PL204863B1

PL204863B1 - Zastosowanie mutanta Streptococcus, szczepionka i sposoby kontrolowania lub eliminowania choroby paciorkowcowej w populacji

Info

Publication number: PL204863B1
Application number: PL346369A
Authority: PL
Inventors: Hilda Elizabeth Smith
Original assignee: Stichting Dienst Landbouwkundi
Priority date: 1998-07-22
Filing date: 1999-07-19
Publication date: 2010-02-26
Also published as: EP1098980A2; US7776323B2; PL346369A1; EP1098980B1; HUP0500459A2; US20070111236A1; DK1098980T3; CA2341268C; AU5070999A; US20110171252A1; US7125548B2; US20020055168A1; WO2000005378A2; US8728490B2; HUP0500459A3; CA2341268A1; USRE45170E1; WO2000005378A3; HU228700B1; ES2512496T3

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie mutanta Streptococcus, szczepionka zawierająca mutanta Streptococcus i sposoby kontrolowania lub eliminowania choroby paciorkowcowej w populacji. Wynalazek dotyczy zakażeń Streptococcus występujących u świń, szczepionek zapobiegającym tym zakażeniom oraz dziedziny szczepionek bakteryjnych, zwłaszcza szczepionek zapobiegających zakażeniom Streptococcus.

Gatunki Streptococcus, a wśród nich wiele różnych powodujących zakażenia zwierząt domowych i człowieka, są często grupowane według grup Lancefield. Określanie przynależności do danej grupy Lancefield następuje w oparciu o determinanty serologiczne lub antygeny, które wraz z innymi są obecne w otoczce bakteryjnej i umożliwiają jedynie przybliżone określenie, często bakterie z różnych grup wykazują wzajemną reaktywność krzyżową, natomiast inne paciorkowce nie mogą być przypisane do żadnej z określonych grup. W obrębie grup możliwe jest często dalsze różnicowanie w oparciu o serotypowanie; serotypy te przyczyniają się do ogromnej zmienności antygenowej paciorkowców, co stwarza trudności w diagnozowaniu i szczepieniu przeciw zakażeniom paciorkowcami.

Gatunki Streptococcus należące do grupy A Lancefield (GAS, Streptococcus pyogenes) występują często u dzieci, wywołując zakażenia nosowo-gardłowe i ich powikłania. Wśród zwierząt, zwłaszcza bydło jest wrażliwe na GAS - stwierdza się u niego często zapalenie wymion.

Paciorkowce grupy A są czynnikiem etiologicznym w zapaleniu gardła i liszajcu, dwóch najczęstszych zakażeniach bakteryjnych wieku dziecięcego, oraz różnych mniej częstych, lecz potencjalnie zagrażających życiu zakażeniach, obejmujących zakażenia tkanek miękkich, bakteriemię, i zapalenia płuc. Ponadto, GAS są swoiście powiązane z poinfekcyjnymi zaspołami autoimrnunologicznymi w postaci ostrej gorą czki reumatycznej i popaciorkowcowego zapalenia kłębuszków nerkowych.

Kilka ostatnio opublikowanych doniesień sugeruje, że występowanie obydwu poważnych zakażeń powodowanych przez GAS i ostrej gorączki reumatycznej wzrosło w ostatniej dekadzie, skupiając wzmożone zainteresowanie na określeniu atrybutów lub czynników zjadliwości, które mogą odgrywać rolę w patogenezie tej choroby.

GAS wytwarzają kilka składników powierzchniowych i produktów pozakomórkowych, które mogą być istotne dla ich zjadliwości. Główne białko powierzchniowe, białko M, zostało zbadane najdokładniej i wykazano przekonywująco jego związek ze zjadliwością i odpornością. Izolaty bogate w białko M mają zdolność do wzrostu we krwi ludzkiej, co jak się uważa odzwierciedla zdolność białka M do zakł ócania fagocytozy, a izolaty te zwykle był y zjadliwe w zwierzę tach doś wiadczalnych.

Streptococcus z grupy B Lancefield (GBS) najczęściej występują u bydła, powodując zapalenie wymion, jednakże ludzkie niemowlęta też są wrażliwe na zakażenie, często w konsekwencji śmiertelne. Paciorkowce grupy B (GBS) stanowią główną przyczynę posocznicy bakteryjnej i zapalenia opon mózgowych u noworodków urodzonych w Stanach Zjednoczonych i Europie zachodniej i stają się znaczącym patogenem zagrażającym noworodkom także w krajach rozwijających się.

Szacuje się, że szczepy GBS są odpowiedzialne za 10 000 do 15 000 przypadków zakażeń inwazyjnych u noworodków w samych Stanach Zjednoczonych. Pomimo postępu, jaki nastąpił we wczesnym diagnozowaniu i leczeniu, posocznica wywołana u noworodków przez GBS w 15 do 20% przypadków prowadzi do śmierci. Ponadto, przeżycie zapalenia opon mózgowych wywołanego przez GBS prowadzi w 30 do 50% przypadków do długotrwałych zaburzeń neurologicznych. Zwiększenie liczby rozpoznawanych w ciągu ostatnich dwóch dekad zakażeń GBS u noworodków przyczyniło się do wzrostu zainteresowania określeniem czynników bakteryjnych i gospodarza istotnych w zjadliwości GBS i wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej wobec zakażeń GBS.

Szczególną uwagę poświęcono polisacharydowi otoczkowemu jako dominującemu antygenowi powierzchniowemu organizmów. W modyfikacji systemu wyjściowo opracowanego przez Rebbecę Lancefield, serotypowanie GBS przeprowadza się w oparciu o różnice antygenów występujących w ich polisacharydach otoczki i obecność lub brak określonych serologicznie białek C. GBS izolowane ze źródeł pozaludzkich często nie posiadają wykrywanej serologicznie otoczki, natomiast większość szczepów związanych z zakażeniami noworodków należy do jednego z czterech głównych serotypów otoczki 1a, 1b, II lub III. Polisacharyd otoczki tworzy najbardziej zewnętrzną warstwę wokół komórki bakteryjnej, wierzchnią wobec ściany komórkowej. Otoczka jest odrębna względem węglowodanu grupy B związanego ze ścianą komórkową. Sugeruje się, że obecność kwasu sialowego w otoczce bakterii powodującej zapalenie opon jest istotna dla pokonywania przez te bakterie bariery krewmózg. W istocie, u S. agalactiae kwas sialowy okazał się być kluczowy dla zjadliwości otoczki typu III.

PL 204 863 B1

Otoczka serotypu S. suis składa się z glukozy, galaktozy, N-acetyloglukozaminy, ramanozy i kwasu sialowego.

Polisacharyd grupy B, w przeciwieństwie do otoczki specyficznej dla typu, jest obecny we wszystkich szczepach GBS i stanowi podstawę do zaklasyfikowania organizmów ze względu na grupę serologiczną do grupy B Lancefield. Wczesne badania prowadzone przez Lancefield i współpracowników wykazały, że przeciwciała uzyskane u królików wobec całych organizmów GBS chroniły myszy przed zakażeniem szczepami o homologicznym typie otoczki, wykazując centralną rolę polisacharydu otoczki jako antygenu ochronnego. Badania przeprowadzone w latach 1970 przez Baker i Kasper wykazują, że krew pępowinowa ludzkich niemowląt z posocznicą wywołaną GBS typu III zawiera niskie lub niewykrywalne poziomy przeciwciał skierowanych wobec otoczki typu III, sugerując, że niedobór przeciwciał wobec otoczki był kluczowym czynnikiem podatności u ludzkich niemowląt na chorobę wywołaną przez GBS.

Zakażenia grupą C Lancefield, takie jak S. equi, S. zooepidermicus, S. dysgalactiae, i inne są obserwowane głównie u koni, bydła i świń, lecz mogą także przełamywać barierę specyficzności gatunkowej wobec ludzi. Zakażenia grupą B Lancefield (S. bovis) są wykrywane u wszystkich ssaków i pewnych ptaków, czasem powodują c zapalenie wsierdzia lub posocznicę .

Grupy Lancefield E, G, L, F, U i V (S. porcinus, S. canis, S. dysgalactiae) są wykrywane u różnych gospodarzy, powodując zakażenia noworodków, zakażenia nosowo-gardłowe lub zapalenie sutka.

W grupach Lancefield R, S i T (oraz typach niezgrupowanych) S. suis okazał się być ważną przyczyną zapalenia opon mózgowych, posocznicy, artretyzmu oraz nagłej śmierci młodych świń. Czasami mogą one także wywoływać zapalenie opon u ludzi.

S. suis okazał się być ważną przyczyną zapalenia opon mózgowych, posocznicy, artretyzmu oraz nagłej śmierci młodych świń (4, 46). Czasami może on także wywoływać zapalenie opon u ludzi (1). Szczepy S. suis są zwykle identyfikowane i klasyfikowane w oparciu o ich charakterystykę morfologiczną, biochemiczną i serologiczną (58, 59, 46). Charakterystyka serologiczna oparta jest na obecności specyficznych antygenów polisacharydowych. Dotychczas opisano 35 różnych serotypów (9, 56, 14). W kilku krajach europejskich, S. suis serotypu 2 jest szczepem najczęściej izolowanym z chorych świń, a kolejnymi serotypami są 9 i 1. Klasyfikowanie S. suis metodami serologicznymi jest prowadzone za pomocą różnych typów testów aglutynacji. W tych testach izolowane i biochemicznie scharakteryzowane komórki S. suis są poddawane aglutynacji z panelem 35 specyficznych surowic. Metody te są bardzo pracochłonne i czasochłonne.

Mało wiadomo o patogenezie chorób wywoływanych przez S. suis, nie mówiąc już o jego różnych serotypach takich jak typ 2. Różne składniki bakteryjne, takie jak białka zewnątrzkomórkowe i związane z bł oną komórkową , fimbrie, hemoglutyniny i hemolizyna są przypuszczalnie czynnikami zjadliwości (9, 10, 11, 15, 16, 47, 49). Jednakże dokładna rola tych składników białkowych w patogenezie choroby pozostaje niejasna (37). Wiadomo, że otoczka polisacharydowa różnych paciorkowców i innych bakterii Gram-dodatnich odgrywa istotną rolę w patogenezie (3, 6, 35, 51, 52). Otoczka pozwala tym mikroorganizmom zapobiec fagocytozie i dlatego uważa się ją za istotny czynnik zjadliwości. Ostatnio, zasugerowano także rolę otoczki S. suis w patogenezie (5). Jednakże struktura, organizacja i funkcjonowanie genów odpowiedzialnych za syntezę otoczki polisacharydowej (cps) u S. suis jest nieznana. Szczepy S. suis o serotypach 1 i 2 mogą różnić się zjadliwością wobec świń (41, 45, 49). Niektóre szczepy typu 1 i 2 są zjadliwe, natomiast inne nie. Ponieważ zarówno zjadliwe jak i niezjadliwe szczepy serotypu 1 i 2 posiadają pełną otoczkę, może się nawet okazać, że otoczka nie jest czynnikiem koniecznym zjadliwości.

Próby kontrolowania zakażeń lub chorób powodowanych przez S. suis są nadal utrudniane przez brak wiedzy o epidemiologii choroby oraz brak skutecznych szczepionek i czułych metod diagnostycznych. Jak dobrze wiadomo i jak jest to ogólnie akceptowane otoczka polisacharydowa różnych paciorkowców i innych bakterii Gram-dodatnich odgrywa ważną rolę w patogenezie. Otoczka pozwala tym mikroorganizmom opierać się fagocytozie i dlatego uznawana jest za ważny czynnik zjadliwości.

W porównaniu z posiadającymi otoczkę szczepami S. suis, szczepy S. suis nieposiadające otoczki są fagocytowane w wysokim stopniu przez mysie leukocyty polimorfojądrzaste. Ponadto zaobserwowano wzrost grubości otoczki dla hodowanych in vivo szczepów zjadliwych, natomiast nie obserwowano takiego wzrostu w przypadku szczepów niezjadliwych. A zatem wyniki te znowu świadczą o znaczeniu otoczki w patogenezie S. suis.

PL 204 863 B1

Niesklasyfikowane gatunki Streptococcus, takie jak S. mutans, powodujący próchnicę u ludzi, S. uberis, powodujący zapalenie wymion u bydła i S. pnaumonia, wywołujący poważne zakażenia u ludzi oraz Enterococcus feacilalis i E. feacium, należą również do dużej grupy paciorkowców.

Streptococcus pneumoniae (pneumokok, dwoinka zapalenia płuc) jest ludzkim patogenem wywołującym choroby zakaźne, takie jak zapalenie płuc, bakteremia i zapalenie opon mózgowych. Pomimo dostępności antybiotyków, zakażenia pneumokokowe pozostają nadal częste i nadal mogą być śmiertelne, szczególnie dla grup wysokiego ryzyka, takich jak małe dzieci i osoby starsze. Szczególnie w krajach rozwijających się, wiele dzieci w wieku poniżej pięciu lat umiera każdego roku na pneumokokowe zapalenie płuc. S. pneumoniae jest także wiodącą przyczyną zapalenia ucha środkowego i zapalenia zatok. Zakaż enia te są mniej groź ne, jednak przyczyniaj ą się do znaczą cych kosztów medycznych, szczególnie, gdy prowadzą do powikłań, takich jak stała głuchota. Naturalną niszą ekologiczną pneumokoków jest nosogardziel człowieka. Cała populacja ludzka jest kolonizowana przez pneumokoki w tym czy innym czasie a w danym momencie aż do 60% osób może być nosicielami. Nosicielstwo nosowo-gardłowe pneumokoków przez człowieka jest zwykle związane z uzyskaniem odporności na zakażenia tymi samym serotypem. Większość infekcji nie następuje po okresie przedłużonego nosicielstwa, lecz dochodzi do nich po nabyciu nowego szczepu. Wiele bakterii posiada polisacharydy powierzchniowe, które działają jako powierzchnia chroniąca przed wpływami środowiska. Polisacharydy powierzchniowe bakterii patogennych zwykle czynią je odpornymi na mechanizmy obronne gospodarza, np. na działanie lityczne surowicy lub fagocytozę. W związku z tym, swoisty dla danego serotypu polisacharyd otoczki (CP) Streptococcus pneumoniae, jest ważnym czynnikiem zjadliwości. Szczepy nieposiadające otoczki są niezjadliwe, a przeciwciała specyficzne wobec CP są ochronne. Ochrona jest specyficzna wobec serotypu; każdy serotyp posiada swoją własną, specyficzną strukturę CP. Zidentyfikowano dziewięćdziesiąt różnych serotypów otoczkowych. Aktualnie, CP z 23 serotypów jest składnikiem szczepionek.

Szczepionki przeciwko zakażeniom Streptococcus ogólnie wykorzystują odpowiedź immunologiczną skierowaną wobec polisacharydu otoczki różnych gatunków Streptococcus, ze względu na to, że otoczka jest uznawana za główny czynnik zjadliwości u tych bakterii. Otoczka, w trakcie infekcji, zapewnia odporność na fagocytozę, przez co umożliwia wymknięcie się bakterii układowi immunologicznemu gospodarza, zabezpieczając bakterie przed usuwaniem przez makrofagi i neutrofile.

Otoczka nadaje bakteriom odporność zwłaszcza na opsonofagcytozę z udziałem dopełniacza. Ponadto, niektóre bakterie wyrażają polisacharydy otoczkowe (CP), które naśladują cząsteczki gospodarza, dzięki czemu unikają działania układu immunologicznego gospodarza. Ponadto, nawet w przypadku fagocytozy bakterii, wewnątrzkomórkowe zabijanie jest utrudniane obecnością otoczki.

Sądzi się powszechnie, że jedynie wtedy, gdy gospodarz ma przeciwciała lub inne czynniki surowicze skierowane wobec antygenów otoczki, bakterie mogą być rozpoznawane przez układ immunologiczny przy udziale przeciwciał anty-otoczkowych lub czynników osocza wiążących się do otoczki, a następnie, na drodze opsonizacji, ulegać fagocytozie i zabiciu.

Jednakże, te przeciwciała są specyficzne dla konkretnego serotypu i często będą dostarczać odporności jedynie wobec jednego z wielu znanych serotypów z grupy Streptococcus.

Przykładowo, dostępne komercyjnie szczepionki na S. suis, które opierają się ogólnie na pełnokomórkowych preparatach bakteryjnych lub wzbogaconych w otoczkę frakcjach S. suis, zapewniają jedynie ograniczoną ochronę przed heterologicznymi szczepami. Również dostępna szczepionka pneumokokowa, udostępniona w Stanach Zjednoczonych w 1983, składa się z oczyszczonych CP z 23 serotypów pneumokokowych spoś ród co najmniej 90 istniej ą cych typów CP.

Kompozycja tej szczepionki pneumokokowej została oparta na częstości zachorowań w USA i reaktywności krzyż owej pomiędzy różnymi serotypami. Jakkolwiek szczepionka ta chroni dorosłych przed zakażeniami wywoływanymi przez serotypy zawarte w szczepionce, nie dostarcza ona zabezpieczającej odpowiedzi odpornościowej u niemowląt poniżej 18 miesiąca życia i jest mało skuteczna u osób starszych. Ponadto, szczepionka zapewnia zaledwie ograniczoną odporność u pacjentów z niedoborami odpornoś ci i nowotworami hematologicznymi.

W ś wietle powyż szego, istnieje zapotrzebowanie na ulepszone szczepionki przeciw zakaż eniom Streptococcus. Wiele uwagi poświęcono otrzymywaniu szczepionek wobec CP poprzez wytwarzanie odpowiednich polisacharydów metodami chemicznymi lub rekombinacyjnymi. Jednakże, synteza chemiczna polisacharydów jest kosztowna, a synteza polisacharydu otoczkowego technikami inżynierii genetycznej wymaga znajomości odpowiednich genów, która nie zawsze jest dostępna i wymaga ustaleń dla każdego serotypu.

PL 204 863 B1

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie mutanta Streptococcus z niedoborem ekspresji otoczki do wytwarzania szczepionki.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto szczepionka, charakteryzująca się tym, że zawiera mutanta Streptococcus z niedoborem ekspresji otoczki.

Korzystnie mutanta Streptococcus stanowi Streptococcus suis.

Korzystnie mutanta Streptococcus stanowi Streptococcus suis serotypu 2.

Korzystnie szczepionka zawiera mutanta zdolnego do ekspresji czynnika zjadliwości lub determinanty antygenowej Streptococcus.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób kontrolowania lub eliminowania choroby paciorkowcowej w populacji, polegający na tym, że obejmuje etap, w którym testuje się próbkę pochodzącą od przynajmniej jednego osobnika z tej populacji pod kątem obecności szczepów paciorkowców posiadających otoczkę, przy czym ta populacja jest częściowo lub całkowicie zaszczepiona za pomocą szczepionki określonej powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób kontrolowania lub eliminowania chorób paciorkowcowych w populacji, polegający na tym, że obejmuje etap, w którym testuje się próbkę pochodzącą od przynajmniej jednego osobnika z tej populacji pod kątem obecności specyficznych wobec otoczki przeciwciał ukierunkowanych przeciwko szczepom paciorkowców, przy czym ta populacja jest częściowo lub całkowicie zaszczepiona za pomocą szczepionki określonej powyżej.

Zgodnie z wynalazkiem ujawniono izolowany lub rekombinowany kwas nukleinowy kodujący zgrupowanie genów otoczki (cps) ze Streptococcus suis. Biosynteza polisacharydów otoczki została ogólnie zbadana w wielu bakteriach Gram-dodatnich i Gram-ujemnych (32). W bakteriach Gramujemnych, ale także w licznych bakteriach Gram-dodatnich, geny zaangażowane w biosyntezę polisacharydów są zgrupowane w jednym locus. Geny otoczki Streptococcus suis tu ujawnione wykazują wspólną organizację genetyczną obejmującą trzy oddzielne regiony. Region centralny jest specyficzny dla serotypu i koduje enzymy odpowiedzialne za syntezę i polimeryzację polisacharydów. Region ten jest oflankowany przez dwa regiony zachowywane w Streptococcus suis, które kodują białka pełniące wspólne funkcje, takie jak transport polisacharydu przez błonę komórkową. Jednakże, pomiędzy gatunkami istnieje jedynie niska homologia, co utrudnia łatwe porównywanie i wykrywanie widocznie podobnych genów. Znajomość kwasu nukleinowego kodującego regiony flankujące umożliwia specyficzne dla danego typu określenie kwasu nukleinowego w regionie centralnym serotypów Streptococcus suis, co zostało przykładowo opisane w części eksperymentalnej wynalazku.

Zgodnie z wynalazkiem ujawniono izolowany lub rekombinowany kwas nukleinowy kodujący zgrupowanie genów otoczki ze Streptococcus suis lub pochodzący z niego gen lub fragment genu. Taki kwas nukleinowy otrzymuje się przykładowo poprzez hybrydyzację chromosomalnego DNA pochodzącego z dowolnego z serotypów Streptococcus suis z kwasem nukleinowym kodującym gen pochodzący ze zgrupowania genów otoczki Streptococcus suis serotypu 1, 2 lub 9, jak ujawniono w niniejszym wynalazku (patrz przykł adowo tabele 4 i 5) i klonowanie (swoistych dla typu) genów jak to opisano przykładowo w części eksperymentalnej opisu. Zidentyfikowano, co najmniej 14 otwartych ramek odczytu. Większość genów należy do pojedynczej jednostki transkrypcyjnej, co oznacza skoordynowaną kontrolę tych genów, a kodowane przez nie enzymy i białka współuczestniczą w tworzeniu otoczki z odpowiednim polisacharydem. Zgodnie z wynalazkiem ujawniono geny cps i białka przez nie kodowane zaangażowane w regulację (CpsA), określanie długości łańcucha (CpsB, C), eksport (CpsC) i biosyntezę (CpsE, F, G, H, J, K). Jakkolwiek na pierwszy rzut oka organizacja wydaje się być podobna do tej w zgrupowaniach genów cps i eps z licznych bakterii Gram-dodatnich (19, 32, 42), ogólna homologia jest niska (patrz tabela 3). Region zaangażowany w biosyntezę znajduje się w centrum zgrupowania genów i jest oflankowany przez dwa regiony zawierające geny spełniające dalsze wspólne funkcje.

