CN102712693A - 牙龈卟啉单胞菌多肽 - Google Patents

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Abstract

本文提供用于引发针对牙龈卟啉单胞菌的免疫应答的组合物和方法。所述组合物和方法涉及牙龈卟啉单胞菌多肽及其片段和变体以及相应的多核苷酸，它们可用于牙龈卟啉单胞菌感染(例如牙周炎)的诊断、预防和治疗。还公开了针对所述多肽的抗体和包括这些抗体的组合物以及方法。本公开还描述了用于检测、预防和治疗牙龈卟啉单胞菌感染(例如牙周炎)的方法。

Description

牙龈卟啉单胞菌多肽
相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年8月2日提交的美国临时申请No.61/230,717的权益，其通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
本发明涉及免疫学领域并且特别涉及牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原和它们在免疫和治疗中的用途。
背景
牙周炎(或牙周疾病)是牙齿支持组织的炎性疾病。疾病进展的特征在于牙周袋(含有菌斑)的形成，支持结缔组织的进行性破坏和牙槽骨丢失，从而导致牙齿的进行性松动和最终丢失。牙周疾病与龈下牙斑中的特定细菌相关。牙龈卟啉单胞菌被认为是病因学上与牙周炎及其进展相关的最重要病原体之一。这种产黑色素的、非糖酵解的革兰氏阴性厌氧菌依赖于特定氨基酸的代谢供能。牙龈卟啉单胞菌绝对需铁，优选以血红素或其Fe(Ⅲ)氧化产物氯高铁血红素的形式，并且当生长在氯高铁血红素过量的条件下时，实验动物中的牙龈卟啉单胞菌具有剧毒性。
许多毒力因子与牙龈卟啉单胞菌的致病性相关，包括荚膜、粘附素、细胞毒素和胞外水解酶。牙龈卟啉单胞菌的主要毒力因子和疫苗候选物是胞外半胱氨酸蛋白酶或牙龈蛋白酶(gingipain)(RgpA、RgpB和Kgp)。它们已被广泛研究(1-8)。已表明单独的牙龈蛋白酶复合物保护预防性动物模型中牙周骨免于丢失并且特异性针对该复合物的抗体已证明在人研究中有保护功效(9，10)。尽管如此，牙龈卟啉单胞菌的毒力和致病能力很可能是多因子的，涉及许多决定因素(11)。
牙龈卟啉单胞菌W83和ATCC 33277菌株的基因组已分别被测序(12，13)，但这些参考文献对牙龈卟啉单胞菌的哪种抗原是免疫原性的或者是有用的未提供任何教导。
因此，仍存在对牙龈卟啉单胞菌感染的有效治疗的需要。
发明概述
本发明提供用于引发针对牙龈卟啉单胞菌的免疫应答的组合物和方法。还提供用于预防和治疗牙龈卟啉单胞菌感染(例如牙周炎)的方法。在一个实例中，组合物包含至少一种选自PG0495、PG0654、PG1374、PG1795、PG2172、PG0613、PG1326、PG1798、PG0186和PG0616的多肽。还提供与这些多肽特异性结合的抗体和包含此类抗体的组合物以及使用这些抗体的方法。
提供了组合物，例如包含一种或多种多肽的药物组合物(例如疫苗组合物)。任选地，组合物可包含佐剂。
本发明提供若干优点。例如，将本发明组合物给予受试者引发针对牙龈卟啉单胞菌感染的免疫应答。
根据下文详述、附图以及权利要求，本发明的其它特征和优点将清楚明了。
附图简述
参考附图，可从下列描述进一步理解本发明，其中：
图1包括A和B组，说明牙龈卟啉单胞菌特异性IgG应答。图1a描述了实施例3的血清抗-蛋白IgG抗体应答并且图1B描述了实施例3的血清总IgG抗体应答。
图2描述了在稳定期的牙龈卟啉单胞菌(W50菌株)的细胞表面上蛋白的可接近性，这通过基于流式细胞术的测定而测量。Y-轴上的每一点表示得到的结果。结果的平均值由水平破折号(—)表示。各种蛋白的名称在X-轴上标出。还评估了牙龈卟啉单胞菌的外膜部分中蛋白的存在情况(如实施例4所论述的)并且在X-轴上提供结果(例如，+表明在OM部分中检测到蛋白；-表明蛋白不存在于OM部分中；*表明在一些实验中在OM中检测到蛋白，而其它实验中未检测到。
图3描述了抗-牙龈卟啉单胞菌蛋白IgG抗体应答。在氢氧化铝存在或不存在下，用牙龈卟啉单胞菌多肽免疫各组小鼠。测量牙龈卟啉单胞菌特异性IgG抗体效价。每一条带表示平均抗体效价并且记号对应于每组的单只小鼠。
图4描述了从用蛋白免疫的小鼠得到的血清样品的血清杀菌活性。
图5描述了特异性抗-蛋白血清的调理吞噬研究活性。
图6描述了三株牙龈卟啉单胞菌(W50、W83、ATCC33277)的细胞表面上蛋白的可接近性，这通过基于流式细胞术的测定而测量。此外，还对生长至不同生长阶段的牙龈卟啉单胞菌W50上蛋白的可接近性进行评估。Y-轴上的每一点表示使用蛋白特异性抗血清进行的测定中获得的结果。
发明详述
本发明提供牙龈卟啉单胞菌多肽及其相应的编码核酸，当给予受试者时其引发免疫应答。提供了例如多肽PG0495、PG0654、PG1374、PG1795、PG2172、PG0613、PG1326、PG1798、PG0186和PG0616，编码这些多肽的核酸序列以及与这些多肽特异性结合的抗体。还提供包含至少一种牙龈卟啉单胞菌多肽的免疫原性组合物和用于预防、治疗牙龈卟啉单胞菌感染和降低牙龈卟啉单胞菌感染风险的方法，和用于在受试者中使用这些组合物以引发或诱导免疫应答的方法以及制备这些组合物的方法。本发明的多肽和核酸序列包括但不限于构成本说明书一部分的序列表所列出的特定核酸和氨基酸序列。下文将进一步描述这些多肽、组合物和方法。
定义
本文使用的术语″抗原″是指能刺激免疫应答的物质。由抗原刺激的免疫应答可为体液应答或细胞应答之一或两者，并且通常是抗原特异性的。当引入受试者中时，抗原能引发并介导形成相应的免疫体(抗体)。抗原可具有多个抗原决定簇，使得受试者对抗原的暴露可产生多个具有不同特异性的相应抗体。抗原可包括但不限于蛋白、肽、多肽、核酸及其片段、变体和组合。
本文使用的术语肽、蛋白和多肽可互换。
″分离的″多肽是从其自然环境移出的多肽。例如，分离的多肽是从细胞的胞质或膜移出的多肽，并且其自然环境中的许多多肽、核酸和其它细胞材料已不再存在。″可分离的″多肽是可从特定来源分离的多肽。″纯化的″多肽是至少60％不含、优选至少75％不含和最优选至少90％不含与它们天然结合的其它组分的多肽。按照定义，在其天然存在的生物体体外例如通过化学的或重组的方式产生的多肽被认为是分离的和纯化的，因为它们从未存在于自然环境中。
术语″表面可接近的蛋白″是指所有表面暴露的蛋白，包括例如内膜和外膜蛋白、与细胞壁粘着的蛋白和分泌蛋白。
本文使用的多肽″片段″优选具有至少约40个残基，或60个残基，并且优选至少约100个残基的长度。可通过本领域技术人员已知方法产生牙龈卟啉单胞菌多肽的片段。
术语″抗体″(antibody或antibodies)是指单克隆和多克隆抗体并且包括未纯化或部分纯化形式(即杂交瘤上清液、腹水、多克隆抗血清)或纯化形式的完整或片段化抗体。在一些实施方案中，抗体的抗原-结合部分包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)变体、单链抗体(scFv)、嵌合抗体例如人源化抗体、双抗体和多肽，其包含足以使多肽与特异性抗原结合的至少一部分抗体。
″纯化的″抗体是与至少约50％的蛋白(即作为杂交瘤上清液或腹水制备物的一部分)分离的抗体，所述蛋白最初与所述抗体共存。
除非上下文另外明确指出，本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数对象。因此，例如，对片段的提及可包括片段混合物而对药物载体或佐剂的提及可包括两种或更多种这类载体或佐剂的混合物。
本文使用的受试者或宿主意指个体。受试者可包括家畜动物例如猫和狗，牲畜(例如牛、马、猪、绵羊和山羊)、实验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠)。在一方面，受试者为哺乳动物例如灵长类动物或人。
任选的或任选地意指随后描述的事件或状况可发生或可不发生，并且该描述包括其中事件或状况发生的情况和不发生的情况。例如，短语“任选地组合物可包括组合”意指组合物可包括不同分子的组合或可不包括组合使得该描述包括组合和没有组合两种(即组合的单个成员)。
本文中可将范围表示为从约一个特定值和/或到约另一特定值。当表示这类范围时，另一方面包括从一个特定值和/或到其它特定值。类似地，当通过使用先行词约或大约将值表示为近似值时，将理解的是，该特定值形成另一方面。还应理解各范围的端点在意义上与另一端点相关而与其它端点无关。
当术语“预防”在本文中与既定病况的既定预防性治疗一起使用(例如预防牙龈卟啉单胞菌感染)时，其旨在表示被治疗的受试者根本没有形成临床可观察水平的病症，或比他/她在没有接受该治疗时更缓慢地和/或更低程度地形成所述病症。这些术语不仅仅局限于其中受试者无论如何不经历该病症的任何方面的情形。例如，如果在将患者暴露于已经预计产生病况的既定表现的刺激期间，给予该治疗且该治疗导致受试者经历比预期的更少和/或更温和的病况症状，则认为治疗已预防所述病症。治疗可通过导致受试者仅显示感染的温和的明显症状来“预防”感染，其并不暗示着一定没有任何细胞被感染性微生物侵入。
类似地，本文中使用的与感染风险相关的用既定治疗“降低”(例如降低牙龈卟啉单胞菌感染的风险)是指与在没有治疗的情况下形成感染的对照或基础水平相比，受试者更慢地或更低程度地形成感染。感染风险的降低可导致受试者仅显示该感染的温和的明显症状或感染症状延迟，它不暗示着一定没有任何细胞被感染性微生物(即牙龈卟啉单胞菌)侵入。
当术语“治疗”与针对既定病况的既定治疗一起使用(例如治疗由牙龈卟啉单胞菌引起的感染或疾病(症状性感染))时，其旨在表示接受治疗的受试者未显示临床上可观察水平的病况或显示比治疗前更低水平的病况。治疗可通过导致受试者显示感染的温和的明显症状来“治疗”感染或疾病，并不暗示必须已完全根除感染性微生物(即牙龈卟啉单胞菌)。
牙龈卟啉单胞菌多肽和核酸
本发明提供源自牙龈卟啉单胞菌的分离的多肽和核酸，其特别可用作免疫原性组合物中的组分和/或用作诊断牙龈卟啉单胞菌感染用试剂(例如作为探针)。本发明的优选实施方案包括一种或多种多肽PG0495、PG0654、PG1374、PG1795、PG2172、PG0613、PG1326、PG1798、PG0186和PG0616以及编码这些多肽的分离的核酸。通过对牙龈卟啉单胞菌W83菌株基因组进行候选物挖掘(mining)，随后采用实施例1中更详细描述的参数和程序从牙龈卟啉单胞菌W50菌株(ATCC 53978)中分离候选物，从而鉴定出PG0495、PG0654、PG1374、PG1795、PG2172、PG0613、PG1326、PG1798、PG0186和PG0616中的每一种。
本发明的组合物包含以下多肽中的至少一种：PG0495、PG0654、PG1374、PG1795、PG2172、PG0613、PG1326、PG1798、PG0186和PG0616。对于PG0495、PG0654、PG1374、PG1795、PG2172、PG0613、PG1326、PG 1798、PG0186和PG0616，适合使用的多肽包括全长氨基酸序列(在信号序列存在或不存在下)、和其免疫原性片段、变体(天然存在的或其它的，例如合成得到的)、和融合蛋白。
适用于本文所述组合物的PG0495多肽可分离自或源自牙龈卟啉单胞菌W83、W50和ATCC33277菌株，及任何其它表达PG0495的菌株。PG0495也被称为PGN_1476。牙龈卟啉单胞菌W83基因组中全长P0495的氨基酸序列可通过GenBank登记号AAQ65689.1而获得并且在本文序列表中将其提供为SEQ ID NO.1。用于本发明的优选P0495多肽包括与SEQ ID NO：1具有50％或更高同一性(例如60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98，99、99.5％或更高)的氨基酸序列。适用于本发明的优选多肽包括SEQ ID NO.1的至少8、9、10、12、13、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250个或更多个连续氨基酸的片段。优选的片段包含来自SEQ ID NO：1的表位。其它优选的片段缺少一个或多个来自SEQ ID NO：1的N-末端的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多个)和/或缺少一个或多个来自SEQ ID NO：1的C-末端的氨基酸而保留SEQID NO：1的至少一个表位。更优选的多肽缺少来自SEQ ID NO：1的N-末端的信号序列。
适用于本文所述组合物的PG0654多肽可分离自或源自牙龈卟啉单胞菌W83、W50和ATCC33277菌株，以及任何其它表达PG0654的菌株。PG0654也被称为PGN_0693。牙龈卟啉单胞菌W83基因组中全长P0654的氨基酸序列可通过GenBank登记号AAQ656833.1而获得并且在本文序列表中也表示为SEQ ID NO.9。用于本发明的优选的P0654多肽包括与SEQ ID NO：9具有50％或更高同一性(例如60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5％或更高)的氨基酸序列。用于本发明的优选多肽包括SEQID NO.9的至少8、9、10、12、13、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250个或更多个连续氨基酸的片段。优选的片段包括来自SEQ ID NO：9的表位。其它优选的片段缺少一个或多个来自SEQ ID NO：9的N-末端的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多个)和/或缺少一个或多个来自SEQ ID NO：9的C-末端的氨基酸而保留SEQ IDNO：9的至少一个表位。更优选的多肽缺少来自SEQ ID NO：9的N-末端的信号序列。
适用于本文所述组合物的PG1374多肽可分离自或源自牙龈卟啉单胞菌W83、W50和ATCC33277菌株，及任何其它表达PG1374的菌株。PG1374也被称为PGN_0852。牙龈卟啉单胞菌W83基因组中全长P1374的氨基酸序列可通过GenBank登记号AAQ66438.1而获得并且在本文的序列表中表示为SEQ ID NO.7。用于本发明的优选P1374多肽包括与SEQ ID NO：7具有50％或更高同一性(例如60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98，99、99.5％或更高)的氨基酸序列。优选用于本发明的多肽包括SEQ IDNO.7的至少8、9、10、12、13、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250个或更多个连续氨基酸的片段。优选的片段包括来自SEQ ID NO：7的表位。其它优选的片段缺少一个或多个来自SEQ ID NO：7的N-末端的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多个)和/或缺少一个或多个来自SEQ ID NO：7的C-末端的氨基酸而保留SEQ ID NO：7的至少一个表位。更优选的多肽缺少来自SEQ ID NO：7的N-末端的信号序列。
适用于本文所述组合物的PG1795多肽可分离自或源自牙龈卟啉单胞菌W83、W50和ATCC33277菌株，及任何其它表达PG1795的菌株。PG1795也被称为PGN_1770。牙龈卟啉单胞菌W83基因组中全长P1795的氨基酸序列可通过GenBank登记号AAQ66795.1而获得并且在本文的序列表中表示为SEQ ID NO.17。用于本发明的优选P1795多肽包括与SEQ ID NO：17具有50％或更高同一性(例如60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98，99、99.5％或更高)的氨基酸序列。优选用于本发明的多肽包括SEQ IDNO.17的至少8、9、10、12、13、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250个或更多个连续氨基酸的片段。优选的片段包括来自SEQ ID NO：17的表位。其它优选的片段缺少一个或多个来自SEQ ID NO：17的N-末端的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多个)和/或缺少一个或多个来自SEQ ID NO：17的C-末端的氨基酸而保留SEQ IDNO：17的至少一个表位。更优选的多肽缺少来自SEQ ID NO：17的N-末端的信号序列。
适用于本文所述组合物的PG2172多肽可分离自或源自牙龈卟啉单胞菌W83、W50和ATCC33277菌株，及任何其它表达PG2172的菌株。PG2172也被称为PGN_0123。牙龈卟啉单胞菌W83基因组中全长P2172的氨基酸序列可通过GenBank登记号AAQ67121.1而获得并且在本文的序列表中表示为SEQ ID NO.3。用于本发明的优选P2172多肽包括与SEQ ID NO：3具有50％或更高同一性(例如60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98，99、99.5％或更高)的氨基酸序列。优选用于本发明的多肽包括SEQ ID
NO.3的至少8、9、10、12、13、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250个或更多个连续氨基酸的片段。优选的片段包括来自SEQ ID NO：3的表位。其它优选的片段缺少一个或多个来自SEQ ID NO：3的N-末端的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多个)和/或缺少一个或多个来自SEQ ID NO：3的C-末端的氨基酸而保留SEQ ID NO：3的至少一个表位。更优选的多肽缺少来自SEQ ID NO：3的N-末端的信号序列。
