CN103687613A - 蛋白f-具有层粘连蛋白和玻连蛋白结合性能的新的流感嗜血杆菌粘附素 - Google Patents

Abstract

描述了疫苗组合物，其包含可在流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)中检测到的具有SEQ ID NO：1中描述的氨基酸序列的蛋白质，或其片段。所述片段包含具有来自SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：1的多肽的免疫应答。

Description

蛋白F-具有层粘连蛋白和玻连蛋白结合性能的新的流感嗜血杆菌粘附素

发明领域

本发明涉及具有粘附性能的层粘连蛋白和玻连蛋白结合蛋白(蛋白F；pF)，可在流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)中找到的毒力因子。本发明还涉及包含蛋白F的疫苗组合物。

发明背景

B型流感嗜血杆菌(Hib)和不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)都在儿童和成人中引起多种疾病。Hib在年龄低于4岁的儿童中引起细菌性脑膜炎和其他侵入性感染，而NTHi已从中耳炎、窦炎、会厌炎、支气管炎和肺炎的案例中被分离，并可导致新生儿败血症。目前没有针对NTHi的可商购疫苗，但有多种在使用中的针对Hib的疫苗。这些疫苗由与多种蛋白质载体(脑膜炎球菌外膜复合物、破伤风类毒素、白喉毒素无毒突变体或白喉类毒素)缀合的Hib荚膜多糖、磷酸多核糖基核糖醇组成，缀合的目的是为了克服在低于18月龄的儿童中对荚膜多糖的弱免疫应答。流感嗜血杆菌外膜蛋白(OMP)也被认为是磷酸多核糖基核糖醇的载体，因为显示它们是在Hib和NTHi感染后的宿主抗体的靶。在针对流感嗜血杆菌感染的体内保护和体外杀菌测定中，已经检测了针对OMP P1，P2，P4，P5和P6以及98-kDa蛋白的抗体，针对P1，P4和P6的抗体显示了针对同源和异源流感嗜血杆菌菌株的生物学活性。针对其他OMP的抗体缺乏异源保护部分地由于这些蛋白质在不同流感嗜血杆菌菌株间的抗原多样性。因此理想的抗原必须暴露在细菌表面并且抗原性良好保守。例如，在Hib和NTHi菌株二者间广泛分布且抗原性保守的42-kDa膜蛋白(蛋白D)已经被分离、克隆、测序，并被显示为致病因子和有效的候选疫苗(Janson等人，1991，Prymula等人，2006).

NTHi发病机制中的初始步骤是对粘膜、基底膜和对细胞外基质(ECM)的粘附。两种主要类别的大分子构成哺乳动物的ECM，具有结构和粘附功能的纤维性蛋白质(例如层粘连蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白)和以蛋白聚糖形式与蛋白质连接的糖胺聚糖[Heino等人，2009]。ECM稳定组织的物理结构，涉及调节真核细胞粘附、分化、迁移、增殖、形状和结构。与ECM的细菌性相互作用在宿主组织的定居中起重要作用，并且在正常情况下ECM不暴露于病原体。然而，在由于机械或化学损伤或通过毒素和分解酶活性的细菌/病毒感染的组织损伤后，病原体可进入ECM。

层粘连蛋白是由α，β，和γ链组成的约400-900kDa的异源三聚体，大十字形的糖蛋白家族[Nguyen2006]。存在不同的α，β和γ链，并且它们组合成不同的层粘连蛋白同种型。层粘连蛋白对上皮的主要作用是将细胞锚定在基底膜上。一些病原体结合层粘连蛋白，例如，结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)[Kinhikar等人，2006]和卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)[Tan等人2006]。

玻连蛋白是ECM的另一个重要组分，其在肝脏中合成并分泌进血浆[综述见Singh等人，2010b]。大多数血液中的循环玻连蛋白是单体(65和75kDa)，而血管外细胞结合的玻连蛋白是多聚体。在血浆中发现高浓度的玻连蛋白(200-700μg/ml)，其也存在于不同的人组织中。在肝脏、扁桃体、十二指肠、心脏、骨骼肌和肺组织中观察到特别高的量。

玻连蛋白在包括细胞迁移、粘附和血管生成的许多生物学过程中起关键作用[Preissner等人，1998]。玻连蛋白与尿激酶纤溶酶原激活物-尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPA-uPAR)复合物和整合素受体的相互作用是涉及旧组织退化(细胞外周蛋白酶水解)、重组和伤口愈合的纤溶酶原激活系统的一部分。因此uPAR-玻连蛋白相互作用是内稳态过程中的关键决定因素[Smith等人，2010]。

除了作为ECM的组分以外，玻连蛋白涉及补体激活的末端途径的调控，以限制先天性免疫应答的自身反应性。膜攻击复合物(MAC)的形成处于2种抑制剂膜蛋白CD59和玻连蛋白的控制下。玻连蛋白在C5b-7复合物的膜结合位点与其结合，从而抑制复合物插入细胞膜。因此，抑制裂解细胞的MAC的形成和避免细胞裂解[Preissner，1991]。在存在玻连蛋白时，C5b-7复合物仍然能够结合C8和C9以形成C5b-8和C5b-9复合物，但后者是非裂解性的。此外，玻连蛋白通过结合C5b-9阻断C9的成孔聚合[Preissner等人，1985]。除了利用玻连蛋白作为附着至上皮细胞的桥，包括NTHi的一些病原体使用玻连蛋白作为抑制MAC的有效的补体调控物，以增加在入血清中的存活[Singh等人，2010b]。最近已显示，一些细菌外膜蛋白，特别是卡他莫拉菌的遍在表面蛋白(UspA2)[Singh等人，2010]和流感嗜血杆菌的蛋白E[

等人2009]与玻连蛋白相互作用。

在WO2007/084053中描述了名为蛋白E的表面暴露蛋白，所述蛋白质可在流感嗜血杆菌中检测到。蛋白E是粘附素且也结合玻连蛋白[Ronander2009，

2009]。

发明总结

鉴于已发现流感嗜血杆菌是上呼吸道和下呼吸道感染的如此重要的原因这一事实，目前需要开发可用于对抗流感嗜血杆菌的疫苗。

因此本发明的目的是进一步研究流感嗜血杆菌与体内细胞相互作用和与免疫系统相互作用的方式，能够提供针对流感嗜血杆菌的新型有效疫苗。

根据一个方面，本发明提供了可在流感嗜血杆菌中检测到的具有根据序列ID No.1的氨基酸序列的表面暴露蛋白，或其片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：1的多肽的免疫应答。

根据另一个方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含根据权利要求1的表面暴露蛋白的免疫原性片段，所述片段可在流感嗜血杆菌中被检测到。

根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含基于上述蛋白质的免疫原性蛋白质，其中SEQ ID No.1的第1-11或1-22位氨基酸中的一个或多个已被缺失或被一个或多个氨基酸替换。在一个实施方案中，SEQID No.1的第1-11或1-22位氨基酸中的一个或多个已被0-11或0-22个任选氨基酸序列替换。

根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含具有根据序列IDNO：2的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：2的多肽的免疫应答。

还根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：3的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ IDNO：3的氨基酸序列中的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：3的多肽的免疫应答。

还根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：4的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ IDNO：4的氨基酸序列中的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：4的多肽的免疫应答。

根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含具有根据序列IDNO：5的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：5的氨基酸序列中的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：5的多肽的免疫应答。

根据另一个方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含具有根据序列IDNO：6的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：6的氨基酸序列中的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：6的多肽的免疫应答。

仍然根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：7的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQID NO：7的氨基酸序列中的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：7的多肽的免疫应答。

根据另一个方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含具有根据序列IDNO：8的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：8的氨基酸序列中的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：8的多肽的免疫应答。

还根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：9的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ IDNO：9的氨基酸序列中的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：9的多肽的免疫应答。

根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含具有根据序列IDNO：10的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ IDNO：10的氨基酸序列中的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：10的多肽的免疫应答。

根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含具有根据序列IDNO：11的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ IDNO：11的氨基酸序列中的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：11的多肽的免疫应答。

仍然根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：12的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQID NO：12的氨基酸序列中的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：12的多肽的免疫应答。

根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含具有根据序列IDNO：13的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ IDNO：13的氨基酸序列中的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：13的多肽的免疫应答。

根据另一个方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含具有根据序列IDNO：14的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ IDNO：14的氨基酸序列中的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：14的多肽的免疫应答。

根据一个方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含根据上文的蛋白质或片段的至少一种二聚体、三聚体或多聚体。

根据另外的方面，本发明提供了根据上文的疫苗组合物，其还包含一种或多种可药用的佐剂、运载体、赋形剂、黏合剂、载体、防腐剂、缓冲剂、乳化剂、湿润剂或促转染化合物。

在另一个方面，本发明提供了根据上文的疫苗组合物，其包含至少另一种疫苗。

根据另外的方面，本发明提供了根据上文的疫苗组合物，其包含另一种分子的免疫原性部分。

根据另外的方面，本发明提供了上述疫苗组合物，其中另一种分子的免疫原性部分选自流感嗜血杆菌的蛋白D，pilA或蛋白E，卡他莫拉菌的MID，卡他莫拉菌的UspA1或UspA2，和在人或动物中发现的任意呼吸道病原体的外膜蛋白。

根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含编码上述蛋白质或片段的核酸序列，以及其同源物、多态性、简并物和剪接变体。

根据另一个方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含重组核酸序列，所述重组核酸序列包含与至少另一个基因融合的根据上文的核酸序列。

还根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含质粒或噬菌体，所述质粒或噬菌体包含上述核酸序列。

还根据另一个方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含非人宿主，所述宿主包含至少一种根据上文的质粒并能够生产上述蛋白质或片段，所述宿主选自细菌、酵母和植物。

根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含上述宿主，所述宿主是大肠杆菌(E.coli)。

根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含融合蛋白或多肽，其中通过利用上述重组核酸序列组合根据上文的蛋白质或片段与至少另一种蛋白质。

根据另一个方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含根据上文的融合蛋白，所述蛋白是上述蛋白质或片段的二聚体、三聚体或多聚体。

根据一个方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含融合产物，其中根据上文的蛋白质或片段或肽与蛋白质、碳水化合物或基质共价结合，或通过任意其他方式结合。

根据另一个方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含分离的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列在SEQ ID NO：1的全长上具有至少85％同一性的氨基酸序列。

根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含如在权利要求31中要求保护的分离的多肽，其中氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少95％的同一性。

还根据另外的方面，本发明提供了上述疫苗组合物，其包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列。

根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含SEQ ID NO：1的分离的多肽。

根据另一个方面，本发明提供了上述疫苗组合物，其中所述多肽缺乏SEQ ID NO：1的信号肽(氨基酸1-22)。

在一个实施方案中本发明提供了疫苗组合物，其包含免疫原性片段，所述免疫原性片段包含具有来自SEQ ID NO：1的氨基酸序列或来自上述多肽的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：1的多肽(或上述多肽，分别地)的免疫应答，或能够结合玻连蛋白和层粘连蛋白。

根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含上述多肽或免疫原性片段，其中所述多肽或所述免疫原性片段是较大的融合蛋白的一部分。

根据另一个方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码上述多肽或免疫原性片段。

根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含分离的多核苷酸，或与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列，所述分离的多核苷酸包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列编码在SEQ ID NO：1的全长上与SEQ IDNO：1的氨基酸序列具有至少85％同一性的多肽。

根据另一个方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含分离的多核苷酸，或与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列，所述分离的多核苷酸包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列在整个编码区上与编码SEQ ID NO：1的多肽的核苷酸序列具有至少85％同一性。

还根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含分离的多核苷酸，或与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列，所述分离的多核苷酸包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列在SEQ ID NO：15的全长上与SEQ IDNO：15的核苷酸序列具有至少85％同一性。

根据另外的方面，本发明提供了上述疫苗组合物，其中分离的多核苷酸与SEQ ID NO：15的同一性为至少95％。

在一个实施方案中本发明提供了疫苗组合物，其包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码SEQ ID NO：1的多肽，或上述免疫原性片段的核苷酸序列。

根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含SEQ ID NO：15的多核苷酸。

还根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码SEQ ID NO：1的多肽的核苷酸序列，所述分离的多核苷酸可通过在严格杂交条件下用具有SEQ ID NO：15的序列或其片段的经标记的探针筛选合适的文库得到。

在另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含表达载体或重组的活微生物，所述表达载体或重组的活微生物包含根据上文的分离的多核苷酸。

还在另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含重组的活微生物，所述重组的活微生物包含根据上文的表达载体。

根据另外的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含宿主细胞，所述宿主细胞包含上述表达载体。

根据另一个方面，本发明提供了疫苗组合物，其包含根据上文的宿主细胞的膜，所述宿主细胞表达分离的多肽，所述分离的多肽包含与SEQ IDNO：1的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。

还根据另外的方面，本发明提供了生产根据上文的疫苗组合物的方法，所述方法包括在足以生产所述多肽或所述免疫原性片段的条件下培养上述宿主细胞，和从培养基中回收多肽。

在一个实施方案中本发明提供了生产根据上文的疫苗组合物的方法，所述方法包括用包含至少一种所述多核苷酸的表达载体转化宿主细胞，和在足以表达任一种所述多核苷酸的条件下培养所述宿主细胞。

在另一个实施方案中本发明提供了疫苗组合物，其包含有效量的上述多肽或免疫原性片段和可药用的赋形剂。

还在另一个实施方案中本发明提供了疫苗组合物，其包含有效量的上述多核苷酸和可药用的赋形剂。

根据一个方面，本发明提供了根据上文的疫苗组合物，其中所述组合物包含至少另一种流感嗜血杆菌抗原。

根据另外的方面，本发明提供了根据上文的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的肺炎球菌溶血素一起配制。

根据另一个方面，本发明提供了上述疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自卡他莫拉菌的Omp106一起配制。

根据另一个方面，本发明提供了根据上文的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自卡他莫拉菌的UspA1和/或UspA2一起配制。

在一个实施方案中本发明提供了根据上文的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自卡他莫拉菌的Hly3一起配制。

在另一个实施方案中本发明提供了上述疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自卡他莫拉菌的OmpCD一起配制。

根据另外的方面，本发明提供了根据上文的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自卡他莫拉菌的D15一起配制。

根据另一个方面，本发明提供了根据上文的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自流感嗜血杆菌的Omp26一起配制。

还根据另一个方面，本发明提供了上述疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自流感嗜血杆菌的P6一起配制。

根据另外的方面，本发明提供了根据上文的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自流感嗜血杆菌的蛋白D或E一起配制。

根据另外的方面，本发明提供了根据上文的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自流感嗜血杆菌的NlpC2一起配制。

根据另外的方面，本发明提供了上述疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自流感嗜血杆菌的Slp或PilA一起配制。

在一个实施方案中本发明提供了根据上文的疫苗在制造用于预防或治疗感染的药物中的用途。

在另外的实施方案中本发明提供了根据上文的用途，其中所述感染由流感嗜血杆菌导致。

根据另外的方面，本发明提供了根据上文的用途，其中流感嗜血杆菌是有荚膜的或不可分型的。

还根据另外的方面，本发明提供了上述用途，用于预防或治疗在患有例如慢性阻塞性肺病(COPD)的儿童和成人中的中耳炎、窦炎或下呼吸道感染。

根据另一个方面，本发明提供了药物，其包含根据上文的至少一种蛋白质、片段或肽和一种或多种可药用的佐剂、运载体、赋形剂、黏合剂、载体、防腐剂、缓冲剂、乳化剂、湿润剂或促转染化合物。

还根据另一个方面，本发明提供了分离根据上文的蛋白质、片段或肽的方法，所述方法包括以下步骤：

a)培养包含编码所述蛋白质、片段或肽的DNA的流感嗜血杆菌或大肠杆菌，收获细菌并分离外膜、外膜囊泡或内含体；

b)用强溶解剂(solvatising agent)溶解内含体；

c)加入复性剂；和

d)用pH从8至10的缓冲液透析得到的悬浮液。

根据另外的方面，本发明提供了根据上文的方法，其中溶解剂是盐酸胍。

还根据另外的方面，本发明提供了上述方法，其中复性剂是精氨酸。

根据另一个方面，本发明提供了制备上述疫苗的方法，其中所述蛋白质、片段或肽和赋形剂一起配制。

根据另外的方面，本发明提供了预防或治疗在个体中的感染的方法，包括施用药物有效量的根据上文的疫苗组合物。

在一个实施方案中所述感染由有荚膜的或不可分型的流感嗜血杆菌导致，并且还在另一个实施方案中所述感染选自中耳炎、窦炎或下呼吸道感染。

在一个方面本发明涉及编码上述蛋白质、片段或肽的核酸序列，以及其同源物、多态性、简并物和剪接变体。在一个实施方案中，所述核酸序列与至少另一个基因融合。

在另一个方面本发明涉及包含上述核酸序列的质粒或噬菌体。

还在另一个实施方案中本发明涉及非人宿主，其包含至少一种上述质粒并能够生产上述蛋白质、片段或肽，以及其同源物、多态性、简并物和剪接变体，所述宿主选自细菌、酵母和植物。在一个实施方案中，所述宿主是大肠杆菌。