Zgodnie z wynalazkiem ujawniono izolowany lub rekombinowany kwas nukleinowy kodujący zgrupowanie genów otoczki ze Streptococcus suis serotypu 2 lub pochodzący z niego gen lub fragment genu, zwłaszcza taki jak przedstawiono na figurze 3. Geny w tym zgrupowaniu genów uczestniczą w biosyntezie polisacharydu składników i antygenów otoczki. Dalszy opis tych genów znajduje się przykładowo w tabeli 2, na przykład pokazany jest gen cpsA funkcjonalnie odpowiadający za regulację syntezy polisacharydu otoczki, natomiast cpsB i cpsC funkcjonalnie uczestniczą w określaniu długości łańcucha. Inne geny, takie jak cpsD, E, F, G, H, I, J, K i geny pokrewne, uczestniczą w syntezach polisacharydów, działając przykładowo jako glukozylo- lub glikozylotrasferaza. Geny cpsF, G, H, I, J kodują więcej białek swoistych dla typu niż geny flankujące, które są mniej lub bardziej konserwowane

PL 204 863 B1 między gatunkami i mogą stanowić podstawę do wyboru starterów lub sond do amplifikacji PCR lub hybrydyzacji krzyżowej do kolejnego klonowania.

Przykładowo, zgodnie z wynalazkiem ujawniono izolowany lub rekombinowany kwas nukleinowy kodujący zgrupowanie genów otoczki ze Streptococcus suis serotypu 1 lub pochodzący z niego gen lub fragmentu genu, w szczególności przedstawiony na figurze 4.

Ponadto zgodnie z wynalazkiem ujawniono izolowany lub rekombinowany kwas nukleinowy kodujący zgrupowanie genów otoczki ze Streptococcus suis serotypu 9 lub pochodzący z niego gen lub fragmentu genu, w szczególności przedstawiony na figurze 5.

Ponadto, zgodnie z wynalazkiem ujawniono na przykład fragment lub jego część locus cps, uczestniczący w biosyntezie polisacharydu otoczki, z S. suis, którego przykłady dla serotypu 1, 2 lub 9 podano w części eksperymentalnej, i który umożliwia identyfikowanie lub detekcję pokrewnych fragmentów z innych serotypów S. suis.

Zgodnie z wynalazkiem ujawniono także kwas nukleinowy sondy lub startera pochodzący z kwasu nukleinowego tu ujawnionego pozwalają cy na detekcję gatunku lub specyficznych serotypów Streptococcus suis. Taką sondą lub starterem (używanymi tu zamiennie) jest przykładowo sonda DNA, RNA lub PNA (peptydowy kwas nukleinowy) hybrydyzująca z kwasem nukleinowym dla otoczki. Wykrywanie swoiste dla gatunku uzyskuje się dogodnie poprzez wybór sekwencji sondy lub startera z regionu specyficznego dla gatunku (np. regionu flankują cego), natomiast wykrywanie swoiste dla serotypu dogodnie uzyskuje się poprze wybór sekwencji sondy lub startera z regionu specyficznego dla typu (np. regionu centralnego) ze zgrupowania genów otoczki tu przedstawionego. Taką sondę lub starter można użyć w postaci dalej nie modyfikowanej, na przykład w hybrydyzacji krzyżowej lub reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) jak na przykład opisano w części doświadczalnej niniejszego opisu. Zgodnie z wynalazkiem opisano izolację i charakteryzację molekularną dodatkowych specyficznych dla typów genów cps z S. suis typów 1 i 9. Ponadto opisano różnorodność genetyczną locI cps z serotypów 1, 2 i 9 spośród 35 znanych aktualnie serotypów S. suis. Zidentyfikowano sondy specyficzne dla typów. Przedstawiono także specyficzny dla typu PCR, na przykład dla serotypu 9, który jest szybkim, rzetelnym i czułym testem, stosowanym bezpośrednio na wysiękach z nosa lub gardła lub innych próbkach ze zwierząt zainfekowanych lub będących nosicielami.

Zgodnie z wynalazkiem ujawniono także sondę lub starter dodatkowo wyposażone w przynajmniej jedną cząsteczkę reporterową. Liczne przykłady cząsteczek reporterowych są znane ze stanu techniki, przykładowo cząsteczka reporterową może zawierać dodatkowy kwas nukleinowy zaopatrzony w specyficzną sekwencję (np. oligo-dT) hybrydyzującą z odpowiednią sekwencją, dla której hybrydyzacja może być łatwo wykryta przykładowo dzięki jej immobilizacji na stałym nośniku.

Jeszcze inną cząsteczką reporterową może być chromatofor, np. fluorochrom do detekcji wizualnej, przykładowo w mikroskopii świetlnej lub techniką fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), lub może zawierać enzym, taki jak peroksydaza chrzanowa do detekcji enzymatycznej, np. techniką testów enzymatycznych (EIA). Jeszcze inne cząsteczki reporterowe zawierają składnik radioaktywny do detekcji w testach opartych na pomiarach radiacji.

W zalecanej postaci realizacji przynajmniej jedna taka sonda lub starter jest wyposaż ona (wyznakowana) cząsteczką reporterową i cząsteczką gaszącą, stanowiąc wraz z nieznakowaną sondą lub starterem oparty na PCR test umożliwiający szybkie wykrywanie specyficznej hybrydyzacji.

Zgodnie z wynalazkiem ujawniono także test diagnostyczny lub zestaw testowy zawierający opisaną powyżej sondę lub starter. Do szybkiej detekcji i/lub określania serotypu Streptococcus suis zalecane jest stosowanie takiego testu lub zestawu testowego, na przykład testu opartego na hybrydyzacji testowej lub testu opartego na PCR.

Zgodnie z wynalazkiem ujawniono także białko lub jego fragment kodowane przez tu opisany kwas nukleinowy. Przykładem takiego białka lub fragmentu są białka opisane przykładowo w tabeli 2 opisu, na przykład opisane jest białko cpsA funkcjonalnie odpowiedzialne za regulację syntezy polisacharydu otoczki, natomiast cpsB i cpsC uczestniczą funkcjonalnie w określaniu długości łańcucha w ł a ń cuchu. Inne białka lub ich funkcjonalne fragmenty, takie jak cpsD, E, F, G, H, I, J, K i biał ka pokrewne, uczestniczą w biosyntezie polisacharydu, działając na przykład jako glukozylo- lub glikozylotransferaza w biosyntezie polisacharydu z antygenu otoczkowego ze Streptococcus suis.

Zgodnie z wynalazkiem ujawniono także sposób otrzymywania antygenu otoczkowego Streptococcus suis, który obejmuje zastosowanie białka lub jego funkcjonalnego fragmentu tu opisanego, a przez co ujawniono otoczkowy antygen Streptococcus suis, który można otrzymać tym sposobem. Porównywanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych genów cps2 z sekwencjami znalezionymi

PL 204 863 B1 w bazach danych pozwala okreś lić domniemane funkcje otwartych ramek odczytu. Region centralny zawiera specyficzne dla typu glikozylotransferazy i domniemaną polimerazę polisacharydu. Region ten jest oflankowany przez dwa regiony kodujące białka o wspólnych funkcjach, takie jak regulacja i transport polisacharydu przez błonę. Biosynteza polisacharydowego antygenu otoczkowego ze Streptococcus przy zastosowaniu białka lub jego funkcjonalnego fragmentu jest dogodnie stosowana w syntezie chemiczno-enzymatycznej i otrzymywaniu szczepionek nadających odporność na choroby wywoływane przez specyficzne serotypy paciorkowców, i jest także dogodnie stosowana w syntezie i opracowywaniu wielowartościowych szczepionek przeciw zakażeniom paciorkowcowym. Takie szczepionki wyzwalają wytwarzanie przeciwciał wobec otoczki, które nadają odporność.

Ponadto zgodnie z wynalazkiem ujawniono bezotoczkowego mutanta Streptococcus do zastosowania w szczepionce, szczep szczepionkowy pochodzący z niego i otrzymaną z jego użyciem szczepionkę. Nieoczekiwanie, wbrew powszechnym opiniom, zgodnie z wynalazkiem dostarczono zastosowanie w szczepionce mutanta Streptococcus z niedoborem ekspresji otoczki.

Bezotoczkowe mutanty Streptococcus były od dawna znane w tej dziedzinie i można je znaleźć w naturze. Griffith (J. Hyg. 27:113-159, 1928) wykazał, że pneumokoki mogą ulegać transformacji od jednego typu do drugiego. Gdy wstrzykiwał on myszom (bezotoczkowe lub posiadające otoczki) żywe szorstkie pneumokoki typu 2 myszy przeżywały. Natomiast, gdy wstrzykiwał myszom taką samą dawkę żywego szorstkiego typu 2 zmieszanego z termicznie zabitym gładkim (z otoczką) typem 1, myszy umierały, a z ich krwi izolowano żywe pneumokoki typu 1. W tamtym czasie, znaczenia takich wyników transformacji nie rozumiano. Zrozumienie przyszło wraz z wykazaniem, że DNA stanowi materiał genetyczny odpowiedzialny za zmiany fenotypowe podczas transformacji.

Mutanty Streptococcus z niedoborem ekspresji otoczki odkryto w różnej postaci. U niektórych niedobór jest całkowity i nie posiadają one wcale otoczki, inne tworzą uszkodzoną otoczkę, co wynika z mutacji w zgrupowaniu genów otoczki. Niedobory mogą przykł adowo dotyczyć tworzenia otoczki, gdzie organizacja materiału otoczki została zmieniona, co można przykładowo wykazać poprzez mikroskopię elektronową. Jeszcze inne posiadają prawie całkowicie wykształconą otoczkę, która posiada niedobory jedynie pewnego składnika cukrowego.

Teraz, po dokonaniu znacznego postępu w biotechnologii i pomimo tego, że nadal niewiele wiadomo o dokładnej lokalizacji i sekwencji genów zaangażowanych w syntezę otoczki paciorkowców, możliwe jest uzyskanie mutantów paciorkowców, przykładowo technikami rekombinacji homologicznej lub mutagenezy transpozonowej, które uzyskano przykładowo dla GAS (Wessels i wsp., PNAS 83:3317-8321, 1991), dla GB3 (Wessels i wsp., PNAS 8 6:8983-8987, 1939), dla S. suis (Smith, ID-DLO Annual report 1996, strony 18-19; Charland i wsp., Microbiol. 144:325-332, 1998) i dla S. pneumonia (Kolkman i wsp., J. Bact. 178:3736-3741, 1996). Takie mutanty pochodzące z rekombinacji, lub mutanty izogeniczne, można łatwo porównać ze szczepami typu dzikiego, z których pochodzą.

W zalecanej realizacji w szczepionce zastosować moż na rekombinowane mutanty Streptococcus z niedoborem ekspresji otoczki. Technikami rekombinacyjnymi uż ytecznymi w wytwarzaniu takich mutantów są przykładowo rekombinacja homologiczna, mutageneza transpozonowa i inne, przy czym delecje, insercje lub mutacje (punktowe) są wprowadzane do genomu. Zaletami stosowania technik rekombinacyjnych jest stabilność uzyskiwanych mutantów (szczególnie z technikami rekombinacji homologicznej i podwójnego crossing-over)oraz wiedza o dokładnym miejscu delecji, mutacji lub insercji.

W bardziej zalecanej realizacji zastosować moż na stabilnego mutanta z niedoborem ekspresji otoczki, którego można uzyskać poprzez rekombinację homologiczną lub integrację na drodze crossing over. Przykłady takich mutantów można znaleźć w części eksperymentalnej opisu, na przykład zgodnie z wynalazkiem takim stabilnym mutantem jest mutant 10cpsB lub 10cpsEF.

Zgodnie z wynalazkiem ujawniono także szczep szczepionkowy Streptococcus i szczepionkę uzyskaną z mutanta Streptococcus z niedoborem ekspresji otoczki. Ogólnie, taki szczep lub szczepionka nadają się do stosowania w szeregu zakażeń paciorkowcowych dotykających zarówno zwierząt, jak i ludzi lub zakażeń odzwierzęcych. Oczywiście możliwe jest też obecnie najpierw wybrać powszechnie stosowany szczep szczepionkowy i uzyskać z niego mutanta paciorkowca z niedoborem ekspresji otoczki służącego do selekcji szczepu szczepionkowego i zastosować go w szczepionce według wynalazku.

W zalecanej realizacji w szczepionce zastosować można mutanta Streptococcus z niedoborem ekspresji otoczki wybranego z grupy składającej się ze Streptococcus grupy A, Streptococcus grupy B, Streptococcus suis i Streptococcus pneumonia. Zgodnie z wynalazkiem ujawniono szczepy szczepionkowe i szczepionki stosowane wobec tych notorycznie heterologicznych paciorkowców, dla których istnieje

PL 204 863 B1 wiele serotypów. Za pomocą szczepionki według wynalazku pochodzącej od specyficznego mutanta Streptococcus, który posiada niedobór ekspresji otoczki, trudności dotyczące braku heterologicznej ochrony można przezwyciężyć, ponieważ u tych mutantów indukcja ochrony jako taka nie zależy od antygenów otoczki.

W zalecanej realizacji taki szczep szczepionkowy wybiera się ze wzglę du na jego zdolność do przeżycia lub nawet replikowania się w immunkompetentnym gospodarzu lub komórkach gospodarza i dzię ki temu może utrzymywać się przez pewien okres w zakresie od 1-2 dni do więcej niż jeden lub dwa tygodnie, w gospodarzu, pomimo swoich braków.

Jakkolwiek gospodarz z niedoborem odporności może podtrzymywać replikację szerokiego zakresu bakterii, z niedoborem jednego lub więcej czynnika zjadliwości, ogólnie uznaje się za charakterystyczne dla patogenności paciorkowców to, że mogą one przeżyć przez pewien okres lub replikować się w zdrowym gospodarzu lub komórkach gospodarza, takich jak makrofagi. Przykładowo, Wiliams i Blakemore (Neuropath. Appl. Neurobiol.: 16, 345-356, 1990; Neuropath. Appl. Neurobiol.: 16, 377-392, 1990; J. Infect. Dis.: 162, 474-481, 1990) wykazują, że zarówno komórki polimorfojądrzaste, jak i komórki makrofagów są zdolne do fagocytozy patogennych S. suis u świń nieposiadających przeciwciał anty-S. suis, a jedynie bakterie patogenne mogą przeżyć i dzielić się w makrofagach i świniach.

W zalecanej realizacji opisano natomiast mutanta z niedoborem lub mutanta niezjadliwego lub szczep szczepionkowy, który jest zdolny do przeżycia przynajmniej przez 4-5 dni, dogodnie przynajmniej przez 8-10 dni w takim gospodarzu, pozwalając przez to na rozwinięcie się stałej odpowiedzi immunologicznej na kolejne infekcje Streptococcus. Dzięki swemu stałemu, lecz niezjadliwemu charakterowi, mutant Streptococcus lub szczep szczepionkowy tu opisany jest przydatny do otrzymywania specyficznych i/lub długotrwałych odpowiedzi immunologicznych wobec antygenów paciorkowcowych; ponadto ewentualna specyficzna wobec otoczki odpowiedź immunologiczna gospodarza jest względnie nieistotna, ponieważ opisany tu szczep szczepionkowy jest ogólnie nierozpoznawany przez takie przeciwciała.

Dodatkowo zgodnie z wynalazkiem ujawniono szczep szczepionkowy Streptococcus zawierający mutanta zdolnego do ekspresji czynnika zjadliwości lub determinanty antygenowej Streptococcus.

W zalecanej realizacji opisano szczep szczepionkowy Streptococcus zawierają cy mutanta zdolnego do ekspresji czynnika zjadliwości lub determinanty antygenowej Streptococcus, przy czym wspomniany czynnik zjadliwości lub determinanta antygenowa jest wybrany z grupy składników komórkowych, takich jak białko spokrewnione z muramidazą (MRP), czynnik zewnątrzkomórkowy (EF) i biał ka zwią zane z bł oną komórkową , 60 kDa białko szoku cieplnego, pneumokokowe biał ko powierzchniowe A (Psp A), pneumolizyna, białko C, białko M, fimbrie, hemaglutynina, hemolizyna lub składniki funkcjonalnie z nimi spokrewnione.

W kolejnej zalecanej realizacji opisano szczep szczepionkowy Streptococcus zawierający mutanta zdolnego do nadekspresji wspomnianego czynnika zjadliwości. W ten sposób, opisano szczep szczepionkowy do zastosowania w szczepionce, która specyficznie spowoduje, że gospodarz będzie zdolny do odpowiedzi immunologicznej specyficznej wobec ważnych antygenowo determinant zjadliwości (wymienionych powyżej), dostarczając dzięki temu specyficznej ochrony skierowanej wobec takich determinant. Nadekspresja może być uzyskana poprzez sklonowanie odpowiedniego genu za silnym promotorem, który na przykład ulega ekspresji konstytutywnej w układzie wielokopiowym, albo w plazmidzie albo na drodze integracji z genomem.

W jeszcze innej realizacji opisano szczep szczepionkowy Streptococcus zawierający mutanta zdolnego do ekspresji białka niepochodzącego od paciorkowców. Taki wektorowy szczep szczepionkowy Streptococcus umożliwia, gdy jest stosowany w szczepionce, ochronę wobec innych patogenów niż Streptococcus.

Ze względu na swój stały, ale niezjadliwy charakter, szczep szczepionkowy lub mutant Streptococcus tu opisany jest przydatny do uzyskiwania specyficznych długotrwałych odpowiedzi immunologicznych nie tylko wobec antygenów paciorkowcowych, lecz także innych antygenów, gdy są one wyrażane przez taki szczep. Szczególnie antygeny pochodzące z innych patogenów są teraz wyrażane bez szkodliwych efektów takiego antygenu lub patogenu, który w innych okolicznościach mógłby zaszkodzić gospodarzowi.

Przykładem takiego wektora jest szczep szczepionkowy lub mutant Streptococcus, w którym wspomniany antygen pochodzi z patogenu takiego jak Actinobacillus pleuroneumonia, Mycoplasmatae, Bordetella, Pasteurella, E. coli, Salmonella, Campylobacter, Serpulina i inne.

Zgodnie z wynalazkiem ujawniono także szczepionkę zawierającą szczep szczepionkowy Streptococcus tu opisany i zawierającą ponadto odpowiedni farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub

PL 204 863 B1 adiuwant. Nośniki i adiuwanty są dobrze znane w tej dziedzinie, przykładami są roztwory soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, roztwory soli fizjologicznej, (podwójne) olejowo-wodne emulsje, wodorotlenek glinu, Specol, polimery blokowe lub kopolimery i inne.

Szczepionka według wynalazku może zawierać szczep szczepionkowy zarówno w postaci zabitej jak i żywej. Przykładowo, martwe szczepionki zawierające szczep z (nad)ekspresją paciorkowcowego lub heterologicznego antygenu lub czynnika zjadliwości bardzo dobrze nadają się do wzbudzania odpowiedzi immunologicznej. W zalecanej realizacji ujawniono szczepionkę, w której wspomniany szczep jest żywy, dzięki jego stałemu, ale niezjadliwemu charakterowi szczep szczepionkowy Streptococcus tu opisany bardzo dobrze nadaje się do uzyskiwania specyficznych długotrwałych odpowiedzi immunologicznych.

Poza dostarczaniem opisanych tu szczepionek paciorkowcowych zgodnie z wynalazkiem dostarczono także sposób kontrolowania lub eliminowania chorób paciorkowcowych w populacji obejmujący szczepienie osobników z tej populacji tu opisaną szczepionką.

W zalecanej realizacji sposób kontrolowania lub eliminowania chorób paciorkowcowych obejmuje testowanie próbki, takiej jak próbka krwi, wysięk z nosa lub gardła, kał, mocz lub inne próbki, które mogą być pobrane podczas lub po uboju, pobranej od przynajmniej jednego osobnika, takiego jak niemowlę lub świnia, z populacji częściowo lub całkowicie zaszczepionej za pomocą szczepionki tu opisanej w celu stwierdzenia obecności szczepów paciorkowców posiadających otoczkę lub mutantów. Ponieważ opisany tu szczep szczepionkowy lub mutant nie jest patogenny i można go odróżnić od szczepu typu dzikiego poprzez ekspresję otoczki, detekcja szczepów paciorkowców z pełną otoczką wskazuje, że zakażenie typem dzikim jest nadal obecne. Takie osobniki zakażone typem dzikim można następnie odizolować od pozostałej populacji do zaniknięcia zakażenia. W przypadku zwierząt domowych, takich jak świnie, jest nawet możliwe całkowite usuwanie zakażonych osobników z populacji poprzez ubój selektywny. Wykrywanie szczepów typu dzikiego można uzyskać przy zastosowaniu techniki tradycyjnej hodowli, lub na drodze szybkiej detekcji technikami takimi jak PCR.

W jeszcze innej realizacji ujawniono sposób kontrolowania lub eliminowania chorób paciorkowcowych obejmujący testowanie próbki pochodzącej od przynajmniej jednego osobnika z populacji częściowo lub całkowicie zaszczepionej za pomocą tu opisanej szczepionki w celu stwierdzenia obecności przeciwciał specyficznych wobec otoczki skierowanych wobec szczepów paciorkowcowych. Przeciwciała specyficzne wobec otoczki można wykryć klasycznymi technikami znanymi w tej dziedzinie, takimi, jakie stosuje się przy klasyfikowaniu do grup Lancefield lub serotypowaniu.

