CN102883744A - 感染的治疗和预防 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及降低个体中疾病或病症的发病率或严重程度的方法,所述疾病或病症是与个体口腔组织中微生物病原体的存在相关的疾病或病症,并且包括抗微生物病原体的抗微生物剂和免疫原形成的组合物的使用。
Description
发明领域
本发明涉及个体中疾病或病症的治疗,所述疾病或病症与个体口腔组织中微生物病原体的存在相关,并且具体而言,但并非穷举,本发明涉及牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)相关疾病或病症的治疗或预防。
发明背景
口腔构成感染的主要部位之一。感染可能导致口腔组织的衰竭性疾病,并且已观察到口腔组织感染和其它解剖分区中的疾病或病症之间具有明显的相关性。
慢性牙周炎是口腔组织疾病的一个例子。这是一种牙支持组织炎性疾病,其导致牙槽骨吸收并最终导致牙齿脱落。该疾病是所有群体的主要公共健康问题,并且据估计高达15%的成年人群患病,其中5-6%为重症。
慢性牙周炎的出现和发展与龈下菌斑中特定的革兰氏阴性菌有关。龈下菌斑中存在的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)与该疾病是显著相关的。
据报道,治疗(洗牙和牙根平整术)后牙周炎患者龈下菌斑中依然存在牙龈卟啉单胞菌,这与进行性牙槽骨丧失显著相关。此外,已证实龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌细胞数量的增加与通过附着丧失、牙周袋深度和探针出血所检测的疾病严重程度相关。
已证实牙龈卟啉单胞菌的口腔感染在小鼠、大鼠和非人的灵长类动物中诱导牙周骨丧失。此外,牙周疾病和牙龈卟啉单胞菌感染与心血管疾病和某些癌症存在渐增的关联。
很多其它微生物病原体,包括其它细菌、真菌、病毒和原生动物,与口腔组织疾病相关,并且这些病原体中的一些还通过口腔组织感染引起其它解剖分区的疾病。前者的实例包括齿垢密螺旋体(T.denticola)和福赛斯坦纳菌(T.forsythia)。A族链球菌(Streptococcus)感染是风湿热和风湿性心脏病的发病原因。
一个问题是还不清楚,在粘膜组织慢性发炎或起因于手术或其它牙科干预的粘膜组织急性炎症的情况下,如何获得对特定微生物病原体的强保护性应答。
说明书中提及的任何现有技术不是且不应当被视为承认或以任何形式暗示,该现有技术形成澳大利亚公知常识或任何其它裁判权的一部分,或者该现有技术能够被合理地预期是本领域技术人员明确的、理解的或视为相关的。
发明概述
在某些实施方案中,提供了降低个体中疾病或病症的发病率或严重程度的方法,所述疾病或病症是与个体口腔组织中微生物病原体的存在相关的疾病或病症,所述方法包括:
-治疗个体,从而提供从所述个体的口腔组织去除几乎所有微生物或其碎片的状态;此后,
-为所述个体提供抗体,所述抗体用于保护所述个体免受微生物病原体侵袭,所述微生物病原体在口腔组织中的存在与疾病或病症相关;
从而降低个体中疾病或病症的发病率或严重程度。
在一实施方案中,通过给予所述个体免疫原在所述个体中提供抗体,所述免疫原用于保护所述个体免受微生物病原体侵袭。
在一实施方案中,提供了降低个体中牙龈卟啉单胞菌相关疾病或病症的发病率或严重程度的方法,所述方法包括:
-治疗个体,从而从所述个体的口腔组织去除几乎所有微生物或其碎片;此后,
-将诱导对牙龈卟啉单胞菌免疫应答的嵌合或融合蛋白给予个体,所述蛋白包含第一肽和第二肽,所述第一肽与第二肽直接连接或通过接头连接,其中:
(A)所述第一肽包含:
(i)与SEQ ID No:1所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(ii)与SEQ ID No:2所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部;以及
(B)所述第二肽包含:
(i)与牙龈卟啉单胞菌Lys-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(ii)与牙龈卟啉单胞菌Arg-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(iii)与牙龈卟啉单胞菌HagA粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。
从而降低个体中疾病或病症的发病率或严重程度。
在其它实施方案中,提供了组合物或试剂盒,其包含:
-用于从所述个体的口腔组织去除几乎所有微生物或其碎片的抗微生物剂;
-用于针对微生物病原体而免疫所述个体的免疫原,所述微生物病原体在口腔组织中的存在与疾病或病症相关;
上文所述的方法中使用所述组合物或试剂盒。
在某些实施方案中,提供了降低个体中疾病或病症的发病率或严重程度的方法,所述疾病或病症是与个体口腔组织中微生物病原体的存在相关的疾病或病症,所述方法包括:
-对个体的口腔组织进行手术操作;此后,
-治疗个体,从而提供从所述个体的口腔组织去除几乎所有微生物或其碎片的状态;此后,
-为所述个体提供抗体,所述抗体用于保护所述个体免受微生物病原体侵袭,口腔组织中所述微生物病原体的存在与疾病或病症相关;
从而降低个体中疾病或病症的发病率或严重程度。
在一实施方案中,手术操作是牙科操作。牙科操作的实例包括牙周清理术,洗牙和/或牙根平整术。
在一实施方案中,本发明提供了用于降低个体中疾病或病症的发病率或严重程度的组合物,所述疾病或病症是与个体口腔组织中微生物病原体的存在相关的疾病或病症,所述组合物包含本文所述的抗微生物剂和本文所述的免疫原。
另一方面,本发明提供了本发明的组合物在制备用于降低个体中疾病或病症的发病率或严重程度的药物中的用途,所述疾病或病症是与个体口腔组织中微生物病原体的存在相关的疾病或病症。疾病的非限制性实例包括牙菌斑、牙龈炎、牙周炎、慢性牙周炎、龋齿、骨丧失、牙槽骨丧失和冠状动脉疾病。
在另一实施方案中,本发明提供了用于治疗或预防牙周病(和/或本文确认的适于治疗的其它病症)的由本文所述的抗微生物剂和本文所述的免疫原的活性成分组成的组合物。
在另一实施方案中,本发明提供了用于降低个体中疾病或病症的发病率或严重程度的包含本文所述的抗微生物剂和本文所述的免疫原的组合物,所述疾病或病症是与个体口腔组织中微生物病原体的存在相关的疾病或病症。
在另一实施方案中,本发明提供了本文所述的用作药物的组合物。
在另一实施方案中,本发明提供了包含有效量的本发明组合物作为主要成分的药物组合物。
在一实施方案中,提供了对个体的口腔病原体形成抗体应答或形成Th2应答的方法,其包括以下步骤:
-提供欲对口腔病原体形成抗体应答或Th2应答的个体;
-评价所述个体以确定所述个体的口腔组织是否发炎;
-在评价表明所述个体的口腔组织没有发炎的情况下,用口腔病原体免疫个体,从而在所述个体中形成对口腔病原体的抗体应答或Th2应答。
在一实施方案中,用于在口腔组织发炎的个体中形成对口腔病原体的抗体应答或形成对口腔病原体的Th2应答的免疫方案中提供了以下步骤,在形成对口腔病原体的抗体应答或Th2应答的个体免疫之前,将抗炎剂给予个体,从而使得口腔组织的炎症最小化或从口腔组织去除炎症。
在另一实施方案中,提供了在用口腔病原体免疫时,使口腔组织发炎的个体形成对所述病原体的抗体应答或形成对所述病原体的Th2应答的方法,所述方法包括以下步骤,在用病原体免疫个体用于形成对口腔病原体的抗体应答或形成对口腔病原体的Th2应答之前,将抗炎剂给予个体,从而使得口腔组织的炎症最小化或从口腔组织去除炎症。
在另一实施方案中,提供了在口腔组织发炎的个体中形成对口腔病原体的抗体应答或形成对口腔病原体的Th2应答的方法,包括以下步骤:
-提供口腔组织发炎的个体;
-对所述个体实施治疗,从而从口腔组织去除炎症;此后,
-用口腔病原体免疫个体,从而在个体中形成对病原体的抗体应答或者形成对病原体的Th2应答。
在上述实施方案中,在口腔组织没有发炎或炎症临床症状不显或无临床症状时,提供免疫。
通常,免疫所形成的免疫应答主要是Th2应答,尽管其可能含有可检测的Th1应答成分。
通常,相关的炎症是慢性牙周炎,尤其是与牙龈卟啉单胞菌感染有关的牙周炎。
如果牙周炎与牙龈卟啉单胞菌感染相关,通常,用于免疫的免疫原是牙龈卟啉单胞菌细胞、碎片、代谢物或从其衍生的重组产物,例如本文所述的嵌合肽(尤其是KAS1-KsA1、KAS2-KLA1)。
通常,本文限定的抗炎剂或抗微生物剂包括抗炎化合物、抗生素和抗生物膜剂中的一种或多种,或由抗炎化合物、抗生素和抗生物膜剂中的一种或多种组成,这些的实例将在本文进行更详细的描述。
除了上下文指定并非如此,本文所用的术语“包含(comprise)”以及该术语的变型诸如“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised)”并非意图排除其它添加剂、组分、整数或步骤。
附图说明
图1显示了重组Kgp蛋白的SDS-PAGE凝胶考马斯亮蓝染色。泳道1=KAS2-KLA1、泳道2=KLA1、泳道3=KsA1、泳道4=KAS1-KsA1。分子量标记表示为kDa。
图2显示了KAS2肽和福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌W50细胞的抗体识别。(A)在ELISA中,用针对福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌W50细胞产生的抗血清(FK-W50)、重组蛋白KAS1-KsA1、KAS2-KLA1和合成的KAS2-DT缀合物以及PBS探测KAS2肽。(B)在ELISA中,用针对福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌W50细胞产生的抗血清(FK-W50)、重组蛋白KAS1-KsA1、KAS2-KLA1、KLA1和PBS探测福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌W50细胞。将抗体应答表示为减去背景水平的两倍而获得的ELISA滴度OD415,每个滴度代表3个值的平均值±标准差。
图3显示了牙龈卟啉单胞菌诱导的、用重组蛋白和重组嵌合蛋白、福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌和单独的佐剂(PBS,IFA)免疫的小鼠或未经口感染的(未激发的)小鼠的上颌骨臼齿的水平骨丧失。在本图中,将KAS2-KLA1表示为AS2-LA1、KLA1表示为LA1、KAS1-KsA1表示为AS1-sA1、KsA1表示为sA1。骨丧失的检测结果是从左上颌骨和右上颌骨的每个上颌骨臼齿的颊侧的牙骨质釉质界(CEJ)至牙槽嵴(ABC)以平方毫米(mm2)为单位测量的面积的平均值。通过Levene方差齐性检验数据为正态分布并表示为平均值(n=12)、单位为mm2,并用单因素方差分析和Dunnett T3检验进行分析。*表明该组的骨丧失显著少于对照组(感染的)(P<0.001),表明该组的骨丧失显著多于AS2-LA1组(P<0.001)。
图4显示了牙周炎模型中被免疫的小鼠的血清抗体亚类应答。在ELISA中使用来自用重组蛋白KsA1、KLA1、KAS1-KsA1和KAS2-KLA1及福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌菌株W50免疫的小鼠的血清(A为口腔接种之前、B为口腔接种之后),用福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌菌株W50作为吸附抗原。将抗体应答IgG(黑色柱)、IgG1(灰色柱)、IgG2a(白色柱)、IgG2b(横条纹柱)、IgG3(斜条纹柱)表示为减去背景水平而获得的ELISA滴度(log 2),每个滴度代表3个值的平均值±标准差。
图5显示了对于代表KAS2肽序列433-468的重叠(overlapping)肽的肽特异性抗体反应性的PEPSCAN分析。(A)用KAS1-KsA1(白色柱)抗血清、KAS2-KLA1(黑色柱)抗血清探测的KAS2重叠肽(步移为1,重叠为7)。(B)用KAS2-DT缀合物抗血清探测的KAS2重叠肽(步移,重叠为7)。每个柱显示抗体反应性(在415nm处的光密度[OD])。
图6.嵌合体AS2-LA1在远交系小鼠中诱导识别牙龈卟啉单胞菌全细胞和RgpA-Kgp复合物的抗体应答。用嵌合体AS2-LA1(50mg/小鼠)免疫CD1远交系小鼠,并将收集的血清用在ELISA中,用AS2-LA1(A)、福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌菌株W50(B)和RgpA-Kgp复合物(C)作为吸附抗原。在本图中,将KAS2-KLA1表示为AS2-LA1。测定对于每种抗原的每种免疫球蛋白同型的滴度,并将数据表示为减去背景水平的两倍而获得的ELISA滴度(‘000),每个滴度代表3个值的平均值±标准差。
图7.Kgp蛋白酶的蛋白模型。KAS2[Asn433-Lys468](A)、KAS4[Asp388-Val395](B)、KAS5[Asn510-Asp516](C)和KAS6[Ile570-Tyr580](D)。
发明详述
下面将详细提及本发明的一些实施方案。尽管本发明将结合实施方案进行描述,但是应当理解,本发明并非将本发明限制于那些实施方案。相反,本发明意图覆盖所有可选方案、修改和等同项,这些可以包括在如权利要求所限定的本发明的范围内。
本领域技术人员应当认识到,与本文所述方法相似或等同的很多方法和材料都可以用于实施本发明。本发明并没有以任何方式受限于所述的方法和材料。
