기호이고, x_n과 y의 임의의 비정수 곱은 이를 x_n에서 빼기 전에 가까운 정수로 내림된다.

(2) 폴리펩티드 구현예에는 추가로 서열번호 1-14의 폴리펩티드 기준 서열에 대해 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 단리된 폴리펩티드가 포함되며, 상기 폴리펩티드 서열은 서열번호 1-14의 기준 서열에 대해 동일할 수 있고 또는 기준 서열에 비해 특정 갯수 이하의 아미노산 변형을 포함할 수 있으며, 상기 변형은 적어도 하나의 아미노산 결실, 보존적 및 비보존적 치환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 변형은 기준 폴리펩티드 서열의 아미노- 또는 카복시-말단 위치에서 또는 기준 서열의 아미노산 가운데 개별적으로 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 인접 군들로 분산된 이들 말단 위치들 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있고, 상기 아미노산 변형의 갯수는 서열번호 1-14에서의 아미노산들의 총 수를 동일성 백분율을 정의하는 정수로 곱하여 100으로 나눈 뒤 각각 서열번호 1-14에서의 상기 아미노산들의 총 수에서 그 값을 빼서, 또는

n_a≤x_a - (x_aㆍy)로 결정된다(식 중, n_a는 아미노산 변형의 갯수이고, x_a는 서열번호 1-14에서의 아미노산들의 총 수이고, y는 50%에 대해 0.50, 60%에 대해 0.60, 70%에 대해 0.70, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85, 90%에 대해 0.90, 95%에 대해 0.95, 97%에 대해 0.97 또는 100%에 대해 1.00이고, ㆍ는 곱셈 연산자에 대한 기호이고, x_a와 y의 임의의 비정수 곱은 이를 x_a에서 빼기 전에 가까운 정수로 내림된다.

예로써, 본 발명의 폴리펩티드 서열은 서열번호 1-14의 기준 서열에 대해 동일할 수 있고, 즉 100% 동일할 수 있고, 또는 기준 서열에 비해 동일성 백분율이 100% 동일성 미만이도록 특정 갯수 이하의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 상기 변형은 적어도 하나의 아미노산 결실, 보존적 및 비보존적 치환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 변형은 기준 폴리펩티드 서열의 아미노- 또는 카복시-말단 위치들에서 또는 기준 서열의 아미노산들 가운데 개별적으로 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 인접 군들로 분산된 이들 말단 위치들 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 주어진 동일성%에 대한 상기 아미노산 변형의 갯수는 서열번호 1-14에서의 아미노산들의 총 수를 동일성 백분율을 정의하는 정수로 곱하여 100으로 나눈 뒤 서열번호 1-14에서의 상기 아미노산들의 총 수에서 그 값을 빼서, 또는

n_a≤x_a - (x_aㆍy)로 결정된다(식 중, n_a는 아미노산 변형의 갯수이고, x_a는 서열번호 1-14에서의 아미노산들의 총 수이고, y는, 예를 들면 70%에 대해 0.70, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85 등이고, ㆍ는 곱셈 연산자에 대한 기호이고, x_a와 y의 임의의 비정수 곱은 이를 x_z에서 빼기 전에 가까운 정수로 내림된다.

본원에서 대상체를 나타내며 사용되는 "개인(들)"은 후생동물, 포유류, 오비드(ovid), 소과동물, 조류, 영장류 및 인간을 비제한적으로 포함하는 다세포성 진핵생물을 의미한다.

"단리된"이란 그 천연 상태에서 "인간의 손에 의해" 변형되었음을, 즉 자연 상태에서 생기는 경우 그 원래 환경에서 변경되었거나 제거되었거나 변경 및 제거되었음을 의미한다. 예를 들어, 생체내에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 그 천연 상태의 공존 재료로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 본원에서 채용되는 용어에서와 같이 "단리된" 것이다. 또한, 형질전환, 유전자 조작 또는 임의의 다른 재조합 방법에 의해 개체 내로 도입된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 이것이 살아있거나 살아있지 않을 수 있는 개체 내에 여전히 존재하는 경우라도 "단리된" 것이다.

"폴리뉴클레오티드(들)"은 일반적으로 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 나타내며, 이는 단일쇄 및 이중쇄 영역을 포함하는 미개질된 RNA 또는 DNA 또는 개질된 RNA 또는 DNA일 수 있다.

"변이체"는 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 상이하지만 본질적 특성을 보유하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드의 전형적 변이체는 다른 기준 폴리뉴클레오티드와 뉴클레오티드 서열이 다르다. 변이체의 뉴클레오티드 서열의 변경은 기준 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변형시킬 수도 변형시키지 않을 수도 있다. 뉴클레오티드 변경은 후술되는 바와 같이 기준 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드에서 아미노산 치환, 추가, 결실, 융합 및 절단을 야기할 수 있다. 폴리펩티드의 전형적 변이체는 다른 기준 폴리펩티드와 아미노산 서열이 다르다. 일반적으로 차이는 기준 폴리펩티드와 변이체의 서열이 전체적으로 매우 유사하고 많은 영역에서 동일하도록 제한된다. 변이체 및 기준 폴리펩티드는 임의의 조합의 하나 이상의 치환, 추가, 결실에 의해 아미노산 서열이 다를 수 있다. 치환되거나 삽입된 아미노산 잔기는 유전 코드에 의해 인코딩되는 것일 수도 아닐 수도 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 변이체는 천연 생성되는, 예컨대 대립유전자 변이체일 수도 있고, 또는 천연 생성되는 것으로 알려져 있지 않은 변이체일 수도 있다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 비천연 생성 변이체는 돌연변이화 기법에 의해 또는 직접 합성에 의해 제조될 수 있다.

"질환(들)"은, 예를 들어 유아 및 어린이에서의 중이염, 노년층에서의 폐렴, 부비동염, 원내 감염 및 침습성 질환, 청력 상실이 동반되는 만성 중이염, 중이에서의 액체 축적, 청신경 손상, 언어 학습 지연, 상기도 감염 및 중이의 염증을 포함하는 박테리아에 의한 감염에 의해 야기되거나 관련된 임의의 질환을 의미한다.