W zalecanej realizacji sposób kontrolowania lub eliminowania chorób paciorkowcowych z populacji obejmuje szczepienie osobników w takiej populacji tu opisaną szczepionką i testowanie próbki pobranej od przynajmniej jednego osobnika z takiej populacji częściowo lub całkowicie zaszczepionej za pomocą tu opisanej szczepionki pod kątem obecności szczepów paciorkowców posiadających otoczkę i/lub pod kątem obecności przeciwciał specyficznych wobec otoczki skierowanych wobec szczepów paciorkowcowych.

Przykładowo, w sposobie według wynalazku wspomniana choroba paciorkowcowa może być wywoływana przez Streptococcus suis.

Zgodnie z wynalazkiem ujawniono także test diagnostyczny do testowania próbki do zastosowania w sposobie według wynalazku zawierający przynajmniej jeden środek do detekcji szczepów paciorkowcowych z otoczką i/lub do detekcji przeciwciał specyficznych wobec otoczki u skierowanych wobec szczepom paciorkowców.

Ponadto zgodnie z wynalazkiem ujawniono szczepionkę zawierającą tu opisany antygen i dodatkowo zawierającą odpowiedni nośnik i adiuwant. Immunogenność tu opisanego antygenu otoczkowego jest na przykład zwiększana przez połączenie z nośnikiem (takim jak białko nośnikowe), umożliwiając werbowanie komórek T do pomocy w uzyskiwaniu odpowiedzi immunologicznej.

Zgodnie z wynalazkiem opisano także rekombinowany mikroorganizm wyposażony przynajmniej w część zgrupowania genów otoczki pochodzącego z Streptococcus suis. Opisano także na przykład bakterię kwasu mlekowego wyposażoną przynajmniej w część zgrupowania genów otoczki pochodzącego ze Streptococcus suis. Różne spożywcze bakterie kwasu mlekowego (Lactococcus lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarium i Streptococcus gordonii) stosuje się jako systemy dostarczania służące do immunizacji śluzówkowej. Wykazano, że doustne (lub śluzówkowe) podawanie rekombinowanych L. Lactis, Lactobacillus i Streptococcus gordonii może wyzwalać miejscową odpowiedź przeciwciałową z udziałem IgA i/lub IgG wobec wyrażanego antygenu. Zastosowanie dróg doustnych do immunizacji przeciwko chorobom zakaźnym jest pożądane, ponieważ szczepionki doustne

PL 204 863 B1 są łatwiejsze w podawaniu, posiadają wysoki poziom zgodności i z tego powodu, że powierzchnie śluzówek są miejscem wnikania wielu patogennych czynników mikrobiologicznych. Fachowiec będzie potrafił przygotować taki mikroorganizm z (dodatkowymi) genami.

Zgodnie z wynalazkiem opisano ponadto rekombinowanego mutanta Streptococcus suis wyposażonego w zmodyfikowane zgrupowanie genów otoczki. Fachowiec potrafi wymieniać geny między gatunkami. W zalecanej realizacji niezjadliwy mutant Streptococcus suis jest wyposażony przynajmniej w część zmodyfikowanego zgrupowania opisanych tu genów otoczki.

Zgodnie z wynalazkiem ujawniono także szczepionkę zawierająca opisany tu mikroorganizm lub mutanta. Zaletą takiej szczepionki w porównaniu ze stosowanymi obecnie szczepionkami jest to, że zawiera ona precyzyjnie zdefiniowane mikroorganizmy i dobrze scharakteryzowane antygeny, pozwalając dokładnie określić pożądane odpowiedzi immunologiczne specyficzne wobec różnych wybranych antygenów.

Wynalazek jest dalej zilustrowany częścią eksperymentalną tego opisu, która jednak nie powinna ograniczać jego zakresu.

Część eksperymentalna

Materiały i metody

Szczepy bakteryjne i warunki wzrostu

Szczepy bakteryjne i plazmidy zastosowane w tych badaniach zostały wymienione w tabeli 1. Szczepy S. suis hodowano w pożywce Todd-Hewitt (kod CM189, Oxoid), a hodowle płytkowe prowadzono na agarze podstawowym krwistym Columbia (kod CM331, Oxoid) zawierającym 6% (obj./obj.) krwi końskiej. Szczepy E.coli hodowano na pożywce Luria (28), a hodowle płytkowe prowadzono na pożywce Luria zawierającej 1,5% (wag./obj.) agaru. Gdy było to konieczne, dodawano antybiotyki do płytek w następujących stężeniach: spektynomycyna: 100 μg/ml dla S. suis i 50 μg/ml dla E.coli i ampicylinę, 50 μg/ml.

Serotypowanie. Szczepy S. suis klasyfikowano stosując szkiełkowy test aglutynacji z użyciem przeciwciał specyficznych wobec danego typu (44).

Techniki DNA. Rutynowe manipulacje DNA prowadzono zgodnie z opisem w Sambrook i wsp. (36).

Aktywność alkalicznej fosfatazy. W celu przeszukiwania pod kątem fuzji PhoA w E.coli skonstruowano biblioteki plazmidowe. W tym celu chromosomalne DNA z S. suis typu 2 trawiono Alul. Fragmenty 300-500 pz ligowano z pPHOS2 trawionym Smal. Mieszaniną ligacyjną transformowano szczep E.coli PhoA^- CC118. Transformanty wysiewano na płytki z pożywką LB uzupełnioną 5-bromo-4-chloro-3-indolylofosforanem (BCIP, 50 μg/ml, Boehringer Mannheim, Niemcy). Niebieskie kolonie oczyszczano na świeżych płytkach LB/BCIP w celu zweryfikowania fenotypu.

Analiza sekwencji DNA. Sekwencje DNA określano przy użyciu systemu 373 DNA Sequencing System (Applied Biosystems, Warrington, GB). Próbki przygotowywano stosując gotowy zestaw do sekwencjonowania cyklicznego z użyciem barwnego terminatora ABI/PRISM (Applied Biosystems). Dane z sekwencjonowania składano i analizowano stosując program MacMollyTetra. Startery do sekwencjonowania na zamówienie zostały dostarczone przez Life Technologies. Hydrofobowe obszary w białkach określano metodą Klain i wsp. (17). Program BLAST dostępny poprzez Netscape Navigator zastosowano do poszukiwania sekwencji białek spokrewnionych z wydedukowanymi sekwencjami aminokwasowymi.

Konstruowanie mutantów pozbawionych specyficznych genów S.suis. W celu uzyskania szczepów mutantów 10cpsB i 10cpsEF patogenny szczep 10 S. suis serotypu 2 (45, 49) poddawano elektrotransformacji odpowiednio pCPSll i pCPS28. W plazmidach tych geny cpsB i cpsEF były zniszczone poprzez insercję genu oporności na spektynomycynę. Aby uzyskać pCPSll, wewnętrzny fragment o długości 400 pz Pstl-BamHI z genu cpsB w pCPS7 zastąpiono genem SpcR. W tym celu pCPS7 trawiono Pstl i BamHl i ligowano z fragmentem Pstl-BamHI o długości 1200 pz, zawierającym gen SpcR, z pIC-spc. Do skonstruowania pCPS28 zastosowano pIC20R. Do tego plazmidu wstawiono fragment KpnI-Sall z pCPS17 (uzyskując pCPS25) i fragment Xbal-Clal z pCPS20 (uzyskując pCPS27). pCPS27 trawiono Pstl i XhoI i ligowano z fragmentem PstI-XhoI o długości 1200 pz, zawierającym gen Spcs, z pIC-spc. Elektrotransformacja S. suis była prowadzona jak opisano poprzednio (38).

Metoda Southerna i hybrydyzacja. Chromosomalne DNA izolowano jak opisano w Sambrook i wsp. (36). Fragmenty DNA rozdzielano w 0,8% żelu agarozowym i przenoszono na membranę ZetaProbe GT (Bio-Rad) jak opisano w Sambrook i wsp. (36). Sondy DNA znakowano stosując [(-³²P]dCTP (3000 Ci mmol^-1; Amersham) stosując zestaw do znakowania z losowymi starterami (Boehringer). DNA na membranach hybrydyzowano w 65°C z odpowiednią sondą DNA jak zalecano przez dostawcę membrany

PL 204 863 B1

Zeta-Probe. Po hybrydyzacji, membrany przemywano dwukrotnie roztworem 40 mM fosforanu sodu, pH 7,2, 1 mM EDTA, 5% SD3 przez 30 min. w 65°C i dwukrotnie z roztworem 40 mM fosforanu sodu, pH 7,2, 1 mM EDTA, 1% SDS przez 30 min. w 65°C.

PCR. Startery stosowane w PCR dla cps2J odpowiadają pozycjom 13791-13313 i 14465-14443 w locus cps2 S. suis. Sekwencje to 5' -CAAACGCAAGGAATTACGGTATC-3' i 5V-GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3'. Startery zastosowane do PCR dla cpsll odpowiadały pozycjom 4398-4417 i 4339-4821 w sekwencji cpsl S. suis. Sekwencje te to: 5'-GGCGGTCTAGCAGATGCTCG-3' i 51-GCGAACTGTTAGCAATGAC-3'. Startery zastosowane do PCR dla cps9H odpowiadały pozycjom 4406-4126 i 4494-4475 w sekwencji cps9 S. suis. Sekwencje te to: 5'-GGCTACATATAATGGAAGCCC-3' i 5'-CGGAAGTATCTGGGCTACTG-3'.

Konstruowanie mutantów S. suis pozbawionych specyficznych genów. W celu uzyskania szczepów mutantów 10cpsB i 10cpsEF patogenny szczep 10 S. suis serotypu 2 poddawano elektrotransformacji odpowiednio pCPSll i pCPS28. W plazmidach tych geny cpsB i cpsEF były zniszczone poprzez insercję genu oporności na spektynomycynę. Aby utworzyć pCPSll, wewnętrzny fragment Pstl-BamHI o długości 400 pz z genu cpsB w pCPS7 zastąpiono genem Spc^R. W tym celu pCPS7 trawiono Pstl i BamHI i poddawano ligacji z fragmentem Pstl-BamHI o długości 1200 pz, zawierającym gen SpcR, z pIC-spc. Dla skonstruowania pCP328 zastosowano pIC20R. Do tego plazmidu wstawiono fragment KpnI-Sall z pCPS17 (uzyskując pCPS25) i fragment Xbal-Clal z pCPS20 (uzyskując pCPS27). pCPS27 strawiono Pstl i XhoI i poddano ligacji z fragmentem PstI-XhoI o długości 1200 pz, zawierającym gen Spc^R, z pIC-spc. Elektrotransformacja S. suis była prowadzona jak opisano poprzednio (38).

Test fagocytozy. Testy fagocytozy prowadzono jak opisano przez Leij i wsp. (23). W skrócie, aby dokonać opsonizacji komórek 10⁷ komórek S. suis inkubowano w 6% surowicy świńskiej SPF przez 30 min. w 37°C w rotorze typu head-overhead przy 6 rpm. 10⁷ AM i 10⁷ opsonizowanych komórek S. suis łączono i inkubowano w 37°C ze stałymi obrotami przy 6 rpm. Próbki 1 ml zbierano po 0, 30, 60 i 90 minutach i mieszano z 4 ml schłodzonego na lodzie EMEM w celu zatrzymania fagocytozy. Fagocyty usuwano przez odwirowywanie przez 4 min. przy 100 x g i 43C. Określano liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) w zawiesinach. Doświdczenia kontrolne prowadzono jednocześnie łącząc 10⁷ opsonizowanych komórek S. suis i EMEM (bez AM).

Test zabijania. AM (10⁷/ml) i opsonizowane komórki S. suis (10⁷/ml) mieszano 1 : 1 i inkubowano przez 10 min. w 37°C ze stałymi obrotami przy 6 rpm. Dodawano schłodzony na lodzie EMEM w celu zatrzymania dalszej fagocytozy i zabijania. W celu usunięcia zewnątrzkomórkowych komórek S. suis, fagocyty przemywano dwukrotnie (4 min., 110 x g, 4°C) i zawieszano ponownie w 5 ml EMEM zawierającego 6% SPF surowicy. Probówki inkubowano w 37°C z rotacją przy 6 rpm. Próbki zbierano po 0, 30, 60 i 90 minutach i mieszano ze schłodzonym na lodzie EMEM w celu zatrzymania dalszego zabijania. Próbki odwirowywano przez 4 min. przy 100 x g i 4°C i komórki po fagocytozie lizowano w EMEM zawierającym 1% saponinę przez 20 min. w temperaturze pokojowej. Okreś lano liczbę CFU w zawiesinach.

Świnie. Wolne od zarazków świnie, krzyżówki ras Great Yorkshire i Duch landrace, uzyskiwano od macior w wyniku cesarskiego cięcia. Operację prowadzano w sterylnych izolatkach z elastycznej folii. Świnie dzielono na grupy, każda po 4 świnie, i hodowano w sterylnych inkubatorach ze stali nierdzewnej.

Zakażenia eksperymentalne. Świnie zaszczepiano donosowo S. suis typu 2 jak poprzednio opisano. W celu przygotowania świń do zakażenia S. suis, pięciodniowe świnie zaszczepiano donosowo około 107 CFU Bordetella bronchiseptica, szczep 92932. Dwa dni później świnie zaszczepiano donosowo S. suis typu 2 (10° CFU). Świnie obserwowano dwa razy dziennie pod kątem objawów klinicznych zachorowania, takich jak gorączka, objawy nerwowe i utykanie. Próbki krwi pobierano od każdej świni trzykrotnie w tygodniu. Zliczano białe krwinki w liczniku komórek. Aby monitorować zakażenie S. suis i B. bronchiseptica i sprawdzić nieobecność zanieczyszczeń, pobierano codziennie wysięki z części gardł owej nosa i odchody. Wymazy posiewano bezpoś rednio na pł ytki z agarem Columbia zawierającym 6% krwi końskiej. Po trzech tygodniach świnie zabijano i poddawano badaniom pod kątem zmian patologicznych. Wycinki tkanek z centralnego układu nerwowego (CNS), surowicówki i stawów poddawano badaniom bakteriologicznym i histologicznym jak opisano uprzednio (45, 49). Kolonizację surowicówki określano jako dodatnią gdy S. suis izolowano z osierdzia, opłucnej piersiowej i otrzewnej. Kolonizację stawów określano jako dodatnią, gdy S. suis izolowano z jednego lub więcej stawów (badano 12 stawów ze zwierzęcia).

PL 204 863 B1

Szczepienia i zakażanie

Tygodniowe świnie zaszczepiano dożylnie dawką 10⁶ cfu szczepów 10cpsEF lub 10cpsB S. suis. Trzy tygodnie później świnie zakażano dożylnie patogennym szczepem 10 serotypu 2 (10⁷ cfu). Obserwowanie postępu choroby, testy hematologiczne, serologiczne i bakteriologiczne oraz badania pośmiertne prowadzono jak opisano uprzednio dla infekcji eksperymentalnej.

Mikroskopia elektronowa. Preparaty bakteryjne do mikroskopii elektronowej przygotowywano zgodnie z opisem Wagenaar i wsp. (50). W skrócie, bakterie mieszano z agarozą MP (Boehringer) w 37°C do stężenia 0,7%. Mieszaninę szybko schładzano na lodzie. Po zestaleniu się żelu, próbki cięto na plastry grubości 1 do 1,5 mm i inkubowano w utwardzaczu zawierającym 0,8% glutaraldehydu i 0,8% osmotetraoksydu. Następnie, próbki unieruchamiano i wybarwiano w octanie uranylowym stymulując mikrofalami, odwadniano i zapiekano w żywicy eponaraldytowej. Ultra cienkie wycinki wybarwiano cytrynianem ołowiu i obserwowano pod mikroskopem elektronowym Philips CM 10 przy 80 kV.

Izolowanie świńskich makrofagów pęcherzykowych (AM, ang. Alveolar macrophages). Świńskie AM otrzymywano z płuc świń wolnych od specyficznych patogenów (SPF, ang. Specific patogen free). Próbki z płuc pobierano zgodnie z opisem van Leengoed i wsp. (43). Komórki zawieszano w EMEM zawierającym 6% (obj./obj.) surowicy świń SPF i doprowadzano do 10⁷ komórek na ml.

Wyniki

Identyfikacja locus cps.

Locus cps z S. suis typu 2 zidentyfikowano wykorzystując strategię używaną do identyfikowania genów białek wydzielanych (13, 31). W tym systemie zastosowano plazmid (pPHOS2) zawierający skrócony gen alkalicznej fosfatazy (13).

Gen nie miał sekwencji promotora, miejsca startu translacji i sekwencji sygnałowej. Skrócony gen jest poprzedzony z wykorzystaniem unikalnego miejsca restrykcyjnego Smal. Chromosomalne DNA z S. suis typu 2, trawione Alul, było losowo klonowane w tym miejscu restrykcyjnym. Ponieważ przechodzenie PhoA przez błonę cytoplazmatyczną E.coli jest konieczne dla aktywności enzymatycznej, system może być stosowany do selekcji fragmentów S. suis zawierających sekwencję promotorową, miejsce startu translacji i funkcjonalną sekwencję sygnałową. Spośród 560 testowanych odrębnych klonów E.coli, 16 wykazywało ciemno niebieski fenotyp, po wysianiu na płytki zawierające BCIP. Przeprowadzono analizę sekwencji DNA wstawek z kilku z tych plazmidów (wyniki niepokazane) i analizowano wydedukowane sekwencje aminokwasowe. Profil hydrofobowości jednego z klonów (pPHOS7, wyniki niepokazane) wykazał, że część N-końcowa sekwencji wykazuje charakterystykę typową dla peptydu sygnałowego: za krótkim hydrofilowym regionem N-końcowym znajduje się region hydrofobowy złożony z 38 aminokwasów. Dane te sugerują, że system phoA został pomyślnie wykorzystany do selekcji genów S. suis kodujących białka wydzielane. Ponadto, analizowano sekwencje pod kątem podobieństwa z bazami danych. Sekwencja pPHOS7 wykazywała wysokie podobieństwo (37% identyczności) z białkiem kodowanym przez gen cps14C ze Streptococcus pneumoniaa (19). Sugeruje to, że pPHOS7 zawiera część operonu cps z S. suis typu 2.

Klonowanie genów flankujących cps. W celu sklonowania genów flankujących cps z S. suis typu 2 zastosowano wstawkę z pPHOS7 jako sondę służącą do zidentyfikowania chromosomalnego fragmentu, który zawiera geny flankujące cps. Fragment WindlII o długości 6 kpz zidentyfikowano i sklonowano w pKUN19. Uzyskano tak klon pCP56 (fig. 1C). Analiza sekwencji wstawki pCPS6 wykazała, że pCPS6 najprawdopodobniej zawiera koniec 5' locus cps, lecz brakuje mu końca 3'. Dlatego sekwencję końca 3' pCPS6 użyto ponownie jako sondę służącą do zidentyfikowania fragmentów chromosomalnych zawierających sekwencje leżące poniżej cps. Fragmenty te także sklonowano w pKUN19, uzyskując pCP317. Stosując ten sam system kroczenia po chromosomie uzyskano następnie plazmidy pCPS18, pCPS20, pCPS23 i pCPS26, zawierające sekwencje leżące poniżej cps.

Analiza operonu cps. Ustalono pełną sekwencję nukleotydową sklonowanych fragmentów (figura

4). Badanie uzyskanych sekwencji wskazało na obecność przynajmniej 13 potencjalnych otwartych ramek odczytu (Orf), które oznaczono jako Orf 2Y, Orf2X i Cps2A-Cps2K (fig. 1A). Ponadto na sekwencji końca 5' zlokalizowano 14 niepełną Orf (Orf 2Z). Zidentyfikowano dwa potencjalne promotory. Jeden znajdował się 313 pz (pozycje 1885-1865 i 1884-1889) powyżej Orf2X. Sekwencja innego potencjalnego promotora znajdowała się 68 pz powyżej Orf2Y (pozycje 2241-2236 i 2216-2211). Orf2Y podlega ekspresji w odwrotnym kierunku. Pomiędzy Orf 2Y i 2Z sekwencja zawiera potencjalną strukturę spinki do włosów, która może działać jako terminator transkrypcji. Każda Orf jest poprzedzana przez miejsce wiążące rybosom i większość Orf leży bardzo blisko siebie. Jedyną znaczącą wewnątrzgenową przerwę stwierdzono pomiędzy Cps2G i Cps2H (389 nukleotydów). Jednakże, nie znaleziono oczywistej

PL 204 863 B1 sekwencji promotorowej lub potencjalnych struktur spinki do włosów w tym regionie. Dane te sugerują, że Orf2X i Cps2A-Cps2K stanowią operon.

Przegląd wszystkich Orf i ich właściwości pokazano w tabeli 2. Większość przewidywanych produktów genowych jest spokrewniona z białkami zaangażowanymi w biosyntezę polisacharydu. Orf2Z wykazywała pewne podobieństwo do białka YitS z Bacillus subtilis. YitS zostało zidentyfikowane podczas analizy sekwencji całego genomu B. subtilis. Funkcja białka jest nieznana.

Orf2Y wykazywał podobieństwo do białka YcxD z B. subtilis (53). W oparciu o podobieństwo pomiędzy YcxD i MocR z Rhizobium maliliti (33), zasugerowano, że YcxD jest białkiem regulatorowym.

Orf2X wykazywał podobieństwo z hipotetycznymi białkami YAAA z Hemophilus influenzas i E.coli. Funkcje tych białek są nieznane.

Produkty genów kodowane przez geny cps2A, cps2B, cps2C i cps2D wykazywały pewne podobieństwo do białek, odpowiednio, CpsA, CpsC, CpsD i CpsB z kilku serotypów Streptococcus pneumoniae (19). Sugeruje to podobieństwo funkcjonalne tych białek. Zatem, Cps2A może pełnić rolę w regulacji syntezy polisacharydu otoczkowego. Cps2B i Cps2C mogłyby uczestniczyć w określaniu długości łańcucha otoczki typu 2 a Cps2C może odgrywać dodatkową rolę w eksporcie polisacharydu. Białko Cps2D z S. suis jest spokrewnione z białkiem CpsB z S. pneumoniae i białkami kodowanymi przez geny kilku innych bakterii Gram-dodatnich zaangażowanymi w syntezę polisacharydu i egzopolisacharydu, lecz ich funkcja nie jest znana (19).