应当理解,本说明书中所公开和定义的发明适用于所提及的或从全文或附图中显而易见的两个或更多个单独特征的所有可选的组合。所有这些不同的组合构成本发明各个可选方面。
除了上下文指定并非如此,本文所用的术语“包含(comprise)”以及该术语的变型诸如“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised)”并非意图排除其它添加剂、组分、整数或步骤。
发明人已经发现,可以在组织中提供免疫力过继转移之前或在组织中激发免疫应答的同时,通过从口腔组织去除几乎所有的炎性刺激物来获得提高对感染的应答,尤其是提高抗体应答。当它提供用于口腔组织疾病的预防和/或治疗的情况下,甚至用于由微生物病原体的口腔组织感染而在其它解剖分区出现的疾病的预防和/或治疗的情况下,该发现尤其有用。
因此,在某些实施方案中,提供了降低个体中疾病或病症的发病率或严重程度的方法,所述疾病或病症是与个体口腔组织中微生物病原体的存在相关的疾病或病症,所述方法包括:
-治疗个体,从而提供从所述个体的口腔组织去除几乎所有微生物和其碎片的状态;此后,
-为所述个体提供抗体,所述抗体用于保护所述个体免受微生物病原体侵袭,口腔组织中所述微生物病原体的存在与疾病或病症相关;
从而降低个体中疾病或病症的发病率或严重程度。
在一实施方案中,通过给予所述个体免疫原在所述个体中提供抗体,所述免疫原用于保护所述个体免于微生物病原体侵袭。
在一实施方案中,以协同有效量提供用于治疗个体的抗微生物组合物和免疫原,从而提供从所述个体的口腔组织去除几乎所有微生物或其片段的状态。
通常,本文提及的个体是动物,尤其是哺乳动物。在一实施方案中,哺乳动物是人。在某些实施方案中,哺乳动物可以是驯养动物或养殖动物。驯养动物或养殖动物的实例包括马、山羊、猪以及诸如牛和绵羊的家畜。在某些实施方案中,动物是诸如狗、猫、兔或豚鼠的伴生动物。
1.定义
短语‘从口腔组织去除几乎所有微生物和其碎片’通常是指提供这样的状态,在该状态中,以足以从组织清除炎性刺激物的量清除微生物或其碎片或代谢物,进而基本上减弱或最小化所述组织中炎症的一种或多种症状。如果相关个体患有由慢性感染造成的慢性组织炎症,情况尤其如此。通常,焦点在于最小化组织炎症。因此,应当理解,在相关处理步骤之后仍然保留一些微生物或其碎片或代谢物。
在其它实施方案中,如果个体没有发炎的组织,则短语‘从口腔组织去除几乎所有微生物和其碎片’是指提供这样的状态,其将微生物或其碎片和代谢物的累积基本上阻止在会引起炎症的量内。如果用于治疗的个体是正常的或在其它方面对于疾病或病症是无临床症状的,情况尤其如此。同样应用于手术或牙科干预已去除微生物且其目标是确保提供这样的状态,在该状态中,将微生物的累积基本上阻止在会引起炎症的量内。在这些实施方案中,当焦点是阻止可能引起炎症的微生物的量的累积时,应当理解,一些微生物或其碎片和由其产生的代谢物在相关处理步骤之后仍可能累积。
短语‘降低疾病或病症的发病率’通常是指使个体发展至完全活性形式的疾病或病症的可能性最小化,所述个体可以是正常的或无临床症状的个体,或具有早期形式的疾病或病症的个体。在某些实施方案中,所述短语是指预防特定个体发展至完全活性形式的疾病或病症。
短语‘降低疾病或病症的严重程度’通常是指使疾病或病症的一种或多种症状或表现最小化。在某些实施方案中,所述短语是指治疗患有疾病或病症的个体。
‘免疫原’通常是指能够激发或引发对抗原的免疫应答,优选体液或抗体应答,例如Th2应答的分子。免疫原的实例包括肽和相关的蛋白。
短语‘协同有效量’通常是指提供的治疗或预防或保护效应大于组合物或免疫原单独使用时每种可达到的效应的抗微生物组合物和免疫原的量。在一实施方案中,抗微生物组合物和免疫原的协同有效量加强了所述组合物和免疫原之间的新的作用关系,进而所述免疫原的保护或治疗效应远大于向发炎组织单独施加免疫原时可以达到的效应。通常,微生物组合物和免疫原的协同有效量提供了比单独使用免疫原可以实现的对微生物病原体更高的滴度和/或更高亲和力的抗体应答。
短语‘治疗有效量’通常是指能够(i)治疗特定疾病、病症或失调,(ii)减弱、减轻或消除特定疾病、病症或病症的一种或多种症状,或(iii)延迟本文所述的特定疾病、病症或失调的一种或多种症状发作的本发明化合物的量。
词语‘治疗(treat)’或‘治疗(treatment)’是指治疗性处理,其目的是减慢(减轻)不希望的生理学变化或失调。为了本发明的目的,有益的或期望的临床结果包括但不限于,无论可检测地或不可检测地,缓解症状、减轻疾病的程度、稳定(即不恶化)疾病的状态、延迟或减慢疾病进程、改善或缓和疾病状态以及暂时康复(不管是部分还是全部)。‘治疗(treatment)’还可以表示,与没有接受治疗的预期存活相比,延长存活。治疗可以并不必然导致感染的完全清除,但是可以降低或最小化感染的并发症和副作用以及感染进程。可以通过个体的体检、细胞生理学、血清学DNA或mRNA检测技术来监测治疗是否成功。
词语‘预防(prevent)’和‘预防(prevention)’通常是指用于保护或阻止患有特定感染相关并发症的个体免于发展成该并发症的预防(prophylactic)或阻止(preventative)措施。需要预防的个体包括具有感染的个体。
短语‘药学上可接受的’表示物质或组合物必须在化学和/或毒理学上与制剂包含的其它组分和/或随之进行治疗的哺乳动物相容。
术语‘药品说明书’用来指治疗产品的商业包装中常规包含的说明书,其含有与适应症、使用、剂量、给予、有关这类治疗产品使用的禁忌和/或警告的信息。,
Th1应答通常是指涉及细胞因子如γ干扰素和TNF的应答。
Th2应答通常是指涉及细胞因子如白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-10、白介素-13等的应答。
2.治疗方法
本发明的方法广泛适用于个体,包括对于所述疾病或病症无临床症状的个体。这些个体的口腔或其它组织中没有疾病症状。具体而言,这些个体可以未出现粘膜或其它口腔组织的炎症。在一实施方案中,在随机选择的一群个体的情况下,这些个体的口腔中可以具有正常的相对多的微生物病原体。
在其它实施方案中,个体显示出口腔组织或其它解剖分区的疾病或病症的亚临床或临床症状。
所述疾病或病症的症状可以显示在所述个体的口腔组织中。可以出现急性炎症的标志包括血浆和白细胞从血液进入受损组织的移动增加。还可以出现牙龈急性感染的临床征象,包括发红(红)、灼热(热度增加)、肿胀(膨胀)、痛(dolor)(疼痛)和机能丧失(功能丧失)。慢性炎症可以由白细胞细胞(单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞)浸润表征。可以观察到组织和骨丧失。炎症的实例包括,唇炎、牙龈炎、舌炎和口炎。
在一实施方案中,个体可以具有发炎的粘膜组织或其它口腔组织。例如,个体可以出现口腔组织的急性炎症。这些个体的实例包括已经进行了牙科手术或口腔手术的个体,包括牙周清理术、洗牙和牙根平整术.
在其它实施方案中,个体可以出现口腔组织的慢性炎症。在一个实例中,个体可以出现牙龈炎,牙槽骨吸收和基于牙齿与牙槽骨的胶原蛋白连接的进行性丧失的最终的牙齿脱落。粘膜组织或相关口腔组织的其它损伤是可能的。
在一实施方案中,疾病或病症是口腔组织的疾病或病症。慢性牙周炎是特别重要的一个实例。其它包括以正如猩红热、口疮性口炎、脓性肉芽肿、白喉、结核病、梅毒、放射菌病、念珠菌病、疱疹性口炎中的口腔粘膜的损伤表征的疾病或病症。
应当理解,疾病或病症可以是除口腔组织之外的组织的疾病或病症,诸如器官或系统,例如心血管系统。在一实施方案中,疾病或病症是心血管疾病。
本发明适用于一系列的微生物病原体,尤其是感染口腔组织的微生物病原体。在一实施方案中,病原体选自细菌、病毒和真菌。
特别优选的细菌选自:牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythia)。
病原体的其它实例如以下表A所示。
表A
在一实施方案中,将形成抗微生物剂的组合物给予个体,从而从所述个体的口腔组织去除几乎所有的微生物或其碎片。实例在下文进一步论述。
在一实施方案中,通过机械牙周清理术和/或应用一种或多种本文限定的抗微生物剂治疗感染部位之后的一至二周,进行例如通过给予个体免疫原来为个体提供抗体。
可以通过检测或测量来自微生物的蛋白或其片段来确定微生物、其碎片或代谢物的水平和存在。
在另一实施方案中,可以通过从个体采集样品并测定样品中特定蛋白的存在或特定蛋白的表达水平,来确定口腔组织中微生物、其碎片或代谢物的水平和存在。可以通过任何测定法来检测蛋白的存在或水平。实例包括免疫测定法、色谱法和质谱法。特别优选的免疫测定的一个实例是FACS。
可以用于检测样品中目标蛋白的存在的各种测定法包括:
酶联免疫吸附测定法(ELISA):该方法涉及将样品(例如,含有目标蛋白、其肽或片段的唾液或口腔组织)固定于表面,例如微量滴定板的孔。施加与酶偶联的目标蛋白特异性抗体,并允许与目标蛋白、其肽或片段结合。然后,通过利用与抗体偶联的酶的比色反应来检测抗体的存在并对其进行定量。该方法中常用的酶包括辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。如果校准良好且处于反应的线性范围内,则样品中存在的目标蛋白、其肽或片段的量与所产生的颜色的量是成比例的。目标蛋白、其肽或片段标准品常用于提高定量精度。
Western印迹:该方法涉及借助丙烯酰胺凝胶,随后通过将蛋白、其肽或片段转移至膜(例如,尼龙膜或PVDF),而从其它蛋白分离目标蛋白、其肽或片段。然后,通过对目标蛋白、其肽或片段特异的抗体检测目标蛋白、其肽或片段的存在,该抗体依次通过抗体结合试剂来检测。抗体结合试剂可以是例如蛋白A或其它抗体。抗体结合试剂如上文所述可以是放射性同位素标记的或酶连接的。检测可以通过放射自显影、比色反应或化学发光法。该方法允许对目标蛋白、其肽或片段的量进行定量,并允许通过在膜上的相对位置来确定其身份,所述相对位置指示电泳期间在丙烯酰胺凝胶中的迁移距离。
放射性免疫测定法(RIA):在一个版本中,该方法涉及用特异性抗体和固定在可沉淀载体(诸如琼脂糖珠)上的放射性标记的抗体结合蛋白(例如,用I125标记的蛋白A)沉淀需要的目标蛋白、其肽或片段。沉淀颗粒计数的数量与目标蛋白、其肽或片段的量是成比例的。
在可选版本的RIA中,利用标记的目标蛋白、其肽或片段和非标记的抗体结合蛋白。将含有未知量的目标蛋白、其肽或片段的样品以不同的量进行添加。标记的目标蛋白、其肽或片段的沉淀计数的降低与添加的样品中的目标蛋白、其肽或片段的量是成比例的。
荧光激活细胞分选术(FACS):该方法涉及通过目标蛋白、其肽或片段特异性抗体在细胞中原位检测目标蛋白、其肽或片段。目标蛋白、其肽或片段特异性抗体与荧光团相连。借助细胞分选仪器进行检测,当细胞通过光束时,所述仪器能读取每个细胞发出光的波长。该方法可以同时利用两种或更多种抗体。
免疫组化分析:该方法涉及通过目标蛋白、其肽或片段特异性抗体在固定细胞中原位检测目标蛋白、其肽或片段。目标蛋白、其肽或片段特异性抗体可以是酶连接的或与荧光团连接的。通过显微镜和主观评价或自动评价进行检测。如果使用酶连接的抗体,则可能需要比色反应。应当理解,免疫组化后通常利用例如苏木精或姬姆萨染色进行细胞核的复染。
原位活性测定法:按照该方法,将显色底物施加到含有活性酶的细胞上,所述酶催化这样的反应,在反应中,底物被分解产生通过光学或荧光显微镜可见的显色产物。
体外活性测定法:在这些方法中,在从细胞提取的蛋白混合物中测量特定酶的活性。可以利用比色法在分光光度计孔中测量活性或者可以在非变性丙烯酰胺凝胶(即,活性凝胶)中测量活性。电泳后,将凝胶浸泡在含有底物和比色试剂的溶液中。得到的染色条带对应于目标蛋白的酶活性。如果校准良好且处于反应的线性范围内,则样品中存在的酶的量与所产生的颜色的量是成比例的。酶标准品常用于提高定量精度。
此外,可以通过定量PCR测定细菌DNA的量,作为口腔组织中微生物的存在或水平的指示物。
可以测定来自牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体、福赛斯坦纳菌的蛋白或DNA的存在或水平,并且表明几乎所有微生物或其碎片都已从个体的口腔组织去除。
抗微生物剂和/或免疫原可以全身给予,或直接给予口腔组织,尤其是直接给予口腔粘膜。
在一实施方案中,对个体的治疗从所述个体的口腔组织去除几乎所有的微生物或其碎片,进而使得个体口腔组织的炎症最小化。在另一实施方案中,对个体的治疗从所述个体的口腔组织去除几乎所有的微生物或其碎片,进而使得个体口腔组织的免疫应答最小化。
可以在对所述个体进行治疗以从所述个体的口腔组织去除几乎所有的微生物或其碎片之后,将免疫原给予所述个体。
通常,按照本发明,相关的口腔组织未发炎,或者即便存在炎症,在免疫时,也是无临床症状的或临床症状不显的。
免疫后,个体表现出主要是Th2应答(其大部分是体液应答),并且个体具有可检测水平的保护性抗体。
3.组合物
在某些实施方案中,提供了组合物,其包含:
-用于从所述个体的口腔组织去除几乎所有微生物或其碎片的抗微生物剂;
-用于针对微生物病原体而使所述个体免疫的免疫原,口腔组织中所述微生物病原体的存在与疾病或病症相关;
所述组合物能够在上述方法中使用。
3.(a)抗微生物剂
抗微生物剂可以是在给予时其效果是清除炎性刺激物的任何试剂。单独或联合使用这些试剂在炎症、牙周病原体再现(例如生物膜形成)和/或牙周骨吸收的短期抑制上具有功效。例如,可以在在已进行手术干预的牙周部位以缓释的牙周凝胶配方局部地单独或联合施加这些试剂,以使患者的免疫系统准备好针对牙周病原体进行接种。
不受任何理论或作用方式的束缚,认为本文限定的抗微生物剂例如以牙周凝胶配方在机械牙周清理术和清洁感染牙周部位时的应用,能够帮助免疫系统准备,以允许产生偏向Th-2的应答。这种偏向Th-2的应答导致保护性抗体的产生和牙周病原体再现的预防和疾病进程的预防。