还在另一个方面，本发明提供了融合蛋白或多肽，其中上述蛋白质、片段或肽通过利用上述重组核酸序列与至少另一种蛋白质组合。在一个实施方案中，所述融合蛋白质是上述蛋白质、片段或肽的二聚体、三聚体或多聚体。

在一个方面，本发明涉及融合产物，其中上述蛋白质或片段或肽与蛋白质、碳水化合物或基质共价结合，或通过任意其他方式结合。

本发明涉及蛋白F，特别是蛋白F多肽和蛋白F多核苷酸，重组材料和其生产方法。在另一个方面，本发明涉及使用这些多肽和多核苷酸的方法，尤其包括微生物疾病的预防和治疗。在另外的方面，本发明涉及用于检测与微生物感染相关的疾病和与这些感染相关的病况的诊断测定，例如用于检测蛋白F多核苷酸或多肽的表达或活性的测定。

通过阅读下面的描述和阅读本公开内容的其他部分，在公开的发明的精神和范围内的多种改变和修改对本领域技术人员而言将是显而易见的。

附图描述

图1.使用玻连蛋白作为诱饵，在1维和2维凝胶电泳(2D-SDS-PAGE)中都检测到29kDa玻连蛋白结合流感嗜血杆菌蛋白。制备来自缺乏(-)或存在(+)CO₂的临床分离物NTHi3655的外膜囊泡(OMV)。运行SDS-PAGE并印迹至尼龙滤器上(左图)。也对来自存在CO₂时培养的培养物的OMV进行2D-SDS-PAGE(右图)。对1维和2维凝胶，平行运行2块对应的凝胶。一块凝胶印迹至尼龙滤器(A)，一块用考马斯蓝染色(B)。加入人血浆玻连蛋白，随后用山羊抗玻连蛋白pAb探测滤器，然后使用HRP缀合的驴抗绵羊pAb检测(A：i)。在图A：ii中，显示了仅与一抗和二抗pAb孵育(没有玻连蛋白)的滤器以排除二抗的背景结合。从考马斯染色的凝胶中切出对应推定的玻连蛋白结合蛋白的点(B)并通过MALDI-ToF测序。在图A：i和B中用箭头显示pF。

图2.包括NTHi3655中蛋白F(SEQ ID No：1)的信号肽的DNA序列和翻译的开放阅读框。在(A)中显示了DNA序列连同翻译的蛋白质序列，在(B)中概述了指示不同预测区的pF的示意图。

图3.蛋白F在不同的流感嗜血杆菌菌株的组中同源性很高。通过Clustal分析比较了在GeneBank中发现的对应HI0362的不同的pF氨基酸序列。

图4.在大肠杆菌中生产重组pF12-293。使用流感嗜血杆菌DNA作为模板，通过PCR扩增对应缺乏预测的信号肽的N-端部分(氨基酸pF1-11)的pF的开放阅读框的序列并克隆进pET26中，然后转化大肠杆菌，随后诱导，表达并使用镍树脂通过亲和层析纯化。在(A)中显示了考马斯染色的凝胶，并在(B)中显示了使用兔抗pF血清和HRP缀合的猪抗兔pAb检测pF的蛋白质印迹。包括来自NTHi3655和卡他莫拉菌Bc5的外膜囊泡(OMV)分别作为阳性和阴性对照。卡他莫拉菌OMV证明了兔抗血清的特异性。

图5.可在不可分型流感嗜血杆菌的外膜中找到蛋白F。(A)考马斯染色的凝胶，指示了临床NTHi分离物。(B)蛋白质印迹，显示了pF的位置。对来自8种不同的临床NTHi分离物的外膜蛋白(OMP)进行SDS-PAGE并使用特异性兔抗pF抗血清分析pF表达。

图6.pF缺陷的NTHi3655突变体在表面不表达pF。(A)NTHi3655野生型(WT)的流式细胞谱显示在缺乏一级抗pF兔pAb的条件下山羊抗兔pAb-FITC的背景值。(B)通过特异性抗pF pAb判断的NTHi3655上的蛋白F表达。(C)在缺乏抗pF兔pAb的条件下NTHi3655Δpf突变体的荧光。(D)pF缺陷NTHi3655Δpf突变体在表面不表达pF。如在材料和方法中描述地制造含有cat基因的NTHi3655Δpf突变体。在肉汤中过夜培养得到的突变体和野生型细菌并洗涤。之后，如指示地加入一级和检测pAb，然后在冰上孵育，洗涤和最后在流式细胞仪中分析。抗pF抗血清在兔中产生。在用重组pF12-293和佐剂免疫3次后，针对pF12-293免疫纯化得到的兔抗血清。显示了具有类似结果的3次实验中的一次典型实验。

图7.重组pF(氨基酸12-293)结合玻连蛋白且表达pF的NTHi3655相比pF缺陷突变体NTHi3655Δpf显著结合更多的玻连蛋白。(A)相比重组流感嗜血杆菌蛋白E，最近公开的粘附素[Ronander等人，2009]，玻连蛋白与pF12-293的结合稍好。(B)相比野生型细菌，缺乏pF的流感嗜血杆菌突变体具有显著降低的与玻连蛋白的结合。在(A)中，在微滴定板中包被重组蛋白质并使用人玻连蛋白和兔抗玻连蛋白pAb分析所述重组蛋白质的玻连蛋白的结合。包括与玻连蛋白高度结合的卡他莫拉菌蛋白UspA230-539[Singh等人，2010a]作为阳性对照。MID962-1200指示阴性对照，其是源自卡他莫拉菌菌株“Bc5”的重组表达的蛋白质。牛血清白蛋白(BSA)是另一个阴性对照。在(B)中，NTHi3655和pF突变体NTHi3655Δpf与[¹²⁵I]标记的玻连蛋白孵育。30分钟后洗涤细菌并在γ-闪烁计数器中进行测量。数据代表在图A和B每者中的3次独立实验。

图8.蛋白F12-293结合ECM蛋白层粘连蛋白。重组pF或pE附着于微滴定板中的塑料表面。加入小鼠肉瘤层粘连蛋白，然后使用兔抗层粘连蛋白pAb和HRP缀合的山羊抗兔pAb(作为第二层)进行检测。包括BSA作为阴性对照。显示了3次独立实验的平均值。

图9.重组pF12-293结合上皮细胞。在24孔板中将II型肺泡上皮细胞系A549培养至汇合，洗涤并用甲醛固定。之后，将浓度增加的重组pF12-293与细胞孵育，随后进行充分洗涤步骤。用抗pF兔抗血清和HRP缀合的山羊抗兔pAb(作为第二层)检测蛋白F。显示了3次独立实验中的一次典型实验。

图10.当与表达pF的野生型比较时，pF缺陷NTHi突变体具有显著降低的与上皮细胞的结合能力。在24孔板中将A549上皮细胞培养至汇合。在存在[³H]-胸苷的条件下培养细菌3小时。将NTHi3655野生型(WT)或pF缺陷突变体(Δpf)添加至细胞，然后孵育2小时。之后洗3次细胞，胰蛋白酶消化并在β-闪烁计数器中测量。使用不同的感染复数(MOI)。对成对的数据通过Student t检验得到p值。显示了3次独立实验的平均值±SD。

图11.用于绘制如在图12中表明的pF的上皮细胞结合区的肽的列表。

图12.主要是pF氨基酸残基23-48结合上皮细胞。显示了(A)H292和(B)A549上皮细胞系的结果。在T25烧瓶中培养细胞至汇合，通过胰蛋白酶-EDTA分离，然后洗涤。之后进行直接结合测定(DBA)。以摩尔比例加入[¹²⁵I]-标记的肽并与细胞在+4℃孵育30分钟。在γ-闪烁计数器中测量放射性。

图13.当通过流式细胞术分析时，抗pF44-68pAb识别NTHi3655表面上的pF。比较表达pF的NTHi3655野生型(A和B)和pF缺陷的NTHi3655Δpf突变体(C和D)。(A)和(C)指示在缺乏特异性抗pF44-68pAb的条件下的背景值。使用附着于CnBr-Sepharose柱的肽pF44-68从抗pF12-293抗血清中免疫纯化识别pF44-68的抗体。pF44-68是通过生物信息学分析揭示的预测的免疫原性区(未显示)。如指示加入一级和检测pAb，然后在冰上孵育，洗涤，最后在流式细胞仪中分析。

发明详述

在详细地解释本发明以前，理解本发明不受限于此申请中的实施方案和本文描述的步骤的细节是重要的。提到的实施例是为了说明本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明能够包括其他实施方案且能够以多种方式实践或实施。应当理解，本文使用的措辞和术语仅是为了描述的目的而不是限制。

本申请描述了名为蛋白F(pF)的新的流感嗜血杆菌外膜蛋白的克隆和表达。使用人玻连蛋白作为诱饵发现了此蛋白质。

为了最大化重组pF的产量，制造了由氨基酸残基A12至K293组成的截短的pF片段。因此去除包括氨基酸pF1-11的预测的信号肽的N-端部分并替换为前导肽外加源自载体pET26(+)的9个残基。将截短的pF命名为pF12-293。

本发明包含嗜血杆菌属外膜蛋白pF和pF衍生肽pF23-48(SEQ IDNo：2)，pF44-68(SEQ ID No：3)，pF64-88(SEQ ID No：4)，pF84-108(SEQ IDNo：5)，pF104-128(SEQ ID No：6)，pF124-148(SEQ ID No：7)，pF144-168(SEQ ID No：8)，pF164-188(SEQ ID No：9)，pF184-209(SEQ ID No：10)，pF204-230(SEQ ID No：11)，pF225-255(SEQ ID No：12)，pF250-275(SEQID No：13)，pF270-293(SEQ ID No：14)，及其二聚体、三聚体或寡聚体。特别地，给予pF或表面暴露的衍生肽的序列更高的优先性。

因此，根据本发明的疫苗组合物包含可在所有流感嗜血杆菌中检测到的具有根据SEQ ID No：1的氨基酸序列的表面暴露的蛋白质，和/或具有根据SEQ ID No：2-14的氨基酸序列的肽，或其片段，同源物、功能等同物、衍生物、简并物或羟基化、磺化或糖基化产物或其其他二级加工产物作为免疫原性组分。疫苗组合物也可包含根据本发明的融合蛋白或多肽，或融合产物作为免疫原性组分。免疫原性组分能够引发针对流感嗜血杆菌的抗体或其他免疫应答，其中引发的抗体抑制流感嗜血杆菌细菌对对象的细胞的致病机制。根据本发明的疫苗组合物的“免疫原性剂量”是这样的剂量，其在施用后产生相比施用前的标准免疫应答的可检测的体液和/或细胞免疫应答。

在本发明的疫苗组合物中使用的产生抗原的核酸序列可通过多种程序插入任意多种表达载体。这样的程序被认为是本领域技术人员公知的。

使用公知的方法和技术容易实现疫苗组合物，并可以多种方式，优选胃肠外或鼻内施用疫苗组合物。适于胃肠外或鼻内施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与考虑中的对象的体液等渗的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂或增稠剂。活性免疫原性成分经常与可药用的赋形剂，例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等混合。此外，疫苗组合物可还含有少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、黏合剂、载体或防腐剂。

疫苗组合物也可包括用于增强组合物的免疫原性的佐剂，例如弗氏佐剂和本领域公知的其他系统。

疫苗组合物的免疫原性组分，即本发明的蛋白质、片段、肽、融合蛋白或多肽或融合产物可作为中性或盐的形式配制进疫苗。

疫苗组合物的剂量将取决于疫苗的比活，并可通过常规实验容易地测定。以治疗有效的和免疫原性的量施用疫苗组合物，并且量取决于对象。

本发明涉及在下文中更详细描述的蛋白F多肽和多核苷酸。特别地，本发明涉及流感嗜血杆菌的蛋白F的多肽和多核苷酸。蛋白F多肽具有信号序列并暴露在细菌的表面。信号肽位于蛋白F多肽的第1位残基至第22位残基。

本文中提及的“蛋白F”指本文中讨论的本发明的任意肽、免疫原性片段、融合物、多肽或蛋白质(例如SEQ ID NO：1，有或没有信号序列，或其中信号肽的第1-11位(预测的信号肽的N-端部分)或第1-22位的氨基酸可被缺失或替换为一种或多种氨基酸)。

“编码蛋白F的多核苷酸”指编码本文中讨论的本发明的任意肽、免疫原性片段、融合物、多肽或蛋白质的任意多核苷酸序列。

本文中的术语“包含”可可选地替换为术语“由...组成”。

应当理解，在下文的序列表中引用的作为“DNA”的序列代表本发明的实施方案的示例，因为普通技术人员将认识到这些序列一般可有用地应用在包括多核糖核苷酸的多核苷酸中。

蛋白F的序列在SEQ ID No：1中示出(来自NTHi菌株3655)。用于绘制pF的上皮细胞结合区的蛋白F编码的肽序列在SEQ ID No：2-14中示出(来自NTHi菌株3655)。蛋白F多核苷酸的序列在SEQ ID NO：15中示出。

多肽

在本发明的一个方面提供了在本文中将其称为“蛋白F”和“蛋白F多肽”的流感嗜血杆菌(特别是不可分型流感嗜血杆菌)的多肽，及其在生物、诊断、预防、临床或治疗上有效的变体，和包含所述多肽或变体的组合物。

本发明还提供了：

(a)分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：1-14中的任意序列具有至少85％同一性，优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，最优选地至少97-99％同一性或完全相同的氨基酸序列，

(b)由分离的多核苷酸编码的多肽，所述分离的多核苷酸包含与SEQID NO：15的任意序列在SEQ ID NO：15的选择的序列的全长上具有至少85％同一性，优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，甚至更优选地至少97-99％同一性或完全相同的多核苷酸序列；或

(c)由分离的多核苷酸编码的多肽，所述分离的多核苷酸包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码与SEQ ID NO：1-14的任意序列的氨基酸序列具有至少85％同一性，优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，甚至更优选地至少97-99％同一性或完全相同的多肽。

在SEQ ID NO：1-14中提供的蛋白F多肽是来自不可分型流感嗜血杆菌菌株的蛋白F多肽。已经从图3列出的流感嗜血杆菌菌株中确认了其他蛋白F序列。

本发明也提供了蛋白F多肽的免疫原性片段，即，蛋白F多肽的连续部分，其与包含选自SEQ ID NO：1-14的相应氨基酸序列的多肽具有相同或基本相同的免疫原性活性。也就是说，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别蛋白F多肽的免疫应答。这样的免疫原性片段可包括，例如缺乏N-端前导序列或其部分，和/或跨膜结构域和/或C-端锚定结构域的蛋白F多肽。在优选的方面，根据本发明的蛋白F的免疫原性片段包含与选自SEQ ID NO：1-14的序列在所述序列的全长上具有至少85％同一性，优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，最优选地至少97-99％同一性的多肽的基本全部的胞外结构域。

片段是具有与本发明的任意多肽的任意氨基酸序列的部分地而不是全部完全相同的氨基酸序列的多肽。与蛋白F多肽一样，片段可为“独立的”，或包含在较大的多肽中，片段形成所述较大的多肽的部分或区域，最优选地作为单个较大多肽中的单个连续区域。因此片段可比全长天然序列短，或如果其包含在较大的多肽中的话，其可为全长天然序列或较长的融合蛋白。

优选的片段包括，例如具有选自SEQ ID NO：1-14的氨基酸序列或其变体的一部分的截短多肽，例如包括氨基和/或羧基末端氨基酸序列的连续的系列残基。也优选通过宿主细胞或在宿主细胞中生产的本发明的多肽的降解形式。还优选通过结构或功能特性表征的片段，例如包含α-螺旋和α-螺旋形成区、β-折叠和β-折叠形成区、转角和转角形成区、卷曲和卷曲形成区、亲水区、疏水区、α两亲性区、β两亲性区、弹性区、表面形成区、底物结合区和高抗原指数区的片段。

其他优选的片段包括包含具有选自SEQ ID NO：1-14的氨基酸序列的至少15，20，30，40，50或100个连续的氨基酸的氨基酸序列的分离的多肽，或包含具有从选自SEQ ID NO：1-14的氨基酸序列截短或缺失了至少15，20，30，40，50或100个连续的氨基酸的氨基酸序列的分离的多肽。