Białko kodowane przez gen cps2E wykazywało podobieństwo do kilku białek bakteryjnych o aktywności transferazy glikozylowej: Cps14E i Cps19fE z S. pneumoniae serotypów 14 i 19F (18, 19, 29), CpsE ze Streptococcus salvarius (X94980) i CpsD ze Streptococcus agalactiae (34). Ostatnio, Kolkman i wsp. (18) pokazali, że Cps14E jest transferazą glukozylo-1-fosforanu, która przyłącza glukozę do nośnika lipidowego, co stanowi pierwszy etap w biosyntezie jednostki powtarzającej się S. pneumoniae typu 14. W oparciu o te dane podobna funkcja może być pełniona przez Cps2E z S. suis.

Białko kodowane przez gen cps2F wykazywało podobieństwo do białka kodowanego przez gen rfbU z Salmonella enteritica (25). Podobieństwo to jest największe w C-końcowych regionach tych białek. Wykazano, że gen rfbU koduje aktywność mannozylotransferazową (25).

Gen cps2G kodował białko wykazujące umiarkowane podobieństwo do produktu genu rfbF pochodzącego z Campylobacter hyoilei (22), produktu genu epsF z S. thermophilus (40) oraz produktu genu capM z S. aureus (24). Na podstawie podobieństwa uważa się, że geny rfbF, epsF oraz capM kodują aktywności galaktozylotransferazy. Zatem, podobną aktywnością galaktozylotransferazową powinien charakteryzować się produkt genu cps2G.

Gen cps2H koduje białko wykazujące podobieństwo do N-końcowego regionu produktu genu lgtD z Haemophilus influenzae (U32763). Ponadto, regiony Cps2H i LgtD mają ten sam hydrofobowy charakter (nieprzedstawione dane). W oparciu o podobieństwo sekwencji uważa się, że produkt genu lgtD posiada aktywność glikozylotransferazową (U32768).

Produkt genowy kodowany przez gen cps2I wykazywał pewne podobieństwo do białka pochodzącego z Actinobacillus actinomycatemcomitans (A3002668). Białko to jest częścią zgrupowania genów odpowiedzialnych za produkcję antygenu specyficznego dla serotypu b A. actinomycetemcomitans. Funkcja białka jest nieznana.

Produkty genowe kodowane przez geny cps2J oraz cps2K wykazywały znaczne podobieństwo do białka Cps14J S. pnaumoniae. Gen cps14J pochodzący z S. pneumoniae kodował aktywność β-1,4-galaktozylotransferazową. U S. pneumoniae białko CpsJ odpowiedzialne jest za dodanie czwartej (tj. ostatniej) reszty cukrowej podczas syntezy polisacharydu S. pneumoniae serotypu 14 (20). Odkryto nawet pewne podobieństwo pomiędzy Cps2J i Cps2K (fig. 2, 25,5% podobieństwa). Podobieństwo to było bardziej wyraźne w N-końcowych obszarach białek. Ostatnio, zidentyfikowano w obrębie N-końcowych fragmentów Cps14J i Cps14I oraz ich homologów, dwa małe regiony o charakterze konserwatywnym (20). Uważa się, że są one istotne dla katalitycznej aktywności białka. Obydwa regiony, DXS oraz DXDD (fig. 2), znaleziono również w Cps2J i Cps2K.

Występowanie genów cps2 u innych serotypów S. suis W celu zbadania pokrewieństwa między genami cps2 a genami cps u innych serotypów S. suis, przeprowadzono hybrydyzację krzyżową. Fragmenty DNA poszczególnych genów cps2 amplifikowano w reakcji PCR, znakowano za pomocą 32P, a następnie stosowano jako sondę wobec filtrów przygotowanych metodą Southerna z chromosomalnym DNA szczepów referencyjnych 35 różnych serotypów S. suis. Zaobserwowano duże zróżnicowanie wzorów hybrydyzacyjnych (tabela 4). Jako kontrolę pozytywną użyto sondę specyficzną dla 16S rRNA. Sonda 163 rRNA hybrydyzowała ze wszystkimi testowanymi serotypami. Jednakże, żaden

PL 204 863 B1 z innych badanych genów nie był wspólny dla wszystkich serotypów. Na podstawie genetycznej organizacji genów, sugerowano uprzednio, że geny orfX i cpsA-cpsK stanowią część jednego operonu, oraz że białka kodowane przez te geny uczestniczą w procesie biosyntezy polisacharydu. OrfY oraz OrfZ nie należą do tego operonu a ich rola w biosyntezie polisacharydu jest niejasna. Opierając się na danych dotyczących podobieństwa sekwencji, zasugerowano, że OrfY może uczestniczyć w regulacji genów cps2. Założono, że OrfZ nie jest związane z biosyntezą polisacharydu.

Sondy specyficzne dla genów orfZ, orfY, orfX, cpsA, cpsB, cpsC i cpsD ulegały hybrydyzacji z większością innych serotypów. Sugeruje to, że kodowane przez te geny białko nie wykazuje specyficzności dla określonego typu i może być odpowiedzialne za bardziej ogólne funkcje w syntezie polisacharydu otoczki. Potwierdza to poprzednie dane wskazujące na silne podobieństwo pomiędzy genami cps2A-cps2D a genami cps pochodzącymi z kilku serotypów Streptococcus pneumoniae. Na podstawie tych podobieństw uważa się, że Cps2A jest prawdopodobnie białkiem regulatorowym, podczas gdy Cps23 i Cps2C mogą pełnić rolę w określaniu długości i eksporcie polisacharydu. Gen cps2E hybrydyzował z DNA pochodzącym z serotypu 1, 2, 14 oraz 1/2. Gen cps2E wykazywał silne podobieństwo z genem cps14E pochodzącym z S. pneumoniae (18). Enzym ten przejawiał aktywność glukozylo-1-fosforanową i katalizował przeniesienie glukozy na nośnik lipidowy (18). Dane te wskazują, że aktywność glikozylotransferazy związana ściśle z Cps14E może być odpowiedzialna za pierwszy etap biosyntezy polisacharydu w przypadku serotypu 1, 2, 14 oraz 1/2 S. suis. Geny cps2F, cps2G, cps2H, cps2I i cps2J hybrydyzowały jedynie z chromosomalnym DNA pochodzącym z serotypu 2 i 1/2. Gen cps2G wykazywał dodatkowy słaby sygnał hybrydyzacyjny z DNA serotypu 34. W testach aglutynacji serotyp 1/2 wykazywał aglutynację z surowicą swoistą dla serotypu 2, jak również z surowicą swoistą dla serotypu 1. Sugeruje to, że serotyp 1/2 posiada wspólne determinanty antygenowe z obydwoma typami, 1 i 2. Dane z hybrydyzacji potwierdzają to spostrzeżenie. Wszystkie przypuszczalne glikozylotransferazy, obecne w serotypie 2, występują również w serotypie 1/2. Gen cps2K dawał podobny wzór hybrydyzacyjny jak gen cps2E. Hybrydyzację obserwowano w przypadku DNA pochodzącego z serotypu 1, 2, 14 oraz 1/2. Łącznie te dane z hybrydyzacji pokazują, że zgrupowanie genów cps2 można podzielić na trzy regiony: region centralny, zawierający geny specyficzne dla danego typu jest oflankowany przez dwa regiony zawierające geny wspólne dla różnych serotypów.

Klonowanie specyficznych dla typu genów cps z serotypu 1 oraz 9.

W celu klonowania specyficznych dla typu genów cps z S. suis serotypu 1 zastosowano gen cps2E jako sondę do identyfikacji fragmentów chromosomalnego DNA typu 1, zawierających flankujące geny cps zidentyfikowano fragment EcoRV o długości 5 kz i sklonowano go w pKUN19. Otrzymano w ten sposób pCPSl-1 (figura 1B). Fragment ten został z kolei uż yty jako sonda do identyfikacji zachodzącego fragmentu Hindlll o długości 2.2 kz. pKUN19 zawierający taki fragment Hindlll oznaczono jako pCPSl-2. Taką samą strategię zastosowano do identyfikacji i klonowania specyficznych dla danego typu genów cps z serotypu 9. W tym przypadku, zastosowano jako sondę gen cps2D. Zidentyfikowano fragment HindIII-XbaI o długości 0,8 kz i sklonowano go, otrzymując pCPS9-l (fig. 1C). Fragment ten został z kolei użyty jako sonda do identyfikacji fragmentu Xbal o długości 4 kpz. pKUN19 zawierający taki fragment Xbal o długości 4 kz oznaczono jako pCPS9-2.

Analiza sklonowanych genów cpsl.

Określono pełną sekwencję nukleotydową wstawek zawartych w pCPSl-1 oraz w pCPSl-2 (fig. 5). Analiza sekwencji wykazała obecność pięciu całkowitych i dwóch niekompletnych Orf (fig. 1B). Każda z tych Orf poprzedzona był a przez miejsce wiążące rybosom. Na podstawie danych uzyskanych z analizy genów cps2 serotypu 2, stwierdzono, ż e większość Orf leż y bardzo blisko siebie. Jedyna znacząca przerwa (718 pz) występuje pomiędzy CpslG a CpslH. W regionie tym nie stwierdzono występowania żadnej oczywistej sekwencji promotorowej lub potencjalnych struktur spinki do włosów. Sugeruje to, że, podobnie jak w przypadku serotypu 2, geny cps serotypu 1 zorganizowane są w postaci operonu.

Podsumowanie danych na temat Orf i ich właściwości przedstawia tabela 2. Jak można było oczekiwać na podstawie danych hybrydyzacyjnych (tabela 4), białko kodowane przez gen cpslE było spokrewnione z Cps2E S. suis typu 2 (86% identyczności). Fragment sklonowany w pCP31-l nie posiadał regionu kodującego dla pierwszych 7 aminokwasów genu cpslE.

Białko kodowane przez geny cpslF i gen cpslG wykazywało silne podobieństwo do białek, odpowiednio, Cps14F i Cps14G z serotypu 14 Streptococcus pneumoniae (20). Funkcja białka Cps14F nie jest całkowicie jasna, ale przypuszcza się, że białko to może wzmacniać aktywność glikozylotransferazową. Wykazano, że pochodzący z S. pneumoniae gen cpsl4G koduje aktywność e-1,4-galaktozylotransferazową.

PL 204 863 B1

W przypadku S. pneumoniae typu 14 aktywność ta wymagana jest dla przebiegu drugiego etapu biosyntezy podjednostki oligosacharydu (20). W oparciu o dane dotyczące podobieństwa, przypisuje się podobne glikozylotransferazowe i wzmacniające aktywności genom cpsGl oraz cpslF pochodzącym z typu 1 S. suis.

Białko kodowane przez gen cpslH wykazywało podobieństwo do białka Cps14H z S. pneumoniae (20). Na podstawie podobieństwa sekwencji Cps14H zaproponowano jako polimerazę polisacharydową (20).

Białko kodowane przez gen cpsll wykazywało pewne podobieństwo do białka Cps14J z S. pneumoniae (19). Wykazano, że gen cpsl4J koduje aktywność e-1,4-galaktozylotransferazową, odpowiedzialną za dodanie czwartej (tj. ostatniej) reszty cukrowej podczas syntezy polisacharydu, S. pneumoniae serotypu 14.

Pomiędzy CpslG a CpslH znaleziono przerwę o długości 718 pz. Region ten zawierał trzy małe Orf. Trzy Orf ulegały ekspresji w trzech różnych ramkach odczytu i nie były poprzedzone przez potencjalne miejsce wiązania rybosomu, nie zawierały też potencjalnych miejsc startu. Jednakże, trzy potencjalne produkty genu kodowane przez ten region wykazywały pewne podobieństwo do trzech kolejnych regionów C-końcowego fragmentu białka EpsK Streptococcus thermophilus (27% identyczności, 40). Brak było regionu spokrewnionego z pierwszymi 82 aminokwasami.

Analiza sklonowanych genów cps9

Ustalono również pełną sekwencję nukleotydową wstawek z pCPS9-l i pCP39-2 (fig. 6). Analiza sekwencji ujawniła obecność trzech pełnych i dwóch niekompletnych Orf (fig. 1C). Podobnie jak w przypadku serotypu 1 i 2, wszystkie Orf poprzedzone były miejscem wiązania rybosomu i były ściśle ze sobą powiązane. Jak wynika z danych hybrydyzacyjnych (tabela 4), białka Cps2D i Cps9D wykazywały wysokie pokrewieństwo (tabela 2). Analiza porównawcza sekwencji pCPS9-l wykazała brak pierwszych 27 aminokwasów białka Cps9D.

Białko kodowane przez gen cps9E wykazywało pewne podobieństwo do białka CapD Staphylococcus aureus serotypu 1 (24). W oparciu o podobieństwo sekwencji białko CAplD uznano za epimerazę lub dehydratazę uczestniczącą w syntezie N-acetylofruktozoaminy lub N-acetylogalaktozoaminy (63).

Cps9F wykazywało pewne podobieństwo do białek CapM S. aureus serotypu 5 i 8 (61, 64, 65). W oparciu o podobieństwo sekwencji białka Cap5M i Cap8M uznano za glikozylotransferazy (63).

Białko kodowane przez gen cps9G wykazywało pewne podobieństwo do białka Actinobacillus actinomycetemcomitans (AB0026684). Białko to jest częścią zgrupowania genów odpowiedzialnych za swoiste dla serotypu b antygeny Actinobacillus actinomycetemcomitans. Funkcja tego białka jest nieznana.

Białko kodowane przez gen cpsSH wykazywało pewne podobieństwo do białka kodowanego przez gen rfbB Yersinia antarolitica (68). Białko Rfb3 jest istotne dla przebiegu syntezy antygenu 0, jednakże funkcja tego białka w syntezie 0:3 lipopolisacharydu jest nieznana.

Geny cps specyficzne dla serotypu 1 i serotypu 9

W celu określenia czy sklonowane fragmenty w pCPSl-1, pCPSl-2, pCPS9-1 i pCPS9-2 zawierają geny swoiste dla serotypu, odpowiednio, 1 oraz 9, wykonano eksperymenty hybrydyzacji krzyżowej. Fragmenty DNA poszczególnych genów cpsl i cps9 amplifikowano poprzez reakcję PCR, znakowano za pomocą 32P, a następnie stosowano jako sondę wobec filtrów przygotowanych metodą Southerna z chromosomalnym DNA szczepów referencyjnych - 35 różnych serotypów S. suis. Wyniki przedstawiono w tabeli 5. W oparciu o uzyskane przy użyciu sondy cps2E (tabela 4), spodziewano się, że sonda cpslE będzie hybrydyzować z chromosomalnym DNA z serotypu 1, 2, 14, 27 oraz 1/2 S. suis. Sondy cpslH, cps9E i cps9F hybrydyzowały z większością innych serotypów. Jednakże, sondy cpslF, cpslG oraz cpsll hybrydyzowały jedynie z chromosomalnym DNA serotypu 1 i 14. Sondy cps9G i cps9H hybrydyzowały wyłącznie z serotypem 9. Dane te sugerują, że sondy cps9G i cps9H są swoiste dla serotypu 9 a zatem mogłyby być przydatne w szybkich i czułych testach diagnostycznych dla infekcji S. suis typu 9.

PCR specyficzny dla typu

Dotychczas sondy testowano jedynie na 35 różnych szczepach referencyjnych. W celu zbadania wartości diagnostycznej sond cps specyficznych dla typu, wykorzystano kilka innych szczepów S. suis serotypu 1, 2, 1/2, 9 i 14. Ponadto, ponieważ metody oparte o reakcję PCR mogą być szybsze i bardziej czułe niż testy hybrydyzacyjne, podjęto próbę sprawdzenia czy do serotypowania szczepów S. suis można zastosować PCR. W tym celu wybrano serię oligonukleotydowych starterów w obrębie genów cps2J, cpsll i cps9H. Dokonano amplifikacji fragmentów o długości, odpowiednio, 675 pz, 330 pz i 390 pz. Otrzymane wyniki wykazały, że fragmenty 675 pz amplifikowano w przypadku szczepów typu 2 i 1/2, stosując startery cps2J; fragmenty 380 pz amplifikowano w przypadku szczepów typu 1

PL 204 863 B1 i 14, stosując startery cpsll, a fragmenty 390 pz amplifikowano w przypadku szczepów typu 9, stosując startery cps9H.

Otrzymywanie mutantów z zaburzoną produkcją otoczki W celu określenia roli, jaką pełni otoczka S. suis w procesie patogenezy, otrzymano dwa izogeniczne mutanty z zaburzoną produkcją otoczki. W celu uzyskania mutanta 10cpsB zastosowano pCPSll. W plazmidzie tym zastąpiono część genu cps2B genem oporności na spektynomycynę. W celu uzyskania zmutowanego szczepu 10cpsEF zastosowano pCPS28. W pCPS28 koniec 3' genu cps2E, a także koniec 5' genu cps2F, zastąpiono genem oporności na spektynomycynę. pCPSll i pCPS28 zastosowano do elektrotransformacji szczepu 10 S. suis typu 2, a następnie dokonano selekcji na spektynomycynę kolonii opornych. W celu wybrania spośród zdarzeń integracji tych, w których zaszła podwójna rekombinacja, przeprowadzono eksperymenty techniką Southerna i hybrydyzacji (wyniki nieprzedstawione). W celu stwierdzenia czy struktura otoczki szczepów 10cpsB i 10cpsEF została zaburzona wykonano test aglutynacji szkiełkowej, wykorzystując zawiesinę zmutowanych szczepów w hiperodpornościowej surowicy anty-S. suis typu 2 (44). Wyniki pokazały, że, nawet w nieobecności swoistej dla danego serotypu antysurowicy, bakterie ulegały aglutynacji. Świadczy to o tym, że w zmutowanych szczepach struktura otoczki jest zaburzona. Dla potwierdzenia cienkie skrawki pobrano z szczepów typu dzikiego oraz mutantów i porównywano za pomocą mikroskopu elektronowego. Uzyskane wyniki wskazują, że, w porównaniu do typu dzikiego (fig. 3A), ilość otoczki wytwarzanej przez zmutowane szczepy była znacznie zmniejszona (fig. 33 i 3C). Nie wykryto prawie żadnego materiału otoczki na powierzchni szczepów zmutowanych.

Mutanty otoczkowe są wrażliwe na fagocytozę i zabijanie przez świńskie makrofagi pęcherzykowe (PAM)

Mutanty otoczkowe testowano pod kątem oporności na fagocytozę przez PAM, w obecności świńskiej surowicy SPF. W tych warunkach dziki szczep typu 10 okazał się oporny na fagocytozę (fig. 4A). W przeciwieństwie do tego, szczepy zmutowane były skutecznie pochłonięte przez makrofagi (fig. 4A). Po upływie 90 minut ponad 99,7% (szczep 10cpsB) i 99,8% (szczep 10cpsEF) zmutowanych komórek uległo pochłonięciu przez makrofagi. Ponadto, jak przedstawiono na figurze 43, pochłonięte szczepy były skutecznie zabijane przez makrofagi. 90-98% wszystkich pochłoniętych komórek zostało zabitych w ciągu 90 minut. Nie zaobserwowano żadnych różnic pomiędzy szczepami dzikiego typu i mutantów. Dane te wskazują na to, że otoczka S. suis typu 2 skutecznie chroni organizm przed pobraniem przez makrofaga in vitro.

Mutanty otoczkowe są mniej zjadliwe dla prosiąt wolnych od bakterii.

Testowano zjadliwość szczepów typu dzikiego i zmutowanych po eksperymentalnym zakażeniu nowonarodzonych, wolnych od zarazków świń (45, 49). Tabela 1 pokazuje, że u wszystkich świń zakażonych szczepem typu dzikiego można było zaobserwować specyficzne i niespecyficzne objawy zakażenia. Ponadto, wszystkie świnie zakażone szczepem typu dzikiego zdechły w trakcie przebiegu eksperymentu lub były uśmiercane ze względu na liczne choroby lub zaburzenia nerwowe (tabela 3). W przeciwieństwie do tego świnie zakażone szczepami 10cpsB i 10cpsEF nie wykazywały specyficznych objawów chorobowych i wszystkie przeżyły do końca eksperymentu. Temperatura świń zakażonych szczepem typu dzikiego wzrosła 2 dni po zakażeniu i pozostawała wysoka aż do 5 dnia (tabela 3). Temperatura świń zakażonych szczepami zmutowanymi czasami przekraczała 40°C, jednakże obserwowano znaczne różnice w wielkości wskaźnika gorączki [tj. % występowania gorączki (>40°C) w obrębie grupy eksperymentalnej] mi ę dzy ś winiami zakaż onymi szczepem typu dzikiego a ś winiami zakażonymi szczepami zmutowanymi. U wszystkich świń zaobserwowano podwyższony poziom leukocytów polimorfojądrzastych (PML ang. Polymorphonuclear leucocytes) (>10 x 10⁹ PML na litr) (tabela 3). Jednakże, u świń zakażonych szczepami zmutowanymi procent próbek z podwyższonym poziomem PML był znacznie niższy. Możliwe było wyizolowanie szczepów S. suis oraz B. bronchiseptica z gardzieli i z próbek wymazów kał u u wszystkich ś wiń , od i dnia po infekcji aż do ostatniego dnia eksperymentu (tabela 3). Pośmiertnie, izolowano szczep typu dzikiego z centralnego układu nerwowego (CNS), nerek, serca, wątroby, śledziony, surowicówki, stawów oraz migdałków. Zmutowane szczepy łatwo było wyizolować z migdałków, lecz nigdy nie uzyskano ich z nerek, wątroby czy śledziony. Co interesujące niewielką liczbę szczepów zmutowanych izolowano z CNS, surowicówki, stawów, płuc i serca. Podsumowując, dane te jasno wskazują , że zmutowane szczepy S. suis z zaburzonym wytwarzaniem otoczki nie są zjadliwe względem młodych, wolnych od zarazków świń.