도 1. 29kDa 비트로넥틴-결합 H. 인플루엔자 단백질은 비트로넥틴을 미끼로 사용한 1- 및 2-차원 겔 전기영동(2D-SDS-PAGE)에서 모두 검출된다. 외막 운반체들(OMV)은 CO₂의 부재(-) 또는 존재(+) 하에 임상 단리물 NTHi 3655에서 제조하였다. SDS-PAGE를 수행하고 나일론 필터로 블로팅하였다(좌측 패널들). CO₂의 존재 하에 인큐베이션한 배양물 유래의 OMV도 2D-SDS-PAGE를 수행하였다(우측 패널들). 1- 및 2-차원 겔들 모두에 있어서, 2개의 대응 겔들을 병렬 수행하였다. 1개의 겔은 나일론 필터로 블로팅했고(A), 1개의 겔은 쿠마시 블루로 염색하였다(B). 인간 혈장 비트로넥틴을 첨가하고, 필터를 염소 항-비트로넥틴 pAb로 탐침을 붙인 뒤 HRP-공액 당나귀 항-양 pAb(A:i)를 사용하여 검출하였다. 패널 A:ii에서는, 이차 항체들의 배경 결합을 배제하기 위해 일차 및 이차 pAb만(비트로넥틴 없이) 포함하여 인큐베이션한 필터를 나타낸다. 추정 비트로넥틴-결합 단백질(B)에 해당하는 스팟을 쿠마시 염색한 겔에서 잘라내어 MALDI-ToF로 서열 분석하였다. pF는 패널들 A:i 및 B에서 화살표로 나타낸다.
도 2. NTHi 3655에서 단백질 F(서열번호 1)에 대한 신호 펩티드를 포함하는 DNA 서열 및 번역된 개방 해독틀. (A)에서는 DNA 서열을 번역된 단백질 서열과 함께 나타내며, (B)에서는 상이한 예측 영역들을 나타내는 pF에 대한 만화를 나타낸다.
도 3. 단백질 F는 한 세트의 상이한 H. 인플루엔자 균주들에서 상동성이 높다. GeneBank에서 확인된 HI 0362에 해당하는 상이한 pF 아미노산 서열들을 클러스터 분석에 의해 비교하였다.
도 4. 대장균에서 제조된 재조합 pF 12-293. H. 인플루엔자 DNA를 주형으로 이용하고 예측되는 신호 펩티드의 N-말단부(아미노산들 pF 1-11)가 없는 pH의 개방 해독틀에 해당하는 서열을 PCR로 증폭하고 pET26 내로 클로닝한 뒤 대장균을 형질전환하고 이어서 유도, 발현 및 Ni-수지를 이용한 친화도 크로마토그래피에 의한 정제를 수행하였다. (A)에서는 쿠마시 염색 겔을 나타내며, (B)에서는 토끼 항-pF 혈청 및 HRP-공액 돼지 항-토끼 pAb를 이용하여 검출된 pF를 갖는 웨스턴 블롯을 나타낸다. NTHi 3655 및 M. 카타랄리스 Bc5 유래의 외막 운반체들(OMV)이 각각 양성 및 음성 대조군으로 포함되었다. M. 카타랄리스 OMV는 토끼 항혈청의 특이성을 입증하였다.
도 5. 단백질 F를 비정형 H. 인플루엔자의 외막에서 확인할 수 있다. (A) 임상 NTHi 단리물들에 대한 쿠마시 염색 겔을 나타낸다. (B) pF의 위치를 나타내는 웨스턴 블롯. 8개의 상이한 임상 NTHi 단리물 유래의 외막 단백질들(OMPs)을 SDS-PAGE하고, 특이적 토끼 항-pF 항혈청을 이용하여 pF 발현을 분석하였다.
도 6. pF-결핍 NTHi 3655 돌연변이는 표면에 pF를 발현하지 않는다. (A) 일차 항-pF 토끼 pAb의 부재 하에 염소 항-토끼 pAb-FITC로 배경값을 나타내는 NTHi 3655 야생형(WT)의 유세포 측정 프로필. (B) 특이적 항-pF pAb로 판단되는 NTHi 3655 상의 단백질 F 발현. (C) 항-pF 토끼 pAb의 부재 하 NTHi 3655 Δpf 돌연변이체의 형광성. (D) pF-결핍 NTHi 3655 Δpf 돌연변이체는 표면에 pF를 발현하지 않았다. cat 유전자를 포함하는 NTHi 3655 Δpf 돌연변이체는 재료 및 방법들에 기재된 바와 같이 제조하였다. 생성 돌연변이체 및 야생형 박테리아를 배지에서 하룻밤 동안 배양하고 세척하였다. 이후, 나타낸 바와 같이 일차 및 검출 pAb를 첨가한 뒤 얼음 상에서 인큐베이션하고 세척하고 유세포 측정기에서 최종 분석하였다. 항-pF 항혈청을 토끼들에서 만들었다. 재조합 pF 12-293 및 보강제들을 이용한 3회 면역접종 후, 생성 토끼 항혈청을 pF 12-293에 대해 면역 정제하였다. 유사한 결과들을 제공하는 3개 중 1개의 전형적 실험을 나타낸다.
도 7. 재조합 pF(아미노산들 12-293)는 비트로넥틴에 결합하며 pF-발현 NTHi 3655는 pF-결핍 돌연변이체 NTHi 3655 Δpf에 비해 비트로넥틴에 더 많이 결합한다. (A) pF 12-293에 대한 비트로넥틴-결합은 최근 공개된 부착분자인 재조합 H. 인플루엔자 단백질 E[Ronander 등, 2009]에 비해 약간 더 컸다. (B) pF가 없는 H. 인플루엔자 돌연변이체는 야생형 박테리아에 비해 비트로넥틴에 대해 크게 감소된 결합을 갖는다. (A)에서, 재조합 단백질들을 마이크로타이터 플레이트들에 코팅하고 인간 비트로넥틴 및 토끼 항-비트로넥틴 pAb를 사용하여 비트로넥틴-결합에 대해 분석하였다. 비트로넥틴-결합력이 높은 M. 카타랄리스 단백질 UspA2 30-539[Singh 등, 2010a]가 양성 대조군으로 포함되었다. MID 962-1200은 M. 카타랄리스 균주 "Bc5"에서 유도된 재조합적으로 발현되는 단백질인 음성 대조군을 나타낸다. 소 혈청 알부민(BSA)은 다른 음성 대조군이었다. (B)에서, NTHi 3655 및 pF-돌연변이체 NTHi 3655 Δpf를 [¹²⁵I]-표지된 비트로넥틴과 인큐베이션하였다. 30분 후, 박테리아를 세척하고 γ-신틸레이션 카운터에서 측정하였다. 각각의 패널들 A 및 B에서의 3회의 독립적인 실험들을 데이터로 나타낸다.
도 8. 단백질 F 12-293은 ECM 단백질 라미닌에 결합한다. 재조합 pF 또는 pE는 마이크로타이터 플레이트에서 플라스틱 표면에 부착되었다. 마우스 육종 라미닌을 첨가한 뒤 토끼 항-라미닌 pAb 및 HRP-공액 염소 항-토끼 pAb를 이차 층으로 하여 검출하였다. BSA가 음성 대조군으로 포함되었다. 3회의 독립적인 실험들의 평균값들을 나타낸다.
도 9. 재조합 pF12-293은 상피 세포들에 결합한다. II형 폐포 상피 세포주 A549를 24웰 플레이트들에서 융합성으로 배양하고, 세척하고, 포름알데히드로 고정하였다. 이후, 증가하는 농도의 재조합 pF12-293을 세포들과 인큐베이션한 후 광범위한 세척 단계들을 거쳤다. 단백질 F를 항-pF 토끼 항혈청 및 HRP-공액 염소 항-토끼 pAb를 이차층으로 이용해서 검출하였다. 3회의 독립적 실험들 중 1개의 전형적 실험을 나타낸다.
도 10. pF-결핍 NTHi 돌연변이체는 pF-발현 야생형에 비해 상피 세포들에 대해 현저히 감소된 결합능을 갖는다. A549 상피 세포들을 24웰 플레이트들에서 융합성으로 배양하였다. 박테리아를 [³H]-티미딘의 존재 하에 3hrs 동안 배양하였다. NTHi 3655 야생형(WT) 또는 pF-결핍 돌연변이체(Δpf)를 세포들에 첨가한 뒤 2hrs 동안 인큐베이션하였다. 이후, 세포들을 3회 세척하고, 트립신 처리하고, 베타-신틸레이션 카운터에서 측정하였다. 상이한 감염다중도(MOI)를 이용하였다. 페어 형성 데이터에 대한 스튜던트 테스트로 p값들을 수득하였다. 3회의 독립적 실험들에 대한 평균값±SD를 나타낸다.
도 11. 도 12에 나타낸 바와 같은 pF의 상피 세포 결합 영역의 맵핑을 위해 이용된 펩티드들의 레이아웃.
도 12. 주로 pF 아미노산 잔기들 23-48이 상피 세포들에 결합한다. (A) H292 및 (B) A549 상피 세포주들에 대한 결과들을 나타낸다. 세포들을 T25 플라스크들에서 융합성으로 배양하고 트립신-EDTA로 탈착한 뒤 세척하였다. 이후, 직접 결합 분석(DBA)을 수행하였다. [¹²⁵I]-표지된 펩티드들을 여러 몰비로 첨가하고, 세포들과 +4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 방사활성을 γ-신틸레이션 카운터에서 측정하였다.
도 13. 유세포 측정으로 분석되는 경우, 항-pF44-68 pAb는 NTHi 3655의 표면에서 pF를 인식한다. pF-발현 NTHi 3655 야생형(A 및 B)을 pF-결핍 NTHi 3655 Δpf 돌연변이체(C 및 D)와 비교하였다. (A) 및 (C)는 특이적 항-pF44-68 pAb 부재 시의 배경 값들을 나타낸다. pF44-68을 인식하는 항체들을 CnBr-세파로오스 칼럼에 부착된 펩티드 pF44-68을 이용하여 항-pF 12-293 항혈청에서 면역 정제하였다. pF44-68은 바이오인포마틱스에서 드러나는 바와 같이(나타내지 않음) 예측되는 면역원성 영역이다. 일차 및 검출 pAb를 나타낸 바와 같이 첨가한 뒤 얼음 위에서 인큐베이션하고, 세척하고, 유세포 측정기에서 최종 분석하였다.