在该背景下,以下可以是抗微生物剂:抗生素、免疫抑制剂和杀菌剂。在某些实施方案中,试剂可以是抗炎剂。抗炎剂包括非固醇类抗炎药(NSAID)。NSAID的实例包括能抑制环氧合酶的化合物。NSAID的具体实例包括阿司匹林、布洛芬和萘普生。抗炎剂的其它实例包括PAR-2的拮抗物,所述PAR-2的拮抗物包括但不限于能与PAR-2结合的抗体和抗体片段、能与PAR-2结合并抑制其活性的其它多肽、能抑制PAR-2活性或表达的其它化合物(包括小分子有机化合物和能与PAR-2编码核酸相互作用的抑制性核酸)。可以阻断或替代内源性配体结合PAR-2和/或通过PAR-2信号转导的示例性拮抗物包括WO 2004/002418和WO2006/023844(例如具有氨基酸序列LIGK或LIGKV的肽)中所描述的那些拮抗物。能与PAR-2结合并充当系锁配体(tethered ligand)阻止PAR-2区的蛋白水解裂解的拮抗物如WO 2007/092640中列举。
抑制、降低或阻断PAR-2表达的拮抗物包括抑制性核酸,包括但不限于,核酶、三螺旋形成寡核苷酸(TFO)、促进RNase P酶切的外部引导序列(EGS)、肽核酸、反义DNA、siRNA和对编码PAR-2的核酸特异的微小RNA。
可以通过能够拮抗蛋白酶活性的“间接拮抗物”来间接抑制PAR-2,所述蛋白酶在正常环境下能够酶切PAR-2导致其活化。能够酶切PAR-2的蛋白酶包括牙龈蛋白酶、胰蛋白酶、类胰蛋白酶和中性粒细胞蛋白酶-3。可用于本发明方法中或可用于本发明组合物中的间接拮抗物的实例包括WO 93/14779中公开的胰蛋白酶抑制剂和WO 02/47762中公开的类胰蛋白酶抑制剂。
在一特别优选的实施方案中,抗微生物剂是抗生素。实例包括选自以下的抗生素:大环内酯类、四环素、青霉素、延胡索酸还原酶抑制剂和抗微生物肽,如以下的表B所示。
表B
在一实施方案中,抗微生物剂选自一种或多种延胡索酸还原酶抑制剂。合适的抑制剂包括天然产物,包括但不限于,前胡素、verticipyrone、paecilaminol、来自链霉菌(Streptomyces spp.)的5-烯基-3,3(2H)-呋喃酮、nafuredin、甲基富马酸、鱼藤酮及其天然的、半合成的和合成的类似物。另一方面,抑制剂可以是合成的化合物,包括但不限于,2-取代的4,6-二硝基酚;巯基吡啶N-氧化物;L-092,201(Merck Sharpe and Dohme);硝基咪唑,诸如fexindazole megazol苄硝唑、MK-436、L-634,549、米索硝唑;或苯并咪唑,如阿苯达唑、坎苯达唑、甲苯哒唑、奥芬达唑、帕苯达唑和噻苯咪唑;或奥克太尔或莫仑太尔。优选的抑制剂是奥克太尔、莫仑太尔或噻苯咪唑。特别优选的抑制剂是奥克太尔。
本领域技术人员应当认识到,抑制剂的选择将取决于决定抑制剂是否适用于临床情况的临床因素的数量。
抗生素对微生物病原体可以具有直接的细胞毒性。在其它实施方案中,抗生素具有间接的细胞毒性,例如,抗生素可以是微生物生物膜产生或一些其它代谢作用的抑制剂。
在一实施方案中,抗生素是抗微生物肽。实例显示在以下的表C中。
表C
在一特别优选的实施方案中,抗微生物剂是微生物生物膜产生的抑制剂。其它优选的试剂是延胡索酸还原酶抑制剂。
在某些实施方案中,抗微生物剂可以是抗体。抗体可以是多克隆或单克隆抗体。可以使用的示例性单克隆抗体是针对抑制炎症的牙周病原体(例如蛋白酶和粘附素)或宿主的分子[例如,单独或联合抗肿瘤坏死因子(TNFa)、白介素-1(IL-1)、尿激酶型纤溶酶原激活(u-PA)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落剌激因子(M-CSF)和RANK配体(RANKL)的抗体]。优选地,抗体是针对不同病原体抗原和宿主炎症介质的单克隆抗体混合物。用于靶向牙龈卟啉单胞菌的优选的单克隆抗体是针对Kgp和RgpA蛋白酶的活性位点的单克隆抗体和针对Kgp和RgpA蛋白酶的A1粘附素的结合基序的单克隆抗体。
在一实施方案中,抗微生物剂是抗体模拟物。抗体模拟物可以具有或不具有免疫球蛋白结构域的四级结构(例如Dimitrov,2009,MAbs 126-28)。抗体模拟物可以对与特定分子的结合具有特异性。抗体模拟物的一个实例是人类脂质运载蛋白相关的分子家族,称为抗运载蛋白(例如,Skerra,2007 Current Opinions in Biotechnology,18 295-304)。优选地,抗运载蛋白针对来自牙龈卟啉单胞菌的蛋白或与来自牙龈卟啉单胞菌的蛋白特异性结合。在优选的实施方案中,抗运载蛋白针对Lys-X-蛋白酶或Arg-X-蛋白酶如Kgp和RgpA蛋白酶的活性位点,或与Lys-X-蛋白酶或Arg-X-蛋白酶如Kgp和RgpA蛋白酶的活性位点特异性结合。抗运载蛋白可用于代替单克隆抗体,但是更小大约8倍,大小为约180个氨基酸,质量为约20kDa。抗运载蛋白比抗体具有更好的组织穿透力,且在高达70℃的温度下是稳定的。与抗体不同,它们可以在细菌细胞如大肠杆菌中大量产生。
在某些实施方案中,抗微生物剂还可以是能够抑制、降低或防止细菌生物膜形成或发展的抗生物膜剂。抗生物膜剂可以具有生物膜破坏活性,并且可以引起生物膜分散。“生物膜破坏活性”在本文用于描述能够引起细菌从生物膜释放的组合物或试剂的性质。组合物或试剂还可以但并不必然能够降低生物膜的细菌的活力。细菌从生物膜的“释放”包括增加来自生物膜的细菌的数量以呈现游离状态,从而增加来自生物膜的细菌对杀菌剂的敏感性。杀菌剂在本文用于描述能够直接降低细菌活力的组合物、试剂、化合物、拟肽或肽的性质。
因此,不受任何理论或作用方式的束缚,认为表现出生物膜破坏活性的组合物或试剂并不必然能够降低生物膜中的细菌的活力,反而能够引起或诱导细菌细胞从生物膜的释放。在某些实施方案中,这些组合物或试剂可以引起或诱导生物膜中的很多细菌细胞呈现游离状态。在其它实施方案中,组合物或试剂可以抑制或降低生物膜的形成。在某些实施方案中,组合物或试剂可以抑制或降低生物膜生长。在其它实施方案中,本发明的抗微生物剂可以抑制或降低生物膜表现出的能够启动或促进个体的疾病或病症的任何特性。在某些实施方案中,肽或组合物可以抑制或降低生物膜表现出的能够启动或促进个体的疾病或病症的任何特性,无需杀死生物膜中的细菌。
在某些实施方案中,抗微生物组合物或试剂是指防止、抑制或降低生物膜的可检测参数的能力。生物膜的可检测参数的非限制性实例可以是总生物量、平均厚度、表面积与生物体积比、生物膜的粗糙系数或细菌组成以及它们的活力。
3.(b)免疫原
选择免疫原以激发免疫应答,优选对关注的微生物病原体的保护性抗体应答。
在一实施方案中,以肽例如重组肽的形式提供免疫原。
在特别是涉及牙龈卟啉单胞菌感染和相关疾病和病症的一个实施方案中,重组肽可以是诱导对牙龈卟啉单胞菌免疫应答的嵌合或融合蛋白,所述蛋白包含第一肽和第二肽,所述第一肽与第二肽直接连接或通过接头连接,其中:
(A)所述第一肽包含:
(i)与SEQ ID No:1所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(ii)与SEQ ID No:2所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部;以及
(B)所述第二肽包含:
(i)与牙龈卟啉单胞菌Lys-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(ii)与牙龈卟啉单胞菌Arg-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(iii)与牙龈卟啉单胞菌HagA粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。
如本文所用的术语“肽”是指最多约40个氨基酸残基、优选为5-40个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一个实施方案中,多肽用于指代“第二肽”或换句话说用于代替“第二肽”。术语“多肽”是指至少约40个氨基酸残基的氨基酸序列。
因此,另一方面,提供了诱导对牙龈卟啉单胞菌免疫应答的嵌合或融合蛋白,所述蛋白包含肽和多肽,所述肽与所述多肽直接连接或通过接头连接,其中:
(A)所述肽包含:
(i)与SEQ ID No:1所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(ii)与SEQ ID No:2所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部;以及
(B)所述多肽包含:
(i)与牙龈卟啉单胞菌Lys-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(ii)与牙龈卟啉单胞菌Arg-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(iii)与牙龈卟啉单胞菌HagA粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。
另一方面,本发明提供了诱导对牙龈卟啉单胞菌免疫应答的肽,所述肽选自:
(i)与SEQ ID No:64-66中的一个所示的序列相同或同源的序列;和
(ii)与SEQ ID No:67或68所示的序列相同或同源的序列。
在本发明的一方面,当肽具有SEQ ID No:64-68的序列时,可以以嵌合或融合蛋白的形式提供所述肽,其中所述肽与第二肽直接连接或通过接头连接。在一个实施方案中,所述嵌合或融合蛋白的第二肽包含:
(i)与牙龈卟啉单胞菌Lys-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(ii)与牙龈卟啉单胞菌Arg-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(iii)与牙龈卟啉单胞菌HagA粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。
在上述实施方案中,多肽用于指代第二肽或换句话说用于代替第二肽。因此,另一方面,提供了诱导对牙龈卟啉单胞菌免疫应答的嵌合或融合蛋白,所述蛋白包含肽和多肽,所述肽与所述多肽直接连接或通过接头连接,其中:
(A)所述肽包含:
(i)与SEQ ID No:64-66中的一个所示的序列相同或同源的序列;或
(ii)与SEQ ID No:67或68所示的序列相同或同源的序列;以及
(B)所述多肽包含:
(i)与牙龈卟啉单胞菌Lys-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(ii)与牙龈卟啉单胞菌Arg-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(iii)与牙龈卟啉单胞菌HagA粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。
如本文所用的,当涉及肽或多肽的“同源物”时,是指肽或多肽所具有的氨基酸序列与先前提及的肽或多肽的氨基酸序列共有同源性或是同源的或具有同一性,通过BLAST算法进行比较时,与首先提及的肽或多肽的氨基酸序列具有优选至少90%的序列同一性,更优选至少95%,并更优选至少98%的序列同一性,其中选择该算法的参数以在各自参考序列的全长上各自的序列之间产生最大的匹配。序列同一性是指两条被比较序列的氨基酸之间的精确匹配。这类同源物可以来自天然存在的变体或牙龈卟啉单胞菌Lys-X-蛋白酶或Arg-X-蛋白酶的分离物。可选择地,它可以是来自牙龈卟啉单胞菌Lys-X-蛋白酶或Arg-X-蛋白酶的肽或多肽的“保守型取代”变体,其中改变了一个或多个氨基酸残基而没有改变所述肽或多肽的总体构象和功能;所述保守型取代包括但不限于用具有相似性质的氨基酸对氨基酸进行取代。具有相似性质的氨基酸在本领域内是公知的。例如,可互换的极性/亲水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸;可互换的非极性/疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸;可互换的酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸,以及可互换的碱性氨基酸包括组氨酸、赖氨酸和精氨酸。这类保守型取代变体优选有少于20个,更优选少于15个,更优选少于10个,以及最优选少于5个氨基酸改变。
通过本说明书的以下教导,尤其结合图7和实施例9,可以确定界定用于酶解肽键的酶位点的牙龈卟啉单胞菌胰酶样酶的区,尤其是Lys-X-蛋白酶(Kgp)或Arg-X-蛋白酶(RgpA)的区,其中图7和实施例9举例说明了预测Lys-X-蛋白酶在牙龈卟啉单胞菌上出现的催化位点三维构象的过程。实施例10提供了Arg-X-蛋白酶三维构象的建模方法。
在某些实施方案中,嵌合或融合蛋白或其第一肽或第二肽组分由拟肽形成。拟肽是模拟特定肽的一个或多个诸如构象特征的分子,并且所述拟肽由氨基酸残基组成,其中一些氨基酸残基并非是天然存在的。
在鉴定出催化位点的免疫原区之后,本发明人测定了可以引起体液应答的各种肽免疫原的序列。具体而言,已经将催化位点侧翼的或以其他方式界定催化位点的“六个”区定义如下:KAS1/RAS1、KAS2/RAS2、KAS3/RAS3、KAS4/RAS4、KAS5/RAS5和KAS6(参见表1)。通过该信息,本发明人能查询蛋白序列数据库,从而确定与形成催化位点侧翼的区的氨基酸序列共有同源性并因此代表牙龈卟啉单胞菌中存在的免疫原性表位的肽。通过下述结构式鉴定这些肽的序列:
表1Kgp和RgpA活性位点侧翼的序列
本发明人已经发现包含这些肽的嵌合蛋白具有多种功效。例如,如本文所述,一些嵌合蛋白产生体液应答,如在慢性牙周炎中所观察到的,其对于治疗或预防骨丧失是具有高度保护性的。所述肽也可以用在诊断分析中,其中所述肽能检测或监测个体血清中的特异性,从而指示所述个体是否被感染,如果被感染了,是否需要治疗或如果已提供治疗,治疗是否有效。
应当理解,界定了酶切位于Lys或Arg的C末端的肽键的酶位点的牙龈卟啉单胞菌胰酶样酶的区不包含Lys-X-蛋白酶或Arg-X-蛋白酶的完整序列。
本文所用的术语“异源蛋白”或“嵌合或融合蛋白”是指由功能单元、结构域、氨基酸的序列或区所组成的蛋白,所述功能单元、结构域、氨基酸的序列或区可以来自不同来源,或来自相同来源并进行组装,从而所具有的结构不同于所述单元、结构域、序列或区所来自的分子或相关的分子中所观察到的结构。本发明嵌合或融合蛋白的共有特征是:它们含有至少一个这样的肽,所述肽具有与界定了酶切肽键的催化位点的牙龈卟啉单胞菌胰酶样酶的序列相同或共有同源性的氨基酸序列。
在优选的实施方案中,当第一肽包含来自Kgp[432-468]区的肽时,其优选为(i)包含选自VSFANYT和VGFANYT的序列,更优选地包含选自GVSFANYT、GVGFANYT、VSFANYTA和VGFANYTA的序列的肽;或(ii)包含选自ETAWAD、ETSWAD、TAWADP和TSWADP的序列,优选地包含选自SETAWAD、SETSWAD、ETAWADP、ETSWADP、TAWADPL和TSWADPL的序列,更优选地包含选自GSETAWAD、GSETSWAD、SETAWADP、SETSWADP、ETAWADPL、ETSWADPL、TAWADPLL和TSWADPLL的序列的肽。更优选地,该肽选自表1所示的KAS1[432-454]肽、KAS2[433-468]肽和KAS3[436-455]肽。可选择地,所述第一肽可以是PAS1K[432-453]肽,也被称为PAS1(K48),其在国际专利申请第PCT/AU98/00311(WO 98/049192)号中公开。这些肽所对应的序列标识符显示在表3中。
同样,在另一个优选的实施方案中,当第一肽包含来自RgpA[426-462]区的肽时,该肽优选选自表1所示的RAS1[426-448]肽、RAS2[427-462]肽和RAS3[430-449]肽。可选择地,所述第一肽可以是PAS1R[426-446]肽,也被称为PAS1(R45),其在国际专利申请第PCT/AU98/00311(WO98/049192)号中公开。
在本发明的嵌合或融合蛋白中,所述第二肽可以是来自诸如Lys-X-蛋白酶(Kgp)或Arg-X-蛋白酶(RgpA)或HagA的牙龈卟啉单胞菌胰酶样酶的粘附素结构域的肽(参见表2)。这些结构域有时也被称为血凝素。在Lys-X-蛋白酶中,优选的结构域是如表2鉴定出的KA1、KA2、KA3、KA4、KA5。在Arg-X-蛋白酶中,优选的结构域是如表2鉴定出的RA1、RA2、RA3和RA4。在HagA中,优选的结构域是HagA1、HagA1*和HagA1**。
表2Kgp和RgpA蛋白酶的粘附素结构域
当将诸如KAS1、KAS2、KAS3、KAS4、KAS5和KAS6或RAS1、RAS2和RAS3、RAS4和RAS5的本发明的肽包括在嵌合或融合蛋白中时,可以增强对所述本发明的肽的体液应答,除此之外,所述粘附素结构域还含有免疫原性表位,因此导致多特异性的产生,从而引起保护性免疫原性应答。以下发现是未预计到的:当本发明的嵌合或融合蛋白具有粘附素结构域的免疫原性表位时,所述免疫原性表位保留的形式与其在牙龈卟啉单胞菌胰酶样酶中的形式接近。
应当理解,在本发明的这些实施方案中,嵌合或融合蛋白可以含有选自KAS1/RAS1、KAS2/RAS2、KAS3/RAS3、KAS4/RAS4、KAS5/RAS5和KAS6/RAS6的肽中的任意一个或多个,以及任意一个或多个牙龈卟啉单胞菌胰酶样酶的粘附素结构域,尤其是Lys-X-蛋白酶粘附素结构域(KA1、KA2、KA3、KA4和KA5)或Arg-X-蛋白酶粘附素结构域(RA1、RA2、RA3和RA4)或HagA结构域HagA1、HagA1*和HagA1**中的任意一个或多个。
还应当理解,所述粘附素结构域未必是如牙龈卟啉单胞菌胰酶样酶中所观察到的完整结构域。例如,所述粘附素结构域可以是此类结构域的片段,尤其优选的片段是Lys-X-蛋白酶A1结构域的KsA1和KLA1结构域片段(参见表2)。当所述结构域是粘附素结构域片段时,其通常含有一个或多个粘附素结构域特异性表位。
粘附素相关肽所对应的序列标识符显示在表3中。
在一个实施方案中,所述第二肽或多肽包含SEQ ID No:69-79中的一个或多个或SEQ ID No:83-85中的一个或多个所示的序列。
本发明的嵌合或融合蛋白还可以包含一个或多个选自Lys-X-蛋白酶的Kgp[432-468]区的其他的肽和/或一个或多个选自Arg-X-蛋白酶的RgpA[426-462]区的其他的肽。
在本发明的优选实施方案中,嵌合或融合蛋白包含KAS1、KAS2、KAS3、KAS4、KAS5和KAS6中的一种或多种或RAS1、RAS2、RAS3、RAS4和RAS5中的一种或多种,以及KsA1或KLA1。
因此,在某些实施方案中,嵌合或融合蛋白可以包含至少一种其他的肽,其中所述其他的肽包含:
(i)与SEQ ID No:1所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(ii)与SEQ ID No:2所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(iii)与牙龈卟啉单胞菌Lys-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(iv)与牙龈卟啉单胞菌Arg-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(v)与牙龈卟啉单胞菌HagA粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。
本文所述的嵌合或融合蛋白中可以包含的结构域、单元、序列或区域的其他实例包括用于与受体或配体结合的结构域,例如Fc结合区或Fc受体;用于改善半寿期的结构域,例如白蛋白;或用于促进嵌合或融合蛋白的表达或纯化的结构域。
在另一方面中,本发明提供了用于诱导对牙龈卟啉单胞菌免疫应答的肽,包括SEQ ID No:17、18、25和26之一所示的序列。在一实施方案中,肽具有与SEQ ID No:17、18、25和26之一同源的序列。肽可以具有5至40个氨基酸的长度。
在另一方面中,本发明提供了编码具有SEQ ID No:17、18、25和26之一所示序列的肽的核酸。
在另一方面中,本发明提供了具有SEQ ID No:17、18、25和26之一所示序列的肽或编码具有SEQ ID No:17、18、25和26之一所示序列的肽的核酸用于制备诱导对牙龈卟啉单胞菌免疫应答的嵌合或融合蛋白的用途。
在另一方面中,本发明提供了具有SEQ ID No:17、18、25和26之一所示序列的肽或编码具有SEQ ID No:17、18、25和26之一所示序列的肽的核酸用于诱导对牙龈卟啉单胞菌免疫应答的用途。在一实施方案中,肽与第二肽同时给予或相继给予,所述第二肽包含:
(i)与牙龈卟啉单胞菌Lys-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(ii)与牙龈卟啉单胞菌Arg-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(iii)与牙龈卟啉单胞菌HagA粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。
表3
在本发明的嵌合或融合蛋白中,第一肽的C末端残基可以与粘附素结构域多肽的N末端残基共价连接,或第一肽的N末端残基可以与粘附素结构域多肽的C末端残基共价连接。在该排列中,所述第一肽和粘附素结构域多肽被认为是“直接连接”或“紧邻”。
在其它实施方案中,嵌合或融合蛋白包含用于连接第一肽和粘附素结构域多肽的接头。所述接头可以是能将肽与多肽连接的任意接头,包括氨基酸和非氨基酸接头。优选地,所述接头是非免疫原性的。合适的接头的长度可以多至15个氨基酸,但是优选少于5个氨基酸。所述接头可以起使第一肽和粘附素结构域多肽的空间排列比在牙龈卟啉单胞菌胰酶样酶中正常观察到的更接近的作用。可选择地,所述接头可以将第一肽与粘附素结构域多肽间隔开。
可以通过重组表达系统(如重组DNA技术)或通过化学合成(如固相肽合成)产生本发明的嵌合或融合蛋白。这些技术在本领域内是公知的。
异源或嵌合蛋白特别有优势,因为与单独使用嵌合或融合蛋白的第一或第二肽组分所获得的体液应答相比,它增强了所获得的体液应答。
本发明人已经发现包含这些肽的嵌合蛋白具有多种功效。例如,如本文所述,一些嵌合蛋白产生体液应答,正如慢性牙周炎中所观察到的,其对于治疗或预防骨丧失具有高度保护性。所述肽也可以用在诊断分析中,其中所述肽能检测或监测个体血清中的特异性,从而指示所述个体是否被感染,如果被感染了,是否需要治疗,或者如果已提供治疗,治疗是否有效。
在一个实施方案中,所述嵌合或融合蛋白诱导保护性免疫应答,通常为至少最小化或限制另外与牙龈卟啉单胞菌感染有关的结缔组织损伤的应答。在一个实施方案中,所述保护性应答至少最小化或限制牙龈卟啉单胞菌诱导的骨丧失。本文讨论了用于测定牙龈卟啉单胞菌感染介导的骨丧失的模型系统。通常,所述保护性免疫应答主要为体液应答。在某些实施方案中,所述保护性免疫应答还包括细胞应答。
本发明还提供了包含上文概括描述的嵌合或融合蛋白的组合物。所述组合物通常是抗原性的或免疫原性的。更具体而言,本发明提供了适于引起针对牙龈卟啉单胞菌感染的保护性或治疗性免疫应答的组合物,所述组合物包含所述嵌合或融合蛋白并任选地与佐剂结合。这类组合物还可以包含用于调节或增强免疫应答的另一组分。在一个实施方案中,所述组合物采用疫苗的形式。
优选的组合物包含对牙周病原体牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体和福赛斯坦纳菌产生免疫应答的免疫原。如果组合物含有抗三种牙周病原体中的一种或多种的抗原,免疫原可以是减毒的全细胞疫苗或纯化的抗原疫苗或更优选地为重组抗原疫苗。能够形成与牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体和福赛斯坦纳菌感染相关的免疫原的合适的肽的其它实例如表D至F所示。
表D
表E
1.登录号和定义来自TIGR (现在是JCVI,www.tiqr.org)。定义来自TIGR自动的基因组注释。
表F
a登录号和蛋白描述来自Oralgen网站(www.oralgen.lanl.gov),带有连字符的登录号为数据库中两个邻近的基因对应于蛋白质组学和同源数据所指明的一个蛋白。
各种佐剂已知可以与疫苗组合物联合使用。所述佐剂协助调节免疫应答,并且有助于使用比单独给予疫苗抗原更少量的疫苗抗原或更少的剂量来获得更持久和更高的免疫力水平。佐剂的实例包括弗氏不完全佐剂(IFA)、佐剂65(含有花生油、二缩甘露醇一油酸和单硬脂酸铝)、油乳化剂、Ribi佐剂、复合多元醇、多胺、阿夫立定(Avridine)、Quil A、皂苷、MPL、QS-21、诸如铝盐和钙盐的矿物质凝胶、诸如羟磷灰石、磷酸钙、铝盐、糖低聚物的纳米颗粒、以及诸如甘露聚糖、壳聚糖的聚合物。其他实例包括水包油乳化剂,如SAF-1、SAF-0、MF59、Seppic ISA720以及其他的颗粒佐剂,如ISCOMsTM和ISCOM基质TM。佐剂的其他实例的广泛但非穷举的列于Cox and Coulter 1992[In:Wong WK(ed.)Animalsparasite control utilizing technology(动物寄生虫控制实用技术).BoccaRaton;CRC press,1992;49-112]。除了佐剂之外,疫苗组合物可以视情况包含常规的药学可接受的载体、赋形剂、填料、缓冲液或稀释剂。可以将一个或多个剂量的含有佐剂的疫苗组合物预防性地给予以预防牙周炎,或治疗性地给予以治疗已存在的牙周炎。在一个实施方案中,可以选择所用的佐剂以促进产生偏向Th-2的应答。一个实例是Alum。
在优选的组合物中,嵌合或融合蛋白与粘膜佐剂相组合,并且通过口腔、颊黏膜或鼻腔途径进行给药。粘膜佐剂的实例是纳米颗粒、霍乱毒素和热不稳定的大肠杆菌毒素、这些毒素的非毒性B亚基、这些毒素的已减小毒性的遗传突变体。可以用于口腔/颊黏膜/鼻腔递送抗原性蛋白的其他方法包括将蛋白通过微囊化作用合并或吸附于可生物降解的聚合物(如丙烯酸酯或聚酯)颗粒或纳米颗粒(如羟磷灰石),从而有助于从胃肠道或其他粘膜表面摄取微球并保护蛋白免于降解。脂质体、ISCOMsTM、水凝胶是其他潜在方法的实例,通过并入用于将抗原性蛋白递送至粘膜免疫系统的诸如LTB、CTB或凝集素的靶分子可以进一步增强这些方法。除了抗原性蛋白和粘膜佐剂或递送系统之外,所述疫苗组合物可以视情况包含常规的药学可接受的载体、赋形剂、填料、包衣、分散介质、抗细菌剂或抗真菌剂和缓冲液或稀释剂。
已知许多方法可以用于将疫苗组合物给予个体,所述方法包括但不限于皮内给药、肌肉内给药、腹膜内给药、静脉内给药、皮下给药、鼻内给药、舌下给药、颊粘膜给药和口服给药。这些给药途径尤其适用于疫苗接种。
另一方面,本发明提供了包含编码上文概括描述的嵌合或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子,所述核苷酸序列任选地与至少一种调节元件可操作地连接。在一个实施方案中,以分离的或基本上纯化的形式提供所述核酸。