适用于本文所述组合物的PG0613多肽可分离自或源自牙龈卟啉单胞菌W83、W50和ATCC33277菌株，及任何其它表达PG0613的菌株。PG0613也被称为PGN_0656。牙龈卟啉单胞菌W83基因组中全长P0613的氨基酸序列可通过GenBank登记号AAQ65797.1而获得并且在本文的序列表中表示为SEQ ID NO.11。用于本发明的优选P0613多肽包括与SEQ ID NO：11具有50％或更高同一性(例如60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98，99、99.5％或更高)的氨基酸序列。优选用于本发明的多肽包括SEQ IDNO.11的至少8、9、10、12、13、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250个或更多个连续氨基酸的片段。优选的片段包括来自SEQ ID NO：11的表位。其它优选的片段缺少一个或多个来自SEQ ID NO：11的N-末端的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多个)和/或缺少一个或多个来自SEQ ID NO：11的C-末端的氨基酸而保留SEQ IDNO：11的至少一个表位。更优选的多肽缺少来自SEQ ID NO：11的N-末端的信号序列。
适用于本文所述组合物的PG1326多肽可分离自或源自牙龈卟啉单胞菌W83，W50和ATCC33277菌株或任何其它表达PG1326的菌株。PG1326也被称为PGN_1115。牙龈卟啉单胞菌W83基因组中全长P1326的氨基酸序列可通过GenBank登记号AAQ66396.1而获得并且在本文中也表示为SEQ ID NO.5。优选用于本发明的P1326多肽包括与SEQ ID NO：5具有50％或更高同一性(例如60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5％或更高)的氨基酸序列。优选用于本发明的多肽包括SEQ ID NO.5的至少8、9、10、12、13、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250个或更多个连续氨基酸的片段。优选的片段包括来自SEQ ID NO：5的表位。其它优选的片段缺少一个或多个来自SEQ ID NO：5的N-末端的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多个)和/或一个或多个来自SEQ IDNO：5的C-末端的氨基酸而保留SEQ ID NO：5的至少一个表位。更优选的多肽缺少来自SEQ ID NO：5的N-末端的信号序列。
适用于本文所述组合物的PG1798多肽可分离自或源自牙龈卟啉单胞菌W83、W50和ATCC33277菌株或任何其它表达PG1798的菌株。PG1798也被称为PGN_1767。牙龈卟啉单胞菌W83基因组中全长P1798的氨基酸序列可通过GenBank登记号AAQ66797.1而获得并且在本文的序列表中表示为SEQ ID NO.13。优选用于本发明的P1798多肽包括与SEQ ID NO：13具有50％或更高同一性(例如60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5％或更高)的氨基酸序列。优选用于本发明的多肽包括SEQID NO.13的至少8、9、10、12、13、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250个或更多个连续氨基酸的片段。优选的片段包括来自SEQ ID NO：13的表位。其它优选的片段缺少一个或多个来自SEQ ID NO：13的N-末端的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多个)和/或一个或多个来自SEQ ID NO：13的C-末端的氨基酸而保留SEQ IDNO：13的至少一个表位。更优选的多肽缺少来自SEQ ID NO：13的N-末端的信号序列。
适用于本文所述组合物的PG0186多肽可分离自或源自牙龈卟啉单胞菌W83、W50和ATCC33277菌株或任何其它表达PG0186的菌株。PG0186也被称为PGN_0294。牙龈卟啉单胞菌W83基因组中全长P0186的氨基酸序列可通过GenBank登记号AAQ65421.1而获得并且在本文的序列表中也表示为SEQ ID NO.15。优选用于本发明的P0186多肽包括与SEQ ID NO：15具有50％或更高同一性(例如60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5％或更高)的氨基酸序列。优选用于本发明的多肽包括SEQ ID NO.15的至少8、9、10、12、13、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250个或更多个连续氨基酸的片段。优选的片段包括来自SEQ ID NO：15的表位。其它优选的片段缺少一个或多个来自SEQ ID NO：15的N-末端的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多个)和/或一个或多个来自SEQ ID NO：15的C-末端的氨基酸而保留SEQ IDNO：15的至少一个表位。更优选的多肽缺少来自SEQ ID NO：15的N-末端的信号序列。
适用于本文所述组合物的PG0616多肽可分离或源自牙龈卟啉单胞菌W83、W50和ATCC33277菌株或任何其它表达PG0616的菌株。PG0616也被称为PGN_0659。牙龈卟啉单胞菌W83基因组中全长P0616的氨基酸序列可通过GenBank登记号AAQ65800.1而获得并且在本文的序列表中也表示为ID NO.19。优选用于本发明的P0616多肽包括与SEQ ID NO：19具有50％或更高同一性(例如60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5％或更高)的氨基酸序列。优选用于本发明的多肽包括SEQID NO.19的至少8、9、10、12、13、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250个或更多个连续氨基酸的片段。优选的片段包括来自SEQ ID NO：19的表位。其它优选的片段缺少一个或多个来自SEQ ID NO：19的N-末端的氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多个)和/或一个或多个来自SEQ ID NO：19的C-末端的氨基酸而保留SEQ IDNO：19的至少一个表位。更优选的多肽缺少来自SEQ ID NO：19的N-末端的信号序列。
本发明包括编码本发明多肽的多核苷酸和在杂交条件下与编码本发明多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸以及此类多核苷酸序列的互补序列。本发明还包括与确定的参考核酸序列例如与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40中的任何一种具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的多核苷酸。根据本文公开的序列一致的分离的或合成的本发明核酸可用于牙龈卟啉单胞菌肽或多肽的重组制备。
本发明的核酸可通过采用聚合酶链式反应(PCR)(如PCR，APractical Approach″(McPherson，Quirke和Taylor主编.IRL PressOxford，UK，1991中描述的)或通过本领域技术人员公认的替代标准技术直接从牙龈卟啉单胞菌菌株(例如但不限于牙龈卟啉单胞菌W83、W50和ATCC33277菌株)以及任何其它携带可应用DNA基因序列的牙龈卟啉单胞菌菌株的DNA获得。本发明的一个实施方案提供具有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40的任何一种对应的序列的分离核酸分子。本发明包括这些序列的序列-保守变体和功能-保守变体。
本发明的多肽包括由公开的分离核酸编码的那些，包括SEQ IDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、35、37和39的多肽及其变体。包括功能-保守变体在内的本发明多肽优选对应于牙龈卟啉单胞菌上表面可接近的蛋白。
采用标准的分子生物学技术和表达系统可制备本发明多肽(参见例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Sambrook等，Cold Spring Harbor Press，2001)。例如，可分离编码免疫原性多肽的基因(或基因的片段)并且可将编码免疫原性多肽的多核苷酸克隆到任何市售表达载体(例如pBR322和pUC载体(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)或表达/纯化载体(例如GST融合载体(Pfizer，Inc.，Piscataway，N.J.，或本文实施例中描述的那些)中，随后在合适的原核、病毒或真核宿主中表达。随后纯化可通过常规方法完成，或在市售表达/纯化系统的情况下，依据制造商的说明书来完成。
或者，包括变体在内的本发明多肽可例如但不限于从野生型或突变牙龈卟啉单胞菌细胞中分离，或采用商业自动程序例如排阻固相合成、部分固相法、片段缩合(fragment condensation)或溶液合成通过化学合成分离。
本发明多肽优选具有免疫原性活性。″免疫原性活性″是指多肽引发受试者中免疫应答的能力。对多肽的免疫应答是受试者中出现对多肽的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，免疫应答包括但不限于以下作用的一种或多种：针对多肽的一个或多个表位的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞的产物。术语″表位″是指抗原上的位点，特异性B细胞和/或T细胞对其产生应答从而产生抗体。特异性B细胞和/或T细胞对该位点应答从而产生抗体。免疫原性活性可为保护性的。术语″保护性的免疫原性活性″是指多肽引发受试者中预防或抑制牙龈卟啉单胞菌感染的免疫应答的能力。
本发明的多肽可通过如下表征：分子量、质量指纹图谱、氨基酸序列、编码多肽的核酸序列、免疫活性、或两个或更多个此类特征的任何组合。通过采用常规方法包括例如凝胶过滤、凝胶电泳包括十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、毛细管电泳、质谱测定法、液相色谱(包括HPLC)和从观察或预测的氨基酸序列计算分子量可测定多肽的分子量(通常用千道尔顿(kDa)表示)。
在一个实施方案中，提供编码多肽的核酸，所述多肽例如SEQID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、35、37和39或它们变体中任一种。还提供此类序列的变体，包括它们的简并的变体。如下文更详细讨论的，在某些实施方案中，可将编码多肽和/或其片段的核酸分子插入一种或多种表达载体中。在此类实施方案中，多肽和/或片段由与氨基酸序列对应的核酸编码。编码各种氨基酸的核苷酸的特定组合是本领域熟知的，如本领域技术人员使用的各种参考文献中描述的(例如Lewin，B.GenesV，Oxford University Press，1994以及后续版本)，如下表1所示。核酸变体可使用编码目标多肽的核苷酸的任何组合。
表1
Figure BPA00001531275400151
本文描述的免疫原性多肽PG0495、PG0654、PG1374、PG1795、PG2172、PG0613、PG1326、PG1798、PG0186和PG0616包括免疫原性片段和此类多肽和/或片段的变体。变体可包含氨基酸修饰。例如氨基酸序列修饰包括取代、插入或缺失改变。只要变体具有免疫原性，取代、缺失、插入或它们的任何组合可被组合到单个变体中。插入包括单个或多个氨基酸残基的氨基和/或羧基末端融合以及序列内插入。插入通常将是比氨基或羧基末端融合的那些更小的插入例如约1至4个残基。缺失特征在于从蛋白序列中去除一个或多个氨基酸残基。通常在蛋白分子内在任何一个位点不多于约2至6个残基缺失。这些变体通常通过编码蛋白的DNA中核苷酸的定点突变，从而产生编码变体的DNA并且此后在重组细胞培养物中表达所述DNA来制备。
在已知序列的DNA中预定位点处产生取代突变的技术是熟知的并且包括但不限于M13引物诱变和PCT诱变。氨基酸取代通常是单个残基但可在许多不同的位置出现。取代变体是其中至少一个残基被去除而不同的残基插入其位置的那些。此类取代通过依据下表2来产生并且被称为保守取代(但也可能为非保守取代)。其它的是本领域技术人员熟知的。
保守氨基酸取代可包括用非天然残基取代天然氨基酸残基，使得对该位置处氨基酸残基的大小、极性、电荷、疏水性或亲水性的影响很小或无影响，并且特别地，不会导致免疫原性降低。合适的保守氨基酸取代示于表2。
表2
  原始残基   示例性的保守取代   优选的保守取代
  Ala   Val，Leu，Ile   Val
  Arg   Lys，Gln，Asn   Lys
  Asn   Gln   Gln
  Asp   Glu   Glu
  Cys   Ser，Ala   Ser
  Gln   Asn   Asn
  Glu   Asp   Asp
  Gly   Pro，Ala   Ala
  His   Asn，Gln，Lys，Arg   Arg
  Ile   Leu，Val，Met，Ala，Phe，正亮氨酸   Leu
  Leu   正亮氨酸，Ile，Val，Met，Ala，Phe   Ile
  Lys   Arg，1，4-二氨基丁酸，Gln，Asn   Arg
  Met   Leu，Phe，Ile   Leu
  Phe   Leu，Val，Ile，Ala，Tyr   Leu
  Pro   Ala   Gly
  Ser   Thr，Ala，Cys   Thr
  Thr   Ser   Ser
  Trp   Tyr，Phe   Tyr
  Tyr   Trp，Phe，Thr，Ser   Phe
  Val   Ile，Met，Leu，Phe，Ala，正亮氨酸   Leu
所选的特定氨基酸取代可取决于所选位点的位置。在某些实施方案中，编码取代的多肽和/或片段的核苷酸基于遗传密码的简并性(即与″摆动″假说一致)。当核酸是可用于在细胞(例如表达载体)中表达多肽的重组DNA分子时，摆动型取代将导致表达具有与原来由该DNA分子编码的氨基酸序列相同的多肽。然而，如上所述，取代可为保守或非保守的，或其任何组合。
采用熟知技术，技术人员将能确定本文提供的多肽和/或片段的合适变体。为鉴定在不破坏生物活性(例如免疫原性、MHC结合、红细胞(RBC)凝集、RBC溶血)的情况下可被改变的分子的合适区域，本领域技术人员可选择被认为是对于该活性不重要的区域作为目标。例如，当已知来自同一物种或来自其它物种的具有相似活性的衍生物时，本领域技术人员可将多肽的氨基酸序列与此类相似多肽比较。通过进行这样的分析，可鉴定分子的保守残基和部分。将理解的是，相对于这类相似衍生物不保守的分子区域中的变化将不太可能负面影响多肽的生物活性和/或结构。然而，在大多数情况下导致与MHC的结合下降的修饰是不合适的。本领域技术人员还将知道，甚至在相对保守区域，可用化学上类似的氨基酸取代天然存在的残基而保留该多肽和/或片段的所需特征。因此，甚至可对可能对生物活性或结构重要的区域进行保守氨基酸取代而不破坏衍生物的生物活性或不负面影响衍生物的结构。
类似物在氨基酸序列方面和/或因非序列修饰而可与天然存在的牙龈卟啉单胞菌多肽不同。非-序列修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、羧化或糖基化的变化。本发明多肽的″修饰″包括在一个或多个成分氨基酸处通过化学或酶促衍生的多肽(或其类似物，例如其片段)。此类修饰可包括例如侧链修饰、主链修饰、以及N-和C-末端修饰例如乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化、和糖类或脂质部分、辅因子等的连接，以及它们的组合。本发明经修饰多肽可保留未修饰多肽的生物活性或可显示降低或增加的生物活性。
多肽序列相似性和多肽序列同一性
两条多肽的结构相似性可通过对两条多肽(例如候选多肽和例如SEQ ID NO：1的多肽)的残基进行比对，以优化沿其序列长度的相同氨基酸数目；在比对中，序列之一或两者允许存在空位以优化相同氨基酸的数目，但每一序列中的氨基酸必须仍保持它们固有的次序。候选多肽是与参考多肽比较的多肽。候选多肽可例如从微生物(例如牙龈卟啉单胞菌)分离，或可采用重组技术制备，或可化学或酶促合成。
氨基酸序列的配对比较分析可采用全局算法例如Needleman-Wunsch来进行。或者，对多肽进行比较可采用局部比对算法例如BLAST 2搜索算法的Blastp程序，如由Tatiana等，(FEMS Microbiol.Lett，174：247-250(1999)描述的，并且可从美国生物技术信息中心(NCBI)网站上获得。可使用所有BLAST 2搜索参数的默认值，包括矩阵＝BLOSUM62；开放空位罚分(open gap penalty)＝11，延伸空位罚分(extension gap penalty)＝1，空位x dropoff＝50，期望10，字长＝3，以及过滤器开启(filter on)。Smith和Waterman算法是另一可用的局部比对工具(1988)。
在两个氨基酸序列的比较中，结构相似性可称为百分比″同一性″或可称为百分比″相似性″。″同一性″是指存在相同氨基酸。除非另有说明，否则术语″百分比同一性″意指采用全局算法对两个氨基酸进行配对比分析。″相似性″是指不仅存在相同氨基酸而且还存在保守取代。如表2所示，本发明多肽中氨基酸的保守取代可选自氨基酸所属类别的其它成员。
本发明的多肽可包括与参考氨基酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的多肽。
融合