실험 부분

하기 실시예들은 상세하게 달리 나타내지 않는 한, 당업자에게 널리 공지되고 일상적인 표준 기법들을 이용하여 수행된다. 실시예들은 예시적인 것이지 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 본 연구에서는 미끼로서 비트로넥틴을 이용하여 발견된, H. 인플루엔자의 단백질 F(pF)로 명명된 신규한 비트로넥틴-결합 외막 단백질 및 신규한 절단 재조합 단백질 F(pF)의 단리, 정제, 특징분석, 클로닝 및 발현을 설명한다.

재료 및 방법

박테리아, 시약 및 상피 세포주

비정형 H. 인플루엔자 균주 NTHi3655는 임상 단리물로, R. Munson(Ohio State University, Colombus, Ohio)으로부터 받았다. 임상적 NTHi 단리물들은 상기도 감염들을 갖는 환자들(Skane County, Sweden)로부터 비인두 면봉들에 의해 수득되었다. H. 인플루엔자는 NAD 및 헤민(Sigma, St. Louis, MO)이 보강된 뇌 심장 주입(BHI) 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI) 중에서 또는 기재된 바와 같은 초콜렛 혈액 한천 플레이트들 상에서(Ronander 등, 2009) 하룻밤 동안 배양하였다.

A549(CCL-185), 및 H292 상피 세포주들은 ATCC에서 입수하였다. 두 세포주들 모두 37℃ 및 5% CO₂에서 10% FCS가 포함된 RPMI 1640 중에 유지하였다.

2-차원 SDS - 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(2D- SDS - PAGE )

외막 운반체들(OMV) 및 외막 단백질들을 기재된 바와 같이 정제하였다(Ronander 등, 2008, Schaar 등, 2010). OMV는 IPGphor IEF 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 등전점 포커싱(IEF)을 수행하였다(Ronander 등, 2008). 겔 교정을 위해, 표준물을 사용하였다(cat. no. 161-0320; Bio-Rad). 2-D 폴리아크릴아미드 겔들을 하룻밤 동안 120mA에서 Immobilon-PVDF 필터들(0.45mm; Millipore, Bedford, MA)에 전기블로팅하였다. 쿠마시 블루로 염색된 2D-SDS-PAGE에서의 스팟들을 겔들에서 잘라내어 기재된 바와 같이 MALDI-ToF에 의한 서열 분석을 위해 보냈다(Schaar 등, 2010).

SDS - PAGE 및 막 상에서의 단백질의 검출( 웨스턴 블롯 ; 면역블롯 )

SDS-PAGE를 Novex(San Diego, CA)의 시약들뿐만 아니라 블로팅 기기로 10% Bis-Tris 겔들을 이용하여 150 정압에서 수행하였다(Vidakovics 등, 2010). 겔들을 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250으로 염색하였다(Bio-Rad, Sundbyberg, Sweden). 전기영동으로 이동시킨 뒤, Immobilon-P 막을 5% 밀크 파우더를 함유하는 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS(PBS-Tween) 중에 블로킹하였다. 세척들 후, 막들을 실온에서 2% 밀크 파우더를 포함하는 PBS-Tween 중에서 인간 비트로넥틴(Sigma)(0.5㎍/㎖)과 인큐베이션하였다. 일부 실험들에서는 1/1,000로 희석된 HRP-공액 마우스 항-인간 비트로넥틴을 세척들 후에 첨가하였다. 인큐베이션 후, Fluor-S Max 중에 또는 ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약들(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)로 발색을 수행하였다.