还优选的片段是包含B细胞表位的片段，例如在图11中描述的那些片段/肽。

本发明的全长蛋白F的片段可用于通过肽合成生产相应的全长多肽；因此，这些片段可用作生产全长蛋白F或基于本发明的蛋白F序列的其他多肽的中间体。

特别优选的是下述变体，其中若干，5-10，1-5，1-3，1-2或1个氨基酸以任意组合被替换、缺失或添加。

本发明的多肽，或免疫原性片段可为“成熟”蛋白质的形式或可为较大的蛋白质例如前体或融合蛋白的一部分。包括这样的额外的氨基酸序列常常是有利的，所述额外的氨基酸序列含有分泌或前导序列、前序列、帮助纯化的序列例如多组氨酸残基，或用于重组生产期间的稳定性的额外序列。此外，也考虑添加外源多肽或脂类尾或多核苷酸序列以增加最终分子的免疫原性潜能。

在一个方面，本发明涉及经遗传改造的可溶性融合蛋白，其包含本发明的多肽，或其片段，和多种亚型(IgG，IgM，IgA，IgE)的免疫球蛋白重或轻链的恒定区的多个部分。

作为免疫球蛋白，优选人IgG，特别是IgG1的重链的恒定部分，其中融合发生在铰链区。在特定的实施方案中，可简单地通过并入切割序列去除Fc部分，所述切割序列可被凝血因子Xa切割。

此外，此发明涉及通过基因工程制备这些融合蛋白的方法，及其用于药物筛选、诊断和疗法的用途。本发明的另一个方面也涉及编码这些融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的实例可见WO94/29458和WO94/22914。

蛋白质可为化学缀合的，或表达为重组融合蛋白，所述重组融合蛋白允许较之非融合蛋白在表达系统中以增加的水平生产。融合伙伴可帮助提供T辅助表位(免疫融合伙伴)，优选地人识别的T辅助表位，或帮助以高于天然重组蛋白的产率表达蛋白质(表达增强子)。优选地融合伙伴将既是免疫融合伙伴又是表达增强伙伴。

融合伙伴包括来自流感嗜血杆菌的蛋白D(EP594610)，来自流感嗜血杆菌的蛋白E(EP1973933)和/或来自流感病毒的非结构蛋白，NS1(血凝素)。另一种融合伙伴是名为Omp26的蛋白质(WO97/01638)。另一种融合伙伴是名为LytA的蛋白质。优选地使用分子的C端部分。LytA源自肺炎链球菌，其合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，酰胺酶LytA，(由lytA基因编码{Gene，43(1986)第265-272页})，特异性降解肽聚糖骨架中的某些键的自溶素。LytA蛋白的C-端结构域负责对胆碱或对一些胆碱类似物例如DEAE的亲和力。此性能已被用于开发用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LytA表达质粒。已经描述了在其氨基端含有C-LytA片段的杂种蛋白的纯化{Biotechnology：10，(1992)第795-798页}。可以使用在C末端中发现的从第178位残基开始的LytA分子的重复部分，例如第188-305位残基。

本发明也包括上述蛋白F和肽的变体，即通过保守氨基酸替换与参考物不同的肽，其中残基被具有相似特征的另一种残基替换。一般这样的替换在Ala，Val，Leu和Ile之间；Ser和Thr之间；酸性残基Asp和Glu之间；Asn和Gln之间；和碱性残基Lys和Arg之间；或芳香性残基Phe和Tyr之间。

本发明的多肽可以任意的合适方式制备。这样的多肽包括分离的天然存在的多肽、重组生产的多肽、合成生产的多肽，或通过这些方法的组合生产的多肽。制备这样的多肽的方式是本领域众所周知的。

最优选地，本发明的多肽源自不可分型流感嗜血杆菌，然而其可优选地从相同分类学属的其他生物中得到。本发明的多肽也可从例如相同分类学科或目的生物中得到。

多核苷酸

本发明的目的是提供编码蛋白F多肽的多核苷酸，特别是编码本文命名为蛋白F的多肽的多核苷酸。

在本发明的特别优选的实施方案中，多核苷酸包含编码蛋白F多肽的区域，所述区域包含在SEQ ID NO：15中示出的序列，所述序列包括全长基因或其变体。

在SEQ ID NO：15中提供的蛋白F多核苷酸是来自不可分型流感嗜血杆菌菌株3655的蛋白F多核苷酸。已经测定了在图3列出的来自流感嗜血杆菌菌株的编码蛋白F的基因的其他序列。

作为本发明的另外的方面，提供了编码和/或表达蛋白F多肽和多核苷酸，特别是不可分型流感嗜血杆菌蛋白F多肽和多核苷酸的分离的核酸分子，包括，例如未加工的RNA，核酶RNA，mRNA，cDNA，基因组DNA，B-和Z-DNA。本发明的其他实施方案包括生物学、诊断、临床、预防或治疗上有用的多核苷酸和多肽，及其变体，和包含所述多核苷酸、多肽或变体的组合物。

本发明的另一个方面涉及分离的多核苷酸，其包括至少一个全长基因，所述基因编码具有SEQ ID NO：1-14的推断的氨基酸序列的蛋白F多肽，和与其密切相关的多核苷酸及其变体。

在本发明的另一个特别优选的实施方案中涉及来自不可分型流感嗜血杆菌的蛋白F多肽，其包含选自SEQ ID NO：1-14或其变体的氨基酸序列或由上述序列组成。

使用本文提供的信息，例如在SEQ ID NO：15中示出的多核苷酸序列，可使用标准克隆和筛选方法得到编码蛋白F多肽的本发明的多核苷酸，所述标准克隆和筛选方法例如用于从细菌中克隆和测序染色体DNA片段的方法，使用不可分型流感嗜血杆菌菌株3224A(或3655)细胞作为起始材料，然后得到全长克隆。

此外，在SEQ ID NO：15中示出的每个DNA序列含有开放阅读框，所述开放阅读框编码具有大约在SEQ ID NO：1中示出的氨基酸残基数的蛋白质，所述蛋白质具有使用本领域技术人员熟知的氨基酸残基分子量值可计算的推断的分子量。

在起始密码子和终止密码子之间的SEQ ID NO：15的多核苷酸分别编码SEQ ID NO：1的多肽。

在另外的方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含下述序列或由下述序列组成：

(a)多核苷酸序列，其与来自SEQ ID NO：15的任意多核苷酸序列在来自SEQ ID NO：15的多核苷酸序列的全长上具有至少85％同一性，优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，甚至更优选地至少97-99％同一性或完全相同；或

(b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽与来自SEQ ID NO：1-14(或其片段)的任意氨基酸序列在来自SEQ ID NO：1-14(或其片段)的氨基酸序列的全长上具有至少85％同一性，优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，甚至更优选地至少97-99％同一性或100％完全相同。

可通过包括下述步骤得到编码本发明的多肽的多核苷酸，包括来自除了不可分型流感嗜血杆菌以外的物种的同源物和直向同源物，所述步骤包括在严格杂交条件下(例如，使用45-65℃范围内的温度和从0.1-1％的SDS浓度)使用经标记的或可检测的探针筛选合适的文库，所述探针由选自SEQ ID NO：15或其片段的任意序列组成或包含所述任意序列；和分离含有所述多核苷酸序列的全长基因和/或基因组克隆。

本发明提供了多核苷酸序列，其在其全长上与在SEQ ID NO：15中示出的编码序列(开发阅读框)相同。

本发明也提供了成熟多肽或其片段自身的编码序列，以及与另一种编码序列(例如编码前导或分泌序列、前蛋白或原蛋白或前原蛋白序列的序列)符合读框的成熟多肽或其片段的编码序列。本发明的多核苷酸也可含有至少一种非编码序列，包括例如，但不限于至少一种非编码5’和3’序列，例如被转录但不被翻译的序列，终止信号(例如依赖rho的和不依赖rho的终止信号)，核糖体结合位点，Kozak序列，稳定mRNA的序列，内含子和多聚腺苷酸化信号。多核苷酸序列也可包含编码额外的氨基酸的额外的编码序列。例如，可编码帮助纯化融合多肽的标记物序列。在本发明的某些实施方案中，标记物序列是如在pQE载体(Qiagen，Inc.)中提供的和在Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA86：821-824(1989)中描述的六组氨酸肽，或HA肽标签(Wilson等人，Cell37：767(1984)，二者都可用于纯化与其融合的多肽。本发明的多核苷酸也包括，但不限于，包含结构基因及其天然相关的控制基因表达的序列的多核苷酸。

编码SEQ ID NO：1-14的蛋白F多肽的核苷酸序列可与编码SEQ IDNO：15的(或SEQ ID NO：15包含的)序列的对应多核苷酸相同。可选地其可为任意序列，所述序列由于遗传密码的冗余性(简并性)，也编码SEQID NO：1-14的多肽。

本文中使用的术语“编码多肽的多核苷酸”涵盖包括这样的序列的多核苷酸，所述序列编码本发明的多肽，特别是细菌多肽和更特别地具有在SEQ ID NO：1-14的任意序列中示出的氨基酸序列的不可分型流感嗜血杆菌的多肽蛋白F或其片段的序列。术语也涵盖下述多核苷酸，其包括编码多肽的单个连续区或不连续区(例如，被整合的噬菌体、整合的插入序列、整合的载体序列、整合的转座子序列，或由于RNA编辑或基因组DNA重组中断的多核苷酸)和也可含有编码和/或非编码序列的额外的区域。

本发明也涉及本文描述的多核苷酸的变体，所述变体编码具有SEQ IDNO：1-14的任意序列的推断的氨基酸序列的多肽的变体。本发明的多核苷酸片段可用于，例如合成本发明的全长多核苷酸。

优选的片段是编码B细胞表位(例如在图11中描述的片段/肽)的多核苷酸，和包含所述多核苷酸片段的重组、嵌合基因。

还特别优选的实施方案是编码蛋白F变体的多核苷酸，所述变体具有来自SEQ ID NO：1-14的任意序列的蛋白F多肽的氨基酸序列，其中若干，一些，5至10，1至5，1至3，2，1或没有氨基酸残基以任意组合被替换、修饰、缺失和/或添加。其中特别优选不改变蛋白F多肽的性能和活性(例如在本文实施例章节中描述的那些性能)的沉默替换、添加和缺失。

本发明的其他优选实施方案是在其全长上与编码蛋白E多肽的多核苷酸至少85％同一的多核苷酸，和与这些多核苷酸互补的多核苷酸，所述蛋白E多肽具有在SEQ ID NO：1-14的任意序列中示出的氨基酸序列。可选地，最高度优选地是包含在其全长上与编码蛋白F多肽的多核苷酸至少90％同一的区域的多核苷酸和与其互补的多核苷酸。在此方面，特别优选在其全长上与编码蛋白F多肽的多核苷酸至少95％同一的多核苷酸。此外，在至少95％中高度优选至少97％，和其中特别高度优选至少98％和至少99％，更优选至少99％。

优选的实施方案是编码这样的多肽的多核苷酸，所述多肽基本保持与选自SEQ ID NO：15的DNA序列编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性。

依照此发明的某些优选实施方案，提供了与蛋白F多核苷酸序列(例如SEQ ID NO：15的那些多核苷酸)杂交，特别是在严格条件下杂交的多核苷酸。

本发明还涉及与本文提供的多核苷酸序列杂交的多核苷酸。在此方面，本发明特别涉及在严格条件下与本文描述的多核苷酸杂交的多核苷酸。本文中使用的术语“严格条件”和“严格杂交条件”指只有在序列之间存在至少95％和优选地至少97％同一性时才发生的杂交。严格杂交条件的具体实例是在包含50％甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5x Denhardt溶液，10％硫酸葡聚糖和20微克/ml经变性、剪切的鲑鱼精DNA的溶液中在42℃过夜孵育，然后在0.1x SSC中在约65℃洗涤杂交支持物。杂交和洗涤条件是公知的，并在Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，特别是其中的第11章中举例说明。溶液杂交也可用于本发明提供的多核苷酸序列。

本发明也提供了由下述多核苷酸序列组成的或包含下述多核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸序列是通过使用具有在SEQ ID NO：15的相应序列中示出的所述多核苷酸序列或其片段的序列的探针，在严格杂交条件下筛选含有在SEQ ID NO：15的任意序列中示出的多核苷酸序列的完整基因的合适的文库，并分离所述多核苷酸序列得到的。用于得到这样的多核苷酸的片段包括，例如在本文其他地方充分描述的探针和引物。

如在本文有关本发明的多核苷酸测定的其他部分讨论地，例如，本发明的多核苷酸可用作用于RNA，cDNA和基因组DNA的杂交探针，以分离编码蛋白F的全长cDNA和基因组克隆，和分离与蛋白F基因具有高同一性，特别是高序列同一性的其他基因的cDNA和基因组克隆。这样的探针一般将包含至少15个核苷酸残基或碱基对。优选地，这样的探针将具有至少30个核苷酸残基或碱基对和可具有至少50个核苷酸残基或碱基对。特别优选的探针将具有至少20个核苷酸残基或碱基对和将具有少于30个核苷酸残基或碱基对。

可使用在SEQ ID NO：15中提供的DNA序列合成寡核苷酸探针通过筛选分离蛋白F基因的编码区。然后使用具有与本发明的基因序列互补的序列的经标记的寡核苷酸筛选cDNA，基因组DNA或mRNA文库，以测定哪些文库成员与探针杂交。

得到全长DNA或延伸短DNA的若干方法是现有的和本领域技术人员熟知的，例如基于cDNA末端快速扩增(RACE)的方法(见，例如Frohman，等人，PNAS USA85：8998-9002，1988)。例如，以Marathon^TM技术(ClontechLaboratories Inc.)为例的最近的改进技术已显著简化了对较长的cDNA的寻找。在Marathon^TM技术中，已从选定组织提取的mRNA中制备了cDNA并在每个末端连接“衔接头”序列。然后进行核酸扩增(PCR)以扩增DNA的“丢失的”5’末端，使用基因特异性和衔接头特异性寡核苷酸引物的组合。然后使用“巢式”引物，即设计用于在扩增的产物内退火的引物(一般是在衔接头序列的更远的3’端退火的衔接头特异性引物，和在选定的基因序列的更远的5’端退火的基因特异性引物)重复PCR反应。然后通过DNA测序可分析此反应的产物，并通过将产物直接连接至现有的DNA以得到完整的序列，或使用用于5’引物设计的新的序列信息实施单独的全长PCR构建全长DNA。

本发明的多核苷酸和多肽可用作例如，用于发现疾病，特别是人疾病的治疗和诊断的研究试剂和材料，如本文有关多核苷酸测定进一步讨论的。

是源自SEQ ID NO：15的序列的寡核苷酸的本发明的多核苷酸可用于本文描述的方法中，但优选地用于PCR，以测定本文鉴定的多核苷酸是否在受感染的组织的细菌中整体或部分地转录。公认这样的序列也用于诊断病原体达到的感染阶段和感染类型。

本发明也提供了编码下述多肽的多核苷酸，所述多肽是成熟蛋白质加上额外的氨基或羧基端氨基酸，或在成熟多肽内部的氨基酸(例如，当成熟形式具有多于一条多肽链时)。这样的序列可在加工蛋白质从前体至成熟形式中起作用，可允许蛋白质转运，可延长或缩短蛋白质半寿期或特别地可帮助在测定或生产中操纵蛋白质。一般在体内的情况下，可通过细胞酶从成熟蛋白质上去除额外的氨基酸。

对本发明的每一种多核苷酸提供了与其互补的多核苷酸。优选地，这些互补的多核苷酸与与其互补的每一种多核苷酸完全互补。

具有与一个或多个前序列融合的多肽的成熟形式的前体蛋白可为多肽的失活形式。当前序列(prosequence)被去除时这些失活前体一般被激活。在激活前可去除一些或全部前序列。一般将这些前体称为原蛋白(proprotein)。

除了核苷酸的标准A，G，C，T/U表示法，也可使用术语“N”描述本发明的某些多核苷酸。“N”指在DNA或RNA序列中的这样的指定位置上可出现4种DNA或RNA核苷酸中的任一种，除了优选地N不是这样的核酸之外，所述核酸当与相邻核苷酸位置组合时，当以正确的读框阅读时，将在这样的读框中具有产生过早终止密码子的效应。

