KR20100063706A - 면역원성 스트렙토코커스 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 스트렙토코커스 단백질을 동정하는 수단 및 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 스트렙토코커스 우베리스로부터 유도된 적어도 2종의 재조합 및/또는 분리된 단백질, 및/또는 상기 단백질 중 어느 하나 또는 둘 모두의 면역원성 부분 또는 유사체 또는 유도체를 포함하는, 스트렙토코커스 우베리스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물을 개시한다. 또한, 본 발명은 상기 단백질 또는 이의 면역원성 부분을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포 및 재조합 운반체, 및 상기 단백질 및 핵산을 기반으로 하는 백신 및 진단 검사를 개시한다.
Description
본 발명은 의약 분야에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 면역원성 스트렙토코커스(Streptococcus) 단백질 및 이의 면역원성 부분, 유도체 및 유사체에 관한 것이다.
스트렙토코커스 속은 다양한 숙주, 예컨대 사람, 말, 돼지 및 소에서 서식하는 것으로 밝혀진 매우 광범위한 병원성 및 공생하는 그람양성균으로 이루어진다. 스트렙토코커스는 상기 숙주 내에서 종종 상기도의 점막 표면에서 집락을 형성하는 것으로 발견된다. 하지만, 특정 환경에서 스트렙토코커스는 아급성부터 급성 또는 심지어 만성에 이르는 범위의 질환을 유발할 수도 있다.
지금까지 스트렙토코커스에 대한 많은 시판 백신들은 전세포 박테린을 기반으로 한다. 일반적으로, 이러한 박테린은 동종 혈청형을 가진 항원공격에 대해서는 유의적인 예방 효과를 나타내지만, 이종 혈청형을 가진 항원 공격에 대해서는 예방 효과가 없다. 전세포 스트렙토코커스를 이용한 백신접종은 종종 동일한 스트렙토코커스 균주에 대해서는 유도되지만, 다른 스트렙토코커스 혈청형을 말할 것도 없고 다른 스트렙토코커스 균주에 대해서는 유도되지 않는(충분하게) 면역 반응을 야기한다. 결과적으로, 많은 백신들은 하나의 스트렙토코커스 균주에 대한 백신접종이 다른 스트렙토코커스 균주에 의한 감염을 상쇄시키는데 일반적으로 효과적이지 않기 때문에 이종 균주 및/또는 혈청형에 대해서는 불충분한 예방 효과를 제공한다. 더욱이, 하나의 스트렙토코커스 혈청형에 대한 백신접종은 다른 스트렙토코커스 혈청형에 의해 감염을 상쇄시키는데 있어서 일반적으로 비효과적이다. 따라서, 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주에 대하여, 바람직하게는 2종의 스트렙토코커스 혈청형에 대하여 면역반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물이 바람직하다.
본 발명의 목적은 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주에 대하여 면역반응을 유도할 수 있는, 스트렙토코커스 단백질 및 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체, 및 이를 암호화하는 핵산을 제공하는 것이다.
본 발명은 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주에 대하여 면역반응을 유도할 수 있는 스트렙토코커스 단백질의 동정방법으로서,
a) 세균의 독성 인자와 적어도 50%의 서열 동일성이 있는 단백질, 표면 결합 단백질 및/또는 분비 단백질의 적어도 일부를 동정하는 단계;
b) 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 상에서 보존되는, 상기 단계 a)에서 동정된 적어도 하나의 단백질을 선택하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 선택된 적어도 하나의 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제1 스트렙토코커스 균주에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포 및 제2 스트렙토코커스 균주에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포에 특이적으로 결합할 수 있는지를 측정하는 단계를 포함하는 동정방법을 제공한다. 상기 제1 스트렙토코커스 균주 및 상기 제2 스트렙토코커스 균주는 동일한 스트렙토코커스 종인 것이 바람직하다. 세균 독성 인자와 적어도 50%의 서열 동일성이 있는 상기 단백질은 바람직하게는 세균 독성 인자와 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 적어도 80%의 서열 동일성인 것이 좋다.
본 발명에 따르면, 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 스트렙토코커스 단백질이 동정된다. 상기 단백질은 광범위한 면역 반응을 유도할 수 있기 때문에 개인 및/또는 비-사람 동물의 면역화에 적합하다. 따라서, 본 발명은 각각의 모든 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대한 백신을 제공해야 하는 필요성을 없애준다. 따라서, 본 발명의 면역원성 스트렙토코커스 단백질의 이용은 시간 및 비용을 절감시켜준다. 더욱 중요한 것은, 본 발명의 면역원성 스트렙토코커스 단백질은 원리상 아직 알려져 있지 않은 스트렙토코커스 균주에 대한 면역 반응, 또는 아직 특이적 백신을 이용할 수 없는 균주(예컨대 자연에서 최근 진화된 균주)에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다는 점이다. 본 발명의 스트렙토코커스 단백질은 적어도 2종의 스트렙토코커스 혈청형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있어 바람직하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태는 적어도 2종의 스트렙토코커스 혈청형에 대하여 면역반응을 유도할 수 있는 스트렙토코커스 단백질의 동정방법으로서,
a) 세균의 독성 인자와 적어도 50%의 서열 동일성이 있는 단백질, 표면 결합 단백질 및/또는 분비 단백질의 적어도 일부를 동정하는 단계;
b) 적어도 2종의 스트렙토코커스 혈청형 상에서 보존되는, 상기 단계 a)에서 동정된 적어도 하나의 단백질을 선택하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 선택된 적어도 하나의 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제1 스트렙토코커스 혈청형에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포 및 제2 스트렙토코커스 혈청형에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포에 특이적으로 결합할 수 있는지를 측정하는 단계를 포함하는 동정방법을 제공한다.
적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 스트렙토코커스 혈청형에 대한 면역 반응은 본 명세서에 적어도 2종의 다른 균주 및/또는 혈청형에 대하여 유도되는 체액 및/또는 세포 면역 반응으로 정의된다. 이러한 면역 반응은 예를 들어 비-사람 동물에서 유도된다. 또한, 스트렙토코커스 관련 질병을 예방 및/또는 상쇄시키기 위해 사람 개체에서 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도하는 것도 가능하다. 체액 면역 반응은 항체 생산을 야기하는 반면, 세포 면역 반응은 주로 T 킬러 세포와 같은 반응성 면역 세포의 형성을 증강시킨다. 일반적으로, 이러한 면역 반응의 양자는 면역원성 단백질 또는 이의 면역원성 부분의 투여에 의해 유도된다. 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주/혈청형에 대한 면역 반응은 항체 생산을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 면역 반응은 바람직하게는 사람 개체 및/또는 비-사람 동물에서 스트렙토코커스 유기체의 수를 적어도 부분적으로 감소시킬 수 있다. 상기 면역 반응은 또한 바람직하게는 스트렙토코커스가 원인인 장애를 적어도 부분적으로 상쇄시킬 수 있다.
스트렙토코커스 균주는 당업계에 공지된 바와 같이 형태적, 생화학적 및 혈청학적 특징에 의해 동정할 수 있다. 스트렙토코커스 혈청형은 특정 항원성 다당류의 존재를 분류의 기본으로 하는 스트렙토코커스 그룹이다. 스트렙토코커스 혈청형의 분류도 역시 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 방법은 분비 단백질, 표면 결합 단백질 및/또는 세균 독성 인자와 적어도 50%의 서열 동일성이 있는 단백질의 적어도 일부를 동정하는 단계를 포함한다. 상기 단백질은 다양한 방식으로 동정된다. 본 발명의 한 양태에 따르면, 게놈 접근법이 사용된다. 분비 단백질 및/또는 표면 결합 단백질을 암호화하는 유전자는 예를 들어 상기 분비 단백질 및/또는 표면 결합 단백질의 모티프를 조사함으로써 동정한다. 상기 모티프는 바람직하게는 지질 부착 부위, 시그널 펩티다제 절단 부위 및/또는 소르타제(sortase) 부착 부위를 포함한다. 물론, 당업계에 공지된 다른 모티프를 조사하는 것도 가능하다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 스트렙토코커스 게놈 서열의 적어도 일부에서 분비 단백질 및/또는 표면 결합 단백질의 모티프를 포함하는 유전자를 동정함으로써 상기 분비 단백질 및/또는 표면 결합 단백질이 동정되는 본 발명의 방법을 제공한다. 또한, 또는 대안적으로 분비 단백질 및/또는 표면 결합 단백질을 암호화하는 유전자는 당업계에 공지된 하나 또는 그 이상의 다른 방법에 의해 동정되기도 한다. 예를 들어, 분비 단백질 및/또는 표면 결합 단백질을 암호화하는 스트렙토코커스 종의 유전자가 일단 알려지면, 서열 동일성%이 높은 유전자의 존재에 대해 다른 스트렙토코커스 게놈 서열을 선별하는 것이 가능하다.
한 양태에 따르면, 이러한 선별 방법은 스트렙토코커스의 분비 단백질 및/또는 표면 결합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화할 수 있는 능력에 대해 다른 스트렙토코커스 게놈 서열을 선별하는 방법을 포함한다. 따라서, 본 발명은 0.5M 인산나트륨, 1mM EDTA 및 7% 나트륨 도데실 설페이트를 보유하는 pH 7.2 완충액에서 65℃ 하에 도 4에 열거된 임의의 핵산 서열에 하이브리드화할 수 있고, 이 핵산 분자가 40mM 인산나트륨(pH 7.2), 1mM EDTA 및 5% 나트륨 도데실 설페이트를 함유하는 완충액으로 65℃에서 30분 동안 2회 세척하고 40mM 인산나트륨(pH 7.2), 1mM EDTA 및 1% 나트륨 도데실 설페이트를 함유하는 완충액으로 65℃에서 30분 동안 2회 세척한 후에도 하이브리드화된 상태를 유지하는 유전자를, 스트렙토코커스 게놈 서열의 적어도 일부에서 동정하여 세균 독성 인자와 적어도 50%의 서열 동일성이 있는 단백질을 동정하는 본 발명에 따른 방법을 제공한다. 바람직하게는, 세균 독성 인자와 적어도 50% 서열 동일성이 있는 상기 단백질은 세균 독성 인자와 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 적어도 80% 서열 동일성이 있다.
또한, 당해 기술은 스트렙토코커스 단백질이 세균 독성 인자와 적어도 50% 서열 동일성이 있는지를 측정하는 다양한 방법을 제공한다. 예를 들어, 스트렙토코커스 단백질의 아미노산 서열을 세균 독성 인자의 아미노산 서열과 비교한다. 또한, 게놈 접근법을 적용하는 것도 가능하다. 세균 독성 인자와 적어도 50% 서열 동일성이 있는 스트렙토코커스 단백질을 암호화하는 유전자는 예를 들어, 독성 인자를 암호화하는 세균 유전자와 적어도 50% 서열 동일성이 있는 뉴클레오타이드 서열에 대해 스트렙토코커스 게놈 서열을 선별하여 동정한다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 세균 독성 인자 유전자와 적어도 50% 서열 동일성이 있는 유전자를 스트렙토코커스 게놈 서열의 적어도 일부에서 동정하여 세균 독성 인자와 적어도 50% 서열 동일성이 있는 단백질을 동정하는 방법을 제공한다. 하지만, 스트렙토코커스 단백질이 세균 독성 인자와 적어도 50%의 서열 동일성이 있는지를 측정하는 많은 다른 방법들은 당업계에 공지되어 있다.
분비 단백질, 표면 결합 단백질 및/또는 세균 독성 인자와 적어도 50% 서열 동일성이 있는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 스트렙토코커스 유전자가 일단 동정되면, 이러한 유전자들 중 적어도 하나가 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 상에서 보존적인지를 측정하는 것이 바람직하다. 제1 스트렙토코커스 균주의 유전자는 제2 스트렙토코커스 균주의 게놈이 상기 제1 스트렙토코커스 균주의 상기 유전자와 적어도 약 60%의 서열 동일성이 있는 핵산 서열을 포함한다면 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주에서 보존적인 것이다. 바람직하게는, 상기 핵산 서열은 상기 유전자와 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성이 있는 것이다. "서열 동일성"이란 용어는 2개의 핵산 서열 또는 아미노산 서열 간에 동일성 백분율을 의미한다. 2개의 핵산 서열은 이 두 서열을 정렬시키고 필요한 경우 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 갭(gap)을 도입시킨 후 적어도 60%의 서열 동일성을 나타낼 때, 서로 적어도 60%의 서열 동일성이 있는 것이다. 정렬을 위한 방법과 컴퓨터 프로그램은 당업계에 잘 알려져 있다. 후보 서열이 이 정의에 속하는지를 측정하기 위해 사용하거나 개조할 수 있는 1가지 컴퓨터 프로그램은 "Align 2"로, 이는 제넨테크, 인크.에 의해 창시되어, 1991년 12월 10일에 사용자 문서와 함께 미국 저작권 사무소(워싱턴 디.씨. 20559)에 제출되었다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명의 유전자가 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주에서 보존된다면, 이 유전자에 의해 암호화된 단백질은 이 단백질, 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 하나 이상의 스트렙토코커스 균주에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는지를 평가하기에 양호한 후보이다. 상기 제1 스트렙토코커스 균주 및 제2 스트렙토코커스 균주는 동일한 스트렙토코커스 종인 것이 바람직하다.
상기 유전자가 적어도 2종의 스트렙토코커스 혈청형에서 보존되는지를 측정하는 것은, 1 이상의 스트렙토코커스 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 능력에 대해 시험하는 양호한 후보 단백질(상기 유전자에 의해 암호화된 것)을 동정하는데 바람직하다. 따라서, 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에서 보존되는 유전자를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 본 발명의 방법은 바람직하다. 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주/혈청형에서 보존되는 유전자가 일단 동정되면, 상기 유전자에 의해 암호화된 단백질이 바람직하게 수득된다. 또한, 또는 대안적으로 상기 단백질의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 수득되기도 한다. 당업계는 유전자에 의해 암호화된 단백질, 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 수득하는 다양한 방법을 제공한다. 상기 유전자는 예를 들어 적당한 발현계에 의해 발현된다. 발현계의 비제한적 예에는 효모와 같은 진핵생물 숙주 세포 및 에스케리키아 콜라이와 같은 원핵생물 숙주 세포가 포함된다. 분비 단백질, 표면 결합 단백질 및/또는 세균 독성 인자와 적어도 50%의 서열 동일성이 있는 단백질을 암호화하고, 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주에서 보존되는 본 발명의 유전자는 원핵생물 발현계에서 발현되는 것이 바람직하다. 스트렙토코커스(원핵생물) 단백질은 원칙적으로 원핵생물 발현계에서 더 잘 발현되기 때문에 원핵생물 발현계가 바람직하다. 더욱이, 원핵생물 발현계는 일반적으로 조립 및 사용이 더 용이하다.
본 발명의 방법은 본 발명의 적어도 하나의 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제1 스트렙토코커스 균주에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포 및 제2 스트렙토코커스 균주에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포에 특이적으로 결합할 수 있는지를 측정하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 적어도 하나의 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제1 스트렙토코커스 혈청형에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포 및 제2 스트렙토코커스 혈청형에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포에 특이적으로 결합할 수 있는지를 측정하는 것이 바람직하다. 이러한 시험을 수행하는 많은 방법은 당업계에 알려져 있다. 바람직하게는, 적어도 2종의 다른 스트렙토코커스 균주에 의해 감염된 적어도 2종의 동물 혈청을 사용한다. 대안적으로, 적어도 2종의 다른 스트렙토코커스 균주에 의해 감염된 단지 한 동물의 혈청만을 사용할 수도 있다. 한 양태에 따르면, 하나의 비-사람 동물은 적어도 제1 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 의해 감염되고, 제2 비-사람 동물은 적어도 제2 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 의해 감염된다. 상기 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형은 예를 들어 상기 동물에게 정맥내 투여한다. 그 다음, 한 양태에 따르면, 스트렙토코커스 특이적 항체 및/또는 면역 세포를 함유하는, 상기 동물 유래의 혈청을 수집한다. 이 혈청은 경우에 따라 사용 전에 가공처리된다. 예를 들어, 항체 및/또는 면역 세포는 적어도 부분적으로 농축 및/또는 분리된다. 본 발명의 단백질 및/또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 분리 및/또는 재조합 생산한 뒤, 상기 동물 유래의 상기 혈청 또는 (부분적으로) 분리된 항체 및/또는 면역 세포와 항온처리한다. 제1 동물 유래의 혈청, 항체 및/또는 면역 세포는 제2 동물 유래의 혈청, 항체 및/또는 면역 세포와 함께 투여하는 것도 가능하다. 대안적으로, 제1 동물 유래의 혈청, 항체 및/또는 면역 세포를 먼저 투여하고, 그 다음 제2 동물 유래의 혈청, 항체 및/또는 면역 세포를 첨가한다. 또 다른 양태에 따르면, 제1 동물의 혈청, 항체 및/또는 면역 세포는 본 발명에 따른 적어도 하나의 단백질 및/또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 함유하는 제1 배취에 투여하고, 제2 동물의 혈청, 항체 및/또는 면역 세포는 본 발명에 따른 적어도 하나의 단백질 및/또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 함유하는 제2 배취에 투여한다. 항온처리 후, 상기 혈청, 항체 및/또는 면역 세포는 세척하고, 결합된 항체 및/또는 면역 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 가시화한다. 예를 들어, 결합된 항체는, 이 결합된 항체에 특이적으로 결합할 수 있고 양고추냉이 퍼옥시다제가 접합된 제2 항체와 항온처리한다. 결합되지 않은 제2 항체를 세척한 다음, 과산화수소를 투여한다. 양고추냉이 퍼옥시다제에 의한 과산화수소의 붕괴는 발색원성 화합물의 산화에 연계되어, 반응이 가시화된다.
본 발명의 단백질 및/또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제1 스트렙토코커스 균주에 의해 유도된 항체 및/또는 면역 세포, 및 제2 스트렙토코커스 균주에 의해 유도된 항체 및/또는 면역 세포에 의해 특이적으로 결합된 것으로 나타난다면, 상기 단백질, 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있음을 시사한다.
바람직한 한 양태에 따르면, 스트렙토코커스로 감염된 동물의 회복기 혈청에서 유래되는 항체 및/또는 면역 세포가 사용된다. 회복기 혈청은 감염을 효과적으로 상쇄시킨 동물에서 유래된 것이다. 따라서, 스트렙토코커스 감염된 동물의 회복기 혈청은 동일한 스트렙토코커스 균주로의 항원공격에 대하여 상기 동물을 방어할 수 있는 항체 및/또는 면역 세포를 포함한다. 따라서, 회복기 혈청과의 항온처리는 본 발명에 따른 단백질 및/또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 방어적 면역 반응을 유도할 수 있는지를 측정하는데 바람직하다.