대장균에서의 재조합 pF 12-293의 DNA 클로닝 및 단백질 발현

NTHi 3655의 염색체 DNA를 주형으로 이용하여 pF 코딩 서열을 단리하였다. 제한 효소 부위들 BamHI 및 HindIII를 pF12-293을 인코딩하는 DNA의 인접 영역들 내로 PCR에 의해 도입하였다. 발현 벡터에 인코딩되는 6개 히스티딘 잔기들을 융합시키기 위해, pF12-293 정지 코돈을 돌연변이화하였다. 생성 PCR 생성물을 pET26(+)(Novagen, Darmstadt, Germany) 내로 결찰하였다. pF를 인코딩하는 플라스미드를 발현 숙주 BL21(DE3) 내로 형질전환하였다. 재조합 pF12-293을 제조하기 위해, 박테리아들을 3.5h 동안 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)로 유도하였다. 원심분리 후, 박테리아 펠릿을 얼음 위에서 1㎎/㎖의 라이소자임과 인큐베이션하고, 초음파 분쇄하여 원심분리하였다. 가용성 단백질을 제조업체(Novagen)가 권장하는 바에 따라 니켈 수지를 함유한 칼럼들 상에서 자연적 조건 하에 정제하였다.

항체 및 효소-연관 면역흡착 분석( ELISA )

특이적 항-pF 항혈청을 제조하기 위해, 토끼들에 완전 및 불완전 프로인트 보강제들을 이용하는 표준 절차들에 따라(Ronander 등, 2008) 재조합 pF12-293을 근육 내로 3회(2주 간격으로) 면역접종하였다. 생성 폴리클로날 항체들(pAb)을 CnBr-세파로오스에 공액된 pF12-293을 이용하여 친화도 크로마토그래피로 단리하였다. 또한, 항-pF44-68 pAb를 CnBr-세파로오스에 공액된 특이적 pF44-68 펩티드를 이용하여 친화도 크로마토그래피로 단리하였다. 홀스래디쉬 페록시다아제(HRP)-공액 돼지 항-토끼 폴리클로날 면역글로불린들은 Dakopatts(Gentofte, Denmark)에서 입수하였다. 재조합 절단된 모락셀라 카타랄리스(비-IgD 결합) IgD 결합 단백질(MID) 962-1200을 음성 대조군으로 사용하였다(Nordstroem 등, 2002).

마우스(Balb/c)를 또한 기재된 바와 같이(Ronander 등, 2009) 재조합 pF12-293으로 면역접종하였다. 특이적 마우스 항-pF pAb를 ELISA로 분석하였다. 간략하게, 50㎍의 재조합 pF12-293을 4℃에서 하룻밤 동안 마이크로타이터 플레이트들에 코팅하였다. 세척 후, 마우스 혈청을 첨가하고 실온에서 인큐베이션하였다. 30분 뒤 추가 세척들 후, HRP-공액 토끼 항-마우스 폴리클로날 항체들을 첨가하여 흡광도를 OD₅₄₀에서 측정하였다.

pF -결핍 H. 인플루엔자( NTHi 3655 Δ pf )의 제조

NTHi 3655에서 단리된 게놈 DNA를 주형으로 사용하였다. pf의 5'- 및 3'-말단들을 증폭하고 겹침 연장에 의한 PCR을 이용하여(Riesbeck 등, 1999) 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(cat) 유전자를 포함하는 카세트와 융합시켰다. 특이적 흡수 서열(AAGTGCGGT)을 인접 프라이머들 중 하나에 포함시켰다. 생성 PCR 생성물을 기재된 바와 같이(Poje 등, 2003) NTHi 3655 내로 형질전환시킨 뒤 클로람페니콜을 함유하는 플레이트들 상에서 선택하였다.

유세포 측정 분석

하룻밤 동안 키운 배양물들의 박테리아가 OD₆₀₀ 0.8이 될 때까지 배지 중에 배양하였다. 이후, NTHi 균주들을 1% BSA를 함유하는 PBS로 2회 세척한 뒤 표준 프로토콜[Samuelsson 등, 2007]에 따라 정제된 토끼 항-pF 항혈청과 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 박테리아를 FITC-공액 염소 항-토끼 이차 pAb들(Dakopatts)과 인큐베이션한 뒤 유세포 측정 분석(EPICS® XL-MCL, Coulter, Hialeah, FL)을 수행하였다.

상피 세포, 부착 분석 및 펩티드 결합 실험

상피 세포주들을 24-웰 플레이트들(Nunc)에서 융합성으로 배양하였다. 박테리아를 상술된 바와 같은 보강물들을 갖는 BHI 중에 배양하고, 36℃에서 [³H]-티미딘으로 펄스를 가하였다. 4h 후, 박테리아를 10% FCS, 0.2% 글루코오스, 0.02% 젤라틴이 보강된 RPMI(반응 배지)로 1회 세척하였다. 배양 배지를 상피 세포들로부터 제거하고 박테리아(20㎕)를 상이한 감염다중도(MOI)로 3개씩 첨가하였다. 이후, 반응 배지를 보강한 뒤 800rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 36℃, 5% CO₂에서 90분 후, 웰들을 PBS로 3회 세척한 뒤 트립신-베르센(Sigma)을 첨가하였다. 3개씩의 웰들을 모아 PBS로 세척하고, 신틸레이션 바이알들로 옮겨 베타-카운터(Wallac)에서 측정하였다.

전체 pF 서열(도 11)을 포괄하는 일련의 합성 펩티드들을 클로라민 T 방법(Greenwood 등, 1963)을 이용하여 [¹²⁵요오드] 표지로 표지하였다(단백질 1몰 당 요오드 0.05몰). 대부분의 펩티드들은 티로신 잔기들을 포함하였지만, 일부 경우들에서 추가 티로신 잔기를 C-말단에 첨가하였다. 상피 세포들을 37℃에서 45분 동안 PBS, 2% BSA 중 방사표지된 단백질들과 인큐베이션하였다. 이후, 세포들을 동일한 완충액 중에 세척한 뒤 γ-신틸레이션 카운터에서 측정하였다.

결과

단백질 F( pF )는 헤모필러스 인플루엔자에서 신규한 비트로넥틴 -결합 단백질이다.