总之，本发明的多核苷酸可编码成熟蛋白质，成熟蛋白质加前导序列(可将其称为前蛋白)，具有一个或多个不是前蛋白的前导序列的前序列的成熟蛋白质的前体，或前原蛋白(preproprotein)，其是具有前导序列和一个或多个前序列的原蛋白的前体，所述前导序列和一个或多个前序列一般在产生多肽的活性和成熟形式的加工步骤中被去除。

依照本发明的方面，提供了本发明的多核苷酸用于治疗或预防目的，特别是基因免疫的用途。

本发明的多核苷酸在基因免疫中的用途将优选地应用合适的递送方法，例如将质粒DNA直接注射进肌肉(Wolff等人，Hum Mol Genet(1992)1：363，Manthorpe等人，Hum.Gene Ther.(1983)4：419)，递送与特异性蛋白质载体复合的DNA(Wu等人，J Biol Chem.(1989)264：16985)，DNA与磷酸钙共沉淀(Benvenisty&Reshef，PNAS USA，(1986)83：9551)，将DNA封装在多种形式的脂质体中(Kaneda等人，Science(1989)243：375)，粒子轰击(Tang等人，Nature(1992)356：152，Eisenbraun等人，DNA Cell Biol(1993)12：791)和使用克隆的逆转录病毒载体体内感染(Seeger等人，PNASUSA(1984)81：5849)。

载体、宿主细胞、表达系统

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，用本发明的载体遗传改造的宿主细胞和通过重组技术生产本发明的多肽。也可使用无细胞翻译系统生产这样的蛋白质，使用源自本发明的DNA构建体的RNA。

可通过本领域技术人员熟知的方法从包含表达系统的经遗传改造的宿主细胞中制备本发明的重组多肽。因此，在另外的方面，本发明涉及包含本发明的一种或多种多核苷酸的表达系统，用这些表达系统遗传改造的宿主细胞，和通过重组技术生产本发明的多肽。

为了重组生产本发明的多肽，可对宿主细胞进行遗传改造以掺入本发明的表达系统或其部分或多核苷酸。可通过在许多标准实验室手册，例如Davis，等人，BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，(1986)和Sambrook，等人，MOLECULAR CLONING：ALABORA TORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)中描述的方法，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转应(transvection)、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、缀合、转导、划痕装载(scrape loading)、弹道引入(ballistic introduction)和感染进行将多核苷酸引入宿主细胞。

合适的宿主的代表性例子包括细菌细胞，例如链球菌(streptococci)、葡萄球菌(staphylococci)、肠球菌(enterococci)、大肠杆菌、链霉菌(streptomyces)、蓝细菌(cyanobacteria)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌的细胞；真菌细胞，例如酵母、克鲁维酵母(Kluveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia)、担子菌(basidiomycete)、白色念珠菌(Candida albicans)和曲霉属(Aspergillus)的细胞；昆虫细胞例如果蝇属(Drosophila)S2和夜蛾属(Spodoptera)Sf9的细胞；动物细胞例如CHO，COS，HeLa，C127，3T3，BHK，293，CV-1和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞，例如裸子植物或被子植物的细胞。

可使用多种表达系统生产本发明的多肽。这些载体特别包括染色体、附加体和病毒来源的载体，例如源自细菌质粒、源自噬菌体、源自转座子、源自酵母附加体、源自插入元件、源自酵母染色体元件、源自病毒例如杆状病毒、乳多空病毒、例如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒、小RNA病毒、逆转录病毒和α病毒的载体和源自其组合的载体，例如源自质粒和噬菌体遗传元件的载体，例如粘粒和噬菌粒。表达系统构建体可含有调控和引起表达的控制区。在此方面，一般可使用适合在宿主中维持、繁殖或表达多核苷酸和/或表达多肽的任意系统或载体用于表达。可通过多种熟知和常规的技术中的任一种将合适的DNA序列插入表达系统，例如在Sambrook等人，MOLECULAR CLONING，A LABORATORYMANUAL，(见上文)中示出的技术。

在真核细胞重组表达系统中，为了将翻译的蛋白质分泌到内质网腔、周质空间或细胞外环境中，可将合适的分泌信号掺入表达的多肽中。这些信号相对多肽可为内源的或其可为异源信号。

可通过熟知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的多肽，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选地，使用离子金属亲和层析(IMAC)用于纯化。当多肽在细胞内合成、分离和或纯化期间变性时，可使用熟知的用于重折叠蛋白质的技术再生活性构象。

表达系统也可为重组的活微生物，例如病毒或细菌。可将目的基因插入活的重组病毒或细菌的基因组中。用此活载体接种和体内感染将导致抗原的体内表达和诱导免疫应答。用于此目的的病毒和细菌为例如：痘病毒(例如牛痘、禽痘、金丝雀痘)，α病毒(辛德毕斯病毒，塞姆利基森林病毒，委内瑞拉马脑炎病毒)，腺病毒，腺相关病毒，小RNA病毒(脊髓灰质炎病毒，鼻病毒)，疱疹病毒(水痘带状疱疹病毒，等等)，李斯特菌属(Listeria)，沙门氏菌属(Salmonella)，志贺氏菌属(Shigella)，BCG，链球菌。这些病毒和细菌可为有毒的，或为了得到活疫苗以多种方式减毒的。这样的或疫苗也构成本发明的部分。

诊断、预后、血清分型和突变测定

此发明也涉及本发明的蛋白F多核苷酸和多肽用作诊断试剂的用途。在真核生物，特别是哺乳动物和尤其是人中检测蛋白F多核苷酸和/或多肽将提供用于疾病诊断、疾病分期或感染性生物对药物的应答的诊断方法。通过多种熟知技术以及本文提供的方法，可在核酸或氨基酸水平上检测真核生物，特别是哺乳动物，和尤其是人，特别是感染了或疑似感染了包含蛋白F基因或蛋白质的生物的那些。

可从推定感染和/或感染的个体的身体材料中得到用于预后、诊断或其他分析的多肽和多核苷酸。来自任一这些来源的多核苷酸，特别是DNA或RNA可直接用于检测或可在分析前通过使用PCR或任意其他扩增技术酶促扩增。也可以相同的方式使用RNA，特别是mRNA，cDNA和基因组DNA。使用扩增，可通过分析生物的选定的多核苷酸的基因型对个体中存在的感染性或驻留生物的种和株进行表征。通过与选自相关生物，优选相同属的不同物种或相同种的不同菌株的参考序列的基因型相比的扩增的产物大小的改变可检测缺失和插入。通过使扩增的DNA与经标记的蛋白F多核苷酸序列杂交可鉴定点突变。通过DNA酶或RNA酶消化(分别用于DNA或RNA)，或通过检测熔解温度或复性动力学的差异，可分辨完全或显著匹配的序列和不完全或更显著错配的双链体。也可通过较之参考序列，多核苷酸片段在凝胶中的电泳迁移率的改变检测多核苷酸序列差异。这可用或不用变性剂进行。也可通过直接的DNA或RNA测序检测多核苷酸差异。见，例如，Myers等人，Science，230：1242(1985)。也可通过核酸酶保护测定，例如RNA酶，V1和S1保护测定或化学切割法揭示在特异性位置上的序列变化。见，例如，Cotton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，85：4397-4401(1985)。

在另一个实施方案中，可构建包含蛋白F核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探针阵列以进行例如基因突变、血清型、系统分类或鉴定的有效筛选。阵列技术方法是熟知的并具有普适性，并可用于解决在分子遗传学中的多种问题，包括基因表达、遗传连锁和遗传变异性(见，例如，Chee等人，Science，274：610(1996))。

因此在另一个方面，本发明涉及诊断试剂盒，其包含：

(a)本发明的多核苷酸，优选地SEQ ID NO：15的任意核苷酸序列，或其片段；

(b)与(a)的多核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(c)本发明的多肽，优选地SEQ ID NO：1-14的任意多肽，或其片段；或

(d)针对本发明的多肽，优选地针对SEQ ID NO：1-14的任意多肽的抗体，

应当理解，在任意这样的试剂盒中，(a)，(b)，(c)或(d)可包含实质组分(substantial component)。这样的试剂盒将特别地用于诊断疾病或对疾病的易感性。

此发明也涉及本发明的多核苷酸作为诊断试剂的用途。检测与疾病或致病性相关的本发明的多核苷酸的突变形式，优选SEQ ID NO：15的任意序列的突变形式将提供可增加或定义疾病的诊断，病程的预后，疾病阶段的测定，或对疾病的易感性的诊断工具，这是多核苷酸的低表达、过表达或改变的表达的结果。可通过多种技术，例如在本文其他部分描述的技术在多核苷酸水平上检测在这些多核苷酸中携带突变的生物，特别是传染性生物。

也可通过多种技术在多核苷酸或多肽水平上检测在本发明的多核苷酸和/或多肽中携带突变或多态性(等位基因变异)的生物的细胞，以允许例如血清分型。例如，可使用RT-PCR检测RNA中的突变。特别优选使用RT-PCR与自动化检测系统(例如GeneScan)的组合。RNA，cDNA或基因组DNA也可用于相同的目的，PCR。例如，与编码蛋白F多肽的多核苷酸互补的PCR引物可用于鉴定和分析突变。

本发明还提供了从5’和/或3’末端去除了1，2，3或4个核苷酸的引物。这些引物可特别地用于扩增从源自个体的样品(例如身体材料)分离的蛋白F DNA和/或RNA。引物可用于扩增从受感染的个体分离的多核苷酸，使得然后可对多核苷酸进行多种技术以阐明多核苷酸序列。这样，可检测多核苷酸序列中的突变并使用突变以对感染或其阶段或过程进行诊断和/或预后，或对感染原进行血清分型和/或分类。

本发明还提供了用于诊断疾病，优选细菌感染，更优选由不可分型流感嗜血杆菌导致的感染的方法，所述方法包括从源自个体的样品，例如身体材料中测定多核苷酸的提高的表达水平，所述多核苷酸具有SEQ ID NO：15的序列中的任意序列。可使用本领域熟知的用于定量多核苷酸的任一方法测量蛋白F多核苷酸的提高或降低的表达，例如，扩增、PCR、RT-PCR、RNA酶保护、Northern印迹、光谱测定法和其他杂交方法。

此外，可使用依照本发明的诊断测定检测例如感染的存在，所述诊断测定用于检测相比正常对照组织样品的蛋白F多肽的过表达。

可用于测定在源自宿主的样品，例如身体材料中的蛋白F多肽水平的测定技术是本领域技术人员熟知的。这样的测定方法包括放射免疫测定、竞争结合测定、蛋白质印迹分析、抗体夹心测定、抗体检测和ELISA测定。

本发明的多核苷酸可用作多核苷酸阵列的组分，优选高密度阵列或网格的组分。这些高密度阵列特别有助于诊断和预后目的。例如，可使用每者包含不同基因并且还包含本发明的多核苷酸的点的组用于探测，例如使用杂交或核酸扩增，使用从身体样品得到的或源自身体样品的探针，以检测个体中特别多核苷酸序列或相关序列的存在。这样的存在可指示病原体，特别是不可分型流感嗜血杆菌的存在，并可用于疾病或病程的诊断和/或预后。优选包含SEQ ID NO：15的任意多核苷酸序列的多种变体的网格。也优选编码SEQ ID NO：1-14的任意多肽序列的多核苷酸序列的多种变体。

抗体

本发明的多肽和多核苷酸或其变体，或表达所述多肽和多核苷酸或其变体的细胞可用作免疫原以生产分别对于这些多肽或多核苷酸免疫特异性的抗体。可选地，也可使用多肽序列中的表位的模拟表位，特别是肽模拟表位用作免疫原以生产对于本发明的多肽免疫特异性的抗体。术语“免疫特异性”指相比其对现有技术中的其他相关多肽的亲和力，抗体对本发明的多肽具有实质更高的亲和力。

在本发明的某些优选的实施方案中提供了针对蛋白F多肽或多核苷酸的抗体。

可通过对动物，优选非人动物使用常规方案施用本发明的多肽和/或多核苷酸，或二者之一或二者的具有表位的片段，二者之一或二者的类似物，或表达二者之一或二者的细胞，得到针对本发明的多肽或多核苷酸产生的抗体。为了制备单克隆抗体，可使用本领域已知的提供通过连续的细胞系培养物生产的抗体的任意技术。例子包括多种技术，例如在Kohler，G.和Milstein，C.，Nature256：495-497(1975)；Kozbor等人，Immunology Today4：72(1983)；Cole等人，第77-96页在MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY，Alan R.Liss，Inc.(1985)中描述的技术。

可调整用于生产单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)以生产本发明的多肽或多核苷酸的单链抗体。也可使用转基因小鼠，或其他生物或动物，例如其他哺乳动物，以表达对于本发明的多肽或多核苷酸免疫特异性的人源化抗体。

可选地，可利用噬菌体展示技术从筛选的具有抗蛋白F的人淋巴细胞的PCR扩增的v-基因库或从天然文库中选择对本发明的多肽具有结合活性的抗体(McCafferty，等人，(1990)，Nature348，552-554；Marks，等人，(1992)Biotechnology10，779-783)。也可通过例如链改组提高这些抗体的亲和力(Clackson等人，(1991)Nature352：628)。

上述抗体可用于分离或鉴定表达本发明的多肽或多核苷酸的克隆以例如通过亲和层析纯化多肽或多核苷酸。

因此，针对蛋白F多肽或蛋白F多核苷酸的抗体可特别用于治疗感染，特别是细菌感染。

包括抗原、表位或免疫学等同变体的多肽变体构成此发明的特别的方面。

优选地，修饰抗体或其变体使其在个体中免疫原性较低。例如，如果个体是人，抗体最优选地为“人源化的”，其中杂交瘤来源的抗体的一个或多个互补决定区已被移植到人单克隆抗体中，例如如在Jones等人(1986)，Nature321，522-525或Tempest等人，(1991)Biotechnology9，266-273中描述的。

拮抗剂和激动剂——测定和分子

本发明的多肽或多核苷酸也可用于评估在例如细胞、无细胞制剂、化学文库和天然产物混合物中的小分子底物和配体的结合。这些底物和配体可为天然底物和配体或可为结构或功能模拟物。见例如Coligan等人，Current Protocols in Immunology1(2)；第5章(1991)。

通过与候选化合物直接或间接连接的标记物，筛选方法可仅测量候选化合物与多肽或多核苷酸，或与具有多肽或多核苷酸的细胞或膜，或多肽的融合蛋白的结合。可选地，筛选方法可涉及与经标记的竞争物的竞争。此外，这些筛选方法可检测候选化合物是否导致由多肽或多核苷酸的激活或抑制产生的信号，使用适合于包含多肽或多核苷酸的细胞的检测系统。一般在存在已知的激动剂时测定抑制或激活，并且观察在候选化合物存在时激动剂对激活的影响。可在反向激动剂或抑制剂的筛选方法中，在没有激动剂或抑制剂时，使用组成型活性多肽和/或组成型表达的多肽和多核苷酸，通过检测候选化合物是否导致多肽或多核苷酸的抑制或激活，视情况而定。此外，筛选方法可仅包括以下步骤：混合候选化合物和含有本发明的多肽或多核苷酸的溶液以形成混合物，测量混合物中的蛋白F多肽和/或多核苷酸活性，和比较混合物的蛋白F多肽和/或多核苷酸活性和标准物。也可使用融合蛋白，例如在上文描述的由Fc部分和蛋白F多肽组成的那些融合蛋白，用于高通量筛选测定，以鉴定本发明的多肽的拮抗剂，以及系统发生以及和/或功能相关的多肽的拮抗剂(见D.Bennett等人，JMol Recognition，8：52-58(1995)；和K.Johanson等人，J Biol Chem，270(16)：9459-9471(1995))。

也可使用与本发明的多肽结合和/或相互作用的多核苷酸，多肽和抗体构成筛选方法用于检测添加的化合物对细胞中的mRNA和/或多肽的生产的影响。例如，通过本领域公知的标准方法，使用单克隆和多克隆抗体，可构建ELISA测定用于测量多肽的分泌或细胞相关的水平。这可用于从适当操作的细胞或组织中发现可抑制或增强多肽的生产的活性剂(分别被称为拮抗剂或激动剂)。