따라서, 본 발명의 한 양태는 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 스트렙토코커스 단백질을 동정하는 방법으로서,
- 분리된 및/또는 재조합 스트렙토코커스 단백질을 수득하는 단계;
- 상기 단백질을 제1 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형으로 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포, 및 제2 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형으로 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포와 항온처리하는 단계, 및
- 단백질이 제1 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형으로 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포 및 제2 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형으로 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포에 결합할 수 있는지를 결정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
스트렙토코커스 단백질은 다양한 방법에서 수득된다. 분비 단백질, 표면 결합 단백질 및/또는 세균 독성 인자와 적어도 50%의 서열 동일성이 있는 단백질은 스트렙토코커스 배양물로부터 분리하는 것이 바람직하다. 한 양태에 따르면, 표면 결합 단백질은 예컨대 리소자임을 이용하여 스트렙토코커스로부터 박리시킨다. 한 양태에서, 스트렙토코커스 단백질은 상기 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 적어도 하나의 핵산을 이용하여 재조합 생산한다. 앞에서 설명한 바와 같이, 분비 단백질, 표면 결합 단백질 및/또는 세균 독성 인자와 적어도 50%의 서열 동일성이 있는 단백질을 암호화하는 유전자가 바람직하게 사용된다. 상기 유전자는 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에서 보존되는 것이 더욱 바람직하다. 대안적으로, 또는 추가로, 스트렙토코커스 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 당업계에 공지된 다른 방법으로 생산할 수 있다. 예를 들어, 면역원성 스트렙토코커스 단백질 또는 펩타이드는 고상 합성법과 같은 일반 합성 기술로 생산한다. 다른 예로, 스트렙토코커스 단백질은 스트렙토코커스에서 분리하거나 재조합 생산하고, 그 후 변형시켜 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 생산할 수 있다.
바람직한 한 양태에 따르면, 스트렙토코커스 단백질은 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고, 그 다음 제1 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포, 및 제2 스트렙토커스 균주 및/또는 혈청형에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포와 항온처리한다. 2차원 폴리아크릴아미드 겔을 사용하는 것이 바람직하다.
바람직한 양태에 따르면, 스트렙토코커스 단백질은 옵소닌포식작용 유도 항체를 유도할 수 있는 것이 동정된다. 옵소닌포식작용은 미생물이 옵소닌에 의해 옵소닌화되고, 그 후 상기 미생물이 포식세포에 의해 포식화되어 사멸하는 자연 과정이다. 많은 미생물들은 자신의 포식작용을 증강시키기 위해 옵소닌에 의해 옵소닌화되어야 한다. 옵소닌화는 포식세포에 의한 흡수에 대해 미생물을 더욱 민감하게 만드는 과정이다. 이러한 과정에서, 옵소닌화 항체 및/또는 단백질은 상기 미생물에 결합하여, 상기 포식세포에 의한 상기 미생물의 흡수를 촉진한다. 따라서, 옵소닌포식작용 유도 항체를 유도할 수 있는 본 발명의 스트렙토코커스 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 동물에 이러한 단백질 및/또는 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체의 투여가 상기 동물에 스트렙토코커스를 포식할 수 있는 옵소닌포식작용 유도 항체의 존재를 초래하기 때문에 바람직하다.
본 발명의 스트렙토코커스 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/유사체는 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있다. 더욱 광범위한 면역 반응을 유도하기 위해서는 적어도 2종의 다른 스트렙토코커스 단백질 및/또는 이 단백질들 중 적어도 하나의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 동정하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 적어도 3종의 다른 스트렙토코커스 단백질 등, 및/또는 이 단백질들 중 적어도 하나의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체 등을 동정하는 것이다. 동정된 본 발명의 스트렙토코커스 단백질 및/또는 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체의 수가 많을수록, 더 광범위한 면역 반응이 유도된다.
다른 바람직한 양태에 따르면, 적어도 3종의 스트렙토코커스 균주에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 본 발명에 따른 적어도 하나의 스트렙토코커스 단백질 및/또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 동정된다. 상기 단백질 및/또는 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 사람 개체 및/또는 비-사람 동물에서 광범위한 면역 반응을 유도하는데 특히 적합하다. 더욱 바람직하게는, 적어도 3종의 스트렙토코커스 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는, 본 발명에 따르는 적어도 하나의 스트렙토코커스 단백질 및/또는 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 동정된다.
단백질의 면역원성 부분은 사람 개체 및/또는 비-사람 동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 단백질의 부분으로 정의된다. 상기 면역원성 부분은 상기 단백질과 종류는 동일하지만 양까지 동일할 필요는 없는 면역 반응을 유도할 수 있는 것이 바람직하다. 단백질의 면역원성 부분은 상기 단백질의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다. 단백질의 에피토프는 상기 단백질의 부분으로서, 길이가 적어도 약 5개의 아미노산이고 상기 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 특정 항체 및/또는 면역 세포를 유도할 수 있는 것으로 정의된다. 에피토프는 다른 2종류가 존재한다: 선형 에피토프 및 입체형태적 에피토프. 선형 에피토프는 연속 아미노산의 쇄를 포함한다. 입체형태적 에피토프는 위치가 폴딩되고 적당한 폴딩된 단백질에서 에피토프를 함께 형성하는 여러 연속 아미노산의 쇄에 의해 형성된다. 본 발명의 면역원성 부분은 상기 에피토프 종류 중 한 종류를 포함하거나, 또는 두 종류 모두를 포함할 수도 있다.
단백질의 면역원성 부분은 적어도 5개의 아미노산 잔기를 포함한다. 이러한 면역원성 부분은 바람직하게는 적어도 10개, 더욱 바람직하게는 적어도 15개, 더욱 바람직하게는 적어도 25개, 가장 바람직하게는 적어도 30개의 연속 아미노산을 포함한다. 상기 면역원성 부분은 바람직하게는 최대 약 500개 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 최대 250개 아미노산 잔기를, 상기 면역원성 부분이 유래되는 단백질의 종류에 따라서 포함한다.
단백질의 유도체는 면역원성 성질의 종류는 동일하지만 양이 반드시 동일할 필요는 없는 분자로서 정의된다. 당업자는 상기 분자의 면역원성 성질이 상기 단백질과 비교했을 때 종류는 본질적으로 동일하지만 양은 반드시 동일할 필요는 없도록 단백질을 변경시킬 수 있다. 단백질의 유도체는 예를 들어 상기 단백질의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜, 및/또는 하나의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 교체하여 제공한다. 보존적 아미노산 치환, 예컨대 산성 측쇄를 함유하는 아미노산의 산성 측쇄를 함유하는 다른 아미노산으로의 교체, 벌키 아미노산의 다른 벌키 아미노산으로의 교체, 염기성 측쇄를 함유하는 아미노산의 염기성 측쇄를 함유하는 다른 아미노산으로의 교체 등에 의해 이루어진 것이 바람직하다.
당업자는 단백질의 유사 화합물을 잘 생산할 수 있다. 이는 예컨대 펩타이드 라이브러리의 선별을 통해 또는 펩타이드 변화 프로그램을 이용하여 수행한다. 본 발명에 따른 유사체는 상기 단백질의 면역원성 성질과 종류는 본질적으로 동일하지만 양은 반드시 동일할 필요는 없는 면역원성 성질을 보유한다. 본 발명에 따른 단백질의 유사체는 예를 들어 융합 단백질 및/또는 키메릭 단백질을 포함한다.
면역 반응을 유도할 수 있기 위해서 본 발명에 따른 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 항체 및/또는 면역 세포가 생산될 수 있게 하는 적당한 특징을 구비하는 것이 바람직하다. 이러한 특징으로는, 당업계에 공지된 바와 같이, 예컨대 적당한 인접 서열 및/또는 단백분해성 절단 부위가 포함된다. 대안적으로, 또는 추가로 본 발명에 따른 단백질, 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 면역원성 운반체를 구비하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 단백질 또는 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 사람 개체 또는 비-사람 동물에 일단 투여되면, 일반적으로 단백분해작용, 언폴딩(unfolding), 극한 pH 값, 세제 및 고염 농도와 같은 다수의 여러 힘에 의해 유발되는 분해의 위험에 놓이게 된다. 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체의 수명을 연장시키기 위해서는, 예컨대 C-말단 카르복사미드를 보유하는 펩타이드의 합성 및/또는 펩타이드의 N-말단 끝의 아세틸화로 자연 하전의 특징을 유지시켜 내분해성을 증강시키는 것이 바람직하다. 한 양태에 따르면, 내분해성은, 상기단백질 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 자가분해에 민감해지게 하는 국소 언폴딩 과정이 적어도 부분적으로 저해되도록 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 돌연변이시킴으로써 더욱 증강된다. 안정화 돌연변이 전략은 공지되어 있고, 예컨대 문헌[Matthews(1991), Alber(1991), Vriend and Eijsink(1993) 및 Fersht and Serrano(1993)]에 기술되어 있다.
분비 단백질은 세포 및/또는 유기체에서 자연적으로 생산되어, 상기 세포 및/또는 유기체로부터 이의 환경으로 적어도 부분적으로 분비되는 단백질로 정의된다. 따라서, 스트렙토코커스를 배양하면, 분비 단백질은 적어도 일부 시점에서 배양 배지의 적어도 일부분에 적어도 부분적으로 존재한다. 분비 단백질은 생산되고/되거나 연속해서 분비되어야 하는 것은 아니다. 분비 단백질은 예를 들어 세균 생활사의 특정 단계 동안만 생산 및/또는 분비될 수 있다. 더욱이, 분비 단백질의 생산 및 분비는 동시에 일어날 필요는 없다. 예를 들어, 일부 분비 단백질은 우선 세포 내에 축적된 다음, 이후 시점에서 분비되기도 한다.
표면 결합 단백질은 본래 세포 표면의 일부를 형성하거나, 또는 세포 표면에 부착된 단백질로 정의된다. 상기 표면 결합 단백질이 세포 표면에 부착되어 있다면, 그 단백질은 직접 부착되거나 간접 부착된다. 간접 부착은 예를 들어 적어도 하나의 링커(linker)의 존재를 수반한다.
"분리된 단백질"이란 용어는 자연 환경에서 적어도 부분적으로 분리된 단백질 및/또는 자연에서 일반적으로 결합되어 있는 서열의 적어도 일부가 없는 단백질을 의미한다.
"재조합 단백질"이란 용어는 분리된 발현계 및/또는 합성 발현계에 의해, 바람직하게는 상기 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 이용해서 생산되는 단백질을 의미한다. 상기 핵산 서열은 프로모터, 인핸서 및/또는 터미네이터와 같은 적어도 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 것이 바람직하다. 상기 조절 서열은 상기 단백질의 발현 정도를 조절하는 것이 가능하도록 유도성인 것이 바람직하다. 한 양태에서, 상기 핵산 서열은 외인성 핵산 서열을 포함한다. 외인성 핵산 서열은 이 핵산 서열이 자연에서는 존재하지 않는 유기체의 게놈 중의 한 부위에 존재하는 핵산 서열이다.
적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 스트렙토코커스 단백질이 본 발명의 방법에 의해 동정된 후에는 생산되는 것이 바람직하다. 생산된 단백질은 예를 들어 면역원성 조성물을 생산할 수 있고 동물에서 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도하기에 적합하다. 앞에서 개략한 바와 같이, 단백질의 다양한 생산 방법은 당업계에 공지되어 있고, 그 예로 재조합체 생산이 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 동정된 적어도 하나의 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 스트렙토코커스 단백질도 제공된다.
본 발명에 따른 스트렙토코커스 단백질 및/또는 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 특히 면역원성 조성물의 제조에 적합하다. 상기 면역원성 조성물은 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주에 대하여 광범위한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 유도할 수 있다. 적어도 2종의 스트렙토코커스 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 스트렙토코커스 단백질 및/또는 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 적어도 2종의 스트렙토코커스 혈청형에 대한 광범위한 면역 반응이 달성되도록 면역원성 조성물을 제조하는데 사용된다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 단백질, 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물의 제조에 사용하는 용도뿐만 아니라, 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 적어도 하나의 분리 단백질 및/또는 재조합 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 함유하는, 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물도 제공한다. 더욱 광범위한 방어를 제공하기 위해서는 본 발명의 적어도 2종 이상의 단백질 및/또는 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 면역원성 조성물의 제조에 사용하는 것이 바람직하다. 한 양태에서, 본 발명에 따르는 적어도 하나의 단백질 및 적어도 하나의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체의 배합물이 면역원성 조성물의 제조에 사용된다.
더 광범위한 방어 외에도, 본 발명의 적어도 2종의 단백질 및/또는 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체의 용도는 스트렙토코커스 유기체의 회피 돌연변이체의 발생 기회를 감소시킨다. 세균 유기체의 회피 돌연변이체는 일반적으로 환경 스트레스 하에서, 예를 들어 항생제 존재 및/또는 상기 유기체의 에피토프에 대한 항체의 존재 하에서 발생한다. 유기체 집단 내에서 자연 변동에 의해 일부 유기체는 상기 항생제 및/또는 항체의 존재와 같은 상기 환경 스트레스의 저해 효과를 회피하여 증식할 수 있다. 한번에 여러 다른 에피토프들의 회피 돌연변이체가 발생할 기회는 단지 하나의 에피토프에 대한 회피 돌연변이체가 발생할 기회보다 적다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물은 본 발명의 방법으로 수득할 수 있는 적어도 2종의 분리 단백질 및/또는 재조합 단백질, 및/또는 이의 적어도 하나의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 포함하는 것이 바람직하다. 회피 돌연변이체의 형성을 더욱 잘 피하기 위해서 본 발명의 단백질은 필수 단백질을 포함하는 것이 바람직하다. 이것은 스트렙토코커스의 대사, 생존 및/또는 증식에 중요한, 바람직하게는 필수적인 단백질이다. 따라서, 변경된 필수 단백질을 보유한 가능한 회피 돌연변이체는 생육한다 하더라도 생육성이 저하된 것이다.
표 5와 6은 본 발명의 방법에 의해 동정된 바람직한 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis) 단백질의 목록을 포함한다. 이 단백질들, 또는 이의 적어도 하나의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 본 발명의 면역원성 조성물의 제조에 적합하다. 상기 단백질이 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는 본 발명의 단백질뿐만 아니라 표 5 및/또는 표 6에 기술된 적어도 하나의 분리 단백질 및/또는 재조합 단백질, 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 함유하는 본 발명의 면역원성 조성물의 용도도 제공된다. 더욱 광범위한 방어를 제공하기 위해, 상기 면역원성 조성물은 표 5 및/또는 표 6에 기술된 적어도 2종의 단백질 및/또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 면역원성 조성물은 표 5 및/또는 표 6에 열거된 적어도 3종의 단백질, 및/또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 포함하는 것이 가장 바람직하다.
바람직한 양태에서, 표 5 및/또는 표 6에 기술된 적어도 하나, 적어도 2종, 적어도 3종의 단백질은 P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100, P105, 표면 배제 단백질, 유발 인자(ropA) 및 뉴클레오사이드 디포스페이트 키나제로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 이 단백질들은 에스.우베리스 감염 동물의 혈청에 존재하는 항체들에 의해 인식되어, 이 단백질들이 생체내에서 발현되고 소에서 면역원성임을 시사하거나, 표 5에 기술된 에스.우베리스의 적어도 2종의 균주들과 교차반응성이다. 표 5에 특징적으로 나타낸 위에 열거한 단백질 번호는 에스.우베리스 일반 표면 단백질들의 비제한적 예를 보여주는 표 1, 2 및 3 등에 제시된 단백질을 의미한다. 또한, 도 4는 이와 같이 선택된 추정상의 에스.우베리스 표면 단백질/독성 인자의 핵산 서열 및 아미노산 서열의 비제한적 예를 보여준다.
고도로 보존적이고 생체내에서 발현되며 고도로 면역원성인 단백질, 예컨대 실시예 11에 제시된 바와 같이 다른 균주에 감염된 소 유래의 회복기 혈청에 의해 인식되는 단백질은 본 발명에 따른 면역원성 조성물에 특히 유용하다. 따라서, 본 발명의 더욱 바람직한 양태에 따르면, 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는 단백질은 P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P93 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질을 포함한다. 가장 바람직하게는, 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는 단백질이 P15, P16, P54, P28, P63 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질을 포함하는 것이다. 실시예 11에 제시된 바와 같이, 후자의 선택된 단백질은 사용된 모든 회복기 혈청에 의해 인식되었고, 이는 이 항원들이 각 감염을 유발하는 모든 에스.우베리스 균주들에 의해 발현되며, 이 항원들이 숙주 감염 동안 발현되고, 이 항원들이 고도로 면역원성이라는 것을 시사한다.
또 다른 양태는 본 발명의 방법으로 수득할 수 있는 적어도 하나의 단백질, 또는 이 단백질의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자를 함유하는 스트렙토코커스의 적어도 2종의 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물을 제공한다. 이러한 면역원성 조성물을 동물에게 투여 시, 상기 핵산 분자는 동물의 기구에 의해 발현되어, 본 발명에 따르는 적어도 하나의 단백질 및/또는 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체의 발현을 초래한다. 상기 단백질 및/또는 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체의 생산 및 경우에 따라 세포외 분비는 면역 반응을 야기한다.
한 양태에서, 본 발명의 단백질 및/또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체는 재조합 생산된다. 본 발명은 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물의 생산 방법으로서, 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는 적어도 하나의 단백질 및/또는 표 5 및/또는 6 중에서 선택되는 적어도 하나의 단백질, 및/또는 이 단백질의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 적어도 하나의 재조합 벡터를 구비한 세포 또는 다른 발현계를 제공하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 적당한 발현계는 당업계에 공지되어 있다. 한 양태에서, 본 발명의 한 단백질 또는 이의 면역원성 부분을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열이 발현된다. 다른 양태에서, 적어도 2종의 단백질 및/또는 면역원성 부분을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자가 사용된다. 또한, 각각의 핵산 분자가 본 발명에 따른 하나 또는 그 이상의 단백질 및/또는 면역원성 부분 등을 암호화하는 적어도 2종의 핵산 분자를 사용하는 것도 가능하다. 예를 들어, (적어도) 하나의 단백질을 암호화하는 하나의 핵산 분자와 (적어도) 하나의 면역원성 부분을 암호화하는 하나의 핵산 분자가 적합하다. 따라서, 핵산분자의 수 및 이 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질 및/또는 면역원성 부분의 수는 변동될 수 있다.