비정형 H. 인플루엔자(NTHi)에서 비트로넥틴-결합 단백질들을 정의하기 위해, 외막 운반체들(OMV)을 NTHi 3655에서 단리하였다. OMV를 CO₂의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션한 배양물들로부터 수확하여 SDS-PAGE하였다. 두 겔들을 병렬로 걸고, 하나는 나일론 필터로 블로팅한 반면(도 1의 A(i), 좌측 패널), 다른 하나는 쿠마시 블루로 염색하였다(도 1의 B, 좌측 패널). 필터를 비트로넥틴과 함께 인큐베이션한 뒤 항-비트로넥틴 pAb 및 이차 HRP-공액 pAb를 이용하여 검출하였다. 가장 강한 신호는 CO₂와 함께 인큐베이션된 박테리아의 OMV에서 수득되어(도 1의 A(i), 좌측 패널) 동일한 OMV 제조물로 2D-SDS-PAGE를 수행하게 되었다. 도 1의 A(i)(우측 패널)에서 알 수 있듯이, 비트로넥틴에 대해 뚜렷한 신호가 CO₂의 존재 하에 배양된 박테리아의 OMV에 대한 2D-SDS-PAGE 상에서 수득되었다. 검출 항체들이 위양성 배경을 제공하지 않았음을 확인하기 위해, 필터들을 또한 비트로넥틴 부재 하에 항체들로 확인하였다(도 1의 A(ii)). 비트로넥틴-결합 스팟들을 2D-SDS-PAGE에서 정의하였고(도 1의 A(i), 우측 패널), 대응하는 스팟들을 쿠마시-염색한 2D-SDS-PAGE에서 정의하였다(도 1의 B, 우측 패널). 몇몇 스팟들을 서열 분석을 위해 보냈으며, 보다 뚜렷한 스팟들 중 하나는 화살표들로 나타내는 바와 같이 HI0362에 해당하는 29kDa 단백질로 나타났다(도 1의 A(i) 및 B). 상기 신규한 비트로넥틴-결합 단백질을 단백질 F(pF)로 명명하고 추가 분석을 위해 선택하였다.

단백질 F의 DNA 서열 및 개방 해독틀

NTHi 3655에서 단백질 F를 인코딩하는 DNA를 서열 분석하고 상세히 분석하였다. 전체 pF 서열은 293개 아미노산들로 구성되며(도 2의 A) 22개 아미노산들 길이인 신호 펩티드를 갖는다(도 2의 B)(Nielsen 등, 1997). 신호 펩티드에는 예측되는 부착성 도메인 및 C-말단의 금속 결합 영역이 뒤따른다.

GeneBank에서 이용 가능한 다른 pF 서열들과의 상동성을 비교하기 위해, 클러스터 분석을 수행하였다(도 3). 발견된 15종의 상이한 pF 서열들 가운데, 11개 균주들은 NTHi 3655의 공개 서열에도 포함되는 100% 보존 서열들을 가졌다. 4개 균주들은 NTHi 3655의 pF와 99% 동일성을 가졌다. 따라서, pF는 다른 공개 서열들과 비교하여 판단 시 탁월한 정도로 보존되었다.

단백질 F의 클로닝 및 대장균에서의 발현

pF를 발현하기 위해, NTHi 3655 게놈 서열을 주형으로 이용하였다. 신호 펩티드(pF 1-22)에서 먼 N-말단 소수성 부분(11개 아미노산들)이 없는 개방 해독틀(ORF)을 인코딩하는 DNA를 증폭하고, 발현 벡터 pET26 내로 클로닝한 뒤 형질전환하였다. 생성 재조합 단백질을 pF 12-293으로 명명하였다. 유도 후, pF 12-293을 친화도 크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 단백질을 용출하고 SDS-PAGE하였다. 6개의 히스티딘들로 구성된 C-말단 태그를 갖는 생성 재조합 pF을 도 4의 A에 나타낸다(좌측으로부터 두 번째 레인). 최종 생성물은 약 33kDa에 해당하는 크기로 이동하였다.

재조합적으로 제조된 단백질 F( pF 12-293)는 토끼 항혈청에 의해 검출되며 pE는 분석된 모든 임상 단리물에 존재한다.

pF가 토끼들에서 폴리클로날 항체 반응을 유도하는지 뿐만 아니라 면역원성인지를 조사하기 위해, 동물들에 재조합 pF12-293을 면역접종하였다. 총 6주의 기간에 걸쳐 3회 면역접종 후, 특이적 항-pF 항혈청을 수집하였다. NTHi 3655의 외막 중 PF의 존재를 조사하였다. 외막 운반체들(OMVs)을 배양 상청액들에서 단리하고, SDS-PAGE하였다. 모락셀라 카타랄리스의 OMV들뿐만 아니라 재조합 pF12-293을 겔에 포함시켰다(도 4의 A). 도 4의 B에서 알 수 있듯이, 토끼 항혈청은 NTHi 3655의 OMV 제조물 중에서 재조합 pF12-293 및 천연 pF 둘 다를 인식한 반면, 음성 대조군으로 포함되었던 모락셀라 OMV들과의 교차 반응성은 확인되지 않았다. 또한, 마우스를 pF로 면역접종하여 이들 동물들도 항체 반응을 일으켰다, 즉 재조합 pF에 대한 특이적 폴리클로날 항체들이 ELISA에서 검출되었다(데이터는 나타내지 않음).

백신의 관점에서, 모든 임상적 NTHi 단리물들이 단백질 수준에서 pF를 발현하는 것이 중요하다. 이를 조사하기 위해, 외막 단백질들을 일련의 비인두 NTHi 단리물들로부터 단리하고 SDS-PAGE한 뒤 블로팅하였다(도 5). 특이적 항-pF 항혈청을 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 단백질 F는 항혈청으로 쉽게 검출되었으며, 실험실에서 사용된 표준 성장 조건들 동안 모든 임상적 단리물들에서 pF가 항상적으로 발현되었다. 웨스턴 블롯은 pF가 분석한 모든 균주들에서 동일한 크기(대략 29kDa)의 단일 밴드로 이동함을 나타내었다(도 5의 B). 요약하면, pF는 면역원성이고 모든 임상적 NTHi 단리물들에서 확인된다.

헤모필러스 단백질 F는 표면-노출 외막 단백질이다.

pF가 NTHi 3655의 표면에 위치하는지를 확인하기 위해, 클로람페니콜에 대한 내성을 만드는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT)를 인코딩하는 유전자 카세트를 도입하여 pf-결핍 돌연변이체를 제조하였다. cat 유전자 카세트는 PCR 및 겹침 연장에 의해 pF의 5'- 및 3'-인접 영역들과 융합되었다. pF 발현의 부재는 크로마토그래피에 의해 재조합 pF 12-293에 대해 정제된 항-pF 항혈청을 이용한 웨스턴 블롯들에 의해 확인되었다(나타내지 않음). 단백질 F 발현을 유세포 측정으로 추가 분석하였다(도 6). 도 6의 B에서 알 수 있듯이, FITC-공액 이차 검출 항체만으로 구성된 배경 대조군에 비해 항-pF pAb로 분석되었을 때 pF는 NTHi 3655에서 강하게 발현되었다(도 6의 A). 흥미롭게도, pf 유전자가 돌연변이된 경우, NTHi 3655 야생형(도 6의 B)에 비해 표면 노출된 pF가 확실히 사라졌다(도 6의 D). pF-결핍 NTHi 3655 Δpf 돌연변이체에 대한 배경 대조군을 도 6의 C에 나타낸다. 따라서 이들 실험들은 pF가 H. 인플루엔자의 박테리아 세포 표면에 위치함을 나타내었다.