本发明也提供了鉴定增强(激动剂)或阻断蛋白F多肽或多核苷酸的作用的化合物，特别是抑菌和/或杀菌的化合物的筛选化合物的方法。筛选方法可涉及高通量技术。例如，为了筛选激动剂或拮抗剂，在缺乏或存在可能为蛋白F激动剂或拮抗剂的候选分子的条件下，孵育包含蛋白F多肽和这些多肽的经标记的底物或配体的合成的反应混合物，细胞区室，例如膜、细胞囊膜或细胞壁，或其任意制剂。候选分子激动或拮抗蛋白F多肽的能力反映为标记配体的降低的结合或来自这些底物的产物的降低的生产。义务地(gratuitously)结合的分子，即不诱导蛋白F多肽的作用的分子最可能是好的拮抗剂。良好结合，和视情况而定，增加来自底物的产物生产率、增加信号转导或增加化学通道活性的分子是激动剂。可通过使用报告子系统增强视情况而定，对来自底物的产物生产、信号转导或化学通道活性的速率或水平的检测。在此方面可用的报告子系统包括但不限于转化为产物的色度标记底物，响应蛋白F多核苷酸或多肽活性改变的报告子基因，和本领域公知的结合测定。

用于蛋白F激动剂的测定的另一个例子是竞争性测定，其在适于竞争性抑制测定的条件下组合蛋白F和潜在的激动剂和蛋白F结合分子，重组蛋白F结合分子，天然底物或配体或底物或配体模拟物。例如可通过放射性或色度化合物标记蛋白F，使得可准确测定与结合分子结合的或转化为产物的蛋白F分子的数量，以评估潜在的拮抗剂的有效性。

潜在的拮抗剂特别包括结合本发明的多核苷酸和/或多肽和因此抑制或消除其活性或表达的有机小分子、肽、多肽和抗体。潜在的拮抗剂也可为这样的有机小分子、肽、多肽，例如紧密相关的蛋白质或抗体，其结合在结合分子(例如结合分子)上的相同位点，而不诱导蛋白F诱导的活性，从而通过阻止蛋白F多肽和/或多核苷酸结合阻止蛋白F多肽和/或多核苷酸的作用或表达。

潜在的拮抗剂包括这样的小分子，其结合并占据多肽的结合位点，从而阻止与细胞结合分子的结合，使得阻止正常生物学活性。小分子的例子包括但不限于有机小分子、肽或肽样分子。其他潜在的拮抗剂包括反义分子(有关这些分子的描述见Okano，J.Neurochem.56：560(1991)；OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENEEXPRESSION，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。优选的潜在拮抗剂包括与蛋白F相关的化合物和蛋白F变体。

在另外的方面，本发明涉及经遗传改造的可溶性融合蛋白，其包含本发明的多肽，或其片段，和多个亚类(IgG，IgM，IgA，IgE)的免疫球蛋白的重或轻链的恒定区的多个部分。优选人IgG，特别是IgG1的重链的恒定部分作为免疫球蛋白，其中融合发生在铰链区。在特别的实施方案中，可仅通过掺入可被凝血因子Xa切割的切割序列去除Fc部分。此外，此发明涉及通过遗传工程制备这些融合蛋白的方法，及其用于药物筛选、诊断和疗法的用途。本发明的另外的方面也涉及编码这些融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的例子可见国际专利申请号WO94/29458和WO94/22914。

本文提供的每一个多核苷酸序列可用于探索和开发抗菌化合物。被编码的蛋白质在表达后可用作用于筛选抗菌药物的靶。另外，编码被编码的蛋白质的氨基端区域的多核苷酸或各个mRNA的Shine-Delgarno或其他翻译促进序列可用于构建控制目的编码序列的表达的反义序列。

本发明也提供了本发明的多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂用于干扰一种或多种病原体和真核，优选哺乳动物宿主之间最初的物理相互作用中的用途，所述相互作用导致感染的结果。特别地，本发明的分子可用于：预防细菌，特别是革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌对留置装置(in-dwellingdevice)上的真核，优选地哺乳动物的细胞外基质蛋白，或对伤口中的细胞外基质蛋白的粘附；阻断在真核，优选哺乳动物的细胞外基质蛋白和介导组织损伤的细菌蛋白F蛋白之间的细菌粘附和/或；阻碍除了由植入留置装置或由其他外科技术以外的原因起始的感染的致病机制的正常进展。

依照本发明的另一个方面，提供了蛋白F激动剂和拮抗剂，优选抑菌或杀菌激动剂和拮抗剂。

本发明的拮抗剂和激动剂可用于例如预防、抑制和/或治疗疾病。

在另外的方面，本发明涉及本发明的多肽的模拟表位。模拟表位是与天然肽(在序列上或结构上)足够类似的肽序列，其能够被识别天然肽的抗体识别；或当与合适的载体偶联时能够引发识别天然肽的抗体。

可通过添加、缺失或替换所选择的氨基酸设计肽模拟表位用于特别的目的。因此，为了易于和蛋白质载体缀合的目的可修饰肽。例如，对于一些化学缀合方法包括末端半胱氨酸可能是理想的。此外，对于与蛋白质载体缀合的肽，包括远离肽的缀合末端的疏水末端可能是理想的，使得肽的自由的未缀合端保持与载体蛋白质的表面连接。从而以最接近在整个天然分子的情况下发现的肽的构象展示肽。例如，可改变肽使其具有N-端半胱氨酸和C-端疏水酰胺化尾。可选地，可进行一个或多个氨基酸的D-立体异构体形式的添加或替换(inverso序列)以产生有益的衍生物，例如以增强肽的稳定性。模拟表位也可为天然肽序列的retro序列，因为序列方向是反向的。模拟表位特性也可为retro-inverso。在WO95/24916和WO94/05311中描述了retro、inverso和retro-inverso肽。

可选地，可使用能够自身结合本发明的多肽的抗体使用例如噬菌体展示技术(EP0 552 267B1)的技术鉴定肽模拟表位。此技术产生大量肽序列，所述肽序列模拟天然肽结构并因此能够结合抗天然肽抗体，但自身可不一定与天然多肽共有显著的序列同源性。

疫苗

本发明的另一个方面涉及在个体，特别是哺乳动物，优选人中诱导免疫应答的方法，其包括用足以生产抗体和/或T细胞免疫应答以保护所述个体免受感染，特别是细菌感染和最特别地是不可分型流感嗜血杆菌感染的蛋白F多核苷酸和/或多肽，或其片段或变体接种个体。也提供了这样的方法，藉此这样的免疫应答减慢细菌复制。本发明的另一个方面涉及在个体中诱导免疫应答的方法，其包括对所述个体递送核酸载体、序列或核酶以指导蛋白F多核苷酸和/或多肽，或其片段或变体的表达，用于体内表达蛋白F多核苷酸和/或多肽，或其片段或变体以诱导免疫应答，例如以生产抗体和/或T细胞免疫应答，包括例如产细胞因子T细胞或细胞毒性T细胞，以保护所述个体，优选人免患疾病，不论所述个体是否已患有疾病。施用基因的一个例子是通过作为颗粒上的涂层或其他形式使其加速进入期望的细胞。这样的核酸载体可包括DNA，RNA，核酶，经修饰的核酸，DNA/RNA杂交物，DNA-蛋白质复合物或RNA-蛋白质复合物。

本发明的另外的方面涉及免疫组合物，当所述组合物引入能够在体内诱导免疫应答的个体，优选人中时，诱导在所述个体中的针对蛋白F多核苷酸和/或由其编码的多肽的免疫应答，其中组合物包含重组蛋白F多核苷酸和/或由其编码的多肽和/或包含DNA和/或RNA，所述DNA和/或RNA编码和表达所述蛋白F多核苷酸、由其编码的多肽或其他本发明的多肽的抗原。免疫应答可用于治疗或预防，并且可采取抗体免疫和/或细胞免疫的形式，例如由CTL或CD4+T细胞引发的细胞免疫。

蛋白F多肽或其片段可与辅蛋白(co-protein)或化学部分融合，所述辅蛋白或化学部分自身可或不可生产抗体，但能够稳定第一种蛋白质和生产将具有抗原和/或免疫原性能，和优选地保护性能的融合的或修饰的蛋白质。如此融合的重组蛋白，优选地还包含抗原性辅蛋白，例如来自流感嗜血杆菌的脂蛋白或蛋白D(EP594610)，来自流感嗜血杆菌的蛋白E(EP1973933)，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或β-半乳糖苷酶，或使蛋白质溶解并帮助其生产或纯化的任意其他相对大的辅蛋白。此外，在提供接受蛋白质的生物的免疫系统的一般化的刺激的意义上，辅蛋白可作为佐剂。辅蛋白可附着于第一种蛋白质的氨基或羧基端。

在根据本发明的疫苗组合物中，蛋白F多肽和/或多核苷酸，或其片段，或模拟表位，或其变体可存在于载体中，例如上述活重组载体，例如活细菌载体。

非活载体也适用于蛋白F多肽，例如细菌外膜囊泡或“疱(bleb)”。OM疱源自革兰氏阴性菌的双层膜的外膜，并已在包括砂眼衣原体(C.trachomatis)和鹦鹉热衣原体(C.Psittaci)的多种革兰氏阴性菌中有记录(Zhou，L等人1998.FEMS Microbiol.Lett.163：223-228)。据报导生产疱的细菌病原体的非详尽列表也包括：百日咳杆菌(Bordetella pertussis)，伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)，绵羊布鲁氏菌(Brucella ovis)，大肠杆菌，流感嗜血杆菌，嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)，卡他莫拉菌，淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)，脑膜炎奈瑟菌，绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)。

疱具有提供处于其天然构象的外膜蛋白的优势，因此特别利于疫苗。也可通过改造细菌从而修饰一种或多种分子在外膜上的表达为了疫苗用途改进疱。因此例如可引入或上调(例如通过改变启动子)期望的免疫原性蛋白，例如蛋白F多肽在外膜上的表达。替代地或额外地，可下调不相关的(例如未保护的抗原或免疫显性但多变的蛋白质)或有害的(例如毒性分子例如LPS，或自身免疫应答的潜在诱导物)外膜分子的表达。下面更详细地讨论这些方法。

蛋白F基因的非编码侧翼区含有在基因表达中重要的调控元件。此调控在转录和翻译水平上都存在。可通过DNA测序得到在基因的开放阅读框的上游或下游的这些区域的序列。此序列信息允许测定潜在的调控基序，例如不同的启动子元件、终止序列、诱导型序列元件、阻遏子、负责相转变的元件、shine-dalgarno序列、具有潜在的参与调控的二级结构的区域，以及其他类型的调控基序或序列。此序列是本发明的另外的方面。

此序列信息允许调节蛋白F基因的天然表达。可通过改变启动子、shine-dalgarno序列、潜在的阻遏子或操纵子元件，或任意其他相关元件实现基因表达的上调。同样地，可通过类似类型的修饰实现表达的下调。可选地，通过改变相转变序列，可使基因表达处于相转变的控制之下，或使其与此调控解偶联。在另一种方法中，可使基因表达处于一种或多种允许受调控的表达的诱导型元件的控制之下。这样的调控的例子包括但不限于，通过温度变化、加入诱导底物例如选定的碳水化合物或其衍生物、微量元素、维生素、辅因子、金属离子等进行诱导。

可通过若干不同的方式引入上述这些修饰。可通过随机诱变然后选择期望的表型，在体内进行参与基因表达的序列修饰。另一种方法在于分离目的区域并通过随机诱变，或定点替换、插入或缺失诱变修饰目的区域。然后可将经修饰的区域通过同源重组再引入细菌基因组并可评估对基因表达的影响。在另一种方法中，可使用目的区域的序列信息来替换或缺失天然调控序列的全部或部分。在这种情况下，分离和修饰靶向的调控区以含有来自另一个基因的调控元件，来自不同基因的调控元件的组合，合成的调控区，或任意其他调控区，或以缺失野生型调控序列的选定部分。然后可通过同源重组将这些修饰的序列再引入细菌基因组中。可用于上调基因表达的优选启动子的非详尽列表包括下述启动子：来自脑膜炎奈瑟菌或淋病奈瑟菌(N.gonorroheae)的porA，porB，lbpB，tbpB，p110，lst，hpuAB；ompCD，copB，lbpB，ompE，UspA1；UspA2；来自卡他莫拉菌的TbpB；来自流感嗜血杆菌的p1，p2，p4，p5，p6，lpD，pE，tbpB，D15，Hia，Hmw1，Hmw2。

在一个例子中，可通过与较强的启动子交换基因的启动子调节基因的表达(通过分离基因的上游序列，体外修饰此序列，和通过同源重组再引入基因组)。可在细菌中以及从细菌脱落(或产生)的外膜囊泡中都得到上调的表达。

在其他例子中，所述方法可用于产生在疫苗应用中具有改进特性的重组细菌菌株。其可为，但不限于，减毒株，具有选定抗原的提高的表达的菌株，具有干扰免疫应答的基因敲除(或降低的表达)的菌株，具有免疫显性蛋白质的调节的表达的菌株，具有外膜囊泡的调节的脱落的菌株。

因此，本发明也提供了蛋白F基因的经修饰的上游区，所述经修饰的上游区含有异源调控元件，所述调控元件改变位于外膜上的蛋白F蛋白的表达水平。根据本发明的此方面的上游区包括蛋白F基因的上游序列。上游区从紧接蛋白F基因的上游开始，并通常持续到从ATG起始密码子开始不超过基因上游的约1000bp的位置。在位于多顺反序列(操纵子)中的基因的情况下，上游区可从紧接目的基因的前面，或操纵子中的第一基因的前面开始。优选地，根据本发明的此方面的经修饰的上游区在ATG上游500和700bp之间的位置上含有异源启动子。

公开的上游区上调蛋白F基因的表达的用途，通过同源重组实现此目的的方法(例如如在WO01/09350中描述的，将其引入本文作为参考)，包含适用于此目的的上游序列的载体，和这样改变的宿主细胞都是此发明的另外的方面。

因此，本发明提供了在经修饰的细菌疱中的蛋白F多肽。本发明还提供了能够生产基于非活膜的疱载体的经修饰的宿主细胞。本发明还提供了包含具有经修饰的上游区的蛋白F基因的核酸载体，所述上游区含有异源调控元件。

本发明还提供了制备根据本发明的宿主细胞和细菌疱的方法。

此发明还提供了组合物，特别是疫苗组合物，和包含本发明的多肽和/或多核苷酸和免疫刺激性DNA序列(例如在Sato，Y.等人Science273：352(1996)中描述的那些)的方法。

此发明还提供了在流感嗜血杆菌感染的动物模型中的这样的基因免疫实验中使用的多核苷酸构建体中，使用描述的多核苷酸或其特别的片段的方法，已显示所述多核苷酸或其特别的片段编码细菌细胞表面蛋白的非可变区。这样的实验将特别可用于鉴定能够引起预防或治疗性免疫应答的蛋白质表位。认为此方法将允许随后制备源自成功抵抗或清除了感染的动物的必需器官的、特别有价值的单克隆抗体，允许开发在哺乳动物，特别是人中的细菌感染，特别是流感嗜血杆菌感染的预防剂或治疗法。

本发明也包括疫苗制剂，其包含本发明的免疫原性重组多肽和/或多核苷酸连同合适的载体，例如可药用的载体。因为多肽和多核苷酸可在胃中被分解，优选地胃肠外施用每者，包括例如皮下、肌肉内、静脉内或皮内施用。适于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌化合物和使制剂与个体的体液，优选血液等渗的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，其可含有悬浮剂或增稠剂。制剂可存在于单位剂量或多剂量的容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并可在冻干条件下储存，在使用前仅需要立即加入无菌液体载体。

本发明的疫苗制剂也可包括佐剂系统用于增强制剂的免疫原性。优选地，佐剂系统优先引发TH1型应答。

免疫应答可广泛地分为2个极端类型，体液或细胞介导的免疫应答(传统上分别以抗体和细胞效应保护机制为特征)。这些应答类型被称为TH1型应答(细胞介导的应答)和TH2型免疫应答(体液应答)。

极端的TH1型免疫应答可通过抗原特异性、单倍型限制的细胞毒性T淋巴细胞的产生和自然杀伤细胞的应答表征。在小鼠中TH1型应答经常通过IgG2a亚型的抗体的产生表征，而在人中其对应IgG1型抗体。TH2型免疫应答通过广泛的免疫球蛋白同种型(在小鼠中包括IgG1，IgA，和IgM)的产生表征。

可以认为，产生这两类免疫应答的背后的驱动力是细胞因子。高水平的TH1型细胞因子倾向有利于诱导对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的TH2型细胞因子倾向有利于诱导对抗原的体液应答。

TH1和TH2型免疫应答的区别不是绝对的。实际上个体将支持被描述为TH1主要的或TH2主要的免疫应答。然而，经常方便地根据Mosmann和Coffman(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1and TH2cells：different patterns of lymphokine secretion lead至different functionalproperties.Annual Review of Immunology，7，p145-173)在鼠CD4+ve T细胞克隆中描述的理解细胞因子家族。传统上，TH1型应答与T淋巴细胞产生的INF-γ和IL-2细胞因子相关。通常与诱导TH1型免疫应答直接相关的其他细胞因子不是由T细胞产生的，例如IL-12。相反地，TH2型应答与IL-4，IL-5，IL-6和IL-13的分泌相关。