在其它实施方案中，本文描述的多肽和/或片段可包括辅助纯化或检测该多肽的融合多肽片段。融合可在其受试者多肽变体的氨基末端或在羧基端处产生。融合可在没有接头或衔接分子下进行，或可通过接头或衔接分子进行。接头或衔接分子可为一个或多个氨基酸残基，通常为约20至约50氨基酸残基。还可将接头或衔接分子设计为具有DNA限制性内切酶或蛋白酶的切割位点以允许分离融合部分。将理解的是，融合多肽一旦构建，其就可依据本文所述方法得到。合适的融合区段特别包括金属结合结构域(例如多组氨酸片段)、免疫球蛋白结合结构域(即蛋白A、蛋白G、T细胞、B细胞、Fc受体或补体蛋白抗体结合结构域)、糖结合结构域(例如麦芽糖结合结构域)、和/或″标签″结构域(即半至少一部分乳糖苷酶、strep标签肽、T7标签肽、FLAG肽或其它结构域(使用与该结构域结合的化合物例如单克隆抗体可将其纯化))。在表达多肽时，该标签通常与多肽融合，并且可作为从宿主细胞亲和纯化目标多肽序列的手段。例如可通过使用针对标签的抗体作为亲和基质的柱色谱完成亲和纯化。任选地，随后可通过多种方法将标签从纯化的目标多肽序列除去，例如使用某些用于切割的肽酶。本文提供在N-末端处连接有区段/结构域以辅助纯化的融合蛋白实例(参见例如SEQ ID NO：21、23、25、27、29、31、35、37和39)。
在某些实施方案中，多肽和/或片段可用使其可被检测的方式直接或间接(即使用抗体)标记或加标签。标记包括荧光染料例如荧光素、罗丹明、藻红蛋白、铕和德克萨斯红、显色染料例如二氨基联苯胺、放射性同位素、大分子胶粒或微粒材料例如着色的、磁性的或顺磁性的胶乳珠、结合剂例如生物素和洋地黄毒苷，以及可直接或间接产生可检测信号的生物或化学活性剂以便在例如FACS、ELISA、蛋白印迹、TRFIA、免疫组织化学、evanescence、Luminex珠阵列或试纸条或其它侧向层析测定(lateral flow assay)形式中肉眼观察到、电子检测或其它方式记录。用于此类方法中的合适抗体-结合分子可包括免疫球蛋白-结合抗体，例如抗-人Ig抗体、抗-人Ig抗体、特异性针对Ig同种型或对IgG亚类，或针对牙龈卟啉单胞菌蛋白的抗-人抗体。
优选的荧光标签蛋白包括源自水母蛋白被称为绿色荧光蛋白(GFP)的那些。以下出版物中给出了有关GFP和其它荧光团的进一步信息：Tsien R Y，″The Green Fluorescent Protein″Annual Reviews ofBiochemistry 1998；67：509-544 Verkhusha，V和Lukyanov，K.″TheMolecular Properties and Applications of Anthoza Fluorescent Proteinsand Chromophores″Nature Biotechnology 2004；22：289-296。编码一系列荧光标签蛋白的质粒载体可从多个供应商市售得到，包括从Clontech Laboratories，Inc可市售得到的一系列″Living Colours&#8482Fluorescent Proteins″。类似载体还可获自其它供应商，包括Invitrogen和Amersham Biosciences。衍生自GFP的合适荧光蛋白为红移变体EGFP、青移变体ECFP以及黄移变体EYFP。作为荧光标记优选EGFP，因为其提供明亮荧光并且对靶抗原的抗原性质影响极小。替代的荧光标记蛋白可通过市售得到。还可利用包括酶(例如其催化显色或变色反应或导致电性改变)在内的生物或化学活性剂。它们可在分子上被激发，使得能态之间的电子跃迁产生特征性的光谱吸收或发射。它们可包括与生物传感器联合使用的化学实体。可采用生物素/抗生物素蛋白或生物素/链霉抗生物素和碱性磷酸酶检测系统。进一步的实例包括辣根过氧化物酶和化学发光。在一些实施方案中，可使用与所述非-固定的抗体-结合分子或多肽结合的抗体，检测所述非-固定的抗体-结合分子或多肽。合适的检测抗体可用荧光标记。标记可为荧光标记(标签)，其用于直接标记靶抗原使得抗原和荧光标记形成融合蛋白。
若生物样品中存在针对靶抗原的抗体，则该抗原可用与这些抗体结合的标签标记，并且采用免疫沉淀来检测由此形成的复合物。随后可使用与标签相关的荧光来确定蛋白已被沉淀(定性测定)或确定沉淀的蛋白的量(定量测定)。例如，可在4℃使荧光标签的抗原的可溶提取物与患者血清孵育一段合适的时间例如过夜(通常10-15μl血清至300-500μl提取物或更少)以让抗体与该抗原结合。接着将用低IgG胎牛血清(Sigma)预孵育以封闭非特异性结合的蛋白A或蛋白G琼脂糖珠加入包含标签蛋白/抗体复合物的提取液/血清混合物中，并通过在室温轻轻旋转1-2小时混合。血清内的抗体(包括特异性结合标签蛋白的那些)被蛋白A/G珠结合。随后在合适缓冲液(通常10mMTris-HCl，pH 7.4，100mM NaCl/ImM EDTA/1％Triton X-100)中洗涤蛋白A/G琼脂糖珠以除去任何未结合的加标签的蛋白。这可通过三轮离心、移除上清液和重悬于缓冲液中来实现。接着，收集这些珠子(一些连接有标签蛋白)并放入荧光分析仪，例如来自MolecularDevices Inc的Spectra Max Gemini XS酶标仪(plate reader)中。对原血清样品中存在的特异性自身抗体/抗体进行定量。在GFP的情况下，使用波长为472nm的激发和波长为512nm的发射。荧光激发将取决于使用的发色团/标签，但可能同时结合几种不同的标签蛋白。例如，可将不同牙龈卟啉单胞菌多肽(和/或其片段)单独加标签并单独或同时测定。该方法的灵敏度取决于检测装置且可通过使用更灵敏的检测装置而极大地增强。还可使用这些方法的各种变化形式。
本文中描述的用于检测与牙龈卟啉单胞菌抗原具有免疫反应性的抗体的测定还可与可用于检测牙龈卟啉单胞菌感染的其它测定结合。例如，这些测定(即ELISA)可与用于检测生物样品中牙龈卟啉单胞菌核酸的聚合酶链式反应(PCR)测定结合。或者，ELISA测定可与免疫沉淀测定结合，或基于PCR的测定可与免疫沉淀测定结合。本文中描述的各种测定方法可结合用于甚至更进一步提高检测的灵敏度并进一步降低数据的阴性预测值。
表达载体
本发明还提供表达载体的应用。表达载体通常由与编码多肽的异源核酸序列(“编码序列”)有效连接的旁侧序列组成。在其它实施方案中，或与这类实施方案的组合中，旁侧序列优选能影响编码序列的复制、转录和/或翻译且与编码序列有效连接。“有效连接”表明该核酸序列被配置成能执行其通常功能。例如，当启动子能引导编码序列的转录时，该启动子与该编码序列有效连接。可存在的启动子元件包括与编码多肽的核苷酸序列天然连接的那些以及不与核苷酸序列连接的外源性元件。
旁侧序列不必与编码序列邻接，只要它能恰当地起作用即可。因此，例如未翻译但已转录的间插序列可存在于启动子序列和编码序列之间，仍可认为该启动子序列与该编码序列有效连接。旁侧序列可为同源的(即来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)、异源的(即来自与宿主细胞物种或菌株不同的物种)、杂合的(即来自超过一个来源的旁侧序列的组合)或合成的。旁侧序列还可为如下的序列：其正常起作用以调节在也可使用的宿主基因组中编码多肽的核苷酸序列的表达。
还提供包含载体的培养细胞。培养细胞可为用载体转染的培养细胞或细胞的子代，其中所述细胞表达免疫原性多肽。合适的细胞系对本领域技术人员而言是已知的并且可市售得到，例如通过美国典型培养物保藏中心(ATCC)。牙龈卟啉单胞菌核苷酸序列可在多种表达系统中表达，例如使用哺乳动物细胞、杆状病毒、植物、细菌和酵母的那些。转染的细胞可用于制备免疫原性多肽的方法中。方法包括在允许多肽表达的条件下，任选在表达序列的控制下培养包含载体的细胞。可使用标准蛋白纯化方法将多肽从细胞或培养基中分离。
递送技术
在某些实施方案中，优选旁侧序列是驱动靶细胞中高水平基因表达的转录调节区域。转录调节区域可包括例如启动子、增强子、沉默基因、阻抑元件或其组合。转录调节区域可为组成型或组织或细胞型特异性的(即该区域在一类组织或细胞中驱动比在另一组织或细胞中更高的转录水平)。同样地，转录调节区域的来源可为任何原核生物或真核生物，任何脊椎或无脊椎生物，或任何植物，条件是旁侧序列在宿主细胞体系中有功能且可被宿主细胞体系激活。可使用很多种转录调节区域。
合适的转录调节区域尤其包括CMV启动子(即，CMV即时早期启动子)；来自真核基因(即雌激素可诱导的鸡卵清蛋白基因、干扰素基因、糖皮质素可诱导的酪氨酸转氨酶基因和胸苷激酶基因)的启动子；和主要的早期和晚期腺病毒基因启动子；SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290：304-10)；劳斯肉瘤病毒(RSV)的3’长末端重复序列(LTR)中包含的启动子(Yamamoto等人，1980，Cell 22：787-97)；单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子(Wagner等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-45)；金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等人，1982，Nature 296：39-42)；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75：3727-31)；或tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：21-25)等。组织和/或细胞类型特异性转录控制区域，包括例如在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区域(Swift等人，1984，Cell 38：639-46；Ornitz等人，1986，Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.50：399-409(1986)；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区域(Hanahan，1985，Nature 315：115-22)；在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区域(Grosschedl等人，1984，Cell 38：647-58；Adames等人，1985，Nature 318：533-38；Alexander等人，1987，Mol.Cell.Biol.，7：1436-44)；睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区域(Leder等人，1986，Cell 45：485-95)；肝中的白蛋白基因控制区域(Pinkert等人，1987，Genes and Devel.1：268-76)；肝中的甲胎蛋白基因控制区域(Krumlauf等人，1985，Mol.Cell.Biol.，5：1639-48；Hammer等人，1987，Science 235：53-58)；肝中的α1-抗胰蛋白酶基因控制区域(Kelsey等人，1987，Genes and Devel.1：161-71)；髓样细胞中的β-球蛋白基因控制区域(Mogram等人，1985，Nature 315：338-40；Kollias等人，1986，Cell 46：89-94)；脑内少突胶质细胞中的髓鞘碱性蛋白基因控制区域(Readhead等人，1987，Cell 48：703-12)；骨骼肌中的肌球蛋白轻链-2基因控制区域(Sani，1985，Nature 314：283-86)；和下丘脑中的促性腺激素释放激素基因控制区域(Mason等人，1986，Science 234：1372-78)，和黑素瘤细胞中的酪氨酸酶启动子(Hart，I.Semin Oncol 1996Feb；23(1)：154-8；Siders等人.Cancer Gene Ther 1998 Sep-Oct；5(5)：281-91)。本领域已知其它合适的启动子。
可将核酸分子作为病毒或非病毒载体的一部分给药。在一个实施方案中，DNA载体可用于将编码靶免疫原和/或相关分子(即，共刺激分子、细胞因子或趋化因子)的核酸递送至患者。在此过程中，可应用各种策略来提高这种机理的效能，包括例如使用自复制病毒复制子(Caley等人.1999.Vaccine，17：3124-2135；Dubensky等人.2000.Mol.Med.6：723-732；Leitner等人.2000.Cancer Res.60：51-55)、密码子优化(Liu等人.2000.Mol.Ther.，1：497-500；Dubensky，同上；Huang等人.2001.J.Virol.75：4947-4951)、体内电穿孔(Widera等人.2000.J.Immunol.164：4635-3640)、引入编码共刺激分子、细胞因子和/或趋化因子的核酸(Xiang等人.1995.Immunity，2：129-135；Kim等人.1998.Eur.J.Immunol.，28：1089-1103；Iwasaki等人.1997.J.Immunol.158：4591-3601；Sheerlinck等人.2001.Vaccine，19：2647-2656)、引入刺激基序例如CpG(Gurunathan，同上；Leitner，同上)、用于靶向胞吞或泛素加工途径的序列(Thomson等人.1998.J.Virol.72：2246-2252；Velders等人.2001.J.Immunol.166：5366-5373)、初免-加强(prime-boost)方案(Gurunathan，同上；Sullivan等人.2000.Nature，408：605-609；Hanke等人.1998.Vaccine，16：439-445；Amara等人.2001.Science，292：69-74)、对蛋白酶体敏感的切割位点和使用粘膜递送载体例如沙门氏菌(Darji等人.1997.Cell，91：765-775；Woo等人.2001.Vaccine，19：2945-2954)。其它方法在本领域中是已知的，下文将对其中的一些进行描述。
已被成功地用于将核酸引入宿主的各种病毒载体包括反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒和痘病毒等。本领域理解的是，许多此类病毒载体在本领域中是可获得的。可使用本领域技术人员普遍可获得的标准重组技术构建载体。这类技术可参见通常的分子生物学文献例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Sambrook等人，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)、GeneExpression Technology(Methods in Enzymology，第185卷，D.Goeddel编辑，1991.Academic Press，San Diego，CA)和PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications (Innis等人.1990.Academic Press，San Diego，CA)。
优选的反转录病毒载体是慢病毒的衍生物以及鼠或鸟类反转录病毒的衍生物。合适的反转录病毒载体的实例包括，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、SIV、BIV、HIV和劳斯肉瘤病毒(RSV)。许多反转录病毒载体可结合多个外源核酸序列。由于重组反转录病毒是有缺陷的，它们需要帮助以产生感染性的载体颗粒。这种帮助可由例如编码反转录病毒结构基因的辅助细胞系提供。合适的辅助细胞系包括PA317和PA12等。然后可将使用这类细胞系产生的载体病毒体用于感染组织细胞系，如NIH 3T3细胞，以产生大量嵌合反转录病毒体。可通过传统方法(即注射)或通过在邻近靶细胞群处植入“生产细胞系”给予反转录病毒载体(Culver，K.等人，1994，Hum.Gene Ther.，5(3)：343-79；Culver，K.等人，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.，59：685-90)；Oldfield，E.，1993，Hum.Gene Ther.，4(1)：39-69)。将该生产细胞系经工程改造以产生病毒载体并在靶细胞附近释放病毒颗粒。一部分释放的病毒颗粒接触靶细胞并感染那些细胞，从而将核酸递送至靶细胞。靶细胞感染之后，载体的核酸进行表达。
已证明腺病毒载体特别可用于将基因转移到真核细胞中(Rosenfeld，M.等人，1991，Science，252(5004)：431-3；Crystal，R.等人，1994，Nat.Genet.，8(1)：42-51)、真核基因表达的研究(Levrero，M.等人，1991，Gene，101(2)：195-202)、疫苗开发(Graham，F.和Prevec，L.，1992，Biotechnology，20：363-90)和用于动物模型中(Stratford-Perricaudet，L.等人，1992，Bone Marrow Transplant.，9(Suppl.1)：151-2；Rich，D.等人，1993，Hum.Gene Ther.，4(4)：461-76)。将重组Ad给予体内不同组织的实验方法包括气管内滴注(Rosenfeld，M.等人，1992，Cell，68(1)：143-55)、注射入肌肉(Quantin，B.等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89(7)：2581-3)、外周静脉注射(Herz，J.和Gerard，R.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90(7)：2812-6)和立体定位接种至脑(Le Gal La Salle，G.等人，1993，Science，259(5097)：988-90)等。