Opisano tu identyfikację i charakteryzację molekularną locus cps, uczestniczącego w biosyntezę polisacharydu otoczki S. suis. Większość genów wydaje się należeć do pojedynczej jednostki transkrypcyjnej, co sugeruje skoordynowaną kontrolę tych genów. Większości produktów genowych przypisaliśmy funkcję. Zidentyfikowaliśmy regiony uczestniczące w regulacji (Cps2A), określaniu długości łańcucha

PL 204 863 B1 (Cps2B, C), eksporcie (Cps2C) oraz biosyntezie (Cps2E, F, G, H, J, K). Region odpowiedzialny za biosyntezę znajduje się centralnie w zgrupowaniu genów i jest oflankowany przez dwa regiony zawierające geny o bardziej ogólnych funkcjach. Niekompletny gen orf2Z znajdował się końcu 5' sklonowanego fragmentu. Orf2Z wykazywała pewne podobieństwo do białka YitS z B. subtilis. Jednakże, ponieważ funkcja białka YitS jest nieznana, wyniki te nie dostarczyły informacji o możliwej funkcji Orf2Z. Ponieważ gen orf2Z nie stanowi części operonu cps, nie przypuszcza się by pełnił on rolę w biosyntezie polisacharydu. Białko Orf2Y wykazywało pewne podobieństwo do białka YcxD z B. subtilis (53). Uważa się, że białko YcxD jest białkiem regulatorowym. Podobnie, Orf2Y może uczestniczyć w procesie regulacji biosyntezy polisacharydu. Białko Orf2X wykazywało podobieństwo do białek YAAA z H. influenzae i E. coli. Funkcja tych białek jest nieznana. W przypadku S. suis typu 2 gen orf2X jest pierwszym genem w operonie cps2. Sugeruje to udział Orf2X w biosyntezie polisacharydu. Jednakże, u H. influenzae i E. coli biał ka te nie są zwią zane ze zgrupowaniem genów otoczki. Analiza izogenicznych mutantów o zaburzonej ekspresji Orf2X powinna dostarczyć więcej informacji na temat roli Orf2X w procesie biosyntezy polisacharydu u S. suis typu 2.

Produkty genowe kodowane przez geny cps2E, cps2F, cps2G, cps2E, cps2J oraz cps2K wykazywały małe podobieństwo do glikozylotransferaz z kilku bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych (18, 19, 20, 22, 25). Produkt genu cps2E wykazywał pewne podobieństwo do białka Cps14E z S. pneumoniae (18, 19). Cps14E to transferaza glukozylo-1-fosforanu, przyłączająca glukozę do nośnika lipidowego (18). U S. pneumoniae jest to pierwszy etap biosyntezy powtarzających się jednostek oligosacharydu. Struktura otoczki S. suis serotypu 2 zawiera glukozę, galaktozę, ramnozę, N-acetyloglukozoaminę oraz kwas sialowy w stosunku 3:1:1:1:1 (7). W oparciu o te dane wyciągnięto wniosek, że Cps2E S. suis ma aktywność glukozylotransferazy i uczestniczy w przyłączaniu pierwszego cukru do nośnika lipidowego.

C-końcowy region produktu genu cps2F wykazywał pewne podobieństwo do RfbU z Salmonella enteritica. RfbU posiada aktywność mannozylotransferazową (24). Ze względu na to, że mannozyl nie jest składnikiem polisacharydu u S. suis typu 2, w organizmie tym nie oczekuje się aktywności mannozylotransferazowej. Mimo tego, cps2F koduje aktywność glikozylotransferazową, specyficzną względem innej reszty cukrowej.

Cps2G wykazywał umiarkowane podobieństwo do rodziny produktów genów kodujących jak się sugeruje aktywności galaktozylotransferazowe (22, 24, 40). Na tej podstawie wykazano podobną aktywność dla Cps2G.

Cps2H wykazywał pewne podobieństwo do LgtD z H. influenzae (U32768). Ponieważ LgtD przypisuje się aktywność glikozylotransferazową, uznano, że Cps2H wykazuje podobną aktywność.

Cps2J oraz Cps2K wykazywały podobieństwo do Cpsl4J S. pneumoniae (20). Cps2J wykazywał również podobieństwo do Cps14I S. pneumoniae. Wykazano, że Cpsl4I ma aktywność N-acetyloglukozoaminylotransferazową, natomiast Cps14J ma aktywność e-1,4-galaktozylotransferazową (20). Cps14I u S. pneumoniae odpowiedzialny jest za dodanie trzeciej reszty cukrowej, natomiast Cps14J za dodanie ostatniej reszty cukrowej podczas syntezy powtarzających się jednostek typu 14 (20). Ze względu na to, że otoczka u S. suis typu 2 zawiera w swym składzie zarówno galaktozę, jak i N-acetyloglukozoaminę, produktom genów cps2J i cps2K przypisano aktywności, odpowiednio, galaktozylotransferazową i N-acetyloglukoaminylotransferazową. Podobnie jak w przypadku Cps14I i Cps14J, N-końcowe fragmenty Cps2J i Cps2K wykazywały znaczny stopień podobieństwa sekwencji. W obrębie N-końcowych domen Cps14I i Cps14J zidentyfikowano dwa małe regiony, występujące również w kilku innych glikozylotransferazach (22). Zaproponowano, że w obrębie tych dwóch regionów, istotne dla katalitycznej aktywności są dwie reszty Asp. Również w Cps2J i Cps2K znaleziono dwa konserwowane regiony, DXS i DXDD.

Funkcja Cps2I pozostaje niejasna. Cps2l wykazywał pewne podobieństwo do białka z A. actinomycatemcomitans. Mimo że białko to kodowane jest przez część zgrupowania genów odpowiedzialnych za specyficzne dla serotypu B antygeny, funkcja białka pozostaje nieznana.

Dalej opisano tu identyfikację i charakteryzację genów cps specyficznych dla serotypów 1, 2 i 9 S. suis. Po sklonowaniu i scharakteryzowaniu całego locus cps2 S. suis serotypu 2 przypisano funkcje większości produktów genu cps2 na podstawie homologii sekwencji. Na podstawie tych wyników można było zlokalizować w centrum operonu, aktywności glukozylotransferazowe wymagane do specyficzności dla danego typu. Dane te zostały potwierdzone przez eksperymenty hybrydyzacji krzyżowej, w których zastosowano poszczególne geny cps2 jako sondy względem chromosomalnego DNA, pochodzącego z 35 różnych serotypów. Regiony zawierające geny specyficzne dla serotypu 1 i 9

PL 204 863 B1 można było sklonować i scharakteryzować, wykazując istnienie identycznej organizacji genetycznej operonów cps u innych serotypów S. suis. Geny cpslE, cpslF, cpslG, cpslH i cpsll wykazują silne podobieństwo do genów cps14E, cps14F, cps14G, cps14H i cps14J z S. pnaumoniae. Interesujący jest fakt, że serotyp 14 S. pnaumoniae jest najpowszechniejszym serotypem związanym z infekcjami pneumokokowymi u małych dzieci (54), podczas gdy szczepy serotypu 1 S. suis są najczęściej izolowane ze świń w wieku poniżej 8 tygodni (46). U S. pneumoniae geny cps14E, cps14G, cps14I i cps14J kodują glikozylotransferazy wymagane do syntezy tetramerycznej, powtarzającej się jednostki typu 14, co wskazuje, że geny cpslE, cpslG i cpsll są odpowiedzialne za wytwarzanie glikozylotransferaz. Możliwe jest określenie dokładnej funkcji tych genów, jak i specyficzności substratowej enzymów. Wykazano, że u S. pneumoniae gen cps14E koduje transferazę glukozylo-1-fosforanu, katalizującą przeniesienie glukozy na nośnik lipidowy. Ponadto, geny podobne do cpsE znaleziono u S. pneumoniae serotypu 9N, 13, 14, 153, 15C, 18F, 18A i 19F (60). Otrzymano mutanty cpsE dla serotypu 9N, 13, 14 i 153. Wszystkie zmutowane szczepy nie posiadały aktywności glukozylotransferazowej (60). Ponadto, u tych wszystkich serotypów S. pneumoniae gen cpsE był odpowiedzialny za dodanie glukozy do nośnika lipidowego. W oparciu o te dane proponujemy podobną funkcję dla genu cpslE z S. suis typu 1. Struktura otoczki S. suis typu 1 nie jest znana, jednakże wiadomo, że składa się z glukozy, galaktozy, N-acetyloglukozaminy oraz kwasu sialowego w stosunku 1: 2,4: 1 : 1: 1,4 (5). Zatem, można przewidzieć rolę cpsE-podobnej aktywności glukozylotransferazowej. Sekwencje cpsE-podobne zidentyfikowano również w przypadku serotypu 2, 1/2 i 14.

Podczas biosyntezy polisacharydu u S. pneumoniae typu 14 następuje przeniesienie drugiej reszty cukrowej powtarzającej się jednostki na pierwszą, związaną z nośnikiem lipidowym resztę cukrową w wyniku działania produktów genów cps14F oraz cps14G (20). Podobnie jak w przypadku Cps14F i Cps14G, białka CpslF i CpslG z S. suis typu 1 mogą posiadać aktywność glikozylotransferazową, katalizując taką samą reakcję. Cps14F i Cps14G z S. pneumonias wykazują podobieństwo odpowiednio do N-końcowej połowy i C-końcowej połowy białka SpsK z Sphingomonas (20, 67). Wskazuje to na łączną funkcję obu białek. Ponadto, u kilku serotypów S. pneumoniae znaleziono sekwencje cps14F i cps14G-podobne i stwierdzono, że geny te zawsze występują razem (60). To samo zauważono w przypadku S. suis typu 1. Sondy cpslF i cpslG hybrydyzowały ze szczepami typu 1 i 14.

Na podstawie podobieństwa występującego pomiędzy genem cpslH a genem cps14H z S. pneumoniae (20), można się spodziewać, że cpslH koduje polimerazę polisacharydową.

Białko kodowane przez gen cpsll wykazywało pewne podobieństwo do białka Cps14J z S. pneumoniae (19). Wykazano, że gen cpsl4J koduje aktywność e-1,4-galaktozylotransferazową, odpowiedzialną za dodanie czwartej (tj. ostatniej) reszty cukrowej podczas syntezy polisacharydu u S. pneumoniae serotypu

14. W przypadku S.suis typu 2 białka kodowane przez geny cps2J i cps2K wykazywały podobieństwo do białek Cps14J. Jednakże, nie znaleziono żadnej znaczącej homologii pomiędzy Cps2J, Cps2K i Cpsll. W N-końcowych regionach Cps14J i Cps14I zidentyfikowano dwa małe, konserwowane regiony, DXS oraz DXDD (19). Regiony wydają się istotne dla aktywności katalitycznej (13). W takich samych pozycjach w sekwencji Cps2I znajdują się regiony DXS i DXED.

W regionie pomiędzy CpslG a CpslH zidentyfikowano trzy małe Orf. Ze względu na to, że orf ulegały ekspresji w trzech różnych ramkach odczytu i nie zawierały potencjalnych miejsc startu, nie spodziewano się ich ekspresji. Jednakże, trzy potencjalne produkty genów kodowane przez ten region wykazywały pewne podobieństwo do trzech kolejnych regionów C-końcowej części białka EpsK, z Streptococcus thermophilus (27% identyczności, 40). Brak było regionu związanego z pierwszymi 82 aminokwasami. Zasugerowano, że białko EpsK pełni rolę w eksporcie egzopolisacharydu poprzez zapewnienie dzięki modyfikacjom lipidowym bardziej hydrofobowego charakteru polimeryzowanego egzopolisacharydu. Dane te mogłyby sugerować, że sekwencje w regionie pomiędzy Cps1G a Cps1H pochodzą z sekwencji epsK-podobnej. Eksperymenty hybrydyzacyjne wykazały, że ten epsK-podobny region jest również obecny u innych szczepów serotypu 1, jak i u szczepów serotypu 14 (wyniki nieprzedstawione).

Możliwe jest określenie funkcji większości sklonowanych genów serotypu 9. Na podstawie podobieństwa sekwencji zaproponowano geny cps9E i cps9F jako kodujące glikozylotransferazy (61, 24, 63, 64, 65). Ponadto, geny cps9G i cps9H wykazywały podobieństwo do genów zlokalizowanych w obrębie regionów uczestniczących w biosyntezie polisacharydu, jednakże funkcja tych genów jest nieznana (68).

Eksperymenty hybrydyzacji krzyżowej, w których zastosowano poszczególne geny cps2, cpsl oraz cps9 jako sondy wykazały, że sondy cps9G i cps9H hybrydyzowały specyficznie ze szczepami

PL 204 863 B1 serotypu 9. Zatem, są one użyteczne jako narzędzia do identyfikacji szczepów S. suis typu 9, zarówno w celach diagnostycznych, jak i badaniach epidemiologicznych transmisji. Opracowaliś my uprzednio metodę PGR, którą można zastosować do wykrywania szczepów S. suis obecnych w wymazach z nosa i migdałków świń (62). Metoda została zastosowana, na przykład, do identyfikacji patogennych (EF-dodatnich) szczepów S. suis serotypu 2. W ciągu ostatnich lat, obok szczepów S. suis serotypu 2, izolowano często z organów chorujących świń szczepy serotypu 9. Jednakże, dotychczas nie był dostępny szybki i czuły test diagnostyczny dla szczepów typu 9. Zatem, sondy specyficzne dla typu 9 lub specyficzna dla typu 9 reakcja PCR posiada wysoką wartość diagnostyczną. Sondy cpslF, cpslG oraz cpsll hybrydyzowały ze szczepami serotypu 1, podobnie jak serotypu 14. W testach koaglutynacji szczepy typu 1 reagowały z antysurowicą anty-typ 1, jak również z antysurowicą z anty-typ 14 (56). Wskazuje to na obecność wspólnych epitopów dla tych serotypów. Z drugiej strony, szczepy typu 1 ulegały aglutynacji tylko z surowicą anty-typ 1 (56, 57), co wskazuje, że możliwe jest wykrycie różnic pomiędzy tymi serotypami.

Sondy cps2F, cps2G, cps2H, cps2l i cps2J hybrydyzowały jedynie z serotypem 2 oraz 1/2. Serotyp 34 dawał słaby sygnał hybrydyzacyjny w reakcji z sondą cps2G. Jak wykazano w testach aglutynacji, szczepy typu 1/2 reagują z surowicą skierowaną przeciwko szczepom typu 2 (46). Zatem, typ 1/2 posiada wspólne antygeny zarówno z typem 1, jak i typem 2. Na podstawie wzoru hybrydyzacji dla szczepów serotypu 1/2 ze specyficznymi genami cpsl i cps2 stwierdzono, że serotyp 1/2 jest ściślej związany ze szczepami typu 2, niż ze szczepami typu 1. W naszych obecnych badaniach identyfikujemy specyficzne dla typu geny, startery lub sondy, które stosuje się do rozróżnienia serotypów 1, 14 i 1/2, a także innych, spośród poznanych dotychczas 35 serotypów. Ponadto, można teraz łatwo uzyskać specyficzne dla typu geny, startery lub sondy dla nowo wyizolowanych, jeszcze nieznanych serotypów.

Klonowanie i charakterystyka dalszej części locus cps2.

W oparciu o ustaloną sekwencję zidentyfikowano 11 genów, oznaczonych od cps2L do cps2T, orf2U i orf2V. Zidentyfikowano gen homologiczny do genów uczestniczących w procesie polimeryzacji powtarzającej się jednostki oligosacharydowej (cps20), jak również geny uczestniczące w syntezie kwasu sialowego (cps2P. do cps2T). Ponadto, doświadczenia hybrydyzacyjne wykazały obecność genów uczestniczących w syntezie kwasu sialowego w serotypie 1, 2, 14, 27 i 1/2 S. suis. Regiony „cps2M” i „cps2N” wykazywały podobieństwo do białek uczestniczących w biosyntezie polisacharydu u innych Gram-dodatnich bakterii. Jednakż e, wydaje się , ż e regiony te są skrócone lub niefunkcjonalne w wyniku przesunięcia ramki odczytu lub mutacji punktowych. Na końcu 3' locus cps2 znajdowały się dwa elementy insercyjne („orf2U” i „orf2V”), oba o charakterze niefunkcjonalnym.

W celu sklonowania pozostałej części locus cps2, zastosowano 3'-końcowe sekwencje pCPS26 do identyfikacji chromosomalnego fragmentu zawierającego sekwencje cps2 zlokalizowane jeszcze dalej poniżej. Fragment ten sklonowano w pKUN19, otrzymując pCPS29. Stosując podobne podejście, kolejno wyizolowano tu plazmidy pCPS30 oraz pCPS34, zawierające sekwencje cps2 leżące poniżej (fig. 1C).

Analiza operonu cps2

Określono pełną sekwencję nukleotydową sklonowanych fragmentów. Analiza złożonych sekwencji wykazała obecność: sekwencji kodującej C-końcową część Cps2K, sześciu, w sposób oczywisty, funkcjonalnych genów (oznaczonych cps2 O-cps2T) oraz pozostałości 5 różnych starodawnych genów (oznaczonych „cps2L”, „cps2M”, „cps2N”, „orf2U” oraz „orf2V”). Te ostatnie geny wydały się skrócone lub niekompletne w wyniku obecności kodonów stop lub mutacji przesunięcia ramki odczytu (fig. 1A). W obrębie sekwencjonowanego regionu nie znaleziono ani potencjalnej sekwencji promotorowej, ani potencjalnych struktur „spinki do włosów”. Miejsce wiążące rybosom poprzedzało każdą ORF, a większość z ORF była ściśle sprzężona. Zidentyfikowano trzy międzygenowe przerwy: jedną pomiędzy „cps2M” a „cps2N” (176 nukleotydów), jedną pomiędzy cps20 a cps2p (525 nukleotydów) i jedną pomi ędzy cps2T a „orf2U” (200 nukleotydów). Dane te sugerują , ż e Orf2X i Cps2A-Orf2T stanowią część pojedynczego operonu.

Lista wszystkich locI i ich właściwości jest przedstawiona w tabeli 4. Region „cps2L” zawierał trzy potencjalne ORF, długości, odpowiednio, 103, 79 i 152 aminokwasów, rozdzielone od siebie jedynie kodonami „stop”. Jedynie pierwsza ORF była poprzedzona potencjalnym miejscem wiązania rybosomu i zawierała metioninowy kodon startu. Wskazuje to, że „cps2L” pochodzi ze starodawnego genu cps2L, kodującego białko długości 339 aminokwasów. Funkcja tego hipotetycznego białka Cps2L pozostaje niejasna: nie znaleziono żadnych znaczących homologii pomiędzy Cps2L a białkami obecnymi w dostępnych bibliotekach danych. Nie jest jasne, czy pierwsza ORF regionu „cps2L” ulega eks20

PL 204 863 B1 presji dając białko długości 103 aminokwasów. Region „cps2M” wykazywał homologię z N-końcowymi, 134 aminokwasami białek NeuA z Streptococcus agalactias i E.coli (AB017355, 32). Jednakże, mimo że region „cps2M” zawierał potencjalne miejsce wiązania rybosomu, nie posiadał metioninowego kodonu startu. Porównanie z sekwencją z S. agalactias pokazało, że kodon startu ATG został zastąpiony przez kodon kodujący lizynę AAG. Ponadto, region wykazujący homologię z sekwencją pierwszych 58 aminokwasów z NeuA S. agalactias (11% identyczności) był oddzielony od regionu homologicznego - aminokwasu 59-134 NeuA przez powtarzającą się sekwencję DNA długości 100 pz (patrz poniżej). Dodatkowo, region homologiczny do aminokwasów 59-95 NeuA (32% identyczności) i region homologiczny do aminokwasów 96-134 NeuA (50% identyczności) obecny był w różnych ramkach odczytu. Zatem, częściowy i skrócony homolog NeuA jest prawdopodobnie niefunkcjonalny u S. suis. Region „cps2N” wykazywał homologię z CpsJ, S. agalactias (nr dostępu AB017355). Jednakże, obserwowano brak homologii sekwencji z pierwszymi 88 aminokwasami białka CpsJ u S. suis. Ponadto, region homologiczny obecny był w dwóch różnych ramkach odczytu. Białko kodowane przez gen cps20 wykazywało homologię z białkami kilku paciorkowców, które uczestniczą w transporcie powtarzającej się jednostki oligosacharydu (nr dostępu AB017355), co sugeruje podobną funkcję białka Cps20. Białka kodowane przez geny cps2P, cps2S i cps2T wykazywały homologię z białkami NeuB, NeuD i NeuA z S. agalactias i E. coli (nr dostępu AB017355). Ze względu na to, że region „cps2M” również wykazywał homologię z NeuA z E. coli, locus cps2 z S. suis zawierał funkcjonalny gen neuA (cps2T), jak również niefunkcjonalny gen („cps2M”). Wzajemna homologia pomiędzy tymi dwoma regionami wykazywała 77% identyczności na poziomie aminokwasowym, w obrębie aminokwasów 1-58, i 49% identyczności dla aminokwasów 59134. Cps2Q i Cps2R wykazywały homologię z N-końcową i C-końcową częścią białka NeuC, odpowiednio, z S. agalactias i E. coli. Sugeruje to, że funkcję białka NeuC S. agalactias pełnią u S. suis dwa różne białka. W przypadku E. coli, wiadomo, że geny neu uczestniczą w syntezie kwasu sialowego. NeuNAc syntetyzowany jest z N-acetylomannozaminy i fosfoenolopirogronianu w wyniku działania syntetazy NeuNAc. Następnie, NeuNAc ulega zamianie do CMP-NeuNAc dzięki enzymowi, syntetazie CMP-NeuNAc. CMP-NeuNAc jest substratem w reakcji syntezy polisacharydu. U E. coli K1 białko NeuB jest syntetazą NeuNAc, natomiast NeuA posiada aktywność syntetazy CMP-NeuNAc. Sugeruje się udział NeuC w syntezie NeuNAc, jednakże jego rola nie została dokładnie określona. Dokładna rola NeuD nie jest znana. Rolę białek Cps2P-Cps2T w syntezie kwasu sialowego można łatwo dostrzec, ponieważ otoczka S. suis serotypu 2 jest bogata w reszty kwasu sialowego. U S. agalactias kwas sialowy jest krytycznym czynnikiem w funkcji zjadliwości otoczki typu III. Ponadto, zasugerowano, że obecność kwasu sialowego w otoczce bakterii mogących wywoływać zapalenie opon mózgowych, jest istotna dla zdolności tych bakterii do przełamywania bariery krew-mózg. Jednakże, dotychczas, związek kwasu sialowego ze zjadliwością pozostaje niejasny.