例如,可以将所述核酸分子插入合适的表达载体中,通过将所述表达载体插入原核或真核宿主细胞,可以产生作为重组蛋白的嵌合蛋白。重组蛋白的成功表达需要表达载体含有转录和翻译所必需的调节元件,所述调节元件与表达所使用的具体宿主细胞系统相容并可以被所述宿主细胞系统识别。各种宿主细胞系统可以用来表达重组蛋白,包括但不限于,用噬菌体载体、质粒载体或粘粒DNA转化的细菌;含有酵母载体的酵母;含有真菌载体的真菌;用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系;以及用质粒或病毒表达载体转染的或用重组病毒(例如牛痘病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等)感染的哺乳动物细胞系。
使用分子生物学领域内已知的方法,可以将各种启动子和增强子合并入表达载体,从而增加重组蛋白的表达,只要增加的氨基酸序列表达与所使用的具体宿主细胞系统相容(例如对所述宿主细胞系统没有毒性)。
启动子的选择取决于所使用的表达系统。启动子在强度,即促进转录的能力上可以不同。通常,为了获得编码核苷酸序列的高水平转录和重组蛋白的高水平表达,使用强启动子是理想的。例如,本领域内已知的通过其可以在包括大肠杆菌在内的宿主细胞系统中观察到高水平转录的细菌、噬菌体或质粒启动子包括lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、PR与PL启动子、lacUV5、ompF、bla、lpp等可以用于提供插入的编码氨基酸序列的核苷酸序列的转录。
用于高效转录或翻译的其他控制元件包括增强子和调节信号。增强子序列是以相对不依赖于它们相对于邻近编码核苷酸序列的位置或方向的方式表现出增加转录效率的DNA元件。因此,根据所使用的宿主细胞表达载体系统,可以将增强子置于插入的编码序列的上游或下游来增加转录效率。诸如转录或翻译起始信号的其他调节位点可以用来调节编码序列的表达。
在另一个实施方案中,载体可以是病毒疫苗载体或细菌疫苗载体,且用来提供重组病毒疫苗、重组细菌疫苗、重组减毒细菌疫苗或灭活重组病毒疫苗。牛痘病毒是本领域内最熟知的感染性病毒的实例,对其进行改造以表达源于其他生物体的疫苗抗原。将重组的活牛痘病毒用来免疫宿主,所述重组活牛痘病毒被减毒过或以另外处理过以使其自身不会导致疾病。重组病毒在宿主内接着复制提供了疫苗抗原对免疫系统的连续刺激,由此提供长效免疫。
其他活疫苗载体包括:腺病毒、巨细胞病毒,并优选诸如牛痘[Paolettiand Panicali,美国专利第4,603,112号]的痘病毒和减毒沙门氏菌(Salmonella)菌株[Stocker et al,美国专利第5,210,035号、第4,837,151号和第4,735,801号和Curtiss et al,1988,Vaccine 6:155-160]。活疫苗特别具有优势,因为它们持续刺激免疫系统,这能赋予基本上长效的免疫力。当免疫应答针对后续牙龈卟啉单胞菌感染具有保护作用时,活疫苗自身可以用于针对牙龈卟啉单胞菌的预防性疫苗中。特别是,活疫苗可以基于口腔的共生物细菌。可以用携带重组嵌合蛋白的载体转化该细菌,然后将其用来在口腔尤其是口腔粘膜中定殖。一旦在口腔粘膜中定殖,所述重组蛋白的表达将刺激粘膜相关淋巴组织产生中和抗体。为了进一步说明本实施方案,利用本领域内公知的分子生物学技术,可以将编码本发明嵌合蛋白的核苷酸序列插入牛痘病毒基因组DNA,所插入的位点允许表位表达但不会对牛痘病毒载体的生长或复制产生不利影响。所得到的重组病毒可以用作疫苗制剂中的免疫原。同样的方法可以用来构建灭活重组病毒疫苗制剂,区别仅在于,所述重组病毒在用作免疫原之前例如通过本领域内已知的化学方法进行灭活且基本上不影响所表达的免疫原的免疫原性。为了增强对疫苗抗原的免疫应答,可以将灭活重组疫苗与合适的佐剂一起配制。
本发明还提供了将包含编码本发明嵌合或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子直接作为疫苗制剂的用途。可以将可操作地连接于一个或多个调节元件的编码嵌合蛋白的核苷酸序列直接导入以对个体进行针对牙龈卟啉单胞菌病原菌株的疫苗接种(“直接的基因转移”)。将基因直接转移进接种的个体会导致遗传物质表达于被接种个体诸如血管内皮细胞的细胞以及主要器官组织中,这已经通过本领域内的技术得到证实,诸如通过静脉内注射表达质粒:阳离子脂质体复合物[Zhu et al,1993,Science261:209-211]。将载体DNA递送进靶细胞的其他有效的方法在本领域内是已知的。在一个实例中,将含有病毒基因的纯化的重组质粒DNA用于接种疫苗(肠胃外免疫、粘膜免疫或通过基因枪进行免疫),以诱导保护性免疫应答[Fynan et al.1993,Proc Natl Acad Sci USA 90:11478-11482]。在另一个实例中,可以通过本领域内已知的标准方案对从个体移除的细胞进行转染或电穿孔,这导致将重组载体DNA导入靶细胞内。然后,可以用本领域内已知的方法,如利用载体中表达的选择标记物来选择含有重组载体DNA的细胞,然后,可以将选择的细胞再引入个体,以表达重组蛋白。
在其它实施方案中,提供了包含上述的抗微生物剂和免疫原的药物组合物。所述组合物还可以包含稀释液、赋形剂或载体或用于治疗口腔感染相关病症或疾病的化疗剂,并且可以使其适于口腔给药。可将本发明的组合物例如通过搅拌进温热的胶基或包被胶基的外表面合并在锭剂或口香糖或其他产品中,所述胶基的实例为节路顿胶(jelutong)、橡胶乳胶、乙烯基树脂等,理想情况伴有常规的增塑剂或软化剂、糖或其他甜味剂或诸如葡萄糖、山梨醇等。
可以以适于口腔的各种形式制备和使用含有上述药物组合物的本发明的口腔组合物,例如包括牙膏、牙粉和液体洁牙剂的洁牙剂、漱口剂、锭剂、口香糖、牙科用糊剂、齿龈按摩乳膏、漱口片剂、乳制品和其他食品。根据具体口腔组合物的类型和形式,本发明的口腔组合物还可以包含其他公知的成分。
在本发明的某些优选形式中,所述口腔组合物可以基本适合为液体,诸如漱口剂或清洗剂。在这类制剂中,介质通常是水-醇混合物,理想情况包含下述的湿润剂。通常,水与醇的重量比为约1:1至约20:1。在该类制剂中,水-醇混合物的总量以重量计通常为所述制剂的约70%-约99.9%。所述醇通常是乙醇或异丙醇。优选乙醇。
本发明的这类液体和其他制剂的pH一般为约5至约9,且通常为约5.0-7.0。可以用酸(例如柠檬酸或苯甲酸)或碱(例如氢氧化钠)或缓冲剂(如用柠檬酸钠、安息香酸钠、碳酸钠或碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等)控制pH。
在本发明的其他理想形式中,所述药物组合物可以基本适合为固体或糊状,例如牙粉、牙科用片剂或牙膏(牙科用乳膏)或凝胶洁牙剂。这类固体或糊状口腔制剂的介质通常含有牙科上可接受的抛光材料。
在牙膏中,液体介质可包含水和湿润剂,它们的量以重量计通常为所述制剂的约10%-约80%。甘油、丙二醇、山梨醇和聚丙二醇是合适的湿润剂/载体的实例。水、甘油和山梨醇的液体混合物也是有利的。在透明凝胶中,因为折射指数是重要的考虑因素,所以优选采用约2.5-30%w/w的水、0-约70%w/w的甘油和约20-80%w/w的山梨醇。
牙膏、乳膏和凝胶通常含有天然的或合成的增稠剂或胶凝剂,其比例为约0.1%-约10%w/w,优选为约0.5%-约5%w/w。合适的增稠剂是合成的锂蒙脱石,例如Laporte Industries Limited销售的名为Laponite(例如CP、SP 2002、D)的合成胶体镁碱金属硅酸盐复合物粘土。以重量计,Laponite D大约为58.00%SiO2、25.40%MgO、3.05%Na2O、0.98%Li2O以及一些水和微量金属。它的真比重为2.53,并且在8%湿度时具有1.0g/ml的表观松装密度。
其他合适的增稠剂包括爱尔兰藓、iota-角叉菜、黄蓍胶、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基丙基纤维素、羟丁基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素(例如,商业名Natrosol)、羧甲基纤维素钠和硅胶,例如精细研磨的Syloid(例如,244)。还可以包含增溶剂,例如湿润剂多元醇,如丙二醇、二丙二醇和己二醇;溶纤剂,如甲基溶纤剂和乙基溶纤剂;在直链中含有至少约12个碳的植物油和蜡,如橄榄油、蓖麻油和矿脂;以及酯类,如乙酸戊酯、乙酸乙酯和苯甲酸苄酯。
应当理解,常规情况下,口腔制剂通常是以合适的带标签的包装进行销售或另外分销。因此,瓶装口腔清洗剂会带有在本质上将其描述为口腔清洗剂或漱口剂的标签,并且所述标签写有它的使用说明;以及牙膏、乳膏或凝胶通常在一般为铝、铅衬或塑料的收缩管,或用于计量内容物的其他挤压、泵取或加压分配器中,所述收缩管或分配器带有在本质上将其描述为牙膏、凝胶或牙科用乳膏的标签。
在本发明的组合物中可以使用有机表面活性剂,以实现增强的预防作用,协助实现活性剂彻底、完全地分散在整个口腔中,并且使本发明的组合物更适合化妆品应用。所述有机表面活性物质本质上优选为阴离子的、非离子的或两性的,且优选不与所述活性剂相互作用。优选地将去垢剂物质作为表面活性剂,所述去垢剂物质赋予组合物去垢和发泡性质。阴离子表面活性剂的合适实例是高级脂肪酸单硫酸甘油单脂的水溶性盐,例如氢化椰子油脂肪酸的单硫酸甘油单脂的钠盐;高级烷基硫酸盐,例如月桂基磺酸钠;烷基芳基磺酸盐,例如十二烷基苯磺酸钠、高级烷基磺基醋酸盐、1,2-二羟基丙磺酸盐的高级脂肪酸酯;以及低级脂肪族氨基羧酸化合物的基本饱和的高级脂肪族酰胺,如在脂肪酸、烷基或酰基中具有12-16个碳的那些化合物等。以上提到的酰胺的实例是N-月桂酰肌氨酸、以及N-月桂酰肌氨酸、N-肉豆蔻酰肌氨酸或N-棕榈酰肌氨酸的钠盐、钾盐和乙醇胺盐,以上应当基本没有肥皂或相似的高级脂肪酸材料。适于使用的水溶性非离子表面活性剂的实例是环氧乙烷和可与其发生反应的各种反应性含氢化合物的缩合产物,所述含氢化合物具有长疏水性链(例如约12-20个碳原子的脂肪族链),该缩合产物(″ethoxamers″)含有亲水性聚氧乙烯部分,例如聚(环氧乙烯)与脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、多羟基醇(如山梨醇酐单硬脂酸酯)和聚环氧丙烷(如普流尼克(Pluronic)材料)的缩合产物。
表面活性剂的量以重量计通常为约0.1%-5%。值得注意的是,表面活性剂可以促进本发明活性剂的溶解,从而减少所需的增溶湿润剂的量。
在本发明的口腔制剂中可以掺入各种其他材料,诸如增白剂、防腐剂、硅酮、叶绿素复合物和/或诸如尿素、磷酸氢二铵的含氨物质,以及以上的混合物。这些佐剂如果存在,则掺入制剂的佐剂的量应当基本上不会对所需的性质和特征产生不利影响。
还可以使用任何合适的调味物质或增甜物质。合适的调味组分的实例是调味油和水杨酸甲酯,所述调味油如绿薄荷油、薄荷油、鹿蹄草油、檫木油、丁香油、鼠尾草油、桉树油、墨角兰油、肉桂油、柠檬油和橙油。合适的增甜剂包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、山梨醇、木糖醇、环氨酸钠、紫苏亭、AMP(天冬酰胺苯丙氨酸酯甲酯)、糖精等。适当地,调味剂和增甜剂可以单独或共同占制剂的约0.1%至5%或更多。
可以按照任何本领域内已知的制备药物组合物的方法来制备欲用于口腔的组合物,并且为了提供满足药学外观和味觉的制剂,该组合物可以含有一种或多种选自以下的试剂:增甜剂、调味剂、着色剂和防腐剂。片剂含有与适于制备片剂的药学可接受的无毒赋形剂混合的活性组分。这些赋形剂可以是,例如,惰性稀释剂,如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠;成粒剂和崩解剂,如玉米淀粉或褐藻酸;粘合剂,如淀粉、明胶或阿拉伯树胶;以及润滑剂,如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是无包衣的或可以用已知的技术进行包衣以延迟在胃肠道或牙周袋中的崩解和吸收,从而在更长的时期提供持续的作用。例如,可以使用时间延迟材料,如单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯。
用于口腔的制剂还可以以硬明胶胶囊的形式提供,其中活性组分与诸如碳酸钙、磷酸钙或高岭土的惰性固体稀释剂混合;或者用于口腔的制剂还可以以软明胶胶囊的形式提供,其中活性组分与水或诸如花生油、液体石蜡或橄榄油的油介质混合。
水性悬液含有活性物质与适于制备水性悬液的赋形剂的混合物。这类赋形剂是悬浮剂,例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶;分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂如卵磷脂,或环氧烷烃与脂肪酸的缩合物如聚氧乙烯硬脂酸酯,或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合物如十七乙烯氧基十六烷醇(heptadecaethyleneoxycetanol),或环氧乙烷与来自脂肪酸和己糖醇的部分酯的缩合物如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯,或环氧乙烷与来自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的缩合物如聚乙烯脱水山梨聚醇单油酸酯。