腺伴随病毒(AAV)显示高水平的感染性、广谱宿主范围和整合入宿主细胞基因组的特异性(Hermonat，P.等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81(20)：6466-70)。并且1型单纯疱疹病毒(HSV-1)也是另一受青睐的载体体系，由于其向神经性质而尤其用于神经系统中(Geller，A.等人，1991，Trends Neurosci.，14(10)：428-32；Glorioso等人，1995，Mol.Biotechnol.，4(1)：87-99；Glorioso等人，1995，Annu.Rev.Microbiol.，49：675-710)。
痘病毒是另一有用的表达载体(Smith等人.1983，Gene，25(1)：21-8；Moss等人，1992，Biotechnology，20：345-62；Moss等人，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：25-38；Moss等人.1991.Science，252：1662-1667)。表明有用的痘病毒除包括牛痘、NYVACTM、禽痘(avipox)、禽痘(fowlpox)、金丝雀痘、ALVACTM和ALVAC(2)等。
NYVACTM(vP866)通过编码已知或潜在毒力因子的基因组的6个非必需区的缺失而衍生自牛痘病毒的哥本哈根疫苗株(参见例如美国专利No.5,364,773和5,494,807)。还将缺失基因座工程改造为接受者基因座以插入外源基因。缺失的区域为：胸苷激酶基因(TK；J2R)vP410；出血区域(u；B13R+B14R)vP553；A型包含体区域(ATI；A26L)vP618；血凝素基因(HA；A56R)vP723；宿主范围基因区域(C7L-K1L)vP804；和大亚基核苷酸还原酶(I4L)vP866。NYVACTM是通过编码与毒力和宿主范围有关的基因产物的18个开放阅读框的具体缺失而产生的遗传工程改造牛痘病毒株。NYVACTM已表明可用于表达TA(参见例如美国专利No.6,265,189)。还根据布达佩斯条约的条款将NYVACTM(vP866)、vP994、vCP205、vCP1433、placZH6H4Lreverse、pMPC6H6K3E3和pC3H6FHVB  保藏于ATCC，登记号分别为VR-2559、VR-2558、VR-2557、VR-2556、ATCC-97913、ATCC-97912和ATCC-97914。
基于ALVAC的重组病毒(即ALVAC-1和ALVAC-2)也适合使用(参见例如美国专利No.5,756,103)。ALVAC(2)等同于ALVAC(1)，不同之处在于ALVAC(2)基因组包含受牛痘启动子控制的牛痘E3L和K3L基因(美国专利No.6,130,066；Beattie等人，1995a，1995b，1991；Chang等人，1992；Davies等人，1993)。ALVAC(1)和ALVAC(2)都已证实可用于表达外源DNA序列，例如TA(Tartaglia等人，1993a，b；美国专利No.5,833,975)。根据布达佩斯条约的条款ALVAC已被保存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209，USA，ATCC登记号VR-2547。
另一有用的痘病毒载体是TROVACTM载体。TROVACTM是指衍生自禽痘病毒的FP-1疫苗株的斑克隆分离物的减毒禽痘，其已被批准用于接种1天龄鸡。根据布达佩斯条约的条款TROVACTM载体样品被保藏于ATCC，登记号2553。
“非病毒”质粒载体也可适合于某些实施方案中。优选的质粒载体与细菌、昆虫和/或哺乳动物宿主细胞相容。这类载体包括，例如PCR-II、pCR3和pcDNA3.1(Invitrogen，San Diego，CA)、pBSII(Stratagene，La Jolla，CA)、pET15(Novagen，Madison，WI)、pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)、pEGFP-N2(Clontech，Palo Alto，CA)、pETL(Bluebacii，Invitrogen)、pDSR-α(PCT公布号WO 90/14363)和pFastBacDual(Gibco-BRL，Grand Island，NY)及Bluescript
Figure BPA00001531275400281
质粒衍生物(高拷贝数COLE1基噬菌粒，StratageneCloning Systems，La Jolla，CA)、设计来克隆Taq扩增PCR产物的PCR克隆质粒(例如，TOPOTM TA cloning
Figure BPA00001531275400282
试剂盒，PCR2.1
Figure BPA00001531275400283
质粒衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)。还可使用细菌载体。这些载体包括，例如志贺氏菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、乳酸杆菌、卡介苗(BCG)和链球菌(参见例如WO 88/6626；WO 90/0594；WO91/13157；WO 92/1796；和WO 92/21376)。许多其它非病毒质粒表达载体和体系在本领域中是已知的并且可使用。
其它递送技术也可满足需要，包括例如DNA-配体复合物、腺病毒-配体-DNA复合物、DNA的直接注射、CaPO4沉淀、基因枪技术、电穿孔和胶态分散体系。胶态分散体系包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和包含水包油乳液的基于脂质的体系、微团、混合微团和脂质体。优选的胶态体系为脂质体，其为可用作体外和体内递送载体的人工膜小泡。RNA、DNA和完整病毒体可被囊封入水性内部并可以生物活性形式递送至细胞(Fraley，R.等人，1981，Trends Biochem.Sci.，6：77)。脂质体的组合物通常是磷脂(尤其高相变温度磷脂)的组合，其通常与类固醇(尤其胆固醇)组合。还可使用其它磷脂或其它脂质。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在情况。可用于脂质体制备的脂质的实例包括磷脂酰化合物，例如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。特别有用的是二酰基磷脂酰甘油，其中脂质部分包含14-18个碳原子，特别为16-18个碳原子，且是饱和的。说明性的磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。牙龈卟啉单胞菌多肽-特异性抗体
本公开还涉及使用PG0495、PG0654、PG1795、PG2172、PG0613、PG1326、PG1798、PG0186或PG0616或它们的片段或变体中之一而生成的抗体，优选保护性和/或中和抗体，其中所得抗体对牙龈卟啉单胞菌多肽和/或其片段或变体具有反应性，或与其特异性结合。还提供引发产生抗体的方法，抗体可为保护性的和/或中和的，并且对牙龈卟啉单胞菌多肽和/或其片段具有反应性。抗体可引发主动和被动免疫两者。多肽和/或其片段还可用于鉴定和分离抗体，其可为保护性的和/或中和的，并且可与由天然牙龈卟啉单胞菌蛋白引发的那些起交叉反应。
优选地，纯化的抗体与至少约60％、75％、80％、85％、90％或95％的蛋白分离，所述蛋白最初与所述抗体共存。如本领域已知的，合适的衍生物可包括片段(即Fab、Fab2或单链抗体例如Fv)。抗体可为任何合适的来源或形式，包括例如鼠类(即由鼠类杂交瘤细胞产生)，或表达为人源化抗体、嵌合抗体、人抗体等。
制备和使用各种类型的抗体的方法对本领域技术人员而言是熟知的且将是适合使用的(参见例如，Harlow等人.Antibody：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；Harlow等人.UsingAbtibidues：A Laboratory Manual，Portable Protocol No.1，1998；Kohlerand Milstein，Nature，256：495(1975))；Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-329(1988)；Presta(Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)；Verhoeyen等人(Science，239：1534-1536(1988)；Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581(1991)；Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等人，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)；Marks等人，Bio/Technology 10，779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368 856-859(1994)；Morrison，Nature 368 812-13(1994)；Fishwild等人，NatureBiotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14，826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)；以及美国专利No.4,816,567；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016)。在某些应用中，抗体可包含于杂交瘤上清液或腹水中且原样直接使用或使用标准技术浓缩后使用。在其它应用中，可使用例如如下方法将抗体进一步纯化：盐分馏和离子交换色谱，或使用与固体载体例如琼脂糖珠共价偶联的蛋白A、蛋白G、蛋白A/G和/或蛋白L配体的亲和色谱，或这些技术的组合。抗体可以任何合适的形式(包括作为冷冻制品(即约-20℃或-70℃)、以冻干形式)或在一般冷藏条件(例如约4℃)下保存。当以液体形式保存时，优选使用合适缓冲液如Tris缓冲盐水(TBS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。抗体及其衍生物可加入本文所述的组合物中作体外或体内使用。本领域技术人员可用的制备和使用抗体的其它方法可能也适合使用。
组合物
公开的多肽和编码这些多肽的核酸可特别用作免疫原性组合物(也称为免疫组合物)例如疫苗组合物中的组分。免疫原性组合物是这样的组合物：将其给予受试者(例如哺乳动物)时，可诱导或增强针对组合物中包含的抗原(或免疫原)的免疫应答。该应答可包括抗体的产生(例如通过刺激B细胞)或基于T细胞的应答(例如细胞溶解应答)。这些应答可为或可不为保护性的或中和性的。保护性或中和性的免疫应答是这样的应答：其对抗原相应的的感染性生物(即抗原的来源)有害而对宿主有益(例如通过降低或防止感染)。本文所用的保护性或中和抗体可对相应野生型牙龈卟啉单胞菌抗原或其片段(多肽(或其片段)的来源)具有反应性并且当在动物中试验时降低或抑制相应牙龈卟啉单胞菌抗原的致死率。在给予受试者时导致保护性或中和性免疫应答的免疫原性组合物可被认为是疫苗。疫苗组合物可作为预防和/或治疗目的。包含一种或多种本发明牙龈卟啉单胞菌多肽(抗原)的免疫原性组合物(例如疫苗)可用于治疗和/或预防牙周疾病，例如牙周炎和龈炎。免疫应答不需要提供针对疾病的完全保护和/或治疗。
本发明免疫原性组合物的优选实施方案包括含有一种或多种以下蛋白的组合物：PG0495、PG0654、PG1374、PG1795、PG2172、PG0613、PG1326、PG1798、PG0186和PG0616。更优选的实施方案是包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、32、34、36、38、40、42、44、46、48和50具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽的免疫原性组合物。
本发明组合物的某些实施方案在实施例6中描述。优选的本发明预防性组合物是当给予动物时其引发Th2-抗体偏袒应答(biasedresponse)的那些；这种应答与预防性牙槽骨丢失小鼠模型中的保护作用相关(J.Immunol.2008年9月15日；181(6)：4150-8)。
本发明的组合物(例如疫苗组合物)可在佐剂存在或不存在下给予。佐剂通常为可增强抗原的免疫原性的物质。佐剂可在获得性免疫和先天性免疫中起作用并且可以多种方式起作用，但并非这些中的所有均被理解。
本文描述的组合物和方法中还可包含佐剂以刺激或增强免疫应答。合适类型的佐剂的非限定性实例包括凝胶型[即氢氧化铝、磷酸铝(“铝佐剂”)、磷酸钙、微生物起源物(胞壁酰二肽(MDP)]、细菌外毒素[例如霍乱毒素(CT)、天然霍乱毒素B亚基(CTB)、大肠杆菌不稳定毒素(LT)、百日咳毒素(PT)、CpG寡核苷酸、BCG序列、破伤风类毒素、单磷酰脂质A(MPL)(例如大肠杆菌、明尼苏达沙门氏菌(Salmonella Minnesota)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimitriitm)或Shigella exseri的单磷酰脂质A)]；微粒佐剂(生物可降解的、聚合物微球)；免疫刺激复合物(ISCOM))、油乳液和基于表面活性剂的佐剂[弗氏不完全佐剂(FIA)；微流体化乳液(MF59，SAF)、皂角苷(QS-21)]、合成胞壁酰肽衍生物(莫拉丁酯，threony-MDP)、非离子嵌段共聚物(L121)、聚磷嗪(PCCP)、合成多核苷酸(聚A:U、聚I:C)、沙利度胺衍生物(CC-4407/ACTIMID))、RH3-配体或聚丙交酯-乙交酯(PLGA)微球等。所述这些毒素中任何的片段、同系物、衍生物及融合物也是合适的，条件是它们保留佐剂活性。佐剂的合适突变体或变体描述于例如WO 95/17211(Arg-7-Lys CT突变体)、WO96/6627(Arg-192-Gly LT突变体)和WO 95/34323(Arg-9-Lys和Glu-129-Gly PT突变体)中。可使用的其它LT突变体包括例如Ser-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-110-Asp和Glu-112-Asp突变体。
铝盐佐剂(或化合物)是实施本发明中使用的佐剂之一。使用的铝盐佐剂的实例包括氢氧化铝(例如结晶碱式氢氧化铝AlO(OH)和氢氧化铝Al(OH)3。在具体的实施方案，铝佐剂是碱式氢氧化铝(例如Alhydrogel)。本领域熟知的是，不应将含铝盐佐剂的组合物暴露于极端温度下，即低于冰点(0℃)或极热(例如≥70℃)，因为这种暴露可负面影响吸附的抗原和佐剂两者的稳定性和免疫原性。
金属盐佐剂例如铝佐剂在本领域中熟知作为提供具有佐剂活性的安全赋形剂。认为这些佐剂的作用机理包括形成抗原贮库制剂使得抗原可在给药后在注射部位保留长达3周，以及还形成更容易被抗原呈递细胞吸收的抗原/金属盐复合物。除了铝以外，还已使用其它金属盐来吸附抗原，包括锌、钙、铈、铬、铁和铍的盐。铝的氢氧化物和磷酸盐是最常见的。包含铝盐、抗原和其它免疫刺激剂的制剂或组合物在本领域中是已知的。免疫刺激剂的实例是3-de-O-乙酰化的单磷酰脂质A(3D-MPL)。另一实例是产品E6020(具有CAS号287180-63-6)。在某些实施方案中，组合物包括氢氧化铝和E6020。US2007/0082875(其通过引用以其整体结合到本文中)中描述了产品E6020。
在佐剂免疫的一个实施方案中，例如，多肽和/或其片段可与细菌多糖共价偶联以形成多糖缀合物。这类缀合物可用作免疫原，用于引发针对与多肽和/或其片段缀合的细菌多糖的T细胞依赖性免疫原性应答。
一种或多种细胞因子也可为合适的共刺激组分，与本发明组合物一起使用(作为多肽或被核酸编码的)(Parmiani等人.Immunol Lett2000年9月15日；74(1)：41-3；Berzofsky等人.Nature Immunol.1：209-219)。合适的细胞因子包括，例如白介素-2(IL-2)(Rosenberg等人.Nature Med.4：321-327(1998))、IL-4、IL-7、IL-12(Pardoll综述，1992；Harries等人.J.Gene Med.20007月-8月；2(4)：243-9；Rao等人.J.Immunol.156：3357-3365(1996))、IL-15(Xin等人.Vaccine，17：858-866，1999)、IL-16(Cruikshank等人.J.Leuk Biol.67(6)：757-66，2000)、IL-18(J.Cancer Res.Clin.Oncol.2001.127(12)：718-726)、GM-CSF(CSF(Disis等人.Blood，88：202-210(1996))、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(INF-γ)。如本领域中已知的，其它细胞因子也可适合使用。
在某些实施方案中，在包含水包油乳剂的佐剂存在下给予组合物，所述乳剂至少包含角鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂、疏水性非离子表面活性剂，其中所述水包油乳剂可通过相转变温度过程而获得并且其中占总数90％体积的油滴尺寸小于200nm，并且任选地小于150nm。这样的佐剂描述于WO2007006939(Vaccine Composition Comprising a ThermoinversableEmulsion)中，该专利以其整体结合到本文中。除所述角鲨烯水包油乳剂之外，或代替所述角鲨烯水包油乳剂，组合物可包含产品E6020(具有CAS号287180-63-6)。