„Orf2U” i „Orf2V” wykazywały homologię do białek zlokalizowanych w obrębie dwóch różnych elementów insercyjnych. „Orf2U” jest homologiczny do IS1194 ze Straptococcus thermophilus, podczas gdy „Orf2V” wykazywał homologię z przypuszczalną transpozazą ze Straptococcus pneumoniae. Ostatnio stwierdzono, że ta przypuszczalna transpozazą związana jest z locus otoczki typu 2 S. pneumoniae. W porównaniu z oryginalnymi elementami insercyjnymi u S. thermophilus i S. pneumoniae, zarówno „Orf2U”, jak i „Orf2V” mają charakter niefunkcjonalny w wyniku mutacji przesunięcia ramki odczytu w obrębie ich regionów kodujących.

Uderzającą obserwacją była obecność sekwencji 100 pz (fig. 9), powtórzonej trzykrotnie w obrębie operonu cps2. Sekwencja jest wysoce konserwowana (między 94% a 98%) i występowała w międzygenowych obszarach, pomiędzy cps2G a cps2H, w obrębie „cps2M” i między cps20 a cps2P. Nie znaleziono żadnej znaczącej homologii między tą sekwencją prostego powtórzenia 100 pz a sekwencjami dostępnymi w znanych bibliotekach danych, co sugeruje, że sekwencja ta jest unikatowa dla S. suis.

Rozmieszczenie sekwencji cps2 w 35 serotypach S. suis.

W celu zbadania obecności genów kodujących kwas sialowy u innych serotypów S. suis wykonano eksperymenty hybrydyzacji krzyżowych. Amplifikowano fragmenty DNA poszczególnych genów cps2 za pomocą reakcji PGR, znakowano radioaktywnie 32P, a następnie poddano hybrydyzacji z chromosomalnym DNA, ze szczepów referencyjnych S. suis o 35 różnych serotypach. Jako kontrolę pozytywną zastosowano sondę specyficzną dla 16S RNA S. suis. Sonda 16S RNA hybrydyzowała z niemal równą intensywnością ze wszystkimi testowanymi serotypami (tabela 4). Sekwencja „cps2L” hybrydyzowała z DNA serotypu 1, 2, 14 i 1/2. Geny „cps2M”, cps20, cps2P, cps2Q, cps2R, cps2S i cps2T hybrydyzowały z DNA serotypu 1, 2, 14, 27 i 1/2. Ze względu na to, że geny cps2P-cps2T

PL 204 863 B1 uczestniczą prawdopodobnie w syntezie kwasu sialowego, uzyskane rezultaty sugerują, że kwas sialowy jest również składnikiem otoczki serotypu 1, 2, 14, 27 i 1/2 S. suis. Stanowi to potwierdzenie odkrycia, że serotypy 1, 2 i 1/2 posiadają otoczkę bogatą w reszty kwasu sialowego. Mimo że chemiczny skład otoczki serotypu 14 i 27 jest nieznany, przeprowadzone testy aglutynacji, wykorzystujące lektyny wiążące kwas sialowy, sugerują obecność kwasu sialowego u serotypu 14 S. suis, jednak nie w przypadku serotypu 27. W niniejszych badaniach również wykryto kwas sialowy u serotypu 15 i 16. Zatem, ostatnia obserwacja nie potwierdza danych uzyskanych z hybrydyzacji; możliwe jest, że za syntezę kwasu sialowego odpowiadają inne, nie homologiczne z cps2P-cps2T, geny, obecne u serotypu 15 i 16.

Sonda oparta na sekwencjach „cps2N” hybrydyzowała z DNA pochodzącym z serotypu 1, 2, 14 i 1/2. Sonda specyficzna dla „orf2U” hybrydyzowała z serotypami 1, 2, 7, 14, 24, 27, 32, 34 i 1/2, podczas gdy sonda specyficzna dla „orf2V” hybrydyzowała z wieloma różnymi serotypami. Ponadto, przygotowano sondę specyficzną względem sekwencji prostego powtórzenia 100 pz. Sonda ta ulegała hybrydyzacji z serotypami 1, 2, 13, 14, 22, 24, 27, 29, 32, 34 i 1/2 (tabela 4). W celu określenia liczby kopii sekwencji prostego powtórzenia w chromosomie S. suis serotypu 2 wykonano analizę i hybrydyzację metodą Southerna. W tym celu, chromosomalny DNA S. suis serotypu 2 poddano trawieniu za pomocą NcoI i hybrydyzowano z sekwencją prostego powtórzenia wyznakowaną 32P. Zidentyfikowano tylko jeden fragment hybrydyzacyjny, zawierający trzy proste powtórzenia, obecny w locus cps2 (wyniki nieprzedstawione). Wskazuje to, że sekwencja prostego powtórzenia 100 pz związana jest jedynie z locus cps2. U S. pneumoniae powtórzona sekwencja długości 115 pz związana jest z genem otoczki u serotypu 1, 3, 14 i 19F. W przypadku S. pneumoniae ta sekwencja 115 pz została znaleziona w sąsiedztwie innych genów, odpowiedzialnych za zjadliwość pneumokokową (geny hialuronidazy i neuraminidazy). Sekwencji 115 pz przypisuje się rolę regulacyjną w koordynowaniu kontroli tych związanych z wirulencją genów.

W celu zbadania roli otoczki w oporności na fagocytozę i w zjawisku wirulencji, przygotowano dwa izogeniczne mutanty z zaburzoną syntezą otoczki. W 10cpsB, gen cps2B został zniszczony poprzez wstawienie genu oporności na antybiotyk, podczas gdy w 10cpsEF, zastąpiono fragmenty genów cps2E i cps2F. Oba zmutowane szczepy okazały się całkowicie pozbawione otoczki. Ze względu na to, że geny cps2 stanowią część operonu, nie można było wykluczyć efektu polarności. Zatem dane te nie dostarczają jakiejkolwiek informacji na temat roli Cps2B, Cps2E czy Cps2F w biosyntezie polisacharydu. Jednakże, uzyskane wyniki pokazują jasno, że polisacharyd otoczki S. suis typu 2 *jest składnikiem powierzchniowym wykazującym aktywność antyfagocytową. Dziki typ bakterii, posiadający otoczkę jest in vitro pochłaniany w wyniku fagocytozy z bardzo niską częstością, podczas gdy zmutowane, pozbawione otoczki bakterie są skutecznie pochłaniane przez makrofagi świni. W ciągu dwóch godzin, ponad 99,6% zmutowanych bakterii było pochłaniane przez makrofagi, a ponad 92% tych bakterii było zabijane. Wewnątrzkomórkowe, dziki typ, jak i zmutowane szczepy, zabijane są z taką samą skutecznością. Wskazuje to, że utrata materiału otoczki związana jest utratą zdolności do oporności chroniącej przed pobraniem przez makrofagi. Taka utrata oporności na fagocytozę in vitro była powiązana z istotnym złagodzeniem zjadliwości u wolnych od zarazków świń. Wszystkie, świnie zarażone zmutowanymi szczepami przeżyły eksperyment i nie wykazywały żadnych specyficznych, klinicznych objawów choroby. Obserwowano jedynie pewne niespecyficzne objawy chorobowe. Ponadto, możliwe było wyizolowanie zmutowanych bakterii ze świń. Potwierdza to opinię, że, podobnie jak u innych patogennych paciorkowców, otoczka S. suis działa jako istotny czynnik zjadliwości. Mutanty transpozonowe, otrzymane przez Charland, charakteryzujące się osłabioną produkcją otoczki, wykazywały zmniejszoną zjadliwość u świń i myszy. W celu uzyskania takich mutantów wykorzystano szczep referencyjny typu 2 S735. Poprzednio pokazano, że szczep ten charakteryzuje się jedynie słabą zjadliwością wobec młodych świń. Ponadto, jak dotychczas, miejsce wstawienia transpozonu pozostaje nieznane.

Jako kolejny przykład opisano tu zastosowanie szybkiego testu PGR dla Streptococcus suis typu 7.

Ostatnie badania epidemiologiczne zakażeń Streptococcus suis u świń wskazują, że oprócz serotypów 1, 2 i 9, równie często serotyp 7, jest powiązany z chorobami u zwierząt. Jednakże, w przypadku tego ostatniego, obserwuje się brak szybkich i czułych metod diagnostycznych. Stanowi to przeszkodę dla programów zapobiegania i kontroli zachorowań. W niniejszym opisie przedstawiono specyficzny dla typu test PCR, pozwalający na szybkie i czułe wykrywanie serotypu 7 S. suis. Test opiera się na sekwencji DNA genów otoczki (cps), specyficznych dla serotypu 7. Sekwencje te ziden22

PL 204 863 B1 tyfikowano poprzez eksperymenty hybrydyzacji krzyżowych kilku pojedynczych genów cps z chromosomalnym DNA, pochodzącym z 35 różnych serotypów S. suis.

Streptococcus suis jest istotną przyczyną występowania zapalenia opon mózgowych, posocznicy, zapalenia stawów oraz nagłej śmierci u młodych świń [69, 70]. Jednakże, może także wywoływać zapalenie opon mózgowych u ludzi [71]. Próby kontrolowania tej choroby nie są skuteczne ze względu na brak wystarczającej wiedzy na temat epidemiologii choroby, jak również skutecznych szczepionek i czułych metod diagnostycznych.

Szczepy S. suis mogą być identyfikowane na podstawie ich morfologicznej, biochemicznej i serologicznej charakterystyki [70, 73, 74]. Klasyfikacja dokonywana za pomocą metod serologicznych opiera się na obecności specyficznych antygenowych determinant. Wyizolowane i scharakteryzowane pod względem biochemicznym komórki S. suis poddawane są testowi aglutynacji z zestawem swoistych surowic. Takie metody typowania są bardzo pracochłonne i czasochłonne i mogą być stosowane tylko względem wyizolowanych kolonii. Ponadto, stwierdzono możliwość występowania niespecyficznych reakcji krzyżowych pomiędzy różnymi typami S. suis [75, 76].

Dotychczas opisano 35 różnych serotypów [7, 78, 79]. Serotyp 2 S. suis jest najpowszechniej izolowanym typem w przypadkach zakażeń świń, obok serotypu 9 i 1. Jednakże, ostatnio często izolowano z chorujących świń również szczepy serotypu 7 [80, 81, 82]. Wskazuje to na rosnący problem infekcji szczepami serotypu 7 S. suis. Ponadto, potwierdzono za pomocą eksperymentalnych infekcji przeprowadzanych u młodych świń, zjadliwość szczepów serotypu 7 S. suis [83].

Ostatnio opracowano szybkie i czułe testy PCR, specyficzne dla serotypu 2 (i 1/2), 1 (i 14) oraz 9 [84]. Analizy te opierały się na locI cps serotypu 2, 1 i 9 5. suis [84, 85]. Jednakże, dotychczas brak szybkiego i czułego testu diagnostycznego, odpowiedniego dla serotypu 7 S. suis. Opisano tu, więc test PCR do szybkiego i czułego wykrywania szczepów S. suis serotypu 7. Test opiera się na sekwencjach DNA stanowiących część locus cps S. suis serotypu 7. W porównaniu z serotypowaniem za pomocą metod serologicznych, analiza PCR okazała się szybką, wiarygodną i czułą metodą. Zatem, test ten, w połączeniu z testami PCR, poprzednio opracowanymi dla serotypu 1, 2 i 9, pozwala niewątpliwie na uzyskanie szybszej i bardziej wiarygodnej diagnozy zakażenia szczepami S. suis i może ułatwić przeprowadzanie programów kontroli i leczenia.

Materiały i metody

Szczepy bakteryjne, warunki wzrostu i serotypowanie

Szczepy bakteryjne i plazmidy wykorzystane w niniejszych badaniach zawarte są w tabeli 7. Szczepy referencyjne S. suis otrzymano od M. Gottschalk, Kanada. Szczepy S. suis hodowano na bulionie Todd-Hewitt (kod CM189, Oxoid) i wysiewano na płytki zawierające krwisty agar Columbia (kod CM331, Oxoid), z dodatkiem 6% (obj./obj.) krwi końskiej. Szczepy E. coli hodowano w bulionie Luria [86] i na płytkach z bulionem Luria, zawierającym 1,5% (wag./obj.) agar. W razie potrzeby do podłoża na płytkach dodawano ampicylinę. Szczepy S. suis poddawano serotypowaniu, za pomocą szkiełkowego testu aglutynacji z udziałem przeciwciał swoistych dla danego typu [70].

Techniki DNA

Wykonano rutynowe działania wobec DNA oraz reakcje PCR, zgodnie z Sambrook i wsp. [88]. Przenoszenie na filtry i hybrydyzację przeprowadzono jak poprzednio opisano [84, 86].

Analiza sekwencji DNA

Sekwencje DNA określano za pomocą systemu do sekwencjonowania DNA 373A (Applied Biosystems, Warrington, GB) . Próbki przygotowywano za pomocą gotowego zestawu do sekwencjonowania cyklicznego ABI/PRISM dye terminator cycle sequencing ready reaction (Applied Biosystems). Robione na zamówienie startery do sekwencjonowania pochodziły z Life Technologies. Dane pochodzące z sekwencjonowania były składane i analizowane za pomocą programu McMollyTetra. Program BLAST zastosowano do poszukiwania sekwencji białkowych homologicznych do wydedukowanych sekwencji aminokwasowych.

PCR

Wykorzystane w reakcji cps7H PCR startery odpowiadały pozycjom 3334-3354 oraz 3535-3565 w locus cps7 S. suis.

Sekwencje były następujące: 5'-AGCTCTAACACGAAATAAGGC-3' i 5'-GTCAAACACCCTGGATAGCCG-3'. Mieszanina reakcyjna zawierała 10 mM Tris-HCl, pH 8,3; 1,5 mM MgCl2; 50 mM KCl; 0,2 mM każdego z czterech trój fosforanów deoksynukleotydów; 1 microM każdego ze starterów oraz 1 U polimerazy DNA AmpliTaQ Gold (Perkin Elmer Applied Biosystems, New Jersey). Amplifikacji DNA dokonano za pomocą termocyklera Perkin Elmer 9600 oraz programu obejmującego trwającą

PL 204 863 B1 minut inkubację w 95°C i 30 cykli 1 minutowych w 95°C, 2 minutową inkubację w 56°C oraz 2 minutową inkubację w 72°C.

Wyniki i dyskusja

Klonowanie genów cps specyficznych dla serotypu 7 W celu wyizolowania genów cps specyficznych dla serotypu 7 S. suis, wykorzystano gen cps9E serotypu 9 jako sondę do identyfikacji fragmentów chromosomalnego DNA typu 7, zawierających homologiczne sekwencje DNA [84].

Zidentyfikowano i sklonowano w pKUN19 fragment Pstl, długości 1,6 kb lub kpz. Tak otrzymano pCPS7-1 (figura 11C). Następnie fragment ten zastosowano jako sondę do identyfikacji zachodzącego fragmentu Scal-Clal, długości 2,7 kpz. pGEM7 zawierający ten fragment oznaczono jako pCPS7-2 (figura 11C).

Analiza sklonowanych genów cps7

Określono pełną sekwencję nukleotydową fragmentów wstawionych do pCPS7-1 oraz do pCP37-2. Analiza sekwencji cps7 wykazała obecność dwóch pełnych i dwóch niekompletnych otwartych ramek odczytu (ORF). (fig. 11C). Wszystkie ORF poprzedzone były miejscem wiążącym rybosom. Zgodnie z danymi uzyskanymi dla genów cpsl, cps2 i cps9 serotypu, odpowiednio, 1, 2 i 9, ORF typu 7 są ściśle sprzężone ze sobą. Jedyną, znaczącą przerwę wewnątrzgenową zidentyfikowano pomiędzy cpslE a cps7F (443 nukleotydy). W regionie tym nie znaleziono żadnej oczywistej sekwencji promotorowej ani potencjalnej struktury „spinki do włosów”. Wskazuje to, że, podobnie jak w przypadku serotypu 1, 2 i 9, geny cps serotypu 7 stanowią część operonu.

Przegląd operonów i ich właściwości zawarty jest w tabeli 8. Jak przypuszczano na podstawie danych hybrydyzacyjnych [84], białka Cps9e i Cps7E wykazują wysokie podobieństwo (99% identyczności, tabela 8). W oparciu o analizę porównawczą sekwencji Cps9E i Cps7E, stwierdzono brak w pCPS7-1 fragmentu Pstl, kodują cego pierwsze 371 kodonów Cps7E. C-końcowy fragment białka kodowanego przez gen cps7F wykazywał pewne podobieństwo do białka BplG, z Bordetella pertussis [88], podobnie jak do C-końcowego obszaru Cps2E z S. suis [85]. Zarówno BplG, jak i Cps2E, przypisuje się aktywność glikozylotransferazową i białka te uczestniczą, prawdopodobnie, w przyłączaniu pierwszej reszty cukrowej do nośnika lipidowego [85, 88]. Białko kodowane przez gen cps7G wykazywało podobieństwo do białka BlpF z Bordetella pertussis [88]. BlpF uczestniczy, prawdopodobnie, w biosyntezie amino-cukrów, co sugeruje podobną funkcję Cps7G. Biał ko kodowane przez gen cps7H wykazywało podobieństwo do białka WbdN, pochodzącego z E. coli [89], podobnie jak do N-końcowego obszaru białka Cps2K z S. suis [81]. Zarówno WbdN, jak i Cps2K, przypisuje się aktywność glikozylotransferazową [85, 89].

Geny specyficzne dla serotypu 7

W celu określenia czy sklonowane w pCPS7-1 i w pCPS7-2 fragmenty zawierają specyficzne dla serotypu 7 sekwencje DNA, przeprowadzono eksperymenty oparte na hybrydyzacji krzyżowej. Fragmenty DNA poszczególnych genów cps7 amplifikowano w wyniku reakcji PCR, znakowano za pomocą 32P i stosowano jako sondy do hybrydyzacji z chromosomalnym DNA, pochodzącym z referencyjnych szczepów 35 różnych serotypów S. suis.

Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli 9. Tak, jak oczekiwano w oparciu o dane uzyskane w wyniku zastosowania sondy cps9E [84], sonda cps7E hybrydyzowała z chromosomalnym DNA wielu różnych serotypów S. suis. Sondy cps7F i cps7G hybrydyzowały z chromosomalnym DNA serotypu 4, 5, 7, 17 oraz 23 S. suis. Jednakże, sonda cps7H hybrydyzowała jedynie z chromosomalnym DNA z serotypu 7, wskazują c, ż e gen ten jest specyficzny dla serotypu 7.

Reakcja PCR specyficzna dla typu

Testowano możliwość zastosowania PCR zamiast testów hybrydyzacyjnych, do typowania szczepów serotypu 7 S. suis. W tym celu, wybrano zestaw starterów oligonukleotydowych, w obrębie genu cps7H, za pomocą, których amplifikowano pożądany fragment długości 251 pz. Dodatkowo do analizy włączono kilka szczepów serotypu 7 S. suis, różnych od szczepów referencyjnych. Badane szczepy otrzymano z różnych krajów i izolowano z różnych narządów (tabela 7). Uzyskane wyniki pokazują, że rzeczywiście, amplifikowano fragment około 250 pz dla wszystkich wykorzystanych w doświadczeniu szczepów typu 7 (fig. 12B), natomiast nie uzyskano żadnego produktu PCR w przypadku użycia serotypu 1, 2 i 9 (fig. 12A). Wskazuje to, że test PCR, jak opisano tu, jest szybkim narzędziem diagnostycznym do identyfikacji szczepów serotypu 7 S. suis. Dotychczas tego typu test diagnostyczny nie był dostępny dla analizy szczepów serotypu 7. Wraz z ostatnio opracowanymi reakcjami PCR dla serotypu 1, 2, 1/2, 14 i 9, metoda ta może służyć jako ważne narzędzie diagnostyczne do wykrywania świń noszących szczepy serotypu 2, 1/2, 1, 14, 9 i 7 oraz może ułatwiać przeprowadzanie programów kontroli i leczenia.

PL 204 863 B1

T a b e l a 1. Szczepy bakterii i plazmidy.