본 발명의 핵산 서열은 예컨대 상동 재조합에 의해 세포의 게놈 내로 삽입된다. 또한, 핵산 서열은 전기침투 등에 의해 무작위로 삽입할 수도 있다. 대안적으로, 또는 추가로 상기 핵산 서열은 미생물 및/또는 세포와 같은 선택된 발현계에서 안정한, 플라스미드 벡터 또는 파지 벡터와 같은 벡터에 배치된다. 이러한 본 발명의 핵산 서열은 프로모터, 인핸서 및/또는 터미네이터와 같은 조절 서열의 제어 하에 전사 및 해독되는 것이 바람직하다. 상기 프로모터, 인핸서 및/또는 터미네이터는 선택된 발현계에서 사용하기에 적합한 것이 바람직하다. 상기 조절 서열은 발현을 제어할 수 있도록 유도성인 것이 더욱 바람직하다. 다양한 미생물에 적합한 프로모터 및 터미네이터는 문헌[Biseibutsugaku Kisokoza (Basic Microbiology), Vol. 8, Genetic Technology, Kyoritsu Shuppan (1990)]에 개시되어 있다. 예를 들어, 에스케리키아, 더 상세하게는 에스케리키아 콜라이에 적합한 플라스미드 벡터는 pBR 및 pUC 시리즈의 플라스미드이고, 적당한 프로모터로 예컨대 lac 프로모터(β-갈락토시다제), trp 오페론(트립토판 오페론), 및 tac 프로모터(lac-trp 하이브리드 프로모터) 및 λ-faag PL 또는 PR 유래의 프로모터가 포함된다. 바람직한 터미네이터는 trpA- 또는 파지 유래의 rrnB 리보솜 터미네이터를 포함한다. 스트렙토코커스에서 재조합 생산에 적합한 플라스미드 벡터는 예컨대 pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239(1985)) 및 pGK1(Appl. Environ. Microbiol. 50, 94(1985))을 포함한다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는 적어도 2종의 스트렙토코커스 단백질 및/또는 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는 적어도 2종의 스트렙토코커스 단백질 및/또는 이 단백질들 중 적어도 하나의 면역원성 부분을 암호화하는 핵산 서열을 프로모터와 같은 기능적으로 연결된 조절 서열의 제어 하에 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있고/있거나 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는 적어도 2종의 단백질, 및/또는 이의 면역원성 부분을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 분리된 숙주 세포도 제공된다. 이 숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포를 포함하는 것이 바람직하다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 스트렙토코커스에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 사용된다. 이것은 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는 적어도 하나의 단백질 및/또는 표 5 및/또는 6에서 선택되는 적어도 하나의 단백질 및/또는 이러한 적어도 하나의 단백질의 면역원성 부분을 암호화하는 핵산을 함유하는 재조합 운반체, 또는 본 발명의 재조합 핵산 분자에 의해 수행된다. 따라서, 상기 재조합 운반체도 제공된다. 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는 적어도 하나의 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 재조합 운반체가 제공되는 것이 가장 바람직하다. 한가지 특히 바람직한 양태에 따르면, 상기 재조합 운반체는 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는 적어도 2종의 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한다. 한 양태에서, 상기 재조합 운반체는 본 발명의 적어도 하나의 단백질을 생산하도록 하고, 그 후 적어도 하나의 재조합 단백질과 운반체 자체의 배합물이 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용된다. 한 양태에 따르면, 본 발명의 사멸된 재조합 운반체가 제공된다. 하지만, 바람직한 한 양태는 본 발명의 생 재조합 운반체를 제공하기도 한다. 한 양태에 따르면, 상기 생 운반체는 약독화된 운반체이다. 본 발명의 생 운반체는 사람 개체 및/또는 비-사람 동물을 감염시킬 수 있고, 그 후 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대한 면역 반응을 유도하는 것이 바람직하다.
본 발명의 재조합 운반체는 스트렙토코커스 종을 포함하는 것이 바람직하다. 스트렙토코커스에 대하여 유도된 이러한 방식의 면역 반응은 상기 운반체에 의해 암호화된 단백질(들) 및/또는 면역원성 부분(들), 유도체(들) 및/또는 유사체(들)에 의해 유도되고, 또한 상기 재조합 운반체 자체에 의해 유도되기도 한다. 스트렙토코커스의 협막성 유전자 발현 산물은 종종 고도로 면역원성이고 혈청형 특이성이다. 따라서, 협막성 유전자 발현 산물의 존재는 다양한 여러 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 지향성인 면역 반응의 유도를 방해한다. 따라서, 한 양태에 따르면, 본 발명의 재조합 운반체가 스트렙토코커스를 포함한다면, 상기 스트렙토코커스는 협막성 유전자 발현 산물의 적어도 일부가 결여되어 있는 것이다. 한 양태에서, 상기 스트렙토코커스는 비협막성 스트렙토코커스이다.
전술한 바와 같이, 적어도 2종의 다른 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형 유래의 적어도 2종의 단백질 및/또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 이용한 면역화는 광범위한 방어를 제공하고 회피 돌연변이체의 형성 기회를 감소시킨다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태는 제1 스트렙토코커스 균주및/또는 혈청형 유래의 적어도 하나의 단백질 및/또는 이의 면역원성 부분을 암호화하는 핵산 서열 및 제2 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형 유래의 적어도 하나의 단백질 및/또는 이의 면역원성 부분을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 재조합 운반체를 제공한다. 이러한 재조합 운반체는 생 재조합 운반체를 포함하는 것이 바람직하다.
재조합 운반체는 예를 들어 적당한 숙주 세포에서 생산된다. 따라서, 본 발명의 재조합 운반체를 함유하는 분리된 숙주 세포도 제공된다.
본 발명의 재조합 운반체는 스트렙토코커스의 적어도 2종의 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물의 생산에 적합하다. 따라서, 본 발명은 스트렙토코커스에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물 및 본 발명의 재조합 운반체를 함유하는 조성물도 제공한다.
본 발명의 면역원성 조성물을 사람 개체 및/또는 비-사람 동물에게 투여한 후에는 스트렙토코커스에 대한 면역 반응이 유도된다. 이러한 면역 반응은 스트렙토코커스 관련 질병을 적어도 부분적으로 상쇄시킬 수 있는 것이 바람직하다. 따라서, 약제로 사용되는 본 발명의 면역원성 조성물도 제공되고, 또한 스트렙토코커스 관련 질병에 대한 약제의 제조에 사용되는 본 발명의 면역원성 조성물의 용도도 제공된다.
또한, 본 발명의 면역원성 조성물은 백신 생산에도 적합하다. 이러한 백신은 스트렙토코커스 관련 질병에 대한 방어를 적어도 부분적으로 제공할 수 있는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 백신은 스트렙토코커스 감염에 대한 방어를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 백신 제조에 사용되는 본 발명의 면역원성 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 단백질, 면역원성 부분, 유도체, 유사체 및/또는 재조합 운반체는 적당한 운반체와 함께 사람 개체 및/또는 비-사람 동물에게 투여하는 것이 바람직하다. 상기 운반체는 바람직하게는 상기 본 발명의 단백질, 면역원성 부분, 유도체, 유사체 및/또는 재조합 운반체에 대한 상기 사람 개체 및/또는 동물의 수용을 증진시키고, 바람직하게는 면역원성 효과를 증가시킨다. 본 발명의 적당한 운반체는 예를 들어 본 발명의 면역원성 조성물의 면역화 효과를 증가시킬 수 있는 적당한 보강제를 포함한다. 오일계 및 수성계의 많은 적당한 보강제는 당업자에게 알려져 있다. 한 양태에서, 상기 보강제는 딜루백 포르테(Diluvac Forte) 및/또는 스페콜(Specol)을 포함한다. 다른 양태에 따르면, 상기 적당한 운반체는 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체의 희석 등을 위한 식염수와 같은 용액을 포함한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 단백질, 면역원성 부분, 유도체, 유사체 및/또는 재조합 운반체 및 적당한 운반체를 함유하는 본 발명의 면역원성 조성물을 개시한다.
본 발명의 면역원성 조성물은 사람 개체 및/또는 비-사람 동물에서 스트렙토코커스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 이로써 상기 개체 및/또는 동물에서 스트렙토코커스 유기체의 수를 감소시키고/시키거나 제어할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물을 사람 개체 및/또는 비-사람 동물에게 제공하는 것을 포함하여, 상기 사람 개체 및/또는 비-사람 동물 중의 스트렙토코커스 유기체의 수를 감소시키고/시키거나 제어하는 방법을 제공한다.
본 발명의 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 관련 질병을 적어도 부분적으로 상쇄 및/또는 예방할 수 있는 것이 바람직하다. 스트렙토코커스 관련 질병이 이미 존재하면, 본 발명의 면역원성 조성물은 적어도 부분적으로 상기 질병을 상쇄시킬 수 있는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물, 및 바람직하게는 적당한 운반체, 예컨대 딜루백 포르테 및/또는 스페콜을 함유하는 약제학적 조성물도 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 스트렙토코커스에 대한 사람 개체 및/또는 비-사람 동물의 면역성을 측정하는 방법으로, 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있고/있거나 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는 단백질, 또는 이의 면역원성 부분에 대하여 지향성인 항체 및/또는 면역 세포의 존재를 상기 개체 및/또는 동물 유래의 적어도 하나의 샘플에서 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법으로 수득할 수 있고/있거나 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는 적어도 하나의 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 및 이 단백질 또는 이의 면역원성 부분에 대한 항체 결합 및/또는 면역 세포 결합을 측정하는 수단을 포함하는 진단 키트도 제공한다. 특히 바람직한 양태에 따르면, 상기 진단 키트는 표 5 및/또는 표 6에서 선택된 적어도 2종의 단백질을 포함하는 것이다.
본 발명에 따른 방법은 바람직한 양태에 따르면 적어도 2종의 스트렙토코커스 우베리스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 스트렙토코커스 우베리스 단백질을 동정하는데 적용된다. 이러한 스트렙토코커스 우베리스 단백질은 적어도 2종의 스트렙토코커스 우베리스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물의 제조에 사용되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 방법으로 수득할 수 있는 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2종의 분리 단백질 및/또는 재조합 단백질(들), 또는 이의 적어도 하나의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 함유하는, 적어도 2종의 스트렙토코커스 우베리스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물, 뿐만 아니라 이의 스트렙토코커스 우베리스 유선염에 대한 약제의 제조에 사용되는 용도가 제공된다. 더욱이, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 수득할 수 있고/있거나 표 5 및/또는 6에서 선택되는 적어도 2종의 스트렙토코커스 우베리스 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 분리된 또는 재조합 핵산 분자를 제공한다. 또한, 상기 핵산을 함유하는 재조합 운반체, 숙주 세포 및 면역원성 조성물뿐만 아니라 이의 용도들도 제공한다.
스트렙토코커스 우베리스는 소 유선염과 관련이 있다. 소 유선염은 보통 세균이 원인인, 소 유선의 감염이다. 감염 후 염증 반응은 우유의 수율과 품질을 저하시키고 낙농업계에 연간 경제적 손실을 유발하는 주요 원인이다. 네덜란드의 경제적 피해는 연간 소 1마리당 약 100 유로 정도인 것으로 추정된다.
유선염과 가장 일반적으로 관련이 있는 세균 종 중에는 스트렙토코커스 속의 다양한 종, 예컨대 스트렙토코커스 우베리스(혈청형을 결정할 수 없는 것), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae)(랭스필드(Lancefield) 그룹 B), 스트렙토코커스 디스갈락티에(Streptococcus dysgalactiae)(랭스필드 그룹 C), 스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus) 및 랭스필드 그룹 D, G, L 및 N 스트렙토코커스가 있다. 이러한 종들 중 일부는 전염성(예, 에스.아갈락티에)이고, 다른 일부는 환경 병원균(예, 에스.디스갈락티에 및 에스.우베리스)으로 생각된다.
에스.우베리스 감염으로부터 초래되는 유선염은 일반적으로 겉보기에는 정상이지만 백혈구 유입으로 인해 체세포 수가 증가된 우유를 특징으로 하는, 준임상적 유선염이다. 유선염은 감염에 의해 유발된 임상 효과에 따라 중증도가 다양하다. 경미한 형태의 유선염은 약간의 체온 증가 및/또는 유방 온도의 증가를 일으킬 수 있다. 이보다 심한 증례에서, 에스.우베리스 유선염은 또한 급성 임상 병태형으로, 우유의 응고 또는 변색 및 유선의 팽창 또는 경화와 같은 질병의 분명한 징후를 나타낼 수 있다. 임상 질병의 일부 증례는 심각하고 열이 있을 수 있다. 에스.우베리스 유선염의 임상 표현에 대한 논의는 문헌[Bramley(1991); 및 Schalm et al.(1971)]을 참조한다. 유두 액침 및 항생제 요법과 같은 통상의 항균 제어 방법은 많은 종류의 전염성 유선염의 제어에 효과적이나, 모든 낙농가에서 일반적으로 발견되는 환경 유기체는 종종 상기 조치들에 대해 내성이 있다. 따라서, 이러한 조치들은 현재 유선염 증례의 95%가 넘는 증례들에 대해 책임이 있는 스트렙토코커스 우베리스 및 에스케리키아 콜라이와 같은 환경 병원균에 의해 유발된 유선염의 빈도에는 영향을 미치지 않았다. 이러한 두 종 중에서, 에스.우베리스는 영국(Hillerton et al., 1993), 뉴질랜드(McDougall, 1998), 미국(Hogan et al., 1989) 및 네덜란드(Animal Health Service, 2000)에서 실시된 조사에서 밝혀진 것처럼 가장 중요한 환경 병원균이다. 또한, 에스.우베리스는 환경으로부터 일단 감염되면, 감염된 소에서 의심 동물로 직접 전파될 수 있다는 증거도 있다(Neave et al., 1969, Oliver et al., 1999, Zadoks et al. 2001). 에스.우베리스에는 독성 및 항원성이 다른 여러 균주가 있다. 에스.우베리스 유선염 제어를 목표로 하는 현행 방법의 실패는 더 효과적인 백신과 같은 대안적 제어 조치에 대한 조사를 유도했다. 지금까지 여러 종류의 백신이 개발되었고 소에서 시험되었다.
사멸 완전 세균을 이용한 젖소의 반복 면역화는 동일 균주를 이용한 실험적 항원공격 후의 우유에 존재하는 세균의 수를 감소시켰다(Leigh, 1991; Leigh, 2000). 하지만, 사멸 백신은 감염이나 유선의 염증 반응을 예방하지 못했고, 현장에서 에스.우베리스 유선염의 빈도에도 영향을 미치지 않았다(Leigh, 1999). 따라서, 사멸 세균을 이용한 면역화가 에스.우베리스 유선염의 문제에 대한 해결책이 아니라는 결론이 내려졌다. 생 에스.우베리스에 의한 면역화는 동일(또는 상동성) 균주에 의한 실험적 항원공격에 대하여 부분적인 방어를 유도했다(Finch et al., 1997). 방어는 옵소닌화 활성의 부재 하에 호중구의 다량 유입없이 이루어졌다. 하지만, 이 백신은 다른 에스.우베리스 균주에 대한 방어는 보이지 않았다. 이러한 전세포 백신 접근법에 의한 비교적 낮은 성공은 종래의 전체 세균 백신을 이용하여 에스.우베리스에 대하여 동물을 방어하기는 어렵다는 것을 시사한다. 최근에는 서브유닛 백신이 에스.우베리스의 한 단백질을 기초로 하여 생산되었다(Fontaine et al. 2002). 이 서브유닛 백신의 공개는 지금까지 후속 연구가 이어지지 않고 있고, 이는 여러 종류의 에스.우베리스에 대하여 동물을 방어할 수 있는 단일 단백질의 발견 기회가 적고, 이러한 종류의 서브유닛 백신은 일반적으로 에스.우베리스 유선염을 제어하는 문제에 대한 해답이 아니라는 결론을 야기했다.
요약하면, 에스.우베리스에 의해 유발된 유선염은 전체 세균, 생 세균 또는 사멸 세균을 이용한 백신접종 또는 1종의 단백질을 함유하는 서브유닛 백신을 이용한 백신접종에 의해 효과적으로 예방되거나 치료되지 않는다.
전술한 에스.우베리스 유선염에 대한 백신접종의 실망스러운 결과에도 불구하고, 본 발명자들은 여기서 다양한 에스.우베리스 균주에 의해 유발된 유선염이 본 발명에 따른 에스.우베리스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 항원 조성물을 이용함으로써 성공적으로 예방 및/또는 감소된다는 것을 개시한다.
본 발명은 적어도 2종의 스트렙토코커스 우베리스 균주 및/또는 종류에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 스트렙토코커스 우베리스 단백질의 동정 방법으로,
a) 분비 단백질, 표면 결합 단백질 및/또는 세균 독성 인자와 적어도 50%의 서열 동일성이 있는 단백질 중 적어도 일부를 동정하는 단계;
b) 적어도 2종의 스트렙토코커스 우베리스 균주 및/또는 종류에서 보존되는, 단계 a)에서 동정된 적어도 하나의 단백질을 선택하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 선택된 적어도 하나의 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제1 스트렙토코커스 우베리스 균주 및/또는 종류에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포, 및 제2 스트렙토코커스 우베리스 균주 및/또는 종류에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포에 특이적으로 결합할 수 있는지를 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 세균 독성 인자와 적어도 50%의 서열 동일성이 있는 단백질은 세균 독성 인자와 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 적어도 80%의 서열 동일성이 있는 것이다.
또한, 본 발명은 항원 조성물 중의 적어도 2종의 분리 또는 재조합 에스.우베리스 표면 단백질 또는 이의 면역원성 부분의 배합물이 에스.우베리스 균주에 대한 면역 반응을 상당히 증강시킨다는 것을 개시한다. 반면에, 많은 세균 면역원성 단백질을 함유하는 전체 세균 세포 백신은 다양한 에스.우베리스 균주에 대한 광범위한 방어를 유도하지 않지만, 본 발명의 면역원성 조성물에 존재하는 2종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 부분은 에스.우베리스에 대한 면역 반응을 증강시키는 바람직한 효과가 있다. 본 발명자들은 본 발명에서, 에스.우베리스 유기체의 적어도 2종의 면역원성 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 및 바람직하게는 적어도 2종의 에스.우베리스 유기체 균주 또는 종류의 선택 및 면역원성 조성물에 상기 적어도 2종의 면역원성 단백질 또는 이의 면역원성 부분의 배합이 광범위한 여러 에스.우베리스 유기체에 대한 면역 반응을 유도하기 때문에 여러 에스.우베리스 균주에 대한 면역성을 증진시킨다는 것을 개시한다.
피검체 또는 동물에서 면역 반응을 유도하기 위해, 단백질의 면역원성 부분을 상기 피검체 또는 동물에게 제공하는 것이 바람직하다. 본 발명에서, "면역원성 부위"란 용어는 "면역원성 부분"이란 용어와 호환해서 사용된다. "면역원성 부분 또는 부위"는 피검체에서 면역학적 반응을 유도할 수 있는 단백질의 부분을 의미한다. 상기 단백질의 면역원성 부분은 하나 이상의 에피토프를 함유하여 면역학적 반응을 유도하는 것이 바람직하다. 면역원성 부분은 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 10 내지 15개, 가장 바람직하게는 25개 또는 그 이상의 연속 아미노산을 포함한다. 따라서, 다른 양태로, 본 발명은 단백질 또는 본 발명에 따른 핵산에 의해 암호화된 단백질성 분자의 적어도 30개의 연속 아미노산의 쇄를 포함하는 면역원성 부분을 제공한다. 입체형태적 에피토프는 일반적으로 단백질이 3차원 구조를 위치할 때 폴딩된 위치에 있고 함께 에피토프를 형성하는 연속 아미노산의 여러 쇄들에 의해 형성된다. 또한, 본 발명은 면역원성 부분으로서 입체형태적 에피토프의 사용을 개시한다.