在某些实施方案中，组合物包含TLR激动剂(例如TLR4激动剂)，单独或与佐剂组合。例如佐剂可包含TLR4激动剂(例如TLA4)、角鲨烯、水性溶剂、属于聚氧乙烯烷基醚化学基团的非离子亲水性表面活性剂，和非离子疏水性表面活性剂并且可以是热致可逆的。此类佐剂的实例描述于WO2007080308(Thermoreversible Oil-in-Water Emulsion)中并且该专利以其整体结合到本文中。在一个实施方案中，组合物用CpG和铝盐佐剂(例如氢氧化铝)的组合佐剂化。
药物制剂
本发明的组合物优选以液体的形式，但它们也可为冻干的(依据标准方法)或泡沫干燥的(如WO2009012601中描述的，Antigen-Adjuvant Compositions and Methods)。本发明一个实施方案的组合物为液体形式。免疫剂量可按0.5至1.0ml的体积配制。液体制剂可为任何适用于给药的形式包括例如溶液或混悬液。
本发明组合物的药物制剂还可任选包括″药学上可接受的载体″。术语″药学上可接受的载体″是指不是生物学上或其它方面不合乎需要的材料(即可将该材料给予受试者，而不产生任何不合乎需要的生物学作用或不以有害的方式与包含该材料的药物组合物的任何其它组分相互作用)。如本领域技术人员熟知的，容易选定载体以使活性成分(例如免疫原性多肽)的降解最小化并且使受试者中任何不利的副作用最小化。
合适的载体及其制剂描述于Remington：The Science and Practiceof Pharmacy，第21版，David B.Troy编辑，Lippicott Williams和Wilkins(2005)。通常，将合适量的药学上可接受的盐用于制剂中来使制剂等渗。药学上可接受的载体的实例包括但不局限于无菌水、盐水、缓冲溶液(如林格氏液)和葡萄糖溶液。溶液的pH通常为约5-约8或约7-约7.5。其它载体包括缓释制剂例如包含多肽或其片段的固体疏水聚合物的半透基质。基质可为成型的制品形式，例如薄膜、脂质体或微粒。对本领域技术人员将显然的是，根据例如给药途径和所给予组合物的浓度，某些载体可能是更优选的。载体是适合于将多肽和/或其片段给予人或其它受试者的那些。
本发明组合物的药物制剂还可任选包含一种或多种本领域熟知的赋形剂(例如稀释剂、增稠剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、洗涤剂和/或免疫刺激剂)。如本领域熟知的，合适的赋形剂将与组合物中存在的抗原以及任何佐剂相容。稀释剂的实例包括粘合剂、崩解剂或分散剂例如淀粉、纤维素衍生物、酚、聚乙二醇、丙二醇或甘油。洗涤剂的实例包括吐温(聚山梨酯)例如吐温80。药物组合物还可包括一种或多种活性成分例如抗微生物剂、抗炎剂和麻醉剂。用于包含在本发明组合物中的合适赋形剂是本领域已知的。
可将组合物配制成口服使用，例如但不限于作为牙膏、牙粉、液态洁牙剂、牙龈乳膏剂(gingival cream)、凝胶剂、胶囊剂、锭剂和咀嚼用口胶剂。
组合物可呈试剂盒形式，其包括组合物和使用说明书。在一个实例中，组合物存在于试剂盒中，其包含组合物和赋形剂或复溶溶液(包含一种或多种药学上可接受的稀释剂)以帮助组合物的复溶，以采用常规或其它设备给予哺乳动物。这种试剂盒可任选包括用于给予液体形式组合物的器械(例如皮下注射器、微针阵列)和/或使用说明书。
使用方法
本发明的预防性和治疗性方法涉及在例如进行治疗本身的过程中，在预防后续感染中，或在制备后续用于被动免疫的抗体中用一种或多种公开的免疫原性多肽接种。
本发明的免疫原性组合物可用于预防或治疗牙龈卟啉单胞菌相关的疾病、病症、病况或症状的方法中。术语疾病、病症和病况在本文中将可互换使用。特别地，预防性和治疗性方法包括将治疗有效量的药物组合物给予受试者。在具体的实施方案，提供用于预防或治疗症状性牙龈卟啉单胞菌感染相关的牙周疾病的方法。
本文使用的预防疾病或病症意指将本发明治疗有效量的药物组合物给予受试者以保护受试者免于出现牙龈卟啉单胞菌相关的特定疾病或病症。
治疗疾病或病症意指将本发明治疗有效量的药物组合物给予患有由牙龈卟啉单胞菌所致的疾病或已暴露于牙龈卟啉单胞菌的受试者，其中目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响疾病的病况或症状。
治疗有效量是指为既定病况和给药方案提供治疗作用的量。治疗有效量可由普通技术医疗工作者根据患者特征(年龄、重量、性别、病况、并发症其它疾病等)来确定。治疗有效量还将受组合物给药途径的影响。
本发明的组合物可按本领域技术人员确定为适当的量和方案通过适当的途径给予，例如经皮(例如经肌内、静脉内、腹膜内或皮下)、经皮肤、经粘膜或局部给予。
方法包括将有效量的本发明组合物给予受试者。在一些方面，方法还可包括将将组合物额外给予(例如一次或多次加强给药)受试者以增强或刺激再次免疫应答。加强给药可在第一次给予后的某一时间例如在第一次给予组合物后的一至八周优选两至四周给予。此后加强给药可每年给予一次、两次、三次、四次或更多次。旨在不受理论的限制，期望在本发明的一些方面中，不必每年加强给药，因为受试者将在实际情况中被攻击，即通过暴露于表达存在于组合物中的多肽的微生物(牙龈卟啉单胞菌)，该微生物具有与给予受试者的组合物的多肽上存在的表位相同或结构上相关的表位。
在一方面，本发明涉及用于制备抗体的方法，例如通过诱导受试者产生抗体，或通过重组技术。产生的抗体包括与存在于组合物中的至少一种多肽的至少一个表位特异性结合的抗体。在本发明的这一方面，″有效量″是在受试者中有效导致产生抗体的量。确定受试者是否已产生与存在于本发明组合物中的多肽特异性结合的抗体的方法是本领域熟知的并且可通过本文描述的方法确定。本发明还包括与本发明多肽特异性结合的抗体以及包含这类抗体的组合物。
方法可用于产生与由微生物(牙龈卟啉单胞菌)表达的多肽特异性结合的抗体，组合物的多肽分离自该微生物。本文使用的可″特异性结合″多肽的抗体是与诱导抗体合成的抗原的表位相互作用的抗体，或与结构相关的表位相互作用的抗体。存在于本发明组合物中的多肽的至少一些通常包含在不同菌种的多肽中保守的表位。因此期望的是，使用来源于牙龈卟啉单胞菌的一种菌株的组合物产生的抗体与由其它牙龈卟啉单胞菌菌株表达的多肽结合，并且提供针对该革兰氏阴性生物的广泛系统保护。
还公开了降低受试者中牙周疾病风险的方法，其包括将包含一种或多种公开的免疫原性多肽的免疫原性组合物给予受试者。牙周疾病(症状性感染)包括例如牙周炎。本文描述的方法可降低任何症状性牙龈卟啉单胞菌感染(或任何此类症状性牙龈卟啉单胞菌感染的复发)的风险。
诊断试剂盒
本文还提供试剂盒，其用于通过检测患者生物样品中抗体或核酸来检测患者中牙龈卟啉单胞菌感染存在情况。在一个实施方案中，一种或多种抗原(例如多肽和/或其片段)可构成用于检测或诊断生物样品中抗-牙龈卟啉单胞菌抗体的试剂盒的一部分。抗原可用合适的容器例如小瓶提供，其中保护内含物免受外部环境的影响。因此，用于检测样品中抗-牙龈卟啉单胞菌抗体的试剂盒可包括一种或多种牙龈卟啉单胞菌多肽和/或其片段以及提供用于确定样品中一种或多种抗体与抗原结合的一种或多种检测试剂。试剂盒优选包括：(i)一种或多种分离且纯化的多肽和/或其片段；和，(ii)用于检测抗原-抗体复合物形成的体系，任选包装有使用说明书。抗原可游离于溶液中或可固定在固体载体例如磁珠、管、微板孔或芯片上。在某些实施方案中，提供包含分离且纯化的多肽和/或其片段的固体基质或吸附到其上的融合蛋白或蛋白聚集体。在一些实施方案中，试剂盒还可包括作为检测试剂的抗体-结合分子。抗体-结合分子可为捕获或检测试剂并且可游离于溶液中或可固定在固体载体例如磁珠、管、微量培养板的孔或芯片上。抗体-结合分子或多肽可用可检测标记例如荧光或显色标记或结合部分例如生物素来标记。上文更详细地描述了合适的标记。试剂盒还可包括检测试剂例如底物，例如显色、荧光或化学发光底物，其与标记或与标记结合的分子例如酶缀合物反应以产生信号和/或用于免疫沉淀的试剂)。检测试剂还可包括缓冲液、洗涤液和其它有用试剂。试剂盒还可包括用于处理和/或储存获自受试者的样品的器械以及从受试者获取样品的器械中的一种或两种(例如针、柳叶刀和收集管或容器)。如本文描述的，试剂盒还可包括抗原的使用说明书(例如在检测试样中抗-牙龈卟啉单胞菌抗体的方法中)。当该测定需与另一类型测定例如PCR结合时，还可包含后一测定所需的试剂(即引物、缓冲液等)以及任选其使用说明书。
本公开内容中引用的所有参考文献均通过引用以其整体结合到本文中。在以下实施例中对某些实施方案进一步描述。提供这些实施方案仅作为实例，而非意欲以任何方式限定权利要求书的范围。
实施例
上述公开内容从总体上描述了本发明。参考以下具体实施例可以获得更完整的理解。描述这些实施例仅为说明的目的而非意欲限制本发明的范围。形式上的改变和等效物的替换是预期的，因为环境可暗示或导致适宜。虽然本文已采用了特定的术语，这种术语意图是描述性的意义，而不是为了限制的目的。本文使用的但未在本公开内容中明确描述的分子遗传学、蛋白生物化学和免疫学的方法以及这些实例在科学文献中有详尽报道并且在本领域技术人员的能力范围内。
实施例1：牙龈卟啉单胞菌基因组的挖掘
该实例描述了为鉴定牙龈卟啉单胞菌的免疫原性多肽而进行的基因组挖掘实践。牙龈卟啉单胞菌W83菌株的基因组具有约2200个开放阅读框。利用计算机辅助，使用以下参数，对构成牙龈卟啉单胞菌W83基因组(http://cmr.jcvi.org/cgi-bin/CMR/GenomePage.cgi？org＝gpg)的蛋白的每一种进行评估，以优先考虑那些用于进一步评估的蛋白(通过克隆、表达和纯化)：
1.优先考虑具有C-末端结构域(CTD)的候选物作进一步评估。牙龈卟啉单胞菌蛋白酶RgpB中存在CTD表明其对蛋白酶的正常成熟、正确分泌和与细胞表面的附着是必需的(Nguyen等，J.ofBacteriology，2007，189，833-843)。
2.PSORTb定位，从高至低的优先级：(外膜或细胞外的)＞(未知的)＞(周质或胞质的)。Psortb(2.0版本)是基于网络的细菌蛋白亚细胞定位预测工具[可从www.psort.org获得；J.L.Gardy，M.R.Laird，F.Chen，S.Rey，CJ.Walsh，M.Ester和F.S.L.Brinkman(2005)PSORTbv.2.0：expanded prediction of bacterial protein subcellular localization andinsights gained from comparative proteome analysis(对细菌蛋白亚细胞定位的扩展预测以及从比较蛋白组分析中获得的深刻见解)，Bioinformatics 21(5)：617-623]。
3.赋予蛋白更高优先级的其它参数：
i.存在信号序列；
ii.菌株普遍性(即在牙龈卟啉单胞菌W50，W83和ATCC 33277菌株中存在)；
iii.在已测序并公布基因组的菌株(例如W83、ATCC 33277)中，序列保守性高(75％)；
iv.已发表文章所公开的数据表明该蛋白位于外膜，和/或是潜在的毒力因子；
4.赋予蛋白更低优先级的其它参数：
i.可检测的人序列相似性；
ii.预测的跨膜螺旋；
iii.分子量＞100kDa或＜20kDa
iv.预测的亚细胞定位
利用这些优先考虑的参数，鉴定了约131种候选蛋白用于评估。随后将每一候选物从牙龈卟啉单胞菌W50菌株(保藏为ATCC53978)克隆并且在大肠杆菌(Escherichia coli)中重组表达，这在实施例2中将更详细说明。选择可溶表达的那些(即约40种蛋白)用于进一步评估。
实施例2：牙龈卟啉单胞菌蛋白的重组克隆、表达和纯化
对选自牙龈卟啉单胞菌W50菌株的基因(例如PG 0495、PG2172、PG 1326、PG 1374、PG 0654、PG 0613、PG 1798、PG0186、PG 1795、PG 0616)进行重组克隆、表达和纯化。
设计下表4中列出的引物以扩增来自牙龈卟啉单胞菌W50菌株的相关基因(全长但缺少信号序列)。用pET-30Ek/LlC载体试剂盒，将扩增的基因产物克隆到pET-30Ek/LlC(Novagen
Figure BPA00001531275400401
Merck，Germany)中。使用该载体，表达产物具有帮助表达分析的载体-编码的S-标签和载体编码的N-末端标签(mhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddk SEQ ID NO：51)。根据对于该载体的克隆要求，下一个氨基酸必须是Met(m)或Ile(i)，因此在其中这两个残基的任一个不是所需克隆片段的第一个天然氨基酸的情况下，还加入其中的任一个。用肠肽酶的消化使得从靶蛋白去除所有载体-编码的序列，但为初筛目的，不去除标签。
每一基因的信号肽序列通过使用SignallP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)来预测或基于如先前描述和鉴定的典型牙龈卟啉单胞菌1型信号切割位点共有序列来指定(J.Bacteriol.2006年9月：188(17)：6376-6386)。克隆这些基因使得所得克隆的核苷酸序列缺少信号肽序列。如本领域已知的，信号肽序列可用多种方法包括通过使用预测软件例如可获自(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)(Locating proteins in the cellusing Target P，SignalP，and related tools，O.Emanuelsson，S.Brunak，G.von Heijne，H.Nielsen，Nature Protocols 2，953-971(2007))的软件来预测。
将所得载体各自亚克隆到NovaBlue感受态细胞中并且随后将所得质粒各自转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，使用OvernightExpressTM Autoinduction System 1(Novagen)用于产生蛋白。在IPTG诱导时，重组多肽得以表达。
表达之后，使用SDS-PAGE和/或FRETWorksTM S-TagTM测定试剂盒(Novagen，依据制造商的建议)来评估表达多肽的溶解度。该测定的根据是来自任何可溶重组蛋白的S-标签融合肽能向外源加入的纯化的突变型S蛋白提供反式互补(trans-complementation)以恢复RNase活性。当底物FRET ArUAA被重构的RNase切割时发荧光并且提供荧光读数。
在天然条件下，可溶性表达多肽通过使用市售试剂盒(Qiagen
Figure BPA00001531275400411
)采用Ni2+-NTA琼脂糖的亲和色谱来纯化。对每一重组克隆的多肽用考马斯蓝染色进行后续的SDS-PAGE分析并且用下表3中指明的近似分子量标出每一情形的单一条带。
表3
Figure BPA00001531275400412
表4
PCR引物
Figure BPA00001531275400421
本领域技术人员将理解的是，核苷酸序列可与信号肽序列一起克隆。同样地，本领域技术人员将理解的是，通过使用不同质粒克隆载体，多肽可各自在不含载体编码的S-标签和His-标签时重组表达。然而应注意的是，就PG0616而言，通过将不含信号肽序列的基因克隆到pET-30Ek/LlC中，多肽能可溶性地表达，而当与信号肽一起表达时该多肽则是不溶的。
rPG0495
如上所述从W50菌株克隆该基因。分离质粒DNA并测序(将序列表示为SEQ ID NO：41)。将表达的蛋白的序列表示为SEQ IDNO：21。经克隆的基因的核苷酸序列(表示为SEQ ID NO：22)与W83的序列相同，下列变化除外：
i)bp 130在克隆的基因中是″T″而在公布的W83序列中是″A″。这导致该密码子处的MET被替换为LEU。
ii)bp 861在克隆的基因中是″G″而在公布的W83序列中是″A″。这是沉默突变因为GCG和GCA两者都编码丙氨酸。
iii)bp 1440之后的″A″缺失导致移码，具有如下结果：C-末端7个氨基酸应为TERVlVQ*，而在由克隆的基因编码的蛋白中，它们被QKE*替换。该移码是克隆假象。
以下是已克隆并表达的rPG0495蛋白的氨基酸序列(源自载体的序列加下划线)。
MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKLQTMAPNYFHADPQQFKHRIVKEKSFSSYSNYEYGVDNRLQRIYSVDESSGEIEHERRFFFNEGGYMIREEEYDGTVQIPVRKWEFVRDDKGYITHFSRYSPKDGSQELIEDIRIDFSYDADMKLIKADIDFFDIMANVWGDLRTTKLVYNENGLLKEMIQTDPGSGQEFNREELTYNNLNKIVAIRFIPGPASTGLNEFELIYEYDSEGMDIVKAGRDDFWYYYEYDKEMLASETFFPKPSIADLVYFGLKDYVDFSGLPFKNSYTHVVVKESTNEVEAIYEPISVYSVVVIQPENGEIKLTADGQPLNSGSTLVAGRRIKIHPIPAEGYEVDKVMVNGENIEAPYEFLLEKDTEVTALMKKSNAVGEVDTKGFHVYPIPTSKDLTIEIPAEMVGKVASLIDMNGQIVYRVTLNNIFQQIDISHLKGVFLLQIGDIQKE(SEQ ID NO：21)
rPG2172
如上所述从W50菌株克隆该基因。分离质粒DNA并测序(序列表示为SEQ ID NO：47)。将表达的蛋白的序列表示为SEQ IDNO：29。W50克隆的基因的核苷酸序列(在SEQ ID NO：30中展示)与来自已公布的基因组的相应W83序列相同。
以下是已克隆并表达的rPG2172蛋白的氨基酸序列(源自载体的序列加下划线)。
MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKMQVVIKMGDAILENNATVDITAFTTEDGTEEMKFEGMVINQSATPINVIGKITKQEMIGDGHFALCFGQCMGPNVSVSPIVEALDGEGEYVSLHYKFPVSNEGHTGAFTFSCFPESGAPGTELATVNINFKYKGGGTGLTNIGLGRIALIQSGNTCTLQYNSNGKRLALEVYNLLGVKVFTSQLPAGSGSYTLPVRLQRGVHIFRITEGGKPAFVQKYLIK(SEQ IDNO：29)