水性悬液还可以含有一种或多种防腐剂或抗微生物剂,例如苯甲酸酯,如乙基或正丙基对羟基苯甲酸酯;另一个实例是葡萄糖酸氯己定。水性悬液还可以含有一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种增甜剂如蔗糖或糖精。
可以通过将活性组分悬浮于植物油或矿物油中来配制油性悬液,所述植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油,所述矿物油例如液体石蜡。油性悬液可以含有增稠剂,例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加诸如上文列出的增甜剂和调味剂,以提供符合味觉需要的口腔制剂。可以通过添加诸如抗坏血酸的抗氧化剂保存这些组合物。
4.试剂盒
在某些实施方案中,提供了试剂盒,其包含:
-用于从所述个体的口腔组织去除几乎所有微生物或其碎片的抗微生物剂;
-用于针对微生物病原体而免疫所述个体的免疫原,口腔组织中所述微生物病原体的存在与疾病或病症相关;
所述试剂盒适用于上述的方法。
试剂盒可以包含:
-容纳处于抗微生物剂和免疫原的一种或多种形式的治疗组合物的容器;
-插入使用说明的标签或包装。
在某些实施方案中,提供了在本文所述方法或用途中使用的试剂盒。
在某些实施方案中,试剂盒可以包含一种或多种用于治疗疾病或病症的其它活性成分或组分。
试剂盒可以包含容器和插入容器或与容器相连的标签或包装。合适的容器包括例如小口瓶、药水瓶、注射器、透明包等。容器可以由各种材料制成,如玻璃或塑料。容器容纳可有效治疗病症的治疗组合物,并可以具有无菌端口(例如容器可以是具有皮下注射针头可刺入的瓶塞的输液袋(intravenous solution bag)或药水瓶)。标签或包装插入物指示治疗组合物是用于治疗所选的病症的。在一实施方案中,标签或包装插入物包括使用说明书,指示治疗组合物可用于治疗特定疾病或病症。
试剂盒可以包含(a)治疗组合物;以及(b)其中含有第二活性成分或组分的第二容器。该实施方案中本发明的试剂盒还可以包含包装插入物,其指示其它活性成分可用于治疗失调或预防源于特定感染的并发症。可选择地或此外,试剂盒还可以包含第二(或第三)容器,所述容器包含药学上可接受的缓冲液如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐溶液、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其还可以包含从商业和用户的角度来看期望的其它材料,包括其它缓冲液、稀释液、滤器、针和注射器。
通过下述实施例对本发明进行进一步说明,下述实施例是为了举例说明而不是为了限制本发明。
实施例1
方法和材料
细菌菌株和生长条件
使牙龈卟啉单胞菌W50的冻干培养物于37℃下,在补充了5μg/ml血晶素、0.5μg/ml半胱氨酸的裂解马血琼脂平板上厌氧生长(HB琼脂,<10代)。3-4天后,将菌落用于接种含有5μg/ml血晶素、0.5μg/ml半胱氨酸的脑心浸液培养基(1)。使批量培育物在MK3厌氧工作站(DonWhitley Scientific Ltd.,Adelaide,Australia)中厌氧生长。在指数生长期时,通过离心收集细胞(7500g,30分钟,4℃),并且在厌氧工作站中用PG缓冲液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl2和5mM半胱氨酸-HCl,pH 8.0)洗涤两次。用分光光度计(295E型,Perkin-Elmer)在650nm处监测批量培养物的生长。按照Slots(2)所述,通过革兰氏染色、显微镜检查并使用各种生化测试常规检测培养物纯度。
含有粘附素序列和N末端添加Kgp蛋白酶序列的粘附素序列的pET28构建体的构建
使用pET表达载体(Novagen),将代表活性位点(AS)与KgpA1粘附素(A1)结构域的肽和嵌合肽的Kgp残基在大肠杆菌中过表达为带有6×His标签的重组(r)蛋白。所表达的r-蛋白是rKAS2和rKLA1,r-嵌合蛋白是rKAS2-KLA1、rKAS1-KsA1和rKAS4-KAS3-KAS5-KAS6-KLA1(也被称为“多KAS-KLA1”)。代表各种A1和AS结构域的氨基酸序列描述于表1和表2中。
使用表4列出的引物、Taq DNA聚合酶(Invitrogen)和PC-960热循环仪(Corbett Research Technologies)分别从pNS1(pUC18中的3.5kb BamHIlys片段)或牙龈卟啉单胞菌基因组DNA扩增kgp基因的不同KAS和KA1结构域。分别使用引物对KAS2-FOR与KAS2-REV和KLA1-FOR与KLA1-REV来产生编码KAS2和KLA1的PCR片段,使用下述条件进行反应:94℃、3分钟;之后每个循环为94℃、45秒(变性),62℃、40秒(退火)和72℃、20秒(延伸),进行28个循环;之后72℃、5分钟进行最后1个循环。
按照下述,通过利用重叠延伸(SOEing)的基因剪接产生KAS2-KLA1嵌合PCR产物:使用引物对KAS2-FOR与KAS2-KLA1-嵌合体-REV和KAS2-KLA1-嵌合体-FOR与KLA1-REV、按上述条件产生PCR产物。然后,将该PCR产物退火,并用引物KAS2-FOR和KLA1-REV进行最后的PCR (94℃、2分钟;之后每个循环为94℃、30秒,50℃、30秒和72℃、40秒,进行28个循环;之后72℃、5分钟进行最后1个循环)。
对于KAS1-KsA1PCR产物的制备,进行两次连续PCR,该PCR中相继使用KAS1-KsA1-REV引物与KAS1-KsA1-FOR引物1和2中的每个(反应条件:94℃、2分钟;之后每个循环为94℃、15秒,63℃、30秒和72℃、2分钟,进行35个循环),从而产生KAS1-KsA1PCR产物。KAS1-KsA1-FOR1和KAS1-KsA1-FOR2引物含有与之前PCR产物的5′重叠的3′延伸。
为了制备多KAS-KLA1PCR片段,进行四次连续PCR,该PCR中相继使用多REV引物与多FOR引物1、2、3和4中的每个(反应条件:95℃、2分钟;之后每个循环为95℃、20秒,68℃、1.5分钟,进行35个循环),从而产生多KAS-KLA1PCR产物。每个多FOR引物含有与之前PCR产物的5′重叠的3′延伸。
按照生产商的方法,用PCR纯化柱(Qiagen)纯化编码KAS2、KLA1、KAS2-KLA1、KAS1-KsA1和多KAS-KLA1的所有PCR片段,将它们连接到TA克隆载体pGem-T Easy(Promega),并转化大肠杆菌JM109。用Ncol和Xhol消化纯化的重组pGemT-Easy构建体并定向克隆到Ncol/Xhol消化的pET28b(Novagen),并转化非表达宿主大肠杆菌JM 109[DH5α]。按照生产商的说明,纯化重组的pET28构建体,并转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)[HMS174(DE3)](Novagen)中,并在含有50μg卡那霉素的LB上进行选择。通过DNA序列分析确认每个插入物的完整性。
寡核苷酸引物(表4)被设计为合并了限制性酶位点、终止密码子,并且如果需要的话合并6×His标签。用于rKAS2、rKLA1和rKAS2-KLA1的引物被设计为将r-蛋白中所包含的无关编码序列限制为不多于3个氨基酸外加6×His标签。rKAS1和rKLA1被设计为分别在N末端和C末端含有6×His标签,使得它们可以与在N末端和C末端都具有6×His标签的rKAS2-KLA1直接进行比较。在rKAS1-KsA1和重组多(rmulti)KAS-KLA1中,His标签在C末端。
表4用于扩增编码Kgp A1和AS的不同片段的核苷酸序列的寡核苷酸引物
*来自序列登录号为U75366的赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶基因的核苷酸(nt)序列编号
重组蛋白的表达和纯化
通过异丙基β-D-硫代半乳糖苷酶(IPTG)进行诱导,从pET28::KLA1(KAS2、KAS2-LA1、KAS1-SA1、多KAS-KLA1)构建体表达重组蛋白。产生的所有重组蛋白为6×His标签融合蛋白,在变性条件下使用NI-NTA纯化系统(Invitrogen)将其纯化。简而言之,将大肠杆菌(DE3)单一集落转化体接种至20mL含有50μg/ml卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培养基,于37℃振荡过夜。然后将该接种物接种至1L含有50μg/ml卡那霉素的LB中。使该培养物的OD600达到0.5-0.7(对数中期),然后用0.1mM异丙基IPTG、于37℃、200rpm振荡下诱导蛋白表达2小时。收获细胞(7,500g),并在变性结合缓冲液(8M尿素、pH 8.0的20mM磷酸钠和500mM NaCl)中重悬,并利用Branson Sonifer 250细胞破碎仪(Branson Ultronics Corporation,Danbury,CT),使用装置3上的微尖端在冰上超声破碎细胞,每次15秒,共3次,每次间隔30秒,然后于4℃下,39,000g离心30分钟。通过上样至预先平衡的Ni-NTA琼脂糖柱从上清中纯化重组蛋白,然后用变性洗涤缓冲液(8M尿素、pH 6.0的20mM磷酸钠和500mM NaCl)进行冲洗以洗脱未结合的蛋白。然后用10倍体积的结合缓冲液B冲洗柱子,并用变性洗脱缓冲液(8M尿素、pH6.0的20mM磷酸钠、500mM NaCl和0.5M咪唑)洗脱重组蛋白。用2M尿素-PBS透析纯化的蛋白,并保存于-80℃。
通过SDS-PAGE分析重组蛋白样品,并用在线ProtParam(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)确定它们的分子量。使用BSA作为标准测定,通过Bio-Rad蛋白分析测定所有样品的蛋白浓度。
免疫和小鼠牙周炎模型
按照之前的报道所述(3)进行小鼠牙周炎实验,该实验经墨尔本大学动物实验道德规范委员会(University of Melbourne Ethics Committee forAnimal Experimentation)批准。6-8周龄的BALB/c小鼠(每组12只小鼠)饲养在微型隔离间中,用50μg的重组蛋白或RgpA-Kgp复合物中的一种、2×109福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌菌株W50细胞或PBS对上述小鼠进行皮下免疫(s.c.100μl);用弗氏不完全佐剂(IFA)乳化每种抗原。30天后,用抗原对小鼠进行加强免疫(s.c.注射,IFA乳化),并且在12天后从眼球后血管丛取血。第二次免疫后4天,供给小鼠去离子水配制的1mg/ml卡那霉素(Sigma-Aldrich,New South Wales,Australia),使小鼠自由摄取持续7天。抗生素治疗之后3天(取血后2天),小鼠用1×1010活牙龈卟啉单胞菌W50(25μl)经口腔接种4次,每次间隔2天,所述活牙龈卟啉单胞菌W50在含有2%(重量/体积)羧甲基纤维素(CMC;Sigma-Aldrich,NewSouth Wales,Australia)的PG缓冲液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mMCaCl2和5mM半胱氨酸-HCl,pH 8.0)中,对照组使用仅含有2%(重量/体积)CMC的PG缓冲液进行假感染。在厌氧室中制备接种物,然后立即将其施用于上颌臼齿的齿龈边缘。两周后,小鼠再接受4次给药(每次间隔2天),每次给药含有2%(重量/体积)CMC的PG缓冲液中的1×1010活牙龈卟啉单胞菌W50细胞(25μl)。通过血琼脂计数验证每个接种物的活细菌数。用软的粉状食物(Barastock,Australia)喂养小鼠,并将小鼠饲养在配备有加高丝网底部的笼子中以防止接触到垫料。最后给药之后4周,从小鼠眼球后血管丛取血并处死小鼠,取出上颌骨并切成两半,将一半(右侧)用于牙槽骨丧失检测,另一半(左侧)用于实时PCR。
将右半上颌骨在去离子水中沸煮(1分钟),机械去肉,并浸入2%(重量/体积)氢氧化钾中(16小时、25℃)。然后洗涤该半块上颌骨(用去离子水洗涤两次),并将其浸入3%(重量/体积)过氧化氢中(6小时、25℃)。洗涤该半块上颌骨(用去离子水洗涤两次)后,用0.1%(重量/体积)的亚甲基蓝水溶液对其进行染色,并用安装在解剖显微镜上的Olympus DP12数码相机拍摄每个半块上颌骨的颊侧的数码图像,用OLYSIA BioReport软件3.2版(Olympus Australia Pty Ltd.,New South Wales,Australia)评价水平骨丧失。水平骨丧失是发生在水平面、垂直于牙槽嵴(ABC)的丧失,其导致嵴高度的降低。将每个半块上颌骨排列,使每幅牙图像的臼齿颊尖侧和舌尖侧相叠,并且拍摄的图像在画面内标有测微计标尺,以便可以将每幅图像的测量结果标准化。用OLYSIA BioReport软件3.2版成像软件测量了每个臼齿从牙骨质釉质界至ABC的面积。由一个检测者使用随机盲法方案测定骨丧失检测结果两次。
通过ELISA确定亚类抗体