단백질 유도체는 면역원성 성질의 종류는 동일하지만 양은 반드시 동일할 필요는 없는 단백질로 정의된다. 당업자는 상기 분자의 면역원성 성질이 본질적으로 동일한 종류이지만 반드시 동일한 양일 필요는 없도록 단백질을 변경시킬 수 있다. 단백질 유도체는 다양한 방법, 예컨대 단백질 내 한 아미노산의 다른 아미노산으로의 교체 등에 의한 보존적 아미노산 치환을 통해 제공될 수 있다. 종래 교체 지도에서, 보존적 변화는 산성 측쇄를 함유하는 아미노산의 산성 측쇄를 함유하는 다른 아미노산으로의 교체, 벌키 아미노산의 벌키 아미노산으로의 교체, 염기성 측쇄를 함유하는 아미노산의 염기성 측쇄를 함유하는 아미노산으로의 교체, 비하전성 극성 측쇄를 함유하는 아미노산의 비하전성 극성 측쇄를 함유하는 아미노산으로의 교체, 및 비극성 측쇄를 함유하는 아미노산의 비극성 측쇄를 함유하는 아미노산으로의 교체 등에 의해 이루어지는 것이 바람직하다. 당업자라면 단백질의 유사 화합물을 잘 생산할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 라이브러리의 선별을 통해 또는 펩타이드 변화 프로그램을 이용하여 수행한다. 면역원으로 사용하기 위해, 펩타이드는 항체 생산의 성공 확률을 높이는 적당한 특징을 갖도록 합성한다. 이러한 특징으로는 펩타이드의 자연 단백질의 실제 C-말단 서열이라면 C-말단 유리 카르복시 기를 포함하고, 펩타이드가 자연 단백질의 실제 N-말단 서열이라면 유리 N-말단 아미노 기를 포함한다. 이러한 유사체는 상기 단백질의 면역원성 성질과 본질적으로 동일한 종류이나 양은 반드시 동일할 필요는 없다. 단백질 또는 펩타이드는 단백분해, 언폴딩, 극한 pH 값, 세제 및 고염 농도와 같은 다수의 여러 힘들에 의해 분해된다. 재조합 단백질 또는 펩타이드의 수명을 연장시키기 위해, 상기 단백질 또는 펩타이드는 예컨대 C-말단 카르복사미드를 보유하는 상기 펩타이드를 합성하고/하거나 N-말단 끝을 아세틸화하여 자연 하전 특징을 유지하게 하여 더욱 안정하여 내분해성이도록 만든다. 이는 추가로 일반적으로 단백질을 자가분해에 민감하게 하는 국소적인 언폴딩 과정을 저해하기 위한 안정화 돌연변이 전략을 이용하여 돌연변이시켜 수행한다. 이러한 안정화 돌연변이 전략은 예컨대, 문헌[Matthews(1991), Alber(1989), Vriend and Eijsink (1993) 및 Fersht and Serrano(1993)]에 기술된 바와 같은 단백질 구조 및 안정성의 공인된 원칙을 기초로 한다.
한 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 적어도 2종의 재조합 또는 분리된 표면 단백질 또는 이의 유도체 또는 유사체, 및/또는 이의 면역원성 부분을 함유하는 조성물을 포함하며, 이 조성물을 피검체 또는 동물, 바람직하게는 소에게 투여 시, 상기 표면 단백질 또는 이의 면역원성 부분에 대한 체액성 면역 반응 및/또는 세포성 면역 반응이 발생된다.
면역학적 반응은 피검체 또는 동물, 바람직하게는 소에서 상기 단백질 또는 이의 면역원성 부분에 대하여 유도된 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 발생을 포함한다. 체액성 면역 반응은 피검체 또는 동물에서 항체 생산을 야기하는 반면, 세포성 면역 반응은 주로 반응성 면역 세포의 형성을 증강시킨다. 일반적으로, 이러한 두 형태의 면역 반응은 면역원성 단백질 또는 이의 부분을 투여하면 유도된다. 에스.우베리스에 대하여 바람직한 면역 반응은 항체 생산이다. 상기 면역 반응은 바람직하게는 유선염을 예방 및/또는 감소시키고/시키거나, 유방 중에 에스.우베리스 유기체의 수를 감소시킨다. 본 발명은 상기 항체 반응을 유도하기 위한 단백질 및 에피토프를 선택하고 생산하는 방법을 개시한다. 에스.우베리스에 대한 다른 바람직한 면역 반응은 세포성 면역 반응이다. 또한, 본 발명은 표면 단백질의 T 세포 에피토프를 선택하고 예비선택된 다수의 T 세포 에피토프를 문헌[Van der Burg et al(WO 97/41440)]에 기술된 바와 같은 한 줄의 비드 방식으로 커플링시키는 방법 등에 의해 T 세포 반응성의 증강을 일으키는 T 세포 에피토프의 생산 방법을 개시한다.
본 발명의 한 양태에서, 상기 면역원성 조성물은 감염 기간 및/또는 중증도를 감소시키고/시키거나 에스.우베리스 감염에 대한 동물의 내성을 증가시킬 수 있다.
본 발명은 에스.우베리스의 외면에 대하여 유도된 면역 반응이 바람직하다는 것을 개시한다. 따라서, 본 발명은 에스.우베리스의 세포 표면에 또는 그 부근에 바람직하게 위치하는 항원들에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물 또는 이의 면역원성 부분을 개시한다. 본 발명의 표면 단백질은 자연에서 에스.우베리스 세균의 표면이나 그 부근에 바람직하게 존재하는 단백질 및/또는 에스.우베리스 세균에 의해 자연에서 바람직하게 생산되고/되거나 세포외로 배출되는 단백질을 포함한다. 이러한 표면 단백질은 다른 에스.우베리스 균주에 상동성 단백질이 있는 것이 바람직하다. 따라서, 에스.우베리스의 한 균주 유래의 면역원성 단백질 또는 이의 부분에 의해 유도된 면역 반응은 또한 다른 에스.우베리스 균주에 대해서도 효과적이다. 따라서, 본 발명은 에스.우베리스에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있고, 스트렙토코커스 우베리스 유래의 적어도 2종의 재조합 및/또는 분리된 표면 단백질, 및 이 단백질들 중 어느 하나 또는 두 단백질의 면역원성 부분을 포함하는 면역원성 조성물을 개시한다.
용어 "재조합 단백질"은 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 단백질, 즉 원하는 단백질을 암호화하는 핵산 작제물에 의해 형질전환된 세포에 의해 생산된 단백질을 의미한다. 상기 핵산 작제물은 발현 서열을 제어하는 프로모터 및/또는 터미네이터 서열 및/또는 인핸서 서열과 같은 조절 서열을 보유하는 재조합 DNA 작제물이다.
용어 "분리 단백질"은 이 분자가 자연에서 발견되는 완전 유기체로부터 분리되어 떨어진 단백질; 및/또는 자연에서 이 단백질과 일반적으로 결합되어 있는 물질이 전혀 또는 부분적으로 없는 단백질을 의미한다. 상기 면역원성 조성물은 동일한 에스.우베리스 유기체에서 유래된 적어도 2종의 단백질 또는 이의 면역원성 부분을 포함하거나, 또는 한 종류의 에스.우베리스 유래의 적어도 하나의 단백질 또는 이의 면역원성 부분과 다른 종류의 에스.우베리스 유래의 적어도 하나의 단백질 또는 이의 면역원성 부분을 포함한다. 또한, 본 발명은 하나 또는 둘 또는 그 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 부분이 다른 종류의 에스.우베리스에서 유래되는, 적어도 3종 또는 4종 또는 그 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 부분의 배합물을 개시한다.
본 발명의 면역원성 조성물 또는 이의 면역원성 부분은 적어도 2종의 다른 에스.우베리스 유기체의 단백질을 함유하는 것이 바람직한데, 그 이유는 수득되는 광범위한 면역 반응이 교차 방어성, 즉 여러 종류의 에스.우베리스에 대하여 유도되기 때문이다. 더욱이, 적어도 2종의 에스.우베리스 균주의 면역원성 단백질 또는 이의 면역원성 부분의 사용은 에스.우베리스 유기체의 회피 돌연변이체의 발생 기회를 감소시킨다. 세균 유기체의 회피 돌연변이체는 일반적으로 환경 스트레스 하에서, 예를 들어 항생제 존재 및/또는 상기 유기체의 에피토프에 대한 항체의 존재 하에서 발생한다. 유기체 집단 내에서 낮은 돌연변이 빈도 등에 의해 유발되는 자연 변동에 의해, 상기 집단의 일부 유기체는 이들의 복제가 상기 항체에 의해 저해되고, 반면 다른 일부 유기체는 상기 항체의 존재에 의한 저해 효과를 회피하여 증식할 수 있어, 새로운 집단의 주요 역할을 한다. 한번에 여러 다른 에피토프들의 회피 돌연변이체가 발생할 기회는 단지 하나의 에피토프에 대한 회피 돌연변이체가 발생할 기회보다 적다. 따라서, 면역원성 조성물 및/또는 이의 면역원성 부분은 적어도 2종의 단백질에 대한 면역 반응을 유도하여 광범위한 감염 방어를 나타내는 것이 바람직하고 유선염의 임상 징후들을 감소시키는 것이 바람직하다. 따라서, 본 출원은 적어도 하나의 스트렙토코커스 우베리스 균주 유래의 적어도 2종의 재조합 및/또는 분리 표면 단백질, 및/또는 이 단백질 중 어느 하나 또는 둘 모두의 면역원성 부분 또는 유사체 또는 유도체를 함유하는, 스트렙토코커스 우베리스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물을 제공한다.
세균 유기체의 대사 또는 생존 또는 증식에 중요한 단백질은 일반적으로 유기체의 필수 단백질로 알려진 것이다. 이러한 필수 단백질의 서열 및 기능은 일반적으로 에스.우베리스의 여러 종류 사이에서 다소 보존되는 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 면역원성 단백질은 에스.우베리스의 필수 단백질이다. 이러한 방식으로 면역 반응은 필수 단백질 또는 이의 면역원성 부분에 대하여 유도되어, 동종 에스.우베리스 유기체에 대한 방어를 형성하지만, 상기 보존적 단백질 또는 필수 단백질이 다른 종류의 에스.우베리스의 표면에도 존재하기 때문에 여러 종류의 에스.우베리스에 대한 교차 반응성 방어를 형성한다. 따라서, 본 발명의 면역원성 단백질로, 에스.우베리스 유기체의 필수 표면 단백질의 사용은 여러 종류의 에스.우베리스 유기체에 의한 감염에 대하여 면역 반응의 방어 효능을 증가시키고 면역 반응을 회피하는 상기 유기체의 가능성을 감소시킨다.
에스.우베리스의 협막성 항원은 일반적으로 양호한 면역원성 에피토프인데, 그 이유는 협막성 항원이 소(에스.우베리스 유선염을 견딘 소)의 회복기 혈청에 의해 쉽게 검출되기 때문이다. 상기 면역원성 성질은 관련된 에스.우베리스 면역원성 에피토프들에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 따라서, 다른 양태에 따르면 면역원성 조성물은 상기 협막성 항원이 상기 면역원성 조성물에 대한 면역 반응을 증가시키기 때문에 상기 면역원성 단백질 외에 적어도 하나의 협막성 항원을 포함한다.
본 특허 출원은 표 5 및 표 6에서 에스.우베리스에서 유래되고 여러 에스.우베리스 균주에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 능력에 대해 선택된 바람직한 재조합 및/또는 분리된 표면 단백질을 개시한다. 따라서, 본 출원은 적어도 2종의 단백질이 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는, 상기 단백질 및/또는 상기 단백질 중 어느 하나 또는 둘 모두의 면역원성 부분 또는 유사체 또는 유도체를 함유하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 선택은 표 5 및/또는 표 6의 단백질 중에서 이루어지고, 배합은 에스.우베리스 균주 O140J에서 유래되는 단백질 번호 63 및/또는 이의 면역원성 부분과 함께 에스.우베리스 균주 41-241 유래의 단백질 번호 15 또는 22 및/또는 이 둘 모두 및/또는 이의 면역원성 부분과 같은 2종 이상의 단백질로 이루어진다. 이러한 선택은 2종의 다른 에스.우베리스 균주 유래의 단백질 또는 이의 면역원성 부분을 제공하여, 여러 에스.우베리스 균주에 대한 광범위한 방어를 제공한다.
바람직한 양태에서, 표 5 및/또는 표 6으로부터의 단백질 선택은 P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질을 포함한다. 전술한 바와 같이, 이 단백질들은 에스.우베리스 감염 동물의 혈청에 존재하는 항체들에 의해 인식되어, 상기 단백질들이 생체내에서 발현되어 소에 면역원성임을 시사하거나 또는 표 5에 기술된 바와 같은 적어도 2종의 에스.우베리스 균주 간에 교차 반응성인 것이다.
실시예 11에서 동정된 바와 같은 단백질은 특히 면역 반응을 유도하는데 유용하다. 따라서, 더욱 바람직한 양태에 따르면, 표 5 및/또는 표 6으로부터의 단백질의 선택은 P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질을 함유한다. 표 5 및/또는 표 6으로부터 단백질의 선택은 P15, P16, P54, P28, P63 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단백질을 함유하는 것이 가장 바람직하다. 전술한 바와 같이, 후자에 선택된 단백질은 실시예 11의 각각의 감염을 유발하고 감염 동안 숙주에서 발현되어 고도로 면역원성인, 모든 에스.우베리스 균주들에 의해 발현되는 것이다. 예컨대 표 5에 특징적으로 표시된 상기 단백질 번호는, 에스.우베리스 공통 표면 단백질의 비제한적 예를 보여주는 표 1, 2 및 3 등에 설명된 단백질을 의미한다. 또한, 도 4는 이와 같이 선택된 에스.우베리스의 추정상의 표면 단백질/독성 인자들의 핵산 및 아미노산 서열의 비제한적 예를 나타낸다.
우유나 유방 표면 또는 내부에 존재하는 낮은 세균 수는 현장 조건 하에서 종종 발견되지만, 동물에게 유해하지는 않다. 유선염은 에스.우베리스 유기체와 같은 세균의 수가 우유 또는 유방에서 증가할 때 발생할 수 있다. 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 면역원성 부분에 의해 유도된 면역 반응은 유방에 존재하는 스트렙토코커스 우베리스 유기체의 세균 성장을 적어도 부분적으로 저해하는데 효과적이어서 바람직하다. 직접 환경에서 에스.우베리스 유기체 수의 감소는 또한 유선염을 예방하는데 도움이 된다. 본 발명은 소를 면역화하여 에스.우베리스 유기체의 수를 낮게 유지함으로써 에스.우베리스 유선염을 예방 및/또는 감소시키는 방법을 개시한다. 상기 에스.우베리스 유기체의 낮은 수준은 또한 착유 시에 위생 체계를 적용하여, 예컨대 유방, 유두 및 이 유방 및/또는 유두와 접촉하는 모든 장치를 세척하여 낮게 유지한다.
본 발명에 의해 제공되는 바와 같은, 에스.우베리스 유래의 재조합 및/또는 분리된 표면 단백질은 한 양태에 따르면 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포를 이용하는 생산 시스템에 의해 생산된다. 재조합 단백질의 생산을 위해 잘 개발된 숙주/벡터계를 보유하는 세포의 예는 예컨대 세균으로는 에스케리키아, 바실러스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 세라티아(Serratia), 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 락토바실러스(Lactobacillus); 및 효모로는 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 야로위아(Yarrowia), 트리코스포론(Trichosporon), 로도스포리듐(Rhodosporidium), 한세눌라(Hansenula), 피치아(Pichia) 및 캔디다(Candida); 및 진균으로는 뉴로스포라(Neurospora), 아스퍼질러스(Aspergillus), 세팔로스포륨(Cephalosporiu) 및 트리코데르마(Trichoderma)가 있다.
당해의 재조합 단백질의 생산을 위해, 상기 단백질 또는 이의 부분을 암호화하는 유전자는 예컨대 상동 재조합에 의해 또는 무작위로 게놈 내로 통합시키거나, 또는 상기 유전자를 선택된 미생물 또는 세포에서 안정적으로 유지하고 발현시키는 플라스미드 벡터 또는 파지 벡터 내에 배치한다. 미생물 또는 세포에서 선택된 DNA 작제물을 발현시키기 위해, 유전자는 프로모터 및 터미네이터의 제어하에 전사 및 해독시킨다. 상기 프로모터 및 터미네이터는 선택된 미생물에 적합한 것이 바람직하다. 다양한 미생물에 적합한 프로모터 및 터미네이터는 문헌[Biseibutsugaku Kisokoza (Basic Microbiology), Vol. 8, Genetic Technology, Kyoritsu Shuppan(1990)]에 개시되어 있고, 효모에 바람직한 것은 문헌["Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102(1990)" 및 "Yeast 8, 423-488(1992)"]에 개시되어 있다. 예를 들어, 에스케리키아, 더 상세하게는 에스케리키아 콜라이에 적합한 플라스미드 벡터는 pBR 및 pUC 시리즈의 플라스미드이고, 적당한 프로모터는 lac 프로모터(β-갈락토시다제), trp 오페론(트립토판 오페론), 및 tac 프로모터(lac - trp 하이브리드 프로모터) 및 λ-faag PL 또는 PR 유래의 프로모터가 포함된다. 바람직한 터미네이터는 trpA- 또는 파지 유래의 rrnB 리보솜 터미네이터를 포함한다. 스트렙토코커스에서 재조합 생산에 적합한 플라스미드 벡터는 예컨대 pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239(1985)) 및 pGK1(Appl. Environ. Microbiol. 50, 94(1985))을 포함한다. 락토바실러스에서 재조합 생산에 적합한 플라스미드 벡터는 예컨대 스트렙토코커스에서 개시한 것, 예컨대 pAMβ1(J. Bacteriol. 137, 614(1979))을 포함한다. 사카로마이세스, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에서 재조합 생산하는데 적합한 플라스미드 벡터는 예컨대 YRp, YEp, YCp 및 YIp 시리즈의 벡터를 포함한다. 염색체에 다중카피를 보유하는 리보솜 DNA의 상동 재조합에 의해 작제된 통합 벡터(integration vector)(EP5327456)는 다중카피의 삽입 및 안정한 유전자 제어에 적합하다. 클루이베로마이세스, 바람직하게는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)에서 재조합 생산하기에 적합한 플라스미드 벡터는 예컨대 사카로마이세스 세레비지에 유래의 2㎛ 플라스미드 시리즈, pKD1 시리즈의 플라스미드(J. Bacteriol. 145, 382-390(1981)), 및 킬러 활성에 관여하는 pGK11 유래 플라스미드, 클루이베로마이스의 자가 복제 유전자를 보유하는 KARS 시리즈의 플라스미드 및 통합 벡터(EP 537456)를 포함한다. 피치아에서 재조합체 생산에 적합한 플라스미드벡터는 예컨대 피치아에서 자가 복제에 관여하는 유전자를 이용하여 피치아 파스토리스에서 개발된 숙주 벡터 시스템을 포함한다(Mol. Cell. Biol. 5, 3376(1985)). 캔디다에서 재조합체 생산에 적합한 플라스미드 벡터는 예컨대 캔디다 말토사(Candida maltosa), 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 및 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)에서 개발된 숙주 벡터 시스템을 포함한다(Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587(1987)). 아스퍼질러스에서 재조합체 생산에 적합한 플라스미드 벡터는 예컨대 플라스미드 또는 염색체에 유전자의 통합에 의해 작제된 벡터 및 세포외 프로테아제 또는 아밀라아제용 프로모터를 포함한다(Trends in Biotechnology 7, 283-287(1989)). 트리코데르마에서 재조합체 생산에 적합한 플라스미드 벡터는 예컨대 트리코데르마 리에세이(Trichoderma reesei)에서 개발된 숙주 벡터 시스템 및 벡터의 작제에 적합한 세포외 셀룰라제용 프로모터를 포함한다(Biotechnology 7, 596-603(1989)).