rPG 1326
如上所述从W50菌株克隆该基因。将表达的蛋白的序列表示为SEQ ID NO：39。W50克隆的基因的序列(表示为SEQ ID NO：40)与来自已公布的基因组的相应W83序列相同。以下是已克隆并表达的rPG 1326蛋白的氨基酸序列(源自载体的序列加下划线)。
MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKMLCENTLAQQKTEEFAPVSDLRAEAYGSTVFLHWTPPYDNPMIPLSESFESGIPAIWKTIDADGDGYNWMHLTNFTGQSGLCVSSASYIGGVGALTPDNYLITPELKLPTDALVEIIYWVCTQDLTAPSEHYAVYSSSTGNNAADFVNLLYEETLTAKRIQSPELIRGNRTQGVWYQRKVVLPNDTKYVAFRHFNSTDNFWLNLDEVSILYTPLPRRAPCPHPGGYTYSVFRDGQKIASGLSALAYIDTDVPYGTQDYCVQVNYLQGDSYKVCKNIVVANSANIYGADKPFALTVVGKTIVASAFKGEITLYDIRGRLIASGCDTLRYKAENGFYLIKIQVNGTVYTEKIQIQ(SEQ ID NO：39)
rPG0654
从W50菌株克隆该基因。分离质粒DNA并测序(序列表示为SEQ ID NO：43)。将表达的蛋白的序列表示为SEQ ID NO：25。W50克隆的基因的序列(表示为SEQ ID NO：26)与来自已公布的基因组的相应W83序列相同。以下是已克隆并表达的rPG0654蛋白的氨基酸序列(源自载体的序列加下划线)。
MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFEROHMDSPDLGTDDDDKMQSPRIPQVDVHTRIARNARYRLDKISVPDSRQIFDYFYKEETIPTKIQTTTGGAITSIDSLFYEDDRLVQVRYFDNNLELKQAEKYVYDGSKLVLREIRKSPTDETPIKKVSYHYLCGSDMPFEITTEMSDGYFESHTLNYLNGKIARIDIMTQQNPSAELIETGRMVYEFDANNDAVLLRDSVFLPLQNKWVEMFTHRYTYDNKHNCIRWEQDEFGTLTLANNFEYDTTIPLSSVLFPTHEEFFRPLLPNFMKHMRTKQTYFNNSGEGLSEVCDYNYFYTDMQGNALTDVAVNESIKIYPRPATDFLRIEGSQLLRLSLFDMNGKLIRATELTGDLAIIGVASLPRGTYIAEITAANSKTIRAKVSLR(SEQ ID NO：25)
rPG 1374
从W50菌株克隆该基因。分离质粒DNA并测序(序列表示为SEQ ID NO：44)。将表达的蛋白的序列表示为SEQ ID NO：27。经克隆的基因的序列(表示为SEQ ID NO：28)与W83的相应序列相同，下列变化除外：
i)bp 481在克隆的基因中是″T″而在公布的W83序列中是″C″。这是沉默突变，因为CTG和TTG两者都编码LEU(即蛋白是100％相同的)。
以下是已克隆并表达的rPG 1374蛋白的氨基酸序列(源自载体的序列加下划线)。
MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKMQFVPAPTTGIRMSVTTTKAVGEKIELLVHSIEKKGIWIDLNGDATYQQGEEITVFDEAYHEYTIGTQTLTIYGNTTRLGCRSTGATAVDVTKNPNLTYLACPKNNLKSLDLTQNPKLLRVWCDSNEIESLDLSGNPALIILGCDRNKLTELKTDNNPKLASLWCSDNNLTELELSANPRLNDLWCFGNRITKLDLSANPLLVTLWCSDNELSTLDLSKNSDVAYLWCSSNKLTSLNLSGVKGLSVLVCHSNQIAGEEMTKVVNALPTLSPGAGAQSKFVVVDLKDTDEKNICTVKDVEKAKSKNWRVFDFNGDSDNMLPYEGSPTSNLAVDAPTVRIYPNPVGRYALVEIPESLLGQEAALYDMNGVKVYSFAVESLRQNIDLTHLPDGTYFFRLDNYTTKLIKQ(SEQ ID NO：27)
rPG 1795
从W50菌株克隆该基因。分离质粒DNA并测序(序列表示为SEQ ID NO：48)。将表达的蛋白的序列表示为SEQ ID NO：31。W50克隆的基因的序列(表示为SEQ ID NO：32)与来自已公布的基因组的W83序列相同。
以下是已克隆并表达的rPG 1795蛋白的氨基酸序列(源自载体的序列加下划线)。
MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKMQSLSTIKVQNNSVQQPREEATIQVCGELAEQVDCIGTGNSAIIAAAAKFESDDLESYVGWEIMSVDFFPGYKACKYTSAVWADDMTILGQSEDSDPEMQTINNLALKTSVKIEAGKNYIVGYIANTAGGHPIGCDQGPAVDGYGDLVSISEDGGATFPPFESLHQAVPTLNYNIYVVVHLKKGEGVEAVLTNDKANAYVQNGVIYVAGANGRQVSLFDMNGKVVYTGVSETIAAPQKGMYILRVGAKSIKLAI(SEQ ID NO：31)
rPG0613
如上所述从W50菌株克隆该基因。分离质粒DNA开测序(序列表示为SEQ ID NO：49)。将表达的蛋白的序列表示为SEQ IDNO：33。W50克隆的基因的序列(表示为SEQ ID NO：34)与来自已公布的基因组的W83序列相同。
以下是已克隆并表达的rPG0613蛋白的氨基酸序列(源自载体的序列加下划线)。
MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKMQTTTNSSRSYFTGRIEKVSLNLGVPPVSTEVWGMTHDANGLPFEIPISFSRFNSQGDIATTYYIANSEATLNEWCDYAHPGGIVRVEGRFWKMTYNIPTYNAVCTRITFENQEIEGTIVLIPKPKVSLPHVSESVPCIRTEAGREFILCEEDDTFVSHDGNEVTIGGKPFLLNTNVKIVGDVSQKYAVGVGEIRFLQICAQTVSQQK(SEQ ID NO：33)
rPG1798
如上所述从W50菌株克隆该基因。分离质粒DNA并测序(序列表示为SEQ ID NO：46)。将表达的蛋白的序列表示为SEQ IDNO：35。经克隆的基因的序列(表示为SEQ ID NO：36)与W83的序列相同，下列变化除外：
i)在PCR扩增期间在基因的3′端引入了错误(引物中)。最终的结果是表达的蛋白缺失最后2个天然氨基酸并且已加入额外的约56个氨基酸(从载体编码的)。将质粒的预测的正确序列表示为SEQ IDNO：45。
以下是已克隆并表达的rPG1798蛋白的氨基酸序列(源自载体的序列加下划线)。
MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKMQTKDNSSYKPFSKEDIAGGVYSLPTQNRAQKDNAEWLLTATVSTNQSADTHFIFDENNRYIARDIKANGVRKSTDSIYYDANGRISHVDLYISFSGGEPALDTRFKYTYDDEGKMTVREVFMLVMDPNTPISRLEYHYDAQGRLTHWISFAFGAESQKNTYHYNEKGLLVSEVLSNAMGTTYSDTGKTEYSYDDADNMVKAEYFVVQQGKAWQVLKREEYTYEDNICIQYLAINGTDTKVYKRDIESDKSISANVIDIPSMPEQTWPNMYGFNAKRLKETYSSYEGDVATPIFDYIYTYKALTSMATPSTEAQVAVYLNPSTDRLVILANGITHLSMYDLQGKLIRDCALSGDKVEMGVGSLTKGTYLLKVNTDQGAFVRKVVFDDRASPQPWRYRIRIRAPSTSLRPHSSTTTTTTEIRLLTKPERKLSWLLPPLSNN(SEQ ID NO：35)
rPG0186
如上所述从W50菌株克隆该基因。分离质粒DNA并测序(序列表示为SEQ ID NO：50)。将表达的蛋白的序列表示为SEQ IDNO：37。质粒pEAG037的插入片段的序列(克隆的基因；表示为SEQID NO：38)按从W83序列预测的100％正确。
以下是已克隆并表达的rPG0186蛋白的氨基酸序列(源自载体的序列加下划线)。
MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKMCELDRDPEGKDFQQPYTSFVQTKQNRDGLYALLRNTENPRMHFYQELQSDMYCTTITDGNSLAPFVNWDLGILNDHGRADEDEVSGIAGYYFVYNRLNQQANAFVNNTEAALQNQVYKNSTEIANAKSFLAEGKVLQALAIWRLMDRFSFHESVTEVNSGAKDLGVILLKEYNPGYIGPRATKAQCYDYILSRLSEAIEVLPENRESVLYVSRDYAYALRARIYLALGEYGKAAADAKMVVDKYPLIGAADASEFENIYRSDANNPEIIFRGFASATLGSFTATTLNGAAPAGKDIKYNPSAVPFQWVVDLYENEDFRKSVYIAKVVKKDKGYLVNKFLEDKAYRDVQDKPNLKVGARYFSVAEVYLILVESALQTGDTPTAEKYLKALSKARGAEVSVVNMEALQAERTRELIGEGSRLRDMVRWSIPNNHDAFETQPGLEGFANTTPLKAQAPVGFYAYTWEFPQRDRQTNPQLIKNWPI(SEQ ID NO：37).
rPG0616(40kDa OMP)
如上所述从W50菌株克隆该基因。分离质粒DNA并测序(序列表示为SEQ ID NO：42)。将表达的蛋白的序列表示为SEQ IDNO：23。W50克隆的基因的序列(表示为SEQ ID NO：24)与来自已公布的基因组的相应W83序列相同。
以下是已克隆并表达的rPG0616蛋白的氨基酸序列(源自载体的序列加下划线)。
MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKMQELKTSADMKGSFKKNVVLEVFTAEWCGYCPGGKERIAKAIEMLDDEYKERVFQTFVHYNDGISKKWPRVGQLFIALDQTLGIPGFPTFSVCRMEKKGENLSIGAPIAIKNKIMKGFGDGTAPAEVNLKLTKGATPEDVCTATFTGKVDADLIGKPLMLTAYVLKNNMKPINPQNGAGDGYLHQHTVLMILSTDVKGDALNIAADGSFTIKKEFKLDGFEIKDTDVLAFVHHPMSNAENHSIINAGQESLDKAEPTATEQIVATPSVKAYVQNGKIVVEEEYSKMEVFNATGQLVKNESLVPGVYVVRITANGVMYFLKVLVP(SEQ ID NO：23)
实施例3：蛋白-特异性抗血清的制备
在小鼠中针对某些重组蛋白(例如rPG 0495、rPG 2172、rPG1326、rPG 1374、rPG 0654、rPG 0613、rPG 1798、rPG 0186、rPG1795、rPG 0616)产生抗体，所述蛋白根据实施例2中展示的步骤制备。
就100μl的注射总体积为而言，用与TiterMax
Figure BPA00001531275400471
Gold佐剂(CytRx Corporation，California，U.S.)1/1(体积/体积)混合的50μl体积的50μg纯化的重组蛋白经肌间免疫小鼠(Balb/c)，以得到抗-重组多克隆血清。TiterMaxGold佐剂是包含嵌段共聚物CRL-8300的油包水乳剂。使用的免疫实验方案如下：
(i)对于每一纯化的重组蛋白，使用1组(3只)小鼠；
(ii)在第-3天，从每一小鼠获取预放血样品
(iii)第0天—用含有TiterMax″Gold的50μg剂量的纯化的重组蛋白经肌间免疫小鼠(使用4x 25μl注射剂，每一腿四头肌各一次)。
(iv)第28天—用25μg剂量的相同的纯化重组蛋白和用TiterMax
Figure BPA00001531275400473
Gold经肌间免疫小鼠(使用2x 25μl注射剂，每一后腿四头肌各一次)。
(v)在两周期间之后，从小鼠获取血液样品。将来自每组的血清合并。
各重组蛋白引起的牙龈卟啉单胞菌特异性抗体应答用ELISA评估。从3项单独研究获取的结果概述于图1a和1b中。从图1a和1b可看出，在TiterMax
Figure BPA00001531275400481
Gold存在下，用50μg每一重组蛋白的免疫引发牙龈卟啉单胞菌-特异性IgG应答。
实施例4：检测牙龈卟啉单胞菌外膜中的蛋白
为评估所选的蛋白是否存在于牙龈卟啉单胞菌的外膜中(并且因此对抗体是可接近的)，用针对重组蛋白产生的抗血清(获自概述于实施例3中的研究之一)探测牙龈卟啉单胞菌(W50)外膜部分的蛋白免疫印迹。
本文提供一个用于获取全细胞裂解液和外膜部分的实验方案。通常，用于蛋白免疫印迹的外膜部分通过使用厌氧生长的牙龈卟啉单胞菌W50菌株的液体培养物而获得。收集细胞并用去污剂Sarkosyl分级分离(该去污剂选择性溶解内膜，使得在Sarkosyl处理后，不溶于Sarkosyl的材料代表外膜部分。
在37℃下于厌氧室中，将牙龈卟啉单胞菌在BHI培养基(补充有半胱氨酸和氯高铁血红素)中培养约5-6天(直至培养物混浊)。将两个1.5ml样品的培养物置于两个2单独的管中。将一个样品离心并且将沉淀储存在-20℃(以用于全细胞裂解液制备)。也将第二个样品离心，并且将所得沉淀重悬于50mM磷酸钠(NaP)(5mL NaP/1g细胞糊状物)中并且储存在-20℃。全细胞裂解制备物按如下制备：融化沉淀、重悬每一300μL的50mM NaP+300μL的4x UMS，并且随后煮沸样品约10分钟。外膜部分按如下制备：将重悬于50mM NaP中的沉淀融化，加入50mM NaP至20mL的最小体积(或超声处理装置所需的最小体积)，加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL。向悬浮液加入蛋白酶抑制剂片剂，随后在冰上对其进行超声处理并且随后离心以使未裂解细胞沉淀。移出上清液。将沉淀重悬于1％sarkosyl溶液，在室温下于旋转混合器上孵育约30分钟，并且随后离心。将所得的包含内膜片段的上清液移出并且将沉淀重悬于0.5％sarkosyl溶液中并且再离心。吸出上清液并且将沉淀重悬于50mM NaP+UMS中并且随后煮沸。在凝胶上运行之前将样品煮沸。样品在凝胶上运行并且每一凝胶包含总共4泳道：(i)对照泳道(含纯化的蛋白)，(ii)分子量标准品，(iii)全细胞裂解液样品和(iv)外膜部分样品。将凝胶转移至PVDF膜上并且用可用的抗血清探测。
在牙龈卟啉单胞菌W50的外膜部分检测到PG0495、PG0654、PG1374、PG1795、PG2172、PG0613、PG1326、PG1798、PG0186和PG0616中的每一种。结果概述于图2中。
实施例5：通过基于流式细胞术的表面可接近性测定来评估表面暴露
基于流式细胞术的表面可接近性测定(SASSY)用于测量完整的牙龈卟啉单胞菌细胞上与抗体结合的每一蛋白的可接近性。如实施例3中所述的获得本测定中使用的蛋白-特异性抗血清。进行了大量SASSY实验并且每一实验都依据以下方案进行：
基本上如实施例4所述来培养牙龈卟啉单胞菌菌株(W50、W83、332277)；即，在37℃下于厌氧室中，将菌株在BHI培养基(补充有半胱氨酸和氯高铁血红素)中培养。在某些实验中，在生长的各个阶段即对数期早期、对数期或稳定期收集细胞并且用分光光度计测量OD600。
为进行每一测定研究，将培养物样品按等分分配至微量离心管中并且离心。将上清液用移液器吸出，并且将沉淀重悬于500μL/1mL 10％FBS的输入培养物中并涡旋。将管再次离心，将上清液吸出并且将沉淀重悬10％FBS中以得到约5E9CFU/mL(基于输入培养物的估计CFU/mL)的悬浮液。通过将约5E9CFU/mL洗涤过的细菌等分分配为190μL/样品并且随后加入至各10μL待测试的样品之一，从而孵育第一抗体。涡旋每一样品并且随后在37℃下孵育约30分钟。随后如下洗涤样品：向每管加入790μL 10％FBS并且随后通过翻转来混合，将各管离心并且用移液器吸出上清液。
如下孵育第二抗体：将5μL的第二抗体在DPBS中稀释(通常以1∶1000的比率)；将200μL稀释过的第二抗体加入每一第一抗体结合的样品管，随后通过用单通道移液器移液使各沉淀重悬并且涡旋。作为对照，一个管不接受第二抗体而接受10％FBS。在室温下于暗处将管孵育约30分钟。随后向每管加入10％FBS并且通过翻转混合来洗涤样品。将管离心并且用移液器吸出上清液。通过加入％PFA固定各样品。将样品储存在2-8℃暗处。
针对福尔马林-杀死的W50全细胞(FKWC)产生的抗血清用作阳性对照(该血清的产生在实施例6中更详细的描述)。将AF488-缀合的山羊抗-小鼠IgG用于检测结合的抗血清。
在FACS Calibur Flow细胞仪(Becton Dickison)上获得样品。细胞仪使用从氩离子激光产生的488nm波长带。使用CELLQuest Pro软件(Becton Dickinson)，收集发射信号(用于SASSY的AlexaFluor-488和用于OPA-吸收的CFSE)用于每一分析，其由10,000个设门事件组成，事件的收集基于尺寸和粒度。使用FlowJo7.2.5软件对样品进行分析。