Szczep/plazmid	Charakterystyka	Źródło/odnośnik
1	2	3
Szczep
E. coli
CC118	Phoa	(28)
XL2 blue	Stratagene
E.coli
XL2 blue	Stratagene
S. suis
10	szczep zjadliwy serotyp 2	(49)
3	serotyp 2	(63)
17	serotyp 2	(63)
735	szczep odnośnikowy serotyp 2	(63)
T15	serotyp 2	(63)
6555	szczep odnośnikowy serotyp 1	(63)
6388	serotyp 1	(63)
6290	serotyp 1	(63)
5637	serotyp 1	(63)
5673	serotyp 1/2	(63)
5679	serotyp 1/2	(63)
5928	serotyp 1/2	(63)
5934	serotyp 1/2	(63)
5209	szczep odnośnikowy serotyp 1/2	(63)
5218	szczep odnośnikowy serotyp 9	(63)
5973	serotyp 9	(63)
6437	serotyp 9	(63)
6207	serotyp 9	(63)
Szczepy odnośnikowe	serotypy 1-34	(9, 56, 14)
S. suis
10	szczep zjadliwy serotyp 2	(51)
10cpsB	izogenny mutant cpsB szczepu 10	ta praca
10cpsEF	izogenny mutant cpsEF szczepu 10	ta praca

PL 204 863 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
Plazmid
pKUN19	funkcje replikacyjne pUC, Amp^R	(23)
pGEM7Zf(+)	funkcje replikacyjne pUC, Amp^R	Promesa Copr.
pIC19R	funkcje replikacyjne pUC, Amp^R	(29)
pIC20R	funkcje replikacyjne pUC, Amp^R	(29)
pIC-spc	PIC19R zawierający gen spc^R z pDL282	kolekcja
pDL282	Funkcje replikacyjne pBR322 i pVT736-1, Amp^R, Spc^R	(43)
pPHOS2	pIC-spc zawierający skrócony gen phoA z pHO7 jako fragment PstI-BamHI	ta praca
pPHO7	Zawiera skrócony gen phoA	(15)
pPHOS7	pHOS2 zawierający chromosomalne DNA S.suis	ta praca
pCPS6	pKUN19 zawierający fragment Hindlll o długości 6 kpz z operonu cps	ta praca (fig. 1)
pCPS7	pKUN19 zawierający fragment EcoRIHindlll o długości 3,5 kpz z operonu cps	ta praca (fig. 1)
pCPS11	pCPS7 w którym fragment Pstl-Bamtil o długości 0,4 kpz z genu cpsB został zastąpiony genem Spc^R z pIC-spc	ta praca (fig. 1)
pCPS17	pKUN19 zawierający fragment Kpnl o długości 3,1 kpz z operonu cps	ta praca (fig. 1)
pCPS18	pKUN19 zawierający fragment SnaBl o długości 1,8 kpz z operonu cps	ta praca (fig. 1)
pCPS20	pKUN19 zawierający fragment XbaI-HindIII o długości 3,3 kpz z operonu cps	ta praca (fig. 1)
pCPS23	pGEM7Zf(+) zawierający fragment Mlul o długości 1,5 kpz z operonu cps	ta praca (fig. 1)
pCPS25	pIC20R zawierający fragment KpnI-Sall o długości 2,5 kpz z operonu cps	ta praca (fig. 1)
pCPS26	pKUN19 zawierający fragment Hindlll o długości 3,0 kpz z operonu cps	ta praca (fig. 1)
pCPS27	pCPS25 zawierający fragment Xbal(tępy)Clal o długości 2,3 kpz z pCPS20	ta praca (fig. 1)
pCPS28	pCPS27 zawierający gen PstI-Xhol Spc^R o długości 1,2 kpz z pIC-spc	ta praca (fig. 1)
pCPS29	pKUN19 zawierający fragment Sacl-Pstl o długości 2,2 kpz z operonu cps	ta praca (fig. 1)
pCPS1-1	pKUN19 zawierający fragment EcoRV o długości 5 kpz z operonu cps typu 1	ta praca (fig. 1)
pCPS1-2	pKUN19 zawierający fragment Hindlll o długości 2,2 kpz z operonu cps typu 1	ta praca (fig. 1)
pCPS9-1	pKUN19 zawierający fragment Hindlll-Xbal o długości 1 kpz z operonu cps serotypu 9	ta praca (fig. 1)
pCPS9-2	pKUN19 zawierający fragment Xbal-Xbal o długości 4,0 kpz z operonu cps serotypu 9	ta praca (fig. 1)

Amp^R: oporność na ampicylinę

PL 204 863 B1

Spc^R: oporność na spektynomycynę cps: polisacharyd otoczki

T a b e l a 2. Właściwości ORF w lotus cps z S. suis serotypu 2 i podobieństwa do produktów genowych innych bakterii

ORF	Pozycja nukleotydowa w sekwencji	liczba amino- kwasów	% GC	proponowana funkcja produktu genowego1	podobne produkty genowe (% identyczności)
Orf2Z	1-719	240	44	nieznana	B. subtilis YitS (26%)
Orf2Y	2079-822	419	38	regulacja transkrypcji	B. subtilis YcxD (39%)
Orf2X	2202-2934	244	39	nieznana	H. influenzae YAAA (24%)
Cps2A	3041-4484	481	39	regulacja	S. pneumoniae Cps19fA (58%)
Cps2B	4504-5191	229	40	określanie długości łańcucha	S. pneumoniae typ 3 Orfl (58%)
Cps2C	5203-5878	225	40	określanie długości łańcucha/eksport	S. pneumoniae Cps23fD (63%)
Cps2D	5919-6648	243	38	nieznana	S. pneumoniae CpsB (62%)
Cps2E	6675-8052	459	33	glikozylotransferaza	S. pneumoniae Cps14E (56%)
Cps2F	8089-9256	389	32	glikozylotransferaza	S. pneumoniae Cps23fT
Cps2G	9262-10417	385	36	glikozylotransferaza	S. thermophilus EpsF (25%)
Cps2H	10808-12176	457	31	glikozylotransferaza	S. mutans RGPEC,^N (29%)
Cps2I	12213-13443	410	29	polimeraza CP	S. pneumoniae Cpc23fl (48%)
Cps2J	13583-14579	332	29	g l i kozy l otra n sfe raza	S. pneumoniae Cps14J (31%)
Cps2K	14574-15576	334	37	glikozylotransferaza	S. pneumoniae Cps14J (40%)
„Cps2L”	15618-16635	103	37	nieznana	-
„Cps2M”	16811-17322	-	38	-	S. agalactiae CpsF^N (77%) E. coli NeuA, ^N (47%)
„Cps2N”	17559-18342	-	39	-	S. agalactiae CpsJ (43%)
Cps2O	18401-19802	476	40	przenośnik jednostek powtarzających się	S. agalactiae CpsK (41%)
Cps2P	20327-21341	338	39	synteza kwasu sialowego	S. agalactiae NeuB (80%) E. coli NeuB (59%)
Cps2Q	21355-21865	170	42	synteza kwasu sialowego	S. agalactiae NeuC^c (61%) E. coli NeuC^N (54%)
Cps2R	21933-22483	184	40	synteza kwasu sialowego	E. coli NeuD (32%)
Cps2S	22501-23125	208	42	synteza kwasu sialowego	S. agalactiae NeuC^Cc (55%) E. coli NeuC^Cc (40%)
Cps2T	23136-24366	395	40	synteza CPM-NeuNAc	S. agalactiae CpsF (49%) E. coli NeuA (34%)
„Orf2U” „Orf2V”	24566-25488	168	42	transpozaza	S. thermophilus IS1194 (51%) S. pneumoniae orfl (85%)

¹ Przewidywane na podstawie podobieństwa sekwencji ^N Podobieństwo odnosi się do N-końcowej części produktu genowego ^c Podobień stwo odnosi się do C-koń cowej części produktu genowego

ORF w „” są skrócone lub niefunkcjonujące w wyniku przesunięcia ramki lub mutacji punktowej

PL 204 863 B1

T a b e l a 3. Właściwości Orf genów cps z S. suis serotypu 1 i 9 i podobieństwa o produktów genowych innych bakterii

ORF	Pozycja nukleoty- dowa w sekwencji	c+c	liczba amino- kwa- sów	Prze- widy- wana masa cząst. (kDa)	Przewi- dywane pl	Proponowana funkcja produktu genowego	Podobne produkty genowe (% identyczności)	odnośnik/nr dost.
Cps1E² (48%)	1-1363	34%	454	52,2	8,0	glukozylotrans- feraza	Cps2E Streptococcus suis (86%) Cps14E Streptococcus pneumoniae	(26) (12)
Cps1F	1374-1821	33%	149	17,3	8,2	nieznana	Cps14F Streptococcus pneumoniae (83%)	(14)
Cps1G	1823-2315	25%	164	19,5	7,5	glikozylotransfe- raza	Cps14G Streptococcus pneumoniae (50%)	(14)
Cps1H	3035-4202	24%	389	45,5	8,4	CP polimeraza	Cps14H Streptococcus pneumoniae (30%)	(14)
Cpsll	4197-					glikozylotransfe- raza	Streptococcus pneumoniae Cps14H (30%)	(13)
							EpsG Lactococcus lactis (31%)	(29)
							Epsl Streptococcus thermofilus (33%)	(28)
Cps1J						glikozylotransfe- raza	Cps14J Streptococcus pneumoniae ( )	(13)
Cps1K³		37%	278	32,5	7,8	glikozylotransfe- raza	Cps14J Streptococcus pneumoniae (44%)	(13)
Cps9D²	1-646	37%	215	24,9	8,1	nieznana	Cps2D Streptococcus suis (89%)	(26)
Cps9E	680-					glikozylotransfe- raza	Cap1D Staphylococcus aureus (27%)	(18)
Cps9F		36%	200	22,3	8,2	glikozylotransfe- raza	Cap5M Staphylococcus aureus (52%)	(17)
Cps9G		35%	269	31,5	8,0	nieznana	Actinobacillus actinomycetemcomitans (43%)	(AB002668_4)
							Lsg Heamophilus influenzae (43%)	(005081)
Cps9H³		30%	143	16,5	7,2	nieznana	RfbB Yersinia enteroliyica (28%)	(33)

Przewidywane w oparciu o podobieństwo sekwencji Brakuje części białka na końcu N Brakuje części białka na końcu C

PL 204 863 B1

Tabela 4. Hybrydyzacja genów cps serotypu 2 i sekwencji sąsiednich z chromosomalnymi DNA innych serotypów

100 pz 16SrJRNA

PL 204 863 B1

T a b e l a 5. Hybrydyzacja genów cps serotypów 1 i 9 z chromosomalnym DNA innych serotypów S. suis

DNA sondy
Se roty py	Cps1E	Cps1F	Cps1G	Cps1H	Cps1I	Cps9E	Cps9F	Cps9G	Cps9H	16rRNA
1	+	+	+	+	+	-	-	-	-	+
2	+	-	-	-	-	-	-	-	-	+
3	-	-	-	+	-	+	-	-	-	+
4	-	-	-	+	-	+	-	-	-	+
5	-	-	-	+	-	+	-	-	-	+
6	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
7	-	-	-	+	-	+	-	-	-	+
8	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
9	-	-	-	+	-	+	+	+	+	+
10	-	-	-	+	-	+	+	-	-	+
11	-	-	-	+	-	+	±	-	-	+
12	-	-	-	±	-	+	±	-	-	+
13	-	-	-	+	-	+	-	-	-	+
14	+	+	+	+	-	-	-	-	-	+
15	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
16	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
17	-	-	-	+	-	+	-	-	-	+
18	-	-	-	+	-	+	-	-	-	+
19	-	-	-	+	-	+	-	-	-	+
20	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
21	-	-	-	+	-	+	±	-	-	+
22	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
23	-	-	-	+	-	+	-	-	-	+
24	-	-	-	+	-	+	+	-	-	+
25	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
26	-	-	-	-	-	-	±	-	-	+
27	+	-	-	-	-	-	-	-	-	+
28	-	-	-	+	-	+	±	-	-	+
29	-	-	-	+	-	+	-	-	-	+
30	-	-	-	+	-	+	±	-	-	+
31	-	-	-	+	-	+	-	-	-	+
32	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
33	-	-	-	-	-	-	±	-	-	+
34	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
1/2	+	-	-	-	-	-	-	-	-	+

PL 204 863 B1

T a b e l a 6. Wirulencja szczepów S. suis typu dzikiego i mutantów otoczkowych w wolnych od zarazków świniach

szczepy S. suis¹	świ- nie/grupę [n]	Śmier- telność² [%]	Zacho- walność³ [%]	indeks kliniczny grupy	indeks gorączki	indeks leukocy- tów	izolacja S.suis u świń [n) w grupie
				objawy specy- ficzne	objawy niespe- cyficz- ne			CNS	surowi- cówka	stawy
10	4	100	100	11	88	43	44	2	3	4
10cpsB	4	0	0	0	10	1	3	1	3	2
10cpsEF	4	0	0	0	0	1	0	1	3	2

¹ szczep 10 w szczepie typu dzikiego, szczepy 10cpsB i 10cpsEF są izogennymi szczepami mutantów otoczkowych ² świnie które zdechły spontanicznie lub zostały zabite z powodów humanitarnych ³ uwzglę dniono jedynie ś winie z objawami swoistymi ⁴ indeks kliniczny: % obserwowanych speł niają cych odpowiednie kryteria ⁵ objawy specyficzne: ataksja, zakażenie przynajmniej jednego stawu, utykanie ⁶ objawy niespecyficzne: brak łaknienia, depresja ⁷ % obserwacji w grupie eksperymentalnej z temperaturą ciał a > 40°C ⁸ % próbek krwi w grupie w których liczba granulocytów > 10¹⁰/1

T a b e l a 7. Szczepy bakteryjne i plazmidy

szczep/plazmid	Charakterystyka
Szczep
E. coli XL2 blue
S. suis
Szczepy odnośnikowe	serotypy 1-34
5667	serotyp 7, migdałki (1933)
7037	serotyp 7, organy (1994)
7044	serotyp 7, mózg (1994)
7068	serotyp 7, (1994)
7646	serotyp 7, (1994)
7744	serotyp 7, płuca (1996)
7759	serotyp 7, stawy (1996)
8169	serotyp 7, (1997)
15913	serotyp 7, opony (1994)
Plazmid
pKUN19	Funkcje replikacyjne pUC, Amp^R
pGEM7Zf(+)	Funkcje replikacyjne pUC, AmpR
pCPS9-1	pKUN19 zawierający fragment HindIII-XbaI o długości 1 kpz z operonu cps serotypu 9
pCPS9-2	pKUN19 zawierający fragment Xbal-Xbal o długości 4,0 kpz z operonu cps serotypu 9
pCPS7-1	pKUN19 zawierający fragment Pstl o długości 1,6 kpz z operonu cps serotypu 7
pCPS7-2	pGEM7 zawierający fragment Scal-Clal o długości 2,7 kpz z operonu cps serotypu 7

Amp^R: oporne na ampicylinę cps: polisacharyd otoczki

PL 204 863 B1

T a b e l a 8. Właściwości Orf genów cps z S. suis serotypu 7 i podobieństwa do produktów genowych innych bakterii

ORF	Pozycja nukleotydowa w sekwencji	Proponowana funkcja produktu genowego	Podobny produkt genowy (% identyczności)
Cps7E	1-719	glikozylotransferaza	Cps9E Streptococcus suis (99%)
Cps7F	1164-1853	glikozylotransferaza	BplG¹ Bordetella pertussis (43%) Cps2E¹ Streptococcus suis (33%)
Cps7G	1372-3036	biosynteza aminocukrów	Bp1F Bordetella pertussis (48%)
Cps7H	3104-3737	glikozylotransferaza	WbdN Escherichia coli (35%) Cps2K² Streptococcus suis (31%)

¹ Podobieństwo odnosi się do C-końcowej części produktu genowego ² Podobieństwo odnosi się do N-końcowej części produktu genowego

PL 204 863 B1

Opis figur

Figura 1. Organizacja zgrupowania genów cps2 z S. suis typu 2.

(A) Mapa genetyczna zgrupowania genów cps2. Zacienione strzałki przedstawiają potencjalne ORF. Przerwy w ORF wskazują na obecność kodonów stop lub mutacji przesuwających ramkę. Oznaczenia genów podano poniżej ORF. Strzałki zamknięte wskazują pozycję potencjalnych sekwencji promotorowych, I wskazuje pozycję potencjalnej sekwencji regulującej transkrypcję. III wskazuje pozycję 100 pz sekwencji powtórzonych.

(B) Mapa fizyczna locus cps2.

Miejsca restrykcyjne: A: Alul; C: Clal; E, EcoRI; H: Hindlll; K: KpnI; M: Mlul; N: Nsil; P: Pstl; S: SnaBI; Sa: Sacl; X: Xbal.

(C) Fragmenty DNA sklonowane w różnych plazmidach.

Figura 2

Wybarwiony bromkiem etydyny żel agarozowy pokazujący produkty PCR uzyskane z chromosomalnego DNA szczepów S. suis należących do następujących serotypów: 1, 2, 1/2, 9 i 14 oraz starterów dla cps2J, cpsll i cps9H; zestaw, jak opisano w Materiałach i metodach. (A) startery cpsll.

(B) startery cps2J i (C) startery cps9H. Ścieżki 1-3: szczepy serotypu 1; ścieżki 4-6: szczepy serotypu 2; ścieżki 7-9: szczepy serotypu 1/2; ścieżki 10-12: szczepy serotypu 9 oraz ścieżki 13-15: szczepy serotypu 14;

(B) Żel agarozowy wybarwiony bromkiem etydyny pokazujący produkty PCR uzyskane z wymazów z migdałków pobranych świniom noszących szczepy S. suis typu 2, typu 1 lub typu 9 z zestawami starterów cps2J, cpsll, i cps9H, jak opisano w Materiałach i metodach. DNA bakteryjny odpowiedni do PCR uzyskano stosując metody wielokrotnego przeszukiwania opisane poprzednio (20). Ścieżki 1-3: produkty PCR uzyskane z wymazów z migdałków pobranych świniom noszącym szczepy S. suis typu 1; ścieżki 4-6: produkty PCR uzyskane z wymazów z migdałków pobranych świniom noszącym szczepy S. suis typu 2; ścieżki 7-9: produkty PCR uzyskane z wymazów z migdałków pobranych świniom noszącym szczepy S. suis typu 9; ścieżki 10-12: produkty PCR uzyskane z chromosomalnego DNA ze szczepów serotypów odpowiednio 9, 2 i 1,; ścieżka 13: kontrola negatywna, brak DNA.

Figura 3

Sekwencje nukleotydowe i odpowiednie sekwencje aminokwasowe z otwartych ramek odczytu z CPS2.

Figura 4

Sekwencje nukleotydowe i odpowiednie sekwencje aminokwasowe z otwartych ramek odczytu z CPS1.

Figura 5

Sekwencje nukleotydowe i odpowiednie sekwencje aminokwasowe z otwartych ramek odczytu z CPS9.

Figura 6

Sekwencje nukleotydowe i odpowiednie sekwencje aminokwasowe z otwartych ramek odczytu z CPS7.

Figura 7

Przyrównanie N-końcowych części Cps2J i Cps2K. Identyczne aminokwasy zostały zaznaczone kreską. Aminokwasy przedstawione tłustym drukiem są także konserwowane w Cps14I, Cps14J ze

S. pnaumoniae i kilku innych glikozylotransferazach (19). Reszty asparaginianu zaznaczone gwiazdkami są silnie konserwowane.

Figura 8

Obraz z elektronowej mikroskopii transmisyjnej cienkich wycinków z różnych szczepów S. suis.

(A) szczep dziki typu 10;

(B) szczep mutanta 10cpsB;

(C) szczep mutanta 10cpsEF.

Kratka = 100 nm.

Figura 9 (A) Kinetyka fagocytozy szczepów typu dzikiego i mutantów S. suis przez świńskie makrofagi pęcherzykowe. Fagocytozę określano zgodnie z opisem w Materiałach i metodach. Oś Y reprezentuje liczbę CFU na mililitr w zawiesinach płynów oznaczoną poprzez zliczanie płytek, oś X oznacza czas w minutach.

PL 204 863 B1 □ szczep 10 typu dzikiego;

szczep mutanta 10cpsB;

Δ szczep mutanta 10cpsEF.

(B) Kinetyka wewnątrzkomórkowego zabijania szczepów S.suis typu dzikiego i mutantów przez świńskie AM. Wewnątrzkomórkowe zabijanie określano zgodnie z opisem w Materiałach i Metodach. Oś Y reprezentuje liczbę CFU na mililitr w zawiesinach płynów po lizie makrofagów oznaczoną poprzez zliczanie płytek, oś X oznacza czas w minutach.

□ szczep 10 typu dzikiego;

szczep mutanta 10cpsB;

Δ szczep mutanta 10cpsEF.

Figura 10

Przyrównanie sekwencji nukleotydowych wysoce konserwowanych 100 pz elementów powtórzonych.

1) 100 pz powtórzony pomiędzy cps2G i cps2H

2) 100 pz powtórzony w „cps2M”

3) 100 pz powtórzony pomiędzy cps20 i cps2P

Figura 11.

Zgrupowanie genów cps2, cps9 i cps 7 z S. suis serotypów 2, 9 i 7.

(A) Organizacja genetyczna zgrupowania genów cps2 [84]. Dwie strzałki przedstawiają potencjalne ORF. Oznaczenia genów znajdują się poniżej ORF. Jednakowo wypełnione strzałki reprezentują ORF wykazujące homologię. Małe, wypełnione strzałki wskazują pozycję potencjalnej sekwencji promotorowej. I wskazuje położenie potencjalnej sekwencji regulatora transkrypcji.

(B) Mapa fizyczna i organizacja genetyczna zgrupowania genów cps9 [15]. Miejsca restrykcyjne są następujące: B: BamHI; P: Pstl; H: Hindlll; X: Xbal. Wskazane są fragmenty DNA sklonowane w różnych plazmidach. Puste strzałki wskazują potencjalne ORF.

(C) Fizyczna mapa i organizacja genetyczna zgrupowania genów cps7. Miejsca restrykcyjne są następujące: C: Clal; P: Pstl; Sc: Scal. Wskazane są fragmenty DNA sklonowane w różnych plazmidach. Otwarte strzałki wskazują potencjalne ORF.

Figura 12 (A) Żel agarozowy barwiony bromkiem etydyny, przedstawiający produkty PCR otrzymane z chromosomalnego DNA szczepów S. suis, należących do serotypu 1, 2, 9 i 7 oraz zestaw starterów dla cps7H. Oznaczenia szczepów znajdują się powyżej linii. C: kontrola negatywna, w nieobecności DNA. M: marker molekularny (lambda trawiony za pomocą FcoRI i Hindlll).