상기 생산 시스템은 표 5 및/또는 표 6의 단백질 또는 이의 면역원성 부분을 암호화하는 핵산 작제물, 바람직하게는 DNA 작제물을 구비하는 것이 바람직하다.
다른 양태에 따르면, 상기 생산 시스템은 표 5 및/또는 표 6의 2개 또는 3개 또는 4개 또는 심지어 더 많은 단백질들 또는 이의 면역원성 부분을 암호화하는 DNA 작제물을 구비한다.
또 다른 양태에 따르면, 상기 생산 시스템은 표 5 및/또는 표 6의 적어도 하나의 단백질 또는 이의 면역원성 부분을 각각 암호화하는 적어도 2개의 DNA 작제물을 구비한다.
바람직한 양태에 따르면, 상기 표 5 및/또는 표 6의 단백질은 P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 더욱 더 바람직한 상기 표 5 및/또는 표 6의 단백질은 P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 가장 바람직한 상기 표 5 및/또는 표 6의 단백질은 P15, P16, P54, P28, P63 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
더욱 바람직한 양태에서, 상기 핵산 작제물은 에스.우베리스의 하나 이상의 단백질 유래의 면역원성 에피토프를 함유하는 융합 단백질을 암호화한다. 더욱 바람직하게는, 상기 융합 단백질은 하나보다 많은 에스.우베리스 균주 유래의 단백질로부터 유도되는 에피토프를 함유한다. 본 발명의 다른 양태에서, 상기 핵산 작제물은 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 증강시키도록 변형된 에피토프를 암호화한다. 따라서, 본 출원은 스트렙토코커스 우베리스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 2종의 에스.우베리스 단백질을 함유하는 면역원성 조성물의 생산 방법으로, 표 5 및/또는 표 6에 기술된 적어도 2종의 단백질 및/또는 이 중 어느 하나 또는 양쪽 단백질 모두의 면역원성 부분 또는 유사체 또는 유도체를 암호화하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터를 구비한 세포를 제공하는 단계를 포함하는 생산 방법을 제공한다. 핵산으로부터 단백질의 재조합 생산 시에, 핵산은 상기 단백질의 발현을 증강시킬 수 있는 유도성 조절 서열의 제어 하에 배치되어, 바람직하게는 단백질을 고수율로 생산하는 것이 바람직하다. 재조합 단백질 또는 이의 면역원성 부분의 축적은 예컨대 생산된 재조합 단백질이 세포에서 수거되는 경우에는 세포질성이고, 또는 생산된 단백질이 배양액에서 수거될 때에는 상기 단백질은 분비성인 것이 바람직하다. 따라서, 상기 면역원성 단백질을 암호화하는 재조합 작제물은 세포내 또는 세포외 축적을 위해 정확한 조절 서열 및/또는 기능적으로 연결된 프로모터를 구비한다.
따라서, 본 발명은 표 5 및/또는 표 6에 열거된 적어도 2종의 단백질 및/또는 이 중 어느 한 단백질 또는 양쪽 단백질 모두의 면역원성 부분 또는 유사체 또는 유도체를 암호화하는 핵산 서열을 기능적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 포함하는 재조합 분자를 제공한다. 바람직한 양태에서, 상기 표 5 및/또는 표 6에 열거된 단백질은 P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 더욱 더 바람직한 상기 표 5 및/또는 표 6에 열거된 단백질은 P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 가장 바람직한 상기 표 5 및/또는 표 6에 열거된 단백질은 P15, P16, P54, P28, P63 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
또한, 본 출원은 본 발명의 핵산 서열 또는 본 발명의 재조합 DNA 분자를 함유하는 생 재조합 운반체(live recombinant carrier)를 제공한다. 바람직한 양태에서, 운반체는 제1 에스.우베리스 균주이고, 재조합 핵산은 다른 에스.우베리스 균주의 면역원성 에피토프를 암호화한다. 따라서, 본 발명은 표 5 및/또는 표 6에 열겨된 하나 또는 그 이상의 단백질 및/또는 이 단백질 중 어느 하나 또는 둘 모두의 면역원성 부분 또는 유사체 또는 유도체를 암호화하는 핵산 서열을 기능적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 함유하는 생 재조합 운반체를 제공한다. 물론, 상기 생 재조합 운반체는 사멸되었을 때에도 면역원성이다. 따라서, 본 발명은 사멸된 재조합 운반체도 개시한다.
또한, 본 출원은 표 5 및/또는 표 6에 열거된 하나 또는 그 이상의 단백질 및/또는 이 단백질 중 어느 한쪽 및/또는 양쪽 단백질의 면역원성 부분 또는 유사체 또는 유도체를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 분리된 숙주 세포를 제공한다. 분리된 숙주 세포는 예컨대 세균 세포, 예를 들어 에스케리키아, 바실러스, 슈도모나스, 세라티아, 브레비박테리움, 코리네박테리움, 스트렙토코커스 우베리스, 스트렙토코커스 수이스, 락토바실러스; 또는 효모, 예컨대 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 스키조사카로마이세스, 지고사카로마이세스, 야로위아, 트리코스포론, 로도스포리듐, 한세눌라, 피치아 또는 캔디다; 또는 진균, 예컨대 뉴로스포라, 아스퍼질러스, 세팔로스포륨 및/또는 트리코데르마가 있다.
표 5 및/또는 표 6에 열거된 하나 또는 그 이상의 단백질 및/또는 이 단백질 중 어느 한쪽 또는 양쪽의 단백질의 면역원성 부분 또는 유사체 또는 유도체를 암호화하는 핵산 서열을 기능적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 함유하는 재조합 분자를 포함하는 전술한 분리된 숙주 세포와 함께, 본 발명은 당업자에게 재조합 단백질 분자를 생산하는 방법을 개시한다. 다른 에스.우베리스 균주 간에 변동 때문에, 다양한 균주 유래의 단백질 및 펩타이드는 아미노산 서열에는 약간의 변동을 보이지만 기능은 동일할 수 있다. 따라서, 한 에스.우베리스 균주 유래의 단백질 분자는 다른 에스.우베리스 균주의 기능적으로 동일한 단백질 분자와 서열 동일성이 있다. "서열 동일성"은 두 서열을 정렬하고 최대 서열 동일성 백분율을 달성하기 위해 필요하다면 갭을 도입시킨 후, 두 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열 간의 서열 동일성 백분율을 의미한다. 정렬에 대한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계에 공지되어 있다. 후보 서열이 본 정의에 속하는지를 측정하기 위한 목적으로 사용되거나 개조될 수 있는 1가지 컴퓨터 프로그램은 "Align 2"로, 이는 제넨테크, 인크.에 의해 창시되어, 1991년 12월 10일에 사용자 문서와 함께 미국 저작권 사무소(워싱턴 디.씨. 20559)에 제출되었다. 정렬 후 분자의 서열 동일성이 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%를 나타낼 때, 두 아미노산 서열은 서로 고도의 "서열 동일성"이 있는 것이다. 따라서, 본 출원은 본 발명에 따른 핵산에 의해 암호화된 단백질과 적어도 80%의 서열 동일성이 있는 분리 단백질 및/또는 재조합 단백질 분자를 개시한다. 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산에 의해 암호화된 단백질 분자와 적어도 95% 서열 동일성이 있는 분리 단백질 및/또는 재조합 단백질 분자를 개시한다.
본 발명의 단백질 또는 면역원성 부분에 대하여 동물의 면역 반응을 유도 또는 유도하기 위해, 동물에게 단백질 및/또는 적어도 하나의 면역원성 부위를 함유하는 면역원성 부분을 제공한다. 단백질의 면역원성 부분 또는 부위는 하나 또는 그 이상의 에피토프에 의해 형성되고, 이로써 면역학적 반응을 유도할 수 있다. 면역원성 부위는 바람직하게는 적어도 5개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 10 내지 15개의 아미노산, 가장 바람직하게는 25개 또는 그 이상의 연속 아미노산을 포함한다. 본 발명은 다른 바람직한 양태에서 본 발명에 따른 핵산에 의해 암호화된 단백질 분자의 적어도 25개의 연속 아미노산의 쇄를 함유하는 단백질 또는 이의 면역원성 부분을 제공한다. 상기 적어도 25개의 연속 아미노산의 쇄는 면역원성 부위를 함유하는 것이 바람직하다. 바람직한 양태의 재조합 핵산 분자는 적어도 하나의 단백질을 암호화하거나 또는 적어도 2개의 단백질을 암호화하는 융합 단백질 또는 이의 면역원성 부분을 암호화한다. 바람직한 양태에서, 상기 융합 단백질은 적어도 2종의 에스.우베리스 균주의 단백질의 면역원성 부분을 함유한다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 단백질 분자를 암호화하는 핵산을 개시한다.
숙주 세포에서 상기 핵산의 발현은 본 발명의 면역원성 단백질을 제공한다. 상기 면역원성 단백질은 본 발명의 면역원성 조성물에 혼입된 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 스트렙토코커스 우베리스에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있으며 본 발명에 따른 분리된 및/또는 재조합 단백질 분자를 함유하는 면역원성 조성물을 제공한다.
상기 본 발명의 재조합 단백질은 숙주 세포에 의해 생산된다. 숙주 세포로서, 이.콜라이와 같은 세균 종 및/또는 효모 또는 진균 또는 진핵생물 세포가 생산에 사용된다.
분리 또는 재조합 단백질을 함유하는 면역원성 조성물 및/또는 상기 단백질을 노출시키는 세포는 동물, 바람직하게는 소에게 투여했을 때 스트렙토코커스 우베리스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 적당한 조절 서열 하에 본 발명의 핵산을 함유하는 상기 세포는 표면에서 단백질을 발현하는 것이 바람직하다. 이러한 세포는 운반체 세포라 불린다. 이러한 운반체 세포는 본 발명의 면역원성 조성물에 바람직하게 혼입된다. 상기 면역원성 단백질을 운반하는 상기 세포는 생 재조합 운반체인 것이 바람직하나, 다른 양태에 따르면, 상기 운반체 세포는 포르말린 처리 등에 의해 세포가 사멸되었을 때에도 면역 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명은 스트렙토코커스 우베리스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고 본 발명의 생 또는 사멸된 재조합 운반체를 함유하는 면역원성 조성물을 제공한다. 소의 유선염의 원인이 스트렙토코커스 우베리스이기 때문에, 본 발명의 바람직한 양태에서 상기 생 또는 사멸된 재조합 운반체는 스트렙토코커스 종이다. 본 발명의 한 양태에서, 상기 숙주 세포는 스트렙토코커스 종이다. 단백질 분자는 그 다음 면역 반응의 유도를 증강시키는 다른 스트렙토코커스 단백질의 환경에서 제공되는 것이 바람직하다. 또한, 면역원성은 숙주 세포, 바람직하게는 스트렙토코커스 세포의 표면에서 재조합 단백질의 과잉발현에 의해서도 증강될 수 있다. 또한, 스트렙토코커스 숙주 세포의 다른 균주의 사용은 면역원성 단백질 또는 이의 부분의 면역원성을 증강시킨다. 따라서, 본 발명은 숙주 세포가 스트렙토코커스 종인 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제공한다. 또한, 숙주 세포로 적합한 스트렙토코커스 종은 여러 종이 있으며, 그 예로 에스.수이스 또는 에스.아갈락티에 또는 에스.디스갈락티에가 있다.
다양한 스트렙토코커스 종 간의 차이로 인해, 그리고 스트렙토코커스 우베리스에서 자연 발생하는 일부 단백질들이 스트렙토코커스 우베리스에 대한 면역 반응을 유도하는데 도움을 줄 수 있기 때문에, 바람직한 양태에서 약독화된 스트렙토코커스 우베리스가 본 발명의 면역원성 조성물의 생 재조합 운반체로써 사용된다. 바람직하게는, 상기 에스.우베리스 유기체는 다른 에스.우베리스 균주의 단백질을 발현하여, 이 두 균주의 단백질에 대한 항체를 검출함으로써, 상기 백신으로 백신접종된 동물의 혈청과 현장 감염으로 감염된 동물의 혈청을 구별할 수 있기 때문에 차별화 백신(differentiating vaccine)을 개시한다. 다른 양태에서, 상기 에스.우베리스 유기체는 숙주 세포로서 또는 생 또는 사멸 운반체로서, 에스.수이스 또는 스타필로코커스 종 또는 이.콜라이(생 또는 사멸)로 교체된다.
본 발명의 면역원성 단백질 또는 이의 부분의 투여, 또는 이러한 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산의 투여는 면역 반응을 유도한다. 이러한 핵산은 소에게 투여했을 때, 소의 세포에서 발현되어 소의 면역계에 의해 인식된다. 따라서, 핵산은 면역원성 조성물로 작용하며, 그 예로는 유선염에 대한 DNA 백신이 있다. 따라서, 본 발명은 스트렙토코커스 우베리스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는, 본 발명의 핵산을 함유하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 면역원성 조성물은 동물, 바람직하게는 소에서 면역 반응을 유도하기 때문에, 본 발명의 단백질은 유선염 관련 질병을 감소시키고 상기 소의 건강을 증진시켜, 소가 다른 (2차) 감염에 더욱 더 내성이 되게 한다. 따라서, 본 발명은 약제로 사용되는 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 면역원성 조성물은 스트렙토코커스 우베리스에 의해 유발된 유선염의 결과로 특정 질병을 감소시키는, 스트렙토코커스 우베리스 유선염에 대한 약제의 제조에 사용되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 스트렙토코커스 우베리스 유선염에 대한 약제의 제조에 사용되는 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명의 면역원성 조성물은 유선염에 대한 백신을 생산 또는 조제하는데 사용된다. 백신은 일반적으로 동물 또는 사람이 질병에 걸리지 않게 한다. 바람직하게는, 본 발명의 면역원성 조성물은 유선염을 예방할 수 있다. 따라서, 본 발명은 바람직한 양태로 백신의 제조에 사용되는 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 용도를 개시한다.
다른 양태로, 본 발명의 면역원성 조성물은 우유 및/또는 소의 유방에서 에스.우베리스 유기체의 수를 감소시키고/시키거나 제어하는데 바람직하게 사용된다. 낙농가에서 착유 과정은 질병에 걸린 소로부터 다른 소로 에스.우베리스 유기체를 전달할 잠재적 위험성을 포함한다. 따라서, 에스.우베리스 유기체 수의 감소는 유두에서 유두로 및/또는 동물에서 동물로 감염의 전파를 억제하는데 가장 적합하다. 본 발명의 면역원성 조성물을 피검체에 투여하기 위해, 단백질 또는 이의 면역원성 부분 또는 숙주 세포와 적당한 운반체의 혼합은 피검체에 의한 면역원성 조성물의 수용을 증진시키고 조성물의 면역원성 효과를 증가시킨다. 본 발명의 적당한 운반체는 예를 들어 상기 면역원성 조성물의 면역화 효과를 증가시키기에 적당한 보강제를 함유한다. 오일계 및 수성계의 많은 적당한 보강제는 당업자에게 알려져 있고, 그 예로는 Diluvacforte® 보강제 또는 Specol® 보강제가 있다. 한 양태에서, 상기 적당한 운반체는 예컨대 세균 또는 단백질 또는 이의 면역원성 부분을 희석하기 위한 식염수와 같은 용액을 함유한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물 및 적당한 운반체를 함유하는 약제학적 조성물을 개시한다.
본 발명의 면역원성 조성물로 면역화된 동물, 바람직하게는 소에서는 에스.우베리스에 대하여 유도된 항체가 생산된다. 이러한 항체의 존재 및 수준은 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물로 면역화 후에 면역성을 나타낸다. 상기 항체는 현장에서 야생형 에스.우베리스 균주로 존재했던 에피토프들에 대해서는 유도되지 않는 것이 바람직하다. 백신접종된 동물과 야생형 감염된 동물을 구별하기 위해, 상기 백신접종된 동물의 면역성은 한 양태에 따르면 본 발명의 면역원성 조성물에 대하여 유도된 항체를 측정함으로써 바람직하게 측정된다. 상기 백신접종된 소의 항혈청은 또한 면역원성 조성물에 존재하지 않는 에스.우베리스 항원에 대한 항체의 존재에 대해서도 시험한다. 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신에 존재하지 않는 에스.우베리스 항원에 대한 항체의 검출은 야생형 감염의 지표이다. 따라서, 본 발명은 에스.우베리스에 대한 동물의 면역성을 측정하는 방법으로, 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는 단백질 또는 이의 면역원성 부분에 대하여 유도된 항체의 존재를 상기 동물 유래의 적어도 하나의 샘플에서 측정하는 단계를 포함하는 방법을 개시한다. 바람직한 양태에서, 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는 상기 단백질은 P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 더욱 더 바람직한 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는 단백질은 P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는 상기 단백질은 P15, P16, P54, P28, P63 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 면역원성 조성물에 결합하는 항체를 검출하기 위해, 표 5 및/또는 표 6의 단백질 중 적어도 하나 또는 이의 면역원성 부분을 함유하는 진단 키트가 적당하다. 상기 단백질 또는 이의 면역원성 부분에 항체의 결합은 예컨대 면역형광성 항체 검출 또는 효소 결합된 항체 검출, 또는 상기 단백질 또는 이의 면역원성 부분에 결합된 항체의 다른 검출 수단에 의해 검출한다.
바람직한 양태에 따르면, 표 5 및/또는 표 6의 단백질 중 적어도 하나의 단백질은 P15, P16, P17, P19, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P64, P68, P75, P81, P93, P100 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 더욱 더 바람직한 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는 적어도 하나의 단백질은 P15, P16, P20, P27, P54, P28, P63, P68, P93 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 가장 바람직하게는, 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는 적어도 하나의 단백질은 P15, P16, P54, P28, P63 및 P105로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
따라서, 본 발명은 표 5 및/또는 표 6에서 선택되는 적어도 하나의 단백질 또는 이의 면역원성 부분을 함유하는 진단 키트 및 상기 단백질 또는 이의 면역원성 부분에 결합하는 항체의 검출 수단을 개시한다. 이러한 진단 키트는 예컨대 ELISA 검사 또는 혈청 선별에 적합한 임의의 다른 검사를 위한 것이다. 상기 검사 키트는 다수의 혈청을 선별하기에 적합한 것이 바람직하다.