图2提供了获自每一测试蛋白的大量单独实验的结果概述。沿Y轴展示的每一点代表在一个SASSY实验中，使用该蛋白的蛋白-特异性抗血清得到的结果。沿Y轴展示的每一水平破折号代表使用该蛋白的蛋白-特异性抗血清进行的所有SASSY实验中得到的平均结果。通过SASSY检测PG0495、PG0654、PG1374、PG1795、PG2172、PG0613、PG1326、PG1798、PG0186和PG0616中每一种，其在稳定期暴露在牙龈卟啉单胞菌W50表面上。
还评估了两种其它牙龈卟啉单胞菌菌株(W83和ATCC33277)以及W50菌株在不同生长阶段时这些蛋白(PG0495、PG0654、PG1374、PG1795、PG2172、PG0613、PG1326、PG1798、PG0186和PG0616)中每一种的表面可接近性。将牙龈卟啉单胞菌W50菌株生长至对数期早期、对数期或稳定期并且将牙龈卟啉单胞菌W83和ATCC33277菌株生长至稳定期。采用上述基于流式细胞术的测定评估表面可接近性。
图6提供了从用各种蛋白进行的各种实验中获得的结果概述。Y轴上展示的每一点(·)代表在使用可用的蛋白的蛋白-特异性抗血清的一种测定中获得的结果。沿Y轴展示的每一水平破折号(—)代表从使用蛋白的蛋白-特异性抗血清进行的所有实验中获得的结果平均值。检测到PG0186、PG0495、PG0613、PG0616、PG0654、PG1326、PG1374、PG1795、PG1798和PG2172中的每一种均暴露在三株牙龈卟啉单胞菌表面上。对大多数蛋白而言，两种或更多种菌株之间的暴露程度不同。经评估，W50菌株在不同生长期(即对数期早期、对数期或稳定期)的抗原暴露也不同，其中最大暴露在对数生长期期间。
实施例6：对SE蛋白候选物的免疫原性评估
Th2-抗体偏袒应答与预防性牙槽骨丢失模型中的保护作用相关(J  Immunol.2008年9月15日；181(6)：4150-8)。在牙周炎小鼠攻击模型中，具有偏向Th1应答的免疫小鼠在用牙龈卟啉单胞菌攻击后，导致小鼠中牙周组织炎症水平升高以及牙槽骨丢失，而偏向Th2应答的小鼠未出现牙周骨丢失(Am.J.Pathol.2007；170：203-213)。鼠类IgG1具有有限的Fc-相关效应物功能；其仅结合FcγRⅢ并且未能通过经典途径激活补体(Klaus，1979)。
为评估由重组多肽引发的应答类型，用纯化的重组多肽(含或不含佐剂)肌内免疫小鼠(BALB/c)。
使用的免疫实验方案如下：
(i)在程序开始前，取预放血样品(第0天)。
第一次免疫发生在第7天，
(ii)对于每一纯化的重组蛋白，使用两组(每组8只)小鼠。一组用含蛋白(5μg)的0.56mg/ml佐剂(即Alhydrogel′85′2％(碱式氢氧化铝))(总体积为50μl)在一个位点肌内免疫，并且第二组仅用蛋白(5μg)(总体积为50μl)在一个位点肌内免疫。
(iii)作为对照，用福尔马林杀死的全牙龈卟啉单胞菌W50细胞(FKWC)免疫小鼠，基本上如先前在Rajapakse等.2002中描述的制备。一组(8只)小鼠仅用1010 cfu FKWC免疫(总体积为50μl)，第二组(8只)小鼠用总体积为50μl的1010cfu FKWC加上0.56mg/ml佐剂(即Alhydrogel′85′2％)免疫。
(iv)在第20天从每只小鼠取放血样品。
(v)在第21天给予小鼠加强免疫(即第二次注射，与第一次相同)
(vi)两周后，将小鼠放血。每组的血清不混合。
IgG、IgG1和lgG2a的终点滴定通过ELISA确定(即使用与FKWC-包被的微量滴定板反应的已知浓度的FKWC抗体，将观察到的OD作为标准。测定lgG1/lgG2a比率。本领域技术人员通常将IgG1与lgG2的比率用作免疫应答的Th2和Th1组分相对大小的间接测量值。比率高和低分别表示由免疫应答的Th2和Th1组分主导的应答。
图3和表5展示了得到的结果。FKWC抗血清得到高的牙龈卟啉单胞菌特异性IgG终点效价。通过使用FKWC-包被的微量滴定板，这些ELISA证明仅给予FKWC(即不含佐剂)产生Th1-偏袒的应答。显示当用AlOOH注射时，每种重组多肽引发牙龈卟啉单胞菌特异性Th2-偏袒的抗体应答，其中rPG0495和rPG2172最高。
表5
  抗原   佐剂   比率(lgG1/lgG2a)
  FKWC   无   0.5
  FKWC   AlOOH   4.0
  rPG0495   AlOOH   789.0
  rPG0613   AlOOH   5.6
  rPG0654   AlOOH   10.4
  rPG1374   AlOOH   64.0
  rPG1795   AlOOH   38.0
  rPG2172   AlOOH   166.0
实施例6b：评估蛋白的抗原-特异性免疫原性
在第二项研究中评估由每种蛋白引发的免疫应答。在这第二项研究中，采用单种特异性抗原包被的微量滴定板来进行ELISA。这使得评估每种蛋白的抗原-特异性免疫原性。
根据基本上如上所述的免疫实验方案，用纯化的重组多肽(含或不含佐剂)肌内免疫BALB/c小鼠组。小鼠用含蛋白(5或25μg/剂量)的0.56mg/ml佐剂(即Alhydrogel′85′2％)(总体积为50μl)在一个位点肌内免疫或仅用蛋白(5或25μg/剂量)(总体积为50μl)在一个位点肌内免疫。在程序开始前，取预放血样品(第0天)并且第一次免疫发生在第7天。与先前的研究一样，在第21天给予加强免疫(即在第21天，给予第二次注射，与第一次相同)，在两周后使小鼠放血并且制备血清样品。对于每种试验的重组多肽，使用的组数和每组小鼠的数目在下表7中列出。
表7
Figure BPA00001531275400541
来自各小鼠血清的IgG、IgG1、lgG2a的终点效价通过蛋白-特异性ELISA测定并且计算lgG1∶lgG2a比率。所用的ELISA实验方案的实例在此处提供。
在室温(RT)下，将微量滴定板(Nunc-lmmuno MaxiSorp，平底聚苯乙烯)用含100μl的0.5μg/mL特异性重组蛋白(50ng/孔)的0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6包被过夜。平板用200μL/孔的洗涤缓冲液(1X PBS+0.1％吐温-20)洗涤两次，随后在RT下用150μL/孔的含1％BSA的PBS封闭60分钟。
随后加入来自各小鼠的两倍连续稀释的血清样品并且在RT下将平板孵育60分钟。用200μl/孔的洗涤缓冲液将平板洗涤4次。随后在RT下，将100μl/孔的HRP-缀合的第二抗体(1∶10′000稀释的F(ab′)2山羊抗小鼠IgG(H+L)∶HRP，1∶20′000稀释的F(ab′)2山羊抗小鼠IgG1(H+L)∶HRP，或1∶20′000稀释的F(ab′)2山羊抗小鼠lgG2a(H+L)∶HRP)孵育60分钟。用200μl/孔的洗涤缓冲液将平板洗涤4次。将100μl/孔的TMB(HRP底物)加入平板中并且在RT下孵育15分钟，随后通过加入50μl/孔的1M H2SO4来终止反应。通过采用SOFTmax Pro v5.2上制备的模板，对分光光度计波长450nm读取平板来确定OD值。
将终点效价定义为得到超过截断值读数的血清的最高稀释度的倒数。终点效价的测定基于截断值。为建立终点效价，选择每一单个步骤的截断值并且将整个稀释系列的全部稀释度的读数与相应截断值进行比较。将OD450的截断值选择为0.100。
当某一稀释度产生小于或等于截断值的读数时达到终点。将前一稀释度的倒数报告为终点效价。
得到的结果的概述在表8中列出。如显示的，每种蛋白在两种给药剂量(5和25μg)下是产生免疫的，其中较高剂量(25μg)引发的总IgG应答较高。当在佐剂(氢氧化铝)存在下给予蛋白时引发较高的总IgG应答。值得注意的是，佐剂化的蛋白引发Th2偏袒的蛋白特异性IgG应答，这些结果表明当适当佐剂化时(例如与铝化合物例如氢氧化铝)，每种评估的蛋白是产生免疫的并且能引发所希望的Th2偏袒的蛋白特异性IgG应答。本领域技术人员将理解的是，可使用其他的佐剂。特别合适的是当与本发明的蛋白一起给予时提供Th2偏袒应答的那些佐剂。
表8
Figure BPA00001531275400561
a.数字表示从每组所有小鼠的终点效价中得到的LOG10值的算术平均±标准差。
b.通过除各自起始的终点效价来计算比率。数字表示来自每组所有单个小鼠中的比率的几何平均值。
实施例7：血清杀菌活性
在两项单独的研究中，评估基本上如实施例6中所述生成的抗血清的血清杀菌活性(SBA)。这种测定是本领域技术人员熟知的。抗原-特异性血清的阳性SBA活性可表明特定抗原将诱导针对相应细菌感染的保护性免疫应答。
此处展示所用方法的实例。简言之，在活性或灭活补体的存在下，用对照或免疫血清孵育已知量的细菌细胞(牙龈卟啉单胞菌)。1小时后，通过铺板并对存活细菌进行计数来评估血清杀菌活性的杀菌水平。特别地，对于各样品和对照，在厌氧室的冰上，将214μL含约1.26x 107cfu的牙龈卟啉单胞菌(W50菌株)等分分配到无菌微量滴定板的单个孔中，对于每一试样和对照，将10μL活性或非活性补体等分分配到单个孔中。向可用的孔加入12.52μL可用血清之一并且通过移液器吹打来混合(结果是SBA反应液中20-倍的血清稀释液)。对于每一样品和对照，将90μL的细菌+血清混合物等分分配至含有活性或非活性补体的两孔中。通过移液器吹打将每孔的内容物混合。在室温下，将各管在厌氧室中孵育约60分钟。
稀释：
对于制备的每一试样和对照，如下制备3次连续的10倍稀释液：20μL SBA反应液至180μL BHI+液体培养基中，1次连续6.25-倍稀释32μL SBA反应液至168μL BHI+液体培养基中和3次连续2.5-倍稀释80μL SBA反应液至120μL BHI+液体培养基中。
所得稀释因子累计为10、100、1000、6250、15625、3.90625E4和9.765625E4。
铺板：
对于铺板的每一样品和对照，将三种最高稀释液的每一种的3x10μL铺板到BHl+血琼脂上。这导致铺板因子为100。一旦接种的平板已干燥，将它们倒置并且在室温下于厌氧室中孵育4-7天。
图4展示了每种重组蛋白与活性或非活性补体所获得的SBA结果概述。在试验的一种血清稀释液中，PG0495、PG613和PG1326各自显示轻微的杀菌活性。尽管其它蛋白显示较小或没有可检测到的SBA活性，但它们可利用不同的免疫机制来诱导针对感染的保护性免疫应答。
实施例8：调理吞噬测定
进行测定以评估某些牙龈卟啉单胞菌蛋白(即rPG0495、rPG2172、rPG1326、rPG654、rPG1374、rPG1795、rPG0613和rPG0616)的多克隆血清的调理活性。对基本上如实施例6中所述产生的抗血清进行评估。将预放血血清和稀释液(不含血清)的样品用作实验对照。
将牙龈卟啉单胞菌W50的细菌培养物培养至约5.0x10^9cfu/mL。通过离心使细胞沉淀，随后用1％PBS洗涤两次并且用CFSE标记。通过向DDAO-SE加入IF缓冲液来制备CFSE溶液。将溶液保存在暗处并且在37C下孵育15分钟。用PBS将样品洗涤2次。随后将OPA缓冲液加入样品中。
以最终为1/50制备血清样品用于调理作用步骤(终体积为200ul，加入50ul/孔)并且OPA缓冲液中的稀释度为1/12.5。在56℃将样品热灭活30分钟。在OPA缓冲液中稀释灭活或活性的补体(在最终反应液中为1％)并且随后将其加入样品中。在冰上通过按顺序加入培养基、血清、补体和细菌来启动调理反应。随后在室温下将样品在振摇孵育器(700次振动/分钟)上孵育30分钟。
将分化的HL-60细胞系(ATCC CCL-240)用作吞噬细胞。用DMF
100mM分化6天的HL-60细胞悬浮液在4x10^5的细胞密度时收集，在1X HBSS中洗涤，随后重悬于OPA缓冲液至5x10^6细胞/ml。将200μl的HL-60细胞悬浮液加入受调理作用的细菌并且在37℃的振摇孵育箱(700次振动/分钟)下孵育30分钟。在冰上终止调理吞噬。将样品保持在冰上并且在反应结束后的2小时内在FACSCalibur Flow细胞仪(Becton Dickison)上获取样品。使用CELLQuestPro软件(Becton Dickinson)，收集每一分析的CSFE发射信号，其由10,000HL-60设门事件组成，事件的收集基于尺寸和粒度。使用FlowJo7.2.5软件对样品进行分析。
将获得的结果汇总于图5中。在既定的试验稀释液中，PG 1374和PG 0613各自显示轻微的OPA活性。尽管其它蛋白显示较小或没有可检测到的OPA活性，但它们可利用不同的免疫机制来诱导针对感染的保护性免疫应答。
实施例9：血细胞凝集活性
评估针对某些牙龈卟啉单胞菌蛋白产生的抗血清的抑制血细胞凝集活性(HAI)(其由细菌(或细菌上清液)诱导)的能力。抗血细胞凝集活性是与针对许多病原体而引发的保护性免疫血清相关的特征。在一些情况下，HAI是已知的用于针对疾病(例如流行性感冒)的保护作用的相关测定。测试基本上如实施例6所述产生的抗血清的HAI。用于评估血细胞凝集活性的方法在下文中描述。
使牙龈卟啉单胞菌W83和W50菌株生长至稳定期。对培养物样品进行离心并且将上清液(培养基部分)与沉淀部分(全细胞)分离。用Dulbecco′s PBS(Gibco)洗涤沉淀并重悬至约1OD/mL。绵羊红细胞(RBC)亦用Dulbecco′s PBS洗涤并且将沉淀用于制备1％绵羊血液混合液。用Dulbecco′s PBS将各菌株的上清液和沉淀(1OD/mL)样品连续稀释2倍，终体积为每孔100ul。向所有含样品的孔加入100ul 1％的绵羊血液，终浓度为0.5％RBC。在室温或4℃下于有氧条件下将这些HA测定物孵育(静止)至少3小时。在3小时时，观察平板并且选择与最后一个具有完整HA的孔邻近的孔，用于血细胞凝集测定。
血清样品(以测试它们是否可抑制牙龈卟啉单胞菌对RBC的血细胞凝集)采用Melon Gel IgG纯化试剂盒(Thermo Fisher)来纯化或不进行处理使其为″粗制的″、非-纯化的血清样品。
在Dulbecco′s PBS中，将血清样品连续稀释2倍。将牙龈卟啉单胞菌样品稀释至所选孔的浓度，所选孔是与最后一个具有完整HA的孔邻近的孔(参见上述HA测定)。在96-孔板中将50ul的血清+50ul的牙龈卟啉单胞菌样品混合。无抗体对照＝50ul的牙龈卟啉单胞菌+Dulbecco′s PBS。其它对照包括50ul血清+50ul PBS或BHI培养基，以及单独的100ul PBS或BHI培养基。在37℃下将板轻摇1小时。向所有含有样品的孔加入100ul 1％绵羊血液，终浓度为0.5％绵羊RBC。在4℃下将板于有氧条件下孵育(静止)过夜(约16-20小时)并观察。将HAI效价定义为仍能抑制细菌沉淀或上清液的血细胞凝集活性的最大稀释的血清样品可见。就显著性而言，免疫血清的HAI效价应为预放血血清样品的HAI效价的至少＞2倍。HAI效价示于表9中。
表9
Figure BPA00001531275400601
用符号″*″标注的HAI效价是预放血背景的2倍。这表明针对这些抗原的抗体抑制牙龈卟啉单胞菌的HA活性。
实施例10：重组蛋白针对牙龈卟啉单胞菌攻击的保护功效
在先前所述(5)，充分建立的预防性鼠类牙周骨丢失模型中，评估每种纯化的蛋白(单独或组合的)的保护功效。在采用此模型的研究中，已显示Th2偏袒应答(具有IgG亚类分布的相关变化)与针对牙龈卟啉单胞菌诱导的骨丢失的保护相关。在各种提供适当的Th2-偏袒应答的佐剂(例如氢氧化铝或Alhydrogel)存在或不存在下，用每种重组蛋白(10-50μg/剂)或用纯化的重组蛋白(10-50μg/剂/蛋白)组合皮下免疫小鼠(BALB/c，6-8周龄)以评估针对牙龈卟啉单胞菌攻击的保护，所述重组蛋白选自PG0186、PG0495、PG0613、PG0616、PG0654、PG1326、PG1374、PG1795、PG1798和PG2172。所述一种或多种重组蛋白通过已知方法例如如实施例2所描述的从牙龈卟啉单胞菌W50(或W83)菌株获得。每1-2周的间隔(或更长间隔)可给予1-3次加强剂量并且在约12天后使小鼠从眼球后丛(retrobulbarplexus)放血。在放血后，小鼠随意地接受含1mg/ml卡那霉素的去离子水达7天。在抗生素处理后三天，隔2天用1x 1010存活的牙龈卟啉单胞菌W50菌株细胞经口攻击小鼠，而对照组仅用含2g/100ml羧甲基纤维素的PG缓冲液假感染(如先前描述的(5))。在攻击28天后将小鼠处死并且移出并制备上颌骨。如先前描述的(5)来评估水平骨丢失。收集血清并且通过ELISA来测量抗体效价。
尽管用优选实施方案已描述本发明，但理解的是，本领域技术人员将想到例如针对本文描述的化合物、组合物和方法的各种变化和改变。因此，意图是所附权利要求涵盖本发明范围内所要求保护的所有此类等同变化。
参考文献
下述文献的内容通过引用以其整体结合到本文中：
1.L.Frazer等，″Vaccination with recombinant adhesins from the RgpA-Kgp proteinase-adhesin complex protects against Porphyromonasgingivalis infection，″(用来自RgpA-Kgp蛋白酶-粘附素复合物的重组粘附素的疫苗接种保护免受牙龈卟啉单胞菌感染)24(42-43)，6542(2006)
2.N.M.O′Brien-Simpson等，″Serum immunoglobulin G(IgG)and IgGsubclass responses to the RgpA-Kgp proteinase-ashesin complex ofPorphyromonas gingivalis in adult periodontitis″(血清免疫球蛋白G(IgG)和IgG亚类对成人牙周炎中牙龈卟啉单胞菌的RgpA-Kgp蛋白酶-粘附素复合物的应答)68(5)2704(2000)
3.N.M.O′Brien-Simpson等，″Role of RgpA，RgpB and Kgp proteinasesin virulence of Porphyromonas gingivalis W50 in a murine lesionmodel，″(在鼠类损伤模型中RgpA、RgpB和Kgp蛋白酶在牙龈卟啉单胞菌W50的毒力中的作用)69(12)，7527(2001).