已知某些疫苗佐剂特别适合刺激TH1或TH2型细胞因子应答。传统上，在接种疫苗或感染后免疫应答的TH1：TH2平衡的最佳指示物包括在用抗原再刺激后在体外直接测量T淋巴细胞产生的TH1或TH2细胞因子，和/或测量抗原特异性抗体应答的IgG1：IgG2a比例。

因此，TH1型佐剂是这样的佐剂，当用抗原在体外再刺激时，其优先刺激分离的T细胞群产生高水平TH1型细胞因子，并促进CD8+细胞毒性T淋巴细胞和与TH1型同种型相关的抗原特异性免疫球蛋白应答的产生的佐剂。

在国际专利申请号WO94/00153和WO95/17209中描述了能够优先刺激TH1细胞应答的佐剂。

3De-O-酰化单磷酰脂A(3D-MPL)是一种这样的佐剂。其从GB2220211(Ribi)知晓。在化学上其是具有4，5或6个酰化链的3De-O-酰化单磷酰脂A的混合物，由Ribi Immunochem，Montana制造。3De-O-酰化单磷酰脂A的优选形式在欧洲专利0689454B1(SmithKline BeechamBiologicals SA)中公开。

优选地，3D-MPL的颗粒足够小以致可通过0.22微米的膜无菌过滤(欧洲专利号0689454)。

3D-MPL将以10μg-100μg，优选地25-50μg/剂的范围存在，其中抗原一般将以2-50μg/剂的范围存在。

另一种优选的佐剂包含QS21，源自石碱木(Quillaja saponariaMolina)树皮的HPLC纯化的无毒级分。任选地其可与3De-O-酰化单磷酰脂A(3D-MPL)混合，任选地与载体一起混合。

在美国专利号5,057,540中公开了生产QS21的方法。

以前已描述了含有QS21的无反应原性(Non-reactogenic)佐剂制剂(WO96/33739)。当与抗原一起配制时，显示这样的包含QS21和胆固醇的制剂是成功的TH1刺激佐剂。

是TH1细胞应答的优先刺激物的其他佐剂包括免疫调节寡核苷酸，例如如在WO96/02555中公开的未甲基化的CpG序列。

也考虑不同的TH1刺激佐剂(例如上文提及的佐剂)的组合以提供是TH1细胞应答的优先刺激物的佐剂。例如，QS21可与3D-MPL一起配制。QS21：3D-MPL的比例一般在1∶10至10∶1的数量级；优选1∶5至5∶1和基本上经常为1∶1。最佳协同作用的优选范围是2.5∶1至1∶1的3D-MPL：QS21。

优选地在根据本发明的疫苗组合物中也存在载体。载体可为水包油乳剂，或铝盐，例如磷酸铝或氢氧化铝。

优选的水包油乳剂包含可代谢的油，例如鲨烯、α生育酚和吐温80。在特别优选的方面，在根据本发明的疫苗组合物中的抗原在这样的乳剂中与QS21和3D-MPL组合。另外地，水包油乳剂可含有span85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。

一般用于入施用，QS21和3D-MPL将以1μg-200μg，例如10-100μg，优选地10μg-50μg/剂的范围存在于疫苗中。一般地水包油将包含2至10％鲨烯，2至10％α生育酚和0.3至3％吐温80。优选地鲨烯：α生育酚的比例等于或小于1，因为这提供了更稳定的乳剂。Span85也可以1％的水平存在。在有些情况下，本发明的疫苗将还有利地包含稳定剂。

无毒水包油乳剂优选地在水性载体中含有无毒油，例如角鲨烷或鲨烯，乳化剂，例如吐温80。水性载体可为，例如磷酸缓冲盐溶液。

在WO95/17210中描述了在水包油乳剂中包含QS21，3D-MPL和生育酚的特别有力的佐剂制剂。

尽管已参考某些蛋白F多肽和多核苷酸描述了本发明，应当理解这包括天然存在的多肽和多核苷酸的片段，和具有基本上不影响重组多肽或多核苷酸的免疫原性性能的添加、缺失或替换的类似多肽和多核苷酸。优选的片段/肽显示在图11中。

本发明也提供了多价疫苗组合物，其包含本发明的疫苗制剂和其他抗原，特别是用于治疗中耳炎的抗原的组合。这样的多价疫苗组合物可包括本文上面描述的TH-1诱导佐剂。

在优选的实施方案中，本发明的多肽、片段和免疫原与一种或多种以下组的抗原一起配制：a)一种或多种肺炎球菌荚膜多糖(简单的(plain)或与载体蛋白缀合)；b)一种或多种可保护宿主抵抗卡他莫拉菌感染的抗原；c)一种或多种可保护宿主抵抗肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)感染的蛋白抗原；d)一种或多种其他不可分型流感嗜血杆菌蛋白抗原；e)一种或多种可保护宿主抵抗RSV的抗原；和f)一种或多种可保护宿主抵抗流感病毒的抗原。优选组a)和b)；b)和c)；b)，d)，和a)和/或c)；b)，d)，e)，f)，和a)和/或c)的组合。这样的疫苗可有利地用作全面的中耳炎疫苗。

肺炎球菌荚膜多糖抗原优选地选自血清型1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F(最优选地选自血清型1，3，4，5，6B，7F，9V，14，18C，19F和23F)。

优选的肺炎球菌蛋白抗原是暴露在肺炎球菌外表面的那些肺炎球菌蛋白(在肺炎球菌的至少部分生命周期期间能够被宿主的免疫系统识别)，或由肺炎球菌分泌或释放的蛋白质。最优选地，所述蛋白质是肺炎链球菌的毒素、粘附素、2组分信号转导物或脂蛋白，或其片段。特别优选的蛋白质包括但不限于：肺炎球菌溶血素(优选地通过化学处理或突变解毒的)[Mitchell等人Nucleic Acids Res.1990Jul11；18(13)：4010″Comparisonof pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types1and2.″，Mitchell等人Biochim Biophys Acta1989Jan23；1007(1)：67-72″Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli：rapid purificationand biological properties.″，WO96/05859(A.Cyanamid)，WO90/06951(Paton等人)，WO99/03884(NAVA)]；PspA及其跨膜缺失变体(WO92/14488；WO99/53940；US5804193-Briles等人)；PspC及其跨膜缺失变体(WO99/53940；WO97/09994-Briles等人)；PsaA及其跨膜缺失变体(Berry&Paton，Infect Immun1996Dec；64(12)：5255-62″Sequenceheterogeneity of PsaA，a37-kilodalton putative adhesin essential forvirulence of Streptococcus pneumoniae″)；肺炎球菌胆碱结合蛋白及其跨膜缺失变体；CbpA及其跨膜缺失变体(WO97/41151；WO99/51266)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Infect.Immun.1996 64：3544)；HSP70(WO96/40928)；PcpA(Sanchez-Beato等人FEMS Microbiol Lett1998，164：207-14)；M样蛋白，SB专利申请号EP0837130；和粘附素18627(SB专利申请号EP0834568)。其他优选的肺炎球菌蛋白抗原是在WO98/18931中描述的，特别是选自WO98/18930和PCT/US99/30390的那些肺炎球菌蛋白抗原。

可包括在组合疫苗(特别是用于预防中耳炎)中的优选的卡他莫拉菌蛋白抗原是：OMP106[WO97/41731(Antex)&WO96/34960(PMC)]；OMP21；LbpA&/或LbpB[WO98/55606(PMC)]；TbpA&/或TbpB[WO97/13785&WO97/32980(PMC)]；CopB[Helminen ME，等人(1993)Infect.Immun.61：2003-2010]；UspA1和/或UspA2[WO2007/018463(Arne Forsgren AB)，WO93/03761(University of Texas)]；OmpCD；HasR(PCT/EP99/03824)；PilQ(PCT/EP99/03823)；OMP85(PCT/EP00/01468)；lipo06(GB9917977.2)；lipo10(GB9918208.1)；lipo11(GB9918302.2)；lipo18(GB9918038.2)；P6(PCT/EP99/03038)；D15(PCT/EP99/03822)；OmplA1(PCT/EP99/06781)；Hly3(PCT/EP99/03257)；和OmpE。

可包括在组合疫苗(特别是用于预防中耳炎)中的优选的其他不可分型流感嗜血杆菌蛋白抗原包括：丝束蛋白[(US5766608-Ohio StateResearch Foundation)]和包含来自其的肽的融合物[例如LB1(f)肽融合物；US5843464(OSU)或WO99/64067]；OMP26[WO97/01638(Cortecs)]；P6[EP281673(State University of New York)]；蛋白D(EP594610)；蛋白E(EP1 973 933)；TbpA和/或TbpB；Hia；Hsf；Hin47；Hif；Hmw1；Hmw2；Hmw3；Hmw4；Hap；D15(WO94/12641)；P2；P5(WO94/26304)；NlpC2(BASB205)[WO02/30971]；Slp(BASB203)[WO02/30960]；和iOMP1681(BASB210)[WO02/34772]。

优选的流感病毒抗原包括整个、活的或失活的病毒，在卵或MDCK细胞或Vero细胞中培养的裂解的流感病毒，或整个流感病毒体(virosome)(如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920描述)或其纯化的或重组蛋白，例如HA，NP，NA，或M蛋白，或其组合。

优选的RSV(呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋白或其衍生物。

组合物、试剂盒和施用

在本发明的另外的方面提供了用于对细胞或对多细胞生物施用的包含蛋白F多核苷酸和/或蛋白F多肽的组合物。

本发明还涉及包含本文讨论的多核苷酸和/或多肽或其激动剂或拮抗剂的组合物。本发明的多肽和多核苷酸可与用于细胞、组织或生物的一种或多种非灭菌的或无菌的载体组合使用，例如适于对个体施用的药物载体。这样的组合物包含例如，介质添加剂或治疗有效量的本发明的多肽和/或多核苷酸和可药用的载体或赋形剂。这样的载体可包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。制剂应适合施用模式。本发明还涉及诊断和药物包和试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器填充了一种或多种本发明的上述组合物的成分。

本发明的多肽、多核苷酸和其他化合物可单独使用或与其他化合物，例如治疗化合物组合使用。

药物组合物可以任意有效、方便的方式施用，特别地包括例如通过局部、口、肛门、阴道、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、鼻内或皮内途径施用。

在疗法中或作为预防药，活性剂可作为可注射的组合物，例如作为无菌水性分散液，优选等渗的无菌水分散液的形式对个体施用。

在另外的方面，本发明提供了药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的多肽和/或多核苷酸，例如多肽和/或多核苷酸的可溶形式，激动或拮抗肽或小分子化合物，和可药用的载体或赋形剂的组合。这样的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。本发明还涉及药物包和试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器填充了一种或多种本发明的上述组合物的成分。本发明的多肽、多核苷酸和其他化合物可单独使用或与其他化合物，例如治疗化合物组合使用。

组合物将适合于施用途径，例如全身或口服途径。全身施用的优选形式包括注射，一般通过静脉内注射。可使用其他注射途径，例如皮下、肌肉内或腹膜内注射途径。全身施用的可选方式包括使用渗透剂例如胆汁盐或夫西地酸(fusidic acid)或其他去垢剂经粘膜和经皮施用。另外，如果可将本发明的多肽或其他化合物配制为肠溶制剂或囊封制剂，也可口服施用。也可以药膏、糊剂、凝胶、溶液、粉末等形式局部和/或定位施用这些化合物。

为了对哺乳动物，特别是人施用，预期活性剂的每日剂量水平将为从0.01mg/kg至10mg/kg，通常约1mg/kg。无论如何医师将决定最合适个体的实际剂量，这将根据特定个体的年龄、体重和反应而变化。上述剂量是平均情况的示例。当然会有应当较高或较低剂量范围的个例，这些包括在此发明的范围内。

所需的剂量范围取决于选择的肽，施用途径，制剂的性质，对象的病况，和主治医生的判断。然而，合适的剂量在0.1-100μg/kg对象的范围内。

疫苗组合物方便地为可注射的形式。可使用常规佐剂以增强免疫应答。接种疫苗的合适的单位剂量是0.5-5微克/kg抗原，这样的剂量优选地施用1-3次，间隔为1-3周。使用指示的剂量范围，将不会观察到会妨碍本发明的化合物对合适的个体施用的有害的毒理学作用。

然而，考虑到多种可用的化合物和多种施用途径的不同的效率，预期需要的剂量在大范围内变化。例如，预期口服施用将比通过静脉内注射的施用需要较高的剂量。可使用本领域众所周知的用于优化的标准实验途径调整这些剂量水平的变化。

序列数据库、在有形介质中的序列和算法

多核苷酸和多肽序列形成了有价值的信息资源，可用于测定其二维和三维结构以及鉴定具有相似同源性的其他序列。通过将序列存储在计算机可读介质中，然后在已知的大分子结构程序中使用存储的数据或使用熟知的搜索工具，例如GCG程序包可最容易地实现这些方法。

本发明也提供了分析特征序列或串，特别是基因序列或编码的蛋白质序列的方法。优选的序列分析方法包括，例如序列同源性分析方法，例如同一性和相似性分析，DNA、RNA和蛋白质结构分析，序列组装，进化枝分析，序列基序分析，开放阅读框测定，核酸碱基调用，密码子使用分析，核酸碱基整理和测序色谱峰分析。

提供了进行同源性鉴定的基于计算机的方法。此方法包括以下步骤：在计算机可读介质中提供包含本发明的多核苷酸序列的第一多核苷酸序列；和比较所述第一多核苷酸序列和至少一种第二多核苷酸或多肽序列以鉴定同源性。

也提供了进行同源性鉴定的基于计算机的方法，所述方法包含以下步骤：在计算机可读介质中提供包含本发明的多肽序列的第一多肽序列；和比较所述第一多肽序列和至少一种第二多核苷酸或多肽序列以鉴定同源性。

将在此说明书中引用的所有出版物和参考，包括但不限于专利和专利申请以其整体引入本文作为参考，就如同每一单个出版物或参考被明确特别和单独地说明被引入本文作为参考被充分阐述一样。也将此申请要求优先权的任意专利申请以其整体以上述用于出版物和参考的方式一样引入本文作为参考。

定义

如本领域公知的，“同一性”是通过如比较序列测定的两种或多种多肽序列或两种或多种多核苷酸序列之间的关系，视情况而定。在本领域中，“同一性”也表示多肽或多核苷酸序列(视情况而定)之间的序列相关程度，如通过这些序列字符串之间的匹配测定的。可通过已知方法容易地计算“同一性”，包括但不限于在(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，编，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics andGenome Projects，Smith，D.W.，编，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in MolecularBiology，von Heine，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)中描述的方法。测定同一性的方法被设计为产生检测的序列之间的最大匹配。此外，测定同一性的方法在公开的计算机程序中编纂。测定2种序列之间的同一性的计算机程序方法包括但不限于，在GCG程序包中的GAP程序(Devereux，J.，等人，Nucleic Acids Research12(1)：387(1984))，BLASTP，BLASTN(Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.215：403-410(1990)，和FASTA(Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA85；2444-2448(1988)。BLAST家族程序在NCBI和其他来源中公开地获得(BLASTManual，Altschul，S.，等人，NCBI NLM NIH Bethesda，MD20894；Altschul，S.，等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。也可使用熟知的SmithWaterman算法测定同一性。

用于多肽序列比较的参数包括以下：

算法：Needleman和Wunsch，J.Mol Biol.48：443-453(1970)

比较矩阵：来自Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：10915-10919(1992)的BLOSSUM62

空位罚分：8空位长度罚分：2

使用这些参数的程序以来自Genetics Computer Group，Madison WI的“gap”程序公开获得。上述参数是用于肽比较的默认参数(以及对末端空位没有罚分)。

用于多核苷酸比较的参数包括以下参数：

算法：Needleman和Wunsch，J.Mol Biol.48：443-453(1970)