다른 양태에서, 본 발명의 핵산은 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신으로 백신접종된 동물 집단에서 야생형 에스.우베리스 균주에 감염된 동물을 검출하는데 사용된다. 이러한 검출은 예컨대 PCR에 의해 달성된다. 본 특허 출원은 본 발명의 성공적인 면역원성 단백질이 세균 표면에 있는 항체에 접근할 수 있는 다수의 에스.우베리스 균주에 공통적인 단백질성 분자 및/또는 단백질임을 개시한다. 한 예로, 표면 단백질은 그람 양성균의 표면 단백질에서 일반적으로 발견되는 하나 이상의 서열을 함유하는 유전자, 예컨대 세포벽에 단백질의 고착에 필요한 LPXTG 소르타제 모티프 또는 지단백질에 필요한 지질 부착 모티프 또는 암호화된 단백질의 표면 국재화를 예고하는 막관통 영역을 선택함으로써 균주 41-241 및 O140J의 게놈 서열로부터 동정되었다.
본 출원은 위에서 선택된 유전자들로부터 수득되는 PCR 산물로, 다수의 에스.우베리스 균주의 염색체 DNA를 탐침하여 조사된, 에스.우베리스 균주 중의 선택된 단백질을 존재를 개시한다.
이하 실시예를 통해 본 발명은 더 상세히 설명된다. 이 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않고, 단지 본 발명의 명료하게 하기 위한 것이다. 많은 대안적 양태들이 실시될 수 있으며, 이 역시 본 발명의 범위에 속한다.
도면의 간단한 설명
도 1. 온전한 에스 . 우베리스 균주의 FACS 분석. 에스.우베리스 균주 41-241(A) 및 O140J(B)는 마우스 면역 혈청(어두운 막대) 또는 대응하는 면역전 혈청(밝은 막대)과 항온처리했다. 결합된 항체는 FITC-접합된 2차 항체를 이용하여 검출했다. 데이터는 세균 세포에 결합된 형광도의 중간치로 나타낸다. ≥10의 형광도(2x 배경치)는 양성으로 간주했다. 사용된 혈청의 번호는 표 1 내지 4에 제시된 유전자/단백질 번호를 의미한다.
도 2. 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 2D 프로테옴 패턴. 대수 증식성 에스.우베리스 균주 41-241(A) 및 O140J(B)의 용해물은, 균주 O140J로 실험 감염한 소에서 수득되는 소 혈청으로 탐침했다. 동그라미 표시된 단백질은 면역원성 단백질로 동정되었다. 겔내 트립신 분해, MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 분석된, 동정된 단백질의 성질은 표 6에 제시했다.
도 3. 소의
에스
.
우베리스
균주
O140J
또는 균주 41-421로의 감염.
도 3a (도 3a, 3 aa , 3 ab 및 3 ac ) . 소 6716 및 6717은 유관을 통해 에스.우베리스 균주 O140J로 감염시켰다. 소 6720 및 6721은 유관을 통해 에스.우베리스 41-241로 감염시켰다. 단, 소 6720은 5000cfu 에스.우베리스로 감염시키고 소 6721은 500cfu 에스.우베리스로 감염시켰다.
SSC는 우유에 존재하는 체세포 수를 의미한다. BO는 세균 조사를 의미하며 우유로부터 분리된 유기체의 수를 콜로니 형성 단위(cfu)로 나타낸 것이다.
RV는 우측 전방 유구를 의미하고, LA는 좌측 후방 유구를 의미한다.
도 3b (도 3b, 3 ba , 3 bb 및 3 bc ) . 에스.우베리스 균주 O140J로 감염된 소 6718 및 6719의 임상 징후 및 세균 및 세포학적 결과.
도 3c (도 3c, 3 ca , 3 cb 및 3 cc ) . 에스.우베리스 균주 41-241로 감염된 소 6722 및 6723의 임상 징후 및 세균 및 세포학적 결과.
도 4
(도 4a
내지 도
4
ad
)
. 표 5의
에스
.
우베리스
단백질의 핵산 서열 및 아미노산 서열.
실시예
실시예
1
공통 표면 항원의 선택
DNA 서열 분석. 에스.우베리스 균주 41-241의 DNA 서열은 2x 범위로 측정했다. 서열분석 데이터를 조립하여 1815개 ORF를 함유하는 572개 인접 서열을 수득했다. 생거(Sanger) 중심에서, 에스.우베리스 균주 O140J(Hill, 1988)를 서열분석했다. 2002년 4월, 생거 사이트에서 입수할 수 있는 서열 데이터도 또한 조립하여 1938개 ORF를 함유하는 61개 인접서열(contig)을 수득했다.
공통 표면 항원의 선택. 성공적인 백신 항원은 세균 표면에 있고 다수의 에스.우베리스 균주에 공통적인 항체에 접근할 수 있는 단백질이다. 표면 단백질은 그람 양성 세균의 표면 단백질에서 공통으로 발견되는 특징 모티프(M&M 참조)를 형성하는 하나 또는 그 이상의 서열을 함유하는 유전자를 선택하여 균주 41-241 및 O140J의 게놈 서열로부터 동정했다. 분석된 모든 ORF 중에서, 17개의 ORF는 세포벽에 단백질을 고착시키는데 필요한 LPXTG 소르타제 모티프(표 1)를 함유했다. 이러한 17개의 단백질 중 4개(P12, P23, P24 및 P25)는 균주 41-241에서만 발견되었다.
31개의 ORF는 지단백질에 필요한 지질 부착 모티프를 함유했다(표 2).
이 단백질들은 모두 균주 O140J뿐만 아니라 균주 41-241에서도 발견되었다.
더욱이, 암호화된 단백질의 표면 국재화를 예고하는 시그널 서열 또는 막관통 영역을 함유하는 87개의 ORF가 선택되었다(표 3).
이 단백질들은 균주 41-241에서뿐만 아니라 균주 O140J에서도 발견되었다.
실시예
2
에스
.
우베리스의
다양한 임상 및
준임상
분리물
중에서 선택된 유전자의 분포
다양한 에스.우베리스 균주 중에서 선택된 유전자의 존재를 조사하기 위해, 상당한 수의 임상적 에스.우베리스 균주의 염색체 DNA를 선택된 유전자 99개에서 수득된 PCR 산물로 탐침하는 스폿 하이브리드화 실험을 수행했다. 이 데이터(표 4)는 선택된 유전자 대부분이 대다수의 에스.우베리스 균주와 하이브리드화한다는 것을 보여주며, 이는 선택된 유전자의 대부분이 다양한 에스.우베리스 균주 중에 공통으로 존재한다는 것을 시사한다. 이에 반해, 검사된 99개 유전자 중 4개 유전자는 제한된 수의 균주와만 하이브리드화했다. 이 유전자들은 모두 균주 41-241에 존재하고, 세포벽에 대한 단백질의 고착에 필요한 LPXTG 소르타제 모티프를 보유하는 단백질을 암호화한다.
실시예
3
선택된 표면 단백질의 면역원성
백신 후보로서 상기 단백질들의 역할을 평가하기 위해, 선택된 유전자 115개에 의해 암호화된 단백질을 클로닝하여 폴리히스티딘 태그를 달아 이.콜라이에서 발현시켰다. 이 유전자 중 106개 산물은 성공적으로 클로닝되고 이.콜라이에서 발현되었다. 이어서, 에스.우베리스 감염된 소 및 포르말린 사멸되거나 초음파처리된 에스.우베리스 세포로 면역화된 토끼로부터 수득한 혈청은, 발현 단백질에 대해 지향성인 특정 항체의 존재를 웨스턴 블롯 분석으로 검사했다. 결과(표 5)는 발현 단백질 중 19개가 에스.우베리스 감염 동물의 혈청에 존재하는 항체에 의해 인식되었음을 보여주며, 이는 이 단백질들이 생체 내에서 발현되고 소에서 면역원성임을 시사한다. 더욱이, 발현된 단백질 중 30개는 포르말린 사멸되거나 초음파처리된 에스.우베리스 세포로 면역화된 토끼 유래의 혈청에 존재하는 항체에 의해 인식되었다. 발현된 단백질 중 12개는 에스.우베리스 감염 소에서 수득된 혈청뿐만 아니라 포르말린 사멸되거나 초음파처리된 에스.우베리스 세포로 면역화된 토끼 유래의 혈청 모두에 의해 인식되었다. 이 데이터들은 대부분의 단백질들이 항원성임을 시사한다. 또한, 표 5는 일부 단백질이 균주 41-241 및 O140J로 실험 감염 후에 유도된 항혈청에 의해 인식되었음을 보여준다. 하지만, 다른 단백질들은 균주 O140J로 감염 후 수득된 혈청 또는 균주 41-241로 감염 후 수득된 혈청 중 어느 하나와만 양성 반응을 나타냈다. 이는 아마도 두 균주 간에 생체내 단백질 발현의 차이 또는 면역계에 대한 단백질 접근성의 차이가 있음을 시사한다.
실시예
4
선택된 단백질의 정제
백신 후보로서 단백질의 역할을 추가로 평가하기 위해, 감염 소 유래의 혈청 및/또는 면역화된 토끼 유래의 혈청 중 어느 하나에 의해 인식된 총 36개 단백질을 정제했다. 또한, 두 혈청과 반응하지 않는 소르타제 모티프를 함유하는 4개의 단백질도 정제했다. 40개의 선택된 재조합 단백질 중 31개는 용해성 형태로 성공적으로 과잉발현되었고, 자연 조건 하에서 정제될 수 있는 반면, 5개의 단백질은 불용성 봉입체로 발현되었다. 이 단백질들은 변성 조건 하에 정제했고, 정제 후에 리폴딩시켰다. 4개의 단백질은 면역화에 충분한 양으로 정제할 수 없었다. 정제된 단백질 36개 모두는 그 다음 마우스의 면역화에 사용했다. 웨스턴 블롯에서 관찰되는 것처럼, 어떠한 단백질도 면역화 전의 마우스로부터 수득한 혈청과는 반응하지 않았다. 하지만, 이에 반해, 단백질들은 마우스에서 수득한 면역 혈청과는 강하게 반응했고(표 5), 이는 단백질들은 마우스에서 고도로 면역원성임을 시사한다. 유도된 항체의 특이성은 에스.우베리스 세포의 용해물(또는 원형질체 상청액)에 대한 면역블로팅으로 확인했다. 결과는 유도된 항체 대부분이 예상 분자량의 에스.우베리스 단백질과 특이적으로 반응했고, 이는 상기 단백질들이 마우스에서 면역 반응을 유도할 수 있는 (표면) 항원임을 분명하게 시사하는 것이다.
실시예
5
유도된 항체의 기능적 특성
완전 캡슐화된 에스.우베리스 세포(Todd-Hewitt에서 증식)에 대한 항체의 결합을 연구하기 위해 마우스 혈청을 FACS 분석에 사용했다. 도 1에서 관찰되는 것처럼, 면역화 전의 마우스 유래의 혈청은 에스.우베리스 전세포에 결합할 수 없었다. 하지만, 이에 반해, 면역 혈청 중 8개(단백질 P11, P15, P17, P20, P25, P26, P27, P63에 대해 유도된 혈청)는 전 세균 세포에 강하게 결합한 반면, 2개의 혈청(단백질 P17, P18에 대해 유도된 혈청)은 전 세균 세포에 대해 약한 결합을 나타냈다. 이는 상기 혈청들에 의해 인식된 단백질들이 증식하는 에스.우베리스 세균 세포에 사용된 조건 하에 발현되고 항체에 결합하기 위해 접근할 수 있다는 것을 분명하게 시사한다. 또한, 도 1은 사용된 두 균주 간에 단백질의 발현 및/또는 표면 접근성이 상이하다는 것을 분명하게 보여준다. 발현 및/또는 표면 접근성은 3가지 단백질(P17, P19 및 P20)에서 보존되었다. 이에 반해, P11 및 P63은 균주 O140J를 사용하는 경우에만 검출되었고, 이에 반해 P15, P18, P25 및 P26은 균주 41-241에 의해서만 검출되었다. P27은 균주 41-241 및 O140J 모두에 표면 노출되어 있었으나, 균주 41-241에서만 항혈청에 의해 약하게 인식되었다.
이를 종합해보면, 본 데이터는 선택된 항원 10가지는 시험관내에서 증식된 세균의 표면에서 발현되고 온전한 캡슐화된 세포 상에 항체의 결합에 이용될 수 있다는 것을 분명하게 입증했다. 상기 단백질 3가지는 사용된 두 균주 중에서 보존되었다.
실시예
6
혈청학적 프로테옴 시도
에스.우베리스 백신 후보를 동정하기 위한 대안적 시도로, 혈청학적 프로테옴 분석을 사용했다.
TH 브로쓰에서 증식된 에스.우베리스 균주의 단백질은 2D 겔 전기영동으로 분리하고, 에스.우베리스 감염된 동물의 혈청에 존재하는 항체로 탐침했다. 고도로 면역원성인 에스.우베리스 단백질이 다수 동정되었다(데이터는 제시되지 않음). 3개의 반점은 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 2D 겔에 존재하는 단백질에 성공적으로 부합했다(도 2). 이 단백질들로부터 트립신 분해 산물을 Q-TOF로 분석하고, 수득되는 펩타이드-질량 핑거프린트를, 균주 41-241 및 O140J의 게놈 서열 분석으로부터 예상된 모든 단백질들의 컴퓨터모의실험에서 수득된 펩타이드-질량 핑거프린트와 비교했다. 또한, 각 핑거프린트에서 선택된 2가지 주요 트립신분해 펩타이드를 탠덤 MS에 사용했다. 수득되는 펩타이드의 아미노산 서열을 그 다음 에스.우베리스 게놈 서열로부터 예상되는 서열과 비교했다. 이러한 절차에 의해 3가지 단백질 모두는 성공적으로 부합시킬 수 있었다. 동정된 단백질의 성질은 표 6에 열거된다. 이러한 백신 후보들 중 하나는 또한 게놈 시도에 의해서도 동정되었다(P63). 이는 백신 후보로서 이 단백질 중요성을 역설하는 것이다.
실시예
7
마우스 면역 혈청과 배양
상청액에
대한
ELISA
P93 및 P105는 두 균주의 배양 상청액에서 강하게 인식되었고, 이는 이 단백질들이 세균에서 분비된다는 것을 시사한다.
실시예
8
생체내
조건을 모방하기 위해
유장에서
증식된 에스.
우베리스
세포를 이용한
FACS
분석
실시예 5의 절차에 따라, 우유 유사 배지에서 증식된 에스.우베리스 세포에 대한 항체의 결합을 검사했다.
실시예
9
다양한 에스.
우베리스
균주 간에 항원 보존성
다양한 에스.우베리스 분리물 간에 선택 단백질의 발현 보존성 및 항체 접근성은 FACS 분석으로 연구했다. 이 연구는 다양한 에스.우베리스 균주들에 대해 유도된 백신 후보들을 선택할 수 있게 한다.
실시예
10
소의 백신접종 및 항원공격
백신접종되지 않은 동물의 실험적 감염. 에스.우베리스 균주 O140J 및 41-241의 독성은 실험적 감염 후에 측정했다. 유방은 일반적으로 유구(quarter)로 불리는 4개 부분으로 나뉘어져 있다. 각 유구는 우유 분비 세포, 유관, 유조(milk cistern) 및 유두를 포함한다. 본 실험에서, 각 유구는 유두에서 유관을 통해 유조 내에 개별적으로 감염시킨다. 균주 O140J를 접종한 8개의 유구 중 6개는 성공적으로 감염되었다(도 3, 표 7). 이러한 유구에서 수득된 우유에서 에스.우베리스 O140J의 순수 배양물이 수득되었고, 증가된 체세포수(SCC)의 수준이 검출되었다. 두 유구(다른 두 소의 유구; 소 6717 및 6719; 도 3A 및 3B)에서는 항원 공격 후에 어떠한 감염도 검출할 수 없었다. 두 유구는 실험 과정 동안 세균학적 음성을 유지했다. 두 유구 중 하나에서는 SCC의 약간의 증가가 관찰되었다. 이에 반해, 균주 41-241 감염으로 항원공격된 8개 유구는 모두 감염되었다(도 3A 및 3C; 표 7). 이 유구 중 4개(소 6721 및 6723)에는 5x102 cfu의 균주 41-241을 접종한 반면, 다른 4개의 유구에는 5x103 cfu(소 6720 및 6722)의 용량을 접종했다. 더 높은 용량을 접종한 후에 더욱 심각한 결과가 관찰되었는데, 즉 소의 체온이 훨씬 더 증가했고 질병의 더욱 심각한 임상적 징후(우유 응고 및 딱딱하게 경직된 유방)가 관찰되었다(표 7; 도 3A 및 3C). 하지만, 5x102 cfu의 접종 용량의 균주 41-241에 의해서도 유선염의 임상 징후는 유도되었다. 종래, 균주 O140J에 의해서도 유사한 데이터가 관찰되었다(Hill, 1988).
균주 41-241에 비해, 균주 O140J(접종 용량 5x102 cfu 및 16일 동안 연구됨)에 의해 수득된 유선염의 임상 징후는 더욱 심각한 것처럼 보였다(도 3B 및 도 3C). 4개의 유구 중에서 3개는 균주 O140J에 의해 성공적으로 감염되었고, 3개의 유구 모두 감염 후 적어도 16일 동안 유선염의 임상 징후를 나타냈다. 3개의 유구 중 2개는 감염 후 16일 동안 세균학적 양성을 유지했고(도 3B), 1개 유구에서는 SCC의 증가 수준이 35일 동안 검출되었다(데이터는 제시되지 않음). 균주 41-241로 감염된 4개 유구는 모두 접종 후 10 내지 13일 동안 유선염의 임상 징후를 나타냈지만, 13일 이후부터는 임상 징후가 음성이었다(도 3C). 이러한 4개의 유구 중 2개(소 6723)는 실험 과정(16일) 동안 세균학적 양성을 유지하여, 유선에 에스.우베리스의 지속을 나타냈다(도 3C).
감염 후 3 내지 5일째 수집한 유방 물질의 조직 검사는 일반적으로 임상 관찰에 일치했다. 균주 41-241로 감염된 소들과 균주 O140J로 감염된 한 소는 모두, 다형핵 과립구의 다병소 폐포내 축적, 폐포 내 상피 층의 국소 파괴 및 단핵 세포의 중간 정도의 간질성 침윤을 나타내는, 중간 내지 심각한 유선염을 전체 유선을 통해 나타냈다(데이터는 제시되지 않음). 균주 O140J로 감염된 두번째 소는 경미한 다병소 카타르성 유선염을 나타냈다. 이를 종합해보면, 상기 데이터는 균주 O140J 및 41-241이 모두 소에게 병원성임을 보여준다.
젖소의 면역화
에스.우베리스 단백질에 대한 다클론성 항체를 소에서 유발시켰다. 소는 다양한 면역화 계획을 통해 피하 접종 및/또는 근육내 및/또는 유방내 접종을 이용하여 면역화시켰다.
면역원성 조성물은 예컨대 인산염 완충 식염수와 같은 용매와 보강제, 예컨대 유중수 보강제 또는 무오일 보강제를 이용하여 조제했다.