4.N.M.O′Brien-Simpson等，″RgpA-Kgp peptide-based immunogensprovide protection against Porphyromonas gingivalis challenge in amurine lesion model，″(基于RgpA-Kgp肽的免疫原提供针对鼠类损伤模型中牙龈卟啉单胞菌攻击的保护)68(7)，4055(2000)
5.N.M O′Brien-Simpson，等，″An immune response directed to proteinaseand adhesin functional epiptopes protects against Porphyromonasgingivalis-induced periotontal bone lone，″(针对蛋白酶和粘附素功能表位的免疫应答保护免于牙龈卟啉单胞菌诱导的牙周骨孤立)175(6)，3980(2005)
6.N.M.O′Brien-Simpson等，″Porphyromonas gingivalis RgpA-Kgpproteinase-adhesin complexes penetrate gingival tissue and induce pro-inflammatory cytokines or apoptosis in a concentration-dependantmanner″(牙龈卟啉单胞菌RgpA-Kgp蛋白酶-粘附素复合物渗透牙龈组织并且以浓度依赖性方式诱导促炎细胞因子或凋亡)，(2008)
7.N.M.O′Brien-Simpson等，″Antigens of bacteria associated withperiodontitis″(与牙周炎相关的细菌抗原)，35，101(2004)
8.V.Tam等，″Characterization of T Cell Responses to the RgpA-KgpProteinase-Adhesin Complexes of Porphyromonas gingivalis in BALB/cMice，″(对BALB/c小鼠中牙龈卟啉单胞菌的RgpA-Kgp蛋白酶-粘附素复合物的T细胞应答的表征)181(6)，4150(2008)
9.Booth V等，Passive immunization with monoclonal antibodies againstPorphyromonas gingivalis in patients with periodontitis(用针对患有牙周炎患者中牙龈卟啉单胞菌的单克隆抗体的被动免疫).Infect Immun.1996年2月；64(2)：422-7
10.Yokoyama，Effects of egg yolk antibody against P.gingivalisgingipains in periodontitis patients(针对牙周炎患者中牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶的卵黄抗体的作用).J Oral Sci.2007年9月；49(3)：201-6
11.Holt SC，Kesavalu L，Viriulence factors ofP gingivalis(牙龈卟啉单胞菌的毒力因子).Periodontal 2000.19996月20日：168-238
12.Nelson KE，等，complete genome sequence of the oral pathogenicbacterium P.gingivalis strain W83(口腔病原菌牙龈卟啉单胞菌W83菌株的全基因组序列).J.Bacteriol.2003年9月；185(18)：5591-601
13.″Determination of the Genome Sequence of Porphyromonas gingivalisStrain ATCC 33277 and Genomic Comparison with Strain W83 RevealedExtensive Genome Rearrangements in P.gingivalis″(牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277菌株的基因组序列的测定以及与W83菌株的基因组比较显示牙龈卟啉单胞菌中广泛的基因组重排)，DNA Res.2008年8月；15(4)：215 225

Claims (21)

1.免疫原性组合物，其包含至少一种分离的多肽和药学上可接受的载体，其中所述至少一种多肽选自：
a.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0495，或其免疫原性片段或变体；
b.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0654，或其免疫原性片段或变体；
c.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG1374，或其免疫原性片段或变体；
d.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG1795，或其免疫原性片段或变体；
e.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0613，或其免疫原性片段或变体；
f.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG2172，或其免疫原性片段或变体；
g.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG1326，或其免疫原性片段或变体；
h.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG1798，或其免疫原性片段或变体；
i.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0186，或其免疫原性片段或变体；和
j.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0616，或其免疫原性片段或变体。
2.免疫原性组合物，其包含至少一种分离的多肽和药学上可接受的载体，其中所述至少一种多肽选自：
a.与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的多肽；
b.与SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的多肽；
c.与SEQ ID NO：5具有至少80％同一性的多肽；
d.与SEQ ID NO：7具有至少80％同一性的多肽；
e.与SEQ ID NO：9具有至少80％同一性的多肽；
f.与SEQ ID NO：11具有至少80％同一性的多肽；
g.与SEQ ID NO：13具有至少80％同一性的多肽；
h.与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的多肽；
i.与SEQ ID NO：17具有至少80％同一性的多肽；和
j.与SEQ ID NO：19具有至少80％同一性的多肽。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述组合物还包含佐剂。
4.治疗或预防受试者中牙龈卟啉单胞菌感染的方法，其包括将治疗有效量的权利要求1或2的组合物给予所述受试者。
5.治疗或预防受试者中牙龈卟啉单胞菌感染的方法，其包括将治疗有效量的权利要求3的组合物给予所述受试者。
6.在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括将权利要求1或2的组合物给予所述受试者的步骤。
7.免疫原性组合物中分离的多肽用于预防或治疗牙龈卟啉单胞菌感染的用途，其中所述分离的多肽选自：
a.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0495，或其免疫原性片段或变体；
b.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0654，或其免疫原性片段或变体；
c.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG1374，或其免疫原性片段或变体；
d.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG1795，或其免疫原性片段或变体；
e.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0613，或其免疫原性片段或变体；
f.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG2172，或其免疫原性片段或变体；
g.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG1326，或其免疫原性片段或变体；
h.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG1798，或其免疫原性片段或变体；
i.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0186，或其免疫原性片段或变体；和
j.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0616，或其免疫原性片段或变体。
8.免疫原性组合物中分离的多肽用于预防或治疗牙龈卟啉单胞菌感染的用途，其中所述分离的多肽选自：
a.与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的多肽；
b.与SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的多肽；
c.与SEQ ID NO：5具有至少80％同一性的多肽；
d.与SEQ ID NO：7具有至少80％同一性的多肽；
e.与SEQ ID NO：9具有至少80％同一性的多肽；
f.与SEQ ID NO：11具有至少80％同一性的多肽；
g.与SEQ ID NO：13具有至少80％同一性的多肽；
h.与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的多肽；
i.与SEQ ID NO：17具有至少80％同一性的多肽；和
j.与SEQ ID NO：19具有至少80％同一性的多肽。
9.治疗或预防受试者中牙龈卟啉单胞菌感染的方法，其包括将治疗有效量的包含至少一种分离的核酸的组合物给予所述受试者，其中所述分离的核酸选自：
a.编码与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的多肽的核酸；
b.编码与SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的多肽的核酸；
c.编码与SEQ ID NO：5具有至少80％同一性的多肽的核酸；
d.编码与SEQ ID NO：7具有至少80％同一性的多肽的核酸；
e.编码与SEQ ID NO：9具有至少80％同一性的多肽的核酸；
f.编码与SEQ ID NO：11具有至少80％同一性的多肽的核酸；
g.编码与SEQ ID NO：13具有至少80％同一性的多肽的核酸；
h.编码与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的多肽的核酸；
i.编码与SEQ ID NO：17具有至少80％同一性的多肽的核酸；和
j.编码与SEQ ID NO：19具有至少80％同一性的多肽的核酸。
10.权利要求9的方法，其中所述组合物还包含佐剂。
11.与多肽特异性结合的抗体，其中所述多肽选自：
a.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0495，或其免疫原性片段或变体；
b.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0654，或其免疫原性片段或变体；
c.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG1374，或其免疫原性片段或变体；
d.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG1795，或其免疫原性片段或变体；
e.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0613，或其免疫原性片段或变体；
f.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG2172，或其免疫原性片段或变体；
g.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG1326，或其免疫原性片段或变体；
h.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG1798，或其免疫原性片段或变体；
i.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0186，或其免疫原性片段或变体；和
j.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0616，或其免疫原性片段或变体。
12.与多肽特异性结合的抗体，其中所述多肽选自：
a.与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的多肽；
b.与SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的多肽；
c.与SEQ ID NO：5具有至少80％同一性的多肽；
d.与SEQ ID NO：7具有至少80％同一性的多肽；
e.与SEQ ID NO：9具有至少80％同一性的多肽；
f.与SEQ ID NO：11具有至少80％同一性的多肽；
g.与SEQ ID NO：13具有至少80％同一性的多肽；
h.与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的多肽；
i.与SEQ ID NO：17具有至少80％同一性的多肽；和
j.与SEQ ID NO：19具有至少80％同一性的多肽。
13.通过将权利要求11的抗体给予受试者来治疗所述受试者的方法。
14.通过将权利要求12的抗体给予受试者来治疗所述受试者的方法。
15.治疗受试者中牙龈卟啉单胞菌感染的方法，其包括将权利要求11的抗体给予所述受试者。
16.治疗受试者中牙龈卟啉单胞菌感染的方法，其包括将权利要求12的抗体给予所述受试者。
17.用于检测受试者中牙龈卟啉单胞菌感染存在情况的试剂盒，其包含至少一种分离的多肽，其中所述多肽选自：
a.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0495，或其免疫原性片段或变体；
b.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0654，或其免疫原性片段或变体；
c.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG1374，或其免疫原性片段或变体；
d.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG1795，或其免疫原性片段或变体；
e.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0613，或其免疫原性片段或变体；
f.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG2172，或其免疫原性片段或变体；
g.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG1326，或其免疫原性片段或变体；
h.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG1798，或其免疫原性片段或变体；
i.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0186，或其免疫原性片段或变体；和
j.牙龈卟啉单胞菌蛋白PG0616，或其免疫原性片段或变体。
18.用于检测受试者中牙龈卟啉单胞菌感染存在情况的试剂盒，其包含至少一种分离的多肽，其中所述多肽选自：
a.与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性的多肽；
b.与SEQ ID NO：3具有至少80％同一性的多肽；
c.与SEQ ID NO：5具有至少80％同一性的多肽；
d.与SEQ ID NO：7具有至少80％同一性的多肽；
e.与SEQ ID NO：9具有至少80％同一性的多肽；
f.与SEQ ID NO：11具有至少80％同一性的多肽；
g.与SEQ ID NO：13具有至少80％同一性的多肽；
h.与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性的多肽；
i.与SEQ ID NO：17具有至少80％同一性的多肽；和
j.与SEQ ID NO：19具有至少80％同一性的多肽。
19.降低受试者中牙龈卟啉单胞菌感染风险的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求1或2的组合物给予所述受试者的步骤。
20.权利要求4或5的方法，其中所述受试者处于出现症状性牙龈卟啉单胞菌感染的风险中或具有所述感染。
21.权利要求20的方法，其中所述受试者具有症状性牙龈卟啉单胞菌感染。
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WO (1) WO2011014947A1 (zh)
ZA (1) ZA201200799B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114469863A (zh) * 2021-11-26 2022-05-13 南方医科大学南方医院 甾醇脂质体作为牙髓和牙本质药物传递系统的应用
CN116751292A (zh) * 2023-07-31 2023-09-15 河南大学 牙龈卟啉单胞菌Mfa1单克隆抗体及其应用

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ598834A (en) 2008-08-29 2013-06-28 Oral Health Australia Pty Ltd Prevention, treatment and diagnosis of P. gingivalis infection
MY162557A (en) * 2010-02-26 2017-06-15 Oral Health Australia Pty Ltd Treatment or prevention of infection
WO2014089706A1 (en) * 2012-12-14 2014-06-19 Sanofi Pasteur, Ltd. Methods for assessing immunogenicity
US20160347829A1 (en) * 2015-05-27 2016-12-01 Merial Inc. Compositions containing antimicrobial IgY antibodies, for treatment and prevention of disorders and diseases caused by oral health compromising (OHC) microorganisms
EA202090908A1 (ru) 2017-10-12 2020-10-29 Ваксайт, Инк. Вакцина и связанные композиции для лечения пародонтита и способ применения
CN116474096A (zh) * 2022-01-14 2023-07-25 中山大学附属口腔医院 靶向牙龈卟啉单胞菌RgpB在结直肠癌的治疗及预防中的应用
WO2023212526A1 (en) * 2022-04-26 2023-11-02 Keystone Bio, Inc. Formulation for antigen-binding molecules that bind to porphyromonas gingivalis
WO2024056196A1 (en) * 2022-09-16 2024-03-21 Qjm Bioinformation Ltd Antibodies and method of use for p. gingivalis

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003192616A (ja) * 2001-12-27 2003-07-09 Univ Nihon 歯周病用ｄｎａワクチン
JP2003286191A (ja) * 2002-03-27 2003-10-07 Univ Nihon 歯周病用粘膜免疫ワクチン
JP2005179301A (ja) * 2003-12-22 2005-07-07 Univ Nihon 歯周病用経皮免疫ワクチン
WO2008000028A1 (en) * 2006-06-27 2008-01-03 Oral Health Australia Pty Ltd Porphyromonas gingivalis polypeptides useful in the prevention of periodontal disease

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2249994A1 (en) * 1996-03-22 1997-09-25 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Immunogenic compositions comprising porphyromonas gingivalis peptides and methods
AUPN901296A0 (en) * 1996-03-29 1996-04-26 University Of Melbourne, The Porphyromonas gingivalis antigens for the diagnosis and treatment of periodontitis
KR100603552B1 (ko) * 1997-12-10 2006-07-20 씨에스엘 리미티드 포피로모나스 긴기발리스 폴리펩티드 및 뉴클레오티드
JPWO2004083425A1 (ja) * 2003-03-17 2006-06-22 麒麟麦酒株式会社 歯周病治療剤
NZ595378A (en) * 2007-07-12 2013-04-26 Immunology treatment for biofilms

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003192616A (ja) * 2001-12-27 2003-07-09 Univ Nihon 歯周病用ｄｎａワクチン
JP2003286191A (ja) * 2002-03-27 2003-10-07 Univ Nihon 歯周病用粘膜免疫ワクチン
JP2005179301A (ja) * 2003-12-22 2005-07-07 Univ Nihon 歯周病用経皮免疫ワクチン
WO2008000028A1 (en) * 2006-06-27 2008-01-03 Oral Health Australia Pty Ltd Porphyromonas gingivalis polypeptides useful in the prevention of periodontal disease

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114469863A (zh) * 2021-11-26 2022-05-13 南方医科大学南方医院 甾醇脂质体作为牙髓和牙本质药物传递系统的应用
CN114469863B (zh) * 2021-11-26 2023-09-26 南方医科大学南方医院 甾醇脂质体作为牙髓和牙本质药物传递系统的应用
CN116751292A (zh) * 2023-07-31 2023-09-15 河南大学 牙龈卟啉单胞菌Mfa1单克隆抗体及其应用
CN116751292B (zh) * 2023-07-31 2024-05-14 河南大学 牙龈卟啉单胞菌Mfa1单克隆抗体及其应用

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