比较矩阵：匹配＝+10，错配＝0

空位罚分：50

空位长度罚分：3

以来自Genetics Computer Group，Madison WI的“gap”程序获得。

这些是用于核酸比较的默认参数。

用于多核苷酸和多肽(视情况而定)的“同一性”的优选含义可在下文的(1)和(2)中提供。(1)多核苷酸实施方案还包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含与SEQ ID NO：15的参考序列具有至少50，60，70，80，85，90，95，97或100％同一性的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可与SEQ ID NO：15的参考序列相同或可包括相比参考序列至多某整数个的核苷酸改变，其中所述改变选自至少一个核苷酸缺失、替换(包括转换或颠换)或插入，并且其中所述改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置上或在这些末端位置之间的任意位置上，单独地分散在参考序列的核苷酸之中或以一个或多个连续的组分散在参考序列中，并且其中如下测定所述核苷酸改变数，即将SEQ ID NO：15中的核苷酸总数乘以已经除以100的定义百分比同一性的整数，然后将乘积从SEQ ID NO：15中的所述核苷酸总数中扣除，或：

n_n≤x_n-(x_n·y)，

其中n_n是核苷酸改变数，x_n是SEQ ID NO：15中的核苷酸总数，对于50％y是0.5，对于60％是0.6，对于70％是0.7，对于80％是0.8，对于85％是0.85，对于90％是0.9，对于95％是0.95，对于97％是0.97或对于100％是1.0，·是乘号的符号，并且其中在从x_n扣除前，将x_n和y的任意非整数乘积向下取整为最近的整数。编码SEQ ID NO：1-14的多肽的多核苷酸序列的改变可产生在此编码序列中的无意、错义或移框突变，因此改变在这些改变后多核苷酸编码的多肽。

作为示例，本发明的多核苷酸序列可与SEQ ID NO：15的参考序列相同，即其可为100％同一，或其可包括相比参考序列至多某整数个的核酸改变，使得百分比同一性小于100％同一性。这样的改变选自至少一个核苷酸缺失、替换(包括转换或颠换)，或插入，并且其中所述改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置上或在这些末端位置之间的任意位置上，单独地分散在参考序列的核苷酸之中或以一个或多个连续的组分散在参考序列中。如下测定对于给定的百分比同一性的核酸改变数：将SEQ IDNO：15中的核苷酸总数乘以已经除以100的定义百分比同一性的整数，然后将乘积从SEQ ID NO：15中的所述核苷酸总数中扣除，或：

n_n≤x_n-(x_n·y)，

其中n_n是核苷酸改变数，x_n是SEQ ID NO：15中的核苷酸总数，例如，对于70％y是0.7，对于80％是0.8，对于85％是0.85，等，·是乘号的符号，并且其中在从x_n扣除前，将x_n和y的任意非整数乘积向下取整为最近的整数。

(2)多肽实施方案还包括分离的多肽，所述分离的多肽包含与SEQ IDNO：1-14的多肽参考序列具有至少50，60，70，80，85，90，95，97或100％同一性的多肽，其中所述多肽序列可与SEQ ID NO：1-14的参考序列相同或可包括相比参考序列至多某整数个的氨基酸改变，其中所述改变选自至少一个氨基酸缺失、替换(包括保守和非保守替换)或插入，并且其中所述改变可发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置上或在这些末端位置之间的任意位置上，单独地分散在参考序列的氨基酸之中或以一个或多个连续的组分散在参考序列中，并且其中如下测定所述氨基酸改变数，将SEQID NO：1-14中的氨基酸总数乘以已经除以100的定义百分比同一性的整数，然后将乘积分别从SEQ ID NO：1-14中的所述氨基酸总数中扣除，或：

n_a≤x_a-(x_a·y)，

其中n_a是氨基酸改变数，x_a是SEQ ID NO：1-14中的氨基酸总数，对于50％y是0.5，对于60％是0.6，对于70％是0.7，对于80％是0.8，对于85％是0.85，对于90％是0.9，对于95％是0.95，对于97％是0.97或对于100％是1.00，而·是乘号的符号，并且其中在从x_a扣除前，将x_a和y的任意非整数乘积向下取整为最近的整数。

作为示例，本发明的多肽序列可与SEQ ID NO：1-14的参考序列相同，即其可为100％同一，或其可包括相比参考序列至多某整数个的氨基酸改变，使得百分比同一性小于100％同一性。这样的改变选自至少一个氨基酸缺失、替换(包括保守和非保守替换)或插入，其中所述改变可发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置上或在这些末端位置之间的任意位置上，单独地分散在参考序列的氨基酸之中或以一个或多个连续的组分散在参考序列中。如下测定给定％同一性的氨基酸改变数，将SEQ ID NO：1-14中的氨基酸总数乘以已经除以100的定义百分比同一性的整数，然后将乘积从SEQ ID NO：1-14中的所述氨基酸总数中扣除，或：

n_a≤x_a-(x_a·y)，

其中n_a是氨基酸改变数，x_a是SEQ ID NO：1-14中的氨基酸总数，例如，对于70％y是0.7，对于80％是0.8，对于85％是0.85，等，·是乘号的符号，其中在从x_a扣除前，将x_a和y的任意非整数乘积向下取整为最近的整数。

当在本文中用于生物时，“个体”指多细胞真核生物，包括但不限于后生动物、哺乳动物、ovid、牛科动物、类人猿、灵长类和人。

“分离的”表示“通过人工”从其天然状态改变的，即如果其天然存在，其已从其原始环境被改变或去除，或二者。例如，依照本文使用的术语，在活生物中天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但从其天然状态的共存材料中分离的相同的多核苷酸或多肽是“分离的”。此外，通过转化、基因操纵或通过任意其他重组方法引入生物的多核苷酸或多肽是“分离的”，即使其仍然存在于所述生物中，所述生物可为活的或非活的。

“多核苷酸”一般指任意多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为包括单和双链区的未经修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。

“变体”指与参考多核苷酸或多肽不同、但保留了基本性能的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型变体与参考多核苷酸彼此核苷酸序列不同。在变体核苷酸序列中的改变可或可不改变由参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下文讨论的，核苷酸改变可导致由参考序列编码的多肽中的氨基酸替换、添加、缺失、融合和截短。多肽的典型变体与参考多肽彼此氨基酸序列不同。一般差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体上很相似，并且在许多区域是相同的。变体和参考多肽的氨基酸序列差异可为一种或多种替换、添加、缺失的任意组合。替换或插入的氨基酸残基可或可不由遗传密码编码。多核苷酸或多肽的变体可为天然存在的，例如等位基因变体，或其可为不已知天然存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在的变体可通过诱变技术或通过直接合成产生。

“疾病”指由细菌引起的或与细菌感染相关的疾病，包括例如在婴儿和儿童中的中耳炎，在老年人中的肺炎，窦炎，院内感染和侵袭性疾病，具有听力丧失、在中耳中的积液、听觉神经损伤、语言学习延迟，上呼吸道感染和中耳炎症的慢性中耳炎。

实验部分

除了另外详细描述的部分，使用本领域技术人员熟知和常规的标准技术进行下面的实施例。实施例是说明性的，而不是限制本发明。本研究描述了使用玻连蛋白作为诱饵发现的流感嗜血杆菌的名为蛋白F(pF)的新的玻连蛋白结合外膜蛋白的分离、纯化、表征、克隆和表达，和新的截短的重组蛋白F(pF)。

材料与方法

细菌、试剂和上皮细胞系

不可分型流感嗜血杆菌菌株NTHi3655是临床分离物，由R.Munson(Ohio State University，Colombus，Ohio)馈赠。通过具有上呼吸道感染的患者(County，Sweden)的鼻咽拭子得到临床NTHi分离物。在补充NAD和氯高铁血红素(Sigma，St.Louis，MO)的脑心浸液(BHI)肉汤中(DifcoLaboratories，Detroit，MI)或在已描述的巧克力血琼脂板上(Ronander等人，2009)过夜培养流感嗜血杆菌。

A549(CCL-185)，和H292上皮细胞系来自ATCC。在含10％FCS的RPMI1640中在37℃和5％CO₂下维持两种细胞系。

二维SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-SDS-PA GE)

如描述地纯化外膜囊泡(OMV)和外膜蛋白(Ronander等人，2008，Schaar等人，2010)。使用IPGphor IEF系统(Amersham Pharmacia Biotech)对OMV进行等电聚焦(IEF)(Ronander等人，2008)。为了凝胶校准，使用标准物(货号161-0320；Bio-Rad)。将2-D聚丙烯酰胺凝胶以120mA过夜电印迹至Immobilon-PVDF滤器(0.45mm；Millipore，Bedford，MA)。从凝胶上切出用考马斯蓝染色的2D-SDS-PAGE中的点并如描述送去通过MALDI-ToF法测序(Schaar等人，2010)。

SDS-PAGE和膜上蛋白质的检测(蛋白质印迹；免疫印迹)

使用10％Bis-Tris凝胶以150恒压运行SDS-PAGE，试剂和印迹仪器来自Novex(San Diego，CA)(Vidakovics等人，2010)。用考马斯亮蓝R-250(Bio-Rad，Sundbyberg，Sweden)染色凝胶。在电泳转移后，在含5％奶粉的具有0.05％吐温20的PBS(PBS-吐温)中封闭Immobilon-P膜。洗涤后，用在含2％奶粉的PBS-吐温中的人玻连蛋白(Sigma)(0.5μg/ml)在室温孵育膜。在一些实验中，在洗涤后加入1/1,000稀释的HRP缀合的小鼠抗人玻连蛋白。孵育后在Fluor-S Max中或用ECL蛋白质印迹检测试剂(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)进行显色。

DNA克隆和在大肠杆菌中的重组pF12-293的蛋白质表达

使用来自NTHi3655的染色体DNA作为模板分离pF编码序列。通过PCR将限制酶位点BamHI和HindIII引入编码pF12-293的DNA的侧翼区。为了融合由表达载体编码的6个组氨酸残基，突变pF12-293终止密码子。将得到的PCR产物连接进pET26(+)(Novagen，Darmstadt，Germany)中。将编码pF的质粒转化进表达宿主BL21(DE3)中。为了生产重组pF12-293，用异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导细菌3.5h。离心后，在冰上用1mg/ml溶菌酶孵育细菌沉淀，声波处理和离心。如制造商建议地在含有镍树脂的柱上(Novagen)在天然条件下纯化可溶性蛋白质。

抗体和酶联免疫吸附测定(ELISA)

为了生产特异性抗pF抗血清，根据标准程序使用完全和不完全弗氏佐剂用重组pF12-293肌肉内免疫兔3次(间隔2周)(Ronander等人2008)。使用与CnBr-Sepharose缀合的pF12-293通过亲和层析分离得到的多克隆抗体(pAb)。此外，使用与CnBr-Sepharose缀合的特异性pF44-68肽通过亲和层析分离抗pF44-68。辣根过氧化物酶(HRP)缀合的猪抗兔多克隆免疫球蛋白来自Dakopatts(Gentofte，Denmark)。使用重组的截短的卡他莫拉菌(非IgD结合)IgD结合蛋白(MID)962-1200作为阴性对照(

等人，2002)。

如描述地也用重组pF12-293免疫小鼠(Balb/c)(Ronander等人，2009)。通过ELISA分析特异性小鼠抗pF pAb。简单地说，在微滴定板中在4℃过夜包被50μg重组pF12-293。洗涤后，加入小鼠血清并在室温孵育。在30分钟和另外的洗涤后，加入HRP缀合的兔抗小鼠多克隆抗体并读取OD₅₄₀处的吸光度。

pF-缺陷的流感嗜血杆菌(NTHi3655Δpf)的制备

使用从NTHi3655分离的基因组DNA作为模板。扩增pf的5’和3’端并通过使用PCR通过重叠延伸与包含氯霉素乙酰转移酶(cat)基因的盒融合(Riesbeck等人，1999)。在其中一条侧翼引物中包括特异性摄取序列(AAGTGCGGT)。如描述地将得到的PCR产物转化进NTHi3655中(Poje等人，2003)，然后在含有氯霉素的板上筛选。

流式细胞术分析

在肉汤中培养过夜培养物细菌直至OD₆₀₀0.8。之后用含1％BSA的PBS洗2次NTHi菌株，然后根据标准方案[Samuelsson等人，2007]与纯化的兔抗pF抗血清孵育。洗涤后，用FITC缀合的山羊抗兔二抗pAb(Dakopatts)孵育细菌，然后通过流式细胞术分析(XL-MCL，Coulter，Hialeah，FL)。

上皮细胞、粘附测定和肽结合实验

在24孔板(Nunc)中培养上皮细胞系至汇合。在36℃在具有上述补充物的BHI中培养细菌并用[³H]-胸苷脉冲。4小时后用补充10％FCS，0.2％葡萄糖，0.02％明胶的RPMI(反应介质)洗1次细菌。去除上皮细胞的培养基，以不同的感染复数(MOI)加入一式三份的细菌(20μl)。之后，补充反应介质，然后以800rpm离心5分钟。在36℃，5％CO₂90分钟后，用PBS洗3次孔，然后加入胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Sigma)。合并一式三份的孔，用PBS洗涤，转移至闪烁管并在β-计数器中测量(Wallac)。

使用氯胺T法(Greenwood等人，1963)用[¹²⁵碘]-标记(0.05摩尔碘/摩尔蛋白质)标记覆盖整个pF序列的合成肽的系列。大多数肽含有酪氨酸残基，但在有些情况下在C-端添加了额外的酪氨酸残基。上皮细胞与经放射性标记的蛋白质在PBS，2％BSA中在37℃孵育45分钟。之后，在相同的缓冲液中洗细胞，然后在γ-闪烁计数器中测量。

结果

蛋白F(pF)是流感嗜血杆菌中新的玻连蛋白结合蛋白

为了确定不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)中的玻连蛋白结合蛋白，从NTHi3655中分离了外膜囊泡(OMV)。对从在存在或缺乏CO₂的条件下孵育的培养物中收获的OMV进行SDS-PAGE。平行运行了2块凝胶，一块印迹至尼龙滤器(图1A(i)，左图)，而另一块用考马斯蓝染色(图1B，左图)。孵育滤器与玻连蛋白，然后使用抗玻连蛋白pAb和HRP缀合的pAb二抗检测。在用CO₂孵育的细菌的OMV中得到最强的信号(图1A(i)，左图)，提示我们用相同的OMV制剂运行2D-SDS-PAGE。如可从图1A(i)中看到的(右图)，在存在CO₂下培养的细菌的OMV的2D-SDS-PAGE上得到玻连蛋白的清晰信号。为了确保检测抗体没有给出假阳性背景，在缺乏玻连蛋白时也用抗体检测了滤器(图1A(ii))。当在2D-SDS-PAGE中已经确定了玻连蛋白结合的点时(图1A(i)，右图)，在考马斯染色的2D-SDS-PAGE上确定了对应的点(图1B，右图)。将几个点送去测序，如箭头所示，较明显的点中的其中一个显示了对应HI0362的29kDa蛋白质(图1A(i)和B)。此新的玻连蛋白结合蛋白被命名为蛋白F(pF)，并被选中用于进一步的分析。

蛋白F的DNA序列和开放阅读框

将在NTHi3655中编码蛋白F的DNA测序并详细分析。完整的pF序列由293个氨基酸组成(图2A)并具有长22个氨基酸的信号肽(图2B)(Nielsen等人，1997)。信号肽后面是预测的黏性结构域和在C-末端的金属结合区。

为了比较与GeneBank中现有的其他pF序列的同源性，进行了聚类分析(图3)。在发现的15个不同的pF序列中，11个菌株具有100％保守的序列，其中也包括NTHi3655的公共序列。4个菌株与NTHi3655中的pF具有99％的同一性。因此，通过与其他公开的序列的比较判断pF极其保守。

蛋白F的克隆和在大肠杆菌中的表达

为了表达pF，使用NTHi3655基因组序列作为模板。扩增了编码缺乏信号肽(pF1-22)的远N-端疏水部分(11个氨基酸)的开放阅读框(ORF)的DNA并克隆进表达载体pET26中，然后转化。将得到的重组蛋白质命名为pF12-293。在诱导后，通过亲和层析纯化pF12-293。洗脱纯蛋白质并进行SDS-PAGE。在图4A中证明了得到的具有由6个组氨酸组成的C-端标签的重组pF(左边第2道)。最终产物迁移的大小对应约33kDa。

通过兔抗血清检测重组生产的蛋白F(pF12-293)且pF存在于所有分 析的临床分析物中

为了研究pF是否是免疫原性的以及是否在兔中诱导多克隆抗体应答，用重组pF12-293免疫动物。在总共6周的时间内免疫3次后，收集特异性抗pF抗血清。研究了在NTHi3655外膜中的pF的存在。外膜囊泡(OMV)从培养物上清中分离并对其进行SDS-PAGE。在凝胶上包括重组pF12-293和来自卡他莫拉菌的OMV(图4A)。如可从图4B中所看见的，兔抗血清既识别重组pF12-293又识别来自NTHi3655的OMV制剂中的天然pF，而在用作阴性对照的莫拉菌属(Moraxella)OMV中没有发现交叉反应性。此外，用pF免疫小鼠并且这些动物也产生了抗体应答，即在ELISA中检测到针对重组pF的特异性多克隆抗体(数据未显示)。