면역화 후, 혈액 샘플을 모아서, 혈청을 에스.우베리스에 대한 항체에 대해 검사했다.
백신접종된
동물의 실험적 감염
백신접종된 소 및 백신접종되지 않은 소를 500 cfu의 에스.우베리스 균주 O140J로 항원공격 감염시켰다. 각 유방의 유구는 유두의 유관을 통해 개별적으로 감염시켰다.
항원공격 후, 본 발명의 면역원성 조성물로 백신접종된 소는 유선염의 적은 임상 징후, 적은 우유 변화, 낮은 SCC 수준, 짧은 임상적 유선염 기간, 낮은 열을 나타냈다. 유방의 임상 점수 및 조직학적 증거는 본 발명에 따른 면역화가 에스.우베리스에 의해 유발된 유선염에 대해 효과적이라는 것을 분명하게 보여준다.
실시예
11
회복기 혈청과 항원의 반응성.
회복기 항체를 유도하는 선택된 단백질 번호(P15, P16, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P68, P75, P93 및 P105)의 능력은 최근 에스.우베리스 감염에서 회복되고 있는 14마리 소에서 수득한 야생 혈청을 이용한 웨스턴 블롯 분석으로 검사했다. 선택된 12개 항원 중 6개(P15, P16, P54, P28, P63, P105)는 사용된 회복기 혈청 14개 모두에 의해 인식되었다. 이 데이터는 이 항원들이 각 감염을 유발한 모든 에스.우베리스 균주들에 의해 발현되고, 이 항원들이 감염 동안 숙주에서 발현되며, 고도로 면역원성임을 나타낸다. 항원 중 5개(P68, P27, P20, P93 및 P22)는 각각 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 회복기 혈청에 의해 인식되었다. 항원 중 하나에서는 어떠한 회복기 혈청과도 반응을 검출할 수 없었다(P75).
실시예
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다양한 에스. 우베리스 균주 간에 항원의 보존성. 다양한 에스.우베리스 균주에 대한 방어를 부여하는 항원의 적합성을 나타내기 위해, 최근 분리된 야생 균주(35개 균주)의 수집물 중에서 12가지 선택된 항원(P15, P16, P20, P22, P27, P54, P28, P63, P68, P75, P93 및 P105)의 보존 및 발현을 측정했다. 항원의 발현은 정제된 항원에 대한 마우스 면역 혈청으로 웨스턴 블롯을 선별하여 확인했다. 12개 항원 중 5개(P15, P16, P28, P75 및 P105)는 검사된 균주의 >97%에서 발현되었고; 2개의 항원(P27, P63)은 균주의 94%에서 발현되었으며, 4개의 항원(P20, P22, P54, P93)은 81-92%의 균주에서 발현되었다. 이 데이터는 대부분의 항원의 발현은 다양한 에스.우베리스 균주들 간에 고도로 보존적임을 분명하게 보여주었다.
재료 및 방법
세균 균주 및 증식 조건
에스.우베리스 균주 41-241은 에스.우베리스 유선염의 발생이 관찰된 네덜란드의 상업용 낙농가에서 1998년에 분리했다(Hill, 1988). 균주 41-241은 유선염 발생 동안 특정 무리에서 주로 발견된 RAPD 핑거프린팅 타입 B로 나타났다(Zadoks et al., 2003). 이 균주는 적어도 2개월 동안 에스.우베리스로 감염된 소에서 분리되었다. 감염 초기에는 준임상적이었고, 그 후 다수의 임상적 급증이 나타났다.
에스.우베리스 균주 O140J 및 EF20은 제이. 레이 박사(Dr. J. Leigh, Institute for Animal Health, Compton, England)에게서 친절하게 공급받았다. 네덜란드의 여러 낙농가에서 유선염의 임상적 증례로부터 분리된 다른 에스.우베리스 및 에스.파라우베리스 균주는 메비우스 박사(Dr. D. Mevius, CIDC, Lelystad, The Netherlands); 샘피몬 박사(Drs. O. Sampimon, Animal Health Service, Deventer, The Netherlands) 또는 Dierenartsen Praktijk(Diessen, The Netherlands)에게서 친절하게 공급받았다. 스트렙토코커스 균주는 토드-휴윗 브로쓰(code CM189, Oxoid)에서 증식시켰고, 별다른 표시가 없는 한 6%(v/v) 말 혈액과 0.1% 에스큘린(w/v)을 함유하는 콜럼비아 한천 혈액 기제(code CM331, Oxoid) 상에 평판 배양했다. 이.콜라이 균주는 루리아 브로쓰(18)에서 증식시킨 뒤, 1.5%(w/v) 한천을 함유하는 루리아 브로쓰에 평판 배양했다. 필요하다면, 카나마이신 50㎍/ml을 첨가했다.
유장의 제조. 이력 중에 에스.우베리스 감염이 없는 낙농가에서 대량 우유를 수득했다(Waiboerhoeve, Lelystad, The Netherlands). 우유는 12,800 x g에서 30분 동안 원심분리하고, 지방을 제거했다. 이어서, 레닌(Lactoferm, Brouwland, Belgium) 40㎕/ml를 첨가하고, 일정하게 혼합하면서 37℃에서 2시간 동안 항온배양했다. 응고된 우유는 체질하여 제거하고, 남은 상청액을 12,800 x g에서 30분 동안 원심분리했다. 맑은 상청액은 0.2㎛ Sartobran P 필터(Sartonus, Goettingen, Germany)를 통해 여과 멸균했다.
우유 샘플 및 혈청. 우유 샘플과 혈청은 여러 네덜란드 낙농가의 임상적 에스.우베리스 유선염 증례로부터 입수했다(Drs. O. Sampimon, Animal Health Service, Deventer, The Netherlands). 샘플을 수집하기 전에는 어떠한 동물도 항생제로 처리하지 않았다. 또한, 우유와 혈청은 에스.우베리스 균주 O140J 및 41-241을 이용한 실험적 감염 후 여러 시점에서 소로부터 수집했다.
토끼 항혈청. 포르말린 사멸된 전체 에스.우베리스 세포에 대해 유도된 폴리클로날 항체 및 초음파처리된 에스.우베리스 세포에 대해 유도된 폴리클로날 항체는 토끼에서 유발시켰다. 토끼는 유중수 보강제 중의 2 내지 4 x 109 사멸 세포를 이용하여 피하로 면역화시켰다. 접종은 2주, 3주 및 4주 후에 반복했다. 6주 후, 토끼를 치사시키고 혈청을 수집했다. 항원을 제조하기 위해, 에스.우베리스 균주는 토드-휴잇 브로쓰에서 16시간 동안 증식시켰다. 배양물은 1L 예비가온된 토드-휴잇 브로쓰에 10배 희석하고, 광학 밀도(600nm)가 0.5에 이를 때까지 세포를 증식시켰다. 배양물은 10,000 x g에서 15분 동안 원심분리하고, 펠릿은 100ml의 PBS(136.89mM NaCl, 2.68mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 2.79mM KH2PO4, pH 7.2)에 용해했다. 이어서, 광학 밀도(600nm)는 PBS로 1.0으로 조정했다. 포르말린 고정된 세포를 준비하기 위해, 이 세포 10ml 부를 10,000 x g에서 20분 동안 원심분리하고, 펠릿을 PBS 2.5ml에 재현탁시켰다. 이 현탁액에 3% 포르말린 250㎕를 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 유지시켰다. 현탁액은 콜럼비아 한천 평판 상에 평판배양하여 생균의 부재에 대해 조사했다. 포르말린을 제거하기 위해, 세포를 PBS로 2회 세척했다. 초음파처리된 세포를 준비하기 위해 세포 10ml 부를 10,000 x g에서 20분 동안 원심분리하고, 펠릿을 PBS 250㎕에 재현탁시켰다. 세포를 100% 출력, 50% 듀티 사이클의 팁 소니파이어(tip sonifier)로 15분 동안 초음파처리했다. 초음파처리 후에 세포는 PBS로 10배 희석했다. 두 항원을 Specol과 1:1로 혼합하여 유중수 에멀젼을 만들었다.
게놈 서열분석. 게놈 DNA는 에스.우베리스 균주 41-241로부터 샘브룩 등(Sambrook et al.(1989))의 서적에 기술된 바와 같이 분리했다. DNA는 절단하여 플라스미드 라이브러리의 제조에 사용했다. 랜덤 클론을 염료-터미네이터 화학을 이용하여 서열분석하고, ABI PRISM 3700 DNA 분석기(Applied Biosystems, Warrington, GB)로 분석했다. 서열분석 데이터를 조립하여 572개 인접 서열을 수득했다. 개방 판독 프레임(ORF)의 최초 세트는 GLIMMER 및 GENEMARK 소프트웨어를 이용하여 동정했다. 이 유전자들의 막관통 나선 및 세포이하 위치는 www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM에서 이용할 수 있는 TMHMM이라는 컴퓨터 프로그램으로 예측했다. 시그널 펩타이드의 존재에 대해 각 ORF를 조사하기 위해, 프로그램 SignalP를 사용했다(Nielsen et al., 1999). 대안적인 시그널 펩타이드 예측은 http://psort.nibb.ac.jp에서 이용할 수 있는 프로그램 PSORT 및 http://www.biology.wust1.edu/gcg/spscan.html에서 이용할 수 있는 GCG-SPScan으로 불리는 프로그램으로 수행했다. 지단백질은 다음과 같은 표현을 보유한 GCG-Findpatterns 프로그램을 이용하여 찾아냈다: PS00013: ~(D,E,R,K)6(L,I,V,M.F,W,S,T,A,G)2(L,I,V,M,F,Y,S,T,A,G,C,Q)(A,G,S)C; g- lpp:<(M,V)X{0,13}(R,K)~(D,E,R,K,Q){6,20}(L,I,V,M,F,E,S,T,A,G)(L,V,I,A,M)(I,V,M,S,T,A,F,G)(A,G)C 및 g-lpp_rvh:
(M,V,L)X{0,13}(R,K)~(D,E,R,K,Q){6,20}(L,I,V,M,F,E,S,T,A,G)(L,V,I,A,M)(I,V,M,S,T,A,F,G)(A,G)C. 세포벽 고착 도메인을 보유한 단백질은 InterPro accession IPR001899를 이용하여 동정했다. BLAST 프로그램은 추론된 아미노산 서열과 서열 동일성이 있는 단백질 서열을 조사하는데 사용했다.
스폿 블로팅 , 서던 블로팅 및 하이브리드화 . 염색체 DNA는 샘브룩 등(1989)에 기술된 바와 같이 분리했다. 스폿 블로팅을 위해 염색체 DNA 1㎍을 Genescreen Plus 막 위에 점적했다. 이 막을 0.4M NaOH-1M NaCl에서 실온 하에 10분 동안 항온처리하여 DNA를 변성시키고 0.6M NaCl, 0.06M 시트르산나트륨(pH 7.0)에서 10분 동안 항온처리하여 중화시켰다. 서던 블로팅을 위해, DNA 단편을 0.8% 아가로스 겔에서 분리하고 Gene-Screen Plus 막(NEN)으로 샘브룩 등(1989)에 기술된 바와 같이 이동시켰다. DNA 프로브는 랜덤 프라이밍된 표지화 키트(Boehringer)를 이용하여 [(α-32P]dCTP(3000 Ci mmol-1; Amersham)로 표지화시켰다. 블롯 위의 DNA는 0.5M 인산나트륨, 1mM EDTA 및 7% 나트륨 도데실 설페이트, pH 7.2를 보유하는 완충액에서 적당한 DNA 프로브와 Gene Screen Plus 막 공급자의 지시에 따라 65℃에서 하이브리드화시켰다. 하이브리드화 후, 막은 40mM 인산나트륨 pH 7.2, 1mM EDTA, 5% SDS 용액으로 65℃에서 30분 동안 2회, 40mM 인산나트륨 pH 7.2, 1mM EDTA, 1% SDS 용액으로 65℃에서 30분 동안 2회 세척했다. 시그널은 인-영상기(Storm; Molecular Dynamics) 상에서 검출했다.
선택된 단백질의 클로닝 및 발현. 선택된 ORF는 pET200/D-TOPO(Invitrogen)에 클로닝하기 위해 특정 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용한 PCR로 증폭시켰다. 단백질은 추정 시그널 서열 또는 예상 막관통 영역 없이 클로닝되었다. 작제물은 재조합 단백질의 발현을 위해 에스케리키아 콜라이 BL21 Star(DE3)(Invitrogen)에 형질전환되었다.
PCR 반응(25㎕)을 위해, 백금 Pfx DNA 폴리머라제(Invitrogen)를 공급자의 설명에 따라 사용했다. DNA 증폭은 Perkin Elmer 9700 열 사이클러에서 수행했고, 프로그램은 94℃에서 5분; 94℃에서 15초, 57℃에서 30초 및 68℃에서 2분을 35회 사이클; 및 68℃에서 5분으로 구성되었다.
발현된 항원의 면역검출. 단백질은 XCell SureLock 미니셀 시스템(Invitrogen)을 이용하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리했다. 겔 중의 단백질은 SYPRO-오렌지(Molecular Probes, Sunnyvale, Calif.) 염색법으로 제조자의 지시에 따라 가시화했다. 시그널은 인-영상화기(Storm; Molecular Dynamics)에서 검출했다.
단백질은 니트로셀룰로스 막으로 표준 절차(19)에 따라 이동시켰다. 막은 Blotto; 4% 탈지유, 5% 소 태아 혈청 및 0.05% Tween 20을 함유하는 Tris-완충된 식염수(TBS)(50mM Tris-HCl[pH 7.5], 150mM NaCl)에서 실온(RT) 하에 16시간 동안 차단시켰다. 재조합 항원을 검출하기 위해, 막을 6x HIS 태그(Clontech, Palo Alto, CA)에 대한 모노클로날 항체와 항온처리했다. 결합된 항체는 알칼리성 포스파타제 접합된 항마우스 항체 및 니트로블루-테트라졸륨/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트를 이용하여 샘브룩 등(1989)에 기술된 바와 같이 검출 및 가시화했다.
발현된 항원의 면역원성은 에스.우베리스로 임상적으로 감염되거나 준임상적으로 감염된 소에서 수득한 혈청 샘플을 이용하거나, 또는 토끼 항-에스.우베리스 항혈청을 이용하여 검사했다. 결합된 항체는 알칼리성 포스파타제 접합된 토끼-항-소 또는 염소-항-토끼 면역글로불린(Jackson Immunoresearch)으로 검출하고, 니트로-블루-테트라졸륨/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트를 이용하여 샘브룩 등(1989)에 기술된 바와 같이 가시화했다.
단백질 정제. 단백질은 가용화된 세포 펠릿으로부터 Ni-니트릴로트리아세트산(Ni2 +-NTA) 컬럼 크로마토그래피를 제조자(Qiagen)의 지시에 따라 사용하여 친화도 정제했다. 간단히 설명하면, 세포는 대수기로 증식시키고; 1mM IPTG를 첨가하 후, 다시 37℃에서 4시간 동안 세포를 증식시켰다. 그 다음, 세포를 수거하고 용해시켰다. 맑은 상청액을 Ni2 +-NTA 아가로스 컬럼 위에 적재했다. 컬럼은 세척하고, 단백질을 용출시켰다. 자연 정제와 변성 정제에는 다른 완충액을 사용했다. 변성 조건 하에서 정제된 단백질은 286.89mM NaCl, 2.68mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 2.79mM KH2PO4, pH 7.2 중의 선형 6M 내지 0M 우레아 구배를 이용한 투석에 의해 복원시켰다. 정제된 단백질은 Amicon Ultra-4 5000 MWCO 필터(Millipore)를 이용하여 추가 농축시켰다.
단백질 농도. 샘플 중의 단백질 농도는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 이후에 측정했다. 겔 중의 단백질은 SYPRO-오렌지(Molecular Probes, Sunnyvale, Calif.) 염색을 제조자의 지시에 따라 이용하여 가시화했다. 시그널은 인-영상화기(Storm; Molecular Dynamics)에서 검출했다. 표준물로, 공지된 농도 범위의 소 혈청 알부민을 이용하여 겔에 존재하는 단백질의 양을 계산했다. 이 계산에는 Molecular Dynamics 프로그램을 사용했다.
정제된 단백질의 면역원성. OF1 마우스는 프로인트 완전 보강제 중의 정제된 단백질 20㎍을 이용하여 피하로 면역화시켰다. 접종은 프로인트 불완전 보강제 중의 정제 단백질 20㎍을 이용하여 3주 후에 반복했다. 2차 접종 3주 후에 마우스를 치사시키고 혈청을 수집했다.
FACS -분석. 에스.우베리스 세포는 OD600이 0.5에 이를 때까지 토드-휴잇 브로쓰에서 증식시켰다. 세포를 원심분리로 수집하고, FACS-완충액(PBS-13, pH 7.2[137mM NaCl, 2.68mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 2.8mM KH2PO4]-0.5% BSA)으로 1회 세척하고, 세포 밀도를 FACS 완충액에서 약 0D600이 1.0이 되도록 조정했다. 세포(250㎕)를 원심분리로 수집하고 마우스 항혈청(1:50 희석률)을 함유하는 FACS-완충액 50㎕에 재현탁시켰다. 샘플을 얼음에서 45분 동안 항온처리했다. 미결합된 항체를 제거하기 위해, 세포를 FACS 완충액 250㎕로 2회 세척했다. 그 다음, 세포를 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지된 토끼 항-마우스 2차 항체(1:100 희석물; DAKO A/S, Glostrup, Denmark)를 함유하는 FACS 완충액 50㎕와 얼음에서 30분 동안 항온처리했다. 세포를 FACS-완충액 250㎕로 2회 세척하고, 100㎕ FACS 완충액에 재현탁시킨 뒤, 결합된 항체는 형광 활성화 세포 분류기(FACS Calibur, Benton Dickinson, Franklin Lakes, USA)로 검출했다.
전세포 ELISA . 대수 증식성인 에스.우베리스 세포를 원심분리로 수집하고, 코팅 완충액 pH 9.6(0.05M NaHCO3, 0.05M Na2CO3)에 재현탁시킨 뒤, 세포 밀도는 OD600이 1.0이 되게 조정했다. 고결합 96웰 평판을 웰당 상기 현탁액 100㎕로 4℃에서 16시간 동안 코팅했다. 웰은 ELISA 완충액(5% Tween-80, 0.02% Na-아지드)으로 4회 세척하고, 혈청(0.05% Tween-80, 2% NaCl 및 5% 소 태아 혈청을 함유하는 PBS-13에 1:20으로 희석됨)을 첨가하고, 평판을 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 미결합된 항체를 제거하기 위해, 웰을 ELISA 완충액으로 4회 세척했다. 그 다음, 2차 항체(0.05% Tween-80, 2% NaCl 및 5% 소 태아 혈청을 함유하는 PBS-13으로 1:250으로 희석한 양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 토끼-항-마우스(DAKO) 100㎕)를 첨가하고, 평판을 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 웰을 다시 ELISA 완충액으로 4회 세척하고, 결합된 항체는 테트라메틸벤지딘(TMB)(CeDi-Diagnostics, Lelystad, The Netherlands) 100㎕를 사용하여 실온에서 검출했다. 반응은 15분 후 웰당 0.5M H2SO4 100㎕를 첨가하여 정지시켰다. 흡광도는 ELISA 판독기(Thermo Labsystems, Franklin, USA)를 이용하여 450nm에서 판독했다.