단백질 F는 비트로넥틴 및 라미닌 모두에 결합하는 외막 단백질이다.

비트로넥틴은 세포외 기질(ECM)의 중요 성분이며, 또한 주로 보체 단백질(C) 9의 결합으로 인해 막 공격 복합체(MAC)의 형성을 저해하여 MAC을 중화시킴으로써 보체 일련 반응의 항상성 유지에 역할을 담당한다(Singh 등, 2010b). pF가 비트로넥틴에 대한 결합능을 갖는지를 평가하기 위해, 재조합 pF12-293을 마이크로타이터 플레이트들 상에 코팅하고 ELISA에서 전장 비트로넥틴에 대한 결합에 대해 평가하였다. 잘 분석되어 있는 UspA2(Singh 등, 2010a) 및 pE(Hallstrom 등, 2009)를 양성 대조군들로 포함시켰고 M. 카타랄리스 MID962-1200을 비-비트로넥틴-결합 음성 대조군으로 포함시켰다(Nordstrom 등, 2002). 흥미롭게도, pF는 pE에 비해 약간 더 비트로넥틴을 끌어당긴 반면, UspA2가 더 강한 결합제였다(도 7의 A). 대조적으로, MID 962-1200은 ELISA에서 비트로넥틴을 끌어당기지 않았다.

pF-의존적 비트로넥틴 결합의 역할을 추가 조사하기 위해, pF가 없는 NTHi 3655 Δpf 돌연변이체를 직접 결합 분석에서 [¹²⁵I]-비트로넥틴과 인큐베이션하였다. 흥미롭게도, pF-결핍 돌연변이체 NTHi 3655 Δpf는 야생형과 비교할 때 비트로넥틴에 대해 40% 감소된 결합을 나타내었다(도 7의 B).

여러 박테리아 종들은 상피 세포들 상의 표적 분자로 ECM 단백질 라미닌을 이용한다. 재조합 단백질 F도 라미닌에 결합하는지를 평가하기 위해, 재조합 pF 12-293을 마이크로타이터 플레이트에 코팅한 뒤 라미닌을 첨가하고 항-라미닌 pAb로 특이적 검출을 수행하였다. 용량 반응이 확인되었고, pF는 단백질 E에 비해 약간 더 우수하게 라미닌에 결합하였다(도 8). 종합적으로, 헤모필러스 pF는 비트로넥틴 및 라미닌 모두에 결합하며, 따라서 NTHi 발병기전에서 중요한 병독성 인자이다.

단백질 F는 상피 세포에 부착하며 활성 결합 도메인은 단백질 F의 N-말단 부분(아미노산 pF23 -48) 내에 위치한다.

몇몇 비트로넥틴-결합 단백질들도 상피 세포들로의 부착에 역할을 담당한다(Singh 등, 2010b), 즉, 이들 다기능적 외막 단백질들은 종종 부착분자들로서 기능한다. pF도 상피 세포들에 대한 박테리아 결합을 촉진할 수 있는지를 평가하기 위해, 재조합 pF12-293을 플라스틱 표면에 부착된 상피 세포들에 첨가하였다. 최대 0.12μΜ까지 증가하는 농도의 pF12-293을 세포들에 첨가한 뒤 항-pF 토끼 항혈청 및 이차 HRP-공액 검출 항체들을 이용하여 검출하였을 때 용량-반응이 관찰되었다(도 9).

pF의 부착분자로서의 중요성을 추가 증명하기 위해, pF-결핍 돌연변이체 NTHi 3655 Δpf를 pF-발현 천연 NTHi 3655 야생형과 비교하였다. 흥미롭게도, pF-돌연변이체는 감염다중도(MOI) 50 및 100으로 상피 세포들과 분석되었을 때 그 결합능의 50% 초과를 소실하여(도 10) pF가 중요한 NTHi 부착분자임을 추가 증명하였다. 따라서, pF는 상피 세포들에 대한 NTHi의 부착에 역할을 담당하며, 박테리아 부착분자로 간주될 수 있다.

일련의 합성 펩티드들을 제조하여 상피 세포 표면에 대한 부착에 관여하는 pF의 정확한 결합 영역을 분석하였다(도 11). 펩티드들을 요오드로 표지하고 2개의 상이한 세포주들과 함께 인큐베이션하였다. 도 12에서 알 수 있듯이, N-말단 펩티드(pE 23-48)는 H292(도 12의 A) 및 A549 상피 세포들(도 12의 B) 모두에 유의미하게 결합하였다. 결론적으로, 주요 상피 결합 부위는 분자의 N-말단 부분 내에 위치하였다.

N-말단 pF44 -68은 표면 노출되며, 특이적 항체에 의해 검출될 수 있다.

상피 세포 결합 부위는 pF의 N-말단 부분에 위치할 가능성이 가장 높으므로, 분자의 이 부분은 표면 노출될 것이다. 바이오인포마틱스로 pF23-48이 면역원성이라는 것이 나타났다(나타내지 않음). 대조적으로, pF44-68은 분석에 의해 판단되는 바와 같이 면역원성일 것이다. 따라서, 펩티드 pF44-68을 CnBr-세파로오스에 커플링한 뒤 원천으로 pF12-293 항혈청을 사용하여 특이적 항-pF44-68 pAb를 흡착시켰다. NTHi3655 야생형 및 pF-결핍 돌연변이체를 모두 생성 항-pF44-68 토끼 pAb과 인큐베이션하였다. 이후, FITC-공액 염소 항-토끼 검출 항체들을 첨가한 뒤 유세포 측정 분석을 수행하였다. 도 13의 B에서 알 수 있듯이, pF-발현 NTHi 3655는 항-pF44-68 pAb로 쉽게 검출되었다. 대조적으로, pF-결핍 돌연변이체 NTHi 3655 Δpf 돌연변이체는 항-pF44-68 pAb로 검출되지 않았다(도 13의 D). 항-pF44-68 pAb가 없이 인큐베이션된 박테리아도 이차 pAb가 결합하지 않음을 나타내고 증명하였다(도 13의 A 및 C). 종합적으로, pF의 N-말단 부분은 서열 pF44-68에 대한 항체들에 의한 인식에 의해 표면에 있는 것을 확인할 수 있었다.