为了确定小鼠血清的亚类抗体应答,按照以下进行酶联免疫吸附测定(ELISA),一式三份:用含有5μg/ml的福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌W50溶液包被平底聚乙烯微量滴定板的孔(Dynatech Laboratories,McLean,VA),所述牙龈卟啉单胞菌W50配制在pH 7.0、含有0.1%(体积/体积)吐温20的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)(0.01M Na2HPO4、1.5mMKH2PO4、0.15M NaCl)(PBST)中。去除包被溶液后,将含有2%(重量/体积)脱脂奶粉的PBST加至孔中,于室温封闭未包被的塑料1小时。用PBST洗涤孔4次,将含有0.5%(重量/体积)脱脂乳的PBST(SK-PBST)中的小鼠血清系列稀释液添加至每个孔中,并于室温孵育16小时。用PBST洗涤孔6次后,将抗小鼠IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3的羊IgG(Sigma,New South Wales,Australia)的1/2000稀释液添加到SK-PBST中,并在室温结合2小时。用PBST洗涤板6次,将SK-PBST中的偶联辣根过氧化物酶的兔抗羊免疫球蛋白(Sigma,New South Wales,Australia)的1/5000稀释液添加至每个孔中,并于室温孵育1小时。用PBST洗涤孔6次后,通过将100μl ABTS底物[含有0.005%(体积/体积)过氧化氢的80mM柠檬酸中的0.9mM 2,2′-联氮-双(3-乙基苯-噻唑啉-6)磺酸,pH4.0]添加至每个孔中来检测结合的抗体。用酶标仪(Bio-Rad酶标仪,型号450)检测415nm处的光密度。
SDS-PAGE凝胶电泳和Western印迹
用XCell surelock Mini-Cell电泳系统分析重组蛋白(10μg)。将重组蛋白混于20μl还原样品缓冲液(10%[重量/体积]SDS、0.05%[重量/体积]溴酚蓝、25%[体积/体积]甘油和0.05%[体积/体积]2-巯基乙醇)中。用1.5M Tris-HCl将pH调至pH 8.0,然后将溶液于100℃加热5分钟。将重组蛋白(10μg/道)上样至Novex 12%(重量/体积)Tris-甘氨酸预制小型凝胶上,并用Novex电泳系统(Novex,San Diego,CA),使用30-50mA的电流和125V的电压进行电泳。用0.25%w/v考马斯亮蓝R250显现蛋白。
Kgp蛋白酶活性位点肽(KAS-2)序列的表位分析
通过在多中心(multipin)肽合成系统(Chiron Technologies,Melbourne,Australia)上使用Fmoc化学的标准固相肽合成方法合成N末端生物素化的重叠的8个残基的肽(1个残基偏移,7个残基重叠)来确定Lys特异性蛋白酶活性位点肽KAS2(433-468SEQ ID No:28)的抗体结合位点。将pH7.4的0.1M PBS中的生物素化的肽(5μg/ml)与链霉亲和素包被的平板结合,于4℃过夜(Nunc,NSW Australia)。用PBST洗涤孔4次之后,用以1:1000稀释在1%w/v脱脂奶粉中的的小鼠血清、按照Chiron Technologies的操作说明、通过ELISA进行平板结合肽的表位定位,所述脱脂奶粉配制在含有0.1%v/v吐温20、pH 7.4的0.1M PBS中(SK-PBST)。用PBST将孔洗涤6次后,将抗小鼠IgG的羊IgG(Sigma,New South Wales,Australia)的1/2,000稀释液添加于SK-PBST中,并允许室温下结合2小时。用PBST将平板洗涤6次,并将SK-PBST中偶联辣根过氧化物酶的兔抗羊免疫球蛋白(Sigma,New South Wales,Australia)的1/5,000稀释液添加至每个孔中,并于室温孵育1小时。用PBST将孔洗涤6次后,通过将100μl ABTS底物[含有0.005%(体积/体积)过氧化氢的80mM柠檬酸中的0.9mM 2,2′-联氮-双(3-乙基苯-噻唑啉-6)磺酸,pH 4.0]添加至每个孔中来检测结合的抗体。用酶标仪(Bio-Rad酶标仪,型号450)测定415nm处的光密度。
统计学分析
用单因素方差分析(ANOVA)和Dunnett′s T3检验(适用于Windows的SPSS,12版)对骨丧失数据进行统计学分析。使用SPSS软件(适用于Windows的SPSS,12版),利用学生t检验对IgA、IgM和IgG亚类抗体滴度进行统计学分析。
实施例2
重组蛋白(KsA1、KLA1、KAS1-KsA1和KAS2-KLA1)的表征和纯化
为了表征Kgp粘附素A1结构域片段和嵌合体Kgp蛋白酶与Kgp粘附素A1结构域片段针对牙龈卟啉单胞菌感染的保护能力,我们表达并纯化了以下重组蛋白:KsA1、KLA1、KAS1-KsA1和KAS2-KLA1。使用镍螯合亲和层析从包涵体纯化重组蛋白(KsA1和KLA1)和重组嵌合蛋白(KAS1-KsA1和KAS2-KLA1),并通过SDS-PAGE分析所述纯化的蛋白(图1)。每一种纯化的重组蛋白由对应于KAS2-KLA1、KLA1、KsA1和KAS1-KsA1的分子量为40、36、31和32kDa的一个主要蛋白条带组成,并且这些分子量与用ProtParam计算出的His标签重组蛋白的分子量相对应。为了表征重组蛋白的免疫原性,将KsA1、KLA1、KAS1-KsA1和KAS2-KLA1用来免疫小鼠,并将血清用来探测用KAS2肽包被的平板和用福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌W50细胞包被的平板(图2)。发现重组嵌合蛋白KAS1-KsA1和KAS2-KLA1抗血清以与KAS2特异性抗血清(KAS2-白喉类毒素缀合物)相似的水平识别KAS2肽(图2A)以及福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌W50细胞(图2B)。然而,针对重组蛋白KLA1的抗血清仅识别杀死的牙龈卟啉单胞菌W50细胞(图2B)。
实施例3
用重组蛋白(KsA1、KLA1、KAS1-KsA1和KAS2-KLA1)免疫对小鼠牙周炎模型中牙龈卟啉单胞菌诱导的牙槽骨丧失的作用
使用基于Baker et al(4)的报道而改进的牙周骨丧失的小鼠模型,将重组蛋白KsA1、KLA1、KAS1-KsA1和KAS2-KLA1、福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌菌株W50和RgpA-Kgp复合物用于确定和比较对牙龈卟啉单胞菌诱导的牙槽骨丧失所产生的保护。小鼠用重组蛋白KsA1、KLA1、KAS1-KsA1或KAS2-KLA1、RgpA-Kgp复合物或福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌菌株W50(FK-W50)细胞或单独的PBS佐剂免疫(第0天和第30天),然后用活牙龈卟啉单胞菌W50经口腔激发。用所有重组抗原、RgpA-Kgp复合物和FK-W50细胞免疫保护的BALB/c小鼠对抗牙龈卟啉单胞菌诱导的牙槽骨丧失,因为这些动物相比PBS免疫组表现出显著(p<0.001)更少的骨丧失(图3)。然而,用KAS2-KLA1免疫的小鼠的骨丧失显著少于用KLA1(p<0.01)、KsA1(p<0.001)、RgpA-Kgp复合物(p<0.001)、FK-W50细胞(p<0.001)免疫的小鼠和未激发(p<0.001)的小鼠。用KAS2-KLA1和KAS1-KsA1免疫的小鼠的骨丧失之间不存在显著差异。此外,用KAS1-KsA1免疫的小鼠的骨丧失显著少于未激发的小鼠(p<0.01)和用RgpA-Kgp复合物免疫的小鼠(p<0.05),但与用KsA1、KLA1和FK-W50免疫的小鼠不存在显著差异。用KsA1、KLA1、RgpA-Kgp复合物和FK-W50免疫的小鼠的骨丧失之间不存在显著差异。
实施例4
通过用重组蛋白(KsA1、KLA1、KAS1-KsA1和KAS2-KLA1)免疫在小鼠牙周炎模型中所诱导的抗体亚类应答
在用活牙龈卟啉单胞菌细胞口腔接种激发之前和之后,对小鼠进行取血并通过离心收集血清。图4表明在小鼠牙周炎模型中,对于每种免疫原(KsA1、KLA1、KAS1-KsA1或KAS2-KLA1或福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌菌株W50(FK-W50)细胞),对福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌W50细胞的抗体亚类反应性。所有保护性免疫原诱导对FK-W50的高IgG抗体滴度。此外,每种保护性免疫原所诱导的主要抗体亚类是IgG1,仅伴随弱免疫反应性的IgG2a、IgG2b和IgG3FK-W50特异性抗体(图4)。在口腔接种之前(图4A)和之后(图4B),每种免疫原所诱导的主要抗体亚类都是IgG1。
实施例5
KAS2(433-468)的表位定位
合成了KAS2(433-468)的重叠的生物素化的8个残基的肽(1个残基偏移,7个残基重叠),并将其用来包被链霉亲和素包被的平板。然后利用来自KAS1-KsA1、KAS2-KLA1和KAS2-白喉毒素缀合物免疫的小鼠的抗血清来鉴定抗体结合表位(图5)。光密度(415nm)高于背景2倍被认为是阳性抗体应答(阈值OD)。所述抗血清识别来自SEQ ID No.28的下述肽序列,即KAS1-KsA1识别肽435-442、436-443、445-452、446-453和447-454(阈值OD=0.07,图5A),而KAS2-KLA1识别肽435-442、447-454和448-455(阈值ID=0.07,图5A)。这提示多个最小表位的识别,即肽436-442(VSFANYT及其变体VGFANYT)、肽447-452(ETAWAD及其变体ETSWAD)和肽448-453(TAWADP及其变体TSWADP)。包括肽436-442表位的肽包括GVSFANYT、GVGFANYT、VSFANYTA和VGFANYTA。包括肽447-452和/或448-453表位的肽包括SETAWAD、SETSWAD、ETAWADP、ETSWADP、TAWADPL和TSWADPL,更具体是GSETAWAD、GSETSWAD、SETAWADP、SETSWADP、ETAWADPL、ETSWADPL、TAWADPLL和TSWADPLL。
实施例6
用于与蛋白缀合的KAS和RAS肽的合成
手动或用CEM微波肽合成仪来合成肽。整个过程中使用Fmoc化学的标准固相肽合成方案。使用Rink-linker来源的AM-sure树脂(AAPPTEC,KY,USA)将肽组装为羧酰胺形式。用4当量Fmoc-氨基酸与6当量DIPEA通过HBTU/HOBt活化完成连接。Fmoc基团由含20%哌啶的1MHOBt/DMF去除。
使具有KAS或RAS肽的树脂在DMF中膨胀,由2%v/v DBU将N末端Fmoc基团去除,所述2%v/v DBU在含有2%v/v哌啶的DMF中。然后,用5当量SAMA-OPfp和5当量HOBt使N末端氨基衍生带有S-乙酰巯基乙酸(SAMA)基团。通过三硝基苯磺酸(TNBSA)测试来监测所述反应。当得到阴性TNBSA测试时,洗涤树脂(5×DMF、3×DCM和3×乙醚)。然后真空干燥树脂。用TFA:苯酚:TIPS:EDT:水(92:2:2:2:2)裂解混合物从树脂载体裂解肽,根据肽的精氨酸含量,裂解进行2.5小时或4小时。切割后,通过过滤去除树脂,并在氮气流下将滤液浓缩至约1mL。将肽产物在冷乙醚中沉淀后,将它们离心并洗涤3次。将肽沉淀物溶解在5-10mL含有0.1%v/v TFA的水中,通过离心去除不溶的残留物。通过RP-HPLC纯化肽。
多种不同的化学部分可以用来对肽进行衍生以用于与蛋白缀合,可以引入反应性基团,如卤化物(溴代、氯代和碘代)、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺基、肼基、肟基、硫醇,然后可以将其用于使衍生的肽与诸如KgpA1的蛋白缀合,所述缀合通过蛋白的天然半胱氨酸残基或经过衍生而具有的允许进行化学连接的互补反应性基团进行以形成肽-蛋白缀合物。
SAMA-肽与KA1的缀合
向含有10mg/mL重组KA1或RgpA-Kgp复合物的其他粘附素结构域的磷酸盐缓冲盐溶液(0.1M磷酸钠、0.9%NaCl,pH 7.4)中添加0.1mL的含有1%w/v马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)的DMF溶液。30分钟后,去除未反应的MBS,并使用在缀合缓冲液(0.1M磷酸钠、5mM EDTA,pH 6.0)中平衡的PD10柱(Pharmacia,NSW,Australia),通过凝胶过滤收集MBS修饰的KA1。将纯化的SAMA-肽(1.3μmol)溶解于200μL含有0.5M Tris、2mM EDTA,pH 6.0的6M盐酸胍中,用800μLMilliQ水稀释,并通过添加溶解于MilliQ水中的25μL 2M NH2OH(40当量)原位脱保护。将收集的MBS-KA1立即与脱保护的SAMA-肽反应,并于室温搅拌1小时。使用在pH 7.4的PBS中平衡的PD10柱,通过凝胶过滤将肽-KA1缀合物与未反应的肽分离并冻干。用Ellmans测试来监测所述反应。
实施例7
抗体制备
通过用蛋白进行皮下免疫在小鼠中产生针对重组蛋白的多克隆抗血清。在第0天时用配制在弗氏不完全佐剂中的25μg蛋白免疫小鼠,并在第30天时用配制在弗氏不完全佐剂中的25μg蛋白免疫小鼠。用标准方法进行免疫。获得了具有针对蛋白的高滴度的多克隆抗血清。如果需要,可以使用标准方法获得特异性定向于重组蛋白的单克隆抗体。
实施例8
用于产生抗体的免疫
使用在弗氏不完全佐剂(IFA)中乳化的50μgKAS2-LA1嵌合体和抗原对6-8周龄的BALB/c小鼠或CD1(瑞士远交系小鼠)(每组10只小鼠)进行皮下免疫(s.c.100μL)。30天之后,用抗原(s.c.注射,用IFA乳化)加强;12天之后处死小鼠并进行心脏取血以收集血清。
通过ELISA确定亚类抗体