2차원 겔 전기영동용 샘플 제조. 에스.우베리스 균주는 100ml 토드-휴잇 브로쓰에서 16시간 동안 증식시켰다. 배양물은 1L 예비가온된 토드 휴잇 브로쓰로 20배 희석하고, 세포를 광학밀도(600nm)가 0.5에 이를 때까지 증식시켰다. 배양물을 10,000 x g에서 20분 동안 원심분리하고, 펠릿은 동량의 250mM 슈크로스/25mM Tris, pH 8.0로 1회 세척하고 동량의 superQ로 1회 세척했다. 수득되는 펠릿은 superQ 5ml에 용해했다. 이 현탁액 1.5ml 부는 팁 소니파이어(Branson sonifier 250, 50% 인터벌, 진폭 3)를 이용하여 15분 동안 초음파처리했다. 그 다음, 현탁액을 DNAse I 및 MgCl2(최종 농도 각각 6.5㎍/ml 및 10mM)로 37℃에서 10분 동안 처리했다. 프로테아제 저해제 펩스타틴 A, 류펩틴, 페파블록 및 아프로티닌을 각각 2.5㎍/ml, 5㎍/ml, 25㎍/ml 및 1㎍/ml의 최종 농도로 첨가했다. 우레아, 디티오트레이톨 및 트리톤-X100은 각각 9M, 70mM 및 2%의 최종 농도로 첨가했다. 샘플은 10,000 x g에서 30분 동안 원심분리하고, 상청액은 수집하여 100,000 x g에서 추가 30분 동안 원심분리했다. 상청액을 수집하고, 샘플 중의 단백질 농도는 RC DC Protein Assay(BioRad)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 측정했다.
2차원 겔 전기영동. 단백질 50 내지 100㎍을 함유하는 샘플은 샘플 완충액(8M 우레아, 2% CHAPS, 0.5% IPG-완충액 3-10, 70mM 디티오트레이톨 및 미량의 브로모-페놀-블루) 450㎕에 용해시켰다. 단백질은 Immobiline 18cm DryStrips(3-10NL Amersham Pharmacia Biotech)을 제조자의 지시에 따라 재수화한 후 IPGphor(Amersham Pharmacia Biotech) 상에서 등전 초점법으로 1차원 분리했다. 등전 초점을 수행한 직후, 스트립은 이어서 10mg/ml 디티오트레이톨을 함유하는 평형 완충액(6M 우레아, 30% 글리세롤, 2% SDS, 50mM Tris-HCl-pH 8.8, 미량의 브로모-페놀-블루)에서 15분, 그리고 25mg/ml 요오도아세트아미드 함유 평형 완충액에서 15분 동안 평형화시켰다. 단백질은 Ettan DALT 트웰브 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)에서 제조자의 지시에 따라 12.5% 예비주조된 Ettan DALT 겔(Amersham Pharmacia Biotech) 상에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 2차원으로 분리했다.
염색. 겔 중의 단백질은 PlusOne™은 염색 키트(Amersham Pharmacia Biotech)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 은으로 염색하거나, 또는 겔의 플라스틱 이면으로 인한 항온시간의 연장 하에 쿠마시 브릴리언트 블루로 샘브룩 등(1989)에 기술된 바와 같이 염색했다.
2D 겔로부터 단백질의 분해. 쿠마시 염색된 겔에서 동정된 단백질 반점은 수작업으로 절제했다. 겔 조각을 0.1% 아세트산 중에서 사용할 때까지 -80℃에 동결시켰다. 겔 중의 단백질은 리 등(2003)에 기술된 바와 같이 트립신으로 분해했다.
2D 겔로부터 트립신 분해된 단백질 반점의 질량 분광분석법. 트립신 분해된 단백질 반점의 질량은 리 등(2004)에 기술된 바와 같이 Micromass Q-TOF 질량 분광계를 사용하여 분석했다.
실험적 감염 실험
동물. 최초 비유기 후 2 내지 4주 된 임상적으로 건강한 홀스타인-프리시안 소를 감염에 사용했다. 착유는 오전 7시와 오후 4시에 2회 실시했다. 모든 소는 체세포수(SCC)가 2.0x105 세포/ml 였고, 감염 전 마지막 14일 동안 우유의 미생물학적 평가 반복을 기초로 한 경우, 유선염 병원균 음성이었으며, 유선염의 이력도 없는 것이었다.
접종물의 제조 및 접종. 에스.우베리스 균주 O140J 및 41-241을 접종물로 사용했다. 6% 말 혈액(v/v) 및 0.1% 에스큘린(w/v)을 함유하는 콜럼비아 한천 평판에서 증식된 단일 콜로니를 90ml 토드-휴잇 브로쓰(Oxoid)로 이동시키고 37℃에서 하룻밤 동안 배양했다. 하룻밤 배양물을 동일 배지로 1:10으로 희석하고, 약 3x108 cfu/ml(대수 증식기) 농도로 세균을 증식시켰다. 그 다음, 세포는 원심분리로 수집하고 재현탁시켜 PBS로 희석했다.
각 소의 2 유구에 PBS 5ml당 5x102(균주 O140J 또는 균주 41-241) 또는 5x103(균주 41-241) cfu를 수조내로 접종했다. 대조용 유구에는 PBS 5ml를 접종했다. 주사는 일회용 유두 캐뉼라를 이용하여 오후 착유 직후에 수행했다. 접종 전에 유두는 알콜로 세정했다. 접종물은 유조 내로 위쪽으로 마사지했다.
4마리 소로 이루어진 한 그룹에는 균주 O140J 5x102 cfu로 항원공격했다. 4마리 소의 다른 그룹에는 균주 41-241로 항원공격했다. 이 소들 중 2마리는 5x102 cfu로 항원공격하고, 다른 2마리 소는 5x103 cfu로 항원공격했다. 소들은 2회 연속 실험에 사용하여, 제1 실험은 45 내지 80시간 후에 종료하고 제2 실험은 16일 후에 종료했다.
샘플링 및 임상 점수. 우유 샘플은 각 착유 시마다 전체 유구로부터 무균적으로 수집했다. 샘플은 6% 말 혈액(v/v) 및 0.1% 에스큘린(w/v)을 함유하는 혈액 한천 평판에서 세균학적으로 조사하고, SCC는 표준 절차(International Dairy Federation, 1981)를 이용하여 측정했다. 또한, 우유 샘플은 항체 반응 분석 시까지 -20℃에서 보관했다. 각 착유 시에, 소의 체온과 우유 생산을 측정하고, 유선염의 임상적 징후(유방의 경직 및 우유의 응고)에 대해 소를 모니터했다. 1주일에 1회 혈액 샘플을 수집해서 혈청의 항체 반응을 분석했다.
병리학. 조직학적 검사를 위해, 각 유구로부터의 유선 조직을 3가지 다른 수평 횡단면의 여러 부위로부터, 즉 유선 기저, 기저와 수조 사이 중간 및 유조에서 샘플링했다. 조직 샘플은 4% 완충된 포르말린으로 고정시키고, 파라핀으로 포매시켰다. 조직 검사를 위해, 조직 절편을 절단하고 헤마톡실린/에오신 염색으로 염색했다.
참조문헌
[표 1]
[표 2]
[표 3]
[표 4]
[표 5]
[표 6]
[표 7]
Claims (65)
- a) 분비 단백질, 표면 결합 단백질 및/또는 세균 독성 인자와 적어도 50%의 서열 동일성이 있는 단백질의 적어도 일부분을 동정하는 단계;
b) 적어도 2종의 스트렙토코커스(Streptococcus) 균주 및/또는 혈청형에서 보존되는, 단계 a)에서 동정된 적어도 하나의 단백질을 선택하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 선택된 적어도 하나의 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체가 제1 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포, 및 제2 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포에 특이적으로 결합할 수 있는지를 측정하는 단계를 포함하는, 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 스트렙토코커스 단백질의 동정 방법. - 제1항에 있어서, 스트렙토코커스의 게놈 서열 중 적어도 일부분에서 분비 단백질 및/또는 표면 결합 단백질의 모티프를 포함하는 유전자를 동정함으로써, 분비 단백질 및/또는 표면 결합 단백질을 동정하는, 동정 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 스트렙토코커스의 게놈 서열 중 적어도 일부분에서 세균 독성 인자 유전자와 적어도 50%의 서열 동일성이 있는 유전자를 동정함으로써, 세균 독성 인자와 적어도 50%의 서열 동일성이 있는 단백질을 동정하는, 동정 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 0.5M 인산나트륨, 1mM EDTA 및 7% 나트륨 도데실 설페이트를 보유하는 pH 7.2 완충액에서 65℃ 하에 도 4에 열거된 임의의 핵산 서열의 전체 길이의 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하고, 상기 핵산 분자가 40mM 인산나트륨(pH 7.2), 1mM EDTA 및 5% 나트륨 도데실 설페이트를 함유하는 완충액으로 65℃에서 30분 동안 2회 세척하고 40mM 인산나트륨(pH 7.2), 1mM EDTA 및 1% 나트륨 도데실 설페이트를 함유하는 완충액으로 65℃에서 30분 동안 2회 세척한 후에도 하이브리드화된 상태를 유지하는 유전자를, 스트렙토코커스 게놈 서열의 적어도 일부에서 동정함으로써, 세균 독성 인자와 적어도 50%의 서열 동일성이 있는 단백질을 동정하는, 동정 방법.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에서 보존되는 유전자를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 동정 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 유전자에 의해 암호화된 단백질, 또는 상기 단백질의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 동정 방법.
- 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자가 원핵생물 발현계에서 발현되는 동정 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
- 스트렙토코커스의 분리 단백질 및/또는 재조합 단백질을 수득하는 단계;
- 상기 단백질을 제1 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포 및 제2 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포와 항온처리하는 단계, 및
- 단백질이 제1 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포 및 제2 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 의해 감염된 동물의 항체 및/또는 면역 세포에 결합할 수 있는지를 측정하는 단계를 포함하는 동정 방법. - 제8항에 있어서, 상기 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 이용하여 상기 단백질을 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 동정 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 및/또는 면역 세포가 회복기 혈청에서 유래되는 동정 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 단백질이 옵소닌포식작용 유도성 항체를 유도할 수 있는 동정 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 2종의 스트렙토코커스 단백질이 동정되는 동정 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 동정된 적어도 하나의 단백질을 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스트렙토코커스가 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis)인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 스트렙토코커스 단백질.
- 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물의 제조를 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 단백질, 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체의 용도.
- 제16항에 있어서, 상기 단백질이 표 5 및/또는 표 6 중에서 선택되는, 용도.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 적어도 하나의 분리 단백질 및/또는 재조합 단백질, 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 포함하는, 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물.
- 제18항에 있어서, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 적어도 2종의 분리 단백질 및/또는 재조합 단백질, 및/또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 포함하는 면역원성 조성물.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 적어도 하나의 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스트렙토코커스가 스트렙토코커스 우베리스인 면역원성 조성물.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2종의 상기 단백질이 표 5 및/또는 표 6 중에서 선택되는 면역원성 조성물.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 적어도 하나의 단백질 및/또는 표 5 및/또는 표 6 중에서 선택되는 적어도 하나의 단백질, 및/또는 이의 면역원성 부분, 유도체 및/또는 유사체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 재조합 벡터를 보유한 세포를 제공하는 단계를 포함하여, 적어도 2종의 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물의 생산 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 적어도 2종의 단백질 및/또는 표 5 및/또는 표 6 중에서 선택되는 적어도 2종의 단백질, 및/또는 상기 단백질들 중 적어도 하나의 면역원성 부분을 암호화하는 핵산 서열을 기능적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있고/있거나 표 5 및/또는 표 6 중에서 선택되는 적어도 2종의 단백질, 및/또는 상기 단백질 중 적어도 하나의 면역원성 부분을 암호화하는 핵산, 또는 제24항에 따른 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 운반체.
- 제25항에 있어서, 생 운반체인 재조합 운반체.
- 제25항 또는 제26항에 있어서, 스트렙토코커스 종인 재조합 운반체.
- 제27항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 종이 스트렙토코커스 우베리스인 재조합 운반체.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 스트렙토코커스가 협막성 유전자 발현 산물의 적어도 일부가 결여되어 있는 것인 재조합 운반체.
- 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스트렙토코커스가 비협막성 스트렙토코커스인 재조합 운반체.
- 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형 유래의 적어도 하나의 단백질 및/또는 이의 면역원성 부분을 암호화하는 핵산, 및 제2 스트렙토코커스 균주 및/또는 혈청형 유래의 적어도 하나의 단백질 및/또는 이의 면역원성 부분을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 운반체.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득할 수 있고/있거나 표 5 및/또는 표 6 중에서 선택되는 적어도 2종의 단백질, 및/또는 상기 단백질들 중 적어도 하나의 면역원성 부분을 암호화하는 핵산 서열, 또는 제24항에 따른 재조합 핵산 분자 또는 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 재조합 운반체를 포함하는 분리된 숙주 세포.
- 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 재조합 운반체를 포함하는, 스트렙토코커스에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물.
- 제18항 내지 제22항 및 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한, 면역원성 조성물.
- 스트렙토코커스 우베리스 유선염에 대한 약제의 제조를 위한, 제18항 내지 제22항 및 제33항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 용도.
- 백신의 제조를 위한, 제18항 내지 제22항 및 제33항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 용도.
- 제18항 내지 제22항 및 제33항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 개체 및/또는 비-사람 동물에게 제공함을 포함하여, 개체 및/또는 비-사람 동물에서 스트렙토코커스 유기체의 수를 감소시키고/시키거나 제어하는 방법.
- 제18항 내지 제22항 및 제33항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 및 적당한 운반체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
- 개체 및/또는 비-사람 동물 유래의 적어도 하나의 샘플에서, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득할 수 있고/있거나 표 5 및/또는 표 6 중에서 선택되는 단백질, 또는 이의 면역원성 부분에 대하여 유도된 항체의 존재를 측정하는 단계를 포함하여, 개체 및/또는 비-사람 동물의 스트렙토코커스에 대한 면역성을 측정하는 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득할 수 있고/있거나 표 5 및/또는 표 6 중에서 선택되는 적어도 하나의 단백질, 또는 이의 면역원성 부분, 및 상기 단백질 또는 이의 면역원성 부분에 결합하는 항체를 검출하는 수단을 포함하는 진단 키트.
- 적어도 하나의 스트렙토코커스 우베리스 균주에서 유래되는 적어도 2종의 재조합 및/또는 분리된 표면 단백질, 및/또는 상기 단백질 중 어느 하나 또는 둘 모두의 면역원성 부분 또는 유사체 또는 유도체를 포함하는, 스트렙토코커스 우베리스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물.
- 제41항에 있어서, 적어도 2종의 단백질이 표 5 및/또는 표 6 중에서 선택되는 면역원성 조성물.
- 표 5 및/또는 표 6에 열거된 적어도 2종의 단백질 및/또는 상기 단백질 중 어느 하나 또는 둘 모두의 면역원성 부분 또는 유사체 또는 유도체를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 세포에 공급하는 단계를 포함하는, 제41항 또는 제42항에 따른 면역원성 조성물의 생산 방법.
- 제43항에 있어서, 제43항에 따른 재조합 벡터, 및/또는 표 5 및/또는 표 6에 열거된 단백질 및/또는 상기 단백질 중 어느 하나 또는 둘 모두의 면역원성 부분 또는 유사체 또는 유도체를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 적어도 2종의 세포에 공급하는 단계를 포함하는 생산 방법.
- 표 5 및/또는 표 6에 열거된 단백질 및/또는 이의 면역원성 부분 또는 유사체 또는 유도체를 암호화하는 핵산 서열을, 기능적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 포함하는 재조합 분자.
- 표 5 및/또는 표 6에 열거된 적어도 2종의 단백질 및/또는 상기 단백질 중 어느 하나 또는 둘 모두의 면역원성 부분 또는 유사체 또는 유도체를 암호화하는 핵산 서열을, 기능적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 포함하는 재조합 분자.
- 제45항 또는 제46항에 따른 핵산 서열을 포함하는 생 재조합 운반체.
- 제45항 또는 제46항에 따른 핵산 서열을 포함하는 분리된 숙주 세포.
- 제45항 또는 제46항에 따른 핵산에 의해 암호화된 단백질과 적어도 80%의 서열 동일성이 있는 분리된 및/또는 재조합 단백질성 분자.
- 제45항 또는 제46항에 따른 핵산에 의해 암호화된 단백질성 분자와 적어도 95%의 서열 동일성이 있는 분리된 및/또는 재조합 단백질성 분자.
- 제45항 또는 제46항에 따른 핵산에 의해 암호화된 단백질성 분자의 적어도 25개의 연속 아미노산의 쇄를 포함하는 분리된 및/또는 재조합 단백질성 분자.
- 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 단백질성 분자를 암호화하는 핵산.
- 제40항 또는 제41항에 있어서, 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 분리된 및/또는 재조합 단백질성 분자를 포함하는 면역원성 조성물.
- 제47항에 따른 생 또는 사멸 재조합 운반체를 포함하는, 스트렙토코커스 우베리스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물.
- 제54항에 있어서, 생 또는 사멸 재조합 운반체가 스트렙토코커스 종인 면역원성 조성물.
- 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 생 또는 사멸 재조합 운반체가 스트렙토코커스 우베리스인 면역원성 조성물.
- 제45항 또는 제55항에 따른 핵산을 포함하는, 스트렙토코커스 우베리스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물.
- 제41항, 제42항 및 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서의 면역원성 조성물.
- 스트렙토코커스 우베리스 유선염에 대한 약제의 제조를 위한, 제41항, 제42항 및 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 용도.
- 백신의 제조를 위한, 제41항, 제42항 및 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 용도.
- 우유 및/또는 소의 유방에서 에스.우베리스 유기체의 수를 감소시키고/시키거나 제어하기 위한, 제41항, 제42항 및 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 용도.
- 제41항, 제42항 및 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 및 적당한 운반체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 표 5 및/또는 표 6 중에서 선택되는 단백질 또는 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 이의 면역원성 부분에 대해 유도된 항체의 존재를 동물 유래의 적어도 하나의 샘플에서 측정하는 단계를 포함하여, 에스.우베리스에 대한 동물의 면역성을 측정하는 방법.
- 표 5 및/또는 표 6 중에서 선택되는 적어도 하나의 단백질 또는 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 및 상기 단백질 또는 이의 면역원성 부분에 대한 항체 결합을 검출하는 수단을 포함하는 진단 키트.
- 유선염의 증례로부터 에스.우베리스 유기체 유래의 핵산을 분리하여, 상기 핵산을 제45항, 제46항 및 제52항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 이의 프라이머를 포함하는 PCR로 처리하는 단계를 포함하는, 에스.우베리스 면역원성 균주를 검출하는 방법.
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