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<110> RIESBECK HEALTHCARE <120> PROTEIN F - A NOVEL HAEMOPHILUS INFLUENZAE ADHESIN WITH LAMININ AND VITRONECTIN-BINDING PROPERTIES <130> 2013-fpa-6259 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 293 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae (pF) <400> 1 Met Arg Asn Ser Phe Lys Ile Met Thr Ala Leu Ala Leu Gly Leu Phe 1 5 10 15 Ala Met Gln Ala Asn Ala Lys Phe Lys Val Val Thr Thr Phe Thr Val 20 25 30 Ile Gln Asp Ile Ala Gln Asn Val Ala Gly Asn Ala Ala Thr Val Glu 35 40 45 Ser Ile Thr Lys Pro Gly Ala Glu Ile His Glu Tyr Glu Pro Thr Pro 50 55 60 Lys Asp Ile Val Lys Ala Gln Ser Ala Asp Leu Ile Leu Trp Asn Gly 65 70 75 80 Leu Asn Leu Glu Arg Trp Phe Glu Arg Phe Phe Gln Asn Val Lys Asp 85 90 95 Lys Pro Ala Val Val Val Thr Glu Gly Ile Gln Pro Leu Ser Ile Tyr 100 105 110 Glu Gly Pro Tyr Lys Asp Ala Pro Asn Pro His Ala Trp Met Ser Pro 115 120 125 Ser Asn Ala Leu Ile Tyr Ile Glu Asn Ile Lys Asn Ala Leu Val Lys 130 135 140 Tyr Asp Pro Gln Asn Ala Ala Val Tyr Glu Lys Asn Ala Ala Asp Tyr 145 150 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Claims (78)