(B) Żel agarozowy barwiony bromkiem etydyny, przedstawiający produkty PCR otrzymane ze szczepów serotypu 7, pochodzących z różnych krajów i wyizolowanych z różnych narządów. Bakteryjny DNA, odpowiedni do reakcji PCR, przygotowany był poprzez zastosowanie metody wielokrotnego przeszukiwania „multioscreen”, jak opisano poprzednio [89]. Oznaczenia szczepów znajdują się powyżej linii. M: marker molekularny (lambda trawiony za pomocą EcoRI i Hindlll).

1. Arends, J. P., ar.c H. C. Zanen. 1988. Meningitis caused by Streptococcus suis in humans. Rev. Infect. Dis. 10:131-137.

2. Arrecubieta, C, E. Garcia, and R. Lopez. 1995. Sequence and Transcriptional analysis of a DNA region involved in the production of capsular polysaccharide in Streptococcus pneumoniae type 3. Gene 167: 1-7

3. Arrecubieta, C, R. Lopez, and E. Garcia. 1S94. Mclecula characterization of cap3A, a gene from the operon required for the synthesis of the capsule of Streptococcus pneumoniae type 3: sequencing of mutations responsible for the uner. capsulated phenctype and localization of the capsular cluster on the pneumococcal chromosome. J. Bacteriol. 176: 6375-6383.

4. Clifton-Hadley, F.A. 1983. Streptococcus suis type 2 infections. Br. Vet. J. 139:1-5.

5. Charland, N., J. Harel, M. Kobisch, S. Lacasse, and M. Gottschalk. 1998. Streptococcus suis serotype 2 mutants deficient in capsular expression. Microbiol. 144:325-332.

6. Cross, A. S. 1990. The biological significance of bacterial encapsulation. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 150: 87-95.

7. Elliott, S. D. and J. Y. Tai . 1978. The type specific polysaccharide of Streptococcus suis. J. Exp. Med. 148: 1699-1704.

8. Feder, I., M. M. Chengappa, B. Fenwick, M. Rider and J. Staats. 1994. Partial characterization of Streptococcus suis type 2 hemolysin. J. Clin. Microbiol. 32:1256-1260.

PL 204 863 B1

9. Gottschalk, M., R. Higgins, M. Jacques, M. Beaudoin, and J. Henrichsen. 1991. Characterization cf six new capsular types (23 through 28) of Streptococcus suis. J. Clin. Microbiol. 29:2590-2594.

10. Gottschalk, M., S. Lacouture, and J. D. Dubreuil. 1995. Characterization of Streptococcus suis type 2 haemolysin. Microbiology 141:169-193.

11. Gottschalk, M., A. Lebrun, M. Jacques, and R. Higgins. L990. Haemagglutination properties of Streptococcus suis. J. Zlin. Microbiol. 28: 2155-2158.

12. Guidolin, A., J. M. Morcna, R. Morona, D. Hansman, and J. C. Paton. 1994. Nucleotide sequence analysis of genes essential for capsular polysaccharide biosynthesis in Streptococcus pneumoniae type 19F. 1994. Infect. Immun. 62: 5384-5396.

13. Guitierrez, C., and J. C. Devedjian. 1989. Plasmid facilitating in vitro construction of PhoA fusions in Escherichia coli. Nucl. Acid. Res. 17: 3999.

14. Higgins, R., M. Gottschalk, M. Boudreau, A. Lebrun, and J. Henrichsen. 1995. Description of six new capsular types (23 through 34) of Streptococcus suis. J. Vet. Diagn. Invest. 7: 405-406.

15. Jacobs, A. A., P. 1. W. Loeffen, A. J. G. van den Berg, and P. K. Storm. 1994. Identification, purification and characterization of a thiol-activated hemolysin (suilysin) of Streptococcus suis. Infect. Immun. 62: 1742-1748.

16. Jacques, M., M. Gottschalk, 3. Foiry 3.and R. Higgins. 1990. Ultrastructural study of surface components of Streptococcus suis. J. Bacteriol. 172:2833-2838.

17. Klein P., M. Kanehisa and C. DeLisi. 1995. The detection and classification of membrane spanning proteins. Biochim. Biophys. Acta. 851: 468-476.

18. Kolkman, M. A. B., D. A. Morrison, B. A. M. van der Zeijst, and P. J. M. Nuijten. 1996. The capsule polysaccharide synthesis locus of Streptococcus pneumoniae serotype 14: identification of the clycosyl transferase gene cpsl4E. J. Bacteriol. 178: 3736-3541.

19. Kolkman, M. A. B., W. Wakarchuk, P. J. M. Nuijten, and 3. A. M. van der Zeijst. 1397. Capsular polysaccharide synthesis in Streptococcus pneumoniae serotype 14: molecular analysis of the complete cps locus and identification of genes encoding glycosyltransferases required for the biosynthesis of the tetrasaccharide subunit. Mol. Microbiol. 26: 197-208.

20. Kolkman, M. A. B., B. A. M. van der Zeijst. and P. J. M. Nuijten. 1997. Functional analysis of glycosyltransferases encoded by the capsular polysaccharide biosynthesis locus of Streptococcus pneumoniae serotype 14. J. Biol. Chem. 272: 1950219508.

21. Konings, R. N. H., E. J. M. Verhoeven, and B. P H. Peeters. 1987. pKUN vectors for the separate production of both DNA strands cf recombinant plasmids. Methods Enzymol. 153: 12-34.

22. Korolik, V., B. N. Fry, M. R. Alderton, B. A. M. van der Zeijst, and P. J. Colce. 1997. Expression of Campylobacter hyoilei lipooligosaccharide (LOS) antigens in Escherichia coli. Microbiol. 143: 3481-3489.

23. Leij, P. C. J., R. van Furth, and T. L. van Zwet. 1986. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of polymorphonuclear and mononuclear phagocytes. In Handbook of Experimental Immunology, vol. 2. Cellular Immunology, pp. 46.1-46.21. Edited by D. M. Weir, L. A. Herzenberg, C. Blackwell and L. A. Herzenberg. Blackwell Scientific Publications, Oxford.

24. Lin, W. S., T. Cunneen, and C. Y. Lee. 1994. Sequence analysis and molecular characterization of genes required for the biosynthesis of type 1 capsular polysaccharide in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 176: 7005-7016.

25. Liu, D., A. M. Haase, L. Lindqvist, A.A. Lindberg, and P. R. Reeves. 1993. Glycosyl transferases of O-antigen biosynthesis in Salmonella enteritica: Identification and characterization of transferase genes of group 3, C2, and El. J. Bacteriol. 175: 3408-3413.

26. Manoil, C, and J. Beckwith. 1985. A transposon probe for protein export signals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3129-8133.

27. Marsh, J. L., M. Erfle, and E. J. Wykes. 1984. The pIC plasmid and phage vectors with versatile cloning sites for recombinant selection by insertional inactivation. Gene 32:481-485.

28. Miller, J. 1972. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory.

29. Morona, J. K., R. Morona, and J. C. Paton. 1997. Characterization of the locus encoding the Streptococcus pneumoniae type 19F capsular polysaccharide biosynthesis pathway. Mol. Microbiol. 23: 761-763.

30. Muhoz, R., M. Mcllerach, R. Lopez and E. Garcia. 1997. Molecular organization of the genes required for the synthesis cf type 1 capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae;

PL 204 863 B1 formation of binary encapsulated pneumococci and identification of cryptic dTDP-rhamnose biosynthesis genes. Mol. Microbiol. 25: 79-92.

31. Pearce B. J., Y. B. Yin, and H. R. Masure. 1993. Genetic identification of exported proteins in Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 9: 1037-1050.

32. Roberts, I. S. 1996. The biochemistry and genetics of capsular polysaccharide production in bacteria. Ann. Rev. Microbiol. 50: 285-315.

33. Rossbach, S., D. A. Kulpa, U. Rossbach, and F. J. de Bruin. 1994. Molecular and genetic characterization of the rhizopine catabolism (mocABRC) genes of Rhizobium meliloti L5-30. Mol. Gen. Genet. 245: 11-24.

34. Rubens, C. E., L. M. Heggen, R. F. Haft, and R. M. Wessels. 1993. Identification of cpsD, a gene essential for type III capsule expression in group B streptococci. Mol. Microbiol. 8: 843-855.

35. Rubens, C. E., L. M. R. Wessels, L. M. Heggen, and D. L. Kasper. 1987. Transposon mutagenesis of type III group B Streptococcus: correlation of capsule expression with virulence. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7208-7212.

36. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York.

37. Smith, H. E., U. Vecht, H. J. Wisselink, N. Stockhofe-Zurwieden, Y. Biermann, and M. A. Smits. 1996. Mutants of Streptococcus suis types 1 and 2 impaired in expression of tvuramidasereleased protein and extracellular protein induce disease in newborn germfree pigs. Infect Immun. 64: 4409-4412.

38. Smith, H. E., H. J. Wisselink, U. Vecht, A. L. J. Gielkens and M. A. Smits. 1995. Highefficiency transformation and gene inactivation in Streptococcus suis type 2. Microbiol. 141: 181-188.

39. Sreenivasan, P. K., D. L. LeBlanc, L. N. Lee, and P. rives-Taylor. 1991. Transformation of Actinobacillus actinomycetemcomitans by electroporation, utilizing constructed shuttle plasmids. Infect. Immun. 59: 4621-4627.

40. Stringele F., J.-R. Neeser, and B. Mollet. 1996. Identification and characterization of the eps (excpolysaccharide) gene cluster from Streptococcus thermophilus Sfi6. J. Bacteriol. 178: 1680-1690.

41. Stockhofe-Zurwieden, N., U. Vecht, H. J. Wisselink, H.van Lieshout, and H. E. Smith. 1996. Comparative studies on the .athogenicity of different Streptococcus suis serotype 1 strains. In Proceedings of the 14th IPVS Congress, pp. 299.

42. van Kranenburg, R., J. D. Marugg, I. I. van Swam, N. J. tfillem and W. M. de Vos. 1997. Molecular characterization of the plasmid-encoded eps gene cluster essential for axopolysaccharide biosynthesis in Lactococcus lactis Mol. Microbiol. 24: 387-397.

43. van Leengoed, L. A., E. M. Kamp, and J. M. A. Pol. 1989. Toxicity of Haemophilus pleuropneumoniae to porcine lung nacrophages. Vet. Microbiol. 19: 337-349.

44. van Leengoed, L. A. M. G., U. Vecht, and E. R. M. Verheyen. 1987. Streptococcus suis type 2 infections in pigs in The Netherlands (part two). Vet Quart. 9, 111-117.

45. Vecht, U., J. P. Arends, E. J. van der Molen, and L. A. VI. G. van Leengoed. 1989. Differences in virulence between two strains of Streptococcus suis type 2 after experimentally induced infection of newborn germfree pigs. Am. J. Vet. Res. 50:1037-1043.

46. Vecht, U., L. A. M. G. van Leengoed, and E. R. M. Verheyen. 1985. Streptococcus suis infections in pics in The Netherlands (part one). Vet. Quart. 7:315-321

47. Vecht, U., H. J. Wisselink, M. L. Jellema, and H. E. Smith. 1991. Identification of two proteins associated with virulence of Streptococcus suis type 2. Infect. Irnraun. 59:3156-3162.

48. Vecht, U., H. J. Wisselink, N. Stockhofe-Zurwieden, and H. E. Smith. 1996. Characterization of virulence of the Streptococcus suis serotype 2 reference strain Henrichsen S 735 in newborn gnotobiotic pigs. Vet. Microbiol. 51:125-136.

49. Vecht, U., H. J. Wisselink, J. E. van Dijk, and H. E. Smith. 1992. Virulence of Streptococcus suis type 2 strains i newborn germfree pigs depends on phenotype. Infect. Immun. 60:550-556.

50. Wagenaar, F., G. L. Kok, J. M. Broekhuijsen-Davies, and J. M. A. Pol. 1993. Rapid cold fixation of tissue samples by microwave irradiation for use in electron microscopy. Histochemical J. 25:

719-725.

51. Wessels, M. R.and M. S. Bronze. 1994. Critical role of the group A streptococcal capsule in pharyngeal colonization and infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12238-12242.

52. Wessels, M. R., A. E. Moses, J. B. Goldberg, and T. J. DiCesare. 1991. Hyaluronic acid capsule is a virulence factor for mucoid group A streptococci. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 8317-8321.

PL 204 863 B1

53. Yamane, K., M. Kumamano, and K.Kurita. 1996. The 25°-36° region of the Bacillus subtilis chromosome: determination of the sequence of a 146 kb segment and identification of 113 genes. Microbiol. 142: 3047-3056.

54. Butler, J. C, R. F. Breiman, H. B. Lipman, J. Hofmann, and R. R. Facklam. 1995. Serotype distribution of Streptococcus pneumoniae infections among preschool children in the United States, 1978-1994: implications fro development of a conjugate vaccine. J. Infect. Dis. 171: 885-889.

55. Charland, N., M. Jacques, S. Lacoutre and M. Gottschalk 1997. Characterization and protective activity of a monoclonal antibody against a capsular epitope shared by Streptococcus suis serotypes 1, 2 and 1/2. Microbiol. 143:3607-3614.

56. Gottschalk, M., R. Higgins, M. Jacques, K. R. Mittal, and J. Henrichsen. Description of 14 new capsular types of Streptococcus suis. J. Clin. Microbiol. 27:2633-2636.

57. Heath, P. J., B. W. Hunt, and J. P. Duff. 1996. Streptococcus suis serotype 14 as a cause of pig disease in the UK. Vet. Ree. 2:450-451.

58. Hommez, J., L. A. Devrieze, J. Henrichsen, and F. Castryck. 1986. Identification and characterization of Streptococcus suis. Vet. Microbiol. 16:349-355.

59. Killper-Balz, R., and K. H. Schleifer. 1987. Streptococcus suis sp. nov. nom. rev. Int. J. Syst. Bacterid. 37:160-162.

60. Kolkman, M. A. B., 3. A. M. van der Zeijst, and P. J. M. Nuijten. 1998. Diversity of capsular polysaccharide synthesis gene clusters in Streptococcus pneumoniae. Submitted for publication.

61. Lee, J. C, S. Xu, A. Albus, and P. J. Livolsi. 1994. Genetic analysis of type 5 capsular polysaccharide expression by Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 17 6:4883-4889.

62. Reek, F. H., M. A. Smits, E. M. Kamp, and H. E. Smith. 1995. Use of multiscreen plates for the preparation of bacterial DNA suitable for PCR. BioTechniques 19: 282-285.

63. Sau, S., N. Bhasin, E. R. Wann, J. C. Lee, T. J. Foster, and C. Y. Lee. 1997. The Staphylococcus aureus allelic genetic loci for serotype 5 and 8 capsule expression contain the type-specific genes flanked by common genes. Microbiol. 143: 2395-2405.

64. Sau, S., and C. Y. Lee. 1996. Cloning of type 8 capsule genes and analysis of gene clusters for the production of different capsular polysaccharides in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 178: 2118-2126.

65. Sau, S., and C. Y. Lee. 1997. Molecular characterization and transcriptional analysis of type 8 capsule genes in Staphylococcus aureus. J. Bacterid. 179:1614-1621.

66. Smith, H. E., M. Rijnsburger, N. Stockhcfe-Zurwieden, H. r. Wisselink, Vecht, and M. A. Smits. 1997. Virulent strains of Streptococcus suis serotype 2 and highly virulent strains of Streptococcus suis serotype 1 can be recognized by i unique ribotype profile. J. Clin. Microbiol. 35:1049-1053.

67. Yamazaki, M., L. Thcrne, M. Mikolajczak, R. W. irmentrout, and T. J. Pollock. 1996. Linkage of genes essential for synthesis of a polysaccharide capsule in Sphingomonas strain S88. J. Bacteriol. 178:2676-2637.

68. Zhang, L., A.Al-Hendy, P. Toivanen. and M. Skurnik. 1993. Jenetic organization and sequence of the rfb gene cluster of Yersinia enterolitica serotype 0:3: similarities to the dTDP-L-rhamnose biosynthesis pathway of Salmonella and to the bacterial polysaccharide transport systems. Mol. Microbiol. 9:309-321.

69. Clifton-Hadley, F.A. (1983). Streptococcus suis type 2 .nfections. Br. Vet. J. 139, 1-5.

70. Vecht, U., van Leengoed, L. A. M. G. and Verheyen, E. R. M. (1985). Streptococcus suis infections in pigs in The Netherlands (part one). Vet. Quart. 7, 315-321.

71. Arends, J. P. and Zanen, H. C.(1988). Meningitis caused by Streptococcus suis in humans. Rev. Infect. Dis. 10, 131-137.

72. Hommez, J., Devrieze, L.A., Henrichsen, J. and Castryck, F. (1986). Identification and characterization of Streptococcus suis. Vet. Microbiol. 16, 349-355.

73. Killper-Balz, R. and Schleifer, K. H. (1997). Streptococcus suis sp. nov. nom.rev. Int. J. Syst. Bacteriol. 17, 160-162.

74. Gottschalk, M., Higgins, R. and Jacques, M. (1993). Production of capsular material by Streptococcus suis serotype I under different conditions. Can. J. Vet. Res. 57, 49-52.

75. Higgins, R. and Gottschalk, M. (1990) . Un update on Streptococcus suis identification. J. Vet. Diagn. Invest. 2, 249-252.

76. Gottschalk, M., Higgins, R., Jacques, M., Beaudoin, M. and Henrichsen, J. (1991). Characterization of six new capsular types (23 through 28) of Streptococcus suis. J. Clin. Microbiol. 29, 2590-2594.

PL 204 863 B1

77. Gottschalk, M., Higgins, R., Jacques, M., Mittal, K. R. and Henrichsen, J. (1989) Description of 14 new capsular types of Streptococcus suis. J. Clin. Microbiol. 27, 2633-2636.

78. Higgins, R., Gottschalk, M., Boudreau, M.,Lebrun, A.and Henrichsen, J. (1995). Description of six new capsular types (28 through 34) of Streptococcus suis. J. Vet. Diagn. Invest. 7, 405-406.

79. Aarestrup, F. M., Jorsal, S. E. and Jensen, N. E. (1998). Serological characterization and antimicrobial susceptibility of Streptococcus suis isolates from diagnostic samples in Denmark during 1995 and 1996. Vet. Microbiol. 15, 59-66.

80. MacLennan, M., Foster, G., Dick, K., Smith, W. J. and Nielsen, B. (1996). Streptococcus suis serotypes 7, 8 and 14 from diseased pigs in Scotland. Vet Ree. 139, 423-424.

81. Sihvonen, L., Kurl, D. N. and Henrichsen, J. (1988). Streptococcus suis isolates from pigs in Finland. Acta Vet. Scand. 29, 9-13.

82. Boetner, A. G., Binder, M. and Bille-Hansen, V. (1987). Streptococcus suis infections in Danish pigs and experimental infection with Streptococcus suis serotype 7. Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B, 95, 233-239.

83. Smith, H. E., Veenbergen, V., van der Velde, J., Damman, M., Wisselink, H. J. and Smits, M. A. (1999). The cps genes of Streptococcus suis serotypes 1, 2 and 9: development of rapid serotype-specific PCR assays. J. Clin. Microbiol, submitted.

84. Smith, H. E., Damman, M., van der Velde, J., Wagenaar, F., Wisselink, H. J., StockhofeZurwieden, N. and Smits, M. A. (1999). Identification and characterization of the cps locus of Streptococcus suis serotype 2: the capsule protects against phagocytosis and is an important virulence factor. Infect. Immun. 67, 1750-1756.

85. Miller, J. (1972). Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

86. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

87. Allen, A. and Maskell, D. (1996). The identification, cloning and mutagenesis of a genetic locus required for lipopolysaccharide biosynthesis in Bordetella pertussis. Mol. Microbiol. 19, 37-52.

88. Wang, L. and Reeves, P. R. (1998). Organization of Escherichia coli 0157 O antigen gene cluster and identification of its specific genes. Infect. Immun. 66, 3545-3551.

89. Wisselink, H. J., Reek, F. H., Vecht, U., Stockhofe-Zurwieden, N., Smits, M. A. and Smith, H. E. (1999). Detection of virulent strains of Streptococcus suis type 2 and highly virulent strains of Streptococcus suis type 1 in tonsillar specimens of pigs by PCR. Vet. Microbiol. 67, 143-157.

90. Konings, R. N. H., Verhoeven, E. J. M. and Peeters, B. P. i. (1987). pKUN vectors for the separate production of both DNA strands of recombinant plasmids. Methods Enzymol. 153, 12-34.

Claims

1. Zastosowanie mutanta Streptococcus z niedoborem ekspresji otoczki do wytwarzania szczepionki.

2. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera mutanta Streptococcus z niedoborem ekspresji otoczki.

3. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że mutanta Streptococcus stanowi Streptococcus suis.

4. Szczepionka według zastrz. 2 albo 3, znamienna tym, że mutanta Streptococcus stanowi Streptococcus suis serotypu 2.

5. Szczepionka według jednego z zastrz. 2 do 4, znamienna tym, że zawiera mutanta zdolnego do ekspresji czynnika zjadliwości lub determinanty antygenowej Streptococcus.

6. Sposób kontrolowania lub eliminowania choroby paciorkowcowej w populacji, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym testuje się próbkę pochodzącą od przynajmniej jednego osobnika z tej populacji pod kątem obecności szczepów paciorkowców posiadających otoczkę, przy czym ta populacja jest częściowo lub całkowicie zaszczepiona za pomocą szczepionki określonej w jednym z zastrz. 2 do 5.

7. Sposób kontrolowania lub eliminowania chorób paciorkowcowych w populacji, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym testuje się próbkę pochodzącą od przynajmniej jednego osobnika z tej populacji pod kątem obecności specyficznych wobec otoczki przeciwciał ukierunkowanych przeciwko szczepom paciorkowców, przy czym ta populacja jest częściowo lub całkowicie zaszczepiona za pomocą szczepionki określonej w jednym z zastrz. 2 do 5.