从疫苗的角度来说，所有临床NTHi分离物都在蛋白质水平上表达pF是很重要的。为了研究这一点，从鼻咽NTHi分离物的系列中分离外膜蛋白并进行SDS-PAGE，然后印迹(图5)。使用特异性抗pF抗血清进行蛋白质印迹。用抗血清容易地检测到蛋白F且在实验室使用的标准培养条件期间pF在所有临床分离物中组成型表达。蛋白质印迹证明，在所有分析的菌株中pF作为具有相同大小的(约29kDa)单条带迁移(图5B)。总之，pF是免疫原性的且在所有的临床NTHi分离物中可见。

嗜血杆菌蛋白F是表面暴露的外膜蛋白

为了揭示pF是否位于NTHi3655的表面，通过引入导致氯霉素抗性的编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)的基因盒制备了pf缺陷的突变体。通过PCR和重叠延伸将cat基因盒与pF的5’和3’-侧翼区融合。使用抗pF抗血清通过蛋白质印迹验证没有pF表达，所述抗pF抗血清是通过层析针对重组pF12-293纯化的(未显示)。通过流式细胞术进一步分析蛋白F表达(图6)。如可从图6B中所看见的，当用抗pF pAb分析时，相比仅由FITC缀合的检测二抗组成的背景对照，pF在NTHi3655上显著表达(图6A)。有趣的是，当pf基因被突变时，相比NTHi3655野生型(图6B)，表面暴露的pF明显消失(图6D)。在图6C中显示了pF缺陷的NTHi3655Δpf突变体的背景对照。这些实验因此证明pF位于流感嗜血杆菌的细菌细胞表面。

蛋白F是既结合玻连蛋白又结合层粘连蛋白的外膜蛋白

玻连蛋白是细胞外基质(ECM)的重要组分，并且其通过抑制主要由于补体蛋白(C)9的结合的膜攻击复合物(MAC)的形成和因此中和MAC在维持补体级联的内稳态中也起重要作用(Singh等人，2010b)。为了检测pF是否能够结合玻连蛋白，在微滴定板上涂敷重组pF12-293并在ELISA中检测其结合全长玻连蛋白。包括良好表征的UspA2(Singh等人，2010a)和pE(等人，2009)作为阳性对照和卡他莫拉菌MID962-1200作为非玻连蛋白结合的阴性对照(

等人，2002)。有趣地是，相比pE，pF略好地吸引玻连蛋白，而UspA2是强结合物(图7A)。相反地，MID962-1200在ELISA中不吸引玻连蛋白。

为了进一步研究pF依赖的玻连蛋白结合的作用，在直接结合测定中用[¹²⁵I]-玻连蛋白孵育缺乏pF的NTHi3655Δpf突变体。有趣地是，相比野生型，pF缺陷突变体NTHi3655Δpf显示了降低了40％的与玻连蛋白的结合(图7B)。

许多细菌种类使用ECM蛋白层粘连蛋白作为上皮细胞上的靶分子。为了测试重组蛋白F是否也结合层粘连蛋白，在微滴定板中涂敷重组pF12-293，然后加入层粘连蛋白并用抗层粘连蛋白pAb特异性检测。观察到剂量响应，且相比蛋白E，pF略好地结合层粘连蛋白(图8)。总之，嗜血杆菌pF既结合玻连蛋白又结合层粘连蛋白，因此是在NTHi致病机制中的重要毒力因子。

蛋白F附着于上皮细胞且活性结合结构域位于蛋白F的N-端部分内 (氨基酸pF23-48)

若干玻连蛋白结合蛋白也在附着于上皮细胞中起作用(Singh等人，2010b)，即这些通常多功能的外膜蛋白作为粘附素。为了测试pF是否可促进细菌与上皮细胞的结合，将重组pF12-293加入附着于塑料表面的上皮细胞中。当对细胞加入至多0.12μM的渐增浓度的pF12-293，然后使用抗pF兔抗血清和HRP缀合的检测二抗检测时，观察到剂量响应(图9)。

为了进一步证明pF作为粘附素的重要性，比较了pF缺陷突变体NTHi3655Δpf和表达pF的天然NTHi3655野生型。有趣地是，当使用50和100的感染复数(MOI)的上皮细胞分析时，pF突变体丢失了超过50％的其结合能力(图10)，进一步证明pF是重要的NTHi粘附素。因此，pF在NTHi附著于上皮细胞中起作用，可被视作细菌粘附素。

制备了一系列合成肽以分析负责附着于上皮细胞表面的pF的准确结合区(图11)。肽用碘标记并与2种不同的上皮细胞系孵育。如可在图12中所看见的，N-端肽(pE23-48)显著结合H292(图12A)和A549上皮细胞二者(图12B)。总之，主要的上皮结合位点位于分子的N-端部分内。

N-端pF44-68是表面暴露的并可通过特异性抗体检测

因为上皮细胞结合位点最可能位于pF的N-端部分内，分子的此部分将是表面暴露的。生物信息学分析显示pF23-48不是免疫原性的(未显示)。相反地，分析认为pF44-68将是免疫原性的。因此，将肽pF44-68与CnBr-Sepharose连接，然后使用pF12-293抗血清作为来源吸附特异性抗pF44-68pAb。NTHi3655野生型和pF缺陷的突变体都与得到的抗pF44-68兔pAb孵育。之后，加入FITC缀合的山羊抗兔检测抗体，然后进行流式细胞术分析。如可从图13B中所看见的，用抗pF44-68pAb容易地检测到表达pF的NTHi3655。相反地，用抗pF44-68pAb没有检测到pF缺陷的突变体NTHi3655Δpf突变体(图13D)。也显示了在缺乏抗pF44-68pAb的条件下孵育的细菌，并证明pAb二抗不结合(图13A和C)。总之，通过由针对序列pF44-68的抗体识别，在表面可发现pF的N-端部分。

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Claims (78)

1.疫苗组合物，其包含可在流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)中检测到的具有如SEQ ID NO：1中描述的氨基酸序列的蛋白质，或其片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：1的多肽的免疫应答。

2.疫苗组合物，其包含根据权利要求1的表面暴露的蛋白的免疫原性片段，所述片段可在流感嗜血杆菌中检测到。

3.疫苗组合物，其包含基于权利要求1的蛋白质的免疫原性蛋白质，其中SEQ ID No.1的第1-11或1-22位氨基酸中的一个或多个已被缺失或被一个或多个氨基酸替换。

4.疫苗组合物，其包含根据权利要求3的重组免疫原性蛋白质，其中SEQ ID No.1的第1-11或1-22位氨基酸中的一个或多个已被0-22个任选氨基酸的序列替换。

5.疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：2的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：2的氨基酸序列的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：2的多肽的免疫应答。

6.疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：3的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：3的氨基酸序列的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：3的多肽的免疫应答。

7.疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：4的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：4的氨基酸序列的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：4的多肽的免疫应答。

8.疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：5的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：5的氨基酸序列的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：5的多肽的免疫应答。

9.疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：6的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：6的氨基酸序列的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：6的多肽的免疫应答。

10.疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：7的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：7的氨基酸序列的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：7的多肽的免疫应答。

11.疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：8的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：8的氨基酸序列的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：8的多肽的免疫应答。

12.疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：9的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：9的氨基酸序列的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：9的多肽的免疫应答。

13.疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：10的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：10的氨基酸序列的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：10的多肽的免疫应答。

14.疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：11的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：11的氨基酸序列的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：11的多肽的免疫应答。

15.疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：12的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：12的氨基酸序列的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：12的多肽的免疫应答。

16.疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：13的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：13的氨基酸序列的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：13的多肽的免疫应答。

17.疫苗组合物，其包含具有根据序列ID NO：14的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有来自SEQ ID NO：14的氨基酸序列的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：14的多肽的免疫应答。

18.疫苗组合物，其包含根据权利要求1-17中任一项的蛋白质或片段的至少一种二聚体、三聚体或多聚体。

19.根据权利要求1-18的疫苗组合物，还包含一种或多种可药用的佐剂、运载体、赋形剂、黏合剂、载体、防腐剂、缓冲剂、乳化剂、湿润剂或促转染化合物。

20.根据权利要求1-19中任一项的疫苗组合物，其包含至少一种另外的疫苗。

21.根据权利要求1-20中任一项的疫苗组合物，其包含另一种分子的免疫原性部分。

22.根据权利要求21的疫苗组合物，其中另一种分子的免疫原性部分选自包含流感嗜血杆菌的蛋白D或E，卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的MID，卡他莫拉菌的UspA1或UspA2，和任意呼吸道病原体的外膜蛋白的组。

23.疫苗组合物，其包含编码根据权利要求1-17中任一项的蛋白质或片段的核酸序列，以及其同源物、多态性、简并物和剪接变体。

24.疫苗组合物，其包含重组核酸序列，所述重组核酸序列包含与至少另一个基因融合的根据权利要求23的核酸序列。

25.疫苗组合物，其包含质粒或噬菌体，所述质粒或噬菌体包含根据权利要求23或24的核酸序列。

26.疫苗组合物，其包含非人宿主，所述非人宿主包含根据权利要求25的至少一种质粒并能够生产根据权利要求1至17的蛋白质或片段，所述宿主选自细菌、酵母和植物。

27.疫苗组合物，其包含根据权利要求26的宿主，所述宿主是大肠杆菌(E.coli)。

28.疫苗组合物，其包含融合蛋白或多肽，其中通过使用根据权利要求24的重组核酸序列，将根据权利要求1至17的蛋白质或片段与至少另一种蛋白质组合。

29.疫苗组合物，其包含根据权利要求28的融合蛋白，所述融合蛋白是根据权利要求1至17的蛋白质或片段的二聚体、三聚体或多聚体。

30.疫苗组合物，其包含融合产物，其中根据权利要求1至17中任一项的蛋白质或片段或肽与蛋白质、碳水化合物或基质共价结合，或通过任意其他方式结合。

31.疫苗组合物，其包含分离的多肽，所述分离的多肽包含与SEQ IDNO：1的氨基酸序列在SEQ ID NO：1的全长上具有至少85％同一性的氨基酸序列。

32.疫苗组合物，其包含如在权利要求31中要求保护的分离的多肽，其中氨基酸序列与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少95％同一性。

33.如在权利要求31中要求保护的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

34.疫苗组合物，其包含SEQ ID NO：1的分离的多肽。

35.权利要求33或34的疫苗组合物，其中多肽缺乏SEQ ID NO：1的信号肽(氨基酸1-22)或信号肽的部分。

36.疫苗组合物，其包含免疫原性片段，所述免疫原性片段包含具有来自SEQ ID NO：1的氨基酸序列或来自权利要求18-21的多肽的至少15个连续的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要当与载体偶联时)能够引起识别SEQ ID NO：1的多肽(或权利要求33-35的多肽，分别地)的免疫应答，或能够结合玻连蛋白和层粘连蛋白。

37.疫苗组合物，其包含如权利要求31至36中任一项要求保护的多肽或免疫原性片段，其中所述多肽或所述免疫原性片段是较大的融合蛋白的部分。

38.疫苗组合物，其包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码如权利要求31至37中任一项要求保护的多肽或免疫原性片段。

39.疫苗组合物，其包含分离的多核苷酸，或与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列，所述分离的多核苷酸包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与SEQ ID NO：1的氨基酸序列在SEQ ID NO：1的全长上具有至少85％同一性的多肽。

40.疫苗组合物，其包含分离的多核苷酸，或与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列，所述分离的多核苷酸包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列与编码SEQ ID NO：1的多肽的核苷酸序列在整个编码区上具有至少85％同一性。

41.疫苗组合物，其包含分离的多核苷酸，或与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列，所述分离的多核苷酸包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：15的核苷酸序列在SEQ ID NO：15的全长上具有至少85％同一性。

42.如权利要求38-41中任一项要求保护的疫苗组合物，其中分离的多核苷酸与SEQ ID NO：15的同一性为至少95％。

43.疫苗组合物，其包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码SEQ ID NO：1的多肽，或权利要求36或37的免疫原性片段的核苷酸序列。

44.疫苗组合物，其包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含SEQ ID NO：15的多核苷酸。

45.疫苗组合物，其包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码SEQ ID NO：1的多肽的核苷酸序列，所述分离的多核苷酸可通过在严格杂交条件下使用具有SEQ ID NO：15的序列或其片段的经标记的探针筛选合适的文库得到。

46.疫苗组合物，其包含表达载体或重组的活微生物，所述表达载体或重组的活微生物包含根据权利要求38-45中任一项的分离的多核苷酸。

47.疫苗组合物，其包含重组的活微生物，所述重组的活微生物包含根据权利要求46的表达载体。

48.疫苗组合物，其包含宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求47的表达载体。

49.疫苗组合物，其包含根据权利要求48的宿主细胞的膜，所述宿主细胞表达分离的多肽，所述分离的多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。

50.生产权利要求31-37的疫苗组合物的方法，所述方法包括在足以生产所述多肽或所述免疫原性片段的条件下培养权利要求48的宿主细胞，和从培养基中回收多肽。

51.生产权利要求38-45中任一项的疫苗组合物的方法，所述方法包括用包含至少一种所述多核苷酸的表达载体转化宿主细胞，和在足以表达任一种所述多核苷酸的条件下培养所述宿主细胞。

52.疫苗组合物，其包含有效量的权利要求31至37中任一项的多肽或免疫原性片段和可药用的赋形剂。

53.疫苗组合物，其包含有效量的权利要求38至45中任一项的多核苷酸和可药用的赋形剂。

54.根据权利要求52或53中任一项的疫苗组合物，其中所述组合物包含至少一种其他的流感嗜血杆菌抗原。

55.权利要求1-45中任一项的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的肺炎球菌溶血素一起配制。

56.权利要求1-45中任一项的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自卡他莫拉菌的Omp106一起配制。

57.权利要求1-45中任一项的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自卡他莫拉菌的UspA1和/或UspA2一起配制。

58.权利要求1-45中任一项的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自卡他莫拉菌的Hly3一起配制。

59.权利要求1-45中任一项的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自卡他莫拉菌的OmpCD一起配制。

60.权利要求1-45中任一项的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自卡他莫拉菌的D15一起配制。

61.权利要求1-45中任一项的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自流感嗜血杆菌的Omp26一起配制。

62.权利要求1-45中任一项的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自流感嗜血杆菌的P6一起配制。

63.权利要求1-45中任一项的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自流感嗜血杆菌的蛋白D一起配制。

64.权利要求1-45中任一项的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自流感嗜血杆菌的NlpC2一起配制。

65.权利要求1-45中任一项的疫苗组合物，所述疫苗组合物和来自流感嗜血杆菌的Slp或PilA一起配制。

66.根据权利要求1-17中任一项的疫苗在制造用于预防或治疗感染的药物中的用途。

67.根据权利要求66的用途，其中所述感染由流感嗜血杆菌导致。

68.根据权利要求67的用途，其中所述流感嗜血杆菌是有荚膜的或不可分型的。

69.根据权利要求66-68中任一项的用途，用于预防或治疗在患有例如慢性阻塞性肺病(COPD)的儿童和成人中的中耳炎、窦炎或下呼吸道感染。

70.药物，其包含根据权利要求1-17中任一项的至少一种蛋白质、片段或肽和一种或多种可药用的佐剂、运载体、赋形剂、黏合剂、载体、防腐剂、缓冲剂、乳化剂、湿润剂或促转染化合物。

71.分离根据权利要求1-17中任一项的蛋白质、片段或肽的方法，所述方法包括以下步骤：

a)培养包含编码所述蛋白质、片段或肽的DNA的流感嗜血杆菌或大肠杆菌，收获细菌并分离外膜或内含体；

b)用强溶解剂溶解内含体；

c)加入复性剂；和

d)用pH从8至10的缓冲液透析得到的悬浮液。

72.根据权利要求71的方法，其中所述溶解剂是盐酸胍。

73.根据权利要求71或72的方法，其中所述复性剂是精氨酸。

74.制备疫苗的方法，所述方法包括权利要求71-73的步骤，其中蛋白质、片段或肽和赋形剂一起配制。

75.预防或治疗在个体中的感染的方法，所述方法包括施用药学有效量的根据权利要求1-45和52-65中任一项的疫苗组合物。

76.根据权利要求75的方法，其中所述感染由流感嗜血杆菌导致。

77.根据权利要求76的方法，其中所述流感嗜血杆菌是有荚膜的或不可分型的。

78.根据权利要求75-77中任一项的方法，用于预防或治疗在患有例如慢性阻塞性肺病(COPD)的儿童和成人中的中耳炎、窦炎或下呼吸道感染。

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