1. 서열번호 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는, 헤모필러스 인플루엔자에서 검출될 수 있는 단백질을 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접(contiguous) 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 1의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신 조성물.
2. 청구항 1에 따른 표면 노출 단백질의 면역원성 단편을 포함하며, 상기 단편은 헤모필러스 인플루엔자에서 검출될 수 있는 백신 조성물.
3. 청구항 1의 단백질에 기반한 면역원성 단백질을 포함하며, 서열번호 1의 위치 1-11 또는 1-22에서의 하나 이상의 아미노산들이 결실되거나 하나 이상의 아미노산들로 치환된 백신 조성물.
4. 청구항 3에 따른 재조합 면역원성 단백질을 포함하며, 서열번호 1의 위치 1-11 또는 1-22에서의 하나 이상의 아미노산들은 0-22개의 선택적 아미노산들의 서열로 치환된 백신 조성물.
5. 서열번호 2에 따른 아미노산 서열 또는 단편을 갖는 펩티드를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 2의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신 조성물.
6. 서열번호 3에 따른 아미노산 서열 또는 단편을 갖는 펩티드를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 3의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신 조성물.
7. 서열번호 4에 따른 아미노산 서열 또는 단편을 갖는 펩티드를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 4의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신 조성물.
8. 서열번호 5에 따른 아미노산 서열 또는 단편을 갖는 펩티드를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단편은 서열번호 5의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 5의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신 조성물.
9. 서열번호 6에 따른 아미노산 서열 또는 단편을 갖는 펩티드를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단편은 서열번호 6의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 6의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신 조성물.
10. 서열번호 7에 따른 아미노산 서열 또는 단편을 갖는 펩티드를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단편은 서열번호 7의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 7의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신 조성물.
11. 서열번호 8에 따른 아미노산 서열 또는 단편을 갖는 펩티드를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단편은 서열번호 8의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 8의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신 조성물.
12. 서열번호 9에 따른 아미노산 서열 또는 단편을 갖는 펩티드를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단편은 서열번호 9의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 9의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신 조성물.
13. 서열번호 10에 따른 아미노산 서열 또는 단편을 갖는 펩티드를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단편은 서열번호 10의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 10의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신 조성물.
14. 서열번호 11에 따른 아미노산 서열 또는 단편을 갖는 펩티드를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단편은 서열번호 11의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 11의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신 조성물.
15. 서열번호 12에 따른 아미노산 서열 또는 단편을 갖는 펩티드를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단편은 서열번호 12의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 12의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신 조성물.
16. 서열번호 13에 따른 아미노산 서열 또는 단편을 갖는 펩티드를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단편은 서열번호 13의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 13의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신 조성물.
17. 서열번호 14에 따른 아미노산 서열 또는 단편을 갖는 펩티드를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단편은 서열번호 14의 아미노산 서열로부터의 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 단편은 (필요한 경우, 담체에 결합되었을 때) 서열번호 14의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있는 백신 조성물.
18. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 단편의 적어도 하나의 이량체, 삼량체 또는 다량체를 포함하는 백신 조성물.
19. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 약학적으로 허용가능한 보강제, 운반체, 부형제, 결합제, 담체, 보존제, 완충제, 에멀전화제, 습윤제, 또는 전달감염 촉진 화합물을 추가로 포함하는 백신 조성물.
20. 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 추가 백신을 포함하는 백신 조성물.
21. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
    다른 분자의 면역원성 부분을 포함하는 백신 조성물.
22. 청구항 21에 있어서,
    상기 다른 분자의 면역원성 부분이 H. 인플루엔자의 단백질 D 또는 E, 모락셀라 카타랄리스의 MID, 모락셀라 카타랄리스의 UspA1 또는 UspA2, 및 임의의 호흡기 병원체의 외막 단백질을 포함하는 군으로부터 선택되는 백신 조성물.
23. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 단편을 코딩하는 핵산 서열뿐만 아니라 그의 동족체, 다형체, 축퇴체(degenerates) 및 스플라이스 변이체를 포함하는 백신 조성물.
24. 적어도 다른 유전자에 융합된 청구항 23에 따른 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 서열을 포함하는 백신 조성물.
25. 청구항 23 또는 청구항 24에 따른 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 또는 파지를 포함하는 백신 조성물.
26. 청구항 25에 따른 적어도 하나의 플라스미드를 포함하고 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 단편을 제조할 수 있는 비인간 숙주를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 숙주가 박테리아, 효모 및 식물 중에서 선택되는 백신 조성물.
27. 대장균인 청구항 26에 따른 숙주를 포함하는 백신 조성물.
28. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 단편이 청구항 24에 따른 재조합 핵산 서열을 이용하여 적어도 다른 단백질에 조합된 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물.
29. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 단편의 이량체, 삼량체 또는 다량체인 청구항 28에 따른 융합 단백질을 포함하는 백신 조성물.
30. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 단편 또는 펩티드가 공유적으로 또는 임의의 다른 수단에 의해 단백질, 탄수화물 또는 기질에 결합된 융합 생성물을 포함하는 백신 조성물.
31. 서열번호 1의 전체 길이에 걸쳐 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물.
32. 그 아미노산 서열이 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 청구항 31에 기재된 것과 같은 단리된 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물.
33. 청구항 31에 있어서,
    서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 백신 조성물.
34. 서열번호 1의 단리된 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물.
35. 청구항 33 또는 청구항 34에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 신호 펩티드(아미노산 1-22) 또는 신호 펩티드의 일부가 없는 백신 조성물.
36. 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 청구항 18 내지 청구항 21 중 어느 한 항의 폴리펩티드로부터 적어도 15개의 인접 아미노산들을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 단편을 포함하는 백신 조성물로서, 상기 단편은 (필요한 경우 담체에 결합되었을 때) 서열번호 1의 폴리펩티드 (또는 각각 청구항 33 내지 청구항 35 중 어느 한 항의 폴리펩티드)를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있거나, 비트로넥틴 및 라미닌에 결합할 수 있는 백신 조성물.
37. 청구항 31 내지 청구항 36 중 어느 한 항에 기재된 것과 같은 폴리펩티드 또는 면역원성 단편을 포함하며, 상기 폴리펩티드 또는 상기 면역원성 단편은 더 큰 융합 단백질의 일부인 백신 조성물.
38. 청구항 31 내지 청구항 37 중 어느 한 항에 기재된 것과 같은 폴리펩티드 또는 면역원성 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신 조성물.
39. 서열번호 1의 전체 길이에 걸쳐서 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 단리된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 백신 조성물.
40. 전체 코딩 영역에 걸쳐서 서열번호 1의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 단리된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 백신 조성물.
41. 서열번호 15의 전체 길이에 걸쳐서 서열번호 15와 적어도 85% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 단리된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 백신 조성물.
42. 청구항 38 내지 청구항 41 중 어느 한 항에 있어서,
    단리된 폴리뉴클레오티드의 동일성이 서열번호 15에 대해 적어도 95%인 백신 조성물.
43. 서열번호 1의 폴리펩티드, 또는 청구항 36 또는 청구항 37의 면역원성 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신 조성물.
44. 서열번호 15의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신 조성물.
45. 서열번호 15의 서열 또는 그의 단편을 갖는 표지 탐침을 이용하여 엄격한 혼성화 조건 하에 적절한 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있는, 서열번호 1의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신 조성물.
46. 청구항 38 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 살아 있는 재조합 미생물을 포함하는 백신 조성물.
47. 청구항 46에 따른 발현 벡터를 포함하는 살아 있는 재조합 미생물을 포함하는 백신 조성물.
48. 청구항 47의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 백신 조성물.
49. 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 발현하는 청구항 48에 따른 숙주 세포의 막을 포함하는 백신 조성물.
50. 상기 폴리펩티드 또는 상기 면역원성 단편을 제조하기 충분한 조건 하에 청구항 48의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 청구항 31 내지 청구항 37 중 어느 한 항의 백신 조성물의 제조 방법.
51. 적어도 하나의 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 폴리뉴클레오티드 중 임의의 하나를 발현하기 충분한 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 청구항 38 내지 청구항 45 중 어느 한 항의 백신 조성물의 제조 방법.
52. 유효량의 청구항 31 내지 청구항 37 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 면역원성 단편 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 백신 조성물.
53. 유효량의 청구항 38 내지 청구항 45 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 백신 조성물.
54. 청구항 52 또는 청구항 53에 있어서,
    상기 조성물은 적어도 하나의 다른 헤모필러스 인플루엔자 항원을 포함하는 백신 조성물.
55. 청구항 1 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
    스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 뉴모라이신(pneumolysin)과 함께 제형화된 백신 조성물.
56. 청구항 1 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
    모락셀라 카타랄리스 유래의 Omp106과 함께 제형화된 백신 조성물.
57. 청구항 1 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
    모락셀라 카타랄리스 유래의 UspA1 및/또는 UspA2와 함께 제형화된 백신 조성물.
58. 청구항 1 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
    모락셀라 카타랄리스 유래의 Hly3과 함께 제형화된 백신 조성물.
59. 청구항 1 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
    모락셀라 카타랄리스 유래의 OmpCD와 함께 제형화된 백신 조성물.
60. 청구항 1 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
    모락셀라 카타랄리스 유래의 D15와 함께 제형화된 백신 조성물.
61. 청구항 1 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
    헤모필러스 인플루엔자 유래의 Omp26과 함께 제형화된 백신 조성물.
62. 청구항 1 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
    헤모필러스 인플루엔자 유래의 P6과 함께 제형화된 백신 조성물.
63. 청구항 1 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
    헤모필러스 인플루엔자 유래의 단백질 D 또는 E와 함께 제형화된 백신 조성물.
64. 청구항 1 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
    헤모필러스 인플루엔자 유래의 NlpC2와 함께 제형화된 백신 조성물.
65. 청구항 1 내지 청구항 45항 중 어느 한 항에 있어서,
    헤모필러스 인플루엔자 유래의 Slp 또는 pilA와 함께 제형화된 백신 조성물.
66. 감염의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에서의 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 백신의 용도.
67. 청구항 66에 있어서,
    상기 감염은 헤모필러스 인플루엔자에 의해 야기되는 용도.
68. 청구항 67에 있어서,
    상기 헤모필러스 인플루엔자는 캡슐화되거나 또는 비정형인 용도.
69. 청구항 66 내지 청구항 68 중 어느 한 항에 있어서,
    예컨대 만성 폐색성 폐 질환(COPD)을 앓는 소아 및 성인에서의 중이염, 부비동염 또는 하기도 감염의 예방 또는 치료를 위한 용도.
70. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 단백질, 단편 또는 펩티드 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 보강제, 운반체, 부형제, 결합제, 담체, 보존제, 완충제, 에멀전화제, 습윤제, 또는 전달감염 촉진 화합물을 포함하는 약제.
71. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 단백질, 단편 또는 펩티드의 단리 방법으로서, 상기 방법은
    a) 상기 단백질, 단편 또는 펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 헤모필러스 인플루엔자 또는 대장균을 성장시키고, 상기 박테리아를 수확하고, 외막 또는 봉입체를 단리하는 단계;
    b) 상기 봉입체를 강한 용매화제로 가용화하는 단계;
    c) 복원제를 첨가하는 단계; 및
    d) 결과물인 현탁액을 pH 8 내지 10의 완충액에 대해 투석하는 단계를 포함하는 방법.
72. 청구항 71에 있어서,
    상기 용매화제는 구아니듐 히드로클로라이드인 방법.
73. 청구항 71 또는 청구항 72에 있어서,
    상기 복원제는 아르기닌인 방법.
74. 청구항 71 내지 청구항 73 중 어느 한 항의 단계들을 포함하며, 상기 단백질, 단편 또는 펩티드는 부형제와 함께 제형화되는 백신의 제조 방법.
75. 청구항 1 내지 청구항 45 및 청구항 52 내지 청구항 65 중 어느 한 항에 따른 백신 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 개인에서 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
76. 청구항 75에 있어서,
    상기 감염은 헤모필러스 인플루엔자에 의해 야기되는 방법.
77. 청구항 76에 있어서,
    상기 헤모필러스 인플루엔자는 캡슐화되거나 또는 비정형인 방법.
78. 청구항 75 내지 청구항 77 중 어느 한 항에 있어서,
    예컨대 만성 폐색성 폐 질환(COPD)을 앓는 소아 및 성인에서의 중이염, 부비동염 또는 하기도 감염의 예방 또는 치료를 위한 방법.

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