为了确定小鼠血清的亚类抗体应答,如下进行酶联免疫吸附测定(ELISA),一式三份:用配制在含有0.1%(体积/体积)的吐温20的pH 7.0的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)(0.01M Na2HPO4、1.5mM KH2PO4、0.15MNaCl)(PBST)中的5-μg/ml KAS2-LA1嵌合体或福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌W50或RgpA-Kgp复合物溶液包被平底聚乙烯微量滴定板孔(Dynatech Laboratories,McLean,VA)。去除包被溶液后,将含有2%(重量/体积)脱脂奶粉的PBST加至孔中,于室温封闭未包被的塑料1小时。用PBST将孔洗涤4次后,将含有0.5%(重量/体积)脱脂乳的PBST(SK-PBST)中的小鼠血清连续稀释液添加至每个孔中,并于室温孵育16小时。用PBST将孔洗涤6次后,将抗小鼠IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3的羊IgG(Sigma,New South Wales,Australia)的1/2,000稀释液添加至SK-PBST,并在室温结合2小时。用PBST将平板洗涤6次,并将SK-PBST中偶联辣根过氧化物酶的兔抗羊免疫球蛋白(Sigma,New South Wales,Australia)的1/5,000稀释液添加至每个孔中,于室温孵育1小时。用PBST将孔洗涤6次后,通过将100μl ABTS底物[含有0.005%(体积/体积)过氧化氢的80mM柠檬酸中的0.9mM 2,2′-联氮-双(3-乙基苯-噻唑啉-6)磺酸,pH 4.0]添加至每个孔中来检测结合的抗体。用酶标仪(Bio-Rad酶标仪,型号450)检测415nm处的光密度。
远交系(CD1,瑞士)小鼠中通过用重组蛋白KAS2-KLA1免疫所诱导的抗体亚类应答
CD1(瑞士)小鼠用KAS2-LA1嵌合体进行免疫,取血并通过离心收集血清。图6给出对KAS2-LA1嵌合体、福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌W50细胞和RgpA-Kgp复合物的抗体亚类反应。KAS2-LA1嵌合体诱导强IgG抗体,主要为识别KAS2-LA1嵌合体并与福尔马林杀死的牙龈卟啉单胞菌W50细胞和RgpA-Kgp复合物发生强交叉反应的IgG1抗体应答(图6)。此外,KAS2-LA1嵌合体仅诱导弱的免疫反应性IgG2a、IgG2b和IgG3抗原特异性抗体(图6)。
实施例9
Kgp结构模型的开发和活性位点表面可接近序列的鉴定
我们的工作已经表明:Kgp蛋白酶活性位点肽是高免疫原性的,并诱导针对牙龈卟啉单胞菌诱导的骨丧失的高水平保护作用。在试图鉴定其它蛋白酶活性位点肽作为疫苗备选者时,使用Sybyl7.3的Orchestrar程序套装开发了Kgp催化结构域的模型(图7)。该模型是基于来自牙龈卟啉单胞菌的RgpB蛋白酶的PDB结构1crv。该蛋白具有23.58%的配对同一性,且Z评分是25.09(高度可信模型)。Meta-PPisp蛋白相互作用服务器预测了Kgp的两个蛋白与蛋白相互作用表面:底物结合表面(如RgpB中)和Kgp特有的第二表面。RgpB和Kgp模型之间的主要差异在于设计第二相互作用表面和19个残基的空位(Val526至Phe545)处于环中,落入第二相互作用表面中的Kgp中不能模拟该19个残基的空位。图7显示的是Kgp模型,较粗的带表示Kgp的蛋白酶活性位点周围的表面可接近序列,发现所述表面可接近序列是Asp388-Gln394、Leu421-Ala423、Ala443-Glu447加Ala451、Asn510-Trp513和ILe570-Gly577加Tyr580。从所述模型(图6)可明显观察到,除KAS2(A)之外,三个其他序列KAS4(Asp388-Val395)(B)、KAS5(Asn510-Asp516)(C)和KAS6(ILe570-Tyr580)(D)是重要的并具有成为疫苗靶标的足够长度。因此,可以依次产生具有这些肽中每一个的重组嵌合蛋白,并将其连接至KLA1的N末端,以产生多KAS-KLA1,该多KAS-KLA1可以被用来诱导免疫应答,并从而针对牙龈卟啉单胞菌相关疾病或病症进行保护。
实施例10
模拟Arg-X-蛋白酶以鉴定位于催化位点侧翼的免疫原性区的方法
按照Eichinger A、Beisel HG、Jacob U、Huber R、Medrano FJ、BanbulaA、Potempa J、Travis J、Bode W[Crystal structure of gingipain R:anArg-specific bacterial cysteine proteinase with a caspase-like fold(牙龈卟啉蛋白酶R的晶体结构:具有半胱天冬酶样折叠的Arg-特异性细菌半胱氨酸蛋白酶)EMBO J.1999年10月15日,18(20):5453-62]的方法确定Arg-X-蛋白酶的三维结构。
实施例11
以下是含有抗体的牙膏配方的实例
实施例12
以下是牙膏配方的实例
实施例13
以下是牙膏配方的实例.
实施例14
以下是牙膏配方的实例.
实施例15
以下是液体牙膏配方的实例
实施例16
以下是漱口剂配方的实例
实施例17
以下是漱口剂配方的实例
实施例18
以下是锭剂配方的实例
实施例19
以下是牙龈按摩乳膏配方的实例
实施例20
以下是口香糖配方的实例
实施例21
以下是药物配方的实例
实施例22
以下是牙周凝胶配方的实例
实施例23
以下是牙周凝胶配方的实例
应当理解,尽管在本文中对本发明进行了详细描述,但是这些实施例仅为示例性目的。对分子生物学、牙科诊断学和相关学科领域的技术人员显而易见的对本发明实施方案的其他改动也意图包括在本发明的范围内。
应当理解,本说明书中公开和限定的本发明延伸至文本或附图提到的或显而易见的两个或更多个独立特征的所有可选组合。所有这些不同的组合构成本发明的各个可选方面。
参考文献
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应当理解,本说明中公开和限定的本发明延伸至文本或附图提到的或显而易见的两个或更多个个体特征的所有可选组合。所有这些不同的组合构成本发明的各个可选方面。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.在个体中形成对口腔病原体的抗体应答的方法,其包括以下步骤:
-提供欲对口腔病原体形成抗体应答的个体;
-评价所述个体以确定所述个体的口腔组织是否发炎;
-在评价表明所述个体的口腔组织没有发炎的情况下,用口腔病原体免疫所述个体,从而在所述个体中形成对口腔病原体的抗体应答。
2.用于在口腔组织发炎的个体中形成对口腔病原体的抗体应答的免疫方案,所述免疫方案包括,在个体免疫形成对口腔病原体的抗体应答之前,将抗炎剂给予个体,从而使口腔组织的炎症最小化,或从口腔组织去除炎症的步骤。
3.在用口腔病原体免疫时使口腔组织发炎的个体形成对所述病原体的抗体应答的方法,所述方法包括,在用病原体免疫所述个体用于形成对口腔病原体的抗体应答之前,将抗炎剂给予所述个体,从而使口腔组织的炎症最小化或从口腔组织去除炎症的步骤。
4.在口腔组织发炎的个体中形成对口腔病原体的抗体应答的方法,其包括以下步骤:
-提供口腔组织发炎的个体;
-对所述个体实施治疗,从而从口腔组织去除炎症;此后,
-用口腔病原体免疫所述个体,从而在所述个体中形成对病原体的抗体应答。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法或免疫方案,其中在口腔组织没有发炎或炎症为亚临床炎症或无临床症状时,提供免疫或免疫步骤。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法或免疫方案,其中免疫所形成的抗体应答主要是Th2应答,尽管其可能含有可检测的Th1应答成分。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法或免疫方案,其中所述炎症是慢性牙周炎。
8.如权利要求7所述的方法或免疫方案,其中所述牙周炎与牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)感染有关。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法或免疫方案,其中用于免疫的免疫原是牙龈卟啉单胞菌细胞、碎片、代谢物或由其衍生的重组产物。
10.如权利要求9所述的方法或免疫方案,其中来源于牙龈卟啉单胞菌的重组产物是嵌合肽或融合蛋白。
11.如权利要求10所述的方法或免疫方案,其中所述嵌合或融合蛋白用于诱导所述个体对牙龈卟啉单胞菌免疫应答,所述蛋白包含第一肽和第二肽,所述第一肽与第二肽直接连接或通过接头连接,其中:
(A)所述第一肽包含:
(i)与SEQ ID No:1所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(ii)与SEQ ID No:2所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部;以及
(B)所述第二肽包含:
(i)与牙龈卟啉单胞菌Lys-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(ii)与牙龈卟啉单胞菌Arg-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(iii)与牙龈卟啉单胞菌HagA粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。
12.如权利要求11所述的方法或免疫方案,其中所述嵌合或融合蛋白是本文所述的KAS1-KsA1或KAS2-KLA1。
13.如权利要求2或3所述的方法或免疫方案,其中所述抗炎剂包含抗炎化合物、抗生素或抗生物膜剂中的一种或多种。
Claims (12)
1.在个体中形成对口腔病原体的抗体应答的方法,其包括以下步骤:
-提供欲对口腔病原体形成抗体应答的个体;
-评价所述个体以确定所述个体的口腔组织是否发炎;
-在评价表明所述个体的口腔组织没有发炎的情况下,用口腔病原体免疫所述个体,从而在所述个体中形成对口腔病原体的抗体应答。
2.用于在口腔组织发炎的个体中形成对口腔病原体的抗体应答的免疫方案,在免疫个体形成对口腔病原体的抗体应答之前,将抗炎剂给予个体,从而使口腔组织的炎症最小化,或从口腔组织去除炎症的步骤。
3.在用口腔病原体免疫时使口腔组织发炎的个体形成对所述病原体的抗体应答的方法,所述方法包括,在用病原体免疫所述个体用于形成对口腔病原体的抗体应答之前,将抗炎剂给予所述个体,从而使口腔组织的炎症最小化或从口腔组织去除炎症的步骤。
4.在口腔组织发炎的个体中形成对口腔病原体的抗体应答的方法,其包括以下步骤:
-提供口腔组织发炎的个体;
-对所述个体实施治疗,从而从口腔组织去除炎症;此后,
-用口腔病原体免疫所述个体,从而在所述个体中形成对病原体的抗体应答。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法或免疫方案,其中在口腔组织没有发炎或炎症为亚临床炎症或无临床症状时,提供免疫或免疫步骤。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法或免疫方案,其中免疫所形成的抗体应答主要是Th2应答,尽管其可能含有可检测的Th1应答成分。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法或免疫方案,其中所述炎症是慢性牙周炎。
8.如权利要求7所述的方法或免疫方案,其中所述牙周炎与牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)感染有关。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法或免疫方案,其中用于免疫的免疫原是牙龈卟啉单胞菌细胞、碎片、代谢物或由其衍生的重组产物。
10.如权利要求9所述的方法或免疫方案,其中来源于牙龈卟啉单胞菌的重组产物是嵌合肽或融合蛋白。
11.如权利要求10所述的方法或免疫方案,其中所述嵌合或融合蛋白用于诱导所述个体对牙龈卟啉单胞菌免疫应答,所述蛋白包含第一肽和第二肽,所述第一肽与第二肽直接连接或通过接头连接,其中:
(A)所述第一肽包含:
(i)与SEQ ID No:1所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(ii)与SEQ ID No:2所示的序列相同或同源的序列的一部分或全部;以及
(B)所述第二肽包含:
(i)与牙龈卟啉单胞菌Lys-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(ii)与牙龈卟啉单胞菌Arg-X-蛋白酶的粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部;或
(iii)与牙龈卟啉单胞菌HagA粘附素结构域的序列相同或同源的序列的一部分或全部。
11.如权利要求11所述的方法或免疫方案,其中所述嵌合或融合蛋白是本文所述的KAS1-KsA1或KAS2-KLA1。
12.如权利要求2或3所述的方法或免疫方案,其中所述炎性剂包含抗炎化合物、抗生素或抗生物膜剂中的一种或多种。
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